Ｄ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法
本発明は、開始生物に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物、及び前記微生物の使用下でのＤ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開始生物に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物、及び前記微生物の使用下でのＤ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
多種の天然アミノ酸が今日ではエナンチオマー純粋な形で、遺伝子的に最適化された細菌を用いた発酵により製造される（de Graaf AA, Eggeling L, Sahm H. 2001. Metabolic engineering for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum. Adv Biochem Eng Biotechnol 73:9-29; Sahm H, Eggeling L, Eikmanns B, Kramer R. 1996. Construction of L-lysine-, L-threonine-, and L-isoleucine-overproducing strains of Corynebacterium glutamicum. Ann N Y Acad Sci 782:25-39）。
【０００３】
もっともこの方法により、全てのタンパク質性アミノ酸が製造されるわけではなく、また非常に少ない非天然アミノ酸及びＤ−アミノ酸のみが製造される。エナンチオマー純粋なアミノ酸（このアミノ酸のうちいくらかが一年につき数トンの規模において使用される）の化学的合成は非常に高価であるので、酵素による方法の系列が開発された。この方法は、アシラーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ、ヒタンドイナーゼ、アミノ酸オキシダーゼ及びプロテアーゼの助けによる動力学的なラセミ体分割から、リアーゼ、アミノトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼを用いたエナンチオ選択的な合成にまで達する（Schmid A. et al. (2002) "The use of enzymes in the chemical industry in Europe" Curr Opin Biotechnol 13(4):359-66）。
【０００４】
エナンチオ選択的な合成の他に、ダイナミックに動力学的なラセミ体分割は、このラセミ体分割の際この不所望のエナンチオマーはｉｎ ｓｉｔｕでラセミ化されるが、特に有効である。ダイナミックに動力学的なラセミ体分割の際のように、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はＬ−アミノ酸オキシダーゼと、この生じたイミノ酸の再度のアミノ酸への非選択的な化学的還元との組み合わせによっても、原則的に１００％の収率が達成されてよい。しかしながらこの還元剤、例えばＮａＢＨ4は、少なくとも２５当量の過剰量で使用されることが望ましく、これはこの変形を非常に高価にする（Enright et al., "Stereoinversion of beta- and gamma- substituted alpha -amino acids using a chemo-enzymatic oxidation-reduction procedure", Chemical Communications (2003), (20), 2636-2637）。
【０００５】
アミノ酸デヒドロゲナーゼによるα−ケト酸のアミン化は一般的に公知である。無論このエダクトは、例えば相応するラセミ体のアミノ酸よりも数倍高価である。
【０００６】
アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼとのカップリングにより、この相応するケト酸をしかしながら、ｉｎ ｓｉｔｕでアミノ酸から産生してよい。この両方の酵素が、反対のエナンチオ選択性を有する場合には、Ｄ−アミノ酸は完全にＬ−アミノ酸に、又はＬ−アミノ酸は完全にＤ−アミノ酸に変換されてよい。ラセミ体から出発する場合には、これらからエナンチオマー純粋な化合物が製造されてよい。
【０００７】
補基質ＮＡＤＨはこの際、酵素を用いて再生されることが望ましく、というのは前記補基質は化学量論量で用いるにはあまりに高価であるからである。特に適しているのは、このための酵素、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル性）であり、前記酵素は、これらの基質から二酸化炭素を放出し、従ってこの反応を不可逆にする。（Hanson, R. L. et al. "Enzymatic synthesis of L-6-hydroxynorleucine", Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(10), 2247-2252及びNakajima, N. et al., "Enzymatic conversion of racemic methionine to the L-enantiomer", Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1990), (13), 947-8）。
【０００８】
【表１】
【０００９】
迅速かつ完全な変換のために、無細胞系においてはしかしながら、付加的にカタラーゼが添加されていることが望ましく、というのは前記アミノ酸オキシダーゼにより触媒される酸化的な一部工程では、過酸化水素が生じ、これはケト酸の脱カルボキシル及び前記酵素の不活化を生じるからである（Trost, E.-M.; Fischer, L., Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalyzed racemate resolution of D/L-amino acids, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2002), 19-20 189-195）。ラセミ体のアミノ酸のエナンチオマー純粋なアミノ酸への変換は、この系により＞９９％ｅｅ及び＞９５％の収率が可能である。
【００１０】
この方法はしかしながら高価であり、というのは四つの異なる酵素が別々に製造されかつ単離されなくてはならないからである。
【００１１】
本発明の課題は、Ｄ−アミノ酸のＬ−アミノ酸への変換に必要な酵素の高価な単離及び調整を回避する方法の提供である。
【００１２】
本発明の主題は有利には、開始生物、例えば野生型に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物の静止細胞である。オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼはこの際、上述の酵素の変換すべき基質及び基質スペクトルを考慮して組み合わせられる。この際前記開始生物は、この上述の酵素を天然には含有するものではない。
【００１３】
補基質ＮＡＤＨのための再生酵素として、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＥ１０２４０６０３）又はアルコールデヒドロゲナーゼを使用してよい。
【００１４】
これらの酵素をコードするポリヌクレオチドの由来は一般的に、前記の組み換え微生物の属又は種に制限されない。
【００１５】
宿主生物の形質転換のためのこの遺伝子は、この由来を考慮することなしに選択されてよい。
【００１６】
前記遺伝子の由来は、微生物、真菌又は酵母、特に微生物、特にＤ−ＡＡＯのためのアルスロバクター・プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）又はトリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variablilis）、ＬｅｕＤＨのためのバシラス・セレウスであってよい。
【００１７】
宿主生物として、有利には、安定な発現系が存在する微生物、例えばバシラス、様々な酵母、スタフィロコッカス又はストレプトマイセス、特に大腸菌が用いられる。
【００１８】
アミノ酸デヒドロゲナーゼとして、特に適するのは、バシラス種からのＬ−ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＰ０７９２９３３）、ロドコッカス種からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、サーモアクチノマイセス・インテルメジウス（Thermoactinomyces intermedius）又はバシラス株からのＬ−アラニンデヒドロゲナーゼである。
【００１９】
これらは、還元によりアミン化するケト酸に依存して選択される。
【００２０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明により特に、酵母、ロトトルラ・グラシリス（Rhototorula gracilis）（ＵＳ６，１８７，５７４）から、トリゴノプシス・バリアビリス（Long-Liu Lin et al., Enzyme and Microbial Technol. 27 (2000), 482-491）、カンジダ種、真菌、ニューロスポラ・クラッサ、ベルリカリウム・ルテオラルボ（Verlicullium luteoralbo）及び様々なフザリウム種に、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼはアルスロバクター・プロトホルミエ（ＥＰ１３７５６４９）に由来する。
【００２１】
様々なＤ−ＡＡＯｓの基質に関する概要は、Ｇａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．(Enzyme Microbiol. Technol. 27(8): 605-611 (2000))に見出される。ＥＰ０８９７００６Ａ１では、属する遺伝子を有するロドスポリジウム（Rhodosporidium）からのＤ−ＡＡＯが記載されている。変換すべき基質に依存して、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が選択され、そして前述の宿主株は前記遺伝子により形質転換される。
【００２２】
従って、例えばＤＬ−メチオニン又はＤＬ−ロイシンの脱ラセミ化（Ｅｎｔｒａｃｅｍｉｓｉｅｒｕｎｇ）のためには、有利にはアルスロバクター・プロトホルミエ（ＥＰ１３７５６４９Ａ）からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びバシラス・セレウスからのロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が大腸菌に過剰発現される。
【００２３】
以下の表は、本発明により使用してよい例示的な遺伝子及びこれに属する酵素を有する：
表１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
受託番号
gi32140775 アルスロバクター・プロトホルミエ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
gi1616634 トリゴノプシス・バリアビリス Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
gi27806895 ウシ Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ
ＥＰ０８９７００６ ロドスポリジウム Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
ＵＳ６，１８７，５７４ ロトトルラ・グラシリス Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
表２:Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ
受託番号
gi6741938 バシラス・セレウス Ｌ−ロイシンデヒドロゲナーゼ
gi625925 ロドコッカス種 Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
−−−−ホモ・サピエンス Ｌ−リシンデヒドロゲナーゼ
gi16080244 バシラス・ズブチリス Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ
gi118533 ウシ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ。
【００２４】
この含有されるＤＮＡ配列は、次いで公知のアルゴリズム又は配列分析プログラムを用いて、例えばＳｔａｄｅｎ(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986))、Ｍａｒｃｋ(Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988))によるプログラム、又はＢｕｔｌｅｒ(Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))によるＧＣＧ−プログラムにより調査されてよい。
【００２５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡ配列の増幅のための指示を、当業者は特に、Ｇａｉｔによるマニュアル:Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍによる:PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)に見出す。
【００２６】
本発明のその他の対象は、前記の選択した宿主株において一般的に自発的に複製可能なベクターであって、相互に和合性でありかつ、本発明により必要とされる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を有するベクターの調整である。
【００２７】
ベクターＤＮＡは、真核細胞又は原核細胞中に、公知の形質転換技術により導入されてよい。
【００２８】
二つの酵素、特に、例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含有するベクターが有利である。
【００２９】
有利には、ベクター上でアミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列の組み合わせでもある。
【００３０】
系中でなお欠けている酵素に対するヌクレオチド配列を、次いで更なるベクターに見出す。
【００３１】
一般的に、良好に発現可能である遺伝子を低コピー数を有するベクター中に、より弱い発現能力を有する遺伝子をより高いコピー数及び／又は強力なプロモーターを有するベクター上でクローニングするように行われる。この宿主細胞は、前記ベクターにより、前記宿主細胞が開始生物と比較して、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸への変換のために必要な３つ又は場合により４つの酵素をコードするヌクレオチド配列のそれぞれ少なくとも１つの付加的なコピーを含有するように形質転換される。
【００３２】
この処置により、上述のヌクレオチド配列を過剰発現することが成功する。
【００３３】
過剰発現の達成のために、前記の相応する遺伝子のコピー数を増加させるか、又は前記遺伝子は、この構造遺伝子の上流に存在するこのプロモーター領域又は調節領域又はこのリボソーム結合部位で変異されてよい。同様に、前記構造遺伝子の上流に構成される発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより、この発現を、発酵によるアミノ酸産生の過程において上昇させることが付加的に可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための処置により、同様に前記発現が改善される。更に、この酵素タンパク質の崩壊の防止により、同様に前記酵素活性は増強される。前記遺伝子又は遺伝子構築物は、様々なコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体に組み込まれそして増幅されてよい。又は、更に、この遺伝子の過剰発現は、この培地組成及び培養操作の変更により達成されてよい。
【００３４】
このための指示を、当業者は特に、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．(Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．(Gene 138, 35-41 (1994))、Ｔｓｕｃｈｉｙａ及びＭｏｒｉｎａｇａ(Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．(Gene 102, 93-98 (1991))で、ヨーロッパ特許公報０４７２８６９で、ＵＳ特許４，６０１，８９３で、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰｕｅｈｌｅｒ(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)で、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))で、ＬａＢａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、特許出願ＷＯ９６／１５２４６で、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．(Gene 134, 15 - 24 (1993))で、日本国公開公報ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１で、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))で、Ｍａｋｒｉｄｅｓ(Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))で、及び遺伝子学及び分子生物学の公知の教本で見出す。
【００３５】
前記過剰発現は、この相応する酵素の、細胞内活性又は濃度の上昇を生じる。
【００３６】
この上昇は、この形質転換体に基づく生物（開始生物）中の酵素の濃度又は活性と比較して、一般的に少なくとも１０〜５００％、特に５０〜５００％、又は１００〜５００％、最高で１０００〜２０００％までにある。
【００３７】
本発明の対象は、エナンチオ選択的な酵素による合成経路の使用下でのＤ−アミノ酸からＬ−アミノ酸の製造において、形質転換すべき開始生物に比較して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物を、Ｄ−アミノ酸を有する溶液と反応させ、この生じるＬ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法でもある。
【００３８】
有利には、補基質を再生する酵素としてのリンゴ酸酵素の過剰発現であり、この際、この変換すべきＤ−アミノ酸を含有する、ホールセル触媒（Ｇａｎｚｚｅｌｌｋａｔａｌｙｓａｔｏｒ）を含有する緩衝水溶液中に、同時にＬ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を、このＤ−アミノ酸の変換すべき量において、少なくとも等モル量、有利には１．５〜６倍モルにおいて見出す。
【００３９】
場合により、カタラーゼも過酸化物分解酵素として過剰発現させる。適しているのは、様々な生物からのカタラーゼ、例えば大腸菌（カタラーゼ ＨＰＩＩ（ヒドロキシペルオキシダーゼＩＩ）受託番号：gi115722）からの酵素である。
【００４０】
前記Ｄ−アミノ酸の変換は有利には、静止細胞を用いて行われる。静止細胞とは、生存可能であるが、所定の条件下では増加しない細胞が理解される。
【００４１】
アミノ酸とは、この関連において、天然及び非天然に存在するα−アミノ酸が理解され、これは例えば、Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart,第22版,1991, p.822参照、に記載されている。
【００４２】
有利には、以下のグループから選択されたＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の混合物、これらのラセミ体、又はこの純粋なＤ−エナンチオマーが使用される：リシン、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、オルニチン、ロイシン、ヒスチジン、ノルロイシン、チロシン、アラニン、グルタミン酸、及びセファロスポリン、特にメチオニン。
【００４３】
特定の酵素が、この様々なＤ−アミノ酸の変換のために特に適していることが示される（参照、Gabler et al., 2000）。従って、アルスロバクター・プロトホルミエからのＤ−ＡＡＯは、特に塩基性及び疎水性のアミノ酸の変換に適する。
【００４４】
前記の適した酵素及びヌクレオチド配列は、一般的には公知技術から公知である。
【００４５】
本発明による方法では、単独の酵素の単離が回避される。更なる利点は、本発明により使用された細胞（ホールセル触媒）は、この反応後容易に分離されてよいことから生じる。
【００４６】
単離された酵素を用いた、Ｄ−メチオニンからＬ−メチオニンへの変換の際には、公知技術によれば、これに対してカタラーゼを添加しなくてはならない（Nakajima et al., 1990）。
【００４７】
本発明により使用される微生物は同様に、本発明の対象であり、かつ連続的に又は非連続的に回分法（バッチ培養）又は流加回分法（流加法）又は反復した流加回分法（反復流加法）において培養されてよい。公知の培養方法に関する概要は、Ｃｈｍｉｅｌ(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教本又はＳｔｏｒｈａｓによる教本(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００４８】
使用すべき培地は適したように、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な微生物の培地の記載は、American Society for Bacteriologyの教本「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C., USA, 1981)に含まれている。
【００４９】
炭素供給源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール、及び有機酸、例えば酢酸が使用されてよい。これらの物質は単独で又は混合物として使用されてよい。
【００５０】
窒素供給源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムが使用されてよい。前記窒素供給源は、単独で又は混合物として使用されてよい。
【００５１】
リン供給源として、リン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用されてよい。前記培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有することが必要であり、これらは成長に必要である。最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に加えて使用してよい。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給されてよい。
【００５２】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸を適した方法で使用する。泡の発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用されてよい。プラスミドの安定性の維持のために前記溶媒に、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を前記培養物に導入する。前記培養物の温度は通常は、２０〜４５℃、有利には２５〜４０℃である。この培養は、対数増殖期を経過している限りは継続される。この目標は通常は、１０〜２０時間の間に達成される。これに引き続き、この細胞を有利には、回収し、洗浄し、緩衝液中に懸濁液としてｐＨ値６〜９、特に６．８〜７．９で取り込む。この細胞濃度は、１〜６％、特に１．５〜４％（湿分質量／ｖ）に達する。前記細胞は一般的に、物理的又は化学的方法により、例えばトルエンで、例えばWilms et al., J. Biotechnol., 86巻 (2001), 19-30が記載しているように、この変換すべきＤ−アミノ酸がこの細胞壁を透過し、かつＬ−アミノ酸が流出するように透過処理されている。
【００５３】
この懸濁液は次いで、Ｄ−アミノ酸及びＬ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を含有する溶液と混合される。この変換は、１０〜４０℃、特に２５〜３６℃で、ｐＨ値６．８〜８．９、有利には７．５〜８．５で行われる。前記変換は７０〜１００℃への加熱により停止された。
【００５４】
実施例１
プラスミドの構築
前記の反応原理を確認するために、プラスミドの系列を構築し、この系列は以下の酵素の遺伝子を様々な組み合わせで有する：リンゴ酸酵素（ＭＡＥ）、ロイシン−デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）、アロスロバクター・プロトホルミエからのＤ−ＡＡＯ（ＡｐＤ−ＡＡＯ）及びトリゴノプシス・バリアビリスからのＤ−ＡＡＯ（ＴｖＤ−ＡＡＯ）。このために、表３に表示したプライマー及びプラスミドを使用した。
【００５５】
ＡｐＤ−ＡＡＯ（Apdao; gi:32140775）、ＴｖＤ−ＡＡＯ（Tvdao; gi:1616634）及びリンゴ酸酵素（mae; gi:1787752）の遺伝子の増幅のために、アルスロバクター・プロトホルミエ、トリゴノプシス・バリアビリス及び大腸菌Ｋ１２からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。ロイシンデヒドロゲナーゼ（leudh; gi:6741938）の遺伝子を、プラスミドｐＴ１Ｌ（＝ｐＬｅｕＢ，(Ansorge MB, Kula MR. (2000), Investigating expression systems for the stable large-scale production of recombinant L-leucine-dehydrogenase from Bacillus cereus in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 53:668-73)）と共に、テンプレートとして増幅した。
【００５６】
適したプライマー（表３に表示したプライマー）により、ＰＣＲを用いて、クローニングのための制限酵素切断部位を導入した。フォワードプライマーＤＡＡＯＴｖｆｏｒＮｄｅＩを用いて、Ｔｖｄａｏ−遺伝子中のイントロンを除去した。
【００５７】
ｐＨ１Ｍ中のＡｐｄａｏ−遺伝子のクローニングの際に、シャイン−ダルガルノ配列及び付加的な制限酵素切断部位（ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩのため）を、ＰＣＲを用いて、リバースプライマーＡｐＮｄｅＩｒｅｖ（表１）を使用することにより導入した。
【００５８】
表３
プラスミド及びプライマー
【表２】
【００５９】
実施例２
発現株の構築
プラスミドの適した組み合わせにより、表４に表示した組み換え大腸菌株を構築し、前記株はアミノ酸オキシダーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素のためのそれぞれの遺伝子を含有する。
出発株として使用：
ＮｏｖａｇｅｎのＢＬ２１（ＤＥ３）
及びＳｔｒａｔｇｅｎｅのＪＭ１０９。
【００６０】
表４
大腸菌株
【表３】
【００６１】
この株の名称（１〜８）は、以下の実施例においてこの表に相応して維持する。
【００６２】
実施例３
細胞内酵素活性の検証
表４に相応する株を、標準的な条件下で、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地中でｐＨ７．５で培養した。形質転換したプラスミドに依存して、前記培地に１００μｇ ｍｌ-1のアンピシリン及び／又は３４μｇ ｍｌ-1のクロラムフェニコールを添加した。この酵素発現のために、前記の組み換え大腸菌株を、好気性条件下で２０ｍｌの培地を有する１００ｍｌの振盪フラスコ中で培養させた。この細胞を３７℃で、ロータリー振盪機で、２００ｒｐｍでインキュベーションし、かつ約０．５のＯＤ５５０で、１００μＭのＩＰＴＧ及び／又は０．２％のラムノースにより誘導した。このインキュベーション後、前記株を次いで３０℃で更にインキュベーションした。
【００６３】
図２には、測定した酵素活性を提示した。
【００６４】
白：Ｄ−ＡＡＯ；灰色：ＭＡＥ；黒：ＬｅｕＤＨ。
【００６５】
株６は、ラムノースプロモーターの作用を示した。
【００６６】
実施例４
全組み換え株による生体内変換反応
Ａ）Ｄ，Ｌ−メチオニン
脱ラセミ化のための例として、メチオニンのラセミ体を基質として使用し、プラスミドｐＡＤ３ＬＭ（ロイシンデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素のための遺伝子を有する）及びｐＥ１Ｄ(アルスロバクター・プロトホルミエ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのための遺伝子を有する)の両方を含有する全組み換え大腸菌細胞株１（表２に相応）により変換した。ＨＰＬＣを用いて、このオキシダーゼにより触媒したＤ−Ｍｅｔの分解及びこの還元によるアミン化により触媒したＬ−Ｍｅｔの合成を追跡した。詳しくは、以下を使用した：
２５ｍＭのＤ、Ｌ−Ｍｅｔ、１００ｍＭのＬ−リンゴ酸塩、０．７ＭのＮＨ4Ｃｌ、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、終ｐＨ８．０。前記細胞を、５０ｍＭのＴＥＡ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に懸濁し、１０μｌ／ｍｌのトルエンと混合し、この懸濁液を３０分間３０℃で撹拌し、次いで変換のために使用した。この変換における細胞濃度は、１ｍｌの終容量中で３．３％（湿分質量／ｖ）を有した。前記変換は３０℃で、１０００ｒｐｍでの振盪下で、サーモミキサー５４３６（Eppendorf社）中で行われた。試料を、５分間の９５℃での加熱により停止させ、この透明な上清をＨＰＬＣを用いて分析した。
【００６７】
Ｄ−Ｍｅｔ及びＬ−Ｍｅｔの濃度決定のために、前記試料を希釈後誘導体化した。ここに、ｐＨ１０．４の１００ｍＭのナトリウム−ホウ酸緩衝液中の２６０ｍＭのイソブチリル−Ｌ−システイン及び１７０ｍＭのｏ−フタルジアルデヒドの溶液２０μｌを添加した。ＨＰＬＣ分離条件は、刊行されたように励行した（Krieg L, et al. (2002) Screening for amidases: isolation and characterization of a novel D-amidase from Variovorax paradoxus. Adv Synth Catal 344(9):965-73）。
【００６８】
Ｄ−Ｍｅｔの分解及びＬ−Ｍｅｔの形成を、図３に概要して示した。Ｌ−Ｍｅｔのエナンチオマー純粋な生成物を、終濃度２５ｍＭで得た。
【００６９】
Ｂ）Ｄ，Ｌ−ロイシン
Ａ部で記載したのと同様にして、２５ｍＭのＤ，Ｌ−ロイシンの溶液を、前記したのと同一の微生物で変換させた。この変換自体及びこのＨＰＬＣ−分析の詳細は、前述した実施例に相応する。
【００７０】
Ｄ−Ｌｅｕの分解及びＬ−Ｌｅｕの形成を、図４に概要して示した。Ｌ−Ｌｅｕのエナンチオマー純粋な生成物を、終濃度２５ｍＭで得た。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、使用したプラスミドを示す図である。
【図２】図２は、測定した酵素活性を示す図である。
【図３】図３は、Ｄ−Ｍｅｔの分解及びＬ−Ｍｅｔの形成を示す図である。
【図４】図４は、Ｄ−Ｌｅｕの分解及びＬ−Ｌｅｕの形成を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開始生物に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物、及び前記微生物の使用下でのＤ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
多種の天然アミノ酸が今日ではエナンチオマー純粋な形で、遺伝子的に最適化された細菌を用いた発酵により製造される（de Graaf AA, Eggeling L, Sahm H. 2001. Metabolic engineering for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum. Adv Biochem Eng Biotechnol 73:9-29; Sahm H, Eggeling L, Eikmanns B, Kramer R. 1996. Construction of L-lysine-, L-threonine-, and L-isoleucine-overproducing strains of Corynebacterium glutamicum. Ann N Y Acad Sci 782:25-39）。
【０００３】
もっともこの方法により、全てのタンパク質性アミノ酸が製造されるわけではなく、また非常に少ない非天然アミノ酸及びＤ−アミノ酸のみが製造される。エナンチオマー純粋なアミノ酸（このアミノ酸のうちいくらかが一年につき数トンの規模において使用される）の化学的合成は非常に高価であるので、酵素による方法の系列が開発された。この方法は、アシラーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ、ヒタンドイナーゼ、アミノ酸オキシダーゼ及びプロテアーゼの助けによる動力学的なラセミ体分割から、リアーゼ、アミノトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼを用いたエナンチオ選択的な合成にまで達する（Schmid A. et al. (2002) "The use of enzymes in the chemical industry in Europe" Curr Opin Biotechnol 13(4):359-66）。
【０００４】
エナンチオ選択的な合成の他に、ダイナミックに動力学的なラセミ体分割は、このラセミ体分割の際この不所望のエナンチオマーはｉｎ ｓｉｔｕでラセミ化されるが、特に有効である。ダイナミックに動力学的なラセミ体分割の際のように、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はＬ−アミノ酸オキシダーゼと、この生じたイミノ酸の再度のアミノ酸への非選択的な化学的還元との組み合わせによっても、原則的に１００％の収率が達成されてよい。しかしながらこの還元剤、例えばＮａＢＨ4は、少なくとも２５当量の過剰量で使用されることが望ましく、これはこの変形を非常に高価にする（Enright et al., "Stereoinversion of beta- and gamma- substituted alpha -amino acids using a chemo-enzymatic oxidation-reduction procedure", Chemical Communications (2003), (20), 2636-2637）。
【０００５】
アミノ酸デヒドロゲナーゼによるα−ケト酸のアミン化は一般的に公知である。無論このエダクトは、例えば相応するラセミ体のアミノ酸よりも数倍高価である。
【０００６】
アミノ酸オキシダーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼとのカップリングにより、この相応するケト酸をしかしながら、ｉｎ ｓｉｔｕでアミノ酸から産生してよい。この両方の酵素が、反対のエナンチオ選択性を有する場合には、Ｄ−アミノ酸は完全にＬ−アミノ酸に、又はＬ−アミノ酸は完全にＤ−アミノ酸に変換されてよい。ラセミ体から出発する場合には、これらからエナンチオマー純粋な化合物が製造されてよい。
【０００７】
補基質ＮＡＤＨはこの際、酵素を用いて再生されることが望ましく、というのは前記補基質は化学量論量で用いるにはあまりに高価であるからである。特に適しているのは、このための酵素、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル性）であり、前記酵素は、これらの基質から二酸化炭素を放出し、従ってこの反応を不可逆にする。（Hanson, R. L. et al. "Enzymatic synthesis of L-6-hydroxynorleucine", Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(10), 2247-2252及びNakajima, N. et al., "Enzymatic conversion of racemic methionine to the L-enantiomer", Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1990), (13), 947-8）。
【０００８】
【表１】
【０００９】
迅速かつ完全な変換のために、無細胞系においてはしかしながら、付加的にカタラーゼが添加されていることが望ましく、というのは前記アミノ酸オキシダーゼにより触媒される酸化的な一部工程では、過酸化水素が生じ、これはケト酸の脱カルボキシル及び前記酵素の不活化を生じるからである（Trost, E.-M.; Fischer, L., Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalyzed racemate resolution of D/L-amino acids, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2002), 19-20 189-195）。ラセミ体のアミノ酸のエナンチオマー純粋なアミノ酸への変換は、この系により＞９９％ｅｅ及び＞９５％の収率が可能である。
【００１０】
この方法はしかしながら高価であり、というのは四つの異なる酵素が別々に製造されかつ単離されなくてはならないからである。
【００１１】
本発明の課題は、Ｄ−アミノ酸のＬ−アミノ酸への変換に必要な酵素の高価な単離及び調整を回避する方法の提供である。
【００１２】
本発明の主題は有利には、開始生物、例えば野生型に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物の静止細胞である。オキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼはこの際、上述の酵素の変換すべき基質及び基質スペクトルを考慮して組み合わせられる。この際前記開始生物は、この上述の酵素を天然には含有するものではない。
【００１３】
補基質ＮＡＤＨのための再生酵素として、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＥ１０２４０６０３）又はアルコールデヒドロゲナーゼを使用してよい。
【００１４】
これらの酵素をコードするポリヌクレオチドの由来は一般的に、前記の組み換え微生物の属又は種に制限されない。
【００１５】
宿主生物の形質転換のためのこの遺伝子は、この由来を考慮することなしに選択されてよい。
【００１６】
前記遺伝子の由来は、微生物、真菌又は酵母、特に微生物、特にＤ−ＡＡＯのためのアルスロバクター・プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）又はトリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variablilis）、ＬｅｕＤＨのためのバシラス・セレウスであってよい。
【００１７】
宿主生物として、有利には、安定な発現系が存在する微生物、例えばバシラス、様々な酵母、スタフィロコッカス又はストレプトマイセス、特に大腸菌が用いられる。
【００１８】
アミノ酸デヒドロゲナーゼとして、特に適するのは、バシラス種からのＬ−ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＰ０７９２９３３）、ロドコッカス種からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、サーモアクチノマイセス・インテルメジウス（Thermoactinomyces intermedius）又はバシラス株からのＬ−アラニンデヒドロゲナーゼである。
【００１９】
これらは、還元によりアミン化するケト酸に依存して選択される。
【００２０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明により特に、酵母、ロトトルラ・グラシリス（Rhototorula gracilis）（ＵＳ６，１８７，５７４）から、トリゴノプシス・バリアビリス（Long-Liu Lin et al., Enzyme and Microbial Technol. 27 (2000), 482-491）、カンジダ種、真菌、ニューロスポラ・クラッサ、ベルリカリウム・ルテオラルボ（Verlicullium luteoralbo）及び様々なフザリウム種に、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼはアルスロバクター・プロトホルミエ（ＥＰ１３７５６４９）に由来する。
【００２１】
様々なＤ−ＡＡＯｓの基質に関する概要は、Ｇａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．(Enzyme Microbiol. Technol. 27(8): 605-611 (2000))に見出される。ＥＰ０８９７００６Ａ１では、属する遺伝子を有するロドスポリジウム（Rhodosporidium）からのＤ−ＡＡＯが記載されている。変換すべき基質に依存して、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が選択され、そして前述の宿主株は前記遺伝子により形質転換される。
【００２２】
従って、例えばＤＬ−メチオニン又はＤＬ−ロイシンの脱ラセミ化（Ｅｎｔｒａｃｅｍｉｓｉｅｒｕｎｇ）のためには、有利にはアルスロバクター・プロトホルミエ（ＥＰ１３７５６４９Ａ）からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びバシラス・セレウスからのロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が大腸菌に過剰発現される。
【００２３】
以下の表は、本発明により使用してよい例示的な遺伝子及びこれに属する酵素を有する：
表１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
受託番号
gi32140775 アルスロバクター・プロトホルミエ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
gi1616634 トリゴノプシス・バリアビリス Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
gi27806895 ウシ Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ
ＥＰ０８９７００６ ロドスポリジウム Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
ＵＳ６，１８７，５７４ ロトトルラ・グラシリス Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
表２:Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ
受託番号
gi6741938 バシラス・セレウス Ｌ−ロイシンデヒドロゲナーゼ
gi625925 ロドコッカス種 Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
−−−−ホモ・サピエンス Ｌ−リシンデヒドロゲナーゼ
gi16080244 バシラス・ズブチリス Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ
gi118533 ウシ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ。
【００２４】
この含有されるＤＮＡ配列は、次いで公知のアルゴリズム又は配列分析プログラムを用いて、例えばＳｔａｄｅｎ(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986))、Ｍａｒｃｋ(Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988))によるプログラム、又はＢｕｔｌｅｒ(Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))によるＧＣＧ−プログラムにより調査されてよい。
【００２５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡ配列の増幅のための指示を、当業者は特に、Ｇａｉｔによるマニュアル:Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍによる:PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)に見出す。
【００２６】
本発明のその他の対象は、前記の選択した宿主株において一般的に自発的に複製可能なベクターであって、相互に和合性でありかつ、本発明により必要とされる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を有するベクターの調整である。
【００２７】
ベクターＤＮＡは、真核細胞又は原核細胞中に、公知の形質転換技術により導入されてよい。
【００２８】
二つの酵素、特に、例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含有するベクターが有利である。
【００２９】
有利には、ベクター上でアミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列の組み合わせでもある。
【００３０】
系中でなお欠けている酵素に対するヌクレオチド配列を、次いで更なるベクターに見出す。
【００３１】
一般的に、良好に発現可能である遺伝子を低コピー数を有するベクター中に、より弱い発現能力を有する遺伝子をより高いコピー数及び／又は強力なプロモーターを有するベクター上でクローニングするように行われる。この宿主細胞は、前記ベクターにより、前記宿主細胞が開始生物と比較して、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸への変換のために必要な３つ又は場合により４つの酵素をコードするヌクレオチド配列のそれぞれ少なくとも１つの付加的なコピーを含有するように形質転換される。
【００３２】
この処置により、上述のヌクレオチド配列を過剰発現することが成功する。
【００３３】
過剰発現の達成のために、前記の相応する遺伝子のコピー数を増加させるか、又は前記遺伝子は、この構造遺伝子の上流に存在するこのプロモーター領域又は調節領域又はこのリボソーム結合部位で変異されてよい。同様に、前記構造遺伝子の上流に構成される発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより、この発現を、発酵によるアミノ酸産生の過程において上昇させることが付加的に可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための処置により、同様に前記発現が改善される。更に、この酵素タンパク質の崩壊の防止により、同様に前記酵素活性は増強される。前記遺伝子又は遺伝子構築物は、様々なコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体に組み込まれそして増幅されてよい。又は、更に、この遺伝子の過剰発現は、この培地組成及び培養操作の変更により達成されてよい。
【００３４】
このための指示を、当業者は特に、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．(Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．(Gene 138, 35-41 (1994))、Ｔｓｕｃｈｉｙａ及びＭｏｒｉｎａｇａ(Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．(Gene 102, 93-98 (1991))で、ヨーロッパ特許公報０４７２８６９で、ＵＳ特許４，６０１，８９３で、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰｕｅｈｌｅｒ(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)で、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))で、ＬａＢａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、特許出願ＷＯ９６／１５２４６で、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．(Gene 134, 15 - 24 (1993))で、日本国公開公報ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１で、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))で、Ｍａｋｒｉｄｅｓ(Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))で、及び遺伝子学及び分子生物学の公知の教本で見出す。
【００３５】
前記過剰発現は、この相応する酵素の、細胞内活性又は濃度の上昇を生じる。
【００３６】
この上昇は、この形質転換体に基づく生物（開始生物）中の酵素の濃度又は活性と比較して、一般的に少なくとも１０〜５００％、特に５０〜５００％、又は１００〜５００％、最高で１０００〜２０００％までにある。
【００３７】
本発明の対象は、エナンチオ選択的な酵素による合成経路の使用下でのＤ−アミノ酸からＬ−アミノ酸の製造において、形質転換すべき開始生物に比較して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物を、Ｄ−アミノ酸を有する溶液と反応させ、この生じるＬ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法でもある。
【００３８】
有利には、補基質を再生する酵素としてのリンゴ酸酵素の過剰発現であり、この際、この変換すべきＤ−アミノ酸を含有する、ホールセル触媒（Ｇａｎｚｚｅｌｌｋａｔａｌｙｓａｔｏｒ）を含有する緩衝水溶液中に、同時にＬ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を、このＤ−アミノ酸の変換すべき量において、少なくとも等モル量、有利には１．５〜６倍モルにおいて見出す。
【００３９】
場合により、カタラーゼも過酸化物分解酵素として過剰発現させる。適しているのは、様々な生物からのカタラーゼ、例えば大腸菌（カタラーゼ ＨＰＩＩ（ヒドロキシペルオキシダーゼＩＩ）受託番号：gi115722）からの酵素である。
【００４０】
前記Ｄ−アミノ酸の変換は有利には、静止細胞を用いて行われる。静止細胞とは、生存可能であるが、所定の条件下では増加しない細胞が理解される。
【００４１】
アミノ酸とは、この関連において、天然及び非天然に存在するα−アミノ酸が理解され、これは例えば、Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart,第22版,1991, p.822参照、に記載されている。
【００４２】
有利には、以下のグループから選択されたＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の混合物、これらのラセミ体、又はこの純粋なＤ−エナンチオマーが使用される：リシン、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、オルニチン、ロイシン、ヒスチジン、ノルロイシン、チロシン、アラニン、グルタミン酸、及びセファロスポリン、特にメチオニン。
【００４３】
特定の酵素が、この様々なＤ−アミノ酸の変換のために特に適していることが示される（参照、Gabler et al., 2000）。従って、アルスロバクター・プロトホルミエからのＤ−ＡＡＯは、特に塩基性及び疎水性のアミノ酸の変換に適する。
【００４４】
前記の適した酵素及びヌクレオチド配列は、一般的には公知技術から公知である。
【００４５】
本発明による方法では、単独の酵素の単離が回避される。更なる利点は、本発明により使用された細胞（ホールセル触媒）は、この反応後容易に分離されてよいことから生じる。
【００４６】
単離された酵素を用いた、Ｄ−メチオニンからＬ−メチオニンへの変換の際には、公知技術によれば、これに対してカタラーゼを添加しなくてはならない（Nakajima et al., 1990）。
【００４７】
本発明により使用される微生物は同様に、本発明の対象であり、かつ連続的に又は非連続的に回分法（バッチ培養）又は流加回分法（流加法）又は反復した流加回分法（反復流加法）において培養されてよい。公知の培養方法に関する概要は、Ｃｈｍｉｅｌ(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教本又はＳｔｏｒｈａｓによる教本(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００４８】
使用すべき培地は適したように、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な微生物の培地の記載は、American Society for Bacteriologyの教本「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C., USA, 1981)に含まれている。
【００４９】
炭素供給源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール、及び有機酸、例えば酢酸が使用されてよい。これらの物質は単独で又は混合物として使用されてよい。
【００５０】
窒素供給源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムが使用されてよい。前記窒素供給源は、単独で又は混合物として使用されてよい。
【００５１】
リン供給源として、リン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用されてよい。前記培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有することが必要であり、これらは成長に必要である。最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に加えて使用してよい。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給されてよい。
【００５２】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸を適した方法で使用する。泡の発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用されてよい。プラスミドの安定性の維持のために前記溶媒に、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を前記培養物に導入する。前記培養物の温度は通常は、２０〜４５℃、有利には２５〜４０℃である。この培養は、対数増殖期を経過している限りは継続される。この目標は通常は、１０〜２０時間の間に達成される。これに引き続き、この細胞を有利には、回収し、洗浄し、緩衝液中に懸濁液としてｐＨ値６〜９、特に６．８〜７．９で取り込む。この細胞濃度は、１〜６％、特に１．５〜４％（湿分質量／ｖ）に達する。前記細胞は一般的に、物理的又は化学的方法により、例えばトルエンで、例えばWilms et al., J. Biotechnol., 86巻 (2001), 19-30が記載しているように、この変換すべきＤ−アミノ酸がこの細胞壁を透過し、かつＬ−アミノ酸が流出するように透過処理されている。
【００５３】
この懸濁液は次いで、Ｄ−アミノ酸及びＬ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を含有する溶液と混合される。この変換は、１０〜４０℃、特に２５〜３６℃で、ｐＨ値６．８〜８．９、有利には７．５〜８．５で行われる。前記変換は７０〜１００℃への加熱により停止された。
【００５４】
実施例１
プラスミドの構築
前記の反応原理を確認するために、プラスミドの系列を構築し、この系列は以下の酵素の遺伝子を様々な組み合わせで有する：リンゴ酸酵素（ＭＡＥ）、ロイシン−デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）、アロスロバクター・プロトホルミエからのＤ−ＡＡＯ（ＡｐＤ−ＡＡＯ）及びトリゴノプシス・バリアビリスからのＤ−ＡＡＯ（ＴｖＤ−ＡＡＯ）。このために、表３に表示したプライマー及びプラスミドを使用した。
【００５５】
ＡｐＤ−ＡＡＯ（Apdao; gi:32140775）、ＴｖＤ−ＡＡＯ（Tvdao; gi:1616634）及びリンゴ酸酵素（mae; gi:1787752）の遺伝子の増幅のために、アルスロバクター・プロトホルミエ、トリゴノプシス・バリアビリス及び大腸菌Ｋ１２からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。ロイシンデヒドロゲナーゼ（leudh; gi:6741938）の遺伝子を、プラスミドｐＴ１Ｌ（＝ｐＬｅｕＢ，(Ansorge MB, Kula MR. (2000), Investigating expression systems for the stable large-scale production of recombinant L-leucine-dehydrogenase from Bacillus cereus in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 53:668-73)）と共に、テンプレートとして増幅した。
【００５６】
適したプライマー（表３に表示したプライマー）により、ＰＣＲを用いて、クローニングのための制限酵素切断部位を導入した。フォワードプライマーＤＡＡＯＴｖｆｏｒＮｄｅＩを用いて、Ｔｖｄａｏ−遺伝子中のイントロンを除去した。
【００５７】
ｐＨ１Ｍ中のＡｐｄａｏ−遺伝子のクローニングの際に、シャイン−ダルガルノ配列及び付加的な制限酵素切断部位（ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩのため）を、ＰＣＲを用いて、リバースプライマーＡｐＮｄｅＩｒｅｖ（表１）を使用することにより導入した。
【００５８】
表３
プラスミド及びプライマー
【表２】
【００５９】
実施例２
発現株の構築
プラスミドの適した組み合わせにより、表４に表示した組み換え大腸菌株を構築し、前記株はアミノ酸オキシダーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素のためのそれぞれの遺伝子を含有する。
出発株として使用：
ＮｏｖａｇｅｎのＢＬ２１（ＤＥ３）
及びＳｔｒａｔｇｅｎｅのＪＭ１０９。
【００６０】
表４
大腸菌株
【表３】
【００６１】
この株の名称（１〜８）は、以下の実施例においてこの表に相応して維持する。
【００６２】
実施例３
細胞内酵素活性の検証
表４に相応する株を、標準的な条件下で、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地中でｐＨ７．５で培養した。形質転換したプラスミドに依存して、前記培地に１００μｇ ｍｌ-1のアンピシリン及び／又は３４μｇ ｍｌ-1のクロラムフェニコールを添加した。この酵素発現のために、前記の組み換え大腸菌株を、好気性条件下で２０ｍｌの培地を有する１００ｍｌの振盪フラスコ中で培養させた。この細胞を３７℃で、ロータリー振盪機で、２００ｒｐｍでインキュベーションし、かつ約０．５のＯＤ５５０で、１００μＭのＩＰＴＧ及び／又は０．２％のラムノースにより誘導した。このインキュベーション後、前記株を次いで３０℃で更にインキュベーションした。
【００６３】
図２には、測定した酵素活性を提示した。
【００６４】
白：Ｄ−ＡＡＯ；灰色：ＭＡＥ；黒：ＬｅｕＤＨ。
【００６５】
株６は、ラムノースプロモーターの作用を示した。
【００６６】
実施例４
全組み換え株による生体内変換反応
Ａ）Ｄ，Ｌ−メチオニン
脱ラセミ化のための例として、メチオニンのラセミ体を基質として使用し、プラスミドｐＡＤ３ＬＭ（ロイシンデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素のための遺伝子を有する）及びｐＥ１Ｄ(アルスロバクター・プロトホルミエ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのための遺伝子を有する)の両方を含有する全組み換え大腸菌細胞株１（表２に相応）により変換した。ＨＰＬＣを用いて、このオキシダーゼにより触媒したＤ−Ｍｅｔの分解及びこの還元によるアミン化により触媒したＬ−Ｍｅｔの合成を追跡した。詳しくは、以下を使用した：
２５ｍＭのＤ、Ｌ−Ｍｅｔ、１００ｍＭのＬ−リンゴ酸塩、０．７ＭのＮＨ4Ｃｌ、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、終ｐＨ８．０。前記細胞を、５０ｍＭのＴＥＡ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に懸濁し、１０μｌ／ｍｌのトルエンと混合し、この懸濁液を３０分間３０℃で撹拌し、次いで変換のために使用した。この変換における細胞濃度は、１ｍｌの終容量中で３．３％（湿分質量／ｖ）を有した。前記変換は３０℃で、１０００ｒｐｍでの振盪下で、サーモミキサー５４３６（Eppendorf社）中で行われた。試料を、５分間の９５℃での加熱により停止させ、この透明な上清をＨＰＬＣを用いて分析した。
【００６７】
Ｄ−Ｍｅｔ及びＬ−Ｍｅｔの濃度決定のために、前記試料を希釈後誘導体化した。ここに、ｐＨ１０．４の１００ｍＭのナトリウム−ホウ酸緩衝液中の２６０ｍＭのイソブチリル−Ｌ−システイン及び１７０ｍＭのｏ−フタルジアルデヒドの溶液２０μｌを添加した。ＨＰＬＣ分離条件は、刊行されたように励行した（Krieg L, et al. (2002) Screening for amidases: isolation and characterization of a novel D-amidase from Variovorax paradoxus. Adv Synth Catal 344(9):965-73）。
【００６８】
Ｄ−Ｍｅｔの分解及びＬ−Ｍｅｔの形成を、図３に概要して示した。Ｌ−Ｍｅｔのエナンチオマー純粋な生成物を、終濃度２５ｍＭで得た。
【００６９】
Ｂ）Ｄ，Ｌ−ロイシン
Ａ部で記載したのと同様にして、２５ｍＭのＤ，Ｌ−ロイシンの溶液を、前記したのと同一の微生物で変換させた。この変換自体及びこのＨＰＬＣ−分析の詳細は、前述した実施例に相応する。
【００７０】
Ｄ−Ｌｅｕの分解及びＬ−Ｌｅｕの形成を、図４に概要して示した。Ｌ−Ｌｅｕのエナンチオマー純粋な生成物を、終濃度２５ｍＭで得た。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、使用したプラスミドを示す図である。
【図２】図２は、測定した酵素活性を示す図である。
【図３】図３は、Ｄ−Ｍｅｔの分解及びＬ−Ｍｅｔの形成を示す図である。
【図４】図４は、Ｄ−Ｌｅｕの分解及びＬ−Ｌｅｕの形成を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開始生物に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する、組み換え微生物。
【請求項２】
静止細胞からなる、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ギ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項５】
アルコールデヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項６】
Ｌ−ロイシンデヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのグループから選択されたＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項８】
前述の酵素をコードする複数の遺伝子が、他の属の微生物、真菌又は酵母に由来する、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項９】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補酵素ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの細胞内活性が、前記酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を増加させるか、又は強力なプロモーターを使用するか、又は両者を組み合わせることにより開始生物に対して増加する、請求項１から８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ又は補基質ＮＡＤＨを再生する酵素をコードするヌクレオチド配列の１つ又は複数を有する、ベクター。
【請求項１１】
Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１３】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１４】
開始生物に比較して、上述の酵素をコードするヌクレオチド配列のそれぞれ少なくとも１つの付加的なコピーを有するように、請求項１０から１３までのいずれか１項記載のベクターを用いて形質変換された微生物。
【請求項１５】
エナンチオ選択的な酵素による合成経路の使用下でＤ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法であって、開始生物（例えば野生型）に対して、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物を、Ｄ−アミノ酸を有する溶液と反応させ、この生じるＬ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法。
【請求項１６】
請求項１から９及び１４のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
補基質ＮＡＤＨを再生する酵素として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを選択し、前記のＤ−アミノ酸を含有する溶液に、Ｌ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を添加することを特徴とする、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物の静止細胞を使用することを特徴とする、請求項１５から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
使用した細胞の細胞壁が、化学的又は物理的処置により、前記溶液からのＤ−アミノ酸の取り込みのために透過性であることを特徴とする、請求項１５から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
リシン、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、オルニチン、ロイシン、ヒスチジン、ノルロイシン、チロシン、アラニン、グルタミン酸、セファロスポリン、特にメチオニンのグループから選択されたＤ−アミノ酸又はラセミ体のＤＬ−アミノ酸を使用することを特徴とする、請求項１５から１９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
開始生物に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する、組み換え微生物。
【請求項２】
静止細胞からなる、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ギ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項５】
アルコールデヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項６】
Ｌ−ロイシンデヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのグループから選択されたＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの増加した濃度又は活性を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項８】
前述の酵素をコードする複数の遺伝子が、他の属の微生物、真菌又は酵母に由来する、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項９】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補酵素ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの細胞内活性が、前記酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を増加させるか、又は強力なプロモーターを使用するか、又は両者を組み合わせることにより開始生物に対して増加する、請求項１から８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ又は補基質ＮＡＤＨを再生する酵素をコードするヌクレオチド配列の１つ又は複数を有する、ベクター。
【請求項１１】
Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１３】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１０記載のベクター。
【請求項１４】
開始生物に比較して、上述の酵素をコードするヌクレオチド配列のそれぞれ少なくとも１つの付加的なコピーを有するように、請求項１０から１３までのいずれか１項記載のベクターを用いて形質変換された微生物。
【請求項１５】
エナンチオ選択的な酵素による合成経路の使用下でＤ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法であって、開始生物（例えば野生型）に対して、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、補基質ＮＡＤＨを再生する酵素及び場合によりカタラーゼの増加した濃度又は活性を有する組み換え微生物を、Ｄ−アミノ酸を有する溶液と反応させ、この生じるＬ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｄ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製造するための方法。
【請求項１６】
請求項１から９及び１４のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
補基質ＮＡＤＨを再生する酵素として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを選択し、前記のＤ−アミノ酸を含有する溶液に、Ｌ−リンゴ酸塩又はＬ−リンゴ酸を添加することを特徴とする、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物の静止細胞を使用することを特徴とする、請求項１５から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
使用した細胞の細胞壁が、化学的又は物理的処置により、前記溶液からのＤ−アミノ酸の取り込みのために透過性であることを特徴とする、請求項１５から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
リシン、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、オルニチン、ロイシン、ヒスチジン、ノルロイシン、チロシン、アラニン、グルタミン酸、セファロスポリン、特にメチオニンのグループから選択されたＤ−アミノ酸又はラセミ体のＤＬ−アミノ酸を使用することを特徴とする、請求項１５から１９までのいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５２２８１０（Ｐ２００７−５２２８１０Ａ）
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５３４７１（Ｐ２００６−５５３４７１）
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０００７６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０５９０
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０１０７３８６２）デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｎｎｉｇｓｅｎｐｌａｔｚ １， Ｄ−４０４７４ Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０００７６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０５９０
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０１０７３８６２）デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｎｎｉｇｓｅｎｐｌａｔｚ １， Ｄ−４０４７４ Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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