Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原
【課題】ワクチン開発における使用に適切な抗原および免疫原を提供するため、天然の感染の間に免疫応答を惹起するクラミジア抗原を同定することが本発明の課題である。
【解決手段】本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原性タンパク質に関する。詳細には、これは、慢性に感染した患者血清またはセロコンバージョンした患者の血清由来の抗体により認識される抗原に関する。上記課題は、感染の結果としてヒトにおいて免疫原性である、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによってコードされるタンパク質を、二次元電気泳動マップのウエスタンブロットを用いて同定することで解決された。いくつかの公知の免疫原は、免疫原として以前には公知ではないタンパク質、および発現された遺伝子産物として以前には報告されていないタンパク質として、同定された。
【解決手段】本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原性タンパク質に関する。詳細には、これは、慢性に感染した患者血清またはセロコンバージョンした患者の血清由来の抗体により認識される抗原に関する。上記課題は、感染の結果としてヒトにおいて免疫原性である、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによってコードされるタンパク質を、二次元電気泳動マップのウエスタンブロットを用いて同定することで解決された。いくつかの公知の免疫原は、免疫原として以前には公知ではないタンパク質、および発現された遺伝子産物として以前には報告されていないタンパク質として、同定された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（クラミジア抗原）
本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原性タンパク質に関する。詳細には、これは、慢性に感染した患者血清またはセロコンバージョンした患者の血清由来の抗体により認識される抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａは、風土性の性感染症、トラコーマ、感染性肺炎、および種々の他の疾患症候群の原因である真核生物細胞の偏性細胞内寄生生物である。それらは、排他的真正細菌の系統学的な分科であり、任意の他の公知の生物体に密接な関係を有さない。それらは、それ自体の目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類され、これは、単一の科（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を含み、次に、これは単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む。４つのＣｈｌａｍｙｄｉａ種が現在、公知である。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍおよびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ［例えば、引用文献１を参照のこと］。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（血清型亜型Ｄ）のゲノム配列は、現在公表されている［２］。
【０００３】
Ｃ．Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒトの血清改変体（「血清型亜型」）は、２つのバイオ改変体（「ｂｉｏｖａｒ」）に分けられる。血清型亜型Ａ〜Ｋは、主に眼の組織（Ａ〜Ｃ）または泌尿生殖器管（Ｄ〜Ｋ）において上皮性感染を誘発する。血清型亜型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、浸潤性の性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）の因子である。
【０００４】
クラミジア感染自体が疾患を生じるが、幾人かの患者においては、症候群の重篤度は、実際には、異常な宿主免疫応答に起因していると考えられる。感染を排除することの失敗は持続的な免疫刺激を生じ、そして宿主を助けることよりも、これは、重篤な結果（不妊および失明を含む）を伴う慢性感染を生じる［３］。
【０００５】
さらに、天然のクラミジア感染により与えられる防御は、通常、不完全で、一過性で、そして株特異的である。
【０００６】
疾患の深刻な性質に起因して、適切なワクチンを提供することが所望される。これらは、（ａ）クラミジア感染に対する、またはクラミジア誘導性疾患に対する免疫のために（予防ワクチン接種）、あるいは（ｂ）確立された慢性クラミジア感染の根絶のために（治療ワクチン接種）有用であり得る。しかし、細胞内寄生生物であることから、この細菌は、一般に抗体媒介免疫応答を逃れ得る。
【０００７】
種々の抗原性タンパク質が、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについて記載されており、そして特に細胞表面が、詳細な検索の標的となっている［例えば、１，４］。これらとしては、例えば、ｐｇｐ３［５，６，７］、ＭＯＭＰ［８］、Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）［９］およびＨｓｐ７０（ＤｎａＫ様）［１０］が挙げられる。しかし、これらの全てが有効なワクチンであると証明されたわけではなく、そして、ワクチン開発における使用に適切な抗原および免疫原を提供するため、天然の感染の間に免疫応答を惹起するクラミジア抗原を同定することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、感染の結果、ヒトにおいて免疫原性である、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによりコードされるタンパク質の同定に基づく。
【０００９】
本発明は、１５頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩに列挙されたような、タンパク質、５、６、７、８、９、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量およびｐＩの特徴を有するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質を提供する。
【００１０】
これらは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＬ２株において、１６頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩＩに開示されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００１１】
本発明はまた、これらのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質に同一の配列を有するタンパク質を提供する。特定のタンパク質に依存して、同一性の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）。これらの相同なタンパク質としては、変異体、対立遺伝子改変体、血清型改変体、およびバイオ改変体が挙げられる。タンパク質の間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。これは、パラメーターｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２、およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１を有するアフィンギャップ検索を用いる。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的に等価の指標とみなされる。
【００１２】
本発明は、さらに、本発明のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、このタンパク質から少なくともｎの連続するアミノ酸を含むべきであり、そして特定のタンパク質に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、５０、１００以上）である。好ましくは、このフラグメントは、このタンパク質由来のエピトープを含む。
【００１３】
本発明のタンパク質は、当然ながら、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）により、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合など）で調製され得る。それらは、好ましくは、実質的に単離されたまたは精製された形態（すなわち、実質的に他のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたは宿主細胞タンパク質を含まない）で調製される。
【００１４】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、そして、任意の適切な手段により生成されてもよい。
【００１５】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質のフラグメントをコードする核酸を提供する。この核酸に配列同一性を有する核酸がまた提供される。特定の核酸に依存して、同一性の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）。
【００１６】
さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェンシー」な条件（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中、６５℃）下で、この核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。この核酸のフラグメントもまた提供される。このフラグメントは、この配列由来の少なくともｎの連続するヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは１０以上である（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０以上）。
【００１７】
本発明は、上記の核酸に相補的（例えば、アンチセンスまたはプローブする目的のため）な配列を含む核酸を提供することもまた理解されるべきである。
【００１８】
本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの方法（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、または生物体自体から、など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、など）をとり得る。
【００１９】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまたそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、そしてまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００２０】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明の核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２１】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および/または核酸を含む組成物を提供する。これらの化合物は、免疫原性組成物（ワクチンを含む）として、例えば、または診断試薬として、適切であり得る。
【００２２】
本発明はまた、医薬として（例えば、ワクチンとして）、または診断試薬としての使用のための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。詳細には、本発明は、クラミジア免疫原としての使用のため、（１５頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩに列挙されたような）タンパク質５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５を提供する。表ＩＩに記載のタンパク質のいくつかは、それ自体、公知であり得ると考えられるが、それらが免疫原性であるとは開示されていない。
【００２３】
本発明はまた、以下の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する：（ｉ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａに起因する感染を処置または予防するための医薬、（ｉｉ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの存在またはＣｈｌａｍｙｄｉａに対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬、および/あるいは（ｉｉｉ）Ｃｈｌａｍｉｄｉａに対して抗体を惹起し得る試薬。Ｃｈｌａｍｙｄｉａは、任意の種または株であってもよいが、好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓである。好ましい実施形態では、本発明は、このような製造における使用のための表ＩＩの５５タンパク質のタンパク質を提供する。
【００２４】
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、本発明に従う核酸、タンパク質および/または抗体の治療的有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００２５】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００２６】
本発明のタンパク質を生成するためのプロセスが提供される。このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００２７】
本発明のタンパク質または核酸を生成するためのプロセスが提供される。ここで、タンパク質または核酸は、化学的手段を用いて部分的にまたは全体として合成される。
【００２８】
本発明の核酸を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従う核酸プローブを、二重鎖を形成するハイブリダイズ条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程：および（ｂ）この二重鎖を検出する工程、を包含する。
【００２９】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程、を包含する。同様に、本発明は、サンプル中の抗クラミジア抗体を検出するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従うタンパク質を、抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程、を包含する。
【００３０】
本発明はまた、これらのプロセスにおける使用に適切な試薬を備えるキットを提供する。
【００３１】
本発明に従う核酸プローブ、およびこのプローブにより形成された二重鎖を検出するための手段を備えるキットが、提供される。本発明に従う抗体、およびこの抗体により形成された抗体−抗原複合体を検出するための手段を備えるキットが提供される。本発明に従うタンパク質、およびこのタンパク質により形成された抗体−抗原複合体を検出するための手段を備えるキットが提供される。
【００３２】
疑いを回避するため、用語「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸから構成されてもよいし、またはＸ以外に何かを含んでも（例えば、Ｘ＋Ｙ）よい。
【００３３】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） １５頁の表ＩＩに記載のようなタンパク質５、６、７、８、９、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量特性およびｐＩ特性を有する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質。
（項目２） Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＬ２株において、１６頁の表ＩＩＩに開示されるＮ末端アミノ酸配列を有する、項目１に記載のタンパク質。
（項目３） 項目１に記載のタンパク質に５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
（項目４） 項目１に記載のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の少なくとも７つの連続するアミノ酸のフラグメントを含む、タンパク質。
（項目５） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質に結合する、抗体。
（項目６） 項目１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目７） 項目６の核酸に５０％以上の配列同一性を有する、核酸。
（項目８） 項目６に記載の核酸にハイブリダイズし得る、核酸。
（項目９） 項目６に記載の核酸の１０以上連続するヌクレオチドのフラグメントを含む、核酸。
（項目１０） 項目６に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１１） 項目１０に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
（項目１２） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
（項目１３） 医薬として、または診断試薬として用いるための、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１４） クラミジアの免疫原として用いるための（１５頁の表ＩＩに記載のような）タンパク質５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量特性およびｐＩ特性を有する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質。
（項目１５） Ｃｈｌａｍｙｄｉａによる感染の処置または予防のための医薬の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１６） Ｃｈｌａｍｙｄｉａの存在の検出のための診断試薬、またはＣｈｌａｍｙｄｉａに対して惹起される抗体の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１７） Ｃｈｌａｍｙｄｉａに対する抗体を惹起し得る試薬の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１８） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、患者を処置する方法。
（項目１９） タンパク質の発現を誘導する条件下で、項目１１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を産生するためのプロセス。
（項目２０） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を産生するためのプロセスであって、該タンパク質または該核酸が、一部または全体において化学的手段を用いて合成される、プロセス。
（項目２１） 項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を検出するためプロセスであって、以下の工程：（ａ）ハイブリダイズする条件下で、核酸プローブを生物学的サンプルに接触させて二重鎖を形成する工程；および（ｂ）該二重鎖を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２２） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を検出するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：（ａ）抗体−抗原複合体の形成のために適切な条件下で、項目５に記載の抗体を生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）該複合体を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２３） 項目５に記載の抗体を検出するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：（ａ）抗体−抗原複合体の形成のために適切な条件下で、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）該複合体を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２４） 項目２１から２３のいずれか一項に記載のプロセスにおける使用のために適切な試薬を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、注釈付き参照２Ｄ電気泳動ＥＢマップを示し、免疫反応性タンパク質スポット（標識された１〜５５）の位置もまた示す。同じタンパク質の一連の等電点として現れるスポットの群を、一緒に囲み、そして同じ識別番号に分類した。
【図２Ａ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｂ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｃ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｄ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（実施例）
（ヒト血清）
血清（表１）は、生殖管のクラミジア属感染に応答した女性から得た。１７の血清（Ａ〜Ｑ）を、低い４症例の生殖管感染および２症例の続発性不妊症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）を含む腹腔鏡検査で確認した１３症例のＰＩＤ（骨盤炎症疾患）から得た。全ての血清は、精製したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｌ２基本小体［１１］を用いた標準の微小免疫蛍光試験（ＭＩＦ）に対して陽性であり、そしてｐｇｐ３抗原［５］をコードしたプラスミドを用いるＥＬＩＳＡ試験により、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ免疫血清として確認した。
【００３６】
健康な血液ドナー由来の１０のセロネガティブコントロール血清の群を、同じ方法で免疫ブロッティングすることにより、かつ非特異的反応の発生を除外するために患者の血清と同じ希釈を用いて試験した。
【００３７】
ほとんどの血清は、Ｂｉｏｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｐｉｃａｒｄｉｅ（Ａｍｉｅｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）のＣｈｌａｍｙｄｉａ収集から得た。いくつかのＰＩＤおよび健康な血液ドナー由来のコントロール血清は、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ（Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｉｔａｌｙ）から得た。
【００３８】
（タンパク質サンプルの調製）
精製したクラミジア属細胞を参考文献１２に記載のように、Ｖｅｒｏ細胞培養中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ種Ｌ２／３４３／Ｂｕを通常の手順に従って増殖し、続く２サイクルの密度勾配遠心分離［１３］によって得た。精製した基本小体（ＥＢ）調製物の平均タンパク質濃度を、ビウレットアッセイを用いて決定した。アリコート（２ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、続く電気泳動分析のために−２０℃で水中に貯蔵した。使用した細胞は、主にＥＢの形態であり、現在までに知られているクラミジアの抗原の全ては、網様体（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ）よりもむしろ基本小体に見出される。
【００３９】
（クラミジアのタンパク質の分離）
クラミジアのタンパク質を高分解能２Ｄ電気泳動を用いて分離し、本質的に参考文献１４および１５に記載されるようなイモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）／ポリアクリルアミド系を用いて実施した。分析ゲルについては、１枚のゲル当たり約４５μｇの総基本小体タンパク質を使用した。（微小配列決定のための）セミプレパレーティブゲル（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｌ）については、約１ｍｇタンパク質を使用した。ＥＢタンパク質のアリコートを低速度の遠心分離によってペレットにし、そして８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホネート）、４０ｍＭ トリス塩基、６５ｍＭジチオエリトリトール（ＤＴＥ）および微量のブロモフェノールブルー中に再懸濁した。
【００４０】
等電点電気泳動を、非線形の３〜１０のｐＨ勾配（ＩＰＧ ｓｔｒｉｐｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を提供するイモビリン片上で実施した。電圧は、最初の３時間の間、直線的に３００〜３５００Ｖまで上昇させ、次いで５０００Ｖで２２時間安定化させた（総電圧−時間の積は、１１０ｋＶｈである）。電気泳動の後、ＩＰＧストリップを、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８、および２％ＤＴＥに対して１２分平衡化させた。二次元を９〜１６％ポリアクリルアミド直線勾配ゲル（１８ｃｍ×２０ｃｍ×１．５ｍｍ）上、４０ｍＡ／ゲル 定電流で、色素の前面がゲルの底面に到達するまで約５時間の間、Ｌａｅｍｍｌｉ系において実施した。分析ゲルをアンモニア性の硝酸銀を用いて染色した［１６］。タンパク質マップをレーザーフォトデンシトメーター（ｌａｓｅｒ ｐｈｏｔｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてスキャンし、次いでＭｅｌａｎｉｅ ＩＩ コンピューターソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析された電子ファイル（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｆｉｌｅ）に変換した。
【００４１】
図１は、イムノブロット上の同定されたタンパク質に使用した注釈付き参照ＥＢマップ（ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＥＢ ｍａｐ）を示す。参照マップに関するＭＷおよびｐＩ座標を、参照タンパク質として働くヒト血清タンパク質とのクラミジアタンパク質の共同移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）により較正した。血清タンパク質に使用した等電点の値は、参考文献１７に記載の等電点の値である。
【００４２】
（免疫ブロット分析）
免疫ブロットの結果を図２および表ＩＩに要約する。
【００４３】
二次元電気泳動の後、ゲルをニトロセルロース膜［１８］上に電気ブロットし、そして参考文献１９に記載されたように改変された標準の手順にしたがって処理した。簡単には、免疫検出の前に、膜を３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中の０．２％（ｗ／ｖ）Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓで３分間染色し、そして選択されたアンカースポットの位置をブロット上に印をつけ、免疫ブロットと銀染色マップとの整合を補助した。免疫反応性スポットは、患者の血清（１５００〜５０００×希釈）を用いて室温で一晩インキュベートし、続いてペルオキシダーゼと結合体化したウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ、７０００×希釈）とインキュベートし、そして化学発光ベースのキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる検出によって検出した。
【００４４】
代表的には、６つの同一の２Ｄマップを各実験に関して並行して調製し、５つを、ニトロセルロース上にブロットし、そして１つを、引き続く免疫ブロットとの相関関係および参照マップに対するコンピューターに補助されたマッチングのために硝酸銀を用いて染色した。
【００４５】
免疫ブロット上のスポットシグナルは、ほとんどいつも銀染色ゲル上のスポットに対応する。しかし、少なくとも２つの実例（図１のスポット１３および１４）において、免疫ブロット分析は、銀染色マップにおいて見えなかったタンパク質スポットを検出した。これは、この技術が、優れた感度を有し、かつ系統的なプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）研究の価値ある手段としてもまた考慮されるべきであることを示す。
【００４６】
免疫ブロットと図１に示される参照マップとのマッチングを補助するために、ニトロセルロースブロットに、一過性Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｅｄ染色を用いて、多くの内部「アンカー」スポットに印をつけた。血清とのインキュベーションおよび化学発光による結合抗体の検出の後、免疫ブロット画像を参照マップに整合し、そしてスポットを対応するｐＩおよびＭＷ座標（表ＩＩ参照のこと）に割り当てた。スポット（または等電点の一連のスポット）の位置および形が、以前に同定されたＥＢ抗原と一致した場合、そのような抗原に対する免疫応答を記録した。他の全ての場合において、免疫ブロットスポットは、染色された領域（または、複合体スポットパターンの場合は、座標領域）の重心（ｂａｒｉｃｅｎｔｒｅ）において得られたＭＷおよびｐＩ座標によって同定した。ＭＷおよびｐＩ値が、電気泳動的に決定され、そして＋／−１０％の潜在的な平均誤差を有し得ることが理解される。より高いＭＷの測定は、低精度である傾向がある。
【００４７】
コントロールブロットは全く空であったが、患者のブロットは、平均約１５を有する２〜２８で変化した多数のスポットを含む、個々に異なるパターンを示す（表ＩＩを参照のこと）。免疫反応性スポットの数は、血清ＭＩＦ力価と相関しない（表ＩおよびＩＩを参照のこと）。それ故、ブロットパターンは、単に抗体力価の差違ではなく、体液性応答において、事実上の個々の多様性を反映するようである。このことをまた、種々の希釈での各血清の結果を比較することによって確認した。
【００４８】
代表的なイムノブロットの結果を、図２に示す。試験した血清すべてについて一定である唯一の特徴は、システインリッチな外膜タンパク質ＯＭＰ２に起因すると以前に同定された、スポットの複合クラスターに対する抗体の存在であった[１２]。このクラスターは、図１においてスポットとして示される−「１」と表示されたスポットすべてが、単一の抗原としてスコア付けされたが、通常はＯＭＰ２の反応性に関連するようである、より低いＭＷおよびｐＩ値を有する多数の付属スポットは、別々にスコア付けされた。なぜなら、ＯＭＰ２ポリペプチドに対するこれらの関係が、未だ不明であるからである。ＯＭＰ２タンパク質はクラミジア特異的であり、そしていかなる関連する抗原性の変化も生じるようではないので、このタンパク質は、本研究において、クラミジア感染のおそらく最良のマーカーと見なされ得る。
【００４９】
観察された次の最も頻出したスポットは、以下に対応する：
・スポット２−ＧｒｏＥＬ様（ｈｓｐ６０）タンパク質（１５／１７の患者）
・スポット３−主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ（１３／１７の患者）
・スポット４−ＤｎａＫ様（ｈｓｐ７０）タンパク質（１１／１７の患者）。
【００５０】
これら公知の免疫原との反応性は、本研究において使用されるヒト血清の質を示す、内部コントロールとして見なされ得る。しかし、これらのブロットに対するｐｇｐ３の反応性の欠如が、顕著である。なぜなら、これらの血清すべては、ｐｇｐ３の精製された可溶性形態を用いる確認ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、陽性であることが見出されているからである。このことは、ヒト感染におけるｐｇｐ３に対する抗体応答が、主に、正確にフォールディングされたタンパク質構造においてのみ利用可能なエピトープに対して生じ、この応答がこれらの実験において失われたことを、示唆する。
【００５１】
以下のタンパク質に対する患者の免疫反応もまた、検出された[参考文献１２参照]：
・スポット１０−タンパク質伸長因子ＥＦ−Ｔｕ（８／１７）
・スポット１９−リボソームタンパク質Ｓ１（５／１７）
・スポット１２−リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（７／１７）。
【００５２】
これら公知のタンパク質に加えて、いくつかの新規な免疫反応性タンパク質が、１１／１７〜１／１７の範囲の頻度で検出された。これらのタンパク質のＭＷおよびｐＩの特徴を、表ＩＩに示す。さらに、少数の場合において、さらなる分析を、データベースの相同性検索で補足した、Ｎ末端アミノ酸配列決定によって実施した。
【００５３】
（スポットの小配列決定）
２Ｄ地図を上記のように調製した。参考文献２０におけるように、１泳動当り１ｍｇの総ＥＢタンパク質から開始し、続いて、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＢｉｏＲａｄ ＰＶＤＦ膜、２０×２０ｃｍ、孔径０．２μｍ）上にブロットした。このブロットを、５０％水性メタノール中にある０．１％（ｗ／ｖ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０を用いて５分間染色し、そして４０％メタノール、１０％酢酸中で脱色した。膜を３７℃で乾燥し、そしてさらなる分析のために−２０℃で保存した。選択したタンパク質スポットを切り出し、そしてフェニルチオヒダントイン−アミノ酸分析機モデル１２０Ａおよびコントロール／Ｄａｔａ Ｍｏｄｕｌｅモデル９００Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）とオンライン接続した、自動Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ｍｏｄ ４７０Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して、エドマン分解によるアミノ酸配列決定に供した。同様のブロットから代表的には３個または４個の等価なスポットを、そのスポット中のタンパク質の推定相対モル量に従って、使用した。
【００５４】
この配列決定の結果を、１６頁の表ＩＩＩに示す。
【００５５】
（配列のコンピューター分析）
Ｎ末端配列のデータを使用して、タンパク質の類似性についてのデータベース検索を、ＮＣＢＩ[ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ]から入手可能なＢＬＡＳＴプログラム[２１]およびＧＣＧソウトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）のプログラム[２２]を使用して、実施した。理論上のｐＩ値およびＭＷ値を、ＥｘＰＡＳｙインターネットサーバー[ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ]から入手可能なｐＩ／ＭＷコンピュータープログラムによって算出した。
【００５６】
これら通常のデータベースに加えて、Ｃｌａｍｙｄｉａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ[ｈｔｔｐ：／／ｃｈｌａｍｙｄｉａ−ｗｗｗ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ：４２３１]により提供される、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ／ＵＷ−３／Ｃｘ株のゲノム配列決定データを検索した。この研究はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ血液型亜型Ｌ２株（リンパ肉芽腫次亜種）（これは、異なる病原性表現型を有する）を使用したが、いくつかのタンパク質配列が、この血液型亜型Ｄ遺伝子に確実に関連し得る。
【００５７】
Ｎ末端のデータを用いたこれらの検索によって、７つの免疫反応性スポットを（上記の７つに加えて）以下の公知の配列に関連付けることが可能になった：
・スポット１５：ペリプラズムペプチダーゼであると推測される（この血液亜型Ｄのゲノムデータベースにおいて、現在はｈｔｒＡと注釈が付いている）。
・スポット１８および４６：外膜タンパク質であると推測される（このゲノムデータベースにおいて、現在はｏｍｐＢと注釈が付いている）。
・スポット２１：そのアミノ酸配列は、以前に記載されたどのタンパク質とも一致しないが、ＥＦ−Ｔｕからの内部配列に対する相同性を示す。このタンパク質は、ＥＦ−Ｔｕの分解産物またはプロセシング産物、あるいはその変異体であり得る。
・スポット２４：ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（ｒｐｏＡ）。
・スポット２５：細菌のロイシンペプチダーゼに対して相同（（このゲノムデータベースにおいて、現在はｐｅｐＡと注釈が付いている）。
・スポット３８：ＧＴＰ結合タンパク質であると推測される（現在は、ｙｃｈＦと注釈が付いている）。
【００５８】
スポット２６、３１および３３のＮ末端配列は、公開された血液型亜型Ｄ配列を含む、データベースのどの配列にも一致しない。
【００５９】
表ＩＶは、いくつかの免疫反応性抗原の同定（いくつかは推定）の要旨を示す。これらは、以前の２Ｄマッピングデータとの比較、または上記で得られたＮ末端配列決定データとの相同性検索のいずれかによって、得られた。
【００６０】
（特に興味深いタンパク質）
これらのイムノブロットから同定された以下のタンパク質が、特に興味深い：
（スポット２４）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩの位置およびそのＮ末端配列に基づいて、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ＲＮＡポリメラーゼ（ｇｉ６２００２９）のα鎖であると考えられる。このＲＮＡＰα鎖は、以前に記載されている[２３]が、クラミジア免疫原としては、未だ報告されていない。４人の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、これが、クラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを示す。Ｃｌａｍｙｄｉａの細胞内に寄生する性質は、この性質が一般的に、抗体媒介性免疫応答を回避し得ることを意味するが、上記で示される抗体の反応性は、その免疫系が、自然感染の間にこれらのタンパク質に遭遇することを示し、そして抗体の形成はまた、例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答を惹起することを補助し得る。
【００６１】
（スポット１８および４６）
スポット１８および４６は、血清型Ｄのゲノム中のｏｍｐＢ遺伝子（推定外膜タンパク質をコードすると注釈される）に相同であるようである。Ｎ末端配列ならびにｐＩ値およびＭＷ値（推定理論値５．０６／３４．５に対して、少なくともスポット１８については、５．０８／３４．０９）は、推定Ｎ末端シグナルペプチドの切断後の、ｏｍｐＢ遺伝子産物の予想特性と一致する。
【００６２】
スポット４６および１８の両方が、クラミジア外膜複合体の精製調製物の２Ｄ電気泳動マップ中に存在することもまた、見出された。これもまた、スポット１８および４６が血清型ＤのｏｍｐＢ遺伝子のホモログを示すという考えを支持する。
【００６３】
このタンパク質が２つの異なる電気泳動種として現れる理由を調べなかったが、この型のスポットのずれは、通常、アミノ酸配列変化および／またはいくつかのアミノ酸残基の真の誘導体化もしくは人為的な誘導体化のいずれかに起因した、アミノ酸組成の変化と関連する。
【００６４】
５名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質が、クラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６５】
（スポット２５）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｐｅｐＡと比較）に基づくと、アミノペプチダーゼであると考えられる。４名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６６】
（スポット３８）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｙｃｈＦと比較）に基づくと、ＧＴＰ結合タンパク質であると考えられる。２名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６７】
（スポット１５）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｈｔｒＡと比較）に基づくと、ストレス誘導性プロテアーゼであると考えられる。７名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６８】
（スポット８）
９名の患者が、タンパク質スポット８に対する反応性を示した。このタンパク質スポットを、Ｎ末端配列決定によって特徴づけることができなかった。しかし、このタンパク質スポットは、確かに以下の「配列型（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）２」アミノ酸組成（モル％）を有する：
【００６９】
【数１】
ＣｙｓおよびＴｒｐは、この型の分析では決定されず、そしてＧｌｕ／ＧｌｎとＡｓｐ／Ａｓｎとを区別することができない。
【００７０】
繰り返して試みられたにも拘わらず、Ｎ末端配列を得ることができないことは、そのＮ末端残基が、いくつかの形態の修飾（例えば、リポタンパク質）に起因してブロックされていることを示唆する。修飾は、しばしば、真核生物における膜結合型タンパク質に特徴的であるが、細菌種における外表面タンパク質または分泌型タンパク質に特徴的でもある（例えば、リポタンパク質［２４］マイコプラズマ外膜タンパク質［２５］、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＦＨＡビルレンス因子［２６］など）。
【００７１】
（スポット１２）
このスポットは、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に起因すると考えられる。７名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。このタンパク質は、クラミジアにおいて以前に記載されたが［登録番号Ｐ３８００１］、クラミジア免疫原であると報告されたことは一度もなかった。しかし、Ｂｒｕｃｅｌｌａ感染における免疫原として記載された［２７、２８］。
【００７２】
（スポット１９）
このスポットは、リボソームタンパク質Ｓ１に起因にすると考えられる。５名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。このタンパク質は、クラミジアにおいて以前に記載されたが［登録番号Ｐ３８０１６］、免疫原であると報告されたことは一度もなかった。
【００７３】
（スポット１０）
このスポットは、タンパク質合成伸長因子ＥＦ−Ｔｕに起因すると考えられる。８名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。クラミジアＥＦ−Ｔｕは、以前に記載されたが［登録番号Ｐ２６６２２］、免疫原であると報告されたことは一度もなかった。
【００７４】
（スポット１０、１２、１５、１９および２４）
慢性感染において、免疫病理反応を誘発し得る保存された微生物抗原に対する、あり得る以前の感作の重要性を仮定すると、これらの新たな免疫反応性抗原のうちのいくつかが、細菌タンパク質の保存されたファミリーに属することは注目すべきである：４つの血清（２３％）がスポット２４（ＲＮＡポリメラーゼのαサブユニット）と反応した；５つ（２９％）がスポット１９（リボソームタンパク質Ｓ１）を認識した；８つ（４７％）がスポット１０（ＥＦ−Ｔｕ）を認識した；７つ（４１％）がスポット１５（ＨｔｒＡ（Ｓ２Ｃペプチダーゼ）ファミリーの推定ストレス誘導性プロテアーゼ）を認識した；そして７つの血清（４１％）がスポット１２（リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２）を認識した。この研究において使用した血清の群において、１２／１７（７６％）がこれらの５つの抗原（ｈｓｐ６０抗原およびｈｓｐ７０抗原を含む）と反応し、そして全ての血清が１と７との間（平均３．７個）のクラミジアタンパク質（他の細菌においてホモログを有する）と反応する抗体を有した。
【００７５】
クラミジア病理における免疫学的感作機構に関する役割を仮定する理論は、ｈｓｐ６０ ＧｒｏＥＬ様抗原に関して記載される［２９］ように、実際には、他のいくつかの共通する細菌抗原（この細菌抗原は、他の細菌感染に置いて免疫原性であり得る）に拡張されるべきである。例えば、タンパク質伸長因子ＥＦ−Ｔｕは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染の急性期の間に免疫原性であり、そしてＬ７／Ｌ１２およびＨｔｒＡストレス誘導性プロテアーゼホモログの両方がＢｒｕｃｅｌｌａ感染において免疫原性である。ＥＦ−Ｔｕの場合において、細菌細胞におけるこのタンパク質の豊富さは、免疫系によるその「注目度（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）」に好都合であり得る。しかし、ＥＦ−Ｔｕが外膜およびペリプラズム細胞画分に関連すると記載され［３０］、そしてより最近では、データにより、ペプチド伸長におけるその機能に加えて、ＥＦ−Ｔｕがタンパク質折り畳みに関与するシャペロン活性およびストレスからの防御もまた有することが示唆される［３１］ことに注意すべきである。Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質に対する応答は特に興味を引く。なぜなら、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ感染において、相同なＬ７／Ｌ１２抗原は、ＤＴＨ細胞媒介応答を誘導する［２７］からである。さらに、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＬ７／Ｌ１２を用いてワクチン接種することは、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓによる感染に対する防御を与えることが示された［３２］。Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染した患者においてかなり頻繁に存在するというこの予測外の知見は、おそらく、クラミジア誘導性疾患においてもまた、この抗原に対してさらなる注意が払われるべきであることを示唆する。
【００７６】
（スポット５、６、７および９）
これらのタンパク質は、利用可能なゲノム配列といまだ全く相関付けられておらず、そして未だ配列決定されてもいないが、試験された血清におけるそれらの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）（＞５０％）を考慮すると、明らかに興味深い。
【００７７】
本発明は、上記で例示としてのみ記載されるにすぎず、そして本発明の範囲および趣旨内にとどまりつつ、改変が行われ得ることは理解される。
【００７８】
（表Ｉ）患者血清の要旨
第１欄における文字は、表ＩＩに示される文字と対応する。第２欄におけるコードは、起源血清コレクションをいう。それぞれの患者に関する病理学は、子宮頚管炎（下部生殖器感染）、ＰＩＤまたは不妊（感染の次の）として広範に示される。全ての血清を、精製Ｌ２基本小体を用いるＭＩＦアッセイによって特徴付けた。表中に示されるＭＩＦ力価は、最大で２倍希釈であり、これは、陽性シグナルを示した。「最適希釈」は、弱いスポットでのシグナルの喪失なしに最低限のバックグラウンドを与えることが見出された希釈である。
【００７９】
【表１】
（表ＩＩ）タンパク質スポットとの患者の反応性
【００８０】
【表２】
（表ＩＩＩ）タンパク質のＮ末端配列
【００８１】
【表３】
（表ＩＶ）抗原の同定
「ＣＴ−Ｄ遺伝子」は、参考文献２から命名される遺伝子をいい、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ中のホモログタンパク質をコードするような遺伝子の名称を与える。最後の欄における理論的なｐＩ／ＭＷ値を、実験値と比較して、ＣＴ−Ｄ遺伝子配列から計算した。
【００８２】
【表４】
（参考文献）（本明細書中にその全体を援用されるものの内容）
【００８３】
【化１】
【技術分野】
【０００１】
（クラミジア抗原）
本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原性タンパク質に関する。詳細には、これは、慢性に感染した患者血清またはセロコンバージョンした患者の血清由来の抗体により認識される抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａは、風土性の性感染症、トラコーマ、感染性肺炎、および種々の他の疾患症候群の原因である真核生物細胞の偏性細胞内寄生生物である。それらは、排他的真正細菌の系統学的な分科であり、任意の他の公知の生物体に密接な関係を有さない。それらは、それ自体の目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類され、これは、単一の科（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を含み、次に、これは単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む。４つのＣｈｌａｍｙｄｉａ種が現在、公知である。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍおよびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ［例えば、引用文献１を参照のこと］。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（血清型亜型Ｄ）のゲノム配列は、現在公表されている［２］。
【０００３】
Ｃ．Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒトの血清改変体（「血清型亜型」）は、２つのバイオ改変体（「ｂｉｏｖａｒ」）に分けられる。血清型亜型Ａ〜Ｋは、主に眼の組織（Ａ〜Ｃ）または泌尿生殖器管（Ｄ〜Ｋ）において上皮性感染を誘発する。血清型亜型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、浸潤性の性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）の因子である。
【０００４】
クラミジア感染自体が疾患を生じるが、幾人かの患者においては、症候群の重篤度は、実際には、異常な宿主免疫応答に起因していると考えられる。感染を排除することの失敗は持続的な免疫刺激を生じ、そして宿主を助けることよりも、これは、重篤な結果（不妊および失明を含む）を伴う慢性感染を生じる［３］。
【０００５】
さらに、天然のクラミジア感染により与えられる防御は、通常、不完全で、一過性で、そして株特異的である。
【０００６】
疾患の深刻な性質に起因して、適切なワクチンを提供することが所望される。これらは、（ａ）クラミジア感染に対する、またはクラミジア誘導性疾患に対する免疫のために（予防ワクチン接種）、あるいは（ｂ）確立された慢性クラミジア感染の根絶のために（治療ワクチン接種）有用であり得る。しかし、細胞内寄生生物であることから、この細菌は、一般に抗体媒介免疫応答を逃れ得る。
【０００７】
種々の抗原性タンパク質が、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについて記載されており、そして特に細胞表面が、詳細な検索の標的となっている［例えば、１，４］。これらとしては、例えば、ｐｇｐ３［５，６，７］、ＭＯＭＰ［８］、Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）［９］およびＨｓｐ７０（ＤｎａＫ様）［１０］が挙げられる。しかし、これらの全てが有効なワクチンであると証明されたわけではなく、そして、ワクチン開発における使用に適切な抗原および免疫原を提供するため、天然の感染の間に免疫応答を惹起するクラミジア抗原を同定することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、感染の結果、ヒトにおいて免疫原性である、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによりコードされるタンパク質の同定に基づく。
【０００９】
本発明は、１５頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩに列挙されたような、タンパク質、５、６、７、８、９、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量およびｐＩの特徴を有するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質を提供する。
【００１０】
これらは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＬ２株において、１６頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩＩに開示されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００１１】
本発明はまた、これらのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質に同一の配列を有するタンパク質を提供する。特定のタンパク質に依存して、同一性の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）。これらの相同なタンパク質としては、変異体、対立遺伝子改変体、血清型改変体、およびバイオ改変体が挙げられる。タンパク質の間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。これは、パラメーターｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２、およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１を有するアフィンギャップ検索を用いる。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的に等価の指標とみなされる。
【００１２】
本発明は、さらに、本発明のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、このタンパク質から少なくともｎの連続するアミノ酸を含むべきであり、そして特定のタンパク質に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、５０、１００以上）である。好ましくは、このフラグメントは、このタンパク質由来のエピトープを含む。
【００１３】
本発明のタンパク質は、当然ながら、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）により、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合など）で調製され得る。それらは、好ましくは、実質的に単離されたまたは精製された形態（すなわち、実質的に他のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたは宿主細胞タンパク質を含まない）で調製される。
【００１４】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、そして、任意の適切な手段により生成されてもよい。
【００１５】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質のフラグメントをコードする核酸を提供する。この核酸に配列同一性を有する核酸がまた提供される。特定の核酸に依存して、同一性の程度は、好ましくは、５０％より大きい（例えば、６５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）。
【００１６】
さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェンシー」な条件（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中、６５℃）下で、この核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。この核酸のフラグメントもまた提供される。このフラグメントは、この配列由来の少なくともｎの連続するヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは１０以上である（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０以上）。
【００１７】
本発明は、上記の核酸に相補的（例えば、アンチセンスまたはプローブする目的のため）な配列を含む核酸を提供することもまた理解されるべきである。
【００１８】
本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの方法（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、または生物体自体から、など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、など）をとり得る。
【００１９】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまたそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、そしてまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００２０】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明の核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２１】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および/または核酸を含む組成物を提供する。これらの化合物は、免疫原性組成物（ワクチンを含む）として、例えば、または診断試薬として、適切であり得る。
【００２２】
本発明はまた、医薬として（例えば、ワクチンとして）、または診断試薬としての使用のための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。詳細には、本発明は、クラミジア免疫原としての使用のため、（１５頁（ＰＣＴ英文）の表ＩＩに列挙されたような）タンパク質５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５を提供する。表ＩＩに記載のタンパク質のいくつかは、それ自体、公知であり得ると考えられるが、それらが免疫原性であるとは開示されていない。
【００２３】
本発明はまた、以下の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する：（ｉ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａに起因する感染を処置または予防するための医薬、（ｉｉ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの存在またはＣｈｌａｍｙｄｉａに対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬、および/あるいは（ｉｉｉ）Ｃｈｌａｍｉｄｉａに対して抗体を惹起し得る試薬。Ｃｈｌａｍｙｄｉａは、任意の種または株であってもよいが、好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓである。好ましい実施形態では、本発明は、このような製造における使用のための表ＩＩの５５タンパク質のタンパク質を提供する。
【００２４】
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、本発明に従う核酸、タンパク質および/または抗体の治療的有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００２５】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００２６】
本発明のタンパク質を生成するためのプロセスが提供される。このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００２７】
本発明のタンパク質または核酸を生成するためのプロセスが提供される。ここで、タンパク質または核酸は、化学的手段を用いて部分的にまたは全体として合成される。
【００２８】
本発明の核酸を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従う核酸プローブを、二重鎖を形成するハイブリダイズ条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程：および（ｂ）この二重鎖を検出する工程、を包含する。
【００２９】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程、を包含する。同様に、本発明は、サンプル中の抗クラミジア抗体を検出するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程：（ａ）本発明に従うタンパク質を、抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程、を包含する。
【００３０】
本発明はまた、これらのプロセスにおける使用に適切な試薬を備えるキットを提供する。
【００３１】
本発明に従う核酸プローブ、およびこのプローブにより形成された二重鎖を検出するための手段を備えるキットが、提供される。本発明に従う抗体、およびこの抗体により形成された抗体−抗原複合体を検出するための手段を備えるキットが提供される。本発明に従うタンパク質、およびこのタンパク質により形成された抗体−抗原複合体を検出するための手段を備えるキットが提供される。
【００３２】
疑いを回避するため、用語「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸから構成されてもよいし、またはＸ以外に何かを含んでも（例えば、Ｘ＋Ｙ）よい。
【００３３】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） １５頁の表ＩＩに記載のようなタンパク質５、６、７、８、９、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量特性およびｐＩ特性を有する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質。
（項目２） Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＬ２株において、１６頁の表ＩＩＩに開示されるＮ末端アミノ酸配列を有する、項目１に記載のタンパク質。
（項目３） 項目１に記載のタンパク質に５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
（項目４） 項目１に記載のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の少なくとも７つの連続するアミノ酸のフラグメントを含む、タンパク質。
（項目５） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質に結合する、抗体。
（項目６） 項目１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目７） 項目６の核酸に５０％以上の配列同一性を有する、核酸。
（項目８） 項目６に記載の核酸にハイブリダイズし得る、核酸。
（項目９） 項目６に記載の核酸の１０以上連続するヌクレオチドのフラグメントを含む、核酸。
（項目１０） 項目６に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１１） 項目１０に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
（項目１２） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
（項目１３） 医薬として、または診断試薬として用いるための、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１４） クラミジアの免疫原として用いるための（１５頁の表ＩＩに記載のような）タンパク質５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５の分子量特性およびｐＩ特性を有する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質。
（項目１５） Ｃｈｌａｍｙｄｉａによる感染の処置または予防のための医薬の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１６） Ｃｈｌａｍｙｄｉａの存在の検出のための診断試薬、またはＣｈｌａｍｙｄｉａに対して惹起される抗体の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１７） Ｃｈｌａｍｙｄｉａに対する抗体を惹起し得る試薬の製造における、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、使用。
（項目１８） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、項目５に記載の抗体、および／または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸の、治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、患者を処置する方法。
（項目１９） タンパク質の発現を誘導する条件下で、項目１１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を産生するためのプロセス。
（項目２０） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質または項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を産生するためのプロセスであって、該タンパク質または該核酸が、一部または全体において化学的手段を用いて合成される、プロセス。
（項目２１） 項目６から９のいずれか一項に記載の核酸を検出するためプロセスであって、以下の工程：（ａ）ハイブリダイズする条件下で、核酸プローブを生物学的サンプルに接触させて二重鎖を形成する工程；および（ｂ）該二重鎖を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２２） 項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を検出するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：（ａ）抗体−抗原複合体の形成のために適切な条件下で、項目５に記載の抗体を生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）該複合体を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２３） 項目５に記載の抗体を検出するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：（ａ）抗体−抗原複合体の形成のために適切な条件下で、項目１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を生物学的サンプルに接触させる工程；および（ｂ）該複合体を検出する工程、を包含する、プロセス。
（項目２４） 項目２１から２３のいずれか一項に記載のプロセスにおける使用のために適切な試薬を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、注釈付き参照２Ｄ電気泳動ＥＢマップを示し、免疫反応性タンパク質スポット（標識された１〜５５）の位置もまた示す。同じタンパク質の一連の等電点として現れるスポットの群を、一緒に囲み、そして同じ識別番号に分類した。
【図２Ａ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｂ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｃ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【図２Ｄ】図２は、典型的な免疫ブロットを示す。全マップ領域を示す。より簡単な比較のために、主要な公知の免疫原は、印を付けている。他のスポットの同定に関しては、図１および表ＩＩを参照する。ブロットＡは、ＰＩＤ患者ＪＯ５１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈は、１：５０００を有する。ブロットＢは、続発性不妊症によって影響された患者ＪＯ３５（ＭＩＦ力価６４）由来でありかつ血清希釈１：２５００を有する。ブロットＣは、ブロットＢに類似するが、患者ＪＯ５２に由来する。ブロットＤは、ＰＩＤ患者ＪＯ３１（ＭＩＦ力価２５６）由来でありかつ血清希釈１：５０００を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（実施例）
（ヒト血清）
血清（表１）は、生殖管のクラミジア属感染に応答した女性から得た。１７の血清（Ａ〜Ｑ）を、低い４症例の生殖管感染および２症例の続発性不妊症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）を含む腹腔鏡検査で確認した１３症例のＰＩＤ（骨盤炎症疾患）から得た。全ての血清は、精製したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｌ２基本小体［１１］を用いた標準の微小免疫蛍光試験（ＭＩＦ）に対して陽性であり、そしてｐｇｐ３抗原［５］をコードしたプラスミドを用いるＥＬＩＳＡ試験により、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ免疫血清として確認した。
【００３６】
健康な血液ドナー由来の１０のセロネガティブコントロール血清の群を、同じ方法で免疫ブロッティングすることにより、かつ非特異的反応の発生を除外するために患者の血清と同じ希釈を用いて試験した。
【００３７】
ほとんどの血清は、Ｂｉｏｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｐｉｃａｒｄｉｅ（Ａｍｉｅｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）のＣｈｌａｍｙｄｉａ収集から得た。いくつかのＰＩＤおよび健康な血液ドナー由来のコントロール血清は、Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ（Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｉｔａｌｙ）から得た。
【００３８】
（タンパク質サンプルの調製）
精製したクラミジア属細胞を参考文献１２に記載のように、Ｖｅｒｏ細胞培養中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ種Ｌ２／３４３／Ｂｕを通常の手順に従って増殖し、続く２サイクルの密度勾配遠心分離［１３］によって得た。精製した基本小体（ＥＢ）調製物の平均タンパク質濃度を、ビウレットアッセイを用いて決定した。アリコート（２ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、続く電気泳動分析のために−２０℃で水中に貯蔵した。使用した細胞は、主にＥＢの形態であり、現在までに知られているクラミジアの抗原の全ては、網様体（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ）よりもむしろ基本小体に見出される。
【００３９】
（クラミジアのタンパク質の分離）
クラミジアのタンパク質を高分解能２Ｄ電気泳動を用いて分離し、本質的に参考文献１４および１５に記載されるようなイモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）／ポリアクリルアミド系を用いて実施した。分析ゲルについては、１枚のゲル当たり約４５μｇの総基本小体タンパク質を使用した。（微小配列決定のための）セミプレパレーティブゲル（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｌ）については、約１ｍｇタンパク質を使用した。ＥＢタンパク質のアリコートを低速度の遠心分離によってペレットにし、そして８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホネート）、４０ｍＭ トリス塩基、６５ｍＭジチオエリトリトール（ＤＴＥ）および微量のブロモフェノールブルー中に再懸濁した。
【００４０】
等電点電気泳動を、非線形の３〜１０のｐＨ勾配（ＩＰＧ ｓｔｒｉｐｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を提供するイモビリン片上で実施した。電圧は、最初の３時間の間、直線的に３００〜３５００Ｖまで上昇させ、次いで５０００Ｖで２２時間安定化させた（総電圧−時間の積は、１１０ｋＶｈである）。電気泳動の後、ＩＰＧストリップを、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８、および２％ＤＴＥに対して１２分平衡化させた。二次元を９〜１６％ポリアクリルアミド直線勾配ゲル（１８ｃｍ×２０ｃｍ×１．５ｍｍ）上、４０ｍＡ／ゲル 定電流で、色素の前面がゲルの底面に到達するまで約５時間の間、Ｌａｅｍｍｌｉ系において実施した。分析ゲルをアンモニア性の硝酸銀を用いて染色した［１６］。タンパク質マップをレーザーフォトデンシトメーター（ｌａｓｅｒ ｐｈｏｔｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてスキャンし、次いでＭｅｌａｎｉｅ ＩＩ コンピューターソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析された電子ファイル（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｆｉｌｅ）に変換した。
【００４１】
図１は、イムノブロット上の同定されたタンパク質に使用した注釈付き参照ＥＢマップ（ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＥＢ ｍａｐ）を示す。参照マップに関するＭＷおよびｐＩ座標を、参照タンパク質として働くヒト血清タンパク質とのクラミジアタンパク質の共同移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）により較正した。血清タンパク質に使用した等電点の値は、参考文献１７に記載の等電点の値である。
【００４２】
（免疫ブロット分析）
免疫ブロットの結果を図２および表ＩＩに要約する。
【００４３】
二次元電気泳動の後、ゲルをニトロセルロース膜［１８］上に電気ブロットし、そして参考文献１９に記載されたように改変された標準の手順にしたがって処理した。簡単には、免疫検出の前に、膜を３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中の０．２％（ｗ／ｖ）Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓで３分間染色し、そして選択されたアンカースポットの位置をブロット上に印をつけ、免疫ブロットと銀染色マップとの整合を補助した。免疫反応性スポットは、患者の血清（１５００〜５０００×希釈）を用いて室温で一晩インキュベートし、続いてペルオキシダーゼと結合体化したウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ、７０００×希釈）とインキュベートし、そして化学発光ベースのキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる検出によって検出した。
【００４４】
代表的には、６つの同一の２Ｄマップを各実験に関して並行して調製し、５つを、ニトロセルロース上にブロットし、そして１つを、引き続く免疫ブロットとの相関関係および参照マップに対するコンピューターに補助されたマッチングのために硝酸銀を用いて染色した。
【００４５】
免疫ブロット上のスポットシグナルは、ほとんどいつも銀染色ゲル上のスポットに対応する。しかし、少なくとも２つの実例（図１のスポット１３および１４）において、免疫ブロット分析は、銀染色マップにおいて見えなかったタンパク質スポットを検出した。これは、この技術が、優れた感度を有し、かつ系統的なプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）研究の価値ある手段としてもまた考慮されるべきであることを示す。
【００４６】
免疫ブロットと図１に示される参照マップとのマッチングを補助するために、ニトロセルロースブロットに、一過性Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｅｄ染色を用いて、多くの内部「アンカー」スポットに印をつけた。血清とのインキュベーションおよび化学発光による結合抗体の検出の後、免疫ブロット画像を参照マップに整合し、そしてスポットを対応するｐＩおよびＭＷ座標（表ＩＩ参照のこと）に割り当てた。スポット（または等電点の一連のスポット）の位置および形が、以前に同定されたＥＢ抗原と一致した場合、そのような抗原に対する免疫応答を記録した。他の全ての場合において、免疫ブロットスポットは、染色された領域（または、複合体スポットパターンの場合は、座標領域）の重心（ｂａｒｉｃｅｎｔｒｅ）において得られたＭＷおよびｐＩ座標によって同定した。ＭＷおよびｐＩ値が、電気泳動的に決定され、そして＋／−１０％の潜在的な平均誤差を有し得ることが理解される。より高いＭＷの測定は、低精度である傾向がある。
【００４７】
コントロールブロットは全く空であったが、患者のブロットは、平均約１５を有する２〜２８で変化した多数のスポットを含む、個々に異なるパターンを示す（表ＩＩを参照のこと）。免疫反応性スポットの数は、血清ＭＩＦ力価と相関しない（表ＩおよびＩＩを参照のこと）。それ故、ブロットパターンは、単に抗体力価の差違ではなく、体液性応答において、事実上の個々の多様性を反映するようである。このことをまた、種々の希釈での各血清の結果を比較することによって確認した。
【００４８】
代表的なイムノブロットの結果を、図２に示す。試験した血清すべてについて一定である唯一の特徴は、システインリッチな外膜タンパク質ＯＭＰ２に起因すると以前に同定された、スポットの複合クラスターに対する抗体の存在であった[１２]。このクラスターは、図１においてスポットとして示される−「１」と表示されたスポットすべてが、単一の抗原としてスコア付けされたが、通常はＯＭＰ２の反応性に関連するようである、より低いＭＷおよびｐＩ値を有する多数の付属スポットは、別々にスコア付けされた。なぜなら、ＯＭＰ２ポリペプチドに対するこれらの関係が、未だ不明であるからである。ＯＭＰ２タンパク質はクラミジア特異的であり、そしていかなる関連する抗原性の変化も生じるようではないので、このタンパク質は、本研究において、クラミジア感染のおそらく最良のマーカーと見なされ得る。
【００４９】
観察された次の最も頻出したスポットは、以下に対応する：
・スポット２−ＧｒｏＥＬ様（ｈｓｐ６０）タンパク質（１５／１７の患者）
・スポット３−主要外膜タンパク質ＭＯＭＰ（１３／１７の患者）
・スポット４−ＤｎａＫ様（ｈｓｐ７０）タンパク質（１１／１７の患者）。
【００５０】
これら公知の免疫原との反応性は、本研究において使用されるヒト血清の質を示す、内部コントロールとして見なされ得る。しかし、これらのブロットに対するｐｇｐ３の反応性の欠如が、顕著である。なぜなら、これらの血清すべては、ｐｇｐ３の精製された可溶性形態を用いる確認ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、陽性であることが見出されているからである。このことは、ヒト感染におけるｐｇｐ３に対する抗体応答が、主に、正確にフォールディングされたタンパク質構造においてのみ利用可能なエピトープに対して生じ、この応答がこれらの実験において失われたことを、示唆する。
【００５１】
以下のタンパク質に対する患者の免疫反応もまた、検出された[参考文献１２参照]：
・スポット１０−タンパク質伸長因子ＥＦ−Ｔｕ（８／１７）
・スポット１９−リボソームタンパク質Ｓ１（５／１７）
・スポット１２−リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（７／１７）。
【００５２】
これら公知のタンパク質に加えて、いくつかの新規な免疫反応性タンパク質が、１１／１７〜１／１７の範囲の頻度で検出された。これらのタンパク質のＭＷおよびｐＩの特徴を、表ＩＩに示す。さらに、少数の場合において、さらなる分析を、データベースの相同性検索で補足した、Ｎ末端アミノ酸配列決定によって実施した。
【００５３】
（スポットの小配列決定）
２Ｄ地図を上記のように調製した。参考文献２０におけるように、１泳動当り１ｍｇの総ＥＢタンパク質から開始し、続いて、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＢｉｏＲａｄ ＰＶＤＦ膜、２０×２０ｃｍ、孔径０．２μｍ）上にブロットした。このブロットを、５０％水性メタノール中にある０．１％（ｗ／ｖ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０を用いて５分間染色し、そして４０％メタノール、１０％酢酸中で脱色した。膜を３７℃で乾燥し、そしてさらなる分析のために−２０℃で保存した。選択したタンパク質スポットを切り出し、そしてフェニルチオヒダントイン−アミノ酸分析機モデル１２０Ａおよびコントロール／Ｄａｔａ Ｍｏｄｕｌｅモデル９００Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）とオンライン接続した、自動Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ｍｏｄ ４７０Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して、エドマン分解によるアミノ酸配列決定に供した。同様のブロットから代表的には３個または４個の等価なスポットを、そのスポット中のタンパク質の推定相対モル量に従って、使用した。
【００５４】
この配列決定の結果を、１６頁の表ＩＩＩに示す。
【００５５】
（配列のコンピューター分析）
Ｎ末端配列のデータを使用して、タンパク質の類似性についてのデータベース検索を、ＮＣＢＩ[ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ]から入手可能なＢＬＡＳＴプログラム[２１]およびＧＣＧソウトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）のプログラム[２２]を使用して、実施した。理論上のｐＩ値およびＭＷ値を、ＥｘＰＡＳｙインターネットサーバー[ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ]から入手可能なｐＩ／ＭＷコンピュータープログラムによって算出した。
【００５６】
これら通常のデータベースに加えて、Ｃｌａｍｙｄｉａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ[ｈｔｔｐ：／／ｃｈｌａｍｙｄｉａ−ｗｗｗ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ：４２３１]により提供される、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ／ＵＷ−３／Ｃｘ株のゲノム配列決定データを検索した。この研究はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ血液型亜型Ｌ２株（リンパ肉芽腫次亜種）（これは、異なる病原性表現型を有する）を使用したが、いくつかのタンパク質配列が、この血液型亜型Ｄ遺伝子に確実に関連し得る。
【００５７】
Ｎ末端のデータを用いたこれらの検索によって、７つの免疫反応性スポットを（上記の７つに加えて）以下の公知の配列に関連付けることが可能になった：
・スポット１５：ペリプラズムペプチダーゼであると推測される（この血液亜型Ｄのゲノムデータベースにおいて、現在はｈｔｒＡと注釈が付いている）。
・スポット１８および４６：外膜タンパク質であると推測される（このゲノムデータベースにおいて、現在はｏｍｐＢと注釈が付いている）。
・スポット２１：そのアミノ酸配列は、以前に記載されたどのタンパク質とも一致しないが、ＥＦ−Ｔｕからの内部配列に対する相同性を示す。このタンパク質は、ＥＦ−Ｔｕの分解産物またはプロセシング産物、あるいはその変異体であり得る。
・スポット２４：ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（ｒｐｏＡ）。
・スポット２５：細菌のロイシンペプチダーゼに対して相同（（このゲノムデータベースにおいて、現在はｐｅｐＡと注釈が付いている）。
・スポット３８：ＧＴＰ結合タンパク質であると推測される（現在は、ｙｃｈＦと注釈が付いている）。
【００５８】
スポット２６、３１および３３のＮ末端配列は、公開された血液型亜型Ｄ配列を含む、データベースのどの配列にも一致しない。
【００５９】
表ＩＶは、いくつかの免疫反応性抗原の同定（いくつかは推定）の要旨を示す。これらは、以前の２Ｄマッピングデータとの比較、または上記で得られたＮ末端配列決定データとの相同性検索のいずれかによって、得られた。
【００６０】
（特に興味深いタンパク質）
これらのイムノブロットから同定された以下のタンパク質が、特に興味深い：
（スポット２４）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩの位置およびそのＮ末端配列に基づいて、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ＲＮＡポリメラーゼ（ｇｉ６２００２９）のα鎖であると考えられる。このＲＮＡＰα鎖は、以前に記載されている[２３]が、クラミジア免疫原としては、未だ報告されていない。４人の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、これが、クラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを示す。Ｃｌａｍｙｄｉａの細胞内に寄生する性質は、この性質が一般的に、抗体媒介性免疫応答を回避し得ることを意味するが、上記で示される抗体の反応性は、その免疫系が、自然感染の間にこれらのタンパク質に遭遇することを示し、そして抗体の形成はまた、例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答を惹起することを補助し得る。
【００６１】
（スポット１８および４６）
スポット１８および４６は、血清型Ｄのゲノム中のｏｍｐＢ遺伝子（推定外膜タンパク質をコードすると注釈される）に相同であるようである。Ｎ末端配列ならびにｐＩ値およびＭＷ値（推定理論値５．０６／３４．５に対して、少なくともスポット１８については、５．０８／３４．０９）は、推定Ｎ末端シグナルペプチドの切断後の、ｏｍｐＢ遺伝子産物の予想特性と一致する。
【００６２】
スポット４６および１８の両方が、クラミジア外膜複合体の精製調製物の２Ｄ電気泳動マップ中に存在することもまた、見出された。これもまた、スポット１８および４６が血清型ＤのｏｍｐＢ遺伝子のホモログを示すという考えを支持する。
【００６３】
このタンパク質が２つの異なる電気泳動種として現れる理由を調べなかったが、この型のスポットのずれは、通常、アミノ酸配列変化および／またはいくつかのアミノ酸残基の真の誘導体化もしくは人為的な誘導体化のいずれかに起因した、アミノ酸組成の変化と関連する。
【００６４】
５名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質が、クラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６５】
（スポット２５）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｐｅｐＡと比較）に基づくと、アミノペプチダーゼであると考えられる。４名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６６】
（スポット３８）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｙｃｈＦと比較）に基づくと、ＧＴＰ結合タンパク質であると考えられる。２名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６７】
（スポット１５）
このスポットは、そのＭＷ／ｐＩ位置およびそのＮ末端配列（両方を、公開された血液型亜型Ｄの配列ｈｔｒＡと比較）に基づくと、ストレス誘導性プロテアーゼであると考えられる。７名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。
【００６８】
（スポット８）
９名の患者が、タンパク質スポット８に対する反応性を示した。このタンパク質スポットを、Ｎ末端配列決定によって特徴づけることができなかった。しかし、このタンパク質スポットは、確かに以下の「配列型（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）２」アミノ酸組成（モル％）を有する：
【００６９】
【数１】
ＣｙｓおよびＴｒｐは、この型の分析では決定されず、そしてＧｌｕ／ＧｌｎとＡｓｐ／Ａｓｎとを区別することができない。
【００７０】
繰り返して試みられたにも拘わらず、Ｎ末端配列を得ることができないことは、そのＮ末端残基が、いくつかの形態の修飾（例えば、リポタンパク質）に起因してブロックされていることを示唆する。修飾は、しばしば、真核生物における膜結合型タンパク質に特徴的であるが、細菌種における外表面タンパク質または分泌型タンパク質に特徴的でもある（例えば、リポタンパク質［２４］マイコプラズマ外膜タンパク質［２５］、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＦＨＡビルレンス因子［２６］など）。
【００７１】
（スポット１２）
このスポットは、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に起因すると考えられる。７名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。このタンパク質は、クラミジアにおいて以前に記載されたが［登録番号Ｐ３８００１］、クラミジア免疫原であると報告されたことは一度もなかった。しかし、Ｂｒｕｃｅｌｌａ感染における免疫原として記載された［２７、２８］。
【００７２】
（スポット１９）
このスポットは、リボソームタンパク質Ｓ１に起因にすると考えられる。５名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。このタンパク質は、クラミジアにおいて以前に記載されたが［登録番号Ｐ３８０１６］、免疫原であると報告されたことは一度もなかった。
【００７３】
（スポット１０）
このスポットは、タンパク質合成伸長因子ＥＦ−Ｔｕに起因すると考えられる。８名の患者が、このタンパク質に対する反応性を示した。このことは、このタンパク質がクラミジア感染の結果としてヒトにおいて免疫原性であることを実証する。クラミジアＥＦ−Ｔｕは、以前に記載されたが［登録番号Ｐ２６６２２］、免疫原であると報告されたことは一度もなかった。
【００７４】
（スポット１０、１２、１５、１９および２４）
慢性感染において、免疫病理反応を誘発し得る保存された微生物抗原に対する、あり得る以前の感作の重要性を仮定すると、これらの新たな免疫反応性抗原のうちのいくつかが、細菌タンパク質の保存されたファミリーに属することは注目すべきである：４つの血清（２３％）がスポット２４（ＲＮＡポリメラーゼのαサブユニット）と反応した；５つ（２９％）がスポット１９（リボソームタンパク質Ｓ１）を認識した；８つ（４７％）がスポット１０（ＥＦ−Ｔｕ）を認識した；７つ（４１％）がスポット１５（ＨｔｒＡ（Ｓ２Ｃペプチダーゼ）ファミリーの推定ストレス誘導性プロテアーゼ）を認識した；そして７つの血清（４１％）がスポット１２（リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２）を認識した。この研究において使用した血清の群において、１２／１７（７６％）がこれらの５つの抗原（ｈｓｐ６０抗原およびｈｓｐ７０抗原を含む）と反応し、そして全ての血清が１と７との間（平均３．７個）のクラミジアタンパク質（他の細菌においてホモログを有する）と反応する抗体を有した。
【００７５】
クラミジア病理における免疫学的感作機構に関する役割を仮定する理論は、ｈｓｐ６０ ＧｒｏＥＬ様抗原に関して記載される［２９］ように、実際には、他のいくつかの共通する細菌抗原（この細菌抗原は、他の細菌感染に置いて免疫原性であり得る）に拡張されるべきである。例えば、タンパク質伸長因子ＥＦ−Ｔｕは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染の急性期の間に免疫原性であり、そしてＬ７／Ｌ１２およびＨｔｒＡストレス誘導性プロテアーゼホモログの両方がＢｒｕｃｅｌｌａ感染において免疫原性である。ＥＦ−Ｔｕの場合において、細菌細胞におけるこのタンパク質の豊富さは、免疫系によるその「注目度（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）」に好都合であり得る。しかし、ＥＦ−Ｔｕが外膜およびペリプラズム細胞画分に関連すると記載され［３０］、そしてより最近では、データにより、ペプチド伸長におけるその機能に加えて、ＥＦ−Ｔｕがタンパク質折り畳みに関与するシャペロン活性およびストレスからの防御もまた有することが示唆される［３１］ことに注意すべきである。Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質に対する応答は特に興味を引く。なぜなら、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ感染において、相同なＬ７／Ｌ１２抗原は、ＤＴＨ細胞媒介応答を誘導する［２７］からである。さらに、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＬ７／Ｌ１２を用いてワクチン接種することは、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓによる感染に対する防御を与えることが示された［３２］。Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染した患者においてかなり頻繁に存在するというこの予測外の知見は、おそらく、クラミジア誘導性疾患においてもまた、この抗原に対してさらなる注意が払われるべきであることを示唆する。
【００７６】
（スポット５、６、７および９）
これらのタンパク質は、利用可能なゲノム配列といまだ全く相関付けられておらず、そして未だ配列決定されてもいないが、試験された血清におけるそれらの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）（＞５０％）を考慮すると、明らかに興味深い。
【００７７】
本発明は、上記で例示としてのみ記載されるにすぎず、そして本発明の範囲および趣旨内にとどまりつつ、改変が行われ得ることは理解される。
【００７８】
（表Ｉ）患者血清の要旨
第１欄における文字は、表ＩＩに示される文字と対応する。第２欄におけるコードは、起源血清コレクションをいう。それぞれの患者に関する病理学は、子宮頚管炎（下部生殖器感染）、ＰＩＤまたは不妊（感染の次の）として広範に示される。全ての血清を、精製Ｌ２基本小体を用いるＭＩＦアッセイによって特徴付けた。表中に示されるＭＩＦ力価は、最大で２倍希釈であり、これは、陽性シグナルを示した。「最適希釈」は、弱いスポットでのシグナルの喪失なしに最低限のバックグラウンドを与えることが見出された希釈である。
【００７９】
【表１】
（表ＩＩ）タンパク質スポットとの患者の反応性
【００８０】
【表２】
（表ＩＩＩ）タンパク質のＮ末端配列
【００８１】
【表３】
（表ＩＶ）抗原の同定
「ＣＴ−Ｄ遺伝子」は、参考文献２から命名される遺伝子をいい、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ中のホモログタンパク質をコードするような遺伝子の名称を与える。最後の欄における理論的なｐＩ／ＭＷ値を、実験値と比較して、ＣＴ−Ｄ遺伝子配列から計算した。
【００８２】
【表４】
（参考文献）（本明細書中にその全体を援用されるものの内容）
【００８３】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【公開番号】特開２０１０−２２０６２２（Ｐ２０１０−２２０６２２Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１３６０６（Ｐ２０１０−１１３６０６）
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【分割の表示】特願２０００−５８９５６３（Ｐ２０００−５８９５６３）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．１７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【分割の表示】特願２０００−５８９５６３（Ｐ２０００−５８９５６３）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．１７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
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