ＣＮＳ髄鞘再形成を促進する組換えヒトｍＡｂを含む組成物および方法
ウイルス、細菌または特発性起源の中枢神経系の他の疾患の治療において活性を示す抗体、特にヒト抗体を開示する。中枢神経系における構造または細胞に結合することができる抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態、それらの単量体およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を包含する神経調節物質を示す。ポリクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体およびそれらの活性フラグメント等を使用して、ヒトおよび家畜の脱髄疾患および中枢神経系の疾患を治療するための方法を述べる。本発明はまた、ヒト抗体、フラグメント、ペプチド誘導体および同様の物質の使用、および上記で言及した治療適用におけるそれらの使用、および脱髄を含む症状を治療し、髄鞘再形成を促進するために望ましい低用量で投与しうる、それらを含有する薬学的組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に神経生物学の分野、特に中枢神経系の機能および治療において役割を果たす、組換え生産される抗体の特定に関する。本発明はまた、例として、薬学的組成物、神経障害に関連する疾患の治療の方法、神経機能損傷における再生および修復の方法、スクリーニングアッセイおよびワクチンを含む、治療物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は、通常は初期軸索損傷を伴わない、原発性脱髄によって病理学的に特徴付けられる慢性の、しばしば進行性の、炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。多発性硬化症の病因および病原は不明である。多発性硬化症のいくつかの免疫学的特徴、およびある種の主要組織適合遺伝子複合体対立遺伝子との中程度の結びつきは、多発性硬化症が免疫介在性疾患であるという推測を喚起した。
【０００３】
自己免疫仮説は、試験的自己免疫性（アレルギー性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによって裏付けられ、そのモデルでは、遺伝的に感受性がある動物へのある種のミエリン成分の注入はＴ細胞介在性中枢神経系脱髄を導く。しかし、特異性自己抗原および病原性ミエリン反応性Ｔ細胞は、多発性硬化症患者の中枢神経系において明確には特定されておらず、また多発性硬化症は他の自己免疫疾患には関連しない。疫学的データに基づく代替的仮説は、環境因子、おそらく特定されていないウイルスが中枢神経系における炎症応答を促進し、それが、潜在的には誘導自己免疫成分を伴って、直接または間接的な（「バイスタンダー（傍観者的）」ミエリン破壊を導くというものである。この仮説は、ヒトおよび動物の両方において、いくつかの自然発生的なウイルス感染が脱髄を引き起こしうるというエビデンスによって裏付けられる。１つの一般的に使用される試験用ウイルスモデルは、タイレルネズミ脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）によって誘導される（Ｄａｌ Ｃａｎｔｏ，Ｍ．Ｃ．，およびＬｉｐｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，８８：４９７−５００（１９７７））。
【０００４】
多発性硬化症および他の脱髄疾患についての現在の治療法の限られた効果は、これらの疾患を改善するための新規療法への関心を刺激していた。しかし、潜在的に環境と自己免疫因子の両方を含む、これらの疾患の見かけ上複雑な病因病原論の故に、これらの脱髄疾患の有効な治療への必要性が現在も存在する。
【０００５】
ｒＨＩｇＭ２２は、げっ歯動物およびヒトの両方の成熟乏突起膠細胞およびミエリンに結合し、脱髄のインビボモデルにおいて新しいミエリンの合成を促進する組換えヒトＩｇＭ抗体である。これまでの試験における髄鞘再形成促進性ｍＡｂの標準的な用量は、ＩＰ投与で２５ｍｇ／ｋｇであった。この用量は、ヒトに当てはめて推定すると、非実用的である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、中枢神経系疾患、特に脱髄および／または再髄鞘形成を含むものについての実際的で安全且つ有効な治療レジメンを開発することの必要性が存在し、本発明が指向するのはその必要性に応えることである。
【０００７】
ここでの参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として入手可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明によれば、中枢神経系におけるニューロンの促進、刺激、再生および／または髄鞘再形成、および／または中枢神経系における脱髄の阻止または低減において活性を示すヒト抗体がクローン化され、単離された。特に、本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、組換え自己抗体、特に組換えヒト自己抗体を使用して、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索の髄鞘再形成を刺激する方法に関する。
【０００９】
本発明の第一態様では、前記抗体は、ｒＨＩｇＭ２２と称されるもののようなヒト抗体であり、組成物は、中枢神経系における髄鞘再形成を促進するために有効な量でそのような抗体を含む。前記抗体および対応する組成物は、体重ｋｇ当りで計算して約５００ｎｇ−約６００μｇの範囲の用量を送達するように作製される。
【００１０】
特定実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体を薬学的に受容可能な組成物中で単独投与する。別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体をメチルプレドニゾロンと組み合わせて投与する。メチルプレドニゾロンは、約１−２ｍｇの範囲の用量で週に１回または２回投与しうる。
【００１１】
別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体とメチルプレドニゾロンの投与は同時であるかまたは連続的でありうる。
【００１２】
本発明の第二の態様は、治療有効量のｒＨＩｇＭ２２抗体と薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供する。１つの実施形態では、前記組成物は治療有効量のｒＨＩｇＭ２２抗体だけを含有する。別の実施形態では、前記組成物は、治療有効量のメチルプレドニゾロンと組み合わせた治療有効量のｒＨＩｇＭ２２を含有する。さらに別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の組成物を１つの組成物として製剤し、およびメチルプレドニゾロンを別個の組成物として製剤して、各々を連続的にまたは同時に、そのような治療を必要とする被験者に処方しうる。さらに別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の治療有効量は、ニューロンの髄鞘再形成を促進する量である。別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の治療有効量は、同時に髄鞘再形成を促進しながら脱髄を低下させる量である。メチルプレドニゾロンと組み合わせて使用するとき、ｒＨＩｇＭ２２抗体は、脱髄を予防すること、髄鞘再形成を促進することまたはそれらの組み合せにおいてより有効でありうる。
【００１３】
本発明の４番目の態様は、本発明の組換えヒト抗体に由来するか、またはそれに関連するフラグメントおよび単量体を提供する。そこで、本発明は特にｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）に由来するか、または基づくフラグメントまたは単量体に関する。そのようなフラグメントおよび／または単量体は、親抗体分子と同じ活性を有し、ニューロンを再髄鞘化するか、またはニューロンの脱髄を防ぐ能力を示しうる。
【００１４】
本発明の５番目の態様は、ハプテンおよびペプチド類似体を含む、同様の治療活性を示しうる他の抗体および関連結合パートナーをスクリーニングするためのアッセイを提供する。そのような活性は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経損傷または機能障害の治療または予防を含む。
【００１５】
本発明の６番目の態様は、本発明の組換えモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを使用して、ヒトにおける多発性硬化症などの哺乳動物における脱髄疾患、および感染後脳脊髄炎などのヒトおよび家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する、またはこれらの疾患状態における脱髄の開始または進行を予防的に阻止する方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、乏突起膠細胞などのグリア細胞を生産し、その増殖を刺激するインビトロでの方法、および脱髄疾患を治療するためのこれらのグリア細胞の使用に関する。従って、１つの実施形態では、そのような抗体療法が有効である脱髄性神経症状または障害は、多発性硬化症である。別の実施形態では、そのような抗体療法が有効である脱髄性神経症状または障害は、急性または慢性脊髄損傷である。神経または神経線維の脱髄が著明である他の神経症状または疾患も考慮される。
【００１７】
本発明はまた、ニューロンの髄鞘再形成を助けるまたはニューロンの脱髄を防ぐ組換えヒト自己抗体のクローニング、単離および使用におよび、前記ヒト自己抗体の例はｒＨＩｇＭ２２である。以下の用語は本出願全体を通じて相互に使用可能である：ＲｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ２２、ｒＨＩｇＭ２２およびＬＹＭ２２。組換えｒＨＩｇＭ２２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列を図５および６に示しており、従って、本発明は、前記の図に示す配列を有するか、または少なくとも部分的にそれに対応する抗体および対応抗体タンパク質、およびハプテンなどの低分子に関する。抗体のこれらの配列は、部分的に、ヒト組換え形態の抗体をクローニングするために使用でき、あるいは研究または診断目的のためのプローブとして使用しうる。本発明はさらに、新たに特定された組換え抗体が、髄鞘再形成の促進、損傷した神経細胞の再生、神経保護、神経成長等のような様々な目的に使用しうることに関する。
【００１８】
本発明はまた、ここで述べる自己抗体に結合するペプチドを広く対象とし、これらのペプチドは、それらの配列、三次元構造または抗体結合から生じる構造配置的変化により、ペプチドワクチンにおいておよびそれら自体がペプチドワクチンとして使用することができる。本発明のさらなる態様では、これらのペプチドは、神経調節および／または免疫調節特性を有すると考えられ、そのような治療を必要とする哺乳動物において、神経細胞増殖応答および／または神経保護、神経再生および／または髄鞘再形成の役割を誘導する方法を提供しうる。
【００１９】
同様に、本発明は、ワクチンを含む治療製剤における有効成分としても機能しうるように、前記ペプチド、抗体および／または他の関連基質に結合することができ、免疫原性を有しうるハプテンを包含する。特定実施形態では、１つまたはそれ以上のハプテンをワクチン製剤中で本発明の他のペプチドと組み合わせうる。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、これらのペプチドは、タンパク質分解を防ぎ、それによって半減期を延長させるための安定剤と共に、そのような治療を必要とする哺乳動物に経口的、皮下、静脈内、鼻内、髄腔内経路でまたはリポソーム製剤として投与される薬学的組成物として製剤することができる。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ここでは神経調節物質と称し、中枢神経系における治療作用が著明である分子群を対象とする。従って、本発明は、中枢神経系において特に有効性を有する神経調節物質に関し、それらの物質は、ＩｇＭサブタイプの抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらの単量体、それらのアゴニスト、それらの擬態、およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む。クラススイッチ（天然にあるいは組換えまたは合成手段によって生じる）を受けたものを含む、種々のサブタイプの関連抗体も考慮され、但し、前記クラススイッチ抗体は本発明の方法において有用な神経調節物質としての特徴を有する。前記神経調節物質は以下の特徴の１つまたはそれ以上を有する：それらはグリア細胞の髄鞘再形成および／または細胞増殖を誘導する；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を惹起する；および／または細胞死、例えば過酸化水素誘導の細胞死を阻止する。
【００２２】
本発明の抗体は、髄鞘再形成も同時に誘導しうるポリクローナル抗体などの、神経組織に結合する他の抗体、特に他のポリクローナルＩｇＭ抗体、特にポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリンおよびその製剤、より具体的には、プールポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリンおよびプールポリクローナルヒトＩｇＭ免疫グロブリンと共に使用しうる。好ましくは、前記抗体は、髄鞘再形成することができる組換え生産されたヒト抗体または組換え生産されたキメラ抗体である。もう１つの特定実施形態では、前記組換え抗体は、ｒＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、その単量体、その活性フラグメント、およびｒＨＩｇＭ２２の特徴を有する天然または合成抗体である。本発明は、図５および６から選択される配列に少なくとも部分的に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその活性フラグメントを含む抗体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、同じかまたは相補的な配列を有する組換えＤＮＡまたはクローン化された遺伝子を含む、ここでは神経調節物質とも称され、および本発明の抗体、特に図５および６に示す配列に少なくとも部分的に対応する配列を有する抗体；本発明の抗体に少なくとも部分的に対応しうる、そしてここでは抗体ペプチドとも称されるペプチド、例えば図５および６に少なくとも部分的に対応する１つまたはそれ以上の配列を有するペプチド；およびハプテンなどの低分子を包含し且つそれらから選択されうる分子のクラスをコードする、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子またはそれらの縮重変異体に関する。
【００２４】
本発明はまた、ここで述べる活性を有し、上記に示すおよび上記で述べた、少なくとも一部は図５および６からなる群より選択されるアミノ酸配列を示す、前記抗体に由来するか、または前記抗体に対応するタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体を包含する。
【００２５】
本発明は、同様に、前記タンパク質または抗体ペプチドと同じ活性を示し、ワクチン中の製剤などによって同様に治療のために投与しうるハプテンに関する。１つの実施形態では、ペプチドとハプテンの両方を含むワクチンを製造しうる。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態では、そのようにして決定した組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子の完全なＤＮＡ配列を、適切な宿主に導入しうる発現調節配列に作動可能に連結しうる。本発明は、従って、本発明の抗体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むクローン化遺伝子または組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主に関する。
【００２７】
特定実施形態では、本発明の抗体の可変領域のＤＮＡ配列は、合成抗体を産生するときに使用しうる。特に、可変領域配列は、合成抗体を提供するためにその天然のまたは遺伝学的に提供される定常領域配列と組み合わせうる。本発明は、本発明の抗体のＤＮＡ配列、特に可変領域配列に由来し且つそれを含む合成抗体を産生するためのベクターを提供する。
【００２８】
本発明のある種の好ましい実施形態の他の好ましい特徴によれば、生物学的に活性を示す動物または特にヒト抗体ペプチドを生産するための組換え発現系が提供される。
【００２９】
本発明は、ここで例示する公知の組換え手法を含む、自己抗体、ペプチド、対応するハプテンまたはその他の低分子類似体のクローンの作製のためのいくつかの手段を包含し、本発明は、従って、そのような合成製剤をその範囲内に含むことが意図されている。ここで開示するｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の単離は、そのような組換え手法による本発明の抗体またはそれらの類似体の再生産（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を促進し、従って本発明は、組換えＤＮＡ手法による宿主系での発現のための、開示ＤＮＡ配列から作製される発現ベクター、および生じる形質転換宿主に関する。
【００３０】
本発明は、例えば本発明の自己抗体またはそれらの類似体の活性を増強することによって、標的哺乳動物神経細胞の神経活性を調節するために有効な潜在的薬剤のスクリーニングのためのアッセイシステムを包含する。１つの例として、試験薬剤を、対照との比較によって何らかの化学的試料（ＤＮＡを含む）または試験薬剤への自己抗体の結合活性に及ぼす作用を測定するために、自己抗体の活性を抑制するか、または阻害するリガンドまたは抑制された抗体を含む抽出物と共に、細胞試料に投与することができる。
【００３１】
本発明は、神経調節物質の存在の程度の定量的分析のため、またはそれらの活性を模倣しうるまたは阻止しうる薬剤または他の物質を特定するための、試験キットの形態で作製しうるアッセイシステムを包含する。前記システムまたは試験キットは、標識を神経調節物質、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストに結合する、ここで述べる放射性および／または酵素的手法の１つによって作製される標識成分、および１つまたはそれ以上の付加的な免疫化学試薬を含みうるが、前記免疫化学試薬の少なくとも１つは、前記標識成分、その結合パートナー、測定する成分またはそれらの結合パートナーの１つに結合することができる、遊離または固定リガンドである。
【００３２】
特定のおよびさらなる態様では、本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、本発明の抗体、特に自己抗体の、画像化およびインビボ診断適用における使用および適用に関する。そこで、前記抗体は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力により、免疫蛍光、放射性および他の診断的に適するタグを通して、中枢神経系を含む神経系の特徴付けおよび、特に多発性硬化症を含む、神経疾患の診断、モニタリングおよび評価のための、画像化試薬または画像化分子として利用することができる。前記抗体はさらに、卒中、脊髄損傷およびアルツハイマー病を含む様々な痴呆の診断、モニタリングおよび評価における画像化試薬または画像化分子として利用しうる。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、神経調節物質、それらのサブユニット、またはそれらの活性フラグメント、それらのペプチド等価物、それらの類似体の活性に基づく、あるいは同じ活性を有すると判定された物質または他の薬剤に基づく、ある種の治療方法に関する。最初の治療法は、抗体またはそれらのサブユニットの結合活性と因果関係があるまたはその結果として起こる症状の発現の予防に関連し、そして神経調節物質、対応する自己抗体、抗体ペプチド、それらの活性フラグメントまたはサブユニットの産生および／または活性を刺激することができる物質を、宿主においてそれらの症状の発現を予防するか、または治療するために有効な量で個別にまたは互いに混合して投与することを含む。例えば薬剤あるいは抗体またはそれらのフラグメントへの他の結合パートナー等を、多発性硬化症の治療におけるように、神経再生および／または神経保護作用を増強するため、または髄鞘再形成を刺激するために投与しうる。
【００３４】
より具体的には、一般にここで言及する治療方法は、神経調節物質の活性の有効な阻害因子またはエンハンサーを含有しうる薬学的組成物、または、例えばここで述べる本発明の態様に従って作製され、使用される薬剤スクリーニングアッセイによって開発される、他の等しく有効な薬剤の投与による、様々な疾病または他の細胞機能不全および障害の治療のための方法を包含しうる。例えば、図５および６に示す配列に少なくとも部分的に対応する配列を有する、薬剤または神経調節物質への他の結合パートナーまたは同様のタンパク質を、パーキンソン病または多発性硬化症の治療におけるように、神経再生、神経保護または髄鞘再形成を阻止するか、または増強するために投与しうる。特に、その配列を図５および６に示す、ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）のタンパク質、それらの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、単量体またはそれらの活性フラグメントは、それらの混合物および組み合せを含めて、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病または脊髄損傷を治療するためのような、神経再生および／または神経保護治療または髄鞘再形成が適切である場合の投与のために、ワクチンを含む医薬製剤として製造しうる。本発明は、ここで提供する抗体の組み合せを包含し、その場合特にｓＨＩｇＭ２２から選択される抗体、特にヒト抗体は、医薬および治療組成物または製剤として製造することができる。様々なヒト抗体、マウス抗体、あるいはそれらに由来するか、またはそれらに基づく単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体の組み合せまたは混合物も、本発明によって提供され、本発明に包含される。ヒト抗体（それらに由来する単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体に及ぶ）は、特にｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ４６、ＭＳＩ１９Ｅ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、ＭＳＩ１９Ｅ５およびＭＳＩ１０Ｅ１０の群から選択される。マウス抗体（それらに由来する単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体およびヒト化抗体に及ぶ）は、特にＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ７９．０８、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ９、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１の群から選択される。加えて、本発明はさらに、そのような何らかの神経再生および／または神経保護治療または髄鞘再形成において有用な治療化合物、薬剤または物質と前記抗体の組み合せを提供する。例えば本発明の抗体製剤または組成物は、βインターフェロン製剤（ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）等）およびコポリマー１（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））を含むがこれらに限定されない、多発性硬化症の治療のための治療化合物と組み合わせうる。加えて、本発明の抗体は、損傷部位で炎症を抑制するように作用しうる他の物質と組み合わせうる。１つのそのような物質はメチルプレドニゾロンである。
【００３５】
従って、神経再生および／または神経保護作用の促進に関連するある種の特徴および活性を示す、精製された形態でのヒト自己抗体および対応する抗体ペプチド、ハプテン、類似体およびそれらの活性フラグメントを含む、神経調節物質を提供することが本発明の主たる目的である。
【００３６】
侵襲性、自発性または特発性疾病状態が存在することが疑われる哺乳動物において自己抗体の存在、量および活性を検出するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００３７】
哺乳動物において自己抗体および／またはそれらのフラグメント、サブユニット等の活性を模倣するか、またはそれらの何らかの有害作用に対抗する上で潜在的に有効な、薬剤、作用物質等のような物質をスクリーニングするための方法および関連アッセイシステムを提供することが本発明のさらなる目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法および治療方法を述べる前に、本発明は特定の方法および記述する試験条件に限定されず、方法および条件はそれら自体が変化しうることが了解されるべきである。また、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、ここで使用する用語は特定実施形態を説明することだけを目的とするものであり、限定を意図しないことも了解されるべきである。
【００３９】
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用するとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる規定を与えない限り、複数の言及を包含する。そこで、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、ここで述べるタイプのおよび／または本開示等を読了後に当業者には明白となる、１つまたはそれ以上の方法および／または工程を包含する。
【００４０】
特に異なる規定がない限り、ここで使用するすべての技術的および学術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここで述べるものと類似のまたは等価のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験において使用できるが、ここでは好ましい方法および材料を述べる。ここで言及するすべての公表文献は参照としてここに組み込まれる。
【００４１】
（定義）
同じくここで使用するとき、本発明の抗体に関係する「ｒＨＩｇＭ」および「ｒｓＨＩｇＭ」、「ｓＨＩｇＭ２２」および「ＬＹＭ２２」という用語は、ここでは等価とみなされるものとする。
【００４２】
「被験者」は、ヒトを包含する。「ヒト」、「患者」および「被験者」という用語は、ここでは相互に使用可能である。
【００４３】
「治療有効量」は、疾患を治療するために被験者に投与するとき、疾患のためのそのような治療を生じさせるのに十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、および治療する被験者の年齢、体重等に依存して異なりうる。
【００４４】
何らかの疾患または障害を「治療すること」または何らかの疾患または障害の「治療」は、１つの実施形態では、その疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発現を阻止することまたは軽減すること）を指す。別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、被験者が識別できない、少なくとも１つの物理的パラメータを改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、物理的に（例えば識別可能な症状の安定化）、生理的に（例えば物理的パラメータの安定化）、またはその両方で、疾患または障害を調節することを指す。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の発症を遅延させることを指す。
【００４５】
本出願および特許請求の範囲全体を通じて個々に使用される「神経調節物質」という用語は、中枢神経系における特定の恩恵および作用を伴って神経突起の成長、再生および髄鞘再形成を促進するように機能する広いクラスの物質を指し、それ故、ＩｇＭサブタイプの抗体、特に、図３５−３８、４５、４６、５５−６１および７１−７２に示すペプチド配列に少なくとも部分的な配列類似性を有しうる物質を含む、ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７およびＭＳＩ１９Ｅ５、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらの単量体、アゴニスト、擬態等としてここで特定して言及するもののようなヒト抗体を含む。神経調節物質はまた、その単量体または活性フラグメントを含む、ここで提供する抗体の２つ以上の組み合せまたは混合物を含み、包含する。
【００４６】
また、「神経調節物質」、「自己抗体」、「抗体ペプチド」、「ペプチド」、「ハプテン」という用語および特定して列挙されていない何らかの変異体は、それらがすべて単一または複数のタンパク質を含むタンパク質様物質を指すことができ、それを含みうる限り、ここでは交換可能に使用でき、そして、ここで述べるおよび図５−６に示すアミノ酸配列データおよびここでおよび特許請求の範囲において述べる活性プロフィールを有するタンパク質を対象とする。従って、実質的に等しいまたは変化した活性を示すタンパク質も同様に考慮される。これらの修飾は、例えば部位指定的突然変異を通して得られる修飾のように意図的であるか、または複合体またはその指定サブユニットの生産者である宿主における突然変異を通しえるもののように偶発的でありうる。また、「神経調節物質」、「自己抗体」、「抗体ペプチド」、「ペプチド」、「ハプテン」という用語は、適宜に、ここで特定して列挙されるそれらの範囲内のタンパク質並びに実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異体を包含することが意図されている。
【００４７】
ここで述べるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性形態であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性形態の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能特性がそのポリペプチドによって保持されている限り、何らかのＬ−アミノ酸残基に置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に従って、アミノ酸残基についての略記法を以下の対応表に示す：
対応表
記号 アミノ酸
１文字 ３文字
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｎ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
すべてのアミノ酸残基配列は、ここでは、その左および右方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表わされていることに留意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の起始部または末端のダッシュは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。上記の表は、ここで交互に出現しうる３文字表記と１文字表記を相関させて示している。
【００４８】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製することができる何らかの遺伝的エレメント（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００４９】
「ベクター」は、もう１つ別のＤＮＡセグメントが、結合したセグメントの複製を生じさせるように結合している、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。「ＤＮＡ分子」は、その一本鎖形態または二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体形態を指す。この用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、いずれの特定三次形態にも限定されない。それ故、この用語は、中でも特に線状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中に認められる、二本鎖ＤＮＡを包含する。特定二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じるとき、配列は、ここでは、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常慣例に従って記述しうる。
【００５０】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【００５１】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下においたとき、インビボでポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の範囲は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を含みうるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常はコード配列の３’側に位置する。
【００５２】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞におけるコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のようなＤＮＡ調節配列である。
【００５３】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に隣接し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって好都合に規定される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合の役割を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。真核生物プロモーターはしばしば、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００５４】
「発現制御配列」は、もう１つ別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写し、次にそれがコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳されるとき、細胞中の転写および翻訳調節配列の「制御下に」ある。
【００５５】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれうる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向かわせるまたはポリペプチドを培地中に分泌するように宿主細胞に伝達する、ポリペプチドのＮ末端のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物にネイティブな種々のタンパク質に関連して認められうる。
【００５６】
本発明のプローブに言及するときここで使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個またはそれ以上、好ましくは３個以上のリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確な大きさは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する、多くの因子に依存する。
【００５７】
ここで使用する「プライマー」という用語は、精製制限消化におけるように天然に生じるかまたは合成によって生産されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下においたとき、すなわち適切な温度とｐＨでヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下においたとき、合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖または二本鎖でありえ、誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーのソースおよび使用する方法を含む、多くの因子に依存する。例えば診断適用のためには、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５−２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。
【００５８】
プライマーは、ここでは、特定標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合し、残りのプライマー配列は鎖に相補的でありうる。あるいは、プライマー配列がそれとハイブリダイズし、それによって伸長産物の合成のために鋳型を形成するために鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーの中に散在させることができる。
【００５９】
ここで使用する、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、各々が特定ヌクレオチド配列でまたはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する、細菌酵素を指す。
【００６０】
細胞は、外来性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入されたとき、そのようなＤＮＡによって「形質転換」された。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色ＤＮＡに組み込まれても（共有結合されても）よくまたは組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントに維持されうる。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、染色体複製を通して娘細胞によって受け継がれるように染色体内に組み込まれたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の個体群からなる細胞系またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通祖先から誘導される細胞の個体群である。「細胞系」は、多くの世代にわたってインビトロで安定に増殖することができる一次細胞のクローンである。
【００６１】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の規定の長さにわたってマッチするとき「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウエアを使用して、または、例えばその特定システムに関して定義されるストリンジェント条件下での、サザンハイブリダイゼーション試験において、配列を比較することによって特定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当技術分野の技術的範囲内である。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出参照。特に、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、対応する生殖細胞系遺伝子配列に実質的に相同であり、対応生殖細胞系遺伝子配列に少なくとも約９０％の相同性を有する。
【００６２】
本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列、または少なくともその一部を規定する、または図５−６に示すのと同じアミノ酸配列を有するが、同じ配列番号に縮重しているペプチドをコードする、ペプチド類似体、ハプテンまたはそれらの活性フラグメントも、本発明の範囲内であることは認識されるべきである。「〜に縮重」とは、特定アミノ酸を規定するために異なる３文字コドンが使用されることを意味する。以下のコドンが、各々の特定アミノ酸をコードするために交換可能に使用できることは当技術分野において周知である。
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ
終結コドン ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）
上記に明記するコドンはＲＮＡ配列に関するものであることが了解されるべきである。ＤＮＡについての対応コドンはＵの代わりにＴを有する。
【００６３】
特定コドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンに変更するように、特定ＤＮＡ配列または分子内で突然変異を実施することができる。そのような突然変異は、一般に、最小ヌクレオチド変化を可能にすることによって実施される。この種の置換突然変異は、生じるタンパク質内のアミノ酸を非保存的に（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、別のグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）または保存的に（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）変化させるように実施しうる。そのような保存的変化は、一般に、生じるタンパク質の構造および機能のより小さな変化を導く。非保存的変化は、生じるタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性がより高い。本発明は、生じるタンパク質の活性または結合特徴を有意に変化させない保存的変化を含む配列を包含するとみなされるべきである。
【００６４】
以下は、アミノ酸の様々なグループの一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン
バリン
ロイシン
イソロイシン
プロリン
フェニルアラニン
トリプトファン
メチオニン。
【００６５】
無電荷極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン
セリン
トレオニン
システイン
チロシン
アスパラギン
グルタミン。
【００６６】
電荷極性Ｒ基（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸
グルタミン酸。
【００６７】
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン
アルギニン
ヒスチジン（ｐＨ６．０で）
もう１つのグループは、フェニル基を有するアミノ酸でありうる：
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン。
【００６８】
もう１つのグループは、分子量（すなわちＲ基の大きさ）に従いうる：
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リシン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０で） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４。
【００６９】
特に好ましい置換は：
−正電荷が維持されうるＡｒｇの代わりのＬｙｓおよびその逆；
−負電荷が維持されうるＡｓｐの代わりのＧｌｕおよびその逆：
−遊離−ＯＨが維持できるＴｈｒの代わりのＳｅｒ；および
−遊離ＮＨ２が維持できるＡｓｎの代わりのＧｌｎ
である。
【００７０】
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を有するアミノ酸に置換するためにも導入しうる。例えばＣｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位に導入しうる。Ｈｉｓは、特に「触媒」部位として導入しうる（すなわちＨｉｓは酸または塩基として働くことができ、生化学的触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質構造にβターンを導入する、その特に平面的な構造の故に導入されうる。
【００７１】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは約９０または９５％）が同一であるかまたは保存的置換であるとき、「実質的に相同」である。特に、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、対応する生殖細胞系遺伝子アミノ酸配列に実質的に相同であり、対応生殖細胞系遺伝子アミノ酸配列に少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００７２】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の、天然ではそのより大きな分子と結びついて認められることがない、ＤＮＡを特定することが可能なセグメントである。そこで、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、その遺伝子は通常、ソース生物のゲノム内ではその哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接される。異種コード配列のもう１つの例は、そのコード配列自体が天然では認められない構築物である（例えばゲノムコード配列が、イントロンまたは天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含むｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または自然発生的な突然変異的事象は、ここで定義するＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００７３】
ここで使用する、「抗体」という用語は、特定エピトープに結合する、抗体およびそのフラグメントを含む免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を包含し、キメラ抗体は米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号に詳細に述べられている。そのような抗体は、公知の一般的手法によって作製されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びに二重特異性またはキメラ抗体、および、例えば中枢神経系軸索の髄鞘再形成および／または再生を刺激する、または神経保護を提供するそれらの調節作用の能力と共に付加的な診断用途に適する他の機能性を含む抗体を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超過変領域からなる抗体分子の構造部分である。ここで使用するその様々な文法的形態での「抗体分子」という語句は、無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分の両方を考慮する。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当技術分野で知られる部分を含む、パラトープを有する無傷の免疫グロブリン分子の部分である。
【００７４】
抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分または抗体フラグメントは、周知の方法による、実質的に無傷の抗体分子に関する、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解応によって作製しうる。例えばＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらへの米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から、２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合をメルカプトエタノールなどで還元し、次に生じたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化することによって作製される。無傷の抗体分子を含む抗体がここでは好ましい。
【００７５】
その様々な文法的形態での「モノクローナル抗体」という語句は、特定抗原と免疫反応することができる１つの種だけの抗体結合部位を有する抗体を指す。モノクローナル抗体は、それ故、典型的にはそれが免疫反応する抗原に対して単一結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、それ故、各々が異なる抗原に対して免疫特異性である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含みうる。
【００７６】
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生するための一般的方法は周知である。不朽抗体産生細胞系も、癌遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションなどの、融合以外の手法によって創造することができる。例えばＭ．Ｓｃｈｅｒｅｉｅｒら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８０）参照；また米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４５１，５７０号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号；同第４，４９１，６３２号；同第４，４９３，８９０号も参照のこと。
【００７７】
（一般的説明）
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学および当技術分野の技術的範囲内の組換えＤＮＡ手法が使用できる。そのような手法は文献において詳細に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編集（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編集（１９９４）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）参照。
【００７８】
本発明の方法において有用であり、神経調節物質ペプチドまたは自己抗体ペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な性質、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性等に関してスクリーニングすることができる。特に興味深いのは、神経調節物質、特に本発明の自己抗体と同じ活性を示すモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナル抗体は、ここで提示し、説明するタイラーウイルス、ＥＡＥおよびリゾレシチンモデルなどの活性のアッセイにおいて容易に特定できる。天然または組換え自己抗体の免疫親和性の精製が可能であるとき、高親和性抗体も有用である。
【００７９】
好ましくは、本発明の診断方法および治療方法において使用する抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。加えて、ここで使用する抗体分子は、全抗体分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態であることが考慮される。
【００８０】
先に示唆したように、本発明の診断方法は、抗ペプチド抗体、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂなどの、抗体ペプチド／タンパク質に対するアンタゴニストの有効量を含むアッセイによって細胞試料または媒体を検討することを含む。加えて、ここで使用する抗ペプチド抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態または全抗体分子であることが好ましい。先に述べたように、この方法から恩恵を受けることができる患者は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ウイルス感染または身体的外傷から生じる損傷を含む他の同様の神経病理学的障害などの神経学的症状を呈している患者を含む。ペプチドを単離し、抗ペプチド抗体を誘導するための方法および標的細胞の検討を助ける抗ペプチド抗体の能力を判定し、最適化するための方法は、すべて当技術分野において周知である。
【００８１】
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である。Ｎｅｓｔｏｒらへの米国特許第４，４９３，７９５号参照。典型的には有用な抗体分子のＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２部分を含む、モノクローナル抗体は、参照としてここに組み込まれる、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に述べられているハイブリドーマテクノロジーを使用して作製することができる。簡単に述べると、それからモノクローナル抗体組成物が生産されるハイブリドーマを形成するために、骨髄腫または他の自己永続化細胞系を、その抗体ペプチド結合部分、または抗体ペプチドまたはフラグメント、またはその起源特異的ＤＮＡ結合部分で超免疫化した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と融合する。
【００８２】
脾細胞を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００を使用して骨髄腫細胞と融合する。融合したハイブリッドを、ＨＡＴに対するそれらの感受性によって選択する。本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明の自己抗体と同じように免疫反応するそれらの能力および標的細胞および組織において規定の活性を阻害するか、または促進するそれらの能力によって特定する。
【００８３】
本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始させることによって生産できる。前記培養を、ハイブリドーマが媒体中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下で十分な時間維持する。次に抗体含有媒体を収集する。その後周知の手法によって抗体分子をさらに単離することができる。
【００８４】
これらの組成物の調製のために有用な媒体は、当技術分野において周知であり且つ市販されており、合成培地、近交系マウス等を含む。例示的な合成培地は、４．５ｇ／ｌグルコース、２０ｍｍグルタミンおよび２０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。例示的な近交系マウス系統はＢａｌｂ／ｃである。
【００８５】
モノクローナル抗ペプチド抗体を産生するための方法も当技術分野において周知である。Ｎｉｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）参照。典型的には、本発明の抗体ペプチドあるいはペプチド類似体またはフラグメントは、抗ペプチドモノクローナル抗体を産生するための前述した手順における免疫源として、単独でまたは免疫原性キャリアと併用して使用される。ハイブリドーマは、抗体ペプチド類似体と免疫反応し、それによって本発明の抗体と同様に反応する抗体を産生する能力に関してスクリーニングされる。
【００８６】
抗体の作製において、所望の抗体に関するスクリーニングは、当技術分野において周知の手法、例えば放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチュー免疫測定法（例えばコロイド状金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等によって達成できる。１つの実施形態では、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって一次抗体を検出する。さらなる実施形態では、二次抗体を標識する。免疫測定法において結合を検出するための多くの手段が当技術分野において公知であり、本発明の範囲内である。
【００８７】
抗体は、例えば酵素、発蛍光団、発色団、放射性同位体、染料、コロイド状金、ラテックス粒子および化学発光物質などの標識で、インビトロでの検出のために標識することができる。あるいは抗体は、例えば放射性同位体（好ましくはテクネチウムまたはヨウ素）、磁気共鳴シフト試薬（ガドリニウムおよびマンガンなど）または放射線不透過性試薬で、インビボでの検出のために標識することができる。
【００８８】
これらの試験のために最も一般的に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線に曝露したとき蛍光を有する化学物質その他である。
【００８９】
多くの蛍光物質が公知であり、標識として利用できる。これらは、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローを含む。特定検出材料は、ヤギにおいて調製し、イソチオシアネートを通してフルオレセインとコンジュゲートした抗ウサギ抗体である。ポリペプチドも放射性元素または酵素で標識することができる。放射性標識は、現在使用可能な計数手段のいずれかによって検出できる。好ましい同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択されうる。
【００９０】
酵素標識も同様に有用であり、現在使用される比色定量、分光測光法、蛍光分光光度法、電流滴定またはガス定量手法のいずれかによって検出できる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような架橋分子との反応によって選択粒子にコンジュゲートされる。これらの手順において使用できる多くの酵素が公知であり、利用できる。好ましいものとしては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号および同第４，０１６，０４３号が、例として、選択的な標識材料および方法についてのそれらの開示に関して参照される。
【００９１】
ポリクローナル免疫グロブリン製剤は、免疫系の機能不全または調節不全を特徴とするか、またはそれらを伴う様々な臨床状況において有益な臨床作用を及ぼすことが示された。免疫グロブリンはまた、個体が一部の疾病を予防するために十分なそれ自身の免疫を生成しないときに起こりうる疾病を予防するか、または治療するために使用される。今日使用されているほぼすべての免疫グロブリン製剤が、分画によるヒト血漿の大きなプールに由来する、高度精製ＩｇＧからなる。これらの製剤は一般に静脈内経路（ＩＶＩＧ）で投与されるが、筋肉内投与（ＩＧＩＭ）および経口投与も使用される。
【００９２】
一般的に使用されるＩｇＧ製剤は、Ｇａｍｉｍｕｎｅ（５％および１０％）（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ガンマガード（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ポリガム（Ｐｏｌｙｇａｍ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）、サンドグロビン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｉｎ）（Ｓａｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベノグロビン（Ｖｅｎｏｇｌｏｂｉｎ）（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ）およびイントラグロビン（Ｉｎｔｒａｇｌｏｂｉｎ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）を含む。筋肉内免疫グロブリン（ＩＧＩＭ）、ベイガム（ＢａｙＧａｍ）はＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能である。臨床用途のＩＶＩＧ製剤は、主としてＩｇＧ、より少量のＩｇＡ、およびさらに少量のＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含有し、一般に９５％またはそれ以上のＩｇＧ、２−５％ＩｇＡおよび極微量のＩｇＭを含む。
【００９３】
ペンタグロビン（Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）は、ＩｇＭに富む多価免疫グロブリン製剤であり、溶液各々１ｍｌは、ＩｇＭ ６ｍｇ、ＩｇＡ ６ｍｇ、ＩｇＧ ３８ｍｇおよび注射用グルコース一水和物２７．５ｍｇ、または１２％ＩｇＭ、一般には１０−１５％ＩｇＭを含有する。ＩｇＭをさらに強化した免疫グロブリン製剤は容易に生成することができ、ある種の症状の治療または緩和のために動物モデルにおいて有効と報告されている。Ｒｉｅｂｅｒｔらは、急性炎症のラットモデルにおけるＩｇＭ強化ヒト静脈内免疫グロブリンの使用、特にペンタグロビンおよびＩＶＩｇＭの試験用製剤（３５ｇ／ｌ ＩｇＭ、１２ｇ／ｌ ＩｇＡ、３ｇ／ｌ ＩｇＧ）の使用を報告している（Ｒｉｅｂｅｒｔ，Ｒ．ら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３（３）：９４２−９５１）。Ｈｕｒｅｚらは、試験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）における９０％以上の静脈内ＩｇＭ製剤の使用を報告している（Ｈｕｒｅｚ，Ｖ．ら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ９０（１０）：４００４−４０１３）。少なくとも２０重量％ＩｇＭのＩｇＭ抗体免疫グロブリン製剤が、それらの全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第５，２５６，７７１号、同第５，５１０，４６５号および同第５，６１２，０３３号に述べられている。免疫グロブリンの総含有量に対して少なくとも５０％重量％のＩｇＭを含有する静脈内投与可能なポリクローナル免疫グロブリン製剤が、その全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第５，１９０，７５２号においてＭｏｌｌｅｒらによって記述されている。
【００９４】
免疫グロブリン製剤は、一般に当業者に周知の方法および工程によって生成される。免疫グロブリンは健常志願者の血液から調製され、供血者の数は少なくとも約５または１０、好ましくは少なくとも約１００、より好ましくは少なくとも約１，０００、さらに一層好ましくは少なくとも約１０，０００人である。１つの一般的の方法では、数千人の供血者のプールに由来するヒト血漿を低温エタノール分画（Ｃｏｈｎ法またはＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法）（Ｃｏｈｎら（１９４６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９−４７５；Ｏｎｃｌｅｙら（１９４９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１：５４１−５５０）によって分別し、次に低いｐＨで酵素処理し、分画して、クロマトグラフィーにかける。低温エタノール分画の後に限外ろ過およびイオン交換クロマトグラフィーを実施してもよい。免疫グロブリン製剤をウイルス伝播から安全にするために、酵素修飾、化学修飾、β−プロピオラクトンでの処理、低いｐＨでの処理、高熱での処理および溶媒／洗浄剤での処理を含むがこれらに限定されないさらなる工程を組み込む。有機溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）混合物での処理は、エンベロープに包まれたウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）によるウイルス伝播を排除する（Ｇａｏ，Ｆ．ら（１９９３）Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ６４（４）：２０４−９；参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，４８１，１８９号および同第４，５４０，５７３号）。ＩｇＭ強化免疫グロブリン溶液のための個々の工程および方法は、それらの全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，３１８，９０２号および同第６，１３６，１３２号に述べられている。
【００９５】
ここで考慮するおよび本発明の方法における使用に適するポリクローナルＩｇＭ強化免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリン製剤を製造するために使用される周知の方法のいずれかによって生成できる。適切な免疫グロブリンはまた、市販のものを入手することができる。免疫グロブリン製剤はヒト免疫グロブリン製剤でありうる。適切な免疫グロブリン製剤は、少なくとも約１０％ＩｇＭ、少なくとも約１５％ＩｇＭ、少なくとも約２０％ＩｇＭ、少なくとも約２５％ＩｇＭ、少なくとも約３０％ＩｇＭ、少なくとも約４０％ＩｇＭ、少なくとも約５０％ＩｇＭ、少なくとも約６０％ＩｇＭ、少なくとも約７０％ＩｇＭ、少なくとも約８０％ＩｇＭ、少なくとも約９０％ＩｇＭおよび少なくとも約９５％ＩｇＭを含む。本発明における使用に適するポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、１０％以上のＩｇＭ、２０％以上のＩｇＭおよび５０％以上のＩｇＭを含む。本発明における使用に適するポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、ＩｇＧの量より多く且つＩｇＡの量より多い量のＩｇＭを含む。
【００９６】
ＩｇＭ強化免疫グロブリン、特にヒト免疫グロブリンのフラグメントの製剤も本発明に従って使用できる。免疫グロブリンのフラグメントは、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２および一本鎖免疫グロブリンまたは単量体などの無傷の免疫グロブリンの部分を指す。
【００９７】
ＩｇＭ強化免疫グロブリン製剤は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤中で提供され、静脈内、筋肉内経路でまたは経口的に投与される。ＩｇＭ免疫グロブリンは、ＩＶＩＧまたはＩＧＩＭまたはペンタグロビンを含む、臨床的に採用されている免疫グロブリンの投与のために当業者によって認識され、使用される投与と同様の用法および用量で、あるいは製造者によって臨床的に示されるまたは推奨されるように投与される。本発明の中心的な態様によれば、組換えＩｇＭ製剤は、マウスにおいて決定される、約５００ｎｇ−約６００μｇの用量で投与される。被験者の大きさおよび表面積対容積の差を考慮して、ヒトに適合するようにこれらの量を調整することにより、おおよその範囲は約１．２５−約２．５μｇ／ｋｇ体重となる。投与は、単回投与でまたは１日中で複数回に分けたまたは分割した用量でまたは数日間または数ヶ月間にわたって、実施することができる。適切な用量は、１．２５μｇ／ｋｇ体重、１．３μｇ／ｋｇ体重、１．４μｇ／ｋｇ体重、１．５μｇ／ｋｇ体重、１．６μｇ／ｋｇ体重、１．７μｇ／ｋｇ体重、１．８μｇ／ｋｇ体重、１．９μｇ／ｋｇ体重、２．０μｇ／ｋｇ体重、２．１μｇ／ｋｇ体重、２．２μｇ／ｋｇ体重、２．３μｇ／ｋｇ体重、２．４μｇ／ｋｇ体重および２．５μｇ／ｋｇ体重を含む。ポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、単独でまたは、症状の治療または緩和のための他の化合物または作用物質を含むがこれらに限定されない、他の治療と組み合わせて投与しうる。脱髄疾患、特に多発性硬化症の治療または緩和の場合は、ＩｇＭ免疫グロブリンを抗炎症薬、ステロイド、ベタセロン、コパキソン等と共に投与しうる。
【００９８】
従って、本発明の診断適用の１つの態様では、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の存在または活性を検出するための方法を開示し、前記神経調節物質は、以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および選択的に、グリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有しており、また前記神経調節物質は、
Ａ）前記神経調節物質の存在または活性が疑われる哺乳動物からの生物学的試料を、神経調節物質がその結合パートナーに結合することを可能にする条件下で、前記神経調節物質の結合パートナーと接触させること；および
Ｂ）前記試料からの前記神経調節物質と結合パートナーとの間で結合が起こったかどうかを検出すること
によって測定され、結合の検出は、試料中の神経調節物質の存在または活性を示す。
【００９９】
異なる態様では、本発明は、前述したように神経調節物質の存在または活性を検出することを含む、哺乳動物において所与の侵襲性刺激に関連するポリペプチドリガンドの存在および活性を検出するための方法に関し、神経調節物質の存在または活性の検出は、哺乳動物における所与の侵襲性刺激に関連したポリペプチドリガンドの存在および活性を示す。特定の態様では、侵襲性刺激は感染であり、ウイルス感染、原生動物感染、細菌感染、腫瘍状哺乳動物細胞および毒素から選択されうる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質に対する結合部位を検出するための方法に関し、前記神経調節物質は、以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および選択的に、グリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有しており、前記方法は、
Ａ．標識した神経調節物質試料を、前記神経調節物質に対する結合部位が疑われる哺乳動物からの生物学的試料と接触させること；
Ｂ．結合試験において、前記生物学的試料を前記標識神経調節物質の存在に関して検査すること；
を含み、前記標識神経調節物質の存在は、神経調節物質に対する結合部位を示している。
【０１０１】
さらに、本発明は、ＩｇＭサブタイプの抗体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の活性を調節する、薬剤または他の実体の能力を試験する方法を含み、前記方法は、
Ａ．神経調節物質に対する受容体を有する試験細胞のコロニーを、神経調節物質を含む増殖培地で培養すること；
Ｂ．試験下の薬剤を添加すること；および
Ｃ．前記神経調節物質と前記試験細胞のコロニー上の受容体との反応性を測定すること
を含み、前記神経調節物質は、以下の特徴：
ａ） 髄鞘再形成を誘導すること；
ｂ）神経組織、特に乏突起膠細胞に結合すること；
ｃ）乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および
ｄ）グリア細胞の細胞増殖を促進すること
の１つまたはそれ以上を有する。
【０１０２】
これらに対応して、本発明は、薬剤および他の作用物質を、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の産生を調節するか、または活性を模倣する能力に関してスクリーニングするためのアッセイ方法を包含し、前記方法は、
Ａ．薬剤または作用物質を接種した観察可能な細胞試験コロニーを培養すること；
Ｂ．前記試験細胞コロニーから上清を採集すること；および
Ｃ．前記上清を前記神経調節物質の存在に関して検査し、前記神経調節物質のレベルの上昇または低下が、前記神経調節物質の活性を調節する薬剤の能力を示すこと
を含み、前記神経調節物質は、以下の特徴：
ｉ） 髄鞘再形成を誘導すること；
ｉｉ）神経組織、特に乏突起膠細胞に結合すること；
ｉｉｉ）乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および
ｉｖ）グリア細胞の細胞増殖を促進すること
の１つまたはそれ以上を有する。
【０１０３】
最後に、真核細胞試料において、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質を明らかにするための試験キットが考慮され、前記キットは、
Ａ．以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；およびグリア細胞の細胞増殖を促進するもののうちの１つまたはそれ以上を有する神経調節物質の、検出可能に標識された特異的結合パートナーの所定の量；
Ｂ．他の試薬；および
Ｃ．前記キットの使用のための指示
を含む。
【０１０４】
真核細胞試料において、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の存在を明らかにするための異なる試験キットを開示する。前記キットは、
Ａ．以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；およびグリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有する神経調節物質の所定の量；
Ｂ．前記神経調節物質の特異的結合パートナーの所定の量；
Ｃ．他の試薬；および
Ｄ．前記キットの使用のための指示
を含み、前記神経調節物質または前記特異的結合パートナーのいずれかは検出可能に標識されている。上記キットはどちらも、神経調節物質に対するポリクローナル抗体、神経調節物質に対するモノクローナル抗体、それらのフラグメントおよびそれらの混合物からなる群より選択される、標識した免疫化学的反応性成分を利用しうる。
【０１０５】
本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、本発明の抗体、特に自己抗体の、画像化およびインビボ診断への適用における使用および適用に関する。そこで、前記抗体は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力により、中枢神経系を含む神経系の特徴付けおよび、特に多発性硬化症を含む、神経疾患の診断、モニタリングおよび評価のための画像化剤または画像化分子として、免疫蛍光、放射性および他の診断に適するタグを通して利用できる。前記抗体はさらに、卒中、脊髄損傷およびアルツハイマー病を含む様々な痴呆の診断、モニタリングおよび評価における画像化剤または画像化分子として利用しうる。インビボでの画像化における使用のために抗体にカップリングするか、または結合するための十分且つ適切な免疫蛍光、放射性または他の標識分子または物質は周知であり、当業者の技術的範囲内である。
【０１０６】
本発明はまた、ヒトにおける多発性硬化症などの哺乳動物における脱髄疾患、および感染後脳脊髄炎のようなヒトおよび家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を、ｒＨＩｇＭ２２としてここで述べる組換えヒト抗体並びにＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ７９．０８、Ｏ１、Ｏ４、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１モノクローナル抗体、およびヒト自己抗体ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６、ハプテンを含むそれらの類似体、それらの活性フラグメント、またはそれらの特徴を有する天然または合成自己抗体を使用して治療する方法に関する。脱髄疾患の発症または進行を抑制するための、これらのｍＡｂ、それらの活性フラグメント、または同じ特徴を有する他の天然または合成自己抗体を使用した予防的治療の方法も本発明に包含される。
【０１０７】
中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン形成細胞である乏突起膠細胞（ＯＬ）は、脳室下領域の神経外胚葉細胞として発生し、その後移動して成熟し、ミエリンを産生する。乏突起膠細胞の連続的な発達は、十分に特性付けられた分化段階特異的マーカーによって特定される。乏突起膠細胞／３型星状膠細胞（Ｏ−２Ａ）前駆細胞と称される、増殖および移動性双極前駆細胞は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ＧＤ３およびＡ２Ｂ５によって特定される［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６（１９７９），４９１３−４９１７］。多極、移動後および増殖細胞によって特徴付けられる次の発達段階は、ｍＡｂ Ｏ４によって認識される［Ｇａｒｄら、Ｎｅｕｒｏｎ，５（１９９０），６１５−６２５；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３（１９８１），３１１−３２７］。さらなる発達は、ｍＡｂ Ｏ１によって認識されるガラクトセレブロシドの細胞表面発現によって［Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，３９（１９８２）、１−８；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］、として２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホヒドロラーゼの発現によって規定される。最も成熟した細胞は、ミエリン塩基性タンパク質およびプロテオリピドタンパク質などの最終分化マーカーを発現する。
【０１０８】
乏突起膠細胞発達の段階を特徴付けるために使用されるｍＡｂ（Ａ２Ｂ５、Ｏ１およびＯ４）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをニワトリ胚網膜細胞またはウシ脳梁のホモジネートで免疫することによって作製された［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、前出；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］。Ａ２Ｂ５は、Ｏ−２Ａ前駆細胞だけでなくニューロンも認識し、細胞表面ガングリオシドＧＱ１ｃ［Ｋａｓａｉら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２７７（１９８３）、１５５−１５８］および他のガングリオシド［Ｆｒｅｄｍａｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２３３（１９８４）、６６１−６６６］と反応する。Ｏ４は、スルファチド、セミノリピドおよびコレステロールと反応し［Ｂａｎｓａｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２４（１９８９），５４８−５５７］、一方Ｏ１は、ガラクトセレブロシド、モノガラクトシル−ジグリセリドおよびサイコシンと反応する［Ｂａｎｓａｌら、前出］。これらのｍＡｂはＩｇＭ免疫グロブリン（Ｉｇ）サブクラスに属し、細胞質構造並びに乏突起膠細胞の表面抗原を認識する［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、前出；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨＳＢ−２ Ｔリンパ芽球細胞の膜懸濁液で免疫することによって作製されるマウスｍＡｂ ＨＮＫ−１（抗Ｌｅｕ−７）が、ナチュラルキラー細胞についてのマーカーとして最初に報告された［Ａｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２７（１９８１），１０２４−１０２９］。その後、ＨＮＫ−１細胞は神経系と抗原決定基を共有することが示された［Ｓｃｈｕｌｌｅｒ−Ｐｅｔｒｏｖｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ，３０６（１９８３），１７９−１８１］。中枢および末梢ミエリン鞘の両方で認められる、ミエリン関連糖タンパク質上の糖質エピトープは、ＨＮＫ−１と反応する神経組織の主要抗原であることが示された［ＭｃＧａｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３０６（１９８３），３７６−３７８］。しかし、神経組織中の他の糖タンパク質はこのｍＡｂと反応し、その内の一部は胚形成、分化および髄鞘形成において重要である［Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１６（１９８５），７２８−７３０；Ｋｒｕｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１１（１９８４），１５３−１５５；Ｋｒｕｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１６（１９８５），１４６−１４８；ＭｃＧａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（１９８５）、１０１−１１４］。興味深いことに、ＨＮＫ−１は細胞質構造とも反応し、ＩｇＭ Ｉｇサブクラスに属する。
【０１０９】
その全体が参照としてここに組み込まれる、特許出願第Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２３６，５２０号において本出願の発明人の一部が開示し、特許請求する、ＳＣＨ９４．０３と称されるモノクローナル抗体は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）に慢性感染したマウスにおいて中枢神経系の髄鞘再形成を促進することが認められた［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１９９４）、６２３０−６２３８］。ＳＣＨ９４．０３は、ＩｇＭ（κ）Ｉｇサブクラスに属し、乏突起膠細胞上の未知の表面抗原を認識するが、すべての細胞における細胞質抗原も認識する（Ａｓａｋｕｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，製版段階）。ＥＬＩＳＡによるＳＣＨ９４．０３の多反応性、および非突然変異Ｉｇ可変領域生殖細胞系配列は、ＳＣＨ９４．０３が天然自己抗体であることを示唆した［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１９９４）、６２３０−６２３８］。ＳＣＨ９４．０３の綿密な試験、および周知の乏突起膠細胞反応性ｍＡｂであるＡ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＨＮＫ−１との比較は、これらが天然自己抗体である可能性を提起した。Ｉｇ可変領域ｃＤＮＡ配列のその後の分析およびＥＬＩＳＡによるこれらのｍＡｂの多反応性は、これが同様の有用性を有する天然自己抗体の属群であることを確認した。
【０１１０】
モノクローナル抗体、すなわちここでＳＣＨ９４．０３（ここではＳＣＨ９４．３２とも称する）およびＳＣＨ７９．０８と称するＩｇＭモノクローナル抗体（どちらも正常哺乳動物（すなわちいかなる脱髄疾患にも感染していない）からの脊髄ホモジネートで免疫した哺乳動物から作製される）の抗原反応性は、その教示が参照としてここに組み込まれる、１９９４年４月２９日出願の前記特許願第Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２３６，５２０号において、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウエスタンブロット法、固相酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびＩｇ可変領域配列決定を含むいくつかの生化学および分子アッセイを用いて特徴付けされ、説明されている。モノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３およびＳＣＨ７９．０８を産生するハイブリドーマは、ブタペスト条約の規定の下で、それぞれ１９９４年４月２８日および１９９６年２月２７日にｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、それぞれＣＲＬ１１６２７およびＨＢ１２０５７のＡＴＣＣアクセッション番号を与えられた。帰宅物質のアベイラビリティーに対するすべての制限は、特許の許諾後取消し不能に取り除かれる。
【０１１１】
天然または生理的自己抗体は、正常では血清中に存在し、自己構造、抗原または細胞に反応性であるまたは結合できることによって特徴付けられる。それらは多反応性であることが多く、しばしばＩｇＭサブタイプであり、非突然変異生殖細胞系遺伝子によってコードされるかあるいはごく僅かなまたはいくつかの配列相違を伴って生殖細胞系遺伝子と実質的に相同である。乏突起膠細胞反応性Ｏ１、Ｏ４、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１ ＩｇＭκモノクローナル抗体の免疫グロブリン（Ｉｇ）ｃＤＮＡを配列決定し、これらを公表されている生殖細胞系配列と比較することにより、これらが天然自己抗体であることが決定された。Ｏ１ ＶＨは、再編成されていないＶＨセグメント転写産物Ａ１およびＡ４と同一であり、Ｏ４ ＶＨは３個、ＨＮＫ−１ ＶＨは６個のＶＨコード領域内のＶＨ１０１とのヌクレオチド相違を有していた。Ｏ１のＤセグメントは生殖細胞系ＳＰ２遺伝子ファミリー、ＪＨ４に由来し、一方Ｏ１ ＪＨは生殖細胞系ＪＨ１によってコードされ、１個の沈黙ヌクレオチド変化を有していた。Ｏ１およびＯ４ 軽鎖は、１個の沈黙ヌクレオチド変化を除いて骨髄腫ＭＯＰＣ２１と同一であった。ＨＮＫ−１ Ｖκは、２個の沈黙ヌクレオチド変化を除いて生殖細胞系Ｖκ４１と同一であった。Ｏ１ Ｊκ、Ｏ４ ＪκおよびＨＮＫ Ｊκは、非突然変異生殖細胞系Ｊκ２によってコードされた。これに対し、Ａ２Ｂ５ＶＨは生殖細胞系Ｖ１と７個のヌクレオチド相違を示し、Ａ２Ｂ５ Ｖκをコードする生殖細胞系配列は特定されなかった。Ｏ１およびＯ４は、直接ＥＬＩＳＡによって多数の抗原に対して多反応性であったが、Ａ２Ｂ５は多反応性ではなかった。それ故、Ｏ１、Ｏ４およびＨＮＫ−１ Ｉｇは生殖細胞系遺伝子によってコードされ、天然自己抗体の遺伝子型および表現型を有する。
【０１１２】
（脱髄疾患の治療）
ここで述べる試験の結果は、多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥおよび他の関連中枢神経系脱髄疾患への実際的な適用を有する。自発的中枢神経系型髄鞘再形成（「陰影斑」）のまれな例が多発性硬化症において認められ、時として末梢神経系（ＰＮＳ）型髄鞘再形成が根入口帯近くの脱髄脊髄斑において認められる。乏突起膠細胞は、多発性硬化症における慢性斑の中心部ではまれであるが、それらが不全型髄鞘再形成に結びつく、斑の末梢部で増殖すると思われる。髄鞘再形成の過程は、多発性硬化症において臨床的に認められる自発的寛解および改善と相関しうる。これらの臨床所見は、多発性硬化症において新しいミエリン形成が可能であることを示している。ＴＭＥＶ誘導性脱髄を有するマウスにおいてｍＡｂを使用することによって刺激された髄鞘再形成は、多発性硬化症における治療適用を有望視させる。
【０１１３】
臨床的に重要な点としては、薄いミエリン鞘の形態学的再生が機能回復に寄与するかどうかという問題である。コンピュータでのシミュレーションは、新たなミエリン形成は、不十分な薄い鞘によるものであっても、インパルスの伝導を改善することを示唆する。正常な有髄線維の軸索膜は高度に分化しているので、跳躍性伝導により伝播するためにはランヴィエ絞輪にナトリウムチャネルが高密度で存在する必要がある。試験的エビデンスは、サキシトキシン結合によって明らかにされたように、新たに形成された節が必要な高いナトリウムチャネル密度を発現することを示唆する。現在までのデータは、不十分な薄い鞘によるものであっても髄鞘再形成は、以前の脱髄軸索における伝導を改善することを示唆する。それ故、この形態学的現象を促進するための手法は、機能回復を生じさせる潜在的可能性を有する。
【０１１４】
ここで示すデータは、初めて、哺乳動物への組換えヒトモノクローナル抗体の投与がインビボで中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激できることを明らかにする。特に、５００ｎｇという低用量のｒＨＩｇＭ２２によるＴＭＥＶ慢性感染マウスの治療は、対照ｍＡｂで治療したマウスに比べて中枢神経系有髄化の総面積の有意な上昇をもたらした。
【０１１５】
ヒト抗体の使用は、治療抗体に対するヒト免疫応答の潜在的可能性を回避する。非ヒト動物に由来する治療抗体は、個人にとって重大且つ有害でありうる免疫応答を生じさせることが示されている。そこで、ポリクローナルヒトＩｇＭおよびポリクローナルヒトＩｇＧをインビボでの脊髄脱髄の２つのモデル：慢性ウイルス感染モデルおよび急性毒性モデルにおいて試験した。両方のモデルにおいて、ヒトＩｇＭを投与した動物は、ポリクローナルヒトＩｇＧで処置した動物よりも有意に高い密度の新たに髄鞘形成された軸索を有していた。ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体のパネルも、中枢神経系に特異的な表面抗原との反応性に基づいて、特定された。これらのヒト抗体は、脱髄疾患を有する哺乳動物に投与したとき、ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体よりも有意に多くの中枢神経系髄鞘再形成を促進する。ヒトモノクローナル抗体は、抗原的に多反応性であり、乏突起膠細胞の表面の抗原決定基およびニューロンの特定個体群を認識する。髄鞘再形成を促進するいくつかのヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域が配列決定されている。特に、これらの抗体は、培養中のグリア細胞（乏突起膠細胞および星状膠細胞）においてカルシウム流入を誘導することができ、グリア細胞を通しての直接結合とシグナル伝達を示唆する。これらのヒト抗体はヒト白質と結合し、ヒトにおける髄鞘再形成を促進する上で有効であると考えられる。治療薬としての使用のための組換えモノクローナル抗体の利点は、１）抗体を、宿主感染を伴わずに増殖させることができる、および２）抗体を、その有効性を変化させるようにインビトロで遺伝的に変更することができる、ことである。
【０１１６】
そこで、ここで述べる試験の結果として、本発明の方法は、脱髄疾患に罹患した、ヒトおよび家畜を含む哺乳動物を治療するため、および中枢神経系軸索の髄鞘再形成および再生を刺激するため、並びに神経保護を与えるために使用することができる。ここで述べるように、モノクローナル抗体またはペプチドフラグメント、ハプテンまたは等価物の有効量を従来の投与経路によって、特に静脈内（ｉｖ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、投与することができる。ここで述べるように、治療組成物およびワクチンが考慮され、それらを調製して、投与しうる。抗体の有効量は、治療する哺乳動物の大きさ、疾患の重症度、投与経路、および治療課程（ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に依存して異なりうる。例えば、投与する抗体の各々の用量は、本発明に従った例示的な非制限的範囲として、約１．２５−約２．５μｇ／ｋｇの範囲をとりうる。抗体の用量はまた、投与経路にも依存する。治療課程は、抗体の投与の頻度（例えば毎日、週に１回、または２週に１回）および治療の期間（例えば４週間から４ヶ月間）を含む。そこで、例えば、より少量のｍＡｂを４ヶ月間投与するのに対し、より高用量のｍＡｂを４−５週間毎日投与することができる。
【０１１７】
投与するモノクローナル抗体の量の有効性は、哺乳動物の全体的外観、哺乳動物の活動および哺乳動物の麻痺の程度を含む、例えばここで実施例において述べるような、多くの臨床判定基準を用いて評価することができる。ヒトにおいて髄鞘再形成を誘導するために必要なモノクローナル抗体の量の有効性も、二重盲検対照試験において評価できる。脱髄疾患からの固定した神経障害を有する患者をモノクローナル抗体または対照物質で治療することができる。定量的生体力学筋肉試験によって検出されるような等尺性筋力の改善が一次治療エンドポイントとして使用できる。
【０１１８】
髄鞘再形成を促進するインビボでの方法に加えて、中枢神経系軸索における髄鞘再形成を刺激する半ビボでの方法も本発明に包含される。例えば、乏突起膠細胞などのグリア細胞の増殖および／または分化を刺激するためにモノクローナル抗体をインビトロで使用しうる。これらの外因性グリア細胞を、次に、公知の手法を用いて哺乳動物の中枢神経系に導入することができる。中枢神経系軸索の髄鞘再形成は、存在する内因性グリア細胞の数を増加させることによって上昇する（乏突起膠細胞などのグリア細胞はミエリンの産生において重要な役割を果たす）。
【０１１９】
グリア細胞を生産するか、または混合培養（例えばラット視神経細胞またはラット脳細胞培養）からグリア細胞の増殖を刺激するインビトロでの方法も本発明に包含される。例えば、グリア細胞を含む、ラット視神経またはラット脳から得た細胞を、細胞の増殖を促進するために十分な条件下で混合培養として培養する。次に、ｒＨＩｇＭ２２またはｓＨＩｇＭ４６またはＳＣＨ９４．０３またはそれらの組み合せなどの、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を促進することができるｍＡｂの有効量を細胞の混合培養に加え、細胞の成長および増殖のために十分な条件下に維持する。ｍＡｂは、ｍＡｂの存在下で培養したグリア細胞の増殖を刺激し、その増殖は、ｍＡｂの不在下で成長したグリア細胞の増殖に比べて高い。
【０１２０】
上述したように、本発明の方法における使用のための抗体は、薬剤、すなわち薬学的組成物として投与でき、好ましくは投与される。そこで、ポリクローナルＩｇＭ抗体の有効量を、生理的緩衝液または食塩水などの、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるまたはそれらで希釈することができる。モノクローナル抗体の有効量を、生理的緩衝液または食塩水などの、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるまたはそれらで希釈することができる。１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体の組み合せの有効量を、同様に適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるかまたはそれらで希釈してもよい。ワクチンを製造する場合は、本発明のモノクローナル抗体または等価活性物質を医薬的に有効で適切なキャリアまたはアジュバントと共に調製し、熟達した医師に既知である免疫のための標準的手法に従って投与のためのプロトコールを実施しうる。
【０１２１】
動物およびヒトへの投与のために本発明の方法において使用される薬学的組成物は、医薬用キャリアまたは賦形剤と組み合わせてポリクローナルＩｇＭ抗体またはモノクローナル抗体を含有する。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、２つ以上の、好ましくは２つの、本発明のモノクローナル自己抗体を含有しうる。そこで、例えばｓＨＩｇＭ２２とｓＨＩｇＭ４６の組み合せの有効量を含有する薬学的組成物がここで考慮される。そのような組成物は、２つ以上のモノクローナル自己抗体の存在が同じ治療組成物または方法における他方の活性を増強しうるという点で有利である。
【０１２２】
薬剤は、本発明の化合物を含有する錠剤（ロゼンジおよび顆粒剤を含む）、糖衣丸、カプセル、丸剤、アンプルまたは坐薬の形態でありうる。
【０１２３】
好都合には、前記組成物は、各々の単位が有効成分の固定用量を供給するように適合されている、投与単位として製剤される。錠剤、被覆錠剤、カプセル、アンプルおよび坐薬は、本発明に従った好ましい投与形態の例である。有効成分が有効量を構成する、すなわち適切な有効用量が単回または複数回の単位投与において使用される用量形態と一致することが唯一必要である。正確な個々の用量並びに一日の用量は、言うまでもなく、医師または獣医の指示の下に標準的医療原則に従って決定される。
【０１２４】
モノクローナル抗体はまた、水性または非水性希釈剤中の活性化合物の懸濁液、溶液および乳剤、シロップ、顆粒または粉末としても投与できる。
【０１２５】
錠剤、糖衣丸、カプセルおよび丸剤を形成するように適合された活性化合物を含有する薬学的組成物（例えば顆粒）において使用できる希釈剤は、以下を含む：（ａ）充填剤および増量剤、例えばデンプン、糖類、マンニトールおよびケイ酸；（ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン；（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム；（ｅ）溶解を遅延させるための物質、例えばパラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（ｇ）界面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；（ｈ）吸着性キャリア、例えばカオリンおよびベントナイト；（ｉ）潤滑剤、例えば滑石、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムおよび固体ポリエチレングリコール。
【０１２６】
活性化合物を含有する錠剤、糖衣丸、カプセルおよび丸剤は、乳白剤を含みうる、慣例的な剤皮、エンベロープおよび保護基質を有しうる。それらは、おそらく一定期間にわたって、有効成分だけを放出するか、または好ましくは腸管の特定部分において有効成分を放出するように構成されうる。剤皮、エンベロープおよび保護基質は、例えばポリマー物質またはろうから作製されうる。
【０１２７】
坐薬を形成するように適合された薬学的組成物において使用される希釈剤は、例えばポリエチレングリコールおよび脂肪（例えばココア油および高エステル［例えばＣ１６−脂肪酸を有するＣ１４−アルコール］）などの通常の水溶性希釈剤またはこれらの希釈剤の混合物でありうる。
【０１２８】
溶液および乳剤である薬学的組成物は、例えば、溶媒、溶解補助剤および乳化剤などの慣例的な希釈剤（言うまでもなく、界面活性剤が存在する場合を除いて、２００未満の分子量を有する前述の溶媒は例外とする）を含みうる。そのような希釈剤の特定の非制限的例は、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば落花生油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビトールの脂肪酸エステルまたはそれらの混合物である。
【０１２９】
非経口投与に関しては、溶液および懸濁液は、アンプルに収められた無菌の、例えば水または落花生油、であるべきであり、そして適切な場合は、血液等張性であるべきである。
【０１３０】
懸濁液である薬学的組成物は、液体希釈剤、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、界面活性剤（例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル）、微血漿セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはそれらの混合物などの通常の希釈剤を含有しうる。
【０１３１】
薬学的組成物はまた、着色料および防腐剤、並びに香料および香味添加物（例えばペパーミント油およびユーカリ油）、および甘味料（例えばサッカリンおよびアスパルテーム）を含有しうる。
【０１３２】
薬学的組成物は一般に、総組成物の重量の０．５−９０％の有効成分を含む。
【０１３３】
モノクローナル抗体に加えて、薬学的組成物および薬剤はまた、他の医薬活性化合物、例えばステロイド、抗炎症薬等を含有することができる。
【０１３４】
本発明の薬剤中の希釈剤は、薬学的組成物に関して前述したもののいずれであってもよい。そのような薬剤は、単独希釈剤として分子量２００未満の溶媒を含みうる。
【０１３５】
ポリクローナルＩｇＭ抗体およびモノクローナル抗体は、経口的、非経口的（例えば筋肉内、腹腔内、皮下、経皮または静脈内経路）、直腸経路または局所的に投与され、好ましくは経口的または非経口的に、特に舌下または静脈内経路で投与される。
【０１３６】
投与経路は、治療するヒトまたは動物の性質および体重、治療に対する前記被験者の個々の反応、有効成分が投与される製剤のタイプ、投与を実施する様式、および疾患の進行の段階または投与の間隔の関数である。そこで、一部の場合には、最小用量割合より少用量未満を使用すれば十分であり、また別の場合には、所望の結果を達成するには上限を超えなければならないこともある。より多くの量を投与する場合は、これらを１日の間に数回の個別投与に分けることが勧められる。
【０１３７】
本発明によれば、本発明の治療組成物の１つまたはそれ以上の成分を、非経口的に、髄腔内に、経粘膜的に、例えば経口的、経鼻的、肺経路で、または直腸経路で、または経皮的に、導入しうる。好ましくは、投与は非経口的であり、例えば静脈内注射によって実施され、また動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内投与も含むが、これらに限定されない。経口または肺送達は粘膜免疫を活性化するために好ましいと考えられる；治療下の症状についての起因菌は鼻咽頭および肺粘膜にコロニー形成するので、粘膜投与は治療として特に有効でありうる。本発明の治療組成物に関して使用するとき「単位用量」という用語は、各々の単位が、必要な希釈剤、すなわちキャリアまたは賦形剤と共同して所望の治療効果を生じるように算定された所定の量の活性物質を含有する、ヒトのための単位別投薬として適する物理的に別個の単位を指す。
【０１３８】
別の実施形態では、活性化合物を小胞中で、特にリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒより，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎとＦｉｄｌｅｒ（編集）、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同上、ｐ．３１７−３２７参照；一般に同上参照）。
【０１３９】
さらに別の実施形態では、治療組成物を制御放出システム中で送達することができる。例えばポリペプチドは、静脈内持続注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与しうる。１つの実施形態では、ポンプを使用しうる（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅ（編集）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒとＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；またＬｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出システムを治療標的、すなわち脳の近くに設置することができ、それ故全身用量の分画だけしか必要としない（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅより、前出、ｖｏｌ．２，ｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。好ましくは、制御放出装置を被験者の不適切な免疫活性化の部位または腫瘍の付近に導入する。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））の中で論じられている。
【０１４０】
上述した活性成分の投与が、一部の場合には細菌感染を含む、中枢神経系に関連する症状または疾患のための有効な治療レジメンの被験者は、好ましくはヒトであるが、いかなる動物でもありうる。そこで、当業者には容易に認識できるように、本発明の方法および薬学的組成物は、ネコまたはイヌ被験者などのペット動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタ被験者などの、但しこれらに限定されることなく家畜、野生動物（野生で存在するかまたは動物園内にいるかに関わらず）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等のような、すなわち獣医学的用途のための、研究動物を含むが、いかなる意味においてもこれらに限定されない、何らかの動物、特に哺乳動物への投与に特に適する。
【０１４１】
本発明の治療方法および組成物において、活性成分の治療有効用量が提供される。治療有効用量は、患者の特徴（年齢、体重、生物、症状、合併症、他の疾患等）に基づいて医療従事者によって決定されうるが、また当技術分野においても周知である。さらに、さらなる常用試験を実施するほど、様々な患者における様々な症状の治療のための適切な用量レベルに関するより詳細な情報が得られ、当業者は、受容者の治療背景、年齢および全身状態を考慮して、適切な用量を確認することができる。一般に、静脈注射または持続注入については、用量は腹腔内、筋肉内または他の投与経路に関する用量よりも低くてよい。投与スケジュールは、循環半減期および使用する製剤によって異なりうる。組成物は、治療有効量の投与剤型と適合させて投与される。投与する必要のある有効成分の正確な量は医師の判断に依存し、各々の個人に特有である。初期投与およびブースター投与のための適切なレジメンも変化しうるが、初期投与とそれに続く１つまたはそれ以上の時間間隔でのその後の注射または他の投与法による反復投与が典型的である。あるいは、１０ナノモルから１０マイクロモルの血液中濃度を維持するのに十分な持続静脈内注入が考慮される。
【０１４２】
（他の化合物との投与）
脱髄症状、例えば多発性硬化症の治療のために、本発明の活性成分を、（１）ステロイドなどの抗炎症薬；（２）ベタセロン；（３）コパキソン；または（４）ポリクローナルＩｇＭ；または（５）メチルプレドニゾロン、を含むがこれらに限定されない、多発性硬化症を治療するために使用される１つまたはそれ以上の薬学的組成物と共に投与しうる。投与は、同時（例えば本発明の活性成分と抗生物質の混合物の投与）、或いは順次行うことが可能である。
【０１４３】
従って、特定の実施形態では、治療組成物は、有効量の活性成分および１つまたはそれ以上の以下の有効成分；抗生物質、ステロイド等、をさらに含みうる。
【０１４４】
本発明の神経調節物質または抗炎症薬に関連しうる作用物質の肺送達もここで考慮される。肺送達のためのタンパク質の製剤についての報告が当技術分野において認められる［Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（補遺５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐ．２０６−２１２（１９８９）（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（１９８９）（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ，３月（１９９０）（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；Ｐｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）］。薬剤の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらへの１９９５年９月１９日発行の米国特許第５，４５１，５６９号に述べられている。
【０１４５】
そのような装置はすべて、接着阻害剤（または誘導体）の配薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各々の製剤は用いる装置のタイプに特異的であり、治療において有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアに加えて、適切な推進薬の使用を含みうる。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、封入複合体、または他の種類のキャリアの使用も考慮される。化学修飾された接着阻害剤も、化学修飾のタイプまたは使用する装置のタイプに依存して種々の製剤中で調製されうる。
【０１４６】
ジェットまたは超音波噴霧器による使用に適する製剤は、典型的には、溶液１ｍｌにつき生物活性物質約０．１−２５ｍｇの濃度で水に溶解した神経調節物質（または誘導体）を含有しうる。製剤はまた、緩衝液と単純な糖（例えば神経調節物質の安定化および浸透圧の調節のため）を含みうる。ネブライザ製剤はまた、エアロゾルを形成するときに溶液の噴霧化によって引き起こされる神経調節物質の表面誘導性凝集を低減するか、または予防するために、界面活性剤も含有しうる。
【０１４７】
定量噴霧式吸入器による使用のための製剤は、一般に、界面活性剤の助けによって推進薬に懸濁された神経調節物質（または誘導体）を含有する微細に分割された粉末を含む。推進薬は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合せなどの、この目的のために使用される従来のいかなる物質でもよい。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタンおよびダイズレシチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用でありうる。
【０１４８】
液体エアロゾル製剤は、生理的に許容される希釈剤中に神経調節物質および分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細分割固体形態の神経調節物質と分散剤からなる。液体または乾燥粉末エアロゾル製剤に関しては、製剤がエアロゾル投与されねばならない。すなわち、エアロゾル化された用量が実際に鼻通路または肺の粘膜に到達することを確実にするために液体または固体粒子に分解されねばならない。「エアロゾル粒子」という用語は、ここでは鼻または肺投与に適する、すなわち粘膜に達する液体または固体粒子を表わすために使用される。送達装置の構築、製剤中の付加的な成分および粒子特徴などの他の配慮も重要である。薬剤の肺投与のこれらの態様は当技術分野において周知であり、製剤の操作、エアロゾル化手段および送達装置の構築は、多くとも当技術分野の通常技術のいずれかによる常套的な試験しか必要としない。特定実施形態では、薬剤粒子が肺胞に到達することを確実にするため、動力学的粒径は５マイクロメーターまたはそれ以下である［Ｗｅａｒｌｅｙ，Ｌ．Ｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８：３３３（１９９１）］。
【０１４９】
本発明の神経調節物質はまた、ここで列挙する自己抗体、ペプチド類似体またはハプテンまたはおそらくそれらの組み合せを活性物質として含有しうる、ワクチンの形態での投与用に調製しうる。そこで、ワクチンの調製は公知の手順に従って実施でき、一価並びに多価ワクチンが考慮される。また、本発明のＤＮＡ分子に基づく、ＤＮＡサブユニットワクチンも調製しうる。すべてのワクチンは医師または臨床家の標準的な慣例に従って投与することができ、そのようなパラメータは本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１５０】
例えば本発明に従ったＤＮＡに基づくワクチンを含有するベクターを、当技術分野で公知の方法によって、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンまたはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主に導入することができる（例えばＷｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕとＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照）。
【０１５１】
ワクチンは、筋肉内、腹腔内、静脈内等を含むが、これらに限定されない、何らかの非経口経路によって投与できる。好ましくは、ワクチン接種の所望の結果は抗原への免疫応答、およびそれによって病原生物への免疫応答を明らかにすることであるので、リンパ組織、例えばリンパ節または脾臓への、直接投与あるいはターゲティングまたはウイルスベクターの選択による間接的な投与が望ましい。免疫細胞は絶えず複製しているので、レトロウイルスは複製細胞を必要とするため、それらはレトロウイルスベクターに基づく核酸ワクチンの理想的な標的である。
【０１５２】
抗血清、ポリクローナル抗体または中和モノクローナル抗体を患者に投与することによって、自己免疫介在性脱髄疾患、例えば多発性硬化症に罹患していることが疑われる動物被験者に受動免疫を与えることができる。好ましくは、受動免疫療法のために投与される抗体は自家抗体である。例えば被験者がヒトである場合、好ましくは、抗体に対する免疫応答の可能性を最小限に抑えるために、抗体はヒト起源であるかまたは「ヒト化」されている。本発明の能動または受動ワクチン、またはアドヘシンの投与は、グラム陰性菌、好ましくは連鎖球菌、より好ましくは肺炎球菌の感染から動物被験者を保護するために使用できる。
【０１５３】
さらに、本発明は、適切な神経調節物質を、治療のために細胞を標的する、対応する物質の発現を生じさせるまたは上昇させるために対応して導入する、遺伝子療法による治療を考慮する。それ故、１つの実施形態では、神経調節物質、自己抗体、抗体ペプチド等をコードするＤＮＡまたは遺伝子、あるいはそのタンパク質またはポリペプチドドメインフラグメントを、ウイルスベクターを用いてまたはＤＮＡの直接導入を通してインビボ、半ビボまたはインビトロで導入する。標的組織における発現は、ウイルスベクターまたは受容体リガンドなどでトランスジェニックベクターを特定細胞に標的することによって、または組織特異的プロモーターを使用することによって、またはその両方によって実現することができる。
【０１５４】
インビボまたは半ビボでのターゲティングおよび治療処置のために一般的に使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用するための方法は当技術分野において公知である［例えばＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９９２）参照］。
【０１５５】
ＤＮＡウイルスベクターは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等を含むがこれらに限定されない、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを包含する。完全にまたはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後は感染性ではない。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染することがあるという懸念を伴わずに、特定の局在領域内の細胞への投与を可能にする。それ故、脂肪組織を特異的に標的することができる。特定ベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクター［Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０（１９９１）］、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター［特許公開第ＲＤ３７１００５ Ａ号］、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター［１９９４年９月２９日公開の国際公開広報第ＷＯ９４／２１８０７号；１９９４年４月２日公開の国際公開広報第ＷＯ９２／０５２６３号］；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０（１９９２）；Ｌａ Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）も参照のこと］によって述べられたベクターのような弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター［Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．：３９８８−３９９６（１９８８）］を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
好ましくは、インビボ投与に関しては、ウイルスベクターおよびトランスフェクト細胞の免疫非活性化を回避するため、適切な免疫抑制治療をウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと共に使用する。例えば、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を阻止するためにインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制サイトカインを投与することができる［例えばＷｉｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）］。加えて、最小数の抗原を発現するように構築されたウイルスベクター使用することが好都合である。
【０１５７】
別の実施形態では、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる、１９９５年３月１６日公開の国際公開広報第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に述べられているように、ＤＮＡまたは遺伝子をレトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するようにまたは単回のトランスフェクションを受けるように構築することができる。前者の場合は、ウイルスを、腫瘍形成形質転換特性の原因となるものを除き、その遺伝子のすべてを保持し、異種遺伝子を発現するように修飾する。ウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、異種遺伝子とパッケージングシグナルを含むように構築された共導入ウイルスをパッケージングするために必要な構造遺伝子は保持する、非感染性ウイルスベクターを作製する。それ故、生産されるウイルス粒子はさらなるウイルスを生産することができない。
【０１５８】
標的遺伝子の送達は、１９９５年１０月公開の国際公開広報第ＷＯ９５／２８４９４号に述べられている。
【０１５９】
あるいは、リポフェクションによってインビボでベクターを導入することができる。この１０年間、インビトロでの核酸の被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用は上昇し続けてきた。リポソームを介したトランスフェクションに関して遭遇する困難と危険性を制限するように設計された合成カチオン脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを作製するために使用できる［Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１（１９８８）；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８（１９９３）参照］。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の被包を促進することができ、また負に荷電した細胞膜との融合も促進しうる［ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８（１９８９）］。外来性遺伝子をインビボで特定器官に導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実際的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子ターゲティングは１つの利点を示している。トランスフェクションを特定細胞型に差し向けることは、膵臓、肝臓、腎臓および脳などの細胞異質性を有する組織において特に好都合であることは明らかである。脂質は、ターゲティングのために他の分子に化学結合しうる［Ｍａｃｋｅｙら、前出参照］。標的ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学結合することができる。
【０１６０】
ベクターをインビボで裸のＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法によって、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞に導入することができる［例えばＷｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕとＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０（１９９１）参照］。受容体を介在したＤＮＡ送達アプローチも使用できる［Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；ＷｕとＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）］。
【０１６１】
本発明の好ましい実施形態では、上述したような遺伝子治療ベクターは、例えば本発明の自己抗体によって認識されるＤＮＡコンセンサス配列を含む転写調節配列、すなわちベクター内に挿入された治療的異種遺伝子に作動可能に連結された、抗体結合部位を使用する。すなわち、本発明の特異的発現ベクターは遺伝子治療において使用することができる。
【０１６２】
本発明は、材料、化合物および組成物の調製および本発明を例示する方法の開発と実施を説明する、以下の非制限的実施例を考察することによってよりよく理解される。この開示の目的および意図から逸脱することなく、材料および方法の両方について多くの変更を実施しうることは当業者には明白である。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に説明するために提示するものであり、また本発明の実施のために既知の最良の方式を提示するという出願人の義務を履行する役割を果たし、いかなる意味においても本発明を広範囲に制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１：組換えｓＨＩｇＭ２２を使用した用量設定試験（試験Ｎｏ．１））
（マウス）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た４−６週齢の雌性ＳＪＬ／Ｊマウスに、１０μｌ中２×１０５プラーク形成単位のダニエル株ＴＭＥＶを大脳内注射した。感染動物に、ＴＭＥＶ感染後６ヶ月目に種々の濃度のｒＨＩｇＭ２２またはＰＢＳの単回５００μｌ腹腔内（ＩＰ）注射を実施した。１つの群には、５週間後に追加の５００μｇ用量のｒＨＩｇＭ２２を投与した。２つの群のマウスには、毎週１回メチルプレドニゾロン２ｍｇを投与した。各々の群について１０匹のマウスを使用した。治療の５または１０週間後に、脊髄における髄鞘再形成の定量的分析のために動物を供犠した。
【０１６４】
最小有効用量を決定するため、ＴＭＥＶに慢性感染したマウスにおいてＲｓＨＩｇＭ２２の用量設定試験を実施した。治療の５週間後、脊髄を切除し、脱髄および髄鞘再形成に関して等級づけた。結果を図１に直接示し、同用量を摂取した被験者に関して分類したスコアの平均値の比較を図２に示す。
【０１６５】
結果の検討から、０．２５ｍｇ／ｋｇまでのＲｓＨＩｇＭ２２のすべての用量において、食塩水対照群よりも有意に大きな面積の髄鞘再形成が生じていた（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。これは、本発明の抗体が妥当な用量で治療上適切な作用を提供する能力を明らかにする。
【０１６６】
加えて、ＲｓＨＩｇＭ２２および週に２ｍｇのメチルプレドニゾロンを投与動物は、より低レベルの脱髄（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）並びに高レベルの髄鞘再形成を示した。ステロイドは、髄鞘再形成性ヒトｍＡｂの潜在的受容者である、急性の増悪を生じた多くの患者のための一次治療方法であるので、これは重要である。さらに、これらの結果は、メチルプレドニゾロンなどのステロイドと本発明の抗体を含有する組成物の製造および投与、あるいは別々であるが結合したまたは連続的な投与のための、ステロイドと抗体を含有する組成物の製剤および投与に関する本発明の態様が、ここで示した有益な結果を生じうることを示唆する。
【０１６７】
これらの結果は、ＲｓＨＩｇＭ２２が古典的増殖因子に必要な範囲内の濃度で作用しうることを明らかにする。
【０１６８】
（実施例２： より低用量のｒＨＩｇＭ２２単独またはメチルプレドニゾロンとｒＨＩｇＭ２２との併用による有効性の試験（試験Ｎｏ．２））
（材料および方法）
（マウス）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た４−６週齢の雌性ＳＪＬ／Ｊマウスに、１０μｌ中２×１０５プラーク形成単位のダニエル株ＴＭＥＶを大脳内注射した。感染動物に、ＴＭＥＶ感染後６ヶ月目に種々の濃度でのｒＨＩｇＭ２２またはＰＢＳを単回５００μｌで腹腔内（ＩＰ）注射を実施した。１つの群には、５週間後に追加の５００μｇ用量のｒＨＩｇＭ２２を投与した。２つの群のマウスには、毎週２回メチルプレドニゾロン１ｍｇを投与した。各々の群において１０匹のマウスを使用した。治療の５または１０週間後に、脊髄における髄鞘再形成の定量的分析のために動物を供犠した。
【０１６９】
（抗体の単離および配列決定）
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する患者の血清からＩｇＭ抗体を単離し（ｓＨＩｇＭ２２と称する）、記述されているように配列決定した（Ｃｉｒｉｃ，Ｂ．ら（２０００）、Ｂｌｏｏｄ ９７：３２１−３２３）。
【０１７０】
（ｒＨＩｇＭ２２のクローニングおよび試験）
（ベクターの構築）
（１）軽鎖フラグメント）
軽鎖の可変領域（ＶＬ）を、ｓＨＩｇＭ２２のソースである患者の末梢血白血球から単離した抗体ｍＲＮＡに由来するＴＡクローン化ＶＬフラグメントから増幅した。ヒトゲノムデータベース中のヒトＩｇＭ配列からの５’（−Ｎｈｅ Ｉ部位、５’−ＵＴＲおよび人工リーダー配列（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：８４０７−８４１４）をこの配列に付加した。λ鎖（Ｃλ）の定常領域を、ヒトＣλにおいて認められる付加的な３’−Ａｖｒ ＩＩ部位を有するヒト血液ｃＤＮＡから増幅した。すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｓＨＩｇＭ２２において認められる１つの特定された形態の主要ＩｇＭ種（軽鎖：ＩＩと称する）（Ｃｉｒｉｃ，Ｂ．ら（２０００）、Ｂｌｏｏｄ ９７：３２１−３２３）のために設計された以下のプライマーを使用することにより、標準的な方法によって実施した：
【０１７１】
【化１】
（２）重鎖フラグメント）
ヒトＩｇＭゲノム配列を、ＶＨの両端に２つの固有な部位（５’：Ｒｓｒ ＩＩ、３’：ＰａｃＩ）を付加することによって単離し、クローン化した。ＶＨを、以下のプライマー：
【０１７２】
【化２】
を使用することにより、付加的な人工５’−ＵＴＲおよびヒトゲノムデータベース（１１）からのリーダー配列を有するＴＡクローン化ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨ領域から増幅した。ヒトＩｇＭのＶＨをｓＨＩｇＭ１１のこの増幅ＶＨフラグメントによって置換した。
【０１７３】
（３）デヒドロキシ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）フラグメント）
ｄｈｆｒフラグメントを、ベクターｐＦＲ２０００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．ら（１９８３）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８０：２４９５−２４９９）から標準的なＰＣＲ反応によって増幅し、ｐＣＩＣλに連結した。ｐＣＩＣλのＥａｇＩ消化によってｄｈｆｒと結合したＨＩｇＭ２２ＩＩ 軽鎖を作製し、このフラグメントをｓＨＩｇＭ２２ ＶＨベクター（ｐＤＭ ２２ＢＩＩ）内のＥａｇ Ｉ部位に連結した。このｐＤＭ ２２ＢＩＩベクターの遺伝子順序は、１）重鎖（ゲノム）、２）軽鎖（ｃＤＮＡ）および３）ｄｈｆｒであった。重鎖および軽鎖遺伝子は同じ方向であったが、ｄｈｆｒの方向は反対向きであった。
【０１７４】
（電気穿孔法、メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅、ＥＬＩＳＡおよびＩｇＭ精製）
ｐＤＭ ２２ＢＩＩを電気穿孔法によって２×１０７のＦ３Ｂ６細胞にトランスフェクトした；Ｂｇｌ ＩＩによって線状化したｐＤＭ ２２ＢＩＩ １０ｇを２×１０７のＦ３Ｂ６細胞と混合し、氷上で１０分間、氷冷無血清ＲＰＭＩ ８００ｌに再懸濁して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて９６０Ｆ／２００Ｖで１回パルスし、３０分間氷上にもどして、２５ｃｍ２フラスコに移し、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ ５ｍｌを供給して、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、培地を、ＭＴＸ ０．２μＭを含む新鮮培地に交換し、生存コロニーが出現するまでインキュベーションを続けた。これらのコロニーを２４穴プレートに移し、１Ｍ ＭＴＸ中で培養した。以下で述べるような集密増殖後、これらのクローンに関してＥＬＩＳＡを実施し、さらなる操作のために陽性クローンを選択した。ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＴＭプレートを２０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）で被覆した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によるブロッキング工程後、ｓＨＩｇＭ２２ＢＩＩを発現するＦ３Ｂ６細胞からの上清を１：５００、１：１０００および１：２０００希釈で３回プレートした。精製ヒトＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を標準対照として使用した。インキュベーションおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／１％ツイーン２０による洗浄の後、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）に複合したモノクローナル抗ヒトＩｇＭを１％ＢＳＡ中１：５０００希釈で適用した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を使用して陽性反応を検出し、Ｂｉｏ−Ｒａｄマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍで吸光度を読み取った。ＭＴＸ濃度を、０．２μＭから出発して２ヶ月間にわたって幾何学的に上昇させ、２００ｉＭで終了した。最大抗体産生クローンをＥＬＩＳＡによって判定し、このクローンの培地を収集した。組換えｓＨＩｇＭ２２ＢＩＩのＩｇＭ抗体を、ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）沈殿およびＨ２Ｏに対する透析、それに続くＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムでのサイズ分画の方法によってこの培地から単離した。
【０１７５】
（脱髄／髄鞘再形成に関する脊髄の評価）
脊髄の脱髄および髄鞘再形成の領域を、４％パラ−フェニレンジアミン染色プラスチック包埋横断切片を使用して視覚化した。脊髄全体の代表的試料を得るために、３連続１ｍｍブロックごとに１μｍの薄い切片を切り出した。これにより、頸部、胸郭、腰部および仙椎脊髄からの試料を代表する１０−１２の横断切片を生成した。等級付けるために、各々の脊髄切片を視覚的に４つの四分円に分け、その後各々の四分円を脱髄または髄鞘再形成病変の存在または不在に関して採点した。すべてのスライドガラスをコード化し、ブラインドで読み取った。すべてのスライドガラスを等級付けた後、データを投与群にまとめた。病変全体が基本的に修復されているとき、その病変は髄鞘再形成されていると判定した。部分的に髄鞘再形成された病変は陰性と採点した。髄鞘再形成のレベルを以下のように算定した：（髄鞘再形成を有する四分円の数／脱髄四分円の総数）×１００。分類したデータを、カイ二乗統計分析を用いて評価した。
【０１７６】
（免疫組織化学）
成体ＳＪＬマウス小脳の切片を先述のように調製した（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．ら（１９９２）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．３３：３３８−３５３）。簡単に述べると、新鮮小脳を３％低融解温度アガロースに包埋し、Ｎｏ．２ Ｗｈａｔｍａｎフィルターにのせて、３００μｍの矢状断切片に切断した。次に切片を４８穴組織培養プレートに移した。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝Ｅａｒｌｅ（登録商標）平衡塩類溶液（Ｅ／Ｈ、ｐＨ７．４）中で５％ＢＳＡと共に２−３時間インキュベートした後、Ｅ／Ｈ中で、静かに揺り動かしながら４℃で少なくとも３時間、１％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌの一次抗体で標識した。Ｅ／Ｈで洗浄した後、切片を適切な二次抗体で染色し、洗浄して、その後手早くＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。スライドガラスを、２．５％１，４−ジアゾビシクロ−［２．２．２］−オクタン（ＤＡＢＣＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＭＯＷＩＯＬ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に封入し、エピ蛍光顕微鏡で観察した。混合一次グリア細胞および精製乏突起膠細胞を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット新生児から先に記述されているように（Ａｓａｋｕｒａ，Ｋ．ら（１９９７）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６８：２２８１−２２９０）調製した。細胞をポリ−Ｄ−リシン被覆またはポリ−Ｌ−オルニチンカバーガラスにプレートした。３％正常ヤギ血清を含むＥ／Ｈでブロッキングした後、非固定細胞に対して生細胞表面染色を４℃で１５分間実施した。結合一次抗体（Ａｂ）を蛍光複合二次Ａｂで検出した。スライドガラスを封入し、上述したように観察した。
【０１７７】
（ｒＨＩｇＭ２２の精製）
ｒＨＩｇＭ２２でトランスフェクトしたＦ３Ｂ６細胞を、ローラーボトルにおいて１０μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を添加したＲＰＭＩ／１０％熱不活性化ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中で増殖させた。十字流ろ過（ＴＦＦ）によって順化培地を０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質に濃縮した。濃縮順化培地をｄＨ２Ｏに対して一晩透析し、ＩｇＭ抗体を沈殿させた。ペレットを５０ｍＭトリス（トリズマ塩基）、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖベタイン中に再懸濁した。再懸濁したペレットをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（２６／６０）カラムに負荷し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ベタインで溶出した。溶出プロフィールは、およそ２つの主要ピーク：ＨＭＷ（約８０％）およびＬＭＷ（約２０％）から成った。ＨＭＷピークにおいて五量体ＩｇＭを認めた。プールＧＦ分画を〜０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し（Ａ２８０）、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（最終製剤緩衝液）に対して透析した。
【０１７８】
（結果）
この試験では、単一有効成分またはメチルプレドニゾロンなどのステロイドとの組み合せとして抗体濃度のより大きな低下で有効用量が達成できるかどうかを判定するためにさらなる試験を実施した。その結果は、用量のさらに大きな低下および結果として生じる利益が可能であることを確認する（図３および４）。ｒＨＩｇＭ２２は、メチルプレドニゾロンと組み合わせたとき６００μｇの用量で脱髄を予防するのに有効である（図３）。さらにｒＨＩｇＭ２２は、単独で使用したとき５００ｎｇという低用量で髄鞘再形成において有意に有効であり（図４）、またメチルプレドニゾロンと組み合わせて６００μｇの用量で投与したときさらに一層大きな髄鞘再形成能力を示した。
【０１７９】
前記の説明から、当業者には本発明の組成物および方法における様々な修正および変更が生じることになる。付属の特許請求の範囲内に属するそのような修正はすべて、その中に包含されることが意図されている。
【０１８０】
本明細書の中で引用する、特許および特許出願を含むがこれらに限定されないすべての公表文献は、個々の公表文献が、各々その全部が記述されているかのように参照としてここに組み込まれることが特定しておよび個別に指示されているかのごとくに、参照としてここに組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、様々な濃度のｒＨＩｇＭ２２、プラセボ、メチルプレドニゾロン単独およびｒＨＩｇＭ２２との組み合せに関する、比較用量設定試験の結果のグラフである。
【図２】図２は、用量設定試験における被験者群の平均スコアのグラフである。
【図３】図３は、メチルプレドニゾロンと組み合わせたｒＨＩｇＭ２２が髄鞘再形成を促進し、損傷負荷を軽減することを示すグラフである。
【図４】図４は、様々な濃度のｒＨＩｇＭ２２に関する比較用量設定試験の結果のグラフである。
【図５】図５は、ｓＨＩｇＭ２２の重鎖の可変領域配列を示す。配列は、出版物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｖｏｌ Ｉ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎの中のヒトＶＨ配列の番号付けシステムに従って整列している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨは、ＶＨサブグループＩＩＩの成員である。下線を付したアミノ酸はタンパク質配列決定によって確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ２２ヌクレオチド配列に対応する。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＡおよびＢ配列は、ＩＧＨＶ３−３０／３−３０−０５＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２およびＩＧＨＤ２−２１＊０２生殖細胞系配列とは異なるヌクレオチドに関してのみ示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＢのタンパク質配列における２個のアミノ酸置換を太字で示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＡおよびＢの両方の配列が、ＩＧＨＶ３−３０／３−３０−０５＊０１生殖細胞系配列と最も密接にマッチした（９６％の相同性）。生殖細胞系配列についての参考文献：ＩＭＧＴ、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４］。（創始者およびコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【図６】図６は、ｓＨＩｇＭ２２の軽鎖の可変領域配列を示す。配列は、出版物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｖｏｌ Ｉ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎの中のヒトＶＨ配列の番号付けシステムに従って整列している。Ｖλ ｓＨＩｇＭ２２は、λサブグループＩの成員である。下線を付したアミノ酸はタンパク質配列決定によって確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ２２ヌクレオチド配列に対応する。ｓＨＩｇＭ２２ ＶλタイプＩおよびＩＩ配列は、ＩＧＬＶ１−５１＊０１およびＩＧＬＪ３＊０１生殖細胞系配列とは異なるヌクレオチドに関してのみ示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶλタイプＩＩのタンパク質配列における２個のアミノ酸置換を太字で示している。ｓＨＩｇＭ２２からのＶλ配列は、ＩＧＬＶ−５１＊０１生殖細胞系配列と最も密接にマッチした（９７％の相同性）。２個の遺伝子は、１個のヌクレオチド変化によってそれらの共通祖先と異なる。生殖細胞系配列についての参考文献：ＩＭＧＴ、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４］。（創始者およびコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に神経生物学の分野、特に中枢神経系の機能および治療において役割を果たす、組換え生産される抗体の特定に関する。本発明はまた、例として、薬学的組成物、神経障害に関連する疾患の治療の方法、神経機能損傷における再生および修復の方法、スクリーニングアッセイおよびワクチンを含む、治療物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は、通常は初期軸索損傷を伴わない、原発性脱髄によって病理学的に特徴付けられる慢性の、しばしば進行性の、炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。多発性硬化症の病因および病原は不明である。多発性硬化症のいくつかの免疫学的特徴、およびある種の主要組織適合遺伝子複合体対立遺伝子との中程度の結びつきは、多発性硬化症が免疫介在性疾患であるという推測を喚起した。
【０００３】
自己免疫仮説は、試験的自己免疫性（アレルギー性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによって裏付けられ、そのモデルでは、遺伝的に感受性がある動物へのある種のミエリン成分の注入はＴ細胞介在性中枢神経系脱髄を導く。しかし、特異性自己抗原および病原性ミエリン反応性Ｔ細胞は、多発性硬化症患者の中枢神経系において明確には特定されておらず、また多発性硬化症は他の自己免疫疾患には関連しない。疫学的データに基づく代替的仮説は、環境因子、おそらく特定されていないウイルスが中枢神経系における炎症応答を促進し、それが、潜在的には誘導自己免疫成分を伴って、直接または間接的な（「バイスタンダー（傍観者的）」ミエリン破壊を導くというものである。この仮説は、ヒトおよび動物の両方において、いくつかの自然発生的なウイルス感染が脱髄を引き起こしうるというエビデンスによって裏付けられる。１つの一般的に使用される試験用ウイルスモデルは、タイレルネズミ脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）によって誘導される（Ｄａｌ Ｃａｎｔｏ，Ｍ．Ｃ．，およびＬｉｐｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，８８：４９７−５００（１９７７））。
【０００４】
多発性硬化症および他の脱髄疾患についての現在の治療法の限られた効果は、これらの疾患を改善するための新規療法への関心を刺激していた。しかし、潜在的に環境と自己免疫因子の両方を含む、これらの疾患の見かけ上複雑な病因病原論の故に、これらの脱髄疾患の有効な治療への必要性が現在も存在する。
【０００５】
ｒＨＩｇＭ２２は、げっ歯動物およびヒトの両方の成熟乏突起膠細胞およびミエリンに結合し、脱髄のインビボモデルにおいて新しいミエリンの合成を促進する組換えヒトＩｇＭ抗体である。これまでの試験における髄鞘再形成促進性ｍＡｂの標準的な用量は、ＩＰ投与で２５ｍｇ／ｋｇであった。この用量は、ヒトに当てはめて推定すると、非実用的である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、中枢神経系疾患、特に脱髄および／または再髄鞘形成を含むものについての実際的で安全且つ有効な治療レジメンを開発することの必要性が存在し、本発明が指向するのはその必要性に応えることである。
【０００７】
ここでの参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として入手可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明によれば、中枢神経系におけるニューロンの促進、刺激、再生および／または髄鞘再形成、および／または中枢神経系における脱髄の阻止または低減において活性を示すヒト抗体がクローン化され、単離された。特に、本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、組換え自己抗体、特に組換えヒト自己抗体を使用して、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索の髄鞘再形成を刺激する方法に関する。
【０００９】
本発明の第一態様では、前記抗体は、ｒＨＩｇＭ２２と称されるもののようなヒト抗体であり、組成物は、中枢神経系における髄鞘再形成を促進するために有効な量でそのような抗体を含む。前記抗体および対応する組成物は、体重ｋｇ当りで計算して約５００ｎｇ−約６００μｇの範囲の用量を送達するように作製される。
【００１０】
特定実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体を薬学的に受容可能な組成物中で単独投与する。別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体をメチルプレドニゾロンと組み合わせて投与する。メチルプレドニゾロンは、約１−２ｍｇの範囲の用量で週に１回または２回投与しうる。
【００１１】
別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体とメチルプレドニゾロンの投与は同時であるかまたは連続的でありうる。
【００１２】
本発明の第二の態様は、治療有効量のｒＨＩｇＭ２２抗体と薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供する。１つの実施形態では、前記組成物は治療有効量のｒＨＩｇＭ２２抗体だけを含有する。別の実施形態では、前記組成物は、治療有効量のメチルプレドニゾロンと組み合わせた治療有効量のｒＨＩｇＭ２２を含有する。さらに別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の組成物を１つの組成物として製剤し、およびメチルプレドニゾロンを別個の組成物として製剤して、各々を連続的にまたは同時に、そのような治療を必要とする被験者に処方しうる。さらに別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の治療有効量は、ニューロンの髄鞘再形成を促進する量である。別の実施形態では、ｒＨＩｇＭ２２抗体の治療有効量は、同時に髄鞘再形成を促進しながら脱髄を低下させる量である。メチルプレドニゾロンと組み合わせて使用するとき、ｒＨＩｇＭ２２抗体は、脱髄を予防すること、髄鞘再形成を促進することまたはそれらの組み合せにおいてより有効でありうる。
【００１３】
本発明の４番目の態様は、本発明の組換えヒト抗体に由来するか、またはそれに関連するフラグメントおよび単量体を提供する。そこで、本発明は特にｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）に由来するか、または基づくフラグメントまたは単量体に関する。そのようなフラグメントおよび／または単量体は、親抗体分子と同じ活性を有し、ニューロンを再髄鞘化するか、またはニューロンの脱髄を防ぐ能力を示しうる。
【００１４】
本発明の５番目の態様は、ハプテンおよびペプチド類似体を含む、同様の治療活性を示しうる他の抗体および関連結合パートナーをスクリーニングするためのアッセイを提供する。そのような活性は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経損傷または機能障害の治療または予防を含む。
【００１５】
本発明の６番目の態様は、本発明の組換えモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを使用して、ヒトにおける多発性硬化症などの哺乳動物における脱髄疾患、および感染後脳脊髄炎などのヒトおよび家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する、またはこれらの疾患状態における脱髄の開始または進行を予防的に阻止する方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、乏突起膠細胞などのグリア細胞を生産し、その増殖を刺激するインビトロでの方法、および脱髄疾患を治療するためのこれらのグリア細胞の使用に関する。従って、１つの実施形態では、そのような抗体療法が有効である脱髄性神経症状または障害は、多発性硬化症である。別の実施形態では、そのような抗体療法が有効である脱髄性神経症状または障害は、急性または慢性脊髄損傷である。神経または神経線維の脱髄が著明である他の神経症状または疾患も考慮される。
【００１７】
本発明はまた、ニューロンの髄鞘再形成を助けるまたはニューロンの脱髄を防ぐ組換えヒト自己抗体のクローニング、単離および使用におよび、前記ヒト自己抗体の例はｒＨＩｇＭ２２である。以下の用語は本出願全体を通じて相互に使用可能である：ＲｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ２２、ｒＨＩｇＭ２２およびＬＹＭ２２。組換えｒＨＩｇＭ２２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列を図５および６に示しており、従って、本発明は、前記の図に示す配列を有するか、または少なくとも部分的にそれに対応する抗体および対応抗体タンパク質、およびハプテンなどの低分子に関する。抗体のこれらの配列は、部分的に、ヒト組換え形態の抗体をクローニングするために使用でき、あるいは研究または診断目的のためのプローブとして使用しうる。本発明はさらに、新たに特定された組換え抗体が、髄鞘再形成の促進、損傷した神経細胞の再生、神経保護、神経成長等のような様々な目的に使用しうることに関する。
【００１８】
本発明はまた、ここで述べる自己抗体に結合するペプチドを広く対象とし、これらのペプチドは、それらの配列、三次元構造または抗体結合から生じる構造配置的変化により、ペプチドワクチンにおいておよびそれら自体がペプチドワクチンとして使用することができる。本発明のさらなる態様では、これらのペプチドは、神経調節および／または免疫調節特性を有すると考えられ、そのような治療を必要とする哺乳動物において、神経細胞増殖応答および／または神経保護、神経再生および／または髄鞘再形成の役割を誘導する方法を提供しうる。
【００１９】
同様に、本発明は、ワクチンを含む治療製剤における有効成分としても機能しうるように、前記ペプチド、抗体および／または他の関連基質に結合することができ、免疫原性を有しうるハプテンを包含する。特定実施形態では、１つまたはそれ以上のハプテンをワクチン製剤中で本発明の他のペプチドと組み合わせうる。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、これらのペプチドは、タンパク質分解を防ぎ、それによって半減期を延長させるための安定剤と共に、そのような治療を必要とする哺乳動物に経口的、皮下、静脈内、鼻内、髄腔内経路でまたはリポソーム製剤として投与される薬学的組成物として製剤することができる。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ここでは神経調節物質と称し、中枢神経系における治療作用が著明である分子群を対象とする。従って、本発明は、中枢神経系において特に有効性を有する神経調節物質に関し、それらの物質は、ＩｇＭサブタイプの抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらの単量体、それらのアゴニスト、それらの擬態、およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む。クラススイッチ（天然にあるいは組換えまたは合成手段によって生じる）を受けたものを含む、種々のサブタイプの関連抗体も考慮され、但し、前記クラススイッチ抗体は本発明の方法において有用な神経調節物質としての特徴を有する。前記神経調節物質は以下の特徴の１つまたはそれ以上を有する：それらはグリア細胞の髄鞘再形成および／または細胞増殖を誘導する；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を惹起する；および／または細胞死、例えば過酸化水素誘導の細胞死を阻止する。
【００２２】
本発明の抗体は、髄鞘再形成も同時に誘導しうるポリクローナル抗体などの、神経組織に結合する他の抗体、特に他のポリクローナルＩｇＭ抗体、特にポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリンおよびその製剤、より具体的には、プールポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリンおよびプールポリクローナルヒトＩｇＭ免疫グロブリンと共に使用しうる。好ましくは、前記抗体は、髄鞘再形成することができる組換え生産されたヒト抗体または組換え生産されたキメラ抗体である。もう１つの特定実施形態では、前記組換え抗体は、ｒＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、その単量体、その活性フラグメント、およびｒＨＩｇＭ２２の特徴を有する天然または合成抗体である。本発明は、図５および６から選択される配列に少なくとも部分的に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその活性フラグメントを含む抗体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、同じかまたは相補的な配列を有する組換えＤＮＡまたはクローン化された遺伝子を含む、ここでは神経調節物質とも称され、および本発明の抗体、特に図５および６に示す配列に少なくとも部分的に対応する配列を有する抗体；本発明の抗体に少なくとも部分的に対応しうる、そしてここでは抗体ペプチドとも称されるペプチド、例えば図５および６に少なくとも部分的に対応する１つまたはそれ以上の配列を有するペプチド；およびハプテンなどの低分子を包含し且つそれらから選択されうる分子のクラスをコードする、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子またはそれらの縮重変異体に関する。
【００２４】
本発明はまた、ここで述べる活性を有し、上記に示すおよび上記で述べた、少なくとも一部は図５および６からなる群より選択されるアミノ酸配列を示す、前記抗体に由来するか、または前記抗体に対応するタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体を包含する。
【００２５】
本発明は、同様に、前記タンパク質または抗体ペプチドと同じ活性を示し、ワクチン中の製剤などによって同様に治療のために投与しうるハプテンに関する。１つの実施形態では、ペプチドとハプテンの両方を含むワクチンを製造しうる。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態では、そのようにして決定した組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子の完全なＤＮＡ配列を、適切な宿主に導入しうる発現調節配列に作動可能に連結しうる。本発明は、従って、本発明の抗体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むクローン化遺伝子または組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主に関する。
【００２７】
特定実施形態では、本発明の抗体の可変領域のＤＮＡ配列は、合成抗体を産生するときに使用しうる。特に、可変領域配列は、合成抗体を提供するためにその天然のまたは遺伝学的に提供される定常領域配列と組み合わせうる。本発明は、本発明の抗体のＤＮＡ配列、特に可変領域配列に由来し且つそれを含む合成抗体を産生するためのベクターを提供する。
【００２８】
本発明のある種の好ましい実施形態の他の好ましい特徴によれば、生物学的に活性を示す動物または特にヒト抗体ペプチドを生産するための組換え発現系が提供される。
【００２９】
本発明は、ここで例示する公知の組換え手法を含む、自己抗体、ペプチド、対応するハプテンまたはその他の低分子類似体のクローンの作製のためのいくつかの手段を包含し、本発明は、従って、そのような合成製剤をその範囲内に含むことが意図されている。ここで開示するｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の単離は、そのような組換え手法による本発明の抗体またはそれらの類似体の再生産（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を促進し、従って本発明は、組換えＤＮＡ手法による宿主系での発現のための、開示ＤＮＡ配列から作製される発現ベクター、および生じる形質転換宿主に関する。
【００３０】
本発明は、例えば本発明の自己抗体またはそれらの類似体の活性を増強することによって、標的哺乳動物神経細胞の神経活性を調節するために有効な潜在的薬剤のスクリーニングのためのアッセイシステムを包含する。１つの例として、試験薬剤を、対照との比較によって何らかの化学的試料（ＤＮＡを含む）または試験薬剤への自己抗体の結合活性に及ぼす作用を測定するために、自己抗体の活性を抑制するか、または阻害するリガンドまたは抑制された抗体を含む抽出物と共に、細胞試料に投与することができる。
【００３１】
本発明は、神経調節物質の存在の程度の定量的分析のため、またはそれらの活性を模倣しうるまたは阻止しうる薬剤または他の物質を特定するための、試験キットの形態で作製しうるアッセイシステムを包含する。前記システムまたは試験キットは、標識を神経調節物質、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストに結合する、ここで述べる放射性および／または酵素的手法の１つによって作製される標識成分、および１つまたはそれ以上の付加的な免疫化学試薬を含みうるが、前記免疫化学試薬の少なくとも１つは、前記標識成分、その結合パートナー、測定する成分またはそれらの結合パートナーの１つに結合することができる、遊離または固定リガンドである。
【００３２】
特定のおよびさらなる態様では、本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、本発明の抗体、特に自己抗体の、画像化およびインビボ診断適用における使用および適用に関する。そこで、前記抗体は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力により、免疫蛍光、放射性および他の診断的に適するタグを通して、中枢神経系を含む神経系の特徴付けおよび、特に多発性硬化症を含む、神経疾患の診断、モニタリングおよび評価のための、画像化試薬または画像化分子として利用することができる。前記抗体はさらに、卒中、脊髄損傷およびアルツハイマー病を含む様々な痴呆の診断、モニタリングおよび評価における画像化試薬または画像化分子として利用しうる。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、神経調節物質、それらのサブユニット、またはそれらの活性フラグメント、それらのペプチド等価物、それらの類似体の活性に基づく、あるいは同じ活性を有すると判定された物質または他の薬剤に基づく、ある種の治療方法に関する。最初の治療法は、抗体またはそれらのサブユニットの結合活性と因果関係があるまたはその結果として起こる症状の発現の予防に関連し、そして神経調節物質、対応する自己抗体、抗体ペプチド、それらの活性フラグメントまたはサブユニットの産生および／または活性を刺激することができる物質を、宿主においてそれらの症状の発現を予防するか、または治療するために有効な量で個別にまたは互いに混合して投与することを含む。例えば薬剤あるいは抗体またはそれらのフラグメントへの他の結合パートナー等を、多発性硬化症の治療におけるように、神経再生および／または神経保護作用を増強するため、または髄鞘再形成を刺激するために投与しうる。
【００３４】
より具体的には、一般にここで言及する治療方法は、神経調節物質の活性の有効な阻害因子またはエンハンサーを含有しうる薬学的組成物、または、例えばここで述べる本発明の態様に従って作製され、使用される薬剤スクリーニングアッセイによって開発される、他の等しく有効な薬剤の投与による、様々な疾病または他の細胞機能不全および障害の治療のための方法を包含しうる。例えば、図５および６に示す配列に少なくとも部分的に対応する配列を有する、薬剤または神経調節物質への他の結合パートナーまたは同様のタンパク質を、パーキンソン病または多発性硬化症の治療におけるように、神経再生、神経保護または髄鞘再形成を阻止するか、または増強するために投与しうる。特に、その配列を図５および６に示す、ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）のタンパク質、それらの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、単量体またはそれらの活性フラグメントは、それらの混合物および組み合せを含めて、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病または脊髄損傷を治療するためのような、神経再生および／または神経保護治療または髄鞘再形成が適切である場合の投与のために、ワクチンを含む医薬製剤として製造しうる。本発明は、ここで提供する抗体の組み合せを包含し、その場合特にｓＨＩｇＭ２２から選択される抗体、特にヒト抗体は、医薬および治療組成物または製剤として製造することができる。様々なヒト抗体、マウス抗体、あるいはそれらに由来するか、またはそれらに基づく単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体の組み合せまたは混合物も、本発明によって提供され、本発明に包含される。ヒト抗体（それらに由来する単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体に及ぶ）は、特にｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ４６、ＭＳＩ１９Ｅ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、ＭＳＩ１９Ｅ５およびＭＳＩ１０Ｅ１０の群から選択される。マウス抗体（それらに由来する単量体、フラグメント、組換えまたは合成抗体およびヒト化抗体に及ぶ）は、特にＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ７９．０８、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ９、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１の群から選択される。加えて、本発明はさらに、そのような何らかの神経再生および／または神経保護治療または髄鞘再形成において有用な治療化合物、薬剤または物質と前記抗体の組み合せを提供する。例えば本発明の抗体製剤または組成物は、βインターフェロン製剤（ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）等）およびコポリマー１（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））を含むがこれらに限定されない、多発性硬化症の治療のための治療化合物と組み合わせうる。加えて、本発明の抗体は、損傷部位で炎症を抑制するように作用しうる他の物質と組み合わせうる。１つのそのような物質はメチルプレドニゾロンである。
【００３５】
従って、神経再生および／または神経保護作用の促進に関連するある種の特徴および活性を示す、精製された形態でのヒト自己抗体および対応する抗体ペプチド、ハプテン、類似体およびそれらの活性フラグメントを含む、神経調節物質を提供することが本発明の主たる目的である。
【００３６】
侵襲性、自発性または特発性疾病状態が存在することが疑われる哺乳動物において自己抗体の存在、量および活性を検出するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００３７】
哺乳動物において自己抗体および／またはそれらのフラグメント、サブユニット等の活性を模倣するか、またはそれらの何らかの有害作用に対抗する上で潜在的に有効な、薬剤、作用物質等のような物質をスクリーニングするための方法および関連アッセイシステムを提供することが本発明のさらなる目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法および治療方法を述べる前に、本発明は特定の方法および記述する試験条件に限定されず、方法および条件はそれら自体が変化しうることが了解されるべきである。また、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、ここで使用する用語は特定実施形態を説明することだけを目的とするものであり、限定を意図しないことも了解されるべきである。
【００３９】
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用するとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる規定を与えない限り、複数の言及を包含する。そこで、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、ここで述べるタイプのおよび／または本開示等を読了後に当業者には明白となる、１つまたはそれ以上の方法および／または工程を包含する。
【００４０】
特に異なる規定がない限り、ここで使用するすべての技術的および学術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここで述べるものと類似のまたは等価のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験において使用できるが、ここでは好ましい方法および材料を述べる。ここで言及するすべての公表文献は参照としてここに組み込まれる。
【００４１】
（定義）
同じくここで使用するとき、本発明の抗体に関係する「ｒＨＩｇＭ」および「ｒｓＨＩｇＭ」、「ｓＨＩｇＭ２２」および「ＬＹＭ２２」という用語は、ここでは等価とみなされるものとする。
【００４２】
「被験者」は、ヒトを包含する。「ヒト」、「患者」および「被験者」という用語は、ここでは相互に使用可能である。
【００４３】
「治療有効量」は、疾患を治療するために被験者に投与するとき、疾患のためのそのような治療を生じさせるのに十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、および治療する被験者の年齢、体重等に依存して異なりうる。
【００４４】
何らかの疾患または障害を「治療すること」または何らかの疾患または障害の「治療」は、１つの実施形態では、その疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発現を阻止することまたは軽減すること）を指す。別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、被験者が識別できない、少なくとも１つの物理的パラメータを改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、物理的に（例えば識別可能な症状の安定化）、生理的に（例えば物理的パラメータの安定化）、またはその両方で、疾患または障害を調節することを指す。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の発症を遅延させることを指す。
【００４５】
本出願および特許請求の範囲全体を通じて個々に使用される「神経調節物質」という用語は、中枢神経系における特定の恩恵および作用を伴って神経突起の成長、再生および髄鞘再形成を促進するように機能する広いクラスの物質を指し、それ故、ＩｇＭサブタイプの抗体、特に、図３５−３８、４５、４６、５５−６１および７１−７２に示すペプチド配列に少なくとも部分的な配列類似性を有しうる物質を含む、ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７およびＭＳＩ１９Ｅ５、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらの単量体、アゴニスト、擬態等としてここで特定して言及するもののようなヒト抗体を含む。神経調節物質はまた、その単量体または活性フラグメントを含む、ここで提供する抗体の２つ以上の組み合せまたは混合物を含み、包含する。
【００４６】
また、「神経調節物質」、「自己抗体」、「抗体ペプチド」、「ペプチド」、「ハプテン」という用語および特定して列挙されていない何らかの変異体は、それらがすべて単一または複数のタンパク質を含むタンパク質様物質を指すことができ、それを含みうる限り、ここでは交換可能に使用でき、そして、ここで述べるおよび図５−６に示すアミノ酸配列データおよびここでおよび特許請求の範囲において述べる活性プロフィールを有するタンパク質を対象とする。従って、実質的に等しいまたは変化した活性を示すタンパク質も同様に考慮される。これらの修飾は、例えば部位指定的突然変異を通して得られる修飾のように意図的であるか、または複合体またはその指定サブユニットの生産者である宿主における突然変異を通しえるもののように偶発的でありうる。また、「神経調節物質」、「自己抗体」、「抗体ペプチド」、「ペプチド」、「ハプテン」という用語は、適宜に、ここで特定して列挙されるそれらの範囲内のタンパク質並びに実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異体を包含することが意図されている。
【００４７】
ここで述べるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性形態であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性形態の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能特性がそのポリペプチドによって保持されている限り、何らかのＬ−アミノ酸残基に置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に従って、アミノ酸残基についての略記法を以下の対応表に示す：
対応表
記号 アミノ酸
１文字 ３文字
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｎ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
すべてのアミノ酸残基配列は、ここでは、その左および右方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表わされていることに留意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の起始部または末端のダッシュは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。上記の表は、ここで交互に出現しうる３文字表記と１文字表記を相関させて示している。
【００４８】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製することができる何らかの遺伝的エレメント（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００４９】
「ベクター」は、もう１つ別のＤＮＡセグメントが、結合したセグメントの複製を生じさせるように結合している、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。「ＤＮＡ分子」は、その一本鎖形態または二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体形態を指す。この用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、いずれの特定三次形態にも限定されない。それ故、この用語は、中でも特に線状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中に認められる、二本鎖ＤＮＡを包含する。特定二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じるとき、配列は、ここでは、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常慣例に従って記述しうる。
【００５０】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【００５１】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下においたとき、インビボでポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の範囲は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を含みうるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常はコード配列の３’側に位置する。
【００５２】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞におけるコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のようなＤＮＡ調節配列である。
【００５３】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に隣接し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって好都合に規定される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合の役割を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。真核生物プロモーターはしばしば、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００５４】
「発現制御配列」は、もう１つ別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写し、次にそれがコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳されるとき、細胞中の転写および翻訳調節配列の「制御下に」ある。
【００５５】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれうる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向かわせるまたはポリペプチドを培地中に分泌するように宿主細胞に伝達する、ポリペプチドのＮ末端のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物にネイティブな種々のタンパク質に関連して認められうる。
【００５６】
本発明のプローブに言及するときここで使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個またはそれ以上、好ましくは３個以上のリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確な大きさは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する、多くの因子に依存する。
【００５７】
ここで使用する「プライマー」という用語は、精製制限消化におけるように天然に生じるかまたは合成によって生産されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下においたとき、すなわち適切な温度とｐＨでヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下においたとき、合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖または二本鎖でありえ、誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーのソースおよび使用する方法を含む、多くの因子に依存する。例えば診断適用のためには、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５−２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。
【００５８】
プライマーは、ここでは、特定標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合し、残りのプライマー配列は鎖に相補的でありうる。あるいは、プライマー配列がそれとハイブリダイズし、それによって伸長産物の合成のために鋳型を形成するために鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーの中に散在させることができる。
【００５９】
ここで使用する、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、各々が特定ヌクレオチド配列でまたはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する、細菌酵素を指す。
【００６０】
細胞は、外来性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入されたとき、そのようなＤＮＡによって「形質転換」された。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色ＤＮＡに組み込まれても（共有結合されても）よくまたは組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントに維持されうる。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、染色体複製を通して娘細胞によって受け継がれるように染色体内に組み込まれたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の個体群からなる細胞系またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通祖先から誘導される細胞の個体群である。「細胞系」は、多くの世代にわたってインビトロで安定に増殖することができる一次細胞のクローンである。
【００６１】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の規定の長さにわたってマッチするとき「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウエアを使用して、または、例えばその特定システムに関して定義されるストリンジェント条件下での、サザンハイブリダイゼーション試験において、配列を比較することによって特定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当技術分野の技術的範囲内である。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出参照。特に、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、対応する生殖細胞系遺伝子配列に実質的に相同であり、対応生殖細胞系遺伝子配列に少なくとも約９０％の相同性を有する。
【００６２】
本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列、または少なくともその一部を規定する、または図５−６に示すのと同じアミノ酸配列を有するが、同じ配列番号に縮重しているペプチドをコードする、ペプチド類似体、ハプテンまたはそれらの活性フラグメントも、本発明の範囲内であることは認識されるべきである。「〜に縮重」とは、特定アミノ酸を規定するために異なる３文字コドンが使用されることを意味する。以下のコドンが、各々の特定アミノ酸をコードするために交換可能に使用できることは当技術分野において周知である。
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ
終結コドン ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）
上記に明記するコドンはＲＮＡ配列に関するものであることが了解されるべきである。ＤＮＡについての対応コドンはＵの代わりにＴを有する。
【００６３】
特定コドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンに変更するように、特定ＤＮＡ配列または分子内で突然変異を実施することができる。そのような突然変異は、一般に、最小ヌクレオチド変化を可能にすることによって実施される。この種の置換突然変異は、生じるタンパク質内のアミノ酸を非保存的に（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、別のグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）または保存的に（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）変化させるように実施しうる。そのような保存的変化は、一般に、生じるタンパク質の構造および機能のより小さな変化を導く。非保存的変化は、生じるタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性がより高い。本発明は、生じるタンパク質の活性または結合特徴を有意に変化させない保存的変化を含む配列を包含するとみなされるべきである。
【００６４】
以下は、アミノ酸の様々なグループの一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン
バリン
ロイシン
イソロイシン
プロリン
フェニルアラニン
トリプトファン
メチオニン。
【００６５】
無電荷極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン
セリン
トレオニン
システイン
チロシン
アスパラギン
グルタミン。
【００６６】
電荷極性Ｒ基（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸
グルタミン酸。
【００６７】
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン
アルギニン
ヒスチジン（ｐＨ６．０で）
もう１つのグループは、フェニル基を有するアミノ酸でありうる：
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン。
【００６８】
もう１つのグループは、分子量（すなわちＲ基の大きさ）に従いうる：
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リシン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０で） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４。
【００６９】
特に好ましい置換は：
−正電荷が維持されうるＡｒｇの代わりのＬｙｓおよびその逆；
−負電荷が維持されうるＡｓｐの代わりのＧｌｕおよびその逆：
−遊離−ＯＨが維持できるＴｈｒの代わりのＳｅｒ；および
−遊離ＮＨ２が維持できるＡｓｎの代わりのＧｌｎ
である。
【００７０】
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を有するアミノ酸に置換するためにも導入しうる。例えばＣｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位に導入しうる。Ｈｉｓは、特に「触媒」部位として導入しうる（すなわちＨｉｓは酸または塩基として働くことができ、生化学的触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質構造にβターンを導入する、その特に平面的な構造の故に導入されうる。
【００７１】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは約９０または９５％）が同一であるかまたは保存的置換であるとき、「実質的に相同」である。特に、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、対応する生殖細胞系遺伝子アミノ酸配列に実質的に相同であり、対応生殖細胞系遺伝子アミノ酸配列に少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００７２】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の、天然ではそのより大きな分子と結びついて認められることがない、ＤＮＡを特定することが可能なセグメントである。そこで、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、その遺伝子は通常、ソース生物のゲノム内ではその哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接される。異種コード配列のもう１つの例は、そのコード配列自体が天然では認められない構築物である（例えばゲノムコード配列が、イントロンまたは天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含むｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または自然発生的な突然変異的事象は、ここで定義するＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００７３】
ここで使用する、「抗体」という用語は、特定エピトープに結合する、抗体およびそのフラグメントを含む免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を包含し、キメラ抗体は米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号に詳細に述べられている。そのような抗体は、公知の一般的手法によって作製されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びに二重特異性またはキメラ抗体、および、例えば中枢神経系軸索の髄鞘再形成および／または再生を刺激する、または神経保護を提供するそれらの調節作用の能力と共に付加的な診断用途に適する他の機能性を含む抗体を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超過変領域からなる抗体分子の構造部分である。ここで使用するその様々な文法的形態での「抗体分子」という語句は、無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分の両方を考慮する。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当技術分野で知られる部分を含む、パラトープを有する無傷の免疫グロブリン分子の部分である。
【００７４】
抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分または抗体フラグメントは、周知の方法による、実質的に無傷の抗体分子に関する、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解応によって作製しうる。例えばＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらへの米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から、２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合をメルカプトエタノールなどで還元し、次に生じたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化することによって作製される。無傷の抗体分子を含む抗体がここでは好ましい。
【００７５】
その様々な文法的形態での「モノクローナル抗体」という語句は、特定抗原と免疫反応することができる１つの種だけの抗体結合部位を有する抗体を指す。モノクローナル抗体は、それ故、典型的にはそれが免疫反応する抗原に対して単一結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、それ故、各々が異なる抗原に対して免疫特異性である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含みうる。
【００７６】
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生するための一般的方法は周知である。不朽抗体産生細胞系も、癌遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションなどの、融合以外の手法によって創造することができる。例えばＭ．Ｓｃｈｅｒｅｉｅｒら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８０）参照；また米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４５１，５７０号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号；同第４，４９１，６３２号；同第４，４９３，８９０号も参照のこと。
【００７７】
（一般的説明）
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学および当技術分野の技術的範囲内の組換えＤＮＡ手法が使用できる。そのような手法は文献において詳細に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編集（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編集（１９９４）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）参照。
【００７８】
本発明の方法において有用であり、神経調節物質ペプチドまたは自己抗体ペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な性質、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性等に関してスクリーニングすることができる。特に興味深いのは、神経調節物質、特に本発明の自己抗体と同じ活性を示すモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナル抗体は、ここで提示し、説明するタイラーウイルス、ＥＡＥおよびリゾレシチンモデルなどの活性のアッセイにおいて容易に特定できる。天然または組換え自己抗体の免疫親和性の精製が可能であるとき、高親和性抗体も有用である。
【００７９】
好ましくは、本発明の診断方法および治療方法において使用する抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。加えて、ここで使用する抗体分子は、全抗体分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態であることが考慮される。
【００８０】
先に示唆したように、本発明の診断方法は、抗ペプチド抗体、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂなどの、抗体ペプチド／タンパク質に対するアンタゴニストの有効量を含むアッセイによって細胞試料または媒体を検討することを含む。加えて、ここで使用する抗ペプチド抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態または全抗体分子であることが好ましい。先に述べたように、この方法から恩恵を受けることができる患者は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ウイルス感染または身体的外傷から生じる損傷を含む他の同様の神経病理学的障害などの神経学的症状を呈している患者を含む。ペプチドを単離し、抗ペプチド抗体を誘導するための方法および標的細胞の検討を助ける抗ペプチド抗体の能力を判定し、最適化するための方法は、すべて当技術分野において周知である。
【００８１】
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である。Ｎｅｓｔｏｒらへの米国特許第４，４９３，７９５号参照。典型的には有用な抗体分子のＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２部分を含む、モノクローナル抗体は、参照としてここに組み込まれる、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に述べられているハイブリドーマテクノロジーを使用して作製することができる。簡単に述べると、それからモノクローナル抗体組成物が生産されるハイブリドーマを形成するために、骨髄腫または他の自己永続化細胞系を、その抗体ペプチド結合部分、または抗体ペプチドまたはフラグメント、またはその起源特異的ＤＮＡ結合部分で超免疫化した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と融合する。
【００８２】
脾細胞を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００を使用して骨髄腫細胞と融合する。融合したハイブリッドを、ＨＡＴに対するそれらの感受性によって選択する。本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明の自己抗体と同じように免疫反応するそれらの能力および標的細胞および組織において規定の活性を阻害するか、または促進するそれらの能力によって特定する。
【００８３】
本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始させることによって生産できる。前記培養を、ハイブリドーマが媒体中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下で十分な時間維持する。次に抗体含有媒体を収集する。その後周知の手法によって抗体分子をさらに単離することができる。
【００８４】
これらの組成物の調製のために有用な媒体は、当技術分野において周知であり且つ市販されており、合成培地、近交系マウス等を含む。例示的な合成培地は、４．５ｇ／ｌグルコース、２０ｍｍグルタミンおよび２０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。例示的な近交系マウス系統はＢａｌｂ／ｃである。
【００８５】
モノクローナル抗ペプチド抗体を産生するための方法も当技術分野において周知である。Ｎｉｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）参照。典型的には、本発明の抗体ペプチドあるいはペプチド類似体またはフラグメントは、抗ペプチドモノクローナル抗体を産生するための前述した手順における免疫源として、単独でまたは免疫原性キャリアと併用して使用される。ハイブリドーマは、抗体ペプチド類似体と免疫反応し、それによって本発明の抗体と同様に反応する抗体を産生する能力に関してスクリーニングされる。
【００８６】
抗体の作製において、所望の抗体に関するスクリーニングは、当技術分野において周知の手法、例えば放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチュー免疫測定法（例えばコロイド状金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等によって達成できる。１つの実施形態では、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって一次抗体を検出する。さらなる実施形態では、二次抗体を標識する。免疫測定法において結合を検出するための多くの手段が当技術分野において公知であり、本発明の範囲内である。
【００８７】
抗体は、例えば酵素、発蛍光団、発色団、放射性同位体、染料、コロイド状金、ラテックス粒子および化学発光物質などの標識で、インビトロでの検出のために標識することができる。あるいは抗体は、例えば放射性同位体（好ましくはテクネチウムまたはヨウ素）、磁気共鳴シフト試薬（ガドリニウムおよびマンガンなど）または放射線不透過性試薬で、インビボでの検出のために標識することができる。
【００８８】
これらの試験のために最も一般的に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線に曝露したとき蛍光を有する化学物質その他である。
【００８９】
多くの蛍光物質が公知であり、標識として利用できる。これらは、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローを含む。特定検出材料は、ヤギにおいて調製し、イソチオシアネートを通してフルオレセインとコンジュゲートした抗ウサギ抗体である。ポリペプチドも放射性元素または酵素で標識することができる。放射性標識は、現在使用可能な計数手段のいずれかによって検出できる。好ましい同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択されうる。
【００９０】
酵素標識も同様に有用であり、現在使用される比色定量、分光測光法、蛍光分光光度法、電流滴定またはガス定量手法のいずれかによって検出できる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような架橋分子との反応によって選択粒子にコンジュゲートされる。これらの手順において使用できる多くの酵素が公知であり、利用できる。好ましいものとしては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号および同第４，０１６，０４３号が、例として、選択的な標識材料および方法についてのそれらの開示に関して参照される。
【００９１】
ポリクローナル免疫グロブリン製剤は、免疫系の機能不全または調節不全を特徴とするか、またはそれらを伴う様々な臨床状況において有益な臨床作用を及ぼすことが示された。免疫グロブリンはまた、個体が一部の疾病を予防するために十分なそれ自身の免疫を生成しないときに起こりうる疾病を予防するか、または治療するために使用される。今日使用されているほぼすべての免疫グロブリン製剤が、分画によるヒト血漿の大きなプールに由来する、高度精製ＩｇＧからなる。これらの製剤は一般に静脈内経路（ＩＶＩＧ）で投与されるが、筋肉内投与（ＩＧＩＭ）および経口投与も使用される。
【００９２】
一般的に使用されるＩｇＧ製剤は、Ｇａｍｉｍｕｎｅ（５％および１０％）（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ガンマガード（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ポリガム（Ｐｏｌｙｇａｍ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）、サンドグロビン（Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｉｎ）（Ｓａｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベノグロビン（Ｖｅｎｏｇｌｏｂｉｎ）（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ）およびイントラグロビン（Ｉｎｔｒａｇｌｏｂｉｎ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）を含む。筋肉内免疫グロブリン（ＩＧＩＭ）、ベイガム（ＢａｙＧａｍ）はＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能である。臨床用途のＩＶＩＧ製剤は、主としてＩｇＧ、より少量のＩｇＡ、およびさらに少量のＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含有し、一般に９５％またはそれ以上のＩｇＧ、２−５％ＩｇＡおよび極微量のＩｇＭを含む。
【００９３】
ペンタグロビン（Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ）は、ＩｇＭに富む多価免疫グロブリン製剤であり、溶液各々１ｍｌは、ＩｇＭ ６ｍｇ、ＩｇＡ ６ｍｇ、ＩｇＧ ３８ｍｇおよび注射用グルコース一水和物２７．５ｍｇ、または１２％ＩｇＭ、一般には１０−１５％ＩｇＭを含有する。ＩｇＭをさらに強化した免疫グロブリン製剤は容易に生成することができ、ある種の症状の治療または緩和のために動物モデルにおいて有効と報告されている。Ｒｉｅｂｅｒｔらは、急性炎症のラットモデルにおけるＩｇＭ強化ヒト静脈内免疫グロブリンの使用、特にペンタグロビンおよびＩＶＩｇＭの試験用製剤（３５ｇ／ｌ ＩｇＭ、１２ｇ／ｌ ＩｇＡ、３ｇ／ｌ ＩｇＧ）の使用を報告している（Ｒｉｅｂｅｒｔ，Ｒ．ら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３（３）：９４２−９５１）。Ｈｕｒｅｚらは、試験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）における９０％以上の静脈内ＩｇＭ製剤の使用を報告している（Ｈｕｒｅｚ，Ｖ．ら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ９０（１０）：４００４−４０１３）。少なくとも２０重量％ＩｇＭのＩｇＭ抗体免疫グロブリン製剤が、それらの全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第５，２５６，７７１号、同第５，５１０，４６５号および同第５，６１２，０３３号に述べられている。免疫グロブリンの総含有量に対して少なくとも５０％重量％のＩｇＭを含有する静脈内投与可能なポリクローナル免疫グロブリン製剤が、その全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第５，１９０，７５２号においてＭｏｌｌｅｒらによって記述されている。
【００９４】
免疫グロブリン製剤は、一般に当業者に周知の方法および工程によって生成される。免疫グロブリンは健常志願者の血液から調製され、供血者の数は少なくとも約５または１０、好ましくは少なくとも約１００、より好ましくは少なくとも約１，０００、さらに一層好ましくは少なくとも約１０，０００人である。１つの一般的の方法では、数千人の供血者のプールに由来するヒト血漿を低温エタノール分画（Ｃｏｈｎ法またはＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ法）（Ｃｏｈｎら（１９４６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９−４７５；Ｏｎｃｌｅｙら（１９４９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１：５４１−５５０）によって分別し、次に低いｐＨで酵素処理し、分画して、クロマトグラフィーにかける。低温エタノール分画の後に限外ろ過およびイオン交換クロマトグラフィーを実施してもよい。免疫グロブリン製剤をウイルス伝播から安全にするために、酵素修飾、化学修飾、β−プロピオラクトンでの処理、低いｐＨでの処理、高熱での処理および溶媒／洗浄剤での処理を含むがこれらに限定されないさらなる工程を組み込む。有機溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）混合物での処理は、エンベロープに包まれたウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）によるウイルス伝播を排除する（Ｇａｏ，Ｆ．ら（１９９３）Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ６４（４）：２０４−９；参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，４８１，１８９号および同第４，５４０，５７３号）。ＩｇＭ強化免疫グロブリン溶液のための個々の工程および方法は、それらの全体が参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，３１８，９０２号および同第６，１３６，１３２号に述べられている。
【００９５】
ここで考慮するおよび本発明の方法における使用に適するポリクローナルＩｇＭ強化免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリン製剤を製造するために使用される周知の方法のいずれかによって生成できる。適切な免疫グロブリンはまた、市販のものを入手することができる。免疫グロブリン製剤はヒト免疫グロブリン製剤でありうる。適切な免疫グロブリン製剤は、少なくとも約１０％ＩｇＭ、少なくとも約１５％ＩｇＭ、少なくとも約２０％ＩｇＭ、少なくとも約２５％ＩｇＭ、少なくとも約３０％ＩｇＭ、少なくとも約４０％ＩｇＭ、少なくとも約５０％ＩｇＭ、少なくとも約６０％ＩｇＭ、少なくとも約７０％ＩｇＭ、少なくとも約８０％ＩｇＭ、少なくとも約９０％ＩｇＭおよび少なくとも約９５％ＩｇＭを含む。本発明における使用に適するポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、１０％以上のＩｇＭ、２０％以上のＩｇＭおよび５０％以上のＩｇＭを含む。本発明における使用に適するポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、ＩｇＧの量より多く且つＩｇＡの量より多い量のＩｇＭを含む。
【００９６】
ＩｇＭ強化免疫グロブリン、特にヒト免疫グロブリンのフラグメントの製剤も本発明に従って使用できる。免疫グロブリンのフラグメントは、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２および一本鎖免疫グロブリンまたは単量体などの無傷の免疫グロブリンの部分を指す。
【００９７】
ＩｇＭ強化免疫グロブリン製剤は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤中で提供され、静脈内、筋肉内経路でまたは経口的に投与される。ＩｇＭ免疫グロブリンは、ＩＶＩＧまたはＩＧＩＭまたはペンタグロビンを含む、臨床的に採用されている免疫グロブリンの投与のために当業者によって認識され、使用される投与と同様の用法および用量で、あるいは製造者によって臨床的に示されるまたは推奨されるように投与される。本発明の中心的な態様によれば、組換えＩｇＭ製剤は、マウスにおいて決定される、約５００ｎｇ−約６００μｇの用量で投与される。被験者の大きさおよび表面積対容積の差を考慮して、ヒトに適合するようにこれらの量を調整することにより、おおよその範囲は約１．２５−約２．５μｇ／ｋｇ体重となる。投与は、単回投与でまたは１日中で複数回に分けたまたは分割した用量でまたは数日間または数ヶ月間にわたって、実施することができる。適切な用量は、１．２５μｇ／ｋｇ体重、１．３μｇ／ｋｇ体重、１．４μｇ／ｋｇ体重、１．５μｇ／ｋｇ体重、１．６μｇ／ｋｇ体重、１．７μｇ／ｋｇ体重、１．８μｇ／ｋｇ体重、１．９μｇ／ｋｇ体重、２．０μｇ／ｋｇ体重、２．１μｇ／ｋｇ体重、２．２μｇ／ｋｇ体重、２．３μｇ／ｋｇ体重、２．４μｇ／ｋｇ体重および２．５μｇ／ｋｇ体重を含む。ポリクローナルＩｇＭ免疫グロブリン製剤は、単独でまたは、症状の治療または緩和のための他の化合物または作用物質を含むがこれらに限定されない、他の治療と組み合わせて投与しうる。脱髄疾患、特に多発性硬化症の治療または緩和の場合は、ＩｇＭ免疫グロブリンを抗炎症薬、ステロイド、ベタセロン、コパキソン等と共に投与しうる。
【００９８】
従って、本発明の診断適用の１つの態様では、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の存在または活性を検出するための方法を開示し、前記神経調節物質は、以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および選択的に、グリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有しており、また前記神経調節物質は、
Ａ）前記神経調節物質の存在または活性が疑われる哺乳動物からの生物学的試料を、神経調節物質がその結合パートナーに結合することを可能にする条件下で、前記神経調節物質の結合パートナーと接触させること；および
Ｂ）前記試料からの前記神経調節物質と結合パートナーとの間で結合が起こったかどうかを検出すること
によって測定され、結合の検出は、試料中の神経調節物質の存在または活性を示す。
【００９９】
異なる態様では、本発明は、前述したように神経調節物質の存在または活性を検出することを含む、哺乳動物において所与の侵襲性刺激に関連するポリペプチドリガンドの存在および活性を検出するための方法に関し、神経調節物質の存在または活性の検出は、哺乳動物における所与の侵襲性刺激に関連したポリペプチドリガンドの存在および活性を示す。特定の態様では、侵襲性刺激は感染であり、ウイルス感染、原生動物感染、細菌感染、腫瘍状哺乳動物細胞および毒素から選択されうる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質に対する結合部位を検出するための方法に関し、前記神経調節物質は、以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および選択的に、グリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有しており、前記方法は、
Ａ．標識した神経調節物質試料を、前記神経調節物質に対する結合部位が疑われる哺乳動物からの生物学的試料と接触させること；
Ｂ．結合試験において、前記生物学的試料を前記標識神経調節物質の存在に関して検査すること；
を含み、前記標識神経調節物質の存在は、神経調節物質に対する結合部位を示している。
【０１０１】
さらに、本発明は、ＩｇＭサブタイプの抗体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の活性を調節する、薬剤または他の実体の能力を試験する方法を含み、前記方法は、
Ａ．神経調節物質に対する受容体を有する試験細胞のコロニーを、神経調節物質を含む増殖培地で培養すること；
Ｂ．試験下の薬剤を添加すること；および
Ｃ．前記神経調節物質と前記試験細胞のコロニー上の受容体との反応性を測定すること
を含み、前記神経調節物質は、以下の特徴：
ａ） 髄鞘再形成を誘導すること；
ｂ）神経組織、特に乏突起膠細胞に結合すること；
ｃ）乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および
ｄ）グリア細胞の細胞増殖を促進すること
の１つまたはそれ以上を有する。
【０１０２】
これらに対応して、本発明は、薬剤および他の作用物質を、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の産生を調節するか、または活性を模倣する能力に関してスクリーニングするためのアッセイ方法を包含し、前記方法は、
Ａ．薬剤または作用物質を接種した観察可能な細胞試験コロニーを培養すること；
Ｂ．前記試験細胞コロニーから上清を採集すること；および
Ｃ．前記上清を前記神経調節物質の存在に関して検査し、前記神経調節物質のレベルの上昇または低下が、前記神経調節物質の活性を調節する薬剤の能力を示すこと
を含み、前記神経調節物質は、以下の特徴：
ｉ） 髄鞘再形成を誘導すること；
ｉｉ）神経組織、特に乏突起膠細胞に結合すること；
ｉｉｉ）乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；および
ｉｖ）グリア細胞の細胞増殖を促進すること
の１つまたはそれ以上を有する。
【０１０３】
最後に、真核細胞試料において、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体を含む抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質を明らかにするための試験キットが考慮され、前記キットは、
Ａ．以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；およびグリア細胞の細胞増殖を促進するもののうちの１つまたはそれ以上を有する神経調節物質の、検出可能に標識された特異的結合パートナーの所定の量；
Ｂ．他の試薬；および
Ｃ．前記キットの使用のための指示
を含む。
【０１０４】
真核細胞試料において、抗体、ペプチド類似体、ハプテン、それらの単量体、それらの活性フラグメント、それらのアゴニスト、それらの擬態およびそれらの組み合せからなる群より選択される物質を含む神経調節物質の存在を明らかにするための異なる試験キットを開示する。前記キットは、
Ａ．以下の特徴：髄鞘再形成を誘導すること；神経組織に結合すること；乏突起膠細胞によるＣａ＋＋シグナル伝達を促進すること；およびグリア細胞の細胞増殖を促進すること、の１つまたはそれ以上を有する神経調節物質の所定の量；
Ｂ．前記神経調節物質の特異的結合パートナーの所定の量；
Ｃ．他の試薬；および
Ｄ．前記キットの使用のための指示
を含み、前記神経調節物質または前記特異的結合パートナーのいずれかは検出可能に標識されている。上記キットはどちらも、神経調節物質に対するポリクローナル抗体、神経調節物質に対するモノクローナル抗体、それらのフラグメントおよびそれらの混合物からなる群より選択される、標識した免疫化学的反応性成分を利用しうる。
【０１０５】
本発明は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、ＩｇＭサブタイプの抗体およびそれらの単量体、またはそれらの混合物および／または活性フラグメントを含む、本発明の抗体、特に自己抗体の、画像化およびインビボ診断への適用における使用および適用に関する。そこで、前記抗体は、特に乏突起膠細胞を含む、中枢神経系の構造および細胞に結合するそれらの能力により、中枢神経系を含む神経系の特徴付けおよび、特に多発性硬化症を含む、神経疾患の診断、モニタリングおよび評価のための画像化剤または画像化分子として、免疫蛍光、放射性および他の診断に適するタグを通して利用できる。前記抗体はさらに、卒中、脊髄損傷およびアルツハイマー病を含む様々な痴呆の診断、モニタリングおよび評価における画像化剤または画像化分子として利用しうる。インビボでの画像化における使用のために抗体にカップリングするか、または結合するための十分且つ適切な免疫蛍光、放射性または他の標識分子または物質は周知であり、当業者の技術的範囲内である。
【０１０６】
本発明はまた、ヒトにおける多発性硬化症などの哺乳動物における脱髄疾患、および感染後脳脊髄炎のようなヒトおよび家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を、ｒＨＩｇＭ２２としてここで述べる組換えヒト抗体並びにＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ７９．０８、Ｏ１、Ｏ４、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１モノクローナル抗体、およびヒト自己抗体ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６、ハプテンを含むそれらの類似体、それらの活性フラグメント、またはそれらの特徴を有する天然または合成自己抗体を使用して治療する方法に関する。脱髄疾患の発症または進行を抑制するための、これらのｍＡｂ、それらの活性フラグメント、または同じ特徴を有する他の天然または合成自己抗体を使用した予防的治療の方法も本発明に包含される。
【０１０７】
中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン形成細胞である乏突起膠細胞（ＯＬ）は、脳室下領域の神経外胚葉細胞として発生し、その後移動して成熟し、ミエリンを産生する。乏突起膠細胞の連続的な発達は、十分に特性付けられた分化段階特異的マーカーによって特定される。乏突起膠細胞／３型星状膠細胞（Ｏ−２Ａ）前駆細胞と称される、増殖および移動性双極前駆細胞は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ＧＤ３およびＡ２Ｂ５によって特定される［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６（１９７９），４９１３−４９１７］。多極、移動後および増殖細胞によって特徴付けられる次の発達段階は、ｍＡｂ Ｏ４によって認識される［Ｇａｒｄら、Ｎｅｕｒｏｎ，５（１９９０），６１５−６２５；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３（１９８１），３１１−３２７］。さらなる発達は、ｍＡｂ Ｏ１によって認識されるガラクトセレブロシドの細胞表面発現によって［Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，３９（１９８２）、１−８；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］、として２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホヒドロラーゼの発現によって規定される。最も成熟した細胞は、ミエリン塩基性タンパク質およびプロテオリピドタンパク質などの最終分化マーカーを発現する。
【０１０８】
乏突起膠細胞発達の段階を特徴付けるために使用されるｍＡｂ（Ａ２Ｂ５、Ｏ１およびＯ４）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをニワトリ胚網膜細胞またはウシ脳梁のホモジネートで免疫することによって作製された［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、前出；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］。Ａ２Ｂ５は、Ｏ−２Ａ前駆細胞だけでなくニューロンも認識し、細胞表面ガングリオシドＧＱ１ｃ［Ｋａｓａｉら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２７７（１９８３）、１５５−１５８］および他のガングリオシド［Ｆｒｅｄｍａｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２３３（１９８４）、６６１−６６６］と反応する。Ｏ４は、スルファチド、セミノリピドおよびコレステロールと反応し［Ｂａｎｓａｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２４（１９８９），５４８−５５７］、一方Ｏ１は、ガラクトセレブロシド、モノガラクトシル−ジグリセリドおよびサイコシンと反応する［Ｂａｎｓａｌら、前出］。これらのｍＡｂはＩｇＭ免疫グロブリン（Ｉｇ）サブクラスに属し、細胞質構造並びに乏突起膠細胞の表面抗原を認識する［Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、前出；Ｓｏｍｍｅｒら、前出］。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨＳＢ−２ Ｔリンパ芽球細胞の膜懸濁液で免疫することによって作製されるマウスｍＡｂ ＨＮＫ−１（抗Ｌｅｕ−７）が、ナチュラルキラー細胞についてのマーカーとして最初に報告された［Ａｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２７（１９８１），１０２４−１０２９］。その後、ＨＮＫ−１細胞は神経系と抗原決定基を共有することが示された［Ｓｃｈｕｌｌｅｒ−Ｐｅｔｒｏｖｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ，３０６（１９８３），１７９−１８１］。中枢および末梢ミエリン鞘の両方で認められる、ミエリン関連糖タンパク質上の糖質エピトープは、ＨＮＫ−１と反応する神経組織の主要抗原であることが示された［ＭｃＧａｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３０６（１９８３），３７６−３７８］。しかし、神経組織中の他の糖タンパク質はこのｍＡｂと反応し、その内の一部は胚形成、分化および髄鞘形成において重要である［Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１６（１９８５），７２８−７３０；Ｋｒｕｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１１（１９８４），１５３−１５５；Ｋｒｕｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１６（１９８５），１４６−１４８；ＭｃＧａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（１９８５）、１０１−１１４］。興味深いことに、ＨＮＫ−１は細胞質構造とも反応し、ＩｇＭ Ｉｇサブクラスに属する。
【０１０９】
その全体が参照としてここに組み込まれる、特許出願第Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２３６，５２０号において本出願の発明人の一部が開示し、特許請求する、ＳＣＨ９４．０３と称されるモノクローナル抗体は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）に慢性感染したマウスにおいて中枢神経系の髄鞘再形成を促進することが認められた［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１９９４）、６２３０−６２３８］。ＳＣＨ９４．０３は、ＩｇＭ（κ）Ｉｇサブクラスに属し、乏突起膠細胞上の未知の表面抗原を認識するが、すべての細胞における細胞質抗原も認識する（Ａｓａｋｕｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，製版段階）。ＥＬＩＳＡによるＳＣＨ９４．０３の多反応性、および非突然変異Ｉｇ可変領域生殖細胞系配列は、ＳＣＨ９４．０３が天然自己抗体であることを示唆した［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４（１９９４）、６２３０−６２３８］。ＳＣＨ９４．０３の綿密な試験、および周知の乏突起膠細胞反応性ｍＡｂであるＡ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＨＮＫ−１との比較は、これらが天然自己抗体である可能性を提起した。Ｉｇ可変領域ｃＤＮＡ配列のその後の分析およびＥＬＩＳＡによるこれらのｍＡｂの多反応性は、これが同様の有用性を有する天然自己抗体の属群であることを確認した。
【０１１０】
モノクローナル抗体、すなわちここでＳＣＨ９４．０３（ここではＳＣＨ９４．３２とも称する）およびＳＣＨ７９．０８と称するＩｇＭモノクローナル抗体（どちらも正常哺乳動物（すなわちいかなる脱髄疾患にも感染していない）からの脊髄ホモジネートで免疫した哺乳動物から作製される）の抗原反応性は、その教示が参照としてここに組み込まれる、１９９４年４月２９日出願の前記特許願第Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２３６，５２０号において、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウエスタンブロット法、固相酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびＩｇ可変領域配列決定を含むいくつかの生化学および分子アッセイを用いて特徴付けされ、説明されている。モノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３およびＳＣＨ７９．０８を産生するハイブリドーマは、ブタペスト条約の規定の下で、それぞれ１９９４年４月２８日および１９９６年２月２７日にｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、それぞれＣＲＬ１１６２７およびＨＢ１２０５７のＡＴＣＣアクセッション番号を与えられた。帰宅物質のアベイラビリティーに対するすべての制限は、特許の許諾後取消し不能に取り除かれる。
【０１１１】
天然または生理的自己抗体は、正常では血清中に存在し、自己構造、抗原または細胞に反応性であるまたは結合できることによって特徴付けられる。それらは多反応性であることが多く、しばしばＩｇＭサブタイプであり、非突然変異生殖細胞系遺伝子によってコードされるかあるいはごく僅かなまたはいくつかの配列相違を伴って生殖細胞系遺伝子と実質的に相同である。乏突起膠細胞反応性Ｏ１、Ｏ４、Ａ２Ｂ５およびＨＮＫ−１ ＩｇＭκモノクローナル抗体の免疫グロブリン（Ｉｇ）ｃＤＮＡを配列決定し、これらを公表されている生殖細胞系配列と比較することにより、これらが天然自己抗体であることが決定された。Ｏ１ ＶＨは、再編成されていないＶＨセグメント転写産物Ａ１およびＡ４と同一であり、Ｏ４ ＶＨは３個、ＨＮＫ−１ ＶＨは６個のＶＨコード領域内のＶＨ１０１とのヌクレオチド相違を有していた。Ｏ１のＤセグメントは生殖細胞系ＳＰ２遺伝子ファミリー、ＪＨ４に由来し、一方Ｏ１ ＪＨは生殖細胞系ＪＨ１によってコードされ、１個の沈黙ヌクレオチド変化を有していた。Ｏ１およびＯ４ 軽鎖は、１個の沈黙ヌクレオチド変化を除いて骨髄腫ＭＯＰＣ２１と同一であった。ＨＮＫ−１ Ｖκは、２個の沈黙ヌクレオチド変化を除いて生殖細胞系Ｖκ４１と同一であった。Ｏ１ Ｊκ、Ｏ４ ＪκおよびＨＮＫ Ｊκは、非突然変異生殖細胞系Ｊκ２によってコードされた。これに対し、Ａ２Ｂ５ＶＨは生殖細胞系Ｖ１と７個のヌクレオチド相違を示し、Ａ２Ｂ５ Ｖκをコードする生殖細胞系配列は特定されなかった。Ｏ１およびＯ４は、直接ＥＬＩＳＡによって多数の抗原に対して多反応性であったが、Ａ２Ｂ５は多反応性ではなかった。それ故、Ｏ１、Ｏ４およびＨＮＫ−１ Ｉｇは生殖細胞系遺伝子によってコードされ、天然自己抗体の遺伝子型および表現型を有する。
【０１１２】
（脱髄疾患の治療）
ここで述べる試験の結果は、多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥおよび他の関連中枢神経系脱髄疾患への実際的な適用を有する。自発的中枢神経系型髄鞘再形成（「陰影斑」）のまれな例が多発性硬化症において認められ、時として末梢神経系（ＰＮＳ）型髄鞘再形成が根入口帯近くの脱髄脊髄斑において認められる。乏突起膠細胞は、多発性硬化症における慢性斑の中心部ではまれであるが、それらが不全型髄鞘再形成に結びつく、斑の末梢部で増殖すると思われる。髄鞘再形成の過程は、多発性硬化症において臨床的に認められる自発的寛解および改善と相関しうる。これらの臨床所見は、多発性硬化症において新しいミエリン形成が可能であることを示している。ＴＭＥＶ誘導性脱髄を有するマウスにおいてｍＡｂを使用することによって刺激された髄鞘再形成は、多発性硬化症における治療適用を有望視させる。
【０１１３】
臨床的に重要な点としては、薄いミエリン鞘の形態学的再生が機能回復に寄与するかどうかという問題である。コンピュータでのシミュレーションは、新たなミエリン形成は、不十分な薄い鞘によるものであっても、インパルスの伝導を改善することを示唆する。正常な有髄線維の軸索膜は高度に分化しているので、跳躍性伝導により伝播するためにはランヴィエ絞輪にナトリウムチャネルが高密度で存在する必要がある。試験的エビデンスは、サキシトキシン結合によって明らかにされたように、新たに形成された節が必要な高いナトリウムチャネル密度を発現することを示唆する。現在までのデータは、不十分な薄い鞘によるものであっても髄鞘再形成は、以前の脱髄軸索における伝導を改善することを示唆する。それ故、この形態学的現象を促進するための手法は、機能回復を生じさせる潜在的可能性を有する。
【０１１４】
ここで示すデータは、初めて、哺乳動物への組換えヒトモノクローナル抗体の投与がインビボで中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激できることを明らかにする。特に、５００ｎｇという低用量のｒＨＩｇＭ２２によるＴＭＥＶ慢性感染マウスの治療は、対照ｍＡｂで治療したマウスに比べて中枢神経系有髄化の総面積の有意な上昇をもたらした。
【０１１５】
ヒト抗体の使用は、治療抗体に対するヒト免疫応答の潜在的可能性を回避する。非ヒト動物に由来する治療抗体は、個人にとって重大且つ有害でありうる免疫応答を生じさせることが示されている。そこで、ポリクローナルヒトＩｇＭおよびポリクローナルヒトＩｇＧをインビボでの脊髄脱髄の２つのモデル：慢性ウイルス感染モデルおよび急性毒性モデルにおいて試験した。両方のモデルにおいて、ヒトＩｇＭを投与した動物は、ポリクローナルヒトＩｇＧで処置した動物よりも有意に高い密度の新たに髄鞘形成された軸索を有していた。ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体のパネルも、中枢神経系に特異的な表面抗原との反応性に基づいて、特定された。これらのヒト抗体は、脱髄疾患を有する哺乳動物に投与したとき、ポリクローナルヒトＩｇＧ抗体よりも有意に多くの中枢神経系髄鞘再形成を促進する。ヒトモノクローナル抗体は、抗原的に多反応性であり、乏突起膠細胞の表面の抗原決定基およびニューロンの特定個体群を認識する。髄鞘再形成を促進するいくつかのヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域が配列決定されている。特に、これらの抗体は、培養中のグリア細胞（乏突起膠細胞および星状膠細胞）においてカルシウム流入を誘導することができ、グリア細胞を通しての直接結合とシグナル伝達を示唆する。これらのヒト抗体はヒト白質と結合し、ヒトにおける髄鞘再形成を促進する上で有効であると考えられる。治療薬としての使用のための組換えモノクローナル抗体の利点は、１）抗体を、宿主感染を伴わずに増殖させることができる、および２）抗体を、その有効性を変化させるようにインビトロで遺伝的に変更することができる、ことである。
【０１１６】
そこで、ここで述べる試験の結果として、本発明の方法は、脱髄疾患に罹患した、ヒトおよび家畜を含む哺乳動物を治療するため、および中枢神経系軸索の髄鞘再形成および再生を刺激するため、並びに神経保護を与えるために使用することができる。ここで述べるように、モノクローナル抗体またはペプチドフラグメント、ハプテンまたは等価物の有効量を従来の投与経路によって、特に静脈内（ｉｖ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、投与することができる。ここで述べるように、治療組成物およびワクチンが考慮され、それらを調製して、投与しうる。抗体の有効量は、治療する哺乳動物の大きさ、疾患の重症度、投与経路、および治療課程（ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に依存して異なりうる。例えば、投与する抗体の各々の用量は、本発明に従った例示的な非制限的範囲として、約１．２５−約２．５μｇ／ｋｇの範囲をとりうる。抗体の用量はまた、投与経路にも依存する。治療課程は、抗体の投与の頻度（例えば毎日、週に１回、または２週に１回）および治療の期間（例えば４週間から４ヶ月間）を含む。そこで、例えば、より少量のｍＡｂを４ヶ月間投与するのに対し、より高用量のｍＡｂを４−５週間毎日投与することができる。
【０１１７】
投与するモノクローナル抗体の量の有効性は、哺乳動物の全体的外観、哺乳動物の活動および哺乳動物の麻痺の程度を含む、例えばここで実施例において述べるような、多くの臨床判定基準を用いて評価することができる。ヒトにおいて髄鞘再形成を誘導するために必要なモノクローナル抗体の量の有効性も、二重盲検対照試験において評価できる。脱髄疾患からの固定した神経障害を有する患者をモノクローナル抗体または対照物質で治療することができる。定量的生体力学筋肉試験によって検出されるような等尺性筋力の改善が一次治療エンドポイントとして使用できる。
【０１１８】
髄鞘再形成を促進するインビボでの方法に加えて、中枢神経系軸索における髄鞘再形成を刺激する半ビボでの方法も本発明に包含される。例えば、乏突起膠細胞などのグリア細胞の増殖および／または分化を刺激するためにモノクローナル抗体をインビトロで使用しうる。これらの外因性グリア細胞を、次に、公知の手法を用いて哺乳動物の中枢神経系に導入することができる。中枢神経系軸索の髄鞘再形成は、存在する内因性グリア細胞の数を増加させることによって上昇する（乏突起膠細胞などのグリア細胞はミエリンの産生において重要な役割を果たす）。
【０１１９】
グリア細胞を生産するか、または混合培養（例えばラット視神経細胞またはラット脳細胞培養）からグリア細胞の増殖を刺激するインビトロでの方法も本発明に包含される。例えば、グリア細胞を含む、ラット視神経またはラット脳から得た細胞を、細胞の増殖を促進するために十分な条件下で混合培養として培養する。次に、ｒＨＩｇＭ２２またはｓＨＩｇＭ４６またはＳＣＨ９４．０３またはそれらの組み合せなどの、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を促進することができるｍＡｂの有効量を細胞の混合培養に加え、細胞の成長および増殖のために十分な条件下に維持する。ｍＡｂは、ｍＡｂの存在下で培養したグリア細胞の増殖を刺激し、その増殖は、ｍＡｂの不在下で成長したグリア細胞の増殖に比べて高い。
【０１２０】
上述したように、本発明の方法における使用のための抗体は、薬剤、すなわち薬学的組成物として投与でき、好ましくは投与される。そこで、ポリクローナルＩｇＭ抗体の有効量を、生理的緩衝液または食塩水などの、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるまたはそれらで希釈することができる。モノクローナル抗体の有効量を、生理的緩衝液または食塩水などの、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるまたはそれらで希釈することができる。１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体の組み合せの有効量を、同様に適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせるかまたはそれらで希釈してもよい。ワクチンを製造する場合は、本発明のモノクローナル抗体または等価活性物質を医薬的に有効で適切なキャリアまたはアジュバントと共に調製し、熟達した医師に既知である免疫のための標準的手法に従って投与のためのプロトコールを実施しうる。
【０１２１】
動物およびヒトへの投与のために本発明の方法において使用される薬学的組成物は、医薬用キャリアまたは賦形剤と組み合わせてポリクローナルＩｇＭ抗体またはモノクローナル抗体を含有する。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、２つ以上の、好ましくは２つの、本発明のモノクローナル自己抗体を含有しうる。そこで、例えばｓＨＩｇＭ２２とｓＨＩｇＭ４６の組み合せの有効量を含有する薬学的組成物がここで考慮される。そのような組成物は、２つ以上のモノクローナル自己抗体の存在が同じ治療組成物または方法における他方の活性を増強しうるという点で有利である。
【０１２２】
薬剤は、本発明の化合物を含有する錠剤（ロゼンジおよび顆粒剤を含む）、糖衣丸、カプセル、丸剤、アンプルまたは坐薬の形態でありうる。
【０１２３】
好都合には、前記組成物は、各々の単位が有効成分の固定用量を供給するように適合されている、投与単位として製剤される。錠剤、被覆錠剤、カプセル、アンプルおよび坐薬は、本発明に従った好ましい投与形態の例である。有効成分が有効量を構成する、すなわち適切な有効用量が単回または複数回の単位投与において使用される用量形態と一致することが唯一必要である。正確な個々の用量並びに一日の用量は、言うまでもなく、医師または獣医の指示の下に標準的医療原則に従って決定される。
【０１２４】
モノクローナル抗体はまた、水性または非水性希釈剤中の活性化合物の懸濁液、溶液および乳剤、シロップ、顆粒または粉末としても投与できる。
【０１２５】
錠剤、糖衣丸、カプセルおよび丸剤を形成するように適合された活性化合物を含有する薬学的組成物（例えば顆粒）において使用できる希釈剤は、以下を含む：（ａ）充填剤および増量剤、例えばデンプン、糖類、マンニトールおよびケイ酸；（ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン；（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム；（ｅ）溶解を遅延させるための物質、例えばパラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（ｇ）界面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；（ｈ）吸着性キャリア、例えばカオリンおよびベントナイト；（ｉ）潤滑剤、例えば滑石、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムおよび固体ポリエチレングリコール。
【０１２６】
活性化合物を含有する錠剤、糖衣丸、カプセルおよび丸剤は、乳白剤を含みうる、慣例的な剤皮、エンベロープおよび保護基質を有しうる。それらは、おそらく一定期間にわたって、有効成分だけを放出するか、または好ましくは腸管の特定部分において有効成分を放出するように構成されうる。剤皮、エンベロープおよび保護基質は、例えばポリマー物質またはろうから作製されうる。
【０１２７】
坐薬を形成するように適合された薬学的組成物において使用される希釈剤は、例えばポリエチレングリコールおよび脂肪（例えばココア油および高エステル［例えばＣ１６−脂肪酸を有するＣ１４−アルコール］）などの通常の水溶性希釈剤またはこれらの希釈剤の混合物でありうる。
【０１２８】
溶液および乳剤である薬学的組成物は、例えば、溶媒、溶解補助剤および乳化剤などの慣例的な希釈剤（言うまでもなく、界面活性剤が存在する場合を除いて、２００未満の分子量を有する前述の溶媒は例外とする）を含みうる。そのような希釈剤の特定の非制限的例は、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば落花生油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビトールの脂肪酸エステルまたはそれらの混合物である。
【０１２９】
非経口投与に関しては、溶液および懸濁液は、アンプルに収められた無菌の、例えば水または落花生油、であるべきであり、そして適切な場合は、血液等張性であるべきである。
【０１３０】
懸濁液である薬学的組成物は、液体希釈剤、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、界面活性剤（例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル）、微血漿セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはそれらの混合物などの通常の希釈剤を含有しうる。
【０１３１】
薬学的組成物はまた、着色料および防腐剤、並びに香料および香味添加物（例えばペパーミント油およびユーカリ油）、および甘味料（例えばサッカリンおよびアスパルテーム）を含有しうる。
【０１３２】
薬学的組成物は一般に、総組成物の重量の０．５−９０％の有効成分を含む。
【０１３３】
モノクローナル抗体に加えて、薬学的組成物および薬剤はまた、他の医薬活性化合物、例えばステロイド、抗炎症薬等を含有することができる。
【０１３４】
本発明の薬剤中の希釈剤は、薬学的組成物に関して前述したもののいずれであってもよい。そのような薬剤は、単独希釈剤として分子量２００未満の溶媒を含みうる。
【０１３５】
ポリクローナルＩｇＭ抗体およびモノクローナル抗体は、経口的、非経口的（例えば筋肉内、腹腔内、皮下、経皮または静脈内経路）、直腸経路または局所的に投与され、好ましくは経口的または非経口的に、特に舌下または静脈内経路で投与される。
【０１３６】
投与経路は、治療するヒトまたは動物の性質および体重、治療に対する前記被験者の個々の反応、有効成分が投与される製剤のタイプ、投与を実施する様式、および疾患の進行の段階または投与の間隔の関数である。そこで、一部の場合には、最小用量割合より少用量未満を使用すれば十分であり、また別の場合には、所望の結果を達成するには上限を超えなければならないこともある。より多くの量を投与する場合は、これらを１日の間に数回の個別投与に分けることが勧められる。
【０１３７】
本発明によれば、本発明の治療組成物の１つまたはそれ以上の成分を、非経口的に、髄腔内に、経粘膜的に、例えば経口的、経鼻的、肺経路で、または直腸経路で、または経皮的に、導入しうる。好ましくは、投与は非経口的であり、例えば静脈内注射によって実施され、また動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内投与も含むが、これらに限定されない。経口または肺送達は粘膜免疫を活性化するために好ましいと考えられる；治療下の症状についての起因菌は鼻咽頭および肺粘膜にコロニー形成するので、粘膜投与は治療として特に有効でありうる。本発明の治療組成物に関して使用するとき「単位用量」という用語は、各々の単位が、必要な希釈剤、すなわちキャリアまたは賦形剤と共同して所望の治療効果を生じるように算定された所定の量の活性物質を含有する、ヒトのための単位別投薬として適する物理的に別個の単位を指す。
【０１３８】
別の実施形態では、活性化合物を小胞中で、特にリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒより，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎとＦｉｄｌｅｒ（編集）、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同上、ｐ．３１７−３２７参照；一般に同上参照）。
【０１３９】
さらに別の実施形態では、治療組成物を制御放出システム中で送達することができる。例えばポリペプチドは、静脈内持続注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与しうる。１つの実施形態では、ポンプを使用しうる（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅ（編集）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒとＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；またＬｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出システムを治療標的、すなわち脳の近くに設置することができ、それ故全身用量の分画だけしか必要としない（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅより、前出、ｖｏｌ．２，ｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。好ましくは、制御放出装置を被験者の不適切な免疫活性化の部位または腫瘍の付近に導入する。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））の中で論じられている。
【０１４０】
上述した活性成分の投与が、一部の場合には細菌感染を含む、中枢神経系に関連する症状または疾患のための有効な治療レジメンの被験者は、好ましくはヒトであるが、いかなる動物でもありうる。そこで、当業者には容易に認識できるように、本発明の方法および薬学的組成物は、ネコまたはイヌ被験者などのペット動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタ被験者などの、但しこれらに限定されることなく家畜、野生動物（野生で存在するかまたは動物園内にいるかに関わらず）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等のような、すなわち獣医学的用途のための、研究動物を含むが、いかなる意味においてもこれらに限定されない、何らかの動物、特に哺乳動物への投与に特に適する。
【０１４１】
本発明の治療方法および組成物において、活性成分の治療有効用量が提供される。治療有効用量は、患者の特徴（年齢、体重、生物、症状、合併症、他の疾患等）に基づいて医療従事者によって決定されうるが、また当技術分野においても周知である。さらに、さらなる常用試験を実施するほど、様々な患者における様々な症状の治療のための適切な用量レベルに関するより詳細な情報が得られ、当業者は、受容者の治療背景、年齢および全身状態を考慮して、適切な用量を確認することができる。一般に、静脈注射または持続注入については、用量は腹腔内、筋肉内または他の投与経路に関する用量よりも低くてよい。投与スケジュールは、循環半減期および使用する製剤によって異なりうる。組成物は、治療有効量の投与剤型と適合させて投与される。投与する必要のある有効成分の正確な量は医師の判断に依存し、各々の個人に特有である。初期投与およびブースター投与のための適切なレジメンも変化しうるが、初期投与とそれに続く１つまたはそれ以上の時間間隔でのその後の注射または他の投与法による反復投与が典型的である。あるいは、１０ナノモルから１０マイクロモルの血液中濃度を維持するのに十分な持続静脈内注入が考慮される。
【０１４２】
（他の化合物との投与）
脱髄症状、例えば多発性硬化症の治療のために、本発明の活性成分を、（１）ステロイドなどの抗炎症薬；（２）ベタセロン；（３）コパキソン；または（４）ポリクローナルＩｇＭ；または（５）メチルプレドニゾロン、を含むがこれらに限定されない、多発性硬化症を治療するために使用される１つまたはそれ以上の薬学的組成物と共に投与しうる。投与は、同時（例えば本発明の活性成分と抗生物質の混合物の投与）、或いは順次行うことが可能である。
【０１４３】
従って、特定の実施形態では、治療組成物は、有効量の活性成分および１つまたはそれ以上の以下の有効成分；抗生物質、ステロイド等、をさらに含みうる。
【０１４４】
本発明の神経調節物質または抗炎症薬に関連しうる作用物質の肺送達もここで考慮される。肺送達のためのタンパク質の製剤についての報告が当技術分野において認められる［Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（補遺５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐ．２０６−２１２（１９８９）（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（１９８９）（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ，３月（１９９０）（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；Ｐｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）］。薬剤の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらへの１９９５年９月１９日発行の米国特許第５，４５１，５６９号に述べられている。
【０１４５】
そのような装置はすべて、接着阻害剤（または誘導体）の配薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各々の製剤は用いる装置のタイプに特異的であり、治療において有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアに加えて、適切な推進薬の使用を含みうる。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、封入複合体、または他の種類のキャリアの使用も考慮される。化学修飾された接着阻害剤も、化学修飾のタイプまたは使用する装置のタイプに依存して種々の製剤中で調製されうる。
【０１４６】
ジェットまたは超音波噴霧器による使用に適する製剤は、典型的には、溶液１ｍｌにつき生物活性物質約０．１−２５ｍｇの濃度で水に溶解した神経調節物質（または誘導体）を含有しうる。製剤はまた、緩衝液と単純な糖（例えば神経調節物質の安定化および浸透圧の調節のため）を含みうる。ネブライザ製剤はまた、エアロゾルを形成するときに溶液の噴霧化によって引き起こされる神経調節物質の表面誘導性凝集を低減するか、または予防するために、界面活性剤も含有しうる。
【０１４７】
定量噴霧式吸入器による使用のための製剤は、一般に、界面活性剤の助けによって推進薬に懸濁された神経調節物質（または誘導体）を含有する微細に分割された粉末を含む。推進薬は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合せなどの、この目的のために使用される従来のいかなる物質でもよい。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタンおよびダイズレシチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用でありうる。
【０１４８】
液体エアロゾル製剤は、生理的に許容される希釈剤中に神経調節物質および分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細分割固体形態の神経調節物質と分散剤からなる。液体または乾燥粉末エアロゾル製剤に関しては、製剤がエアロゾル投与されねばならない。すなわち、エアロゾル化された用量が実際に鼻通路または肺の粘膜に到達することを確実にするために液体または固体粒子に分解されねばならない。「エアロゾル粒子」という用語は、ここでは鼻または肺投与に適する、すなわち粘膜に達する液体または固体粒子を表わすために使用される。送達装置の構築、製剤中の付加的な成分および粒子特徴などの他の配慮も重要である。薬剤の肺投与のこれらの態様は当技術分野において周知であり、製剤の操作、エアロゾル化手段および送達装置の構築は、多くとも当技術分野の通常技術のいずれかによる常套的な試験しか必要としない。特定実施形態では、薬剤粒子が肺胞に到達することを確実にするため、動力学的粒径は５マイクロメーターまたはそれ以下である［Ｗｅａｒｌｅｙ，Ｌ．Ｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８：３３３（１９９１）］。
【０１４９】
本発明の神経調節物質はまた、ここで列挙する自己抗体、ペプチド類似体またはハプテンまたはおそらくそれらの組み合せを活性物質として含有しうる、ワクチンの形態での投与用に調製しうる。そこで、ワクチンの調製は公知の手順に従って実施でき、一価並びに多価ワクチンが考慮される。また、本発明のＤＮＡ分子に基づく、ＤＮＡサブユニットワクチンも調製しうる。すべてのワクチンは医師または臨床家の標準的な慣例に従って投与することができ、そのようなパラメータは本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１５０】
例えば本発明に従ったＤＮＡに基づくワクチンを含有するベクターを、当技術分野で公知の方法によって、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンまたはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主に導入することができる（例えばＷｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕとＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照）。
【０１５１】
ワクチンは、筋肉内、腹腔内、静脈内等を含むが、これらに限定されない、何らかの非経口経路によって投与できる。好ましくは、ワクチン接種の所望の結果は抗原への免疫応答、およびそれによって病原生物への免疫応答を明らかにすることであるので、リンパ組織、例えばリンパ節または脾臓への、直接投与あるいはターゲティングまたはウイルスベクターの選択による間接的な投与が望ましい。免疫細胞は絶えず複製しているので、レトロウイルスは複製細胞を必要とするため、それらはレトロウイルスベクターに基づく核酸ワクチンの理想的な標的である。
【０１５２】
抗血清、ポリクローナル抗体または中和モノクローナル抗体を患者に投与することによって、自己免疫介在性脱髄疾患、例えば多発性硬化症に罹患していることが疑われる動物被験者に受動免疫を与えることができる。好ましくは、受動免疫療法のために投与される抗体は自家抗体である。例えば被験者がヒトである場合、好ましくは、抗体に対する免疫応答の可能性を最小限に抑えるために、抗体はヒト起源であるかまたは「ヒト化」されている。本発明の能動または受動ワクチン、またはアドヘシンの投与は、グラム陰性菌、好ましくは連鎖球菌、より好ましくは肺炎球菌の感染から動物被験者を保護するために使用できる。
【０１５３】
さらに、本発明は、適切な神経調節物質を、治療のために細胞を標的する、対応する物質の発現を生じさせるまたは上昇させるために対応して導入する、遺伝子療法による治療を考慮する。それ故、１つの実施形態では、神経調節物質、自己抗体、抗体ペプチド等をコードするＤＮＡまたは遺伝子、あるいはそのタンパク質またはポリペプチドドメインフラグメントを、ウイルスベクターを用いてまたはＤＮＡの直接導入を通してインビボ、半ビボまたはインビトロで導入する。標的組織における発現は、ウイルスベクターまたは受容体リガンドなどでトランスジェニックベクターを特定細胞に標的することによって、または組織特異的プロモーターを使用することによって、またはその両方によって実現することができる。
【０１５４】
インビボまたは半ビボでのターゲティングおよび治療処置のために一般的に使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用するための方法は当技術分野において公知である［例えばＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９９２）参照］。
【０１５５】
ＤＮＡウイルスベクターは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等を含むがこれらに限定されない、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを包含する。完全にまたはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後は感染性ではない。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染することがあるという懸念を伴わずに、特定の局在領域内の細胞への投与を可能にする。それ故、脂肪組織を特異的に標的することができる。特定ベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクター［Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０（１９９１）］、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター［特許公開第ＲＤ３７１００５ Ａ号］、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター［１９９４年９月２９日公開の国際公開広報第ＷＯ９４／２１８０７号；１９９４年４月２日公開の国際公開広報第ＷＯ９２／０５２６３号］；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０（１９９２）；Ｌａ Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）も参照のこと］によって述べられたベクターのような弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター［Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．：３９８８−３９９６（１９８８）］を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
好ましくは、インビボ投与に関しては、ウイルスベクターおよびトランスフェクト細胞の免疫非活性化を回避するため、適切な免疫抑制治療をウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと共に使用する。例えば、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を阻止するためにインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制サイトカインを投与することができる［例えばＷｉｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）］。加えて、最小数の抗原を発現するように構築されたウイルスベクター使用することが好都合である。
【０１５７】
別の実施形態では、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる、１９９５年３月１６日公開の国際公開広報第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に述べられているように、ＤＮＡまたは遺伝子をレトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するようにまたは単回のトランスフェクションを受けるように構築することができる。前者の場合は、ウイルスを、腫瘍形成形質転換特性の原因となるものを除き、その遺伝子のすべてを保持し、異種遺伝子を発現するように修飾する。ウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、異種遺伝子とパッケージングシグナルを含むように構築された共導入ウイルスをパッケージングするために必要な構造遺伝子は保持する、非感染性ウイルスベクターを作製する。それ故、生産されるウイルス粒子はさらなるウイルスを生産することができない。
【０１５８】
標的遺伝子の送達は、１９９５年１０月公開の国際公開広報第ＷＯ９５／２８４９４号に述べられている。
【０１５９】
あるいは、リポフェクションによってインビボでベクターを導入することができる。この１０年間、インビトロでの核酸の被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用は上昇し続けてきた。リポソームを介したトランスフェクションに関して遭遇する困難と危険性を制限するように設計された合成カチオン脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを作製するために使用できる［Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１（１９８８）；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８（１９９３）参照］。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の被包を促進することができ、また負に荷電した細胞膜との融合も促進しうる［ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８（１９８９）］。外来性遺伝子をインビボで特定器官に導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実際的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子ターゲティングは１つの利点を示している。トランスフェクションを特定細胞型に差し向けることは、膵臓、肝臓、腎臓および脳などの細胞異質性を有する組織において特に好都合であることは明らかである。脂質は、ターゲティングのために他の分子に化学結合しうる［Ｍａｃｋｅｙら、前出参照］。標的ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学結合することができる。
【０１６０】
ベクターをインビボで裸のＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法によって、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞に導入することができる［例えばＷｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕとＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０（１９９１）参照］。受容体を介在したＤＮＡ送達アプローチも使用できる［Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；ＷｕとＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）］。
【０１６１】
本発明の好ましい実施形態では、上述したような遺伝子治療ベクターは、例えば本発明の自己抗体によって認識されるＤＮＡコンセンサス配列を含む転写調節配列、すなわちベクター内に挿入された治療的異種遺伝子に作動可能に連結された、抗体結合部位を使用する。すなわち、本発明の特異的発現ベクターは遺伝子治療において使用することができる。
【０１６２】
本発明は、材料、化合物および組成物の調製および本発明を例示する方法の開発と実施を説明する、以下の非制限的実施例を考察することによってよりよく理解される。この開示の目的および意図から逸脱することなく、材料および方法の両方について多くの変更を実施しうることは当業者には明白である。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に説明するために提示するものであり、また本発明の実施のために既知の最良の方式を提示するという出願人の義務を履行する役割を果たし、いかなる意味においても本発明を広範囲に制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１：組換えｓＨＩｇＭ２２を使用した用量設定試験（試験Ｎｏ．１））
（マウス）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た４−６週齢の雌性ＳＪＬ／Ｊマウスに、１０μｌ中２×１０５プラーク形成単位のダニエル株ＴＭＥＶを大脳内注射した。感染動物に、ＴＭＥＶ感染後６ヶ月目に種々の濃度のｒＨＩｇＭ２２またはＰＢＳの単回５００μｌ腹腔内（ＩＰ）注射を実施した。１つの群には、５週間後に追加の５００μｇ用量のｒＨＩｇＭ２２を投与した。２つの群のマウスには、毎週１回メチルプレドニゾロン２ｍｇを投与した。各々の群について１０匹のマウスを使用した。治療の５または１０週間後に、脊髄における髄鞘再形成の定量的分析のために動物を供犠した。
【０１６４】
最小有効用量を決定するため、ＴＭＥＶに慢性感染したマウスにおいてＲｓＨＩｇＭ２２の用量設定試験を実施した。治療の５週間後、脊髄を切除し、脱髄および髄鞘再形成に関して等級づけた。結果を図１に直接示し、同用量を摂取した被験者に関して分類したスコアの平均値の比較を図２に示す。
【０１６５】
結果の検討から、０．２５ｍｇ／ｋｇまでのＲｓＨＩｇＭ２２のすべての用量において、食塩水対照群よりも有意に大きな面積の髄鞘再形成が生じていた（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。これは、本発明の抗体が妥当な用量で治療上適切な作用を提供する能力を明らかにする。
【０１６６】
加えて、ＲｓＨＩｇＭ２２および週に２ｍｇのメチルプレドニゾロンを投与動物は、より低レベルの脱髄（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）並びに高レベルの髄鞘再形成を示した。ステロイドは、髄鞘再形成性ヒトｍＡｂの潜在的受容者である、急性の増悪を生じた多くの患者のための一次治療方法であるので、これは重要である。さらに、これらの結果は、メチルプレドニゾロンなどのステロイドと本発明の抗体を含有する組成物の製造および投与、あるいは別々であるが結合したまたは連続的な投与のための、ステロイドと抗体を含有する組成物の製剤および投与に関する本発明の態様が、ここで示した有益な結果を生じうることを示唆する。
【０１６７】
これらの結果は、ＲｓＨＩｇＭ２２が古典的増殖因子に必要な範囲内の濃度で作用しうることを明らかにする。
【０１６８】
（実施例２： より低用量のｒＨＩｇＭ２２単独またはメチルプレドニゾロンとｒＨＩｇＭ２２との併用による有効性の試験（試験Ｎｏ．２））
（材料および方法）
（マウス）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た４−６週齢の雌性ＳＪＬ／Ｊマウスに、１０μｌ中２×１０５プラーク形成単位のダニエル株ＴＭＥＶを大脳内注射した。感染動物に、ＴＭＥＶ感染後６ヶ月目に種々の濃度でのｒＨＩｇＭ２２またはＰＢＳを単回５００μｌで腹腔内（ＩＰ）注射を実施した。１つの群には、５週間後に追加の５００μｇ用量のｒＨＩｇＭ２２を投与した。２つの群のマウスには、毎週２回メチルプレドニゾロン１ｍｇを投与した。各々の群において１０匹のマウスを使用した。治療の５または１０週間後に、脊髄における髄鞘再形成の定量的分析のために動物を供犠した。
【０１６９】
（抗体の単離および配列決定）
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する患者の血清からＩｇＭ抗体を単離し（ｓＨＩｇＭ２２と称する）、記述されているように配列決定した（Ｃｉｒｉｃ，Ｂ．ら（２０００）、Ｂｌｏｏｄ ９７：３２１−３２３）。
【０１７０】
（ｒＨＩｇＭ２２のクローニングおよび試験）
（ベクターの構築）
（１）軽鎖フラグメント）
軽鎖の可変領域（ＶＬ）を、ｓＨＩｇＭ２２のソースである患者の末梢血白血球から単離した抗体ｍＲＮＡに由来するＴＡクローン化ＶＬフラグメントから増幅した。ヒトゲノムデータベース中のヒトＩｇＭ配列からの５’（−Ｎｈｅ Ｉ部位、５’−ＵＴＲおよび人工リーダー配列（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：８４０７−８４１４）をこの配列に付加した。λ鎖（Ｃλ）の定常領域を、ヒトＣλにおいて認められる付加的な３’−Ａｖｒ ＩＩ部位を有するヒト血液ｃＤＮＡから増幅した。すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｓＨＩｇＭ２２において認められる１つの特定された形態の主要ＩｇＭ種（軽鎖：ＩＩと称する）（Ｃｉｒｉｃ，Ｂ．ら（２０００）、Ｂｌｏｏｄ ９７：３２１−３２３）のために設計された以下のプライマーを使用することにより、標準的な方法によって実施した：
【０１７１】
【化１】
（２）重鎖フラグメント）
ヒトＩｇＭゲノム配列を、ＶＨの両端に２つの固有な部位（５’：Ｒｓｒ ＩＩ、３’：ＰａｃＩ）を付加することによって単離し、クローン化した。ＶＨを、以下のプライマー：
【０１７２】
【化２】
を使用することにより、付加的な人工５’−ＵＴＲおよびヒトゲノムデータベース（１１）からのリーダー配列を有するＴＡクローン化ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨ領域から増幅した。ヒトＩｇＭのＶＨをｓＨＩｇＭ１１のこの増幅ＶＨフラグメントによって置換した。
【０１７３】
（３）デヒドロキシ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）フラグメント）
ｄｈｆｒフラグメントを、ベクターｐＦＲ２０００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．ら（１９８３）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８０：２４９５−２４９９）から標準的なＰＣＲ反応によって増幅し、ｐＣＩＣλに連結した。ｐＣＩＣλのＥａｇＩ消化によってｄｈｆｒと結合したＨＩｇＭ２２ＩＩ 軽鎖を作製し、このフラグメントをｓＨＩｇＭ２２ ＶＨベクター（ｐＤＭ ２２ＢＩＩ）内のＥａｇ Ｉ部位に連結した。このｐＤＭ ２２ＢＩＩベクターの遺伝子順序は、１）重鎖（ゲノム）、２）軽鎖（ｃＤＮＡ）および３）ｄｈｆｒであった。重鎖および軽鎖遺伝子は同じ方向であったが、ｄｈｆｒの方向は反対向きであった。
【０１７４】
（電気穿孔法、メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅、ＥＬＩＳＡおよびＩｇＭ精製）
ｐＤＭ ２２ＢＩＩを電気穿孔法によって２×１０７のＦ３Ｂ６細胞にトランスフェクトした；Ｂｇｌ ＩＩによって線状化したｐＤＭ ２２ＢＩＩ １０ｇを２×１０７のＦ３Ｂ６細胞と混合し、氷上で１０分間、氷冷無血清ＲＰＭＩ ８００ｌに再懸濁して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて９６０Ｆ／２００Ｖで１回パルスし、３０分間氷上にもどして、２５ｃｍ２フラスコに移し、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ ５ｍｌを供給して、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、培地を、ＭＴＸ ０．２μＭを含む新鮮培地に交換し、生存コロニーが出現するまでインキュベーションを続けた。これらのコロニーを２４穴プレートに移し、１Ｍ ＭＴＸ中で培養した。以下で述べるような集密増殖後、これらのクローンに関してＥＬＩＳＡを実施し、さらなる操作のために陽性クローンを選択した。ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＴＭプレートを２０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）で被覆した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によるブロッキング工程後、ｓＨＩｇＭ２２ＢＩＩを発現するＦ３Ｂ６細胞からの上清を１：５００、１：１０００および１：２０００希釈で３回プレートした。精製ヒトＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を標準対照として使用した。インキュベーションおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／１％ツイーン２０による洗浄の後、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）に複合したモノクローナル抗ヒトＩｇＭを１％ＢＳＡ中１：５０００希釈で適用した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を使用して陽性反応を検出し、Ｂｉｏ−Ｒａｄマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍで吸光度を読み取った。ＭＴＸ濃度を、０．２μＭから出発して２ヶ月間にわたって幾何学的に上昇させ、２００ｉＭで終了した。最大抗体産生クローンをＥＬＩＳＡによって判定し、このクローンの培地を収集した。組換えｓＨＩｇＭ２２ＢＩＩのＩｇＭ抗体を、ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）沈殿およびＨ２Ｏに対する透析、それに続くＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムでのサイズ分画の方法によってこの培地から単離した。
【０１７５】
（脱髄／髄鞘再形成に関する脊髄の評価）
脊髄の脱髄および髄鞘再形成の領域を、４％パラ−フェニレンジアミン染色プラスチック包埋横断切片を使用して視覚化した。脊髄全体の代表的試料を得るために、３連続１ｍｍブロックごとに１μｍの薄い切片を切り出した。これにより、頸部、胸郭、腰部および仙椎脊髄からの試料を代表する１０−１２の横断切片を生成した。等級付けるために、各々の脊髄切片を視覚的に４つの四分円に分け、その後各々の四分円を脱髄または髄鞘再形成病変の存在または不在に関して採点した。すべてのスライドガラスをコード化し、ブラインドで読み取った。すべてのスライドガラスを等級付けた後、データを投与群にまとめた。病変全体が基本的に修復されているとき、その病変は髄鞘再形成されていると判定した。部分的に髄鞘再形成された病変は陰性と採点した。髄鞘再形成のレベルを以下のように算定した：（髄鞘再形成を有する四分円の数／脱髄四分円の総数）×１００。分類したデータを、カイ二乗統計分析を用いて評価した。
【０１７６】
（免疫組織化学）
成体ＳＪＬマウス小脳の切片を先述のように調製した（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．ら（１９９２）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．３３：３３８−３５３）。簡単に述べると、新鮮小脳を３％低融解温度アガロースに包埋し、Ｎｏ．２ Ｗｈａｔｍａｎフィルターにのせて、３００μｍの矢状断切片に切断した。次に切片を４８穴組織培養プレートに移した。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝Ｅａｒｌｅ（登録商標）平衡塩類溶液（Ｅ／Ｈ、ｐＨ７．４）中で５％ＢＳＡと共に２−３時間インキュベートした後、Ｅ／Ｈ中で、静かに揺り動かしながら４℃で少なくとも３時間、１％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌの一次抗体で標識した。Ｅ／Ｈで洗浄した後、切片を適切な二次抗体で染色し、洗浄して、その後手早くＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。スライドガラスを、２．５％１，４−ジアゾビシクロ−［２．２．２］−オクタン（ＤＡＢＣＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＭＯＷＩＯＬ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に封入し、エピ蛍光顕微鏡で観察した。混合一次グリア細胞および精製乏突起膠細胞を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット新生児から先に記述されているように（Ａｓａｋｕｒａ，Ｋ．ら（１９９７）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６８：２２８１−２２９０）調製した。細胞をポリ−Ｄ−リシン被覆またはポリ−Ｌ−オルニチンカバーガラスにプレートした。３％正常ヤギ血清を含むＥ／Ｈでブロッキングした後、非固定細胞に対して生細胞表面染色を４℃で１５分間実施した。結合一次抗体（Ａｂ）を蛍光複合二次Ａｂで検出した。スライドガラスを封入し、上述したように観察した。
【０１７７】
（ｒＨＩｇＭ２２の精製）
ｒＨＩｇＭ２２でトランスフェクトしたＦ３Ｂ６細胞を、ローラーボトルにおいて１０μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を添加したＲＰＭＩ／１０％熱不活性化ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中で増殖させた。十字流ろ過（ＴＦＦ）によって順化培地を０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質に濃縮した。濃縮順化培地をｄＨ２Ｏに対して一晩透析し、ＩｇＭ抗体を沈殿させた。ペレットを５０ｍＭトリス（トリズマ塩基）、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖベタイン中に再懸濁した。再懸濁したペレットをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（２６／６０）カラムに負荷し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ベタインで溶出した。溶出プロフィールは、およそ２つの主要ピーク：ＨＭＷ（約８０％）およびＬＭＷ（約２０％）から成った。ＨＭＷピークにおいて五量体ＩｇＭを認めた。プールＧＦ分画を〜０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し（Ａ２８０）、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（最終製剤緩衝液）に対して透析した。
【０１７８】
（結果）
この試験では、単一有効成分またはメチルプレドニゾロンなどのステロイドとの組み合せとして抗体濃度のより大きな低下で有効用量が達成できるかどうかを判定するためにさらなる試験を実施した。その結果は、用量のさらに大きな低下および結果として生じる利益が可能であることを確認する（図３および４）。ｒＨＩｇＭ２２は、メチルプレドニゾロンと組み合わせたとき６００μｇの用量で脱髄を予防するのに有効である（図３）。さらにｒＨＩｇＭ２２は、単独で使用したとき５００ｎｇという低用量で髄鞘再形成において有意に有効であり（図４）、またメチルプレドニゾロンと組み合わせて６００μｇの用量で投与したときさらに一層大きな髄鞘再形成能力を示した。
【０１７９】
前記の説明から、当業者には本発明の組成物および方法における様々な修正および変更が生じることになる。付属の特許請求の範囲内に属するそのような修正はすべて、その中に包含されることが意図されている。
【０１８０】
本明細書の中で引用する、特許および特許出願を含むがこれらに限定されないすべての公表文献は、個々の公表文献が、各々その全部が記述されているかのように参照としてここに組み込まれることが特定しておよび個別に指示されているかのごとくに、参照としてここに組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、様々な濃度のｒＨＩｇＭ２２、プラセボ、メチルプレドニゾロン単独およびｒＨＩｇＭ２２との組み合せに関する、比較用量設定試験の結果のグラフである。
【図２】図２は、用量設定試験における被験者群の平均スコアのグラフである。
【図３】図３は、メチルプレドニゾロンと組み合わせたｒＨＩｇＭ２２が髄鞘再形成を促進し、損傷負荷を軽減することを示すグラフである。
【図４】図４は、様々な濃度のｒＨＩｇＭ２２に関する比較用量設定試験の結果のグラフである。
【図５】図５は、ｓＨＩｇＭ２２の重鎖の可変領域配列を示す。配列は、出版物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｖｏｌ Ｉ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎの中のヒトＶＨ配列の番号付けシステムに従って整列している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨは、ＶＨサブグループＩＩＩの成員である。下線を付したアミノ酸はタンパク質配列決定によって確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ２２ヌクレオチド配列に対応する。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＡおよびＢ配列は、ＩＧＨＶ３−３０／３−３０−０５＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２およびＩＧＨＤ２−２１＊０２生殖細胞系配列とは異なるヌクレオチドに関してのみ示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＢのタンパク質配列における２個のアミノ酸置換を太字で示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶＨタイプＡおよびＢの両方の配列が、ＩＧＨＶ３−３０／３−３０−０５＊０１生殖細胞系配列と最も密接にマッチした（９６％の相同性）。生殖細胞系配列についての参考文献：ＩＭＧＴ、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４］。（創始者およびコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【図６】図６は、ｓＨＩｇＭ２２の軽鎖の可変領域配列を示す。配列は、出版物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｖｏｌ Ｉ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎの中のヒトＶＨ配列の番号付けシステムに従って整列している。Ｖλ ｓＨＩｇＭ２２は、λサブグループＩの成員である。下線を付したアミノ酸はタンパク質配列決定によって確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ２２ヌクレオチド配列に対応する。ｓＨＩｇＭ２２ ＶλタイプＩおよびＩＩ配列は、ＩＧＬＶ１−５１＊０１およびＩＧＬＪ３＊０１生殖細胞系配列とは異なるヌクレオチドに関してのみ示している。ｓＨＩｇＭ２２ ＶλタイプＩＩのタンパク質配列における２個のアミノ酸置換を太字で示している。ｓＨＩｇＭ２２からのＶλ配列は、ＩＧＬＶ−５１＊０１生殖細胞系配列と最も密接にマッチした（９７％の相同性）。２個の遺伝子は、１個のヌクレオチド変化によってそれらの共通祖先と異なる。生殖細胞系配列についての参考文献：ＩＭＧＴ、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４］。（創始者およびコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、Ｃｂ２ＢＧ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体、ならびに、薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤を含有する薬学的組成物であって、約５００ｎｇ〜約６００μｇに相当するか、またはそれに等しい用量範囲での送達のために調製される、薬学的組成物。
【請求項２】
前記用量が、約５００ｎｇである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記用量が、約６００μｇである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記用量が、約１．２５μｇ／ｋｇ〜約２．５μｇ／ｋｇの範囲に相当する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記用量が、約２．５μｇ／ｋｇに相当する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記用量が、約１．２５μｇ／ｋｇの範囲に相当する、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ヒト組換え抗体が、ｍＡｂ ＳＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）に相当するか、またはそれから誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ヒト組換え抗体が、ｍＡｂ ＳＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）に相当するか、またはそれから誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物が、約２ｍｇまでのステロイドをさらに含有し、該ステロイドが、メチルプレドニゾロンを含むか、またはそれに相当する、請求項１〜８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、約１〜約２ｍｇの前記ステロイドを含有する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ステロイドが、メチルプレドニゾロンを含む、請求項９または１０のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
哺乳動物において中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する方法であって、該方法は、乏突起膠細胞を含む、中枢神経系内の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、モノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
哺乳動物において中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する方法であって、該方法は、中枢神経系内の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、ヒトモノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかに記載の方法であって、該方法は、ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＣＢ２ｂ−Ｇ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体の投与を包含する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物において中枢神経系の脱髄疾患を処置するか、または予防する方法であって、該方法は、乏突起膠細胞を含む、中枢神経系内の構造および細胞に結合して、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する能力によって特徴付けられる、モノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、該方法は、ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＣＢ２ｂ−Ｇ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体の投与を包含する、方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、多発性硬化症を有するヒト、あるいは脱髄疾患または中枢神経系の疾患もしくは他の損傷もしくは機能障害を有するヒトまたは家畜である、請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
投与の方法が、静脈内投与、腹腔内投与、鞘内投与、皮下投与、舌下投与、筋肉内投与、直腸投与、呼吸器投与および鼻咽頭投与から選択される、請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、Ｃｂ２ＢＧ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体、ならびに、薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤を含有する薬学的組成物であって、約５００ｎｇ〜約６００μｇに相当するか、またはそれに等しい用量範囲での送達のために調製される、薬学的組成物。
【請求項２】
前記用量が、約５００ｎｇである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記用量が、約６００μｇである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記用量が、約１．２５μｇ／ｋｇ〜約２．５μｇ／ｋｇの範囲に相当する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記用量が、約２．５μｇ／ｋｇに相当する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記用量が、約１．２５μｇ／ｋｇの範囲に相当する、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ヒト組換え抗体が、ｍＡｂ ＳＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）に相当するか、またはそれから誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ヒト組換え抗体が、ｍＡｂ ＳＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）に相当するか、またはそれから誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物が、約２ｍｇまでのステロイドをさらに含有し、該ステロイドが、メチルプレドニゾロンを含むか、またはそれに相当する、請求項１〜８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、約１〜約２ｍｇの前記ステロイドを含有する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ステロイドが、メチルプレドニゾロンを含む、請求項９または１０のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
哺乳動物において中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する方法であって、該方法は、乏突起膠細胞を含む、中枢神経系内の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、モノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
哺乳動物において中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する方法であって、該方法は、中枢神経系内の構造および細胞に結合する能力によって特徴付けられる、ヒトモノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかに記載の方法であって、該方法は、ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＣＢ２ｂ−Ｇ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体の投与を包含する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物において中枢神経系の脱髄疾患を処置するか、または予防する方法であって、該方法は、乏突起膠細胞を含む、中枢神経系内の構造および細胞に結合して、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激する能力によって特徴付けられる、モノクローナル抗体、またはこれらの混合物、単量体、活性フラグメント、またはこれらに由来する組換え抗体の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、該方法は、ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２（ＬＹＭ２２）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｓＨＩｇＭ４６（ＬＹＭ４６）、ｅｂｖＨＩｇＭ ＣＢ２ｂ−Ｇ８、ＭＳＩ１０Ｅ１０、これらの混合物，これらの単量体、これらの活性フラグメント、これらに対する結合パートナーおよびこれらに由来する組換え抗体からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体の投与を包含する、方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、多発性硬化症を有するヒト、あるいは脱髄疾患または中枢神経系の疾患もしくは他の損傷もしくは機能障害を有するヒトまたは家畜である、請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
投与の方法が、静脈内投与、腹腔内投与、鞘内投与、皮下投与、舌下投与、筋肉内投与、直腸投与、呼吸器投与および鼻咽頭投与から選択される、請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０５１５７（Ｐ２００７−５０５１５７Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３１４７（Ｐ２００６−５３３１４７）
【出願日】平成１６年５月１７日（２００４．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５４３６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３５５
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０２２０４２１８）マヨ ファウンデイション フォア メディカル エデュケイション アンド リサーチ (4)
【出願人】（５０５４２４８４８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１７日（２００４．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５４３６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３５５
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０２２０４２１８）マヨ ファウンデイション フォア メディカル エデュケイション アンド リサーチ (4)
【出願人】（５０５４２４８４８）
【Ｆターム（参考）】
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