ＣＦＴＲを安定的に発現する細胞および細胞株、ならびにそれらの細胞および細胞株の使用法を本明細書で開示する。本発明は、これらの細胞および細胞株を作製するための技術も含む。本発明の細胞および細胞株は、生理的な関連性がある。本発明の細胞および細胞株は高い感受性があり、細胞に基づくアッセイにおいて、一貫性があり信頼できる結果を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を安定的に発現するように遺伝子工学処理された細胞または細胞株。
【請求項２】
前記ＣＦＴＲが、前記ＣＦＴＲをコードする導入核酸から発現する、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項３】
前記ＣＦＴＲが、遺伝子工学処理された遺伝子活性によって活性化される内在性核酸から発現する、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項４】
ａ）真核性であり、
ｂ）哺乳類であり、
ｃ）内在性のＣＦＴＲを発現しないか、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせである、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項５】
１つまたは複数のＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項６】
分極した単分子層を形成することができる、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項７】
前記ＣＦＴＲが哺乳類ＣＦＴＲまたはヒトＣＦＴＲである、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項８】
アッセイにおいて、少なくとも０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、または０．８５のＺ’値をもたらす、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項９】
選択圧が存在しない状態で維持される、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１０】
前記ＣＦＴＲが任意のポリペプチドタグを含まない、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１１】
自己蛍光タンパク質を発現しない、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１２】
前記自己蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはその変異型である、請求項１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１３】
選択圧が存在しない状態で増殖する、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１４】
前記細胞または細胞株が、選択圧が存在しない状態で、少なくとも１５日間、３０日間、４５日間、６０日間、７５日間、１００日間、１２０日間、または１５０日間、一貫したレベルで前記ＣＦＴＲを発現する、請求項１３に記載の細胞または細胞株。
【請求項１５】
前記ＣＦＴＲが、
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＦＴＲポリペプチドと；
ｂ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＣＦＴＲポリペプチドと；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１とハイブリダイズする核酸によってコードされるＣＦＴＲポリペプチドと；
ｄ）配列番号２の対立遺伝子変異型であるＣＦＴＲポリペプチドと
からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１６】
前記ＣＦＴＲが、配列番号７に記載の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドかまたは、配列番号４に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１５に記載の細胞または細胞株。
【請求項１７】
前記ＣＦＴＲが、
ａ）配列番号１に記載の配列を含む核酸と；
ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸と；
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸と；
ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸と；
ｅ）配列番号１の対立遺伝子変異型である核酸と
からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１８】
前記ＣＦＴＲが、配列番号４に記載の配列を含む核酸によってコードされるかまたは、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸によってコードされる、請求項１７に記載の細胞または細胞株。
【請求項１９】
収集物中の前記細胞または細胞株が、異なるＣＦＴＲ型を発現する、請求項１に記載の細胞または細胞株の収集物。
【請求項２０】
前記収集物または前記細胞もしくは細胞株が、各々、表１または表２から選択される異なるＣＦＴＲ変異体を発現する、請求項１９に記載の収集物。
【請求項２１】
前記細胞または細胞株が同じ生理的特性を共有するように調和され、並行処理を可能にする、請求項１９に記載の収集物。
【請求項２２】
前記生理的特性が増殖速度である、請求項１９に記載の収集物。
【請求項２３】
前記生理的特性が組織培養表面への接着性である、請求項２１に記載の収集物。
【請求項２４】
前記生理的特性がＺ’因子である、請求項２１に記載の収集物。
【請求項２５】
前記Ｚ’因子が、タンパク質輸送補正物質が存在しない状態で決定される、請求項２４に記載の収集物。
【請求項２６】
前記生理的特性がＣＦＴＲの発現レベルである、請求項２１に記載の収集物。
【請求項２７】
ａ）ＣＦＴＲをコードする核酸を宿主細胞に導入するステップと；
ｂ）前記ＣＦＴＲの発現を検出する分子ビーコンを前記宿主細胞に導入するステップと；
ｃ）ＣＦＴＲを発現する細胞を単離するステップと
を含む、請求項１に記載の細胞または細胞株を作製する方法。
【請求項２８】
ａ）内在性ＣＦＴＲの発現を活性化する１つ以上の核酸配列を宿主細胞に導入するステップと；
ｂ）前記活性化されたＣＦＴＲの発現を検出する分子ビーコンを前記宿主細胞に導入するステップと；
ｃ）前記活性化されたＣＦＴＲを発現する細胞を単離するステップと
を含む、請求項１に記載の細胞または細胞株を作製する方法。
【請求項２９】
ステップ（ｃ）において単離される前記細胞から細胞株を作製するステップをさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、
ａ）真核細胞であるか、
ｂ）哺乳類細胞であるか、
ｃ）内在性ＣＦＴＲを内因的に発現しないか、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせである、
請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＦＴＲが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＦＴＲが、配列番号１を含む核酸によってコードされる、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＦＴＲが、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＦＴＲが、配列番号４を含む核酸によってコードされる、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記単離が、蛍光活性化細胞選別装置を利用する、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記収集物の前記細胞または細胞株が同時に作製される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２７または請求項２８の方法によって作製される細胞または細胞株。
【請求項３８】
請求項１に記載の細胞もしくは細胞株または請求項１９に記載の収集物を試験化合物に曝露するステップと；
前記試験化合物がＣＦＴＲモジュレーターであることを変化が示す、ＣＦＴＲ機能の変化を細胞において検出するステップと
を含むＣＦＴＲ機能のモジュレーターを同定する方法。
【請求項３９】
前記検出ステップが、膜電位アッセイ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）クエンチングアッセイ、電気生理学的アッセイ、結合アッセイ、またはＵｓｓｉｎｇ
ｃｈａｍｂｅｒアッセイを利用する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＦＴＲがヒトＣＦＴＲである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＦＴＲが、表１または表２から選択されるＣＦＴＲ変異体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出ステップが、タンパク質輸送補正物質が存在しない状態で行われる、請求項３８または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＦＴＲが配列番号４を含む核酸によってコードされるか、または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記試験化合物が、小分子、化学成分、ポリペプチド、または抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記試験化合物が化合物ライブラリーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ライブラリーが小分子ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ペプチドライブラリー、または抗体ライブラリーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
一貫したレベルで、長期にわたってＣＦＴＲを安定的に発現するように遺伝子工学処理された細胞であって、
ａ）前記ＣＦＴＲをコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを発現する多数の細胞を提供するステップと；
ｂ）前記細胞を個々の培養容器の中で１つ１つ分散させ、それによって多数の別々の細胞培養物を提供するステップと；
ｃ）培養条件が前記別々の細胞培養物の各々と実質的に同一であり、その培養中、別々の細胞培養物あたりの細胞数を正規化し、前記別々の培養物を同じスケジュールで継代するという点で特徴づけられる自動細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で前記細胞を培養するステップと；
ｄ）前記別々の細胞培養物をアッセイし、少なくとも２回、前記ＣＦＴＲの発現を測定するステップと；
ｅ）両方のアッセイにおいて、一貫したレベルで前記ＣＦＴＲを発現する別々の細胞培養物を同定し、それによって前記細胞を取得するステップと
を含む方法によって作製される細胞。
【請求項４８】
ａ）細胞の集団を提供するステップと；
ｂ）ＣＦＴＲの発現を検出する分子ビーコンを前記細胞に導入するステップと；
ｃ）ＣＦＴＲを発現する細胞を単離するステップと
を含む、ＣＦＴＲを内生的に発現する細胞を単離する方法。
【請求項４９】
前記細胞の集団が、ＣＦＴＲを内生的に発現しない細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞の細胞膜においてＣＦＴＲの発現レベルを増加させるために、式
【化１】

Ｎ−｛２−[（２−メトキシフェニル）アミノ]−４’−メチル−４，５’−ビ−１，３−チアゾ−ル−２’−イル｝ベンズアミド臭化水素酸
の化合物を含む組成物の使用。

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【公表番号】特表２０１２−５１６６８６（Ｐ２０１２−５１６６８６Ａ）
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８３７７（Ｐ２０１１−５４８３７７）
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２７７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８８６３０
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５１１１８１５４４）クロモセル　コーポレーション (6)
【Ｆターム（参考）】