ＣＭＰ−デアミノノイラミン酸の製造法
【課題】 ＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）の効率的な大量合成法及び精製法を提供する。
【解決手段】シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法を提供する。
また、工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法を提供する。
（工程１）ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、（工程２）アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、（工程３）有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び（工程４）ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程。
【解決手段】シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法を提供する。
また、工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法を提供する。
（工程１）ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、（工程２）アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、（工程３）有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び（工程４）ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖合成の原料であるＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）の製造法、精製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炭素骨格９からなるα−ケト酸であるシアル酸は生物界に広く存在し、炭素５位のアミノアシル基の違い、あるいは炭素４位、同７位、同８位、同９位の水酸基のアシル基の有無の違いから３０種類以上存在することが明らかとなっている。
【０００３】
シアル酸の中で最も主要なものとしては、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）が挙げられ、当該シアル酸は、糖鎖の還元末端に位置し、細胞接着、ウイルス感染の際の受容体となるなど生体内における認識という行為において重要な役割を果たしている。
【０００４】
そのような理由からこのＮｅｕＡｃを含めシアル酸を含有するオリゴ糖、糖脂質、糖タンパク質、あるいはある種の担体と結合させた複合糖質を医薬品又は機能性素材として用途開発することが期待されている。
【０００５】
デアミノノイラミン酸（２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸；ＫＤＮ）は、５位のＮ−アシル基がＯＨ基に置換しているシアル酸である。ニジマスの卵糖タンパク質から初めて発見され、その後、魚類以外にも細菌しょう膜多糖、両生類の卵、哺乳類の糖タンパク質や糖脂質など、生物界に広く存在することが明らかとなっている。
【０００６】
ＫＤＮ又はそれを含有シアロ糖鎖の特徴は、細菌、ウイルス、並びにある種の動物細胞由来のシアリダーゼに対して抵抗性を有することである。ＮｅｕＡｃなどのシアル酸含有糖質を血中などの生体内に導入した場合、シアル酸あるいはシアル酸残基がシアリダーゼによって分解されてアシアロ糖質となり、これが肝臓などで速やかに代謝されることから、ＫＤＮ又はそれを含有シアロ糖鎖の安定性、半減期の減少などが問題とされていた。また、ウイルスなどの吸着用素材として使用したシアロ糖鎖含有糖質が、ウイルスなどの吸着物由来のシアリダーゼによりシアル酸が分解され、吸着活性が低下するといった問題も指摘されていた。
【０００７】
しかし、ＮｅｕＡｃと構造類似体であるＫＤＮがシアリダーゼ抵抗性を持つことから、ＮｅｕＡｃの替わりにＫＤＮを用いることで、シアロ糖鎖含有糖質の生体内、特に血中などにおける安定性、半減期の飛躍的な向上が期待されるため、すなわちアシアロ糖鎖、糖質の分解ブロッカーとして機能することが考えられるため、ＫＤＮ含有シアロ糖質の応用開発が望まれていた。
【０００８】
このようなＫＤＮ含有シアロ糖鎖又は糖質は、一般的にシアル酸糖転移酵素の触媒反応により糖供与体としてＣＭＰ−ＫＤＮを用いて合成できることが報告されている。しかしながら、その糖供与体であるＣＭＰ−ＫＤＮについて量産方法は確立されておらず、また、現在では試薬としても販売されていないことから入手が極めて困難であり、これがＫＤＮ含有シアロ糖質の開発、実用化の妨げになっていると言っても過言ではない。
【０００９】
従来、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成法としては、化学法及び酵素法が挙げられる。化学合成法は、糖由来の水酸基、並びにヌクレオチド由来のリン酸基の保護、脱保護が必要であり、煩雑なステップを踏むことから、また、生成する副産物の分離を行うために各種クロマトグラフィーが必要となることでかなりの労力が必要であることから、試薬レベルならまだしも、実用、量産に適した方法とは言い難い。
【００１０】
酵素合成法としては、Ｔｅｒａｄａらは、ニジマス精巣由来ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素を用いてシチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とＫＤＮからの合成を報告している（非特許文献１）。
【００１１】
伊藤らは利用価値のないウシ顎下腺、またはブタ肝臓の水性抽出物の上澄液中に存在するＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性（酵素）を利用したＣＭＰ−ＫＤＮ合成について報告している（特許文献１）。
【００１２】
一方、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液からＣＭＰ−ＫＤＮを取得する方法としては、Ｔｅｒａｄａらは、合成反応終了液を仔牛由来アルカリホスファターゼを用いて処理することで、反応で生成した５’−ＣＴＰ由来のヌクレオチドをヌクレオシドに分解した後、ペーパークロマトグラフィーによる分離、並びにペーパーからの有機溶媒抽出、その後、ゲルろ過クロマトグラフィーを行うことでＣＭＰ−ＫＤＮを取得できることを報告している（非特許文献１）。
【００１３】
また、伊藤らは、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液を有機溶媒系を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを２回実施した後、最後にゲルろ過クロマトグラフィーを行うことでＣＭＰ−ＫＤＮを取得できることを報告している（特許文献１）。
【００１４】
【特許文献１】特開平６−１４１８８０
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２６４０−２６４８（１９９３）
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１，６８５−６９２（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、Ｔｅｒａｄａらの方法（非特許文献１）は、当該合成反応に用いた酵素がニジマス精巣から調製したものであることから、当該酵素の大量調製、取得が困難であり、これを解決するために当該遺伝子をクローニングし、大腸菌内での発現系が検討しているが（非特許文献２）、発現量が不十分で、量産に対応できる量が取得できているとは言えなかった。さらに、ニジマス由来調製の酵素を用いた反応でＣＭＰ−ＫＤＮを調製した場合、ＣＭＰ−ＫＤＮの収率は、対ＫＤＮあたり８．２％、対ＣＴＰあたり３．３％、また、大腸菌生産の組換え酵素を用いた反応でも対ＫＤＮ及び対ＣＴＰあたり１２％と極めて低い収率でしかＣＭＰ−ＫＤＮを合成することができず、満足できる方法とは言いものであった。
【００１６】
一方、伊藤らの方法（特許文献１）は、利用価値のないウシ顎下腺、またはブタ肝臓の水性抽出物の上澄液中に存在するＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性（酵素）を利用しており、酵素の原料としては安価で、大量入手可能な材料を用いてはいるが、酵素の由来が動物由来であり、現在問題となっているＢＳＥなどの感染症の問題があり、酵素源としては好ましいものではなかった。また、基質である５’−ＣＴＰの分解活性など、共雑活性を取り除くため酵素を高純度に精製する必要があり、かつウシ顎下腺調製酵素を用いた反応でのＣＭＰ−ＫＤＮの収率は、対ＫＤＮあたり４０％と若干高いものの、対５’−ＣＴＰあたり１３．３％と低く、ブタ肝臓調製酵素反応では対ＫＤＮあたり１８．０％、対５’−ＣＴＰあたり６．０％と、必ずしも満足する収率とは言い難かった。
【００１７】
さらに、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液からＣＭＰ−ＫＤＮを取得する方法としては、Ｔｅｒａｄａらの方法（非特許文献１）では、ペーパークロマトグラフィーによる分離、並びにペーパーからの有機溶媒抽出、その後、ゲルろ過クロマトグラフィーを採用しており、このような方法はスケールアップが非常に困難なことから、量産は事実上不可能と考えられ、伊藤らの方法（特許文献１）では、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを２回実施した後、最後にゲルろ過クロマトグラフィーを行う方法を採用しているものの、この方法もまたスケールアップが困難で、必ずしも実用的な方法とは言えなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく、鋭意検討したところ、（１）安全で大量取得が容易な微生物由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素が、本来の活性であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成活性以外にもＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性をも併せ持ち、この酵素を用いることで効率よく５’−ＣＴＰとＫＤＮからＣＭＰ−ＫＤＮが合成できること、（２）当該反応液から、複雑なクロマトグラフィー処理を行わずとも、２価カチオンを添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させるという簡単な操作を行うことで高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを容易に取得できることを見出し、この方法は、スケールアップが可能で量産に耐えうるＣＭＰ−ＫＤＮの工業的な大量製造法に適した方法であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１９】
したがって、本発明は以下の通りである。
【００２０】
〔１〕シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法。
〔２〕ＫＤＮとして、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いてマンノース及びピルビン酸から調製したもの、あるいはその反応液を使用する、〔１〕記載の方法。
〔３〕工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法。
工程１：ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び
工程４：ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程
〔４〕工程４の前後に、イオン交換樹脂を用いて、ＣＭＰ−ＫＤＮの塩の交換を行う、〔１〕記載の精製法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＣＭＰ−ＫＤＮ合成は、安全で大量調製可能な微生物由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を用いた反応であり、反応効率も従来のＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素を用いた方法と比較し、著しく高いことから効率的な大量合成法としては極めて有意義な方法である。
【００２２】
さらに、本発明のＣＭＰ−ＫＤＮの精製法は、２価カチオンを添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させるという簡単な操作を基本とするため、煩雑なクロマトグラフィーを使用せずとも高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを容易に取得できることから、スケールアップが容易で、工業的な大量製造法に適した極めて有意義な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（１）酵素の調製
本発明で使用するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素とは、５’−ＣＴＰとＮｅｕＡｃを基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、微生物由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素は、上記反応以外にも５’−ＣＴＰとＫＤＮを基質としてＣＭＰ−ＫＤＮを生成する触媒活性も併せ持つものである。
【００２４】
このような微生物由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素は公知の酵素であり、当該活性を有する細胞（形質転換体を含む）またはその処理物、あるいはこれらの精製物を例示することができる。これらの酵素がＣＭＰ−ＫＤＮの合成活性が強いか否かは、簡単は反応試験で判別可能である。特に、ヘモフィラス・インフルエンザ（H.influenzae）株、ヘモフィラス・ディクレイ（H.ducreyi）株、大腸菌Ｋ１（E.coli）、ナイセリア・メニンギティディス（N.meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（C.jejuni）、スプレプトコッカス・アガラクチェ（S.agalactiae）、ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）株由来のもなどが好適な酵素として利用可能である。
【００２５】
また、当該活性を増強させるための手段として、該酵素遺伝子群（J.Biol.Chem.,271,15373-15380,1996、Glycobiology,1,187-191,1991、J.Biol.Chem.,264,14769-14774,1989）をクローンニングし、菌体内でこれを大量発現させた部生物種を用いる、いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いるのが好適である。
【００２６】
遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００２７】
たとえば、報告されている塩基配列をもとにプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
【００２８】
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）もしくはダイデオキシチェインターミネーター法（Methods in Enzymology,101,20(1983)）などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００２９】
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的には、ｐＢＲ３２２（Gene,2,95(1975)）、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Gene、33,103(1985)）などを例示することができる。
【００３０】
作製した組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Gene,33,103-119(1985)）などが使用可能である。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J.Mol.Biol.,53,159(1970)）などにより大腸菌を形質転換することができる。
【００３１】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした目的とする酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００３２】
目的の酵素活性を有する菌体としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収したものを例示することができる。また、回収した菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる処理物、もしくは該菌体処理物から目的の酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素も菌体処理物として利用することができる。
【００３３】
（２）ＣＭＰ−ＫＤＮの合成
ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応に使用するＫＤＮとしては、（１）ニジマス卵、精巣などの天然物より抽出、取得したもの（Anal.Biochem.,202,25-34(1992)）、（２）ピルビン酸とマンノースからＮｅｕＡｃリアーゼの触媒反応により可逆的に合成したもの（J.Am.Chem.Soc.,110,6481-6486(1988)、Tetrahedran,46,201-214(1990)）、（３）ホスホエノールピルビン酸とマンノースからＮｅｕＡｃ−９リン酸シンセターゼの触媒反応によりＫＤＮ−９リン酸を不可逆的に合成した後、ホスファターゼによりＫＤＮにしたもの（J.Biol.Chem.,275,17869-17877(2000)）、あるいは微生物由来ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により不可逆的に合成したものなどを利用することが可能であり、これらを各種クロマトグラフィーにより精製、単離したもの、あるいはＫＤＮ抽出液、あるいは合成反応液をそのまま使用することができる。
【００３４】
これらの内、調製が比較的容易なことからＮｅｕＡｃリアーゼの触媒反応を用いて合成したものをそのまま使用することが、工程的にもコスト的にも有利で望ましい。使用するＫＤＮ及び５’−ＣＴＰの各濃度としては、１〜２０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から便宜設定することができる。
【００３５】
合成反応は上記範囲での基質濃度で、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を反応液１Ｌ当たり１ユニット以上、好ましくは１０〜５００００ユニットを添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４５℃で１〜１５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施できる。
【００３６】
ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応においては、必要に応じてマグネシウムを添加するのが好ましい。マグネシウムとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどの無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウムなどの有機酸マグネシウム塩を使用することができ、その使用濃度としては１〜１０００ｍＭの範囲から便宜設定することが出来る。
【００３７】
（３）ＣＭＰ−ＫＤＮの精製
このようにして得られたＣＭＰ−ＫＤＮ合成液は、その不安定さから高純度のものの取得が非常に困難であったが、２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させ（工程１）、アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換した後（工程２）、有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させ（工程３）、必要によりイオン交換カラムにより塩置換を行った後、ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する（工程４）ことで、高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを簡単な操作により回収することができる。以下、各工程毎に説明する。
【００３８】
（工程１）
工程１は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程である。
【００３９】
添加する２価カチオンとしては、無機リン酸、ピロリン酸もしくはヌクレオチドと不溶性の沈殿を形成するものであれば特に限定されず、例えばカルシウム又はマンガンの各イオンを挙げることができる。具体的には、カルシウムイオンを添加する場合には、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩を使用することができ、マンガンイオンを添加する場合には塩化マンガン、硫酸マンガン等の水溶性マンガン塩を使用することができる。添加濃度としては、０．１〜２０００ｍＭの範囲から適宜設定すればよい。
【００４０】
このような２価カチオンをＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に添加し、温度０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００４１】
（工程２）
工程２は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程である。
【００４２】
反応に使用するホスファターゼとしては、ヌクレオチドのリン酸残基を脱リン酸してヌクレシドに変換できる酵素で、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンまで加水分解できる酵素であれば特に限定されず、特に、反応時におけるＣＭＰ−ＫＤＮの安定性や酵素調製の容易性等を考慮すると、アルカリホスファターゼ、特に大腸菌アルカリホスファターゼが好適である。
【００４３】
ホスファターゼ反応は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液１ｍｌ当たり０．０１ユニット以上、好ましくは０．１〜５０ユニット添加し、７０℃以下、好ましくは２０〜６０℃で０．１〜５０時間程度、必要により撹拌し、ｐＨを調整しながら反応させることにより実施できる。
【００４４】
なお、上記工程１と工程２は、順序は特に関係なく、どちらを先に行ってもかまわず、同時に行っても良い。例えば、工程１、工程２の順番で実施した場合、反応後、反応液中に２価イオンが存在するため、ホスファターゼ処理中あるいは処理後、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００４５】
（工程３）
工程３は、有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程である。
【００４６】
添加する有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、具体的にはメタノール、エタノール、イソプロパノール等を使用することができる。また、有機溶媒の添加量としては、反応液当たり０．１〜２０倍量の範囲から適宜設定することができる。
【００４７】
このような有機溶媒を上記工程１又は工程２の処理後の液に添加し、温度−８０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、ＣＭＰ−ＫＤＮが沈降してくる。
【００４８】
（工程４）
工程４は、沈殿したＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程である。
【００４９】
回収の方法は、通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）によって行うことができ、回収後、必要により乾燥させて製品とする。
【００５０】
また、上記工程３と本工程４を複数回（通常、２〜５回程度）実施することで、より高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを取得することができる。
【００５１】
（付加工程）
上記工程４終了前後、ＣＭＰ−ＫＤＮはカルシウム塩、マンガン塩等の塩となっているため、必要に応じて、例えばナトリウム塩等に変換することも可能である。
【００５２】
塩の交換反応は、回収した沈殿を再溶解し、例えば、目的とする塩に置換したカチオン交換樹脂に接触（当該樹脂カラムへ通液等）させることで実施することができる。
このようにして得られたＣＭＰ−ＫＤＮはＨＰＬＣよる純度が９５％以上で、５’−ＣＭＰ等の夾雑物が極めて少ない高純度の製品である。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、ＮｅｕＡｃリアーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素、及びアルカリホスファターゼの調製法並びに当該酵素活性の定義等は、日本特許第３８３３５８４号公報及び国際公開番号ＷＯ２００５／０３０９７４公報の記載に準じて行った。
【００５４】
また、ＣＭＰ−ＫＤＮの定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液には０．１Ｍトリエチルアミンーリン酸（ｐＨ６．０）を用いた。ＫＤＮの定量にはＨＰＡＥ−ＰＡＤ法により行った。具体的には分離、検出には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１、ＥＤ４０を用い、溶出液としてＡ液；０．１Ｍ ＮａＯＨ、Ｂ液；Ａ液＋０．５Ｍ酢酸ナトリウムを用い、Ａ液−Ｂ液のグラジエントにより行った。
【００５５】
実施例
（１）ＫＤＮ合成
４００ｍＭマンノース、４００ｍＭピルビン酸溶液（２５ｍｌ）に２ユニット／ｍｌ反応液のＮｅｕＡｃリアーゼを添加し、室温で反応を行った。６３時間後、１００℃、５分間の熱処理を行った後、ＨＰＰＡＥ−ＰＡＤ法でＫＤＮ生成量を測定したところ、２７０．３ｍＭのＫＤＮの生成を確認した。
【００５６】
（２）ＣＭＰ−ＫＤＮ合成
２０ｍＭ ５’−ＣＴＰ、２０ｍＭ ＫＤＮ（上記（１）で合成した反応液１３．８ｍｌ相当）、５０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する溶液（２００ｍｌ）に１．７５ユニット／ｍｌ反応液当たりのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を添加し、４０℃で反応を行った。反応中ｐＨの低下を抑えるために水酸化ナトリウム溶液を適宜添加した。反応開始４５分後、一部を分取し、ＨＰＬＣ分析により確認したところ、１５．１ｍＭのＣＭＰ−ＫＤＮの生成を確認した。対ＫＤＮ及び対５’−ＣＴＰモル収率はそれぞれ７５．５％と非常に高い反応率であった。
【００５７】
（３）ＣＭＰ−ＫＤＮの取得
上記ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応、開始５５分後、８０ｍＭ相当量の塩化カルシウム溶液を添加することで反応を停止させ、続けて４０ユニットのアルカリホスファターゼを添加し、４０℃で反応を行った。反応途中、ｐＨの低下を抑えるために水酸化ナトリウム溶液を適宜添加した。反応開始６０分後に氷上に移すことで反応を終了させた。
【００５８】
反応終了液を２０，０００ｇｘ１０分の遠心分離により上清を回収し、塩酸でｐＨを中性に戻した後、活性炭粉末と共に攪拌した。活性炭粉末を除去した後、エバポレーターによる濃縮を行い、濃縮液に５倍量のエタノールを添加した。冷却しながら一晩攪拌を行った後、２０，０００ｇｘ１０ｍｉｎの遠心分離を行うことで沈殿画分を回収した。
【００５９】
沈殿画分を再度蒸留水で溶解し、同様にエタノールによる沈殿、遠心分離を行うことで沈殿画分を回収した。沈殿画分を蒸留水で再溶解した後、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗｘ８（ナトリウム型）カラム（７．５ｍｌ）に通液し、さらに３０ｍｌ蒸留水を通液しこれらを回収した。
【００６０】
回収画分をエバポレーター濃縮した後、５倍量のエタノールを添加し、冷却しながら一晩攪拌を行った。沈殿画分を２０，０００ｇｘ１０分の遠心分離を行うことで回収し、これを蒸留水で再溶解した後、凍結乾燥を行うことでＨＰＬＣ純度９７．０％のＣＭＰ−ＫＤＮ標品１．４３ｇを回収した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖合成の原料であるＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）の製造法、精製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炭素骨格９からなるα−ケト酸であるシアル酸は生物界に広く存在し、炭素５位のアミノアシル基の違い、あるいは炭素４位、同７位、同８位、同９位の水酸基のアシル基の有無の違いから３０種類以上存在することが明らかとなっている。
【０００３】
シアル酸の中で最も主要なものとしては、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）が挙げられ、当該シアル酸は、糖鎖の還元末端に位置し、細胞接着、ウイルス感染の際の受容体となるなど生体内における認識という行為において重要な役割を果たしている。
【０００４】
そのような理由からこのＮｅｕＡｃを含めシアル酸を含有するオリゴ糖、糖脂質、糖タンパク質、あるいはある種の担体と結合させた複合糖質を医薬品又は機能性素材として用途開発することが期待されている。
【０００５】
デアミノノイラミン酸（２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸；ＫＤＮ）は、５位のＮ−アシル基がＯＨ基に置換しているシアル酸である。ニジマスの卵糖タンパク質から初めて発見され、その後、魚類以外にも細菌しょう膜多糖、両生類の卵、哺乳類の糖タンパク質や糖脂質など、生物界に広く存在することが明らかとなっている。
【０００６】
ＫＤＮ又はそれを含有シアロ糖鎖の特徴は、細菌、ウイルス、並びにある種の動物細胞由来のシアリダーゼに対して抵抗性を有することである。ＮｅｕＡｃなどのシアル酸含有糖質を血中などの生体内に導入した場合、シアル酸あるいはシアル酸残基がシアリダーゼによって分解されてアシアロ糖質となり、これが肝臓などで速やかに代謝されることから、ＫＤＮ又はそれを含有シアロ糖鎖の安定性、半減期の減少などが問題とされていた。また、ウイルスなどの吸着用素材として使用したシアロ糖鎖含有糖質が、ウイルスなどの吸着物由来のシアリダーゼによりシアル酸が分解され、吸着活性が低下するといった問題も指摘されていた。
【０００７】
しかし、ＮｅｕＡｃと構造類似体であるＫＤＮがシアリダーゼ抵抗性を持つことから、ＮｅｕＡｃの替わりにＫＤＮを用いることで、シアロ糖鎖含有糖質の生体内、特に血中などにおける安定性、半減期の飛躍的な向上が期待されるため、すなわちアシアロ糖鎖、糖質の分解ブロッカーとして機能することが考えられるため、ＫＤＮ含有シアロ糖質の応用開発が望まれていた。
【０００８】
このようなＫＤＮ含有シアロ糖鎖又は糖質は、一般的にシアル酸糖転移酵素の触媒反応により糖供与体としてＣＭＰ−ＫＤＮを用いて合成できることが報告されている。しかしながら、その糖供与体であるＣＭＰ−ＫＤＮについて量産方法は確立されておらず、また、現在では試薬としても販売されていないことから入手が極めて困難であり、これがＫＤＮ含有シアロ糖質の開発、実用化の妨げになっていると言っても過言ではない。
【０００９】
従来、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成法としては、化学法及び酵素法が挙げられる。化学合成法は、糖由来の水酸基、並びにヌクレオチド由来のリン酸基の保護、脱保護が必要であり、煩雑なステップを踏むことから、また、生成する副産物の分離を行うために各種クロマトグラフィーが必要となることでかなりの労力が必要であることから、試薬レベルならまだしも、実用、量産に適した方法とは言い難い。
【００１０】
酵素合成法としては、Ｔｅｒａｄａらは、ニジマス精巣由来ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素を用いてシチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とＫＤＮからの合成を報告している（非特許文献１）。
【００１１】
伊藤らは利用価値のないウシ顎下腺、またはブタ肝臓の水性抽出物の上澄液中に存在するＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性（酵素）を利用したＣＭＰ−ＫＤＮ合成について報告している（特許文献１）。
【００１２】
一方、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液からＣＭＰ−ＫＤＮを取得する方法としては、Ｔｅｒａｄａらは、合成反応終了液を仔牛由来アルカリホスファターゼを用いて処理することで、反応で生成した５’−ＣＴＰ由来のヌクレオチドをヌクレオシドに分解した後、ペーパークロマトグラフィーによる分離、並びにペーパーからの有機溶媒抽出、その後、ゲルろ過クロマトグラフィーを行うことでＣＭＰ−ＫＤＮを取得できることを報告している（非特許文献１）。
【００１３】
また、伊藤らは、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液を有機溶媒系を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを２回実施した後、最後にゲルろ過クロマトグラフィーを行うことでＣＭＰ−ＫＤＮを取得できることを報告している（特許文献１）。
【００１４】
【特許文献１】特開平６−１４１８８０
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２６４０−２６４８（１９９３）
【非特許文献２】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１，６８５−６９２（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、Ｔｅｒａｄａらの方法（非特許文献１）は、当該合成反応に用いた酵素がニジマス精巣から調製したものであることから、当該酵素の大量調製、取得が困難であり、これを解決するために当該遺伝子をクローニングし、大腸菌内での発現系が検討しているが（非特許文献２）、発現量が不十分で、量産に対応できる量が取得できているとは言えなかった。さらに、ニジマス由来調製の酵素を用いた反応でＣＭＰ−ＫＤＮを調製した場合、ＣＭＰ−ＫＤＮの収率は、対ＫＤＮあたり８．２％、対ＣＴＰあたり３．３％、また、大腸菌生産の組換え酵素を用いた反応でも対ＫＤＮ及び対ＣＴＰあたり１２％と極めて低い収率でしかＣＭＰ−ＫＤＮを合成することができず、満足できる方法とは言いものであった。
【００１６】
一方、伊藤らの方法（特許文献１）は、利用価値のないウシ顎下腺、またはブタ肝臓の水性抽出物の上澄液中に存在するＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性（酵素）を利用しており、酵素の原料としては安価で、大量入手可能な材料を用いてはいるが、酵素の由来が動物由来であり、現在問題となっているＢＳＥなどの感染症の問題があり、酵素源としては好ましいものではなかった。また、基質である５’−ＣＴＰの分解活性など、共雑活性を取り除くため酵素を高純度に精製する必要があり、かつウシ顎下腺調製酵素を用いた反応でのＣＭＰ−ＫＤＮの収率は、対ＫＤＮあたり４０％と若干高いものの、対５’−ＣＴＰあたり１３．３％と低く、ブタ肝臓調製酵素反応では対ＫＤＮあたり１８．０％、対５’−ＣＴＰあたり６．０％と、必ずしも満足する収率とは言い難かった。
【００１７】
さらに、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成液からＣＭＰ−ＫＤＮを取得する方法としては、Ｔｅｒａｄａらの方法（非特許文献１）では、ペーパークロマトグラフィーによる分離、並びにペーパーからの有機溶媒抽出、その後、ゲルろ過クロマトグラフィーを採用しており、このような方法はスケールアップが非常に困難なことから、量産は事実上不可能と考えられ、伊藤らの方法（特許文献１）では、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを２回実施した後、最後にゲルろ過クロマトグラフィーを行う方法を採用しているものの、この方法もまたスケールアップが困難で、必ずしも実用的な方法とは言えなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく、鋭意検討したところ、（１）安全で大量取得が容易な微生物由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素が、本来の活性であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成活性以外にもＣＭＰ−ＫＤＮ合成活性をも併せ持ち、この酵素を用いることで効率よく５’−ＣＴＰとＫＤＮからＣＭＰ−ＫＤＮが合成できること、（２）当該反応液から、複雑なクロマトグラフィー処理を行わずとも、２価カチオンを添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させるという簡単な操作を行うことで高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを容易に取得できることを見出し、この方法は、スケールアップが可能で量産に耐えうるＣＭＰ−ＫＤＮの工業的な大量製造法に適した方法であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１９】
したがって、本発明は以下の通りである。
【００２０】
〔１〕シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法。
〔２〕ＫＤＮとして、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いてマンノース及びピルビン酸から調製したもの、あるいはその反応液を使用する、〔１〕記載の方法。
〔３〕工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法。
工程１：ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び
工程４：ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程
〔４〕工程４の前後に、イオン交換樹脂を用いて、ＣＭＰ−ＫＤＮの塩の交換を行う、〔１〕記載の精製法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＣＭＰ−ＫＤＮ合成は、安全で大量調製可能な微生物由来ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を用いた反応であり、反応効率も従来のＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素を用いた方法と比較し、著しく高いことから効率的な大量合成法としては極めて有意義な方法である。
【００２２】
さらに、本発明のＣＭＰ−ＫＤＮの精製法は、２価カチオンを添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させるという簡単な操作を基本とするため、煩雑なクロマトグラフィーを使用せずとも高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを容易に取得できることから、スケールアップが容易で、工業的な大量製造法に適した極めて有意義な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（１）酵素の調製
本発明で使用するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素とは、５’−ＣＴＰとＮｅｕＡｃを基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、微生物由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素は、上記反応以外にも５’−ＣＴＰとＫＤＮを基質としてＣＭＰ−ＫＤＮを生成する触媒活性も併せ持つものである。
【００２４】
このような微生物由来のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素は公知の酵素であり、当該活性を有する細胞（形質転換体を含む）またはその処理物、あるいはこれらの精製物を例示することができる。これらの酵素がＣＭＰ−ＫＤＮの合成活性が強いか否かは、簡単は反応試験で判別可能である。特に、ヘモフィラス・インフルエンザ（H.influenzae）株、ヘモフィラス・ディクレイ（H.ducreyi）株、大腸菌Ｋ１（E.coli）、ナイセリア・メニンギティディス（N.meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（C.jejuni）、スプレプトコッカス・アガラクチェ（S.agalactiae）、ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）株由来のもなどが好適な酵素として利用可能である。
【００２５】
また、当該活性を増強させるための手段として、該酵素遺伝子群（J.Biol.Chem.,271,15373-15380,1996、Glycobiology,1,187-191,1991、J.Biol.Chem.,264,14769-14774,1989）をクローンニングし、菌体内でこれを大量発現させた部生物種を用いる、いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いるのが好適である。
【００２６】
遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００２７】
たとえば、報告されている塩基配列をもとにプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
【００２８】
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）もしくはダイデオキシチェインターミネーター法（Methods in Enzymology,101,20(1983)）などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００２９】
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的には、ｐＢＲ３２２（Gene,2,95(1975)）、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Gene、33,103(1985)）などを例示することができる。
【００３０】
作製した組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Gene,33,103-119(1985)）などが使用可能である。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J.Mol.Biol.,53,159(1970)）などにより大腸菌を形質転換することができる。
【００３１】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした目的とする酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００３２】
目的の酵素活性を有する菌体としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収したものを例示することができる。また、回収した菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる処理物、もしくは該菌体処理物から目的の酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素も菌体処理物として利用することができる。
【００３３】
（２）ＣＭＰ−ＫＤＮの合成
ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応に使用するＫＤＮとしては、（１）ニジマス卵、精巣などの天然物より抽出、取得したもの（Anal.Biochem.,202,25-34(1992)）、（２）ピルビン酸とマンノースからＮｅｕＡｃリアーゼの触媒反応により可逆的に合成したもの（J.Am.Chem.Soc.,110,6481-6486(1988)、Tetrahedran,46,201-214(1990)）、（３）ホスホエノールピルビン酸とマンノースからＮｅｕＡｃ−９リン酸シンセターゼの触媒反応によりＫＤＮ−９リン酸を不可逆的に合成した後、ホスファターゼによりＫＤＮにしたもの（J.Biol.Chem.,275,17869-17877(2000)）、あるいは微生物由来ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒反応により不可逆的に合成したものなどを利用することが可能であり、これらを各種クロマトグラフィーにより精製、単離したもの、あるいはＫＤＮ抽出液、あるいは合成反応液をそのまま使用することができる。
【００３４】
これらの内、調製が比較的容易なことからＮｅｕＡｃリアーゼの触媒反応を用いて合成したものをそのまま使用することが、工程的にもコスト的にも有利で望ましい。使用するＫＤＮ及び５’−ＣＴＰの各濃度としては、１〜２０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から便宜設定することができる。
【００３５】
合成反応は上記範囲での基質濃度で、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を反応液１Ｌ当たり１ユニット以上、好ましくは１０〜５００００ユニットを添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４５℃で１〜１５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施できる。
【００３６】
ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応においては、必要に応じてマグネシウムを添加するのが好ましい。マグネシウムとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどの無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウムなどの有機酸マグネシウム塩を使用することができ、その使用濃度としては１〜１０００ｍＭの範囲から便宜設定することが出来る。
【００３７】
（３）ＣＭＰ−ＫＤＮの精製
このようにして得られたＣＭＰ−ＫＤＮ合成液は、その不安定さから高純度のものの取得が非常に困難であったが、２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させ（工程１）、アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換した後（工程２）、有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させ（工程３）、必要によりイオン交換カラムにより塩置換を行った後、ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する（工程４）ことで、高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを簡単な操作により回収することができる。以下、各工程毎に説明する。
【００３８】
（工程１）
工程１は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程である。
【００３９】
添加する２価カチオンとしては、無機リン酸、ピロリン酸もしくはヌクレオチドと不溶性の沈殿を形成するものであれば特に限定されず、例えばカルシウム又はマンガンの各イオンを挙げることができる。具体的には、カルシウムイオンを添加する場合には、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩を使用することができ、マンガンイオンを添加する場合には塩化マンガン、硫酸マンガン等の水溶性マンガン塩を使用することができる。添加濃度としては、０．１〜２０００ｍＭの範囲から適宜設定すればよい。
【００４０】
このような２価カチオンをＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に添加し、温度０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００４１】
（工程２）
工程２は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程である。
【００４２】
反応に使用するホスファターゼとしては、ヌクレオチドのリン酸残基を脱リン酸してヌクレシドに変換できる酵素で、５’−ＣＭＰ、５’−ＣＤＰ、５’−ＣＴＰを特異的にシチジンまで加水分解できる酵素であれば特に限定されず、特に、反応時におけるＣＭＰ−ＫＤＮの安定性や酵素調製の容易性等を考慮すると、アルカリホスファターゼ、特に大腸菌アルカリホスファターゼが好適である。
【００４３】
ホスファターゼ反応は、ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液１ｍｌ当たり０．０１ユニット以上、好ましくは０．１〜５０ユニット添加し、７０℃以下、好ましくは２０〜６０℃で０．１〜５０時間程度、必要により撹拌し、ｐＨを調整しながら反応させることにより実施できる。
【００４４】
なお、上記工程１と工程２は、順序は特に関係なく、どちらを先に行ってもかまわず、同時に行っても良い。例えば、工程１、工程２の順番で実施した場合、反応後、反応液中に２価イオンが存在するため、ホスファターゼ処理中あるいは処理後、リン酸カルシウム、リン酸マンガン等の不溶塩が沈降してくるので、沈殿物を通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）で取り除き、次工程に供する。
【００４５】
（工程３）
工程３は、有機溶媒を添加し、ＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程である。
【００４６】
添加する有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールが好ましく、具体的にはメタノール、エタノール、イソプロパノール等を使用することができる。また、有機溶媒の添加量としては、反応液当たり０．１〜２０倍量の範囲から適宜設定することができる。
【００４７】
このような有機溶媒を上記工程１又は工程２の処理後の液に添加し、温度−８０〜６０℃の条件下、必要によりｐＨを６．０〜１３．０に調整し、及び／又は撹拌することで、ＣＭＰ−ＫＤＮが沈降してくる。
【００４８】
（工程４）
工程４は、沈殿したＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程である。
【００４９】
回収の方法は、通常の固液分離手段（ろ過、遠心分離等）によって行うことができ、回収後、必要により乾燥させて製品とする。
【００５０】
また、上記工程３と本工程４を複数回（通常、２〜５回程度）実施することで、より高純度のＣＭＰ−ＫＤＮを取得することができる。
【００５１】
（付加工程）
上記工程４終了前後、ＣＭＰ−ＫＤＮはカルシウム塩、マンガン塩等の塩となっているため、必要に応じて、例えばナトリウム塩等に変換することも可能である。
【００５２】
塩の交換反応は、回収した沈殿を再溶解し、例えば、目的とする塩に置換したカチオン交換樹脂に接触（当該樹脂カラムへ通液等）させることで実施することができる。
このようにして得られたＣＭＰ−ＫＤＮはＨＰＬＣよる純度が９５％以上で、５’−ＣＭＰ等の夾雑物が極めて少ない高純度の製品である。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、ＮｅｕＡｃリアーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素、及びアルカリホスファターゼの調製法並びに当該酵素活性の定義等は、日本特許第３８３３５８４号公報及び国際公開番号ＷＯ２００５／０３０９７４公報の記載に準じて行った。
【００５４】
また、ＣＭＰ−ＫＤＮの定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液には０．１Ｍトリエチルアミンーリン酸（ｐＨ６．０）を用いた。ＫＤＮの定量にはＨＰＡＥ−ＰＡＤ法により行った。具体的には分離、検出には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１、ＥＤ４０を用い、溶出液としてＡ液；０．１Ｍ ＮａＯＨ、Ｂ液；Ａ液＋０．５Ｍ酢酸ナトリウムを用い、Ａ液−Ｂ液のグラジエントにより行った。
【００５５】
実施例
（１）ＫＤＮ合成
４００ｍＭマンノース、４００ｍＭピルビン酸溶液（２５ｍｌ）に２ユニット／ｍｌ反応液のＮｅｕＡｃリアーゼを添加し、室温で反応を行った。６３時間後、１００℃、５分間の熱処理を行った後、ＨＰＰＡＥ−ＰＡＤ法でＫＤＮ生成量を測定したところ、２７０．３ｍＭのＫＤＮの生成を確認した。
【００５６】
（２）ＣＭＰ−ＫＤＮ合成
２０ｍＭ ５’−ＣＴＰ、２０ｍＭ ＫＤＮ（上記（１）で合成した反応液１３．８ｍｌ相当）、５０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する溶液（２００ｍｌ）に１．７５ユニット／ｍｌ反応液当たりのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を添加し、４０℃で反応を行った。反応中ｐＨの低下を抑えるために水酸化ナトリウム溶液を適宜添加した。反応開始４５分後、一部を分取し、ＨＰＬＣ分析により確認したところ、１５．１ｍＭのＣＭＰ−ＫＤＮの生成を確認した。対ＫＤＮ及び対５’−ＣＴＰモル収率はそれぞれ７５．５％と非常に高い反応率であった。
【００５７】
（３）ＣＭＰ−ＫＤＮの取得
上記ＣＭＰ−ＫＤＮ合成反応、開始５５分後、８０ｍＭ相当量の塩化カルシウム溶液を添加することで反応を停止させ、続けて４０ユニットのアルカリホスファターゼを添加し、４０℃で反応を行った。反応途中、ｐＨの低下を抑えるために水酸化ナトリウム溶液を適宜添加した。反応開始６０分後に氷上に移すことで反応を終了させた。
【００５８】
反応終了液を２０，０００ｇｘ１０分の遠心分離により上清を回収し、塩酸でｐＨを中性に戻した後、活性炭粉末と共に攪拌した。活性炭粉末を除去した後、エバポレーターによる濃縮を行い、濃縮液に５倍量のエタノールを添加した。冷却しながら一晩攪拌を行った後、２０，０００ｇｘ１０ｍｉｎの遠心分離を行うことで沈殿画分を回収した。
【００５９】
沈殿画分を再度蒸留水で溶解し、同様にエタノールによる沈殿、遠心分離を行うことで沈殿画分を回収した。沈殿画分を蒸留水で再溶解した後、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗｘ８（ナトリウム型）カラム（７．５ｍｌ）に通液し、さらに３０ｍｌ蒸留水を通液しこれらを回収した。
【００６０】
回収画分をエバポレーター濃縮した後、５倍量のエタノールを添加し、冷却しながら一晩攪拌を行った。沈殿画分を２０，０００ｇｘ１０分の遠心分離を行うことで回収し、これを蒸留水で再溶解した後、凍結乾燥を行うことでＨＰＬＣ純度９７．０％のＣＭＰ−ＫＤＮ標品１．４３ｇを回収した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法。
【請求項２】
ＫＤＮとして、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いてマンノース及びピルビン酸から調製したもの、あるいはその反応液を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法。
工程１：ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び
工程４：ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程
【請求項４】
工程４の前後に、イオン交換樹脂を用いて、ＣＭＰ−ＫＤＮの塩の交換を行う、請求項３記載の精製法。
【請求項１】
シチジン５’−トリリン酸（５’−ＣＴＰ）とデアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）から酵素的にＣＭＰ−デアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）を製造する方法において、酵素としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を使用する、ＣＭＰ−ＫＤＮの製造法。
【請求項２】
ＫＤＮとして、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いてマンノース及びピルビン酸から調製したもの、あるいはその反応液を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程１〜４よりなるＣＭＰ−ＫＤＮの精製法。
工程１：ＣＭＰ−ＫＤＮ含有液に２価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程２：アルカリホスファターゼ反応によりヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程３：有機溶媒によりＣＭＰ−ＫＤＮを沈殿させる工程、及び
工程４：ＣＭＰ−ＫＤＮを回収する工程
【請求項４】
工程４の前後に、イオン交換樹脂を用いて、ＣＭＰ−ＫＤＮの塩の交換を行う、請求項３記載の精製法。
【公開番号】特開２００８−１４８６２０（Ｐ２００８−１４８６２０Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３９３７３（Ｐ２００６−３３９３７３）
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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