ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤
個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法に関する。阻害剤は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、またはリボザイムであってもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、腫瘍内皮特異的遺伝子およびポリペプチド、腫瘍血管系をイメージングし標的化するための、これらのポリペプチドに結合する抗体の使用、ならびに、固形腫瘍における血管新生を阻害するための、これらの腫瘍内皮特異的遺伝子／ポリペプチドの阻害剤の使用、に関する。特に、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａ、腫瘍血管新生をイメージングし標的化するための、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の使用、ならびに、固形腫瘍における血管新生を阻害するための、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮は、多数の生理的かつ病理学的プロセスにおいて中心的役割を果たし、またそれは非常に活性の高い転写部位であることが知られている。約１，０００の異なる遺伝子が内皮細胞内で発現されるが、それらの多くは、内皮細胞に特異的なものではない。それに対し、赤血球は、８つの血小板２２および平滑筋１２７の別々の遺伝子を発現することが見出されている（Ａｄａｍｓら（１９９５年） Ｎａｔｕｒｅ ３７７（６５４７ Ｓｕｐｐｌ）：３−１７４頁）。既知の内皮特異的遺伝子は、基礎研究および臨床コミュニティの双方から多大な注目を集めている。例えば、内皮に特異的なチロシンキナーゼＴｉｅ、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＫＤＲ、およびｆｌｔ１は、血管の完全性、内皮媒介性の炎症性プロセスおよび血管新生の調節における重要な担い手（ｐｌａｙｅｒ）である。
【０００３】
発明者は、過去に、コンピュータ上のデータベースによるスクリーニングアプローチを用いて内皮特異的遺伝子を同定しており、４つの新たな内皮特異的候補遺伝子を同定したが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（ＨｕｍｉｎｉｅｃｋｉおよびＢｉｃｋｎｅｌｌ（２０００年） 「Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ．」 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１７９６−１８０６頁）。
【０００４】
Ｈｏらは、データマイニングおよびマイクロアレイ発現分析を用い、内皮特異的遺伝子を同定し、内皮細胞に特異的であるかまたは内皮細胞内で少なくとも３倍優先的に発現される６４の遺伝子を同定したが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（Ｈｏら（２００３年） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．」 Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：２４９−２６２頁）。
【０００５】
Ｗａｌｌｇａｒｄらは、公的に利用可能なマイクロアレイ発現データを分析し、微小血管系における広範な内皮特異的発現を伴う５８の遺伝子のコアセットを同定した。このセットは、最も有名でかつ現在使用されている内皮マーカー、ならびに過去に内皮機能と関連性がなかった遺伝子を含むが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（Ｗａｌｌｇａｒｄら（２００８年） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｒｅ ｓｅｔ ｏｆ ５８ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２８：１４６９−１４７６頁）。
【０００６】
内皮細胞は、すべての血管沿いに並びかつ血流と周囲組織との間での交換を調節する単細胞層を形成する。新しい血管が、血管新生と称されるプロセスにおける内皮細胞の増殖により、既存の小管の壁から発生する。内皮細胞は、培養液中に単離される場合であっても、空洞の毛細管の形成能を有する。一旦、血管系が十分に発達すると、血管の内皮細胞は通常、休止状態を維持し、自然な創傷治癒における新しい血管の形成以外での新たな管形成は全くない。
【０００７】
しかし、一部の腫瘍は、近隣の内皮細胞を刺激し、新しい毛細血管芽を作る因子を分泌することにより、新しい血液供給を促進する。血管新生は、固形腫瘍の進行における主要な役割を果たし、固形腫瘍の成長における律速プロセスとして広く認識されている。血液供給を促進できない腫瘍は、その成長が著しく制限される。したがって、不適切であるかまたは望ましくない血管新生に対する阻害能は、固形腫瘍の処置において有用でありうる。
【０００８】
新しい血管の発生は、局所的な腫瘍進行と遠隔転移の発生の双方にとって不可欠である。確かに、腫瘍の成長および生存は、その血液供給を得る能力に依存し、腫瘍内皮上に受ける損傷は、腫瘍を有効に根絶することが示されている（Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９９３年） 「Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０（１９）：８９９６−９０００頁）。腫瘍血管新生は、活性化組織または循環内皮前駆体による基底膜の分解、内皮細胞の増殖および移動、細胞外マトリックスとの相互作用、形態学的分化、細胞接着および血管脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を含む。したがって、腫瘍血管新生の阻害は、抗腫瘍療法における標的であり、ここでは血管新生阻害剤が単独でまたは標準的癌治療と組み合わせて利用される。しかし、抗腫瘍剤を血管新生の部位に標的化することは、腫瘍血管新生の特異的マーカーの同定に依存する。いまでは、固形腫瘍の成長が、それが血液供給を得る能力に依存し、またこのプロセスを破壊する抗血管新生剤の開発に多大な努力が向けられていることは理解されている。また、確立された腫瘍血管系の標的化された破壊が治療機会を促すための別の手段であり、また広範に発現される腫瘍内皮マーカーの発見が多大な臨床的利益を約束することが明らかになっている（ＮｅｒｉおよびＢｉｃｋｎｅｌｌ（２００５年） 「Ｔｕｍｏｕｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５（６）：４３６−４４６頁）。
【０００９】
これらの治療的アプローチは、特異的な腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）の同定に依存する。抗血管新生腫瘍療法における候補でありうる腫瘍特異的な内皮マーカーについてのスクリーニングでは、Ｓｔ Ｃｒｏｉｘら（２０００年）は、腫瘍内皮由来の内皮細胞と正常な結腸粘膜との間に特異的に発現された７９の遺伝子を同定し、そのいずれもがＣＬＥＣ１４Ａでなかった（Ｓｔ Ｃｒｏｉｘら（２０００年） 「Ｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１１９７−２０２頁）。３３のこれらの遺伝子（１１の既知の遺伝子および１４の現時点で（ａｓ−ｔｈｅｎ）特徴づけられていない遺伝子を含む）の発現が、腫瘍内皮細胞内で少なくとも１０倍高まった。組織試料に対するインサイチュハイブリダイゼーションによると、徹底的に試験された９つの特徴づけられていない遺伝子のうちの８つの発現が、腫瘍内皮細胞に特異的であることが確認された。さらに、これらの遺伝子はまた、肺および脳腫瘍を含む他の腫瘍の内皮細胞上で発現された。これらの遺伝子はまた、１つの遺伝子を除き、創傷治癒などの他の血管新生状態において高レベルに発現された。
【００１０】
Ｋｈｏｄａｒｅｖら（２００３年）は、Ｕ８７ヒトグリオーマ細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とを共培養することによる腫瘍／内皮−細胞相互作用をモデル化した。Ｕ８７細胞は、増殖、移動および網状形成の増大を含む、ＨＵＶＥＣ内で「活性化された」表現型を誘発した。活性化は、細胞が直接接触または物理的分離のいずれかの状態にある場合の共培養物中で認められ、これは、認められた表現型および遺伝子型の変化における可溶性因子にとっての重要な役割を示唆した。腫瘍が活性化された内皮細胞の発現プロファイリングが、ｃＤＮＡアレイを用いて評価され、定量ＰＣＲによって確認された。ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３、ＦＧＦＲＩＩ、およびシステインリッチ線維芽細胞成長因子受容体（ＣＲＦ−１）とＦＧＦ７、およびＦＧＦ１２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５とＲＡＮＴＥＳ、およびカルシトニン受容体様遺伝子（ＣＡＬＣＲＬ）とアドレノメデュリンを含む、受容体／リガンドの一致ペアが、協調的に発現されることが見出された。ＣＬＥＣ１４Ａは、同定されなかった（Ｋｈｏｄａｒｅｖら（２００３年） 「Ｔｕｍｏｕｒ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１６：１０１３−１０２２頁）。
【００１１】
Ｓｅａｍａｎら（２００７年）は、８つの正常な静止組織、５つの腫瘍、および再生肝の血管に由来する内皮細胞の遺伝子発現パターンを比較した。Ｓｅａｍａｎらは、器官特異的な内皮遺伝子、ならびに正常な内皮に対して腫瘍において過剰発現された２５の転写産物を同定した（そのうちの１３は、再生肝の血管新生内皮において見出されなかった）。ＣＬＥＣ１４Ａは同定されなかった。共有される血管新生遺伝子の大部分が、細胞周期制御における役割を有することが想定されたが、腫瘍内皮に特異的なものは、主に不特定の機能を有する細胞表面分子であった（Ｓｅａｍａｎら（２００７年） 「Ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．１１（６）：５３９−５４頁）。
【００１２】
発明者は、先行的に、公的なｃＤＮＡおよびＳＡＧＥライブラリのデータマイニングにより、４５９の予測される内皮遺伝子（そのうちの１つはＣＬＥＣ１４Ａである）を同定した。発明者は、これらの４５９から、発現が腫瘍内皮に対して高度に特異的である２７の遺伝子／ポリペプチド（ＣＬＥＣ１４Ａを含まない）を同定した（Ｈｅｒｂｅｒｔら（２００８年） 「Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｅｎｅｓ」 ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９：１５３（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−９−１５３））。このように、これらの遺伝子／ポリペプチドは、血液供給を介して直接的に標的化されうるような特に優れた抗癌剤標的である、新規の腫瘍内皮マーカーとして同定された。
【００１３】
にもかかわらず、当該技術分野では、さらなる腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）に対する需要がある。
【００１４】
発明者は、いまでは、さらなる遺伝子／ポリペプチドとして、高度な腫瘍内皮特異性を有するＣＬＥＣ１４Ａを同定している。発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが、ヒト内皮細胞内でまたゼブラフィッシュモデルにおける発生の間に血管新生組織内で特異的に発現されることを示している。発明者はまた、ｓｉＲＮＡ技術を用いたＣＬＥＣ１４Ａの下方制御および抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体を用いたＣＬＥＣ１４Ａの阻害により、血管新生の本質的成分である内皮細胞移動が低下することを示している。さらに、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現が、血管新生促進遺伝子の下方制御に関連することが多いせん断応力に応答して下方制御されることを示している。発明者はまた、免疫蛍光により、ＣＬＥＣ１４Ａが、正常な成体組織内で発現されないが、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肺癌および甲状腺癌を含む癌の新生血管（ｎｅｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｖｅｓｓｅｌｓ）において発現されることを示している。
【００１５】
したがって、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが本質的にＴＥＭをコードすることを結論づけている。したがって、発明者は、いまでは、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドが腫瘍内皮のマーカーとして重要になり、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用し、腫瘍血管新生を画像化し、標的化することが可能であり、また、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドの阻害剤であれば、固形腫瘍における腫瘍血管新生の阻害において臨床的に有用になる、と考えている。
【００１６】
発明者の知りうる限りにおいて、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生の阻害剤であることが示唆されたことはかつて全くない。
【００１７】
国際公開第０２／０７９４９２号パンフレット（Ｅｏｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）は、発現が血管新生組織内で経時的に変化すると言われた数百ものＥＳＴを列挙している。これらのＥＳＴの１つが、１６６のＣＬＥＣ１４Ａの残基断片をコードするＥＳＴ（その中でＰｋｅｙ１０５７２９、登録番号Ｈｓ４６６１２、Ｕｎｉｇｅｎｅ番号Ｈｓ２９３８１５、Ｕｎｉｇｅｎｅ名称ＨＳＰＣ２８５として称される）であった。しかし、国際公開第０２／０７９４９２号パンフレットは、血管新生の間でのこのＥＳＴの発現に対するデータの提示が全くなく、発現が増大または低下していることへの考察あるいは発現が腫瘍内皮細胞に限られたか否かについてさえ記載がない。
【００１８】
Ｈｅｒｂｅｒｔら（２００８年）においては、発明者は、ｃＤＮＡおよびＳＡＧＥライブラリデータを組み合わせることによって得られた、４５９のコンピュータで予測された包括的な内皮遺伝子セットについて記載した。発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａを内皮細胞内で選択的に発現されるものとして同定したが（追加ファイル１３）、それは上位１０４の最も内皮に特異的な遺伝子に含まれなかった。この前報では、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａを、腫瘍内皮に特異的であるかまたは血管新生に関与するものとして同定しなかった。確かに、ＣＬＥＣ１４Ａにおける機能として、既知であるかまたは提示されたものは全くなく、さらなる実証実験が行われたことは全くなかった。
【００１９】
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．は、ＰＲＯ２６９（クローンＤＮＡ３８２６０−１１８０）がＣＬＥＣ１４Ａに相当するという、「ＰＲＯ」遺伝子およびポリペプチドに関する多数の公開された特許および特許出願を有している。これらの特許および特許出願においては、複数の潜在的な役割がＰＲＯ２６９に帰するものとしている。例えば、米国特許第２００３／０１８６３５８号明細書および米国特許第６，８９４，１４８号明細書の双方において、ＰＲＯ２６９は、そのトロンボモジュリンとの相同性から抗血栓剤としての用途を有すると言われており、また、リンパ球増殖を刺激し、皮質ニューロンにおけるｃ−ｆｏｓを誘発し、またグルコース取り込みに作用する能力を有すると言われている。より適切には、ＰＲＯ２６９は、８つの肺腫瘍試料および細胞系（ｎ＝２０）のゲノムＤＮＡにおいて２〜４倍の間で増幅されるが、結腸（ｎ＝１９）、睾丸（ｎ＝２）もしくは腎臓（ｎ＝１）の腫瘍試料または細胞系に由来するゲノムＤＮＡにおいて増幅されないことが見出された。同様に、米国特許出願公開第２００３／０１７５９００号明細書では、ＰＲＯ２６９は、同じ８つの肺腫瘍試料および細胞系（ｎ＝５０）のゲノムＤＮＡにおいて２〜４倍の間で増幅されるが、結腸（ｎ＝４５）、乳房（ｎ＝１８）、リンパ節（ｎ＝３）、腎臓（ｎ＝２）、副甲状腺（ｎ＝２）、直腸（ｎ＝２）または睾丸（ｎ＝２）の腫瘍試料および細胞系に由来するゲノムＤＮＡにおいて増幅されないことが見出された。
【００２０】
米国特許出願公開第２００３／０１９４７７５号明細書（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）では、ＰＲＯ２６９は、肝臓、腎臓、および肺組織を含む、上皮由来の非癌性ヒト組織をプールすることによって調製された「ユニバーサルな（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」上皮対照試料に比べて、肺および直腸腫瘍において過剰発現されるが、乳房、結腸、頸部、前立腺または肝臓腫瘍において過剰発現されないと言われた。
【００２１】
それに対し、国際公開第０３／１０１２８３号パンフレット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ）は、発現が肺腫瘍において特異的に調節されることが見出された１７０の転写産物について記載している。これらのうち、ＣＬＥＣ１４Ａに相当する転写産物（その中でＩｎｃｙｔｅ ＩＤ ２２６４００２ＣＢ１、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇ１５２０９７５２と称される）は、３９のうち２１の異なる肺腫瘍試料中で４〜１６倍の間で下方制御されることが見出された。これは、米国特許出願公開第２００３／０１９４７７５号明細書中での肺腫瘍におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現に関する実験結果に矛盾するように思われる。
【００２２】
Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃはまた、ＣＬＥＣ１４Ａが、他の既知のアテローム性動脈硬化症遺伝子との同時発現から、３４のヒトアテローム性動脈硬化症関連遺伝子の１つであることを示唆している（国際公開第０１／０４２６４号パンフレット）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、本発明に至るまで、ＣＬＥＣ１４Ａの考えられる機能および使用について多くの示唆があるにもかかわらず、腫瘍内皮マーカーとしてのその役割、またはＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が腫瘍血管新生の阻害剤でありうることについて示唆するものは全くなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明の第１の態様は、腫瘍血管新生を、阻害を必要とする個体において阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明のこの態様は、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用を含む。本発明は、個体における腫瘍血管新生を阻害することにおいて使用されるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤をさらに含む。
【００２６】
典型的には、個体は、固形腫瘍を有し、それは腫瘍血管新生を阻害することによって処置可能である、すなわち、固形腫瘍は、新たな血管産生に関連している。用語「腫瘍」は、限定はされないが、乳房、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺の腫瘍を含む、腫瘍性細胞成長のすべての形態を参照するものとして理解されるべきである。
【００２７】
典型的には、腫瘍は、望ましくない血管新生形成に関連しており、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、これを有効な範囲まで低減する。望ましくない血管新生形成の低減は、腫瘍の進行を停止させ、腫瘍サイズおよび成長の臨床的に有効な低減をもたらしうる。したがって、腫瘍血管新生の阻害を用いることで、腫瘍を処置し、例えば、腫瘍の（さらなる）成長を阻止するか、腫瘍の浸潤（転移）を阻止するか、または腫瘍のサイズを低減することが可能である。
【００２８】
発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺の腫瘍を含む、ある範囲の固形腫瘍の血管内皮において特異的に発現されることを示している。したがって、好ましい実施形態では、個体は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺腫瘍から選択される固形腫瘍を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、個体は、肺癌および／または直腸癌以外の固形腫瘍を有する。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法および薬剤は、ヒトを処置するために使用され、その場合、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤である。しかし、本発明の方法および薬剤が非ヒト哺乳類の処置を目的とする場合、阻害剤が他種由来のＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドに特異的である場合に好ましいことが理解されている。
【００３１】
ＣＬＥＣ１４Ａ
遺伝子ＣＬＥＣ１４Ａ（Ｃ型レクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）は、１４ｑ２１．１に位置し、以前はＣ１４ｏｒｆ２７、ＣＥＧ１およびＥＧＦＲ５として知られていた。ＣＬＥＣ１４Ａは、５１ｋＤａの予測分子量を有する４９０アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの遺伝子産物（その天然変異体を含む）の意味が含まれる。ヒトＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０中に見出されるアミノ酸配列およびその天然変異体を含む。ＮＰ＿７７８２３０由来のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド配列は、図１中に示される（配列番号１）。
【００３２】
ヒトＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中に見出され、図１中に示される（配列番号２）。ＮＭ＿１７５０６０由来のこのｃＤＮＡのコード領域は、ヌクレオチド３４８〜ヌクレオチド１８２０であり、これもまた、図１中に示される（配列番号３）。
【００３３】
ＣＬＥＣ１４Ａは、残基１〜２１にシグナルペプチドを有するＩ型膜貫通タンパク質である。成熟ヒトポリペプチドは、４６９アミノ酸長（アミノ酸残基２２〜４９０）であり、３７５残基の細胞外領域（残基２２〜３９６）、膜貫通領域（残基３９７〜４２５）、および細胞質領域（残基４２６〜４９０）を有する。細胞外領域は、Ｃ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７５）およびＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）を有する。
【００３４】
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤には、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの阻害剤およびＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ｃＤＮＡの阻害剤の双方が含まれる。
【００３５】
好適なＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体を含む。他の好適なＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム分子を含み、それらはＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的であり、その発現を阻止する。
【００３６】
ポリヌクレオチドＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が、直接投与可能であるか、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドの形態で投与可能であることは理解されている。したがって、ポリヌクレオチドであるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与することとは、本明細書で使用される場合、文脈上特に断りがない限り、阻害剤を直接投与する、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドを典型的にはベクターの形態で投与するという意味が含まれる。同様に、ポリヌクレオチドであるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含む薬剤または組成物には、本明細書で使用される場合、文脈上特に要求されない限り、薬剤または組成物が、阻害剤自体を含むか、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むという意味が含まれる。
【００３７】
抗体
ＣＬＥＣ１４Ａまたはその特異的部分に結合する好適な抗体は、当業者により、当該技術分野で長期にわたって確立された技術を用いて作製可能である。モノクローナル抗体および抗体断片を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年） 「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７頁）；抗体ファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年） 「Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５頁）；リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９年） 「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１９−１３５頁）；および反復コロニーフィルタスクリーニング（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら（２００１年） 「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ｆｉｌｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ２７）を含む。さらに、本発明における使用に適した抗体および抗体断片は、例えば、次の出版物、すなわち、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ．Ｚｏｌａ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、ＩＳＢＮ：０−８４９３６−４７６−０；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第１版、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２；「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年、ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４３−９；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ編、第１版、−Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、２００７年、ＩＳＢＮ：３−５２７−３１４５３−９において記載されている。
【００３８】
腫瘍血管新生を阻害するときに特に活性が高い抗体は、抗癌治療剤として好ましく、それらは、下記の当該技術分野で周知の方法を用い、この活性について選択することが可能である。
【００３９】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体については、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチド、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するよりも高い親和性で結合することを意味する。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチドに対するよりも、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチドに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。
【００４０】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体が、関連ポリペプチド、例えばトロンボモジュリンに結合しないか、または、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチド、例えばトロンボモジュリンに対するよりも高い親和性で結合することが好ましい。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチドに対するよりも、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチドに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。
【００４１】
抗体が、ＣＬＥＣ１４Ａに対して少なくとも１０−７Ｍおよびより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有する場合が好ましいが、より高い親和性、例えば１０−９Ｍ以上の値を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。
【００４２】
典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、成熟ペプチド（残基２２〜４９０）に結合し、シグナルペプチド（残基１〜２１）に結合しない。好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域（残基２２〜３９６）に結合する。抗体は、Ｃ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７５）に結合するか、またはＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）に結合する可能性がある。
【００４３】
ＣＬＥＣ１４Ａの特異的部分に選択的に結合する抗体については、抗体が、上記の標的に選択的に結合するだけでなく、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａの特異的部分に、その任意の他の部分に対するよりも高い親和性で結合することを意味する。好ましくは、抗体は、特異的部分に、ＣＬＥＣ１４Ａ上の任意の他のエピトープに対するよりも、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、特異的部分に、ＣＬＥＣ１４Ａ上の任意の他のエピトープに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。抗体が、ＣＬＥＣ１４Ａ上のその標的エピトープに対して少なくとも１０−７Ｍおよびより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有する場合が好ましいが、より高い親和性、例えば１０−９Ｍ以上の値を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａ内部の特定の特異的エピトープに選択的に結合し、その内部の任意の他のエピトープに結合しない。
【００４４】
好ましくは、抗体が個体に投与される場合、抗体は、標的ＣＬＥＣ１４Ａまたはその特異的部分に、個体内の任意の他の分子に対するよりも高い親和性で結合する。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａ（の特異的部分）に、個体内の任意の他の分子に対するよりも、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、作用剤は、ＣＬＥＣ１４Ａに（特異的ドメインに）、個体内の任意の他の分子に対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合し、身体内の他のポリペプチドに有意に結合することがない。
【００４５】
用語「抗体」または「抗体分子」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリによって生成される断片を含む。かかる断片は、標的物質に対する結合活性を保持する全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ'）およびＦ（ａｂ'）２断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質、を含む。同用語はまた、特異的ポリペプチドまたはその特定の領域に結合する分子に対するファージディスプレイ技術または他のランダム選択技術を用いて生成可能な抗体様分子を含む。したがって、抗体という用語は、天然抗体の認識部位の一部（すなわちエピトープまたは抗原に結合するかまたはそれと結合する抗体の一部）である構造、好ましくはペプチド構造を有するすべての分子を含む。さらに、抗体およびその断片は、ヒト化抗体であってもよく、それは今では当該技術分野で周知である。
【００４６】
「ＳｃＦｖ分子」については、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合された分子を意味する。改変抗体、例えばＳｃＦｖ抗体は、当該技術分野で長く知られている技術およびアプローチを用いて作製可能である。全抗体でなく抗体断片を使用する利点は、数倍に相当する。断片のサイズがより小さいことにより、改善された薬理学的特性、例えば標的部位へのより優れた浸透性が得られうる。全抗体のエフェクター機能、例えば補体結合が除外される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片はすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、またそれから分泌され、それにより、大量の断片の容易な生成が可能になる。全抗体およびＦ（ａｂ'）２断片は、「二価」である。「二価」とは、抗体およびＦ（ａｂ'）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。それに対し、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は、一価であり、抗原結合部位を１つだけ有する。
【００４７】
ＣＬＥＣ１４Ａが糖タンパク質でありうることは理解されている。したがって、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａのタンパク質または炭水化物成分の任意の組み合わせに結合しうる。
【００４８】
抗体は、標準的技術により、例えば適切な（糖）ポリペプチドまたはその一部で免疫することにより、またはファージディスプレイライブラリを使用することにより、産生されうる。
【００４９】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、所望されるエピトープを担持する、場合によって別のポリペプチドにハプテン結合された（ｈａｐｔｅｎｉｓｅｄ）免疫原性ポリペプチドで免疫される。宿主種に依存するが、様々なアジュバントを使用し、免疫応答を増強することが可能である。かかるアジュバントは、限定はされないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの天然ゲル、ならびに、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、およびジニトロフェニルなどの界面活性物質を含む。免疫動物由来の血清は、既知の手順に従い、回収され、処理される。所望されるエピトープに対するポリクローナル抗体を有する血清が、他の抗原に対する抗体を有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製されうる。ポリクローナル抗血清を産生し、処理するための技術は、当該技術分野で周知である。
【００５０】
抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号ＳＡＢ１４００８３１）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＦ４９６８およびＢＡＦ４９６８）、Ａｂｃａｍ（製品コードａｂ７３０８７）およびＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カタログ番号Ｈ００１６１１９８−Ｂ０１）から市販されている。
【００５１】
全ポリペプチドまたはその特定のエピトープに特異的なモノクローナル抗体はまた、当業者によって容易に産生されうる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的方法は、周知である。不死抗体産生細胞系は、細胞融合に加え、Ｂリンパ球と発癌性ＤＮＡとの直接形質転換またはエプスタイン−バーウイルスの形質移入などの他の技術により、作製可能である。上掲のポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体群は、様々な特性、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーニング可能である。モノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞系によって抗体分子の産生をもたらす周知の技術のいずれかを用いて調製してもよい。
【００５２】
抗体がモノクローナル抗体である場合が好ましい。いくつかの環境下では、特に抗体がヒト患者に反復投与されるべき場合、モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である場合が好ましく、それらは、ヒトへの投与に適し、投与される免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を生じさせることがない。好適に調製された非ヒト抗体は、既知の方法において、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することにより、「ヒト化」されうる。ヒト化抗体は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９、１５３４−１５３６頁およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（１９９１年） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｌ４（７）、７７３−７８３頁において記載の技術およびアプローチを用いて作製されうる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部もしくは大部分が、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応する場合の可変ドメインと、実質的または完全にヒト免疫グロブリン共通配列のそれらであるフレームワーク領域とを有することになる。
【００５３】
完全ヒト抗体は、組換え技術を用いて産生されうる。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大型ライブラリが使用される。例えばマウス抗体のキメラ化またはヒト化を用いる先行技術に対し、この技術は、特異抗体を産生するための動物の免疫に依存することがない。代わりに、組換えライブラリは、膨大な数の既製抗体変異体を含み、ここでライブラリは、任意の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体を有することになる可能性が高い。したがって、かかるライブラリを使用し、所望される結合特性を有する既存の抗体を同定することが可能である。ライブラリ中で良好な結合剤を効率的な方法で見出すため、表現型、すなわち抗体または抗体断片が、その遺伝子型、すなわちコード遺伝子に結合される場合の様々な系が考案されている。最も一般的に使用されるかかる系は、抗体断片が、繊維状ファージ粒子の表面上でのファージコートタンパク質との融合体として、発現され、提示される一方、それと同時に、提示された分子をコードする遺伝子情報を有する、いわゆるファージディスプレイ系である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁）。特定の抗原に特異的な抗体断片に対するファージディスプレイは、問題の抗原への結合を通じて選択されうる。次いで、単離されたファージは増幅され、選択された抗体の可変ドメインをコードする遺伝子は、場合により、他の抗体フォーマット、例えば完全長免疫グロブリンなどに移され、当該技術分野で周知の適切なベクターおよび宿主細胞を使用し、大量に発現されうる。あるいは、「ヒト」抗体は、本質的にヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することによって作製されうる（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９８年） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、５３５−５３９頁）。
【００５４】
抗体が非ヒト個体への投与を目的とする場合、抗体が意図されるレシピエント種に特化して設計／産生されている可能性があることは理解されている。
【００５５】
ファージ粒子上に提示される抗体特異性のフォーマットは、異なる場合がある。最も一般的に使用されるフォーマットは、Ｆａｂ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４年、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５−３２６０頁）および一本鎖（ｓｃＦｖ）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８頁）であり、双方は抗体の可変抗原結合ドメインを含む。一本鎖フォーマットは、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に柔軟なリンカーを介して連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）から構成される（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）。抗体は、治療剤として使用する前、可溶性フォーマット、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖに移し、それ自体分析することが可能である。後のステップにおいて、望ましい特性を有するものとして同定された抗体断片は、完全長抗体などのさらに他のフォーマットに移されうる。
【００５６】
国際公開第９８／３２８４５号パンフレットおよびＳｏｄｅｒｌｉｎｄら（２０００年） Ｎａｔｕｒｅ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６頁は、抗体ライブラリにおける可変性を生成するための技術について記載している。このライブラリに由来する抗体断片はすべて、同じフレームワーク領域を有し、かつそれらのＣＤＲ内で異なるにすぎない。フレームワーク領域が生殖細胞系配列であることから、ライブラリ、または同じ技術を用いて生成された類似のライブラリに由来する抗体の免疫原性は、特に低いものと想定される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、２０００年）。この特性は、治療抗体にとって非常に貴重であり、患者が投与された抗体に対する抗体を形成するリスクを低減し、それにより、アレルギー反応、ブロッキング抗体の発生に対するリスクを低減し、抗体の長い血漿半減期を可能にする。したがって、ヒトにおいて使用されるべき治療抗体を開発する場合、ここでは現行の組換えライブラリ技術（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、２００１年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．４：４０９−４１６頁）が、より初期のハイブリドーマ技術に優先して用いられる。
【００５７】
また抗体には、構造的にラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）抗体に由来する重鎖抗体、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ）が含まれる。これらは、天然重鎖抗体の構造的および機能的特性を有する、抗体由来の治療タンパク質である。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）技術は、ラクダ科（ラクダおよびリャマ）が、軽鎖が欠如した完全機能抗体を有するという発見後に開発された。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。クローン化された単離ＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を有する完全に安定なポリペプチドである。これらのＶＨＨドメイン（それら独自の構造的および機能的特性を有する）は、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の基盤を形成する。それらは、従来の抗体の利点（高い標的特異性、高い標的親和性および低い固有毒性）と、小分子薬剤の重要な特徴（酵素を阻害しかつ受容体間隙（ｃｌｅｆｔ）に接近する能力）とを組み合わせている。さらに、それらは、安定であり、注射以外の手段によって投与される可能性を有し、作製がより容易であり、ヒト化することが可能である（例えば、米国特許第５，８４０，５２６号明細書；米国特許第５，８７４，５４１号明細書；米国特許第６，００５，０７９号明細書、米国特許第６．７６５，０８７号明細書；欧州特許第１５８９１０７号明細書；国際公開第９７／３４１０３号パンフレット；国際公開第９７／４９８０５号パンフレット；米国特許第５，８００，９８８号明細書；米国特許第５，８７４，５４１号明細書および米国特許第６，０１５，６９５号明細書を参照）。
【００５８】
ｓｉＲＮＡ
小さい干渉ＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９４）：２４４−５１頁（２００２年）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１、２１頁（２００２年）；およびＳｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９、５５１５−５５２０頁（２００２年）において記載されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列がサイレント遺伝子（ｓｉｌｅｎｃｅｄ ｇｅｎｅ）に相同な二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。配列特異的なｍＲＮＡ分解のメディエーターは、典型的には、インビボでより長いｄｓＲＮＡからのリボヌクレアーゼＩＩＩの切断によって生成可能な、２１および２２ヌクレオチドの小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、内因性および異種遺伝子の双方の発現を特異的に抑制することが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１年） Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８頁）。哺乳類細胞においては、ｓｉＲＮＡは、より長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡがＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ）を活性化し、かつタンパク質合成全体を阻害することから、下記の２つの相補的な２１ｍｅｒｓからなる必要があると考えられる。
【００５９】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して選択的な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、そのｃＤＮＡ配列を参照することにより、容易に設計することが可能である。例えば、それらは、図１中に列挙される、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中のＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡ配列を参照することにより、設計可能である。
【００６０】
典型的には、イニシエーターメチオニンコドンから下流の少なくとも１２０のヌクレオチドであるＡＡジヌクレオチドから開始する最初の２１−ｍｅｒ配列が選択される。これに完全に相補的なＲＮＡ配列は、最初のＲＮＡオリゴヌクレオチドになる。２番目のＲＮＡ配列は、最初のＲＮＡ配列の最初の１９残基に対して完全に相補的であるとともに、その３’末端に追加的なＵＵジヌクレオチドを有する必要がある。合成ＲＮＡ分子は、一旦設計されると、当該技術分野で周知の方法を用いて合成することが可能である。
【００６１】
好適な抗ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡの配列は、下記に与えられる。さらに、抗ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ｓｉＲＮＡ ＩＤ番号：ｓ４６２４８、ｓ４６２４９、ｓ４６２５０、１２９８７９、１２９８８０、１２９８８１）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（オリゴＩＤ番号：ＨＳＳ１３６２３８、ＨＳＳ１７５９２５およびＨＳＳ１７５９２６）から市販されている。
【００６２】
ｓｉＲＮＡは、任意の好適な方法、例えば本明細書中に記載の方法を用いて患者内の細胞に導入してもよい。典型的には、ＲＮＡは、例えば好適な担体中または媒体中に封入されることにより、細胞外環境から保護される。リポソーム媒介性移入、例えばオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）法を用いてもよい。
【００６３】
アンチセンスポリヌクレオチド
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって選択的なアンチセンス核酸分子は、当該技術分野で既知のように、そのｃＤＮＡまたは遺伝子配列を参照することにより、容易に設計することが可能である。アンチセンス核酸、例えばオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸であり、それは相補的核酸配列に特異的に結合しうる。適切な標的配列に結合することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成される。これらの核酸は、遺伝子のセンスまたはコード鎖に対して相補的であることから、「アンチセンス」と称されることが多い。最近、三重らせんの形成は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二本鎖に結合される場合には可能であることが判明している。オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重らせんの主溝内の配列を認識しうることが見出された。三重らせんは、それによって形成された。これは、二本鎖ＤＮＡに主溝の水素結合部位の認識を介して特異的に結合する配列特異的な分子を合成することが可能であることを示唆する。上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合することにより、標的核酸の機能を阻害しうる。これは、例えば、転写、プロセシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳を遮断するか、または細胞の阻害機序を促進する、例えばＲＮＡ分解を促進する結果でありうる。
【００６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、実験室において調製され、次いで、例えばマイクロインジェクションまたは細胞培地から細胞への取り込みによって細胞に導入されるか、あるいはそれらは、アンチセンス遺伝子を有するプラスミドまたはレトロウイルスまたは他のベクターでの形質移入後、細胞内で発現される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、シミアンウイルスおよびインフルエンザウイルスにおける細胞培養液中で、ウイルス複製または発現を阻害することが発見された。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害は、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物を含む無細胞系において幅広く試験されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス性機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶレトロウイルスＲＮＡに対して相補的であったオリゴヌクレオチドを使用し、生体外で実証されている（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ．１９８８年 「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（１５）：５５０７−１１頁）。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ試験によると、最も有効であるオリゴヌクレオチドが、ポリ（Ａ）シグナルに対して相補的であり、また有効であるものが、ＲＮＡの５’末端、特にキャップおよび５Ｎ未翻訳領域（プライマー結合部位に隣接する）、およびプライマー結合部位で標的化されるものであることが示された。キャップ、５’未翻訳領域、およびポリ（Ａ）シグナルは、レトロウイルスＲＮＡの末端（Ｒ領域）で反復される配列内に位置し、またこれらに相補的なオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡに２回結合しうる。
【００６５】
典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜３５塩基長である。例えば、２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、表皮成長因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Ｗｉｔｔｅｒｓら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ５３：４１−５０頁（１９９９年））、また２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％超低下させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９１：２６１−７頁（１９９９年））。しかし、この範囲外の長さ、例えば１０、１１、１２、１３、もしくは１４塩基、または３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基を有するオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい場合があることは理解されている。
【００６６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、全身投与してもよい。あるいは、また好ましくは、塩基対合の特徴を示すポリヌクレオチドに固有の結合特異性は、ポリヌクレオチドのその意図される遺伝子座に対するインビボでの利用可能性を制限し、より少ない用量の使用を許容し、また全身性効果を最小にすることによって促進される。したがって、ポリヌクレオチドは、固形腫瘍に局所的に適用し、所望される効果を得てもよい。所望される遺伝子座でのポリヌクレオチドの濃度は、ポリヌクレオチドが全身投与された場合よりはるかに高く、また治療効果は、有意により少ない総量を用いて得られうる。局所的な高濃度のポリヌクレオチドは、標的化細胞の透過性を促進し、標的核酸配列の翻訳を有効に遮断する。
【００６７】
アンチセンス剤はまた、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡまたは遺伝子）に結合するより大きい分子を含み、かつタンパク質の発現を実質的に阻止しうることは理解されるであろう。したがって、各ｍＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス分子についても予想される。
【００６８】
同分子は、任意の好適な遺伝子コンストラクトから発現させ、患者に送達してもよい。典型的には、アンチセンス分子を発現する遺伝子コンストラクトは、細胞内でアンチセンス分子を発現しうる、プロモーターに作動可能に連結されたＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡまたは遺伝子の少なくとも一部を含む。好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適している。
【００６９】
リボザイム
リボザイムは、部位特異的な方法で核酸が切断された、ＲＮＡまたはＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する。例えば、多数のリボザイムは、高い特異度でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断することが多い。この特異性は、基質が、化学反応前に、リボザイムの内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（「ＩＧＳ」）と特異的な塩基対合相互作用を介して結合する必要性に起因している。
【００７０】
リボザイム触媒作用は、主に核酸を含む配列特異的な切断／ライゲーション反応の一部として認められている。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号明細書は、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼの場合より大きい（ＤＮＡ制限酵素の場合に近い）配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用しうることを報じている。したがって、遺伝子発現の配列特異的なリボザイム媒介性阻害は、治療用途に特に適する可能性があり、またＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的なリボザイムは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中に列挙されかつ図１中に列挙されるｃＤＮＡ配列を参照することにより、設計可能である。
【００７１】
ポリヌクレオチド阻害剤、例えばｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子およびリボザイムを患者に投与する方法および経路は、下記により詳述される。
【００７２】
また、上掲のポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子の転写を阻害するさらなる作用剤は、例えば、Ｉｓａｌａｎら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（７）：６５６−６０頁（２００１年））およびＵｒｎｏｖ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６４（５−６）：９１９頁（２００２年））に記載の改変された転写リプレッサーを用いて設計してもよい。さらに、それらは、例えば本発明の後述する態様において記載のスクリーニング方法を用いて選択してもよい。
【００７３】
調合物および投与経路
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が、典型的には、医薬組成物として、すなわち医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を伴い、個体に投与することを意図して調合されることになることは理解されている。
【００７４】
「医薬的に許容できる」には、製剤が滅菌されかつ発熱性物質が除去されていることが含まれる。好適な医薬担体、希釈剤および賦形剤は、薬学の当該技術分野で周知である。担体は、阻害剤に適合可能でありかつそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容できる」必要がある。典型的には、担体は、滅菌されかつ発熱性物質が除去される、水または生理食塩水となるが、他の許容できる担体を使用してもよい。
【００７５】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または調合物は、非経口投与、より詳細には静脈内投与を意図している。好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば注射による患者への静脈内投与に適している。
【００７６】
非経口投与に適した調合物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および調合物に対して意図されるレシピエントの血液で等張性を与える溶質を含有しうる水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含有しうる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００７７】
他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、患者への局所投与に適している。
【００７８】
好ましくは、調合物は、活性成分の、日常用量または単位、日常副用量またはその適切な画分を含有する単位用量である。
【００７９】
阻害剤は、経口的にまたは任意の非経口経路により、活性成分を含有する医薬調合物の形態で、場合により、医薬的に許容できる剤形で、非毒性の有機もしくは無機の酸または塩基、付加塩の形態で投与してもよい。処置されるべき疾患および患者ならびに投与経路に依存し、組成物は、異なる用量で投与してもよい。
【００８０】
ヒト治療においては、阻害剤は、一般に、意図される投与経路および標準の薬務との関連で選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与されることになる。
【００８１】
例えば、阻害剤は、錠剤、カプセル、オビュール（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で、経口的、口腔的または舌下的に投与してもよく、即時、遅延または制御放出用途として、香料または着色剤を含有してもよい。阻害剤はまた、陰茎海綿体内注射を介して投与してもよい。
【００８２】
好適な錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ポテトまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複雑珪酸塩などの崩壊剤、ならびに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの顆粒結合剤を含んでもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘナートおよびタルクなどの潤滑剤を含めてもよい。
【００８３】
類似タイプの固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として使用してもよい。これに関連する好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液および／またはエリキシルにおいては、本発明の化合物は、様々な甘味剤または香料、着色物質または染料、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにそれらの組み合わせと結合させてもよい。
【００８４】
阻害剤はまた、非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与してもよく、あるいは、それらは、注入技術によって投与してもよい。それらは、無菌水溶液（他の物質、例えば血液とともに等張溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含有しうる）の形態で使用するのが最適である。水溶液は、必要があれば、好適に緩衝化される必要がある（好ましくは３〜９のｐＨ）。無菌条件下での好適な非経口調合物の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に行われる。
【００８５】
調合物は、単回投与または複数回投与容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルで提示してもよく、また、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥条件下で保存してもよい。即時注射溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【００８６】
ヒト患者への経口および非経口投与においては、阻害剤の日常用量レベルは通常、成人１名あたり１〜１，０００ｍｇ（すなわち約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回または分割用量で投与されることになる。
【００８７】
したがって、例えば、阻害剤の錠剤またはカプセルは、必要に応じて、一度に１回または２回以上の投与に対し、１ｍｇ〜１，０００ｍｇの活性剤を含有してもよい。医師は、いずれの場合でも、任意の個別の患者に最適となる実用量を決定することになり、またそれは特定の患者の年齢、体重および応答に応じて変化することになる。上記用量は、平均的症例に典型的なものである。当然のことながら、用量範囲の拡大または縮小に値する個別例があってもよく、それらは本発明の範囲内に含まれる。
【００８８】
阻害剤はまた、鼻腔内にまたは吸入により、投与してもよく、また、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素または他の好適な気体の使用とともに、圧力容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器から、乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレー提示の形態で便益的に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計られた量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。圧力容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えば溶媒としてエタノールと推進剤の混合物を使用し、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、それはさらに、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエートを含有してもよい。吸入剤または吸入器における用途としてのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、抗体とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するように調合してもよい。かかる調合物は、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸膜肺芽腫またはカルシノイド腫瘍などの肺の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００８９】
エアロゾルまたは乾燥粉末調合物は、好ましくは、計られた各用量または「パフ（ｐｕｆｆ）」が患者への送達用に少なくとも１ｍｇの阻害剤を含有するように準備される。エアロゾルを伴う全日常用量が、患者間で変化することになり、単回用量、またはより通常には、１日を通して分割用量で投与可能であることは理解されるであろう。
【００９０】
あるいは、阻害剤は、特に、結腸、直腸または前立腺腫瘍を処置または標的化するため、坐剤またはペッサリーの形態で投与してもよい。
【００９１】
阻害剤はまた、眼内経路によって投与してもよい。眼科使用においては、阻害剤は、場合により、塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの防腐剤と組み合わせて、例えば、等張、ｐＨ調整、無菌の生理食塩水中の微粒化（ｍｉｃｒｏｎｉｓｅｄ）懸濁液として、または、好ましくは、等張、ｐＨ調整、無菌の生理食塩水中の溶液として調合してもよい。あるいは、それは、ワセリンなどの軟膏で調合してもよい。かかる調合物は、眼の固形腫瘍、例えば、網膜芽腫、髄様上皮腫、ブドウ膜メラノーマ、横紋筋肉腫、眼内悪性リンパ腫、または眼窩リンパ腫を処置するのに特に有用でありうる。
【００９２】
阻害剤は、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で、局所に適用してもよく、または、例えば皮膚パッチの使用により、経皮的に投与してもよい。皮膚への局所適用においては、阻害剤は、例えば、次のもの、すなわち、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水、のうちの１つもしくは複数との混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として調合してもよい。あるいは、それは、例えば、次のもの、すなわち、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水、のうちの１つもしくは複数との混合物中に懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして調合してもよい。かかる調合物は、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌またはメラノーマなどの皮膚の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００９３】
皮膚癌に対しては、阻害剤はまた、エレクトロインコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＥＩ）によって送達してもよい。ＥＩは、皮膚の表面上の直径が最大３０ミクロンの小さい粒子が、エレクトロポレーションにおいて使用される場合と同一または類似の電気パルスを受ける場合に行われる。ＥＩでは、これらの粒子は、角質層を貫通するように、また皮膚のより深い層に向けて駆動される。粒子は、阻害剤で負荷またはコートされるか、または単に、阻害剤が侵入しうる皮膚内に孔を作る「銃弾」として作用しうる。
【００９４】
口腔内への局所投与に適した調合物は、風味付けした基剤（ｆｌａｖｏｕｒｅｄ ｂａｓｉｓ）、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントの中に活性成分を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアの中に活性成分を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；ならびに、好適な液体担体中に活性成分を含むマウスウォッシュ、を含む。かかる調合物は、口腔および咽頭の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００９５】
一実施形態では、阻害剤がポリペプチド、例えば抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体である場合、それは注射可能な徐放薬剤送達システムを使用して送達してもよい。これらは、注射の頻度を低減することに特化して設計される。かかるシステムの例として、組換えヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｒｈＧＨ）を分解性ミクロスフェアの中にカプセル化するＮｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔが挙げられ、それは、一旦注射されると、ｒｈＧＨを持続時間にわたって徐放する。
【００９６】
抗体は、薬剤を必要とされる部位、例えば眼に直接放出し、眼内腫瘍を処置する、外科的移植装置（ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）によって投与してもよい。疾患の部位へのかかる直接適用により、有意な全身性副作用を伴わない有効な治療がなされる。
【００９７】
ポリペプチド阻害剤、例えば抗体を送達するための他の方法が、感熱性のＲｅＧｅｌ注射可能システムである。ＲｅＧｅｌは、体温未満では、注射可能な液体である一方、体温では、徐々に浸食され、既知の安全な生分解性ポリマーに溶解するゲルリザーバ（ｇｅｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を直ちに形成する。活性薬剤は、生体高分子が溶解するにつれて、徐々に送達される。
【００９８】
抗体などのポリペプチド薬剤はまた、経口的に送達してもよい。同プロセスは、タンパク質およびペプチドを同時送達する、体内へのビタミンＢ１２の経口摂取における天然プロセスを利用する。タンパク質またはペプチドは、ビタミンＢ１２摂取系に乗ることにより、腸壁を通過しうる。複合体は、ビタミンＢ１２類似体と薬剤との間で合成され、それにより、複合体のビタミンＢ１２部分における内因性因子（ＩＦ）に対する有意な親和性と複合体の薬剤部分の有意な生物活性との双方が保持される。
【００９９】
ポリヌクレオチドは、任意の有効な方法、例えば、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）あるいは経口、経鼻またはポリヌクレオチドが患者の血流に接近し、その中を循環することを可能にする他の手段により、投与してもよい。全身投与されるポリヌクレオチドは、好ましくは、局所投与されるポリヌクレオチドに加えて与えられるが、局所投与の不在下でも有用性を有する。ヒト成人に対する１回の投与あたり約０．１〜約１０ｇの範囲内の用量は、一般に、この目的にとって有効となる。
【０１００】
ポリヌクレオチドは、それが発現される場合、患者に、下記のような好適な遺伝子コンストラクトとして投与し、送達してもよい。典型的には、遺伝子コンストラクト内のポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されることで、細胞内で化合物が発現されうる。本発明の遺伝子コンストラクトは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）における当該技術分野で周知の方法を用いて調製してもよい。
【０１０１】
ポリヌクレオチドの送達用の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうるが、それらがＤＮＡである場合が好ましい。
【０１０２】
好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適合する。
【０１０３】
遺伝子コンストラクトを動物体内の細胞に導入する手段および方法は、当該技術分野で既知である。例えば、本発明のコンストラクトは、任意の便益的な方法、例えばレトロウイルスを含む方法により、コンストラクトが細胞のゲノムに挿入されるように、細胞に導入してもよい。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａら（１９９１年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ．Ａｎｄ Ｆｕｎｃ．１６、５０３−５１０頁）においては、精製レトロウイルスが投与される。上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスＤＮＡコンストラクトは、当該技術分野で周知の方法を用いて作成してもよい。かかるコンストラクトから活性レトロウイルスを生成するため、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長されたエコトロピック性のｐｓｉ２パッケージング細胞系を使用することが一般的である。細胞系の形質移入は、便益的にリン酸カルシウム共沈によって行われ、かつ安定な形質転換体は、Ｇ４１８を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで添加することによって（レトロウイルスコンストラクトがｎｅｏＲ遺伝子を有することを仮定）選択される。独立コロニーは、単離され、展開され、培養上清が除去され、孔サイズが０．４５μｍのフィルタを通して濾過され、−７０℃で保存される。例えば、レトロウイルスの腫瘍細胞への導入においては、１０μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅが添加されているレトロウイルス上清を直接注射することが便益的である。直径が１０ｍｍを超える腫瘍においては、０．１ｍｌ〜１ｍｌの間、好ましくは０．５ｍｌのレトロウイルス上清を注射することが適切である。
【０１０４】
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、１５５０−１５５２頁）に記載のように、レトロウイルスを生成する細胞に注射してもよい。そのように導入されたレトロウイルス生成細胞を改変することで、レトロウイルスベクター粒子が活発に生成され、それにより、ベクターの連続的生成が原位置で腫瘤内部で行われる。
【０１０５】
標的化されるレトロウイルスはまた、本発明における使用において利用可能であり、例えば、特異的結合親和性を与える配列は、既存のウイルスｅｎｖ遺伝子に改変してもよい（遺伝子治療用のこの標的化ベクターと他の標的化ベクターのレビューについては、ＭｉｌｌｅｒおよびＶｉｌｅ（１９９５年） Ｆａｓｅｂ Ｊ．９、１９０−１９９頁を参照）。
【０１０６】
他の方法は、限定された期間か、または、ゲノムへの組込み後にはより長期間の、コンストラクトの細胞へのその中での発現のための単純な送達を含む。後者のアプローチの例として、リポソームが挙げられる（Ｎａｅｓｓａｎｄｅｒら（１９９２年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２、６４６−６５３頁）。
【０１０７】
他の送達方法は、抗体−ポリリシン架橋を介して外部ＤＮＡを有するアデノウイルス（Ｃｕｒｉｅｌ（１９９３年） Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０、１−１８頁を参照）および担体としてのトランスフェリン−ポリカチオン複合体（Ｗａｇｎｅｒら（１９９０年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、３４１０−３４１４頁）を含む。これらの方法の前者では、ポリカチオン−抗体複合体は、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトとともに形成され、ここで抗体は、抗体に結合する新しいエピトープが導入されている野生型アデノウイルスまたは変異体アデノウイルスのいずれかに特異的である。ポリカチオン部分は、リン酸塩骨格との静電相互作用を介してＤＮＡに結合する。アデノウイルスは、改変されていない線維およびペントンタンパク質を有することから、細胞に内在化され、細胞内にそれとともに本発明のＤＮＡコンストラクトを運ぶ。ポリカチオンがポリリシンである場合が好ましい。
【０１０８】
他の方法では、受容体媒介性エンドサイトーシスを利用し、ＤＮＡ高分子を細胞に運ぶ高効率核酸送達システムが用いられる。これは、鉄輸送タンパク質トランスフェリンを核酸に結合するポリカチオンに複合することによって行われる。ヒトトランスフェリン、またはニワトリの相同体コンアルブミン、またはそれらの組み合わせは、小さいＤＮＡ結合タンパク質のプロタミンまたは様々なサイズのポリリシンとジスルフィド結合を介して共有結合される。これらの修飾トランスフェリン分子は、それらの同種受容体に結合し、細胞への効率的な鉄輸送を媒介するそれらの能力を維持する。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸サイズと独立に、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトと電気泳動的に安定な複合体を形成する（短いオリゴヌクレオチドから２１キロ塩基対のＤＮＡまで）。トランスフェリン−ポリカチオンと本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトとの複合体は、腫瘍細胞に供給され、細胞内でのコンストラクトからの高レベルの発現が予想される。
【０１０９】
また、Ｃｏｔｔｅｎら（１９９２年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、６０９４−６０９８頁の方法によって生成される、欠陥があるかまたは化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いる、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトの高効率受容体媒介性送達を使用してもよい。このアプローチは、アデノウイルスが、それらのＤＮＡがリソソームを通過することなく、また例えば本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトに連結されたトランスフェリンの存在下でエンドソームから放出できるように適合され、コンストラクトが、アデノウイルス粒子と同じ経路により、細胞によって取り込まれるという事実に依存するように見られる。このアプローチは、複合体レトロウイルスコンストラクトを使用する必要がなく、レトロウイルス感染の場合に生じるようなゲノムの永続的修飾が全く生じることなく、また、標的化発現システムを標的化送達システムと共役させることで、他の細胞種に対する毒性が低下する、という利点を有する。
【０１１０】
「裸ＤＮＡ」ならびにカチオンおよび中性脂質と複合体が形成されたＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡを、処置されるべき個体の細胞に導入する上で有用でありうることは理解されるであろう。遺伝子治療に対する非ウイルスアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６、１１２９−１１４４頁）中に記載されている。
【０１１１】
特定の組織の固形腫瘍において、ポリヌクレオチド阻害剤をコードするベクター内で組織特異的プロモーターを使用することは有用でありうるが、これは本質的ではない。これは、標的化遺伝子が、腫瘍内皮において、単に発現されるか、または選択的に発現されるためである。したがって、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子およびリボザイムなど、ＣＬＥＣ１４Ａに特異的な阻害剤の、身体内の固形腫瘍以外の位置での発現であれば、ＣＬＥＣ１４Ａが発現されないかまたは比較的低いレベルで発現されることから、全く効果を有しないことが想定されることになる。さらに、標的ポリペプチドを低いレベルで発現しうる細胞内での、これらの阻害剤の不適切な発現のリスクは、固形腫瘍を患う患者に対する治療効果に比べて極めて少ない。
【０１１２】
また、標的化送達システム、例えば、典型的には、国際公開第９４／１０３２３号パンフレット中に記載の、ＤＮＡがアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子内部に運ばれる、修飾されたアデノウイルス系は既知である。Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９５年） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８頁では、細胞の選択部分を線維タンパク質に加えるというアデノウイルスの修飾についての記載がある。例えば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６頁において記載の、ｐ５３欠損ヒト腫瘍細胞内で選択的に複製する突然変異体アデノウイルスはまた、遺伝子コンストラクトを細胞に送達するのに有用である。他の好適なウイルス、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子は、レンチウイルスおよびレンチウイルスベクター、ＨＳＶ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびＡＡＶに基づくベクター、ワクチニアおよびパルボウイルス、を含む。
【０１１３】
ポリヌクレオチドを患者に送達する方法は、当業者に周知であり、免疫リポゾーム、ウイルスベクター（ワクチニア、修飾ワクチニア、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）の使用や、例えば遺伝子銃およびエレクトロポレーションを使用する、ＤＮＡの直接送達によるものを含む。さらに、処置のため、ポリヌクレオチドを患者の標的組織に送達する方法はまた、当該技術分野で周知である。
【０１１４】
治療剤を標的化し、それを身体の特異的領域に直接送達する方法は、当業者に周知である。
【０１１５】
例えば、米国特許第６，５０３，２４２号明細書は、治療剤を海馬に直接送達するための植込み型（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）カテーテル装置について記載している。作用剤を標的化し、それを脳に送達する方法は、脳の固形腫瘍の処置において使用してもよい。一実施形態では、ベクターを含む治療剤は、脳脊髄液への注射、例えば腰椎穿刺により、ＣＮＳの広範な領域全体に分布させてもよい（例えば、Ｋａｐａｄｉａら（１９９６年） Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０：５８５−５８７頁を参照）。あるいは、治療剤の脳の特異的部位への正確な送達は、定位マイクロインジェクション技術を用いて行ってもよい。例えば、処置されている対象は、定位フレームベース（ＭＲＩ互換性）内に置いて、次いで高分解能ＭＲＩを使用して画像化し、処置されるべき特異的領域の三次元位置を判定することが可能である。次いで、ＭＲＩ画像は、適切な定位ソフトウェアを有するコンピュータに移してもよく、多数の画像を使用し、治療剤のマイクロインジェクションにおける標的部位および軌跡が判定される。ソフトウェアは、軌道を、定位フレームとして正確に登録された三次元座標に翻訳する。頭蓋内送達の場合、頭蓋骨が露出され、穿頭孔が挿入部位上にドリル穿孔され、定位装置を使用し、針が位置決めされ、所定の深さでの注入が確認されることになる。治療剤は、ＣＮＳの領域、例えば、海馬、脊髄の細胞、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内部、後頭部、側頭部、頭頂部または前頭葉）、またはそれらの組み合わせに送達してもよい。別の実施形態では、治療剤は、局所的送達、例えば血液脳関門の局所的透過に適した他の送達方法を用いて送達される。米国特許出願公開第２００５／００２５７４６号明細書は、治療剤をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）ベクターの脳の特異的領域への局所的送達のための送達システムについて記載している。
【０１１６】
例えば、脳の固形腫瘍の処置用の治療剤がポリヌクレオチドによってコードされる場合、その発現が好適な組織特異的プロモーターの制御下にあることが好ましい場合がある。中枢神経系（ＣＮＳ）に特異的なプロモーター、例えば、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター（ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７頁）およびグリア特異的プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５：１８５−１９１頁）は、好ましくは、ポリヌクレオチドの発現を優先的にＣＮＳの細胞内で駆動するために使用される。好ましくは、プロモーターは、組織特異的であり、かつ中枢神経系外部では本質的に活性を示さないか、あるいはプロモーターの活性は、中枢神経系においては、他の細胞または組織内より高い。例えば、プロモーターは、脊髄、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内部、後頭部、側頭部、頭頂部または前頭葉）、またはそれらの組み合わせに対して特異的でありうる。プロモーターは、特定の細胞種、例えばＣＮＳにおけるニューロンまたはグリア細胞に対して特異的でありうる。それがグリア細胞内で活性を示す場合、それは、星状細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、またはミクログリアに対して特異的でありうる。それがニューロン内で活性を示す場合、それは、ニューロンの特定種、例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、または介在ニューロンに対して特異的でありうる。プロモーターは、脳の特定の領域、例えば、皮質、線条体（ｓｔｒａｔｉｕｍ）、黒質および海馬における細胞に対して特異的でありうる。
【０１１７】
好適なニューロン特異的プロモーターは、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；Ｏｌｉｖｉａら（１９９１年） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：１５７−１６５頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ５１９５６）、およびヒトニューロフィラメント軽鎖プロモーター（ＮＥＦＬ；Ｒｏｇａｅｖら（１９９２年） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：７８１頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ０４１４７）を含む。グリア特異的プロモーターは、限定はされないが、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６５２１０）、Ｓ１００プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６５２１０）およびグルタミンシンターゼプロモーター（Ｖａｎ ｄｅｎら（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２：２４９−２５１頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ５９８３４）を含む。好ましい実施形態では、遺伝子は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターにより、上流（すなわち５'側）に隣接される。別の好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、伸長因子１α（ＥＦ）プロモーターにより、上流（すなわち５'側）に隣接される。使用可能と思われる海馬特異的プロモーターは、海馬特異的グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子プロモーターである。
【０１１８】
あるいは、心臓の固形腫瘍の処置においては、Ｓｖｅｎｓｓｏｎら（１９９９年）が、組換え遺伝子の心筋細胞への、心臓作用性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ）ベクター、例えば組換えアデノ随伴ウイルスベクターの心筋内注射または冠動脈内注入による送達により、インビボでのマウス心筋細胞内でのトランス遺伝子の発現をもたらすことについて記載している（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら（１９９９年） 「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．」 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９９：２０１−５頁）。Ｍｅｌｏらは、心疾患に対する遺伝子および細胞に基づく治療についてレビューしている（Ｍｅｌｏら（２００４年） 「Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．」 ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８（６）：６４８−６３頁）。他の好ましい投与経路は、カテーテルまたはステントを介するものである。ステントは、持続的な遺伝子溶出および反対側の動脈壁での効率的な形質導入におけるプラットフォームを提供することから、局所的遺伝子送達における魅力的な選択肢を表す。この遺伝子送達方法は、ウイルスベクターの全身浸潤を低下させる可能性、ひいては低下した宿主免疫応答を有する。合成および天然ステントコーティングの双方は、持続的な遺伝子溶出を可能にし、それに伴う有害反応が全く有意でないという可能性を示している（Ｓｈａｒｉｆら（２００４年） 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃａｔｈｅｔｅｒ−ａｎｄ ｓｔｅｎｔ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．」 Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．６４（２）：２０８−１６頁）。
【０１１９】
細胞内でのポリヌクレオチド阻害剤の発現を一時的に調節できることが望ましい場合があるが、これは上で与えられる理由として本質的なことではない。したがって、ポリヌクレオチドの発現が、直接的または間接的に（下記参照）、例えば患者に投与可能な小分子の濃度によって調節可能なプロモーターの制御下にあることが望ましい場合があり、その場合、ポリヌクレオチドからの抗体の発現を（小分子が前記プロモーターの活性化または抑制を有効にするか否かに依存して）活性化するどころか抑制することが所望される。これは、発現コンストラクトが、安定である、すなわち、少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月または１年以上の期間、細胞内での（任意の必要な調節分子の存在下で）阻害剤の発現能を有する場合、特に有益でありうる。したがって、ポリヌクレオチドは、調節可能なプロモーターに作動可能に連結してもよい。調節可能なプロモーターの例として、次の論文、すなわち、Ｒｉｖｅｒａら（１９９９年） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９６（１５）、８６５７−６２頁（２つの別々のアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（一方は誘導性ヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｈＧＨ）標的遺伝子をコードし、他方は二分されたラパマイシン調節転写因子をコードする）を使用する、経口的に生物が利用可能な薬剤のラパマイシンによる制御）；Ｍａｇａｒｉら（１９９７年） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（１１）、２８６５−７２頁（ラパマイシンによる制御）；Ｂｕｅｌｅｒ（１９９９年） Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３８０（６）、６１３−２２頁（アデノ随伴ウイルスベクターに関するレビュー）；Ｂｏｈｌら（１９９８年） Ｂｌｏｏｄ ９２（５）、１５１２−７頁（アデノ随伴ベクター内のドキシサイクリンによる制御）；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら（１９９６年） Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ７４（７）、３７９−９２頁（誘導因子、例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、放射線照射、熱ショックおよび関連の応答因子に関するレビュー）において言及されたものが挙げられる。
【０１２０】
獣医学用途においては、阻害剤は、典型的には、通常の獣医学臨床に従う好適に許容できる調合物として投与され、獣医は、特定の動物にとって最適なものとなる投与計画および投与経路を決定することになる。
【０１２１】
併用療法
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００５年４月１４日付、２００５年６月１６日更新）（「Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｗｉｔｈ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」）によると、血管新生阻害剤の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブは、標準の化学療法と併用して投与される場合、多数の固形腫瘍における臨床転帰を改善する。用いられている併用は、ベバシズマブとイリノテカン、フルオロウラシル、およびロイコボリンとの併用；ベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ４（オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンのレジメン）との併用；ベバシズマブとパクリタキセルとの併用；ならびにベバシズマブとパクリタキセルおよびカルボプラチンとの併用、を含む。
【０１２２】
したがって、上記のＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、任意の他の抗癌化合物の不在下で臨床的に有効でありうるが、これらの阻害剤をさらなる抗癌剤と並行投与することが有利でありうることは理解されている。
【０１２３】
したがって、一実施形態では、本方法はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を個体に投与するステップを含んでもよい。本方法は、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤およびさらなる抗癌剤を含有する医薬組成物を個体に投与するステップを含んでもよい。しかし、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤およびさらなる抗癌剤が、別々に、例えば別々の投与経路によって投与可能であることは理解されている。したがって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤および少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、連続的または（実質的に）同時に投与可能であることは理解されている。それらは同じ医薬製剤または薬剤の中で投与してもよく、あるいはそれらは別々に調合し、投与してもよい。
【０１２４】
医学用途の一実施形態では、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を含んでもよい。
【０１２５】
医学用途の別の実施形態では、処置されるべき個体は、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が投与される個体であってもよい。個体は、さらなる抗癌剤を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤と同時に投与されうるが、個体は、さらなる抗癌剤を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤を受ける前（または受けた後）に投与されている場合がある（または投与されることになる）ことは理解されている。
【０１２６】
さらなる抗癌剤は、アルキル化剤、例えば、窒素マスタード、例えば、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシル；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、例えばヘキサメチルメラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、チオテパ；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；およびトリアゼン、例えばデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾール−カルボキサミド）；代謝拮抗剤、メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含む；ピリミジン類似体、例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）；ならびにプリン類似体および関連阻害剤、例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）；ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドを含む天然生成物；エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；およびインターフェロンアルフェノーム（ａｌｐｈｅｎｏｍｅｓ）などの生物学的応答調節物質；シスプラチン（シス−ＤＤＰ）およびカルボプラチンなどの白金配位複合体を含む種々雑多な製剤（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ ａｇｅｎｔ）；ミトキサントロンおよびアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；ならびにミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）；タクソールおよび類似体／誘導体；細胞周期阻害剤；Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））などのプロテアソーム阻害剤；シグナルトランスダクターゼ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔａｓｅ）（例えばチロシンキナーゼ）阻害剤、例えば、Ｉｍａｔｉｎｉｂ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ＣＯＸ−２阻害剤、ならびにホルモン作動薬／拮抗薬、例えばフルタミドおよびタモキシフェン、から選択してもよい。
【０１２７】
臨床的に使用される抗癌剤は、典型的には、作用機序によって分類され、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、ＤＮＡ代謝拮抗剤および抗有糸分裂剤が挙げられる。米国ＮＩＨ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトは、１２２の化合物を挙げており（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｅａｒｃｈｅｓ／ｓｔａｎｄａｒｄ＿ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ｈｔｍｌ）、それら全部を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤と併用してもよい。それらは、アルキル化剤、例えば、アサリー（Ａｓａｌｅｙ）、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、カルボキシフタラート白金（ｃａｒｂｏｘｙｐｈｔｈａｌａｔｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シス−白金、クロメソン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドーパ、ヘプスルファム、ヒカントン、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド（ｍｉｔｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、窒素マスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポプロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、ピコプラチン（ＳＰ−４−３）（シス−アミンジクロロ（２−メチルピリジン）Ｐｔ（ＩＩ））、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシル窒素マスタード、ヨシ（Ｙｏｓｈｉ）−８６４；抗有糸分裂剤（ａｎｉｔｍｉｔｏｔｉｃ）、例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、タクソール、タクソール誘導体、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン、カンプトテシン、Ｎａ塩、アミノカンプトテシン、２０のカンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、アモナファイド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール（ｏｘａｎｔｈｒａｚｏｌｅ）、ルビダゾン、ＶＭ−２６、ＶＰ−１６；ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、例えば、Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、アシビシン、３つのアミノプテリン誘導体、アンチフォル（ａｎｔｉｆｏｌ）、可溶性ベーカーズアンチフォル（Ｂａｋｅｒ'ｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｆｏｌ）、ジクロロアリルローソン（ｄｉｃｈｌｏｒａｌｌｙｌ ｌａｗｓｏｎｅ）、ブレキナル、フトラフル（プロドラッグ）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、ピラゾフリン、トリメトレキサート；ＤＮＡ代謝拮抗剤、例えば、３−ＨＰ、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−ＨＰ、α−ＴＧＤＲ、アフィジコリングリシナート、アラ−Ｃ、５−アザ−２'−デオキシシチジン、β−ＴＧＤＲ、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシ尿素、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾロイミダゾール、チオグアニンおよびチオプリン、を含む。
【０１２８】
しかし、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、シスプラチン；カルボプラチン；ピコプラチン；５−フルオロウラシル；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トミュデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン；ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチンから選択されることは好ましい。
【０１２９】
さらなる抗癌剤が、特定の腫瘍タイプに対して特に有効であることが示されている場合、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤をそのさらなる抗癌剤と併用し、特定の腫瘍タイプを処置することが好ましい場合がある。
【０１３０】
細胞毒性剤の標的化送達
より選択的な、ひいてはより優れた抗癌剤の開発に向けた手段の一つは、生物活性分子の、腫瘍内皮マーカーに特異的な分子（例えばヒト抗体）に結合することによる、腫瘍環境への標的化送達である。それらの利用可能性およびそれらが可能にする治療オプション（例えば腔内血液凝固または免疫細胞の動員）に起因し、腫瘍血管上に選択的に発現される血管マーカーは、理想的にはリガンドに基づく腫瘍標的化方法に適合し、腫瘍血管新生のイメージングおよび腫瘍血管新生に対する細胞毒性剤の標的化が可能になる。
【０１３１】
したがって、本発明の第２の態様は、細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化する方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１３２】
本発明のこの態様はまた、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体と、（ｉｉ）細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化するための、薬剤の調製における細胞毒性部分と、を含む化合物の使用を提供する。この態様は、細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化する上での使用を意図したかかる化合物をさらに提供する。
【０１３３】
典型的には、細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子、から選択される。かかる細胞毒性部分、ならびに抗体および細胞毒性部分を含む複合体を作製する方法の例は、出願人らが以前に公表した国際公開第０２／３６７７１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）において提供されている。
【０１３４】
細胞毒性部分は、新生血管における細胞あるいは新生血管に極めて接近し、それに関連する細胞に対して直接的または間接的に毒性を示しうる。「直接的に細胞毒性を示す」には、同部分がそれ自体で細胞毒性を示す部分であるという意味が含まれる。「間接的な細胞毒性」には、同部分が、それ自体で細胞毒性を示さないが、例えばさらなる分子に対するその活性によるかまたはそれに対するさらなる活性により、細胞毒性を誘発しうる部分であるという意味が含まれる。
【０１３５】
一実施形態では、細胞毒性部分は、細胞毒性化学療法剤である。細胞毒性化学療法剤は、当該技術分野で周知である。細胞毒性化学療法剤、例えば抗癌剤は、本明細書中に列挙されるものを含む。
【０１３６】
様々なこれらの細胞毒性部分、例えば細胞毒性化学療法剤は、予め抗体および他の標的化剤に結合されており、それにより、これらの作用剤を含む本発明の化合物は、当業者によって容易に作製可能である。例えば、カルボジイミド複合（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ（１９８０年） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０、１５１−１５９頁）を用い、ドキソルビシンを含む種々の作用剤を抗体に複合してもよい。また、細胞毒性部分を抗体に複合するための他の方法を用いてもよい。例えば、グルタルアルデヒド架橋が使用可能であるように、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化とその後の適切な反応物の還元的アルキル化を用いてもよい。ポリペプチドを架橋する方法は、当該技術分野で既知であり、国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレット中に記載されている。しかし、それとは無関係に、本発明の化合物を生成する方法が選択され、抗体がその標的化能を維持し、かつ結合部分がその関連機能を維持しているという判定がなされる必要があることが理解されている。
【０１３７】
本発明のさらなる実施形態では、細胞毒性部分は、細胞死をもたらす任意の部分が含まれる細胞毒性ペプチドまたはポリペプチド部分であってもよい。細胞毒性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当該技術分野で周知であり、例えば、リシン、アブリン、緑膿菌外毒素、組織因子などを含む。それらを抗体などの標的化部分に結合するための方法はまた、当該技術分野で既知である。細胞毒性剤としてのリシンの使用は、ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９３年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０、８９９６−９０００頁において記載されており、また、局所的血液凝固および腫瘍の梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ｒａｎら（１９９８年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、４６４６−４６５３頁およびＨｕａｎｇら（１９９７年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、５４７−５５０頁によって記載されている。Ｔｓａｉら（１９９５年） Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３８、１０６７−１０７４頁は、モノクローナル抗体に複合されたアブリンＡ鎖について記載している。タンパク質を不活性化する他のリボソームは、細胞毒性剤として、国際公開第９６／０６６４１号パンフレット中に記載されている。緑膿菌外毒素はまた、細胞毒性ポリペプチド部分として使用可能である（Ａｉｅｌｌｏら（１９９５年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２、１０４５７−１０４６１頁）。
【０１３８】
特定のサイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＮＦγおよびＩＬ−２もまた、細胞毒性剤として有用でありうる。
【０１３９】
特定の放射性原子もまた、十分な用量で送達される場合、細胞毒性を示しうる。したがって、細胞毒性部分は、使用時に、細胞毒性を示すように十分な量の放射能を標的部位に送達する放射性原子を含んでもよい。好適な放射性原子は、リン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、レニウム−１８６、レニウム−１８８またはイットリウム−９０、または、十分なエネルギーを放射し、近隣の細胞、オルガネラまたは核酸を破壊する任意の他の同位体、を含む。好ましくは、本発明の化合物中の放射性原子の同位体および密度は、４０００ｃＧｙより大きい（好ましくは少なくとも６０００、８０００もしくは１００００ｃＧｙ）放射線量が、標的部位、好ましくは標的部位の細胞およびそのオルガネラ、特に核に送達される程度である。
【０１４０】
放射性原子は、既知の方法で抗体に結合してもよい。例えば、ＥＤＴＡまたは別のキレート剤は、抗体に結合させ、またそれを使用し、１１１Ｉｎまたは９０Ｙに結合させてもよい。チロシン残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識してもよい。
【０１４１】
細胞毒性部分は、放射線増感剤であってもよい。放射線増感剤は、フロロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、３−アミノベンズアミド、３−アミノベンゾジアミド（ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｍｉｄｅ）、エタニクサドール（ｅｔａｎｉｘａｄｏｌｅ）、ピモニダゾールおよびミソニダゾール、を含む（例えば、ＭｃＧｉｎｎら（１９９６年）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８、１１９３−１１２０３頁；ＳｈｅｗａｃｈおよびＬａｗｒｅｎｃｅ（１９９６年） Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １４、２５７−２６３頁；Ｈｏｒｓｍａｎ（１９９５年） Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３４、５７１−５８７頁；ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ（１９９２年） Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０、５３３−５５１頁；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．５６、８２７−８３６頁；ＩｌｉａｋｉｓおよびＫｕｒｔｚｍａｎ（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、１２３５−１２４１頁；Ｂｒｏｗｎ（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、９８７−９９３頁；Ｂｒｏｗｎ（１９８５年） Ｃａｎｃｅｒ ５５、２２２２−２２２８頁を参照）。
【０１４２】
細胞毒性部分は、凝血促進因子、例えば組織因子の細胞外ドメインであってもよい（Ｒｉｐｐｍａｎｎら（２０００年） 「Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｔｏ ａ ｔｕｍｏｕｒ ｓｔｒｏｍａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．」 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３４９：８０５−１２頁；Ｈｕａｎｇら（１９９７年） 「Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５（５２９９頁）：５４７−５５０頁）。
【０１４３】
細胞毒性部分は、間接的な細胞毒性ポリペプチドであってもよい。特に好ましい実施形態では、間接的な細胞毒性ポリペプチドは、酵素活性を有し、比較的非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬に変換可能なポリペプチドである。標的化部分が抗体である場合、この種の系は、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）と称されることが多い。同系は、標的化部分が酵素部分を患者の身体内の所望される部位（例えば腫瘍に関連した新しい血管組織の部位）に位置づけ、酵素が同部位に局在化されるだけの時間が経過後、酵素に対する基質であるプロドラッグを投与し、触媒作用の最終産物が細胞毒性化合物であることを必要とする。同アプローチの目的は、所望される部位での薬剤の濃度を最大化し、正常組織内での薬剤の濃度を最小化することであり（Ｓｅｎｔｅｒら（１９８８年） 「Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、４８４２−４８４６頁；Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９８７年） Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６、５３１−２頁；およびＢａｇｓｈａｗｅら（１９８８年） 「Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｉｔｅｓ」 Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．５８、７００−７０３頁）、また、Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９９５年） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３４、２２０−２３０頁および国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレットは、本発明との関連で好適でありうる様々な酵素／プロドラッグの併用について記載している。
【０１４４】
典型的には、プロドラッグは、細胞毒性薬に比べて、比較的非毒性である。典型的には、それは、好適なインビトロ細胞毒性試験における測定によると、１０％未満の毒性、好ましくは１％未満の毒性を有する。
【０１４５】
プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な同部分は、化合物の残りから単離される際、活性を示す可能性が高いが、あくまで、（ａ）それが化合物の残りと組み合わされ、かつ（ｂ）化合物が標的細胞に結合され、近接され、その中に内在化される場合にそれが活性を示すことが必要である。
【０１４６】
さらなる部分は、放射線照射時、細胞毒性を示すようになるかまたは細胞毒性部分を放出するものであってもよい。例えば、ホウ素−１０同位体は、適切に照射される場合、細胞毒性を示すα粒子を放出する（米国特許第４，３４８，３７６号明細書；Ｐｒｉｍｕｓら（１９９６年） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：５３２−５３５頁）。
【０１４７】
同様に、細胞毒性部分は、フォトフリンなど、光線力学的療法において有用なものであってもよい（例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８年） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９０、８８９−９０５頁を参照）。
【０１４８】
処置されるべき個体、固形腫瘍のタイプ、投与経路、抗体などに対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上で規定される通りである。
【０１４９】
細胞毒性剤の腫瘍血管新生への標的化が、腫瘍血管新生を阻害するように作用することになることは理解されている。したがって、本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に関連し、上で規定されるように、個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。この第３の態様はまた、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製における、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用を提供する。この態様は、個体における腫瘍血管新生を阻害する上での使用を意図したかかる化合物をさらに提供する。処置されるべき個体、固形腫瘍のタイプ、投与経路、抗体などに対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上で規定される通りである。
【０１５０】
また、本発明の第２および第３の態様に記載のように、細胞毒性部分を腫瘍血管新生に対して標的化し、腫瘍血管新生を阻害することが、任意の他の抗癌化合物の不在下で臨床的に有効でありうるが、化合物をさらなる抗癌剤と並行投与することが有利でありうることは理解されている。したがって、本発明の第２および第３の態様の一実施形態では、本方法は、個体にさらなる抗癌剤を投与するステップを含んでもよい。投与されるべきさらなる抗癌剤に対する選好は、上記の通りである。（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物とさらなる抗癌剤とは、これらの両成分を含有する医薬組成物の形態で投与してもよい。しかし、化合物およびさらなる抗癌剤が、例えば別々の投与経路により、別々に投与可能であることは理解されている。したがって、化合物および少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、別々にまたは（実質的に）同時に投与可能であることは理解されている。それらは、同じ医薬製剤または薬剤の中で投与してもよく、あるいはそれらは別々に調合し、投与してもよい。
【０１５１】
腫瘍のイメージング、検出および診断
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、検出可能な部分に結合される場合、イメージング、例えば腫瘍の血管イメージングにおいて有用でありうる。腫瘍の血管イメージングにおいて有用な方法および化合物は、出願人らが以前に公表した国際公開第０２／３６７７１号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）において記載されている。
【０１５２】
上で規定された抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体および検出可能な部分を含む化合物は、適切な検出方法と併用し、個体における化合物の位置を検出し、それによって個体における腫瘍血管新生の部位および範囲を同定してもよい。
【０１５３】
したがって、本発明の第４の態様は、個体の身体における腫瘍血管新生をイメージングする方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を個体に投与するステップと、身体における検出可能な部分をイメージングするステップと、を含む、方法を提供する。
【０１５４】
一実施形態では、本方法は、個体における化合物の位置を検出するステップをさらに含んでもよい。
【０１５５】
「検出可能な部分」には、同部分が、本発明の化合物の患者への投与後に標的部位に位置づけられる場合、典型的には身体および位置づけられた標的の部位の外部から非侵襲的に検出されうるものであるという意味が含まれる。したがって、本発明のこの態様の化合物は、イメージングおよび診断、特に固形腫瘍の血管新生のイメージングおよび診断において有用である。
【０１５６】
典型的には、検出可能な部分は、磁気ナノ粒子、放射性核種またはフルオロフォアであるかまたはそれらを含む。
【０１５７】
したがって、一実施形態では、検出可能な部分は、イメージングにおいて有用な放射性原子であってもよい。好適な放射性原子は、シンチグラフィー試験におけるテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３を含む。他の容易に検出可能な部分は、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）におけるスピン標識、例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含む。明らかに、本発明の化合物は、分子が検出可能であるように、十分な適切な原子同位体を有する必要がある。
【０１５８】
放射線標識または他の標識は、既知の方法で化合物に取り込んでもよい。例えば、抗体が、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成により、生合成または合成できる場合である。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、抗体におけるシステイン残基を介して結合させてもよい。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合させてもよい。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９−５７頁）を使用し、ヨウ素−１２３を取り込んでもよい。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）は、他の方法について詳述している。
【０１５９】
多くの好適なフルオロフォアおよび検出方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｔｅｆａｎ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓら（１９９７年） 「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．」 Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４２：８１５−８２４頁；Ａｌｔｉｎｏｇｌｕら（２００８年） 「Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−Ｄｏｐｅｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」 ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２（１０）：２０７５−８４頁；およびＣｈｉｎら（２００９年） 「Ｉｎ−ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｈｌｏｒｉｎ ｅ６−ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」 ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ９：１（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２３４２−９−１）により、記載されている。
【０１６０】
典型的には、個体は、固形腫瘍、好ましくは本発明の第１の態様に関連する上記のものなどを有し、固形腫瘍の血管新生は画像化される。したがって、身体における特定の器官での抗体の局在化は、個体が、その器官に固形腫瘍を有するかまたは発生させている可能性があることを示す。この方法は、例えば、過去に診断された固形腫瘍のサイズを判定するか、固形腫瘍に対する治療の有効性を判定するか、または腫瘍の転移の範囲を判定する上で有用でありうる。身体における検出可能な部分を画像化するための方法は、当該技術分野で周知であり、ＰＥＴ（ポジトロンエミッショントモグラフィー）を含む。
【０１６１】
したがって、本発明のこの態様は、個体における固形腫瘍を検出、診断または予測する方法であって、
（ｉ）ポリペプチドＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を個体に投与するステップと、
身体における検出可能な部分の存在および／または位置を検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【０１６２】
抗体、化合物および検出可能な部分に対する選好は、上記の通りである。
【０１６３】
他の血管新生条件
出願人らの知る限りにおいては、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生の阻害剤であることがかつて示唆されたことはない。また、血管新生の阻害が、腫瘍以外の血管新生疾患または症状を処置する上で有用でありうることは理解されるであろう。したがって、本発明の第５の態様に従い、処置を必要とする個体における血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法が提供される。
【０１６４】
腫瘍以外では、血管新生の阻害はまた、不要な、望ましくないまたは不適切な血管新生を含む任意の疾患または症状と闘う上で有用でありうる。かかる症状は、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、を含む。したがって、本発明のこの態様は、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を、それを必要とする個体に投与することによる、これらの疾患または症状を処置する方法を含む。本発明はまた、これらの疾患または症状を処置するための、薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用を提供する。これらの疾患および症状は、望ましくない血管新生形成に関連し、典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、これを有効な範囲まで低減する。
【０１６５】
「血管新生を阻害する」には、血管新生の速度またはレベルを低下させるという意味が含まれる。低下は、血管新生の速度またはレベルの約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％といった低レベルの低下であってもよい。好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％の低下といった中間レベルの低下である。より好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９９％、もしくは約９９．９％、もしくは約９９．９９％といった高レベルの低下である。最も好ましくは、阻害はまた、血管新生の除去または検出不能なレベルまでのその低下を含んでもよい。血管新生の速度またはレベルを測定する、ひいてはＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生を阻害するか否かとその範囲の程度を判定するための方法およびアッセイは、当該技術分野で既知であり、本明細書中に記載される。
【０１６６】
療法（治療）は、ヒトまたは動物が対象であってもよい。好ましくは、本発明の方法を使用することで、ヒトが処置される。
【０１６７】
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤、調合物および投与経路などに対する選好は、上で規定される通りである。
【０１６８】
生体外方法
本発明の第６の態様は、血管新生を阻害する生体外方法であって、生体外でＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を組織または細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。典型的には、血管新生を阻害するこの生体外方法は、血管新生アッセイとの関連でまたは腫瘍血管新生のモデルにおいて、例えば下記のように実施される。したがって、細胞は、個体から取り出されている腫瘍細胞系または腫瘍細胞で確立してもよい。組織または細胞は、好ましくは哺乳類組織または細胞、および最も好ましくはヒト組織または細胞である。好ましくは、組織または細胞は、腫瘍内皮を含むか、または腫瘍内皮のモデルである。ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤に対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上記の通りである。
【０１６９】
好適な血管新生アッセイは、内皮細胞の増殖、移動および浸潤に対するアッセイを含み、また、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）製のカタログ番号３５４１４１および３５４１４２として利用可能なＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎを含む。腫瘍血管新生の好適なモデルは、腫瘍内皮細胞の移動、例えば腫瘍内皮細胞のｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘発性の移動、増殖、および腫瘍内皮細胞の浸潤に対するアッセイ、ならびに大動脈輪アッセイを含む。
【０１７０】
スクリーニング
本発明の第７の態様は、固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤、または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
ポリペプチドＣＬＥＣ１４Ａまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
候補化合物を血管新生アッセイにおいて試験するステップと、
を含み、ここで、アッセイにおける血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤であるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物であってもよい、方法を提供する。
【０１７１】
一実施形態では、本方法は、候補化合物がＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に選択的に結合するか否かを判定する、先行するステップをさらに含む。
【０１７２】
これらの方法を用い、抗癌剤でありうる抗血管新生因子を同定することが可能であることは理解されている。
【０１７３】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、図１中に列挙される配列（配列番号１）を有するポリペプチドおよびその天然変異体が含まれる。結合アッセイにおいては、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド配列に対して１００％の配列同一性を有するポリペプチドを使用する必要がない（完全長ポリペプチドまたはその断片の全体にわたるか否かにかかわらず）ことは理解されている。したがって、本発明のこの態様では、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａ配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを使用することは可能である（完全長ポリペプチドまたはその断片にわたるか否かにかかわらず）。変異体ポリペプチドが、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの配列の、少なくとも２０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０残基の連続領域を有する場合が好ましい。かかる変異体は、例えば、当該技術分野で周知の、組換えＤＮＡ技術、タンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作製してもよい。
【０１７４】
２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータプログラム、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定してもよく、パーセント同一性が、配列が最適に整列されているポリペプチドに関連して計算されることは理解されるであろう。アラインメントは、あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４年） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２、４６７３−８０頁）を使用して実行してもよい。使用されるパラメータは、以下の通りである。すなわち、Ｆａｓｔペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上方対角線の数；５、スコアリング法：ｘパーセント。多重アラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１７５】
また、候補化合物が特異的ポリペプチドに結合するか否かを判定するのに、結合アッセイにおいて必ずしも完全長ポリペプチド全体を使用する必要がなく、かつポリペプチドの断片を有効に使用することが可能であることは理解されている。好ましくは、断片は、少なくとも２０アミノ酸残基長であり、２０〜５０の間の残基長または５０〜１００の間の残基長または１００〜１５０の間の残基長または１５０〜２００の間の残基長、またはそれ以上であってもよい。断片が成熟ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの細胞外ドメインの断片であるか、または断片がそれを有することが好ましい。
【０１７６】
一実施形態では、候補化合物は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片であってもよい。好適な抗体は、上記のものである。
【０１７７】
別の実施形態では、候補化合物は、ペプチドであってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適なペプチドは、ペプチドライブラリのファージディスプレイ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０年） 「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０頁；Ｆｅｌｉｃｉら（１９９５年） 「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．」 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９−１８３頁）；およびＣｏｌｌｉｎｓら（２００１年） 「Ｃｏｓｍｉｘ−ｐｌｅｘｉｎｇ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３１７−３３８頁）；例えばインビボパニング（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９７年） 「αｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６頁）、および固相パラレル合成（Ｆｒａｎｋ（２００２年） 「Ｔｈｅ ＳＰＯＴ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：１３−２６頁；ならびにＰｉｎｉｌｌａら（２００３年） 「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１１８−１２２頁）などの方法によって同定してもよい。ペプチドの解離定数は、典型的にはマイクロモルの範囲内にあるが、親和性は、多量体化によって改善されうる（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７年） 「“Ｐｅｐｔａｂｏｄｙ”：ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１６６３−１６６８頁；およびＷｒｉｇｈｔｏｎら（１９９７年） 「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１２６１−１２６５頁）。
【０１７８】
Ｃ型レクチンの一次リガンドは、たとえ他のタンパク質、脂質または無機化合物への結合が示されていても、炭水化物である。したがって、別の実施形態では、候補化合物は、炭水化物、または糖タンパク質もしくは糖脂質などの炭水化物部分を有する分子であってもよい。Ｃ型レクチンによる炭水化物の認識および結合がカルシウム依存性であることは理解されている。したがって、この実施形態では、本方法は、カルシウムイオンの存在下で実施される。
【０１７９】
さらに別の実施形態では、候補化合物は、アプタマー、すなわち特異的リガンド結合構造に折りたたまれた一本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適なアプタマーは、インビトロ選択および増幅などの方法によって同定してもよい（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９２年） 「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｆｏｌｄ ｉｎｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２頁；およびＤａｎｉｅｌｓら（２００３年） 「Ａ ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ ａｐｔａｍｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００、１５４１６−１５４２１頁）。アプタマーは、ヌクレアーゼ安定性を示す「シュピーゲルマー」であってもよい（Ｈｅｌｍｌｉｎｇら（２００４年） 「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ａｎ ＲＮＡ−Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１３１７４−１３１７９頁）。アプタマーは、典型的には、マイクロモルからサブナノモルの範囲内にある解離定数を有する。
【０１８０】
さらに別の実施形態では、候補化合物は、小さい有機分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適な小分子は、化合物の大ライブラリのスクリーニング（Ｂｅｃｋ−ＳｉｃｋｉｎｇｅｒおよびＷｅｂｅｒ（２００１年） 「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）；核磁気共鳴による構造−活性関係による（Ｓｈｕｋｅｒら（１９９６年） 「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ ｂｙ ＮＭＲ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５３１−１５３４頁）；コード化された自己集合の化学ライブラリＭｅｌｋｋｏら（２００４年） 「Ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８−５７４頁）；ＤＮＡ鋳型化学（Ｇａｒｔｎｅｒら（２００４年） 「ＤＮＡ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１６０１−１６０５頁）；動的コンビナトリアル化学（ＲａｍｓｔｒｏｍおよびＬｅｈｎ（２００２年） 「Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６−３６頁）；連結（ＡｒｋｉｎおよびＷｅｌｌｓ（２００４年） 「Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｒｅａｍ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１−３１７頁）；ならびにスピードスクリーン（ｓｐｅｅｄ ｓｃｒｅｅｎ）（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌら（２００４年） 「ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｏｒｐｈａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ．」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１−２４９頁）などの方法によって同定してもよい。典型的には、小さい有機分子は、ナノモル範囲内のポリペプチドに対する、特に空洞（ｃａｖｉｔｙ）を有する抗原に対する解離定数を有することになる。最小の有機分子結合剤の利点として、それらの作製しやすさ、免疫原性の欠如、組織分布特性、化学修飾方法および経口バイオアベイラビリティが挙げられる。
【０１８１】
候補化合物が、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片と結合または相互作用する能力は、下でさらに考察されるように、タンパク質／タンパク質相互作用または他の化合物／タンパク質相互作用を検出／測定する任意の方法によって測定してもよい。好適な方法は、例えば、酵母ツーハイブリッド相互作用、同時精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降および表面プラスモン共鳴法などの方法を含む。したがって、候補化合物とポリペプチドまたはその断片との間の相互作用が、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降または表面プラスモン共鳴法、あるいは酵母ツーハイブリッド相互作用または同時精製方法によって検出可能である場合、候補化合物は、ポリペプチドまたはその断片に結合する能力があると考えることができる。同相互作用が表面プラスモン共鳴法を用いて検出できることは好ましい。表面プラスモン共鳴法は、当業者に周知である。例えば、技術は、Ｏ'Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ Ｄ．Ｊ．（１９９４年） 「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒａｔｅ ａｎｄ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ ｃｒｉｔｉｑｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（１）：６５−７１頁；Ｆｉｖａｓｈら（１９９８年） 「ＢＩＡｃｏｒｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：９７−１０１頁；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ（１９９９年） 「ＢＩＡＣＯＲＥ：ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．」 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２７（２）：３３５−４０頁において記載されている。
【０１８２】
高スループット処理が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことは理解されている。例として、細胞に基づくアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイを含んでもよい。ＳＰＡに基づく（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）システムを使用してもよい。例えば、タンパク質キナーゼの活性を調節可能な化合物を同定するためのアッセイは、次のように実施してもよい。シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を含むビーズおよびリン酸化可能な基質ポリペプチドは、調製可能である。ビーズは、タンパク質キナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含む試料と、また試験化合物と混合してもよい。便宜上、これは、マルチウェル（例えば、９６または３８４）フォーマットで行われる。次いで、プレートは、３２Ｐまたは３３Ｐ ＳＰＡアッセイにおける既知のパラメータを用いる好適なシンチレーションカウンタを使用し、計数される。シンチラントに接近している３２Ｐまたは３３Ｐのみ、すなわちポリペプチドに結合されたそれのみが検出される。また、例えば、ポリペプチドがシンチラントビーズ上に抗体または抗体断片への結合を介して固定される場合、かかるアッセイの変異体を使用してもよい。
【０１８３】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法は、限界濾過とともにイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理的分析法を含む。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）法を使用してもよく、ここでは、２つの蛍光標識された実体の結合が、互いに近接している場合に蛍光標識の相互作用を測定することによって測定可能である。
【０１８４】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合可能な化合物を同定するさらなる方法が、ポリペプチドが化合物に暴露され、かつ化合物の前記ポリペプチドへの任意の結合が検出され、および／または測定される場合の方法である。化合物のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの結合における結合定数が測定されうる。化合物のポリペプチドへの結合を検出し、および／または測定（定量）するための好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、高スループット処理が可能な方法、例えばチップに基づく方法を用いて実施してもよい。ＶＬＳＩＰＳ（商標）と称される技術により、数十万以上の異なる分子プローブを有する極小チップの生成が可能になっている。これらの生物学的チップまたはアレイは、アレイ内に配列されたプローブを有し、各プローブは特定の位置に割り当てられる。生物学的チップは、各位置が例えば１０ミクロンの規模を有するように生成されている。チップを使用し、標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するか否かを判定することが可能である。アレイを選択された試験条件下で標的分子に暴露した後、走査デバイスにより、アレイ内の各位置を検査し、標的分子がその位置でのプローブと相互作用しているか否かを判定することができる。
【０１８５】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する候補化合物の同定が、薬剤スクリーニング経路における最初のステップでありえ、また同定された化合物は、例えば血管新生に対する阻害能についてさらに選別されうることは理解されている。
【０１８６】
「血管新生を阻害する」には、血管新生の速度またはレベルを低下させるという意味が含まれる。低下は、血管新生の速度またはレベルの約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％といった低レベルの低下であってもよい。好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％の低下といった中間レベルの低下である。より好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９９％、もしくは約９９．９％、もしくは約９９．９９％といった高レベルの低下である。最も好ましくは、阻害はまた、血管新生の除去または検出不能なレベルまでのその低下を含んでもよい。
【０１８７】
血管新生の速度またはレベルを測定する、ひいては試験化合物が血管新生を阻害するか否かとその範囲の程度を判定するための方法およびアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，２２５，１１８号明細書（参照により本明細書中に援用される）は、血管新生の複合的（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ステージ、すなわち細胞発生の増殖、移動および分化ステージをモデル化するための多細胞生体外アッセイ（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｓｓａｙ）について記載している。ＴＣＳ ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ Ｌｔｄ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ ＭＫ１８ ２ＬＲ，ＵＫ）によるＡｎｇｉｏＫｉｔ（カタログ番号ＺＨＡ−１０００）は、化合物の抗血管新生特性を分析するためのヒト血管新生の好適なモデルである。血管新生の速度またはレベルはまた、当該技術分野で周知の大動脈輪アッセイおよびスポンジ血管新生アッセイを用いて測定してもよい。
【０１８８】
また、内皮細胞の増殖、移動および浸潤についてのアッセイは、血管新生アッセイとして有用である。内皮細胞の増殖および移動に適したアッセイは、当業者に既知であり、本明細書中に記載される。内皮細胞の浸潤に適したアッセイもまた、当業者に既知であり、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）製、カタログ番号３５４１４１および３５４１４２として利用可能）を含む。
【０１８９】
発明者はまた、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する候補化合物が、腫瘍内皮細胞の移動、例えばｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘発性の移動を阻害し、阻害する腫瘍内皮細胞の増殖、あるいは腫瘍内皮細胞の浸潤を阻害しうることについて考察している。したがって、ＨＵＶＥＣ移動アッセイにおいて阻害活性を示すか、または抗増殖活性を示すか、または、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））などのアッセイにおいて抗浸潤活性を示す候補化合物は、固形腫瘍と闘う上で治療的に有用でありえ、ここで腫瘍内皮細胞の移動、増殖または浸潤は、新血管系の血管新生ひいては固形腫瘍の病理学に寄与する。
【０１９０】
これらの方法が、当業者に周知の用語である薬剤スクリーニング方法であってもよく、候補化合物が、薬様化合物または薬様化合物の開発のためのリード化合物であってもよいことは理解されている。
【０１９１】
用語「薬様化合物」は、当業者に周知であり、薬剤用途として、例えば薬剤中の活性成分として適合させる特性を有する化合物の意味を含んでもよい。したがって、例えば、薬様化合物は、有機化学の技術、優先度は下がるが分子生物学または生化学の技術によって合成可能な分子であってもよく、好ましくは小分子であり、それは、５０００ダルトン未満であってもよく、また水溶性であってもよい。さらに、薬様化合物は、特定の１つもしくは複数のタンパク質との選択的相互作用に加え、バイオアベイラビリティが高く、および／または、標的細胞膜または血液脳関門を貫通できるという特徴を示しうるが、これらの特徴が本質的なものでないことは理解されるであろう。
【０１９２】
用語「リード化合物」は、同様に当業者に周知であり、化合物が、それ自体で薬剤としての使用に適しない（例えば、それは、その意図される標的に対する効力が弱いか、その活性において非選択的であるか、不安定であるか、溶解性が低いか、合成が困難であるか、または低いバイオアベイラビリティを有するに過ぎない）一方、より望ましい特性を有しうる他の化合物を設計するための出発点を提供しうるという意味を含んでもよい。
【０１９３】
一実施形態では、同定された化合物は、修飾され、また修飾された化合物は、血管新生に対する阻害能について試験される。血管新生の阻害に適したアッセイは、上記のものである。
【０１９４】
本スクリーニング方法を使用し、固形腫瘍と闘う上で有用でありうる作用剤を同定できることは理解されている。したがって、本スクリーニング方法はまた、好ましくは、同定された化合物または修飾された化合物を、癌、特に固形腫瘍の動物モデルにおける有効性について試験するさらなるステップを含む。好適なモデルは、当該技術分野で既知であり、マウスにおけるＬｅｗｉｓ肺癌皮下移植（Ｂｌａｃｋ５７マウスにおける同種移植）またはヌードマウスにおけるＨＴ２９異種移植片の皮下移植を含む。
【０１９５】
本発明は、同定された化合物または修飾された化合物を合成および／または（ａｎ／ｏｒ）精製するさらなるステップを含んでもよい。本発明は、化合物を医薬的に許容できる組成物に調合するステップをさらに含んでもよい。
【０１９６】
化合物はまた、当業者に周知のように、他の試験、例えば毒物または代謝試験を受けてもよい。
【０１９７】
したがって、本発明は、固形腫瘍の処置において有用でありうる抗癌剤を調製するための方法であって、化合物を上記のスクリーニング方法を用いて同定するステップと、同定された化合物を合成し、精製し、および／または、調合するステップと、を含む方法を含む。
【０１９８】
本発明はまた、医薬組成物を作製する方法であって、同定された化合物を、上記の方法を用い、医薬的に許容できる担体と混合するステップを含む、方法を含む。
【０１９９】
本明細書で言及されるすべての文書は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０２００】
本明細書中の明らかに先行的に公表された文書に関する列挙または考察は、必ずしも、文書が最先端技術の一部であるかまたは共通の一般的知識であることの確認として解釈されるべきではない。
【０２０１】
ここで、本発明は、以下の実施例および図面を参照することにより、より詳述されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１Ａ】Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０由来のヒトＣＬＥＣ１４Ａのポリペプチド配列（配列番号１）
【図１Ｂ】Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０由来のヒトＣＬＥＣ１４ＡのｃＤＮＡ（配列番号２）
【図１Ｃ】ＮＭ＿１７５０６０の位置３４８〜１８２０由来のヒトＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡのコード領域（配列番号３）
【図２】ＨＵＶＥＣおよび他の一次細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対的発現を示すグラフ。ＣＬＥＣ１４Ａは、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において特異的に発現され、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）、ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）、肝細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において特異的に発現されなかった。
【図３】ゼブラフィッシュ胚の受精後２４時間以内のＣＬＥＣ１４Ａオルソログのインサイチュハイブリダイゼーション。ゼブラフィッシュＣＬＥＣ１４Ａオルソログは、背部大動脈、主静脈、および体節間血管（ｉｎｔｅｒ−ｓｏｍｉｔｉｃ ｖｅｓｓｅｌ）において発現される。
【図４】ＣＨＯ細胞内での完全長ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体のライブ蛍光イメージング。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体は、細胞膜に局在化し、糸状仮足および微小突起に集結し、同じパターンがＨＵＶＥＣ内に認められる。
【図５】コンフルエントなＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現およびＶＥ−カドヘリンとの共局在化の共焦点イメージング。ＣＬＥＣ１４Ａは、細胞間結合部で発現され、ＶＥ−カドヘリンと共局在化する。
【図６】ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンのウエスタンブロット。二本鎖１は、配列ＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡ（配列番号４）を有し、二本鎖２は、配列ＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号５）を有する。「スクランブルされた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈから入手し、配列が示されない非標的化ｓｉＲＮＡから構成される。未グリコシル化ポリペプチドは約６０ｋＤａ、また成熟グリコシル化タンパク質は約１００ｋＤａで認められる。
【図７】ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンの共焦点イメージングであり、ＶＥ−カドヘリンの発現に対して全く効果を有しない。
【図８Ａ】ｓｉＲＮＡノックダウンを伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、２つのＳｉＲＮＡ二本鎖によるＣＬＥＣ１４Ａのノックダウン後における傷口閉鎖（ｗｏｕｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ）の遅延を示す。
【図８Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図９Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体を伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、やはり傷口閉鎖の遅延を示す。
【図９Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図１０】せん断応力および静的条件下でのＨＵＶＥＣのリアルタイムＰＣＲ。ＲＯＢＯ４およびＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡの双方は、層流せん断応力（２Ｐａ）下で下方制御される。
【図１１】ヒト卵巣、膀胱、肝臓および乳房腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１２】ヒト結腸、直腸および膀胱（２通りの）腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１３】ヒト食道、腎臓および肺腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１４】ヒト前立腺、胃、膵臓および甲状腺腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１５】正常なヒトの脳、心臓および腎組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された正常な組織のいずれにおいても検出されなかった。
【図１６Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体ＣＲＴ−３を伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、傷口閉鎖の遅延を示す。
【図１６Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図１７Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体ＣＲＴ−２を伴うＳＥＮＤスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、傷口閉鎖の遅延を示す。
【図１７Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【実施例】
【０２０３】
実施例１：ＣＬＥＣ１４Ａに対する実験的研究
目的
発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現および機能を特徴づけるための多くの実験を行った。
【０２０４】
材料および方法
ＨＵＶＥＣの調製および培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ドナーのインフォームドコンセントを得た後にＵＫ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅによって提供されたへその緒から単離した。へその緒を胎盤から切除し、静脈を無菌ＰＢＳで洗浄し、血液を除去した。Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）で希釈した１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを、静脈に注射し、次いで３７℃で２０分間インキュベートし、内皮細胞を分離した。ＨＵＶＥＣを、１０％ＦＣＳ、１０％大血管内皮細胞成長添加物（ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓ）、および４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＭ１９９完全培地での洗浄によって採取し、ブタ皮膚（Ｓｉｇｍａ）でコートされたディッシュ由来の０．１％タイプ１ゼラチン上にプレーティングした。
【０２０５】
一次細胞の供給源
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）を、ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓから購入した。ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）を、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから得た。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た。肝細胞は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｄａｖｉｄ Ａｄａｍｓ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から贈呈された。
【０２０６】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）使用し、培養液中の一次細胞から単離した後、提供されたランダムプライマーを有するＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ｃＤＮＡ合成を行った。ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ リアルタイム ＰＣＲアッセイ系（Ｅｘｉｑｏｎ）を、ＣＬＥＣ１４Ａの発現の一次細胞スクリーニングにおいて使用した。フロチリン２をハウスキーピング遺伝子として選択し、それに対し、ＣＬＥＣ１４Ａの発現を正規化した。ＣＬＥＣ１４Ａおよびフロチリン２に対するプライマーおよびプローブセットを、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）によって設計した。ＣＬＥＣ１４Ａに対するプライマーおよびプローブセットは、
５’−ＣＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号６）、および
５’−ＣＧＣＧＡＴＧＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号７）（プローブ番号２４を伴う）
であった。
【０２０７】
フロチリン２に対するプライマーおよびプローブセットは、
５’−ＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号８）、および
５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＴＣＡＴＡＡＴＣＴ−３’（配列番号９）（プローブ番号２８を伴う）
であった。
【０２０８】
定量ＰＣＲ反応を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ３０００サーマルサイクラー（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で行った。反応混合物を、各一次細胞種に対して３通りに調製し、５ｎｇのｃＤＮＡを各反応に適用した。倍率変化を、ΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【０２０９】
ゼブラフィッシュのインサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ
ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（ＮＭ＿１９９７８６．１、ｚｇｃ：６６４３９）ｃＤＮＡのゼブラフィッシュオルソログを、ｚＣｌｅｃ１４Ａプライマー：
フォワード：５’−ＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１０）、および
リバース：５’−ＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１１）
を使用し、受精後２４時間（ｈｐｆ）のｃＤＮＡ調製物から増幅した。
【０２１０】
これらのプライマーによって生成した１１７２ｂｐのＰＣＲ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者のプロトコルに従い、クローン化した。ｚＣｌｅｃ１４Ａクローンを配列決定し、その同一性を検証した。インサイチュハイブリダイゼーション用のジゴキシゲニンで標識したセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブを、ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、インビトロ転写によって生成した。センスプローブを生成するため、プラスミドをＫｐｎＩで線状化し、Ｔ７で転写した。プラスミドをＸｈｏＩで線状化し、ＳＰ６で転写することにより、アンチセンスプローブが生成された。インサイチュハイブリダイゼーションを、ＴｈｉｓｓｅおよびＴｈｉｓｓｅ（２００８年） 「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｔｏ ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ．」 Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：５９−６９頁の方法に従って行った。
【０２１１】
ｚＣＬＥＣ１４Ａの発現の一時的パターンを分析するため、ゼブラフィッシュ発生の様々なステージから得られるＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムヘキサマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して調製した。ＺＣｌｅｃ１４Ａを、次の条件（Ｔｍ５５℃、２６サイクル）およびｚＣｌｅｃ１４Ａプライマー：
フォワード：５’−ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号１２）、および
リバース：５’−ＡＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１３）
を使用して増幅した。
【０２１２】
伸長因子−１α（ＥＦ１α）を負荷対照として使用し、次のＥＦ１αプライマー（ＴｈｉｓｓｅおよびＴｈｉｓｓｅ（２００８年））：
フォワード：５’−ＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１４）、および
リバース：５’−ＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１５）
を使用して増幅した。
【０２１３】
ＨＵＶＥＣ免疫蛍光
ＨＵＶＥＣを、氷冷メタノール中に固定したガラス製マイクロウェルチャンバー（Ｎｕｎｃ）内で成長させ、ＰＢＳＴ中１０％ＦＣＳ３％ＢＳＡでブロッキングしたＰＢＳＴで洗浄した。次いで、細胞を、パラフィン包埋切片用に使用されるのと同じプロトコルに従い、ＣＬＥＣ１４Ａ抗体で染色するか、または、親切にもＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｍａｒｉａ Ｇｒａｚｉａ Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ（Ｆｉｒｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｍｉｌａｎ）により贈呈された、ヒトＶＥ−カドヘリンに対する５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナルＩｇＧ抗体で同時染色した。切片染色を、５１０レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【０２１４】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合およびＣＨＯ細胞の形質移入
ＰＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ６ベクター内の完全長ＣＬＥＣ１４Ａを、ＭＧＣから購入した。配列を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、次いでｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。１０５個のＣＨＯ細胞を、１０％ＦＣＳおよび４ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプレーティングし、培養した。播種の４８時間後、サブコンフルエントな（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞を、６：１の比で、Ｆｕｇｅｎｅ６（ＲＯＣＨＥ）を使用し、完全長ＣＬＥＣ１４Ａを有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１で形質移入した。形質移入混合物を、細胞培養物に２４時間かけて添加し、次いで無血清ＤＭＥＭと交換した。細胞を、形質移入の７２時間後、Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ ２ Ｐｌｕｓライブ蛍光顕微鏡システム（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析し、画像を、Ａｘｉｏｃｏｍカラーカメラ（Ｚｅｉｓｓ）で取得した。
【０２１５】
ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡの設計およびＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａサイレンシング
２．５×１０５個のＨＵＶＥＣを、形質移入の前日、６つのウェルプレートに播種した。ＣＬＥＣ１４Ａに対する２つの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖、ＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡ（二本鎖１、配列番号４）およびＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡ（二本鎖２、配列番号５）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈ）を使用し、また陰性対照二本鎖と並行して使用した。形質移入を、０．３％リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｏｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１０ｎＭ二本鎖を使用して行った。正常なＭ１９９完全培地と交換する前、形質移入混合物を、細胞とともに４時間インキュベートした。細胞を形質移入の４８時間後に使用し、タンパク質発現のノックダウンをウエスタンブロッティングによって評価した。タンパク質を、ＮＰ４０溶解緩衝液を使用して単離し、ＢｉｏＲａｄ Ｄｃタンパク質アッセイを用い、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って定量した。各レーンにおいて等量のタンパク質を負荷し、ＳＤＳ ＰＡＧＥを介して分離した。タンパク質を、ニトロセルロース膜上に移し、０．２ｎｇ／ｍｌのヒツジＣＬＥＣ１４Ａ ＩｇＧ抗ヒトポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および０．２μｇ／ｍｌのＨＲＰ複合化ウサギポリクローナル抗ヒツジ二次抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してプローブした。同じブロットを、１ｎｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗チューブリン一次抗体および１μｇ／ｍｌのヤギポリクローナル抗マウスＨＲＰ複合二次抗体でプローブした。
【０２１６】
ｓｉＲＮＡを用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
２．５×１０５個のＨＵＶＥＣを、形質移入の前日、６つのウェルプレートに播種した。形質移入の４８時間後、２０μｌのピペットチップでスクラッチした。ＨＵＶＥＣの化学運動性移動（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、８、１２および２４時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セル（ｃｅｌｌ）ＩＱアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
【０２１７】
ＣＬＥＣ１４Ａ抗血清を用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
コンフルエントなＨＵＶＥＣに対し、２０μｌのピペットチップでスクラッチした。５、１０および２０μｇ／ｍｌのＣＬＥＣ１４Ａ抗血清を含有する新しい培地を交換した。ＨＵＶＥＣの化学運動性移動を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、８、１２および２４時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セルＩＱアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
【０２１８】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体を用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
コンフルエントなＨＵＶＥＣまたはマウス内皮細胞系ＳＥＮＤの細胞に対し、１０μｌのピペットチップでスクラッチした。マウスにおいてＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対して産生された１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのモノクローナルＣＬＥＣ１４Ａ抗体を含有する新しい培地を適用した。ＨＵＶＥＣまたはＳＥＮＤ細胞の化学運動性移動を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、６、１２時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて定量した。
【０２１９】
フローアッセイ
ＨＵＶＥＣの一次培養物を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で解離し、予めコラーゲン／ゼラチンでコートした長方形のガラス毛細管（マイクロスライド；内部幅３ｍｍ、深さ０．３ｍｍ）に播種した。播種は、２４時間以内にコンフルエントな単層を生成する密度であった。播種後、マイクロスライドを、特別に設けられたガラス皿に置いて、予め壁に融合されたガラス管に取り付けた。シリコンゴム管（Ｔｙｇｏｎ Ｒ１０００；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を、各外部アームに接続した。ディッシュは培地を有し、それを加湿ＣＯ２インキュベーター（Ｎｕａｉｒｅ ＤＨ；Ｔｒｉｐｌｅ Ｒｅｄ，Ｔｈａｍｅ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）内に置いた。チューブは、インキュベーター壁内のポートを通した。２つの隣接するアーム（マイクロスライドに取り付けたものと空のもの）からのチューブを、接続し、マルチチャンネルの８ローラーポンプ（モデル５０２Ｓ；Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ Ｌｔｄ．）に入れ、連続流ループを形成した。ポンプチューブの内径およびポンプ速度を選択し、流速（７．７６ｍｌ／分）を送り、マイクロスライドにおいて２．０Ｐａ（＝２０ｄｙｎ／ｃｍ２）の壁せん断応力が得られた。ポンプおよび外部チューブをパースペクスボックス内に入れ、サーモスタットで３７℃に制御した。各ディッシュ内の別々のマイクロスライドからのチューブを、別々のポンプに接続した。これにより、マイクロスライドを通して少量の培地を１時間に１回、３０秒間ポンピングし、「静的」条件下での持続的な成長を可能にした。ＨＵＶＥＣを、静的条件下で２４時間培養し、次いで２．０Ｐａのせん断応力に２４時間さらした。各ディッシュ内の静的条件下およびフロー条件下のマイクロスライドのペアを、同一の再循環培地に同時間さらした。
【０２２０】
パラフィン包埋組織に対する免疫蛍光
免疫蛍光を、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫの組織学サービス（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｓｅｒｖｉｃｅ）から得たパラフィン包埋された正常および癌ヒト組織コレクション、ならびに癌および正常組織アレイ（Ｓｕｐｅｒｂｉｏｃｈｉｐｓ）に対して行った。胃癌、食道癌、肺癌、結腸／直腸癌、甲状腺癌および腎臓癌の各々からの、１０のコアを含むヒトの一般的な癌１（ＭＡ２）、ならびに、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および前立腺癌の各々からの、１０のコアを含む一般的な癌２（ＭＢ３）を使用した。隣接する正常な組織に一致する２つの追加的な対照アレイについても分析した。パラフィンの除去後、抗原回復のため、組織を、再水和し、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中、中間出力で３分間マイクロ波処理した。切片を、１０％ＦＣＳおよび３％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴでブロッキングした。切片を、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対する１０μｇ／ｍｌのヒツジＩｇＧ一次ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ）および１５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ複合ウサギＩｇＧ二次抗ヒツジポリクローナル抗体（Ｚｙｍａｘ）でプローブした。管内皮細胞を、ローダミンと複合した２０μｇ／ｍｌのＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅａｕｓ凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）で染色した。スライドに、ＤＡＰＩを有するプロロングゴールド（ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ）退色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を常に載せ、細胞核を対比染色した。染色切片を、５１０レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析した。
【０２２１】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の調製に使用される抗原は、場合によってアジュバントタンパク質（ＡＰ）と複合されたマウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＭ）およびヒトＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＨ）であった。次のプロトコルを用い、これらの４つの抗原（ＣＭ、ＣＨ、ＣＭ−ＡＰ、ＣＨ−ＡＰ）を、マウス免疫に対して使用した。
日 処理
０ 予備免疫試料を完全フロイントアジュバント中の１００μｇの抗原での免疫（足蹠）から採取
１４ 不完全フロイントアジュバント中の１００μｇの抗原での免疫（足蹠）
１７ 出血を試験
１８ 融合のため、膝窩リンパ節を採取
【０２２２】
血清を、３つの抗原、ＣＭ、ＣＨおよびＦｃに対し、ＥＬＩＳＡによって試験した。非免疫血清を、陰性対照として採取した。
【０２２３】
融合プロトコルは次の通りであった。
（１）膝窩リンパ節を免疫マウスから採取し、均質化した。
（２）細胞を温かいＤＭＥＭで洗浄した。
（３）細胞をｓｐ２／０骨髄腫細胞と混合した。
（４）混合物を遠心分離した（１０００ｇ）。
（５）ペレットを５０％ＰＥＧ１５００に懸濁し、１分間インキュベートした。
（６）懸濁液を温かいＤＭＥＭで徐々に希釈した。
（７）懸濁液を遠心分離した（１０００ｇ）。
（８）細胞を、腹膜マクロファージを有するプレートに播種した。
（９）細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０２２４】
各マウスに由来する５００超のＨＡＴ耐性ハイブリドーマクローンを得た。クローン上清の全部を、３つの吸収された抗原（ＣＭ、ＣＨおよびＦｃ）に対し、ＥＬＩＳＡにより、４日間隔で２回試験した。試験によると、ＣＭおよびＣＨの双方と反応するが、Ｆｃと反応しない５つのクローン（全部がサブクラスＩｇＧ１）が得られた。すべての陽性は、限界希釈法により、２〜４回クローン化し、培養フラスク内で増幅させ、腹水症のマウスに注射した。３つのクローンが、ＣＬＥＣ１４ａヒト（ＣＨ）で免疫した結果として得られ、１つのクローン（ＣＲＴ−３）は、ＣＬＥＣ１４ａヒト−ＡＰ（ＣＨ−ＡＰ）で免疫した結果であり、１つのクローン（ＣＲＴ−２）は、ＣＬＥＣ１４ａマウス−ＡＰ（ＣＭ−ＡＰ）で免疫した結果であった。
【０２２５】
結果
図２は、ＨＵＶＥＣおよび他の一次細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対的発現を示すグラフである。ＣＬＥＣ１４Ａは、内皮細胞内で特異的に発現された。これから、ＣＬＥＣ１４Ａが内皮特異的であるという出願人らの先行的な実験結果（Ｈｅｒｂｅｒｔら、２００８年）が確認される。
【０２２６】
図３は、ゼブラフィッシュ胚の受精後２４時間以内の、ＣＬＥＣ１４Ａオルソログのインサイチュハイブリダイゼーションの結果を図示する。ゼブラフィッシュＣＬＥＣ１４Ａオルソログは、ゼブラフィッシュとヒトとの間で保存され、背部大動脈および体節間血管において発現され、これは、ＣＬＥＣ１４Ａが、ゼブラフィッシュ胚モデルにおける脈管形成および血管新生の部位に限って発現されることを示す。
【０２２７】
図４は、（通常ＣＬＥＣ１４Ａを発現することがない）ＣＨＯ細胞内の完全長ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体のライブ蛍光イメージングを示す。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体は、糸状仮足および微小突起における膜に局在化し、同じパターンがＨＵＶＥＣ内で認められる。図５は、コンフルエントなＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現およびＶＥ−カドヘリンとの共局在化の共焦点イメージングを示す。ＣＬＥＣ１４Ａは、突出する微小突起および糸状仮足において、細胞間接触時に、細胞接着部位で発現され、ＶＥ−カドヘリンと共局在化する。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａが、細胞表面に発現されるタンパク質であり、それが標的化にとって理想的な分子になることを明示している。
【０２２８】
ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの内因性発現および局在化を、ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光によって分析した。図６は、ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡのノックダウンのウエスタンブロットである。ＣＬＥＣ１４Ａは、ＨＵＶＥＣ内で非常に高レベルで発現され、それらは２つのバンド、すなわち１つは約６０ｋＤａ（おそらくはＣＬＥＣ１４Ａの非グリコシル化形態）であり、１つは約１００ｋＤａ（おそらくはグリコシル化形態）である、を示す。ＣＬＥＣ１４Ａに特異的な１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ二本鎖のＨＵＶＥＣへの形質移入により、両バンドの強度が約８０％低下したが、それは両バンドがＣＬＥＣ１４Ａに特異的であることを示す。図７は、ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンの共焦点イメージングを示す。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤のｓｉＲＮＡ分子が、実際、ＣＬＥＣ１４Ａの発現を確かにノックダウンすることを示す。
【０２２９】
ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤の血管新生に対する阻害能を試験した。図８Ａは、ＣＬＥＣ１４ＡのｓｉＲＮＡノックダウンがＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける内皮細胞移動を阻害することを示す光学顕微鏡画像である。図９Ａは、抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体がＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける内皮細胞移動を阻害することを示す光学顕微鏡画像である。図８Ｂおよび９Ｂは、それぞれ８Ａおよび９Ａからの結果のグラフ表示である。同様の結果が、モノクローナル抗体を使用するスクラッチ創傷治癒アッセイにおいて得られた。図１６ＡおよびＢに示されるように、ＨＵＶＥＣを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＣＲＴ−３で処理した時、１２時間後、対照における１３％に比べて、創傷部の２５％が開口状態であった。図１７ＡおよびＢに示されるように、ＳＥＮＤ細胞を１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＣＲＴ−２で処理した時、１２時間後、対照における９％に比べて、創傷部の１７％が開口状態であった。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤、例えばｓｉＲＮＡおよび抗体が、内皮細胞移動に対する阻害効果を有することを示す。内皮細胞移動は、血管新生の本質的特徴である。したがって、これらのアッセイは、２つの異なるＣＬＥＣ１４Ａの分子阻害剤、ｓｉＲＮＡおよび抗体が血管新生を阻害するという証拠を提供する。
【０２３０】
図１０は、せん断応力および静的条件下でのＨＵＶＥＣのリアルタイムＰＣＲから得られる結果を図示する。ＲＯＢＯ４は、内皮細胞に対して高度に特異的な、既知の腫瘍内皮マーカーであり、その阻害により、血管新生が阻害される。ＲＯＢＯ４およびＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡの双方は、せん断応力（２Ｐａ）下で有意に下方制御され、またせん断応力下での下方制御は、血管新生促進遺伝子に関連した現象である。
【０２３１】
固形腫瘍および正常組織の切片におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現を、ＣＬＥＣ１４Ａに特異的なプローブを使用して試験した。図１１〜１４は、ヒト卵巣、膀胱、肝臓、乳房、結腸、直腸、食道、腎臓、肺、前立腺、胃、膵臓および甲状腺腫瘍組織内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光画像である。ＣＬＥＣ１４Ａの発現の内皮特異性を、内皮細胞上の特異的なフコース残基に結合するＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅａｕｓ凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）との共局在化によって確認した。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析したすべての腫瘍組織内の血管内で認められた。卵巣、膀胱、肝臓、乳房、腎臓および前立腺腫瘍は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に対して強い陽性を示した一方、胃、食道、肺、結腸、直腸、膵臓および甲状腺腫瘍組織は、より低レベルのＣＬＥＣ１４Ａの特異的発現を示した。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、対応する正常な対照（非腫瘍）組織のいずれにおいても検出されなかった。正常なヒトの脳、心臓および腎組織内でＣＬＥＣ１４Ａが発現されなかったことを示す免疫蛍光画像の代表例を、図１５に示す。したがって、出願人らは、ＣＬＥＣ１４Ａが腫瘍血管系において特異的に発現されることを示している。
【０２３２】
結論
まとめると、この試験の結果は、膜貫通タンパク質ＣＬＥＣ１４Ａが過去に認識されなかった腫瘍内皮マーカーであることを示す。
【０２３３】
実施例２：動物モデルにおける固形腫瘍の処置
固形腫瘍のマウスモデル（例えば、Ｂｌａｃｋ ５７マウスにおけるＬｅｗｉｓ肺癌皮下同種移植片移植またはヌードマウスにおけるＨＴ２９皮下異種移植片移植のいずれか）は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む医薬組成物の生理食塩溶液の静脈内注入によって処置する。注入物は、２〜４か月の期間、週１回投与する。腫瘍は、動物モデルにおいて、対照に比べて退行する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、腫瘍内皮特異的遺伝子およびポリペプチド、腫瘍血管系をイメージングし標的化するための、これらのポリペプチドに結合する抗体の使用、ならびに、固形腫瘍における血管新生を阻害するための、これらの腫瘍内皮特異的遺伝子／ポリペプチドの阻害剤の使用、に関する。特に、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａ、腫瘍血管新生をイメージングし標的化するための、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の使用、ならびに、固形腫瘍における血管新生を阻害するための、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮は、多数の生理的かつ病理学的プロセスにおいて中心的役割を果たし、またそれは非常に活性の高い転写部位であることが知られている。約１，０００の異なる遺伝子が内皮細胞内で発現されるが、それらの多くは、内皮細胞に特異的なものではない。それに対し、赤血球は、８つの血小板２２および平滑筋１２７の別々の遺伝子を発現することが見出されている（Ａｄａｍｓら（１９９５年） Ｎａｔｕｒｅ ３７７（６５４７ Ｓｕｐｐｌ）：３−１７４頁）。既知の内皮特異的遺伝子は、基礎研究および臨床コミュニティの双方から多大な注目を集めている。例えば、内皮に特異的なチロシンキナーゼＴｉｅ、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＫＤＲ、およびｆｌｔ１は、血管の完全性、内皮媒介性の炎症性プロセスおよび血管新生の調節における重要な担い手（ｐｌａｙｅｒ）である。
【０００３】
発明者は、過去に、コンピュータ上のデータベースによるスクリーニングアプローチを用いて内皮特異的遺伝子を同定しており、４つの新たな内皮特異的候補遺伝子を同定したが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（ＨｕｍｉｎｉｅｃｋｉおよびＢｉｃｋｎｅｌｌ（２０００年） 「Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ．」 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１７９６−１８０６頁）。
【０００４】
Ｈｏらは、データマイニングおよびマイクロアレイ発現分析を用い、内皮特異的遺伝子を同定し、内皮細胞に特異的であるかまたは内皮細胞内で少なくとも３倍優先的に発現される６４の遺伝子を同定したが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（Ｈｏら（２００３年） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．」 Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：２４９−２６２頁）。
【０００５】
Ｗａｌｌｇａｒｄらは、公的に利用可能なマイクロアレイ発現データを分析し、微小血管系における広範な内皮特異的発現を伴う５８の遺伝子のコアセットを同定した。このセットは、最も有名でかつ現在使用されている内皮マーカー、ならびに過去に内皮機能と関連性がなかった遺伝子を含むが、その中のいずれもＣＬＥＣ１４Ａではなかった（Ｗａｌｌｇａｒｄら（２００８年） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｒｅ ｓｅｔ ｏｆ ５８ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２８：１４６９−１４７６頁）。
【０００６】
内皮細胞は、すべての血管沿いに並びかつ血流と周囲組織との間での交換を調節する単細胞層を形成する。新しい血管が、血管新生と称されるプロセスにおける内皮細胞の増殖により、既存の小管の壁から発生する。内皮細胞は、培養液中に単離される場合であっても、空洞の毛細管の形成能を有する。一旦、血管系が十分に発達すると、血管の内皮細胞は通常、休止状態を維持し、自然な創傷治癒における新しい血管の形成以外での新たな管形成は全くない。
【０００７】
しかし、一部の腫瘍は、近隣の内皮細胞を刺激し、新しい毛細血管芽を作る因子を分泌することにより、新しい血液供給を促進する。血管新生は、固形腫瘍の進行における主要な役割を果たし、固形腫瘍の成長における律速プロセスとして広く認識されている。血液供給を促進できない腫瘍は、その成長が著しく制限される。したがって、不適切であるかまたは望ましくない血管新生に対する阻害能は、固形腫瘍の処置において有用でありうる。
【０００８】
新しい血管の発生は、局所的な腫瘍進行と遠隔転移の発生の双方にとって不可欠である。確かに、腫瘍の成長および生存は、その血液供給を得る能力に依存し、腫瘍内皮上に受ける損傷は、腫瘍を有効に根絶することが示されている（Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９９３年） 「Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０（１９）：８９９６−９０００頁）。腫瘍血管新生は、活性化組織または循環内皮前駆体による基底膜の分解、内皮細胞の増殖および移動、細胞外マトリックスとの相互作用、形態学的分化、細胞接着および血管脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を含む。したがって、腫瘍血管新生の阻害は、抗腫瘍療法における標的であり、ここでは血管新生阻害剤が単独でまたは標準的癌治療と組み合わせて利用される。しかし、抗腫瘍剤を血管新生の部位に標的化することは、腫瘍血管新生の特異的マーカーの同定に依存する。いまでは、固形腫瘍の成長が、それが血液供給を得る能力に依存し、またこのプロセスを破壊する抗血管新生剤の開発に多大な努力が向けられていることは理解されている。また、確立された腫瘍血管系の標的化された破壊が治療機会を促すための別の手段であり、また広範に発現される腫瘍内皮マーカーの発見が多大な臨床的利益を約束することが明らかになっている（ＮｅｒｉおよびＢｉｃｋｎｅｌｌ（２００５年） 「Ｔｕｍｏｕｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５（６）：４３６−４４６頁）。
【０００９】
これらの治療的アプローチは、特異的な腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）の同定に依存する。抗血管新生腫瘍療法における候補でありうる腫瘍特異的な内皮マーカーについてのスクリーニングでは、Ｓｔ Ｃｒｏｉｘら（２０００年）は、腫瘍内皮由来の内皮細胞と正常な結腸粘膜との間に特異的に発現された７９の遺伝子を同定し、そのいずれもがＣＬＥＣ１４Ａでなかった（Ｓｔ Ｃｒｏｉｘら（２０００年） 「Ｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１１９７−２０２頁）。３３のこれらの遺伝子（１１の既知の遺伝子および１４の現時点で（ａｓ−ｔｈｅｎ）特徴づけられていない遺伝子を含む）の発現が、腫瘍内皮細胞内で少なくとも１０倍高まった。組織試料に対するインサイチュハイブリダイゼーションによると、徹底的に試験された９つの特徴づけられていない遺伝子のうちの８つの発現が、腫瘍内皮細胞に特異的であることが確認された。さらに、これらの遺伝子はまた、肺および脳腫瘍を含む他の腫瘍の内皮細胞上で発現された。これらの遺伝子はまた、１つの遺伝子を除き、創傷治癒などの他の血管新生状態において高レベルに発現された。
【００１０】
Ｋｈｏｄａｒｅｖら（２００３年）は、Ｕ８７ヒトグリオーマ細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とを共培養することによる腫瘍／内皮−細胞相互作用をモデル化した。Ｕ８７細胞は、増殖、移動および網状形成の増大を含む、ＨＵＶＥＣ内で「活性化された」表現型を誘発した。活性化は、細胞が直接接触または物理的分離のいずれかの状態にある場合の共培養物中で認められ、これは、認められた表現型および遺伝子型の変化における可溶性因子にとっての重要な役割を示唆した。腫瘍が活性化された内皮細胞の発現プロファイリングが、ｃＤＮＡアレイを用いて評価され、定量ＰＣＲによって確認された。ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３、ＦＧＦＲＩＩ、およびシステインリッチ線維芽細胞成長因子受容体（ＣＲＦ−１）とＦＧＦ７、およびＦＧＦ１２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５とＲＡＮＴＥＳ、およびカルシトニン受容体様遺伝子（ＣＡＬＣＲＬ）とアドレノメデュリンを含む、受容体／リガンドの一致ペアが、協調的に発現されることが見出された。ＣＬＥＣ１４Ａは、同定されなかった（Ｋｈｏｄａｒｅｖら（２００３年） 「Ｔｕｍｏｕｒ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１６：１０１３−１０２２頁）。
【００１１】
Ｓｅａｍａｎら（２００７年）は、８つの正常な静止組織、５つの腫瘍、および再生肝の血管に由来する内皮細胞の遺伝子発現パターンを比較した。Ｓｅａｍａｎらは、器官特異的な内皮遺伝子、ならびに正常な内皮に対して腫瘍において過剰発現された２５の転写産物を同定した（そのうちの１３は、再生肝の血管新生内皮において見出されなかった）。ＣＬＥＣ１４Ａは同定されなかった。共有される血管新生遺伝子の大部分が、細胞周期制御における役割を有することが想定されたが、腫瘍内皮に特異的なものは、主に不特定の機能を有する細胞表面分子であった（Ｓｅａｍａｎら（２００７年） 「Ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．１１（６）：５３９−５４頁）。
【００１２】
発明者は、先行的に、公的なｃＤＮＡおよびＳＡＧＥライブラリのデータマイニングにより、４５９の予測される内皮遺伝子（そのうちの１つはＣＬＥＣ１４Ａである）を同定した。発明者は、これらの４５９から、発現が腫瘍内皮に対して高度に特異的である２７の遺伝子／ポリペプチド（ＣＬＥＣ１４Ａを含まない）を同定した（Ｈｅｒｂｅｒｔら（２００８年） 「Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｅｎｅｓ」 ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９：１５３（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−９−１５３））。このように、これらの遺伝子／ポリペプチドは、血液供給を介して直接的に標的化されうるような特に優れた抗癌剤標的である、新規の腫瘍内皮マーカーとして同定された。
【００１３】
にもかかわらず、当該技術分野では、さらなる腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）に対する需要がある。
【００１４】
発明者は、いまでは、さらなる遺伝子／ポリペプチドとして、高度な腫瘍内皮特異性を有するＣＬＥＣ１４Ａを同定している。発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが、ヒト内皮細胞内でまたゼブラフィッシュモデルにおける発生の間に血管新生組織内で特異的に発現されることを示している。発明者はまた、ｓｉＲＮＡ技術を用いたＣＬＥＣ１４Ａの下方制御および抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体を用いたＣＬＥＣ１４Ａの阻害により、血管新生の本質的成分である内皮細胞移動が低下することを示している。さらに、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現が、血管新生促進遺伝子の下方制御に関連することが多いせん断応力に応答して下方制御されることを示している。発明者はまた、免疫蛍光により、ＣＬＥＣ１４Ａが、正常な成体組織内で発現されないが、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肺癌および甲状腺癌を含む癌の新生血管（ｎｅｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｖｅｓｓｅｌｓ）において発現されることを示している。
【００１５】
したがって、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが本質的にＴＥＭをコードすることを結論づけている。したがって、発明者は、いまでは、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドが腫瘍内皮のマーカーとして重要になり、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用し、腫瘍血管新生を画像化し、標的化することが可能であり、また、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドの阻害剤であれば、固形腫瘍における腫瘍血管新生の阻害において臨床的に有用になる、と考えている。
【００１６】
発明者の知りうる限りにおいて、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生の阻害剤であることが示唆されたことはかつて全くない。
【００１７】
国際公開第０２／０７９４９２号パンフレット（Ｅｏｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）は、発現が血管新生組織内で経時的に変化すると言われた数百ものＥＳＴを列挙している。これらのＥＳＴの１つが、１６６のＣＬＥＣ１４Ａの残基断片をコードするＥＳＴ（その中でＰｋｅｙ１０５７２９、登録番号Ｈｓ４６６１２、Ｕｎｉｇｅｎｅ番号Ｈｓ２９３８１５、Ｕｎｉｇｅｎｅ名称ＨＳＰＣ２８５として称される）であった。しかし、国際公開第０２／０７９４９２号パンフレットは、血管新生の間でのこのＥＳＴの発現に対するデータの提示が全くなく、発現が増大または低下していることへの考察あるいは発現が腫瘍内皮細胞に限られたか否かについてさえ記載がない。
【００１８】
Ｈｅｒｂｅｒｔら（２００８年）においては、発明者は、ｃＤＮＡおよびＳＡＧＥライブラリデータを組み合わせることによって得られた、４５９のコンピュータで予測された包括的な内皮遺伝子セットについて記載した。発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａを内皮細胞内で選択的に発現されるものとして同定したが（追加ファイル１３）、それは上位１０４の最も内皮に特異的な遺伝子に含まれなかった。この前報では、発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａを、腫瘍内皮に特異的であるかまたは血管新生に関与するものとして同定しなかった。確かに、ＣＬＥＣ１４Ａにおける機能として、既知であるかまたは提示されたものは全くなく、さらなる実証実験が行われたことは全くなかった。
【００１９】
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．は、ＰＲＯ２６９（クローンＤＮＡ３８２６０−１１８０）がＣＬＥＣ１４Ａに相当するという、「ＰＲＯ」遺伝子およびポリペプチドに関する多数の公開された特許および特許出願を有している。これらの特許および特許出願においては、複数の潜在的な役割がＰＲＯ２６９に帰するものとしている。例えば、米国特許第２００３／０１８６３５８号明細書および米国特許第６，８９４，１４８号明細書の双方において、ＰＲＯ２６９は、そのトロンボモジュリンとの相同性から抗血栓剤としての用途を有すると言われており、また、リンパ球増殖を刺激し、皮質ニューロンにおけるｃ−ｆｏｓを誘発し、またグルコース取り込みに作用する能力を有すると言われている。より適切には、ＰＲＯ２６９は、８つの肺腫瘍試料および細胞系（ｎ＝２０）のゲノムＤＮＡにおいて２〜４倍の間で増幅されるが、結腸（ｎ＝１９）、睾丸（ｎ＝２）もしくは腎臓（ｎ＝１）の腫瘍試料または細胞系に由来するゲノムＤＮＡにおいて増幅されないことが見出された。同様に、米国特許出願公開第２００３／０１７５９００号明細書では、ＰＲＯ２６９は、同じ８つの肺腫瘍試料および細胞系（ｎ＝５０）のゲノムＤＮＡにおいて２〜４倍の間で増幅されるが、結腸（ｎ＝４５）、乳房（ｎ＝１８）、リンパ節（ｎ＝３）、腎臓（ｎ＝２）、副甲状腺（ｎ＝２）、直腸（ｎ＝２）または睾丸（ｎ＝２）の腫瘍試料および細胞系に由来するゲノムＤＮＡにおいて増幅されないことが見出された。
【００２０】
米国特許出願公開第２００３／０１９４７７５号明細書（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）では、ＰＲＯ２６９は、肝臓、腎臓、および肺組織を含む、上皮由来の非癌性ヒト組織をプールすることによって調製された「ユニバーサルな（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」上皮対照試料に比べて、肺および直腸腫瘍において過剰発現されるが、乳房、結腸、頸部、前立腺または肝臓腫瘍において過剰発現されないと言われた。
【００２１】
それに対し、国際公開第０３／１０１２８３号パンフレット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ）は、発現が肺腫瘍において特異的に調節されることが見出された１７０の転写産物について記載している。これらのうち、ＣＬＥＣ１４Ａに相当する転写産物（その中でＩｎｃｙｔｅ ＩＤ ２２６４００２ＣＢ１、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇ１５２０９７５２と称される）は、３９のうち２１の異なる肺腫瘍試料中で４〜１６倍の間で下方制御されることが見出された。これは、米国特許出願公開第２００３／０１９４７７５号明細書中での肺腫瘍におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現に関する実験結果に矛盾するように思われる。
【００２２】
Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃはまた、ＣＬＥＣ１４Ａが、他の既知のアテローム性動脈硬化症遺伝子との同時発現から、３４のヒトアテローム性動脈硬化症関連遺伝子の１つであることを示唆している（国際公開第０１／０４２６４号パンフレット）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、本発明に至るまで、ＣＬＥＣ１４Ａの考えられる機能および使用について多くの示唆があるにもかかわらず、腫瘍内皮マーカーとしてのその役割、またはＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が腫瘍血管新生の阻害剤でありうることについて示唆するものは全くなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明の第１の態様は、腫瘍血管新生を、阻害を必要とする個体において阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明のこの態様は、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用を含む。本発明は、個体における腫瘍血管新生を阻害することにおいて使用されるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤をさらに含む。
【００２６】
典型的には、個体は、固形腫瘍を有し、それは腫瘍血管新生を阻害することによって処置可能である、すなわち、固形腫瘍は、新たな血管産生に関連している。用語「腫瘍」は、限定はされないが、乳房、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺の腫瘍を含む、腫瘍性細胞成長のすべての形態を参照するものとして理解されるべきである。
【００２７】
典型的には、腫瘍は、望ましくない血管新生形成に関連しており、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、これを有効な範囲まで低減する。望ましくない血管新生形成の低減は、腫瘍の進行を停止させ、腫瘍サイズおよび成長の臨床的に有効な低減をもたらしうる。したがって、腫瘍血管新生の阻害を用いることで、腫瘍を処置し、例えば、腫瘍の（さらなる）成長を阻止するか、腫瘍の浸潤（転移）を阻止するか、または腫瘍のサイズを低減することが可能である。
【００２８】
発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａが、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺の腫瘍を含む、ある範囲の固形腫瘍の血管内皮において特異的に発現されることを示している。したがって、好ましい実施形態では、個体は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺および甲状腺腫瘍から選択される固形腫瘍を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、個体は、肺癌および／または直腸癌以外の固形腫瘍を有する。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法および薬剤は、ヒトを処置するために使用され、その場合、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤である。しかし、本発明の方法および薬剤が非ヒト哺乳類の処置を目的とする場合、阻害剤が他種由来のＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ポリペプチドに特異的である場合に好ましいことが理解されている。
【００３１】
ＣＬＥＣ１４Ａ
遺伝子ＣＬＥＣ１４Ａ（Ｃ型レクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）は、１４ｑ２１．１に位置し、以前はＣ１４ｏｒｆ２７、ＣＥＧ１およびＥＧＦＲ５として知られていた。ＣＬＥＣ１４Ａは、５１ｋＤａの予測分子量を有する４９０アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの遺伝子産物（その天然変異体を含む）の意味が含まれる。ヒトＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０中に見出されるアミノ酸配列およびその天然変異体を含む。ＮＰ＿７７８２３０由来のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド配列は、図１中に示される（配列番号１）。
【００３２】
ヒトＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中に見出され、図１中に示される（配列番号２）。ＮＭ＿１７５０６０由来のこのｃＤＮＡのコード領域は、ヌクレオチド３４８〜ヌクレオチド１８２０であり、これもまた、図１中に示される（配列番号３）。
【００３３】
ＣＬＥＣ１４Ａは、残基１〜２１にシグナルペプチドを有するＩ型膜貫通タンパク質である。成熟ヒトポリペプチドは、４６９アミノ酸長（アミノ酸残基２２〜４９０）であり、３７５残基の細胞外領域（残基２２〜３９６）、膜貫通領域（残基３９７〜４２５）、および細胞質領域（残基４２６〜４９０）を有する。細胞外領域は、Ｃ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７５）およびＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）を有する。
【００３４】
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤には、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの阻害剤およびＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子／ｃＤＮＡの阻害剤の双方が含まれる。
【００３５】
好適なＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体を含む。他の好適なＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム分子を含み、それらはＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的であり、その発現を阻止する。
【００３６】
ポリヌクレオチドＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が、直接投与可能であるか、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドの形態で投与可能であることは理解されている。したがって、ポリヌクレオチドであるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与することとは、本明細書で使用される場合、文脈上特に断りがない限り、阻害剤を直接投与する、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドを典型的にはベクターの形態で投与するという意味が含まれる。同様に、ポリヌクレオチドであるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含む薬剤または組成物には、本明細書で使用される場合、文脈上特に要求されない限り、薬剤または組成物が、阻害剤自体を含むか、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むという意味が含まれる。
【００３７】
抗体
ＣＬＥＣ１４Ａまたはその特異的部分に結合する好適な抗体は、当業者により、当該技術分野で長期にわたって確立された技術を用いて作製可能である。モノクローナル抗体および抗体断片を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年） 「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７頁）；抗体ファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年） 「Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５頁）；リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９年） 「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１９−１３５頁）；および反復コロニーフィルタスクリーニング（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら（２００１年） 「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ｆｉｌｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ２７）を含む。さらに、本発明における使用に適した抗体および抗体断片は、例えば、次の出版物、すなわち、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ．Ｚｏｌａ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、ＩＳＢＮ：０−８４９３６−４７６−０；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第１版、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２；「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年、ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４３−９；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ編、第１版、−Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、２００７年、ＩＳＢＮ：３−５２７−３１４５３−９において記載されている。
【００３８】
腫瘍血管新生を阻害するときに特に活性が高い抗体は、抗癌治療剤として好ましく、それらは、下記の当該技術分野で周知の方法を用い、この活性について選択することが可能である。
【００３９】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体については、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチド、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するよりも高い親和性で結合することを意味する。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチドに対するよりも、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに、無関係のポリペプチドに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。
【００４０】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体が、関連ポリペプチド、例えばトロンボモジュリンに結合しないか、または、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチド、例えばトロンボモジュリンに対するよりも高い親和性で結合することが好ましい。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチドに対するよりも、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに、関連ポリペプチドに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。
【００４１】
抗体が、ＣＬＥＣ１４Ａに対して少なくとも１０−７Ｍおよびより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有する場合が好ましいが、より高い親和性、例えば１０−９Ｍ以上の値を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。
【００４２】
典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、成熟ペプチド（残基２２〜４９０）に結合し、シグナルペプチド（残基１〜２１）に結合しない。好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域（残基２２〜３９６）に結合する。抗体は、Ｃ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７５）に結合するか、またはＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）に結合する可能性がある。
【００４３】
ＣＬＥＣ１４Ａの特異的部分に選択的に結合する抗体については、抗体が、上記の標的に選択的に結合するだけでなく、抗体分子が、ＣＬＥＣ１４Ａの特異的部分に、その任意の他の部分に対するよりも高い親和性で結合することを意味する。好ましくは、抗体は、特異的部分に、ＣＬＥＣ１４Ａ上の任意の他のエピトープに対するよりも、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、抗体分子は、特異的部分に、ＣＬＥＣ１４Ａ上の任意の他のエピトープに対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。かかる結合は、当該技術分野で周知の方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つにより、判定可能である。抗体が、ＣＬＥＣ１４Ａ上のその標的エピトープに対して少なくとも１０−７Ｍおよびより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有する場合が好ましいが、より高い親和性、例えば１０−９Ｍ以上の値を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａ内部の特定の特異的エピトープに選択的に結合し、その内部の任意の他のエピトープに結合しない。
【００４４】
好ましくは、抗体が個体に投与される場合、抗体は、標的ＣＬＥＣ１４Ａまたはその特異的部分に、個体内の任意の他の分子に対するよりも高い親和性で結合する。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａ（の特異的部分）に、個体内の任意の他の分子に対するよりも、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍高い親和性で結合する。より好ましくは、作用剤は、ＣＬＥＣ１４Ａに（特異的ドメインに）、個体内の任意の他の分子に対するよりも、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で結合する。好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合し、身体内の他のポリペプチドに有意に結合することがない。
【００４５】
用語「抗体」または「抗体分子」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリによって生成される断片を含む。かかる断片は、標的物質に対する結合活性を保持する全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ'）およびＦ（ａｂ'）２断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質、を含む。同用語はまた、特異的ポリペプチドまたはその特定の領域に結合する分子に対するファージディスプレイ技術または他のランダム選択技術を用いて生成可能な抗体様分子を含む。したがって、抗体という用語は、天然抗体の認識部位の一部（すなわちエピトープまたは抗原に結合するかまたはそれと結合する抗体の一部）である構造、好ましくはペプチド構造を有するすべての分子を含む。さらに、抗体およびその断片は、ヒト化抗体であってもよく、それは今では当該技術分野で周知である。
【００４６】
「ＳｃＦｖ分子」については、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合された分子を意味する。改変抗体、例えばＳｃＦｖ抗体は、当該技術分野で長く知られている技術およびアプローチを用いて作製可能である。全抗体でなく抗体断片を使用する利点は、数倍に相当する。断片のサイズがより小さいことにより、改善された薬理学的特性、例えば標的部位へのより優れた浸透性が得られうる。全抗体のエフェクター機能、例えば補体結合が除外される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片はすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、またそれから分泌され、それにより、大量の断片の容易な生成が可能になる。全抗体およびＦ（ａｂ'）２断片は、「二価」である。「二価」とは、抗体およびＦ（ａｂ'）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。それに対し、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は、一価であり、抗原結合部位を１つだけ有する。
【００４７】
ＣＬＥＣ１４Ａが糖タンパク質でありうることは理解されている。したがって、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａのタンパク質または炭水化物成分の任意の組み合わせに結合しうる。
【００４８】
抗体は、標準的技術により、例えば適切な（糖）ポリペプチドまたはその一部で免疫することにより、またはファージディスプレイライブラリを使用することにより、産生されうる。
【００４９】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、所望されるエピトープを担持する、場合によって別のポリペプチドにハプテン結合された（ｈａｐｔｅｎｉｓｅｄ）免疫原性ポリペプチドで免疫される。宿主種に依存するが、様々なアジュバントを使用し、免疫応答を増強することが可能である。かかるアジュバントは、限定はされないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの天然ゲル、ならびに、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、およびジニトロフェニルなどの界面活性物質を含む。免疫動物由来の血清は、既知の手順に従い、回収され、処理される。所望されるエピトープに対するポリクローナル抗体を有する血清が、他の抗原に対する抗体を有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製されうる。ポリクローナル抗血清を産生し、処理するための技術は、当該技術分野で周知である。
【００５０】
抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号ＳＡＢ１４００８３１）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＦ４９６８およびＢＡＦ４９６８）、Ａｂｃａｍ（製品コードａｂ７３０８７）およびＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カタログ番号Ｈ００１６１１９８−Ｂ０１）から市販されている。
【００５１】
全ポリペプチドまたはその特定のエピトープに特異的なモノクローナル抗体はまた、当業者によって容易に産生されうる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的方法は、周知である。不死抗体産生細胞系は、細胞融合に加え、Ｂリンパ球と発癌性ＤＮＡとの直接形質転換またはエプスタイン−バーウイルスの形質移入などの他の技術により、作製可能である。上掲のポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体群は、様々な特性、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーニング可能である。モノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞系によって抗体分子の産生をもたらす周知の技術のいずれかを用いて調製してもよい。
【００５２】
抗体がモノクローナル抗体である場合が好ましい。いくつかの環境下では、特に抗体がヒト患者に反復投与されるべき場合、モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である場合が好ましく、それらは、ヒトへの投与に適し、投与される免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を生じさせることがない。好適に調製された非ヒト抗体は、既知の方法において、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することにより、「ヒト化」されうる。ヒト化抗体は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９、１５３４−１５３６頁およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（１９９１年） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｌ４（７）、７７３−７８３頁において記載の技術およびアプローチを用いて作製されうる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部もしくは大部分が、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応する場合の可変ドメインと、実質的または完全にヒト免疫グロブリン共通配列のそれらであるフレームワーク領域とを有することになる。
【００５３】
完全ヒト抗体は、組換え技術を用いて産生されうる。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大型ライブラリが使用される。例えばマウス抗体のキメラ化またはヒト化を用いる先行技術に対し、この技術は、特異抗体を産生するための動物の免疫に依存することがない。代わりに、組換えライブラリは、膨大な数の既製抗体変異体を含み、ここでライブラリは、任意の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体を有することになる可能性が高い。したがって、かかるライブラリを使用し、所望される結合特性を有する既存の抗体を同定することが可能である。ライブラリ中で良好な結合剤を効率的な方法で見出すため、表現型、すなわち抗体または抗体断片が、その遺伝子型、すなわちコード遺伝子に結合される場合の様々な系が考案されている。最も一般的に使用されるかかる系は、抗体断片が、繊維状ファージ粒子の表面上でのファージコートタンパク質との融合体として、発現され、提示される一方、それと同時に、提示された分子をコードする遺伝子情報を有する、いわゆるファージディスプレイ系である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁）。特定の抗原に特異的な抗体断片に対するファージディスプレイは、問題の抗原への結合を通じて選択されうる。次いで、単離されたファージは増幅され、選択された抗体の可変ドメインをコードする遺伝子は、場合により、他の抗体フォーマット、例えば完全長免疫グロブリンなどに移され、当該技術分野で周知の適切なベクターおよび宿主細胞を使用し、大量に発現されうる。あるいは、「ヒト」抗体は、本質的にヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することによって作製されうる（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９８年） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、５３５−５３９頁）。
【００５４】
抗体が非ヒト個体への投与を目的とする場合、抗体が意図されるレシピエント種に特化して設計／産生されている可能性があることは理解されている。
【００５５】
ファージ粒子上に提示される抗体特異性のフォーマットは、異なる場合がある。最も一般的に使用されるフォーマットは、Ｆａｂ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４年、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５−３２６０頁）および一本鎖（ｓｃＦｖ）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８頁）であり、双方は抗体の可変抗原結合ドメインを含む。一本鎖フォーマットは、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に柔軟なリンカーを介して連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）から構成される（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）。抗体は、治療剤として使用する前、可溶性フォーマット、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖに移し、それ自体分析することが可能である。後のステップにおいて、望ましい特性を有するものとして同定された抗体断片は、完全長抗体などのさらに他のフォーマットに移されうる。
【００５６】
国際公開第９８／３２８４５号パンフレットおよびＳｏｄｅｒｌｉｎｄら（２０００年） Ｎａｔｕｒｅ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６頁は、抗体ライブラリにおける可変性を生成するための技術について記載している。このライブラリに由来する抗体断片はすべて、同じフレームワーク領域を有し、かつそれらのＣＤＲ内で異なるにすぎない。フレームワーク領域が生殖細胞系配列であることから、ライブラリ、または同じ技術を用いて生成された類似のライブラリに由来する抗体の免疫原性は、特に低いものと想定される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、２０００年）。この特性は、治療抗体にとって非常に貴重であり、患者が投与された抗体に対する抗体を形成するリスクを低減し、それにより、アレルギー反応、ブロッキング抗体の発生に対するリスクを低減し、抗体の長い血漿半減期を可能にする。したがって、ヒトにおいて使用されるべき治療抗体を開発する場合、ここでは現行の組換えライブラリ技術（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、２００１年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．４：４０９−４１６頁）が、より初期のハイブリドーマ技術に優先して用いられる。
【００５７】
また抗体には、構造的にラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）抗体に由来する重鎖抗体、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ）が含まれる。これらは、天然重鎖抗体の構造的および機能的特性を有する、抗体由来の治療タンパク質である。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）技術は、ラクダ科（ラクダおよびリャマ）が、軽鎖が欠如した完全機能抗体を有するという発見後に開発された。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。クローン化された単離ＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を有する完全に安定なポリペプチドである。これらのＶＨＨドメイン（それら独自の構造的および機能的特性を有する）は、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の基盤を形成する。それらは、従来の抗体の利点（高い標的特異性、高い標的親和性および低い固有毒性）と、小分子薬剤の重要な特徴（酵素を阻害しかつ受容体間隙（ｃｌｅｆｔ）に接近する能力）とを組み合わせている。さらに、それらは、安定であり、注射以外の手段によって投与される可能性を有し、作製がより容易であり、ヒト化することが可能である（例えば、米国特許第５，８４０，５２６号明細書；米国特許第５，８７４，５４１号明細書；米国特許第６，００５，０７９号明細書、米国特許第６．７６５，０８７号明細書；欧州特許第１５８９１０７号明細書；国際公開第９７／３４１０３号パンフレット；国際公開第９７／４９８０５号パンフレット；米国特許第５，８００，９８８号明細書；米国特許第５，８７４，５４１号明細書および米国特許第６，０１５，６９５号明細書を参照）。
【００５８】
ｓｉＲＮＡ
小さい干渉ＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９４）：２４４−５１頁（２００２年）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１、２１頁（２００２年）；およびＳｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９、５５１５−５５２０頁（２００２年）において記載されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列がサイレント遺伝子（ｓｉｌｅｎｃｅｄ ｇｅｎｅ）に相同な二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。配列特異的なｍＲＮＡ分解のメディエーターは、典型的には、インビボでより長いｄｓＲＮＡからのリボヌクレアーゼＩＩＩの切断によって生成可能な、２１および２２ヌクレオチドの小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、内因性および異種遺伝子の双方の発現を特異的に抑制することが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１年） Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８頁）。哺乳類細胞においては、ｓｉＲＮＡは、より長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡがＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ）を活性化し、かつタンパク質合成全体を阻害することから、下記の２つの相補的な２１ｍｅｒｓからなる必要があると考えられる。
【００５９】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して選択的な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、そのｃＤＮＡ配列を参照することにより、容易に設計することが可能である。例えば、それらは、図１中に列挙される、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中のＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡ配列を参照することにより、設計可能である。
【００６０】
典型的には、イニシエーターメチオニンコドンから下流の少なくとも１２０のヌクレオチドであるＡＡジヌクレオチドから開始する最初の２１−ｍｅｒ配列が選択される。これに完全に相補的なＲＮＡ配列は、最初のＲＮＡオリゴヌクレオチドになる。２番目のＲＮＡ配列は、最初のＲＮＡ配列の最初の１９残基に対して完全に相補的であるとともに、その３’末端に追加的なＵＵジヌクレオチドを有する必要がある。合成ＲＮＡ分子は、一旦設計されると、当該技術分野で周知の方法を用いて合成することが可能である。
【００６１】
好適な抗ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡの配列は、下記に与えられる。さらに、抗ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ｓｉＲＮＡ ＩＤ番号：ｓ４６２４８、ｓ４６２４９、ｓ４６２５０、１２９８７９、１２９８８０、１２９８８１）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（オリゴＩＤ番号：ＨＳＳ１３６２３８、ＨＳＳ１７５９２５およびＨＳＳ１７５９２６）から市販されている。
【００６２】
ｓｉＲＮＡは、任意の好適な方法、例えば本明細書中に記載の方法を用いて患者内の細胞に導入してもよい。典型的には、ＲＮＡは、例えば好適な担体中または媒体中に封入されることにより、細胞外環境から保護される。リポソーム媒介性移入、例えばオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）法を用いてもよい。
【００６３】
アンチセンスポリヌクレオチド
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって選択的なアンチセンス核酸分子は、当該技術分野で既知のように、そのｃＤＮＡまたは遺伝子配列を参照することにより、容易に設計することが可能である。アンチセンス核酸、例えばオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸であり、それは相補的核酸配列に特異的に結合しうる。適切な標的配列に結合することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成される。これらの核酸は、遺伝子のセンスまたはコード鎖に対して相補的であることから、「アンチセンス」と称されることが多い。最近、三重らせんの形成は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二本鎖に結合される場合には可能であることが判明している。オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重らせんの主溝内の配列を認識しうることが見出された。三重らせんは、それによって形成された。これは、二本鎖ＤＮＡに主溝の水素結合部位の認識を介して特異的に結合する配列特異的な分子を合成することが可能であることを示唆する。上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合することにより、標的核酸の機能を阻害しうる。これは、例えば、転写、プロセシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳を遮断するか、または細胞の阻害機序を促進する、例えばＲＮＡ分解を促進する結果でありうる。
【００６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、実験室において調製され、次いで、例えばマイクロインジェクションまたは細胞培地から細胞への取り込みによって細胞に導入されるか、あるいはそれらは、アンチセンス遺伝子を有するプラスミドまたはレトロウイルスまたは他のベクターでの形質移入後、細胞内で発現される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、シミアンウイルスおよびインフルエンザウイルスにおける細胞培養液中で、ウイルス複製または発現を阻害することが発見された。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害は、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物を含む無細胞系において幅広く試験されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス性機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶレトロウイルスＲＮＡに対して相補的であったオリゴヌクレオチドを使用し、生体外で実証されている（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ．１９８８年 「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（１５）：５５０７−１１頁）。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ試験によると、最も有効であるオリゴヌクレオチドが、ポリ（Ａ）シグナルに対して相補的であり、また有効であるものが、ＲＮＡの５’末端、特にキャップおよび５Ｎ未翻訳領域（プライマー結合部位に隣接する）、およびプライマー結合部位で標的化されるものであることが示された。キャップ、５’未翻訳領域、およびポリ（Ａ）シグナルは、レトロウイルスＲＮＡの末端（Ｒ領域）で反復される配列内に位置し、またこれらに相補的なオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡに２回結合しうる。
【００６５】
典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜３５塩基長である。例えば、２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、表皮成長因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Ｗｉｔｔｅｒｓら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ５３：４１−５０頁（１９９９年））、また２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％超低下させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９１：２６１−７頁（１９９９年））。しかし、この範囲外の長さ、例えば１０、１１、１２、１３、もしくは１４塩基、または３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基を有するオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい場合があることは理解されている。
【００６６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、全身投与してもよい。あるいは、また好ましくは、塩基対合の特徴を示すポリヌクレオチドに固有の結合特異性は、ポリヌクレオチドのその意図される遺伝子座に対するインビボでの利用可能性を制限し、より少ない用量の使用を許容し、また全身性効果を最小にすることによって促進される。したがって、ポリヌクレオチドは、固形腫瘍に局所的に適用し、所望される効果を得てもよい。所望される遺伝子座でのポリヌクレオチドの濃度は、ポリヌクレオチドが全身投与された場合よりはるかに高く、また治療効果は、有意により少ない総量を用いて得られうる。局所的な高濃度のポリヌクレオチドは、標的化細胞の透過性を促進し、標的核酸配列の翻訳を有効に遮断する。
【００６７】
アンチセンス剤はまた、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡまたは遺伝子）に結合するより大きい分子を含み、かつタンパク質の発現を実質的に阻止しうることは理解されるであろう。したがって、各ｍＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス分子についても予想される。
【００６８】
同分子は、任意の好適な遺伝子コンストラクトから発現させ、患者に送達してもよい。典型的には、アンチセンス分子を発現する遺伝子コンストラクトは、細胞内でアンチセンス分子を発現しうる、プロモーターに作動可能に連結されたＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡまたは遺伝子の少なくとも一部を含む。好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適している。
【００６９】
リボザイム
リボザイムは、部位特異的な方法で核酸が切断された、ＲＮＡまたはＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する。例えば、多数のリボザイムは、高い特異度でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断することが多い。この特異性は、基質が、化学反応前に、リボザイムの内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（「ＩＧＳ」）と特異的な塩基対合相互作用を介して結合する必要性に起因している。
【００７０】
リボザイム触媒作用は、主に核酸を含む配列特異的な切断／ライゲーション反応の一部として認められている。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号明細書は、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼの場合より大きい（ＤＮＡ制限酵素の場合に近い）配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用しうることを報じている。したがって、遺伝子発現の配列特異的なリボザイム媒介性阻害は、治療用途に特に適する可能性があり、またＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的なリボザイムは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０中に列挙されかつ図１中に列挙されるｃＤＮＡ配列を参照することにより、設計可能である。
【００７１】
ポリヌクレオチド阻害剤、例えばｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子およびリボザイムを患者に投与する方法および経路は、下記により詳述される。
【００７２】
また、上掲のポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子の転写を阻害するさらなる作用剤は、例えば、Ｉｓａｌａｎら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（７）：６５６−６０頁（２００１年））およびＵｒｎｏｖ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６４（５−６）：９１９頁（２００２年））に記載の改変された転写リプレッサーを用いて設計してもよい。さらに、それらは、例えば本発明の後述する態様において記載のスクリーニング方法を用いて選択してもよい。
【００７３】
調合物および投与経路
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が、典型的には、医薬組成物として、すなわち医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を伴い、個体に投与することを意図して調合されることになることは理解されている。
【００７４】
「医薬的に許容できる」には、製剤が滅菌されかつ発熱性物質が除去されていることが含まれる。好適な医薬担体、希釈剤および賦形剤は、薬学の当該技術分野で周知である。担体は、阻害剤に適合可能でありかつそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容できる」必要がある。典型的には、担体は、滅菌されかつ発熱性物質が除去される、水または生理食塩水となるが、他の許容できる担体を使用してもよい。
【００７５】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または調合物は、非経口投与、より詳細には静脈内投与を意図している。好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば注射による患者への静脈内投与に適している。
【００７６】
非経口投与に適した調合物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および調合物に対して意図されるレシピエントの血液で等張性を与える溶質を含有しうる水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含有しうる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００７７】
他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、患者への局所投与に適している。
【００７８】
好ましくは、調合物は、活性成分の、日常用量または単位、日常副用量またはその適切な画分を含有する単位用量である。
【００７９】
阻害剤は、経口的にまたは任意の非経口経路により、活性成分を含有する医薬調合物の形態で、場合により、医薬的に許容できる剤形で、非毒性の有機もしくは無機の酸または塩基、付加塩の形態で投与してもよい。処置されるべき疾患および患者ならびに投与経路に依存し、組成物は、異なる用量で投与してもよい。
【００８０】
ヒト治療においては、阻害剤は、一般に、意図される投与経路および標準の薬務との関連で選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与されることになる。
【００８１】
例えば、阻害剤は、錠剤、カプセル、オビュール（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で、経口的、口腔的または舌下的に投与してもよく、即時、遅延または制御放出用途として、香料または着色剤を含有してもよい。阻害剤はまた、陰茎海綿体内注射を介して投与してもよい。
【００８２】
好適な錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ポテトまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複雑珪酸塩などの崩壊剤、ならびに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの顆粒結合剤を含んでもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘナートおよびタルクなどの潤滑剤を含めてもよい。
【００８３】
類似タイプの固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として使用してもよい。これに関連する好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液および／またはエリキシルにおいては、本発明の化合物は、様々な甘味剤または香料、着色物質または染料、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにそれらの組み合わせと結合させてもよい。
【００８４】
阻害剤はまた、非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与してもよく、あるいは、それらは、注入技術によって投与してもよい。それらは、無菌水溶液（他の物質、例えば血液とともに等張溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含有しうる）の形態で使用するのが最適である。水溶液は、必要があれば、好適に緩衝化される必要がある（好ましくは３〜９のｐＨ）。無菌条件下での好適な非経口調合物の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に行われる。
【００８５】
調合物は、単回投与または複数回投与容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルで提示してもよく、また、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥条件下で保存してもよい。即時注射溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【００８６】
ヒト患者への経口および非経口投与においては、阻害剤の日常用量レベルは通常、成人１名あたり１〜１，０００ｍｇ（すなわち約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回または分割用量で投与されることになる。
【００８７】
したがって、例えば、阻害剤の錠剤またはカプセルは、必要に応じて、一度に１回または２回以上の投与に対し、１ｍｇ〜１，０００ｍｇの活性剤を含有してもよい。医師は、いずれの場合でも、任意の個別の患者に最適となる実用量を決定することになり、またそれは特定の患者の年齢、体重および応答に応じて変化することになる。上記用量は、平均的症例に典型的なものである。当然のことながら、用量範囲の拡大または縮小に値する個別例があってもよく、それらは本発明の範囲内に含まれる。
【００８８】
阻害剤はまた、鼻腔内にまたは吸入により、投与してもよく、また、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素または他の好適な気体の使用とともに、圧力容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器から、乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレー提示の形態で便益的に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計られた量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。圧力容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えば溶媒としてエタノールと推進剤の混合物を使用し、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、それはさらに、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエートを含有してもよい。吸入剤または吸入器における用途としてのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、抗体とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するように調合してもよい。かかる調合物は、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸膜肺芽腫またはカルシノイド腫瘍などの肺の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００８９】
エアロゾルまたは乾燥粉末調合物は、好ましくは、計られた各用量または「パフ（ｐｕｆｆ）」が患者への送達用に少なくとも１ｍｇの阻害剤を含有するように準備される。エアロゾルを伴う全日常用量が、患者間で変化することになり、単回用量、またはより通常には、１日を通して分割用量で投与可能であることは理解されるであろう。
【００９０】
あるいは、阻害剤は、特に、結腸、直腸または前立腺腫瘍を処置または標的化するため、坐剤またはペッサリーの形態で投与してもよい。
【００９１】
阻害剤はまた、眼内経路によって投与してもよい。眼科使用においては、阻害剤は、場合により、塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの防腐剤と組み合わせて、例えば、等張、ｐＨ調整、無菌の生理食塩水中の微粒化（ｍｉｃｒｏｎｉｓｅｄ）懸濁液として、または、好ましくは、等張、ｐＨ調整、無菌の生理食塩水中の溶液として調合してもよい。あるいは、それは、ワセリンなどの軟膏で調合してもよい。かかる調合物は、眼の固形腫瘍、例えば、網膜芽腫、髄様上皮腫、ブドウ膜メラノーマ、横紋筋肉腫、眼内悪性リンパ腫、または眼窩リンパ腫を処置するのに特に有用でありうる。
【００９２】
阻害剤は、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で、局所に適用してもよく、または、例えば皮膚パッチの使用により、経皮的に投与してもよい。皮膚への局所適用においては、阻害剤は、例えば、次のもの、すなわち、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水、のうちの１つもしくは複数との混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として調合してもよい。あるいは、それは、例えば、次のもの、すなわち、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水、のうちの１つもしくは複数との混合物中に懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして調合してもよい。かかる調合物は、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌またはメラノーマなどの皮膚の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００９３】
皮膚癌に対しては、阻害剤はまた、エレクトロインコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＥＩ）によって送達してもよい。ＥＩは、皮膚の表面上の直径が最大３０ミクロンの小さい粒子が、エレクトロポレーションにおいて使用される場合と同一または類似の電気パルスを受ける場合に行われる。ＥＩでは、これらの粒子は、角質層を貫通するように、また皮膚のより深い層に向けて駆動される。粒子は、阻害剤で負荷またはコートされるか、または単に、阻害剤が侵入しうる皮膚内に孔を作る「銃弾」として作用しうる。
【００９４】
口腔内への局所投与に適した調合物は、風味付けした基剤（ｆｌａｖｏｕｒｅｄ ｂａｓｉｓ）、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントの中に活性成分を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアの中に活性成分を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；ならびに、好適な液体担体中に活性成分を含むマウスウォッシュ、を含む。かかる調合物は、口腔および咽頭の固形腫瘍を処置するのに特に有用でありうる。
【００９５】
一実施形態では、阻害剤がポリペプチド、例えば抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体である場合、それは注射可能な徐放薬剤送達システムを使用して送達してもよい。これらは、注射の頻度を低減することに特化して設計される。かかるシステムの例として、組換えヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｒｈＧＨ）を分解性ミクロスフェアの中にカプセル化するＮｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔが挙げられ、それは、一旦注射されると、ｒｈＧＨを持続時間にわたって徐放する。
【００９６】
抗体は、薬剤を必要とされる部位、例えば眼に直接放出し、眼内腫瘍を処置する、外科的移植装置（ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）によって投与してもよい。疾患の部位へのかかる直接適用により、有意な全身性副作用を伴わない有効な治療がなされる。
【００９７】
ポリペプチド阻害剤、例えば抗体を送達するための他の方法が、感熱性のＲｅＧｅｌ注射可能システムである。ＲｅＧｅｌは、体温未満では、注射可能な液体である一方、体温では、徐々に浸食され、既知の安全な生分解性ポリマーに溶解するゲルリザーバ（ｇｅｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を直ちに形成する。活性薬剤は、生体高分子が溶解するにつれて、徐々に送達される。
【００９８】
抗体などのポリペプチド薬剤はまた、経口的に送達してもよい。同プロセスは、タンパク質およびペプチドを同時送達する、体内へのビタミンＢ１２の経口摂取における天然プロセスを利用する。タンパク質またはペプチドは、ビタミンＢ１２摂取系に乗ることにより、腸壁を通過しうる。複合体は、ビタミンＢ１２類似体と薬剤との間で合成され、それにより、複合体のビタミンＢ１２部分における内因性因子（ＩＦ）に対する有意な親和性と複合体の薬剤部分の有意な生物活性との双方が保持される。
【００９９】
ポリヌクレオチドは、任意の有効な方法、例えば、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）あるいは経口、経鼻またはポリヌクレオチドが患者の血流に接近し、その中を循環することを可能にする他の手段により、投与してもよい。全身投与されるポリヌクレオチドは、好ましくは、局所投与されるポリヌクレオチドに加えて与えられるが、局所投与の不在下でも有用性を有する。ヒト成人に対する１回の投与あたり約０．１〜約１０ｇの範囲内の用量は、一般に、この目的にとって有効となる。
【０１００】
ポリヌクレオチドは、それが発現される場合、患者に、下記のような好適な遺伝子コンストラクトとして投与し、送達してもよい。典型的には、遺伝子コンストラクト内のポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されることで、細胞内で化合物が発現されうる。本発明の遺伝子コンストラクトは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）における当該技術分野で周知の方法を用いて調製してもよい。
【０１０１】
ポリヌクレオチドの送達用の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうるが、それらがＤＮＡである場合が好ましい。
【０１０２】
好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適合する。
【０１０３】
遺伝子コンストラクトを動物体内の細胞に導入する手段および方法は、当該技術分野で既知である。例えば、本発明のコンストラクトは、任意の便益的な方法、例えばレトロウイルスを含む方法により、コンストラクトが細胞のゲノムに挿入されるように、細胞に導入してもよい。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａら（１９９１年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ．Ａｎｄ Ｆｕｎｃ．１６、５０３−５１０頁）においては、精製レトロウイルスが投与される。上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスＤＮＡコンストラクトは、当該技術分野で周知の方法を用いて作成してもよい。かかるコンストラクトから活性レトロウイルスを生成するため、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長されたエコトロピック性のｐｓｉ２パッケージング細胞系を使用することが一般的である。細胞系の形質移入は、便益的にリン酸カルシウム共沈によって行われ、かつ安定な形質転換体は、Ｇ４１８を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで添加することによって（レトロウイルスコンストラクトがｎｅｏＲ遺伝子を有することを仮定）選択される。独立コロニーは、単離され、展開され、培養上清が除去され、孔サイズが０．４５μｍのフィルタを通して濾過され、−７０℃で保存される。例えば、レトロウイルスの腫瘍細胞への導入においては、１０μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅが添加されているレトロウイルス上清を直接注射することが便益的である。直径が１０ｍｍを超える腫瘍においては、０．１ｍｌ〜１ｍｌの間、好ましくは０．５ｍｌのレトロウイルス上清を注射することが適切である。
【０１０４】
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、１５５０−１５５２頁）に記載のように、レトロウイルスを生成する細胞に注射してもよい。そのように導入されたレトロウイルス生成細胞を改変することで、レトロウイルスベクター粒子が活発に生成され、それにより、ベクターの連続的生成が原位置で腫瘤内部で行われる。
【０１０５】
標的化されるレトロウイルスはまた、本発明における使用において利用可能であり、例えば、特異的結合親和性を与える配列は、既存のウイルスｅｎｖ遺伝子に改変してもよい（遺伝子治療用のこの標的化ベクターと他の標的化ベクターのレビューについては、ＭｉｌｌｅｒおよびＶｉｌｅ（１９９５年） Ｆａｓｅｂ Ｊ．９、１９０−１９９頁を参照）。
【０１０６】
他の方法は、限定された期間か、または、ゲノムへの組込み後にはより長期間の、コンストラクトの細胞へのその中での発現のための単純な送達を含む。後者のアプローチの例として、リポソームが挙げられる（Ｎａｅｓｓａｎｄｅｒら（１９９２年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２、６４６−６５３頁）。
【０１０７】
他の送達方法は、抗体−ポリリシン架橋を介して外部ＤＮＡを有するアデノウイルス（Ｃｕｒｉｅｌ（１９９３年） Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０、１−１８頁を参照）および担体としてのトランスフェリン−ポリカチオン複合体（Ｗａｇｎｅｒら（１９９０年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、３４１０−３４１４頁）を含む。これらの方法の前者では、ポリカチオン−抗体複合体は、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトとともに形成され、ここで抗体は、抗体に結合する新しいエピトープが導入されている野生型アデノウイルスまたは変異体アデノウイルスのいずれかに特異的である。ポリカチオン部分は、リン酸塩骨格との静電相互作用を介してＤＮＡに結合する。アデノウイルスは、改変されていない線維およびペントンタンパク質を有することから、細胞に内在化され、細胞内にそれとともに本発明のＤＮＡコンストラクトを運ぶ。ポリカチオンがポリリシンである場合が好ましい。
【０１０８】
他の方法では、受容体媒介性エンドサイトーシスを利用し、ＤＮＡ高分子を細胞に運ぶ高効率核酸送達システムが用いられる。これは、鉄輸送タンパク質トランスフェリンを核酸に結合するポリカチオンに複合することによって行われる。ヒトトランスフェリン、またはニワトリの相同体コンアルブミン、またはそれらの組み合わせは、小さいＤＮＡ結合タンパク質のプロタミンまたは様々なサイズのポリリシンとジスルフィド結合を介して共有結合される。これらの修飾トランスフェリン分子は、それらの同種受容体に結合し、細胞への効率的な鉄輸送を媒介するそれらの能力を維持する。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸サイズと独立に、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトと電気泳動的に安定な複合体を形成する（短いオリゴヌクレオチドから２１キロ塩基対のＤＮＡまで）。トランスフェリン−ポリカチオンと本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトとの複合体は、腫瘍細胞に供給され、細胞内でのコンストラクトからの高レベルの発現が予想される。
【０１０９】
また、Ｃｏｔｔｅｎら（１９９２年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、６０９４−６０９８頁の方法によって生成される、欠陥があるかまたは化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いる、本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトの高効率受容体媒介性送達を使用してもよい。このアプローチは、アデノウイルスが、それらのＤＮＡがリソソームを通過することなく、また例えば本発明のＤＮＡコンストラクトまたは他の遺伝子コンストラクトに連結されたトランスフェリンの存在下でエンドソームから放出できるように適合され、コンストラクトが、アデノウイルス粒子と同じ経路により、細胞によって取り込まれるという事実に依存するように見られる。このアプローチは、複合体レトロウイルスコンストラクトを使用する必要がなく、レトロウイルス感染の場合に生じるようなゲノムの永続的修飾が全く生じることなく、また、標的化発現システムを標的化送達システムと共役させることで、他の細胞種に対する毒性が低下する、という利点を有する。
【０１１０】
「裸ＤＮＡ」ならびにカチオンおよび中性脂質と複合体が形成されたＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡを、処置されるべき個体の細胞に導入する上で有用でありうることは理解されるであろう。遺伝子治療に対する非ウイルスアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６、１１２９−１１４４頁）中に記載されている。
【０１１１】
特定の組織の固形腫瘍において、ポリヌクレオチド阻害剤をコードするベクター内で組織特異的プロモーターを使用することは有用でありうるが、これは本質的ではない。これは、標的化遺伝子が、腫瘍内皮において、単に発現されるか、または選択的に発現されるためである。したがって、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子およびリボザイムなど、ＣＬＥＣ１４Ａに特異的な阻害剤の、身体内の固形腫瘍以外の位置での発現であれば、ＣＬＥＣ１４Ａが発現されないかまたは比較的低いレベルで発現されることから、全く効果を有しないことが想定されることになる。さらに、標的ポリペプチドを低いレベルで発現しうる細胞内での、これらの阻害剤の不適切な発現のリスクは、固形腫瘍を患う患者に対する治療効果に比べて極めて少ない。
【０１１２】
また、標的化送達システム、例えば、典型的には、国際公開第９４／１０３２３号パンフレット中に記載の、ＤＮＡがアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子内部に運ばれる、修飾されたアデノウイルス系は既知である。Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９５年） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８頁では、細胞の選択部分を線維タンパク質に加えるというアデノウイルスの修飾についての記載がある。例えば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６頁において記載の、ｐ５３欠損ヒト腫瘍細胞内で選択的に複製する突然変異体アデノウイルスはまた、遺伝子コンストラクトを細胞に送達するのに有用である。他の好適なウイルス、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子は、レンチウイルスおよびレンチウイルスベクター、ＨＳＶ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびＡＡＶに基づくベクター、ワクチニアおよびパルボウイルス、を含む。
【０１１３】
ポリヌクレオチドを患者に送達する方法は、当業者に周知であり、免疫リポゾーム、ウイルスベクター（ワクチニア、修飾ワクチニア、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）の使用や、例えば遺伝子銃およびエレクトロポレーションを使用する、ＤＮＡの直接送達によるものを含む。さらに、処置のため、ポリヌクレオチドを患者の標的組織に送達する方法はまた、当該技術分野で周知である。
【０１１４】
治療剤を標的化し、それを身体の特異的領域に直接送達する方法は、当業者に周知である。
【０１１５】
例えば、米国特許第６，５０３，２４２号明細書は、治療剤を海馬に直接送達するための植込み型（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）カテーテル装置について記載している。作用剤を標的化し、それを脳に送達する方法は、脳の固形腫瘍の処置において使用してもよい。一実施形態では、ベクターを含む治療剤は、脳脊髄液への注射、例えば腰椎穿刺により、ＣＮＳの広範な領域全体に分布させてもよい（例えば、Ｋａｐａｄｉａら（１９９６年） Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０：５８５−５８７頁を参照）。あるいは、治療剤の脳の特異的部位への正確な送達は、定位マイクロインジェクション技術を用いて行ってもよい。例えば、処置されている対象は、定位フレームベース（ＭＲＩ互換性）内に置いて、次いで高分解能ＭＲＩを使用して画像化し、処置されるべき特異的領域の三次元位置を判定することが可能である。次いで、ＭＲＩ画像は、適切な定位ソフトウェアを有するコンピュータに移してもよく、多数の画像を使用し、治療剤のマイクロインジェクションにおける標的部位および軌跡が判定される。ソフトウェアは、軌道を、定位フレームとして正確に登録された三次元座標に翻訳する。頭蓋内送達の場合、頭蓋骨が露出され、穿頭孔が挿入部位上にドリル穿孔され、定位装置を使用し、針が位置決めされ、所定の深さでの注入が確認されることになる。治療剤は、ＣＮＳの領域、例えば、海馬、脊髄の細胞、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内部、後頭部、側頭部、頭頂部または前頭葉）、またはそれらの組み合わせに送達してもよい。別の実施形態では、治療剤は、局所的送達、例えば血液脳関門の局所的透過に適した他の送達方法を用いて送達される。米国特許出願公開第２００５／００２５７４６号明細書は、治療剤をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）ベクターの脳の特異的領域への局所的送達のための送達システムについて記載している。
【０１１６】
例えば、脳の固形腫瘍の処置用の治療剤がポリヌクレオチドによってコードされる場合、その発現が好適な組織特異的プロモーターの制御下にあることが好ましい場合がある。中枢神経系（ＣＮＳ）に特異的なプロモーター、例えば、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター（ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７頁）およびグリア特異的プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５：１８５−１９１頁）は、好ましくは、ポリヌクレオチドの発現を優先的にＣＮＳの細胞内で駆動するために使用される。好ましくは、プロモーターは、組織特異的であり、かつ中枢神経系外部では本質的に活性を示さないか、あるいはプロモーターの活性は、中枢神経系においては、他の細胞または組織内より高い。例えば、プロモーターは、脊髄、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内部、後頭部、側頭部、頭頂部または前頭葉）、またはそれらの組み合わせに対して特異的でありうる。プロモーターは、特定の細胞種、例えばＣＮＳにおけるニューロンまたはグリア細胞に対して特異的でありうる。それがグリア細胞内で活性を示す場合、それは、星状細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、またはミクログリアに対して特異的でありうる。それがニューロン内で活性を示す場合、それは、ニューロンの特定種、例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、または介在ニューロンに対して特異的でありうる。プロモーターは、脳の特定の領域、例えば、皮質、線条体（ｓｔｒａｔｉｕｍ）、黒質および海馬における細胞に対して特異的でありうる。
【０１１７】
好適なニューロン特異的プロモーターは、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；Ｏｌｉｖｉａら（１９９１年） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：１５７−１６５頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ５１９５６）、およびヒトニューロフィラメント軽鎖プロモーター（ＮＥＦＬ；Ｒｏｇａｅｖら（１９９２年） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：７８１頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ０４１４７）を含む。グリア特異的プロモーターは、限定はされないが、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６５２１０）、Ｓ１００プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１年）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ６５２１０）およびグルタミンシンターゼプロモーター（Ｖａｎ ｄｅｎら（１９９１年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２：２４９−２５１頁）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ５９８３４）を含む。好ましい実施形態では、遺伝子は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターにより、上流（すなわち５'側）に隣接される。別の好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、伸長因子１α（ＥＦ）プロモーターにより、上流（すなわち５'側）に隣接される。使用可能と思われる海馬特異的プロモーターは、海馬特異的グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子プロモーターである。
【０１１８】
あるいは、心臓の固形腫瘍の処置においては、Ｓｖｅｎｓｓｏｎら（１９９９年）が、組換え遺伝子の心筋細胞への、心臓作用性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ）ベクター、例えば組換えアデノ随伴ウイルスベクターの心筋内注射または冠動脈内注入による送達により、インビボでのマウス心筋細胞内でのトランス遺伝子の発現をもたらすことについて記載している（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら（１９９９年） 「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．」 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９９：２０１−５頁）。Ｍｅｌｏらは、心疾患に対する遺伝子および細胞に基づく治療についてレビューしている（Ｍｅｌｏら（２００４年） 「Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．」 ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８（６）：６４８−６３頁）。他の好ましい投与経路は、カテーテルまたはステントを介するものである。ステントは、持続的な遺伝子溶出および反対側の動脈壁での効率的な形質導入におけるプラットフォームを提供することから、局所的遺伝子送達における魅力的な選択肢を表す。この遺伝子送達方法は、ウイルスベクターの全身浸潤を低下させる可能性、ひいては低下した宿主免疫応答を有する。合成および天然ステントコーティングの双方は、持続的な遺伝子溶出を可能にし、それに伴う有害反応が全く有意でないという可能性を示している（Ｓｈａｒｉｆら（２００４年） 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃａｔｈｅｔｅｒ−ａｎｄ ｓｔｅｎｔ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．」 Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．６４（２）：２０８−１６頁）。
【０１１９】
細胞内でのポリヌクレオチド阻害剤の発現を一時的に調節できることが望ましい場合があるが、これは上で与えられる理由として本質的なことではない。したがって、ポリヌクレオチドの発現が、直接的または間接的に（下記参照）、例えば患者に投与可能な小分子の濃度によって調節可能なプロモーターの制御下にあることが望ましい場合があり、その場合、ポリヌクレオチドからの抗体の発現を（小分子が前記プロモーターの活性化または抑制を有効にするか否かに依存して）活性化するどころか抑制することが所望される。これは、発現コンストラクトが、安定である、すなわち、少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月または１年以上の期間、細胞内での（任意の必要な調節分子の存在下で）阻害剤の発現能を有する場合、特に有益でありうる。したがって、ポリヌクレオチドは、調節可能なプロモーターに作動可能に連結してもよい。調節可能なプロモーターの例として、次の論文、すなわち、Ｒｉｖｅｒａら（１９９９年） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９６（１５）、８６５７−６２頁（２つの別々のアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（一方は誘導性ヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｈＧＨ）標的遺伝子をコードし、他方は二分されたラパマイシン調節転写因子をコードする）を使用する、経口的に生物が利用可能な薬剤のラパマイシンによる制御）；Ｍａｇａｒｉら（１９９７年） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（１１）、２８６５−７２頁（ラパマイシンによる制御）；Ｂｕｅｌｅｒ（１９９９年） Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３８０（６）、６１３−２２頁（アデノ随伴ウイルスベクターに関するレビュー）；Ｂｏｈｌら（１９９８年） Ｂｌｏｏｄ ９２（５）、１５１２−７頁（アデノ随伴ベクター内のドキシサイクリンによる制御）；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら（１９９６年） Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ７４（７）、３７９−９２頁（誘導因子、例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、放射線照射、熱ショックおよび関連の応答因子に関するレビュー）において言及されたものが挙げられる。
【０１２０】
獣医学用途においては、阻害剤は、典型的には、通常の獣医学臨床に従う好適に許容できる調合物として投与され、獣医は、特定の動物にとって最適なものとなる投与計画および投与経路を決定することになる。
【０１２１】
併用療法
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００５年４月１４日付、２００５年６月１６日更新）（「Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｗｉｔｈ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」）によると、血管新生阻害剤の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブは、標準の化学療法と併用して投与される場合、多数の固形腫瘍における臨床転帰を改善する。用いられている併用は、ベバシズマブとイリノテカン、フルオロウラシル、およびロイコボリンとの併用；ベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ４（オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンのレジメン）との併用；ベバシズマブとパクリタキセルとの併用；ならびにベバシズマブとパクリタキセルおよびカルボプラチンとの併用、を含む。
【０１２２】
したがって、上記のＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、任意の他の抗癌化合物の不在下で臨床的に有効でありうるが、これらの阻害剤をさらなる抗癌剤と並行投与することが有利でありうることは理解されている。
【０１２３】
したがって、一実施形態では、本方法はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を個体に投与するステップを含んでもよい。本方法は、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤およびさらなる抗癌剤を含有する医薬組成物を個体に投与するステップを含んでもよい。しかし、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤およびさらなる抗癌剤が、別々に、例えば別々の投与経路によって投与可能であることは理解されている。したがって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤および少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、連続的または（実質的に）同時に投与可能であることは理解されている。それらは同じ医薬製剤または薬剤の中で投与してもよく、あるいはそれらは別々に調合し、投与してもよい。
【０１２４】
医学用途の一実施形態では、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を含んでもよい。
【０１２５】
医学用途の別の実施形態では、処置されるべき個体は、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が投与される個体であってもよい。個体は、さらなる抗癌剤を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤と同時に投与されうるが、個体は、さらなる抗癌剤を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を含有する薬剤を受ける前（または受けた後）に投与されている場合がある（または投与されることになる）ことは理解されている。
【０１２６】
さらなる抗癌剤は、アルキル化剤、例えば、窒素マスタード、例えば、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシル；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、例えばヘキサメチルメラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、チオテパ；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；およびトリアゼン、例えばデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾール−カルボキサミド）；代謝拮抗剤、メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含む；ピリミジン類似体、例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）；ならびにプリン類似体および関連阻害剤、例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）；ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドを含む天然生成物；エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；およびインターフェロンアルフェノーム（ａｌｐｈｅｎｏｍｅｓ）などの生物学的応答調節物質；シスプラチン（シス−ＤＤＰ）およびカルボプラチンなどの白金配位複合体を含む種々雑多な製剤（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ ａｇｅｎｔ）；ミトキサントロンおよびアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；ならびにミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）；タクソールおよび類似体／誘導体；細胞周期阻害剤；Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））などのプロテアソーム阻害剤；シグナルトランスダクターゼ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔａｓｅ）（例えばチロシンキナーゼ）阻害剤、例えば、Ｉｍａｔｉｎｉｂ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ＣＯＸ−２阻害剤、ならびにホルモン作動薬／拮抗薬、例えばフルタミドおよびタモキシフェン、から選択してもよい。
【０１２７】
臨床的に使用される抗癌剤は、典型的には、作用機序によって分類され、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、ＤＮＡ代謝拮抗剤および抗有糸分裂剤が挙げられる。米国ＮＩＨ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトは、１２２の化合物を挙げており（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｅａｒｃｈｅｓ／ｓｔａｎｄａｒｄ＿ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ｈｔｍｌ）、それら全部を、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤と併用してもよい。それらは、アルキル化剤、例えば、アサリー（Ａｓａｌｅｙ）、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、カルボキシフタラート白金（ｃａｒｂｏｘｙｐｈｔｈａｌａｔｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シス−白金、クロメソン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドーパ、ヘプスルファム、ヒカントン、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド（ｍｉｔｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、窒素マスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポプロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、ピコプラチン（ＳＰ−４−３）（シス−アミンジクロロ（２−メチルピリジン）Ｐｔ（ＩＩ））、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシル窒素マスタード、ヨシ（Ｙｏｓｈｉ）−８６４；抗有糸分裂剤（ａｎｉｔｍｉｔｏｔｉｃ）、例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、タクソール、タクソール誘導体、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン、カンプトテシン、Ｎａ塩、アミノカンプトテシン、２０のカンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、アモナファイド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール（ｏｘａｎｔｈｒａｚｏｌｅ）、ルビダゾン、ＶＭ−２６、ＶＰ−１６；ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、例えば、Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、アシビシン、３つのアミノプテリン誘導体、アンチフォル（ａｎｔｉｆｏｌ）、可溶性ベーカーズアンチフォル（Ｂａｋｅｒ'ｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｆｏｌ）、ジクロロアリルローソン（ｄｉｃｈｌｏｒａｌｌｙｌ ｌａｗｓｏｎｅ）、ブレキナル、フトラフル（プロドラッグ）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、ピラゾフリン、トリメトレキサート；ＤＮＡ代謝拮抗剤、例えば、３−ＨＰ、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−ＨＰ、α−ＴＧＤＲ、アフィジコリングリシナート、アラ−Ｃ、５−アザ−２'−デオキシシチジン、β−ＴＧＤＲ、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシ尿素、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾロイミダゾール、チオグアニンおよびチオプリン、を含む。
【０１２８】
しかし、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、シスプラチン；カルボプラチン；ピコプラチン；５−フルオロウラシル；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トミュデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン；ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチンから選択されることは好ましい。
【０１２９】
さらなる抗癌剤が、特定の腫瘍タイプに対して特に有効であることが示されている場合、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤をそのさらなる抗癌剤と併用し、特定の腫瘍タイプを処置することが好ましい場合がある。
【０１３０】
細胞毒性剤の標的化送達
より選択的な、ひいてはより優れた抗癌剤の開発に向けた手段の一つは、生物活性分子の、腫瘍内皮マーカーに特異的な分子（例えばヒト抗体）に結合することによる、腫瘍環境への標的化送達である。それらの利用可能性およびそれらが可能にする治療オプション（例えば腔内血液凝固または免疫細胞の動員）に起因し、腫瘍血管上に選択的に発現される血管マーカーは、理想的にはリガンドに基づく腫瘍標的化方法に適合し、腫瘍血管新生のイメージングおよび腫瘍血管新生に対する細胞毒性剤の標的化が可能になる。
【０１３１】
したがって、本発明の第２の態様は、細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化する方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１３２】
本発明のこの態様はまた、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体と、（ｉｉ）細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化するための、薬剤の調製における細胞毒性部分と、を含む化合物の使用を提供する。この態様は、細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に標的化する上での使用を意図したかかる化合物をさらに提供する。
【０１３３】
典型的には、細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子、から選択される。かかる細胞毒性部分、ならびに抗体および細胞毒性部分を含む複合体を作製する方法の例は、出願人らが以前に公表した国際公開第０２／３６７７１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）において提供されている。
【０１３４】
細胞毒性部分は、新生血管における細胞あるいは新生血管に極めて接近し、それに関連する細胞に対して直接的または間接的に毒性を示しうる。「直接的に細胞毒性を示す」には、同部分がそれ自体で細胞毒性を示す部分であるという意味が含まれる。「間接的な細胞毒性」には、同部分が、それ自体で細胞毒性を示さないが、例えばさらなる分子に対するその活性によるかまたはそれに対するさらなる活性により、細胞毒性を誘発しうる部分であるという意味が含まれる。
【０１３５】
一実施形態では、細胞毒性部分は、細胞毒性化学療法剤である。細胞毒性化学療法剤は、当該技術分野で周知である。細胞毒性化学療法剤、例えば抗癌剤は、本明細書中に列挙されるものを含む。
【０１３６】
様々なこれらの細胞毒性部分、例えば細胞毒性化学療法剤は、予め抗体および他の標的化剤に結合されており、それにより、これらの作用剤を含む本発明の化合物は、当業者によって容易に作製可能である。例えば、カルボジイミド複合（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ（１９８０年） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０、１５１−１５９頁）を用い、ドキソルビシンを含む種々の作用剤を抗体に複合してもよい。また、細胞毒性部分を抗体に複合するための他の方法を用いてもよい。例えば、グルタルアルデヒド架橋が使用可能であるように、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化とその後の適切な反応物の還元的アルキル化を用いてもよい。ポリペプチドを架橋する方法は、当該技術分野で既知であり、国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレット中に記載されている。しかし、それとは無関係に、本発明の化合物を生成する方法が選択され、抗体がその標的化能を維持し、かつ結合部分がその関連機能を維持しているという判定がなされる必要があることが理解されている。
【０１３７】
本発明のさらなる実施形態では、細胞毒性部分は、細胞死をもたらす任意の部分が含まれる細胞毒性ペプチドまたはポリペプチド部分であってもよい。細胞毒性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当該技術分野で周知であり、例えば、リシン、アブリン、緑膿菌外毒素、組織因子などを含む。それらを抗体などの標的化部分に結合するための方法はまた、当該技術分野で既知である。細胞毒性剤としてのリシンの使用は、ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ（１９９３年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０、８９９６−９０００頁において記載されており、また、局所的血液凝固および腫瘍の梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ｒａｎら（１９９８年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、４６４６−４６５３頁およびＨｕａｎｇら（１９９７年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、５４７−５５０頁によって記載されている。Ｔｓａｉら（１９９５年） Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３８、１０６７−１０７４頁は、モノクローナル抗体に複合されたアブリンＡ鎖について記載している。タンパク質を不活性化する他のリボソームは、細胞毒性剤として、国際公開第９６／０６６４１号パンフレット中に記載されている。緑膿菌外毒素はまた、細胞毒性ポリペプチド部分として使用可能である（Ａｉｅｌｌｏら（１９９５年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２、１０４５７−１０４６１頁）。
【０１３８】
特定のサイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＮＦγおよびＩＬ−２もまた、細胞毒性剤として有用でありうる。
【０１３９】
特定の放射性原子もまた、十分な用量で送達される場合、細胞毒性を示しうる。したがって、細胞毒性部分は、使用時に、細胞毒性を示すように十分な量の放射能を標的部位に送達する放射性原子を含んでもよい。好適な放射性原子は、リン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、レニウム−１８６、レニウム−１８８またはイットリウム−９０、または、十分なエネルギーを放射し、近隣の細胞、オルガネラまたは核酸を破壊する任意の他の同位体、を含む。好ましくは、本発明の化合物中の放射性原子の同位体および密度は、４０００ｃＧｙより大きい（好ましくは少なくとも６０００、８０００もしくは１００００ｃＧｙ）放射線量が、標的部位、好ましくは標的部位の細胞およびそのオルガネラ、特に核に送達される程度である。
【０１４０】
放射性原子は、既知の方法で抗体に結合してもよい。例えば、ＥＤＴＡまたは別のキレート剤は、抗体に結合させ、またそれを使用し、１１１Ｉｎまたは９０Ｙに結合させてもよい。チロシン残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識してもよい。
【０１４１】
細胞毒性部分は、放射線増感剤であってもよい。放射線増感剤は、フロロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、３−アミノベンズアミド、３−アミノベンゾジアミド（ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｍｉｄｅ）、エタニクサドール（ｅｔａｎｉｘａｄｏｌｅ）、ピモニダゾールおよびミソニダゾール、を含む（例えば、ＭｃＧｉｎｎら（１９９６年）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８、１１９３−１１２０３頁；ＳｈｅｗａｃｈおよびＬａｗｒｅｎｃｅ（１９９６年） Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １４、２５７−２６３頁；Ｈｏｒｓｍａｎ（１９９５年） Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３４、５７１−５８７頁；ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ（１９９２年） Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０、５３３−５５１頁；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．５６、８２７−８３６頁；ＩｌｉａｋｉｓおよびＫｕｒｔｚｍａｎ（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、１２３５−１２４１頁；Ｂｒｏｗｎ（１９８９年） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、９８７−９９３頁；Ｂｒｏｗｎ（１９８５年） Ｃａｎｃｅｒ ５５、２２２２−２２２８頁を参照）。
【０１４２】
細胞毒性部分は、凝血促進因子、例えば組織因子の細胞外ドメインであってもよい（Ｒｉｐｐｍａｎｎら（２０００年） 「Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｔｏ ａ ｔｕｍｏｕｒ ｓｔｒｏｍａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．」 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３４９：８０５−１２頁；Ｈｕａｎｇら（１９９７年） 「Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５（５２９９頁）：５４７−５５０頁）。
【０１４３】
細胞毒性部分は、間接的な細胞毒性ポリペプチドであってもよい。特に好ましい実施形態では、間接的な細胞毒性ポリペプチドは、酵素活性を有し、比較的非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬に変換可能なポリペプチドである。標的化部分が抗体である場合、この種の系は、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）と称されることが多い。同系は、標的化部分が酵素部分を患者の身体内の所望される部位（例えば腫瘍に関連した新しい血管組織の部位）に位置づけ、酵素が同部位に局在化されるだけの時間が経過後、酵素に対する基質であるプロドラッグを投与し、触媒作用の最終産物が細胞毒性化合物であることを必要とする。同アプローチの目的は、所望される部位での薬剤の濃度を最大化し、正常組織内での薬剤の濃度を最小化することであり（Ｓｅｎｔｅｒら（１９８８年） 「Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、４８４２−４８４６頁；Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９８７年） Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６、５３１−２頁；およびＢａｇｓｈａｗｅら（１９８８年） 「Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｉｔｅｓ」 Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．５８、７００−７０３頁）、また、Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９９５年） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３４、２２０−２３０頁および国際公開第２００４／０４６１９１号パンフレットは、本発明との関連で好適でありうる様々な酵素／プロドラッグの併用について記載している。
【０１４４】
典型的には、プロドラッグは、細胞毒性薬に比べて、比較的非毒性である。典型的には、それは、好適なインビトロ細胞毒性試験における測定によると、１０％未満の毒性、好ましくは１％未満の毒性を有する。
【０１４５】
プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な同部分は、化合物の残りから単離される際、活性を示す可能性が高いが、あくまで、（ａ）それが化合物の残りと組み合わされ、かつ（ｂ）化合物が標的細胞に結合され、近接され、その中に内在化される場合にそれが活性を示すことが必要である。
【０１４６】
さらなる部分は、放射線照射時、細胞毒性を示すようになるかまたは細胞毒性部分を放出するものであってもよい。例えば、ホウ素−１０同位体は、適切に照射される場合、細胞毒性を示すα粒子を放出する（米国特許第４，３４８，３７６号明細書；Ｐｒｉｍｕｓら（１９９６年） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：５３２−５３５頁）。
【０１４７】
同様に、細胞毒性部分は、フォトフリンなど、光線力学的療法において有用なものであってもよい（例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８年） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９０、８８９−９０５頁を参照）。
【０１４８】
処置されるべき個体、固形腫瘍のタイプ、投与経路、抗体などに対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上で規定される通りである。
【０１４９】
細胞毒性剤の腫瘍血管新生への標的化が、腫瘍血管新生を阻害するように作用することになることは理解されている。したがって、本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に関連し、上で規定されるように、個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を個体に投与するステップを含む、方法を提供する。この第３の態様はまた、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製における、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用を提供する。この態様は、個体における腫瘍血管新生を阻害する上での使用を意図したかかる化合物をさらに提供する。処置されるべき個体、固形腫瘍のタイプ、投与経路、抗体などに対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上で規定される通りである。
【０１５０】
また、本発明の第２および第３の態様に記載のように、細胞毒性部分を腫瘍血管新生に対して標的化し、腫瘍血管新生を阻害することが、任意の他の抗癌化合物の不在下で臨床的に有効でありうるが、化合物をさらなる抗癌剤と並行投与することが有利でありうることは理解されている。したがって、本発明の第２および第３の態様の一実施形態では、本方法は、個体にさらなる抗癌剤を投与するステップを含んでもよい。投与されるべきさらなる抗癌剤に対する選好は、上記の通りである。（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物とさらなる抗癌剤とは、これらの両成分を含有する医薬組成物の形態で投与してもよい。しかし、化合物およびさらなる抗癌剤が、例えば別々の投与経路により、別々に投与可能であることは理解されている。したがって、化合物および少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、別々にまたは（実質的に）同時に投与可能であることは理解されている。それらは、同じ医薬製剤または薬剤の中で投与してもよく、あるいはそれらは別々に調合し、投与してもよい。
【０１５１】
腫瘍のイメージング、検出および診断
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、検出可能な部分に結合される場合、イメージング、例えば腫瘍の血管イメージングにおいて有用でありうる。腫瘍の血管イメージングにおいて有用な方法および化合物は、出願人らが以前に公表した国際公開第０２／３６７７１号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）において記載されている。
【０１５２】
上で規定された抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体および検出可能な部分を含む化合物は、適切な検出方法と併用し、個体における化合物の位置を検出し、それによって個体における腫瘍血管新生の部位および範囲を同定してもよい。
【０１５３】
したがって、本発明の第４の態様は、個体の身体における腫瘍血管新生をイメージングする方法であって、（ｉ）ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を個体に投与するステップと、身体における検出可能な部分をイメージングするステップと、を含む、方法を提供する。
【０１５４】
一実施形態では、本方法は、個体における化合物の位置を検出するステップをさらに含んでもよい。
【０１５５】
「検出可能な部分」には、同部分が、本発明の化合物の患者への投与後に標的部位に位置づけられる場合、典型的には身体および位置づけられた標的の部位の外部から非侵襲的に検出されうるものであるという意味が含まれる。したがって、本発明のこの態様の化合物は、イメージングおよび診断、特に固形腫瘍の血管新生のイメージングおよび診断において有用である。
【０１５６】
典型的には、検出可能な部分は、磁気ナノ粒子、放射性核種またはフルオロフォアであるかまたはそれらを含む。
【０１５７】
したがって、一実施形態では、検出可能な部分は、イメージングにおいて有用な放射性原子であってもよい。好適な放射性原子は、シンチグラフィー試験におけるテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３を含む。他の容易に検出可能な部分は、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）におけるスピン標識、例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含む。明らかに、本発明の化合物は、分子が検出可能であるように、十分な適切な原子同位体を有する必要がある。
【０１５８】
放射線標識または他の標識は、既知の方法で化合物に取り込んでもよい。例えば、抗体が、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成により、生合成または合成できる場合である。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、抗体におけるシステイン残基を介して結合させてもよい。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合させてもよい。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９−５７頁）を使用し、ヨウ素−１２３を取り込んでもよい。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）は、他の方法について詳述している。
【０１５９】
多くの好適なフルオロフォアおよび検出方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｔｅｆａｎ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓら（１９９７年） 「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．」 Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４２：８１５−８２４頁；Ａｌｔｉｎｏｇｌｕら（２００８年） 「Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−Ｄｏｐｅｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」 ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２（１０）：２０７５−８４頁；およびＣｈｉｎら（２００９年） 「Ｉｎ−ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｈｌｏｒｉｎ ｅ６−ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」 ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ９：１（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２３４２−９−１）により、記載されている。
【０１６０】
典型的には、個体は、固形腫瘍、好ましくは本発明の第１の態様に関連する上記のものなどを有し、固形腫瘍の血管新生は画像化される。したがって、身体における特定の器官での抗体の局在化は、個体が、その器官に固形腫瘍を有するかまたは発生させている可能性があることを示す。この方法は、例えば、過去に診断された固形腫瘍のサイズを判定するか、固形腫瘍に対する治療の有効性を判定するか、または腫瘍の転移の範囲を判定する上で有用でありうる。身体における検出可能な部分を画像化するための方法は、当該技術分野で周知であり、ＰＥＴ（ポジトロンエミッショントモグラフィー）を含む。
【０１６１】
したがって、本発明のこの態様は、個体における固形腫瘍を検出、診断または予測する方法であって、
（ｉ）ポリペプチドＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を個体に投与するステップと、
身体における検出可能な部分の存在および／または位置を検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【０１６２】
抗体、化合物および検出可能な部分に対する選好は、上記の通りである。
【０１６３】
他の血管新生条件
出願人らの知る限りにおいては、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生の阻害剤であることがかつて示唆されたことはない。また、血管新生の阻害が、腫瘍以外の血管新生疾患または症状を処置する上で有用でありうることは理解されるであろう。したがって、本発明の第５の態様に従い、処置を必要とする個体における血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法が提供される。
【０１６４】
腫瘍以外では、血管新生の阻害はまた、不要な、望ましくないまたは不適切な血管新生を含む任意の疾患または症状と闘う上で有用でありうる。かかる症状は、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、を含む。したがって、本発明のこの態様は、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を、それを必要とする個体に投与することによる、これらの疾患または症状を処置する方法を含む。本発明はまた、これらの疾患または症状を処置するための、薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用を提供する。これらの疾患および症状は、望ましくない血管新生形成に関連し、典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤は、これを有効な範囲まで低減する。
【０１６５】
「血管新生を阻害する」には、血管新生の速度またはレベルを低下させるという意味が含まれる。低下は、血管新生の速度またはレベルの約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％といった低レベルの低下であってもよい。好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％の低下といった中間レベルの低下である。より好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９９％、もしくは約９９．９％、もしくは約９９．９９％といった高レベルの低下である。最も好ましくは、阻害はまた、血管新生の除去または検出不能なレベルまでのその低下を含んでもよい。血管新生の速度またはレベルを測定する、ひいてはＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤が血管新生を阻害するか否かとその範囲の程度を判定するための方法およびアッセイは、当該技術分野で既知であり、本明細書中に記載される。
【０１６６】
療法（治療）は、ヒトまたは動物が対象であってもよい。好ましくは、本発明の方法を使用することで、ヒトが処置される。
【０１６７】
ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤、調合物および投与経路などに対する選好は、上で規定される通りである。
【０１６８】
生体外方法
本発明の第６の態様は、血管新生を阻害する生体外方法であって、生体外でＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を組織または細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。典型的には、血管新生を阻害するこの生体外方法は、血管新生アッセイとの関連でまたは腫瘍血管新生のモデルにおいて、例えば下記のように実施される。したがって、細胞は、個体から取り出されている腫瘍細胞系または腫瘍細胞で確立してもよい。組織または細胞は、好ましくは哺乳類組織または細胞、および最も好ましくはヒト組織または細胞である。好ましくは、組織または細胞は、腫瘍内皮を含むか、または腫瘍内皮のモデルである。ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤に対する選好は、本発明の第１の態様に関連し、上記の通りである。
【０１６９】
好適な血管新生アッセイは、内皮細胞の増殖、移動および浸潤に対するアッセイを含み、また、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）製のカタログ番号３５４１４１および３５４１４２として利用可能なＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎを含む。腫瘍血管新生の好適なモデルは、腫瘍内皮細胞の移動、例えば腫瘍内皮細胞のｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘発性の移動、増殖、および腫瘍内皮細胞の浸潤に対するアッセイ、ならびに大動脈輪アッセイを含む。
【０１７０】
スクリーニング
本発明の第７の態様は、固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤、または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
ポリペプチドＣＬＥＣ１４Ａまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
候補化合物を血管新生アッセイにおいて試験するステップと、
を含み、ここで、アッセイにおける血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤であるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物であってもよい、方法を提供する。
【０１７１】
一実施形態では、本方法は、候補化合物がＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に選択的に結合するか否かを判定する、先行するステップをさらに含む。
【０１７２】
これらの方法を用い、抗癌剤でありうる抗血管新生因子を同定することが可能であることは理解されている。
【０１７３】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、図１中に列挙される配列（配列番号１）を有するポリペプチドおよびその天然変異体が含まれる。結合アッセイにおいては、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド配列に対して１００％の配列同一性を有するポリペプチドを使用する必要がない（完全長ポリペプチドまたはその断片の全体にわたるか否かにかかわらず）ことは理解されている。したがって、本発明のこの態様では、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａ配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを使用することは可能である（完全長ポリペプチドまたはその断片にわたるか否かにかかわらず）。変異体ポリペプチドが、図１中に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの配列の、少なくとも２０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０残基の連続領域を有する場合が好ましい。かかる変異体は、例えば、当該技術分野で周知の、組換えＤＮＡ技術、タンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作製してもよい。
【０１７４】
２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータプログラム、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定してもよく、パーセント同一性が、配列が最適に整列されているポリペプチドに関連して計算されることは理解されるであろう。アラインメントは、あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４年） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２、４６７３−８０頁）を使用して実行してもよい。使用されるパラメータは、以下の通りである。すなわち、Ｆａｓｔペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上方対角線の数；５、スコアリング法：ｘパーセント。多重アラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１７５】
また、候補化合物が特異的ポリペプチドに結合するか否かを判定するのに、結合アッセイにおいて必ずしも完全長ポリペプチド全体を使用する必要がなく、かつポリペプチドの断片を有効に使用することが可能であることは理解されている。好ましくは、断片は、少なくとも２０アミノ酸残基長であり、２０〜５０の間の残基長または５０〜１００の間の残基長または１００〜１５０の間の残基長または１５０〜２００の間の残基長、またはそれ以上であってもよい。断片が成熟ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの細胞外ドメインの断片であるか、または断片がそれを有することが好ましい。
【０１７６】
一実施形態では、候補化合物は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片であってもよい。好適な抗体は、上記のものである。
【０１７７】
別の実施形態では、候補化合物は、ペプチドであってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適なペプチドは、ペプチドライブラリのファージディスプレイ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０年） 「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０頁；Ｆｅｌｉｃｉら（１９９５年） 「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．」 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９−１８３頁）；およびＣｏｌｌｉｎｓら（２００１年） 「Ｃｏｓｍｉｘ−ｐｌｅｘｉｎｇ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３１７−３３８頁）；例えばインビボパニング（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９７年） 「αｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６頁）、および固相パラレル合成（Ｆｒａｎｋ（２００２年） 「Ｔｈｅ ＳＰＯＴ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：１３−２６頁；ならびにＰｉｎｉｌｌａら（２００３年） 「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１１８−１２２頁）などの方法によって同定してもよい。ペプチドの解離定数は、典型的にはマイクロモルの範囲内にあるが、親和性は、多量体化によって改善されうる（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７年） 「“Ｐｅｐｔａｂｏｄｙ”：ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１６６３−１６６８頁；およびＷｒｉｇｈｔｏｎら（１９９７年） 「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１２６１−１２６５頁）。
【０１７８】
Ｃ型レクチンの一次リガンドは、たとえ他のタンパク質、脂質または無機化合物への結合が示されていても、炭水化物である。したがって、別の実施形態では、候補化合物は、炭水化物、または糖タンパク質もしくは糖脂質などの炭水化物部分を有する分子であってもよい。Ｃ型レクチンによる炭水化物の認識および結合がカルシウム依存性であることは理解されている。したがって、この実施形態では、本方法は、カルシウムイオンの存在下で実施される。
【０１７９】
さらに別の実施形態では、候補化合物は、アプタマー、すなわち特異的リガンド結合構造に折りたたまれた一本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適なアプタマーは、インビトロ選択および増幅などの方法によって同定してもよい（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９２年） 「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｆｏｌｄ ｉｎｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２頁；およびＤａｎｉｅｌｓら（２００３年） 「Ａ ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ ａｐｔａｍｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００、１５４１６−１５４２１頁）。アプタマーは、ヌクレアーゼ安定性を示す「シュピーゲルマー」であってもよい（Ｈｅｌｍｌｉｎｇら（２００４年） 「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ａｎ ＲＮＡ−Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１３１７４−１３１７９頁）。アプタマーは、典型的には、マイクロモルからサブナノモルの範囲内にある解離定数を有する。
【０１８０】
さらに別の実施形態では、候補化合物は、小さい有機分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する好適な小分子は、化合物の大ライブラリのスクリーニング（Ｂｅｃｋ−ＳｉｃｋｉｎｇｅｒおよびＷｅｂｅｒ（２００１年） 「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）；核磁気共鳴による構造−活性関係による（Ｓｈｕｋｅｒら（１９９６年） 「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ ｂｙ ＮＭＲ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５３１−１５３４頁）；コード化された自己集合の化学ライブラリＭｅｌｋｋｏら（２００４年） 「Ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８−５７４頁）；ＤＮＡ鋳型化学（Ｇａｒｔｎｅｒら（２００４年） 「ＤＮＡ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１６０１−１６０５頁）；動的コンビナトリアル化学（ＲａｍｓｔｒｏｍおよびＬｅｈｎ（２００２年） 「Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６−３６頁）；連結（ＡｒｋｉｎおよびＷｅｌｌｓ（２００４年） 「Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｒｅａｍ．」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１−３１７頁）；ならびにスピードスクリーン（ｓｐｅｅｄ ｓｃｒｅｅｎ）（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌら（２００４年） 「ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｏｒｐｈａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ．」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１−２４９頁）などの方法によって同定してもよい。典型的には、小さい有機分子は、ナノモル範囲内のポリペプチドに対する、特に空洞（ｃａｖｉｔｙ）を有する抗原に対する解離定数を有することになる。最小の有機分子結合剤の利点として、それらの作製しやすさ、免疫原性の欠如、組織分布特性、化学修飾方法および経口バイオアベイラビリティが挙げられる。
【０１８１】
候補化合物が、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片と結合または相互作用する能力は、下でさらに考察されるように、タンパク質／タンパク質相互作用または他の化合物／タンパク質相互作用を検出／測定する任意の方法によって測定してもよい。好適な方法は、例えば、酵母ツーハイブリッド相互作用、同時精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降および表面プラスモン共鳴法などの方法を含む。したがって、候補化合物とポリペプチドまたはその断片との間の相互作用が、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降または表面プラスモン共鳴法、あるいは酵母ツーハイブリッド相互作用または同時精製方法によって検出可能である場合、候補化合物は、ポリペプチドまたはその断片に結合する能力があると考えることができる。同相互作用が表面プラスモン共鳴法を用いて検出できることは好ましい。表面プラスモン共鳴法は、当業者に周知である。例えば、技術は、Ｏ'Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ Ｄ．Ｊ．（１９９４年） 「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒａｔｅ ａｎｄ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ ｃｒｉｔｉｑｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（１）：６５−７１頁；Ｆｉｖａｓｈら（１９９８年） 「ＢＩＡｃｏｒｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：９７−１０１頁；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ（１９９９年） 「ＢＩＡＣＯＲＥ：ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．」 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２７（２）：３３５−４０頁において記載されている。
【０１８２】
高スループット処理が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことは理解されている。例として、細胞に基づくアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイを含んでもよい。ＳＰＡに基づく（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）システムを使用してもよい。例えば、タンパク質キナーゼの活性を調節可能な化合物を同定するためのアッセイは、次のように実施してもよい。シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を含むビーズおよびリン酸化可能な基質ポリペプチドは、調製可能である。ビーズは、タンパク質キナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含む試料と、また試験化合物と混合してもよい。便宜上、これは、マルチウェル（例えば、９６または３８４）フォーマットで行われる。次いで、プレートは、３２Ｐまたは３３Ｐ ＳＰＡアッセイにおける既知のパラメータを用いる好適なシンチレーションカウンタを使用し、計数される。シンチラントに接近している３２Ｐまたは３３Ｐのみ、すなわちポリペプチドに結合されたそれのみが検出される。また、例えば、ポリペプチドがシンチラントビーズ上に抗体または抗体断片への結合を介して固定される場合、かかるアッセイの変異体を使用してもよい。
【０１８３】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法は、限界濾過とともにイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理的分析法を含む。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）法を使用してもよく、ここでは、２つの蛍光標識された実体の結合が、互いに近接している場合に蛍光標識の相互作用を測定することによって測定可能である。
【０１８４】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合可能な化合物を同定するさらなる方法が、ポリペプチドが化合物に暴露され、かつ化合物の前記ポリペプチドへの任意の結合が検出され、および／または測定される場合の方法である。化合物のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの結合における結合定数が測定されうる。化合物のポリペプチドへの結合を検出し、および／または測定（定量）するための好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、高スループット処理が可能な方法、例えばチップに基づく方法を用いて実施してもよい。ＶＬＳＩＰＳ（商標）と称される技術により、数十万以上の異なる分子プローブを有する極小チップの生成が可能になっている。これらの生物学的チップまたはアレイは、アレイ内に配列されたプローブを有し、各プローブは特定の位置に割り当てられる。生物学的チップは、各位置が例えば１０ミクロンの規模を有するように生成されている。チップを使用し、標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するか否かを判定することが可能である。アレイを選択された試験条件下で標的分子に暴露した後、走査デバイスにより、アレイ内の各位置を検査し、標的分子がその位置でのプローブと相互作用しているか否かを判定することができる。
【０１８５】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する候補化合物の同定が、薬剤スクリーニング経路における最初のステップでありえ、また同定された化合物は、例えば血管新生に対する阻害能についてさらに選別されうることは理解されている。
【０１８６】
「血管新生を阻害する」には、血管新生の速度またはレベルを低下させるという意味が含まれる。低下は、血管新生の速度またはレベルの約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％といった低レベルの低下であってもよい。好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％の低下といった中間レベルの低下である。より好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９９％、もしくは約９９．９％、もしくは約９９．９９％といった高レベルの低下である。最も好ましくは、阻害はまた、血管新生の除去または検出不能なレベルまでのその低下を含んでもよい。
【０１８７】
血管新生の速度またはレベルを測定する、ひいては試験化合物が血管新生を阻害するか否かとその範囲の程度を判定するための方法およびアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，２２５，１１８号明細書（参照により本明細書中に援用される）は、血管新生の複合的（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ステージ、すなわち細胞発生の増殖、移動および分化ステージをモデル化するための多細胞生体外アッセイ（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｓｓａｙ）について記載している。ＴＣＳ ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ Ｌｔｄ．（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ ＭＫ１８ ２ＬＲ，ＵＫ）によるＡｎｇｉｏＫｉｔ（カタログ番号ＺＨＡ−１０００）は、化合物の抗血管新生特性を分析するためのヒト血管新生の好適なモデルである。血管新生の速度またはレベルはまた、当該技術分野で周知の大動脈輪アッセイおよびスポンジ血管新生アッセイを用いて測定してもよい。
【０１８８】
また、内皮細胞の増殖、移動および浸潤についてのアッセイは、血管新生アッセイとして有用である。内皮細胞の増殖および移動に適したアッセイは、当業者に既知であり、本明細書中に記載される。内皮細胞の浸潤に適したアッセイもまた、当業者に既知であり、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）製、カタログ番号３５４１４１および３５４１４２として利用可能）を含む。
【０１８９】
発明者はまた、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する候補化合物が、腫瘍内皮細胞の移動、例えばｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘発性の移動を阻害し、阻害する腫瘍内皮細胞の増殖、あるいは腫瘍内皮細胞の浸潤を阻害しうることについて考察している。したがって、ＨＵＶＥＣ移動アッセイにおいて阻害活性を示すか、または抗増殖活性を示すか、または、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））などのアッセイにおいて抗浸潤活性を示す候補化合物は、固形腫瘍と闘う上で治療的に有用でありえ、ここで腫瘍内皮細胞の移動、増殖または浸潤は、新血管系の血管新生ひいては固形腫瘍の病理学に寄与する。
【０１９０】
これらの方法が、当業者に周知の用語である薬剤スクリーニング方法であってもよく、候補化合物が、薬様化合物または薬様化合物の開発のためのリード化合物であってもよいことは理解されている。
【０１９１】
用語「薬様化合物」は、当業者に周知であり、薬剤用途として、例えば薬剤中の活性成分として適合させる特性を有する化合物の意味を含んでもよい。したがって、例えば、薬様化合物は、有機化学の技術、優先度は下がるが分子生物学または生化学の技術によって合成可能な分子であってもよく、好ましくは小分子であり、それは、５０００ダルトン未満であってもよく、また水溶性であってもよい。さらに、薬様化合物は、特定の１つもしくは複数のタンパク質との選択的相互作用に加え、バイオアベイラビリティが高く、および／または、標的細胞膜または血液脳関門を貫通できるという特徴を示しうるが、これらの特徴が本質的なものでないことは理解されるであろう。
【０１９２】
用語「リード化合物」は、同様に当業者に周知であり、化合物が、それ自体で薬剤としての使用に適しない（例えば、それは、その意図される標的に対する効力が弱いか、その活性において非選択的であるか、不安定であるか、溶解性が低いか、合成が困難であるか、または低いバイオアベイラビリティを有するに過ぎない）一方、より望ましい特性を有しうる他の化合物を設計するための出発点を提供しうるという意味を含んでもよい。
【０１９３】
一実施形態では、同定された化合物は、修飾され、また修飾された化合物は、血管新生に対する阻害能について試験される。血管新生の阻害に適したアッセイは、上記のものである。
【０１９４】
本スクリーニング方法を使用し、固形腫瘍と闘う上で有用でありうる作用剤を同定できることは理解されている。したがって、本スクリーニング方法はまた、好ましくは、同定された化合物または修飾された化合物を、癌、特に固形腫瘍の動物モデルにおける有効性について試験するさらなるステップを含む。好適なモデルは、当該技術分野で既知であり、マウスにおけるＬｅｗｉｓ肺癌皮下移植（Ｂｌａｃｋ５７マウスにおける同種移植）またはヌードマウスにおけるＨＴ２９異種移植片の皮下移植を含む。
【０１９５】
本発明は、同定された化合物または修飾された化合物を合成および／または（ａｎ／ｏｒ）精製するさらなるステップを含んでもよい。本発明は、化合物を医薬的に許容できる組成物に調合するステップをさらに含んでもよい。
【０１９６】
化合物はまた、当業者に周知のように、他の試験、例えば毒物または代謝試験を受けてもよい。
【０１９７】
したがって、本発明は、固形腫瘍の処置において有用でありうる抗癌剤を調製するための方法であって、化合物を上記のスクリーニング方法を用いて同定するステップと、同定された化合物を合成し、精製し、および／または、調合するステップと、を含む方法を含む。
【０１９８】
本発明はまた、医薬組成物を作製する方法であって、同定された化合物を、上記の方法を用い、医薬的に許容できる担体と混合するステップを含む、方法を含む。
【０１９９】
本明細書で言及されるすべての文書は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０２００】
本明細書中の明らかに先行的に公表された文書に関する列挙または考察は、必ずしも、文書が最先端技術の一部であるかまたは共通の一般的知識であることの確認として解釈されるべきではない。
【０２０１】
ここで、本発明は、以下の実施例および図面を参照することにより、より詳述されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１Ａ】Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０由来のヒトＣＬＥＣ１４Ａのポリペプチド配列（配列番号１）
【図１Ｂ】Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０由来のヒトＣＬＥＣ１４ＡのｃＤＮＡ（配列番号２）
【図１Ｃ】ＮＭ＿１７５０６０の位置３４８〜１８２０由来のヒトＣＬＥＣ１４Ａ ｃＤＮＡのコード領域（配列番号３）
【図２】ＨＵＶＥＣおよび他の一次細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対的発現を示すグラフ。ＣＬＥＣ１４Ａは、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において特異的に発現され、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）、ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）、肝細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において特異的に発現されなかった。
【図３】ゼブラフィッシュ胚の受精後２４時間以内のＣＬＥＣ１４Ａオルソログのインサイチュハイブリダイゼーション。ゼブラフィッシュＣＬＥＣ１４Ａオルソログは、背部大動脈、主静脈、および体節間血管（ｉｎｔｅｒ−ｓｏｍｉｔｉｃ ｖｅｓｓｅｌ）において発現される。
【図４】ＣＨＯ細胞内での完全長ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体のライブ蛍光イメージング。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体は、細胞膜に局在化し、糸状仮足および微小突起に集結し、同じパターンがＨＵＶＥＣ内に認められる。
【図５】コンフルエントなＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現およびＶＥ−カドヘリンとの共局在化の共焦点イメージング。ＣＬＥＣ１４Ａは、細胞間結合部で発現され、ＶＥ−カドヘリンと共局在化する。
【図６】ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンのウエスタンブロット。二本鎖１は、配列ＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡ（配列番号４）を有し、二本鎖２は、配列ＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号５）を有する。「スクランブルされた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈから入手し、配列が示されない非標的化ｓｉＲＮＡから構成される。未グリコシル化ポリペプチドは約６０ｋＤａ、また成熟グリコシル化タンパク質は約１００ｋＤａで認められる。
【図７】ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンの共焦点イメージングであり、ＶＥ−カドヘリンの発現に対して全く効果を有しない。
【図８Ａ】ｓｉＲＮＡノックダウンを伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、２つのＳｉＲＮＡ二本鎖によるＣＬＥＣ１４Ａのノックダウン後における傷口閉鎖（ｗｏｕｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ）の遅延を示す。
【図８Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図９Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体を伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、やはり傷口閉鎖の遅延を示す。
【図９Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図１０】せん断応力および静的条件下でのＨＵＶＥＣのリアルタイムＰＣＲ。ＲＯＢＯ４およびＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡの双方は、層流せん断応力（２Ｐａ）下で下方制御される。
【図１１】ヒト卵巣、膀胱、肝臓および乳房腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１２】ヒト結腸、直腸および膀胱（２通りの）腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１３】ヒト食道、腎臓および肺腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１４】ヒト前立腺、胃、膵臓および甲状腺腫瘍組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された全腫瘍組織における内皮に限局された。
【図１５】正常なヒトの脳、心臓および腎組織におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光分析。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析された正常な組織のいずれにおいても検出されなかった。
【図１６Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体ＣＲＴ−３を伴うＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、傷口閉鎖の遅延を示す。
【図１６Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【図１７Ａ】抗ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体ＣＲＴ−２を伴うＳＥＮＤスクラッチ創傷治癒アッセイの結果の光学顕微鏡画像であり、傷口閉鎖の遅延を示す。
【図１７Ｂ】（Ａ）からの結果のグラフ表示。
【実施例】
【０２０３】
実施例１：ＣＬＥＣ１４Ａに対する実験的研究
目的
発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現および機能を特徴づけるための多くの実験を行った。
【０２０４】
材料および方法
ＨＵＶＥＣの調製および培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ドナーのインフォームドコンセントを得た後にＵＫ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅによって提供されたへその緒から単離した。へその緒を胎盤から切除し、静脈を無菌ＰＢＳで洗浄し、血液を除去した。Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）で希釈した１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを、静脈に注射し、次いで３７℃で２０分間インキュベートし、内皮細胞を分離した。ＨＵＶＥＣを、１０％ＦＣＳ、１０％大血管内皮細胞成長添加物（ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓ）、および４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＭ１９９完全培地での洗浄によって採取し、ブタ皮膚（Ｓｉｇｍａ）でコートされたディッシュ由来の０．１％タイプ１ゼラチン上にプレーティングした。
【０２０５】
一次細胞の供給源
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）を、ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓから購入した。ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）を、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから得た。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た。肝細胞は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｄａｖｉｄ Ａｄａｍｓ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から贈呈された。
【０２０６】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）使用し、培養液中の一次細胞から単離した後、提供されたランダムプライマーを有するＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ｃＤＮＡ合成を行った。ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ リアルタイム ＰＣＲアッセイ系（Ｅｘｉｑｏｎ）を、ＣＬＥＣ１４Ａの発現の一次細胞スクリーニングにおいて使用した。フロチリン２をハウスキーピング遺伝子として選択し、それに対し、ＣＬＥＣ１４Ａの発現を正規化した。ＣＬＥＣ１４Ａおよびフロチリン２に対するプライマーおよびプローブセットを、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）によって設計した。ＣＬＥＣ１４Ａに対するプライマーおよびプローブセットは、
５’−ＣＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号６）、および
５’−ＣＧＣＧＡＴＧＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号７）（プローブ番号２４を伴う）
であった。
【０２０７】
フロチリン２に対するプライマーおよびプローブセットは、
５’−ＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号８）、および
５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＴＣＡＴＡＡＴＣＴ−３’（配列番号９）（プローブ番号２８を伴う）
であった。
【０２０８】
定量ＰＣＲ反応を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ３０００サーマルサイクラー（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で行った。反応混合物を、各一次細胞種に対して３通りに調製し、５ｎｇのｃＤＮＡを各反応に適用した。倍率変化を、ΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【０２０９】
ゼブラフィッシュのインサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ
ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（ＮＭ＿１９９７８６．１、ｚｇｃ：６６４３９）ｃＤＮＡのゼブラフィッシュオルソログを、ｚＣｌｅｃ１４Ａプライマー：
フォワード：５’−ＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１０）、および
リバース：５’−ＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１１）
を使用し、受精後２４時間（ｈｐｆ）のｃＤＮＡ調製物から増幅した。
【０２１０】
これらのプライマーによって生成した１１７２ｂｐのＰＣＲ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者のプロトコルに従い、クローン化した。ｚＣｌｅｃ１４Ａクローンを配列決定し、その同一性を検証した。インサイチュハイブリダイゼーション用のジゴキシゲニンで標識したセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブを、ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、インビトロ転写によって生成した。センスプローブを生成するため、プラスミドをＫｐｎＩで線状化し、Ｔ７で転写した。プラスミドをＸｈｏＩで線状化し、ＳＰ６で転写することにより、アンチセンスプローブが生成された。インサイチュハイブリダイゼーションを、ＴｈｉｓｓｅおよびＴｈｉｓｓｅ（２００８年） 「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｔｏ ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ．」 Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：５９−６９頁の方法に従って行った。
【０２１１】
ｚＣＬＥＣ１４Ａの発現の一時的パターンを分析するため、ゼブラフィッシュ発生の様々なステージから得られるＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムヘキサマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して調製した。ＺＣｌｅｃ１４Ａを、次の条件（Ｔｍ５５℃、２６サイクル）およびｚＣｌｅｃ１４Ａプライマー：
フォワード：５’−ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号１２）、および
リバース：５’−ＡＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１３）
を使用して増幅した。
【０２１２】
伸長因子−１α（ＥＦ１α）を負荷対照として使用し、次のＥＦ１αプライマー（ＴｈｉｓｓｅおよびＴｈｉｓｓｅ（２００８年））：
フォワード：５’−ＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１４）、および
リバース：５’−ＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１５）
を使用して増幅した。
【０２１３】
ＨＵＶＥＣ免疫蛍光
ＨＵＶＥＣを、氷冷メタノール中に固定したガラス製マイクロウェルチャンバー（Ｎｕｎｃ）内で成長させ、ＰＢＳＴ中１０％ＦＣＳ３％ＢＳＡでブロッキングしたＰＢＳＴで洗浄した。次いで、細胞を、パラフィン包埋切片用に使用されるのと同じプロトコルに従い、ＣＬＥＣ１４Ａ抗体で染色するか、または、親切にもＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｍａｒｉａ Ｇｒａｚｉａ Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ（Ｆｉｒｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｍｉｌａｎ）により贈呈された、ヒトＶＥ−カドヘリンに対する５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナルＩｇＧ抗体で同時染色した。切片染色を、５１０レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【０２１４】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合およびＣＨＯ細胞の形質移入
ＰＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ６ベクター内の完全長ＣＬＥＣ１４Ａを、ＭＧＣから購入した。配列を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、次いでｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。１０５個のＣＨＯ細胞を、１０％ＦＣＳおよび４ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプレーティングし、培養した。播種の４８時間後、サブコンフルエントな（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞を、６：１の比で、Ｆｕｇｅｎｅ６（ＲＯＣＨＥ）を使用し、完全長ＣＬＥＣ１４Ａを有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１で形質移入した。形質移入混合物を、細胞培養物に２４時間かけて添加し、次いで無血清ＤＭＥＭと交換した。細胞を、形質移入の７２時間後、Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ ２ Ｐｌｕｓライブ蛍光顕微鏡システム（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析し、画像を、Ａｘｉｏｃｏｍカラーカメラ（Ｚｅｉｓｓ）で取得した。
【０２１５】
ＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡの設計およびＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａサイレンシング
２．５×１０５個のＨＵＶＥＣを、形質移入の前日、６つのウェルプレートに播種した。ＣＬＥＣ１４Ａに対する２つの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖、ＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡ（二本鎖１、配列番号４）およびＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡ（二本鎖２、配列番号５）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈ）を使用し、また陰性対照二本鎖と並行して使用した。形質移入を、０．３％リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｏｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１０ｎＭ二本鎖を使用して行った。正常なＭ１９９完全培地と交換する前、形質移入混合物を、細胞とともに４時間インキュベートした。細胞を形質移入の４８時間後に使用し、タンパク質発現のノックダウンをウエスタンブロッティングによって評価した。タンパク質を、ＮＰ４０溶解緩衝液を使用して単離し、ＢｉｏＲａｄ Ｄｃタンパク質アッセイを用い、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って定量した。各レーンにおいて等量のタンパク質を負荷し、ＳＤＳ ＰＡＧＥを介して分離した。タンパク質を、ニトロセルロース膜上に移し、０．２ｎｇ／ｍｌのヒツジＣＬＥＣ１４Ａ ＩｇＧ抗ヒトポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および０．２μｇ／ｍｌのＨＲＰ複合化ウサギポリクローナル抗ヒツジ二次抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してプローブした。同じブロットを、１ｎｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗チューブリン一次抗体および１μｇ／ｍｌのヤギポリクローナル抗マウスＨＲＰ複合二次抗体でプローブした。
【０２１６】
ｓｉＲＮＡを用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
２．５×１０５個のＨＵＶＥＣを、形質移入の前日、６つのウェルプレートに播種した。形質移入の４８時間後、２０μｌのピペットチップでスクラッチした。ＨＵＶＥＣの化学運動性移動（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、８、１２および２４時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セル（ｃｅｌｌ）ＩＱアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
【０２１７】
ＣＬＥＣ１４Ａ抗血清を用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
コンフルエントなＨＵＶＥＣに対し、２０μｌのピペットチップでスクラッチした。５、１０および２０μｇ／ｍｌのＣＬＥＣ１４Ａ抗血清を含有する新しい培地を交換した。ＨＵＶＥＣの化学運動性移動を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、８、１２および２４時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セルＩＱアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
【０２１８】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体を用いるスクラッチ創傷治癒アッセイ
コンフルエントなＨＵＶＥＣまたはマウス内皮細胞系ＳＥＮＤの細胞に対し、１０μｌのピペットチップでスクラッチした。マウスにおいてＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対して産生された１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのモノクローナルＣＬＥＣ１４Ａ抗体を含有する新しい培地を適用した。ＨＵＶＥＣまたはＳＥＮＤ細胞の化学運動性移動を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ１０００光学顕微鏡およびＵＳＢ２．０ ２Ｍ Ｘｌｉカメラで、０、４、６、１２時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて定量した。
【０２１９】
フローアッセイ
ＨＵＶＥＣの一次培養物を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で解離し、予めコラーゲン／ゼラチンでコートした長方形のガラス毛細管（マイクロスライド；内部幅３ｍｍ、深さ０．３ｍｍ）に播種した。播種は、２４時間以内にコンフルエントな単層を生成する密度であった。播種後、マイクロスライドを、特別に設けられたガラス皿に置いて、予め壁に融合されたガラス管に取り付けた。シリコンゴム管（Ｔｙｇｏｎ Ｒ１０００；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を、各外部アームに接続した。ディッシュは培地を有し、それを加湿ＣＯ２インキュベーター（Ｎｕａｉｒｅ ＤＨ；Ｔｒｉｐｌｅ Ｒｅｄ，Ｔｈａｍｅ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）内に置いた。チューブは、インキュベーター壁内のポートを通した。２つの隣接するアーム（マイクロスライドに取り付けたものと空のもの）からのチューブを、接続し、マルチチャンネルの８ローラーポンプ（モデル５０２Ｓ；Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ Ｌｔｄ．）に入れ、連続流ループを形成した。ポンプチューブの内径およびポンプ速度を選択し、流速（７．７６ｍｌ／分）を送り、マイクロスライドにおいて２．０Ｐａ（＝２０ｄｙｎ／ｃｍ２）の壁せん断応力が得られた。ポンプおよび外部チューブをパースペクスボックス内に入れ、サーモスタットで３７℃に制御した。各ディッシュ内の別々のマイクロスライドからのチューブを、別々のポンプに接続した。これにより、マイクロスライドを通して少量の培地を１時間に１回、３０秒間ポンピングし、「静的」条件下での持続的な成長を可能にした。ＨＵＶＥＣを、静的条件下で２４時間培養し、次いで２．０Ｐａのせん断応力に２４時間さらした。各ディッシュ内の静的条件下およびフロー条件下のマイクロスライドのペアを、同一の再循環培地に同時間さらした。
【０２２０】
パラフィン包埋組織に対する免疫蛍光
免疫蛍光を、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫの組織学サービス（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｓｅｒｖｉｃｅ）から得たパラフィン包埋された正常および癌ヒト組織コレクション、ならびに癌および正常組織アレイ（Ｓｕｐｅｒｂｉｏｃｈｉｐｓ）に対して行った。胃癌、食道癌、肺癌、結腸／直腸癌、甲状腺癌および腎臓癌の各々からの、１０のコアを含むヒトの一般的な癌１（ＭＡ２）、ならびに、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および前立腺癌の各々からの、１０のコアを含む一般的な癌２（ＭＢ３）を使用した。隣接する正常な組織に一致する２つの追加的な対照アレイについても分析した。パラフィンの除去後、抗原回復のため、組織を、再水和し、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中、中間出力で３分間マイクロ波処理した。切片を、１０％ＦＣＳおよび３％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴでブロッキングした。切片を、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対する１０μｇ／ｍｌのヒツジＩｇＧ一次ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ）および１５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ複合ウサギＩｇＧ二次抗ヒツジポリクローナル抗体（Ｚｙｍａｘ）でプローブした。管内皮細胞を、ローダミンと複合した２０μｇ／ｍｌのＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅａｕｓ凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）で染色した。スライドに、ＤＡＰＩを有するプロロングゴールド（ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ）退色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を常に載せ、細胞核を対比染色した。染色切片を、５１０レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析した。
【０２２１】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の調製に使用される抗原は、場合によってアジュバントタンパク質（ＡＰ）と複合されたマウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＭ）およびヒトＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＨ）であった。次のプロトコルを用い、これらの４つの抗原（ＣＭ、ＣＨ、ＣＭ−ＡＰ、ＣＨ−ＡＰ）を、マウス免疫に対して使用した。
日 処理
０ 予備免疫試料を完全フロイントアジュバント中の１００μｇの抗原での免疫（足蹠）から採取
１４ 不完全フロイントアジュバント中の１００μｇの抗原での免疫（足蹠）
１７ 出血を試験
１８ 融合のため、膝窩リンパ節を採取
【０２２２】
血清を、３つの抗原、ＣＭ、ＣＨおよびＦｃに対し、ＥＬＩＳＡによって試験した。非免疫血清を、陰性対照として採取した。
【０２２３】
融合プロトコルは次の通りであった。
（１）膝窩リンパ節を免疫マウスから採取し、均質化した。
（２）細胞を温かいＤＭＥＭで洗浄した。
（３）細胞をｓｐ２／０骨髄腫細胞と混合した。
（４）混合物を遠心分離した（１０００ｇ）。
（５）ペレットを５０％ＰＥＧ１５００に懸濁し、１分間インキュベートした。
（６）懸濁液を温かいＤＭＥＭで徐々に希釈した。
（７）懸濁液を遠心分離した（１０００ｇ）。
（８）細胞を、腹膜マクロファージを有するプレートに播種した。
（９）細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０２２４】
各マウスに由来する５００超のＨＡＴ耐性ハイブリドーマクローンを得た。クローン上清の全部を、３つの吸収された抗原（ＣＭ、ＣＨおよびＦｃ）に対し、ＥＬＩＳＡにより、４日間隔で２回試験した。試験によると、ＣＭおよびＣＨの双方と反応するが、Ｆｃと反応しない５つのクローン（全部がサブクラスＩｇＧ１）が得られた。すべての陽性は、限界希釈法により、２〜４回クローン化し、培養フラスク内で増幅させ、腹水症のマウスに注射した。３つのクローンが、ＣＬＥＣ１４ａヒト（ＣＨ）で免疫した結果として得られ、１つのクローン（ＣＲＴ−３）は、ＣＬＥＣ１４ａヒト−ＡＰ（ＣＨ−ＡＰ）で免疫した結果であり、１つのクローン（ＣＲＴ−２）は、ＣＬＥＣ１４ａマウス−ＡＰ（ＣＭ−ＡＰ）で免疫した結果であった。
【０２２５】
結果
図２は、ＨＵＶＥＣおよび他の一次細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対的発現を示すグラフである。ＣＬＥＣ１４Ａは、内皮細胞内で特異的に発現された。これから、ＣＬＥＣ１４Ａが内皮特異的であるという出願人らの先行的な実験結果（Ｈｅｒｂｅｒｔら、２００８年）が確認される。
【０２２６】
図３は、ゼブラフィッシュ胚の受精後２４時間以内の、ＣＬＥＣ１４Ａオルソログのインサイチュハイブリダイゼーションの結果を図示する。ゼブラフィッシュＣＬＥＣ１４Ａオルソログは、ゼブラフィッシュとヒトとの間で保存され、背部大動脈および体節間血管において発現され、これは、ＣＬＥＣ１４Ａが、ゼブラフィッシュ胚モデルにおける脈管形成および血管新生の部位に限って発現されることを示す。
【０２２７】
図４は、（通常ＣＬＥＣ１４Ａを発現することがない）ＣＨＯ細胞内の完全長ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体のライブ蛍光イメージングを示す。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＧＦＰ融合体は、糸状仮足および微小突起における膜に局在化し、同じパターンがＨＵＶＥＣ内で認められる。図５は、コンフルエントなＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現およびＶＥ−カドヘリンとの共局在化の共焦点イメージングを示す。ＣＬＥＣ１４Ａは、突出する微小突起および糸状仮足において、細胞間接触時に、細胞接着部位で発現され、ＶＥ−カドヘリンと共局在化する。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａが、細胞表面に発現されるタンパク質であり、それが標的化にとって理想的な分子になることを明示している。
【０２２８】
ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａの内因性発現および局在化を、ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光によって分析した。図６は、ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡのノックダウンのウエスタンブロットである。ＣＬＥＣ１４Ａは、ＨＵＶＥＣ内で非常に高レベルで発現され、それらは２つのバンド、すなわち１つは約６０ｋＤａ（おそらくはＣＬＥＣ１４Ａの非グリコシル化形態）であり、１つは約１００ｋＤａ（おそらくはグリコシル化形態）である、を示す。ＣＬＥＣ１４Ａに特異的な１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ二本鎖のＨＵＶＥＣへの形質移入により、両バンドの強度が約８０％低下したが、それは両バンドがＣＬＥＣ１４Ａに特異的であることを示す。図７は、ＨＵＶＥＣ内でのＣＬＥＣ１４Ａ ｓｉＲＮＡノックダウンの共焦点イメージングを示す。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤のｓｉＲＮＡ分子が、実際、ＣＬＥＣ１４Ａの発現を確かにノックダウンすることを示す。
【０２２９】
ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤の血管新生に対する阻害能を試験した。図８Ａは、ＣＬＥＣ１４ＡのｓｉＲＮＡノックダウンがＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける内皮細胞移動を阻害することを示す光学顕微鏡画像である。図９Ａは、抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体がＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける内皮細胞移動を阻害することを示す光学顕微鏡画像である。図８Ｂおよび９Ｂは、それぞれ８Ａおよび９Ａからの結果のグラフ表示である。同様の結果が、モノクローナル抗体を使用するスクラッチ創傷治癒アッセイにおいて得られた。図１６ＡおよびＢに示されるように、ＨＵＶＥＣを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＣＲＴ−３で処理した時、１２時間後、対照における１３％に比べて、創傷部の２５％が開口状態であった。図１７ＡおよびＢに示されるように、ＳＥＮＤ細胞を１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＣＲＴ−２で処理した時、１２時間後、対照における９％に比べて、創傷部の１７％が開口状態であった。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａ阻害剤、例えばｓｉＲＮＡおよび抗体が、内皮細胞移動に対する阻害効果を有することを示す。内皮細胞移動は、血管新生の本質的特徴である。したがって、これらのアッセイは、２つの異なるＣＬＥＣ１４Ａの分子阻害剤、ｓｉＲＮＡおよび抗体が血管新生を阻害するという証拠を提供する。
【０２３０】
図１０は、せん断応力および静的条件下でのＨＵＶＥＣのリアルタイムＰＣＲから得られる結果を図示する。ＲＯＢＯ４は、内皮細胞に対して高度に特異的な、既知の腫瘍内皮マーカーであり、その阻害により、血管新生が阻害される。ＲＯＢＯ４およびＣＬＥＣ１４Ａ ｍＲＮＡの双方は、せん断応力（２Ｐａ）下で有意に下方制御され、またせん断応力下での下方制御は、血管新生促進遺伝子に関連した現象である。
【０２３１】
固形腫瘍および正常組織の切片におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現を、ＣＬＥＣ１４Ａに特異的なプローブを使用して試験した。図１１〜１４は、ヒト卵巣、膀胱、肝臓、乳房、結腸、直腸、食道、腎臓、肺、前立腺、胃、膵臓および甲状腺腫瘍組織内でのＣＬＥＣ１４Ａの発現の免疫蛍光画像である。ＣＬＥＣ１４Ａの発現の内皮特異性を、内皮細胞上の特異的なフコース残基に結合するＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅａｕｓ凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）との共局在化によって確認した。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、分析したすべての腫瘍組織内の血管内で認められた。卵巣、膀胱、肝臓、乳房、腎臓および前立腺腫瘍は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に対して強い陽性を示した一方、胃、食道、肺、結腸、直腸、膵臓および甲状腺腫瘍組織は、より低レベルのＣＬＥＣ１４Ａの特異的発現を示した。ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、対応する正常な対照（非腫瘍）組織のいずれにおいても検出されなかった。正常なヒトの脳、心臓および腎組織内でＣＬＥＣ１４Ａが発現されなかったことを示す免疫蛍光画像の代表例を、図１５に示す。したがって、出願人らは、ＣＬＥＣ１４Ａが腫瘍血管系において特異的に発現されることを示している。
【０２３２】
結論
まとめると、この試験の結果は、膜貫通タンパク質ＣＬＥＣ１４Ａが過去に認識されなかった腫瘍内皮マーカーであることを示す。
【０２３３】
実施例２：動物モデルにおける固形腫瘍の処置
固形腫瘍のマウスモデル（例えば、Ｂｌａｃｋ ５７マウスにおけるＬｅｗｉｓ肺癌皮下同種移植片移植またはヌードマウスにおけるＨＴ２９皮下異種移植片移植のいずれか）は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む医薬組成物の生理食塩溶液の静脈内注入によって処置する。注入物は、２〜４か月の期間、週１回投与する。腫瘍は、動物モデルにおいて、対照に比べて退行する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を前記個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用。
【請求項３】
前記阻害剤は、前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体は、成熟ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項３に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体である、請求項３または４に記載の方法または使用。
【請求項６】
前記阻害剤は、前記ＣＬＥＣ１４Ａポリヌクレオチドに特異的なｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項７】
細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化する方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項８】
前記細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化するための薬剤の調製における、（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項９】
個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製における、（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項１１】
前記細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子から選択される、請求項７もしくは９に記載の方法、または請求項８もしくは１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記放射性原子は、リン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、またはイットリウム−９０である、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのさらなる抗癌剤を前記個体に投与するステップも含む、請求項１、３〜７、９、１１、または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を含む、請求項２〜６、８、または１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記個体は、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が投与される個体である、請求項２〜６、８、または１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン；カルボプラチン；５−フルオロウラシル；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トミュデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン；ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチン、から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
個体の身体における腫瘍血管新生をイメージングする方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップと、
前記身体における前記検出可能な部分をイメージングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記個体における前記化合物の位置を検出するステップをさらに含む、請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能な部分は、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、テクネチウム−９９ｍ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体は、ヒトである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺または甲状腺の腫瘍である、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２４】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項２１または２３に記載の方法または使用。
【請求項２５】
乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用。
【請求項２７】
生体外での血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を内皮細胞または血管新生モデルに生体外で投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
ＣＬＥＣ１４Ａの前記阻害剤は、請求項３〜６のいずれか一項において規定されるものである、請求項２５もしくは２７に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
血管新生アッセイにおいて前記候補化合物を試験するステップと、
を含み、ここで、前記アッセイにおいて血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤でありうるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物でありうる、方法。
【請求項３０】
前記候補化合物が前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に選択的に結合するか否かを判定する先行するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記候補化合物は、抗体、ペプチド、アプタマーまたは小さい有機分子である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管新生アッセイは、大動脈輪アッセイ、スポンジ血管新生アッセイ、内皮細胞増殖のアッセイ、内皮細胞移動のアッセイ、および／または内皮細胞浸潤のアッセイ、である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記同定された化合物は、修飾され、かつ、前記修飾された化合物は、血管新生に対する阻害能について試験される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記同定された化合物または前記修飾された化合物は、固形腫瘍の動物モデルにおける有効性について試験される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記同定された化合物または前記修飾された化合物を合成、精製、および／または調合するステップをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
固形腫瘍の処置において有用でありうる抗癌剤を調製するための方法であって、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法を用いて化合物を同定するステップと、前記同定された化合物を合成、精製、および／または調合するステップと、を含む、方法。
【請求項３７】
医薬組成物を作製する方法であって、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された前記化合物を、医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤と混合するステップを含む、方法。
【請求項１】
個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を前記個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用。
【請求項３】
前記阻害剤は、前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体は、成熟ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項３に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体である、請求項３または４に記載の方法または使用。
【請求項６】
前記阻害剤は、前記ＣＬＥＣ１４Ａポリヌクレオチドに特異的なｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項７】
細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化する方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項８】
前記細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化するための薬剤の調製における、（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項９】
個体における腫瘍血管新生を阻害する方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製における、（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項１１】
前記細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子から選択される、請求項７もしくは９に記載の方法、または請求項８もしくは１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記放射性原子は、リン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、またはイットリウム−９０である、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのさらなる抗癌剤を前記個体に投与するステップも含む、請求項１、３〜７、９、１１、または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤はまた、少なくとも１つのさらなる抗癌剤を含む、請求項２〜６、８、または１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記個体は、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が投与される個体である、請求項２〜６、８、または１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン；カルボプラチン；５−フルオロウラシル；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トミュデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン；ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチン、から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
個体の身体における腫瘍血管新生をイメージングする方法であって、
（ｉ）前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、および（ｉｉ）検出可能な部分、を含む化合物を前記個体に投与するステップと、
前記身体における前記検出可能な部分をイメージングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記個体における前記化合物の位置を検出するステップをさらに含む、請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能な部分は、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、テクネチウム−９９ｍ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体は、ヒトである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺または甲状腺の腫瘍である、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２４】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項２１または２３に記載の方法または使用。
【請求項２５】
乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性およびリウマチ様の双方）、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症（例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維症（ｆｉｂｒｏｓｅｓ）、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置するための薬剤の調製におけるＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤の使用。
【請求項２７】
生体外での血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤を内皮細胞または血管新生モデルに生体外で投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
ＣＬＥＣ１４Ａの前記阻害剤は、請求項３〜６のいずれか一項において規定されるものである、請求項２５もしくは２７に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
血管新生アッセイにおいて前記候補化合物を試験するステップと、
を含み、ここで、前記アッセイにおいて血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤でありうるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物でありうる、方法。
【請求項３０】
前記候補化合物が前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドまたはその断片に選択的に結合するか否かを判定する先行するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記候補化合物は、抗体、ペプチド、アプタマーまたは小さい有機分子である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管新生アッセイは、大動脈輪アッセイ、スポンジ血管新生アッセイ、内皮細胞増殖のアッセイ、内皮細胞移動のアッセイ、および／または内皮細胞浸潤のアッセイ、である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記同定された化合物は、修飾され、かつ、前記修飾された化合物は、血管新生に対する阻害能について試験される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記同定された化合物または前記修飾された化合物は、固形腫瘍の動物モデルにおける有効性について試験される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記同定された化合物または前記修飾された化合物を合成、精製、および／または調合するステップをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
固形腫瘍の処置において有用でありうる抗癌剤を調製するための方法であって、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法を用いて化合物を同定するステップと、前記同定された化合物を合成、精製、および／または調合するステップと、を含む、方法。
【請求項３７】
医薬組成物を作製する方法であって、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された前記化合物を、医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤と混合するステップを含む、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０３８４２（Ｐ２０１３−５０３８４２Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７３８６（Ｐ２０１２−５２７３８６）
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１６８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２７１３２
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０５４０１６５４）キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｓａｒｄｉｎｉａ Ｈｏｕｓｅ，Ｓａｒｄｉｎｉａ Ｓｔｒｅｅｔ，ＷＣ２Ａ ３ＮＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１６８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２７１３２
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０５４０１６５４）キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｓａｒｄｉｎｉａ Ｈｏｕｓｅ，Ｓａｒｄｉｎｉａ Ｓｔｒｅｅｔ，ＷＣ２Ａ ３ＮＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
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