Ｄ−セリン合成活性を有する酵素を利用したＤ−セリンの製造方法
【課題】グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを製造する際に、Ｌ−セリンの副生を抑制する方法を提供する。
【解決手段】ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する。
【解決手段】ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の医薬品の合成中間体として有用な化合物であることが知られている。
【０００３】
従来、ホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素としては、アリスロバクター（Arthrobacter）ｓｐ．ＤＫ−１９に由来するＤ−スレオニンアルドラーゼ（以下、「ＤＴＡ」と略記する。）が知られているに過ぎない（特許文献１：特開昭５８−１１６６９０号公報を参照）。
【０００４】
このＤＴＡは、ホルムアルデヒド及びグリシンをそれぞれ５０ｍｍｏｌ使用して３０℃で４０時間反応させた後のＤ−セリンの生成量は２．５ｍｍｏｌ（ホルムアルデヒドに対する収率は僅かに５％）であったことが報告されている。
【０００５】
これに対し、同じアリスロバクター属の微生物である、アリスロバクターｓｐ．ＤＫ−３８に由来するＤＴＡは、Ｄ−スレオニン、Ｄ−β−ヒドロキシフェニルセリン、Ｄ−β−ヒドロキシ−α−アミノ吉草酸等に反応する広い基質特異性を有しているにもかかわらず、Ｄ−セリンには反応しないことが報告されている（非特許文献１：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２４８，ｐ３８５−３９３を参照）。
【０００６】
また、キサントモナス属（Xanthomonas）由来のＤＴＡを用いることにより、グリシンとアルデヒド化合物からＤ−β−ヒドロキシアミノ酸類を製造できることが報告されているが、キサントモナス属由来のＤＴＡを用いてホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンが合成できるとの報告はなされていない（特許文献２：特開平５−１６８４８４号公報を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５８−１１６６９０号公報
【特許文献２】特開平５−１６８４８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２４８，ｐ３８５−３９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の背景技術に鑑み、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素、及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、公知のＤＴＡと類似の構造を有する未知の酵素のなかに、ホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する能力を有する酵素が存在する可能性があると考え、公知のＤＴＡのアミノ酸配列に関する情報に関する調査を行った。その結果、キサントモナス属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０５０５５）、アクロモバクター（Achromobacter）属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０２６８９２）、及びアリスロバクター属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１０９５６）に由来するＤＴＡのアミノ酸配列に関する情報を見出した。これらのアミノ酸配列を比較検討した結果、ＤＴＡのＮ末端領域及びＣ末端領域に相当するアミノ酸配列に高い相同性を持つことを見出した。
【００１１】
本発明者らは、これらのアミノ酸配列からＮ末端領域とＣ末端領域を基にプライマーを設計し、このプライマーを用いて各種の微生物の染色体ＤＮＡからＰＣＲによる増幅を試みたところ、アクロモバクター属の微生物からホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡの増幅に成功した。
【００１２】
このＤＮＡに相当するアミノ酸配列と公知のアクロモバクター属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列との相同性は約５０％程度であり、公知のアクロモバクター属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列とはかなり異なるものであった。一方、公知のキサントモナス属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列との相同性は約９０％であった。
【００１３】
本発明者らは次に、前記の新規なＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡで形質転換された組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いてホルムアルデヒドとグリシンとを反応させてＤ−セリンの合成を試みたところ、驚くべきことに従来知られているＤＴＡとは異なり、１００ｍＭのグリシンとホルムアルデヒドから反応収率７０％以上という高収率でＤ−セリンを合成できることを見出した。
【００１４】
更に、この組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いてＤ−セリンの蓄積反応を行うと、僅かながらＬ−セリンが生成することが認められた。
【００１５】
Ｄ−セリンを医薬中間体等の高純度が要求される分野に用いる場合、Ｄ−セリンへのＬ−セリンの混入は好ましくない。Ｄ−セリンの製造時にＬ−セリンが副生することは、Ｄ−セリンの溶解度よりＤＬ−セリンの溶解度が低いことからＤ−セリンの精製収率を大幅に低下させる。
【００１６】
本発明者らは、この問題を解決するために、更に検討した結果、２価金属イオンの存在下、有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施すことでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。また、このような処理を施さなくとも反応中のホルムアルデヒド濃度を１５０ｍＭ以上に維持することでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。更に、Ｄ−セリン合成に利用するＤＳＡを生産する宿主としてＬ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を利用することでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。
【００１７】
以上の知見を基に、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ
（３）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ。
【００１８】
（４）前記（３）に記載の組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
（５）形質転換される宿主細胞が微生物である前記（４）に記載の形質転換体。
（６）形質転換される微生物がＤ−セリンデアミナーゼの欠損した微生物である前記（５）に記載の形質転換体。
【００１９】
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質
【００２０】
（８）前記（４）から（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素の製造方法。
（９）前記（４）から（６）のいずれかに記載の形質転換体又はその処理物の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることを含むＤ−セリンの製造方法。
（１０）前記（７）に記載のタンパク質の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることを含むＤ−セリンの製造方法。
【００２１】
（１１）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物又はその処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドとを反応させてＤ−セリンを合成するＤ−セリンの製造方法であって、該反応の反応液中のＬ−セリンの副生をＤ−セリンに対して１．５モル％以下に抑制させる以下の（ｉ）〜（iv）の一つ以上の手段を有するＤ−セリンの製造方法。
（ｉ）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物を有機溶媒処理及び／又は加熱処理する方法、
（ii）反応液中のホルムアルデヒド濃度を、ａ）前記（ｉ）の方法により有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施す場合には２Ｍ以下に制御し、ｂ）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施さない場合には、１５０ｍＭ以上２Ｍ以下に制御する方法、
（iii）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を含有し、かつ、Ｌ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を触媒として利用する方法、
（iv）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する酵素を含有する微生物を反応液中に添加する方法。
【００２２】
（１２）有機溶媒がホルムアルデヒド、ベンズアルデヒド、ジクロロエタン及びイソプロピルアルコールから選ばれる一種以上のものである前記（１１）に記載の製造方法。
（１３）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を２価の金属イオンの存在下で行う前記（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）２価の金属がマグネシウム、マンガン、亜鉛、ニッケル、コバルト及び鉄から選ばれる一種以上の金属である前記（１３）に記載の製造方法。
（１５）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が前記（５）又は（６）に記載の形質転換体である前記（１１）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、公知のＤＴＡを用いたＤ−セリンの製造方法に比べ、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを収率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、形質転換体から得た破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図２】図２は、精製されたＤＳＡのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡの遺伝子取得
配列表の配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含み、かつ、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素（以下、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を「ＤＳＡ」と略記する。）をコードするＤＮＡは、例えば、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能なアクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）（ＡＴＣＣ９２２０）、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation）の生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手可能なアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）及びアクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）（Synonym: Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans）（ＮＢＲＣ１５１２５）から染色体ＤＮＡを抽出し、配列表の配列番号１及び２に示した塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを実施することにより得ることができる。
【００２６】
ＰＣＲを実施するに際して、若干のミスマッチを持つ遺伝子も増幅することができるように増幅時の条件を改良することが有効である。例えば、アニール温度を低めに抑える方法、ＰＣＲ反応液中にジメチルスルホキシドを５％程度添加する方法、あるいはＧＣリッチな遺伝子を増幅しやすいように工夫されたＰＣＲキット（例えばＧＣ−ＲＩＣＨ ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製））を使用する方法、更には前記の方法を組み合わせる方法などにより増幅が困難な遺伝子を増幅できることがある。
【００２７】
ＤＳＡをコードするＤＮＡの具体的な例としてアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号３に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号４に例示できる。アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号５に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号６に例示できる。アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号７に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号８に例示できる。
【００２８】
ＤＳＡをコードするＤＮＡとしては前記したものの他に、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＳＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればどのような生物由来であっても構わない。例えば、その生物中で機能を有していないサイレントなＤＮＡであっても単離したＤＮＡを適当な発現ベクターに連結することでＤＳＡを産生することができればそれでも構わない。
【００２９】
更に生物を特定しなくても、土壌などを直接、鋳型ＤＮＡとして配列表の配列番号１及び２の塩基配列をもつプライマーを用いたＰＣＲに付すことでＤＳＡをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００３０】
ＤＳＡをコードするＤＮＡの具体的な取得方法として、例えばＤ−セリンを含有する培地で生育する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１及び２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅したＤＮＡを例示することができる。
【００３１】
また、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列もしくは相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内でかつ、コードされる酵素の活性に影響を及ぼさない範囲内で部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res., 10, pp. 6487 (1982); Nucleic Acid Res., 13, pp. 4431 (1985); Methods in Enzymol., 100, pp. 448(1983); Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &;Sons (1987-1997); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, pp. 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, pp.488 (1985)）などを用いて、適宜欠失、置換、挿入、及び／又は付加変異を導入することにより、配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＳＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００３２】
本明細書中の、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加は、前記の出願前周知技術である部位特異的変異導入法により実施することができ、また、１もしくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異導入法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数、例えば１〜５個のアミノ酸、好ましくは１〜３個のアミノ酸を意味する。
【００３３】
ハイブリダイゼーションのための条件とは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いている条件を例示できる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【００３４】
本明細書中で用いる「配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片」とは、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の又はそれらの相補配列中の任意の少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、例えば４０、６０又は１００塩基の連続した配列を一つ又は複数選択したＤＮＡの断片のことである。
【００３５】
２．該タンパク質の遺伝子を持つ組換えＤＮＡの作製
前記のＤＳＡをコードするＤＮＡをベクターに組込むことにより組換え体ＤＮＡを得ることができる。
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示することができる。また、プラスミドとしては、例えばＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等を例示することができる。
【００３６】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＨプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。更にバチルス属細菌中で発現させるためにＮｐプロモーター（特公平８−２４５８６号公報）なども用いることができる。
【００３７】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００３８】
転写・翻訳を効率的に行うため、該タンパク質活性を有するタンパク質のＮ末端又はその一部を欠失したタンパク質と発現ベクターのコードするタンパク質のＮ末端部分を融合させたタンパク質を発現させてもよい。
【００３９】
目的とするタンパク質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４０】
クローニングの際、前記のようなベクターを、上述したＤＳＡをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば該ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、微生物等の宿主に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００４１】
３．ＤＳＡをコードするＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡによる形質転換体の作製
前記の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより、前記の組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。宿主細胞としては、微生物、例えば細菌を挙げることができ、そのようなものとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α，ＸＬ−１ＢｌｕｅなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが例示される。また、宿主細胞としてその他酵母等の微生物や昆虫細胞を利用することも可能である。
【００４２】
微生物に組換え体ＤＮＡを移入する方法としては、例えば微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００４３】
宿主細胞として、生成物であるＤ−セリンの分解を抑制する目的でＤ−セリンデアミナーゼ活性の低い微生物又はＤ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物を用いることができる。Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物の具体的な例として、例えば実施例６に記載のＤ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組換えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等が挙げられる。
【００４４】
また、Ｄ−セリン合成反応におけるＬ−セリンの生成を抑制する目的で、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の高い微生物を用いることにより生成したＬ−セリンを分解することも可能である。Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の高い微生物として実施例１５に記載のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組換えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等を用いることもできる。
【００４５】
微生物として、アラニンラセマーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ等のＬ−セリンの合成に関与する酵素活性が低い微生物又はこれらの酵素活性が欠損した微生物を用いることは、Ｌ−セリンが生成しないため好適である。
【００４６】
更に好ましくは、これらの酵素が全て欠損した微生物を宿主細胞として用いることが望ましい。
【００４７】
４．ＤＳＡの生産
前記の形質転換体を培養し、次に得られたＤＳＡを採取することにより、ＤＳＡを製造することができる。
形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換体がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４８】
炭素源としては、形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００４９】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。
【００５０】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５１】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜５０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜５日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等をそれぞれ培地に添加してもよい。
【００５３】
形質転換体は、これを含む培養液を遠心分離、ろ過等の手段を用いて分離し回収することができる。
【００５４】
形質転換体処理物は、細胞の破壊を目的として、形質転換体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理、酵素処理したもの、及びこれらの処理により得られるＤＳＡを含む画分の固定化物、形質転換体の固定化物として得ることができる。
【００５５】
なお、本発明において微生物の処理物も前記形質転換体処理物と同様の処理をしたものを指す。
【００５６】
このような形質転換体又は形質転換体処理物からＤＳＡを精製するためには、形質転換細胞を破砕し細胞破砕液をイオン交換樹脂やゲルろ過等のクロマトグラフィーによる分画や硫酸アンモニウムなどによる塩析などを組み合わせることで精製酵素を得ることができる。
【００５７】
５．Ｄ−セリンの製造方法
前記の形質転換体又はその形質転換体処理物の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることによりＤ−セリンを製造することができる。
Ｄ−セリンの製造は、ｐＨ６．０〜９．０、温度２０〜６０℃で振盪、もしくは攪拌条件下で行うのが好ましい。
【００５８】
形質転換体又はその形質転換体処理物の使用量は、ホルムアルデヒドとグリシンとの反応が十分に進行すれば特に制限されないが、通常グリシン１ｇに対して少なくても１０ｕｎｉｔ、好ましくは５０ｕｎｉｔ以上のＤＳＡ活性となる量を添加することが望ましい。形質転換体又はその形質転換体処理物の添加方法は反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【００５９】
ＤＳＡ活性は、１μモルのＤ−セリンを１分間に合成できる能力を１ｕｎｉｔと定義する。
ＤＳＡ活性は、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭホルムアルデヒドを含むｐＨ８．０の２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液中に酵素液を加えて３０℃で保温し、Ｄ−セリンの生成量を測定して算出する。
【００６０】
反応液中のグリシンの濃度は、１００ｍＭ以上であり、好ましくは１Ｍ以上５Ｍ以下である。グリシンの添加方法については反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。
【００６１】
ホルムアルデヒドは、その気体を反応液中に供給することができるが、水溶液又はアルコール溶液として供給することもできる。また、ホルムアルデヒドの供給源としてパラホルムアルデヒドを使用することもできるが、３７％程度のホルムアルデヒドの水溶液の使用が好適である。
【００６２】
ホルムアルデヒドの添加方法としては、一括添加又は反応の進行に伴い分割又は連続的に添加する方法で行えるが、反応液中のホルムアルデヒド濃度はＤＳＡ活性を阻害しない程度の濃度に制御することが好ましい。ＤＳＡ活性を阻害しない程度の濃度とは通常５Ｍ以下、好ましくは２Ｍ以下、更に好ましくは５００ｍＭ以下、特に好ましくは３００ｍＭ以下である。
【００６３】
反応液中のホルムアルデヒド濃度を制御する方法として（１）反応液に一定速度で添加する方法、（２）ホルムアルデヒド濃度を定量し、酵素活性が失活しない程度の濃度になってから分割添加する方法、（３）パラホルムアルデヒドを添加し、パラホルムアルデヒドがホルムアルデヒドに遊離する速度以上の酵素量を反応系に添加しておくことで実質的にホルムアルデヒドによる阻害を回避する方法、（４）反応の進行に伴い反応液中に生成物のＤ−セリンが蓄積し、原料のグリシンが減少する。Ｄ−セリンとグリシンの等電点がそれぞれ、５．６８と５．９７であるため、反応の進行に伴い反応液のｐＨの低下が起こる。反応液のｐＨの低下を補正する量以上のアルカリを反応液に添加し、そのｐＨ上昇分を補正できる量のホルムアルデヒドを添加するという方法でホルムアルデヒドを添加することも可能である。
【００６４】
反応液中のＤＳＡ量を予め設定したアルカリの添加速度、即ちＤ−セリンの合成速度以上にしておけば、ホルムアルデヒドの濃度を測定するなどの煩雑な操作を用いずとも反応液中のホルムアルデヒド濃度を制御することが可能となる。
【００６５】
反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものであればよい。
【００６６】
反応液の媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【００６７】
上述の反応において、２価の金属イオンを有する化合物、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤や補酵素であるピリドキサールリン酸、アンモニウム塩等を添加することにより反応収率が向上することがある。
【００６８】
２価の金属イオンを有する化合物としては、例えば塩化マグネシウム、塩化マンガン、酢酸コバルト、硫酸第１鉄、塩化カルシウムなどが挙げられる。
これら化合物の反応液中の濃度としては通常０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭから１０ｍＭである。
【００６９】
６．反応液中のＤ−セリンの光学純度を高める方法
前記の形質転換体又はその形質転換体処理物を加熱処理して得られる処理物、又は前記の形質転換体又はその形質転換体処理物を有機溶媒で処理して得られる処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドを反応させることにより、Ｌ−セリンの副生を抑制することができる。
【００７０】
加熱処理の条件としては加熱により大幅にＤＳＡ活性を低減させず、Ｌ−セリンを生成する活性を低減又は消失させることが可能であればどのような条件でも構わない。具体的な例として、例えばｐＨ６．０から９．０、温度４０℃から７０℃で１０分間から６時間程度攪拌する方法を挙げることができる。
また、有機溶媒処理と加熱処理を組み合わせて行うことも可能である。
【００７１】
有機溶媒処理の条件としては大幅にＤＳＡ活性を低減させず、Ｌ−セリンを生成する活性を低減又は消失させることが可能であればどのような条件でも構わない。有機溶媒処理の条件としては、有機溶媒の濃度は通常２０ｍＭ以上２Ｍ以下、好ましくは２０ｍＭ以上１Ｍ以下、更に好ましくは５０ｍＭから１０００ｍＭ、特に好ましくは５０ｍＭから３００ｍＭ程度である。有機溶媒はＤＳＡ活性を大幅に低減させないものであれば制限はないが、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒド類、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類などの有機溶媒を用いることが好ましい。中でもホルムアルデヒドは酵素反応の基質であるため、最も好適である。Ｄ−セリンを添加することで該酵素反応によりホルムアルデヒドが生成するため、ホルムアルデヒドの変わりにＤ−セリンを添加する方法でも構わない。Ｄ−セリンの添加濃度としては１００ｍＭから５Ｍ程度が望ましい。
【００７２】
有機溶媒処理の温度は１０℃から５０℃の範囲であり、ｐＨは６．０から９．０の範囲が望ましい。有機溶媒処理中は、処理液のｐＨや有機溶媒濃度が均一となるように攪拌することが望ましい。
【００７３】
また、Ｄ−セリン製造の反応開始時にホルムアルデヒド濃度を高めることでＬ−セリンの生成活性を低減又は失活させることも可能である。この場合、反応中のホルムアルデヒド濃度を０．１％から５％程度で３０分間から３時間程度保った後、通常の反応を行えばよい。
【００７４】
上述の処理を行う際に、２価の金属イオンを有する化合物、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤や補酵素であるピリドキサールリン酸、アンモニウム塩等を添加することにより酵素活性が更に安定化することがある。
【００７５】
２価の金属イオンを有する化合物としては、例えば、塩化マグネシウム、塩化マンガン、酢酸コバルト、硫酸第１鉄、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００７６】
これら化合物の処理液中の濃度としては通常０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭから１０ｍＭである。
【００７７】
Ｄ−セリン合成反応終了後の反応液にＬ−セリンセアミナーゼ生産菌を加え、生成したＬ−セリンを分解させることにより最終製品であるＤ−セリンの光学純度を高めることもできる。Ｌ−セリンデアミナーゼ生産菌としてはＤ−セリンデアミナーゼを欠損した微生物を用いることが望ましい。
【００７８】
７．Ｄ−セリンの採取方法
反応液からのＤ−セリンの採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００４−２９８３４４の明細書及び／又は図面に記載された内容を包含する。
【実施例】
【００７９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、Ｄ−セリン、Ｌ−セリン及びグリシンは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件及び、酵素（ＤＳＡ及びＤＴＡ）活性の測定方法は次のとおりである。
【００８０】
（１）Ｄ−セリン及びＬ−セリンの分析条件
カラム；ＴＳＫ−ＧＥＬ ＥＮＡＮＴＩＯ Ｌ１ ４．６ｘ２５０（東ソー株式会社）
カラム温度；４５℃
ポンプ流速；０．８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、溶離液；０．２５ｍＭ硫酸銅：メタノール＝９：１（Ｖ／Ｖ）
（２）セリン及びグリシンの分析条件
カラム；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＮＮ−８１４ ８ｘ２５０（昭和電工株式会社）
カラム温度；４０℃
溶離液；１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ３．０）
ポンプ流速；０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出はオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたポストカラム誘導体化法〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，８３，３５３−３５５（１９７３）〕を用いた。
（３）酵素活性の測定方法
１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭホルムアルデヒドを含むｐＨ８．０の２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液０．９ｍＬに菌体懸濁液を超音波破砕した酵素液を適当に希釈して０．１ｍＬを加え、３０℃で１５分間反応した。
生成したＤ−セリンをＨＰＬＣにて分析し活性を測定した。活性の単位は１分間に１μｍｏｌのＤ−セリンを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。
【００８１】
［実施例１］
（ＤＳＡをコードする遺伝子の取得）
アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００８２】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のＤＴＡ遺伝子に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【００８３】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１５秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００８４】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。
【００８５】
得られたＤＳＡをコードするＤＮＡから予想されるアミノ酸配列の分子量は何れもほぼ４０ｋＤａであった。
【００８６】
得られたアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ１と命名した。
【００８７】
アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ２と命名した。アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ３と命名した。
【００８８】
（形質転換体の作製）
ｐＡｃＤＴＡ１、ｐＡｃＤＴＡ２、ｐＡｃＤＴＡ３を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０１５、ＭＴ−１１０１６、ＭＴ−１１０１７と命名した。
【００８９】
各々の組換え微生物を５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコにＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が０．６になるまで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）が１ｍＭとなるように添加し、更に１６時間振盪培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた菌体を５ｍＬの１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００９０】
［実施例２］
（ＤＳＡの製造法）
実施例１で作製した形質転換体の懸濁液０．５ｍＬをバイオラピュター（オリンパス社製）を用いて、氷水中で５分間破砕した。形質転換体の破砕液を遠心分離し、破砕液を調製した。破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を図１に示した。
沈殿物に１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍＬ加えて細胞残渣として同様に分析した。
【００９１】
何れの形質転換体も可溶性画分におよそ４０ｋＤａの位置に発現するタンパク質が見出され、不溶性画分には見出されなかった。この分子量はそれぞれの遺伝子から推測されるアミノ酸配列の分子量とほぼ一致した。
【００９２】
［実施例３］
（ＤＳＡの精製と精製ＤＳＡによるＤ−セリンの合成）
実施例２と同様の方法で作製したＭＴ−１１０１５の破砕液１０ｍＬを１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細胞残渣を除いた酵素液を調製した。酵素液を陰イオン交換樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｑ−ＸＬ、アマシャム社製）に吸着させ、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニアーグラジエントで溶出させた。活性画分を疎水クロマト樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ、アマシャム社製）に吸着させ、硫酸アンモニウムで飽和させた１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニア−グラジエントで溶出させた。なお、以上の操作は、約１０℃で操作した。
【００９３】
超音波破砕液、イオン交換クロマトグラフィー処理した後の活性画分及び疎水クロマトグラフィー処理した後の活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を図２に示した。精製ＤＳＡのモノマーの分子量は４００００±５０００であった。
【００９４】
１００ｍＭホルムアルデヒド、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬよりなる基質溶液に精製ＤＳＡ酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。
Ｄ−セリンの反応収率は９５％であった。
【００９５】
［実施例４］
（Ｄ−セリン合成能力とＤ−スレオニン合成能力の比較）
アルデヒド源として、１００ｍＭのホルムアルデヒド又はアセトアルデヒドを含み、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬよりなる基質溶液に実施例１で作製したＭＴ−１１０１５株の超音波破砕酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。
アルデヒド源としてホルムアルデヒドは用いたときは、収率９０％であったがアセトアルデヒドを用いたときは１０％であった。
【００９６】
［実施例５］
（ホルムアルデヒド１００ｍＭ濃度でのＤ−セリン合成反応）
ホルムアルデヒド１００ｍＭ、グリシン１００ｍＭ、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ８．０の２００ｍＭトリス塩酸緩衝液１００ｍＬよりなる基質溶液に実施例１で作製した組換え微生物の超音波破砕酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。結果を表１に示した。
【００９７】
【表１】
【００９８】
［実施例６］
（Ｄ−セリンデアミナーゼ欠損Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤ−セリンデアミナーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｄｓｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１６０３）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡのｄｓｄＡ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化することにより、それぞれ約９００ｂｐ、８００ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ．， Ｇｅｎｅ， ２４１， １８５−１９１ （２０００）〕をＰｓｔＩ、ＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＸｂａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理を行った後、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来のカナマイシン耐性遺伝子と連結した。
【００９９】
こうして得られたプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【０１００】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｄｓｄＡ近傍領域の約３．０ｋｂ断片を増幅させ、ｄｓｄＡがカナマイシン耐性遺伝子に置換されている株を選抜し、得られた株をＷ３１１０ｄｓｄＡ欠失株（以下ΔｄｓｄＡと略することがある）と命名した。実施例１で作製したプラスミドを用いて形質転換し、前記と同様に凍結保存した菌体を作製し、同様の反応を行ったところＤ−セリンの分解は殆ど確認できなかった。
【０１０１】
［実施例７］
（形質転換体ＭＴ−１１０１６を使用したＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
７．５ｇのグリシンと９．４ｇの０．０２６重量％のピリドキサールリン酸に蒸留水５３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した。実施例１で得たＭＴ−１１０１６の菌体懸濁液（活性として１５００ｕｎｉｔ相当）を加えた。反応温度３０℃にて２０重量％のホルムアルデヒド２０．８ｇを反応液中のホルムアルデヒド濃度をＡＨＭＴ法（衛生化学（１９７６）、Ｖｏｌ２２、ｐ３９）にて定量し、５０ｍＭから３００ｍＭとなるように添加した。反応液のｐＨは水酸化ナトリウムにてｐＨ８．０に調整した。７２時間後の反応収率は８５％に達していた。
【０１０２】
［実施例８］
（形質転換体ＭＴ−１１０１７を使用したＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
７．５ｇのグリシンと９．４ｇの０．０２６重量％のピリドキサールリン酸に蒸留水５３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した。実施例１で得たＭＴ−１１０１７菌体懸濁液（活性として１５００ｕｎｉｔ相当）を加えた。反応温度３０℃にて２０重量％のホルムアルデヒド２０．８ｇを０．８ｇ／１５分の速度で１５分間添加し、ホルムアルデヒドの添加を４５分間停止するというサイクルを繰り返して反応液に添加した。反応液のｐＨは反応中水酸化ナトリウムにてｐＨ８．０に調整した。２４時間後のＤ−セリンの反応収率は９５％に達していた。
一方、ホルムアルデヒドを一括で添加して反応させたところ反応収率は２０％であった。
【０１０３】
［実施例９］
（ホルムアルデヒド処理した形質転換体によるＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
実施例１で作製したＭＴ−１１０１５の凍結菌体の溶解液にホルムアルデヒドを１００ｍＭとなるように添加し、３０℃で１時間緩やかに攪拌した。攪拌中はｐＨを８．０に水酸化ナトリウムにて調整した。該菌体験濁液を用いて実施例８と同じ反応を行った。ホルムアルデヒド処理を行わなかった場合はＬ−セリンが２モル％生成したが、ホルムアルデヒド処理を行った場合はＬ−セリンを検出できなかった。
【０１０４】
前記の反応液に６Ｎ−塩酸を加えｐＨを４．１に調整した。活性炭（５０％含水率）０．９７ｇを加え、６０℃で１時間攪拌し、ろ過により活性炭と菌体成分を除去した。次いで、ろ液を３０ｇまで濃縮し、イソプロピルアルコール１３ｇを徐々に加え氷中で１時間緩やかに攪拌しながらＤ−セリンを析出させた。晶析液をろ過し、結晶を冷却した４０％イソプロピルアルコール１３ｍＬで洗浄して乾燥させた。回収率は６０％で白色のＤ−セリン結晶が得られ、原料であるグリシンは検出されなかった。結晶の光学純度は９９．８％ｅｅであった。
【０１０５】
［実施例１０］
［１０−１］（キサントモナスのＤＴＡクローニングとベクター構築）
東京大学 分子細胞生物学研究所より入手可能なキサントモナス・オリゼー（ＩＡＭ１６５７）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【０１０６】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のキサントモナス・オリゼーのＤＴＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｅ０５０５５）に基づいて設計した配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【０１０７】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１５秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【０１０８】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い、公知のキサントモナス・オリゼーのＤＴＡと同じ配列であることを確認した。得られた発現プラスミドをｐＸＤＴＡ１と命名した。
【０１０９】
［１０−２］（キサントモナス属のＤＴＡ発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの取得）
ｐＸＤＴＡ1を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ΔｄｓｄＡを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０２８と命名した。
また、実施例１で作製したｐＡｃＤＴＡ１、ｐＡｃＤＴＡ２、ｐＡｃＤＴＡ３を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ΔｄｓｄＡを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０１５Ｗ、ＭＴ−１１０１６Ｗ、ＭＴ−１１０１７Ｗと命名した。
【０１１０】
［１０−３］（Ｊａｒ培養による菌体の取得）
ＭＴ−１１０１５Ｗ、ＭＴ−１１０１６Ｗ、ＭＴ−１１０１７Ｗ、ＭＴ−１１０２８の組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコにＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が１．０になるまで培養した。
次いで１０Ｌ容量のＢＭＳ１０（エイブル社製）で培養を行った。培養の条件は、撹拌：７００ｒｐｍ、温度：３０℃、ｐＨ（ＮＨ３で維持）：７．２、通気：１ｖｖｍ、容量：５Ｌ、培養時間：４８時間の条件で操作した。培地は、特記しない限り、水１Ｌに対してポリペプトン（大日本製薬）７ｇ、硫酸第一鉄・７水和物０．０９ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・６水和物２ｇ、リン酸水素１カリウム２ｇ、リン酸水素２カリウム２ｇ、アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．６ｇの培地組成を用いた。
【０１１１】
接種前に、２０ｇ／Ｌの濃度となるようにグルコースを添加し、前記のバッフル付き三角フラスコの培養液５０ｍＬを接種した。前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの時間を０．１ｇ／Ｌ未満となるような可変速度でグルコースを全量で２００ｇを供給した。培養液から遠心分離により菌体を集めて−２０℃にて凍結した。
【０１１２】
［１０−４］（有機溶媒処理した微生物のＬ−セリン副生抑制）
［Ｌ−セリン副生酵素活性の測定方法］
ＭＴ−１１０２８の凍結菌体６０ｇ（固形分率およそ１０％）に塩化マグネシウム・６水和物を１．０ｇ加え各種有機溶媒を所定濃度となるように加え、３５℃で１時間攪拌した。
前記の処理菌体液から乾燥菌体として０．２２ｇ分を測りとり、酵素活性測定液９ｇを加えて３５℃で２０時間攪拌し、生成したＬ−セリンと残存するＤ−セリンの比率を測定した。結果を表２にまとめて示した。
【０１１３】
（Ｌ−セリン生成活性測定液）
Ｄ−セリン１０．８４ｇ、ＰＬＰ６ｍｇをｐＨ７．０の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液で１００ｇに溶解した。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
［実施例１１］
（有機溶媒処理した微生物によるＤ−セリン合成）
実施例１０で得た湿菌体８３．４ｇ（固定分率約１０％）に塩化マグネシウム・６水和物１．８５ｇと３７重量％のホルムアルデヒド１．２ｇを加え、水を加えてホルムアルデヒド濃度０．５％に調整し、３５℃で１時間撹拌した。
【０１１６】
水２８０ｇにグリシン８０ｇと３５重量％の塩化マグネシウム６水和物４ｇ、３７重量％のホルムアルデヒド３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調整した。
０．３８重量％のＰＬＰ溶液を３．２ｇ添加し、前記の有機溶媒処理菌体を湿菌体として３０ｇを加えて反応を開始した。反応中にｐＨが７．３を上回ったらホルムアルデヒドを添加し、ｐＨを７．３に制御した。反応中のホルムアルデヒド濃度は、添加したホルムアルデヒドからＨＰＬＣで定量したＤ−セリンの生成量を差し引くことで求めた。反応液中のホルムアルデヒド濃度は、およそ８０ｍＭから１００ｍＭに制御されていた。反応終了後のセリンをＨＰＬＣにて分析した結果、対Ｇｌｙ収率９５モル％で、光学純度は９９．９％ｅｅであった。
【０１１７】
［実施例１２］
（高ホルムアルデヒド濃度の反応実施例）
水２８０ｇにグリシン８０ｇ、３５重量％の塩化マグネシウム６水和物を４ｇ加え溶解させた。ホルムアルデヒドを各濃度となるように添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調節した。０．３８重量％のＰＬＰを３．２ｇ加え、実施例１０で得た凍結菌体を３０ｇ加えて反応を開始した。反応中のｐＨが７．３以上となったらホルムアルデヒドを添加し、ｐＨを７．３に制御した。結果を表３にまとめて示した。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
［実施例１３］
［１３−１］（ｇｌｙＡ遺伝子破壊Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作出とＤＳＡ生産菌の作製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｇｌｙＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１６２０）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡのｇｌｙＡ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで消化することにより、それぞれ約８５０ｂｐ、７５０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５−１９１（２０００）〕をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＰｓｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理を行った後、トランスポゾンＴｎ１０由来のテトラサイクリン耐性遺伝子と連結した。
【０１２０】
こうして得られたプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｄｓｄＡ欠失株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、更にテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【０１２１】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｇｌｙＡ近傍領域の約３．６ｋｂｐの断片を増幅させ、ｇｌｙＡがテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されている株を選抜し、得られた株をＷ３１１０ｄｓｄＡ・ｇｌｙＡ欠失株と命名した。
【０１２２】
［１３−２］（ｇｌｙＡ遺伝子破壊Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの効果）
このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉをプラスミドｐＸＤＴＡ１で形質転換し、実施例１０と同じ方法で培養した。但し、フラスコ培養ではグリシンを２０ｍｇ／Ｌ添加し、培養槽での培養では、グリシンを２ｇ／Ｌ添加し、培養の途中にグリシンを分割添加したものを用いた。
実施例９と同じ方法でＬ−セリンの生成活性を調べたところＤ−セリンの光学純度は９７％であった。
【０１２３】
［実施例１４］
（金属塩類の効果）
実施例１０で得たＭＴ−１１０２８の凍結菌体１００ｇに３００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）３．５ｇを添加し、４℃にて１時間攪拌した。懸濁液１０ｇを塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化カルシウム、塩化第一鉄を各々２０ｍＭ含むｐＨ７．０の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液１０ｇに懸濁し、４℃にて１時間攪拌した。
【０１２４】
次いで前記懸濁液に、ホルムアルデヒドを０．５％となるように加え、３５℃で１時間攪拌した。前記の処理菌体液から乾燥菌体として０．２２ｇ分を測りとり、実施例１０に記載の酵素活性測定液９ｇを加えて３５℃で２０時間攪拌し、生成したＬ−セリンと残存するＤ−セリンの比率を測定した。
何れの金属塩を用いた場合もＤ−セリンの光学純度は９６％以上であった。また、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する酵素活性は何れの金属塩でも有機溶媒処理前の活性に対して５０％以上保持していた。
【０１２５】
［実施例１５］
（Ｌ−セリンデアミナーゼ発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによる光学純度を高める方法）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【０１２６】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ２８６９５）に基づいて設計した配列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【０１２７】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分３０秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【０１２８】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い、公知のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬ−セリンデアミナーゼと同じ配列であることを確認した。得られた発現プラスミドをｐＳＤＡ１と命名した。
【０１２９】
ｐＳＤＡ1を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｄｓｄＡ・ｇｌｙＡ欠失株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体を実施例１３と同じ方法で培養槽による培養を行った。
【０１３０】
実施例１２の比較例で行った反応と同じ方法で、反応液に前記の菌体を１０ｇ加えて反応を行った。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、反応液中のＤ−セリンの光学純度は９９．９％であった。
【０１３１】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、グリシンとホルムアルデヒドとからＤ−セリンを製造する方法として有用である。また、本発明の製造方法により得られるＤ−セリンは結核薬として有用なＤ−サイクロセリンの原料等の医薬中間体として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の医薬品の合成中間体として有用な化合物であることが知られている。
【０００３】
従来、ホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素としては、アリスロバクター（Arthrobacter）ｓｐ．ＤＫ−１９に由来するＤ−スレオニンアルドラーゼ（以下、「ＤＴＡ」と略記する。）が知られているに過ぎない（特許文献１：特開昭５８−１１６６９０号公報を参照）。
【０００４】
このＤＴＡは、ホルムアルデヒド及びグリシンをそれぞれ５０ｍｍｏｌ使用して３０℃で４０時間反応させた後のＤ−セリンの生成量は２．５ｍｍｏｌ（ホルムアルデヒドに対する収率は僅かに５％）であったことが報告されている。
【０００５】
これに対し、同じアリスロバクター属の微生物である、アリスロバクターｓｐ．ＤＫ−３８に由来するＤＴＡは、Ｄ−スレオニン、Ｄ−β−ヒドロキシフェニルセリン、Ｄ−β−ヒドロキシ−α−アミノ吉草酸等に反応する広い基質特異性を有しているにもかかわらず、Ｄ−セリンには反応しないことが報告されている（非特許文献１：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２４８，ｐ３８５−３９３を参照）。
【０００６】
また、キサントモナス属（Xanthomonas）由来のＤＴＡを用いることにより、グリシンとアルデヒド化合物からＤ−β−ヒドロキシアミノ酸類を製造できることが報告されているが、キサントモナス属由来のＤＴＡを用いてホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンが合成できるとの報告はなされていない（特許文献２：特開平５−１６８４８４号公報を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５８−１１６６９０号公報
【特許文献２】特開平５−１６８４８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２４８，ｐ３８５−３９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記の背景技術に鑑み、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換した形質転換体、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素、及び該酵素を利用したホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、公知のＤＴＡと類似の構造を有する未知の酵素のなかに、ホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する能力を有する酵素が存在する可能性があると考え、公知のＤＴＡのアミノ酸配列に関する情報に関する調査を行った。その結果、キサントモナス属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０５０５５）、アクロモバクター（Achromobacter）属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０２６８９２）、及びアリスロバクター属（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１０９５６）に由来するＤＴＡのアミノ酸配列に関する情報を見出した。これらのアミノ酸配列を比較検討した結果、ＤＴＡのＮ末端領域及びＣ末端領域に相当するアミノ酸配列に高い相同性を持つことを見出した。
【００１１】
本発明者らは、これらのアミノ酸配列からＮ末端領域とＣ末端領域を基にプライマーを設計し、このプライマーを用いて各種の微生物の染色体ＤＮＡからＰＣＲによる増幅を試みたところ、アクロモバクター属の微生物からホルムアルデヒドとグリシンとからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡの増幅に成功した。
【００１２】
このＤＮＡに相当するアミノ酸配列と公知のアクロモバクター属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列との相同性は約５０％程度であり、公知のアクロモバクター属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列とはかなり異なるものであった。一方、公知のキサントモナス属に由来するＤＴＡのアミノ酸配列との相同性は約９０％であった。
【００１３】
本発明者らは次に、前記の新規なＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡで形質転換された組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いてホルムアルデヒドとグリシンとを反応させてＤ−セリンの合成を試みたところ、驚くべきことに従来知られているＤＴＡとは異なり、１００ｍＭのグリシンとホルムアルデヒドから反応収率７０％以上という高収率でＤ−セリンを合成できることを見出した。
【００１４】
更に、この組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いてＤ−セリンの蓄積反応を行うと、僅かながらＬ−セリンが生成することが認められた。
【００１５】
Ｄ−セリンを医薬中間体等の高純度が要求される分野に用いる場合、Ｄ−セリンへのＬ−セリンの混入は好ましくない。Ｄ−セリンの製造時にＬ−セリンが副生することは、Ｄ−セリンの溶解度よりＤＬ−セリンの溶解度が低いことからＤ−セリンの精製収率を大幅に低下させる。
【００１６】
本発明者らは、この問題を解決するために、更に検討した結果、２価金属イオンの存在下、有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施すことでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。また、このような処理を施さなくとも反応中のホルムアルデヒド濃度を１５０ｍＭ以上に維持することでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。更に、Ｄ−セリン合成に利用するＤＳＡを生産する宿主としてＬ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を利用することでＬ−セリンの副生を抑制できることを見出した。
【００１７】
以上の知見を基に、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ
（３）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ。
【００１８】
（４）前記（３）に記載の組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
（５）形質転換される宿主細胞が微生物である前記（４）に記載の形質転換体。
（６）形質転換される微生物がＤ−セリンデアミナーゼの欠損した微生物である前記（５）に記載の形質転換体。
【００１９】
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質
【００２０】
（８）前記（４）から（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素の製造方法。
（９）前記（４）から（６）のいずれかに記載の形質転換体又はその処理物の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることを含むＤ−セリンの製造方法。
（１０）前記（７）に記載のタンパク質の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることを含むＤ−セリンの製造方法。
【００２１】
（１１）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物又はその処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドとを反応させてＤ−セリンを合成するＤ−セリンの製造方法であって、該反応の反応液中のＬ−セリンの副生をＤ−セリンに対して１．５モル％以下に抑制させる以下の（ｉ）〜（iv）の一つ以上の手段を有するＤ−セリンの製造方法。
（ｉ）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物を有機溶媒処理及び／又は加熱処理する方法、
（ii）反応液中のホルムアルデヒド濃度を、ａ）前記（ｉ）の方法により有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施す場合には２Ｍ以下に制御し、ｂ）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施さない場合には、１５０ｍＭ以上２Ｍ以下に制御する方法、
（iii）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を含有し、かつ、Ｌ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を触媒として利用する方法、
（iv）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する酵素を含有する微生物を反応液中に添加する方法。
【００２２】
（１２）有機溶媒がホルムアルデヒド、ベンズアルデヒド、ジクロロエタン及びイソプロピルアルコールから選ばれる一種以上のものである前記（１１）に記載の製造方法。
（１３）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を２価の金属イオンの存在下で行う前記（１１）又は（１２）に記載の製造方法。
（１４）２価の金属がマグネシウム、マンガン、亜鉛、ニッケル、コバルト及び鉄から選ばれる一種以上の金属である前記（１３）に記載の製造方法。
（１５）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が前記（５）又は（６）に記載の形質転換体である前記（１１）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、公知のＤＴＡを用いたＤ−セリンの製造方法に比べ、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを収率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、形質転換体から得た破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図２】図２は、精製されたＤＳＡのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する活性を有する新規な酵素をコードするＤＮＡの遺伝子取得
配列表の配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列を含み、かつ、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素（以下、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を「ＤＳＡ」と略記する。）をコードするＤＮＡは、例えば、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能なアクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）（ＡＴＣＣ９２２０）、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation）の生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手可能なアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）及びアクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）（Synonym: Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans）（ＮＢＲＣ１５１２５）から染色体ＤＮＡを抽出し、配列表の配列番号１及び２に示した塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを実施することにより得ることができる。
【００２６】
ＰＣＲを実施するに際して、若干のミスマッチを持つ遺伝子も増幅することができるように増幅時の条件を改良することが有効である。例えば、アニール温度を低めに抑える方法、ＰＣＲ反応液中にジメチルスルホキシドを５％程度添加する方法、あるいはＧＣリッチな遺伝子を増幅しやすいように工夫されたＰＣＲキット（例えばＧＣ−ＲＩＣＨ ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製））を使用する方法、更には前記の方法を組み合わせる方法などにより増幅が困難な遺伝子を増幅できることがある。
【００２７】
ＤＳＡをコードするＤＮＡの具体的な例としてアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号３に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号４に例示できる。アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号５に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号６に例示できる。アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）由来ＤＴＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号７に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号８に例示できる。
【００２８】
ＤＳＡをコードするＤＮＡとしては前記したものの他に、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＳＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればどのような生物由来であっても構わない。例えば、その生物中で機能を有していないサイレントなＤＮＡであっても単離したＤＮＡを適当な発現ベクターに連結することでＤＳＡを産生することができればそれでも構わない。
【００２９】
更に生物を特定しなくても、土壌などを直接、鋳型ＤＮＡとして配列表の配列番号１及び２の塩基配列をもつプライマーを用いたＰＣＲに付すことでＤＳＡをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００３０】
ＤＳＡをコードするＤＮＡの具体的な取得方法として、例えばＤ−セリンを含有する培地で生育する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１及び２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅したＤＮＡを例示することができる。
【００３１】
また、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列もしくは相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内でかつ、コードされる酵素の活性に影響を及ぼさない範囲内で部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res., 10, pp. 6487 (1982); Nucleic Acid Res., 13, pp. 4431 (1985); Methods in Enzymol., 100, pp. 448(1983); Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &;Sons (1987-1997); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, pp. 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, pp.488 (1985)）などを用いて、適宜欠失、置換、挿入、及び／又は付加変異を導入することにより、配列番号４、６、８の何れかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＳＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００３２】
本明細書中の、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加は、前記の出願前周知技術である部位特異的変異導入法により実施することができ、また、１もしくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異導入法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数、例えば１〜５個のアミノ酸、好ましくは１〜３個のアミノ酸を意味する。
【００３３】
ハイブリダイゼーションのための条件とは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いている条件を例示できる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【００３４】
本明細書中で用いる「配列番号３、５、７の何れかに記載の塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片」とは、配列表の配列番号３、５、７の何れかに記載の又はそれらの相補配列中の任意の少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、例えば４０、６０又は１００塩基の連続した配列を一つ又は複数選択したＤＮＡの断片のことである。
【００３５】
２．該タンパク質の遺伝子を持つ組換えＤＮＡの作製
前記のＤＳＡをコードするＤＮＡをベクターに組込むことにより組換え体ＤＮＡを得ることができる。
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示することができる。また、プラスミドとしては、例えばＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等を例示することができる。
【００３６】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＨプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。更にバチルス属細菌中で発現させるためにＮｐプロモーター（特公平８−２４５８６号公報）なども用いることができる。
【００３７】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００３８】
転写・翻訳を効率的に行うため、該タンパク質活性を有するタンパク質のＮ末端又はその一部を欠失したタンパク質と発現ベクターのコードするタンパク質のＮ末端部分を融合させたタンパク質を発現させてもよい。
【００３９】
目的とするタンパク質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４０】
クローニングの際、前記のようなベクターを、上述したＤＳＡをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば該ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、微生物等の宿主に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００４１】
３．ＤＳＡをコードするＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡによる形質転換体の作製
前記の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより、前記の組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。宿主細胞としては、微生物、例えば細菌を挙げることができ、そのようなものとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α，ＸＬ−１ＢｌｕｅなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが例示される。また、宿主細胞としてその他酵母等の微生物や昆虫細胞を利用することも可能である。
【００４２】
微生物に組換え体ＤＮＡを移入する方法としては、例えば微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００４３】
宿主細胞として、生成物であるＤ−セリンの分解を抑制する目的でＤ−セリンデアミナーゼ活性の低い微生物又はＤ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物を用いることができる。Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物の具体的な例として、例えば実施例６に記載のＤ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組換えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等が挙げられる。
【００４４】
また、Ｄ−セリン合成反応におけるＬ−セリンの生成を抑制する目的で、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の高い微生物を用いることにより生成したＬ−セリンを分解することも可能である。Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の高い微生物として実施例１５に記載のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組換えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等を用いることもできる。
【００４５】
微生物として、アラニンラセマーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ等のＬ−セリンの合成に関与する酵素活性が低い微生物又はこれらの酵素活性が欠損した微生物を用いることは、Ｌ−セリンが生成しないため好適である。
【００４６】
更に好ましくは、これらの酵素が全て欠損した微生物を宿主細胞として用いることが望ましい。
【００４７】
４．ＤＳＡの生産
前記の形質転換体を培養し、次に得られたＤＳＡを採取することにより、ＤＳＡを製造することができる。
形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換体がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４８】
炭素源としては、形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００４９】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。
【００５０】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５１】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜５０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜５日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等をそれぞれ培地に添加してもよい。
【００５３】
形質転換体は、これを含む培養液を遠心分離、ろ過等の手段を用いて分離し回収することができる。
【００５４】
形質転換体処理物は、細胞の破壊を目的として、形質転換体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理、酵素処理したもの、及びこれらの処理により得られるＤＳＡを含む画分の固定化物、形質転換体の固定化物として得ることができる。
【００５５】
なお、本発明において微生物の処理物も前記形質転換体処理物と同様の処理をしたものを指す。
【００５６】
このような形質転換体又は形質転換体処理物からＤＳＡを精製するためには、形質転換細胞を破砕し細胞破砕液をイオン交換樹脂やゲルろ過等のクロマトグラフィーによる分画や硫酸アンモニウムなどによる塩析などを組み合わせることで精製酵素を得ることができる。
【００５７】
５．Ｄ−セリンの製造方法
前記の形質転換体又はその形質転換体処理物の存在下でグリシンとホルムアルデヒドを反応させることによりＤ−セリンを製造することができる。
Ｄ−セリンの製造は、ｐＨ６．０〜９．０、温度２０〜６０℃で振盪、もしくは攪拌条件下で行うのが好ましい。
【００５８】
形質転換体又はその形質転換体処理物の使用量は、ホルムアルデヒドとグリシンとの反応が十分に進行すれば特に制限されないが、通常グリシン１ｇに対して少なくても１０ｕｎｉｔ、好ましくは５０ｕｎｉｔ以上のＤＳＡ活性となる量を添加することが望ましい。形質転換体又はその形質転換体処理物の添加方法は反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【００５９】
ＤＳＡ活性は、１μモルのＤ−セリンを１分間に合成できる能力を１ｕｎｉｔと定義する。
ＤＳＡ活性は、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭホルムアルデヒドを含むｐＨ８．０の２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液中に酵素液を加えて３０℃で保温し、Ｄ−セリンの生成量を測定して算出する。
【００６０】
反応液中のグリシンの濃度は、１００ｍＭ以上であり、好ましくは１Ｍ以上５Ｍ以下である。グリシンの添加方法については反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。
【００６１】
ホルムアルデヒドは、その気体を反応液中に供給することができるが、水溶液又はアルコール溶液として供給することもできる。また、ホルムアルデヒドの供給源としてパラホルムアルデヒドを使用することもできるが、３７％程度のホルムアルデヒドの水溶液の使用が好適である。
【００６２】
ホルムアルデヒドの添加方法としては、一括添加又は反応の進行に伴い分割又は連続的に添加する方法で行えるが、反応液中のホルムアルデヒド濃度はＤＳＡ活性を阻害しない程度の濃度に制御することが好ましい。ＤＳＡ活性を阻害しない程度の濃度とは通常５Ｍ以下、好ましくは２Ｍ以下、更に好ましくは５００ｍＭ以下、特に好ましくは３００ｍＭ以下である。
【００６３】
反応液中のホルムアルデヒド濃度を制御する方法として（１）反応液に一定速度で添加する方法、（２）ホルムアルデヒド濃度を定量し、酵素活性が失活しない程度の濃度になってから分割添加する方法、（３）パラホルムアルデヒドを添加し、パラホルムアルデヒドがホルムアルデヒドに遊離する速度以上の酵素量を反応系に添加しておくことで実質的にホルムアルデヒドによる阻害を回避する方法、（４）反応の進行に伴い反応液中に生成物のＤ−セリンが蓄積し、原料のグリシンが減少する。Ｄ−セリンとグリシンの等電点がそれぞれ、５．６８と５．９７であるため、反応の進行に伴い反応液のｐＨの低下が起こる。反応液のｐＨの低下を補正する量以上のアルカリを反応液に添加し、そのｐＨ上昇分を補正できる量のホルムアルデヒドを添加するという方法でホルムアルデヒドを添加することも可能である。
【００６４】
反応液中のＤＳＡ量を予め設定したアルカリの添加速度、即ちＤ−セリンの合成速度以上にしておけば、ホルムアルデヒドの濃度を測定するなどの煩雑な操作を用いずとも反応液中のホルムアルデヒド濃度を制御することが可能となる。
【００６５】
反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものであればよい。
【００６６】
反応液の媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【００６７】
上述の反応において、２価の金属イオンを有する化合物、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤や補酵素であるピリドキサールリン酸、アンモニウム塩等を添加することにより反応収率が向上することがある。
【００６８】
２価の金属イオンを有する化合物としては、例えば塩化マグネシウム、塩化マンガン、酢酸コバルト、硫酸第１鉄、塩化カルシウムなどが挙げられる。
これら化合物の反応液中の濃度としては通常０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭから１０ｍＭである。
【００６９】
６．反応液中のＤ−セリンの光学純度を高める方法
前記の形質転換体又はその形質転換体処理物を加熱処理して得られる処理物、又は前記の形質転換体又はその形質転換体処理物を有機溶媒で処理して得られる処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドを反応させることにより、Ｌ−セリンの副生を抑制することができる。
【００７０】
加熱処理の条件としては加熱により大幅にＤＳＡ活性を低減させず、Ｌ−セリンを生成する活性を低減又は消失させることが可能であればどのような条件でも構わない。具体的な例として、例えばｐＨ６．０から９．０、温度４０℃から７０℃で１０分間から６時間程度攪拌する方法を挙げることができる。
また、有機溶媒処理と加熱処理を組み合わせて行うことも可能である。
【００７１】
有機溶媒処理の条件としては大幅にＤＳＡ活性を低減させず、Ｌ−セリンを生成する活性を低減又は消失させることが可能であればどのような条件でも構わない。有機溶媒処理の条件としては、有機溶媒の濃度は通常２０ｍＭ以上２Ｍ以下、好ましくは２０ｍＭ以上１Ｍ以下、更に好ましくは５０ｍＭから１０００ｍＭ、特に好ましくは５０ｍＭから３００ｍＭ程度である。有機溶媒はＤＳＡ活性を大幅に低減させないものであれば制限はないが、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒド類、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類などの有機溶媒を用いることが好ましい。中でもホルムアルデヒドは酵素反応の基質であるため、最も好適である。Ｄ−セリンを添加することで該酵素反応によりホルムアルデヒドが生成するため、ホルムアルデヒドの変わりにＤ−セリンを添加する方法でも構わない。Ｄ−セリンの添加濃度としては１００ｍＭから５Ｍ程度が望ましい。
【００７２】
有機溶媒処理の温度は１０℃から５０℃の範囲であり、ｐＨは６．０から９．０の範囲が望ましい。有機溶媒処理中は、処理液のｐＨや有機溶媒濃度が均一となるように攪拌することが望ましい。
【００７３】
また、Ｄ−セリン製造の反応開始時にホルムアルデヒド濃度を高めることでＬ−セリンの生成活性を低減又は失活させることも可能である。この場合、反応中のホルムアルデヒド濃度を０．１％から５％程度で３０分間から３時間程度保った後、通常の反応を行えばよい。
【００７４】
上述の処理を行う際に、２価の金属イオンを有する化合物、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤や補酵素であるピリドキサールリン酸、アンモニウム塩等を添加することにより酵素活性が更に安定化することがある。
【００７５】
２価の金属イオンを有する化合物としては、例えば、塩化マグネシウム、塩化マンガン、酢酸コバルト、硫酸第１鉄、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００７６】
これら化合物の処理液中の濃度としては通常０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭから１０ｍＭである。
【００７７】
Ｄ−セリン合成反応終了後の反応液にＬ−セリンセアミナーゼ生産菌を加え、生成したＬ−セリンを分解させることにより最終製品であるＤ−セリンの光学純度を高めることもできる。Ｌ−セリンデアミナーゼ生産菌としてはＤ−セリンデアミナーゼを欠損した微生物を用いることが望ましい。
【００７８】
７．Ｄ−セリンの採取方法
反応液からのＤ−セリンの採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００４−２９８３４４の明細書及び／又は図面に記載された内容を包含する。
【実施例】
【００７９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、Ｄ−セリン、Ｌ−セリン及びグリシンは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件及び、酵素（ＤＳＡ及びＤＴＡ）活性の測定方法は次のとおりである。
【００８０】
（１）Ｄ−セリン及びＬ−セリンの分析条件
カラム；ＴＳＫ−ＧＥＬ ＥＮＡＮＴＩＯ Ｌ１ ４．６ｘ２５０（東ソー株式会社）
カラム温度；４５℃
ポンプ流速；０．８ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、溶離液；０．２５ｍＭ硫酸銅：メタノール＝９：１（Ｖ／Ｖ）
（２）セリン及びグリシンの分析条件
カラム；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＮＮ−８１４ ８ｘ２５０（昭和電工株式会社）
カラム温度；４０℃
溶離液；１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ３．０）
ポンプ流速；０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出はオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたポストカラム誘導体化法〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，８３，３５３−３５５（１９７３）〕を用いた。
（３）酵素活性の測定方法
１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭホルムアルデヒドを含むｐＨ８．０の２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液０．９ｍＬに菌体懸濁液を超音波破砕した酵素液を適当に希釈して０．１ｍＬを加え、３０℃で１５分間反応した。
生成したＤ−セリンをＨＰＬＣにて分析し活性を測定した。活性の単位は１分間に１μｍｏｌのＤ−セリンを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。
【００８１】
［実施例１］
（ＤＳＡをコードする遺伝子の取得）
アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００８２】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のＤＴＡ遺伝子に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【００８３】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１５秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００８４】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。
【００８５】
得られたＤＳＡをコードするＤＮＡから予想されるアミノ酸配列の分子量は何れもほぼ４０ｋＤａであった。
【００８６】
得られたアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＡＴＣＣ９２２０）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ１と命名した。
【００８７】
アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＢＲＣ１３４９５）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ２と命名した。アクロモバクター・デニトリフィカンス（ＮＢＲＣ１５１２５）由来のＤＳＡをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＡｃＤＴＡ３と命名した。
【００８８】
（形質転換体の作製）
ｐＡｃＤＴＡ１、ｐＡｃＤＴＡ２、ｐＡｃＤＴＡ３を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０１５、ＭＴ−１１０１６、ＭＴ−１１０１７と命名した。
【００８９】
各々の組換え微生物を５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコにＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が０．６になるまで培養し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）が１ｍＭとなるように添加し、更に１６時間振盪培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた菌体を５ｍＬの１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００９０】
［実施例２］
（ＤＳＡの製造法）
実施例１で作製した形質転換体の懸濁液０．５ｍＬをバイオラピュター（オリンパス社製）を用いて、氷水中で５分間破砕した。形質転換体の破砕液を遠心分離し、破砕液を調製した。破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を図１に示した。
沈殿物に１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍＬ加えて細胞残渣として同様に分析した。
【００９１】
何れの形質転換体も可溶性画分におよそ４０ｋＤａの位置に発現するタンパク質が見出され、不溶性画分には見出されなかった。この分子量はそれぞれの遺伝子から推測されるアミノ酸配列の分子量とほぼ一致した。
【００９２】
［実施例３］
（ＤＳＡの精製と精製ＤＳＡによるＤ−セリンの合成）
実施例２と同様の方法で作製したＭＴ−１１０１５の破砕液１０ｍＬを１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細胞残渣を除いた酵素液を調製した。酵素液を陰イオン交換樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｑ−ＸＬ、アマシャム社製）に吸着させ、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニアーグラジエントで溶出させた。活性画分を疎水クロマト樹脂（ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ、アマシャム社製）に吸着させ、硫酸アンモニウムで飽和させた１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニア−グラジエントで溶出させた。なお、以上の操作は、約１０℃で操作した。
【００９３】
超音波破砕液、イオン交換クロマトグラフィー処理した後の活性画分及び疎水クロマトグラフィー処理した後の活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した結果を図２に示した。精製ＤＳＡのモノマーの分子量は４００００±５０００であった。
【００９４】
１００ｍＭホルムアルデヒド、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬよりなる基質溶液に精製ＤＳＡ酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。
Ｄ−セリンの反応収率は９５％であった。
【００９５】
［実施例４］
（Ｄ−セリン合成能力とＤ−スレオニン合成能力の比較）
アルデヒド源として、１００ｍＭのホルムアルデヒド又はアセトアルデヒドを含み、１００ｍＭグリシン、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬよりなる基質溶液に実施例１で作製したＭＴ−１１０１５株の超音波破砕酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。
アルデヒド源としてホルムアルデヒドは用いたときは、収率９０％であったがアセトアルデヒドを用いたときは１０％であった。
【００９６】
［実施例５］
（ホルムアルデヒド１００ｍＭ濃度でのＤ−セリン合成反応）
ホルムアルデヒド１００ｍＭ、グリシン１００ｍＭ、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ８．０の２００ｍＭトリス塩酸緩衝液１００ｍＬよりなる基質溶液に実施例１で作製した組換え微生物の超音波破砕酵素液１５０ｕｎｉｔを加え３０℃で２０時間反応させた。結果を表１に示した。
【００９７】
【表１】
【００９８】
［実施例６］
（Ｄ−セリンデアミナーゼ欠損Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤ−セリンデアミナーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｄｓｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１６０３）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡのｄｓｄＡ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化することにより、それぞれ約９００ｂｐ、８００ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ．， Ｇｅｎｅ， ２４１， １８５−１９１ （２０００）〕をＰｓｔＩ、ＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＸｂａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理を行った後、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来のカナマイシン耐性遺伝子と連結した。
【００９９】
こうして得られたプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【０１００】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｄｓｄＡ近傍領域の約３．０ｋｂ断片を増幅させ、ｄｓｄＡがカナマイシン耐性遺伝子に置換されている株を選抜し、得られた株をＷ３１１０ｄｓｄＡ欠失株（以下ΔｄｓｄＡと略することがある）と命名した。実施例１で作製したプラスミドを用いて形質転換し、前記と同様に凍結保存した菌体を作製し、同様の反応を行ったところＤ−セリンの分解は殆ど確認できなかった。
【０１０１】
［実施例７］
（形質転換体ＭＴ−１１０１６を使用したＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
７．５ｇのグリシンと９．４ｇの０．０２６重量％のピリドキサールリン酸に蒸留水５３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した。実施例１で得たＭＴ−１１０１６の菌体懸濁液（活性として１５００ｕｎｉｔ相当）を加えた。反応温度３０℃にて２０重量％のホルムアルデヒド２０．８ｇを反応液中のホルムアルデヒド濃度をＡＨＭＴ法（衛生化学（１９７６）、Ｖｏｌ２２、ｐ３９）にて定量し、５０ｍＭから３００ｍＭとなるように添加した。反応液のｐＨは水酸化ナトリウムにてｐＨ８．０に調整した。７２時間後の反応収率は８５％に達していた。
【０１０２】
［実施例８］
（形質転換体ＭＴ−１１０１７を使用したＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
７．５ｇのグリシンと９．４ｇの０．０２６重量％のピリドキサールリン酸に蒸留水５３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した。実施例１で得たＭＴ−１１０１７菌体懸濁液（活性として１５００ｕｎｉｔ相当）を加えた。反応温度３０℃にて２０重量％のホルムアルデヒド２０．８ｇを０．８ｇ／１５分の速度で１５分間添加し、ホルムアルデヒドの添加を４５分間停止するというサイクルを繰り返して反応液に添加した。反応液のｐＨは反応中水酸化ナトリウムにてｐＨ８．０に調整した。２４時間後のＤ−セリンの反応収率は９５％に達していた。
一方、ホルムアルデヒドを一括で添加して反応させたところ反応収率は２０％であった。
【０１０３】
［実施例９］
（ホルムアルデヒド処理した形質転換体によるＤ−セリンの製造：Ｍｇ無添加による製造）
実施例１で作製したＭＴ−１１０１５の凍結菌体の溶解液にホルムアルデヒドを１００ｍＭとなるように添加し、３０℃で１時間緩やかに攪拌した。攪拌中はｐＨを８．０に水酸化ナトリウムにて調整した。該菌体験濁液を用いて実施例８と同じ反応を行った。ホルムアルデヒド処理を行わなかった場合はＬ−セリンが２モル％生成したが、ホルムアルデヒド処理を行った場合はＬ−セリンを検出できなかった。
【０１０４】
前記の反応液に６Ｎ−塩酸を加えｐＨを４．１に調整した。活性炭（５０％含水率）０．９７ｇを加え、６０℃で１時間攪拌し、ろ過により活性炭と菌体成分を除去した。次いで、ろ液を３０ｇまで濃縮し、イソプロピルアルコール１３ｇを徐々に加え氷中で１時間緩やかに攪拌しながらＤ−セリンを析出させた。晶析液をろ過し、結晶を冷却した４０％イソプロピルアルコール１３ｍＬで洗浄して乾燥させた。回収率は６０％で白色のＤ−セリン結晶が得られ、原料であるグリシンは検出されなかった。結晶の光学純度は９９．８％ｅｅであった。
【０１０５】
［実施例１０］
［１０−１］（キサントモナスのＤＴＡクローニングとベクター構築）
東京大学 分子細胞生物学研究所より入手可能なキサントモナス・オリゼー（ＩＡＭ１６５７）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【０１０６】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のキサントモナス・オリゼーのＤＴＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｅ０５０５５）に基づいて設計した配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【０１０７】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分１５秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【０１０８】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い、公知のキサントモナス・オリゼーのＤＴＡと同じ配列であることを確認した。得られた発現プラスミドをｐＸＤＴＡ１と命名した。
【０１０９】
［１０−２］（キサントモナス属のＤＴＡ発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの取得）
ｐＸＤＴＡ1を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ΔｄｓｄＡを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０２８と命名した。
また、実施例１で作製したｐＡｃＤＴＡ１、ｐＡｃＤＴＡ２、ｐＡｃＤＴＡ３を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ΔｄｓｄＡを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０１５Ｗ、ＭＴ−１１０１６Ｗ、ＭＴ−１１０１７Ｗと命名した。
【０１１０】
［１０−３］（Ｊａｒ培養による菌体の取得）
ＭＴ−１１０１５Ｗ、ＭＴ−１１０１６Ｗ、ＭＴ−１１０１７Ｗ、ＭＴ−１１０２８の組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコにＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬに接種し、３０℃にてＯＤ６６０が１．０になるまで培養した。
次いで１０Ｌ容量のＢＭＳ１０（エイブル社製）で培養を行った。培養の条件は、撹拌：７００ｒｐｍ、温度：３０℃、ｐＨ（ＮＨ３で維持）：７．２、通気：１ｖｖｍ、容量：５Ｌ、培養時間：４８時間の条件で操作した。培地は、特記しない限り、水１Ｌに対してポリペプトン（大日本製薬）７ｇ、硫酸第一鉄・７水和物０．０９ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・６水和物２ｇ、リン酸水素１カリウム２ｇ、リン酸水素２カリウム２ｇ、アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．６ｇの培地組成を用いた。
【０１１１】
接種前に、２０ｇ／Ｌの濃度となるようにグルコースを添加し、前記のバッフル付き三角フラスコの培養液５０ｍＬを接種した。前記の条件で最初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの時間を０．１ｇ／Ｌ未満となるような可変速度でグルコースを全量で２００ｇを供給した。培養液から遠心分離により菌体を集めて−２０℃にて凍結した。
【０１１２】
［１０−４］（有機溶媒処理した微生物のＬ−セリン副生抑制）
［Ｌ−セリン副生酵素活性の測定方法］
ＭＴ−１１０２８の凍結菌体６０ｇ（固形分率およそ１０％）に塩化マグネシウム・６水和物を１．０ｇ加え各種有機溶媒を所定濃度となるように加え、３５℃で１時間攪拌した。
前記の処理菌体液から乾燥菌体として０．２２ｇ分を測りとり、酵素活性測定液９ｇを加えて３５℃で２０時間攪拌し、生成したＬ−セリンと残存するＤ−セリンの比率を測定した。結果を表２にまとめて示した。
【０１１３】
（Ｌ−セリン生成活性測定液）
Ｄ−セリン１０．８４ｇ、ＰＬＰ６ｍｇをｐＨ７．０の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液で１００ｇに溶解した。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
［実施例１１］
（有機溶媒処理した微生物によるＤ−セリン合成）
実施例１０で得た湿菌体８３．４ｇ（固定分率約１０％）に塩化マグネシウム・６水和物１．８５ｇと３７重量％のホルムアルデヒド１．２ｇを加え、水を加えてホルムアルデヒド濃度０．５％に調整し、３５℃で１時間撹拌した。
【０１１６】
水２８０ｇにグリシン８０ｇと３５重量％の塩化マグネシウム６水和物４ｇ、３７重量％のホルムアルデヒド３．１ｇを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調整した。
０．３８重量％のＰＬＰ溶液を３．２ｇ添加し、前記の有機溶媒処理菌体を湿菌体として３０ｇを加えて反応を開始した。反応中にｐＨが７．３を上回ったらホルムアルデヒドを添加し、ｐＨを７．３に制御した。反応中のホルムアルデヒド濃度は、添加したホルムアルデヒドからＨＰＬＣで定量したＤ−セリンの生成量を差し引くことで求めた。反応液中のホルムアルデヒド濃度は、およそ８０ｍＭから１００ｍＭに制御されていた。反応終了後のセリンをＨＰＬＣにて分析した結果、対Ｇｌｙ収率９５モル％で、光学純度は９９．９％ｅｅであった。
【０１１７】
［実施例１２］
（高ホルムアルデヒド濃度の反応実施例）
水２８０ｇにグリシン８０ｇ、３５重量％の塩化マグネシウム６水和物を４ｇ加え溶解させた。ホルムアルデヒドを各濃度となるように添加し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調節した。０．３８重量％のＰＬＰを３．２ｇ加え、実施例１０で得た凍結菌体を３０ｇ加えて反応を開始した。反応中のｐＨが７．３以上となったらホルムアルデヒドを添加し、ｐＨを７．３に制御した。結果を表３にまとめて示した。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
［実施例１３］
［１３−１］（ｇｌｙＡ遺伝子破壊Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作出とＤＳＡ生産菌の作製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｇｌｙＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１６２０）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡのｇｌｙＡ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで消化することにより、それぞれ約８５０ｂｐ、７５０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５−１９１（２０００）〕をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＰｓｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理を行った後、トランスポゾンＴｎ１０由来のテトラサイクリン耐性遺伝子と連結した。
【０１２０】
こうして得られたプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｄｓｄＡ欠失株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、更にテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【０１２１】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをテトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｇｌｙＡ近傍領域の約３．６ｋｂｐの断片を増幅させ、ｇｌｙＡがテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されている株を選抜し、得られた株をＷ３１１０ｄｓｄＡ・ｇｌｙＡ欠失株と命名した。
【０１２２】
［１３−２］（ｇｌｙＡ遺伝子破壊Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの効果）
このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉをプラスミドｐＸＤＴＡ１で形質転換し、実施例１０と同じ方法で培養した。但し、フラスコ培養ではグリシンを２０ｍｇ／Ｌ添加し、培養槽での培養では、グリシンを２ｇ／Ｌ添加し、培養の途中にグリシンを分割添加したものを用いた。
実施例９と同じ方法でＬ−セリンの生成活性を調べたところＤ−セリンの光学純度は９７％であった。
【０１２３】
［実施例１４］
（金属塩類の効果）
実施例１０で得たＭＴ−１１０２８の凍結菌体１００ｇに３００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）３．５ｇを添加し、４℃にて１時間攪拌した。懸濁液１０ｇを塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化カルシウム、塩化第一鉄を各々２０ｍＭ含むｐＨ７．０の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液１０ｇに懸濁し、４℃にて１時間攪拌した。
【０１２４】
次いで前記懸濁液に、ホルムアルデヒドを０．５％となるように加え、３５℃で１時間攪拌した。前記の処理菌体液から乾燥菌体として０．２２ｇ分を測りとり、実施例１０に記載の酵素活性測定液９ｇを加えて３５℃で２０時間攪拌し、生成したＬ−セリンと残存するＤ−セリンの比率を測定した。
何れの金属塩を用いた場合もＤ−セリンの光学純度は９６％以上であった。また、ホルムアルデヒドとグリシンからＤ−セリンを合成する酵素活性は何れの金属塩でも有機溶媒処理前の活性に対して５０％以上保持していた。
【０１２５】
［実施例１５］
（Ｌ−セリンデアミナーゼ発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによる光学純度を高める方法）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株を５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３０℃で一夜培養した後、集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【０１２６】
ＰＣＲ用のプライマーには、公知のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎａｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ２８６９５）に基づいて設計した配列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近及び３’末端付近に、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
【０１２７】
前記微生物の染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．０２５ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、１分３０秒間からなる反応サイクルを、３５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【０１２８】
ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出した。プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い、公知のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬ−セリンデアミナーゼと同じ配列であることを確認した。得られた発現プラスミドをｐＳＤＡ１と命名した。
【０１２９】
ｐＳＤＡ1を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｄｓｄＡ・ｇｌｙＡ欠失株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体を実施例１３と同じ方法で培養槽による培養を行った。
【０１３０】
実施例１２の比較例で行った反応と同じ方法で、反応液に前記の菌体を１０ｇ加えて反応を行った。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、反応液中のＤ−セリンの光学純度は９９．９％であった。
【０１３１】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、グリシンとホルムアルデヒドとからＤ−セリンを製造する方法として有用である。また、本発明の製造方法により得られるＤ−セリンは結核薬として有用なＤ−サイクロセリンの原料等の医薬中間体として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物又はその処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドとを反応させてＤ−セリンを合成するＤ−セリンの製造方法であって、該反応の反応液中のＬ−セリンの副生をＤ−セリンに対して１．５モル％以下に抑制させる以下の（１）〜（４）の一つ以上の手段を有するＤ−セリンの製造方法。
（１）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物を有機溶媒処理及び／又は加熱処理する方法、
（２）反応液中のホルムアルデヒド濃度を、ａ）前記（１）の方法により有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施す場合には２Ｍ以下に制御し、ｂ）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施さない場合には、１５０ｍＭ以上２Ｍ以下に制御する方法、
（３）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を含有し、かつ、Ｌ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を触媒として利用する方法、
（４）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する酵素を含有する微生物を反応液中に添加する方法。
【請求項２】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、反応液中４１０ｍＭという高ホルムアルデヒド濃度下においてグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、配列番号４、６及び８に記載のアミノ酸配列並びにキサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列の共通配列を含むアミノ酸配列からなり、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、
以下の（ａ）もしくは（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ、又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）キサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）（ａ）のキサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）キサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡ；
をベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
有機溶媒がホルムアルデヒド、ベンズアルデヒド、ジクロロエタン及びイソプロピルアルコールから選ばれる一種以上のものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
有機溶媒処理及び／又は加熱処理を２価の金属イオンの存在下で行う請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
２価の金属がマグネシウム、マンガン、亜鉛、ニッケル、コバルト及び鉄から選ばれる一種以上の金属である請求項６記載の製造方法。
【請求項１】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物又はその処理物の存在下で、グリシンとホルムアルデヒドとを反応させてＤ−セリンを合成するＤ−セリンの製造方法であって、該反応の反応液中のＬ−セリンの副生をＤ−セリンに対して１．５モル％以下に抑制させる以下の（１）〜（４）の一つ以上の手段を有するＤ−セリンの製造方法。
（１）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物を有機溶媒処理及び／又は加熱処理する方法、
（２）反応液中のホルムアルデヒド濃度を、ａ）前記（１）の方法により有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施す場合には２Ｍ以下に制御し、ｂ）有機溶媒処理及び／又は加熱処理を施さない場合には、１５０ｍＭ以上２Ｍ以下に制御する方法、
（３）グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素を含有し、かつ、Ｌ−セリン合成酵素遺伝子が欠失している微生物を触媒として利用する方法、
（４）Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する酵素を含有する微生物を反応液中に添加する方法。
【請求項２】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、反応液中４１０ｍＭという高ホルムアルデヒド濃度下においてグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、配列番号４、６及び８に記載のアミノ酸配列並びにキサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列の共通配列を含むアミノ酸配列からなり、グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
グリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する活性を有する微生物が、
以下の（ａ）もしくは（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ、又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）キサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）（ａ）のキサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリシンとホルムアルデヒドからＤ−セリンを合成する酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）キサントモナス・オリゼー由来のＤ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡ；
をベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
有機溶媒がホルムアルデヒド、ベンズアルデヒド、ジクロロエタン及びイソプロピルアルコールから選ばれる一種以上のものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
有機溶媒処理及び／又は加熱処理を２価の金属イオンの存在下で行う請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
２価の金属がマグネシウム、マンガン、亜鉛、ニッケル、コバルト及び鉄から選ばれる一種以上の金属である請求項６記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１７２５８２（Ｐ２０１１−１７２５８２Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８７４７１（Ｐ２０１１−８７４７１）
【出願日】平成２３年４月１１日（２０１１．４．１１）
【分割の表示】特願２００６−５４０９７６（Ｐ２００６−５４０９７６）の分割
【原出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１１日（２０１１．４．１１）
【分割の表示】特願２００６−５４０９７６（Ｐ２００６−５４０９７６）の分割
【原出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
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