ＤＨＡエステルならびに心血管疾患の治療および予防におけるその使用
本発明は、ドコサヘキサエン酸エスエルであって、有利には下式（Ｉ）のニコチニルアルコール、下式（ＩＩ）のパンテノール、および下式（ＩＩＩ）のイノシトールからなるビタミンＢ群もしくはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、または下式（ＩＶ）のイソソルビドもしくは下式（Ｖ）の一硝酸イソソルビドとのドコサヘキサエン酸エステルに関する。本発明はまた、これらの製造方法、これらを含んでなる医薬組成物、および心血管疾患、特に、心房細動の治療または予防におけるこれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニコチニルアルコール（Ｂ３）、パンテノール（Ｂ５）もしくはイノシトール（Ｂ７）などのビタミンＢ群またはプロビタミンの中から選択されるアルコール、あるいはイソソルビドまたは一硝酸イソソルビドとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステルに関する。特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、ならびに心血管疾患の治療および予防における薬剤としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
ω−３多価不飽和脂肪酸、特に、ＥＰＡおよびＤＨＡ、有利にはエチルエステルの形態で精製および濃縮されたものは、ある種の心血管疾患の治療に、また、対応するリスク因子の調整における、それらの潜在的使用に関して知られている。特に、それらは高脂血症、高コレステロール血症および高血圧症の治療において知られている。心筋梗塞患者に対して高濃度のＥＰＡおよびＤＨＡエチルエステルを含有する処方物を用いて行った臨床試験では、罹患率、特に突然死の減少におけるそれらの有効性が示された。これらの結果は、１つには、心室の心筋細胞の細胞膜に対する安定化作用に帰され、これは梗塞後の患者またはこのような症状を再現する試験モデルにおいて見られるような、虚血筋細胞の存在下での有害な不整脈の出現を防ぐ。
【０００３】
さらに、特許出願ＷＯ２００４／０４７８３５によれば、ＤＨＡおよびＥＰＡエチルエステルが心房細動の予防に使用することができることも知られている。しかしながら、驚くことに、本願の発明は、ＤＨＡおよびＥＰＡは心房細動に対して同じ作用を持たず、ＤＨＡはＥＰＡよりも心房細動に対してより大きな作用を有することを見出した。よって、心房細動の治療において、そして疑いなくほとんどの心血管疾患の治療において、ＤＨＡとＥＰＡの混合物よりもＤＨＡ単独の方が有利である。
【０００４】
ビタミンＢ群は極めて多様な分子種に属する水溶性分子であるが、総てのものが主要機能として、いずれの場所でも、代謝において酵素活性を制御する能力を持っている。これらのビタミンは、チアミン（Ｂ１）、リボフラビン（Ｂ２）、ナイアシン（Ｂ３）、パントテン酸（Ｂ５）、ピリドキシン（Ｂ６）、ビオチン（Ｂ８）、葉酸（Ｂ９）およびシアノコバラミン（Ｂ１２）と呼ばれている。
【０００５】
ビタミンＢ群およびプロビタミンは、それらの機能に関連した利点を有している。特に、ニコチニルアルコールは、ニコチン酸（ビタミンＢ３）に由来するアルコールである。それはヒトの体内で急速にニコチン酸へと変換される。
【０００６】
ニコチン酸は、ナイアシンとも呼ばれ、トリプトファンから合成される水溶性のビタミンＢ群である。しかしながら、コレステロールおよび脂質を降下させりための有効治療用量は、身体によって合成される量よりも高い。従って、コレステロールおよび／またはトリグリセリドの降下を標的とする上で、経口サプリメントが不可欠であることが分かる。
【０００７】
作用機序の点で、ニコチン酸は脂肪組織からの遊離脂肪酸の放出を阻害して、肝臓への脂肪酸供給の低下をもたらすものと推測される。トリグリセリドへとエステル化される脂肪酸が少ないほど低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に組み込まれるものが少なくなるので、ＬＤＬコレステロールレベルは低くなる。また、ニコチン酸は、おそらくこの形態のＨＤＬコレステロールの異化作用を阻害することによって、ＨＤＬコレステロールレベルを明らかに高めることも示されている。
【０００８】
特に、ニコチン酸は強い末梢血管拡張作用を有する。よって、ニコチニルアルコールをニコチン酸へ変換した後に静脈注射すると、動脈圧の降下に好ましい血管拡張がもたらされる。
【０００９】
ニコチン酸はコレステロールおよび脂質を降下させるための療法に広く用いられている。
【００１０】
また、例えば、スタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤によるコレステロールの降下が十分であると分かっていない場合には、ニコチン酸をこれらのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤と組み合わせることができることも示されている。このような組合せは、特にスタチンによるＬＤＬコレステロールの降下およびニコチン酸によるＨＤＬコレステロールの上昇に、各化合物の作用からの利益が求められる場合に有益であり得る。さらに、ニコチン酸は混合型異脂肪血症の治療にも好適であり、従って、コレステロールおよびトリグリセリドの両レベルに影響を及ぼし得る。
【００１１】
パンテノールは、ビタミンＢ５として一般に知られている、パントテン酸のアルコール誘導体である。体内で、パンテノールはパントテン酸に変換される。その後、パントテン酸は、細胞の代謝において特に着目される化合物補酵素Ａの重要な部分となる。実際、それは脂質、炭水化物およびタンパク質の代謝に関与する。パンテノールはまた、アセチルコリンおよび腎ステロイドの形成にも関与する。パンテノールは異物の解毒および感染に対する抵抗性にも働く。
【００１２】
イノシトール（ビタミンＢ７）は、脂肪の蓄積を妨げることによって脂肪を可動化する。イノシトールはまた、抗不安作用も有し、神経系および肝臓を刺激し、血中コレステロールレベルを引き下げる。イノシトールは、セロトニン活性の増強、細胞内カルシウム濃度の維持、細胞膜電位の維持および細胞骨格の組み立てに関連している。
【００１３】
イソソルビド、特に、一硝酸イソソルビドは、強力な末梢血管拡張薬である。
【００１４】
驚くことに、本発明者らは、ニコチニルアルコール（Ｂ３）、パンテノール（Ｂ５）およびイノシトール（Ｂ７）などのビタミンＢ群またはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、またはイソソルビドもしくは一硝酸イソソルビドとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステル、特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート（ニコチニルアルコールとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステルが心血管疾患に関しても著しい活性を有することを見出した。
【００１５】
よって、本発明は、ドコサヘキサエン酸エスエルであって、有利には下式：
【化１】
のニコチニルアルコール、
下式：
【化２】
のパンテノール、および
下式：
【化３】
のイノシトール
からなるビタミンＢ群もしくはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、または
下式：
【化４】
のイソソルビドもしくは下式：
【化５】
の一硝酸イソソルビド
とのドコサヘキサエン酸エステルに関する。
【００１６】
有利には、本発明のエステルは、下記の一般式（１）：
【化６】
のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートである。
本発明はまた、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート（１）の製造方法であって、ドコサヘキサエン酸エチルエステルの、ニコチニルアルコール、パンテノール、イソソルビド、一硝酸イソソルビドおよびイノシトールの中から選択されるアルコールとの、有利にはニコチニルアルコールとのエステル交換による、方法。
【００１７】
エステル交換は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
有利には、本発明のエステル交換は触媒の存在下で行われる。有利には、このような触媒はアルカリ金属炭酸塩またはアルカリ土類炭酸塩、有利にはＫ２ＣＯ３である。有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルカリ金属炭酸塩またはアルカリ土類炭酸塩のモル比は１／１〜６／１の範囲である。有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルコールのモル比は１／１〜６／１の範囲であり、よりいっそう有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するニコチニルアルコールのモル比は１／１〜６／１の範囲である。有利には、エステル交換反応は、有利にはジオキサンまたはＴＨＦの中から選択される溶媒中で行われる（有利には、ＴＨＦが選択される）。有利には、ＴＨＦは窒素吹き込みにより脱気する。よりいっそう有利には、反応混合物を還流下で、有利には少なくとも１４時間加熱する。
【００１８】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のエステル交換法の触媒はリパーゼであり、有利にはカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼである。特に、このリパーゼは固定化形態である。有利には、このリパーゼはNovo Nordiskにより販売されているノボザイム(Novozyme)（登録商標）である。有利には、この反応は溶媒を含まない媒体中、または２−メチル−２−ブタノールまたはアセトニトリルなどの溶媒中、有利には、ニコチニルアルコールの場合には溶媒を含まない媒体中で、パンテノールの場合には溶媒中で行う。有利には、イノシトールの場合、使用溶媒は１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムＢＦ４または１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムＣ（ＣＮ）２などのイオン性極性溶媒である。有利には、この反応は室温より高い温度、有利には６０℃で行う。
【００１９】
有利には、エタノールは反応中に、有利には真空下または窒素吹き込みにより、いっそうより有利には窒素吹き込みにより除去する。このようにすれば、変換率が上昇し、反応が加速化され、副次的加水分解反応が排除される。
【００２０】
有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルコールのモル比は１〜５の間、有利には１．５〜４．５の間である。
【００２１】
有利には、この反応は１時間〜１００時間の間、有利には１時間〜７２時間の間、有利には１時間〜４８時間の間、いっそうより有利には１時間〜３時間の間行う。
【００２２】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、エステル交換反応は無水溶媒中で、または例えば塩かリチウム、ＭｇＣｌ２もしくはシリカゲルなどの水捕捉剤の存在下、非無水溶媒中で、または乾燥雰囲気下、溶媒無しで行う。このようにすれば、副次的加水分解反応が排除される。
【００２３】
有利には、エステル交換反応は、純粋なドコサヘキサエン酸エチルエステル（少なくとも９５％の純度、市販されているか、またはエチルエステル脂肪酸の混合物から、当業者に周知の方法によって精製される）を用いて、あるいは少なくとも７０％モルのＤＨＡエチルエステルを含有する混合物を用いて行う。使用するＤＨＡエチルエステルが混合物である場合には、エステル交換反応の後に得られたエステルを精製することが勧められる。
【００２４】
本発明はまた、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートと少なくとも１種類の薬学上許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳類に投与するために処方することができる。用量は治療法および対象とする疾病によって異なる。これらの組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸経路によって投与されるように調製される。この場合、有効成分は単位投与形または従来の医薬ビヒクルとの混合物として動物またはヒトに投与することができる。好適な単位用量投与形としては、錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口溶液または懸濁液、舌下および経口投与形、皮下、局所、筋肉内、静脈内、鼻腔内または眼内投与形、および直腸投与形が挙げられる。
【００２６】
固形組成物が錠剤形態で調製される場合、主要な有効成分をゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム、シリカまたは類似体などの医薬ビヒクルと混合する。錠剤はスクロースまたは他の好適な材料でコーティングすることもできるし、あるいはそれらが活性の遅延または持続を示し、かつ、所定量の有効成分を継続的に放出するように処理することもできる。
【００２７】
ゼラチンカプセル製剤は、有効成分と希釈剤を混合した後、得られた混合物をゼラチン軟カプセルまたは硬カプセルに充填することにより得られる。
【００２８】
シロップまたはエリキシル形態の製剤は、有効成分を甘味剤、防腐剤ならびに香味剤および好適な着色剤とともに含み得る。
【００２９】
水に分散可能な散剤または顆粒剤は、有効成分を、分散剤、湿潤剤または沈殿防止剤、ならびに矯味剤または甘味剤との混合物として含み得る。
【００３０】
坐剤は、例えばカカオバターまたはポリエチレングリコールなどの直腸温度で融解する結合剤を用いて調製され、直腸投与に使用される。
【００３１】
非経口（静脈内、筋肉内など）、鼻腔内または眼内投与に用いるものとしては、薬学上適合する分散剤および／または湿潤を含有する剤水性懸濁液、等張性生理食塩水または無菌注射溶液がある。
【００３２】
有効成分はまた、所望により１種類以上の添加剤とともにマイクロカプセルの形態で処方することもできる。
【００３３】
有利には、本発明の医薬組成物は、経口または静脈内経路により、心筋梗塞後の処置の場合は有利には静脈内経路により投与するためのものである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、補足作用または可能性としての相乗作用を生じる他の有効成分を含むことができる。有利には、この医薬組成物はＥＰＡエステルを含む。
【００３５】
本発明はまた、薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００３６】
本発明はまた、心血管疾患、有利には心調律に関する疾患（好ましくは、心調律異常または伝導異常）、好ましくは、心房および／または心室不整脈、頻脈および／または細動の中から選択されるものの予防および／または治療のため；心筋細胞の電気伝導異常によって現れる疾病の予防および／または治療のため；有利には高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高血圧症、高脂血症、異脂肪血症、有利には混合型異脂肪血症、および／または血液凝固におけるＶＩＩ因子の活性亢進の中から選択される心血管疾患の多くのリスク因子の予防および／または治療のため；心房および／または心室不整脈、頻脈、細動および／または心筋梗塞により誘発される電気伝導異常などの心血管疾患に由来する調律異常、有利には突然死の治療および／または一次もしくは二次予防のため；および／または心筋梗塞後の治療のための薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００３７】
調律異常は、特に、洞性頻脈などの洞房結節異常；心房期外収縮、規則的心房性頻脈または心房細動などの心房不整脈；発作性接合部頻脈またはウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群などの接合部頻脈；あるいは若年性心室収縮、心室頻脈または心室細動などの心室不整脈を含む。
【００３８】
伝導異常は、特に、徐脈を含む。
【００３９】
最後に、本発明は、心房細動の予防および／または治療のための薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００４０】
特定の理論に縛られるものではないが、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートは、体内で、エステラーゼ活性を介して、アルコールおよびＤＨＡ、特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの場合には、ニコチニルアルコールおよびＤＨＡを放出することが明らかである。よって、本発明のドコサヘキサエン酸エステルは、ＤＨＡとアルコールの混合物と同様の活性を有することが明らかである。よって、このアルコールがビタミンＢ群またはプロビタミンである場合には、本発明のドコサヘキサエン酸エステルはＤＨＡとビタミンＢ群またはプロビタミンの混合物と同様の効果を有すると考えられる。また、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの場合、ニコチニルアルコールは体内でニコチン酸へ変換されることも明らかである。よって、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートは、ＤＨＡとニコチン酸の混合物と同様の活性を有することが明らかである。ニコチン酸の血管拡張作用の利点は、特にピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの静脈内注射の場合に、ニコチニルアルコールがニコチン酸へ変換された後、末梢において最も満足のいくＤＨＡの分布が得られることである。
【００４１】
本発明は、以下の図面および実施例を参照すれば、よりよく理解できる。
【００４２】
図１は、６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下でエステル交換反応を行った際のＤＨＡ−ＥＥ消費％を、実施例３．１（開放試験管）、３．２（真空下）および３．３（窒素吹き込み下）に関して、時間の関数として表したものである。
【００４３】
以下に非限定例を示す。
【実施例】
【００４４】
実施例１：Ｋ２ＣＯ３を用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成
１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）のエチルドコサヘキサエノエート（純度９５％以上；Interchimにより提供）を、１．５３ｇ（１１ｍｍｏｌ）の粉砕Ｋ２ＣＯ３および１．０６ｍｌ（１０．９ｍｍｏｌ）のニコチニルアルコール（純度９８％以上；Acrosにより提供）の存在下、窒素吹き込みにより脱気した５ｍｌのＴＨＦ中に入れる。この反応混合物を７時間、還流下で加熱した後、０．７６ｇ（５．５ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３を加え、加熱を７時間続ける。
【００４５】
冷却後、反応混合物を水に取り、次いで、酢酸エチルで抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、濃縮乾固した。得られた残渣をシリカフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２→９０／１０ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル勾配、１５分）により精製する。透明な油状物が単離される（０．８４ｇ、収率７１％）。
シリカゲルＴＬＣ６０Ｆ ２５４ Ｍｅｒｃｋ、９０／１０ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ、Ｒｆ＝０．３５。
【００４６】
実施例２：リパーゼを用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成
反応は総て、各酵素に最適な温度で、不連続混合反応器（磁気混合）で行う。
【００４７】
用いた生成物は次の通りである；
ＤＨＡエチルエステル（ＤＨＡ−ＥＥ）中に７０％まで濃縮されたエチルエステル混合物（Croda Chemical Ltd.により販売）（以下、「７０％ＤＨＡ−ＥＥエステル混合物」と呼ぶ）；
Novo Nordiskにより販売されているカンジダ・アンタルクチカの固定化形態のリパーゼ、ノボザイム（登録商標）；
ニコチニルアルコール。
反応混合物は次のいずれかである：
基質のみを用いる、溶媒を用いない媒体；または
種々の溶媒を用いる有機媒体。
【００４８】
この有機媒体に用いられる溶媒は、
多価不飽和脂肪酸エステルなどの疎水性化合物とニコチニルアルコールなどの親水性化合物の同時可溶化を可能とする中程度の極性の溶媒２−メチル−２−ブタノール（２Ｍ２Ｂ）または
２Ｍ２Ｂと同じ理由で、アセトニトリル
である。
【００４９】
反応条件を下表１にまとめる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
各条件で２００ｍｇのノボザイム（登録商標）とともに６０℃でインキュベートした。開放系（換気フード下）で行った２Ｍ２Ｂの反応を６０℃で２００ｍｇのノボザイム（登録商標）を用いて試験した。
【００５２】
反応が完了するまで、定期的に５００μｌのサンプルを採取する。反応プロセスを、１３，０００ｒｐｍで５分遠心心分離を行うことによりクエンチし、これにより媒体から固定化酵素が除去される。サンプルは総て、分析まで４℃で保存する。
【００５３】
酵素を含まない対照反応および補助基質（ニコチニルアルコール）を含まない対照反応を並行して行う。
【００５４】
分析は、次のパラメーターに従い、２つのＨＰＬＣ法（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズの仕打ちを使用）を使用して行う。
【００５５】
方法１
Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
温度：４０℃
流速：１ｍｌ／分
溶出剤：０．０２％メタノール／酢酸
検出；屈折率測定
測定時間：１５分
【００５６】
方法２
Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
温度：４０℃
流速：３ｍｌ／分
溶出剤：５０／５０アセトニトリル／アセトン
検出：屈折率測定
測定時間：１５分
【００５７】
種々の反応中に採取したサンプルを、方法１では０．０２％メタノール／酢酸混合物で、方法２ではアセトンで、１００ｍＭ未満の濃度まで予め希釈する。
結果および考察：
【００５８】
エステル交換反応の際に２種類の種が見られる。１つは、分析条件下で４．１５分に溶出し、エステル加水分解産物に相当し、もう１つは４．８５分に溶出する。後者の化合物は７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルとニコチニルアルコールの間のエステル交換の産物に相当する。ここで、ニコチニルアルコールは１つの第１級ヒドロキシルのみを有するので、ただ１つの産物であると予測される。
【００５９】
種々の反応条件下で得られた変換率％を下表２に示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
変換率％は、反応が開放系で行われた場合に高く、生成エタノールは蒸発し、反応平衡はＤＨＥ−ニコチニルアルコールの合成側へ傾く。これらのエステル交換反応には反応混合物の著しい黒化を伴う。
【００６２】
加水分解産物は、反応溶媒として２Ｍ２Ｂを用いる場合が明らかに好ましい。しかしながら、溶媒を用いない媒体でも弱い加水分解反応が存在する。従って、用いたニコチニルアルコール中に水も存在していこと、および周囲水分がこの副反応を起こすことが明らかである。
【００６３】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルの、ニコチニルアルコールとのエステル交換反応の実現可能性は実証され、このような反応は、特に反応混合物から反応中に生じたエタノールを排除すると、９０％近く、またはそれを超える有利な変換率を示す。しかしながら、用いた溶媒中の水の存在および／または周囲の水分による副次的加水分解反応がこれらの合成を妨げる。
【００６４】
よって、見られる副次的加水分解反応を回避する試みが重要であるのは明らかである。例えば、完全に無水の溶媒を使用することができる。加水分解の可能性を排除するために水捕捉剤（例えば、塩化リチウム、ＭｇＣｌ２またはシリカゲル）の存在下でこれらの同じ反応を行うこともできる。
【００６５】
ニコチニルアルコール−ＤＨＡエステル合成反応では、反応中に生じたエタノールが反応を制限する要素であることが明らかである。それを排除すると、反応平衡が意図するエステルの合成側へ傾く。よって、特に、減圧下で合成を行う場合には、この排除を至適化することが勧められる。これによりエタノールの迅速な蒸発が可能となり、反応速度が高まる。
【００６６】
実施例３：リパーゼを用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成；エステル交換の至適化；反応中に生じたエタノールの蒸発；および酸化褐変の除去
６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下、溶媒を用いない媒体中で、同じ出発品（ニコチニルアルコール、７０％ＤＨＡ−ＥＥエステル混合物、ノボザイム（登録商標））を用い、実施例２と同様の合成反応を行った。用いた反応器は実施例２と同じであり、分析方法も同様である。
【００６７】
実施例３．１：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が開放容器（開放試験管）で行われたことだけである。
結果（図１）：
エステル交換反応は「遅く」、計８０時間近くかかる。酸化褐変が見られる。「強い」副次的加水分解も見られる。
【００６８】
実施例３．２：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が真空下で行われたことだけである。
結果（図１）：
実施例３．１と比べて反応の加速化が見られるが、依然として「遅く」、計４８時間近くかかる。
さらに、酸化褐変および副次的加水分解が見られる。
【００６９】
実施例３．３：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が窒素吹き込み下で行われたことである。
結果（図１）：
反応中に生じたエタノールの即時排出と混合物の改良により、反応の極めて著しい加速が見られ、計３時間未満となる。
酸化渇変は存在しないことが示される。
副次的加水分解は著しく低下する。
【００７０】
実施例４：リパーゼを用いたＤＨＡエステルのパンテノールとの合成
試験および分析条件は、次の違い以外、実施例２と同様である：
反応条件を下表３にまとめる。
【００７１】
【表３】
【００７２】
結果および考察：
分析条件下で３．９分と４．１４分に２種が溶出する。パンテノールは２つの第１級アルコールを示す。よって、数種の産物（３つの極大）の産生が考えられる。しかしながら、補助基質（パンテノール）を含まない対照では、４．１４分にピークが見られる。このように、該ピークは使用する溶媒中の水の存在に関連したエチルエステルの加水分解に相当するものであろう。この反応は酵素の存在下でのみ見られる。
【００７３】
結論として、パンテノール−ＤＨＡエステル合成に相当するのは最初のピークだけである。
【００７４】
種々の反応条件下で得られた変換率％を下表４にまとめる。
【００７５】
【表４】
【００７６】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルの変換率％は、反応が開放系で行われた場合に上昇することが明らかである。実際、この条件下では、反応中に生じたエタノールは蒸発する。よって、反応平衡はパンテノール−ＤＨＥエステルの合成側へ傾く。さらに、これらの変換値は、２Ｍ２Ｂ溶媒の同時蒸発（媒体濃縮効果）によるものと明らかに理解される。また、これらのエステル交換反応には反応混合物の著しい黒化も伴う。
【００７７】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルのパンテノールとのエステル交換反応の実現可能性は実証され、このような反応は、特に反応混合物から反応中に生じたエタノールを排除すると、９０％近く、またはそれを超える有利な変換率を示す。しかしながら、用いた溶媒中の水の存在および／または周囲の水分による副次的加水分解反応がこれらの合成を妨げる。
【００７８】
よって、見られる副次的加水分解反応を回避する試みが重要であるのは明らかである。例えば、完全に無水の溶媒を使用することができる。加水分解の可能性を排除するために水捕捉剤（例えば、塩化リチウム、ＭｇＣｌ２またはシリカゲル）の存在下でこれらの同じ反応を行うこともできる。
【００７９】
パンテノール−ＤＨＡエステル合成反応では、反応中に生じたエタノールが反応を制限する要素であることが明らかである。それを排除すると、反応平衡が意図するエステルの合成側へ傾く。よって、特に、減圧下で合成を行う場合には、この排除を至適化することが勧められる。これによりエタノールの迅速な蒸発が可能となり、反応速度が高まる。
【００８０】
実施例５：超高速カリウム電流に対する、従って心房細動に対するＥＰＡおよびＤＨＡの作用の結果の比較
心臓活動電位は興奮性心細胞の基本的電気単位であり、活動電位の種々の相を担う数種のイオンチャネルの活動を表す。活動電位の種類の違いは心臓領域の違いに相当し、従って、これらの領域における隔離された、また、協調した活動が可能である。このため、ＫＣＮＡ５遺伝子によってコードされているＫｖ１．５カリウムチャネルは心耳組織にのみ発現し、心房活動電位の再分極に作用する超高速カリウム電流（ＩＫｕｒ）を担う。このＫｖ１．５の局在性の高い発現は、実際に、心房活動電位に変化が見られる病態である心房細動の処置の標的選択肢である。
【００８１】
従って、ＩＫｕｒに対するＤＨＡおよびＥＰＡの作用を検討した。このため、Ｋｖ１．５チャネルのヒトイソ型（ｈＫｖ１．５）を安定的にＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）細胞にトランスフェクトし、これらのチャネルの活動から得られた電流をホールセルパッチクランプ法（whole-cell patch clamp）法を用いて検討した。
材料および方法
【００８２】
細胞系統の維持
ＨＥＫ２９３−ｈＫｖ１．５細胞を、標準的条件（３７℃、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２のインキュベーター）下、ファルコン(Falcon)ディッシュ内で、集密度８０％まで増殖させた。次に、これらを取り出し、次の培養培地：ＤＭＥＭ(Invitrogen)；１０％ウシ胎児血清(Invitrogen)；１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５ｍｇ／ｍｌグルタミン(Invitrogen)の混合物；および選択抗生物質としての１．２５ｍｇ／ｍｌゲネチシン(Geneticin)（登録商標）を含む３５ｍｍのペトリ皿で培養した。
【００８３】
電気生理学
ＩＫｕｒを、周囲温度（１９〜２２℃）でホールセルパッチクランプ法を用いて調べた。ピペット媒体としては、１２５ｍＭ Ｋ−アスパラギン酸塩、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３（ＫＯＨ）を含む。細胞外媒体としては、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ Ｄ（＋）−グルコース、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４（ＮａＯＨ）を含む。
【００８４】
ＩＫｕｒを、−８０ｍＶの保持電位から−５０ｍＶの再分極まで、１５秒ごとに３００ｍｓ、＋６０ｍＶ脱分極性パルスにより誘導する。この電流ピークの大きさは、最初の１００ｍｓの脱分極性パルス中に得られた最大電流から確立される。パルスの終了時における電流の大きさは、最後の２０ｍｓの脱分極性パルス中に測定される。
【００８５】
試薬
ＤＨＡおよびＥＰＡはSigmaから供給されている。エタノールで保存溶液（１０ｍＭ）を作製し、溶媒の終濃度を０．２５％とする。
結果：
結果を下表５にまとめる。
【００８６】
【表５】
【００８７】
ＥＰＡはＩＫｕｒピークの大きさを若干低下させる（最大阻害１７．５±６．４％、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５、１０μＭ、パルス終了時の電流の大きさ（６１．６±７．３％、ｎ＝５、ｐ＜０．０５、２５μＭ）。
【００８８】
ＤＨＡはＩＫｕｒピークの大きさを最大５８．１±１３．６％（ｎ＝５、ｐ＜０．００５）まで阻害し、パルス終了時の電流の大きさを、２５μＭにて、８６．５±３．４％（ｎ＝５、ｐ＜０．００５）まで阻害する。
【００８９】
結論：
これらの結果は、ＤＨＡの適用が、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされたヒトＫｖ１．５チャネルの超高速カリウム電流（ＩＫｕｒ）を、ＥＰＡよりも強く、かつ、濃度依存的に阻害することを示す。ＤＨＡパルス終了時に優先的に作用するが、このことはＫｖ１．５チャネルの不活性化に対する作用を示唆する。さらに、この作用はＩＫｕｒピークの低下を伴い（ＥＰＡで見られたものと対照的）、ＤＨＡによるＩＫｕｒの阻害を増強する。
【００９０】
ＩＫｕｒに対するこれらの作用は心房細動に対するＤＨＡの有益な作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下でエステル交換反応を行った際のＤＨＡ−ＥＥ消費％を、実施例３．１（開放試験管）、３．２（真空下）および３．３（窒素吹き込み下）に関して、時間の関数として表したものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニコチニルアルコール（Ｂ３）、パンテノール（Ｂ５）もしくはイノシトール（Ｂ７）などのビタミンＢ群またはプロビタミンの中から選択されるアルコール、あるいはイソソルビドまたは一硝酸イソソルビドとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステルに関する。特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、ならびに心血管疾患の治療および予防における薬剤としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
ω−３多価不飽和脂肪酸、特に、ＥＰＡおよびＤＨＡ、有利にはエチルエステルの形態で精製および濃縮されたものは、ある種の心血管疾患の治療に、また、対応するリスク因子の調整における、それらの潜在的使用に関して知られている。特に、それらは高脂血症、高コレステロール血症および高血圧症の治療において知られている。心筋梗塞患者に対して高濃度のＥＰＡおよびＤＨＡエチルエステルを含有する処方物を用いて行った臨床試験では、罹患率、特に突然死の減少におけるそれらの有効性が示された。これらの結果は、１つには、心室の心筋細胞の細胞膜に対する安定化作用に帰され、これは梗塞後の患者またはこのような症状を再現する試験モデルにおいて見られるような、虚血筋細胞の存在下での有害な不整脈の出現を防ぐ。
【０００３】
さらに、特許出願ＷＯ２００４／０４７８３５によれば、ＤＨＡおよびＥＰＡエチルエステルが心房細動の予防に使用することができることも知られている。しかしながら、驚くことに、本願の発明は、ＤＨＡおよびＥＰＡは心房細動に対して同じ作用を持たず、ＤＨＡはＥＰＡよりも心房細動に対してより大きな作用を有することを見出した。よって、心房細動の治療において、そして疑いなくほとんどの心血管疾患の治療において、ＤＨＡとＥＰＡの混合物よりもＤＨＡ単独の方が有利である。
【０００４】
ビタミンＢ群は極めて多様な分子種に属する水溶性分子であるが、総てのものが主要機能として、いずれの場所でも、代謝において酵素活性を制御する能力を持っている。これらのビタミンは、チアミン（Ｂ１）、リボフラビン（Ｂ２）、ナイアシン（Ｂ３）、パントテン酸（Ｂ５）、ピリドキシン（Ｂ６）、ビオチン（Ｂ８）、葉酸（Ｂ９）およびシアノコバラミン（Ｂ１２）と呼ばれている。
【０００５】
ビタミンＢ群およびプロビタミンは、それらの機能に関連した利点を有している。特に、ニコチニルアルコールは、ニコチン酸（ビタミンＢ３）に由来するアルコールである。それはヒトの体内で急速にニコチン酸へと変換される。
【０００６】
ニコチン酸は、ナイアシンとも呼ばれ、トリプトファンから合成される水溶性のビタミンＢ群である。しかしながら、コレステロールおよび脂質を降下させりための有効治療用量は、身体によって合成される量よりも高い。従って、コレステロールおよび／またはトリグリセリドの降下を標的とする上で、経口サプリメントが不可欠であることが分かる。
【０００７】
作用機序の点で、ニコチン酸は脂肪組織からの遊離脂肪酸の放出を阻害して、肝臓への脂肪酸供給の低下をもたらすものと推測される。トリグリセリドへとエステル化される脂肪酸が少ないほど低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に組み込まれるものが少なくなるので、ＬＤＬコレステロールレベルは低くなる。また、ニコチン酸は、おそらくこの形態のＨＤＬコレステロールの異化作用を阻害することによって、ＨＤＬコレステロールレベルを明らかに高めることも示されている。
【０００８】
特に、ニコチン酸は強い末梢血管拡張作用を有する。よって、ニコチニルアルコールをニコチン酸へ変換した後に静脈注射すると、動脈圧の降下に好ましい血管拡張がもたらされる。
【０００９】
ニコチン酸はコレステロールおよび脂質を降下させるための療法に広く用いられている。
【００１０】
また、例えば、スタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤によるコレステロールの降下が十分であると分かっていない場合には、ニコチン酸をこれらのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤と組み合わせることができることも示されている。このような組合せは、特にスタチンによるＬＤＬコレステロールの降下およびニコチン酸によるＨＤＬコレステロールの上昇に、各化合物の作用からの利益が求められる場合に有益であり得る。さらに、ニコチン酸は混合型異脂肪血症の治療にも好適であり、従って、コレステロールおよびトリグリセリドの両レベルに影響を及ぼし得る。
【００１１】
パンテノールは、ビタミンＢ５として一般に知られている、パントテン酸のアルコール誘導体である。体内で、パンテノールはパントテン酸に変換される。その後、パントテン酸は、細胞の代謝において特に着目される化合物補酵素Ａの重要な部分となる。実際、それは脂質、炭水化物およびタンパク質の代謝に関与する。パンテノールはまた、アセチルコリンおよび腎ステロイドの形成にも関与する。パンテノールは異物の解毒および感染に対する抵抗性にも働く。
【００１２】
イノシトール（ビタミンＢ７）は、脂肪の蓄積を妨げることによって脂肪を可動化する。イノシトールはまた、抗不安作用も有し、神経系および肝臓を刺激し、血中コレステロールレベルを引き下げる。イノシトールは、セロトニン活性の増強、細胞内カルシウム濃度の維持、細胞膜電位の維持および細胞骨格の組み立てに関連している。
【００１３】
イソソルビド、特に、一硝酸イソソルビドは、強力な末梢血管拡張薬である。
【００１４】
驚くことに、本発明者らは、ニコチニルアルコール（Ｂ３）、パンテノール（Ｂ５）およびイノシトール（Ｂ７）などのビタミンＢ群またはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、またはイソソルビドもしくは一硝酸イソソルビドとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステル、特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート（ニコチニルアルコールとのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステルが心血管疾患に関しても著しい活性を有することを見出した。
【００１５】
よって、本発明は、ドコサヘキサエン酸エスエルであって、有利には下式：
【化１】
のニコチニルアルコール、
下式：
【化２】
のパンテノール、および
下式：
【化３】
のイノシトール
からなるビタミンＢ群もしくはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、または
下式：
【化４】
のイソソルビドもしくは下式：
【化５】
の一硝酸イソソルビド
とのドコサヘキサエン酸エステルに関する。
【００１６】
有利には、本発明のエステルは、下記の一般式（１）：
【化６】
のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートである。
本発明はまた、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート（１）の製造方法であって、ドコサヘキサエン酸エチルエステルの、ニコチニルアルコール、パンテノール、イソソルビド、一硝酸イソソルビドおよびイノシトールの中から選択されるアルコールとの、有利にはニコチニルアルコールとのエステル交換による、方法。
【００１７】
エステル交換は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
有利には、本発明のエステル交換は触媒の存在下で行われる。有利には、このような触媒はアルカリ金属炭酸塩またはアルカリ土類炭酸塩、有利にはＫ２ＣＯ３である。有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルカリ金属炭酸塩またはアルカリ土類炭酸塩のモル比は１／１〜６／１の範囲である。有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルコールのモル比は１／１〜６／１の範囲であり、よりいっそう有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するニコチニルアルコールのモル比は１／１〜６／１の範囲である。有利には、エステル交換反応は、有利にはジオキサンまたはＴＨＦの中から選択される溶媒中で行われる（有利には、ＴＨＦが選択される）。有利には、ＴＨＦは窒素吹き込みにより脱気する。よりいっそう有利には、反応混合物を還流下で、有利には少なくとも１４時間加熱する。
【００１８】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のエステル交換法の触媒はリパーゼであり、有利にはカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼである。特に、このリパーゼは固定化形態である。有利には、このリパーゼはNovo Nordiskにより販売されているノボザイム(Novozyme)（登録商標）である。有利には、この反応は溶媒を含まない媒体中、または２−メチル−２−ブタノールまたはアセトニトリルなどの溶媒中、有利には、ニコチニルアルコールの場合には溶媒を含まない媒体中で、パンテノールの場合には溶媒中で行う。有利には、イノシトールの場合、使用溶媒は１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムＢＦ４または１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムＣ（ＣＮ）２などのイオン性極性溶媒である。有利には、この反応は室温より高い温度、有利には６０℃で行う。
【００１９】
有利には、エタノールは反応中に、有利には真空下または窒素吹き込みにより、いっそうより有利には窒素吹き込みにより除去する。このようにすれば、変換率が上昇し、反応が加速化され、副次的加水分解反応が排除される。
【００２０】
有利には、ＤＨＡエチルエステルに対するアルコールのモル比は１〜５の間、有利には１．５〜４．５の間である。
【００２１】
有利には、この反応は１時間〜１００時間の間、有利には１時間〜７２時間の間、有利には１時間〜４８時間の間、いっそうより有利には１時間〜３時間の間行う。
【００２２】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、エステル交換反応は無水溶媒中で、または例えば塩かリチウム、ＭｇＣｌ２もしくはシリカゲルなどの水捕捉剤の存在下、非無水溶媒中で、または乾燥雰囲気下、溶媒無しで行う。このようにすれば、副次的加水分解反応が排除される。
【００２３】
有利には、エステル交換反応は、純粋なドコサヘキサエン酸エチルエステル（少なくとも９５％の純度、市販されているか、またはエチルエステル脂肪酸の混合物から、当業者に周知の方法によって精製される）を用いて、あるいは少なくとも７０％モルのＤＨＡエチルエステルを含有する混合物を用いて行う。使用するＤＨＡエチルエステルが混合物である場合には、エステル交換反応の後に得られたエステルを精製することが勧められる。
【００２４】
本発明はまた、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートと少なくとも１種類の薬学上許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳類に投与するために処方することができる。用量は治療法および対象とする疾病によって異なる。これらの組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸経路によって投与されるように調製される。この場合、有効成分は単位投与形または従来の医薬ビヒクルとの混合物として動物またはヒトに投与することができる。好適な単位用量投与形としては、錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口溶液または懸濁液、舌下および経口投与形、皮下、局所、筋肉内、静脈内、鼻腔内または眼内投与形、および直腸投与形が挙げられる。
【００２６】
固形組成物が錠剤形態で調製される場合、主要な有効成分をゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム、シリカまたは類似体などの医薬ビヒクルと混合する。錠剤はスクロースまたは他の好適な材料でコーティングすることもできるし、あるいはそれらが活性の遅延または持続を示し、かつ、所定量の有効成分を継続的に放出するように処理することもできる。
【００２７】
ゼラチンカプセル製剤は、有効成分と希釈剤を混合した後、得られた混合物をゼラチン軟カプセルまたは硬カプセルに充填することにより得られる。
【００２８】
シロップまたはエリキシル形態の製剤は、有効成分を甘味剤、防腐剤ならびに香味剤および好適な着色剤とともに含み得る。
【００２９】
水に分散可能な散剤または顆粒剤は、有効成分を、分散剤、湿潤剤または沈殿防止剤、ならびに矯味剤または甘味剤との混合物として含み得る。
【００３０】
坐剤は、例えばカカオバターまたはポリエチレングリコールなどの直腸温度で融解する結合剤を用いて調製され、直腸投与に使用される。
【００３１】
非経口（静脈内、筋肉内など）、鼻腔内または眼内投与に用いるものとしては、薬学上適合する分散剤および／または湿潤を含有する剤水性懸濁液、等張性生理食塩水または無菌注射溶液がある。
【００３２】
有効成分はまた、所望により１種類以上の添加剤とともにマイクロカプセルの形態で処方することもできる。
【００３３】
有利には、本発明の医薬組成物は、経口または静脈内経路により、心筋梗塞後の処置の場合は有利には静脈内経路により投与するためのものである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、補足作用または可能性としての相乗作用を生じる他の有効成分を含むことができる。有利には、この医薬組成物はＥＰＡエステルを含む。
【００３５】
本発明はまた、薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００３６】
本発明はまた、心血管疾患、有利には心調律に関する疾患（好ましくは、心調律異常または伝導異常）、好ましくは、心房および／または心室不整脈、頻脈および／または細動の中から選択されるものの予防および／または治療のため；心筋細胞の電気伝導異常によって現れる疾病の予防および／または治療のため；有利には高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高血圧症、高脂血症、異脂肪血症、有利には混合型異脂肪血症、および／または血液凝固におけるＶＩＩ因子の活性亢進の中から選択される心血管疾患の多くのリスク因子の予防および／または治療のため；心房および／または心室不整脈、頻脈、細動および／または心筋梗塞により誘発される電気伝導異常などの心血管疾患に由来する調律異常、有利には突然死の治療および／または一次もしくは二次予防のため；および／または心筋梗塞後の治療のための薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００３７】
調律異常は、特に、洞性頻脈などの洞房結節異常；心房期外収縮、規則的心房性頻脈または心房細動などの心房不整脈；発作性接合部頻脈またはウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群などの接合部頻脈；あるいは若年性心室収縮、心室頻脈または心室細動などの心室不整脈を含む。
【００３８】
伝導異常は、特に、徐脈を含む。
【００３９】
最後に、本発明は、心房細動の予防および／または治療のための薬剤として用いられる、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエート、または本発明の医薬組成物に関する。
【００４０】
特定の理論に縛られるものではないが、本発明のドコサヘキサエン酸エステル、特に、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートは、体内で、エステラーゼ活性を介して、アルコールおよびＤＨＡ、特に、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの場合には、ニコチニルアルコールおよびＤＨＡを放出することが明らかである。よって、本発明のドコサヘキサエン酸エステルは、ＤＨＡとアルコールの混合物と同様の活性を有することが明らかである。よって、このアルコールがビタミンＢ群またはプロビタミンである場合には、本発明のドコサヘキサエン酸エステルはＤＨＡとビタミンＢ群またはプロビタミンの混合物と同様の効果を有すると考えられる。また、ピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの場合、ニコチニルアルコールは体内でニコチン酸へ変換されることも明らかである。よって、本発明のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートは、ＤＨＡとニコチン酸の混合物と同様の活性を有することが明らかである。ニコチン酸の血管拡張作用の利点は、特にピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの静脈内注射の場合に、ニコチニルアルコールがニコチン酸へ変換された後、末梢において最も満足のいくＤＨＡの分布が得られることである。
【００４１】
本発明は、以下の図面および実施例を参照すれば、よりよく理解できる。
【００４２】
図１は、６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下でエステル交換反応を行った際のＤＨＡ−ＥＥ消費％を、実施例３．１（開放試験管）、３．２（真空下）および３．３（窒素吹き込み下）に関して、時間の関数として表したものである。
【００４３】
以下に非限定例を示す。
【実施例】
【００４４】
実施例１：Ｋ２ＣＯ３を用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成
１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）のエチルドコサヘキサエノエート（純度９５％以上；Interchimにより提供）を、１．５３ｇ（１１ｍｍｏｌ）の粉砕Ｋ２ＣＯ３および１．０６ｍｌ（１０．９ｍｍｏｌ）のニコチニルアルコール（純度９８％以上；Acrosにより提供）の存在下、窒素吹き込みにより脱気した５ｍｌのＴＨＦ中に入れる。この反応混合物を７時間、還流下で加熱した後、０．７６ｇ（５．５ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３を加え、加熱を７時間続ける。
【００４５】
冷却後、反応混合物を水に取り、次いで、酢酸エチルで抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、濃縮乾固した。得られた残渣をシリカフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２→９０／１０ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル勾配、１５分）により精製する。透明な油状物が単離される（０．８４ｇ、収率７１％）。
シリカゲルＴＬＣ６０Ｆ ２５４ Ｍｅｒｃｋ、９０／１０ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ、Ｒｆ＝０．３５。
【００４６】
実施例２：リパーゼを用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成
反応は総て、各酵素に最適な温度で、不連続混合反応器（磁気混合）で行う。
【００４７】
用いた生成物は次の通りである；
ＤＨＡエチルエステル（ＤＨＡ−ＥＥ）中に７０％まで濃縮されたエチルエステル混合物（Croda Chemical Ltd.により販売）（以下、「７０％ＤＨＡ−ＥＥエステル混合物」と呼ぶ）；
Novo Nordiskにより販売されているカンジダ・アンタルクチカの固定化形態のリパーゼ、ノボザイム（登録商標）；
ニコチニルアルコール。
反応混合物は次のいずれかである：
基質のみを用いる、溶媒を用いない媒体；または
種々の溶媒を用いる有機媒体。
【００４８】
この有機媒体に用いられる溶媒は、
多価不飽和脂肪酸エステルなどの疎水性化合物とニコチニルアルコールなどの親水性化合物の同時可溶化を可能とする中程度の極性の溶媒２−メチル−２−ブタノール（２Ｍ２Ｂ）または
２Ｍ２Ｂと同じ理由で、アセトニトリル
である。
【００４９】
反応条件を下表１にまとめる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
各条件で２００ｍｇのノボザイム（登録商標）とともに６０℃でインキュベートした。開放系（換気フード下）で行った２Ｍ２Ｂの反応を６０℃で２００ｍｇのノボザイム（登録商標）を用いて試験した。
【００５２】
反応が完了するまで、定期的に５００μｌのサンプルを採取する。反応プロセスを、１３，０００ｒｐｍで５分遠心心分離を行うことによりクエンチし、これにより媒体から固定化酵素が除去される。サンプルは総て、分析まで４℃で保存する。
【００５３】
酵素を含まない対照反応および補助基質（ニコチニルアルコール）を含まない対照反応を並行して行う。
【００５４】
分析は、次のパラメーターに従い、２つのＨＰＬＣ法（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズの仕打ちを使用）を使用して行う。
【００５５】
方法１
Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
温度：４０℃
流速：１ｍｌ／分
溶出剤：０．０２％メタノール／酢酸
検出；屈折率測定
測定時間：１５分
【００５６】
方法２
Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
温度：４０℃
流速：３ｍｌ／分
溶出剤：５０／５０アセトニトリル／アセトン
検出：屈折率測定
測定時間：１５分
【００５７】
種々の反応中に採取したサンプルを、方法１では０．０２％メタノール／酢酸混合物で、方法２ではアセトンで、１００ｍＭ未満の濃度まで予め希釈する。
結果および考察：
【００５８】
エステル交換反応の際に２種類の種が見られる。１つは、分析条件下で４．１５分に溶出し、エステル加水分解産物に相当し、もう１つは４．８５分に溶出する。後者の化合物は７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルとニコチニルアルコールの間のエステル交換の産物に相当する。ここで、ニコチニルアルコールは１つの第１級ヒドロキシルのみを有するので、ただ１つの産物であると予測される。
【００５９】
種々の反応条件下で得られた変換率％を下表２に示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
変換率％は、反応が開放系で行われた場合に高く、生成エタノールは蒸発し、反応平衡はＤＨＥ−ニコチニルアルコールの合成側へ傾く。これらのエステル交換反応には反応混合物の著しい黒化を伴う。
【００６２】
加水分解産物は、反応溶媒として２Ｍ２Ｂを用いる場合が明らかに好ましい。しかしながら、溶媒を用いない媒体でも弱い加水分解反応が存在する。従って、用いたニコチニルアルコール中に水も存在していこと、および周囲水分がこの副反応を起こすことが明らかである。
【００６３】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルの、ニコチニルアルコールとのエステル交換反応の実現可能性は実証され、このような反応は、特に反応混合物から反応中に生じたエタノールを排除すると、９０％近く、またはそれを超える有利な変換率を示す。しかしながら、用いた溶媒中の水の存在および／または周囲の水分による副次的加水分解反応がこれらの合成を妨げる。
【００６４】
よって、見られる副次的加水分解反応を回避する試みが重要であるのは明らかである。例えば、完全に無水の溶媒を使用することができる。加水分解の可能性を排除するために水捕捉剤（例えば、塩化リチウム、ＭｇＣｌ２またはシリカゲル）の存在下でこれらの同じ反応を行うこともできる。
【００６５】
ニコチニルアルコール−ＤＨＡエステル合成反応では、反応中に生じたエタノールが反応を制限する要素であることが明らかである。それを排除すると、反応平衡が意図するエステルの合成側へ傾く。よって、特に、減圧下で合成を行う場合には、この排除を至適化することが勧められる。これによりエタノールの迅速な蒸発が可能となり、反応速度が高まる。
【００６６】
実施例３：リパーゼを用いたピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートの合成；エステル交換の至適化；反応中に生じたエタノールの蒸発；および酸化褐変の除去
６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下、溶媒を用いない媒体中で、同じ出発品（ニコチニルアルコール、７０％ＤＨＡ−ＥＥエステル混合物、ノボザイム（登録商標））を用い、実施例２と同様の合成反応を行った。用いた反応器は実施例２と同じであり、分析方法も同様である。
【００６７】
実施例３．１：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が開放容器（開放試験管）で行われたことだけである。
結果（図１）：
エステル交換反応は「遅く」、計８０時間近くかかる。酸化褐変が見られる。「強い」副次的加水分解も見られる。
【００６８】
実施例３．２：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が真空下で行われたことだけである。
結果（図１）：
実施例３．１と比べて反応の加速化が見られるが、依然として「遅く」、計４８時間近くかかる。
さらに、酸化褐変および副次的加水分解が見られる。
【００６９】
実施例３．３：
実施例２と比較した場合の違いは、反応が窒素吹き込み下で行われたことである。
結果（図１）：
反応中に生じたエタノールの即時排出と混合物の改良により、反応の極めて著しい加速が見られ、計３時間未満となる。
酸化渇変は存在しないことが示される。
副次的加水分解は著しく低下する。
【００７０】
実施例４：リパーゼを用いたＤＨＡエステルのパンテノールとの合成
試験および分析条件は、次の違い以外、実施例２と同様である：
反応条件を下表３にまとめる。
【００７１】
【表３】
【００７２】
結果および考察：
分析条件下で３．９分と４．１４分に２種が溶出する。パンテノールは２つの第１級アルコールを示す。よって、数種の産物（３つの極大）の産生が考えられる。しかしながら、補助基質（パンテノール）を含まない対照では、４．１４分にピークが見られる。このように、該ピークは使用する溶媒中の水の存在に関連したエチルエステルの加水分解に相当するものであろう。この反応は酵素の存在下でのみ見られる。
【００７３】
結論として、パンテノール−ＤＨＡエステル合成に相当するのは最初のピークだけである。
【００７４】
種々の反応条件下で得られた変換率％を下表４にまとめる。
【００７５】
【表４】
【００７６】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルの変換率％は、反応が開放系で行われた場合に上昇することが明らかである。実際、この条件下では、反応中に生じたエタノールは蒸発する。よって、反応平衡はパンテノール−ＤＨＥエステルの合成側へ傾く。さらに、これらの変換値は、２Ｍ２Ｂ溶媒の同時蒸発（媒体濃縮効果）によるものと明らかに理解される。また、これらのエステル交換反応には反応混合物の著しい黒化も伴う。
【００７７】
７０％ＤＨＡ−ＥＥエステルのパンテノールとのエステル交換反応の実現可能性は実証され、このような反応は、特に反応混合物から反応中に生じたエタノールを排除すると、９０％近く、またはそれを超える有利な変換率を示す。しかしながら、用いた溶媒中の水の存在および／または周囲の水分による副次的加水分解反応がこれらの合成を妨げる。
【００７８】
よって、見られる副次的加水分解反応を回避する試みが重要であるのは明らかである。例えば、完全に無水の溶媒を使用することができる。加水分解の可能性を排除するために水捕捉剤（例えば、塩化リチウム、ＭｇＣｌ２またはシリカゲル）の存在下でこれらの同じ反応を行うこともできる。
【００７９】
パンテノール−ＤＨＡエステル合成反応では、反応中に生じたエタノールが反応を制限する要素であることが明らかである。それを排除すると、反応平衡が意図するエステルの合成側へ傾く。よって、特に、減圧下で合成を行う場合には、この排除を至適化することが勧められる。これによりエタノールの迅速な蒸発が可能となり、反応速度が高まる。
【００８０】
実施例５：超高速カリウム電流に対する、従って心房細動に対するＥＰＡおよびＤＨＡの作用の結果の比較
心臓活動電位は興奮性心細胞の基本的電気単位であり、活動電位の種々の相を担う数種のイオンチャネルの活動を表す。活動電位の種類の違いは心臓領域の違いに相当し、従って、これらの領域における隔離された、また、協調した活動が可能である。このため、ＫＣＮＡ５遺伝子によってコードされているＫｖ１．５カリウムチャネルは心耳組織にのみ発現し、心房活動電位の再分極に作用する超高速カリウム電流（ＩＫｕｒ）を担う。このＫｖ１．５の局在性の高い発現は、実際に、心房活動電位に変化が見られる病態である心房細動の処置の標的選択肢である。
【００８１】
従って、ＩＫｕｒに対するＤＨＡおよびＥＰＡの作用を検討した。このため、Ｋｖ１．５チャネルのヒトイソ型（ｈＫｖ１．５）を安定的にＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）細胞にトランスフェクトし、これらのチャネルの活動から得られた電流をホールセルパッチクランプ法（whole-cell patch clamp）法を用いて検討した。
材料および方法
【００８２】
細胞系統の維持
ＨＥＫ２９３−ｈＫｖ１．５細胞を、標準的条件（３７℃、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２のインキュベーター）下、ファルコン(Falcon)ディッシュ内で、集密度８０％まで増殖させた。次に、これらを取り出し、次の培養培地：ＤＭＥＭ(Invitrogen)；１０％ウシ胎児血清(Invitrogen)；１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５ｍｇ／ｍｌグルタミン(Invitrogen)の混合物；および選択抗生物質としての１．２５ｍｇ／ｍｌゲネチシン(Geneticin)（登録商標）を含む３５ｍｍのペトリ皿で培養した。
【００８３】
電気生理学
ＩＫｕｒを、周囲温度（１９〜２２℃）でホールセルパッチクランプ法を用いて調べた。ピペット媒体としては、１２５ｍＭ Ｋ−アスパラギン酸塩、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３（ＫＯＨ）を含む。細胞外媒体としては、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ Ｄ（＋）−グルコース、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４（ＮａＯＨ）を含む。
【００８４】
ＩＫｕｒを、−８０ｍＶの保持電位から−５０ｍＶの再分極まで、１５秒ごとに３００ｍｓ、＋６０ｍＶ脱分極性パルスにより誘導する。この電流ピークの大きさは、最初の１００ｍｓの脱分極性パルス中に得られた最大電流から確立される。パルスの終了時における電流の大きさは、最後の２０ｍｓの脱分極性パルス中に測定される。
【００８５】
試薬
ＤＨＡおよびＥＰＡはSigmaから供給されている。エタノールで保存溶液（１０ｍＭ）を作製し、溶媒の終濃度を０．２５％とする。
結果：
結果を下表５にまとめる。
【００８６】
【表５】
【００８７】
ＥＰＡはＩＫｕｒピークの大きさを若干低下させる（最大阻害１７．５±６．４％、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５、１０μＭ、パルス終了時の電流の大きさ（６１．６±７．３％、ｎ＝５、ｐ＜０．０５、２５μＭ）。
【００８８】
ＤＨＡはＩＫｕｒピークの大きさを最大５８．１±１３．６％（ｎ＝５、ｐ＜０．００５）まで阻害し、パルス終了時の電流の大きさを、２５μＭにて、８６．５±３．４％（ｎ＝５、ｐ＜０．００５）まで阻害する。
【００８９】
結論：
これらの結果は、ＤＨＡの適用が、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされたヒトＫｖ１．５チャネルの超高速カリウム電流（ＩＫｕｒ）を、ＥＰＡよりも強く、かつ、濃度依存的に阻害することを示す。ＤＨＡパルス終了時に優先的に作用するが、このことはＫｖ１．５チャネルの不活性化に対する作用を示唆する。さらに、この作用はＩＫｕｒピークの低下を伴い（ＥＰＡで見られたものと対照的）、ＤＨＡによるＩＫｕｒの阻害を増強する。
【００９０】
ＩＫｕｒに対するこれらの作用は心房細動に対するＤＨＡの有益な作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】６０℃にて、アルコール／エステル比３のノボザイム（登録商標）２００ｍｇの存在下でエステル交換反応を行った際のＤＨＡ−ＥＥ消費％を、実施例３．１（開放試験管）、３．２（真空下）および３．３（窒素吹き込み下）に関して、時間の関数として表したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸エスエルであって、有利には下式：
【化１】
のニコチニルアルコール、
下式：
【化２】
のパンテノール、および
下式：
【化３】
のイノシトール
からなるビタミンＢ群もしくはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、または下式：
【化４】
のイソソルビドもしくは下式：
【化５】
の一硝酸イソソルビド
とのドコサヘキサエン酸エステル。
【請求項２】
前記エステルが、下記の一般式（１）：
【化６】
のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートである、請求項１に記載のドコサヘキサエン酸エステル。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸エチルエステルの、ニコチニルアルコール、パンテノール、イソソルビド、一硝酸イソソルビドおよびイノシトールとの、有利にはニコチニルアルコールとのエステル交換による、請求項１または請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステルの製造方法。
【請求項４】
前記方法が触媒の存在下で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記触媒がリパーゼであり、有利にはカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エタノールが反応中に、有利には窒素吹き込みにより除去される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応が無水溶媒中で、または乾燥雰囲気下、溶媒無しで行う、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、有利には請求項２に記載のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートと少なくとも１種類の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項９】
薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心血管疾患、有利には心調律に関する疾患、好ましくは、心房および／または心室不整脈、頻脈および／または細動の中から選択されるものの予防および／または治療のため；心筋細胞の電気伝導異常によって現れる疾病の予防および／または治療のため；有利には高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高血圧症、高脂血症、異脂肪血症、有利には混合型異脂肪血症、および／または血液凝固におけるＶＩＩ因子の活性亢進の中から選択される心血管疾患の多くのリスク因子の予防および／または治療のため；心房および／または心室不整脈、頻脈、細動および／または心筋梗塞により誘発される電気伝導異常などの心血管疾患に由来する調律異常、有利には突然死の治療および／または一次もしくは二次予防のため；および／または心筋梗塞後の治療のための薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
心房細動の予防および／または治療のための薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸エスエルであって、有利には下式：
【化１】
のニコチニルアルコール、
下式：
【化２】
のパンテノール、および
下式：
【化３】
のイノシトール
からなるビタミンＢ群もしくはプロビタミンの中から選択されるアルコールとの、または下式：
【化４】
のイソソルビドもしくは下式：
【化５】
の一硝酸イソソルビド
とのドコサヘキサエン酸エステル。
【請求項２】
前記エステルが、下記の一般式（１）：
【化６】
のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートである、請求項１に記載のドコサヘキサエン酸エステル。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸エチルエステルの、ニコチニルアルコール、パンテノール、イソソルビド、一硝酸イソソルビドおよびイノシトールとの、有利にはニコチニルアルコールとのエステル交換による、請求項１または請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステルの製造方法。
【請求項４】
前記方法が触媒の存在下で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記触媒がリパーゼであり、有利にはカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エタノールが反応中に、有利には窒素吹き込みにより除去される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応が無水溶媒中で、または乾燥雰囲気下、溶媒無しで行う、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、有利には請求項２に記載のピリジン−３−イルメチルドコサヘキサエノエートと少なくとも１種類の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項９】
薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心血管疾患、有利には心調律に関する疾患、好ましくは、心房および／または心室不整脈、頻脈および／または細動の中から選択されるものの予防および／または治療のため；心筋細胞の電気伝導異常によって現れる疾病の予防および／または治療のため；有利には高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高血圧症、高脂血症、異脂肪血症、有利には混合型異脂肪血症、および／または血液凝固におけるＶＩＩ因子の活性亢進の中から選択される心血管疾患の多くのリスク因子の予防および／または治療のため；心房および／または心室不整脈、頻脈、細動および／または心筋梗塞により誘発される電気伝導異常などの心血管疾患に由来する調律異常、有利には突然死の治療および／または一次もしくは二次予防のため；および／または心筋梗塞後の治療のための薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
心房細動の予防および／または治療のための薬剤として用いられる、請求項１もしくは請求項２に記載のドコサヘキサエン酸エステル、または請求項８記載の医薬組成物。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５４４５７６（Ｐ２００９−５４４５７６Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７１４４（Ｐ２００９−５１７１４４）
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５６２７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４７８９９
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５６２７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４７８９９
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
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