ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造
本発明は、マクロファージ特異的レセプターＣＲＩｇ（以前はＳＴＩｇＭＡと呼ばれていたもの）と、補体Ｃ３のＣ３ｂ及びＣ３ｃサブユニットとのその複合体（Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体）の結晶構造の決定に関する。本発明は更にＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストを含むＣＲＩｇに構造的及び／又は機能的に関連する分子をスクリーニングし同定するためのＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ特異的レセプターＣＲＩｇ（以前はＳＴＩｇＭＡと呼ばれていたもの）と、補体Ｃ３のＣ３ｂ及びＣ３ｃサブユニットとのその複合体（Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体）の結晶構造の決定に関する。本発明は更にＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストを含むＣＲＩｇに構造的及び／又は機能的に関連する分子をスクリーニングし同定するためのＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、通常は不活性なプロ酵素形態で存在している一連の血清糖タンパク質から構成される複雑な酵素カスケードである。Ｃ３は、補体の古典的、レクチン及び代替経路の３つの主要な経路の収束点を表すので、補体活性化において重要な役割を果たしている。Ｃ３は２０種を超えるタンパク質と（M. J. Walport, N Engl J Med 344, 1058 (2001)及び(M. J. Walport, N Engl J Med 344, 1140 (2001)）タンパク分解酵素Ｃ３転換酵素（J. Janssen等, Nature 437, 505 (2005)）によるその切断後にのみさらされる多数の別個の結合部位を介して相互作用する。最初のタンパク質切断段階はアナフィラトキシンとも呼ばれる小さい（９ｋＤａ）Ｃ３ａペプチドと大きな（１７７ｋＤａ）Ｃ３ｂ断片を生成する。Ｃ３からＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断は、分子を粒子表面に共有的に結合させることができるＣ３ｂ中の埋設チオ-エステル結合を露出させる立体構造変化を誘発する。「オプソニン化」と言われるこの過程は、粒子を標的にしてマクロファージ特異的レセプターに結合させ、ついで系から粒子を除去する。
【０００３】
最近、ＣＲＩｇがＣ３ｂ／ｉＣ３ｂオプソニン化粒子に対するレセプターとして同定された（K. Y. Helmy等, Cell 124, 915 (2006)）。ＣＲＩｇはＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ、並びにＣ３ｃに結合するが、不活性な前駆体Ｃ３との複合体を形成することはできない。
【０００４】
オプソニンとしてのその機能に加えて、Ｃ３ｂは補体のＣ３及びＣ５転換酵素のサブユニットである。Ｃ３ｂはセリンプロテアーゼ因子Ｂに結合する（W. Vogt, G. Schmidt, B. Von Buttlar, L. Dieminger, Immunology 34, 29 (1978)；Z. Fishelson, M. K. Pangburn, H. J. Muller-Eberhard, J Biol Chem 258, 741 1 (1983)）。この複合体は、Ｄ因子の補充とＤ因子による活性化後に、代替経路（ＡＰ）の活性なＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂ複合体を形成する。Ｃ３転換酵素への第二Ｃ３ｂ分子の付加は、実験的動物モデルにおいて炎症を媒介し、ヒト自己免疫及び炎症性疾患を媒介する際に重要な役割を果たすことが証明されている（M. J. Walport, K. A. Davies, B. J. Morley, M. Botto, Ann N YAcadSci 815, 267 (1997)）補体の代替経路のＣ５転換酵素である(Ｃ３ｂ)２Ｂｂの形成を生じる。代替経路転換酵素のＣ３ｂサブユニットは各基質Ｃ３又はＣ５に対してドッキング部位となり、転換酵素の触媒活性に必要とされる（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Immunol 164, 1379 (2000)）。補体の代替経路は、代替、古典及びマンノース結合レクチン経路の３つの経路の何れかを通して開始される補体活性化を増幅させる。その結果、代替経路の調節因子である補体Ｈ因子の欠損が炎症の増幅を招く（N. Rougier等, J Am Soc Nephrol 9, 2318 (1998)；M. A. Abrera-Abeleda等 J Med Genet (Nov 18, 2005)）。よって、代替経路補体転換酵素によるＣ３及びＣ５の切断がオプソニン化、転換酵素の生成及び炎症を生じさせる。
【０００５】
転換酵素の中心的成分として、Ｃ３ｂは数多くの補体調節因子の標的となる。これらには補体レセプター１（ＣＲ１）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、補体関連レセプターｙ（Ｃｒｒｙ）、Ｈ因子及びＩ因子（D. Hourcade, V. M. Holers, J. P. Atkinson, Adv Immunol 45, 381 (1989)）がある。Ｉ因子の結合はタンパク質分解を介してＣ３ｂの不活性化を生じてＣ３ｂ及びＣ３ｆ（２ｋＤａ）を形成し、チオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）を含み標的に結合したままであるＣ３ｄｇ（４０ｋＤａ）と、Ｃ３ｃ（１３５ｋＤａ）を最終的に生成する。Ｃ３及びＣ３ｃの結晶構造に関する最近の報告は、Ｃ３が活性化される機序の我々の理解を顕著に向上させた（上掲のB. J. Janssen等, 2005）。Ｃ３ｃはＣ３と比較して著しい構造変化を示し、複数のタンパク質分解切断段階の結果を反映している。これらの構造研究はＣ３活性化及び調節の立体構造依存的機序を示唆しているが、活性化種Ｃ３ｂの立体構造に対する回答を提供するものではない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、病原体の排除に必要なマクロファージ補体レセプターＣＲＩｇの結晶構造を提供する。また、ＣＲＩｇとの複合体でのＣ３ｂ及びＣ３ｃの結晶構造が提供される。天然細胞性レセプター及び補体活性化の調節物質との複合体での転換酵素サブユニットのこの第一構造が補体活性化及び調節の機序の我々の理解を改善する。本発明はまたＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストを含むＣＲＩｇに機能的に関連した分子を同定するために使用することができる、ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合領域、及びそのような結合に関与するＣ３ｂ内のドメイン及び配列についての情報を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体により形成された結晶に関する。
【０００８】
一実施態様では、該結晶は、格子定数(セル定数)ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Å、及びＰ２１２１２１の空間群をおよそ有している。
【０００９】
他の実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される。
【００１０】
更に他の実施態様では、ＣＲＩｇの機能的断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００１１】
更なる実施態様では、結晶は約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００１２】
また更なる実施態様では、本発明はアペンディクス１に示された構造座標を有するＣＲＩｇ結晶に関する。
【００１３】
他の態様では、本発明は上述のような結晶を含んでなる組成物に関する。
【００１４】
また他の態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｂとの複合体の結晶形態に関する。
【００１５】
一実施態様では、複合体の結晶形態は、格子定数ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群をおよそ有している。
【００１６】
他の実施態様では、複合体の結晶形態は、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドの一つを含む。
【００１７】
更なる実施態様では、機能的ＣＲＩｇ断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００１８】
また更なる実施態様では、複合体の結晶形態は、約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００１９】
更に他の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｂ複合体の結晶形態はアペンディクス２に示された構造座標を有する。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｃとの複合体の結晶形態に関する。
【００２１】
特定の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｂ複合体の結晶形態は、格子定数ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群をおよそ有している。
【００２２】
他の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３Ｃ複合体中に存在する天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される。
【００２３】
また他の実施態様では、複合体中に存在するＣＲＩｇ機能的断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００２４】
更なる実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｃ複合体の結晶形態は、約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００２５】
特定の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｃ複合体はアペンディクス３に示された構造座標を有する。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、配列番号２のＣＲＩｇポリペプチド又はその保存的置換のＣ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる分子又は分子複合体であって、結合部位が、８、１４−１５、４１−４２、４４、４５−４７、５０、５２、５４−６１、６２、６４、８５−８７、８９、９５、９９、１０５、１０７−１１０、及び１１１からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含み、結合部位がアペンディクス２に記載の構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から４．７Å未満の距離を有する点の集合によって定まる分子又は分子複合体に関する。
【００２７】
他の態様では、本発明は、点の少なくとも一部が、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位を定める少なくともコアアミノ酸の骨格原子の位置を表すアペンディクス２の構造座標から誘導されている点の三次元立体構造に関する。点の三次元立体構造は、限定するものではないが、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位が空間群対称Ｃ２２２１を有する結晶を形成する、ホログラフィー像、立体ダイアグラム、モデル、又はコンピュータ・ディスプレイ画像として示されうる。
【００２８】
また他の態様では、本発明は、機械可読データでコードされたデータストレージ材を含む機械可読データストレージ媒体であって、該データを使用するための指示書を用いてプログラムされた機械が、Ｃ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる少なくとも一つの分子又は分子複合体の三次元グラフィック図を表示し、点の集合によって定まった結合部位が、アペンディクス２に記載された構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から約４．７Å未満の距離を有している媒体に関する。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物を設計することを含むＣＲＩｇアゴニストを同定する方法に関する。
【００３０】
本発明は更に（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定された化学物質に関する。
【００３１】
特定の実施態様では、上記の化学物質はＣＲＩｇとＣ３ｂの間の結合をインビボ又はインビトロで妨害する。
【００３２】
本発明は更に天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む分子又は分子複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本特許又は出願ファイルはカラーで作製した少なくとも一図面を含んでいる。カラー図面の本特許又は特許出願のコピーは請求し必要な料金を支払えば特許庁から提供されるものである。
【図１】Ｃ３及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体のドメイン構造及び全体構造。（Ａ）Ｃ３のドメイン組織、β鎖を緑色、α鎖を青緑色（ＡＮＡドメイン）、オレンジ色（ＣＵＢ）、青色（ＴＥＤ）、及び紫色で示す。赤色の球は、チオ-エステルの位置を示している。（Ｂ）天然Ｃ３（左側）、ＣＲＩｇとの複合体としてのＣ３ｂ（中央）、及びＣＲＩｇとの複合体としてのＣ３ｃのリボン図。図１Ａのカラースキームを使用し、ＣＲＩｇの表面を黄色で示す。Ｃ３とＣ３ｂを比較する場合ＣＵＢ及びＴＥＤドメインの大きな動きに留意のこと。活性化後、ＴＥＤはＣ３ｂの残りと比較して移動し回転し、Ｃｙｓ９８８は８０Åを越えて移動する。（Ｃ）図１Ｂの概略図；病原体に対するＣ３ｂの潜在的な共有結合がＣ３Ｂ：ＣＲＩｇ複合体において示されている。
【００３４】
【図２】ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃのβ鎖キーリングの中心に結合する。（Ａ）Ｃ３ｃ及びＣＲＩｇの複合体。Ｃ３ｃの表面を白色にしたα鎖の残基と共に示し、β鎖のＭＧ１、ＭＧ２、ＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ６、及びＬＮＫドメインはそれぞれ白色、オレンジ色、赤色、淡緑色、青色及び暗緑色にした。ＣＲＩｇはリボン図として示し、全てのβ鎖及びＮ末端及びＣ末端を標識した。（Ｂ）図２ＡからＹ軸の回りに１８０度回転させたＣＲＩｇの表面図。Ｃ３ｃ／Ｃ３ｂに対して４．５Ａ未満の距離である全原子は、図２Ａにおいてそれらが接触している残基と同様に着色した。（Ｃ）ＣＲＩｇ野生型及びカラーのコードされたＣＲＩｇ変異体の相対的親和性。親和性は、プレート上の被覆Ｃ３ｂへの結合についてＣＲＩｇ-ＬＦＨとの様々なＣＲＩｇタンパク質の競合によって決定した。ＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合は抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。（Ｄ）図２Ｃに示した結合実験に使用したＣＲＩｇ変異を示すＣＲＩｇの表面。変異された残基は、図２Ｃにおいてそれらが表す結合曲線に従って着色した。
【００３５】
【図３】ＣＲＩｇは補体の代替（ＡＰ）経路を阻害するが、古典（ＣＰ）経路を阻害しない。（Ａ）ＣＲＩｇはＡＰを介したＣ５ｂ-９沈着を阻害するが、ＣＰ又はＭＢＬ経路のものは阻害しない。補体経路はＬＰＳ（ＡＰ）又はＩｇＭ（ＣＰ）で被覆されたプレート上で再構成され、Ｃ１ｑ欠損（ＡＰ）又はｆＢ欠損（ＣＰ）血清と共にインキュベートした。補体活性化は、Ｃ５ｂ-９への結合ＨＲＰＯコンジュゲート抗体の検出について色素源によって決定した。ＡＰアッセイにおけるＣＲＩｇのＩＣ５０値は１．４９±０．１９μＭ（ｎ＝３）である。（Ｂ）ＣＲＩｇは液相Ｃ３転換酵素活性を阻害する。Ｃ３、ｆＢ及びｆＤを、増大する濃度のｈｕＣＲＩｇ(Ｌ)-ＥＣＤの存在下でベロナールバッファー中でインキュベートした。反応をＥＤＴＡで停止させ、切断産物をクーマシー染色ゲル（左パネル）又はＥＬＩＳＡ（右パネル）で可視化した。ＣＲＩｇ-ＥＣＤに対するＩＣ５０値は０．３９±０．１４μＭ（ｎ＝３）である。（Ｃ）ＣＲＩｇはザイモサン粒子の表面上に集められたＣ５転換酵素を阻害する。ザイモサン粒子はｆＢ及びｆＤの存在下でＣ３ｂでオプソニン化され、Ｃ５転換酵素を生成する。固定濃度のＣ５を、増加する濃度のＣＲＩｇ ｗｔ又はＣＲＩｇ変異体Ｃ（ＣＲＩｇ（Ｃ））の存在下で転換酵素と混合した。転換酵素活性は、溶血アッセイを使用して液相中に生産されたＣ５ｂ６を測定することによって決定した。ＩＣ５０値：ＣＲＩｇ（Ｗｔ）１．６３±０．６２μＭ（ｎ＝３）、ＣＲＩｇ（Ｅ）６．５２±３．２１μＭ（ｎ＝３）。
【００３６】
【図４】全身的に投与されたＣＲＩｇ-Ｆｃは抗体誘発関節炎に伴う局所的及び全身的補体活性化を阻害する。（Ａ）コラーゲンでの二次免疫から７日後の、既に確認された疾患のｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃで治療されたマウスにおける炎症の減少（組織学的スコア）及び骨変形の減少（関節皮質骨体積ＪＣＢＶの増加）。６４日目に中足骨関節を常套的なＨ＆Ｅ組織検査、又はマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）のために準備した。（Ｂ）抗コラーゲンＩＩ型抗体での受動免疫後３日（左側パネル）又は５日後（右側パネル）に開始する１２ｍｇ／ｋｇのｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃの３回の毎週の投与を受けたマウスにおける臨床スコアの減少。（Ｃ）ＣＲＩｇ-Ｆｃでの処置は、関節の軟骨表面上でのＩｇＧ２ａではなくＣ３断片の蓄積を阻害する。組み合わさった画像では、赤色がＩｇＧ２ａ抗コラーゲン抗体の存在を示し、緑色が軟骨表面上の補体Ｃ３産物の存在を示している。（Ｄ）既に確認された疾患のＣＲＩｇ-Ｆｃで治療されたマウスの関節中におけるＣ３へのＣＲＩｇ-Ｆｃの結合（緑色）。尺度バー＝２０ｕｍ。（Ｅ）上側パネル：受動免疫前の日に開始したＣＲＩｇ-Ｆｃ処置マウスにおける関節中でのＣ３ａ生産の阻害。下側パネル：ＣＲＩｇ-Ｆｃで処置されたマウスの血清中におけるＣ５ａレベルの有意な減少。統計的解析（スチューデントｔ検定）：＊ ｐ＜０．０１、＊＊ ｐ＜０．００１、＊＊ ｐ＜０．０００１。
【００３７】
【図５】ＣＲＩｇは、転換酵素の非触媒サブユニットへのＣ５の結合を阻害することによりＣ５転換酵素を阻害する。（Ａ）ＣＲＩｇはＣ５のＣ３ｂ２への結合をブロックするがＣ３ｂＣ４ｂへの結合はブロックしない。Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ２及びＣ３ｂＣ４ｂをポリクローナル抗Ｃ３抗体で捕捉し、Ｃ５と増加濃度のＣＲＩｇ（ｗｔ）又は変異体ＣＲＩｇ（Ｃ）との混合物と共にインキュベートした。転換酵素サブユニットに結合したＣ５を、ポリクローナル抗Ｃ５抗体及びＨＲＰＯコンジュゲート二次抗体で検出した。Ｃ５結合のＣＲＩｇ阻害のＩＣ５０は０．８８±０．２２μＭであった。（Ｂ）ＣＲＩｇは精製Ｃ５転換酵素のＶｍａｘを減少させる。固定濃度のＣＲＩｇを、増加濃度のＣ５の存在下でザイモサン結合Ｃ５転換酵素と混合した。ミカエリスメンテン式に基づいて計算したＫｍ及びＶｍａｘ値は、ＣＲＩｇ（ｗｔ）の不在下で０．９９及び４．０１であり、０．８ｕＭのＲＩｇ（ｗｔ）の存在下で１．７０及び２．１６であった。
【００３８】
【図６】Ｃ３及びＣ３ｂ間のドメイン配置の差。示されているのはＣＵＢ、ＴＥＤ及びＭＧ８-ドメインのリボン図である。（Ａ）Ｃ３及びＣ３ｂ（共にオレンジ色）のＣＵＢドメインに基づく重ね合わせ。この重ね合わせは、Ｃ３ｂ中のＣＵＢドメインがＣ３のＭＧ８ドメインに関して移動する一方（淡紫色で示す）、ＴＥＤドメインがＣ３活性化時に大きな回転を受けることを示している。（Ｃ）ＴＥＤドメインに基づく重ね合わせ。Ｃ３ｂは暗色の、Ｃ３は明るい青色で示す。Ｃ３ｂ構造において完全に開放しているＣ３中の非常にコンパクトなドメイン配置に留意のこと。Ｃｙｓ９８８の［位置は赤色の球で示す。
【００３９】
【図７】Ｃ３ｂ中のＴＥＤとＡｒｇ８０との間の相互作用。該図はプログラムpymol（DeLano, M.C.及びCao, Y., Neuroimaging Clin. N. Am. 12(1):21-34 (2002))で計算した静電ポテンシャルに従って着色したＴＥＤの表面図を示している。赤色及び青色は負及び正に荷電したパッチをそれぞれ示している。Ｒ８０の側鎖原子は球で表している。Ａｒｇ８０はＴＥＤの表面の高度に負に荷電した溝に近接していることに留意のこと。
【００４０】
【図８】異なった種からのＣＲＩｇの配列アラインメント。Ｃ３ｂと接触している残基は図２Ａに従って着色した。残基番号はシグナル配列後のヒトＣＲＩｇを意味する。二次的構造要素は上の配列アラインメントに矢印（ストランド）及びボックス（ヘリックス）として示す。
【００４１】
【図９】ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃと同様の親和性を有している。親和性は固定濃度のＣＲＩｇ-ＬＦＨとの増加濃度のＣ３ｂ又はＣ３ｃの競合によって決定した。ＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合は、ＨＲＰＯにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出し、ＴＮＢ反応産物の吸光度を４１５ｎｍの波長で分光測定により測定した。
【００４２】
【図１０】ＣＲＩｇ結合部位の近傍におけるＣ３及びＣ３ｂ間の局所的差。ここに示したＣ３及びＣ３ｂの重ね合わせはＭＧ６ドメインのＣα原子に基づく。Ｃ３の一部は白色で示し、α'ＮＴドメインは青色で示す。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体は緑色（Ｃ３ｂのβ鎖）、紫色（Ｃ３ｂのα鎖）で示し、α'ＮＴドメインは青色で示す。ＣＲＩｇは黄色で示す。Ｃ３活性化時に起こる大きな立体構造変化は赤色の矢印で示す。α'ＮＴドメインの大きな動きに留意のこと。ＭＧ６に関するＭＧ３の回転と、螺旋セグメント（５７７：５９０）の動きはＣ３ｂ及びＣ３ｃへのＣＲＩｇの結合に必要とされている。
【００４３】
【図１１】ＣＲＩｇはヒト及びマウス血清中における代替経路を選択的に阻害する。（Ａ）ＣＲＩｇはＣ１ｑ欠損血清中においてウサギ赤血球の溶血を阻止するが（代替経路、左側パネル）、ｆＢ欠損血清中におけるＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球の溶血は阻止しない（古典経路、右側パネル）。Ｅ-ＩｇＭとＥｒを、異なった濃度のＣＲＩｇ-Ｆｃ又はＣＲＩｇ-ＥＣＤ融合タンパク質を含む５％血清中でインキュベートした。氷冷ＥＤＴＡを加えることによって溶血を停止させ、４１５ｎｍにて分光計で上清中のＯ．Ｄを決定することによって溶血量を測定した。ＩＣ５０値：ＣＲＩｇ-Ｆｃ １２７±４９ｎＭ（ｎ＝６）、ＣＲＩｇ-ＥＣＤ ６４０±１２３ｎＭ。（Ｂ）ＣＲＩｇは古典経路によって開示される補体の代替経路を阻害する。古典経路の補体成分をＳＲＢＣ上に集めてＥＡＣ３４（ＡＰ、左側パネル）又はＥＡＣ１２３４（ＣＰ、右側パネル）を生成する。溶血は（Ａ）に記載されるようにして決定した。（Ｃ）マウスＣＲＩｇ-Ｆｃはマウス血清中の代替経路溶血を阻害する。Ｅｒを、増加濃度のマウスＣＲＩｇ-Ｆｃを含む３０％マウス血清と共にインキュベートした。溶血は（Ａ）に記載されるようにして決定した。（Ｄ）ＣＲＩｇはマンノース結合レクチン経路を阻害しない。ＭＢＬ経路活性化によって誘導されるＣ５ｂ−９沈着を、４１５ｎｍの波長で分光測定により測定した。
【００４４】
【図１２】ＣＲＩｇはコラーゲン誘発関節炎を阻害する。（Ａ）ウシコラーゲンを用いて０日目と２３日目に２回マウスを免役することによって関節炎を誘発させた。疾患が既に確認されたときに２４日目（予防的）又は４５日目（矢印）に開始して毎週３回ｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃでマウスを処置した。臨床スコアは足首の厚みを反映させたものである。関節炎の誘発後７０日目に、マウスを安楽死させ、関節皮質骨体積（ＪＣＢＶ）を測定し（Ｂ）、Ｈ＆Ｅ染色切片について炎症の徴候を評価した（Ｃ）。（Ｄ）ＣＲＩｇ-Ｆｃで処置したマウスの関節におけるＩＬ-６（左側パネル）及びＩＬ-１ｂ（右側パネル）の減少。関節炎の誘発後、表示した時点でマウスを安楽死させ、関節を解剖し、サイトカイン測定のために加工した。ＬＰＳ処置（最初の時点）によるサイトカインレベルの増加はｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃ処置には影響を受けない。統計：＊ ｐ＜０．０１、＊＊ ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。
【００４５】
【図１３】（Ａ）ＣＲＩｇはＨ因子のコファクター活性に影響しないし、内因的なコファクター活性を有してもいない。左側パネル：固定濃度のＣ３ｂを４μＭのＣＲＩｇ（ｗｔ）又はＣＲＩｇ（Ｃ）の存在下で増加濃度のＨ因子と混合した。コファクター活性を、ｉＣ３ｂからＣ３ｂを区別するためにクーマシー染色ＳＤＳゲル上の反応産物を可視化することによってモニターした。右側パネル：固定濃度のＣ３ｂ及びｆＩをｆＨ又は増加濃度のＣＲＩｇと混合した。（Ｂ）ＣＲＩｇはＣ３ｂに結合するＢ因子を阻害しない。固定濃度のＢ因子を増加濃度のＣＲＩｇと混合した。結合したＢ因子の量を、ｆＢに対するポリクローナル抗体及び二次ＨＲＰＯコンジュゲートａｂを使用して決定した。（Ｃ）ＣＲＩｇはＣ３転換酵素を崩壊させない。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３ｂ、Ｂ因子及びＤ因子をインキュベートすることによってマキシソーププレート上に形成された。ついで、そのプレートを増加濃度のＣＲＩｇ又はＨ因子と共にインキュベートした。残りの結合したＢ因子は、抗Ｂ因子抗体及びＨＲＰＯコンジュゲート二次抗体で検出した。示される結果は３回の独立した実験を代表するものである。
【００４６】
【図１４】ＣＲＩｇ ＥＣＤは、Ｃ３ｂへの結合についてＣＲＩｇ-ＬＦＨと競合できるがＣ５はできない。ＣＲＩｇ-ＬＦＨと増加濃度のＣＲＩｇ-ＥＣＤ又はＣ５の混合物を、Ｃ３ｂを被覆したマキシソルブプレートに加えた。残っているＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合を抗ｆｌａｇ抗体を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
特に他の定義をしない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するところと同じ意味を持つ。例えば、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ２版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989 )を参照のこと。本発明のために、次の用語を下記のように定義する。
【００４８】
「ＣＲＩｇ」、「ＰＲＯ３６２」、「ＪＡＭ４」及び「ＳＴＩｇＭＡ」は、互いに交換可能に使用され、天然配列及び変異体ＣＲＩｇポリペプチドを意味する。
【００４９】
「天然配列」ＣＲＩｇは、その調製態様にかかわらず、天然由来のＣＲＩｇと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。しかして、天然配列ＣＲＩｇは、天然から単離されうるか、又は組換え及び／又は合成手段によって製造されうる。「天然配列ＣＲＩｇ」なる用語は、ＣＲＩｇの天然に生じる切断又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型）及びＣＲＩｇの天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、配列番号１の３２１アミノ酸長のヒトＣＲＩｇポリペプチドで、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号１のおよそ２７７から３０７のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に包含する。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、配列番号２の完全長３９９アミノ酸長ヒトＣＲＩｇポリペプチド（ｈｕＣＲＩｇ、又はｈｕＣＲＩｇ-ｌｏｎｇ）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号２のおよそ２７７から３０７のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に包含する。また更なる実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、ヒトＣＲＩｇポリペプチドの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ-ｓｈｏｒｔ、配列番号３）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号３のおよそ１８３から２１３のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものである。異なった実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその断片は、配列番号４の２８０アミノ酸長の完全長マウスＣＲＩｇポリペプチド（ｍｕＣＲＩｇ）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号４のおよそ１８１から２１１のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものである。天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその断片は、配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチドで、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、及び膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものでありうる。該用語は更に配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドで、それぞれＮ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、及び各配列中に膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に含む。
【００５０】
「ＣＲＩｇ変異体」とは、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する活性なＣＲＩｇポリペプチドを意味する。特定の実施態様では、ＣＲＩｇ変異体は天然配列の成熟完全長ＣＲＩｇポリペプチドの配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有している。かかるＣＲＩｇポリペプチドには、例えば、天然配列のＮ又はＣ末端において、一又は複数のアミノ酸残基が挿入され、置換され、及び／又は欠失されたＣＲＩｇポリペプチドが含まれる。他の変異体は天然ポリペプチド配列の膜貫通領域内に一又は複数のアミノ酸が挿入され、置換され、及び／又は欠失されたものである。
【００５１】
通常、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号１−７の何れかのものからの成熟アミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、最も高い度合いの配列同一性は細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内（配列番号１又は２のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここで、Ｘは２７１から２８１の任意のアミノ酸残基；又は配列番号３のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここで、Ｘは１７８から１８６の任意のアミノ酸残基、あるいは配列番号４のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここでＸは１７６から１８４の任意のアミノ酸残基である）で生じる。
【００５２】
ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、各全長分子の膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＣＲＩｇポリペプチドの形態を意味する。通常、ＣＲＩｇ ＥＣＤはこのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。上で検討したように、場合によっては、ＣＲＩｇ ＥＣＤは、配列番号１、２、３、又は４のアミノ酸残基１又は約２１からＸを含み、ここで、Ｘは配列番号１又は２の約２７１から２８１の任意のアミノ酸残基、配列番号３の約１７８から１８６の任意のアミノ酸、及び配列番号４の約１７６から１８４の任意のアミノ酸を含む。
【００５３】
ＣＲＩｇ配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、ＣＲＩｇ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。別段の記載がなされない限り、アラインメントは、選択されたソフトウェアのデフォルトパラメータを使用して実施される。ついで、酸配列同一性は、より長い配列に対して計算される。つまり、より短い配列が、より長い配列の一部と１００％の配列同一性を示すとしても、全体の配列同一性は１００％未満になるであろう。
【００５４】
ＣＲＩｇコード配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、ＣＲＩｇコード配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ついで、酸配列同一性は、より長い配列に対して計算される。つまり、より短い配列が、より長い配列の一部と１００％の配列同一性を示すとしても、全体の配列同一性は１００％未満になるであろう。
【００５５】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるコード化ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００５６】
「単離された」ＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、同定され、ＣＲＩｇコード核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＣＲＩｇコード核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＣＲＩｇを通常発現する細胞に含まれるＣＲＩｇコード核酸分子を含む。
【００５７】
「補体関連疾患」なる用語は、ここでは最も広い意味で使用され、例えば補体欠損症のような病因が補体系の活性化の異常性を含む全ての疾患及び病理学的症状を含む。該用語はＣ３転換酵素の阻害から恩恵を受ける疾患及び病理学的症状を含む。該用語は、代替補体経路の選択的阻害を含む阻害から恩恵を受ける疾患及び病理学的症状を更に含む。補体関連疾患には、限定するものではないが、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎（ＲＡ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎及びその結果の糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺誘発性冠血管内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患及び他の補体関連の眼の症状、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、眼内炎、及び他の眼内血管新生疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、並びに異物移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞肺促迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、及び誤嚥性肺炎が含まれる。
【００５８】
「補体関連の眼の症状」なる用語は最も広い意味で使用され、古典及び代替経路、特に補体の代替経路を含む病因が補体に関連する全ての眼の症状を含む。補体関連の眼の症状には、限定するものではないが、黄斑変性疾患、例えばドライ及びウェット（非滲出性及び滲出性）形態を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、及び他の眼内血管新生疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生が含まれる。補体関連の眼の症状の好ましい群には、非滲出性（ウェット）及び滲出性（ドライ又は萎縮性）ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び眼内炎が含まれる。
【００５９】
「炎症性疾患」及び「炎症性障害」なる用語は、ここでは置き換え可能に使用され、哺乳動物の免疫系の成分が哺乳動物の罹患率に寄与する免疫反応を生じ、媒介し又は寄与等する疾患又は障害を意味する。また含まれるものは、炎症反応の減少が疾患の進行に寛解効果を有する疾患である。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患を含む免疫媒介炎症疾患である。
【００６０】
「Ｔ細胞媒介」疾患という用語は、Ｔ細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか又は寄与等する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に、また例えばＴ細胞により分泌されるリンホカインによりＢ細胞が刺激されるならばＢ細胞に関連した効果にさえも関連している。
【００６１】
その幾つかがＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、限定するものではないが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、多発性神経障害、肝胆汁性疾患、例えば感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性及び線維性肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、肺のアレルギー性疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。アルツハイマー病、及びアテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００６２】
ここで使用される「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうとあらゆる新生物細胞成長及び増殖、及びあらゆる前癌状態の細胞及び組織を意味する。
【００６３】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。
【００６４】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更を行なう本発明により実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に免疫反応の成分の反応の大きさを変え、又は他の治療剤、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対する疾患の感受性を高めることができる。
【００６５】
補体関連疾患のような疾患の「病理」は、患者の良好な健康を危険にさらす全ての現象を含む。これには、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球性、リンパ性細胞）、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、正常に機能している隣接細胞の妨害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、あらゆる炎症性又は免疫性反応の抑制又は悪化、炎症性細胞（好中球、好酸球、単球性、リンパ性）の組織空間への浸潤等が含まれる。
【００６６】
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ及びケナガイタチなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００６７】
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００６８】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラクシン、プロリラクシン、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)、肝臓成長因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子-α及び-β、ミュラー阻害物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、神経成長因子、例えばＮＧＦ-β血小板増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、骨誘導因子、インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)、及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β、及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００６９】
「治療的有効量」は、標的の疾患又は症状、例えば補体関連疾患又は症状、又は癌の状態、例えば病理において測定可能な改善を達成するために必要とされる活性なＣＲＩｇ、ＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストの量である。
【００７０】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。
【００７２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７３】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度のストリンジェント条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いるもの、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いるもの、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用い、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で、５５℃において５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃においてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェント洗浄を用いるものによって同定できる。
【００７４】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように特定され、上記のものよりストリンジェンシーが低い洗浄液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーション後に、３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄を行うという条件である。プローブ長などの因子に必要に応じて適合させるには、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは当業者であれば分かるであろう。
【００７５】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００７６】
本発明のＣＲＩｇポリペプチドの変異体に関し、「活性な」又は「活性」は、本発明の天然又は天然に生じるポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態を意味する。好ましい生物学的活性は、Ｃ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替の補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害する能力である。３転換酵素の阻害は、例えばコラーゲン-又は抗体-誘発関節炎の間における正常な血清中でのＣ３代謝回転の阻害、又は関節炎の間接におけるＣ３沈着の阻害を測定することにより測定することができる。
【００７７】
ＣＲＩｇの生物学的活性を模倣し、ここに開示されたスクリーニングアッセイによって同定することができる抗体、ポリペプチド又は他の分子（例えば有機又は無機小分子、ペプチド等々）に関する「生物学的活性」とは、Ｃ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替の補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害するそのような分子の能力を指す。
【００７８】
ＣＲＩｇ「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で使用され、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの（上述の）定性的生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。
【００７９】
ＣＲＩｇ「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で使用され、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのような天然ポリペプチドの定性的生物学的活性を部分的に又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子を含む。
【００８０】
適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、本発明の天然ポリペプチドの断片、融合体又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子を含む小分子等々が特に含まれる。
【００８１】
「小分子」はここでは約６００以下、好ましくは約１０００ダルトン以下の分子量を有するものと定義されている。
【００８２】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、単一の抗ＣＲＩｇモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及び多エピトープ特異性を持つ抗ＣＲＩｇ抗体組成物を包含する。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を意味する。
【００８３】
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは例えばリンパ系によって低レベルで、ミエローマによって増大したレベルで生産される。「抗体」なる用語は最も広い意味で使用され、限定するものではないが、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を特に包含する。
【００８４】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００８５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性と特異性に使用されていることを意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域を含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991)を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００８６】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；線形抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００８７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位、及び残基「Ｆｃ」断片を持つ。該名称「Ｆｃ」は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差結合可能なＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００８８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、強固に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この構造において各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的には、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な三つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有している。
【００８９】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されていることでＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’に対するここでの表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は間にヒンジシステインを有しているＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００９０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類できる。
【００９１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれγ、μ、δ、α、及びεと呼ばれる。異なったクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体構造はよく知られている。
【００９２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に向く。特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されることで、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、特定の方法で抗体を生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等によって最初にNature 256:495[1975]に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができるか、あるいは組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えば Clackson等, Nature 352:624-628 (1991) 及び Marks等, J.Mol.Biol. 222：581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。また、ファージミッド及びファージベクターの利用による抗体の調製が記載されている米国特許第５７５０３７３号、第５５７１６９８号、第５４０３４８４号及び第５２２３４０９号を参照のこと。
【００９３】
ここで、モノクローナル抗体は、特に重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りそれらの抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。
【００９４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大抵は、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基はまた対応する非ヒト残基によって置換されうる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させ、最大化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 [1988]；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、マカクザルを対象の抗原で免疫化することにより生成された抗体に由来している「霊長類化」抗体を含む。旧世界ザル由来の残基を含む抗体もまた本発明において可能である。例えば米国特許第５６５８５７０号、第５６９３７８０号、第５６８１７２２号、第５７５０１０５号及び第５７５６０９６号を参照のこと。
【００９５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にするＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００９６】
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ小抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
【００９７】
抗体のような「単離された」ポリペプチドとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体を含むポリペプチドは、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法による測定で化合物の９５重量％よりも大きな割合まで、最も好ましくは９９重量％よりも大きな割合まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された化合物、例えば抗体又は他のポリペプチドには、化合物の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの化合物が含まれる。しかしながら、通常は、単離された化合物は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００９８】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識した」化合物が生成されるように、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接又は間接的に抱合させた検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒しうる。
【００９９】
「固相」とは、本発明の化合物が付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここで包含される固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施形態では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含み得；その他では精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【０１００】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ここに開示する抗ＥｒｂＢ２抗体及び場合によっては化学療法剤）の輸送に有用である種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形態に配列させる。
【０１０１】
ここで用いられる場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（つまり「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【０１０２】
「慢性」投与とは、延長された期間の間、所望の効果を維持するように、急性態様とは異なる連続態様で薬剤を投与することを意味する。
【０１０３】
「間欠」投与とは、中断がなく連続的になされるのではなく、むしろ周期的な性質の治療法である。
【０１０４】
一又は複数の更なる治療剤「との併用での」投与は同時（同時期）と任意の順序の連続投与を含む。
【０１０５】
「患者」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１０６】
「哺乳動物」なる用語は、ここでは限定するものではないが、ヒト、牧畜、家畜、及び動物園の動物、スポーツ、又はペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等々を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指すために使用される。
【０１０７】
「有効量」とは有益な又は所望される治療的（予防を含む）結果を得るのに十分な量である。有効量は一又は複数回の投与で投与できる。
【０１０８】
（発明を実施するための形態）
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の一般的な技術を用いる。かかる技術は例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2版 (Sambrook等, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait編, 1984)；“Animal Cell Culture” (R.I. Freshney編, 1987)；“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”, 4版 (D.M. Weir & C.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos編, 1987)；“Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel等編, 1987)；“PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等編, 1994)；及び“Current Protocols in Immunology” (J.E. Coligan等編, 1991)のような文献に十分に説明されている。
【０１０９】
ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｈ及びＣ３ｃ複合体の結晶構造
ＣＲＩｇ分子を含むポリペプチドは一次アミノ酸配列及びポリペプチドを囲む環境によって決定される３次元構造を有している。この３次元構造はポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、及び他の生化学的特質を樹立する。よって、タンパク質の３次元構造の知識はその生物学的活性を模倣し、阻害し又は改善する薬剤を設計する際の大きな指針を提供する。
【０１１０】
ポリペプチドの３次元構造は多くの方法で決定することができる。最も精確な方法の多くはｘ線結晶解析（Van Holde, Physical Biochemistry (Prentice Hall: N.J., 1971), pp. 221-239）を用いる。この技術はｘ線又は他の形態の放射線を回折する結晶格子の能力に依存している。巨大分子の３次元構造を決定するために適した回折実験は典型的には高品質の結晶を必要とする。不幸にも、かかる結晶はＩＧＦ-１並びに興味のある多くの他のタンパク質には利用できなかった。結晶は例えばＭ−ＣＳＦ（ＥＰ６６８９１４Ｂ１）、ＣＤ４０リガンド（ＷＯ９７／００８９５）、及びＢＣ２Ｆａｂ断片（ＷＯ９９／０１４７６）に対して記載されている。
【０１１１】
結晶性タンパク質及びポリペプチドを調製するための様々な方法が当該分野で知られている（McPherson等., “Preparation and Analysis of Protein Crystals,” McPherson (Robert E. Krieger Publishing Company, Malabar, FL, 1989)；Weber, Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36 (1991)；米国特許第４６７２１０８号及び第４８３３２３３号）。ポリペプチドを結晶化させるための複数のアプローチ法が存在しているが、特に結晶がｘ線回折研究に適したものでなければならない場合には、合理的な成功の可能性をもたらす単一セットの条件は存在しない。構造に関する精確な情報をもたらす十分なサイズと分解能の結晶を得るには顕著な努力が必要とされる。例えば、十分な純度のタンパク質がひとたび得られれば、ｘ線回折と続く構造解明に有用なサイズと透明度になるまで結晶化されなければならない。更に、標的タンパク質のアミノ酸配列は知られていても、この配列情報からタンパク質の結晶構造を正確に予測することはできない。また配列情報から、タンパク質とＣＲＩｇやＣ３ｂのようなそれが相互作用する結合対との間の構造的、コンフォメーション的及び化学的相互作用の理解ができるようになるものでもない。よって、結晶構造はドラッグデザイン及び発見の分野で豊富な価値ある情報をもたらしうるが、ＣＲＩｇのようなある種の生物学的に関連した化合物の結晶は当業者が直ぐに利用できるものではない。ＣＲＩｇの高品質の回折結晶は、その生物学的役割を更に理解し、限定するものではないがアゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含むＣＲＩｇ変異体、アゴニスト及び淡タゴニストを設計するために重要になるその３次元構造の決定に役立つ。
【０１１２】
構造情報の提供に加えて、結晶性ポリペプチドは他の利点をもたらす。例えば、結晶化方法自体はポリペプチドを更に精製し、均一性の古典的条件の一つを満たす。実際、結晶化は、ＨＰＬＣ、透析、一般的なカラムクロマトグラフィー等々の他の精製方法によっては除去されない不純物を除去する無比の精製品質をもたらすことがよくある。更に、結晶性ポリペプチドはしばしば周囲温度で安定であり、プロテアーゼの汚染や溶液保存に伴う他の分解を受けない。結晶性ポリペプチドはまた医薬製剤としても有用でありうる。最後に、一般に結晶化技術には、他の安定化法（例えば凍結乾燥）に付随する変性のような問題が概してない。
【０１１３】
本発明はＣＲＩｇ単独とＣ３ｂ及びＣ３ｃそれぞれとの複合体の結晶構造を提供する。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の構造は、Ｃ３活性化時に生じ補体レセプターＣＲＩｇの結合部位を定める立体構造変化を完全に明らかにする。また、代替経路転換酵素のタンパク質分解活性に対するこの相互作用の結果を調べる。
【０１１４】
すなわち、本発明は、およそ次の寸法：ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Åを有するＣＲＩｇ結晶を提供する。該結晶は、Ｐ２１２１２１の対称、又は空間群を有している。ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス１に提供する。
【０１１５】
本発明は更におよそ次の寸法：ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群を有しているＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造を提供する。ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス２に提供し、そのリボン構造は図１Ｂに示す。
【０１１６】
本発明はまたおよそ次の寸法：ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群を有しているＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造を提供する。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス３に提供し、そのリボン構造は図１Ｃに示す。
【０１１７】
残基１〜６４５からなるＣ３ｂは、５つのマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ１-ＭＧ５）、及び第６ＭＧドメインのＮ末端半分、リンカー領域（ＬＮＫ）（図１Ａ及び１Ｂ）に折り畳まれる。免疫グロブリントポロジーＭＧドメインは「キーリング」様形式に配置され、約１０Å幅で３０Å長の中央溝の回りを円で囲んでいる。Ｃ３ｂのα鎖は残基７２９：１６４１からなり、Ｃ３と比較してＣ３ａ又はＡＮＡドメインを欠いている。α'ＮＴドメインと呼ばれるＣ３ｂα鎖のＮ末端残基（７２９：７４５）は、伸展したコンフォメーションを採用しており、第６ＭＧドメインの第２の半分を形成する残基につながっている。これに続いて、α鎖は間にＣＵＢドメインとチオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）が挿入された２つの更なるＭＧドメイン（ＭＧ７及びＭＧ８）を含んでいる。最後に、α鎖のＣ末端の１７０残基はいわゆる「アンカー領域」とＣ３４５Ｃドメインを形成している。
【０１１８】
実施例１に記載されるように、Ｃ３ｂのコンフォメーションは活性化の際に劇的な変化を受ける。ＴＥＤはＣＵＢ及びＮＧ８ドメインから離れる方向に回転し、完全に異なったコンフォメーションでＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する残基を残す。このコンフォメーション変化の一部として、Ｃ３ｂの９８８位のＣｙｓ残基がＣ３構造中のその最初の保護されたネストから露出した位置まで移動する。
【０１１９】
実施例１に記載された結晶化研究から、ＣＲＩｇに対する結合部位がＣ３ｂのＣＵＢ及びＴＥＤドメインとは反対側にあり、ＣＲＩｇをＴＥＤドメインから約４０Åのところに位置させていることが明らかになった（図１Ａ及び１Ｂを参照）。
【０１２０】
ＣＲＩｇとＣ３ｃ又はＣ３ｂの間の結合界面は大きく、不連続で、全体で約２６７０Å２の溶媒露出面積を埋めている（図２Ａ）。ＣＲＩｇはＣ３ｂと接触し、Ａ’、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’シートからの残基が、ストランドＣ’とＣ”の近傍の残基及びループによって形成された相互作用の大部分を有する。Ｃ’とＣ”を連結するヘアピンループは、Ｃ３ｂのキーリング形状のβ鎖の中心に形成された裂け目中に突出している。界面のＣ３ｂ側では、ドメインＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ５、ＭＧ６、ＬＮＫ及びＭＧ６が全てＣＲＩｇ結合に寄与し、埋まった界面のそれぞれ約３０％と４０％に対してＭＧ３とＭＧ６が原因となっている（図２Ｂを参照）。ＭＧ３ドメインはＣ３ｂ（及びＣ３ｃ）へのＣＲＩｇの結合のゲーティングに重要な役割を担っていると考えられる。また、Ｃ３分子の残りと比較してＭＧ３の比較的小さいがなお有意な１５°の回転が、ＣＲＩｇ結合部位を構成する他のＭＧドメインのリングに関したＭＧ３の相対的再配向の原因である。従って、ＬＮＫ領域の螺旋部分の動きと連係して、この回転がＣＲＩｇをＣ３ｂ及びＣ３ｃに結合させる。これらの中程度の変化がないと、Ｃ３はＣＲＩｇにはラッチされないであろう。
【０１２１】
これらの構造-機能の知見はＣＲＩｇの数個のアミノ酸置換変異体を試験することによって確認した。ＮＧ６及びＭＧ３結合ドメインにおける変異はＣ３ｂへのＣＲＩｇの結合を効果的に抑止することが確認された。これに対して、反対側のＣＲＩｇ表面残基の変異は野生型ＣＲＩｇの活性に効果はなかった。
【０１２２】
ＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストのデザイン、調製及びスクリーニング
本発明は、例えば補体関連疾患又は障害、例えば免疫複合体及び自己免疫疾患、及び補体介在炎症組織損傷を含む様々な炎症症状の治療に有用性があるＣＲＩｇアゴニストを同定するスクリーニングアッセイを含む。補体関連疾患の病理は様々であり、長期間又は短期間の補体活性化、カスケード全体、カスケードの一つだけ（例えば古典又は代替経路）、カスケードの幾つかの成分だけの活性化等々を含むかもしれない。ある疾患では、補体断片の補体生物学的活性が組織損傷及び疾患を生じさせる。従って、補体の阻害剤は高い治療的潜在性を有している。代替経路の選択的阻害剤は、古典経路による血液からの病原体及び他の生物の除去が手を付けられていないままであるので、特に有用であろう。
【０１２３】
ＣＲＩｇポリペプチドのアゴニストは天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの定性的生物学的活性を模倣する。好ましくは、生物学的活性はＣ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害する能力である。アゴニストには、例えばイムノアドヘシン、ペプチド模倣薬、天然ＣＲＩｇの定性的生物学的活性を模倣する非ペプチド小有機分子並びに抗体断片を含むアゴニスト抗体が含まれる。
【０１２４】
イムノアドヘシンは、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを兼ね備えた抗体様分子である。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外(すなわち「異種性の」もの)である所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含んでなる。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は典型的にはレセプター又はリガンドの結合部位を少なくとも含んでなる連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られうる。
【０１２５】
ペプチド模倣薬は、例えば、該化合物がここに記載のＣＲＩｇ生物学的活性を保持しているならば非天然発生アミノ酸を含むペプチドを含む。同様に、ペプチド模倣薬及びアナログは、本発明のＣＲＩｇポリペプチドの重要な構造的エレメントの構造を模倣しＣＲＩｇ生物学的活性を保持している非アミノ酸化学構造を含みうる。「ペプチド」なる用語は、約５０アミノ酸残基未満、及び好ましくは４０アミノ酸残基未満の制約された（すなわち、例えば、βターン又はβプリーツシートを先導するアミノ酸の存在、又は例えば、ジスルフィド結合Ｃｙｓ残基の存在によって環状化する構造のある要素を有する）あるいは非制約（例えば直鎖状）アミノ酸配列で、その二量体又はその中間のような多量体を包含するものを指すようにここでは使用される。約４０アミノ酸残基未満のペプチドでは、約１０及び約３０アミノ酸残基の間のペプチド、特に約２０アミノ酸残基のペプチドが好ましい。しかしながら、本開示を読めば、当業者ならば、ペプチドを識別するのは、特定のペプチドの長さではなく、そのＣ３ｂへ結合しＣ３転換酵素、特に代替補体経路のＣ３転換酵素を阻害する能力であることを認めるであろう。
【０１２６】
ＣＲＩｇアゴニストのスクリーニングと同定は、ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の開示と、ＣＲＩｇとＣ３ｂ間の結合界面の同定によって非常に容易になる。この情報によりＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物の設計が可能になる。
【０１２７】
また、ＣＲＩｇアゴニストは、（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定することができる。この情報に基づいて、アゴニスト候補を合成することができ、そのアゴニスト特性をＣＲＩｇ活性の生物学的アッセイにおいて実証することができる。
【０１２８】
特定の実施態様では、アゴニストは、天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む化学物質であろう。
【０１２９】
ペプチド模倣薬は固相ペプチド合成法を用いて簡便に調製できる(Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1964)；Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5132 (1985))。固相合成法は、保護されたアミノ酸を不活性固形担体に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固形担体は、開始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る。典型的には、高分子担体は、架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はポリスチレン樹脂に連結されてベンジルエステルを形成する。高分子支持体は、ペプチド合成の阻害アミノ酸のα-アミノ基を脱保護するのに使用される条件下でペプチドアンカー結合が安定であるように選択される。塩基不安定α保護基が使用されるならば、ペプチドと固形担体の間に酸不安定結合を使用するのが望ましい。例えば、酸不安定エーテル樹脂は、塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペプチドアンカー結合及び差次的に酸分解に移行するα-保護基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂のようなアミノメチル樹脂は、Ｂｏｃ-アミノ酸ペプチド合成に関連して良好に働く。開始アミノ酸が不活性固形担体に連結された後、開始アミノ酸のαアミノ酸保護基を例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリエチルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、合成における次のα-アミノ及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りのα-アミノ酸と、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、固形担体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。
【０１３０】
２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルアミノ]ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【０１３１】
ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。更に共通なのは、アミノ酸又はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、アミノ酸又はペプチド断片のＣ末端カルボキシル基は成長固形相ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端アミノ基と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド断片を固相ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において、ペプチド鎖の所望の配列に位置するアミノ酸残基の各々を含み、その個々の残基が側鎖保護基を担持する中間体化合物が生成されるのが一般的である。これらの保護基は、実質的に同時に除去でき、固相から取り外した後に所望のポリペプチド生成物が生成される。
【０１３２】
α-及びε-アミノ酸側鎖を、ベンジルオキシカルボニル（Ｚと略）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ２)］、ｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピル-オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護できる。
【０１３３】
カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示される。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいことが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキシベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２,６-ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１,３,５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。システインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる。
【０１３４】
上述の多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(San Diego, Calif.)、Bachem CA（Terrence, Calif.)又はPeninsula Labs(Belmont, Calif.)のような市販元から得ることができる。
【０１３５】
所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固形担体から切断され、回収され、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬により固形担体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、残っている側鎖保護基も取り除く液体フッ化水素酸(ＨＦ)での酸分解により固相から取り外す。好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、酸分解反応混合物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＨＦ切断後、樹脂はエーテルで洗浄され、遊離ペプチドが酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。組み合わされた洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【０１３６】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストは過剰な補体活性化及び亢進された補体介在宿主防御メカニズムから恩恵を受ける症状の治療に有用性が見出される。ＣＲＩｇに対する抗体のようなＣＲＩｇアンタゴニストは、腫瘍（癌）治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは現在は十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織においてサイレントであるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱癌においては有意な量で発現される。DeSmet, C.等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。Ｔ細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘導されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine (1997) 3:682；Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1997) 94:8099；Lynch, D.H.等, Nature Medicine (1997) 3:625；Finn, O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol. (1998) 21:114。本発明によって設計され同定されたＣＲＩｇアンタゴニストはアジュバントとして単独で又は増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤は既知の投与方法を使用して一般的な量で投与することができる。本発明のＣＲＩｇアンタゴニストによる免疫刺激活性により、増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
【０１３７】
ある種のマクロファージは腫瘍根絶に関わっているけれども、多くの固形腫瘍は腫瘍増殖を支援するマクロファージを含んでいることが知られている（Bingle等, J Pathol 196:254-265 (2002)；Mantovani等, Trends Immunol 23:549-555 (2002)）。これらのマクロファージはその表面にＣＲＩｇを含みうる。ＣＲＩｇの補体活性化を阻害する能力をブロックする抗体を用いて腫瘍細胞上の補体を活性化させ、補体介在溶解により腫瘍を根絶するのを補助することができよう。このアプローチ法はＣＲＩｇ陽性マクロファージを含む腫瘍に特に有用であることが予想される。
【０１３８】
アンタゴニストの好ましい群には天然ＣＲＩｇに特異的に結合しその生物学的活性を阻害する抗体が含まれる。
【０１３９】
抗体（アゴニストとアンタゴニストの双方）の例には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的及びヘテロコンジュゲート抗体、及び抗体断片が含まれる。
【０１４０】
本発明のポリペプチドを認識してそれに結合し、又はそれに対するアンタゴニストとして作用する抗体は、あるいはモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１４１】
免疫剤は、典型的には本発明のＣＲＩｇポリペプチド、その抗原性断片又は融合タンパク質を含む。一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１４２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63］。
【０１４３】
ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、本発明のポリペプチドに対する又は本発明のポリペプチドと同様の活性を有するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは当該分野において知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１４４】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［上掲のGoding］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
【０１４５】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の一般的な免疫グロブリン精製法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製されうる。
【０１４６】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質をさもなければ生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［上掲の米国特許第４８１６５６７号；Morrison等］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１４７】
抗体は好ましくは一価抗体である。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１４８】
一価抗体の調製には、またインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成することができる。
【０１４９】
本発明の抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１５０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１５１】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１５２】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方は本発明のポリペプチドに対するものであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してであり得る。
【０１５３】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 [1983]）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１５４】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えば、Suresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５５】
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１５６】
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の効力を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５７】
また、本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞傷害性剤、あるいは放射性同位体（つまり、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体にも関する。
【０１５８】
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は上述の通りである。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１５９】
抗体及び細胞傷害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
【０１６０】
他の実施態様では、組織の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、ついで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞傷害性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１６１】
ＣＲＩｇ及びそのアゴニスト及びアンタゴニストは、天然ＣＲＩｇ分子の生物学的活性を模倣し又は阻害するかどうかを決定するために様々なインビトロ及びインビボアッセイにおいて試験することができる。
【０１６２】
補体活性化、特に代替補体経路を阻害するその能力の結果として、ＣＲＩｇポリペプチドは、補体関連疾患及び病理状態の予防及び／又は治療において有用性が見出される。このような疾患及び症状には、限定するものではないが、補体関連の炎症性及び自己免疫疾患が含まれる。
【０１６３】
補体関連疾患の特定の例には、限定するものではないが、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎及びその結果の糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺誘発性冠血管内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患及び他の補体関連の眼の症状、非滲出性及び滲出性ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎、ブドウ膜炎、同種移植、異物移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞肺促迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、遺伝性血管浮腫、発作性夜間血色素尿症、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、誤嚥性肺炎、蕁麻疹、例えば慢性特発性蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、子宮内膜症、心原性ショック、虚血再かん流傷害、多発性硬化症（ＭＳ）が含まれる。
【０１６４】
ＡＭＤは、６０歳以上の個人における不可逆的な視力障害の主たる原因である黄斑の加齢性変性症である。非滲出性（ドライ）及び滲出性（ウェット）ＡＭＤの２つのタイプのＡＭＤが存在している。ドライ又は非滲出型は中心網膜（黄斑）並びにＲＰＥ上の沈積物（ドルーゼ）の根底にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）内の萎縮及び異常肥大変化を含む。非滲出型ＡＲＭＤの患者は、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜、漏出液及び血液の下で発達し、最終的には網膜内及び網膜下で失明に至る円板状瘢痕を生じるＡＲＭＤのウェット又は滲出型まで進行しうる。通常は滲出型ＡＲＭＤの前躯体である非滲出型ＡＲＭＤはより一般的である。非滲出型ＡＲＭＤの提示は様々である；ハードドルーゼ、ソフトドルーゼ、ＲＰＥ地図状萎縮、及び色素凝集が存在しうる。補体成分はＡＭＤの早期にＲＰＥ上に付着し、ドルーゼの主要構成成分である。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形性がＡＭＤの起因リスクの５０％を占めることが最近報告されている（Klein等, Science 308:385-9 (2005)）。
【０１６５】
ＣＲＩｇは、カテゴリー３及びカテゴリー４ＡＭＤを含む高リスクのＡＭＤの治療において特に有用である。カテゴリー３ＡＭＤは、双方の眼に進行ＡＭＤがなく、少なくとも一つの眼が２０／３２又はそれ以上の視力、少なくとも一つの大きなドルーゼ（例えば１２５μｍ）、広範な（ドルーゼ面積で測定）中間ドルーゼ、又は黄斑の中心を含まない地図状萎縮（ＧＡ）又はこれらの任意の組合せを有することによって特徴付けられる。カテゴリー４高リスクＡＭＤは、２０／３２又はそれ以上の視力によって特徴付けられ、インデックス眼において進行ＡＭＤ（黄斑の中心又は脈絡膜血管新生の特徴を含むＧＡ）はない。他眼は進行ＡＭＤ、又はＡＭＤ黄斑症に帰す２０／３２未満の視力によって特徴付けられている。典型的には、未治療ならば、高リスクＡＭＤは、カテゴリー１又は２（高リスクではない）ＡＭＤの進行速度よりも約１０−３０倍高い速度で脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に速やかに進行する。従って、ＣＲＩｇはＣＮＶとＡＭＤの予防と治療に有用性が見出される。
【０１６６】
補体関連疾患の例としての炎症性症状のより広範なリストには、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
【０１６７】
全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心的な媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、続いての免疫媒介炎症の発生である。抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接的には関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発生に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的に冒される。
【０１６８】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、二つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１６９】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡと幾つかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は三つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１７０】
脊椎関節症は、幾つかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
【０１７１】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１７２】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体が多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
【０１７３】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴う場合がある。この疾患は、双方とも小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
【０１７４】
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、幾つかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベーチェット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１７５】
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【０１７６】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（幾つかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【０１７７】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
【０１７８】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
【０１７９】
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリンレセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
【０１８０】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、幾つかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
【０１８１】
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
【０１８２】
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
【０１８３】
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
【０１８４】
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
【０１８５】
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
【０１８６】
ＣＲＩｇの上に列挙した治療的用途に鑑みて、ＣＲＩｇの潜在的アゴニストは様々な細胞ベースアッセイ及び補体関連、炎症及び／又は自己免疫疾患又は障害の動物モデルで評価することができる。
【０１８７】
よって、例えば、関節炎の予防及び／又は治療における効力はコラーゲン誘発関節炎モデル（Terato等 Brit. J. Rheum. 35:828-838 (1966)）において評価することができる。潜在的な関節炎予防／治療薬は、Terato等, J. Immunol. 148:2103-8 (1992)；Terato等, Autoimmunity 22:137-47 (1995)に記載されたように、４種のモノクローナル抗体のカクテルの静脈内注射により誘発される抗体媒介関節炎モデルにおいてスクリーニングできる。またここの実施例４を参照のこと。関節炎の予防及び／又は治療のための候補は、例えばＴＮＦ-αトランスジェニックマウス（Taconic）のようなトランスジェニック動物モデルで研究することがまたできる。これらの動物は、ヒトリウマチ様関節炎の病因に結びつけられているサイトカインであるヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α）を発現する。これらのマウスにおけるＴＮＦ-αの発現は、前肢及び後肢の重症の慢性関節炎を生じ、炎症性関節炎の簡単なマウスモデルを提供する。
【０１８８】
最近、乾癬の動物モデルがまた開発された。よって、Asebia（ａｂ）、鱗状皮膚（ｆｓｎ）及び慢性増殖性皮膚炎（ｃｐｄ）は乾癬様皮膚変化を持つ自然マウス突然変異である。例えばインターフェロン-γ、インターロイキン-１α、ケラチノサイト増殖因子、トランスフォーミング増殖因子-α、インターフェロン-６、血管内皮増殖因子、又は骨形成タンパク質６のようなサイトカインの皮膚性過剰発現があるトランスジェニックマウスをまた使用して、インビボで乾癬を研究し、感染治療のための治療薬を同定することができる。乾癬様病巣はまたＰＬ／Ｊ系統に戻し交配したβ２-インテグリン低形質マウス及びβ１-インテグリントランスジェニックマウス、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉＴリンパ球で再構成されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス並びにＨＬＡ-Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニックラットにおいて記載されている。免疫不全マウスに移植されたヒト皮膚を使用する異種移植モデルもまた知られている。よって、本発明の化合物は、マウスが乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示すSchon, M.P.等, Nat. Med. (1997) 3:183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができる。他の適切なモデルは、Nickoloff, B.J.等, Am. J. Path. (1995) 146:580に記載されているようにして調製されるヒトｓｋｉｎ／ｓｃｉｄマウスキメラである。更なる詳細については、例えばSchon, M.P., J Invest Dermatology 112:405-410 (1999)を参照のこと。
【０１８９】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、対象の遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作製のための標準的技術を用いて、対象動物のゲノム中に導入することにより操作できる。トランスジェニック操作の標的となりうる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及び他のサルを含む。このような動物に導入遺伝子を導入するための当該分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第４８７３１９１号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性幹細胞での遺伝子ターゲティング（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子導入（Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説としては、例えば、米国特許第４７３６８６６号を参照のこと。
【０１９０】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれうる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えばLasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従えば、可能である。
【０１９１】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組込みの確認にはサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。ついで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。
【０１９２】
例えば免疫細胞の特定の細胞への浸潤を確定するための組織学的検査によって、免疫疾患病理の徴候について該動物を更に調べることができる。補体及び古典的及び代替経路を含む補体活性化又はＴ細胞増殖に対する効果の度合いを決定するためにＣＲＩｇ又は候補アゴニストでトランスジェニック動物を治療する遮断実験もまた行うことができる。これらの実験では、本発明のポリペプチドと結合する遮断抗体が動物へ投与され、興味ある生物学的効果がモニターされる。
【０１９３】
あるいは、「ノックアウト」動物は、ＣＲＩｇポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、動物の胚性細胞へ導入された同ポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ＣＲＩｇをコードする欠陥又は改変遺伝子を有するものとして構築することができる。例えば、ＣＲＩｇをコードするｃＤＮＡは、確立されている技術によって、ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに利用できる。ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡの一部は、その他の遺伝子、例えば組込みをモニターするために利用できる選択可能マーカーをコードする遺伝子によって置換え又は除去できる。典型的には、ベクターには数キロベースの未変化フランキングＤＮＡ（５'と３'末端の両方）が含まれる［例えば、相同組換えベクターの説明についてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照］。ベクターを胚性幹細胞株へ（例えば電気穿孔法等によって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、出産させて「ノックアウト」動物をつくり出す。その胚細胞に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定でき、それらを使用して動物の全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を飼育することができる。ノックアウト動物は、例えば、ＣＲＩｇポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けることができる。
【０１９４】
よって、潜在的ＣＲＩｇの生物学的活性は、以下の実施例７に記載されたように、マウスＣＲＩｇノックアウトマウスにおいて更に研究することができる。
【０１９５】
抗原誘発性気道反応亢進、好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同じタンパク質に動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。幾つかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）では、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候を示す。マウスモデルはヒト喘息の特徴の多くを有している。喘息治療における活性と有効性についてＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストを試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777とそこに引用されている文献に記載されている。
【０１９６】
接触性過敏症は、細胞媒介免疫機能の単純なインビボアッセイである。この手順において、遅発型過敏反応を生じさせる外因性ハプテンに表皮細胞を暴露し、反応を測定して定量する。接触過敏症は最初の感作段階に顕在化段階が続く。顕在化段階は表皮細胞がそれらが過去に接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫れと炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作製される。適切な手順は、Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1):37-44(1998)も参照のこと。
【０１９７】
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度の場合まで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上記のCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
【０１９８】
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、抗ウイルス及び腫瘍免疫におけるそれらの役割の指標であり尺度であるＴ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾-皮膚移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストの試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation (1994) 58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol. (1994) 4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【０１９９】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
【０２００】
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞の炎症と、続いての中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的にヒトにおけるＭＳの関連動物モデルであると考えられている。Bolton. C., Multiple Sclerosis (1995)1:143。急性及び再発寛解型モデルの双方が開発されている。ＣＲＩｇ及びそのアゴニスト及びアンタゴニストは上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.1及び15.2.に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Duncan. I.D.等, Molec. Med. Today (1997) 554-561に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患モデルも参照されたい。
【０２０１】
年齢関連性黄斑変性(ＡＭＤ)の動物モデルは、Ｃｃｌ-２又はＣｃｒ-２遺伝子に無発現変異を有するマウスからなる。これらのマウスは網膜色素上皮（ＲＰＥ）の中のリポフスチン及びその下のドルーゼの蓄積、光受容体萎縮及び脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を含むＡＭＤの主要な特徴を発症する。これらの特徴は６ヶ月の年齢を越えて発達する。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストはドルーゼの形成、光受容体及び脈絡膜血管新生について試験することができる。
【０２０２】
心筋虚血再灌流のモデルはマウス又はラットで実施することができる。動物を気管切開し、小動物人工呼吸器で酸素供給する。ポリエチレンカテーテルを平均動脈圧の測定のために内頸動脈と外頸静脈内に配する。心筋虚血再灌流は、冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を６-Ｏ縫合によって結紮することによって開始される。虚血は血管を完全に閉塞するためにＬＡＤの回りに可逆的な結紮糸を締めることによってつくり出される。結紮糸は３０分後に除去され、心臓は４時間灌流される。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストは、心臓梗塞サイズ、心臓クレアチンキナーゼ活性、ミエロペルオキシダーゼ活性及び抗Ｃ３抗体を使用する免疫組織化学の測定によってその効力を試験することができる。
【０２０３】
糖尿病性網膜症のモデルはストレプトゾトシンでのマウス又はラットの治療を含む。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストは、 細静脈拡張、網膜内微小血管異常、及び網膜及び硝子体腔の血管新生に対するその効果について試験することができる。
【０２０４】
膜性増殖性糸球体腎炎のモデルは次のようにして樹立することができる：雌マウスをＣＦＡ中の０．５ｍｇコントロールウサギＩｇＧを用いて腹腔内免疫する（−７日目）。７日後に（０日目）、１ｍｇのウサギ抗マウス糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体を尾静脈から静脈内注射する。血清中の抗ウサギＩｇＧ抗体の上昇をＥＬＩＳＡによって測定する。２４時間の尿試料を代謝ケージ中のマウスから集め、マウスの腎臓機能を、血中尿素窒素に加えて尿中タンパク質を測定することによって評価する。
【０２０５】
薬学的組成物
本発明に従って同定されたＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストは、炎症性疾患の治療のために、薬学的組成物の形態で投与することができる。
【０２０６】
治療製剤は、所望される度合いの純度を持つ活性分子を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製されて保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16版, Osol, A.編 [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）及び／又はトゥイーン（TWEENTM）、プルロニクス（PLURONICSTM）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０２０７】
リポフェクション又はリポソームを使用して、細胞中にポリペプチド、抗体、又は抗体断片を送達することができる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術（Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 [1993]）により生産することができる。
【０２０８】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に一つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでいてもよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は増殖阻害剤を含んでもよい。このような分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２０９】
また、活性分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０２１０】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２１１】
徐放性製剤を調製することもできる。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴTM（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフィア）等の分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に亘って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２１２】
次の実施例は例証のためにのみ提供するものであり、本発明の範囲を限定するものでは決してない。
【０２１３】
本明細書において引用された全ての特許及び文献はその全体を出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【０２１４】
実施例１
ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の決定
材料と方法
ａ．成熟ヒトＣＲＩｇタンパク質の生産と精製
配列番号２（配列番号８）の成熟ヒトＣＲＩｇの残基１〜１１９をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ２８ｂ発現ベクター(Novagen)のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングし、トロンビン切断部位が続くＮ末端Ｈｉｓタグを有する融合体をつくった。Ｎｉ-アフィニティークロマトグラフィーを使用した精製後に、融合タンパク質をトロンビンで消化させ、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。最終のタンパク質原液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有していた。セレノメチオニン標識タンパク質を、標準的なプロトコルを使用して得た。
【０２１５】
精製されたＣＲＩｇを５倍モル過剰でＣ３ｃ又はＣ３ｂと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。その試料を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌ中で１０−２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０２１６】
ｂ．結晶化
全ての結晶は懸滴蒸気拡散法を使用して１９℃で成長させた。
【０２１７】
ＣＲＩｇを、３０％のＰＥＧ４０００、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、及び０．２Ｍの酢酸アンモニウムを含むリザーバの等容量でタンパク質溶液を等しく混合することによって結晶化させた。結晶は３日後に形成された。１２％のＰＥＧ２００００、０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５を含むリザーバ溶液と１：１の比でタンパク質溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を混合することによってＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の結晶を得た。１２％のＰＥＧ２００００、０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５を含むリザーバ溶液の等容量とタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合することによってＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶を得た。結晶は３日後に形成された。
【０２１８】
ｃ．データ収集、構造解明及び緻密化
データ収集のために、２０％グリセロールを添加した溶液含有リザーバ中に結晶を短時間浸漬した後、液体窒素でフラッシュ凍結させた。全てのデータはＡＬＳビームライン５．０．２．で集め、ＨＫＬ２０００を使用して処理した(Otwinowski, Z.及びMinor, W., Methods Enzymol. 276:307-326 (1997))。未複合体化ＣＲＩｇの結晶は１．２Åの分解能で回折し、ａ＝３０．２、ｂ＝５０．７及びｃ＝６１．９Ａの格子パラメータの空間群Ｐ２１２１２１に属する。構造は複数の異常な分散系及びプログラムａｕｔｏ-ＳＨＡＲＰ（G. Bricogne, C. Vonrhein, C. Flensburg, M. Schiltz, W. Paciorek, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59, 2023 (2003)）を用いて解明した。 Ｒｅｆｍａｃ（G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240 (1997)）を用いる緻密化とプログラムＯ（T. A. Jones, J. Y. Zou, S. W. Cowan, Kjeldgaard, Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2), 110 (1991)）を用いたマニュアルでの調節によって、１４．９％のＲｃｒｙｓｔと１７．７％のＲｆｒｅｅのモデルを得た。Ｃ３ｃの結晶は３．１Åに回折し、ａ＝３８２Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å及びβ＝１０２．７°の格子パラメータの空間群Ｃ２に属し、非対称ユニットに二つの複合体を含んでいる。構造はＡＭｏＲｅ（Navazza J., Acta Crystallogr. A 50:157-163 (1994)）及び未結合ＣＲＩｇ及びＣ３Ｃモデル（ｐｄｂコード２Ａ７４）を使用して解明した。非結晶学的対称制約を適用する緻密化後の最終のＲｃｒｙｓｔ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２３．７％及び２９．７％であった。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶は４．１Å分解能に回折し、ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Åの格子パラメータの空間群Ｃ２２２２１に属する。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体を使用する分子置換後、ＣＵＢドメイン（ｐｄｂコード２Ａ７３）とＴＥＤドメイン（１Ｃ３Ｄ）を電子密度マップ中にマニュアルでドッキングさせた。剛性体緻密化後、ＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する領域並びに２つのグリコシル化部位の明確な密度は解釈可能な密度を有しており、電子密度中に嵌り込むことができた。最終モデルは、Ｃ３４５ＣドメインのないＣＲＩｇ及びＣ３ｂの複合体を含む；後者のドメインは非常に弱い密度を有しており、図１に対して０．０に設定された占有率でモデルに含められた。最終Ｒｃｙｓｔ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２５．２％及び３３．３％であった。
【０２１９】
結果
ａ．構造の決定
ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びｉＣ３ｂと複合体を形成するが、親分子Ｃ３に結合することができないことが最近確定された（K. Y. Helmy等, Cell 124, 915 (2006)）。ＣＲＩｇの選択性に対する構造的基礎をより良好に理解するために、その未結合状態におけるＣＲＩｇの結晶構造を高分解能で決定し、またＣ３ｂ及びＣ３ｃとの複合体についても決定した（それぞれ４．１Å及び３．２Å）。未結合ＣＲＩｇの構造を、３波長異常分散（ＭＡＤ）フェージングを使用して解明した（Hendrickson, W.A.等, Proteins 4:77-88 (1988)）。つづいて、複合体の構造を、サーチモデルとして、ＣＲＩｇ及びＣ３（２Ａ７３）、Ｃ３ｃ（２Ａ７４）、並びにＣ３ｄ（１Ｃ３Ｄ）の構造の様々なドメイン及び断片の座標を使用して分子置換によって解明した。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ構造は非対称ユニットに２分子を含み、非結晶学的対称制約を使用する緻密化後に、最終のＲ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２３．６％及び２９．５％であった。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の限られた分解能のため広範な位置的緻密化は可能ではない。しかしながら、様々なリンカーのモデル化及び個々のドメインの剛性体緻密化後、最終モデルのＲ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２４．８％及び３３．１％であり、構造が限られた分解能を考えると良い品質であることを示している。
【０２２０】
ｂ． Ｃ３ｂの全体構造
Ｃ３ｂの個々のドメインの構造は最近報告されたＣ３構造（上掲のJanssen等；D. Hourcade, V. M. Holers, J. P. Atkinson, Adv Immunol 45, 381 (1989)）と同様であるが、これらのドメインの配置はＣ３と比較するとかなり異なっている。簡単に述べると、残基１〜６４５からなるＣ３ｂのβ鎖は、５つのマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ１-ＭＧ５）、第６ＭＧドメインのＮ末端半分、リンカー領域（ＬＮＫ）（図１Ａ、Ｂ）に折り畳まれる。免疫グロブリントポロジーＭＧドメインは「キーリング」様形式に配置され、約１０Å幅で３０Å長の中央溝の回りを円で囲んでいる。Ｃ３ｂのα鎖は残基７２９：１６４１からなり、Ｃ３と比較してＣ３ａ又はＡＮＡドメインを欠いている。α'ＮＴドメインと呼ばれるＣ３ｂα鎖のＮ末端残基（７２９：７４５）は、伸展したコンフォメーションを採用し、第６ＭＧドメインの第２の半分を形成する残基につながっている。これに続いて、α鎖は間にＣＵＢドメインとチオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）が挿入された２つの更なるＭＧドメイン（ＭＧ７及びＭＧ８）を含んでいる。最後に、α鎖のＣ末端の１７０残基はいわゆる「アンカー領域」とＣ３４５Ｃドメインを形成している。
【０２２１】
ｃ． Ｃ３活性化時のコンフォメーション変化
Ｃ３、Ｃ３ｂ、及びＣ３ｃの構造の比較は、大きなコンフォメーション変化、つまりＣ３のＣ３ｂとＣ３ａへの開裂が活性化後直ぐに生じることを示している（図１Ａ、Ｂ）。Ｃ３中のＭＧ３及びＭＧ８ドメイン間に割り込んでいるＡＮＡドメインの放出により（上掲のF. Fredslund, J等）ＭＧ３とＭＧ８が回転させられる。これらのコンフォメーション変化によりＭＧ７ドメインが更に回転し、Ｃ３をＣ３ｃと比較した場合、上掲のJannsen等に記載されたα'ＮＴドメインの興味深い動きが生じる。Ｃ３ｃの場合と同様に、α'ＮＴはＣ３におけるよりもＣ３ｂにおいて更に溶媒露出性であり、補体活性化のレセプター及び調節因子、ＣＲ１、ＣＦＨ及びＢ因子のための多くの潜在的結合部位を示す（J. D. Lambris等, J Immunol 156, 4821 (1996)；A. Taniguchi-Sidle, D. E. Isenman, J Immunol 153, 5285 (1994)；A. E. Oran, D. E. Isenman, J Biol Chem 274, 5120 (1999)）。しかしながら、Ｃ３活性化によって誘導される最も大きな動きはＣＵＢ及びＴＥＤモジュールに関する。Ｃ３中のＴＥＤ及びＭＧ８に対して密接に充填されているＣＵＢはＭＧ８に対して約２５Å動き（図１Ｂ及び図６）、Ｃ３ｂ構造中においてＭＧ２と緩い相互作用のみを形成する。Ｃ３においてＴＥＤは、残基Ｃｙｓ９８８及びＧｌｎ９９１の間に形成されたチオ-エステル結合を溶媒から保護するＭＧ８ドメイン及びＣＵＢに対して堅固に埋もれている。活性化の際、ＴＥＤはＣＵＢ及びＭＧ８ドメインから離れる方向に回転しＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する残基を完全に異なったコンフォメーションで残す；これらの変化の過程において、Ｃｙｓ９８８は、Ｃ３構造中のその最初の保護された巣からＣ３構造中のその顕著に露出した位置まで８０Åを越えて移動する。
【０２２２】
Ｃ３は炎症疾患の発生率に影響を及ぼす２つの一般的なアロタイプで存在している（J. E. Finn等, Nephrol Dial Transplant 9, 1564 (1994)）。これらの変異体は単一のアミノ酸が異なる。更に一般的なアロタイプのＣ３Ｆは、８０位に大きい正荷電のアルギニンを有する一方、Ｃ３Ｓは小さい非荷電のグリシンを有している。残基Ｒ８０と回りのループはＣ３又はＣ３ｃの構造では相互作用を形成せず（上掲のJanssen等）、Ｒ８０と相互作用する他のタンパク質はこれまで同定されていない。Ｃ３ｂにおいて、このループはＭＧ１とＴＥＤドメイン間の多くの接触の原因であり、Ｒ８０はＴＥＤの表面上の負に荷電した溝に近接して位置している（図７）。Ｒ８０及びＴＥＤドメイン間の相互作用がＣ３Ｓ及びＣ３Ｆアロタイプ間の観察された差異の原因であるかどうかを確認するためには更なる実験が必要である。
【０２２３】
Ｃ３ｄ及びＣ３におけるαヘリックストロイドＴＥＤモジュールは多くの有意な差を示している（上掲のJanssen等）。最も重要な点は、−粒子表面へのＴＥＤドメインの共有結合に必要とされる−残基Ｈｉｓ１１０４及びＧｌｕ１１０６が互いに離れ、またＣｙｓ９８８から離れていることである。しかしながら、Ｃ３ｄにおいては、これらの残基は非常に近接しており、これは共有結合反応のための重要な必要条件である。ここに提示されたＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の分解能は個々のアミノ酸側鎖の正確な位置の検討を可能にするものではない一方、Ｃ３ｂ中のＴＥＤのコンフォメーションがＣ３ｄ構造に非常に類似していることは我々の構造から明らかである。Ｃ３とＣ３ｂ間の著しいコンフォメーションシフトにより、結合反応に重要なＴＥＤ残基が溶媒露出性になり、Ｃ３ｂ分子の遠位端に槍の穂先のように位置せしめられる。
【０２２４】
ｄ． ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃのβ鎖に結合する
配列解析によって予測されるように（K. Langnaese等, Biochim Biophys Acta 1492, 522 (2000)）、ＣＲＩｇのＮ末端ドメインは、位相幾何学的には、免疫グロブリン様ドメインのＩｇＶファミリーに属するが、プロテインデータバンクに現在寄託されている他のＩｇドメインと僅か約２０％の配列同一性を共有しているだけである。この折り畳みファミリーの全てのメンバーと同様に、ＣＲＩｇドメインは２つのβシートによって形成されている。これらのシートの一方はストランドＡ’、Ｇ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’及びＣ’’によって構成され、他方はストランドＢ、Ｅ、及びＤによって構成される（図２Ａ及び図８）。該ドメインは、ストランドＢ及びＦを内部で連結する２つのシステイン残基間に形成された正準なＩｇ様ジスルフィド結合によって更に安定化されている。
【０２２５】
ＣＲＩｇは同一の形式でＣ３ｂとＣ３ｃに係合し、両方のＣＲＩｇ複合体中に存在する全ての接触ドメインの配置は非常に類似している。これに沿って、Ｃ３ｂとＣ３ｃに対するＣＲＩｇの親和性は比較できる（図９）。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ構造の重ね合わせは、β鎖の６４２の共通のＣａ位置に対しては０．６Å未満で、Ｃ３ｃとＣ３ｂのα鎖の４７９Ｃａ原子に対しては０．５Å未満のＲＭＳＤになる。
【０２２６】
これまでに同定された全ての他の補体レセプターとは異なり（J. D. Lambris等, J Immunol 156, 4821 (1996)；A. Taniguchi-Sidle, D. E. Isenman, J Immunol 153, 5285 (1994)；A. E. Oran, D. E. Isenman, J Biol Chem 274, 5120 (1999)）、ＣＲＩｇは主にＣ３ｂのβ鎖に結合する。その未結合状態及び互いの複合体でのＣ３ｃ及びＣＲＩｇ構造の比較から、結合を亢進させるために２分子の何れにおいても有意なコンフォメーションの適応が必要とはされないことが明らかになった。ＣＲＩｇへの未結合（上掲のJanssen等）及び結合双方のＣ３ｃ構造における９６３の共通のＣａ位置は０．８ÅのＲＭＳＤで重ね合わさり、最も大きな動きは可動性領域で生じ、ただ一つの小さなループの移動がＭＧ６ドメインで生じる（結果を示さず）。ＣＲＩｇに対する結合部位は、ＣＵＢ及びＴＥＤドメインとはＣ３ｂの反対側にあり、ＴＥＤドメインから離れる方向におよそ４０Å離れてＣＲＩｇを位置させている。
【０２２７】
ＣＲＩｇとＣ３ｃ又はＣ３ｂの間の結合界面は大きく、不連続で、全体で約２６７０Å２の溶媒露出面積を埋めている（図２Ａ）。ＣＲＩｇはＣ３ｂと接触し、Ａ’、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’シートからの残基が、ストランドＣ’とＣ”の近傍の残基及びループによって形成された相互作用の大部分を有する。Ｃ’とＣ”を連結するヘアピンループは、Ｃ３ｂのキーリング形状のβ鎖の中心に形成された裂け目中に突出している。界面のＣ３ｂ側では、ドメインＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ５、ＭＧ６、ＬＮＫ及びＭＧ６が全てＣＲＩｇ結合に寄与し、埋まった界面のそれぞれ約３０％と４０％に対してＭＧ３とＭＧ６が原因となっている（図２Ｂ）。Ｃ３及びＣ３ｂ構造の比較は、Ｃ３ｂ及びＣ３ｃへのＣＲＩｇの結合のゲーティングにおけるＭＧ３ドメインの重要な役割を示唆している。Ｃ３活性化時に生じる大規模なドメイン移動とは別に、機能的な重要性を有することがある数種のより小さいドメインシフトがある。これらの間のキーは、比較的僅かであるが、Ｃ３分子の残りと比較してなお有意な１５°のＭＧ３の回転である。この回転は、ＣＲＩｇ結合部位を構成する他のＭＧドメインのリングに関したＭＧ３の相対的再配向の原因であり、ＬＮＫ領域の螺旋部分の動きと連係して（図９）、ＣＲＩｇをＣ３ｂ及びＣ３ｃに結合させる；これらの中程度の変化がないと、Ｃ３はＣＲＩｇにはラッチされないであろう。
【０２２８】
重要な結合パラメータを次の表１にまとめる。
【０２２９】
実施例２
ＣＲＩｇ変異体
構造複合体によって明らかになった結合界面の重要性を機能的に検証するために、次のＣＲＩｇ変異体をデザインし、製造し、Ｃ３ｂに結合するそれらの能力を試験した：次の表２において、番号はシグナル配列切断部位の開始位置を示す。
表２
変異体 アミノ酸置換
Ａ Ｅ８５Ａ Ｍ８６Ａ
Ｂ Ｈ５７Ａ Ｑ５９Ａ
Ｃ Ｖ１０７Ｓ Ｄ１０９Ｒ Ｉ１１１Ｅ
Ｄ Ｌ３４Ｓ Ｋ３６Ｄ Ｌ３８Ｈ
Ｅ Ｐ９１Ａ Ｔ９３Ａ Ｄ９５Ａ
コントロール Ｈ２１Ａ Ｔ２３Ａ Ｄ２５Ａ
【０２３０】
変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用して作製し、プライマーは製造者の指示に従って設計した。二重又は三重変異体を用いた結合実験の結果は結晶学的に定めたタンパク質-タンパク質接触と密接に一致している（図２Ｂ）。ＭＧ６及びＭＧ３結合ドメイン（Ｅ８５Ａ Ｍ８６Ａ及びＨ５７Ａ Ｑ５９Ａ）における変異がＣＲＩｇのＣ３ｂへの結合を最も効果的に抑止し（ＩＣ５０値はｗｔＣＲＩｇと比較して＞１００００及び１００倍高かった）、ＣＲＩｇ結合におけるこれらのドメインの相互作用の重要性を示している。これに対して、結合界面とは反対側に位置するＣＲＩｇ表面残基における変異は、野生型分子と同様の結合活性を示し、これらの変異が分子の全体の折り畳みを変えないことを確認した。また、円二色性分光法を更に使用して、全ての変異タンパク質が正しく折り畳まれたことを確認した（結果は示さず）。
【０２３１】
実施例３
Ｃ３ｂへのＣＲＩｇの結合は補体の代替経路を阻害する
ＡＰ及び古典／ＭＢＬ経路双方のＣ５転換酵素がＣ３ｂサブユニットを含んでいるので（Pangburn及びMuller-Eberhard, Biochem J., 235:723 (1986)）、我々は、ＣＲＩｇがそのＣ３ｂへの結合を介して補体活性化の何れかの経路を調節できるかどうかを問うた。ＣＲＩｇは代替経路を介する補体活性化を阻止したが、古典又はＭＢＬ経路はしなかった（図３ａ）。この阻害活性はＣ３ｂ結合活性を欠いたＣＲＩｇ変異体では失われており、ＣＲＩｇ-Ｃ３ｂ結合が転換酵素活性を乱す直接の原因であることを確認した。ＣＲＩｇによるＡＰの選択的阻害は、代替及び古典／ＭＢＬ経路を区別する細胞ベースアッセイで更に確認した。ＩＣ５０は、ＣＲＩｇがＩｇＧのＦｃ部分に融合された場合に２倍まで減少した（図Ｓ６Ａ）。ＣＲＩｇは代替経路の選択的インヒビターであるので、ＣＲＩｇは古典経路によって開始される代替経路溶血を阻害することができる（図Ｓ６Ｂ）。代替経路阻害は、マウスＣＲＩｇにおいて保持されており（図Ｓ３Ｃ）、ＣＲＩｇの補体阻害活性は系統的に保存されていることを確認した。
【０２３２】
ＣＲＩｇが転換酵素を阻害する分子メカニズムを更に決定するために、Ｃ３及びＣ５転換酵素のＣ３ｂサブユニットとのＣＲＩｇの相互作用を精製した成分を使用して研究した。ＣＲＩｇは、減少したＣ３ａ生産によって示されるように液相Ｃ３転換酵素を阻害することができた（図３Ｂ）。ＣＲＩｇはまたザイモサン粒子の表面に集まったＣ５転換酵素の酵素活性を減少させた（図３Ｃ）。様々なＣＲＩｇ変異体の阻害活性はＣ３ｂサブユニットへのその親和性と相関しており、Ｃ３ｂへのＣＲＩｇの結合がＣ５転換酵素の活性を直接調節することを示している。これは、Ｃ３ｂβ鎖へのＣＲＩｇの結合が代替経路の転換酵素によってＣ３とＣ５の双方の切断を妨害することを示している。
【０２３３】
実施例４
ＣＲＩｇは関節炎のマウスモデルにおいて補体活性化を阻害する
材料と方法
ａ．マウスにおける関節炎の誘発
コラーゲン誘発関節炎を、他に記載されているようにして（K. H. Barck等, Arthritis Rheum 50, 3377 (2004)）実施した。マウスに、２１日目に開始して４ｍｇ／ｋｇのＣＲＩｇ-Ｉｇ融合タンパク質を、又は一次免疫後３６日目に開始して１２ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を皮下的に注射した。ＣＲＩｇ-Ｉｇ融合タンパク質では、マウスＣＲＩｇ細胞外ドメインをＩｇＧ１分子のマウスＦｃ部分に融合させている。抗体誘発関節炎は関節炎誘発性混合物を使用してＴｅｒａｏと同僚の方法（K. Terato等, J Exp Med 162, 637 (1985)）によって誘発させた。簡単に言えば、マウスに尾静脈から２ｍｇの抗ＣＩＩＡｂ（２ｍｇ／５００μｌ／体）を静脈内注射し、３日後に２５μｇのＬＰＳ（２５μｇ／１００μｌ／体）を腹腔内注射した。骨体積の測定と組織検査を、他に記載されているようにして（上掲のBarck等）実施した。
【０２３４】
ｂ．関節炎の後足におけるサイトカイン濃度の測定
屠殺したマウスの後足蹠を毛の生え際で切断し、液体Ｎ２で凍結させた。ポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA）を使用して２５ｍｌ当たり１完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche）を補填した氷冷ＲＩＰＡ可溶化バッファー中で足蹠をホモジナイズさせた。均質化に使用したＰＢＳの体積を、バッファー１ミリリットル当たり７５ｍｇの組織に調節した。ホモジネートを１８７０×ｇで１５分間遠心分離し、上清を１３２３０×ｇで５分間遠心分離した。その上清をＥＬＩＳＡ分析にかけた。マウスＩＬ-１β及びＩＬ-６（BD DuoSet）及びｍＣ３ａ（Bachem）のＥＬＩＳＡキットを、各ＥＬＩＳＡキットのプロトコルに従って使用した。Ｃ５ａは、製造者のプロトコル（ＢＤ）に従ってＣ５ａ-ｄｅｓａｒｇのネオ-エピトープに対する特異的抗体のセットを使用してＥＬＩＳＡによって測定した。上清中の全タンパク質濃度はＢＣＡキット（Pierce）を使用して測定した。サイトカインとケモカインの濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのピコグラムで表した。
【０２３５】
ｃ．ＥＬＩＳＡ解析
Ｃ３ａ及びＣ５ａのＥＬＩＳＡは、ＢＤからの捕捉及び検出抗体を使用して、又はマウスＥＬＩＳＡキットを使用して確立した。Weilisa全補体スクリーン：プロトコルはキットによって提供された指示書に従った。ＣＰの潜在的なＣＲＩｇ阻害を評価するために、Ｂ因子枯渇血清を使用した。ＡＰのＣＲＩｇ阻害を決定するために、Ｃ２枯渇血清を使用した。
【０２３６】
ｄ．関節炎の後足におけるサイトカイン濃度の測定
屠殺したマウスの後足蹠を毛の生え際で切断し、液体Ｎ２で凍結させた。ポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA）を使用して２５ｍｌ当たり１完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche）を補填した氷冷ＲＩＰＡ可溶化バッファー中で足蹠をホモジナイズさせた。均質化に使用したＰＢＳの体積を、バッファー１ミリリットル当たり７５ｍｇの組織に調節した。ホモジネートを１８７０×ｇで１５分間遠心分離し、上清を１３２３０×ｇで５分間遠心分離した。その上清をＥＬＩＳＡ分析にかけた。マウスＩＬ-１β及びＩＬ-６（BD DuoSet）及びｍＣ３ａ（Bachem）のＥＬＩＳＡキットを、各ＥＬＩＳＡキットのプロトコルに従って使用した。Ｃ５ａは、製造者のプロトコル（ＢＤ）に従ってＣ５ａ-ｄｅｓａｒｇのネオ-エピトープに対する特異的抗体のセットを使用してＥＬＩＳＡによって測定した。上清中の全タンパク質濃度はＢＣＡキット（Pierce）を使用して測定した。サイトカインとケモカインの濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのピコグラムで表した。
【０２３７】
結果
補体活性化の可溶型調節因子は炎症に至る補体活性化を阻害する強力な治療的ツールであることが証明された（H. F. Weisman等, Science 249, 146 (1990)；B. P. Morgan, C. L. Harris, Mol Immunol 40, 159 (2003)）。ＣＲＩｇの治療上の潜在性を、コラーゲン自己抗体及び補体活性化が疾患の原因に寄与するリウマチ様関節炎の二つのマウスモデルで試験した（A. Aggarwal等, Rheumatology (Oxford) 39, 189 (2000)；S. Solomon等, Arthritis Res Ther 7, 129 (2005)；K. Terato等, J Immunol 148, 2103 (Apr 1, 1992)）。インビボでのその薬理学的半減期を延長させるために、ｍｕＣＲＩｇの細胞外ドメインをマウスＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させた。ＣＲＩｇは、関節炎の臨床的徴候の前又は後で与えられたとき、関節膨張、組織学的スコア及び骨量減少を有意に減少させた（図４Ａ及びＢ、Ｓ１２）。その転換酵素活性の阻害に沿って、ＣＲＩｇは、軟骨表面上のＣ３沈着の減少によって示されるように（図４Ｃ）、関節において補体活性化を有意に減少させた。既に確認された疾患を持つマウスでは、ＣＲＩｇは関節の裏にあるＣ３と共に同時局在化され（図４Ｄ）、それが転換酵素に結合し、転換酵素を局所的に阻害することができることを示している。また、Ｃ３ａの局所レベル及びＣ５ａの全身レベルは、コントロール-Ｆｃ処置マウスにおけるよりもＣＲＩｇ-Ｆｃ処置において有意に低くなっていた（図４Ｅ）。これらの結果は、ＣＲＩｇが、局所的及び全身性補体活性化を阻害することによって疾患のエフェクター相において関節炎を阻害することを示している。ＣＲＩｇの保護活性は、Ｆｃレセプター結合を消失させるＣＲＩｇ-ＦｃのＦｃ部分の変異が、ｗｔＦｃタンパク質に融合したＣＲＩｇと等価な活性を有していたので、Ｆｃレセプター機能と独立であった（結果は示さず）。これらの結果に基づくと、ＣＲＩｇの単一ＩｇＶ様ドメインは補体介在疾患において代替経路を阻害する有望なタンパク質治療剤となりうる。
【０２３８】
実施例５
ＣＲＩｇは基質-酵素結合の阻害によりＡＰ転換酵素を阻害する
材料と方法
ａ．崩壊促進アッセイ
代替経路ＤＡＡに対するマイクロタイタープレートアッセイを過去に記載されているようにして（M. Krych-Goldberg等, J Biol Chem 274, 31160 (1999)）実施した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水中４μｇ／ｍｌのＣ３ｂで一晩被覆した。プレートを、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で３７℃にて２時間ブロックし、７１ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び４％のＢＳＡを含むベロナールバッファー中の４０ｎｇのＢ因子、１０ｎｇのＤ因子、及び０．８ｍＭのＮｉＣｌ２と共に室温で２時間インキュベートした（バッファーの濃度と組成はプロトコルでチェック）。ついで、ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（PBST）中のＨ因子又はＣＲＩｇ-ＨｉｓＥＣＤと共に室温で１５分間インキュベートして、プレート上のＣ３ｂからＢｂを解離させた。ついで、Ｂｂを、１：５０００の希釈のＰＢＳＴ中ヤギ抗ヒトＢ因子ポリクローナル抗体（Kent）と１：３０００の希釈のＰＢＳＴ中西洋わさびペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギ抗体（Caltag）と共に連続１時間インキュベートして検出した（希釈と二次抗体をプロトコルでチェック）。色はＯ-フェニレンジアミンで発色させた。このアッセイにおいて、Ｈ因子は予想された通りに崩壊促進活性のメディエーターとして挙動した。
【０２３９】
ｂ．Ｃ３ｂ-Ｃ４ｂ及びＣ３ｂ-Ｃ３ｂ二量体調製及び結合／競合アッセイ
Ｃ３ｂＣ４ｂヘテロ二量体を次の変更をして（S. Meri, M.K. Pangburn, Eur. J. Immunol. 20:2555 (1990)）本質的に他に記載されているようにして（S. Meri, M. K. Pangburn, Eur J Immunol 20, 2555 (1990)）作製した。Ｃ３ｂ-Ｃ４ｂヘテロ二量体とＣ３ｂホモ二量体へのＣＲＩｇの結合を決定するために、マキシソープ９６ウェルマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗Ｃ３ポリクローナル抗体（ＩＣＮ）で４℃にて一晩被覆し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ついで、プレートを室温で２時間、２５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックし、滴定量のｈＣＲＩｇ-Ｌ ＬＦＨを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中で１時間加えた。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、ＣＲＩｇ結合を、ＰＢＳＴ／１％ＢＳＡ中の１：２００００希釈のＨＲＰにコンジュゲートしたマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（SIGMA）で検出した。ついで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００ｕｌのＴＭＢ基質溶液（KPL）で展開させ、５０ｕｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｃ５がこの形態においてＣ３ｂ-Ｃ４ｂヘテロ二量体及びＣ３ｂホモ二量体の双方に結合することがまた決定された。ＣＲＩｇがＣ３ｂ-Ｃ４ｂ又はＣ３ｂ-Ｃ３ｂへのＣ５の結合をブロックすることができるかどうかを決定するために、補体二量体を捕捉し上述のようにブロックした。２０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むバッファーに希釈して、４００ｎＭのＣ５を滴定濃度のｈＣＲＩｇ-Ｓ ＨｉｓＥＣＤ又はＣ３ｂに結合しないこの融合体の変異型と前もって混合し、室温で１時間、捕捉した二量体に加えた。ついで、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｃ５を、１：５０００のＰＢＳＴ希釈のマウス抗ヒトＣ５（Quidel）と１：３０００のヤギＦ'ａｂ抗マウス抗体（Caltag）の段階的添加によって検出した。該プレートを上のようにして発色させ、２つのウェルのＡ４１５を平均化し単一の点と考えた。
【０２４０】
結果
補体活性化の全ての既知の調節因子は、Ｃ３のＩ因子介在性切断のコファクターとして作用し、又はＣ３ｂへの結合についてＢｂの競合体であり、よって転換酵素活性を除去する（D. Hourcade等, Adv Immunol 45, 381 (1989)；T. Seya, J. P. Atkinson, Biochem J 264, 581 (1989)；X. Sun等, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 628 (1999)）。これに対して、ＣＲＩｇは崩壊活性もコファクター活性も示さない。また、ＣＲＩｇは、Ｈ因子、Ｂ因子又はプロパージンのＣ３ｂへの結合と干渉しない（図Ｓ１３Ａ−Ｃ、結果は示さず）。ＣＲＩｇがＡＰ補体活性化を阻害するメカニズムを更に探究するために、我々はＣＲＩｇがＣ５転換酵素の触媒性ＢｂサブユニットとよりもむしろＣ３ｂの機能と干渉するかどうかを決定した。代替経路転換酵素の非触媒性Ｃ３ｂサブユニットは基質Ｃ３及びＣ５の結合の原因である。ついで、転換酵素のＢｂ因子サブユニットはプロテアーゼとして作用することができ、結合した基質を切断する（W. Vogt等, Immunology 34, 29 (1978)）。その結果、転換酵素の活性はＣ３ｂに対する基質の親和性に直接的に比例する（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Immunol 164, 1379 (2000)）。ＣＲＩｇはＡＰ転換酵素のＣ３ｂ２サブユニットへのＣ５の結合を防止するが、ＡＰに対するその選択性と一致して、Ｃ５転換酵素（図５Ａ）はＣＰ転換酵素のＣ３ｂＣ４ｂサブユニットに対して効果は有していない。Ｃ５転換酵素の活性に対するＣＲＩｇの結合の重要性を、精製されたＣ５転換酵素で更に決定した（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Biol Chem 273, 16828 (1998)）。ＣＲＩｇの存在下ではｓ、酵素のＶｍａｘは〜５０％減少し（図５Ｂ）、これは、ＣＲＩｇが基質濃度とは独立にＣ３ｂへのＣ５の最大結合能を阻害することを示している。これは、ＣＲＩｇによるＣ３ｂへのＣ５の結合の立体的又はアロステリックな阻害の指標であり、Ｃ３ｂへの結合に対するＣ５とのＣＲＩｇの直接の競合ではない。これは、Ｃ５がＣ３ｂへの結合についてＣＲＩｇと競合できない結合アッセイからの結果によって更に裏付けられている（図１４）。よって、Ｃ３ｂのキーリング様β鎖構造の中心に結合したＣＲＩｇは転換酵素へのＣ５の結合をブロックすることができ、よって酵素の活性を阻害する。これは、Ｃ５-転換酵素のその基質との相互作用に対するＣ３ｂのβ鎖の重要性を示している（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Biol Chem 273, 16828 (1998)）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ特異的レセプターＣＲＩｇ（以前はＳＴＩｇＭＡと呼ばれていたもの）と、補体Ｃ３のＣ３ｂ及びＣ３ｃサブユニットとのその複合体（Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体）の結晶構造の決定に関する。本発明は更にＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストを含むＣＲＩｇに構造的及び／又は機能的に関連する分子をスクリーニングし同定するためのＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、通常は不活性なプロ酵素形態で存在している一連の血清糖タンパク質から構成される複雑な酵素カスケードである。Ｃ３は、補体の古典的、レクチン及び代替経路の３つの主要な経路の収束点を表すので、補体活性化において重要な役割を果たしている。Ｃ３は２０種を超えるタンパク質と（M. J. Walport, N Engl J Med 344, 1058 (2001)及び(M. J. Walport, N Engl J Med 344, 1140 (2001)）タンパク分解酵素Ｃ３転換酵素（J. Janssen等, Nature 437, 505 (2005)）によるその切断後にのみさらされる多数の別個の結合部位を介して相互作用する。最初のタンパク質切断段階はアナフィラトキシンとも呼ばれる小さい（９ｋＤａ）Ｃ３ａペプチドと大きな（１７７ｋＤａ）Ｃ３ｂ断片を生成する。Ｃ３からＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断は、分子を粒子表面に共有的に結合させることができるＣ３ｂ中の埋設チオ-エステル結合を露出させる立体構造変化を誘発する。「オプソニン化」と言われるこの過程は、粒子を標的にしてマクロファージ特異的レセプターに結合させ、ついで系から粒子を除去する。
【０００３】
最近、ＣＲＩｇがＣ３ｂ／ｉＣ３ｂオプソニン化粒子に対するレセプターとして同定された（K. Y. Helmy等, Cell 124, 915 (2006)）。ＣＲＩｇはＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ、並びにＣ３ｃに結合するが、不活性な前駆体Ｃ３との複合体を形成することはできない。
【０００４】
オプソニンとしてのその機能に加えて、Ｃ３ｂは補体のＣ３及びＣ５転換酵素のサブユニットである。Ｃ３ｂはセリンプロテアーゼ因子Ｂに結合する（W. Vogt, G. Schmidt, B. Von Buttlar, L. Dieminger, Immunology 34, 29 (1978)；Z. Fishelson, M. K. Pangburn, H. J. Muller-Eberhard, J Biol Chem 258, 741 1 (1983)）。この複合体は、Ｄ因子の補充とＤ因子による活性化後に、代替経路（ＡＰ）の活性なＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂ複合体を形成する。Ｃ３転換酵素への第二Ｃ３ｂ分子の付加は、実験的動物モデルにおいて炎症を媒介し、ヒト自己免疫及び炎症性疾患を媒介する際に重要な役割を果たすことが証明されている（M. J. Walport, K. A. Davies, B. J. Morley, M. Botto, Ann N YAcadSci 815, 267 (1997)）補体の代替経路のＣ５転換酵素である(Ｃ３ｂ)２Ｂｂの形成を生じる。代替経路転換酵素のＣ３ｂサブユニットは各基質Ｃ３又はＣ５に対してドッキング部位となり、転換酵素の触媒活性に必要とされる（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Immunol 164, 1379 (2000)）。補体の代替経路は、代替、古典及びマンノース結合レクチン経路の３つの経路の何れかを通して開始される補体活性化を増幅させる。その結果、代替経路の調節因子である補体Ｈ因子の欠損が炎症の増幅を招く（N. Rougier等, J Am Soc Nephrol 9, 2318 (1998)；M. A. Abrera-Abeleda等 J Med Genet (Nov 18, 2005)）。よって、代替経路補体転換酵素によるＣ３及びＣ５の切断がオプソニン化、転換酵素の生成及び炎症を生じさせる。
【０００５】
転換酵素の中心的成分として、Ｃ３ｂは数多くの補体調節因子の標的となる。これらには補体レセプター１（ＣＲ１）、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、補体関連レセプターｙ（Ｃｒｒｙ）、Ｈ因子及びＩ因子（D. Hourcade, V. M. Holers, J. P. Atkinson, Adv Immunol 45, 381 (1989)）がある。Ｉ因子の結合はタンパク質分解を介してＣ３ｂの不活性化を生じてＣ３ｂ及びＣ３ｆ（２ｋＤａ）を形成し、チオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）を含み標的に結合したままであるＣ３ｄｇ（４０ｋＤａ）と、Ｃ３ｃ（１３５ｋＤａ）を最終的に生成する。Ｃ３及びＣ３ｃの結晶構造に関する最近の報告は、Ｃ３が活性化される機序の我々の理解を顕著に向上させた（上掲のB. J. Janssen等, 2005）。Ｃ３ｃはＣ３と比較して著しい構造変化を示し、複数のタンパク質分解切断段階の結果を反映している。これらの構造研究はＣ３活性化及び調節の立体構造依存的機序を示唆しているが、活性化種Ｃ３ｂの立体構造に対する回答を提供するものではない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、病原体の排除に必要なマクロファージ補体レセプターＣＲＩｇの結晶構造を提供する。また、ＣＲＩｇとの複合体でのＣ３ｂ及びＣ３ｃの結晶構造が提供される。天然細胞性レセプター及び補体活性化の調節物質との複合体での転換酵素サブユニットのこの第一構造が補体活性化及び調節の機序の我々の理解を改善する。本発明はまたＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストを含むＣＲＩｇに機能的に関連した分子を同定するために使用することができる、ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合領域、及びそのような結合に関与するＣ３ｂ内のドメイン及び配列についての情報を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体により形成された結晶に関する。
【０００８】
一実施態様では、該結晶は、格子定数(セル定数)ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Å、及びＰ２１２１２１の空間群をおよそ有している。
【０００９】
他の実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される。
【００１０】
更に他の実施態様では、ＣＲＩｇの機能的断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００１１】
更なる実施態様では、結晶は約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００１２】
また更なる実施態様では、本発明はアペンディクス１に示された構造座標を有するＣＲＩｇ結晶に関する。
【００１３】
他の態様では、本発明は上述のような結晶を含んでなる組成物に関する。
【００１４】
また他の態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｂとの複合体の結晶形態に関する。
【００１５】
一実施態様では、複合体の結晶形態は、格子定数ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群をおよそ有している。
【００１６】
他の実施態様では、複合体の結晶形態は、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドの一つを含む。
【００１７】
更なる実施態様では、機能的ＣＲＩｇ断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００１８】
また更なる実施態様では、複合体の結晶形態は、約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００１９】
更に他の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｂ複合体の結晶形態はアペンディクス２に示された構造座標を有する。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｃとの複合体の結晶形態に関する。
【００２１】
特定の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｂ複合体の結晶形態は、格子定数ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群をおよそ有している。
【００２２】
他の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３Ｃ複合体中に存在する天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される。
【００２３】
また他の実施態様では、複合体中に存在するＣＲＩｇ機能的断片は天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である。
【００２４】
更なる実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｃ複合体の結晶形態は、約１から４０Åまでの分解能、又は少なくとも約５Å、又は少なくとも４Å又は少なくとも３Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する。
【００２５】
特定の実施態様では、ＣＲＩｇ：Ｃ３ｃ複合体はアペンディクス３に示された構造座標を有する。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、配列番号２のＣＲＩｇポリペプチド又はその保存的置換のＣ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる分子又は分子複合体であって、結合部位が、８、１４−１５、４１−４２、４４、４５−４７、５０、５２、５４−６１、６２、６４、８５−８７、８９、９５、９９、１０５、１０７−１１０、及び１１１からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含み、結合部位がアペンディクス２に記載の構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から４．７Å未満の距離を有する点の集合によって定まる分子又は分子複合体に関する。
【００２７】
他の態様では、本発明は、点の少なくとも一部が、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位を定める少なくともコアアミノ酸の骨格原子の位置を表すアペンディクス２の構造座標から誘導されている点の三次元立体構造に関する。点の三次元立体構造は、限定するものではないが、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位が空間群対称Ｃ２２２１を有する結晶を形成する、ホログラフィー像、立体ダイアグラム、モデル、又はコンピュータ・ディスプレイ画像として示されうる。
【００２８】
また他の態様では、本発明は、機械可読データでコードされたデータストレージ材を含む機械可読データストレージ媒体であって、該データを使用するための指示書を用いてプログラムされた機械が、Ｃ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる少なくとも一つの分子又は分子複合体の三次元グラフィック図を表示し、点の集合によって定まった結合部位が、アペンディクス２に記載された構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から約４．７Å未満の距離を有している媒体に関する。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物を設計することを含むＣＲＩｇアゴニストを同定する方法に関する。
【００３０】
本発明は更に（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定された化学物質に関する。
【００３１】
特定の実施態様では、上記の化学物質はＣＲＩｇとＣ３ｂの間の結合をインビボ又はインビトロで妨害する。
【００３２】
本発明は更に天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む分子又は分子複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本特許又は出願ファイルはカラーで作製した少なくとも一図面を含んでいる。カラー図面の本特許又は特許出願のコピーは請求し必要な料金を支払えば特許庁から提供されるものである。
【図１】Ｃ３及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体のドメイン構造及び全体構造。（Ａ）Ｃ３のドメイン組織、β鎖を緑色、α鎖を青緑色（ＡＮＡドメイン）、オレンジ色（ＣＵＢ）、青色（ＴＥＤ）、及び紫色で示す。赤色の球は、チオ-エステルの位置を示している。（Ｂ）天然Ｃ３（左側）、ＣＲＩｇとの複合体としてのＣ３ｂ（中央）、及びＣＲＩｇとの複合体としてのＣ３ｃのリボン図。図１Ａのカラースキームを使用し、ＣＲＩｇの表面を黄色で示す。Ｃ３とＣ３ｂを比較する場合ＣＵＢ及びＴＥＤドメインの大きな動きに留意のこと。活性化後、ＴＥＤはＣ３ｂの残りと比較して移動し回転し、Ｃｙｓ９８８は８０Åを越えて移動する。（Ｃ）図１Ｂの概略図；病原体に対するＣ３ｂの潜在的な共有結合がＣ３Ｂ：ＣＲＩｇ複合体において示されている。
【００３４】
【図２】ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃのβ鎖キーリングの中心に結合する。（Ａ）Ｃ３ｃ及びＣＲＩｇの複合体。Ｃ３ｃの表面を白色にしたα鎖の残基と共に示し、β鎖のＭＧ１、ＭＧ２、ＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ６、及びＬＮＫドメインはそれぞれ白色、オレンジ色、赤色、淡緑色、青色及び暗緑色にした。ＣＲＩｇはリボン図として示し、全てのβ鎖及びＮ末端及びＣ末端を標識した。（Ｂ）図２ＡからＹ軸の回りに１８０度回転させたＣＲＩｇの表面図。Ｃ３ｃ／Ｃ３ｂに対して４．５Ａ未満の距離である全原子は、図２Ａにおいてそれらが接触している残基と同様に着色した。（Ｃ）ＣＲＩｇ野生型及びカラーのコードされたＣＲＩｇ変異体の相対的親和性。親和性は、プレート上の被覆Ｃ３ｂへの結合についてＣＲＩｇ-ＬＦＨとの様々なＣＲＩｇタンパク質の競合によって決定した。ＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合は抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。（Ｄ）図２Ｃに示した結合実験に使用したＣＲＩｇ変異を示すＣＲＩｇの表面。変異された残基は、図２Ｃにおいてそれらが表す結合曲線に従って着色した。
【００３５】
【図３】ＣＲＩｇは補体の代替（ＡＰ）経路を阻害するが、古典（ＣＰ）経路を阻害しない。（Ａ）ＣＲＩｇはＡＰを介したＣ５ｂ-９沈着を阻害するが、ＣＰ又はＭＢＬ経路のものは阻害しない。補体経路はＬＰＳ（ＡＰ）又はＩｇＭ（ＣＰ）で被覆されたプレート上で再構成され、Ｃ１ｑ欠損（ＡＰ）又はｆＢ欠損（ＣＰ）血清と共にインキュベートした。補体活性化は、Ｃ５ｂ-９への結合ＨＲＰＯコンジュゲート抗体の検出について色素源によって決定した。ＡＰアッセイにおけるＣＲＩｇのＩＣ５０値は１．４９±０．１９μＭ（ｎ＝３）である。（Ｂ）ＣＲＩｇは液相Ｃ３転換酵素活性を阻害する。Ｃ３、ｆＢ及びｆＤを、増大する濃度のｈｕＣＲＩｇ(Ｌ)-ＥＣＤの存在下でベロナールバッファー中でインキュベートした。反応をＥＤＴＡで停止させ、切断産物をクーマシー染色ゲル（左パネル）又はＥＬＩＳＡ（右パネル）で可視化した。ＣＲＩｇ-ＥＣＤに対するＩＣ５０値は０．３９±０．１４μＭ（ｎ＝３）である。（Ｃ）ＣＲＩｇはザイモサン粒子の表面上に集められたＣ５転換酵素を阻害する。ザイモサン粒子はｆＢ及びｆＤの存在下でＣ３ｂでオプソニン化され、Ｃ５転換酵素を生成する。固定濃度のＣ５を、増加する濃度のＣＲＩｇ ｗｔ又はＣＲＩｇ変異体Ｃ（ＣＲＩｇ（Ｃ））の存在下で転換酵素と混合した。転換酵素活性は、溶血アッセイを使用して液相中に生産されたＣ５ｂ６を測定することによって決定した。ＩＣ５０値：ＣＲＩｇ（Ｗｔ）１．６３±０．６２μＭ（ｎ＝３）、ＣＲＩｇ（Ｅ）６．５２±３．２１μＭ（ｎ＝３）。
【００３６】
【図４】全身的に投与されたＣＲＩｇ-Ｆｃは抗体誘発関節炎に伴う局所的及び全身的補体活性化を阻害する。（Ａ）コラーゲンでの二次免疫から７日後の、既に確認された疾患のｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃで治療されたマウスにおける炎症の減少（組織学的スコア）及び骨変形の減少（関節皮質骨体積ＪＣＢＶの増加）。６４日目に中足骨関節を常套的なＨ＆Ｅ組織検査、又はマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）のために準備した。（Ｂ）抗コラーゲンＩＩ型抗体での受動免疫後３日（左側パネル）又は５日後（右側パネル）に開始する１２ｍｇ／ｋｇのｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃの３回の毎週の投与を受けたマウスにおける臨床スコアの減少。（Ｃ）ＣＲＩｇ-Ｆｃでの処置は、関節の軟骨表面上でのＩｇＧ２ａではなくＣ３断片の蓄積を阻害する。組み合わさった画像では、赤色がＩｇＧ２ａ抗コラーゲン抗体の存在を示し、緑色が軟骨表面上の補体Ｃ３産物の存在を示している。（Ｄ）既に確認された疾患のＣＲＩｇ-Ｆｃで治療されたマウスの関節中におけるＣ３へのＣＲＩｇ-Ｆｃの結合（緑色）。尺度バー＝２０ｕｍ。（Ｅ）上側パネル：受動免疫前の日に開始したＣＲＩｇ-Ｆｃ処置マウスにおける関節中でのＣ３ａ生産の阻害。下側パネル：ＣＲＩｇ-Ｆｃで処置されたマウスの血清中におけるＣ５ａレベルの有意な減少。統計的解析（スチューデントｔ検定）：＊ ｐ＜０．０１、＊＊ ｐ＜０．００１、＊＊ ｐ＜０．０００１。
【００３７】
【図５】ＣＲＩｇは、転換酵素の非触媒サブユニットへのＣ５の結合を阻害することによりＣ５転換酵素を阻害する。（Ａ）ＣＲＩｇはＣ５のＣ３ｂ２への結合をブロックするがＣ３ｂＣ４ｂへの結合はブロックしない。Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ２及びＣ３ｂＣ４ｂをポリクローナル抗Ｃ３抗体で捕捉し、Ｃ５と増加濃度のＣＲＩｇ（ｗｔ）又は変異体ＣＲＩｇ（Ｃ）との混合物と共にインキュベートした。転換酵素サブユニットに結合したＣ５を、ポリクローナル抗Ｃ５抗体及びＨＲＰＯコンジュゲート二次抗体で検出した。Ｃ５結合のＣＲＩｇ阻害のＩＣ５０は０．８８±０．２２μＭであった。（Ｂ）ＣＲＩｇは精製Ｃ５転換酵素のＶｍａｘを減少させる。固定濃度のＣＲＩｇを、増加濃度のＣ５の存在下でザイモサン結合Ｃ５転換酵素と混合した。ミカエリスメンテン式に基づいて計算したＫｍ及びＶｍａｘ値は、ＣＲＩｇ（ｗｔ）の不在下で０．９９及び４．０１であり、０．８ｕＭのＲＩｇ（ｗｔ）の存在下で１．７０及び２．１６であった。
【００３８】
【図６】Ｃ３及びＣ３ｂ間のドメイン配置の差。示されているのはＣＵＢ、ＴＥＤ及びＭＧ８-ドメインのリボン図である。（Ａ）Ｃ３及びＣ３ｂ（共にオレンジ色）のＣＵＢドメインに基づく重ね合わせ。この重ね合わせは、Ｃ３ｂ中のＣＵＢドメインがＣ３のＭＧ８ドメインに関して移動する一方（淡紫色で示す）、ＴＥＤドメインがＣ３活性化時に大きな回転を受けることを示している。（Ｃ）ＴＥＤドメインに基づく重ね合わせ。Ｃ３ｂは暗色の、Ｃ３は明るい青色で示す。Ｃ３ｂ構造において完全に開放しているＣ３中の非常にコンパクトなドメイン配置に留意のこと。Ｃｙｓ９８８の［位置は赤色の球で示す。
【００３９】
【図７】Ｃ３ｂ中のＴＥＤとＡｒｇ８０との間の相互作用。該図はプログラムpymol（DeLano, M.C.及びCao, Y., Neuroimaging Clin. N. Am. 12(1):21-34 (2002))で計算した静電ポテンシャルに従って着色したＴＥＤの表面図を示している。赤色及び青色は負及び正に荷電したパッチをそれぞれ示している。Ｒ８０の側鎖原子は球で表している。Ａｒｇ８０はＴＥＤの表面の高度に負に荷電した溝に近接していることに留意のこと。
【００４０】
【図８】異なった種からのＣＲＩｇの配列アラインメント。Ｃ３ｂと接触している残基は図２Ａに従って着色した。残基番号はシグナル配列後のヒトＣＲＩｇを意味する。二次的構造要素は上の配列アラインメントに矢印（ストランド）及びボックス（ヘリックス）として示す。
【００４１】
【図９】ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃと同様の親和性を有している。親和性は固定濃度のＣＲＩｇ-ＬＦＨとの増加濃度のＣ３ｂ又はＣ３ｃの競合によって決定した。ＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合は、ＨＲＰＯにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出し、ＴＮＢ反応産物の吸光度を４１５ｎｍの波長で分光測定により測定した。
【００４２】
【図１０】ＣＲＩｇ結合部位の近傍におけるＣ３及びＣ３ｂ間の局所的差。ここに示したＣ３及びＣ３ｂの重ね合わせはＭＧ６ドメインのＣα原子に基づく。Ｃ３の一部は白色で示し、α'ＮＴドメインは青色で示す。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体は緑色（Ｃ３ｂのβ鎖）、紫色（Ｃ３ｂのα鎖）で示し、α'ＮＴドメインは青色で示す。ＣＲＩｇは黄色で示す。Ｃ３活性化時に起こる大きな立体構造変化は赤色の矢印で示す。α'ＮＴドメインの大きな動きに留意のこと。ＭＧ６に関するＭＧ３の回転と、螺旋セグメント（５７７：５９０）の動きはＣ３ｂ及びＣ３ｃへのＣＲＩｇの結合に必要とされている。
【００４３】
【図１１】ＣＲＩｇはヒト及びマウス血清中における代替経路を選択的に阻害する。（Ａ）ＣＲＩｇはＣ１ｑ欠損血清中においてウサギ赤血球の溶血を阻止するが（代替経路、左側パネル）、ｆＢ欠損血清中におけるＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球の溶血は阻止しない（古典経路、右側パネル）。Ｅ-ＩｇＭとＥｒを、異なった濃度のＣＲＩｇ-Ｆｃ又はＣＲＩｇ-ＥＣＤ融合タンパク質を含む５％血清中でインキュベートした。氷冷ＥＤＴＡを加えることによって溶血を停止させ、４１５ｎｍにて分光計で上清中のＯ．Ｄを決定することによって溶血量を測定した。ＩＣ５０値：ＣＲＩｇ-Ｆｃ １２７±４９ｎＭ（ｎ＝６）、ＣＲＩｇ-ＥＣＤ ６４０±１２３ｎＭ。（Ｂ）ＣＲＩｇは古典経路によって開示される補体の代替経路を阻害する。古典経路の補体成分をＳＲＢＣ上に集めてＥＡＣ３４（ＡＰ、左側パネル）又はＥＡＣ１２３４（ＣＰ、右側パネル）を生成する。溶血は（Ａ）に記載されるようにして決定した。（Ｃ）マウスＣＲＩｇ-Ｆｃはマウス血清中の代替経路溶血を阻害する。Ｅｒを、増加濃度のマウスＣＲＩｇ-Ｆｃを含む３０％マウス血清と共にインキュベートした。溶血は（Ａ）に記載されるようにして決定した。（Ｄ）ＣＲＩｇはマンノース結合レクチン経路を阻害しない。ＭＢＬ経路活性化によって誘導されるＣ５ｂ−９沈着を、４１５ｎｍの波長で分光測定により測定した。
【００４４】
【図１２】ＣＲＩｇはコラーゲン誘発関節炎を阻害する。（Ａ）ウシコラーゲンを用いて０日目と２３日目に２回マウスを免役することによって関節炎を誘発させた。疾患が既に確認されたときに２４日目（予防的）又は４５日目（矢印）に開始して毎週３回ｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃでマウスを処置した。臨床スコアは足首の厚みを反映させたものである。関節炎の誘発後７０日目に、マウスを安楽死させ、関節皮質骨体積（ＪＣＢＶ）を測定し（Ｂ）、Ｈ＆Ｅ染色切片について炎症の徴候を評価した（Ｃ）。（Ｄ）ＣＲＩｇ-Ｆｃで処置したマウスの関節におけるＩＬ-６（左側パネル）及びＩＬ-１ｂ（右側パネル）の減少。関節炎の誘発後、表示した時点でマウスを安楽死させ、関節を解剖し、サイトカイン測定のために加工した。ＬＰＳ処置（最初の時点）によるサイトカインレベルの増加はｍｕＣＲＩｇ-Ｆｃ処置には影響を受けない。統計：＊ ｐ＜０．０１、＊＊ ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。
【００４５】
【図１３】（Ａ）ＣＲＩｇはＨ因子のコファクター活性に影響しないし、内因的なコファクター活性を有してもいない。左側パネル：固定濃度のＣ３ｂを４μＭのＣＲＩｇ（ｗｔ）又はＣＲＩｇ（Ｃ）の存在下で増加濃度のＨ因子と混合した。コファクター活性を、ｉＣ３ｂからＣ３ｂを区別するためにクーマシー染色ＳＤＳゲル上の反応産物を可視化することによってモニターした。右側パネル：固定濃度のＣ３ｂ及びｆＩをｆＨ又は増加濃度のＣＲＩｇと混合した。（Ｂ）ＣＲＩｇはＣ３ｂに結合するＢ因子を阻害しない。固定濃度のＢ因子を増加濃度のＣＲＩｇと混合した。結合したＢ因子の量を、ｆＢに対するポリクローナル抗体及び二次ＨＲＰＯコンジュゲートａｂを使用して決定した。（Ｃ）ＣＲＩｇはＣ３転換酵素を崩壊させない。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３ｂ、Ｂ因子及びＤ因子をインキュベートすることによってマキシソーププレート上に形成された。ついで、そのプレートを増加濃度のＣＲＩｇ又はＨ因子と共にインキュベートした。残りの結合したＢ因子は、抗Ｂ因子抗体及びＨＲＰＯコンジュゲート二次抗体で検出した。示される結果は３回の独立した実験を代表するものである。
【００４６】
【図１４】ＣＲＩｇ ＥＣＤは、Ｃ３ｂへの結合についてＣＲＩｇ-ＬＦＨと競合できるがＣ５はできない。ＣＲＩｇ-ＬＦＨと増加濃度のＣＲＩｇ-ＥＣＤ又はＣ５の混合物を、Ｃ３ｂを被覆したマキシソルブプレートに加えた。残っているＣＲＩｇ-ＬＦＨ結合を抗ｆｌａｇ抗体を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
特に他の定義をしない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するところと同じ意味を持つ。例えば、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ２版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989 )を参照のこと。本発明のために、次の用語を下記のように定義する。
【００４８】
「ＣＲＩｇ」、「ＰＲＯ３６２」、「ＪＡＭ４」及び「ＳＴＩｇＭＡ」は、互いに交換可能に使用され、天然配列及び変異体ＣＲＩｇポリペプチドを意味する。
【００４９】
「天然配列」ＣＲＩｇは、その調製態様にかかわらず、天然由来のＣＲＩｇと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。しかして、天然配列ＣＲＩｇは、天然から単離されうるか、又は組換え及び／又は合成手段によって製造されうる。「天然配列ＣＲＩｇ」なる用語は、ＣＲＩｇの天然に生じる切断又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型）及びＣＲＩｇの天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、配列番号１の３２１アミノ酸長のヒトＣＲＩｇポリペプチドで、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号１のおよそ２７７から３０７のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に包含する。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、配列番号２の完全長３９９アミノ酸長ヒトＣＲＩｇポリペプチド（ｈｕＣＲＩｇ、又はｈｕＣＲＩｇ-ｌｏｎｇ）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号２のおよそ２７７から３０７のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に包含する。また更なる実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとその断片は、ヒトＣＲＩｇポリペプチドの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ-ｓｈｏｒｔ、配列番号３）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号３のおよそ１８３から２１３のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものである。異なった実施態様では、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその断片は、配列番号４の２８０アミノ酸長の完全長マウスＣＲＩｇポリペプチド（ｍｕＣＲＩｇ）で、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、１位の開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、配列番号４のおよそ１８１から２１１のアミノ酸位置の膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものである。天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその断片は、配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチドで、Ｎ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、及び膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものでありうる。該用語は更に配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドで、それぞれＮ末端シグナル配列を含むもの又は含まないもの、開始メチオニンを含むもの又は含まないもの、及び各配列中に膜貫通ドメインの何れか又は全てを含むもの又は含まないものを特に含む。
【００５０】
「ＣＲＩｇ変異体」とは、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する活性なＣＲＩｇポリペプチドを意味する。特定の実施態様では、ＣＲＩｇ変異体は天然配列の成熟完全長ＣＲＩｇポリペプチドの配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有している。かかるＣＲＩｇポリペプチドには、例えば、天然配列のＮ又はＣ末端において、一又は複数のアミノ酸残基が挿入され、置換され、及び／又は欠失されたＣＲＩｇポリペプチドが含まれる。他の変異体は天然ポリペプチド配列の膜貫通領域内に一又は複数のアミノ酸が挿入され、置換され、及び／又は欠失されたものである。
【００５１】
通常、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号１−７の何れかのものからの成熟アミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％アミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、最も高い度合いの配列同一性は細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内（配列番号１又は２のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここで、Ｘは２７１から２８１の任意のアミノ酸残基；又は配列番号３のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここで、Ｘは１７８から１８６の任意のアミノ酸残基、あるいは配列番号４のアミノ酸１又は約２１からＸ、ここでＸは１７６から１８４の任意のアミノ酸残基である）で生じる。
【００５２】
ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、各全長分子の膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＣＲＩｇポリペプチドの形態を意味する。通常、ＣＲＩｇ ＥＣＤはこのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。上で検討したように、場合によっては、ＣＲＩｇ ＥＣＤは、配列番号１、２、３、又は４のアミノ酸残基１又は約２１からＸを含み、ここで、Ｘは配列番号１又は２の約２７１から２８１の任意のアミノ酸残基、配列番号３の約１７８から１８６の任意のアミノ酸、及び配列番号４の約１７６から１８４の任意のアミノ酸を含む。
【００５３】
ＣＲＩｇ配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、ＣＲＩｇ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。別段の記載がなされない限り、アラインメントは、選択されたソフトウェアのデフォルトパラメータを使用して実施される。ついで、酸配列同一性は、より長い配列に対して計算される。つまり、より短い配列が、より長い配列の一部と１００％の配列同一性を示すとしても、全体の配列同一性は１００％未満になるであろう。
【００５４】
ＣＲＩｇコード配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、ＣＲＩｇコード配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ついで、酸配列同一性は、より長い配列に対して計算される。つまり、より短い配列が、より長い配列の一部と１００％の配列同一性を示すとしても、全体の配列同一性は１００％未満になるであろう。
【００５５】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるコード化ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００５６】
「単離された」ＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、同定され、ＣＲＩｇコード核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＣＲＩｇポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＣＲＩｇコード核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＣＲＩｇを通常発現する細胞に含まれるＣＲＩｇコード核酸分子を含む。
【００５７】
「補体関連疾患」なる用語は、ここでは最も広い意味で使用され、例えば補体欠損症のような病因が補体系の活性化の異常性を含む全ての疾患及び病理学的症状を含む。該用語はＣ３転換酵素の阻害から恩恵を受ける疾患及び病理学的症状を含む。該用語は、代替補体経路の選択的阻害を含む阻害から恩恵を受ける疾患及び病理学的症状を更に含む。補体関連疾患には、限定するものではないが、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎（ＲＡ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎及びその結果の糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺誘発性冠血管内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患及び他の補体関連の眼の症状、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、眼内炎、及び他の眼内血管新生疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、並びに異物移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞肺促迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、及び誤嚥性肺炎が含まれる。
【００５８】
「補体関連の眼の症状」なる用語は最も広い意味で使用され、古典及び代替経路、特に補体の代替経路を含む病因が補体に関連する全ての眼の症状を含む。補体関連の眼の症状には、限定するものではないが、黄斑変性疾患、例えばドライ及びウェット（非滲出性及び滲出性）形態を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、及び他の眼内血管新生疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生が含まれる。補体関連の眼の症状の好ましい群には、非滲出性（ウェット）及び滲出性（ドライ又は萎縮性）ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び眼内炎が含まれる。
【００５９】
「炎症性疾患」及び「炎症性障害」なる用語は、ここでは置き換え可能に使用され、哺乳動物の免疫系の成分が哺乳動物の罹患率に寄与する免疫反応を生じ、媒介し又は寄与等する疾患又は障害を意味する。また含まれるものは、炎症反応の減少が疾患の進行に寛解効果を有する疾患である。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患を含む免疫媒介炎症疾患である。
【００６０】
「Ｔ細胞媒介」疾患という用語は、Ｔ細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか又は寄与等する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に、また例えばＴ細胞により分泌されるリンホカインによりＢ細胞が刺激されるならばＢ細胞に関連した効果にさえも関連している。
【００６１】
その幾つかがＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、限定するものではないが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、多発性神経障害、肝胆汁性疾患、例えば感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性及び線維性肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、肺のアレルギー性疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。アルツハイマー病、及びアテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００６２】
ここで使用される「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうとあらゆる新生物細胞成長及び増殖、及びあらゆる前癌状態の細胞及び組織を意味する。
【００６３】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。
【００６４】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更を行なう本発明により実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に免疫反応の成分の反応の大きさを変え、又は他の治療剤、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対する疾患の感受性を高めることができる。
【００６５】
補体関連疾患のような疾患の「病理」は、患者の良好な健康を危険にさらす全ての現象を含む。これには、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球性、リンパ性細胞）、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、正常に機能している隣接細胞の妨害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、あらゆる炎症性又は免疫性反応の抑制又は悪化、炎症性細胞（好中球、好酸球、単球性、リンパ性）の組織空間への浸潤等が含まれる。
【００６６】
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ及びケナガイタチなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００６７】
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００６８】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラクシン、プロリラクシン、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)、肝臓成長因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子-α及び-β、ミュラー阻害物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、神経成長因子、例えばＮＧＦ-β血小板増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、骨誘導因子、インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)、及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β、及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００６９】
「治療的有効量」は、標的の疾患又は症状、例えば補体関連疾患又は症状、又は癌の状態、例えば病理において測定可能な改善を達成するために必要とされる活性なＣＲＩｇ、ＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストの量である。
【００７０】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。
【００７２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７３】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度のストリンジェント条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いるもの、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いるもの、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用い、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で、５５℃において５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃においてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェント洗浄を用いるものによって同定できる。
【００７４】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように特定され、上記のものよりストリンジェンシーが低い洗浄液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーション後に、３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄を行うという条件である。プローブ長などの因子に必要に応じて適合させるには、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは当業者であれば分かるであろう。
【００７５】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００７６】
本発明のＣＲＩｇポリペプチドの変異体に関し、「活性な」又は「活性」は、本発明の天然又は天然に生じるポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態を意味する。好ましい生物学的活性は、Ｃ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替の補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害する能力である。３転換酵素の阻害は、例えばコラーゲン-又は抗体-誘発関節炎の間における正常な血清中でのＣ３代謝回転の阻害、又は関節炎の間接におけるＣ３沈着の阻害を測定することにより測定することができる。
【００７７】
ＣＲＩｇの生物学的活性を模倣し、ここに開示されたスクリーニングアッセイによって同定することができる抗体、ポリペプチド又は他の分子（例えば有機又は無機小分子、ペプチド等々）に関する「生物学的活性」とは、Ｃ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替の補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害するそのような分子の能力を指す。
【００７８】
ＣＲＩｇ「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で使用され、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの（上述の）定性的生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。
【００７９】
ＣＲＩｇ「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で使用され、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのような天然ポリペプチドの定性的生物学的活性を部分的に又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子を含む。
【００８０】
適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、本発明の天然ポリペプチドの断片、融合体又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子を含む小分子等々が特に含まれる。
【００８１】
「小分子」はここでは約６００以下、好ましくは約１０００ダルトン以下の分子量を有するものと定義されている。
【００８２】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、単一の抗ＣＲＩｇモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及び多エピトープ特異性を持つ抗ＣＲＩｇ抗体組成物を包含する。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を意味する。
【００８３】
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは例えばリンパ系によって低レベルで、ミエローマによって増大したレベルで生産される。「抗体」なる用語は最も広い意味で使用され、限定するものではないが、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を特に包含する。
【００８４】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００８５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性と特異性に使用されていることを意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域を含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991)を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００８６】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；線形抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００８７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位、及び残基「Ｆｃ」断片を持つ。該名称「Ｆｃ」は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差結合可能なＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００８８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、強固に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この構造において各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的には、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な三つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有している。
【００８９】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されていることでＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’に対するここでの表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は間にヒンジシステインを有しているＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００９０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類できる。
【００９１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれγ、μ、δ、α、及びεと呼ばれる。異なったクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体構造はよく知られている。
【００９２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に向く。特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されることで、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、特定の方法で抗体を生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等によって最初にNature 256:495[1975]に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができるか、あるいは組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えば Clackson等, Nature 352:624-628 (1991) 及び Marks等, J.Mol.Biol. 222：581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。また、ファージミッド及びファージベクターの利用による抗体の調製が記載されている米国特許第５７５０３７３号、第５５７１６９８号、第５４０３４８４号及び第５２２３４０９号を参照のこと。
【００９３】
ここで、モノクローナル抗体は、特に重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りそれらの抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。
【００９４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大抵は、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基はまた対応する非ヒト残基によって置換されうる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させ、最大化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 [1988]；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、マカクザルを対象の抗原で免疫化することにより生成された抗体に由来している「霊長類化」抗体を含む。旧世界ザル由来の残基を含む抗体もまた本発明において可能である。例えば米国特許第５６５８５７０号、第５６９３７８０号、第５６８１７２２号、第５７５０１０５号及び第５７５６０９６号を参照のこと。
【００９５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にするＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００９６】
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ小抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
【００９７】
抗体のような「単離された」ポリペプチドとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体を含むポリペプチドは、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法による測定で化合物の９５重量％よりも大きな割合まで、最も好ましくは９９重量％よりも大きな割合まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された化合物、例えば抗体又は他のポリペプチドには、化合物の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの化合物が含まれる。しかしながら、通常は、単離された化合物は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００９８】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識した」化合物が生成されるように、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接又は間接的に抱合させた検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒しうる。
【００９９】
「固相」とは、本発明の化合物が付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここで包含される固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施形態では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含み得；その他では精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【０１００】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ここに開示する抗ＥｒｂＢ２抗体及び場合によっては化学療法剤）の輸送に有用である種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形態に配列させる。
【０１０１】
ここで用いられる場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（つまり「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【０１０２】
「慢性」投与とは、延長された期間の間、所望の効果を維持するように、急性態様とは異なる連続態様で薬剤を投与することを意味する。
【０１０３】
「間欠」投与とは、中断がなく連続的になされるのではなく、むしろ周期的な性質の治療法である。
【０１０４】
一又は複数の更なる治療剤「との併用での」投与は同時（同時期）と任意の順序の連続投与を含む。
【０１０５】
「患者」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１０６】
「哺乳動物」なる用語は、ここでは限定するものではないが、ヒト、牧畜、家畜、及び動物園の動物、スポーツ、又はペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等々を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指すために使用される。
【０１０７】
「有効量」とは有益な又は所望される治療的（予防を含む）結果を得るのに十分な量である。有効量は一又は複数回の投与で投与できる。
【０１０８】
（発明を実施するための形態）
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の一般的な技術を用いる。かかる技術は例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2版 (Sambrook等, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait編, 1984)；“Animal Cell Culture” (R.I. Freshney編, 1987)；“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”, 4版 (D.M. Weir & C.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos編, 1987)；“Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel等編, 1987)；“PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等編, 1994)；及び“Current Protocols in Immunology” (J.E. Coligan等編, 1991)のような文献に十分に説明されている。
【０１０９】
ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｈ及びＣ３ｃ複合体の結晶構造
ＣＲＩｇ分子を含むポリペプチドは一次アミノ酸配列及びポリペプチドを囲む環境によって決定される３次元構造を有している。この３次元構造はポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、及び他の生化学的特質を樹立する。よって、タンパク質の３次元構造の知識はその生物学的活性を模倣し、阻害し又は改善する薬剤を設計する際の大きな指針を提供する。
【０１１０】
ポリペプチドの３次元構造は多くの方法で決定することができる。最も精確な方法の多くはｘ線結晶解析（Van Holde, Physical Biochemistry (Prentice Hall: N.J., 1971), pp. 221-239）を用いる。この技術はｘ線又は他の形態の放射線を回折する結晶格子の能力に依存している。巨大分子の３次元構造を決定するために適した回折実験は典型的には高品質の結晶を必要とする。不幸にも、かかる結晶はＩＧＦ-１並びに興味のある多くの他のタンパク質には利用できなかった。結晶は例えばＭ−ＣＳＦ（ＥＰ６６８９１４Ｂ１）、ＣＤ４０リガンド（ＷＯ９７／００８９５）、及びＢＣ２Ｆａｂ断片（ＷＯ９９／０１４７６）に対して記載されている。
【０１１１】
結晶性タンパク質及びポリペプチドを調製するための様々な方法が当該分野で知られている（McPherson等., “Preparation and Analysis of Protein Crystals,” McPherson (Robert E. Krieger Publishing Company, Malabar, FL, 1989)；Weber, Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36 (1991)；米国特許第４６７２１０８号及び第４８３３２３３号）。ポリペプチドを結晶化させるための複数のアプローチ法が存在しているが、特に結晶がｘ線回折研究に適したものでなければならない場合には、合理的な成功の可能性をもたらす単一セットの条件は存在しない。構造に関する精確な情報をもたらす十分なサイズと分解能の結晶を得るには顕著な努力が必要とされる。例えば、十分な純度のタンパク質がひとたび得られれば、ｘ線回折と続く構造解明に有用なサイズと透明度になるまで結晶化されなければならない。更に、標的タンパク質のアミノ酸配列は知られていても、この配列情報からタンパク質の結晶構造を正確に予測することはできない。また配列情報から、タンパク質とＣＲＩｇやＣ３ｂのようなそれが相互作用する結合対との間の構造的、コンフォメーション的及び化学的相互作用の理解ができるようになるものでもない。よって、結晶構造はドラッグデザイン及び発見の分野で豊富な価値ある情報をもたらしうるが、ＣＲＩｇのようなある種の生物学的に関連した化合物の結晶は当業者が直ぐに利用できるものではない。ＣＲＩｇの高品質の回折結晶は、その生物学的役割を更に理解し、限定するものではないがアゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含むＣＲＩｇ変異体、アゴニスト及び淡タゴニストを設計するために重要になるその３次元構造の決定に役立つ。
【０１１２】
構造情報の提供に加えて、結晶性ポリペプチドは他の利点をもたらす。例えば、結晶化方法自体はポリペプチドを更に精製し、均一性の古典的条件の一つを満たす。実際、結晶化は、ＨＰＬＣ、透析、一般的なカラムクロマトグラフィー等々の他の精製方法によっては除去されない不純物を除去する無比の精製品質をもたらすことがよくある。更に、結晶性ポリペプチドはしばしば周囲温度で安定であり、プロテアーゼの汚染や溶液保存に伴う他の分解を受けない。結晶性ポリペプチドはまた医薬製剤としても有用でありうる。最後に、一般に結晶化技術には、他の安定化法（例えば凍結乾燥）に付随する変性のような問題が概してない。
【０１１３】
本発明はＣＲＩｇ単独とＣ３ｂ及びＣ３ｃそれぞれとの複合体の結晶構造を提供する。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の構造は、Ｃ３活性化時に生じ補体レセプターＣＲＩｇの結合部位を定める立体構造変化を完全に明らかにする。また、代替経路転換酵素のタンパク質分解活性に対するこの相互作用の結果を調べる。
【０１１４】
すなわち、本発明は、およそ次の寸法：ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Åを有するＣＲＩｇ結晶を提供する。該結晶は、Ｐ２１２１２１の対称、又は空間群を有している。ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス１に提供する。
【０１１５】
本発明は更におよそ次の寸法：ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群を有しているＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造を提供する。ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス２に提供し、そのリボン構造は図１Ｂに示す。
【０１１６】
本発明はまたおよそ次の寸法：ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群を有しているＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造を提供する。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ結晶の構造座標はアペンディクス３に提供し、そのリボン構造は図１Ｃに示す。
【０１１７】
残基１〜６４５からなるＣ３ｂは、５つのマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ１-ＭＧ５）、及び第６ＭＧドメインのＮ末端半分、リンカー領域（ＬＮＫ）（図１Ａ及び１Ｂ）に折り畳まれる。免疫グロブリントポロジーＭＧドメインは「キーリング」様形式に配置され、約１０Å幅で３０Å長の中央溝の回りを円で囲んでいる。Ｃ３ｂのα鎖は残基７２９：１６４１からなり、Ｃ３と比較してＣ３ａ又はＡＮＡドメインを欠いている。α'ＮＴドメインと呼ばれるＣ３ｂα鎖のＮ末端残基（７２９：７４５）は、伸展したコンフォメーションを採用しており、第６ＭＧドメインの第２の半分を形成する残基につながっている。これに続いて、α鎖は間にＣＵＢドメインとチオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）が挿入された２つの更なるＭＧドメイン（ＭＧ７及びＭＧ８）を含んでいる。最後に、α鎖のＣ末端の１７０残基はいわゆる「アンカー領域」とＣ３４５Ｃドメインを形成している。
【０１１８】
実施例１に記載されるように、Ｃ３ｂのコンフォメーションは活性化の際に劇的な変化を受ける。ＴＥＤはＣＵＢ及びＮＧ８ドメインから離れる方向に回転し、完全に異なったコンフォメーションでＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する残基を残す。このコンフォメーション変化の一部として、Ｃ３ｂの９８８位のＣｙｓ残基がＣ３構造中のその最初の保護されたネストから露出した位置まで移動する。
【０１１９】
実施例１に記載された結晶化研究から、ＣＲＩｇに対する結合部位がＣ３ｂのＣＵＢ及びＴＥＤドメインとは反対側にあり、ＣＲＩｇをＴＥＤドメインから約４０Åのところに位置させていることが明らかになった（図１Ａ及び１Ｂを参照）。
【０１２０】
ＣＲＩｇとＣ３ｃ又はＣ３ｂの間の結合界面は大きく、不連続で、全体で約２６７０Å２の溶媒露出面積を埋めている（図２Ａ）。ＣＲＩｇはＣ３ｂと接触し、Ａ’、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’シートからの残基が、ストランドＣ’とＣ”の近傍の残基及びループによって形成された相互作用の大部分を有する。Ｃ’とＣ”を連結するヘアピンループは、Ｃ３ｂのキーリング形状のβ鎖の中心に形成された裂け目中に突出している。界面のＣ３ｂ側では、ドメインＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ５、ＭＧ６、ＬＮＫ及びＭＧ６が全てＣＲＩｇ結合に寄与し、埋まった界面のそれぞれ約３０％と４０％に対してＭＧ３とＭＧ６が原因となっている（図２Ｂを参照）。ＭＧ３ドメインはＣ３ｂ（及びＣ３ｃ）へのＣＲＩｇの結合のゲーティングに重要な役割を担っていると考えられる。また、Ｃ３分子の残りと比較してＭＧ３の比較的小さいがなお有意な１５°の回転が、ＣＲＩｇ結合部位を構成する他のＭＧドメインのリングに関したＭＧ３の相対的再配向の原因である。従って、ＬＮＫ領域の螺旋部分の動きと連係して、この回転がＣＲＩｇをＣ３ｂ及びＣ３ｃに結合させる。これらの中程度の変化がないと、Ｃ３はＣＲＩｇにはラッチされないであろう。
【０１２１】
これらの構造-機能の知見はＣＲＩｇの数個のアミノ酸置換変異体を試験することによって確認した。ＮＧ６及びＭＧ３結合ドメインにおける変異はＣ３ｂへのＣＲＩｇの結合を効果的に抑止することが確認された。これに対して、反対側のＣＲＩｇ表面残基の変異は野生型ＣＲＩｇの活性に効果はなかった。
【０１２２】
ＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストのデザイン、調製及びスクリーニング
本発明は、例えば補体関連疾患又は障害、例えば免疫複合体及び自己免疫疾患、及び補体介在炎症組織損傷を含む様々な炎症症状の治療に有用性があるＣＲＩｇアゴニストを同定するスクリーニングアッセイを含む。補体関連疾患の病理は様々であり、長期間又は短期間の補体活性化、カスケード全体、カスケードの一つだけ（例えば古典又は代替経路）、カスケードの幾つかの成分だけの活性化等々を含むかもしれない。ある疾患では、補体断片の補体生物学的活性が組織損傷及び疾患を生じさせる。従って、補体の阻害剤は高い治療的潜在性を有している。代替経路の選択的阻害剤は、古典経路による血液からの病原体及び他の生物の除去が手を付けられていないままであるので、特に有用であろう。
【０１２３】
ＣＲＩｇポリペプチドのアゴニストは天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの定性的生物学的活性を模倣する。好ましくは、生物学的活性はＣ３ｂに結合し、及び／又は補体又は補体活性化に影響を及ぼし、特に代替補体経路及び／又はＣ３転換酵素を阻害する能力である。アゴニストには、例えばイムノアドヘシン、ペプチド模倣薬、天然ＣＲＩｇの定性的生物学的活性を模倣する非ペプチド小有機分子並びに抗体断片を含むアゴニスト抗体が含まれる。
【０１２４】
イムノアドヘシンは、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを兼ね備えた抗体様分子である。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外(すなわち「異種性の」もの)である所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含んでなる。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は典型的にはレセプター又はリガンドの結合部位を少なくとも含んでなる連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られうる。
【０１２５】
ペプチド模倣薬は、例えば、該化合物がここに記載のＣＲＩｇ生物学的活性を保持しているならば非天然発生アミノ酸を含むペプチドを含む。同様に、ペプチド模倣薬及びアナログは、本発明のＣＲＩｇポリペプチドの重要な構造的エレメントの構造を模倣しＣＲＩｇ生物学的活性を保持している非アミノ酸化学構造を含みうる。「ペプチド」なる用語は、約５０アミノ酸残基未満、及び好ましくは４０アミノ酸残基未満の制約された（すなわち、例えば、βターン又はβプリーツシートを先導するアミノ酸の存在、又は例えば、ジスルフィド結合Ｃｙｓ残基の存在によって環状化する構造のある要素を有する）あるいは非制約（例えば直鎖状）アミノ酸配列で、その二量体又はその中間のような多量体を包含するものを指すようにここでは使用される。約４０アミノ酸残基未満のペプチドでは、約１０及び約３０アミノ酸残基の間のペプチド、特に約２０アミノ酸残基のペプチドが好ましい。しかしながら、本開示を読めば、当業者ならば、ペプチドを識別するのは、特定のペプチドの長さではなく、そのＣ３ｂへ結合しＣ３転換酵素、特に代替補体経路のＣ３転換酵素を阻害する能力であることを認めるであろう。
【０１２６】
ＣＲＩｇアゴニストのスクリーニングと同定は、ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の開示と、ＣＲＩｇとＣ３ｂ間の結合界面の同定によって非常に容易になる。この情報によりＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物の設計が可能になる。
【０１２７】
また、ＣＲＩｇアゴニストは、（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定することができる。この情報に基づいて、アゴニスト候補を合成することができ、そのアゴニスト特性をＣＲＩｇ活性の生物学的アッセイにおいて実証することができる。
【０１２８】
特定の実施態様では、アゴニストは、天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む化学物質であろう。
【０１２９】
ペプチド模倣薬は固相ペプチド合成法を用いて簡便に調製できる(Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1964)；Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5132 (1985))。固相合成法は、保護されたアミノ酸を不活性固形担体に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固形担体は、開始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る。典型的には、高分子担体は、架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はポリスチレン樹脂に連結されてベンジルエステルを形成する。高分子支持体は、ペプチド合成の阻害アミノ酸のα-アミノ基を脱保護するのに使用される条件下でペプチドアンカー結合が安定であるように選択される。塩基不安定α保護基が使用されるならば、ペプチドと固形担体の間に酸不安定結合を使用するのが望ましい。例えば、酸不安定エーテル樹脂は、塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペプチドアンカー結合及び差次的に酸分解に移行するα-保護基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂のようなアミノメチル樹脂は、Ｂｏｃ-アミノ酸ペプチド合成に関連して良好に働く。開始アミノ酸が不活性固形担体に連結された後、開始アミノ酸のαアミノ酸保護基を例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリエチルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、合成における次のα-アミノ及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りのα-アミノ酸と、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、固形担体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。
【０１３０】
２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルアミノ]ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【０１３１】
ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。更に共通なのは、アミノ酸又はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、アミノ酸又はペプチド断片のＣ末端カルボキシル基は成長固形相ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端アミノ基と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド断片を固相ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において、ペプチド鎖の所望の配列に位置するアミノ酸残基の各々を含み、その個々の残基が側鎖保護基を担持する中間体化合物が生成されるのが一般的である。これらの保護基は、実質的に同時に除去でき、固相から取り外した後に所望のポリペプチド生成物が生成される。
【０１３２】
α-及びε-アミノ酸側鎖を、ベンジルオキシカルボニル（Ｚと略）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ２)］、ｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピル-オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護できる。
【０１３３】
カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示される。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいことが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキシベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２,６-ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１,３,５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。システインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる。
【０１３４】
上述の多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(San Diego, Calif.)、Bachem CA（Terrence, Calif.)又はPeninsula Labs(Belmont, Calif.)のような市販元から得ることができる。
【０１３５】
所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固形担体から切断され、回収され、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬により固形担体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、残っている側鎖保護基も取り除く液体フッ化水素酸(ＨＦ)での酸分解により固相から取り外す。好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、酸分解反応混合物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＨＦ切断後、樹脂はエーテルで洗浄され、遊離ペプチドが酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。組み合わされた洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【０１３６】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストは過剰な補体活性化及び亢進された補体介在宿主防御メカニズムから恩恵を受ける症状の治療に有用性が見出される。ＣＲＩｇに対する抗体のようなＣＲＩｇアンタゴニストは、腫瘍（癌）治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは現在は十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織においてサイレントであるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱癌においては有意な量で発現される。DeSmet, C.等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。Ｔ細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘導されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine (1997) 3:682；Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1997) 94:8099；Lynch, D.H.等, Nature Medicine (1997) 3:625；Finn, O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol. (1998) 21:114。本発明によって設計され同定されたＣＲＩｇアンタゴニストはアジュバントとして単独で又は増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤は既知の投与方法を使用して一般的な量で投与することができる。本発明のＣＲＩｇアンタゴニストによる免疫刺激活性により、増殖調節剤、細胞毒性薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
【０１３７】
ある種のマクロファージは腫瘍根絶に関わっているけれども、多くの固形腫瘍は腫瘍増殖を支援するマクロファージを含んでいることが知られている（Bingle等, J Pathol 196:254-265 (2002)；Mantovani等, Trends Immunol 23:549-555 (2002)）。これらのマクロファージはその表面にＣＲＩｇを含みうる。ＣＲＩｇの補体活性化を阻害する能力をブロックする抗体を用いて腫瘍細胞上の補体を活性化させ、補体介在溶解により腫瘍を根絶するのを補助することができよう。このアプローチ法はＣＲＩｇ陽性マクロファージを含む腫瘍に特に有用であることが予想される。
【０１３８】
アンタゴニストの好ましい群には天然ＣＲＩｇに特異的に結合しその生物学的活性を阻害する抗体が含まれる。
【０１３９】
抗体（アゴニストとアンタゴニストの双方）の例には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的及びヘテロコンジュゲート抗体、及び抗体断片が含まれる。
【０１４０】
本発明のポリペプチドを認識してそれに結合し、又はそれに対するアンタゴニストとして作用する抗体は、あるいはモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１４１】
免疫剤は、典型的には本発明のＣＲＩｇポリペプチド、その抗原性断片又は融合タンパク質を含む。一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１４２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63］。
【０１４３】
ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、本発明のポリペプチドに対する又は本発明のポリペプチドと同様の活性を有するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは当該分野において知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１４４】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［上掲のGoding］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
【０１４５】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の一般的な免疫グロブリン精製法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製されうる。
【０１４６】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質をさもなければ生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［上掲の米国特許第４８１６５６７号；Morrison等］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１４７】
抗体は好ましくは一価抗体である。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１４８】
一価抗体の調製には、またインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成することができる。
【０１４９】
本発明の抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１５０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１５１】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１５２】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方は本発明のポリペプチドに対するものであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してであり得る。
【０１５３】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 [1983]）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１５４】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えば、Suresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５５】
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１５６】
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の効力を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５７】
また、本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞傷害性剤、あるいは放射性同位体（つまり、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体にも関する。
【０１５８】
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は上述の通りである。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１５９】
抗体及び細胞傷害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
【０１６０】
他の実施態様では、組織の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、ついで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞傷害性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１６１】
ＣＲＩｇ及びそのアゴニスト及びアンタゴニストは、天然ＣＲＩｇ分子の生物学的活性を模倣し又は阻害するかどうかを決定するために様々なインビトロ及びインビボアッセイにおいて試験することができる。
【０１６２】
補体活性化、特に代替補体経路を阻害するその能力の結果として、ＣＲＩｇポリペプチドは、補体関連疾患及び病理状態の予防及び／又は治療において有用性が見出される。このような疾患及び症状には、限定するものではないが、補体関連の炎症性及び自己免疫疾患が含まれる。
【０１６３】
補体関連疾患の特定の例には、限定するものではないが、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎及びその結果の糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺誘発性冠血管内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患及び他の補体関連の眼の症状、非滲出性及び滲出性ＡＭＤを含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎、ブドウ膜炎、同種移植、異物移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞肺促迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、遺伝性血管浮腫、発作性夜間血色素尿症、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、誤嚥性肺炎、蕁麻疹、例えば慢性特発性蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、子宮内膜症、心原性ショック、虚血再かん流傷害、多発性硬化症（ＭＳ）が含まれる。
【０１６４】
ＡＭＤは、６０歳以上の個人における不可逆的な視力障害の主たる原因である黄斑の加齢性変性症である。非滲出性（ドライ）及び滲出性（ウェット）ＡＭＤの２つのタイプのＡＭＤが存在している。ドライ又は非滲出型は中心網膜（黄斑）並びにＲＰＥ上の沈積物（ドルーゼ）の根底にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）内の萎縮及び異常肥大変化を含む。非滲出型ＡＲＭＤの患者は、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜、漏出液及び血液の下で発達し、最終的には網膜内及び網膜下で失明に至る円板状瘢痕を生じるＡＲＭＤのウェット又は滲出型まで進行しうる。通常は滲出型ＡＲＭＤの前躯体である非滲出型ＡＲＭＤはより一般的である。非滲出型ＡＲＭＤの提示は様々である；ハードドルーゼ、ソフトドルーゼ、ＲＰＥ地図状萎縮、及び色素凝集が存在しうる。補体成分はＡＭＤの早期にＲＰＥ上に付着し、ドルーゼの主要構成成分である。補体Ｈ因子（ＣＦＨ）多形性がＡＭＤの起因リスクの５０％を占めることが最近報告されている（Klein等, Science 308:385-9 (2005)）。
【０１６５】
ＣＲＩｇは、カテゴリー３及びカテゴリー４ＡＭＤを含む高リスクのＡＭＤの治療において特に有用である。カテゴリー３ＡＭＤは、双方の眼に進行ＡＭＤがなく、少なくとも一つの眼が２０／３２又はそれ以上の視力、少なくとも一つの大きなドルーゼ（例えば１２５μｍ）、広範な（ドルーゼ面積で測定）中間ドルーゼ、又は黄斑の中心を含まない地図状萎縮（ＧＡ）又はこれらの任意の組合せを有することによって特徴付けられる。カテゴリー４高リスクＡＭＤは、２０／３２又はそれ以上の視力によって特徴付けられ、インデックス眼において進行ＡＭＤ（黄斑の中心又は脈絡膜血管新生の特徴を含むＧＡ）はない。他眼は進行ＡＭＤ、又はＡＭＤ黄斑症に帰す２０／３２未満の視力によって特徴付けられている。典型的には、未治療ならば、高リスクＡＭＤは、カテゴリー１又は２（高リスクではない）ＡＭＤの進行速度よりも約１０−３０倍高い速度で脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に速やかに進行する。従って、ＣＲＩｇはＣＮＶとＡＭＤの予防と治療に有用性が見出される。
【０１６６】
補体関連疾患の例としての炎症性症状のより広範なリストには、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
【０１６７】
全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心的な媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、続いての免疫媒介炎症の発生である。抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接的には関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発生に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的に冒される。
【０１６８】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、二つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１６９】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡと幾つかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は三つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１７０】
脊椎関節症は、幾つかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
【０１７１】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１７２】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体が多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
【０１７３】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴う場合がある。この疾患は、双方とも小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
【０１７４】
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、幾つかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベーチェット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１７５】
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【０１７６】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（幾つかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【０１７７】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
【０１７８】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
【０１７９】
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリンレセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
【０１８０】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、幾つかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
【０１８１】
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
【０１８２】
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
【０１８３】
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
【０１８４】
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
【０１８５】
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
【０１８６】
ＣＲＩｇの上に列挙した治療的用途に鑑みて、ＣＲＩｇの潜在的アゴニストは様々な細胞ベースアッセイ及び補体関連、炎症及び／又は自己免疫疾患又は障害の動物モデルで評価することができる。
【０１８７】
よって、例えば、関節炎の予防及び／又は治療における効力はコラーゲン誘発関節炎モデル（Terato等 Brit. J. Rheum. 35:828-838 (1966)）において評価することができる。潜在的な関節炎予防／治療薬は、Terato等, J. Immunol. 148:2103-8 (1992)；Terato等, Autoimmunity 22:137-47 (1995)に記載されたように、４種のモノクローナル抗体のカクテルの静脈内注射により誘発される抗体媒介関節炎モデルにおいてスクリーニングできる。またここの実施例４を参照のこと。関節炎の予防及び／又は治療のための候補は、例えばＴＮＦ-αトランスジェニックマウス（Taconic）のようなトランスジェニック動物モデルで研究することがまたできる。これらの動物は、ヒトリウマチ様関節炎の病因に結びつけられているサイトカインであるヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α）を発現する。これらのマウスにおけるＴＮＦ-αの発現は、前肢及び後肢の重症の慢性関節炎を生じ、炎症性関節炎の簡単なマウスモデルを提供する。
【０１８８】
最近、乾癬の動物モデルがまた開発された。よって、Asebia（ａｂ）、鱗状皮膚（ｆｓｎ）及び慢性増殖性皮膚炎（ｃｐｄ）は乾癬様皮膚変化を持つ自然マウス突然変異である。例えばインターフェロン-γ、インターロイキン-１α、ケラチノサイト増殖因子、トランスフォーミング増殖因子-α、インターフェロン-６、血管内皮増殖因子、又は骨形成タンパク質６のようなサイトカインの皮膚性過剰発現があるトランスジェニックマウスをまた使用して、インビボで乾癬を研究し、感染治療のための治療薬を同定することができる。乾癬様病巣はまたＰＬ／Ｊ系統に戻し交配したβ２-インテグリン低形質マウス及びβ１-インテグリントランスジェニックマウス、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉＴリンパ球で再構成されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス並びにＨＬＡ-Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニックラットにおいて記載されている。免疫不全マウスに移植されたヒト皮膚を使用する異種移植モデルもまた知られている。よって、本発明の化合物は、マウスが乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示すSchon, M.P.等, Nat. Med. (1997) 3:183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができる。他の適切なモデルは、Nickoloff, B.J.等, Am. J. Path. (1995) 146:580に記載されているようにして調製されるヒトｓｋｉｎ／ｓｃｉｄマウスキメラである。更なる詳細については、例えばSchon, M.P., J Invest Dermatology 112:405-410 (1999)を参照のこと。
【０１８９】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、対象の遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作製のための標準的技術を用いて、対象動物のゲノム中に導入することにより操作できる。トランスジェニック操作の標的となりうる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及び他のサルを含む。このような動物に導入遺伝子を導入するための当該分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第４８７３１９１号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性幹細胞での遺伝子ターゲティング（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子導入（Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説としては、例えば、米国特許第４７３６８６６号を参照のこと。
【０１９０】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれうる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えばLasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従えば、可能である。
【０１９１】
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組込みの確認にはサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。ついで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。
【０１９２】
例えば免疫細胞の特定の細胞への浸潤を確定するための組織学的検査によって、免疫疾患病理の徴候について該動物を更に調べることができる。補体及び古典的及び代替経路を含む補体活性化又はＴ細胞増殖に対する効果の度合いを決定するためにＣＲＩｇ又は候補アゴニストでトランスジェニック動物を治療する遮断実験もまた行うことができる。これらの実験では、本発明のポリペプチドと結合する遮断抗体が動物へ投与され、興味ある生物学的効果がモニターされる。
【０１９３】
あるいは、「ノックアウト」動物は、ＣＲＩｇポリペプチドをコードする内在性の遺伝子と、動物の胚性細胞へ導入された同ポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ＣＲＩｇをコードする欠陥又は改変遺伝子を有するものとして構築することができる。例えば、ＣＲＩｇをコードするｃＤＮＡは、確立されている技術によって、ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに利用できる。ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡの一部は、その他の遺伝子、例えば組込みをモニターするために利用できる選択可能マーカーをコードする遺伝子によって置換え又は除去できる。典型的には、ベクターには数キロベースの未変化フランキングＤＮＡ（５'と３'末端の両方）が含まれる［例えば、相同組換えベクターの説明についてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照］。ベクターを胚性幹細胞株へ（例えば電気穿孔法等によって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、出産させて「ノックアウト」動物をつくり出す。その胚細胞に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定でき、それらを使用して動物の全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を飼育することができる。ノックアウト動物は、例えば、ＣＲＩｇポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けることができる。
【０１９４】
よって、潜在的ＣＲＩｇの生物学的活性は、以下の実施例７に記載されたように、マウスＣＲＩｇノックアウトマウスにおいて更に研究することができる。
【０１９５】
抗原誘発性気道反応亢進、好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同じタンパク質に動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。幾つかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）では、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候を示す。マウスモデルはヒト喘息の特徴の多くを有している。喘息治療における活性と有効性についてＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストを試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777とそこに引用されている文献に記載されている。
【０１９６】
接触性過敏症は、細胞媒介免疫機能の単純なインビボアッセイである。この手順において、遅発型過敏反応を生じさせる外因性ハプテンに表皮細胞を暴露し、反応を測定して定量する。接触過敏症は最初の感作段階に顕在化段階が続く。顕在化段階は表皮細胞がそれらが過去に接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫れと炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作製される。適切な手順は、Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1):37-44(1998)も参照のこと。
【０１９７】
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度の場合まで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上記のCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
【０１９８】
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、抗ウイルス及び腫瘍免疫におけるそれらの役割の指標であり尺度であるＴ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾-皮膚移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストの試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation (1994) 58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol. (1994) 4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【０１９９】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
【０２００】
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞の炎症と、続いての中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的にヒトにおけるＭＳの関連動物モデルであると考えられている。Bolton. C., Multiple Sclerosis (1995)1:143。急性及び再発寛解型モデルの双方が開発されている。ＣＲＩｇ及びそのアゴニスト及びアンタゴニストは上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.1及び15.2.に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Duncan. I.D.等, Molec. Med. Today (1997) 554-561に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患モデルも参照されたい。
【０２０１】
年齢関連性黄斑変性(ＡＭＤ)の動物モデルは、Ｃｃｌ-２又はＣｃｒ-２遺伝子に無発現変異を有するマウスからなる。これらのマウスは網膜色素上皮（ＲＰＥ）の中のリポフスチン及びその下のドルーゼの蓄積、光受容体萎縮及び脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を含むＡＭＤの主要な特徴を発症する。これらの特徴は６ヶ月の年齢を越えて発達する。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストはドルーゼの形成、光受容体及び脈絡膜血管新生について試験することができる。
【０２０２】
心筋虚血再灌流のモデルはマウス又はラットで実施することができる。動物を気管切開し、小動物人工呼吸器で酸素供給する。ポリエチレンカテーテルを平均動脈圧の測定のために内頸動脈と外頸静脈内に配する。心筋虚血再灌流は、冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を６-Ｏ縫合によって結紮することによって開始される。虚血は血管を完全に閉塞するためにＬＡＤの回りに可逆的な結紮糸を締めることによってつくり出される。結紮糸は３０分後に除去され、心臓は４時間灌流される。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストは、心臓梗塞サイズ、心臓クレアチンキナーゼ活性、ミエロペルオキシダーゼ活性及び抗Ｃ３抗体を使用する免疫組織化学の測定によってその効力を試験することができる。
【０２０３】
糖尿病性網膜症のモデルはストレプトゾトシンでのマウス又はラットの治療を含む。ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇアゴニストは、 細静脈拡張、網膜内微小血管異常、及び網膜及び硝子体腔の血管新生に対するその効果について試験することができる。
【０２０４】
膜性増殖性糸球体腎炎のモデルは次のようにして樹立することができる：雌マウスをＣＦＡ中の０．５ｍｇコントロールウサギＩｇＧを用いて腹腔内免疫する（−７日目）。７日後に（０日目）、１ｍｇのウサギ抗マウス糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体を尾静脈から静脈内注射する。血清中の抗ウサギＩｇＧ抗体の上昇をＥＬＩＳＡによって測定する。２４時間の尿試料を代謝ケージ中のマウスから集め、マウスの腎臓機能を、血中尿素窒素に加えて尿中タンパク質を測定することによって評価する。
【０２０５】
薬学的組成物
本発明に従って同定されたＣＲＩｇアゴニスト及びアンタゴニストは、炎症性疾患の治療のために、薬学的組成物の形態で投与することができる。
【０２０６】
治療製剤は、所望される度合いの純度を持つ活性分子を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製されて保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16版, Osol, A.編 [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）及び／又はトゥイーン（TWEENTM）、プルロニクス（PLURONICSTM）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０２０７】
リポフェクション又はリポソームを使用して、細胞中にポリペプチド、抗体、又は抗体断片を送達することができる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術（Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 [1993]）により生産することができる。
【０２０８】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に一つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでいてもよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は増殖阻害剤を含んでもよい。このような分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２０９】
また、活性分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０２１０】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２１１】
徐放性製剤を調製することもできる。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴTM（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフィア）等の分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に亘って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２１２】
次の実施例は例証のためにのみ提供するものであり、本発明の範囲を限定するものでは決してない。
【０２１３】
本明細書において引用された全ての特許及び文献はその全体を出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【０２１４】
実施例１
ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造の決定
材料と方法
ａ．成熟ヒトＣＲＩｇタンパク質の生産と精製
配列番号２（配列番号８）の成熟ヒトＣＲＩｇの残基１〜１１９をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ２８ｂ発現ベクター(Novagen)のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングし、トロンビン切断部位が続くＮ末端Ｈｉｓタグを有する融合体をつくった。Ｎｉ-アフィニティークロマトグラフィーを使用した精製後に、融合タンパク質をトロンビンで消化させ、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して更に精製した。最終のタンパク質原液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有していた。セレノメチオニン標識タンパク質を、標準的なプロトコルを使用して得た。
【０２１５】
精製されたＣＲＩｇを５倍モル過剰でＣ３ｃ又はＣ３ｂと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。その試料を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５０ｍＭのＮａＣｌ中で１０−２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０２１６】
ｂ．結晶化
全ての結晶は懸滴蒸気拡散法を使用して１９℃で成長させた。
【０２１７】
ＣＲＩｇを、３０％のＰＥＧ４０００、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、及び０．２Ｍの酢酸アンモニウムを含むリザーバの等容量でタンパク質溶液を等しく混合することによって結晶化させた。結晶は３日後に形成された。１２％のＰＥＧ２００００、０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５を含むリザーバ溶液と１：１の比でタンパク質溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を混合することによってＣ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の結晶を得た。１２％のＰＥＧ２００００、０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．５を含むリザーバ溶液の等容量とタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合することによってＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶を得た。結晶は３日後に形成された。
【０２１８】
ｃ．データ収集、構造解明及び緻密化
データ収集のために、２０％グリセロールを添加した溶液含有リザーバ中に結晶を短時間浸漬した後、液体窒素でフラッシュ凍結させた。全てのデータはＡＬＳビームライン５．０．２．で集め、ＨＫＬ２０００を使用して処理した(Otwinowski, Z.及びMinor, W., Methods Enzymol. 276:307-326 (1997))。未複合体化ＣＲＩｇの結晶は１．２Åの分解能で回折し、ａ＝３０．２、ｂ＝５０．７及びｃ＝６１．９Ａの格子パラメータの空間群Ｐ２１２１２１に属する。構造は複数の異常な分散系及びプログラムａｕｔｏ-ＳＨＡＲＰ（G. Bricogne, C. Vonrhein, C. Flensburg, M. Schiltz, W. Paciorek, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59, 2023 (2003)）を用いて解明した。 Ｒｅｆｍａｃ（G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240 (1997)）を用いる緻密化とプログラムＯ（T. A. Jones, J. Y. Zou, S. W. Cowan, Kjeldgaard, Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2), 110 (1991)）を用いたマニュアルでの調節によって、１４．９％のＲｃｒｙｓｔと１７．７％のＲｆｒｅｅのモデルを得た。Ｃ３ｃの結晶は３．１Åに回折し、ａ＝３８２Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å及びβ＝１０２．７°の格子パラメータの空間群Ｃ２に属し、非対称ユニットに二つの複合体を含んでいる。構造はＡＭｏＲｅ（Navazza J., Acta Crystallogr. A 50:157-163 (1994)）及び未結合ＣＲＩｇ及びＣ３Ｃモデル（ｐｄｂコード２Ａ７４）を使用して解明した。非結晶学的対称制約を適用する緻密化後の最終のＲｃｒｙｓｔ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２３．７％及び２９．７％であった。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶は４．１Å分解能に回折し、ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Åの格子パラメータの空間群Ｃ２２２２１に属する。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体を使用する分子置換後、ＣＵＢドメイン（ｐｄｂコード２Ａ７３）とＴＥＤドメイン（１Ｃ３Ｄ）を電子密度マップ中にマニュアルでドッキングさせた。剛性体緻密化後、ＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する領域並びに２つのグリコシル化部位の明確な密度は解釈可能な密度を有しており、電子密度中に嵌り込むことができた。最終モデルは、Ｃ３４５ＣドメインのないＣＲＩｇ及びＣ３ｂの複合体を含む；後者のドメインは非常に弱い密度を有しており、図１に対して０．０に設定された占有率でモデルに含められた。最終Ｒｃｙｓｔ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２５．２％及び３３．３％であった。
【０２１９】
結果
ａ．構造の決定
ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びｉＣ３ｂと複合体を形成するが、親分子Ｃ３に結合することができないことが最近確定された（K. Y. Helmy等, Cell 124, 915 (2006)）。ＣＲＩｇの選択性に対する構造的基礎をより良好に理解するために、その未結合状態におけるＣＲＩｇの結晶構造を高分解能で決定し、またＣ３ｂ及びＣ３ｃとの複合体についても決定した（それぞれ４．１Å及び３．２Å）。未結合ＣＲＩｇの構造を、３波長異常分散（ＭＡＤ）フェージングを使用して解明した（Hendrickson, W.A.等, Proteins 4:77-88 (1988)）。つづいて、複合体の構造を、サーチモデルとして、ＣＲＩｇ及びＣ３（２Ａ７３）、Ｃ３ｃ（２Ａ７４）、並びにＣ３ｄ（１Ｃ３Ｄ）の構造の様々なドメイン及び断片の座標を使用して分子置換によって解明した。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ構造は非対称ユニットに２分子を含み、非結晶学的対称制約を使用する緻密化後に、最終のＲ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２３．６％及び２９．５％であった。Ｃ３ｃ：ＣＲＩｇ複合体の限られた分解能のため広範な位置的緻密化は可能ではない。しかしながら、様々なリンカーのモデル化及び個々のドメインの剛性体緻密化後、最終モデルのＲ及びＲｆｒｅｅはそれぞれ２４．８％及び３３．１％であり、構造が限られた分解能を考えると良い品質であることを示している。
【０２２０】
ｂ． Ｃ３ｂの全体構造
Ｃ３ｂの個々のドメインの構造は最近報告されたＣ３構造（上掲のJanssen等；D. Hourcade, V. M. Holers, J. P. Atkinson, Adv Immunol 45, 381 (1989)）と同様であるが、これらのドメインの配置はＣ３と比較するとかなり異なっている。簡単に述べると、残基１〜６４５からなるＣ３ｂのβ鎖は、５つのマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ１-ＭＧ５）、第６ＭＧドメインのＮ末端半分、リンカー領域（ＬＮＫ）（図１Ａ、Ｂ）に折り畳まれる。免疫グロブリントポロジーＭＧドメインは「キーリング」様形式に配置され、約１０Å幅で３０Å長の中央溝の回りを円で囲んでいる。Ｃ３ｂのα鎖は残基７２９：１６４１からなり、Ｃ３と比較してＣ３ａ又はＡＮＡドメインを欠いている。α'ＮＴドメインと呼ばれるＣ３ｂα鎖のＮ末端残基（７２９：７４５）は、伸展したコンフォメーションを採用し、第６ＭＧドメインの第２の半分を形成する残基につながっている。これに続いて、α鎖は間にＣＵＢドメインとチオ-エステルドメイン（ＴＥＤ）が挿入された２つの更なるＭＧドメイン（ＭＧ７及びＭＧ８）を含んでいる。最後に、α鎖のＣ末端の１７０残基はいわゆる「アンカー領域」とＣ３４５Ｃドメインを形成している。
【０２２１】
ｃ． Ｃ３活性化時のコンフォメーション変化
Ｃ３、Ｃ３ｂ、及びＣ３ｃの構造の比較は、大きなコンフォメーション変化、つまりＣ３のＣ３ｂとＣ３ａへの開裂が活性化後直ぐに生じることを示している（図１Ａ、Ｂ）。Ｃ３中のＭＧ３及びＭＧ８ドメイン間に割り込んでいるＡＮＡドメインの放出により（上掲のF. Fredslund, J等）ＭＧ３とＭＧ８が回転させられる。これらのコンフォメーション変化によりＭＧ７ドメインが更に回転し、Ｃ３をＣ３ｃと比較した場合、上掲のJannsen等に記載されたα'ＮＴドメインの興味深い動きが生じる。Ｃ３ｃの場合と同様に、α'ＮＴはＣ３におけるよりもＣ３ｂにおいて更に溶媒露出性であり、補体活性化のレセプター及び調節因子、ＣＲ１、ＣＦＨ及びＢ因子のための多くの潜在的結合部位を示す（J. D. Lambris等, J Immunol 156, 4821 (1996)；A. Taniguchi-Sidle, D. E. Isenman, J Immunol 153, 5285 (1994)；A. E. Oran, D. E. Isenman, J Biol Chem 274, 5120 (1999)）。しかしながら、Ｃ３活性化によって誘導される最も大きな動きはＣＵＢ及びＴＥＤモジュールに関する。Ｃ３中のＴＥＤ及びＭＧ８に対して密接に充填されているＣＵＢはＭＧ８に対して約２５Å動き（図１Ｂ及び図６）、Ｃ３ｂ構造中においてＭＧ２と緩い相互作用のみを形成する。Ｃ３においてＴＥＤは、残基Ｃｙｓ９８８及びＧｌｎ９９１の間に形成されたチオ-エステル結合を溶媒から保護するＭＧ８ドメイン及びＣＵＢに対して堅固に埋もれている。活性化の際、ＴＥＤはＣＵＢ及びＭＧ８ドメインから離れる方向に回転しＴＥＤ及びＣＵＢドメインを連結する残基を完全に異なったコンフォメーションで残す；これらの変化の過程において、Ｃｙｓ９８８は、Ｃ３構造中のその最初の保護された巣からＣ３構造中のその顕著に露出した位置まで８０Åを越えて移動する。
【０２２２】
Ｃ３は炎症疾患の発生率に影響を及ぼす２つの一般的なアロタイプで存在している（J. E. Finn等, Nephrol Dial Transplant 9, 1564 (1994)）。これらの変異体は単一のアミノ酸が異なる。更に一般的なアロタイプのＣ３Ｆは、８０位に大きい正荷電のアルギニンを有する一方、Ｃ３Ｓは小さい非荷電のグリシンを有している。残基Ｒ８０と回りのループはＣ３又はＣ３ｃの構造では相互作用を形成せず（上掲のJanssen等）、Ｒ８０と相互作用する他のタンパク質はこれまで同定されていない。Ｃ３ｂにおいて、このループはＭＧ１とＴＥＤドメイン間の多くの接触の原因であり、Ｒ８０はＴＥＤの表面上の負に荷電した溝に近接して位置している（図７）。Ｒ８０及びＴＥＤドメイン間の相互作用がＣ３Ｓ及びＣ３Ｆアロタイプ間の観察された差異の原因であるかどうかを確認するためには更なる実験が必要である。
【０２２３】
Ｃ３ｄ及びＣ３におけるαヘリックストロイドＴＥＤモジュールは多くの有意な差を示している（上掲のJanssen等）。最も重要な点は、−粒子表面へのＴＥＤドメインの共有結合に必要とされる−残基Ｈｉｓ１１０４及びＧｌｕ１１０６が互いに離れ、またＣｙｓ９８８から離れていることである。しかしながら、Ｃ３ｄにおいては、これらの残基は非常に近接しており、これは共有結合反応のための重要な必要条件である。ここに提示されたＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の分解能は個々のアミノ酸側鎖の正確な位置の検討を可能にするものではない一方、Ｃ３ｂ中のＴＥＤのコンフォメーションがＣ３ｄ構造に非常に類似していることは我々の構造から明らかである。Ｃ３とＣ３ｂ間の著しいコンフォメーションシフトにより、結合反応に重要なＴＥＤ残基が溶媒露出性になり、Ｃ３ｂ分子の遠位端に槍の穂先のように位置せしめられる。
【０２２４】
ｄ． ＣＲＩｇはＣ３ｂ及びＣ３ｃのβ鎖に結合する
配列解析によって予測されるように（K. Langnaese等, Biochim Biophys Acta 1492, 522 (2000)）、ＣＲＩｇのＮ末端ドメインは、位相幾何学的には、免疫グロブリン様ドメインのＩｇＶファミリーに属するが、プロテインデータバンクに現在寄託されている他のＩｇドメインと僅か約２０％の配列同一性を共有しているだけである。この折り畳みファミリーの全てのメンバーと同様に、ＣＲＩｇドメインは２つのβシートによって形成されている。これらのシートの一方はストランドＡ’、Ｇ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’及びＣ’’によって構成され、他方はストランドＢ、Ｅ、及びＤによって構成される（図２Ａ及び図８）。該ドメインは、ストランドＢ及びＦを内部で連結する２つのシステイン残基間に形成された正準なＩｇ様ジスルフィド結合によって更に安定化されている。
【０２２５】
ＣＲＩｇは同一の形式でＣ３ｂとＣ３ｃに係合し、両方のＣＲＩｇ複合体中に存在する全ての接触ドメインの配置は非常に類似している。これに沿って、Ｃ３ｂとＣ３ｃに対するＣＲＩｇの親和性は比較できる（図９）。Ｃ３ｂ：ＣＲＩｇ及びＣ３ｃ：ＣＲＩｇ構造の重ね合わせは、β鎖の６４２の共通のＣａ位置に対しては０．６Å未満で、Ｃ３ｃとＣ３ｂのα鎖の４７９Ｃａ原子に対しては０．５Å未満のＲＭＳＤになる。
【０２２６】
これまでに同定された全ての他の補体レセプターとは異なり（J. D. Lambris等, J Immunol 156, 4821 (1996)；A. Taniguchi-Sidle, D. E. Isenman, J Immunol 153, 5285 (1994)；A. E. Oran, D. E. Isenman, J Biol Chem 274, 5120 (1999)）、ＣＲＩｇは主にＣ３ｂのβ鎖に結合する。その未結合状態及び互いの複合体でのＣ３ｃ及びＣＲＩｇ構造の比較から、結合を亢進させるために２分子の何れにおいても有意なコンフォメーションの適応が必要とはされないことが明らかになった。ＣＲＩｇへの未結合（上掲のJanssen等）及び結合双方のＣ３ｃ構造における９６３の共通のＣａ位置は０．８ÅのＲＭＳＤで重ね合わさり、最も大きな動きは可動性領域で生じ、ただ一つの小さなループの移動がＭＧ６ドメインで生じる（結果を示さず）。ＣＲＩｇに対する結合部位は、ＣＵＢ及びＴＥＤドメインとはＣ３ｂの反対側にあり、ＴＥＤドメインから離れる方向におよそ４０Å離れてＣＲＩｇを位置させている。
【０２２７】
ＣＲＩｇとＣ３ｃ又はＣ３ｂの間の結合界面は大きく、不連続で、全体で約２６７０Å２の溶媒露出面積を埋めている（図２Ａ）。ＣＲＩｇはＣ３ｂと接触し、Ａ’、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’シートからの残基が、ストランドＣ’とＣ”の近傍の残基及びループによって形成された相互作用の大部分を有する。Ｃ’とＣ”を連結するヘアピンループは、Ｃ３ｂのキーリング形状のβ鎖の中心に形成された裂け目中に突出している。界面のＣ３ｂ側では、ドメインＭＧ３、ＭＧ４、ＭＧ５、ＭＧ６、ＬＮＫ及びＭＧ６が全てＣＲＩｇ結合に寄与し、埋まった界面のそれぞれ約３０％と４０％に対してＭＧ３とＭＧ６が原因となっている（図２Ｂ）。Ｃ３及びＣ３ｂ構造の比較は、Ｃ３ｂ及びＣ３ｃへのＣＲＩｇの結合のゲーティングにおけるＭＧ３ドメインの重要な役割を示唆している。Ｃ３活性化時に生じる大規模なドメイン移動とは別に、機能的な重要性を有することがある数種のより小さいドメインシフトがある。これらの間のキーは、比較的僅かであるが、Ｃ３分子の残りと比較してなお有意な１５°のＭＧ３の回転である。この回転は、ＣＲＩｇ結合部位を構成する他のＭＧドメインのリングに関したＭＧ３の相対的再配向の原因であり、ＬＮＫ領域の螺旋部分の動きと連係して（図９）、ＣＲＩｇをＣ３ｂ及びＣ３ｃに結合させる；これらの中程度の変化がないと、Ｃ３はＣＲＩｇにはラッチされないであろう。
【０２２８】
重要な結合パラメータを次の表１にまとめる。
【０２２９】
実施例２
ＣＲＩｇ変異体
構造複合体によって明らかになった結合界面の重要性を機能的に検証するために、次のＣＲＩｇ変異体をデザインし、製造し、Ｃ３ｂに結合するそれらの能力を試験した：次の表２において、番号はシグナル配列切断部位の開始位置を示す。
表２
変異体 アミノ酸置換
Ａ Ｅ８５Ａ Ｍ８６Ａ
Ｂ Ｈ５７Ａ Ｑ５９Ａ
Ｃ Ｖ１０７Ｓ Ｄ１０９Ｒ Ｉ１１１Ｅ
Ｄ Ｌ３４Ｓ Ｋ３６Ｄ Ｌ３８Ｈ
Ｅ Ｐ９１Ａ Ｔ９３Ａ Ｄ９５Ａ
コントロール Ｈ２１Ａ Ｔ２３Ａ Ｄ２５Ａ
【０２３０】
変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用して作製し、プライマーは製造者の指示に従って設計した。二重又は三重変異体を用いた結合実験の結果は結晶学的に定めたタンパク質-タンパク質接触と密接に一致している（図２Ｂ）。ＭＧ６及びＭＧ３結合ドメイン（Ｅ８５Ａ Ｍ８６Ａ及びＨ５７Ａ Ｑ５９Ａ）における変異がＣＲＩｇのＣ３ｂへの結合を最も効果的に抑止し（ＩＣ５０値はｗｔＣＲＩｇと比較して＞１００００及び１００倍高かった）、ＣＲＩｇ結合におけるこれらのドメインの相互作用の重要性を示している。これに対して、結合界面とは反対側に位置するＣＲＩｇ表面残基における変異は、野生型分子と同様の結合活性を示し、これらの変異が分子の全体の折り畳みを変えないことを確認した。また、円二色性分光法を更に使用して、全ての変異タンパク質が正しく折り畳まれたことを確認した（結果は示さず）。
【０２３１】
実施例３
Ｃ３ｂへのＣＲＩｇの結合は補体の代替経路を阻害する
ＡＰ及び古典／ＭＢＬ経路双方のＣ５転換酵素がＣ３ｂサブユニットを含んでいるので（Pangburn及びMuller-Eberhard, Biochem J., 235:723 (1986)）、我々は、ＣＲＩｇがそのＣ３ｂへの結合を介して補体活性化の何れかの経路を調節できるかどうかを問うた。ＣＲＩｇは代替経路を介する補体活性化を阻止したが、古典又はＭＢＬ経路はしなかった（図３ａ）。この阻害活性はＣ３ｂ結合活性を欠いたＣＲＩｇ変異体では失われており、ＣＲＩｇ-Ｃ３ｂ結合が転換酵素活性を乱す直接の原因であることを確認した。ＣＲＩｇによるＡＰの選択的阻害は、代替及び古典／ＭＢＬ経路を区別する細胞ベースアッセイで更に確認した。ＩＣ５０は、ＣＲＩｇがＩｇＧのＦｃ部分に融合された場合に２倍まで減少した（図Ｓ６Ａ）。ＣＲＩｇは代替経路の選択的インヒビターであるので、ＣＲＩｇは古典経路によって開始される代替経路溶血を阻害することができる（図Ｓ６Ｂ）。代替経路阻害は、マウスＣＲＩｇにおいて保持されており（図Ｓ３Ｃ）、ＣＲＩｇの補体阻害活性は系統的に保存されていることを確認した。
【０２３２】
ＣＲＩｇが転換酵素を阻害する分子メカニズムを更に決定するために、Ｃ３及びＣ５転換酵素のＣ３ｂサブユニットとのＣＲＩｇの相互作用を精製した成分を使用して研究した。ＣＲＩｇは、減少したＣ３ａ生産によって示されるように液相Ｃ３転換酵素を阻害することができた（図３Ｂ）。ＣＲＩｇはまたザイモサン粒子の表面に集まったＣ５転換酵素の酵素活性を減少させた（図３Ｃ）。様々なＣＲＩｇ変異体の阻害活性はＣ３ｂサブユニットへのその親和性と相関しており、Ｃ３ｂへのＣＲＩｇの結合がＣ５転換酵素の活性を直接調節することを示している。これは、Ｃ３ｂβ鎖へのＣＲＩｇの結合が代替経路の転換酵素によってＣ３とＣ５の双方の切断を妨害することを示している。
【０２３３】
実施例４
ＣＲＩｇは関節炎のマウスモデルにおいて補体活性化を阻害する
材料と方法
ａ．マウスにおける関節炎の誘発
コラーゲン誘発関節炎を、他に記載されているようにして（K. H. Barck等, Arthritis Rheum 50, 3377 (2004)）実施した。マウスに、２１日目に開始して４ｍｇ／ｋｇのＣＲＩｇ-Ｉｇ融合タンパク質を、又は一次免疫後３６日目に開始して１２ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を皮下的に注射した。ＣＲＩｇ-Ｉｇ融合タンパク質では、マウスＣＲＩｇ細胞外ドメインをＩｇＧ１分子のマウスＦｃ部分に融合させている。抗体誘発関節炎は関節炎誘発性混合物を使用してＴｅｒａｏと同僚の方法（K. Terato等, J Exp Med 162, 637 (1985)）によって誘発させた。簡単に言えば、マウスに尾静脈から２ｍｇの抗ＣＩＩＡｂ（２ｍｇ／５００μｌ／体）を静脈内注射し、３日後に２５μｇのＬＰＳ（２５μｇ／１００μｌ／体）を腹腔内注射した。骨体積の測定と組織検査を、他に記載されているようにして（上掲のBarck等）実施した。
【０２３４】
ｂ．関節炎の後足におけるサイトカイン濃度の測定
屠殺したマウスの後足蹠を毛の生え際で切断し、液体Ｎ２で凍結させた。ポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA）を使用して２５ｍｌ当たり１完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche）を補填した氷冷ＲＩＰＡ可溶化バッファー中で足蹠をホモジナイズさせた。均質化に使用したＰＢＳの体積を、バッファー１ミリリットル当たり７５ｍｇの組織に調節した。ホモジネートを１８７０×ｇで１５分間遠心分離し、上清を１３２３０×ｇで５分間遠心分離した。その上清をＥＬＩＳＡ分析にかけた。マウスＩＬ-１β及びＩＬ-６（BD DuoSet）及びｍＣ３ａ（Bachem）のＥＬＩＳＡキットを、各ＥＬＩＳＡキットのプロトコルに従って使用した。Ｃ５ａは、製造者のプロトコル（ＢＤ）に従ってＣ５ａ-ｄｅｓａｒｇのネオ-エピトープに対する特異的抗体のセットを使用してＥＬＩＳＡによって測定した。上清中の全タンパク質濃度はＢＣＡキット（Pierce）を使用して測定した。サイトカインとケモカインの濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのピコグラムで表した。
【０２３５】
ｃ．ＥＬＩＳＡ解析
Ｃ３ａ及びＣ５ａのＥＬＩＳＡは、ＢＤからの捕捉及び検出抗体を使用して、又はマウスＥＬＩＳＡキットを使用して確立した。Weilisa全補体スクリーン：プロトコルはキットによって提供された指示書に従った。ＣＰの潜在的なＣＲＩｇ阻害を評価するために、Ｂ因子枯渇血清を使用した。ＡＰのＣＲＩｇ阻害を決定するために、Ｃ２枯渇血清を使用した。
【０２３６】
ｄ．関節炎の後足におけるサイトカイン濃度の測定
屠殺したマウスの後足蹠を毛の生え際で切断し、液体Ｎ２で凍結させた。ポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA）を使用して２５ｍｌ当たり１完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche）を補填した氷冷ＲＩＰＡ可溶化バッファー中で足蹠をホモジナイズさせた。均質化に使用したＰＢＳの体積を、バッファー１ミリリットル当たり７５ｍｇの組織に調節した。ホモジネートを１８７０×ｇで１５分間遠心分離し、上清を１３２３０×ｇで５分間遠心分離した。その上清をＥＬＩＳＡ分析にかけた。マウスＩＬ-１β及びＩＬ-６（BD DuoSet）及びｍＣ３ａ（Bachem）のＥＬＩＳＡキットを、各ＥＬＩＳＡキットのプロトコルに従って使用した。Ｃ５ａは、製造者のプロトコル（ＢＤ）に従ってＣ５ａ-ｄｅｓａｒｇのネオ-エピトープに対する特異的抗体のセットを使用してＥＬＩＳＡによって測定した。上清中の全タンパク質濃度はＢＣＡキット（Pierce）を使用して測定した。サイトカインとケモカインの濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのピコグラムで表した。
【０２３７】
結果
補体活性化の可溶型調節因子は炎症に至る補体活性化を阻害する強力な治療的ツールであることが証明された（H. F. Weisman等, Science 249, 146 (1990)；B. P. Morgan, C. L. Harris, Mol Immunol 40, 159 (2003)）。ＣＲＩｇの治療上の潜在性を、コラーゲン自己抗体及び補体活性化が疾患の原因に寄与するリウマチ様関節炎の二つのマウスモデルで試験した（A. Aggarwal等, Rheumatology (Oxford) 39, 189 (2000)；S. Solomon等, Arthritis Res Ther 7, 129 (2005)；K. Terato等, J Immunol 148, 2103 (Apr 1, 1992)）。インビボでのその薬理学的半減期を延長させるために、ｍｕＣＲＩｇの細胞外ドメインをマウスＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させた。ＣＲＩｇは、関節炎の臨床的徴候の前又は後で与えられたとき、関節膨張、組織学的スコア及び骨量減少を有意に減少させた（図４Ａ及びＢ、Ｓ１２）。その転換酵素活性の阻害に沿って、ＣＲＩｇは、軟骨表面上のＣ３沈着の減少によって示されるように（図４Ｃ）、関節において補体活性化を有意に減少させた。既に確認された疾患を持つマウスでは、ＣＲＩｇは関節の裏にあるＣ３と共に同時局在化され（図４Ｄ）、それが転換酵素に結合し、転換酵素を局所的に阻害することができることを示している。また、Ｃ３ａの局所レベル及びＣ５ａの全身レベルは、コントロール-Ｆｃ処置マウスにおけるよりもＣＲＩｇ-Ｆｃ処置において有意に低くなっていた（図４Ｅ）。これらの結果は、ＣＲＩｇが、局所的及び全身性補体活性化を阻害することによって疾患のエフェクター相において関節炎を阻害することを示している。ＣＲＩｇの保護活性は、Ｆｃレセプター結合を消失させるＣＲＩｇ-ＦｃのＦｃ部分の変異が、ｗｔＦｃタンパク質に融合したＣＲＩｇと等価な活性を有していたので、Ｆｃレセプター機能と独立であった（結果は示さず）。これらの結果に基づくと、ＣＲＩｇの単一ＩｇＶ様ドメインは補体介在疾患において代替経路を阻害する有望なタンパク質治療剤となりうる。
【０２３８】
実施例５
ＣＲＩｇは基質-酵素結合の阻害によりＡＰ転換酵素を阻害する
材料と方法
ａ．崩壊促進アッセイ
代替経路ＤＡＡに対するマイクロタイタープレートアッセイを過去に記載されているようにして（M. Krych-Goldberg等, J Biol Chem 274, 31160 (1999)）実施した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水中４μｇ／ｍｌのＣ３ｂで一晩被覆した。プレートを、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で３７℃にて２時間ブロックし、７１ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び４％のＢＳＡを含むベロナールバッファー中の４０ｎｇのＢ因子、１０ｎｇのＤ因子、及び０．８ｍＭのＮｉＣｌ２と共に室温で２時間インキュベートした（バッファーの濃度と組成はプロトコルでチェック）。ついで、ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（PBST）中のＨ因子又はＣＲＩｇ-ＨｉｓＥＣＤと共に室温で１５分間インキュベートして、プレート上のＣ３ｂからＢｂを解離させた。ついで、Ｂｂを、１：５０００の希釈のＰＢＳＴ中ヤギ抗ヒトＢ因子ポリクローナル抗体（Kent）と１：３０００の希釈のＰＢＳＴ中西洋わさびペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギ抗体（Caltag）と共に連続１時間インキュベートして検出した（希釈と二次抗体をプロトコルでチェック）。色はＯ-フェニレンジアミンで発色させた。このアッセイにおいて、Ｈ因子は予想された通りに崩壊促進活性のメディエーターとして挙動した。
【０２３９】
ｂ．Ｃ３ｂ-Ｃ４ｂ及びＣ３ｂ-Ｃ３ｂ二量体調製及び結合／競合アッセイ
Ｃ３ｂＣ４ｂヘテロ二量体を次の変更をして（S. Meri, M.K. Pangburn, Eur. J. Immunol. 20:2555 (1990)）本質的に他に記載されているようにして（S. Meri, M. K. Pangburn, Eur J Immunol 20, 2555 (1990)）作製した。Ｃ３ｂ-Ｃ４ｂヘテロ二量体とＣ３ｂホモ二量体へのＣＲＩｇの結合を決定するために、マキシソープ９６ウェルマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗Ｃ３ポリクローナル抗体（ＩＣＮ）で４℃にて一晩被覆し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ついで、プレートを室温で２時間、２５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックし、滴定量のｈＣＲＩｇ-Ｌ ＬＦＨを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中で１時間加えた。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、ＣＲＩｇ結合を、ＰＢＳＴ／１％ＢＳＡ中の１：２００００希釈のＨＲＰにコンジュゲートしたマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（SIGMA）で検出した。ついで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００ｕｌのＴＭＢ基質溶液（KPL）で展開させ、５０ｕｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。Ｃ５がこの形態においてＣ３ｂ-Ｃ４ｂヘテロ二量体及びＣ３ｂホモ二量体の双方に結合することがまた決定された。ＣＲＩｇがＣ３ｂ-Ｃ４ｂ又はＣ３ｂ-Ｃ３ｂへのＣ５の結合をブロックすることができるかどうかを決定するために、補体二量体を捕捉し上述のようにブロックした。２０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むバッファーに希釈して、４００ｎＭのＣ５を滴定濃度のｈＣＲＩｇ-Ｓ ＨｉｓＥＣＤ又はＣ３ｂに結合しないこの融合体の変異型と前もって混合し、室温で１時間、捕捉した二量体に加えた。ついで、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｃ５を、１：５０００のＰＢＳＴ希釈のマウス抗ヒトＣ５（Quidel）と１：３０００のヤギＦ'ａｂ抗マウス抗体（Caltag）の段階的添加によって検出した。該プレートを上のようにして発色させ、２つのウェルのＡ４１５を平均化し単一の点と考えた。
【０２４０】
結果
補体活性化の全ての既知の調節因子は、Ｃ３のＩ因子介在性切断のコファクターとして作用し、又はＣ３ｂへの結合についてＢｂの競合体であり、よって転換酵素活性を除去する（D. Hourcade等, Adv Immunol 45, 381 (1989)；T. Seya, J. P. Atkinson, Biochem J 264, 581 (1989)；X. Sun等, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 628 (1999)）。これに対して、ＣＲＩｇは崩壊活性もコファクター活性も示さない。また、ＣＲＩｇは、Ｈ因子、Ｂ因子又はプロパージンのＣ３ｂへの結合と干渉しない（図Ｓ１３Ａ−Ｃ、結果は示さず）。ＣＲＩｇがＡＰ補体活性化を阻害するメカニズムを更に探究するために、我々はＣＲＩｇがＣ５転換酵素の触媒性ＢｂサブユニットとよりもむしろＣ３ｂの機能と干渉するかどうかを決定した。代替経路転換酵素の非触媒性Ｃ３ｂサブユニットは基質Ｃ３及びＣ５の結合の原因である。ついで、転換酵素のＢｂ因子サブユニットはプロテアーゼとして作用することができ、結合した基質を切断する（W. Vogt等, Immunology 34, 29 (1978)）。その結果、転換酵素の活性はＣ３ｂに対する基質の親和性に直接的に比例する（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Immunol 164, 1379 (2000)）。ＣＲＩｇはＡＰ転換酵素のＣ３ｂ２サブユニットへのＣ５の結合を防止するが、ＡＰに対するその選択性と一致して、Ｃ５転換酵素（図５Ａ）はＣＰ転換酵素のＣ３ｂＣ４ｂサブユニットに対して効果は有していない。Ｃ５転換酵素の活性に対するＣＲＩｇの結合の重要性を、精製されたＣ５転換酵素で更に決定した（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Biol Chem 273, 16828 (1998)）。ＣＲＩｇの存在下ではｓ、酵素のＶｍａｘは〜５０％減少し（図５Ｂ）、これは、ＣＲＩｇが基質濃度とは独立にＣ３ｂへのＣ５の最大結合能を阻害することを示している。これは、ＣＲＩｇによるＣ３ｂへのＣ５の結合の立体的又はアロステリックな阻害の指標であり、Ｃ３ｂへの結合に対するＣ５とのＣＲＩｇの直接の競合ではない。これは、Ｃ５がＣ３ｂへの結合についてＣＲＩｇと競合できない結合アッセイからの結果によって更に裏付けられている（図１４）。よって、Ｃ３ｂのキーリング様β鎖構造の中心に結合したＣＲＩｇは転換酵素へのＣ５の結合をブロックすることができ、よって酵素の活性を阻害する。これは、Ｃ５-転換酵素のその基質との相互作用に対するＣ３ｂのβ鎖の重要性を示している（N. Rawal, M. K. Pangburn, J Biol Chem 273, 16828 (1998)）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体により形成された結晶。
【請求項２】
格子定数ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Å及びＰ２１２１２１の空間群をおよそ有している請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項１に記載の結晶。
【請求項５】
結晶が約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１に記載の結晶。
【請求項６】
結晶が少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１に記載の結晶。
【請求項７】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項６に記載の結晶。
【請求項８】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項７に記載の結晶。
【請求項９】
アペンディクス１に示された構造座標を有するＣＲＩｇ結晶。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載の結晶を含んでなる組成物。
【請求項１１】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｂとの複合体の結晶形態。
【請求項１２】
格子定数ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群をおよそ有している請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１３】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１４】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１５】
約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１６】
少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１７】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項１６に記載の結晶。
【請求項１８】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項１７に記載の結晶。
【請求項１９】
アペンディクス２に示された構造座標を有する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項２０】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｃとの複合体の結晶形態。
【請求項２１】
格子定数ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群をおよそ有している請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２２】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２３】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２４】
約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２５】
少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２６】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項２５に記載の結晶。
【請求項２７】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項２６に記載の結晶。
【請求項２８】
アペンディクス３に示された構造座標を有する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２９】
配列番号２のＣＲＩｇポリペプチド又はその保存的置換のＣ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる分子又は分子複合体であって、結合部位が、８、１４−１５、４１−４２、４４、４５−４７、５０、５２、５４−６１、６２、６４、８５−８７、８９、９５、９９、１０５、１０７−１１０、及び１１１からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含み、結合部位がアペンディクス２に記載の構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から４．７Å未満の距離を有する点の集合によって定まる分子又は分子複合体。
【請求項３０】
上記結合部位が上記アミノ酸残基の実質的に全てを含む請求項２９に記載の分子又は分子複合体。
【請求項３１】
点の少なくとも一部が、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位を定める少なくともコアアミノ酸の骨格原子の位置を表すアペンディクス２の構造座標から誘導されている点の三次元立体構造。
【請求項３２】
Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位が空間群対称Ｃ２２２１を有する結晶を形成する、ホログラフィー像、立体ダイアグラム、モデル、又はコンピュータ・ディスプレイ画像として示された請求項３１に記載の点の三次元立体構造。
【請求項３３】
機械可読データでコードされたデータストレージ材を含む機械可読データストレージ媒体であって、該データを使用するための指示書を用いてプログラムされた機械が、Ｃ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる少なくとも一つの分子又は分子複合体の三次元グラフィック図を表示し、点の集合によって定まった結合部位が、アペンディクス２に記載された構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から約４．７Å未満の距離を有している媒体。
【請求項３４】
ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物を設計することを含むＣＲＩｇアゴニストを同定する方法。
【請求項３５】
（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定された化学物質。
【請求項３６】
ＣＲＩｇとＣ３ｂの間の結合をインビボ又はインビトロで妨害する請求項３５に記載の化学物質。
【請求項３７】
天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む分子又は分子複合体。
【請求項１】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体により形成された結晶。
【請求項２】
格子定数ａ＝３０．３Å、ｂ＝５０．８Å、ｃ＝６２．０Å及びＰ２１２１２１の空間群をおよそ有している請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項１に記載の結晶。
【請求項５】
結晶が約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１に記載の結晶。
【請求項６】
結晶が少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１に記載の結晶。
【請求項７】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項６に記載の結晶。
【請求項８】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項７に記載の結晶。
【請求項９】
アペンディクス１に示された構造座標を有するＣＲＩｇ結晶。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載の結晶を含んでなる組成物。
【請求項１１】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｂとの複合体の結晶形態。
【請求項１２】
格子定数ａ＝９７．６Å、ｂ＝２５５．７Å、ｃ＝１８０．３Å及びＣ２２２１の空間群をおよそ有している請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１３】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１４】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１５】
約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１６】
少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１７】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項１６に記載の結晶。
【請求項１８】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項１７に記載の結晶。
【請求項１９】
アペンディクス２に示された構造座標を有する請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項２０】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチド又はその機能的断片又は保存的アミノ酸置換変異体と、補体因子Ｃ３ｃとの複合体の結晶形態。
【請求項２１】
格子定数ａ＝３８２．８Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１４７．２Å、β＝１０２．７、及びＣ２の空間群をおよそ有している請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２２】
上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号１、２及び３のヒトＣＲＩｇポリペプチド；配列番号４のマウスＣＲＩｇポリペプチド；配列番号５のラットＣＲＩｇポリペプチド；配列番号６のウシＣＲＩｇポリペプチド；及び配列番号７のサルＣＲＩｇポリペプチドからなる群から選択される請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２３】
上記機能的断片が天然配列ＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列である請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２４】
約１から４０Åまでの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２５】
少なくとも約５Åの分解能で原子座標を決定するためにＸ線を回折する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２６】
上記分解能が少なくとも４Åである請求項２５に記載の結晶。
【請求項２７】
上記分解能が少なくとも３Åである請求項２６に記載の結晶。
【請求項２８】
アペンディクス３に示された構造座標を有する請求項２０に記載の結晶形態。
【請求項２９】
配列番号２のＣＲＩｇポリペプチド又はその保存的置換のＣ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる分子又は分子複合体であって、結合部位が、８、１４−１５、４１−４２、４４、４５−４７、５０、５２、５４−６１、６２、６４、８５−８７、８９、９５、９９、１０５、１０７−１１０、及び１１１からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含み、結合部位がアペンディクス２に記載の構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から４．７Å未満の距離を有する点の集合によって定まる分子又は分子複合体。
【請求項３０】
上記結合部位が上記アミノ酸残基の実質的に全てを含む請求項２９に記載の分子又は分子複合体。
【請求項３１】
点の少なくとも一部が、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位を定める少なくともコアアミノ酸の骨格原子の位置を表すアペンディクス２の構造座標から誘導されている点の三次元立体構造。
【請求項３２】
Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ結合部位が空間群対称Ｃ２２２１を有する結晶を形成する、ホログラフィー像、立体ダイアグラム、モデル、又はコンピュータ・ディスプレイ画像として示された請求項３１に記載の点の三次元立体構造。
【請求項３３】
機械可読データでコードされたデータストレージ材を含む機械可読データストレージ媒体であって、該データを使用するための指示書を用いてプログラムされた機械が、Ｃ３ｂ結合部位の少なくとも一部を含んでなる少なくとも一つの分子又は分子複合体の三次元グラフィック図を表示し、点の集合によって定まった結合部位が、アペンディクス２に記載された構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から約４．７Å未満の距離を有している媒体。
【請求項３４】
ＣＲＩｇのＣ３ｂ結合部位を模倣する化合物を設計することを含むＣＲＩｇアゴニストを同定する方法。
【請求項３５】
（ａ）計算又は実験手段を用いて化学物質とＣＲＩｇポリペプチド又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の三次元構造の間のフィッティング操作を実施し；（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを解析して化学物質と天然ＣＲＩｇ又はＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の間の結合の特徴を決定することにより同定された化学物質。
【請求項３６】
ＣＲＩｇとＣ３ｂの間の結合をインビボ又はインビトロで妨害する請求項３５に記載の化学物質。
【請求項３７】
天然配列ＣＲＩｇ分子又はその保存的アミノ酸置換変異体のＣ３ｂ結合領域の少なくとも一部を含む分子又は分子複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５０５７４３（Ｐ２０１０−５０５７４３Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３２６８（Ｐ２００９−５１３２６８）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１２８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６１３５
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１２８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３６１３５
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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