ＤＮＡを単離するための溶出試薬、方法およびキット
【課題】生物学的物質からのＤＮＡの効果的な単離手段の提供
【解決手段】緩衝剤、塩基、キレート剤及び水を含むＤＮＡ溶離試薬を提供する。
【解決手段】緩衝剤、塩基、キレート剤及び水を含むＤＮＡ溶離試薬を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを単離するための溶出(または溶離)組成物及びそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのような核酸は、研究及び臨床分析のために分子生物学の分野において広く用いられる。DNAを分析するための一般的な方法は、サザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような方法による増幅及びシークエンシングである。これらの方法を用いて、遺伝子同定、集団スクリーニング、病原体同定及び診断試験を促進するためにDNA配列中の違いを決定する。これらの分析は全て、一貫し且つ確かな結果のための基礎として精製されたDNAサンプルを必要とする。
【０００３】
液相及び固相精製の２つの一般的カテゴリーに入る多数の核酸精製方法がある。液相精製では、DNAは液相中にとどまり、一方、不純物は沈殿及び／または遠心分離により除かれる。固相精製では、DNAは固体支持体に結合しており、一方、不純物は選択的に溶出される。両方の精製方法は、多数の工程及びしばしば危険な試薬を必要とする常法、並びにより少ない工程及び通常危険が低い試薬を必要とするより迅速な方法を利用する。
【０００４】
通常の液相法を用いて、DNAは密度勾配遠心分離、有機溶媒抽出または塩沈殿を用いて最も一般的に単離される。これらの精製方法を記述するプロトコルは、非特許文献１及び非特許文献２中に与えられる。簡潔に言えば、密度勾配遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出及び塩沈殿の液相精製法は、一般に、４つの主要な工程：細胞及び核膜からDNAを遊離させるために細胞を溶解すること；（タンパク質、脂質及び炭水化物のような）不純物を除くこと；アルコール沈殿により濃縮すること；及び次に水和溶液中でDNAを再水和させることを必要とする。これら３つの方法の主要な違いは、第二の工程中に存在し、そこで、不純物は密度差異化、有機−水相分配または選択的塩沈殿によりDNAから除かれる。
【０００５】
標本収集カード（ガスリーカード）上で乾燥させた血液を精製するための通常の液相精製法は、非特許文献３により記述されている。その方法は、非特許文献１に記述された液体血液のための方法に厳密に従う。このフェノール抽出法では、生理的食塩水溶液で再水和させることにより収集紙から乾燥した白血球を取り出す。それらの白血球を溶解するためにそれらの細胞を緩衝剤中でインキュベートする。次に、３回のフェノール抽出を実施してタンパク質不純物を除き、続いて、３回エーテル抽出してフェノールを除く。酢酸ナトリウム−エタノール沈殿によりDNAを濃縮し、70%エタノールで洗浄し、次に、標準的なDNA水和溶液中に再水和させる。この方法には、典型的に、２種が危険な（フェノール及びエーテル）いくつかの試薬（１０）が必要とされる。これらの常法は、典型的に、非常に精製されたDNA調製物をもたらすが、それらは労力を要し且つ危険である。
【０００６】
液相精製でのように、通常の固相法が非常に精製されたDNAを生成するために開発されている。一般に、これらの方法は４つの一般的な工程：細胞及び核膜からDNAを遊離させるために細胞を溶解すること；遊離されたDNAを固体支持体に結合すること；不純物を洗浄して除くこと；及び精製されたDNAを次に溶離させることを必要とする。最初の２つの工程、細胞を溶解すること及び遊離されたDNAを結合することは、通常、高濃度の危険な試薬を必要とする。
【０００７】
固相DNA精製では、膜フィルター、磁気ビーズ、金属酸化物及びラテックス粒子を初め
とする多数の固体支持体が用いられている。おそらく最も広く用いられる固体支持体はシリカに基づく粒子である（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照）。例えば、特許文献１中に開示された方法は、シリカ粒子にDNAを結合するために高濃度のカオトロピック溶液を用い、そして全血からDNAを精製するために６回の遠心分離工程及び５種の試薬を必要とする。この方法の不都合な点は、粒子懸濁液の使用、多数の遠心分離工程の使用並びにグアニジニウムイソチオシアネート及びアセトンのような危険な試薬の使用である。
【０００８】
通常の固相精製方法を簡略化するための一つの手段は、溶離工程を省き、そして増幅のような次の分析のために固体支持体に結合したままでDNAを用いることである。従って、固定されたDNAを用いることにより、通常、少なくとも１つの試薬及び１つの工程が省かれる。例えば、特許文献１は、血液のような複雑な混合物では存在しないが、DNAを精製するための方法を記述している。上記の方法を用いるが、溶離工程を省くことにより、試薬及び工程の数が１つ減らされる。
【０００９】
別の例として、特許文献６は、4回のフェノール洗浄及び５回のイソプロパノール洗浄中に4種の試薬を用いる、乾燥した血液を含有するセルロース濾紙を精製する方法を記述している。乾燥させた後、濾紙の小片を四角から切り、PCR増幅のための基質として直接用いる。分析のために結合したDNAを用いるにもかかわらず、これらの方法は多数の工程及び危険な試薬をなお必要とする。
【００１０】
最近、液相及び固相精製の両方のためにより迅速で且つ簡単な方法を開発する傾向がある。これは一つには分析のために必要な時間を減らすDNA増幅アッセイの開発により推進されている。DNAに基づくアッセイの数がその分野において増えるにつれて、生物学的サンプルを処理するより迅速な手段が必要とされる。また、より簡単な方法を用いることは、サンプル取り扱い工程の数を減らすことによりサンプル交差汚染の危険を減らす。さらに、方法がより簡単になるほど、その方法をより容易に自動化できる。
【００１１】
DNA精製のための一つの迅速な液相法は、液体血液または血液ステインから金属不純物を除くためにキレート化樹脂を使用する（非特許文献４）。この方法を用いて、血液細胞をまず脱イオン水で洗浄し、次に、キレート化樹脂及び脱イオン水の懸濁液と56℃で15-30分間インキュベートする。このインキュベート後、ボルテックスし、100℃で８分間インキュベートし、再びボルテックスし、そして遠心分離により不純物を除く。この方法は迅速であり（45-75分のうちの完了する）、そして簡単である（2種の試薬のみを必要とする）。
【００１２】
液相DNA精製のための別の簡単で且つ迅速な方法は、非特許文献５により記述されている。ヒト全血から出発し、血液細胞を10mM EDTA及び10mM NaClの溶液で2回洗浄し、各洗浄後にミクロ遠心分離により集める。次に、それらの細胞を50ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（Tris-HCl）緩衝剤（pH 8.0）中に再懸濁し、PCR増幅の前に3分間沸騰させる。この精製法では、2種の試薬のみが必要とされ、それらは両方とも一般的に危険でない。さらに、その方法は約１５分のみを必要とする。
【００１３】
さらにより簡単な単一試薬法が非特許文献６により記述されている。この方法を用いて、3mm直径の血液スポットを3分間オートクレーブし、次に、PCRに適合した緩衝剤（10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、3mM MgCl2及び0.001ゼラチン）中で５分間沸騰させるかまたは１０分間超音波処理する。オートクレーブ後、不純物はディスクに結合したままであり、一方、DNAは緩衝剤中に回収される。
【００１４】
DNA精製のためのこれらの液相法の３つは全て、低濃度の危険でない試薬及び簡略化さ
れた方法を使用する。しかしながら、（使用前に均一に懸濁されなければならい）樹脂の使用を省くか、細胞の繰返された洗浄を省くか、または血液スポットの面倒なオートクレーブを省くことによりこれら３つの方法（非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６）をさらに簡略化できるはずである。
【００１５】
また、固相DNA精製のための迅速で且つ簡単な方法も開発されている。非特許文献７の方法は、乾燥させた血液スポットを非イオン溶剤を含有する緩衝剤で連続して洗浄することを記述している。濾紙からDNAを溶離させるために、プロテイナーゼＫ溶液を含む別の非イオン溶剤を含有する緩衝剤と各サンプルを65℃で１時間インキュベートする。 95℃より高温で１０分間の最後のインキュベートは、プロテイナーゼＫを不活性化するために必要である。この方法は必要な試薬の数を3種に減らすが、酵素、長いインキュベート時間及び高いインキュベート温度（すなわち、95℃より高い）を用いるという不都合な点を有する。
【００１６】
DNAを分離する手段として膜フィルターを用いる迅速な方法が特許文献７中に開示されている。典型的に、この方法は、全血中に存在する細胞を溶解するために高濃度の溶解試薬を必要とする。次に、ライセートをフィルターに加え、DNAをさらに精製するために第二の溶解試薬、そして次に緩衝剤または水のいずれかで連続して洗浄する。水中または塩化マグネシウムを含有する緩衝試薬中で１５分間沸騰させることによりDNAを膜から溶離させる。この固相精製法の不都合な点は、精製及び溶離試薬中のキレート化剤の欠如を含み、それは（例えばヌクレアーゼによる）DNA損傷の可能性を高める可能性がある。さらに、面倒な高温インキュベーション（すなわち、約１００℃）の条件がある。
【００１７】
別の例として、特許文献８は、細胞を溶剤及び磁気ビーズからなる固相と混合することにより細胞からDNAを精製する方法を記述している。この方法では、細胞を溶剤により先に溶解してDNAを遊離させることができ、それを続いて固相に結合する。あるいはまた、細胞及び固相からなる懸濁液に溶剤を添加してもよく、または細胞、溶剤及び固相を一緒に懸濁してもよく、溶剤により液相中で細胞を溶解させ、続いて、DNAを固相に結合させる。しかしながら、この方法は、液相（すなわち、溶剤または細胞残渣−溶剤懸濁液）を添加するかまたは固相から除く多数の工程を含む。
【００１８】
非常に簡単な方法が非特許文献８により提示され、その場合、セルロース収集紙上で乾燥させた血液サンプルから穴をあけた3mm直径のディスクを脱イオン水で洗浄し（2回の３０分洗浄）、PCR増幅のために直接用いる。特許文献７上の分析において説明したように、精製試薬として脱イオン水を用いる主要な不都合な点は、キレート化剤の欠如により（例えばヌクレアーゼによる）DNA損傷の可能性が上がることである。さらに、溶剤の欠如により不純物を可溶化する効率が下がる。
【００１９】
いくつかの手段により核酸を検出し、定量することができる。一般に、260nmの波長でのUV吸光度を用いる。バックグラウンドの吸光度を測定するために320nmの波長を用いる。また、核酸を検出し、定量するためにヘキスト33258色素の存在下での蛍光測定法（例えば、Hoefer、DyNA Quant蛍光計、Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）、抗体検出片（DNA Dipstick、Invitrogen、Carlsbad、CA）、分岐シグナル増幅（Chiron Corporation、Emeryville、CA）及び定量的PCR増幅（例えば、Applied Biosystems 7700、Perkin Elmer Applied Biosystems Division、Foster City、CA）も用いる。
【００２０】
一般的に既知であり、実施されるように、様々な波長で吸光度を測定することによりDNAの純度を確かめることができる。タンパク質、脂質、炭水化物、細胞残渣等のような不純物の存在は測定される吸光度を上げる可能性がある。それに反して、純粋な核酸、特にＰＣＲ増幅に用いられるDNAは、確立された波長で実質的により低い吸光度を有する。
【００２１】
現在、利用できる多数の核酸増幅系がある。最も一般的に用いられる増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であるが、他の標的増幅技術はリガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、自給配列複製（SSRまたは3SR）、鎖置換増幅（SDA）及び転写によりもたらされる増幅(TMA)を含む。
【００２２】
サンプルまたは核酸の混合物内の１つまたはそれ以上の標的核酸配列を増幅するためにPCRが慣例的に用いられる。この方法は、特許文献９中に開示されている。この方法で増幅される各標的核酸配列に対して、２本の鎖内の標的核酸の一部に実質的に相補的であるように選択された2個のプライマーで核酸の別個の相補鎖を処理する。一般に、熱安定性酵素（ポリメラーゼ）を用いてプライマーを伸長し、相補的プライマー伸長生成物を生成せしめる。これらがそれらの相補鎖に分離されると、それらは相補的プライマーを標的核酸配列に伸長するための鋳型として働く。分離されると、これらは次にさらなる核酸配列の合成のための鋳型として働く。PCR増幅方法は、一連の簡単な工程を含む。これらは、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーション、ポリメラーゼによりもたらされるプライマー伸長生成物の合成、並びに鋳型鎖の鎖と合成された標的核酸配列の分離及びそれに続くアニーリングを引き起こすための温度サイクリングを含む。従って、合成される標的核酸配列の量の指数的増加がある。PCR増幅は非常に高感度の方法である。それ故、非常に高純度の出発サンプルが必要である。
【００２３】
LCRは、一次PCR増幅と共にしばしば利用される別の診断技術である。LCRは熱安定性リガーゼを用い、単一塩基対のみが異なるDNA配列の区別を可能にする。ＬＣＲはその感度のために非常に純粋なNA鋳型に依存する。
【００２４】
精製された核酸をサザンハイブリダイゼーションまたはより一般的に知られているようなサザンブロッティングによりさらに分析することができる。サザンブロッティングは、ゲルから様々な種類の濾紙へのDNAフラグメントの毛管移動である。それにより研究者は制限フラグメントの複雑な集団において稀な配列を検出することができ、そして遺伝子クローニング、逆遺伝学及びヒト遺伝病診断のための制限断片長多型（RFLP）の分析において有用である。サザンブロッティングは、１種またはそれ以上の制限酵素でのDNAの消化及びそれに続くアガロースゲルでの電気泳動によるサイズ分離を含む。次に、DNAをインサイチューで変性させ、ゲルから膜(例えば、ニトロセルロースまたはナイロン)に移す。次に、膜に結合したDNAを放射性標識したDNAまたはRNAにハイブリダイズさせ、プローブに相補的なバンドの位置を突き止めるためにオートラジオグラフィーを用いる。サザンブロッティングは非常に高感度である。10μgのゲノムDNAをフィルターに移し、そして数百ヌクレオチドの長さのプローブにハイブリダイズさせる場合、哺乳類ゲノム中に１回だけ（すなわち、3百万分の１）存在する1000塩基対（bp）の配列を一晩の露出で検出することができる。
【００２５】
DNAサンプル調製の分野を前進させるためには、固相DNA精製方法が必要とされる。また、簡単で且つ迅速であるだけでなく、自動化のための適応性を最大にする目的において一般的である、固相精製方法に適応できる試薬及び方法も必要とされる。一般に低濃度のものであり、室温（すなわち、20-25℃）で安定であり、危険が低く（すなわち、腐食性、引火性または毒性が低く）、混合する必要性を省くために非粒子であり、そしてDNAの質を保護する試薬が必要とされる。また、特に臨床試験所において見られるような日常的試験に用いられる場合、水和していようと乾燥していようと、様々な生物学的出発材料を用いて実施することができる数工程の方法も必要とされる。それらの試薬は、PCR緩衝剤の緩衝能力を妨げることにより次のDNA分析方法を阻害してはならず、またはDNA増幅に用いられるポリメラーゼ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドの分解を引き起こしてはならない。また、特に臨床試験所において見られるような日常的試験に用いられる場合、水
和していようと乾燥していようと、様々な生物学的出発材料を用いて実施することができる数工程の方法も必要とされる。
【００２６】
また、固相精製方法に用いられる試薬及び方法は、核酸定量、制限酵素消化、DNAシークエンシング、サザンブロッティングのようなハイブリダイゼーション技術等の標準的な方法、並びにリガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、自給配列複製（SSRもしくは3SR）、鎖置換増幅（SDA）及び転写によりもたらされる増幅（TMA）を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅方法、または他のDNA分析も妨げてはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第5,234,809号（Boom等）
【特許文献２】国際公開第WO95/01359号（Colpan等）
【特許文献３】米国特許第5,405,951号（Woodard）
【特許文献４】国際公開第WO95/02049号（Jones）
【特許文献５】国際公開第WO92/07863号（Qiagen GmbH）
【特許文献６】米国特許第5,496,562号（Burgoyne）
【特許文献７】米国特許第5,234,824号（Mullis）
【特許文献８】国際公開第WO96/18731号(Deggerdal)
【特許文献９】米国特許第4,965,188号(Mullis)
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、7.19-7.25、9.16-9.19、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)
【非特許文献２】Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology、4.4.2-4.4.4(1987)
【非特許文献３】McCabe等、Human Genetics、75、213―216(1987)
【非特許文献４】Walsh等、BioTechniques、10、506-513(1991) 非特許文献５：Nordvag等、BioTechniques、12、490-492(1992)
【非特許文献６】Carducci等、BioTechniques、13、735-737(1992)
【非特許文献７】Berlin等、Human Mutation、1、260-261(1992)
【非特許文献８】Makowski等、Nucleic Acids Research、23、3788-3789(1995)
【発明の概要】
【００２９】
本発明は、液体または乾燥した生物学的サンプルからDNAを精製し、増幅し、そして特性化するための試薬、方法及び固体支持体を含むキットを提供する。精製されたDNAは、増幅及び制限酵素消化のような次に広く用いられる技術における使用のために適している。
【００３０】
本発明の試薬は、一般に、次のDNA分析を著しく阻害しないように低濃度の緩衝剤、塩、酸、塩基、キレート化剤及び／または溶剤を含有する。通常の系では、典型的に、高濃度の1種またはそれ以上のこれらの化合物を含有する試薬をDNA精製のために用いる。これらの低濃度の試薬を用いることにより、DNA精製のために必要な工程の数を減らし、方法をより迅速で且つ簡単にする。また、これらの試薬は一般に、通常のDNA精製のために用いられるものより危険も低い。記述される固相精製法は典型的に２つの主要な工程（例えば洗浄及び乾燥）のみを必要とする。固体支持体（または固体支持マトリックス）からのDNAの除去が必要とされる場合、別の工程（溶離）を用いる。
【００３１】
細胞またはタンパク質コート膜を可溶化し、そして／もしくは破壊してDNAの遊離を容易にするため及び／または不純物を可溶化してそれらの除去を容易にするために市販され
ているDNA精製試薬を本発明に用いる。DNA精製試薬の組成は、ＰＣＲ増幅のような次のDNA分析とそれが適合する（すなわち、著しく阻害しない）ようにすべきである。例えば、DNA精製試薬のモル濃度は低いべきである。
【００３２】
固相精製後に精製されたDNAを固体支持体から取り出す（または取り除く）ためにDNA溶離（本明細書では、「溶離」と「溶出」の語は互換可能に使用されている）試薬を用いることができる。DNA溶離試薬は：pHを少なくとも約７（好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは少なくとも約１０）で保つための緩衝剤；試薬pHを調整するための塩基；キレート化剤（本明細書では、「キレート化剤」と「錯化剤」の語は互換可能に使用されている）；及び脱イオンし且つ実質的にヌクレア−ゼを含まない水を含む。緩衝剤は好ましくは少なくとも約８のpKaを有する。好ましい緩衝剤はトリスである。塩基は好ましくは、試薬のpHを７ほどまでに上げることができるものである。塩基は好ましくはアルカリ金属水酸化物である。そのようなアルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウムを含む。キレート化剤は好ましくはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはシクロへキサンジアミン四酢酸(CDTA)である。しかしながら、ヌクレア−ゼ活性を下げることができるあらゆるキレート化剤が使用のために適している。緩衝剤、塩基及びキレート化剤の合わせた量は低濃度のものであり（典型的には、約２０ｍＭにすぎない）、それをPCR増幅または制限酵素消化のような次のDNA分析と一般に適合する（すなわち、著しく阻害しない）ようにする。
【００３３】
適当な固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデン及びそれらの組み合わせを含む。好ましい固体支持体は、標本収集のために一般に用いられるもののようなセルロースから構成される。
【００３４】
乾燥による溶解または非イオン性溶剤を含有するDNA精製試薬での処理に組織、細胞膜、細胞壁またはウイルスタンパク質コートが耐性である場合、溶解及び次の精製を助けるために固体支持体を溶解試薬で処理することができる。常法では、この溶解工程を典型的に固体支持体と生物学的物質を接触させる前に実施する。しかしながら、固体支持体に溶解試薬を添加することにより、工程を省き、方法を簡略化する。好ましくは、溶解試薬を固体支持体に加え、次に固体支持体上で乾燥させ、その後、処理した固体支持体と生物学的物質を接触させるが、これは必要な条件ではない。
【００３５】
好ましくはDNAの精製のために溶解試薬を用い、それは十分に細胞またはタンパク質コートを溶解してDNAを遊離させるために有効な溶剤の量；DNA損傷を減らすためのキレート化剤；水；及び場合により約２より大きいpHを与えるために有効な緩衝剤からなることができる。溶剤は好ましくは陰イオン性である。陰イオン溶剤の例は、N-ラウロイルサルコシンまたはドデシル硫酸塩を含む。ドデシル硫酸ナトリウムが特に好ましい陰イオン溶剤である。緩衝剤は好ましくは約６より大きいpHを与えるために有効である。トリスが特に好ましい緩衝剤である。キレート化剤は好ましくはEDTAまたはCDTAである。
【００３６】
場合により、溶解試薬は、生物学的サンプル中に存在するRNAを分解する目的のために、RNアーゼAのようなRNA消化酵素を含むことができる。RNA消化酵素を含むことにより、常法において典型的に必要とされるような別個のRNアーセ゛消化工程の必要性が省かれる。
【００３７】
また、本発明は生物学的サンプルからDNAを精製するための方法も提供する。生物学的サンプルは、例えば、細胞またはウイルス懸濁液、体液、全血、骨髄、軟層、血漿、培養細胞、全ての懸濁液（例えば、細菌、組織ホモジネート）及び環境サンプルを含む。環境サンプルは、例えば、空気、水または土壌を含む。固相精製のために、本発明の方法は、
固体支持体と生物学的サンプルを接触させることを含む。不純物の可溶化、細胞壁の溶解、細胞からのDNAの遊離及び固体支持体へのDNA結合を容易にするために生物学的サンプルを含有する固体支持体にDNA精製試薬を添加する。DNA精製試薬で固体支持体を（好ましくは少なくとも2回）洗浄することにより、不純物が固体支持体から除かれる。結合し、精製されたDNAを含有する固体支持体を増幅または他の分析に直接用いることができる。あるいはまた、DNA溶離試薬を用いてDNAを取り出すことができる。固体支持体からDNAを溶離させるために、DNA溶離試薬を固体支持体と接触させ、インキュベートし、次に取り除く。
【００３８】
本発明の別の態様は、1種またはそれ以上の任意の補助試薬とDNA精製試薬及び／またはDNA溶離試薬の組み合わせを含む。赤血球細胞を溶解し、次に哺乳類全血中に含まれる白血球からのNAの精製を容易にするために第一の補助試薬、RBC溶解試薬を用いる。DNA精製前に酵母及びグラム陽性細菌の細胞壁を消化するために第二及び第三の補助試薬、細胞懸濁試薬及び溶解酵素試薬を一緒に用いる。混入するタンパク質を消化するために第四の補助試薬、タンパク質消化試薬を用いる。DNA及び／または細胞を必要なように懸濁するために第五の補助試薬、等張溶液を用いる。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、酵母及びグラム陽性細菌からDNAを精製するための方法である。その方法は、細胞懸濁試薬と生物学的サンプルを合わせることを含む。細胞懸濁試薬は、緩衝剤、キレート化剤及び細胞懸濁液を生成せしめるための細胞沈殿防止剤を含む。細胞懸濁液に溶解酵素試薬を添加する。溶解酵素試薬は、細胞壁を消化するための酵素、緩衝剤、試薬のpHを調整するための酸及び２種の安定剤を含む。消化した細胞を上記の液相または固相精製に用いることができる。
【００４０】
また、本発明は、生物学的サンプルから実質的に純粋なDNAを調製するための指示手段及び以下のもの：DNA精製試薬、DNA溶離試薬、溶解試薬、RBC溶解試薬、細胞沈殿防止試薬、溶解酵素試薬、等張溶液またはそれらのあらゆる組み合わせの一つまたは全部を含んでなるDNAを精製するためのキットも提供する。また、キットは、溶解試薬で処理されていないかまたは処理されたいずれかの固体支持体も含むことができる。さらに、キットは、固体支持体を入れるための容器を含むことができる。実質的に純粋な核酸は、例えば、DNA増幅、逆転写及び制限酵素消化のような、当業者に既知の次の分析における使用のために適当なものである。
【発明の詳細な記述】
【００４１】
本発明は固体支持体を導入して生物学的サンプルからのＤＮＡを精製し、増幅し、特性化するための試薬、方法及びキットを提供する。そのような生物学的サンプルには、ＤＮＡのような核酸（ＮＡｓ）を含有する典型的には水性混合物中の、又は乾燥された生物材料が含まれ、原核もしくは真核細胞の複合生物学的混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）を含む。典型的には、生物材料は炭水化物、タンパク質及び脂質も含有する。生物材料には以下が含まれる：体液、例えば全血、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート試料、唾液及び脳脊髄液、頬スワブ（ｂｕｃｃａｌ ｓｗａｂｓ）、培養細胞、バクテリアの細胞懸濁液又は組織ホモジネート、固体の動物組織、例えば心臓、肝臓及び脳、体の廃物、例えば便及び尿、空気、水、沈渣（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）もしくは土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、バクテリア、ウィルス、マイコプラズマ、菌・カビ、原生動物、リケッチア及び他の小さい微生物細胞。これらの生物材料のライセート又はホモジネートも用いることができる。
【００４２】
好ましくは、本発明の固体支持体が導入された試薬、方法及びキットはいずれかの形態の実質的に純粋なＤＮＡを与える。ＤＮＡは例えば染色体もしくはゲノムＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（ミトコンドリア及びプラスミドＤＮＡのような）、１本鎖ＤＮＡ及びウィルス
ＤＮＡから成ることができる。
【００４３】
これらの固体支持体が導入された試薬、方法及びキットを用い、実質的に高純度のＤＮＡを得ることができる。ＤＮＡの純度は、感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲアッセイのようなその後の分析を妨げ得る不純物、例えばタンパク質の実質的な減少により決定される。本明細書で用いられる場合、「純粋」は実質的に炭水化物、タンパク質及び脂質の不純物を含有せず、精製されたＤＮＡを当該技術分野における熟練者に既知のその後の分析において用いることができることを意味する。かくして本発明に従って得られる単離され且つ精製されたＤＮＡはその後の分析で用いるのに適している。好ましくは、本発明の方法及びキットは広い範囲のＤＮＡを精製し、そのすべてを広い分子量範囲に及んで回収できる。
【００４４】
本発明はＤＮＡの精製のために低濃度の試薬を用いるための方法を記載する。これらの方法は一般に、ＤＮＡ精製のために典型的に用いられる方法より迅速で簡単である。これらの精製段階から得られる精製されたＤＮＡを純度、収率、寸法、増幅能力などに関して評価することができる。
【００４５】
生物学的サンプルには例えば細胞もしくはウィルス懸濁液、体液及び組織ホモジネートが含まれる。生物学的サンプルが細胞もしくはウィルスから成る場合、細胞もしくはウィルスをこの段階の前に計数することができる。計数は標準的細胞カウンティング法、例えば電子的細胞カウンター（例えばＣＢＣ５ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）又は視覚的カウンター（例えばヘマシトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ），Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を用いて行うことができる。
【００４６】
固相ＤＮＡ精製のための方法は、ライシング試薬（ｌｙｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）で処理されていることができる固体支持体に生物学的サンプルを適用することを含む。固体支持体との接触は細胞及び核膜を可溶化及び／又は破裂させ、それによりＤＮＡを放出させ、それが次いで固体支持体に結合する。固体支持体を加熱して細胞及び核膜の可溶化及び破裂を助長することができる。放出されるＤＮＡは固体支持体に結合し、第１の試薬の添加による不純物の除去を可能にする。この第１の試薬は商業的に入手可能なＤＮＡのための精製試薬であることができる。不純物は第１の試薬中で可溶化され、遠心、ピペット使用、圧力又は真空のような適した手段により除去され、ＤＮＡが固体支持体に結合して残される。かくして方法は１種のみの試薬及び２つの主要な段階（すなわち洗浄及び過剰の水溶液の除去）を用いる。ＤＮＡが固体支持体から取り出されたら、追加の試薬であるＤＮＡ溶離試薬を加え、さらに別の段階（溶離）を行う。
【００４７】
固相ＤＮＡ精製の場合、精製されたＤＮＡを分析の前に固体支持体から取り出すことが必要であり得る。本発明は、固体支持体からのＤＮＡの溶離のための低濃度ＤＮＡ溶離試薬も含む。低濃度ＤＮＡ溶離試薬の組成は変わり得るが、合計濃度はすべての組成の場合に典型的に２０ｍＭ未満である。
【００４８】
本明細書において「ＤＮＡ溶離試薬」と呼ぶ低濃度ＤＮＡ溶離試薬は固体支持体からＤＮＡを取り出すことができる。それは塩基、緩衝剤、キレート化剤及び水を、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは少なくとも約１０のｐＨを保持するような組合わせにおいて含有する。
【００４９】
ＤＮＡ溶離試薬はｐＨを少なくとも約７に保持するための緩衝剤を含有し、好ましくは少なくとも約８のｐＫａを有する。適した緩衝剤にはＮ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏから商品名「ＢＩＣＩＮＥ」の下に入手可能）、３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから商品名「ＣＡＰＳＯ」の下に入手可能）及びＴｒｉｓが含まれるがこれらに限られるわけではない。緩衝剤は、ＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくしてそれは典型的には約２０ｍＭ以下の量で用いられる。好ましくは緩衝剤はＴｒｉｓであり、試薬の合計容積に基づいて約０．００１〜２０ｍＭ、より好ましくは約０．０１〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約１〜１０ｍＭの量で用いられる。
【００５０】
緩衝剤の他に、ＤＮＡ溶離試薬は試薬のｐＨを調節するための塩基を含有する。塩基は、ＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくして塩基は典型的には約２０ｍＭ以下の量で用いられる。そのような塩基には水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムが含まれるが、これらに限られない。好ましくは塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化リチウムのようなアルカリ金属水酸化物であり、試薬の合計容積に基づいて約０．２〜２０ｍＭ、より好ましくは約０．５〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約１〜５ｍＭの量で用いられる。
【００５１】
緩衝剤及び塩基の他に、ＤＮＡ溶離試薬はキレート化剤を含む。キレート化剤は、固体担体から取り出す間及びその後のＤＮＡ損傷（例えばヌクレアーゼ活性による）を減少させてＤＮＡをその後の分析に適したものとするのに有効な量で用いられる。適したキレート化剤は水性媒体中で２価のカチオンをキレート化することができるものである。そのようなキレート化剤にはエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びシクロヘキサンジアミンテトラアセテート（ＣＤＴＡ）が含まれるがこれに限られない。好ましくはキレート化剤はＥＤＴＡである。さらに、キレート化剤はＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくしてそれは典型的には約０．１ｍＭ以下の量で用いられる。好ましくはキレート化剤は試薬の合計容積に基づいて約０．０００１〜０．１ｍＭ、より好ましくは約０．００５〜０．０５ｍＭ、そして最も好ましくは約０．００１５〜０．０１５ｍＭの量で用いられる。
【００５２】
緩衝剤、塩基及びキレート化剤は水と一緒になってＤＮＡ溶離試薬を形成する。水は好ましくは脱イオン化され且つヌクレアーゼを含有しない。緩衝剤、塩基及びキレート化剤の合計された量は低濃度のものであり（典型的には約２０ｍＭ以下）、ＰＣＲ増幅又は制限酵素消化のようなその後のＤＮＡ分析と一般的に適合するものとなっている（すなわち有意に妨害性でない）。
【００５３】
生物材料源からのＤＮＡの精製において用いられるすべての試薬は、増幅及び他の分析と適合性であるように調製されている。試薬は低濃度の緩衝剤、塩、洗剤及びキレート化剤を有し、それは試薬を増幅分析と適合するものとしている。最終的な精製された核酸は、固相核酸抽出のためにＤＮＡ溶離試薬中に懸濁される。従ってこれらの試薬は下流のＤＮＡ分析において用いるために最適化されている。そのようなＤＮＡ分析にはＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲが含まれ得るがこれらに限られない。
【００５４】
３つの製造者、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ及びＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからの現在利用できるＰＣＲ増幅反応は、典型的には表１に示す濃度のＴｒｉｓ緩衝剤、塩及び非イオン性洗剤を８〜１０の塩基性ｐＨにおいて有する１Ｘ緩衝液中で行われる。
【００５５】
【表１】
【００５６】
ライシング試薬及び溶離試薬はＰＣＲ系において見られる濃度と同じ大きさの程度か、又はそれより有意に低いＴｒｉｓ緩衝剤濃度を有する。溶離試薬中のＴｒｉｓ緩衝剤の濃度は典型的には１〜１０ｍＭの範囲であり、増幅プロセスを妨害したり、又は有意に損なったりしないであろう。
【００５７】
本発明の他の側面は、ＤＮＡ精製試薬及び／又はＤＮＡ溶離試薬と１種もしくはそれより多い任意の補助試薬の組合わせを含む。これらの補助試薬は核酸精製のための当該技術分野における熟練者に既知の試薬を含む。しかしながら本発明の方法及びキットはこれらの特定の補助試薬の使用に制限されず、それは当該技術分野における熟練者が同じ目的を達成するために他の試薬及び／又は方法を用いることができるからである。又、ＤＮＡ精製試薬及び／又はＤＮＡ溶離試薬を、必要なら他の試薬及び／又は方法と一緒に用いることもできる。
【００５８】
第１の補助試薬は赤血球を溶解し（ｌｙｓｅ）、哺乳類の全血中に含有される白血球からのＤＮＡのその後の精製を容易にするために用いられる赤血球ライシング試薬である。この試薬を本明細書で「ＲＢＣ 溶解試薬（ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）」と呼び、それは塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム及びＥＤＴＡを含有する。好ましくは、塩化アンモニウムはＲＢＣ溶解試薬中で、試薬の合計容積に基づいて約１４０〜１５０ｍＭ、そしてより好ましくは約１４２〜１４６ｍＭの濃度で用いられる。好ましくは、重炭酸ナトリウムは試薬の合計容積に基づいて約０．５〜５ｍＭ、そしてより好ましくは約０．５〜２ｍＭの濃度で用いられる。好ましくは、ＥＤＴＡは試薬の合計容積に基づいて約０．５〜１０ｍＭ、そしてより好ましくは約０．７５〜１．２５の濃度で用いられる。ＲＢＣ溶解試薬は、好ましくは上記の純度の水を含有する。ＲＢＣ溶解試薬を血液の１体積に対してＲＢＣ溶解試薬の３体積の量で哺乳類全血と接触させる。試料を約１〜３０分、好ましくは約１０分インキュベートし、１５，０００における２０秒間の遠心により白血球を試料から分離する。上澄み画分の約１〜３％を除いてすべてを捨て、ＤＮＡ精製のために利用できる白血球を残す。
【００５９】
ＲＢＣ溶解試薬は、哺乳類全血と合わされると、実質的に無損傷の白血球を含有する赤血球ライゼートを形成する。それは実質的に無損傷のタンパク質外被を有するウィルスも含有し得る。白血球（及び存在し得る細胞性ウィルス）を次いで赤血球ライゼートから分離する。白血球を直接、又は固体支持体への適用の後に核酸精製試薬と合わせることができる。
【００６０】
第２及び第３の補助試薬は、ＤＮＡ精製の前に酵母及びグラム−陽性バクテリアから細胞壁を消化するために一緒に用いられる。本明細書で該試薬を「細胞懸濁試薬（Ｃｅｌｌ
Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）」及び「溶解酵素試薬（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）」と呼ぶ。それらは核酸精製試薬による溶解に抵抗性であり得る細胞壁を消化するために、ＤＮＡ精製法の第１段階で用いられる。細胞懸濁試薬を生物学的サンプルと合わせて細胞懸濁液を形成する。溶解酵素試薬を細胞懸濁液と合わせて消化された細胞を含有する混合物を形成する。これらの消化された細胞を次いで例えば遠心により混合物から分離し、次いで直接、又は固体支持体への適用の後に核酸精製試薬と接触させる。
【００６１】
細胞懸濁試薬は細胞を無損傷に保ち、その間にその細胞壁が溶解酵素により消化される。この試薬は、試薬のｐＨを約７〜８．５、そしてより好ましくは約７．５〜８．０に保持するために緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓを含有する。緩衝剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．０５〜０．１５Ｍ、そしてより好ましくは約０．０８〜０．１２Ｍの濃度で用いられる。細胞懸濁試薬はＤＮＡ損傷を減少させるためにキレート化剤、好ましくはＥＤＴＡも含有する。キレート化剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．０５〜０．１５Ｍの濃度、そしてより好ましくは約０．０８〜０．１２Ｍにおいて用いられる。緩衝剤対キレート化剤の好ましいモル比は約１：１である。この試薬は細胞の細胞壁が消化されている間に細胞を無損傷に保つために、ソルビトールのような薬剤も含有する。この薬剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．８〜１．０Ｍ、そしてより好ましくは約０．８５〜０．９５Ｍの濃度で用いられる。緩衝剤、キレート化剤及び細胞懸濁剤は水中で合わされる。水は好ましくは脱イオン化され且つ実質的にヌクレアーゼを含有しない。
【００６２】
溶解酵素試薬は、酵母細胞壁に含有されるベータ−１，３−グルコースポリマーを消化する溶解酵素を含む。この酵素の精製された形態はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのような商業的供給源から容易に入手可能である。この酵素の活性は好ましくはｍｇ当たりに少なくとも２００単位、より好ましくはｍｇ当たりに少なくとも１０００単位、そして最も好ましくはｍｇ当たりに少なくとも約５，０００単位である。酵素に加え、溶解酵素試薬は試薬のｐＨを保持するために緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓを含有する。Ｔｒｉｓは試薬の合計容積に基づいて好ましくは約１〜２０ｍＭ、より好ましくは約５〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約８〜１２ｍＭの濃度で用いられる。溶解酵素試薬のｐＨは、塩酸のような酸を用いて約７．５〜８．２のｐＨに調節される。さらに、溶解酵素試薬は２種の安定化剤を含有する。第１は好ましくはグリセロールである。グリセロールは好ましくは約２０〜５０％グリセロール（容積／容積）、より好ましくは約２４〜４０％グリセロール、そして最も好ましくは約２８〜３２％グリセロールの量で用いられる。第２の安定化剤は好ましくは塩化カルシウムである。塩化カルシウムは試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．５〜５ｍＭの濃度、そしてより好ましくは約０．７５〜１．２５ｍＭにおいて用いられる。酵素、緩衝剤、酸及び２種の安定化剤は水中で合わされる。水は好ましくは脱イオン水である。好ましくは試薬を約０．２μＭの孔径のフィルターに通過させることにより精製する。
【００６３】
典型的には、第２及び第３の補助試薬を用いて例えば酵母の細胞壁を消化するために、３００μｌの細胞懸濁試薬を約１億個の酵母細胞の１０〜２０μｌの懸濁液に１．５μｌの溶解酵素試薬と一緒に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。１５，０００ｘｇで１分間遠心した後、上澄み画分を除去し、ＤＮＡ精製に利用できる消化された細胞を残す。
【００６４】
本明細書で「タンパク質消化試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅ
ｎｔ）」と呼ぶ第４の補助試薬であるタンパク質消化試薬は、特に固体組織試料中の汚染タンパク質を消化するために用いられる。この酵素の精製された形態であるプロテイナーゼ Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙのような商業的供給源から容易に入手可能であり、約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で用いられる。３６℃より高い温度における加熱はこの酵素の活性を促進する。
【００６５】
第５の補助試薬である等張液（Ｉｓｏｔｏｎｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、典型的に細胞もしくはＤＮＡ懸濁液を作るために用いられる。適した等張液は塩に基づき、多くの場合にｔｒｉｓ、クエン酸塩又はリン酸塩で緩衝されている。１つの例はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【００６６】
固相精製のためには、適する固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびそれらの組み合わせを包含するがしかしこれらに制限されない。好ましい固体支持体は、シュライヒャー アンド シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）（ニューハンプシャー州キーン）から入手可能な試料収集紙９０３、もしくはワットマン インターナショナル リミテッド（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）（イギリスケント州スプリングフィールドミル）から入手可能なＢＦＣ１８０に見出されるようなセルロース繊維から構成される。別の好ましい固体支持体はポリオレフィンである。ポリオレフィンは、本明細書で、グラフトコポリマーのような改質ポリマーを包含するいずれかのオレフィンを基材とするコポリマーもしくはホモポリマーと定義される。許容できるポリオレフィンは、低、中および高密度ポリオレフィン、ならびに線状の低密度ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリブチレンを包含する。好ましくは、ポリオレフィンの固体支持体は親水性であり、そして、アメリカン フィルトローナ インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｉｌｔｒｏｎａ，Ｉｎｃ．）（ヴァージニア州リッチモンド）から入手可能なフィルトローナ［Ｆｉｌｔｒｏｎａ］（商標）ポリオレフィンで見出されるもののような低密度ポリエチレンおよびポリプロピレン繊維の混合物から構成される。最も好ましくは、固体支持体は、均一な流動の特徴および低背圧を与える方向性に多孔質であり、相互に交錯かつ結合される繊維から構成され、回転チューブ(spin tube)、ウェル、カートリッジもしくは別の容器中への容易な充填を見込むように弾性であり、約５０〜９０％の気孔率を有し、そして約２０〜３０μｍの直径を有する繊維から構成される。
【００６７】
本発明の試薬との使用に適する固体支持体の大きさは、生物学的物質の体積に従って変動してよい。例えば、０．５ｍｍの厚さを有するシュライヒャー アンド シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）の９０３紙を固体支持体に使用する場合、３ｍｍ直径の円板は約３μｌの血液を保持することができ、また、８ｍｍ直径の円板は約２５μｌの血液を保持することができる。生物学的物質の体積が増大する際に、厚さおよび／もしくは直径がそれに従って増大してよい。
【００６８】
本発明の試薬との使用に適する固体支持体の形状は、生物学的物質の型に従って変動してよい。例えば、頬側、鼻咽頭、膣、尿道および直腸のサンプルを得る場合には、スワブが適切な収集装置である。血液もしくは唾液サンプルのような体液を得る場合には、固体支持体は、例えばシート、予め切断された円板もしくは筒であってよい。必要な場合は、固体支持体を適切な容器、例えば（ガスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）カードのような）紙の形態、微小遠心管、回転チューブ、９６穴プレート、チャンバーもしくはカートリッジ中に含有する。
【００６９】
固体支持体は、溶解およびその後の精製で補助するために溶解試薬で処理してよい。好ましくは、固体支持体を処理するのに使用される溶解試薬の体積は、その固体支持体の総
体積の最低１／１０である。より好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積の最低半分であり、そして最も好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積に対応する。固体支持体の総体積は、その固体支持体の外的境界により規定される体積を指す。生じる生成物は、本明細書で「溶解マトリックス（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）」と称される、ＤＮＡのような核酸の単離のための溶解マトリックスである。溶解試薬を固体支持体と組み合わせることにより、ＤＮＡ精製法は、別個の溶解段階を除去することにより単純化される。好ましくは、溶解試薬を固体支持体に適用し、そしてその後、生物学的物質との接触前に固体支持体上で乾燥する。対照的に、慣習的系は、典型的には、生物学的物質を、固体支持体との接触に先立つ１段階として溶解試薬と接触させるか、もしくは、生物学的物質を固体支持体とともに懸濁し、その後、溶解試薬を、生じる懸濁液に添加する。
【００７０】
場合によっては、溶解試薬は、生物学的サンプル中に存在するＲＮＡを消化することが必要である場合にはＲＮＡ消化酵素を包含し得る。ＲＮＡ消化酵素を固体支持体と組み合わせることにより、ＤＮＡ精製方法は、別個の消化段階を除去することにより単純化される。好ましいＲＮＡ消化酵素はＲＮアーゼＡである。この酵素の精製された形態は、シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミズーリ州セントルイスのような商業的供給源から容易に入手可能である。好ましくは、ＲＮアーゼＡを、１ｍｌあたり約０．００５〜１ｍｇ、そしてより好ましくは１ｍｌあたり約０．０１〜０．１ｍｇの量で溶解試薬（Ｌｙｓｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）に添加する。この酵素の活性は、好ましくは、１ｍｇあたり最低約５０単位、そしてより好ましくは１ｍｇあたり最低約１００単位である。
【００７１】
好ましい一態様において、溶解試薬は、陰イオン性洗剤およびＲＮＡ消化酵素を包含するが、しかしキレート剤もしくは緩衝剤を包含しない。適する陰イオン性洗剤は、細胞を溶解するそして／もしくはタンパク質および脂質を可溶化することが可能である。こうした陰イオン性洗剤は、ドデシル硫酸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム塩）、ならびにＮ−ラウロイルサルコシンもしくはドデシル硫酸塩を包含するがしかしこれらに制限されない。好ましくは、陰イオン性洗剤はドデシル硫酸塩である。好ましくは、それは、試薬の総体積に基づき、約０．１〜１０％、より好ましくは０．２〜１．６％、そして最も好ましくは約１．０〜１．２重量／体積％の量で使用される。細胞培養懸濁液のような高ＲＮＡ含量を伴う生物学的サンプルには、ＲＮＡ消化酵素が必要である。好ましいＲＮＡ消化酵素はＲＮアーゼＡである。高ＲＮＡ含量を伴う生物学的サンプルには、商業的に入手可能なＲＮアーゼＡ（例えば、４ｍｇ／ｍＬの濃度で入手可能なピュアジーン［Ｐｕｒｅｇｅｎｅ］ＲＮアーゼＡ、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を、１ｍＬあたり約０．００５〜１ｍｇ、そしてより好ましくは１ｍＬあたり約０．０１〜０．１ｍｇの量で陰イオン性洗剤溶液に添加する。この酵素の活性は、好ましくは、１ｍｇあたり最低約５０単位、そしてより好ましくは１ｍｇあたり最低約１００単位である。
【００７２】
なお別の好ましい態様において、溶解試薬は陰イオン性洗剤のみを包含するが、しかし、キレート剤、緩衝剤もしくはＲＮＡ消化酵素を包含しない。陰イオン性洗剤は上述されたとおり使用される。
【００７３】
本発明は生物学的サンプルからのＤＮＡの精製方法もまた提供する。固相精製には、本発明の方法は、典型的には、ただ１種の試薬および２個の主段階（例えば、洗浄および乾燥）を使用する。当該方法は、生物学的サンプルを、細胞を溶解するために固体支持体と接触させて、それによりＤＮＡを遊離させることを必要とし、ＤＮＡはその後固体支持体に結合する。商業的に入手可能なＤＮＡ精製試薬を、可溶化および不純物の除去を助長するため固体支持体に添加する。この試薬での固体支持体の連続的洗浄は、不純物が固体支持体から除去されることを引き起こす。その後の分析での使用に先立ち、過剰の水性溶液
を、実施例１、２および３に記述されるとおり蒸発もしくは遠心分離のような方法により精製されたＤＮＡを含有する固体支持体から除去することができる。
【００７４】
その後の分析での、精製されたＤＮＡを含有する固体支持体の使用に対する一代替として、ＤＮＡは固体支持体から取り出されてよい。追加の試薬および追加の段階（溶出）を、ＤＮＡが固体支持体から取り出される場合は使用する。好ましくは、ＤＮＡ溶出試薬（Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）を、固体支持体からＤＮＡを取り出すのに使用する。これは実施例４、５、７、８、９、１０、１１および１３に具体的に説明される。
【００７５】
好ましくは、当該方法は、ＤＮＡを含有する固体支持体をＤＮＡ溶出試薬と接触させること、そしてインキュベートすることを必要とする。好ましくは、ＤＮＡ溶出試薬の量は、約１体積の固体支持体に対し約０．２５体積のＤＮＡ溶出試薬であり、より好ましくは、当該体積は約１体積の固体支持体に対し約１体積の試薬であり、そして最も好ましくは、当該体積は約１体積の固体支持体に対し約４体積の試薬である。
【００７６】
インキュベートの温度は、好ましくは最低約３０℃、より好ましくは最低約８０℃、そして最も好ましくは最低約１００℃である。インキュベートの持続期間は、好ましくは最低約２分、より好ましくは最低約５分、そして最も好ましくは最低約１０分である。ＤＮＡは、遠心分離、真空もしくは圧のような標準的方法により固体支持体から取り出される。
【００７７】
好ましい一態様において、固体支持体は、溶解試薬が固体支持体に結合されるように溶解試薬で処理される。溶解試薬は、共有結合で、非共有結合で、固体支持体の内的空間内に捕捉されることにより、もしくは固体支持体の素材（例えば繊維、ビーズなど）上に付着されることにより結合されてよい。生じる生成物が溶解マトリックスである。好ましくは、溶解試薬は固体支持体上で乾燥させられる。
【００７８】
溶解試薬は、好ましくは固体支持体の総体積の最低１／１０に対応する体積で、より好ましくは固体支持体の総体積の最低半分に対応する体積で、そして最も好ましくは、固体支持体の少なくとも総体積に対応する体積で、固体支持体に添加される。
【００７９】
本発明の別の態様においては、溶解試薬は、固体支持体の作成で使用された素材（例えば繊維、ビーズなど）に直接添加されてよく、そして、好ましくは、それが最終の使用者に準備のできた(user-ready)形態（例えば、紙、スワブ、円板、栓、カラムなど）に作成される前に乾燥させられてよい。なお別の態様において、固体支持体は、結晶もしくは粉末の形態の溶解試薬で処理されてそして固体支持体に結合させられてよい。
【００８０】
ＤＮＡは、生物学的物質（培養細胞、全血など）のサンプルが溶解マトリックスを接触することを可能にすることにより単離される。サンプルは溶解マトリックスとの接触前に溶解試薬で処理してよいとは言え、精製の効率およびＤＮＡの収量は、生物学的物質が予め溶解されない場合に大きく向上される。従って、好ましくは、生物学的物質は、細胞を溶解しかつタンパク質コートおよび脂質を可溶化する溶解マトリックスに直接添加される。溶解の効率は、最低３０℃より上で、より好ましくは最低５０℃より上で、そして最も好ましくは最低８０℃より上で加熱することにより向上させることができる。サンプルを溶解マトリックス内で最低１分インキュベート後に、それをＤＮＡ精製試薬で洗浄する。ＤＮＡ精製試薬での溶解マトリックスの連続的洗浄は、不純物が溶解マトリックスから除去されることを引き起こす。好ましくは、ＤＮＡの精製に使用されるＤＮＡ精製試薬の量は、約１体積の生物学的物質に対し約０．５体積のＤＮＡ精製試薬、より好ましくは、約１体積の生物学的物質に対し約２体積のＤＮＡ精製試薬、そして最も好ましくは、約１体積の生物学的物質に対し約５体積のＤＮＡ精製試薬である。好ましくは、ＤＮＡ精製試薬
での洗浄の回数は最低２回、そしてより好ましくは最低３回である。本方法は実施例７、８、９、１０、１２および１３で具体的に説明される。
【００８１】
本発明のさらなる一態様は、酵母およびグラム陽性細菌からのＤＮＡのような核酸の精製方法である。これらの生物学的物質は、典型的には溶解に対しより抵抗性である。当該方法は、生物学的サンプルを、第一の補助試薬、すなわち細胞懸濁試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、細胞懸濁溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）と組み合わせることを必要とする。細胞懸濁試薬は、緩衝剤、キレート剤、および細胞懸濁液を形成するための細胞懸濁剤を包含する。細胞懸濁液に、第二の補助試薬、すなわち溶解酵素試薬（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、溶解酵素溶液（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を添加する。溶解酵素試薬は、細胞壁を消化するための酵素、緩衝剤、試薬のｐＨを調節するための酸および２種の安定剤を包含する。消化された細胞を、上述された液相もしくは固相精製に使用することができる。
【００８２】
本発明の別の局面として、特別のプロトコルを包含するキットが提供され、これは、本明細書に記述される試薬および場合によっては固体支持体と共同して、本発明の方法に従って生物学的物質からＤＮＡを精製するのに使用することができる。このキットは説明手段を包含する。応用に依存して、このキットは、ＤＮＡ精製試薬、ＤＮＡ溶出試薬、ＲＢＣ溶解試薬、細胞懸濁試薬、溶解酵素試薬、タンパク質消化試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）、等張溶液（Ｉｓｏｔｏｎｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、固体支持体、溶解試薬および／もしくはＲＮＡ消化酵素で処理された固体支持体、固体支持体を含有するための容器、廃液を含有するための容器、ならびにいかなる溶出されたＤＮＡも含有するための容器のいずれかの組み合わせもまた包含してよい。２種の好ましいＤＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を以下に記述する。
【００８３】
固相精製を使用する、ＤＮＡを精製するための１キットは、ＤＮＡ精製試薬（例えば、ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）、説明手段、溶解マトリックス、および溶解マトリックスを保持するための容器を含有する。本キットでは、精製されたＤＮＡはその後の分析のため固体支持体に結合されたままである。本キットの使用を具体的に説明する方法を実施例５および２８に示す。
【００８４】
固相精製およびその後の溶出を使用する、ＤＮＡを精製するための１キットは、ＤＮＡ精製試薬、説明手段、ＤＮＡ溶出試薬、固体支持体もしくは溶解マトリックス、固体支持体もしくは溶解マトリックスを保持するための容器、廃棄物を収集するための１個もしくはそれ以上の容器、そして精製されたＤＮＡを収集するための容器を含有する。本キットの使用を具体的に説明する方法を実施例４、５、７、８、９、１０および２５に示す。
【００８５】
本発明をより良好に理解することができるために、固体支持体を含有する容器についての特定の態様を今やより詳細に記述するであろう。
【００８６】
本発明の好ましい一態様において、当該容器は上部に２個の入口ポートを装備されたカートリッジである。入口ポートは雌型ルーアロック［Ｌｕｅｒ−Ｌｏｃｋ］（商標）のようなコネクタによりサンプルもしくは試薬を含有する上流の容器に取付けられる。一方の入口（サンプルポート）は、固体支持体への生物学的サンプルの適用に使用される。サンプルポート上の任意の一特徴は、サンプルがそれを通って移動された後でサンプルポート
を封止する自己封止機構である。第二の入口は試薬ポートとしてはたらく。双方の入口ポート上の任意の一特徴は保護解放(breakaway)封止である。さらに、入口ポート、解放封止および拡散装置が任意のスクリューキャップ中に収容されてよい。固体支持体の底部には、細胞破片、タンパク質および脂質分子の通過に適する孔径をもつ任意の拡散装置がある。この拡散装置は、カートリッジの断面を横断する生物学的物質の均一な横切りを見込み、そして固体支持体の下のどこででも生物学的物質の一様でない集積を予防する。カートリッジの出口は、テーパーバレルの上に適切に嵌まる保護キャップを装備されてできあがる。精製されたＤＮＡは、容易なかつ混入のない貯蔵のため、スナップキャップを伴う円錐チューブより成る収集チューブに収集される。容器全体は、加工されるべきサンプルの大きさおよびその後の分析に必要とされる収量に依存して、大きさに合わせて調整し得る。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様において、容器は、その中に固体支持体が充填されるインサートを保持するよう設計された回転チューブより成る。固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびこれらの組み合わせであってよい。インサートは、それを回転チューブ中に保持するためのフランジをつけられた上部、および固体支持体を支持しつつ液体を通過させる孔底より成る。回転チューブにつながれるキャップはインサートを覆うために使用した。商業的に入手可能な回転チューブの例を、実施例２、４、７、８、９および１０に示す。生物学的物質は孔底を通過し、そして回転チューブの底部で収集される。使用される場合、生物学的物質は固体支持体に適用される。必須の体積の試薬（核酸精製試薬であろうと溶出試薬であろうと）がその後固体支持体に添加される。回転チューブをその後遠心分離器中に置き、そして遠心力にさらし、遠心力は、生物学的物質、精製試薬および精製されたＤＮＡを、精製過程の間に固体支持体を通って引き出す。
【００８８】
なお別の態様において、容器は複数のウェルのプレート、例えば６、１２、２４、４８もしくは９６穴プレートであってよく、ここでは固体支持体が各ウェル中に充填される。各ウェルの底部は出口ポートを有し、それを通って廃棄物および破片が進み得る。
【００８９】
本発明は以下の詳細な実施例への言及によりさらに記述されるであろう。これらの実施例は、多様な特定のかつ具体的に説明する態様および技術をさらに具体的に説明するために提供される。しかしながら、多くの変形物および改変が本発明の範囲内にとどまりつつなされてよいことが理解されるべきである。
【００９０】
以下で挙げられる原料の全部は、シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミズーリ州セントルイスのような商業的供給源から容易に入手可能である。全部のパーセンテージは、別に明記されない限り、試薬の総体積に基づく体積につき体積である。
【実施例】
【００９１】
実施例１．ＤＮＡ精製のための固体支持体の評価
約３ｍｍ直径もしくは２ｍｍ平方の表面積をもつ小片に切断されたいくつかの固体支持体を、ＤＮＡ精製のための支持体として評価した。１μｌ体積の全血を各固体支持体上にピペットで移し、０．６ｍｌチューブもしくは９６穴プレートのウェル中に保持し、そして乾燥させた。ＤＮＡを精製するために、２００μｌのＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を添加し、そして１５分間インキュベートした。ピペットで３回上下して混合した後に、ＤＮＡ精製試薬（溶出された不純物を含有する）を廃棄した。この洗浄処置を、合計３回の洗浄のため
さらに２回反復した。この３段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、固体支持体に結合された精製されたＤＮＡが残った。固体支持体は室温ないし８０℃での蒸発により乾燥し得たとは言え、任意のアルコール洗浄段階を使用して乾燥過程を加速した。２００μｌの体積の１００％エタノールを各固体支持体上にピペットで移し、１分間インキュベートし、そしてその後除去した。１００％のイソプロパノール（２−プロパノール）もまた乾燥を加速するための適するアルコールであることが見出された。エタノールのすすぎを、合計２回のすすぎのためさらに１回反復し、そしてその後、円板を室温で最低２時間乾燥させた。
【００９２】
固体支持体をＤＮＡ増幅アッセイで評価するため、それぞれを０．６ｍｌチューブに移した。各増幅反応は、１×増幅緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、およびＤ１Ｓ８０遺伝子座に特異的なそれぞれ１μＭのプライマーを含有した。このプライマーは、以下のようなオリゴヌクレオチド配列、すなわちセンス５’ＧＡＡ−ＡＣＴ−ＧＧＣ−ＣＴＣ−ＣＡＡ−ＡＣＡ−ＣＴＧ−ＣＣＣ３’（配列番号１）およびアンチセンス５’ＧＴＣ−ＴＴＧ−ＴＴＧ−ＧＡＧ−ＡＴＧ−ＣＡＣ−ＧＴＧ−ＣＣＣ３’（配列番号２）を伴い、バドウル（Ｂｕｄｏｗｌｅ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４８、１３７−１４４（１９９１）により示されるものから短くした。サンプルを、９４℃１分間、７０℃１分間および７２℃２分間の３５周期を使用して増幅した。
【００９３】
この結果は、数種の固体支持体を使用してのＤ１Ｓ８０の増幅産物の存在を示した。ＤＮＡ精製に適することが見出された固体支持体を以下に列挙する。最良の結果（すなわち増幅産物の最大の量）は、セルロース紙固体支持体を使用して観察された。
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
実施例２：全血からのＤＮＡの迅速固相精製
迅速固相精製法を評価するため、２個の血液サンプルを３個体のそれぞれから収集し、一方は新鮮で使用し、そして他方は３ヶ月間−８０℃で凍結させて保存しそしてその後使用前に融解した。３μｌの体積の全血を、２ｍｌ回転チューブ（スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ、カタログ番号９４２４、コーニング コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のインサート中に含有されたＳ＆Ｓ ９０３紙の３ｍｍ直径の円板上にピペットで移した。２００μｌの体積の核酸ＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製試薬、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）をインサート中にピペットで移し、そしてサンプルを１分間インキュベートした。ＤＮＡ精製試薬を、１５，０００×ｇで１０秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を回転チューブ中に収集した。ＤＮＡ精製試薬での第二のおよび第三の洗浄を、合計３回の洗浄のため同一の様式で実施した。精製されたＤＮＡを含有する各円板を、増幅分析のため０．６ｍｌのシリコン処理チューブに移した。回転チューブ中に収集された廃棄物を廃棄した。
【００９７】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５０μｌのＰＣＲ増幅溶液を各円板に添加した。各増幅反応は、１×増幅緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）および１μＭの各プライマーを含有した。リドカー（Ｒｉｄｋｅｒ）ら、Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３２、９１２−９１７（１９９５）により与えられたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、第Ｖ因子の遺伝子配列を３５周期の間増幅し、ここで１周期は９４℃１分間、５８℃１分間および７２℃１分間と定義した。各ＤＮＡサンプルからの１０μｌのアリコートを、２％アガロースゲルにより８０ボルトで４５分間電気泳動して、増幅の結果を決定した。ゲルおよび泳動緩衝液は、透視器上で増幅されたＤＮＡの可視化を可能にするために１ｍｌあたり０．１２５μｇの臭化エチジウムを含有した。
【００９８】
２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、ゲル電気泳動後に６サンプルのそれぞれについて観察された。増幅の結果は、約５分で実施された迅速固相ＤＮＡ精製法が、新鮮もしくは凍結された全血から本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【００９９】
実施例３：数種の生物学的サンプルからのＤＮＡの固相精製
最低２個のＤＮＡサンプルを、以下の生物学的物質（注記された場合を除いてヒト起源）、すなわち全血、骨髄、唾液、頬側細胞、培養されたＫ５６２リンパ腫細胞、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アルファルファ葉および大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌から調製した。全血、骨髄、唾液および頬側細胞切屑のサンプルをＳ＆Ｓ ９０３紙に適用し、乾燥し、そしてその後穴あけ器で３ｍｍ直径の円板を打ち抜くことによりサンプリングした。植物もしくは動物組織のサンプルは、成体のＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒハエもしくはアルファルファの第一葉（子葉）をＳ＆Ｓ ９０３紙上で押すことにより調製した。サンプルを、収集紙と一片のパラフィルム（ＰＡＲＡＦＩＬＭ）「Ｍ」（アメリカン ナショナル キャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ）、コネティカット州グリニッジ）との間に置き、そして親指の圧を用いて押した。培養細胞懸濁液は、Ｋ５６２ヒト細胞もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞のいずれかに適する標準的成長培地中で調製した。約１０，０００個のＫ５６２細胞を含有する１μｌの体積の培地、もしくは約３００万個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含有する５μｌの体積を、３ｍｍ直径の円板上にピペットで移し、そして乾燥した。その後、各円板を実施例１に記述されたとおり精製した。
【０１００】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５０μｌの体積のＰＣＲ増幅溶液を、結合されたＤＮＡを含む円板を含有する各チューブに直接添加した。ＰＣＲ溶液は、プライマーについてを除き、上の実施例２に記述されたようであった。プライマーを以下に示す。全血、骨髄、唾液、頬側細胞、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ組織、およびＫ５６２細胞を、ｍＲＮＡ捕捉キット（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）（ユナイテッド ステイツ バイオケミカル コーポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、オハイオ州クリーヴランド）で与えられるグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子配列に特異的なプライマーを使用して増幅した。ＧＡＰＤＨを増幅するために使用された増幅プログラムは、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間の３０周期であった。全血からのＤＮＡサンプルは、ワン（Ｗａｎｇ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７、７６−８２（１９９４）により記述されたミトコンドリアのプライマーＭＴ−１およびＭＴ−２、ならびにＧＡＰＤＨについて上述された増幅プログラムを使用することにより、染色体外ＤＮＡの存在についてもまた試験した。アルファルファおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡサンプルは、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１、１７６−１７７（１９９１）により記述された１６ｓ様リボソームＤＮＡに特異的なプライマーを使用することにより試験した。増幅プログラムは、９４℃１分間、５０℃１分間および７２℃２分間の３０周期であった。増幅後、５０μｌの反応の１０μｌを、実施例２に記述されたとおりアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１０１】
この結果は、各サンプルが、本質的に純粋なＤＮＡの存在を示す期待された増幅産物を生じたことを示した。全血、骨髄、唾液、頬側細胞、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＫ５６２細胞から精製されたＤＮＡの増幅は、ＧＡＰＤＨの約３００塩基対の増幅産物を生じた。また、全血から精製されたＤＮＡの増幅は、ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマーを使用して約３９４塩基対の増幅産物を生じ；これは、染色体外ＤＮＡが固体支持体の円板上に保持されたことを示した。アルファルファおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡからは、１６ｓ様リボソームＤＮＡ増幅由来の約４００塩基対の増幅産物が観
察された。
【０１０２】
実施例４： 全血および頬側スワブサンプルからのＤＮＡの固相精製および溶出
全血および頬側スワブの含水および乾燥双方のサンプルを試験するため、各型の３サンプルを３個体から収集し、合計１２サンプルを生じた。液体の全血サンプルについて、２５μｌの体積を、２ｍｌ回転チューブ（スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ、カタログ番号９４２４、コーニング コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のインサート中に置かれたＳ＆Ｓ ９０３収集紙の８ｍｍ直径の円板上にピペットで移した。乾燥の全血サンプルについては、８ｍｍの円板を、３００μｌの乾燥された血液のスポットから打ち抜き、そして２ｍｌ回転チューブのインサート中に挿入した。頬側スワブを、滅菌の先端に綿をつけられた(cotton-tipped)スワブ（パーラップス［Ｐｕｒ−Ｗｒａｐｓ］（商標）、ハードウッド プロダクツ（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、メーン州ギルフォード）で内側頬表面を２０回ぬぐうことにより得た。スワブの綿端部を切り離し、そして、含水サンプルについては収集の２時間以内に、また、乾燥サンプルについては２４時間乾燥後に、２ｍｌ回転チューブのインサート中に置いた。サンプルを精製するため、２００μｌのＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を各インサート中にピペットで移し、そして、含水サンプルについて１分、また乾燥サンプルについて１５分インキュベーションした。ＤＮＡ精製試薬を、１５，０００×ｇで１０秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を２ｍｌ回転チューブ中に収集した。ＤＮＡ精製試薬での第二および第三の洗浄を、合計３回の洗浄のため同一の様式で実施した。固体支持体に結合された精製されたＤＮＡを溶出するため、各インサートを清浄な２ｍｌ受容器チューブに移した。その後、１００μｌのＤＮＡ溶出試薬を、固体支持体を含有するインサート中にピペットで移し、そして、１２ｍｍ直径のウェルを含有するアルミニウムブロックを取り付けられた乾燥ブロックヒーター（例えば、ＶＷＲ サイエンティフィック プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）カタログ番号１３２５９−００７）中で、８０℃で１５分間加熱した。ＤＮＡ溶出試薬は、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＮａＯＨおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．９を含有した。加熱した後、各サンプルを１５，０００×ｇで２０秒間遠心分離して、精製されたＤＮＡを収集した。
【０１０３】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５μｌのアリコートを各サンプルから試験した。実施例２に記述された増幅手順を使用した。
【０１０４】
約２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、１２サンプルのそれぞれについて観察された。この結果は、固相精製法が、固体支持体にセルロース収集紙および綿スワブを使用して、含水および乾燥双方の血液および頬側細胞サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【０１０５】
実施例５：カートリッジを使用する全血および培養細胞中のＤＮＡの精製
カートリッジを、標準的な１ｍｌポリプロピレンシリンジ（カタログ番号３０９６０２、ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用して構築し、その中に固体支持体を挿入した。固体支持体は、約５ｍｍ直径×２７ｍｍ長さの寸法のセルロースアセテート（フィルトローナ［Ｆｉｌｔｒｏｎａ］（商標）、アメリカン フィルトローナ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｉｌｔｒｏｎａ）、ヴァージニア州リッチモンド）から構成された。固体支持体は、既に５００μｌの溶解試薬およびＲＮアーゼＡで処理しそして室温で２４時間乾燥させてあった。溶解試薬は、０．５％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス、０．１Ｍ ＥＤＴＡを含有し、これに０．０４ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを添加した（１ｍｇあたり約１００単位のＲＮアーゼＡ）。それぞれ３００μｌの体積中に約２００万個の細胞を含有する、２個の全血サンプル
および２個のＫ５６２培養細胞サンプルを、それぞれ垂直の位置に支持されたカートリッジにピペットで移した。細胞を溶解させそしてＲＮアーゼにサンプル中に存在するＲＮＡを消化させるために室温で１５分間インキュベートした後に、３００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を、６０ｒｐｍのペリスタリックポンプ（カタログ番号ＭＣ１３００３、マークソン サイエンス（Ｍａｒｋｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、オレゴン州ヒルズボロ）を使用して２．５ｍｍ内径のシリコンチューブを介して導入した。１分のインキュベート後に、空気を、カートリッジを通してポンプで送って、カートリッジの内容物を廃棄物容器中に排出した。その後、第二の３００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬をカートリッジ中にポンプで送り、そして１分インキュベートした。この洗浄段階を、ＤＮＡ精製試薬での合計３回の洗浄のためさらに１回反復した。カートリッジ中の固体支持体を、それを通して３００μｌのＤＮＡ溶出試薬をポンプで送ることによりすすいだ。精製されたＤＮＡを固体支持体から取り出すために、３００μｌのＤＮＡ溶出試薬をカートリッジ中にポンプで送った。カートリッジを、双方の端部で栓をし、そして重力対流オーブン中６０℃で３０分間インキュベートした。あるいは、適切な電子レンジを使用してもよい。カートリッジは、１１００Ｗのシャープ（Ｓｈａｒｐ）電子レンジ中で、３０％出力で２５分間加熱してよい。その後、精製されたＤＮＡを含有したＤＮＡ溶出試薬を、カートリッジからそして１．５ｍｌ微小遠心管中にポンプで送った。あるいは、ＤＮＡ溶出試薬を、６０℃より上の温度に加熱し得そしてその後カートリッジ上にポンプで送り得る。
【０１０６】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５μｌのアリコートを各サンプルから試験した。実施例２に記述された増幅手順を使用した。
【０１０７】
約２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、４サンプルのそれぞれについて観察された。この結果は、カートリッジの形式の固相精製法が、全血もしくは培養細胞双方のサンプルから本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【０１０８】
実施例６：個体支持体に結合されたＤＮＡの精製および制限酵素消化
ＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して精製されたＤＮＡの質を、固体支持体に結合されている間にさらに試験するため、７種の制限酵素を使用して精製されたＤＮＡを消化するそれらの能力を試験した。単一の個体からの３００μｌの体積の全血をＳ＆Ｓ ９０３紙上にピペットで移し、そして室温で乾燥した。その後、７個の５ｍｍ直径の円板を押して抜き取り、そしてそれぞれを０．６ｍｌチューブ中に置いた。２００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬を各チューブに添加し、そして１５分間インキュベートした。ピペットで３回上下して混合した後に、ＤＮＡ精製試薬を廃棄した。この洗浄処置を、合計３回の洗浄のため２回反復した。この３段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、円板に結合された精製されたＤＮＡが残った。２００μｌの体積の１００％イソプロパノール（２−プロパノール）を各円板上にピペットで移し、１分間インキュベートし、そしてその後除去した。これを、合計２回のアルコールのすすぎのため１回反復した。精製されたＤＮＡを含有する円板を室温で２時間乾燥させた。
【０１０９】
各円板に結合されたＤＮＡの質を試験するため、２５μｌの体積の制限酵素溶液を各チューブに直接添加した。各制限酵素溶液は、製造元（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー）により供給された適切な緩衝剤、および２．５ｍＭのスペルミジン（シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ））を含有した。以下の酵素、すなわち、Ｐｓｔ Ｉ（１２単位）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（２０単位）、Ｅｃｏ ＲＩ（２０
単位）、Ｍｓｐ Ｉ（２０単位）、Ｂａｍ ＨＩ（２０単位）、Ｈｐａ Ｉ（５単位）、およびＨａｅ ＩＩＩ（１０単位）を、明記された各反応に添加された単位で試験した。サンプルを３７℃で４時間消化し、その時間の間、消化されたＤＮＡフラグメントは固体支持体から消化溶液中に遊離された。制限フラグメントを収集するために、各サンプルチューブを２７ゲージの針を用いて刺し通し、そして清浄な０．６ｍｌチューブ中に置いた。消化溶液を、２，０００×ｇで２分間の遠心分離により収集した。精製されたＤＮＡが消化されたかどうかを決定するために、２０μｌの体積を各サンプルから取り出し、そして１％アガロースゲルにより２２ボルトで１２時間電気泳動した。
【０１１０】
この結果は、試験された７種の酵素のそれぞれについて高分子量から低分子量までの範囲にわたるＤＮＡ制限フラグメントの特徴的なスメアの存在を示した。これは、このＤＮＡサンプルが本質的に純粋でありそして制限酵素消化に適したことを立証した。
【０１１１】
実施例７．固体支持体の処理に関する界面活性剤の評価
種々の界面活性剤を試験して、ＤＮＡの収量を至適化するために必要な界面活性剤の最良の種類を決定した。以下の種類の界面活性剤を試験した：
アニオン性 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
Sarkosyl
カチオン性 ドデシルトリメチラム−モニウム ブロミド
非イオン性 Tween-20
Triton X-100
【０１１２】
対照は、界面活性剤を含めず、そしてサンプルを加えずに設定した。
【０１１３】
使用した各ポリスルホン固体支持体は、25.31mmの円周および9.73mmの高さを有した（Filtrona(商標)、ロット#18475、アメリカン フィルトロナ（American Filtrona)、リッチモンド、バージニア州）。360μl容量の１％界面活性剤溶液を、各固体支持体に添加し、室温で少なくとも16時間、固体支持体を飽和した。２連の固体支持体を各処理について調製した。固体支持体を２mlのスピン管（スピン−Ｘ、カタログ番号9424、コーニング コースター（Corning Costar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)のインサート中に置いた。約２百万個の細胞を300μl中に含む全血サンプルを各固体支持体に適用し、そして室温で少なくとも１時間インキュベートして、細胞を溶解させた。200μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社(Gentra Systems,Inc.)，ミネアポリス、ミネソタ州）を次に加えた。１分インキュベートした後、ＤＮＡ精製試薬を15,000×gで10秒間遠心して２mlの回収管に不純物を集めることにより除去した。これを全部で３回洗浄するために２回繰り返した。廃液は２回目および３回目の洗浄の間に受容管から除去した。次に固体支持体は200μlのＤＮＡ溶出試薬（１mM Tris、0.001mM EDTA、５mM NaOH）を加え、そして15,000×gで10秒間遠心することによりすすいだ。精製したＤＮＡを支持体から取り出すために、固体支持体を含有するインサートをきれいな受容管に移し、そして200μlのＤＮＡ溶出試薬をそれに加えた。次に固体支持体を80℃で10分間、ドライブロックヒーター（例えばVER サイエンティフィック プロダクツ(Scientific Products) カタログ番号13259-007)中でインキュベートし、そして精製したＤＮＡを含有するＤＮＡ溶出試薬を15,000×gで20秒間遠心することにより取り出した。
【０１１４】
ゲノムＤＮＡの収量およびＰＣＲ増幅収量を測定し、精製したＤＮＡを評価した。相対的なゲノムＤＮＡの収率を決定するために、10μl容量の精製したＤＮＡを１μlの10×標準追跡色素と混合し、そして0.125μg/mlのエチジウムブロミドをゲルおよび泳動緩衝剤に含有する0.7％アガロースゲルに乗せた。ＤＮＡを80ボルトで15分間泳動し、そしてバンドはUVトランスイルミネーター上でバンド強度について視覚的に調査した。
【０１１５】
ＰＣＲ増幅アッセイは、2.5μlの精製したＤＮＡサンプルを22.5ＰＣＲ増幅ミックスに直接加えることにより、25μlの全増幅容量について行った。各増幅反応は１×増幅緩衝剤（プロメガ（Promega)、マジソン、ウィスコンシン州）、1.5mM MgCl2、200μMの各デオキシメクレオチド、1.25単位のTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、および１μMの各プライマーを含んだ。プライマーはヒトベータグロビン遺伝子に特異的な配列であった:
センス５’ＣＣＴ−ＧＧＣ−ＴＣＡ−ＣＣＴ−ＧＧＡ−ＣＡＡ−ＣＣＴ−ＣＡＡ３’（配列番号３）およびアンチセンス５’ＴＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＣ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＴ−ＴＣＴ３’（配列番号４）。サンプルは、94℃で１分間、70℃で１分間、そして72℃で2分間の35サイクルを使用して増幅した。次に10μlの増幅したＤＮＡは、0.125μg/mlのエチジウムブロマイドをゲルおよび泳動緩衝剤に含有する２％アガロースゲルに乗せた。サンプルは80ボルトで45分間電気泳動し、そして1.1kbのＤＮＡバンドをUVトランスイルミネーター上で視覚化した。界面活性剤は表２に示すように、ゲノムおよび増幅ＤＮＡの両方についてバンド強度を視覚で順位付けすることにより評価した。
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
非イオン性の界面活性剤は、対照を上回るＤＮＡ収量の実質的に向上を示さなかった。使用したカチオン性界面活性剤は、ゲノムＤＮＡ収量において約２倍の上昇を示した。２つのアニオン性界面活性剤は、ゲノムおよび増幅ＤＮＡについて最高の収量を与えた。
【０１１８】
実施例８．ＤＮＡ増幅に及ぼすNaOH濃度、界面活性剤の種類および固体支持体密度の効果
NaOH濃度および界面活性剤の種類（アニオン性または両イオン性であるか）の効果を、２種の固体支持体密度で調査した。０または５mM NaOHおよび１％ ドデシル硫酸ナトリウムまたは１％CHAPSを含有する４種の溶液を調製した。CHAPSは市販されている両イオン性界面活性剤である。各360μl容量のこのような溶液を実施例７に記載するように固体支持体に加えた。調査した２種類のポリオレフィン固体支持体密度は、0.113グラム繊維／cc（低密度）および0.184グラム繊維／cc（高密度）（Filtrona(商標)、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州）であった。300μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして実施例７に記載したように、しかし150μl容量のＤＮＡ精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）の使用は除いて溶出させた。精製したＤＮＡはＰＣＲ増幅およびＵＶ分光光度計により分析した。使用したＰＣＲプロトコルは、実施例７に記載したものと同一であった。ゲノムＤＮＡの収量は、ＵＶ分光光度計および0.7％アガロースゲル電気泳動により調査した。ＵＶ
分光光度計によりＤＮＡを定量するために、50μlの精製したＤＮＡを950μlの脱イオン水に最初に加えた。次にＵＶ吸収を320（バックグラウンド）nmおよび260nmおよび280nmの波長で測定した。収量はＡ260×50×希釈因子×溶出容量として計算した。
【０１１９】
結果は、NaOH無し、および５mM NaOHを使用して行った固体支持体処理に関して、ＤＮＡ収量に検出できる差異はないことが示された。ＤＮＡ収量において、SDSの使用はCHAPSより2.8倍上昇した。高密度固体支持体を使用すると低密度固体支持体よりも75％の上昇が観察された。
【０１２０】
実施例９．錯化剤、塩および界面活性剤が固体支持体の処理に及ぼす効果
錯化剤、塩および界面活性剤が固体支持体の処理に及ぼす効果を決定するために、ポリオレフィン固体支持体を0.5％または2.0％のドデシル硫酸ナトリウム、０または50mM EDTAおよび０または100mM NaClを含有する８種類の溶液を用いて処理した。実施例７に記載したように200μlの全血サンプルを各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出させた。精製したＤＮＡを回収し、そしてゲノムＤＮＡの収量を実施例８に記載したようにＵＶ分光光度計により調査した。相対的収率は、さらに実施例７に記載したように0.7％アガロースゲルで精製したＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動することにより視覚化した。０と50mM NaClの間で観察されるＤＮＡ収率の差異は無かった。同様に０と50mM EDTAとの間で観察されるＤＮＡ収量の差異は無かった。しかし２％SDSに比べて0.5％SDSを使用した時、収率が３倍向上した。
【０１２１】
実施例１０．最適なアニオン性界面活性剤濃度の決定
最適なアニオン性界面活性剤濃度は、ポリオレフィン固体支持体を0.2〜1.6％の範囲のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液を用いて処理することにより予測した。固体支持体は実施例７に記載するように0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6％SDSを含有する８溶液で処理した。実施例７に記載するように200μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出した。精製したＤＮＡを集め、そしてゲノムＤＮＡの収量を実施例７に記載したようにアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
【０１２２】
0.7％アガロースゲル上のバンド強度の見積もりは、すべての濃度のSDSが良好なゲノムＤＮＡ収量を示したが、２つの最高の収量は1.0および1.2％濃度のSDSで観察されたことを示した。
【０１２３】
実施例１１．ＤＮＡ溶出に及ぼす時間および温度の変動効果
ＤＮＡ収量に及ぼす時間および温度の効果を、実施例７に記載したポリオレフィン固体支持体を使用して試験した。200μlの血液サンプルに由来するＤＮＡは、ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いた２回の400μl洗浄およびＤＮＡ溶出試薬を用いた１回の洗浄を使用して精製した。
【０１２４】
さらに200μl容量のＤＮＡ溶出試薬を加えた後、サンプルをドライブロックヒーター（VER サイエンティフィック プロダクツ、カタログ番号13259-007)中で４種の溶出温度で10分間インキュベートした。各インキュベート温度に関して、３種のサンプルの平均を表３に与える。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
100℃のインキュベート温度で、最高のＤＮＡ収量を与えた。さらに120℃の試験では、実質的な向上は観察されなかった。
【０１２７】
溶出工程中、99℃でのインキュベート時間の効果を第２の全血サンプルを使用して調査した。異なるドライブロックヒーター（ロビンズ サイエンティフィック(Robbins Scientific)、TruTemp(商標)、サニーバレ、カリフォルニア州）を使用したことを除き、上記と同じ精製プロトコルを使用した。結果を表４に示す。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
99℃で少なくとも９分間のインキュベート時間が、最適なＤＮＡ収量を与えることが分かった。
【０１３０】
実施例１２．固体支持体を含む容器の設計
カートリッジは、中に固体支持体が挿入された標準の１mlのポリプロピレンシリンジ（カタログ番号309602、ベクトン デッキンソン（Beckton Dickinson）、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を使用して構成した。固体支持体は、約５mm直径×27mm長の酢酸セルロース（Filtrona（商標)、アメリカン フィルトロナ、バージニア州）から成った。
【０１３１】
第２設計では、カートリッジは最上部に２つの入口部分を備えている。１つの入口（サンプル口）は、生物サンプルを固体支持体に適用するために使用される。サンプル口の最適な形状は、サンプルがこれを通って輸送された後にサンプル口を密封する自己密封メカニズムである。第２入口は試薬口として役立つ。両方の入口について最適な形状は、保護離脱型シールである。固体支持体の底は、細胞屑、タンパク質および脂質分子の通過に適する孔サイズの随意の拡散器である。この拡散器はカートリッジの断面を横切る生物学的物質の公平な分散を可能とし、そして固体支持体下の任意の場所で生物学的物質の不公平な蓄積を防ぐ。カートリッジの出口は、保護カップを備えるようになっている。精製されたＤＮＡは、保存の容易さ、および混入が無い保存のためにスナップカップを持つ0.5mlのコニカル管から成る回収管中に集められる。
【０１３２】
別の容器設計では、スピン管（スピン-Ｘ、コーニング コスターNo.9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)が使用され、これは固体支持体を中に配置したインサートを含む。使用した固体支持体はインサート中に置かれたポリオレフィンプラグ（アメリカン フィルトロナ、バージニア州）であった。インサートはスピン管内にポリオレフィンプラグを維持するためのつば付の最上部および固体支持体を支持する間に流体を通過させる孔底から成る。スピン管につながれたカップは、インサートを覆うために使用した。市販されているスピン管の例は、実施例１に与える。生物学的物質は孔底を通過し、そしてスピン管の底で集められる。使用する時、生物学的物質は固体支持体に適用する。次に必要な試薬容量を（ＤＮＡ試薬またはＤＮＡ溶出試薬であっても）、固体に適用する。次にこのスピン管を遠心機に置き、そして生物学的物質、精製試薬および精製ＤＮＡを精製工程中に固体支持体を通ってを引き出す遠心力をかける。
【０１３３】
実施例１３．96-ウェルプレート系でのポリオレフィン固体支持体の使用試験
高処理量システムでＤＮＡ精製の効力を試験するために、親水性ポリオレフィン固体支持体（R-18495、アメリカン フィルトロナ社、リッチモンド、バージニア州）を、800μlのウェル容量を持つ96-ウェルプレート（マサチューセッツ州、ロックランドのポリフィルトロニックス（Polyfiltronics)による、フィルター無しで製造されたユニフィルタープレート(Unifilter plate)）中のウェルに挿入した。固体支持体はサイズが円筒状であり、そして16.7mmの円周および10mmの長さを有した。前述の96-ウェルサンプル処理プレートを、廃液回収プレートとして役立つ２mlウェル容量を持つ別の96ウェルプレート上に置いた。100μl容量の全血を各固体支持体に適用し、そして１分間インキュベートした。続いて固体支持体は、200μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）をウェルに加えることにより２回洗浄し、そして１分間インキュベートした。続いて廃棄材料は、マイクロプレートキャリアーを装備したM4ローターを持つJouan C412遠心機（ジョアン（Jouan）、ウィンチェスター、バージニア州）中で1500×gにて１分間、遠心することにより除去した。次に固体支持体は、100μlのＤＮＡ溶出試薬を用いて洗浄し、そして上記のようにインキュベーション無しで遠心した。洗浄した固体支持体から精製したＤＮＡを溶出するために、処理プレートをきれいな標準ポリスチレン96-ウェルプレートに移し、そして100μl容量のＤＮＡ溶出試薬を各ウェルに加えた。積み重ねた処理プレートおよびサンプル回収プレートを80℃に設定した対流オーブン（BioOven I、セント ジョーンズ アソシエイツ（St.John's
Associates)、ベルツビレ、メリーランド州）に置き、そして30分間インキュベートした。次にＤＮＡを固体支持体から1500×gで１分間遠心することにより溶出させた。８つの10μlのサンプル溶出物を80ボルトで15分間、１％アガロースゲル中で電気泳動することにより、ＤＮＡの存在を分析した。８サンプルの各々が、ＵＶトランスイルミネーターで調査することにより視覚化されるようなＤＮＡを含んだ。
【０１３４】
実施例１４．固体支持体をRNaseAで処理する効果
300μl容量の溶解試薬（0.5％ SDS、0.1M Tris塩基、0.1M EDTA二ナトリウム塩）を、酢酸セルロース固体支持体（アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州） に適用し、そして室温で乾燥させた。第２の固体支持体は、0.04mg/mlのRNaseA（ミネソタ州、ミネアポリスのジェントラ システムズ社からの4mg/mlで）も含む溶解試薬で処理し、そして室温で乾燥させた。固体支持体は８mmの直径および6.75mmの長さを有した。２つの処理した固体支持体をスピン管のインサート中に置き（実施例８に記載したように）、そして150μl容量の大腸菌（E.coli）の一晩のバクテリアカルチャーを各固体支持体に直接加えた。大腸菌（E.coli）のバクテリアカルチャーは、大量のＲＮＡを含み、そして固定化されたＲＮＡ消化酵素の効力を試験するためのモデルとして役立った。次にサンプルは37℃で12分間インキュベートしてＲＮＡ消化を可能とした。続いてそれらを150μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製試薬、ジェントラ システムズ社、ミネ
アポリス、ミネソタ州）で３回、洗浄した。次に150μlの塩基性溶出試薬（10mM Tris、0.1M EDTAおよび１mM NaOH）を固体支持体に室温で20分間加えた。核酸は15,000×gで10秒間遠心することにより溶出させた。10μl容量を、80ボルトで60分間、１％アガロースゲルを通して電気泳動することにより、ＤＮＡの存在について分析した。ＵＶトランスイルミネーター上でのゲルの調査では、溶解試薬を用いて処理した固体支持体を使用して精製されたサンプル中のＲＮＡに対応する主要な低分子量スメア（約0.1〜1.4kb）の存在が明らかに示された。対照的に、RNaseAを加えた溶解試薬で精製したサンプルは、低分子量ＲＮＡスメアを欠き、RNaseの存在が混入ＲＮＡの除去に効果的であることを示している。
【０１３５】
実施例１５．ＤＮＡ増幅のためのＤＮＡ溶出試薬の至適化
溶出溶液は、固体支持体から最高のＤＮＡ収量を提供し、そしてPCR緩衝剤系を妨害せずに高いPCR収量を生成するように至適化した。塩基、NaOHまたはKOHのいずれか、トリス緩衝剤および錯化剤（EDTA）の至適濃度は、PCRを使用してＤＮＡ増幅収量につい試験した。
【０１３６】
条件は、25μlの全血サンプルをスピン管中に含まれるセルロース固体支持体に加えることにより試験した。続いてセルロース固体支持体は、200μlのＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で３回洗浄し、そしてＤＮＡ溶出試薬で２回洗浄した。サンプルは、ＤＮＡ溶出試薬中の塩基濃度を除き、すべて同一に処理した。ＤＮＡ溶出試薬中の１〜８mM NaOH濃度を試験した。
【０１３７】
β-アクチン増幅標的を使用するTaqMan7700Quantitative PCRシステムを製造元（パーキン エルマー(Perkin Elmer)、アプライドバイオシステムズ デビジョン（Applied Biosystems Division)、ホスター市、カリフォルニア州）が推薦するようにＤＮＡ増幅に使用した。増幅阻害について試験するために、連続希釈を各試験サンプルについて調製し、そして各々についてコンピューター処理したＤＮＡ量から出発した。阻害も最高の希釈物で最大に希釈されるので、最高希釈ですべての試験サンプルをＤＮＡサンプルと比較した。希釈したＤＮＡ試験サンプルが最大の希釈でＤＮＡサンプルと同様の収量を与えるならば（希釈因子による調整後に）、その試験サンプル中には増幅阻害が無いと予想される。
【０１３８】
最良のPCR収量は、５〜８mM NaOHで得られた。KOHを用いた同様の実験では、NaOHまたはKOHを使用するPCR収量に差異は示されなかった。
【０１３９】
この緩衝剤濃度およびEDTA濃度は、どの濃度が高いPCR収量および低い増幅阻害を至適化するかを決定するために試験した。Tris緩衝剤濃度を１mMから0.1mMに下げ、そしてEDTA濃度を0.1mMから0.001mMに下げると有意に増幅阻害が減少することが観察された。
【０１４０】
実施例１６．洗浄および溶出手順の至適化
さまざまな洗浄および溶出手順を試験して、どの組み合わせが至適なＤＮＡ収量および低い％増幅阻害を提供するかを、TaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して決定した。PCR手順は実施例４に記載した通りである。
【０１４１】
25μl容量の血液は、スピン管（スピン-Ｘ、コーニング コースター、カタログ番号9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)中に含まれるセルロース固体支持体に適用し、そして５分間吸収させた。ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）での各洗浄には２分間を要した。ＤＮＡ溶出試薬を固体支持体に80℃で20分間適用した。種々の精製および溶出手順は、以下に掲げるものを含め試験した。各手順は３連で試験した。
(１) ３×150μl NA精製試薬＋１×150μl DNA 溶出試薬
(２) ４×200μl NA精製試薬＋１×200μl DNA 溶出試薬
(３) ３×200μl NA精製試薬＋２×200μl DNA 溶出試薬
結果を表５に示す。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
両手順（２）および（３）は、良好な純度および収量を与えた。
【０１４４】
実施例１７．固体支持体処理の至適化
セルロース固体支持体は、未処理固体支持体に対する比較のために異なる組成を有する溶解試薬を用いて処理した。第１組成は、0.5％SDS、0.1M Trisおよび0.1mM EDTAから成り、一方第２組成は１％SDS、10mM Trisおよび0.1mM EDTAから成った。セルロース紙をスピン管（スピン-Ｘ、コーニング コースター番号9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に挿入し、そして２つの上述の組成で処理した。処理したセルロース紙を次に室温で少なくとも16時間、乾燥させた。未処理セルロース紙も、処理したサンプルに対する比較として使用した。25μl容量の血液を各セルロース固体支持体に適用し、そして５分間インキュベートした。ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いた３回の洗浄およびＤＮＡ溶出試薬を用いた２回の洗浄を含む最適な精製法を行った。ＤＮＡを回収し、そしてTaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して分析し、ここでβ-アクチン増幅標的を製造元（パーキン エルマー、アプライドバイオシステムズ デビジョン、ホスター市、カリフォルニア州）が推薦するようにＤＮＡ増幅に使用した。
【０１４５】
１％SDS処理により最高のＤＮＡ収量を得た。SDSのレべルを0.5％から1.0％に下げた時、ＤＮＡ収量および％増幅に有意な検出できる差異は無かった。しかしSDSの不在ではＤＮＡの収量が50％まで減少し、そして阻害が10％から40％以上に上昇した。
【０１４６】
実施例１８．ＤＮＡ精製の分析：ＤＮＡ純度の測定
全血のサンプルを、EDTA（B-D16852、ベクトン デッキンソン アンド社(Becton Dickinson & Co.)、フランクリン レイクス、ニュージャージー州）を含むバキュテイナー（vacutainer)管に引き出し、そして良く混合した。全血の小さいアリコートを取り出し、そして白血球細胞の総数をCBC5細胞カウンター（コールター エレクトロニックス(Coulter Electronics)、ハイアレア、フロリダ州）で製造元の指示に従い計数した。これにより7.25×106細胞／mlと決定された。次に血液の残りを１mlのアリコートで-80℃にさらに精製を必要とするまで凍結した。
【０１４７】
凍結した血液を37℃の水浴中で急速に解凍し、そして使用するまで氷上に維持した。７つの200μlの血液サンプルをアリコートに分け、そしてそれぞれインサート中に収容された溶解マトリックス、および回収管を含む２mlのスピン管（スピン-Ｘ、カタログ番号942
4、コーニング コースター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に加えた。溶解マトリックスは直径８mmおよび高さ８mmの円筒状のポリオレフィン固体支持体マトリックスから成った（Filtrona(商標)、カタログ番号18475、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州）。ポリオレフィン固体支持体マトリックスは、１％SDSおよび20μg/ml RNaseAを含む溶液ですでに飽和され、そして続いて乾燥された。
【０１４８】
サンプルを少なくとも１分間、マトリックスに吸収させた後、400μlのＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）をサンプルに加え、そして室温で１分間インキュベートした。不純物はスピン管を12,000×gで10分間遠心することにより２mlのスピン管中に集めた。固体支持体を含むインサートは第２スピン管に移し、そして第１スピン管を捨てた。別に400μlのＤＮＡ精製試薬を固体支持体に加え、室温で１分間インキュベートし、そしてスピン管を12,000×gで10分間遠心した。200μl容量のＤＮＡ溶出試薬を固体支持体に加え、そしてインキュベートせずに遠心した。精製したＤＮＡを含む各固体支持体を次にきれいな２mlのスピン管に移し、そして200μl ＤＮＡ溶出試薬を加えた。管を99℃で10分間インキュベートし、そして精製したＤＮＡは12,000×gで20秒間遠心することにより固体支持体から溶出した。
【０１４９】
ヘムのような不純物は、血液中を含むＤＮＡ精製工程中の主要な混入物である。ヘムの存在は、自動化EL311マイクロプレートリーダー（バイオ-テックインスツルメンツ社（Bio-Tek Instruments Inc.)、ビノースキー、バーモント州）を使用して測定することができる。サンプルを１：50に脱イオン水中で希釈し、そして200μl容量を96ウェルプレート中に入れた。吸収は405nmで測定した。405nmでの吸収が0.01nm未満である時、サンプルの純度を確定した。７つのサンプルについて405nmでの平均可視吸収は0.004であり、高度な純度を示していた。
【０１５０】
別のＤＮＡ純度の見積もりは、260nmおよび280nmでの吸収比、Ａ260／Ａ280である。この比の値が1.7〜2.0の間であれば、サンプルはタンパク質および他の混入物が比較的少ないと考えられる。この比は以下のように算出される：
（Ａ260−Ａ320）／（Ａ280−Ａ320）
【０１５１】
７つのサンプルに関する平均Ａ260／Ａ280比は、1.95であると分かり、これは実質的に純粋なＤＮＡであることを示している。
【０１５２】
実施例１９．ＤＮＡ精製の分析：ＤＮＡ濃度および収量の測定
実施例１８からの７種の精製したサンプルを、さらに濃度および収量について分析した。各々のサンプルの１：50希釈を脱イオン水中で、ＤＮＡ溶出試薬を含むブランクと共に調製した。320nm（バックグラウンド）、260nmおよび280nmで の吸収を、ベックマン DU64分光光度計（ベックマン インスツルメンツ社(Beckman Instruments,Inc.)、フラートン、カリフォルニア州）を使用して読んだ。ＤＮＡ濃度は以下のように算出した：
（Ａ260−Ａ320）Ｘ 50（ＤＮＡ消光係数）Ｘ 50（希釈因子）
【０１５３】
７種のサンプルの平均は、41μg/mlとなることが分かった。この濃度に次にサンプル容量（200μl)をかけて、各７つのサンプルについて8.2μgの平均収量を得た。
【０１５４】
理論的な最大収量は、白血球細胞のカウントから決定され、各ヒト二倍体細胞が６pgのＤＮＡを有すると予想された。したがって以下の計算式に基づき、8.7μg ＤＮＡの理論的最大収量を得る。
（7.25×106細胞／ml）Ｘ（0.2ml）Ｘ（6×106μg）＝8.7μg
【０１５５】
収率を計算するために、8.2μgＤＮＡの平均収量を8.7μgの理論的最大収量で除算した
。この計算により94％の収率を得た。
【０１５６】
定量後に、ＤＮＡ濃度を必要に応じて希釈または濃縮により調整することができる。ＤＮＡが濃すぎるならば、脱イオン水のような希釈剤で希釈することができる。ＤＮＡが希釈されすぎているならば、標準的なアルコール塩沈殿法を使用することにより濃度することができる。この方法では、塩化ナトリウムを100mMまで、（ＤＮＡサンプル容量について)２倍容量の100％エタノールを用いて加える。サンプルは管を上下逆転させながら混合し、そして15,000×gで５分間遠心してＤＮＡをペレットにする。このＤＮＡペレットは、３倍容量の70％エタノールを加えることにより洗浄し、管を上下逆転させ、そして15,000×gで１分間遠心する。上清を捨てた後、ペレットを15分間風乾させる。次に脱イオン水のような水和溶液を加えて所望の、より濃縮された溶液を調製する。
【０１５７】
しかしPCR増幅に先立ち、このようなサンプルを濃縮調製する必要は無かった。
【０１５８】
実施例２０．ＤＮＡサイズの分析
実施例１８の７種の各サンプルに関するＤＮＡサイズは、HindIIIで消化したラムダＤＮＡの23.1kbバンドと比較することにより決定した。７種の各200μlのＤＮＡサンプルをから10μlの容量を追跡色素と混合し、そして１％アガロースゲルに乗せた。サンプルを80ボルトで１時間、１ＸTAE泳動緩衝剤中で電気泳動した。ゲルおよび泳動緩衝剤の両方が、ＤＮＡをトランスイルミネーター上で視覚化できるように0.125μg/mlのエチジウムブロミドを含んだ。ＤＮＡサンプルとマーカーレーンと比較することにより、95％より多くのＤＮＡが23.1kbマーカーを越え、ＤＮＡが実質的により高分子量であることを示した。
【０１５９】
実施例２１．精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅および後の制限酵素消化に対する適性試験
実施例１７からの７種の各サンプルを、それらがPCRによる分析に適するかどうかを見るために試験した。2.5μl容量の７種の各サンプルを22.5PCR増幅ミックスに加えて、全増幅容量を25μlとした。各増幅反応は、１Ｘ増幅緩衝剤（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、1.5mM MgCl2、200μM 各デオキシヌクレオチド、1.25単位のTaq DNA ポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、および１μM 各プライマーを含んだ。プライマーは、遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子スクリーニングに使用するHLA-H遺伝子の領域に特異的な配列、５’−ＴＧＧ−ＣＡＡ−ＧＧＧ−ＴＡＡ−ＡＣＡ−ＧＡＴ−ＣＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＴＣ−ＡＧＧ−ＣＡＣ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＣＡＡ−ＣＣ−３’（配列番号６）（Federら、1995,Nature Genetics 13:399-408）であった。サンプルは94℃で１分間、58℃で１分間、そして72℃で１分間の35サイクルを使用して増幅した。
【０１６０】
ＤＮＡサンプルが適当な増幅鋳型であるかどうかを決定するために、７サンプルを増幅生成物の存在および正しいサイズ（388bp）の両方について調査した。７つの各反応から10μl容量を、0.125μg/mlのエチジウムブロミドをゲルおよび泳動緩衝剤に含む２％アガロースゲルに乗せた。サンプルは80ボルトで45分間電気泳動し、そしてＤＮＡバンドをトランスイルミネーター上で視覚化した。７種の各サンプルは388bpサイズを越える大きなバンドを与え、ＤＮＡの純度はPCR増幅に適することが示された。
【０１６１】
増幅したＤＮＡサンプルは、次にそれらが制限酵素RsaIにより消化される能力について試験した。この酵素は遺伝性疾患のヘモクロマトーシスに関係するＤＮＡ点突然変異を検出するために臨床研究室で使用されている。10μl容量の増幅反応物を、3.3mgのウシ血清アルブミン、3.3単位のRsaIおよび1.5μlの10×制限酵素緩衝剤（すべての成分はマサチューセッツ州、ヴェバリーのニューイングランド バイオラボズ(New England BioLabs)から)を含む５μlのRsaI制限酵素ミックスと混合した。サンプルを37℃で30分間インキュベートし、制限酵素が増幅したＤＮＡを消化できるようにした。
【０１６２】
15μlの反応容量の７種の各サンプルは、85ボルトで60分間泳動する２％アガロースゲル中で電気泳動した。エチジウムブロミドは0.125μg/mlでゲルおよび泳動緩衝剤中に存在し、トランスイルミネーター上でのバンドの視覚化を可能とした。ゲルの調査により、７種のすべてのサンプルがRsaI制限酵素部位で効果的に切断されたので、388bpのバンドは存在しなかった。各７レーンで、２つのバンドが約250および140bpのサイズで検出できた。
【０１６３】
実施例２２．ＤＮＡ精製試薬を使用して精製したＤＮＡの制限酵素消化およびサザンブロット分析
７種の５mm直径の乾燥した血液スポットに由来するＤＮＡを、実施例６に記載したように精製し、消化し、そして電気泳動した。電気泳動後、制限断片をナイロン膜（Biotrans+(商標)、ICNバイオメディカルズ社（Biomedicals,Inc.)、イルバイン、カルフォルニア州）に、0.4N NaOHおよび0.6M NaClを含有する転写溶液を使用してサザンブロットにより７時間にわたり転写した。このナイロンブロットを65℃で14時間、HYB-9（商標）ハイブリダイゼーション溶液（ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）中でハイブリダイズさせ、そして製造元の支持に従い洗浄した。プローブは、グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの32Ｐ-標識化dCTPを用いて標識した増幅した300bp領域から、ランダムプライミングキット（アマーシャム ライフ サイエンス社(Amersham Life Science,Inc.)、アーリントンハイツ、イリノイ州）を使用して調製した。膜は２枚の増感スクリーンの間のＸ-線フィルム（XRA5、イーストマン コダック社（Eastman Kodak Company)、ロチェスター、ニューヨーク州）に対して、-80℃で14時間、置いた。得られたオートラジオグラムは、消化したＤＮＡに対応する各レーン中のバンドがゲノム中のGAPDH配列に相補的であることを示した。
【０１６４】
実施例２３．ＤＮＡ精製法における潜在的交差汚染の評価
＊試験材料：全血（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、８ＥＳ培養細胞（Ｆｏｌｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）もしくはリン酸緩衝剤生理食塩水（ＰＢＳ）を、２種の異なる容器型（ＣａｐｔｕｒｅプレートTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮおよびＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に含有された溶解マトリックス（ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）上に負荷した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMは、遠心チューブ内に置かれた挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）中に封入された溶解マトリックスからなる。ＣａｐｔｕｒｅプレートTMは、各々溶解マトリックスを封入されている９６個の流出（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ウェルからなる。各ウェルの底は先細りの出口をもつ。
【０１６５】
＊実験組み立て：血液もしくはＰＢＳのサンプル容量２００μｌを、エアロゾル防止チップ（ａｅｒｏｓｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｉｐ）を用いてＣａｐｔｕｒｅカラムTMチューブもしくはＣａｐｔｕｒｅカラムTMウェルに添加した。
【０１６６】
＊精製法：サンプルを、ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）４００μｌを用いて２回およびＤＮＡ溶出試薬（ＤＮＡ溶出溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）２００μｌを用いて１回洗浄することによって精製した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、洗浄の間で１３，０００ｘｇで１０秒間遠心し、そしてＣａｐｔｕｒｅプレートTMを、２０００ｘｇで３分間遠心した。新しいシーリングフィルムを、汚染を防ぐために洗浄の間各プレートに使用した。サンプル溶出を、各ウェルにＤＮＡ溶出溶液TM２００μｌを添加することによって実施した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、ブロックヒーター（ｂｌｏｃｋ ｈｅａｔｅｒ）において９９℃で１０分間加熱し、そしてＣａｐｔｕ
ｒｅプレートTMを、１１００Ｗ Ｓｈａｒｐマイクロウェーブオーブンにおいて３０％出力で２５分間加熱した。遠心に続いて、溶出液を増幅のために用いた。
【０１６７】
＊増幅：各溶出液のサンプル２μｌを、ＤＮＡ（ＰＢＳ）無添加で、サンプル中の汚染ＤＮＡを検出するために増幅した。ＨＬＡ−Ｈプライマー（Ｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を、血液を用いる実験では使用し、そしてＨＩＶ−１（ｇａｇ）プライマー（Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を、８ＥＳ培養細胞では使用した。使用したサイクリング条件は、ＰＥ２４００もしくは９７００サーマルサイクラーにおいて、９４℃３０秒間、５８℃３０秒間および７２℃３０秒間：の４０サイクルであった。
【０１６８】
＊検出：ＣａｐｔｕｒｅカラムTM増幅産物のゲル分析では、２５μｌ反応物の５μｌを２％ゲル上に負荷し、そして８０ボルトで４５分間電気泳動した。ＣａｐｔｕｒｅプレートTM増幅産物のゲル分析では、９６ウェル型ミニゲル（２％アガロース）を、８０ボルトで５分間使用した。ＰＥ７２００シーケンス・ディテクション・システムにおけるＴａｑＭａｎ検出では、ＨＬＡ−ＨおよびＨＩＶに対する蛍光プローブが、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成された。
【０１６９】
実施例２４．固形支持体におけるＤＮＡ精製のためのサンプル収集および取り扱い
ＤＮＡは、溶解マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）において、全血、骨髄、軟膜、培養細胞および固形組織（ｓｏｌｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）から精製した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMにおける精製の前に、サンプルを次のように処理した：
【０１７０】
ｉ．全血および骨髄
全血および骨髄は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。サンプルは、新鮮なものでも凍結されたものでもよい。しかしながら、改善された収量は、凍結サンプルを用いて観察される。凍結サンプルは、−８０℃において少なくとも２年間安定である。使用前に、サンプルを、３７℃温浴で速やかに融解し、そして使用まで氷上に保つ。血液もしくは骨髄が凍結されない場合は、４℃で貯蔵することが推奨される。血液もしくは骨髄の２００μｌ容量がＤＮＡ精製のために使用できる。より大容量からＤＮＡを精製する必要がある場合は、軟膜サンプルが調製されてもよい。
【０１７１】
ｉｉ．軟膜
全血は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中で収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。新鮮サンプルは、４℃で貯蔵された。白血細胞は、十分な溶解試薬（Ｌｙｓｉｓ ＳｏｌｕｔｉｏｎTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて素早く単離された。あるいはまた、軟膜は、５ｍｌまでの全血から、室温で１０分間８００ｘｇでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。あるいはまた、血液を含有するチューブを、直立位置に４℃で一夜放置して細胞を沈降させてもよい。白血細胞の薄層（軟膜）は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて注意深く収集し、そして使用まで氷上に保つ。ＤＮＡは、最大１０ｘ１０6白血細胞を含有する２００μｌまでの軟膜調製物から精製できる。
【０１７２】
ｉｉｉ．体液
（例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。）
体液サンプルを収集し、４℃で保存し、そして可能な限り速やかに使用する。あるいはまた、それらを−８０℃で凍結保存してもよい。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心
によって濃縮することが望ましい。体液３〜４０ｍｌからの細胞を、２，０００ｘｇ１０分間の遠心によってペレットにした。上澄液を、残液２００μｌ〜１ｍｌを残して除去した。残留液におけるペレットを、上下繰り返し１０回ピペッティングして完全に懸濁し、そして氷上に維持するか、−８０℃で凍結保存した。
【０１７３】
ｉｖ．培養細胞
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。懸濁された培養細胞を収集し、そして使用まで氷上に置いた。細胞計数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて得られた。１０ｘ１０6までの培養細胞を含有する懸濁液２００μｌを、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMに直接添加した。
【０１７４】
ｖ．固形組織
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを、常時、氷上に保ってＤＮアーゼ活性を減少させた。組織２０ｍｇを、冷ＰＢＳ1)（好ましくは、ＤＮアーゼ活性を減少させるために１ｍＭ ＥＤＴＡを含有）３０μｌを含有する１．５ｍｌミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブに添加し、そして素早く、ミクロフュージチューブ乳棒でホモジナイズした。サンプルを氷上に置いて細胞塊を２〜１０分間沈降させた。次いで、上部細胞懸濁液２００μｌを採取してすべての細胞塊を排除した。
【０１７５】
−−−−−
1) ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ：８ｇｍＮａＣｌ，０．２ｇｍＫＣｌ，２．７２ｇｍＮａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．２４ｇｍＫＨ2ＰＯ4，０．３７２ｇｍＥＤＴＡ二ナトリウム塩を超純水に溶解し、１０００ｍｌまでの容量にしてオートクレーブする。
【０１７６】
ｖｉ．グラム陰性細菌
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを氷上に維持した。典型的には、一夜培養液は、１〜３ｘ１０9細胞／ｍｌを含有する。しかしながら、グラム陰性細菌の比較的小さいゲノムサイズによっては、３ｘ１０9までの細胞がＤＮＡ精製用カラムに適用された。培養液を遠心し、洗浄し、再懸濁し、そしてカラムに適用した。
【０１７７】
実施例２５．溶解マトリックスにおけるＤＮＡ精製
例２４からのサンプルを、溶解マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて次のように精製した：
ｉ．サンプル精製
１．十分混合したサンプル容量２００μｌを、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMに添加し、そして室温で少なくとも１分〜１時間吸着させた。
【０１７８】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量４００μｌを添加し、そして室温で１分間インキュベートした。
【０１７９】
３．ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、２，０００〜１２，０００ｘｇで１０秒間遠心した。廃液容量６００μｌを廃液回収チューブ中に集めた。
【０１８０】
４．ＤＮＡ精製溶液TM容量４００μｌを再びＣａｐｔｕｒｅカラムTMに添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。
【０１８１】
５．次いで、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、２，０００〜１２，０００ｘｇで１０秒間遠
心し、そして廃液容量を集めた。
【０１８２】
６．次いで、ＤＮＡ溶出溶液TM容量２００μｌを添加した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを上記のように遠心した。
【０１８３】
７．ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、ＤＮＡ回収チューブに移し、そして廃液を捨てた。
【０１８４】
８．ＤＮＡ溶出溶液TM容量２００μｌを添加し、そして９９℃に予備加熱した乾燥ブロックヒーター中で１０分間インキュベートさせた。次いで、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、先に記したように遠心して、溶解マトリックスからＤＮＡを放出した。
【０１８５】
９．次いで、精製ＤＮＡを分析に使用した。
【０１８６】
ｉｉ．ＤＮＡ保存
精製ＤＮＡは、４℃において少なくとも３カ月間安定である。長期保存のためには、それは−２０℃で保存できる。
【０１８７】
実施例２６．ＵＶ分光光度分析を用いるＤＮＡ定量
ＵＶ分光光度分析用のＤＮＡを希釈するために、しばしば水が使用される。しかしながら、水が希釈液として使用される場合、測定されたＡ260／Ａ280比および収量の両方には、有意な変化が生じることがある。市販緩衝剤、例えばＴｒｉｓもしくはリン酸に基づく緩衝剤は、これらの問題に打ち勝つために使用できる。確実な結果は、下記のようなＴＥ緩衝剤TM（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中にＤＮＡサンプルを希釈することによって得られる。さらに確実には、マスクされた石英キュベット（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｓｅｍｉ−Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ Ｍａｓｋｅｄ Ｃｕｖｅｔｔｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．５３３０４１）を用いることによって得られる。
【０１８８】
ｉｉ．サンプル調製およびＵＶ分光光度分析
１．精製ＤＮＡサンプルを、５秒間静かに旋回させる。
【０１８９】
２．希釈チューブは、ＴＥ緩衝剤TM１９０μｌを０．６ｍｌミクロフュージチューブに添加することによって調製した。
【０１９０】
３．ブランク溶液は、０．６ｍｌミクロフュージチューブ中で、ＴＥ緩衝剤TM１９０μｌによりＤＮＡ溶出試薬（ＤＮＡ溶出溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量１０μｌを希釈することによって調製した。
【０１９１】
４．ＤＮＡ １０μｌを、各サンプルから採取し、そしてＴＥ緩衝剤TMと混合して全容量２００μｌにすると１：２０希釈になる。
【０１９２】
５．次いで、希釈サンプルを、高速で５秒間回転した。
【０１９３】
６．希釈サンプル容量２００μｌを使用し、ＵＶ分光光度計を用いて２６０ｎｍ，２８０ｎｍおよび３２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、収量および純度を測定した。
【０１９４】
ｉｉｉ．ＤＮＡ収量および純度計算
１．各サンプルのＤＮＡ濃度を算出するために：（Ａ260−Ａ320）ｘ５０ｘ希釈ファクター（例えば２００／１０）＝ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。注意：Ａ320はバックグラウ
ンド散乱を測定する。
【０１９５】
２．ＤＮＡ収量を算出するために：ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）ｘ溶出溶液の容量（０．２ｍｌ）＝ＤＮＡ収量（μｇ）。
【０１９６】
３．ＤＮＡ純度を算出するために：（Ａ260−Ａ320）／Ａ280−Ａ320）＝ＤＮＡの純度。Ａ260/280比は、少なくとも１．５でなければならないが、この比は、ＤＮＡ純度の正確な測定値ではないかも知れない（引用１，２，３、参照）。この比は、タンパク質調製物中の核酸汚染を検出するために最初に使用され、そしてそれ自体、ＤＮＡ品質の不正確な指標である。ＤＮＡ品質は、アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡを単純に分析するか、または性能を評価する（例えばＰＣＲ増幅によって）ことによって、より良く検査できる。
【０１９７】
実施例２７．平板固形支持体におけるＤＮＡ精製
新鮮もしくは凍結生物サンプルを収集し、そして例２４．に記述されたように処理した。大サンプル容量（例えば３００μｌ）を平板固形支持体（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣａｒｄTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）上にピペットで添加し、乾燥し、次いで、ＤＮＡ精製前にディスクを打ち抜くことによってサンプリングした。サンプルは、室温で少なくとも９カ月、または長期保存では−２０℃で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄ上で保存できる。
【０１９８】
次のサンプルを収集し、そして室温で２時間、水平位置のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄ上で乾燥させた。
【０１９９】
ｉ．全血（皮膚穿刺もしくは静脈穿刺により得る）
ｉｉ．頬細胞（頬内側からの上皮細胞）
ｉｉｉ．体液（唾液、尿、血漿、血清）
ｉｖ．培養細胞
【０２００】
ＤＮＡ精製
サンプルを、清潔なホールパンチを用いて３ｍｍディスクを打ち抜くことによって、Ｃｏｏｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄから採取し、次いで、９６穴プレート、０．２ｍｌもしくは０．６ｍｌミクロフュージ・チューブにおいて精製した。３ｍｍディスクを、９６穴プレートのウェルに置き、そしてプレートを自動ワークステーション中に設置した。（さもなくば、サンプルを、マルチチャンネルピペットを用いて９６穴プレート中に、またはミクロピペットを用いて０．２もしくは０．６ｍｌチューブ中に、手動で処理してもよい）。ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量２００μｌを添加し、そして室温で１５分間インキュベートさせて、汚染物が遊離される間、ＤＮＡをディスクに結合させたままにした。溶液をピペッティングによって混合し、次いで除去した。この処理を２回繰り返した。次いで、１００％イソプロパノールもしくは１００％エタノール容量２００μｌを添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。アルコールを除去し、そしてアルコール洗浄を繰り返した。次いで、ディスクを、室温で少なくとも１〜１６時間乾燥させてアルコールを蒸発させた。乾燥後、サンプルディスクは、明橙色ないし白色であった。精製ディスクは、室温で少なくとも９カ月、または長期保存では−２０℃で安定である。
【０２０１】
ＤＮＡ増幅
１．ディスクを、０．２もしくは０．６ｍｌ増幅チューブで精製する場合は、少なくとも５０μｌの増幅溶液を、直接チューブに添加した。ディスクを、９６穴平底プレートで精製する場合は、精製ＤＮＡサンプルディスクを増幅チューブに移し、次いで、少なくと
も５０μｌの増幅溶液を添加した。ディスクを完全に増幅溶液中に沈めた。次いで、サンプルを標準条件を用いて増幅した。
【０２０２】
２．ディスクは、増幅溶液中、室温で少なくとも４カ月間保存できる。
【０２０３】
ＤＮＡサンプルディスクの再使用
精製ＤＮＡディスクを洗浄し、そして少なくとも５回再使用してもよい。
【０２０４】
１．ディスクを増幅チューブから取り除き、続いて、２ｍｌレシーバー遠心チューブ内に含有されたフィルター挿入物に移す。
【０２０５】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）２００μｌをフィルター挿入物中にピペッティングし、そして１３，０００〜１６，０００ｘｇ５秒間で遠心してディスクを洗浄する。この洗浄を、全２回洗浄の間もう１回繰り返す。
【０２０６】
３．レシーバーチューブ中の洗浄溶液を廃棄し、そして洗浄されたディスクを、新しい増幅チューブに移す。増幅溶液を添加し、上記のように増幅する。
【０２０７】
実施例２８．溶解マトリックスディスクにおける生物サンプルからのＤＮＡ精製、および続いての増幅
ＤＮＡは、溶解マトリックスディスク（Ｃａｐｔｕｒｅディスク，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）において、５種の生物サンプルから精製した。ＤＮＡの品質はＰＣＲ増幅を用いて確認された。
【０２０８】
生物サンプルを収集し、そして次のように調製した：ヒト全血および骨髄は、ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｎｏ．６４５７）を含有するチューブ中に収集した；軟膜は、ＥＤＴＡ中に収集された全血０．２ｍｌから単離した；尿沈降物０．５ｍｌは、尿サンプル４０ｍｌを８００ｘｇ１０分間の遠心によって調製した；そして１０6Ｋ５６２細胞は、培養基０．３ｍｌ中に懸濁した。ＤＮＡを、次節に記述されるように各調製サンプル３μｌから精製した。精製ＤＮＡを含有する各３ｍｍディスクを、ＨＬＡ−Ｈ座（遺伝的血色素症スクリーニングのために使用される）の特異的プライマーを用いて反応液５０μｌにおいて増幅した。３８８塩基対の増幅産物が期待された。
【０２０９】
サンプル収集および取り扱い
ｉ．軟膜調製物
全血もしくは骨髄を、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。白血細胞は、ＲＢＣ溶解試薬（ＰＵＲＥＧＥＮＥR ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、サンプル中の赤血細胞から単離された。あるいはまた、軟膜は、室温で１０分間８００ｘｇでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。白血細胞の薄層（軟膜）は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて収集し、そして氷上に保つ。少なくとも２，１００の白血細胞を含有する軟膜の懸濁液３μｌを、次いで、Ｃａｐｔｕｒｅディスクに添加した。
【０２１０】
ｉｉ．体液
体液の例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心によって濃縮する。体液３〜４０ｍｌからの細胞を、８００ｘｇ１０分間の遠心によってペレットにする。上澄液を除去し、そしてペレットを、残液中
に懸濁し、そして氷上に維持する。
【０２１１】
ｉｉｉ．培養細胞
細胞数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて測定された。少なくとも２，１００培養細胞を含有する懸濁液３μｌを、溶解マトリックスディスクに添加した。
【０２１２】
ｉｖ．グラム陰性細菌
少なくとも６００，０００細菌細胞を含有する懸濁液３μｌを溶解マトリックスディスクに添加した。典型的には、細菌の一夜培養液は、１〜３ｘ１０9細胞／ｍｌを含有する。かくして、培養液は直接使用されても、また必要ならば、遠心によって濃縮されてもよい。
【０２１３】
ｖ．マウス唾液
マウスを直立位に拘束し、そして唾液３〜５μｌを、ミクロピペッターを用いてマウスの舌下から採取した。
【０２１４】
ｖｉ．全血もしくは骨髄
全血もしくは骨髄は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを成功裏に使用できる。血液もしくは骨髄の３μｌ容量がＤＮＡ精製のために使用された。
【０２１５】
ＤＮＡ精製
上記サンプルを次のように精製する：
１．十分混合したサンプル容量３μｌを、２ｍｌスピンチューブの挿入物中の３ｍｍ溶解マトリックスディスク上にピペッティングした。サンプルを、室温で少なくとも１分もしくは２時間まで吸収させた。
【０２１６】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量２００μｌを挿入物に添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。
【０２１７】
３．スピンチューブを、２，０００〜１６，０００ｘｇで１０秒間遠心して、洗浄溶液をレシーバーチューブ中に集めた。
【０２１８】
４．ＤＮＡ精製試薬とのインキュベーションおよび遠心を２回繰り返した。固定化精製ＤＮＡを含有する溶解マトリックスディスクは、白色もしくはオフホワイト色であった。次いで、固定化されたＤＮＡを、ＤＮＡ増幅のために使用した。
【０２１９】
ＤＮＡ増幅
ディスクを、直接、増幅チューブ中に置いた。増幅主混合液容量２５〜５０μｌをチューブに添加し、そしてＤＮＡを標準条件を用いて増幅した。ディスクは、増幅溶液中で少なくとも４カ月間室温で保存された。
【０２２０】
サンプル再使用
ディスクは、さらなる増幅のために再使用されてもよい。方法は次のとおりである：ディスクをＤＮＡ精製溶液２００μｌで２回洗浄し、そして増幅前に、２，０００〜１６，０００ｘｇ５秒間遠心する。
【０２２１】
＜本発明の主たる態様＞
本発明の特徴または主たる態様を以下に挙げる。
【０２２２】
態様１： （ａ）緩衝剤；
（ｂ）塩基；
（ｃ）キレート剤；および
（ｄ）水、
を含んで成るＤＮＡ溶出試薬。
【０２２３】
態様２： キレート剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて約０．１ｍＭより大きくない量で使用される、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２４】
態様３： ＤＮＡ溶出試薬が最低約７のｐＨを有する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２５】
態様４： 塩基が、アルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２６】
態様５： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２７】
態様６： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．００１から２０ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２８】
態様７： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．０１から１５ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２９】
態様８： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３０】
態様９： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて１から１０ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３１】
態様１０： 緩衝剤、塩基およびキレート剤の合わせられた量が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて約２０ｍＭより大きくない、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３２】
態様１１： （ａ）ＤＮＡを含有する生物学的物質を固体支持体と接触させること；
（ｂ）ＤＮＡを含有する生物学的物質をＤＮＡ精製試薬で処理すること；
（ｃ）ＤＮＡを生物学的物質の残余から精製すること；そして
（ｄ）ＤＮＡを、ＤＮＡ溶出試薬を用いて固体支持体から溶出すること、
の段階を含んで成る、ＤＮＡの単離方法であって、ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成る方法。
【０２３３】
態様１２： ＤＮＡ溶出試薬が最低約７のｐＨを有する、態様１１の方法。
【０２３４】
態様１３： 固体支持体が、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびそれらの組み合わせより成る群から選択される、態様１１の方法。
【０２３５】
態様１４： 固体支持体が容器中に含有され、容器が、遠心管、回転チューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、複数のウェルのプレート、試験管およびそれらの組み合わせより成る群から選択される、態様１３の方法。
【０２３６】
態様１５： 生物学的物質が、真核生物細胞、原核生物細胞、微生物細胞、細菌細胞、植物細胞、マイコプラスマ、原生動物、細菌、真菌、ウイルスならびにそれらのライセートおよびホモジェネートより成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３７】
態様１６： 生物学的物質が、体液、身体の廃棄生成物、排泄物および組織より成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３８】
態様１７： 生物学的物質が、空気、水、堆積物および土壌から採取された環境サンプルより成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３９】
態様１８： 塩基が、アルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１１の方法。
【０２４０】
態様１９： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４１】
態様２０： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．００１から２０ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４２】
態様２１： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．０１から１５ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４３】
態様２２： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４４】
態様２３： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて１から１０ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４５】
態様２４： キレート剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．１ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４６】
態様２５： 緩衝剤、塩基およびキレート剤の組み合わせられた量が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量を基礎として約２０ｍＭより大きくない、態様１１の方法。
【０２４７】
態様２６： 緩衝剤がトリスであり、キレート剤がＥＤＴＡであり、そして塩基がアルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１１の方法。
【０２４８】
態様２７： ６０℃より上で加熱する段階をさらに含んで成る、態様１１の方法。
【０２４９】
態様２８： （ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；
（ｂ）ＤＮＡ精製試薬；および
（ｃ）ＤＮＡ溶出試薬、
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキットであって、
ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成るキット。
【０２５０】
態様２９： 固体支持体をさらに含んで成る、態様２８のキット。
【０２５１】
態様３０：（ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；および
（ｂ）ＤＮＡ溶出試薬
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキットであって、
ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成るキット。
【０２５２】
態様３１： 固体支持体をさらに含んで成る、態様３０のキット。
【０２５３】
態様３２： 溶解試薬が固体支持体に結合されるように、
（ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；
（ｂ）ＤＮＡ精製試薬；および
（ｃ）溶解試薬で処理された固体支持体、
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキット。
【０２５４】
態様３３： 固体支持体を保持するための容器をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５５】
態様３４： 固体支持体が溶解試薬で処理される、態様２９および３１のキット。
【０２５６】
態様３５： 固体支持体がＲＮＡ消化酵素で処理される、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５７】
態様３６： ＤＮＡ単離に先立つ哺乳動物の全血中の赤血球からの白血球の分離での使用のための、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含んで成るＲＢＣ溶解試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５８】
態様３７： （ａ）トリス、ＥＤＴＡおよびソルビトールを含んで成る細胞懸濁試薬；ならびに
（ｂ）溶解酵素、グリセロール、トリスおよび塩化カルシウムを含んで成る溶解酵素試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキットであって、
当該細胞懸濁試薬および当該溶解酵素試薬が酵母およびグラム陽性細菌の細胞壁を消化するための組み合わせでの使用に適するキット。
【０２５９】
態様３８： （ａ）ＲＢＣ溶解試薬；
（ｂ）細胞懸濁試薬；
（ｃ）溶解酵素試薬；
（ｄ）タンパク質消化試薬；および
（ｅ）等張溶液、
より成る群から選択される試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを単離するための溶出(または溶離)組成物及びそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのような核酸は、研究及び臨床分析のために分子生物学の分野において広く用いられる。DNAを分析するための一般的な方法は、サザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような方法による増幅及びシークエンシングである。これらの方法を用いて、遺伝子同定、集団スクリーニング、病原体同定及び診断試験を促進するためにDNA配列中の違いを決定する。これらの分析は全て、一貫し且つ確かな結果のための基礎として精製されたDNAサンプルを必要とする。
【０００３】
液相及び固相精製の２つの一般的カテゴリーに入る多数の核酸精製方法がある。液相精製では、DNAは液相中にとどまり、一方、不純物は沈殿及び／または遠心分離により除かれる。固相精製では、DNAは固体支持体に結合しており、一方、不純物は選択的に溶出される。両方の精製方法は、多数の工程及びしばしば危険な試薬を必要とする常法、並びにより少ない工程及び通常危険が低い試薬を必要とするより迅速な方法を利用する。
【０００４】
通常の液相法を用いて、DNAは密度勾配遠心分離、有機溶媒抽出または塩沈殿を用いて最も一般的に単離される。これらの精製方法を記述するプロトコルは、非特許文献１及び非特許文献２中に与えられる。簡潔に言えば、密度勾配遠心分離、フェノール−クロロホルム抽出及び塩沈殿の液相精製法は、一般に、４つの主要な工程：細胞及び核膜からDNAを遊離させるために細胞を溶解すること；（タンパク質、脂質及び炭水化物のような）不純物を除くこと；アルコール沈殿により濃縮すること；及び次に水和溶液中でDNAを再水和させることを必要とする。これら３つの方法の主要な違いは、第二の工程中に存在し、そこで、不純物は密度差異化、有機−水相分配または選択的塩沈殿によりDNAから除かれる。
【０００５】
標本収集カード（ガスリーカード）上で乾燥させた血液を精製するための通常の液相精製法は、非特許文献３により記述されている。その方法は、非特許文献１に記述された液体血液のための方法に厳密に従う。このフェノール抽出法では、生理的食塩水溶液で再水和させることにより収集紙から乾燥した白血球を取り出す。それらの白血球を溶解するためにそれらの細胞を緩衝剤中でインキュベートする。次に、３回のフェノール抽出を実施してタンパク質不純物を除き、続いて、３回エーテル抽出してフェノールを除く。酢酸ナトリウム−エタノール沈殿によりDNAを濃縮し、70%エタノールで洗浄し、次に、標準的なDNA水和溶液中に再水和させる。この方法には、典型的に、２種が危険な（フェノール及びエーテル）いくつかの試薬（１０）が必要とされる。これらの常法は、典型的に、非常に精製されたDNA調製物をもたらすが、それらは労力を要し且つ危険である。
【０００６】
液相精製でのように、通常の固相法が非常に精製されたDNAを生成するために開発されている。一般に、これらの方法は４つの一般的な工程：細胞及び核膜からDNAを遊離させるために細胞を溶解すること；遊離されたDNAを固体支持体に結合すること；不純物を洗浄して除くこと；及び精製されたDNAを次に溶離させることを必要とする。最初の２つの工程、細胞を溶解すること及び遊離されたDNAを結合することは、通常、高濃度の危険な試薬を必要とする。
【０００７】
固相DNA精製では、膜フィルター、磁気ビーズ、金属酸化物及びラテックス粒子を初め
とする多数の固体支持体が用いられている。おそらく最も広く用いられる固体支持体はシリカに基づく粒子である（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照）。例えば、特許文献１中に開示された方法は、シリカ粒子にDNAを結合するために高濃度のカオトロピック溶液を用い、そして全血からDNAを精製するために６回の遠心分離工程及び５種の試薬を必要とする。この方法の不都合な点は、粒子懸濁液の使用、多数の遠心分離工程の使用並びにグアニジニウムイソチオシアネート及びアセトンのような危険な試薬の使用である。
【０００８】
通常の固相精製方法を簡略化するための一つの手段は、溶離工程を省き、そして増幅のような次の分析のために固体支持体に結合したままでDNAを用いることである。従って、固定されたDNAを用いることにより、通常、少なくとも１つの試薬及び１つの工程が省かれる。例えば、特許文献１は、血液のような複雑な混合物では存在しないが、DNAを精製するための方法を記述している。上記の方法を用いるが、溶離工程を省くことにより、試薬及び工程の数が１つ減らされる。
【０００９】
別の例として、特許文献６は、4回のフェノール洗浄及び５回のイソプロパノール洗浄中に4種の試薬を用いる、乾燥した血液を含有するセルロース濾紙を精製する方法を記述している。乾燥させた後、濾紙の小片を四角から切り、PCR増幅のための基質として直接用いる。分析のために結合したDNAを用いるにもかかわらず、これらの方法は多数の工程及び危険な試薬をなお必要とする。
【００１０】
最近、液相及び固相精製の両方のためにより迅速で且つ簡単な方法を開発する傾向がある。これは一つには分析のために必要な時間を減らすDNA増幅アッセイの開発により推進されている。DNAに基づくアッセイの数がその分野において増えるにつれて、生物学的サンプルを処理するより迅速な手段が必要とされる。また、より簡単な方法を用いることは、サンプル取り扱い工程の数を減らすことによりサンプル交差汚染の危険を減らす。さらに、方法がより簡単になるほど、その方法をより容易に自動化できる。
【００１１】
DNA精製のための一つの迅速な液相法は、液体血液または血液ステインから金属不純物を除くためにキレート化樹脂を使用する（非特許文献４）。この方法を用いて、血液細胞をまず脱イオン水で洗浄し、次に、キレート化樹脂及び脱イオン水の懸濁液と56℃で15-30分間インキュベートする。このインキュベート後、ボルテックスし、100℃で８分間インキュベートし、再びボルテックスし、そして遠心分離により不純物を除く。この方法は迅速であり（45-75分のうちの完了する）、そして簡単である（2種の試薬のみを必要とする）。
【００１２】
液相DNA精製のための別の簡単で且つ迅速な方法は、非特許文献５により記述されている。ヒト全血から出発し、血液細胞を10mM EDTA及び10mM NaClの溶液で2回洗浄し、各洗浄後にミクロ遠心分離により集める。次に、それらの細胞を50ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（Tris-HCl）緩衝剤（pH 8.0）中に再懸濁し、PCR増幅の前に3分間沸騰させる。この精製法では、2種の試薬のみが必要とされ、それらは両方とも一般的に危険でない。さらに、その方法は約１５分のみを必要とする。
【００１３】
さらにより簡単な単一試薬法が非特許文献６により記述されている。この方法を用いて、3mm直径の血液スポットを3分間オートクレーブし、次に、PCRに適合した緩衝剤（10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、3mM MgCl2及び0.001ゼラチン）中で５分間沸騰させるかまたは１０分間超音波処理する。オートクレーブ後、不純物はディスクに結合したままであり、一方、DNAは緩衝剤中に回収される。
【００１４】
DNA精製のためのこれらの液相法の３つは全て、低濃度の危険でない試薬及び簡略化さ
れた方法を使用する。しかしながら、（使用前に均一に懸濁されなければならい）樹脂の使用を省くか、細胞の繰返された洗浄を省くか、または血液スポットの面倒なオートクレーブを省くことによりこれら３つの方法（非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６）をさらに簡略化できるはずである。
【００１５】
また、固相DNA精製のための迅速で且つ簡単な方法も開発されている。非特許文献７の方法は、乾燥させた血液スポットを非イオン溶剤を含有する緩衝剤で連続して洗浄することを記述している。濾紙からDNAを溶離させるために、プロテイナーゼＫ溶液を含む別の非イオン溶剤を含有する緩衝剤と各サンプルを65℃で１時間インキュベートする。 95℃より高温で１０分間の最後のインキュベートは、プロテイナーゼＫを不活性化するために必要である。この方法は必要な試薬の数を3種に減らすが、酵素、長いインキュベート時間及び高いインキュベート温度（すなわち、95℃より高い）を用いるという不都合な点を有する。
【００１６】
DNAを分離する手段として膜フィルターを用いる迅速な方法が特許文献７中に開示されている。典型的に、この方法は、全血中に存在する細胞を溶解するために高濃度の溶解試薬を必要とする。次に、ライセートをフィルターに加え、DNAをさらに精製するために第二の溶解試薬、そして次に緩衝剤または水のいずれかで連続して洗浄する。水中または塩化マグネシウムを含有する緩衝試薬中で１５分間沸騰させることによりDNAを膜から溶離させる。この固相精製法の不都合な点は、精製及び溶離試薬中のキレート化剤の欠如を含み、それは（例えばヌクレアーゼによる）DNA損傷の可能性を高める可能性がある。さらに、面倒な高温インキュベーション（すなわち、約１００℃）の条件がある。
【００１７】
別の例として、特許文献８は、細胞を溶剤及び磁気ビーズからなる固相と混合することにより細胞からDNAを精製する方法を記述している。この方法では、細胞を溶剤により先に溶解してDNAを遊離させることができ、それを続いて固相に結合する。あるいはまた、細胞及び固相からなる懸濁液に溶剤を添加してもよく、または細胞、溶剤及び固相を一緒に懸濁してもよく、溶剤により液相中で細胞を溶解させ、続いて、DNAを固相に結合させる。しかしながら、この方法は、液相（すなわち、溶剤または細胞残渣−溶剤懸濁液）を添加するかまたは固相から除く多数の工程を含む。
【００１８】
非常に簡単な方法が非特許文献８により提示され、その場合、セルロース収集紙上で乾燥させた血液サンプルから穴をあけた3mm直径のディスクを脱イオン水で洗浄し（2回の３０分洗浄）、PCR増幅のために直接用いる。特許文献７上の分析において説明したように、精製試薬として脱イオン水を用いる主要な不都合な点は、キレート化剤の欠如により（例えばヌクレアーゼによる）DNA損傷の可能性が上がることである。さらに、溶剤の欠如により不純物を可溶化する効率が下がる。
【００１９】
いくつかの手段により核酸を検出し、定量することができる。一般に、260nmの波長でのUV吸光度を用いる。バックグラウンドの吸光度を測定するために320nmの波長を用いる。また、核酸を検出し、定量するためにヘキスト33258色素の存在下での蛍光測定法（例えば、Hoefer、DyNA Quant蛍光計、Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）、抗体検出片（DNA Dipstick、Invitrogen、Carlsbad、CA）、分岐シグナル増幅（Chiron Corporation、Emeryville、CA）及び定量的PCR増幅（例えば、Applied Biosystems 7700、Perkin Elmer Applied Biosystems Division、Foster City、CA）も用いる。
【００２０】
一般的に既知であり、実施されるように、様々な波長で吸光度を測定することによりDNAの純度を確かめることができる。タンパク質、脂質、炭水化物、細胞残渣等のような不純物の存在は測定される吸光度を上げる可能性がある。それに反して、純粋な核酸、特にＰＣＲ増幅に用いられるDNAは、確立された波長で実質的により低い吸光度を有する。
【００２１】
現在、利用できる多数の核酸増幅系がある。最も一般的に用いられる増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であるが、他の標的増幅技術はリガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、自給配列複製（SSRまたは3SR）、鎖置換増幅（SDA）及び転写によりもたらされる増幅(TMA)を含む。
【００２２】
サンプルまたは核酸の混合物内の１つまたはそれ以上の標的核酸配列を増幅するためにPCRが慣例的に用いられる。この方法は、特許文献９中に開示されている。この方法で増幅される各標的核酸配列に対して、２本の鎖内の標的核酸の一部に実質的に相補的であるように選択された2個のプライマーで核酸の別個の相補鎖を処理する。一般に、熱安定性酵素（ポリメラーゼ）を用いてプライマーを伸長し、相補的プライマー伸長生成物を生成せしめる。これらがそれらの相補鎖に分離されると、それらは相補的プライマーを標的核酸配列に伸長するための鋳型として働く。分離されると、これらは次にさらなる核酸配列の合成のための鋳型として働く。PCR増幅方法は、一連の簡単な工程を含む。これらは、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーション、ポリメラーゼによりもたらされるプライマー伸長生成物の合成、並びに鋳型鎖の鎖と合成された標的核酸配列の分離及びそれに続くアニーリングを引き起こすための温度サイクリングを含む。従って、合成される標的核酸配列の量の指数的増加がある。PCR増幅は非常に高感度の方法である。それ故、非常に高純度の出発サンプルが必要である。
【００２３】
LCRは、一次PCR増幅と共にしばしば利用される別の診断技術である。LCRは熱安定性リガーゼを用い、単一塩基対のみが異なるDNA配列の区別を可能にする。ＬＣＲはその感度のために非常に純粋なNA鋳型に依存する。
【００２４】
精製された核酸をサザンハイブリダイゼーションまたはより一般的に知られているようなサザンブロッティングによりさらに分析することができる。サザンブロッティングは、ゲルから様々な種類の濾紙へのDNAフラグメントの毛管移動である。それにより研究者は制限フラグメントの複雑な集団において稀な配列を検出することができ、そして遺伝子クローニング、逆遺伝学及びヒト遺伝病診断のための制限断片長多型（RFLP）の分析において有用である。サザンブロッティングは、１種またはそれ以上の制限酵素でのDNAの消化及びそれに続くアガロースゲルでの電気泳動によるサイズ分離を含む。次に、DNAをインサイチューで変性させ、ゲルから膜(例えば、ニトロセルロースまたはナイロン)に移す。次に、膜に結合したDNAを放射性標識したDNAまたはRNAにハイブリダイズさせ、プローブに相補的なバンドの位置を突き止めるためにオートラジオグラフィーを用いる。サザンブロッティングは非常に高感度である。10μgのゲノムDNAをフィルターに移し、そして数百ヌクレオチドの長さのプローブにハイブリダイズさせる場合、哺乳類ゲノム中に１回だけ（すなわち、3百万分の１）存在する1000塩基対（bp）の配列を一晩の露出で検出することができる。
【００２５】
DNAサンプル調製の分野を前進させるためには、固相DNA精製方法が必要とされる。また、簡単で且つ迅速であるだけでなく、自動化のための適応性を最大にする目的において一般的である、固相精製方法に適応できる試薬及び方法も必要とされる。一般に低濃度のものであり、室温（すなわち、20-25℃）で安定であり、危険が低く（すなわち、腐食性、引火性または毒性が低く）、混合する必要性を省くために非粒子であり、そしてDNAの質を保護する試薬が必要とされる。また、特に臨床試験所において見られるような日常的試験に用いられる場合、水和していようと乾燥していようと、様々な生物学的出発材料を用いて実施することができる数工程の方法も必要とされる。それらの試薬は、PCR緩衝剤の緩衝能力を妨げることにより次のDNA分析方法を阻害してはならず、またはDNA増幅に用いられるポリメラーゼ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドの分解を引き起こしてはならない。また、特に臨床試験所において見られるような日常的試験に用いられる場合、水
和していようと乾燥していようと、様々な生物学的出発材料を用いて実施することができる数工程の方法も必要とされる。
【００２６】
また、固相精製方法に用いられる試薬及び方法は、核酸定量、制限酵素消化、DNAシークエンシング、サザンブロッティングのようなハイブリダイゼーション技術等の標準的な方法、並びにリガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、自給配列複製（SSRもしくは3SR）、鎖置換増幅（SDA）及び転写によりもたらされる増幅（TMA）を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅方法、または他のDNA分析も妨げてはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第5,234,809号（Boom等）
【特許文献２】国際公開第WO95/01359号（Colpan等）
【特許文献３】米国特許第5,405,951号（Woodard）
【特許文献４】国際公開第WO95/02049号（Jones）
【特許文献５】国際公開第WO92/07863号（Qiagen GmbH）
【特許文献６】米国特許第5,496,562号（Burgoyne）
【特許文献７】米国特許第5,234,824号（Mullis）
【特許文献８】国際公開第WO96/18731号(Deggerdal)
【特許文献９】米国特許第4,965,188号(Mullis)
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、7.19-7.25、9.16-9.19、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)
【非特許文献２】Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology、4.4.2-4.4.4(1987)
【非特許文献３】McCabe等、Human Genetics、75、213―216(1987)
【非特許文献４】Walsh等、BioTechniques、10、506-513(1991) 非特許文献５：Nordvag等、BioTechniques、12、490-492(1992)
【非特許文献６】Carducci等、BioTechniques、13、735-737(1992)
【非特許文献７】Berlin等、Human Mutation、1、260-261(1992)
【非特許文献８】Makowski等、Nucleic Acids Research、23、3788-3789(1995)
【発明の概要】
【００２９】
本発明は、液体または乾燥した生物学的サンプルからDNAを精製し、増幅し、そして特性化するための試薬、方法及び固体支持体を含むキットを提供する。精製されたDNAは、増幅及び制限酵素消化のような次に広く用いられる技術における使用のために適している。
【００３０】
本発明の試薬は、一般に、次のDNA分析を著しく阻害しないように低濃度の緩衝剤、塩、酸、塩基、キレート化剤及び／または溶剤を含有する。通常の系では、典型的に、高濃度の1種またはそれ以上のこれらの化合物を含有する試薬をDNA精製のために用いる。これらの低濃度の試薬を用いることにより、DNA精製のために必要な工程の数を減らし、方法をより迅速で且つ簡単にする。また、これらの試薬は一般に、通常のDNA精製のために用いられるものより危険も低い。記述される固相精製法は典型的に２つの主要な工程（例えば洗浄及び乾燥）のみを必要とする。固体支持体（または固体支持マトリックス）からのDNAの除去が必要とされる場合、別の工程（溶離）を用いる。
【００３１】
細胞またはタンパク質コート膜を可溶化し、そして／もしくは破壊してDNAの遊離を容易にするため及び／または不純物を可溶化してそれらの除去を容易にするために市販され
ているDNA精製試薬を本発明に用いる。DNA精製試薬の組成は、ＰＣＲ増幅のような次のDNA分析とそれが適合する（すなわち、著しく阻害しない）ようにすべきである。例えば、DNA精製試薬のモル濃度は低いべきである。
【００３２】
固相精製後に精製されたDNAを固体支持体から取り出す（または取り除く）ためにDNA溶離（本明細書では、「溶離」と「溶出」の語は互換可能に使用されている）試薬を用いることができる。DNA溶離試薬は：pHを少なくとも約７（好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは少なくとも約１０）で保つための緩衝剤；試薬pHを調整するための塩基；キレート化剤（本明細書では、「キレート化剤」と「錯化剤」の語は互換可能に使用されている）；及び脱イオンし且つ実質的にヌクレア−ゼを含まない水を含む。緩衝剤は好ましくは少なくとも約８のpKaを有する。好ましい緩衝剤はトリスである。塩基は好ましくは、試薬のpHを７ほどまでに上げることができるものである。塩基は好ましくはアルカリ金属水酸化物である。そのようなアルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウムを含む。キレート化剤は好ましくはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはシクロへキサンジアミン四酢酸(CDTA)である。しかしながら、ヌクレア−ゼ活性を下げることができるあらゆるキレート化剤が使用のために適している。緩衝剤、塩基及びキレート化剤の合わせた量は低濃度のものであり（典型的には、約２０ｍＭにすぎない）、それをPCR増幅または制限酵素消化のような次のDNA分析と一般に適合する（すなわち、著しく阻害しない）ようにする。
【００３３】
適当な固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデン及びそれらの組み合わせを含む。好ましい固体支持体は、標本収集のために一般に用いられるもののようなセルロースから構成される。
【００３４】
乾燥による溶解または非イオン性溶剤を含有するDNA精製試薬での処理に組織、細胞膜、細胞壁またはウイルスタンパク質コートが耐性である場合、溶解及び次の精製を助けるために固体支持体を溶解試薬で処理することができる。常法では、この溶解工程を典型的に固体支持体と生物学的物質を接触させる前に実施する。しかしながら、固体支持体に溶解試薬を添加することにより、工程を省き、方法を簡略化する。好ましくは、溶解試薬を固体支持体に加え、次に固体支持体上で乾燥させ、その後、処理した固体支持体と生物学的物質を接触させるが、これは必要な条件ではない。
【００３５】
好ましくはDNAの精製のために溶解試薬を用い、それは十分に細胞またはタンパク質コートを溶解してDNAを遊離させるために有効な溶剤の量；DNA損傷を減らすためのキレート化剤；水；及び場合により約２より大きいpHを与えるために有効な緩衝剤からなることができる。溶剤は好ましくは陰イオン性である。陰イオン溶剤の例は、N-ラウロイルサルコシンまたはドデシル硫酸塩を含む。ドデシル硫酸ナトリウムが特に好ましい陰イオン溶剤である。緩衝剤は好ましくは約６より大きいpHを与えるために有効である。トリスが特に好ましい緩衝剤である。キレート化剤は好ましくはEDTAまたはCDTAである。
【００３６】
場合により、溶解試薬は、生物学的サンプル中に存在するRNAを分解する目的のために、RNアーゼAのようなRNA消化酵素を含むことができる。RNA消化酵素を含むことにより、常法において典型的に必要とされるような別個のRNアーセ゛消化工程の必要性が省かれる。
【００３７】
また、本発明は生物学的サンプルからDNAを精製するための方法も提供する。生物学的サンプルは、例えば、細胞またはウイルス懸濁液、体液、全血、骨髄、軟層、血漿、培養細胞、全ての懸濁液（例えば、細菌、組織ホモジネート）及び環境サンプルを含む。環境サンプルは、例えば、空気、水または土壌を含む。固相精製のために、本発明の方法は、
固体支持体と生物学的サンプルを接触させることを含む。不純物の可溶化、細胞壁の溶解、細胞からのDNAの遊離及び固体支持体へのDNA結合を容易にするために生物学的サンプルを含有する固体支持体にDNA精製試薬を添加する。DNA精製試薬で固体支持体を（好ましくは少なくとも2回）洗浄することにより、不純物が固体支持体から除かれる。結合し、精製されたDNAを含有する固体支持体を増幅または他の分析に直接用いることができる。あるいはまた、DNA溶離試薬を用いてDNAを取り出すことができる。固体支持体からDNAを溶離させるために、DNA溶離試薬を固体支持体と接触させ、インキュベートし、次に取り除く。
【００３８】
本発明の別の態様は、1種またはそれ以上の任意の補助試薬とDNA精製試薬及び／またはDNA溶離試薬の組み合わせを含む。赤血球細胞を溶解し、次に哺乳類全血中に含まれる白血球からのNAの精製を容易にするために第一の補助試薬、RBC溶解試薬を用いる。DNA精製前に酵母及びグラム陽性細菌の細胞壁を消化するために第二及び第三の補助試薬、細胞懸濁試薬及び溶解酵素試薬を一緒に用いる。混入するタンパク質を消化するために第四の補助試薬、タンパク質消化試薬を用いる。DNA及び／または細胞を必要なように懸濁するために第五の補助試薬、等張溶液を用いる。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、酵母及びグラム陽性細菌からDNAを精製するための方法である。その方法は、細胞懸濁試薬と生物学的サンプルを合わせることを含む。細胞懸濁試薬は、緩衝剤、キレート化剤及び細胞懸濁液を生成せしめるための細胞沈殿防止剤を含む。細胞懸濁液に溶解酵素試薬を添加する。溶解酵素試薬は、細胞壁を消化するための酵素、緩衝剤、試薬のpHを調整するための酸及び２種の安定剤を含む。消化した細胞を上記の液相または固相精製に用いることができる。
【００４０】
また、本発明は、生物学的サンプルから実質的に純粋なDNAを調製するための指示手段及び以下のもの：DNA精製試薬、DNA溶離試薬、溶解試薬、RBC溶解試薬、細胞沈殿防止試薬、溶解酵素試薬、等張溶液またはそれらのあらゆる組み合わせの一つまたは全部を含んでなるDNAを精製するためのキットも提供する。また、キットは、溶解試薬で処理されていないかまたは処理されたいずれかの固体支持体も含むことができる。さらに、キットは、固体支持体を入れるための容器を含むことができる。実質的に純粋な核酸は、例えば、DNA増幅、逆転写及び制限酵素消化のような、当業者に既知の次の分析における使用のために適当なものである。
【発明の詳細な記述】
【００４１】
本発明は固体支持体を導入して生物学的サンプルからのＤＮＡを精製し、増幅し、特性化するための試薬、方法及びキットを提供する。そのような生物学的サンプルには、ＤＮＡのような核酸（ＮＡｓ）を含有する典型的には水性混合物中の、又は乾燥された生物材料が含まれ、原核もしくは真核細胞の複合生物学的混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）を含む。典型的には、生物材料は炭水化物、タンパク質及び脂質も含有する。生物材料には以下が含まれる：体液、例えば全血、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート試料、唾液及び脳脊髄液、頬スワブ（ｂｕｃｃａｌ ｓｗａｂｓ）、培養細胞、バクテリアの細胞懸濁液又は組織ホモジネート、固体の動物組織、例えば心臓、肝臓及び脳、体の廃物、例えば便及び尿、空気、水、沈渣（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）もしくは土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、バクテリア、ウィルス、マイコプラズマ、菌・カビ、原生動物、リケッチア及び他の小さい微生物細胞。これらの生物材料のライセート又はホモジネートも用いることができる。
【００４２】
好ましくは、本発明の固体支持体が導入された試薬、方法及びキットはいずれかの形態の実質的に純粋なＤＮＡを与える。ＤＮＡは例えば染色体もしくはゲノムＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（ミトコンドリア及びプラスミドＤＮＡのような）、１本鎖ＤＮＡ及びウィルス
ＤＮＡから成ることができる。
【００４３】
これらの固体支持体が導入された試薬、方法及びキットを用い、実質的に高純度のＤＮＡを得ることができる。ＤＮＡの純度は、感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲアッセイのようなその後の分析を妨げ得る不純物、例えばタンパク質の実質的な減少により決定される。本明細書で用いられる場合、「純粋」は実質的に炭水化物、タンパク質及び脂質の不純物を含有せず、精製されたＤＮＡを当該技術分野における熟練者に既知のその後の分析において用いることができることを意味する。かくして本発明に従って得られる単離され且つ精製されたＤＮＡはその後の分析で用いるのに適している。好ましくは、本発明の方法及びキットは広い範囲のＤＮＡを精製し、そのすべてを広い分子量範囲に及んで回収できる。
【００４４】
本発明はＤＮＡの精製のために低濃度の試薬を用いるための方法を記載する。これらの方法は一般に、ＤＮＡ精製のために典型的に用いられる方法より迅速で簡単である。これらの精製段階から得られる精製されたＤＮＡを純度、収率、寸法、増幅能力などに関して評価することができる。
【００４５】
生物学的サンプルには例えば細胞もしくはウィルス懸濁液、体液及び組織ホモジネートが含まれる。生物学的サンプルが細胞もしくはウィルスから成る場合、細胞もしくはウィルスをこの段階の前に計数することができる。計数は標準的細胞カウンティング法、例えば電子的細胞カウンター（例えばＣＢＣ５ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）又は視覚的カウンター（例えばヘマシトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ），Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を用いて行うことができる。
【００４６】
固相ＤＮＡ精製のための方法は、ライシング試薬（ｌｙｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）で処理されていることができる固体支持体に生物学的サンプルを適用することを含む。固体支持体との接触は細胞及び核膜を可溶化及び／又は破裂させ、それによりＤＮＡを放出させ、それが次いで固体支持体に結合する。固体支持体を加熱して細胞及び核膜の可溶化及び破裂を助長することができる。放出されるＤＮＡは固体支持体に結合し、第１の試薬の添加による不純物の除去を可能にする。この第１の試薬は商業的に入手可能なＤＮＡのための精製試薬であることができる。不純物は第１の試薬中で可溶化され、遠心、ピペット使用、圧力又は真空のような適した手段により除去され、ＤＮＡが固体支持体に結合して残される。かくして方法は１種のみの試薬及び２つの主要な段階（すなわち洗浄及び過剰の水溶液の除去）を用いる。ＤＮＡが固体支持体から取り出されたら、追加の試薬であるＤＮＡ溶離試薬を加え、さらに別の段階（溶離）を行う。
【００４７】
固相ＤＮＡ精製の場合、精製されたＤＮＡを分析の前に固体支持体から取り出すことが必要であり得る。本発明は、固体支持体からのＤＮＡの溶離のための低濃度ＤＮＡ溶離試薬も含む。低濃度ＤＮＡ溶離試薬の組成は変わり得るが、合計濃度はすべての組成の場合に典型的に２０ｍＭ未満である。
【００４８】
本明細書において「ＤＮＡ溶離試薬」と呼ぶ低濃度ＤＮＡ溶離試薬は固体支持体からＤＮＡを取り出すことができる。それは塩基、緩衝剤、キレート化剤及び水を、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは少なくとも約１０のｐＨを保持するような組合わせにおいて含有する。
【００４９】
ＤＮＡ溶離試薬はｐＨを少なくとも約７に保持するための緩衝剤を含有し、好ましくは少なくとも約８のｐＫａを有する。適した緩衝剤にはＮ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏから商品名「ＢＩＣＩＮＥ」の下に入手可能）、３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから商品名「ＣＡＰＳＯ」の下に入手可能）及びＴｒｉｓが含まれるがこれらに限られるわけではない。緩衝剤は、ＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくしてそれは典型的には約２０ｍＭ以下の量で用いられる。好ましくは緩衝剤はＴｒｉｓであり、試薬の合計容積に基づいて約０．００１〜２０ｍＭ、より好ましくは約０．０１〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約１〜１０ｍＭの量で用いられる。
【００５０】
緩衝剤の他に、ＤＮＡ溶離試薬は試薬のｐＨを調節するための塩基を含有する。塩基は、ＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくして塩基は典型的には約２０ｍＭ以下の量で用いられる。そのような塩基には水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムが含まれるが、これらに限られない。好ましくは塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化リチウムのようなアルカリ金属水酸化物であり、試薬の合計容積に基づいて約０．２〜２０ｍＭ、より好ましくは約０．５〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約１〜５ｍＭの量で用いられる。
【００５１】
緩衝剤及び塩基の他に、ＤＮＡ溶離試薬はキレート化剤を含む。キレート化剤は、固体担体から取り出す間及びその後のＤＮＡ損傷（例えばヌクレアーゼ活性による）を減少させてＤＮＡをその後の分析に適したものとするのに有効な量で用いられる。適したキレート化剤は水性媒体中で２価のカチオンをキレート化することができるものである。そのようなキレート化剤にはエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びシクロヘキサンジアミンテトラアセテート（ＣＤＴＡ）が含まれるがこれに限られない。好ましくはキレート化剤はＥＤＴＡである。さらに、キレート化剤はＰＣＲ増幅のようなその後のＤＮＡ分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくしてそれは典型的には約０．１ｍＭ以下の量で用いられる。好ましくはキレート化剤は試薬の合計容積に基づいて約０．０００１〜０．１ｍＭ、より好ましくは約０．００５〜０．０５ｍＭ、そして最も好ましくは約０．００１５〜０．０１５ｍＭの量で用いられる。
【００５２】
緩衝剤、塩基及びキレート化剤は水と一緒になってＤＮＡ溶離試薬を形成する。水は好ましくは脱イオン化され且つヌクレアーゼを含有しない。緩衝剤、塩基及びキレート化剤の合計された量は低濃度のものであり（典型的には約２０ｍＭ以下）、ＰＣＲ増幅又は制限酵素消化のようなその後のＤＮＡ分析と一般的に適合するものとなっている（すなわち有意に妨害性でない）。
【００５３】
生物材料源からのＤＮＡの精製において用いられるすべての試薬は、増幅及び他の分析と適合性であるように調製されている。試薬は低濃度の緩衝剤、塩、洗剤及びキレート化剤を有し、それは試薬を増幅分析と適合するものとしている。最終的な精製された核酸は、固相核酸抽出のためにＤＮＡ溶離試薬中に懸濁される。従ってこれらの試薬は下流のＤＮＡ分析において用いるために最適化されている。そのようなＤＮＡ分析にはＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲが含まれ得るがこれらに限られない。
【００５４】
３つの製造者、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ及びＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからの現在利用できるＰＣＲ増幅反応は、典型的には表１に示す濃度のＴｒｉｓ緩衝剤、塩及び非イオン性洗剤を８〜１０の塩基性ｐＨにおいて有する１Ｘ緩衝液中で行われる。
【００５５】
【表１】
【００５６】
ライシング試薬及び溶離試薬はＰＣＲ系において見られる濃度と同じ大きさの程度か、又はそれより有意に低いＴｒｉｓ緩衝剤濃度を有する。溶離試薬中のＴｒｉｓ緩衝剤の濃度は典型的には１〜１０ｍＭの範囲であり、増幅プロセスを妨害したり、又は有意に損なったりしないであろう。
【００５７】
本発明の他の側面は、ＤＮＡ精製試薬及び／又はＤＮＡ溶離試薬と１種もしくはそれより多い任意の補助試薬の組合わせを含む。これらの補助試薬は核酸精製のための当該技術分野における熟練者に既知の試薬を含む。しかしながら本発明の方法及びキットはこれらの特定の補助試薬の使用に制限されず、それは当該技術分野における熟練者が同じ目的を達成するために他の試薬及び／又は方法を用いることができるからである。又、ＤＮＡ精製試薬及び／又はＤＮＡ溶離試薬を、必要なら他の試薬及び／又は方法と一緒に用いることもできる。
【００５８】
第１の補助試薬は赤血球を溶解し（ｌｙｓｅ）、哺乳類の全血中に含有される白血球からのＤＮＡのその後の精製を容易にするために用いられる赤血球ライシング試薬である。この試薬を本明細書で「ＲＢＣ 溶解試薬（ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）」と呼び、それは塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム及びＥＤＴＡを含有する。好ましくは、塩化アンモニウムはＲＢＣ溶解試薬中で、試薬の合計容積に基づいて約１４０〜１５０ｍＭ、そしてより好ましくは約１４２〜１４６ｍＭの濃度で用いられる。好ましくは、重炭酸ナトリウムは試薬の合計容積に基づいて約０．５〜５ｍＭ、そしてより好ましくは約０．５〜２ｍＭの濃度で用いられる。好ましくは、ＥＤＴＡは試薬の合計容積に基づいて約０．５〜１０ｍＭ、そしてより好ましくは約０．７５〜１．２５の濃度で用いられる。ＲＢＣ溶解試薬は、好ましくは上記の純度の水を含有する。ＲＢＣ溶解試薬を血液の１体積に対してＲＢＣ溶解試薬の３体積の量で哺乳類全血と接触させる。試料を約１〜３０分、好ましくは約１０分インキュベートし、１５，０００における２０秒間の遠心により白血球を試料から分離する。上澄み画分の約１〜３％を除いてすべてを捨て、ＤＮＡ精製のために利用できる白血球を残す。
【００５９】
ＲＢＣ溶解試薬は、哺乳類全血と合わされると、実質的に無損傷の白血球を含有する赤血球ライゼートを形成する。それは実質的に無損傷のタンパク質外被を有するウィルスも含有し得る。白血球（及び存在し得る細胞性ウィルス）を次いで赤血球ライゼートから分離する。白血球を直接、又は固体支持体への適用の後に核酸精製試薬と合わせることができる。
【００６０】
第２及び第３の補助試薬は、ＤＮＡ精製の前に酵母及びグラム−陽性バクテリアから細胞壁を消化するために一緒に用いられる。本明細書で該試薬を「細胞懸濁試薬（Ｃｅｌｌ
Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）」及び「溶解酵素試薬（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）」と呼ぶ。それらは核酸精製試薬による溶解に抵抗性であり得る細胞壁を消化するために、ＤＮＡ精製法の第１段階で用いられる。細胞懸濁試薬を生物学的サンプルと合わせて細胞懸濁液を形成する。溶解酵素試薬を細胞懸濁液と合わせて消化された細胞を含有する混合物を形成する。これらの消化された細胞を次いで例えば遠心により混合物から分離し、次いで直接、又は固体支持体への適用の後に核酸精製試薬と接触させる。
【００６１】
細胞懸濁試薬は細胞を無損傷に保ち、その間にその細胞壁が溶解酵素により消化される。この試薬は、試薬のｐＨを約７〜８．５、そしてより好ましくは約７．５〜８．０に保持するために緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓを含有する。緩衝剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．０５〜０．１５Ｍ、そしてより好ましくは約０．０８〜０．１２Ｍの濃度で用いられる。細胞懸濁試薬はＤＮＡ損傷を減少させるためにキレート化剤、好ましくはＥＤＴＡも含有する。キレート化剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．０５〜０．１５Ｍの濃度、そしてより好ましくは約０．０８〜０．１２Ｍにおいて用いられる。緩衝剤対キレート化剤の好ましいモル比は約１：１である。この試薬は細胞の細胞壁が消化されている間に細胞を無損傷に保つために、ソルビトールのような薬剤も含有する。この薬剤は試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．８〜１．０Ｍ、そしてより好ましくは約０．８５〜０．９５Ｍの濃度で用いられる。緩衝剤、キレート化剤及び細胞懸濁剤は水中で合わされる。水は好ましくは脱イオン化され且つ実質的にヌクレアーゼを含有しない。
【００６２】
溶解酵素試薬は、酵母細胞壁に含有されるベータ−１，３−グルコースポリマーを消化する溶解酵素を含む。この酵素の精製された形態はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのような商業的供給源から容易に入手可能である。この酵素の活性は好ましくはｍｇ当たりに少なくとも２００単位、より好ましくはｍｇ当たりに少なくとも１０００単位、そして最も好ましくはｍｇ当たりに少なくとも約５，０００単位である。酵素に加え、溶解酵素試薬は試薬のｐＨを保持するために緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓを含有する。Ｔｒｉｓは試薬の合計容積に基づいて好ましくは約１〜２０ｍＭ、より好ましくは約５〜１５ｍＭ、そして最も好ましくは約８〜１２ｍＭの濃度で用いられる。溶解酵素試薬のｐＨは、塩酸のような酸を用いて約７．５〜８．２のｐＨに調節される。さらに、溶解酵素試薬は２種の安定化剤を含有する。第１は好ましくはグリセロールである。グリセロールは好ましくは約２０〜５０％グリセロール（容積／容積）、より好ましくは約２４〜４０％グリセロール、そして最も好ましくは約２８〜３２％グリセロールの量で用いられる。第２の安定化剤は好ましくは塩化カルシウムである。塩化カルシウムは試薬の合計容積に基づいて好ましくは約０．５〜５ｍＭの濃度、そしてより好ましくは約０．７５〜１．２５ｍＭにおいて用いられる。酵素、緩衝剤、酸及び２種の安定化剤は水中で合わされる。水は好ましくは脱イオン水である。好ましくは試薬を約０．２μＭの孔径のフィルターに通過させることにより精製する。
【００６３】
典型的には、第２及び第３の補助試薬を用いて例えば酵母の細胞壁を消化するために、３００μｌの細胞懸濁試薬を約１億個の酵母細胞の１０〜２０μｌの懸濁液に１．５μｌの溶解酵素試薬と一緒に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。１５，０００ｘｇで１分間遠心した後、上澄み画分を除去し、ＤＮＡ精製に利用できる消化された細胞を残す。
【００６４】
本明細書で「タンパク質消化試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅ
ｎｔ）」と呼ぶ第４の補助試薬であるタンパク質消化試薬は、特に固体組織試料中の汚染タンパク質を消化するために用いられる。この酵素の精製された形態であるプロテイナーゼ Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙのような商業的供給源から容易に入手可能であり、約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で用いられる。３６℃より高い温度における加熱はこの酵素の活性を促進する。
【００６５】
第５の補助試薬である等張液（Ｉｓｏｔｏｎｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、典型的に細胞もしくはＤＮＡ懸濁液を作るために用いられる。適した等張液は塩に基づき、多くの場合にｔｒｉｓ、クエン酸塩又はリン酸塩で緩衝されている。１つの例はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【００６６】
固相精製のためには、適する固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびそれらの組み合わせを包含するがしかしこれらに制限されない。好ましい固体支持体は、シュライヒャー アンド シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）（ニューハンプシャー州キーン）から入手可能な試料収集紙９０３、もしくはワットマン インターナショナル リミテッド（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）（イギリスケント州スプリングフィールドミル）から入手可能なＢＦＣ１８０に見出されるようなセルロース繊維から構成される。別の好ましい固体支持体はポリオレフィンである。ポリオレフィンは、本明細書で、グラフトコポリマーのような改質ポリマーを包含するいずれかのオレフィンを基材とするコポリマーもしくはホモポリマーと定義される。許容できるポリオレフィンは、低、中および高密度ポリオレフィン、ならびに線状の低密度ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリブチレンを包含する。好ましくは、ポリオレフィンの固体支持体は親水性であり、そして、アメリカン フィルトローナ インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｉｌｔｒｏｎａ，Ｉｎｃ．）（ヴァージニア州リッチモンド）から入手可能なフィルトローナ［Ｆｉｌｔｒｏｎａ］（商標）ポリオレフィンで見出されるもののような低密度ポリエチレンおよびポリプロピレン繊維の混合物から構成される。最も好ましくは、固体支持体は、均一な流動の特徴および低背圧を与える方向性に多孔質であり、相互に交錯かつ結合される繊維から構成され、回転チューブ(spin tube)、ウェル、カートリッジもしくは別の容器中への容易な充填を見込むように弾性であり、約５０〜９０％の気孔率を有し、そして約２０〜３０μｍの直径を有する繊維から構成される。
【００６７】
本発明の試薬との使用に適する固体支持体の大きさは、生物学的物質の体積に従って変動してよい。例えば、０．５ｍｍの厚さを有するシュライヒャー アンド シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）の９０３紙を固体支持体に使用する場合、３ｍｍ直径の円板は約３μｌの血液を保持することができ、また、８ｍｍ直径の円板は約２５μｌの血液を保持することができる。生物学的物質の体積が増大する際に、厚さおよび／もしくは直径がそれに従って増大してよい。
【００６８】
本発明の試薬との使用に適する固体支持体の形状は、生物学的物質の型に従って変動してよい。例えば、頬側、鼻咽頭、膣、尿道および直腸のサンプルを得る場合には、スワブが適切な収集装置である。血液もしくは唾液サンプルのような体液を得る場合には、固体支持体は、例えばシート、予め切断された円板もしくは筒であってよい。必要な場合は、固体支持体を適切な容器、例えば（ガスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）カードのような）紙の形態、微小遠心管、回転チューブ、９６穴プレート、チャンバーもしくはカートリッジ中に含有する。
【００６９】
固体支持体は、溶解およびその後の精製で補助するために溶解試薬で処理してよい。好ましくは、固体支持体を処理するのに使用される溶解試薬の体積は、その固体支持体の総
体積の最低１／１０である。より好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積の最低半分であり、そして最も好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積に対応する。固体支持体の総体積は、その固体支持体の外的境界により規定される体積を指す。生じる生成物は、本明細書で「溶解マトリックス（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）」と称される、ＤＮＡのような核酸の単離のための溶解マトリックスである。溶解試薬を固体支持体と組み合わせることにより、ＤＮＡ精製法は、別個の溶解段階を除去することにより単純化される。好ましくは、溶解試薬を固体支持体に適用し、そしてその後、生物学的物質との接触前に固体支持体上で乾燥する。対照的に、慣習的系は、典型的には、生物学的物質を、固体支持体との接触に先立つ１段階として溶解試薬と接触させるか、もしくは、生物学的物質を固体支持体とともに懸濁し、その後、溶解試薬を、生じる懸濁液に添加する。
【００７０】
場合によっては、溶解試薬は、生物学的サンプル中に存在するＲＮＡを消化することが必要である場合にはＲＮＡ消化酵素を包含し得る。ＲＮＡ消化酵素を固体支持体と組み合わせることにより、ＤＮＡ精製方法は、別個の消化段階を除去することにより単純化される。好ましいＲＮＡ消化酵素はＲＮアーゼＡである。この酵素の精製された形態は、シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミズーリ州セントルイスのような商業的供給源から容易に入手可能である。好ましくは、ＲＮアーゼＡを、１ｍｌあたり約０．００５〜１ｍｇ、そしてより好ましくは１ｍｌあたり約０．０１〜０．１ｍｇの量で溶解試薬（Ｌｙｓｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）に添加する。この酵素の活性は、好ましくは、１ｍｇあたり最低約５０単位、そしてより好ましくは１ｍｇあたり最低約１００単位である。
【００７１】
好ましい一態様において、溶解試薬は、陰イオン性洗剤およびＲＮＡ消化酵素を包含するが、しかしキレート剤もしくは緩衝剤を包含しない。適する陰イオン性洗剤は、細胞を溶解するそして／もしくはタンパク質および脂質を可溶化することが可能である。こうした陰イオン性洗剤は、ドデシル硫酸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム塩）、ならびにＮ−ラウロイルサルコシンもしくはドデシル硫酸塩を包含するがしかしこれらに制限されない。好ましくは、陰イオン性洗剤はドデシル硫酸塩である。好ましくは、それは、試薬の総体積に基づき、約０．１〜１０％、より好ましくは０．２〜１．６％、そして最も好ましくは約１．０〜１．２重量／体積％の量で使用される。細胞培養懸濁液のような高ＲＮＡ含量を伴う生物学的サンプルには、ＲＮＡ消化酵素が必要である。好ましいＲＮＡ消化酵素はＲＮアーゼＡである。高ＲＮＡ含量を伴う生物学的サンプルには、商業的に入手可能なＲＮアーゼＡ（例えば、４ｍｇ／ｍＬの濃度で入手可能なピュアジーン［Ｐｕｒｅｇｅｎｅ］ＲＮアーゼＡ、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を、１ｍＬあたり約０．００５〜１ｍｇ、そしてより好ましくは１ｍＬあたり約０．０１〜０．１ｍｇの量で陰イオン性洗剤溶液に添加する。この酵素の活性は、好ましくは、１ｍｇあたり最低約５０単位、そしてより好ましくは１ｍｇあたり最低約１００単位である。
【００７２】
なお別の好ましい態様において、溶解試薬は陰イオン性洗剤のみを包含するが、しかし、キレート剤、緩衝剤もしくはＲＮＡ消化酵素を包含しない。陰イオン性洗剤は上述されたとおり使用される。
【００７３】
本発明は生物学的サンプルからのＤＮＡの精製方法もまた提供する。固相精製には、本発明の方法は、典型的には、ただ１種の試薬および２個の主段階（例えば、洗浄および乾燥）を使用する。当該方法は、生物学的サンプルを、細胞を溶解するために固体支持体と接触させて、それによりＤＮＡを遊離させることを必要とし、ＤＮＡはその後固体支持体に結合する。商業的に入手可能なＤＮＡ精製試薬を、可溶化および不純物の除去を助長するため固体支持体に添加する。この試薬での固体支持体の連続的洗浄は、不純物が固体支持体から除去されることを引き起こす。その後の分析での使用に先立ち、過剰の水性溶液
を、実施例１、２および３に記述されるとおり蒸発もしくは遠心分離のような方法により精製されたＤＮＡを含有する固体支持体から除去することができる。
【００７４】
その後の分析での、精製されたＤＮＡを含有する固体支持体の使用に対する一代替として、ＤＮＡは固体支持体から取り出されてよい。追加の試薬および追加の段階（溶出）を、ＤＮＡが固体支持体から取り出される場合は使用する。好ましくは、ＤＮＡ溶出試薬（Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）を、固体支持体からＤＮＡを取り出すのに使用する。これは実施例４、５、７、８、９、１０、１１および１３に具体的に説明される。
【００７５】
好ましくは、当該方法は、ＤＮＡを含有する固体支持体をＤＮＡ溶出試薬と接触させること、そしてインキュベートすることを必要とする。好ましくは、ＤＮＡ溶出試薬の量は、約１体積の固体支持体に対し約０．２５体積のＤＮＡ溶出試薬であり、より好ましくは、当該体積は約１体積の固体支持体に対し約１体積の試薬であり、そして最も好ましくは、当該体積は約１体積の固体支持体に対し約４体積の試薬である。
【００７６】
インキュベートの温度は、好ましくは最低約３０℃、より好ましくは最低約８０℃、そして最も好ましくは最低約１００℃である。インキュベートの持続期間は、好ましくは最低約２分、より好ましくは最低約５分、そして最も好ましくは最低約１０分である。ＤＮＡは、遠心分離、真空もしくは圧のような標準的方法により固体支持体から取り出される。
【００７７】
好ましい一態様において、固体支持体は、溶解試薬が固体支持体に結合されるように溶解試薬で処理される。溶解試薬は、共有結合で、非共有結合で、固体支持体の内的空間内に捕捉されることにより、もしくは固体支持体の素材（例えば繊維、ビーズなど）上に付着されることにより結合されてよい。生じる生成物が溶解マトリックスである。好ましくは、溶解試薬は固体支持体上で乾燥させられる。
【００７８】
溶解試薬は、好ましくは固体支持体の総体積の最低１／１０に対応する体積で、より好ましくは固体支持体の総体積の最低半分に対応する体積で、そして最も好ましくは、固体支持体の少なくとも総体積に対応する体積で、固体支持体に添加される。
【００７９】
本発明の別の態様においては、溶解試薬は、固体支持体の作成で使用された素材（例えば繊維、ビーズなど）に直接添加されてよく、そして、好ましくは、それが最終の使用者に準備のできた(user-ready)形態（例えば、紙、スワブ、円板、栓、カラムなど）に作成される前に乾燥させられてよい。なお別の態様において、固体支持体は、結晶もしくは粉末の形態の溶解試薬で処理されてそして固体支持体に結合させられてよい。
【００８０】
ＤＮＡは、生物学的物質（培養細胞、全血など）のサンプルが溶解マトリックスを接触することを可能にすることにより単離される。サンプルは溶解マトリックスとの接触前に溶解試薬で処理してよいとは言え、精製の効率およびＤＮＡの収量は、生物学的物質が予め溶解されない場合に大きく向上される。従って、好ましくは、生物学的物質は、細胞を溶解しかつタンパク質コートおよび脂質を可溶化する溶解マトリックスに直接添加される。溶解の効率は、最低３０℃より上で、より好ましくは最低５０℃より上で、そして最も好ましくは最低８０℃より上で加熱することにより向上させることができる。サンプルを溶解マトリックス内で最低１分インキュベート後に、それをＤＮＡ精製試薬で洗浄する。ＤＮＡ精製試薬での溶解マトリックスの連続的洗浄は、不純物が溶解マトリックスから除去されることを引き起こす。好ましくは、ＤＮＡの精製に使用されるＤＮＡ精製試薬の量は、約１体積の生物学的物質に対し約０．５体積のＤＮＡ精製試薬、より好ましくは、約１体積の生物学的物質に対し約２体積のＤＮＡ精製試薬、そして最も好ましくは、約１体積の生物学的物質に対し約５体積のＤＮＡ精製試薬である。好ましくは、ＤＮＡ精製試薬
での洗浄の回数は最低２回、そしてより好ましくは最低３回である。本方法は実施例７、８、９、１０、１２および１３で具体的に説明される。
【００８１】
本発明のさらなる一態様は、酵母およびグラム陽性細菌からのＤＮＡのような核酸の精製方法である。これらの生物学的物質は、典型的には溶解に対しより抵抗性である。当該方法は、生物学的サンプルを、第一の補助試薬、すなわち細胞懸濁試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、細胞懸濁溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）と組み合わせることを必要とする。細胞懸濁試薬は、緩衝剤、キレート剤、および細胞懸濁液を形成するための細胞懸濁剤を包含する。細胞懸濁液に、第二の補助試薬、すなわち溶解酵素試薬（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、溶解酵素溶液（Ｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を添加する。溶解酵素試薬は、細胞壁を消化するための酵素、緩衝剤、試薬のｐＨを調節するための酸および２種の安定剤を包含する。消化された細胞を、上述された液相もしくは固相精製に使用することができる。
【００８２】
本発明の別の局面として、特別のプロトコルを包含するキットが提供され、これは、本明細書に記述される試薬および場合によっては固体支持体と共同して、本発明の方法に従って生物学的物質からＤＮＡを精製するのに使用することができる。このキットは説明手段を包含する。応用に依存して、このキットは、ＤＮＡ精製試薬、ＤＮＡ溶出試薬、ＲＢＣ溶解試薬、細胞懸濁試薬、溶解酵素試薬、タンパク質消化試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）、等張溶液（Ｉｓｏｔｏｎｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、固体支持体、溶解試薬および／もしくはＲＮＡ消化酵素で処理された固体支持体、固体支持体を含有するための容器、廃液を含有するための容器、ならびにいかなる溶出されたＤＮＡも含有するための容器のいずれかの組み合わせもまた包含してよい。２種の好ましいＤＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を以下に記述する。
【００８３】
固相精製を使用する、ＤＮＡを精製するための１キットは、ＤＮＡ精製試薬（例えば、ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）、説明手段、溶解マトリックス、および溶解マトリックスを保持するための容器を含有する。本キットでは、精製されたＤＮＡはその後の分析のため固体支持体に結合されたままである。本キットの使用を具体的に説明する方法を実施例５および２８に示す。
【００８４】
固相精製およびその後の溶出を使用する、ＤＮＡを精製するための１キットは、ＤＮＡ精製試薬、説明手段、ＤＮＡ溶出試薬、固体支持体もしくは溶解マトリックス、固体支持体もしくは溶解マトリックスを保持するための容器、廃棄物を収集するための１個もしくはそれ以上の容器、そして精製されたＤＮＡを収集するための容器を含有する。本キットの使用を具体的に説明する方法を実施例４、５、７、８、９、１０および２５に示す。
【００８５】
本発明をより良好に理解することができるために、固体支持体を含有する容器についての特定の態様を今やより詳細に記述するであろう。
【００８６】
本発明の好ましい一態様において、当該容器は上部に２個の入口ポートを装備されたカートリッジである。入口ポートは雌型ルーアロック［Ｌｕｅｒ−Ｌｏｃｋ］（商標）のようなコネクタによりサンプルもしくは試薬を含有する上流の容器に取付けられる。一方の入口（サンプルポート）は、固体支持体への生物学的サンプルの適用に使用される。サンプルポート上の任意の一特徴は、サンプルがそれを通って移動された後でサンプルポート
を封止する自己封止機構である。第二の入口は試薬ポートとしてはたらく。双方の入口ポート上の任意の一特徴は保護解放(breakaway)封止である。さらに、入口ポート、解放封止および拡散装置が任意のスクリューキャップ中に収容されてよい。固体支持体の底部には、細胞破片、タンパク質および脂質分子の通過に適する孔径をもつ任意の拡散装置がある。この拡散装置は、カートリッジの断面を横断する生物学的物質の均一な横切りを見込み、そして固体支持体の下のどこででも生物学的物質の一様でない集積を予防する。カートリッジの出口は、テーパーバレルの上に適切に嵌まる保護キャップを装備されてできあがる。精製されたＤＮＡは、容易なかつ混入のない貯蔵のため、スナップキャップを伴う円錐チューブより成る収集チューブに収集される。容器全体は、加工されるべきサンプルの大きさおよびその後の分析に必要とされる収量に依存して、大きさに合わせて調整し得る。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様において、容器は、その中に固体支持体が充填されるインサートを保持するよう設計された回転チューブより成る。固体支持体は、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびこれらの組み合わせであってよい。インサートは、それを回転チューブ中に保持するためのフランジをつけられた上部、および固体支持体を支持しつつ液体を通過させる孔底より成る。回転チューブにつながれるキャップはインサートを覆うために使用した。商業的に入手可能な回転チューブの例を、実施例２、４、７、８、９および１０に示す。生物学的物質は孔底を通過し、そして回転チューブの底部で収集される。使用される場合、生物学的物質は固体支持体に適用される。必須の体積の試薬（核酸精製試薬であろうと溶出試薬であろうと）がその後固体支持体に添加される。回転チューブをその後遠心分離器中に置き、そして遠心力にさらし、遠心力は、生物学的物質、精製試薬および精製されたＤＮＡを、精製過程の間に固体支持体を通って引き出す。
【００８８】
なお別の態様において、容器は複数のウェルのプレート、例えば６、１２、２４、４８もしくは９６穴プレートであってよく、ここでは固体支持体が各ウェル中に充填される。各ウェルの底部は出口ポートを有し、それを通って廃棄物および破片が進み得る。
【００８９】
本発明は以下の詳細な実施例への言及によりさらに記述されるであろう。これらの実施例は、多様な特定のかつ具体的に説明する態様および技術をさらに具体的に説明するために提供される。しかしながら、多くの変形物および改変が本発明の範囲内にとどまりつつなされてよいことが理解されるべきである。
【００９０】
以下で挙げられる原料の全部は、シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミズーリ州セントルイスのような商業的供給源から容易に入手可能である。全部のパーセンテージは、別に明記されない限り、試薬の総体積に基づく体積につき体積である。
【実施例】
【００９１】
実施例１．ＤＮＡ精製のための固体支持体の評価
約３ｍｍ直径もしくは２ｍｍ平方の表面積をもつ小片に切断されたいくつかの固体支持体を、ＤＮＡ精製のための支持体として評価した。１μｌ体積の全血を各固体支持体上にピペットで移し、０．６ｍｌチューブもしくは９６穴プレートのウェル中に保持し、そして乾燥させた。ＤＮＡを精製するために、２００μｌのＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を添加し、そして１５分間インキュベートした。ピペットで３回上下して混合した後に、ＤＮＡ精製試薬（溶出された不純物を含有する）を廃棄した。この洗浄処置を、合計３回の洗浄のため
さらに２回反復した。この３段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、固体支持体に結合された精製されたＤＮＡが残った。固体支持体は室温ないし８０℃での蒸発により乾燥し得たとは言え、任意のアルコール洗浄段階を使用して乾燥過程を加速した。２００μｌの体積の１００％エタノールを各固体支持体上にピペットで移し、１分間インキュベートし、そしてその後除去した。１００％のイソプロパノール（２−プロパノール）もまた乾燥を加速するための適するアルコールであることが見出された。エタノールのすすぎを、合計２回のすすぎのためさらに１回反復し、そしてその後、円板を室温で最低２時間乾燥させた。
【００９２】
固体支持体をＤＮＡ増幅アッセイで評価するため、それぞれを０．６ｍｌチューブに移した。各増幅反応は、１×増幅緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、およびＤ１Ｓ８０遺伝子座に特異的なそれぞれ１μＭのプライマーを含有した。このプライマーは、以下のようなオリゴヌクレオチド配列、すなわちセンス５’ＧＡＡ−ＡＣＴ−ＧＧＣ−ＣＴＣ−ＣＡＡ−ＡＣＡ−ＣＴＧ−ＣＣＣ３’（配列番号１）およびアンチセンス５’ＧＴＣ−ＴＴＧ−ＴＴＧ−ＧＡＧ−ＡＴＧ−ＣＡＣ−ＧＴＧ−ＣＣＣ３’（配列番号２）を伴い、バドウル（Ｂｕｄｏｗｌｅ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４８、１３７−１４４（１９９１）により示されるものから短くした。サンプルを、９４℃１分間、７０℃１分間および７２℃２分間の３５周期を使用して増幅した。
【００９３】
この結果は、数種の固体支持体を使用してのＤ１Ｓ８０の増幅産物の存在を示した。ＤＮＡ精製に適することが見出された固体支持体を以下に列挙する。最良の結果（すなわち増幅産物の最大の量）は、セルロース紙固体支持体を使用して観察された。
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
実施例２：全血からのＤＮＡの迅速固相精製
迅速固相精製法を評価するため、２個の血液サンプルを３個体のそれぞれから収集し、一方は新鮮で使用し、そして他方は３ヶ月間−８０℃で凍結させて保存しそしてその後使用前に融解した。３μｌの体積の全血を、２ｍｌ回転チューブ（スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ、カタログ番号９４２４、コーニング コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のインサート中に含有されたＳ＆Ｓ ９０３紙の３ｍｍ直径の円板上にピペットで移した。２００μｌの体積の核酸ＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製試薬、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）をインサート中にピペットで移し、そしてサンプルを１分間インキュベートした。ＤＮＡ精製試薬を、１５，０００×ｇで１０秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を回転チューブ中に収集した。ＤＮＡ精製試薬での第二のおよび第三の洗浄を、合計３回の洗浄のため同一の様式で実施した。精製されたＤＮＡを含有する各円板を、増幅分析のため０．６ｍｌのシリコン処理チューブに移した。回転チューブ中に収集された廃棄物を廃棄した。
【００９７】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５０μｌのＰＣＲ増幅溶液を各円板に添加した。各増幅反応は、１×増幅緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各デオキシヌクレオチド、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）および１μＭの各プライマーを含有した。リドカー（Ｒｉｄｋｅｒ）ら、Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３２、９１２−９１７（１９９５）により与えられたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、第Ｖ因子の遺伝子配列を３５周期の間増幅し、ここで１周期は９４℃１分間、５８℃１分間および７２℃１分間と定義した。各ＤＮＡサンプルからの１０μｌのアリコートを、２％アガロースゲルにより８０ボルトで４５分間電気泳動して、増幅の結果を決定した。ゲルおよび泳動緩衝液は、透視器上で増幅されたＤＮＡの可視化を可能にするために１ｍｌあたり０．１２５μｇの臭化エチジウムを含有した。
【００９８】
２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、ゲル電気泳動後に６サンプルのそれぞれについて観察された。増幅の結果は、約５分で実施された迅速固相ＤＮＡ精製法が、新鮮もしくは凍結された全血から本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【００９９】
実施例３：数種の生物学的サンプルからのＤＮＡの固相精製
最低２個のＤＮＡサンプルを、以下の生物学的物質（注記された場合を除いてヒト起源）、すなわち全血、骨髄、唾液、頬側細胞、培養されたＫ５６２リンパ腫細胞、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アルファルファ葉および大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌から調製した。全血、骨髄、唾液および頬側細胞切屑のサンプルをＳ＆Ｓ ９０３紙に適用し、乾燥し、そしてその後穴あけ器で３ｍｍ直径の円板を打ち抜くことによりサンプリングした。植物もしくは動物組織のサンプルは、成体のＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒハエもしくはアルファルファの第一葉（子葉）をＳ＆Ｓ ９０３紙上で押すことにより調製した。サンプルを、収集紙と一片のパラフィルム（ＰＡＲＡＦＩＬＭ）「Ｍ」（アメリカン ナショナル キャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ）、コネティカット州グリニッジ）との間に置き、そして親指の圧を用いて押した。培養細胞懸濁液は、Ｋ５６２ヒト細胞もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞のいずれかに適する標準的成長培地中で調製した。約１０，０００個のＫ５６２細胞を含有する１μｌの体積の培地、もしくは約３００万個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含有する５μｌの体積を、３ｍｍ直径の円板上にピペットで移し、そして乾燥した。その後、各円板を実施例１に記述されたとおり精製した。
【０１００】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５０μｌの体積のＰＣＲ増幅溶液を、結合されたＤＮＡを含む円板を含有する各チューブに直接添加した。ＰＣＲ溶液は、プライマーについてを除き、上の実施例２に記述されたようであった。プライマーを以下に示す。全血、骨髄、唾液、頬側細胞、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ組織、およびＫ５６２細胞を、ｍＲＮＡ捕捉キット（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）（ユナイテッド ステイツ バイオケミカル コーポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、オハイオ州クリーヴランド）で与えられるグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子配列に特異的なプライマーを使用して増幅した。ＧＡＰＤＨを増幅するために使用された増幅プログラムは、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間の３０周期であった。全血からのＤＮＡサンプルは、ワン（Ｗａｎｇ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７、７６−８２（１９９４）により記述されたミトコンドリアのプライマーＭＴ−１およびＭＴ−２、ならびにＧＡＰＤＨについて上述された増幅プログラムを使用することにより、染色体外ＤＮＡの存在についてもまた試験した。アルファルファおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡサンプルは、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１、１７６−１７７（１９９１）により記述された１６ｓ様リボソームＤＮＡに特異的なプライマーを使用することにより試験した。増幅プログラムは、９４℃１分間、５０℃１分間および７２℃２分間の３０周期であった。増幅後、５０μｌの反応の１０μｌを、実施例２に記述されたとおりアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１０１】
この結果は、各サンプルが、本質的に純粋なＤＮＡの存在を示す期待された増幅産物を生じたことを示した。全血、骨髄、唾液、頬側細胞、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＫ５６２細胞から精製されたＤＮＡの増幅は、ＧＡＰＤＨの約３００塩基対の増幅産物を生じた。また、全血から精製されたＤＮＡの増幅は、ミトコンドリアＤＮＡに特異的なプライマーを使用して約３９４塩基対の増幅産物を生じ；これは、染色体外ＤＮＡが固体支持体の円板上に保持されたことを示した。アルファルファおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡからは、１６ｓ様リボソームＤＮＡ増幅由来の約４００塩基対の増幅産物が観
察された。
【０１０２】
実施例４： 全血および頬側スワブサンプルからのＤＮＡの固相精製および溶出
全血および頬側スワブの含水および乾燥双方のサンプルを試験するため、各型の３サンプルを３個体から収集し、合計１２サンプルを生じた。液体の全血サンプルについて、２５μｌの体積を、２ｍｌ回転チューブ（スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ、カタログ番号９４２４、コーニング コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のインサート中に置かれたＳ＆Ｓ ９０３収集紙の８ｍｍ直径の円板上にピペットで移した。乾燥の全血サンプルについては、８ｍｍの円板を、３００μｌの乾燥された血液のスポットから打ち抜き、そして２ｍｌ回転チューブのインサート中に挿入した。頬側スワブを、滅菌の先端に綿をつけられた(cotton-tipped)スワブ（パーラップス［Ｐｕｒ−Ｗｒａｐｓ］（商標）、ハードウッド プロダクツ（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、メーン州ギルフォード）で内側頬表面を２０回ぬぐうことにより得た。スワブの綿端部を切り離し、そして、含水サンプルについては収集の２時間以内に、また、乾燥サンプルについては２４時間乾燥後に、２ｍｌ回転チューブのインサート中に置いた。サンプルを精製するため、２００μｌのＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を各インサート中にピペットで移し、そして、含水サンプルについて１分、また乾燥サンプルについて１５分インキュベーションした。ＤＮＡ精製試薬を、１５，０００×ｇで１０秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を２ｍｌ回転チューブ中に収集した。ＤＮＡ精製試薬での第二および第三の洗浄を、合計３回の洗浄のため同一の様式で実施した。固体支持体に結合された精製されたＤＮＡを溶出するため、各インサートを清浄な２ｍｌ受容器チューブに移した。その後、１００μｌのＤＮＡ溶出試薬を、固体支持体を含有するインサート中にピペットで移し、そして、１２ｍｍ直径のウェルを含有するアルミニウムブロックを取り付けられた乾燥ブロックヒーター（例えば、ＶＷＲ サイエンティフィック プロダクツ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）カタログ番号１３２５９−００７）中で、８０℃で１５分間加熱した。ＤＮＡ溶出試薬は、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＮａＯＨおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．９を含有した。加熱した後、各サンプルを１５，０００×ｇで２０秒間遠心分離して、精製されたＤＮＡを収集した。
【０１０３】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５μｌのアリコートを各サンプルから試験した。実施例２に記述された増幅手順を使用した。
【０１０４】
約２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、１２サンプルのそれぞれについて観察された。この結果は、固相精製法が、固体支持体にセルロース収集紙および綿スワブを使用して、含水および乾燥双方の血液および頬側細胞サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【０１０５】
実施例５：カートリッジを使用する全血および培養細胞中のＤＮＡの精製
カートリッジを、標準的な１ｍｌポリプロピレンシリンジ（カタログ番号３０９６０２、ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用して構築し、その中に固体支持体を挿入した。固体支持体は、約５ｍｍ直径×２７ｍｍ長さの寸法のセルロースアセテート（フィルトローナ［Ｆｉｌｔｒｏｎａ］（商標）、アメリカン フィルトローナ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｉｌｔｒｏｎａ）、ヴァージニア州リッチモンド）から構成された。固体支持体は、既に５００μｌの溶解試薬およびＲＮアーゼＡで処理しそして室温で２４時間乾燥させてあった。溶解試薬は、０．５％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス、０．１Ｍ ＥＤＴＡを含有し、これに０．０４ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを添加した（１ｍｇあたり約１００単位のＲＮアーゼＡ）。それぞれ３００μｌの体積中に約２００万個の細胞を含有する、２個の全血サンプル
および２個のＫ５６２培養細胞サンプルを、それぞれ垂直の位置に支持されたカートリッジにピペットで移した。細胞を溶解させそしてＲＮアーゼにサンプル中に存在するＲＮＡを消化させるために室温で１５分間インキュベートした後に、３００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を、６０ｒｐｍのペリスタリックポンプ（カタログ番号ＭＣ１３００３、マークソン サイエンス（Ｍａｒｋｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、オレゴン州ヒルズボロ）を使用して２．５ｍｍ内径のシリコンチューブを介して導入した。１分のインキュベート後に、空気を、カートリッジを通してポンプで送って、カートリッジの内容物を廃棄物容器中に排出した。その後、第二の３００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬をカートリッジ中にポンプで送り、そして１分インキュベートした。この洗浄段階を、ＤＮＡ精製試薬での合計３回の洗浄のためさらに１回反復した。カートリッジ中の固体支持体を、それを通して３００μｌのＤＮＡ溶出試薬をポンプで送ることによりすすいだ。精製されたＤＮＡを固体支持体から取り出すために、３００μｌのＤＮＡ溶出試薬をカートリッジ中にポンプで送った。カートリッジを、双方の端部で栓をし、そして重力対流オーブン中６０℃で３０分間インキュベートした。あるいは、適切な電子レンジを使用してもよい。カートリッジは、１１００Ｗのシャープ（Ｓｈａｒｐ）電子レンジ中で、３０％出力で２５分間加熱してよい。その後、精製されたＤＮＡを含有したＤＮＡ溶出試薬を、カートリッジからそして１．５ｍｌ微小遠心管中にポンプで送った。あるいは、ＤＮＡ溶出試薬を、６０℃より上の温度に加熱し得そしてその後カートリッジ上にポンプで送り得る。
【０１０６】
精製されたＤＮＡサンプルを増幅アッセイで評価するため、５μｌのアリコートを各サンプルから試験した。実施例２に記述された増幅手順を使用した。
【０１０７】
約２２３塩基対の第Ｖ因子の増幅産物が、４サンプルのそれぞれについて観察された。この結果は、カートリッジの形式の固相精製法が、全血もしくは培養細胞双方のサンプルから本質的に純粋なＤＮＡを生じたことを示した。
【０１０８】
実施例６：個体支持体に結合されたＤＮＡの精製および制限酵素消化
ＤＮＡ精製試薬（ジェネレーション［ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ］（商標）ＤＮＡ精製溶液、ジェントラ システムズ インク（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して精製されたＤＮＡの質を、固体支持体に結合されている間にさらに試験するため、７種の制限酵素を使用して精製されたＤＮＡを消化するそれらの能力を試験した。単一の個体からの３００μｌの体積の全血をＳ＆Ｓ ９０３紙上にピペットで移し、そして室温で乾燥した。その後、７個の５ｍｍ直径の円板を押して抜き取り、そしてそれぞれを０．６ｍｌチューブ中に置いた。２００μｌの体積のＤＮＡ精製試薬を各チューブに添加し、そして１５分間インキュベートした。ピペットで３回上下して混合した後に、ＤＮＡ精製試薬を廃棄した。この洗浄処置を、合計３回の洗浄のため２回反復した。この３段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、円板に結合された精製されたＤＮＡが残った。２００μｌの体積の１００％イソプロパノール（２−プロパノール）を各円板上にピペットで移し、１分間インキュベートし、そしてその後除去した。これを、合計２回のアルコールのすすぎのため１回反復した。精製されたＤＮＡを含有する円板を室温で２時間乾燥させた。
【０１０９】
各円板に結合されたＤＮＡの質を試験するため、２５μｌの体積の制限酵素溶液を各チューブに直接添加した。各制限酵素溶液は、製造元（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー）により供給された適切な緩衝剤、および２．５ｍＭのスペルミジン（シグマ ケミカル カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ））を含有した。以下の酵素、すなわち、Ｐｓｔ Ｉ（１２単位）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（２０単位）、Ｅｃｏ ＲＩ（２０
単位）、Ｍｓｐ Ｉ（２０単位）、Ｂａｍ ＨＩ（２０単位）、Ｈｐａ Ｉ（５単位）、およびＨａｅ ＩＩＩ（１０単位）を、明記された各反応に添加された単位で試験した。サンプルを３７℃で４時間消化し、その時間の間、消化されたＤＮＡフラグメントは固体支持体から消化溶液中に遊離された。制限フラグメントを収集するために、各サンプルチューブを２７ゲージの針を用いて刺し通し、そして清浄な０．６ｍｌチューブ中に置いた。消化溶液を、２，０００×ｇで２分間の遠心分離により収集した。精製されたＤＮＡが消化されたかどうかを決定するために、２０μｌの体積を各サンプルから取り出し、そして１％アガロースゲルにより２２ボルトで１２時間電気泳動した。
【０１１０】
この結果は、試験された７種の酵素のそれぞれについて高分子量から低分子量までの範囲にわたるＤＮＡ制限フラグメントの特徴的なスメアの存在を示した。これは、このＤＮＡサンプルが本質的に純粋でありそして制限酵素消化に適したことを立証した。
【０１１１】
実施例７．固体支持体の処理に関する界面活性剤の評価
種々の界面活性剤を試験して、ＤＮＡの収量を至適化するために必要な界面活性剤の最良の種類を決定した。以下の種類の界面活性剤を試験した：
アニオン性 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
Sarkosyl
カチオン性 ドデシルトリメチラム−モニウム ブロミド
非イオン性 Tween-20
Triton X-100
【０１１２】
対照は、界面活性剤を含めず、そしてサンプルを加えずに設定した。
【０１１３】
使用した各ポリスルホン固体支持体は、25.31mmの円周および9.73mmの高さを有した（Filtrona(商標)、ロット#18475、アメリカン フィルトロナ（American Filtrona)、リッチモンド、バージニア州）。360μl容量の１％界面活性剤溶液を、各固体支持体に添加し、室温で少なくとも16時間、固体支持体を飽和した。２連の固体支持体を各処理について調製した。固体支持体を２mlのスピン管（スピン−Ｘ、カタログ番号9424、コーニング コースター（Corning Costar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)のインサート中に置いた。約２百万個の細胞を300μl中に含む全血サンプルを各固体支持体に適用し、そして室温で少なくとも１時間インキュベートして、細胞を溶解させた。200μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社(Gentra Systems,Inc.)，ミネアポリス、ミネソタ州）を次に加えた。１分インキュベートした後、ＤＮＡ精製試薬を15,000×gで10秒間遠心して２mlの回収管に不純物を集めることにより除去した。これを全部で３回洗浄するために２回繰り返した。廃液は２回目および３回目の洗浄の間に受容管から除去した。次に固体支持体は200μlのＤＮＡ溶出試薬（１mM Tris、0.001mM EDTA、５mM NaOH）を加え、そして15,000×gで10秒間遠心することによりすすいだ。精製したＤＮＡを支持体から取り出すために、固体支持体を含有するインサートをきれいな受容管に移し、そして200μlのＤＮＡ溶出試薬をそれに加えた。次に固体支持体を80℃で10分間、ドライブロックヒーター（例えばVER サイエンティフィック プロダクツ(Scientific Products) カタログ番号13259-007)中でインキュベートし、そして精製したＤＮＡを含有するＤＮＡ溶出試薬を15,000×gで20秒間遠心することにより取り出した。
【０１１４】
ゲノムＤＮＡの収量およびＰＣＲ増幅収量を測定し、精製したＤＮＡを評価した。相対的なゲノムＤＮＡの収率を決定するために、10μl容量の精製したＤＮＡを１μlの10×標準追跡色素と混合し、そして0.125μg/mlのエチジウムブロミドをゲルおよび泳動緩衝剤に含有する0.7％アガロースゲルに乗せた。ＤＮＡを80ボルトで15分間泳動し、そしてバンドはUVトランスイルミネーター上でバンド強度について視覚的に調査した。
【０１１５】
ＰＣＲ増幅アッセイは、2.5μlの精製したＤＮＡサンプルを22.5ＰＣＲ増幅ミックスに直接加えることにより、25μlの全増幅容量について行った。各増幅反応は１×増幅緩衝剤（プロメガ（Promega)、マジソン、ウィスコンシン州）、1.5mM MgCl2、200μMの各デオキシメクレオチド、1.25単位のTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、および１μMの各プライマーを含んだ。プライマーはヒトベータグロビン遺伝子に特異的な配列であった:
センス５’ＣＣＴ−ＧＧＣ−ＴＣＡ−ＣＣＴ−ＧＧＡ−ＣＡＡ−ＣＣＴ−ＣＡＡ３’（配列番号３）およびアンチセンス５’ＴＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＣ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＴ−ＴＣＴ３’（配列番号４）。サンプルは、94℃で１分間、70℃で１分間、そして72℃で2分間の35サイクルを使用して増幅した。次に10μlの増幅したＤＮＡは、0.125μg/mlのエチジウムブロマイドをゲルおよび泳動緩衝剤に含有する２％アガロースゲルに乗せた。サンプルは80ボルトで45分間電気泳動し、そして1.1kbのＤＮＡバンドをUVトランスイルミネーター上で視覚化した。界面活性剤は表２に示すように、ゲノムおよび増幅ＤＮＡの両方についてバンド強度を視覚で順位付けすることにより評価した。
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
非イオン性の界面活性剤は、対照を上回るＤＮＡ収量の実質的に向上を示さなかった。使用したカチオン性界面活性剤は、ゲノムＤＮＡ収量において約２倍の上昇を示した。２つのアニオン性界面活性剤は、ゲノムおよび増幅ＤＮＡについて最高の収量を与えた。
【０１１８】
実施例８．ＤＮＡ増幅に及ぼすNaOH濃度、界面活性剤の種類および固体支持体密度の効果
NaOH濃度および界面活性剤の種類（アニオン性または両イオン性であるか）の効果を、２種の固体支持体密度で調査した。０または５mM NaOHおよび１％ ドデシル硫酸ナトリウムまたは１％CHAPSを含有する４種の溶液を調製した。CHAPSは市販されている両イオン性界面活性剤である。各360μl容量のこのような溶液を実施例７に記載するように固体支持体に加えた。調査した２種類のポリオレフィン固体支持体密度は、0.113グラム繊維／cc（低密度）および0.184グラム繊維／cc（高密度）（Filtrona(商標)、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州）であった。300μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして実施例７に記載したように、しかし150μl容量のＤＮＡ精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）の使用は除いて溶出させた。精製したＤＮＡはＰＣＲ増幅およびＵＶ分光光度計により分析した。使用したＰＣＲプロトコルは、実施例７に記載したものと同一であった。ゲノムＤＮＡの収量は、ＵＶ分光光度計および0.7％アガロースゲル電気泳動により調査した。ＵＶ
分光光度計によりＤＮＡを定量するために、50μlの精製したＤＮＡを950μlの脱イオン水に最初に加えた。次にＵＶ吸収を320（バックグラウンド）nmおよび260nmおよび280nmの波長で測定した。収量はＡ260×50×希釈因子×溶出容量として計算した。
【０１１９】
結果は、NaOH無し、および５mM NaOHを使用して行った固体支持体処理に関して、ＤＮＡ収量に検出できる差異はないことが示された。ＤＮＡ収量において、SDSの使用はCHAPSより2.8倍上昇した。高密度固体支持体を使用すると低密度固体支持体よりも75％の上昇が観察された。
【０１２０】
実施例９．錯化剤、塩および界面活性剤が固体支持体の処理に及ぼす効果
錯化剤、塩および界面活性剤が固体支持体の処理に及ぼす効果を決定するために、ポリオレフィン固体支持体を0.5％または2.0％のドデシル硫酸ナトリウム、０または50mM EDTAおよび０または100mM NaClを含有する８種類の溶液を用いて処理した。実施例７に記載したように200μlの全血サンプルを各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出させた。精製したＤＮＡを回収し、そしてゲノムＤＮＡの収量を実施例８に記載したようにＵＶ分光光度計により調査した。相対的収率は、さらに実施例７に記載したように0.7％アガロースゲルで精製したＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動することにより視覚化した。０と50mM NaClの間で観察されるＤＮＡ収率の差異は無かった。同様に０と50mM EDTAとの間で観察されるＤＮＡ収量の差異は無かった。しかし２％SDSに比べて0.5％SDSを使用した時、収率が３倍向上した。
【０１２１】
実施例１０．最適なアニオン性界面活性剤濃度の決定
最適なアニオン性界面活性剤濃度は、ポリオレフィン固体支持体を0.2〜1.6％の範囲のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液を用いて処理することにより予測した。固体支持体は実施例７に記載するように0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6％SDSを含有する８溶液で処理した。実施例７に記載するように200μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出した。精製したＤＮＡを集め、そしてゲノムＤＮＡの収量を実施例７に記載したようにアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
【０１２２】
0.7％アガロースゲル上のバンド強度の見積もりは、すべての濃度のSDSが良好なゲノムＤＮＡ収量を示したが、２つの最高の収量は1.0および1.2％濃度のSDSで観察されたことを示した。
【０１２３】
実施例１１．ＤＮＡ溶出に及ぼす時間および温度の変動効果
ＤＮＡ収量に及ぼす時間および温度の効果を、実施例７に記載したポリオレフィン固体支持体を使用して試験した。200μlの血液サンプルに由来するＤＮＡは、ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いた２回の400μl洗浄およびＤＮＡ溶出試薬を用いた１回の洗浄を使用して精製した。
【０１２４】
さらに200μl容量のＤＮＡ溶出試薬を加えた後、サンプルをドライブロックヒーター（VER サイエンティフィック プロダクツ、カタログ番号13259-007)中で４種の溶出温度で10分間インキュベートした。各インキュベート温度に関して、３種のサンプルの平均を表３に与える。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
100℃のインキュベート温度で、最高のＤＮＡ収量を与えた。さらに120℃の試験では、実質的な向上は観察されなかった。
【０１２７】
溶出工程中、99℃でのインキュベート時間の効果を第２の全血サンプルを使用して調査した。異なるドライブロックヒーター（ロビンズ サイエンティフィック(Robbins Scientific)、TruTemp(商標)、サニーバレ、カリフォルニア州）を使用したことを除き、上記と同じ精製プロトコルを使用した。結果を表４に示す。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
99℃で少なくとも９分間のインキュベート時間が、最適なＤＮＡ収量を与えることが分かった。
【０１３０】
実施例１２．固体支持体を含む容器の設計
カートリッジは、中に固体支持体が挿入された標準の１mlのポリプロピレンシリンジ（カタログ番号309602、ベクトン デッキンソン（Beckton Dickinson）、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を使用して構成した。固体支持体は、約５mm直径×27mm長の酢酸セルロース（Filtrona（商標)、アメリカン フィルトロナ、バージニア州）から成った。
【０１３１】
第２設計では、カートリッジは最上部に２つの入口部分を備えている。１つの入口（サンプル口）は、生物サンプルを固体支持体に適用するために使用される。サンプル口の最適な形状は、サンプルがこれを通って輸送された後にサンプル口を密封する自己密封メカニズムである。第２入口は試薬口として役立つ。両方の入口について最適な形状は、保護離脱型シールである。固体支持体の底は、細胞屑、タンパク質および脂質分子の通過に適する孔サイズの随意の拡散器である。この拡散器はカートリッジの断面を横切る生物学的物質の公平な分散を可能とし、そして固体支持体下の任意の場所で生物学的物質の不公平な蓄積を防ぐ。カートリッジの出口は、保護カップを備えるようになっている。精製されたＤＮＡは、保存の容易さ、および混入が無い保存のためにスナップカップを持つ0.5mlのコニカル管から成る回収管中に集められる。
【０１３２】
別の容器設計では、スピン管（スピン-Ｘ、コーニング コスターNo.9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)が使用され、これは固体支持体を中に配置したインサートを含む。使用した固体支持体はインサート中に置かれたポリオレフィンプラグ（アメリカン フィルトロナ、バージニア州）であった。インサートはスピン管内にポリオレフィンプラグを維持するためのつば付の最上部および固体支持体を支持する間に流体を通過させる孔底から成る。スピン管につながれたカップは、インサートを覆うために使用した。市販されているスピン管の例は、実施例１に与える。生物学的物質は孔底を通過し、そしてスピン管の底で集められる。使用する時、生物学的物質は固体支持体に適用する。次に必要な試薬容量を（ＤＮＡ試薬またはＤＮＡ溶出試薬であっても）、固体に適用する。次にこのスピン管を遠心機に置き、そして生物学的物質、精製試薬および精製ＤＮＡを精製工程中に固体支持体を通ってを引き出す遠心力をかける。
【０１３３】
実施例１３．96-ウェルプレート系でのポリオレフィン固体支持体の使用試験
高処理量システムでＤＮＡ精製の効力を試験するために、親水性ポリオレフィン固体支持体（R-18495、アメリカン フィルトロナ社、リッチモンド、バージニア州）を、800μlのウェル容量を持つ96-ウェルプレート（マサチューセッツ州、ロックランドのポリフィルトロニックス（Polyfiltronics)による、フィルター無しで製造されたユニフィルタープレート(Unifilter plate)）中のウェルに挿入した。固体支持体はサイズが円筒状であり、そして16.7mmの円周および10mmの長さを有した。前述の96-ウェルサンプル処理プレートを、廃液回収プレートとして役立つ２mlウェル容量を持つ別の96ウェルプレート上に置いた。100μl容量の全血を各固体支持体に適用し、そして１分間インキュベートした。続いて固体支持体は、200μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）をウェルに加えることにより２回洗浄し、そして１分間インキュベートした。続いて廃棄材料は、マイクロプレートキャリアーを装備したM4ローターを持つJouan C412遠心機（ジョアン（Jouan）、ウィンチェスター、バージニア州）中で1500×gにて１分間、遠心することにより除去した。次に固体支持体は、100μlのＤＮＡ溶出試薬を用いて洗浄し、そして上記のようにインキュベーション無しで遠心した。洗浄した固体支持体から精製したＤＮＡを溶出するために、処理プレートをきれいな標準ポリスチレン96-ウェルプレートに移し、そして100μl容量のＤＮＡ溶出試薬を各ウェルに加えた。積み重ねた処理プレートおよびサンプル回収プレートを80℃に設定した対流オーブン（BioOven I、セント ジョーンズ アソシエイツ（St.John's
Associates)、ベルツビレ、メリーランド州）に置き、そして30分間インキュベートした。次にＤＮＡを固体支持体から1500×gで１分間遠心することにより溶出させた。８つの10μlのサンプル溶出物を80ボルトで15分間、１％アガロースゲル中で電気泳動することにより、ＤＮＡの存在を分析した。８サンプルの各々が、ＵＶトランスイルミネーターで調査することにより視覚化されるようなＤＮＡを含んだ。
【０１３４】
実施例１４．固体支持体をRNaseAで処理する効果
300μl容量の溶解試薬（0.5％ SDS、0.1M Tris塩基、0.1M EDTA二ナトリウム塩）を、酢酸セルロース固体支持体（アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州） に適用し、そして室温で乾燥させた。第２の固体支持体は、0.04mg/mlのRNaseA（ミネソタ州、ミネアポリスのジェントラ システムズ社からの4mg/mlで）も含む溶解試薬で処理し、そして室温で乾燥させた。固体支持体は８mmの直径および6.75mmの長さを有した。２つの処理した固体支持体をスピン管のインサート中に置き（実施例８に記載したように）、そして150μl容量の大腸菌（E.coli）の一晩のバクテリアカルチャーを各固体支持体に直接加えた。大腸菌（E.coli）のバクテリアカルチャーは、大量のＲＮＡを含み、そして固定化されたＲＮＡ消化酵素の効力を試験するためのモデルとして役立った。次にサンプルは37℃で12分間インキュベートしてＲＮＡ消化を可能とした。続いてそれらを150μl容量のＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製試薬、ジェントラ システムズ社、ミネ
アポリス、ミネソタ州）で３回、洗浄した。次に150μlの塩基性溶出試薬（10mM Tris、0.1M EDTAおよび１mM NaOH）を固体支持体に室温で20分間加えた。核酸は15,000×gで10秒間遠心することにより溶出させた。10μl容量を、80ボルトで60分間、１％アガロースゲルを通して電気泳動することにより、ＤＮＡの存在について分析した。ＵＶトランスイルミネーター上でのゲルの調査では、溶解試薬を用いて処理した固体支持体を使用して精製されたサンプル中のＲＮＡに対応する主要な低分子量スメア（約0.1〜1.4kb）の存在が明らかに示された。対照的に、RNaseAを加えた溶解試薬で精製したサンプルは、低分子量ＲＮＡスメアを欠き、RNaseの存在が混入ＲＮＡの除去に効果的であることを示している。
【０１３５】
実施例１５．ＤＮＡ増幅のためのＤＮＡ溶出試薬の至適化
溶出溶液は、固体支持体から最高のＤＮＡ収量を提供し、そしてPCR緩衝剤系を妨害せずに高いPCR収量を生成するように至適化した。塩基、NaOHまたはKOHのいずれか、トリス緩衝剤および錯化剤（EDTA）の至適濃度は、PCRを使用してＤＮＡ増幅収量につい試験した。
【０１３６】
条件は、25μlの全血サンプルをスピン管中に含まれるセルロース固体支持体に加えることにより試験した。続いてセルロース固体支持体は、200μlのＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で３回洗浄し、そしてＤＮＡ溶出試薬で２回洗浄した。サンプルは、ＤＮＡ溶出試薬中の塩基濃度を除き、すべて同一に処理した。ＤＮＡ溶出試薬中の１〜８mM NaOH濃度を試験した。
【０１３７】
β-アクチン増幅標的を使用するTaqMan7700Quantitative PCRシステムを製造元（パーキン エルマー(Perkin Elmer)、アプライドバイオシステムズ デビジョン（Applied Biosystems Division)、ホスター市、カリフォルニア州）が推薦するようにＤＮＡ増幅に使用した。増幅阻害について試験するために、連続希釈を各試験サンプルについて調製し、そして各々についてコンピューター処理したＤＮＡ量から出発した。阻害も最高の希釈物で最大に希釈されるので、最高希釈ですべての試験サンプルをＤＮＡサンプルと比較した。希釈したＤＮＡ試験サンプルが最大の希釈でＤＮＡサンプルと同様の収量を与えるならば（希釈因子による調整後に）、その試験サンプル中には増幅阻害が無いと予想される。
【０１３８】
最良のPCR収量は、５〜８mM NaOHで得られた。KOHを用いた同様の実験では、NaOHまたはKOHを使用するPCR収量に差異は示されなかった。
【０１３９】
この緩衝剤濃度およびEDTA濃度は、どの濃度が高いPCR収量および低い増幅阻害を至適化するかを決定するために試験した。Tris緩衝剤濃度を１mMから0.1mMに下げ、そしてEDTA濃度を0.1mMから0.001mMに下げると有意に増幅阻害が減少することが観察された。
【０１４０】
実施例１６．洗浄および溶出手順の至適化
さまざまな洗浄および溶出手順を試験して、どの組み合わせが至適なＤＮＡ収量および低い％増幅阻害を提供するかを、TaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して決定した。PCR手順は実施例４に記載した通りである。
【０１４１】
25μl容量の血液は、スピン管（スピン-Ｘ、コーニング コースター、カタログ番号9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)中に含まれるセルロース固体支持体に適用し、そして５分間吸収させた。ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）での各洗浄には２分間を要した。ＤＮＡ溶出試薬を固体支持体に80℃で20分間適用した。種々の精製および溶出手順は、以下に掲げるものを含め試験した。各手順は３連で試験した。
(１) ３×150μl NA精製試薬＋１×150μl DNA 溶出試薬
(２) ４×200μl NA精製試薬＋１×200μl DNA 溶出試薬
(３) ３×200μl NA精製試薬＋２×200μl DNA 溶出試薬
結果を表５に示す。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
両手順（２）および（３）は、良好な純度および収量を与えた。
【０１４４】
実施例１７．固体支持体処理の至適化
セルロース固体支持体は、未処理固体支持体に対する比較のために異なる組成を有する溶解試薬を用いて処理した。第１組成は、0.5％SDS、0.1M Trisおよび0.1mM EDTAから成り、一方第２組成は１％SDS、10mM Trisおよび0.1mM EDTAから成った。セルロース紙をスピン管（スピン-Ｘ、コーニング コースター番号9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に挿入し、そして２つの上述の組成で処理した。処理したセルロース紙を次に室温で少なくとも16時間、乾燥させた。未処理セルロース紙も、処理したサンプルに対する比較として使用した。25μl容量の血液を各セルロース固体支持体に適用し、そして５分間インキュベートした。ＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いた３回の洗浄およびＤＮＡ溶出試薬を用いた２回の洗浄を含む最適な精製法を行った。ＤＮＡを回収し、そしてTaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して分析し、ここでβ-アクチン増幅標的を製造元（パーキン エルマー、アプライドバイオシステムズ デビジョン、ホスター市、カリフォルニア州）が推薦するようにＤＮＡ増幅に使用した。
【０１４５】
１％SDS処理により最高のＤＮＡ収量を得た。SDSのレべルを0.5％から1.0％に下げた時、ＤＮＡ収量および％増幅に有意な検出できる差異は無かった。しかしSDSの不在ではＤＮＡの収量が50％まで減少し、そして阻害が10％から40％以上に上昇した。
【０１４６】
実施例１８．ＤＮＡ精製の分析：ＤＮＡ純度の測定
全血のサンプルを、EDTA（B-D16852、ベクトン デッキンソン アンド社(Becton Dickinson & Co.)、フランクリン レイクス、ニュージャージー州）を含むバキュテイナー（vacutainer)管に引き出し、そして良く混合した。全血の小さいアリコートを取り出し、そして白血球細胞の総数をCBC5細胞カウンター（コールター エレクトロニックス(Coulter Electronics)、ハイアレア、フロリダ州）で製造元の指示に従い計数した。これにより7.25×106細胞／mlと決定された。次に血液の残りを１mlのアリコートで-80℃にさらに精製を必要とするまで凍結した。
【０１４７】
凍結した血液を37℃の水浴中で急速に解凍し、そして使用するまで氷上に維持した。７つの200μlの血液サンプルをアリコートに分け、そしてそれぞれインサート中に収容された溶解マトリックス、および回収管を含む２mlのスピン管（スピン-Ｘ、カタログ番号942
4、コーニング コースター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に加えた。溶解マトリックスは直径８mmおよび高さ８mmの円筒状のポリオレフィン固体支持体マトリックスから成った（Filtrona(商標)、カタログ番号18475、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州）。ポリオレフィン固体支持体マトリックスは、１％SDSおよび20μg/ml RNaseAを含む溶液ですでに飽和され、そして続いて乾燥された。
【０１４８】
サンプルを少なくとも１分間、マトリックスに吸収させた後、400μlのＤＮＡ精製試薬（GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）をサンプルに加え、そして室温で１分間インキュベートした。不純物はスピン管を12,000×gで10分間遠心することにより２mlのスピン管中に集めた。固体支持体を含むインサートは第２スピン管に移し、そして第１スピン管を捨てた。別に400μlのＤＮＡ精製試薬を固体支持体に加え、室温で１分間インキュベートし、そしてスピン管を12,000×gで10分間遠心した。200μl容量のＤＮＡ溶出試薬を固体支持体に加え、そしてインキュベートせずに遠心した。精製したＤＮＡを含む各固体支持体を次にきれいな２mlのスピン管に移し、そして200μl ＤＮＡ溶出試薬を加えた。管を99℃で10分間インキュベートし、そして精製したＤＮＡは12,000×gで20秒間遠心することにより固体支持体から溶出した。
【０１４９】
ヘムのような不純物は、血液中を含むＤＮＡ精製工程中の主要な混入物である。ヘムの存在は、自動化EL311マイクロプレートリーダー（バイオ-テックインスツルメンツ社（Bio-Tek Instruments Inc.)、ビノースキー、バーモント州）を使用して測定することができる。サンプルを１：50に脱イオン水中で希釈し、そして200μl容量を96ウェルプレート中に入れた。吸収は405nmで測定した。405nmでの吸収が0.01nm未満である時、サンプルの純度を確定した。７つのサンプルについて405nmでの平均可視吸収は0.004であり、高度な純度を示していた。
【０１５０】
別のＤＮＡ純度の見積もりは、260nmおよび280nmでの吸収比、Ａ260／Ａ280である。この比の値が1.7〜2.0の間であれば、サンプルはタンパク質および他の混入物が比較的少ないと考えられる。この比は以下のように算出される：
（Ａ260−Ａ320）／（Ａ280−Ａ320）
【０１５１】
７つのサンプルに関する平均Ａ260／Ａ280比は、1.95であると分かり、これは実質的に純粋なＤＮＡであることを示している。
【０１５２】
実施例１９．ＤＮＡ精製の分析：ＤＮＡ濃度および収量の測定
実施例１８からの７種の精製したサンプルを、さらに濃度および収量について分析した。各々のサンプルの１：50希釈を脱イオン水中で、ＤＮＡ溶出試薬を含むブランクと共に調製した。320nm（バックグラウンド）、260nmおよび280nmで の吸収を、ベックマン DU64分光光度計（ベックマン インスツルメンツ社(Beckman Instruments,Inc.)、フラートン、カリフォルニア州）を使用して読んだ。ＤＮＡ濃度は以下のように算出した：
（Ａ260−Ａ320）Ｘ 50（ＤＮＡ消光係数）Ｘ 50（希釈因子）
【０１５３】
７種のサンプルの平均は、41μg/mlとなることが分かった。この濃度に次にサンプル容量（200μl)をかけて、各７つのサンプルについて8.2μgの平均収量を得た。
【０１５４】
理論的な最大収量は、白血球細胞のカウントから決定され、各ヒト二倍体細胞が６pgのＤＮＡを有すると予想された。したがって以下の計算式に基づき、8.7μg ＤＮＡの理論的最大収量を得る。
（7.25×106細胞／ml）Ｘ（0.2ml）Ｘ（6×106μg）＝8.7μg
【０１５５】
収率を計算するために、8.2μgＤＮＡの平均収量を8.7μgの理論的最大収量で除算した
。この計算により94％の収率を得た。
【０１５６】
定量後に、ＤＮＡ濃度を必要に応じて希釈または濃縮により調整することができる。ＤＮＡが濃すぎるならば、脱イオン水のような希釈剤で希釈することができる。ＤＮＡが希釈されすぎているならば、標準的なアルコール塩沈殿法を使用することにより濃度することができる。この方法では、塩化ナトリウムを100mMまで、（ＤＮＡサンプル容量について)２倍容量の100％エタノールを用いて加える。サンプルは管を上下逆転させながら混合し、そして15,000×gで５分間遠心してＤＮＡをペレットにする。このＤＮＡペレットは、３倍容量の70％エタノールを加えることにより洗浄し、管を上下逆転させ、そして15,000×gで１分間遠心する。上清を捨てた後、ペレットを15分間風乾させる。次に脱イオン水のような水和溶液を加えて所望の、より濃縮された溶液を調製する。
【０１５７】
しかしPCR増幅に先立ち、このようなサンプルを濃縮調製する必要は無かった。
【０１５８】
実施例２０．ＤＮＡサイズの分析
実施例１８の７種の各サンプルに関するＤＮＡサイズは、HindIIIで消化したラムダＤＮＡの23.1kbバンドと比較することにより決定した。７種の各200μlのＤＮＡサンプルをから10μlの容量を追跡色素と混合し、そして１％アガロースゲルに乗せた。サンプルを80ボルトで１時間、１ＸTAE泳動緩衝剤中で電気泳動した。ゲルおよび泳動緩衝剤の両方が、ＤＮＡをトランスイルミネーター上で視覚化できるように0.125μg/mlのエチジウムブロミドを含んだ。ＤＮＡサンプルとマーカーレーンと比較することにより、95％より多くのＤＮＡが23.1kbマーカーを越え、ＤＮＡが実質的により高分子量であることを示した。
【０１５９】
実施例２１．精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅および後の制限酵素消化に対する適性試験
実施例１７からの７種の各サンプルを、それらがPCRによる分析に適するかどうかを見るために試験した。2.5μl容量の７種の各サンプルを22.5PCR増幅ミックスに加えて、全増幅容量を25μlとした。各増幅反応は、１Ｘ増幅緩衝剤（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、1.5mM MgCl2、200μM 各デオキシヌクレオチド、1.25単位のTaq DNA ポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）、および１μM 各プライマーを含んだ。プライマーは、遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子スクリーニングに使用するHLA-H遺伝子の領域に特異的な配列、５’−ＴＧＧ−ＣＡＡ−ＧＧＧ−ＴＡＡ−ＡＣＡ−ＧＡＴ−ＣＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＴＣ−ＡＧＧ−ＣＡＣ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＣＡＡ−ＣＣ−３’（配列番号６）（Federら、1995,Nature Genetics 13:399-408）であった。サンプルは94℃で１分間、58℃で１分間、そして72℃で１分間の35サイクルを使用して増幅した。
【０１６０】
ＤＮＡサンプルが適当な増幅鋳型であるかどうかを決定するために、７サンプルを増幅生成物の存在および正しいサイズ（388bp）の両方について調査した。７つの各反応から10μl容量を、0.125μg/mlのエチジウムブロミドをゲルおよび泳動緩衝剤に含む２％アガロースゲルに乗せた。サンプルは80ボルトで45分間電気泳動し、そしてＤＮＡバンドをトランスイルミネーター上で視覚化した。７種の各サンプルは388bpサイズを越える大きなバンドを与え、ＤＮＡの純度はPCR増幅に適することが示された。
【０１６１】
増幅したＤＮＡサンプルは、次にそれらが制限酵素RsaIにより消化される能力について試験した。この酵素は遺伝性疾患のヘモクロマトーシスに関係するＤＮＡ点突然変異を検出するために臨床研究室で使用されている。10μl容量の増幅反応物を、3.3mgのウシ血清アルブミン、3.3単位のRsaIおよび1.5μlの10×制限酵素緩衝剤（すべての成分はマサチューセッツ州、ヴェバリーのニューイングランド バイオラボズ(New England BioLabs)から)を含む５μlのRsaI制限酵素ミックスと混合した。サンプルを37℃で30分間インキュベートし、制限酵素が増幅したＤＮＡを消化できるようにした。
【０１６２】
15μlの反応容量の７種の各サンプルは、85ボルトで60分間泳動する２％アガロースゲル中で電気泳動した。エチジウムブロミドは0.125μg/mlでゲルおよび泳動緩衝剤中に存在し、トランスイルミネーター上でのバンドの視覚化を可能とした。ゲルの調査により、７種のすべてのサンプルがRsaI制限酵素部位で効果的に切断されたので、388bpのバンドは存在しなかった。各７レーンで、２つのバンドが約250および140bpのサイズで検出できた。
【０１６３】
実施例２２．ＤＮＡ精製試薬を使用して精製したＤＮＡの制限酵素消化およびサザンブロット分析
７種の５mm直径の乾燥した血液スポットに由来するＤＮＡを、実施例６に記載したように精製し、消化し、そして電気泳動した。電気泳動後、制限断片をナイロン膜（Biotrans+(商標)、ICNバイオメディカルズ社（Biomedicals,Inc.)、イルバイン、カルフォルニア州）に、0.4N NaOHおよび0.6M NaClを含有する転写溶液を使用してサザンブロットにより７時間にわたり転写した。このナイロンブロットを65℃で14時間、HYB-9（商標）ハイブリダイゼーション溶液（ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）中でハイブリダイズさせ、そして製造元の支持に従い洗浄した。プローブは、グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの32Ｐ-標識化dCTPを用いて標識した増幅した300bp領域から、ランダムプライミングキット（アマーシャム ライフ サイエンス社(Amersham Life Science,Inc.)、アーリントンハイツ、イリノイ州）を使用して調製した。膜は２枚の増感スクリーンの間のＸ-線フィルム（XRA5、イーストマン コダック社（Eastman Kodak Company)、ロチェスター、ニューヨーク州）に対して、-80℃で14時間、置いた。得られたオートラジオグラムは、消化したＤＮＡに対応する各レーン中のバンドがゲノム中のGAPDH配列に相補的であることを示した。
【０１６４】
実施例２３．ＤＮＡ精製法における潜在的交差汚染の評価
＊試験材料：全血（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、８ＥＳ培養細胞（Ｆｏｌｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）もしくはリン酸緩衝剤生理食塩水（ＰＢＳ）を、２種の異なる容器型（ＣａｐｔｕｒｅプレートTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮおよびＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に含有された溶解マトリックス（ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）上に負荷した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMは、遠心チューブ内に置かれた挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）中に封入された溶解マトリックスからなる。ＣａｐｔｕｒｅプレートTMは、各々溶解マトリックスを封入されている９６個の流出（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ウェルからなる。各ウェルの底は先細りの出口をもつ。
【０１６５】
＊実験組み立て：血液もしくはＰＢＳのサンプル容量２００μｌを、エアロゾル防止チップ（ａｅｒｏｓｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｉｐ）を用いてＣａｐｔｕｒｅカラムTMチューブもしくはＣａｐｔｕｒｅカラムTMウェルに添加した。
【０１６６】
＊精製法：サンプルを、ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）４００μｌを用いて２回およびＤＮＡ溶出試薬（ＤＮＡ溶出溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）２００μｌを用いて１回洗浄することによって精製した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、洗浄の間で１３，０００ｘｇで１０秒間遠心し、そしてＣａｐｔｕｒｅプレートTMを、２０００ｘｇで３分間遠心した。新しいシーリングフィルムを、汚染を防ぐために洗浄の間各プレートに使用した。サンプル溶出を、各ウェルにＤＮＡ溶出溶液TM２００μｌを添加することによって実施した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、ブロックヒーター（ｂｌｏｃｋ ｈｅａｔｅｒ）において９９℃で１０分間加熱し、そしてＣａｐｔｕ
ｒｅプレートTMを、１１００Ｗ Ｓｈａｒｐマイクロウェーブオーブンにおいて３０％出力で２５分間加熱した。遠心に続いて、溶出液を増幅のために用いた。
【０１６７】
＊増幅：各溶出液のサンプル２μｌを、ＤＮＡ（ＰＢＳ）無添加で、サンプル中の汚染ＤＮＡを検出するために増幅した。ＨＬＡ−Ｈプライマー（Ｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を、血液を用いる実験では使用し、そしてＨＩＶ−１（ｇａｇ）プライマー（Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を、８ＥＳ培養細胞では使用した。使用したサイクリング条件は、ＰＥ２４００もしくは９７００サーマルサイクラーにおいて、９４℃３０秒間、５８℃３０秒間および７２℃３０秒間：の４０サイクルであった。
【０１６８】
＊検出：ＣａｐｔｕｒｅカラムTM増幅産物のゲル分析では、２５μｌ反応物の５μｌを２％ゲル上に負荷し、そして８０ボルトで４５分間電気泳動した。ＣａｐｔｕｒｅプレートTM増幅産物のゲル分析では、９６ウェル型ミニゲル（２％アガロース）を、８０ボルトで５分間使用した。ＰＥ７２００シーケンス・ディテクション・システムにおけるＴａｑＭａｎ検出では、ＨＬＡ−ＨおよびＨＩＶに対する蛍光プローブが、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成された。
【０１６９】
実施例２４．固形支持体におけるＤＮＡ精製のためのサンプル収集および取り扱い
ＤＮＡは、溶解マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）において、全血、骨髄、軟膜、培養細胞および固形組織（ｓｏｌｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）から精製した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMにおける精製の前に、サンプルを次のように処理した：
【０１７０】
ｉ．全血および骨髄
全血および骨髄は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。サンプルは、新鮮なものでも凍結されたものでもよい。しかしながら、改善された収量は、凍結サンプルを用いて観察される。凍結サンプルは、−８０℃において少なくとも２年間安定である。使用前に、サンプルを、３７℃温浴で速やかに融解し、そして使用まで氷上に保つ。血液もしくは骨髄が凍結されない場合は、４℃で貯蔵することが推奨される。血液もしくは骨髄の２００μｌ容量がＤＮＡ精製のために使用できる。より大容量からＤＮＡを精製する必要がある場合は、軟膜サンプルが調製されてもよい。
【０１７１】
ｉｉ．軟膜
全血は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中で収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。新鮮サンプルは、４℃で貯蔵された。白血細胞は、十分な溶解試薬（Ｌｙｓｉｓ ＳｏｌｕｔｉｏｎTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて素早く単離された。あるいはまた、軟膜は、５ｍｌまでの全血から、室温で１０分間８００ｘｇでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。あるいはまた、血液を含有するチューブを、直立位置に４℃で一夜放置して細胞を沈降させてもよい。白血細胞の薄層（軟膜）は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて注意深く収集し、そして使用まで氷上に保つ。ＤＮＡは、最大１０ｘ１０6白血細胞を含有する２００μｌまでの軟膜調製物から精製できる。
【０１７２】
ｉｉｉ．体液
（例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。）
体液サンプルを収集し、４℃で保存し、そして可能な限り速やかに使用する。あるいはまた、それらを−８０℃で凍結保存してもよい。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心
によって濃縮することが望ましい。体液３〜４０ｍｌからの細胞を、２，０００ｘｇ１０分間の遠心によってペレットにした。上澄液を、残液２００μｌ〜１ｍｌを残して除去した。残留液におけるペレットを、上下繰り返し１０回ピペッティングして完全に懸濁し、そして氷上に維持するか、−８０℃で凍結保存した。
【０１７３】
ｉｖ．培養細胞
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。懸濁された培養細胞を収集し、そして使用まで氷上に置いた。細胞計数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて得られた。１０ｘ１０6までの培養細胞を含有する懸濁液２００μｌを、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMに直接添加した。
【０１７４】
ｖ．固形組織
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを、常時、氷上に保ってＤＮアーゼ活性を減少させた。組織２０ｍｇを、冷ＰＢＳ1)（好ましくは、ＤＮアーゼ活性を減少させるために１ｍＭ ＥＤＴＡを含有）３０μｌを含有する１．５ｍｌミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブに添加し、そして素早く、ミクロフュージチューブ乳棒でホモジナイズした。サンプルを氷上に置いて細胞塊を２〜１０分間沈降させた。次いで、上部細胞懸濁液２００μｌを採取してすべての細胞塊を排除した。
【０１７５】
−−−−−
1) ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ：８ｇｍＮａＣｌ，０．２ｇｍＫＣｌ，２．７２ｇｍＮａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．２４ｇｍＫＨ2ＰＯ4，０．３７２ｇｍＥＤＴＡ二ナトリウム塩を超純水に溶解し、１０００ｍｌまでの容量にしてオートクレーブする。
【０１７６】
ｖｉ．グラム陰性細菌
新鮮サンプルおよび−８０℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを氷上に維持した。典型的には、一夜培養液は、１〜３ｘ１０9細胞／ｍｌを含有する。しかしながら、グラム陰性細菌の比較的小さいゲノムサイズによっては、３ｘ１０9までの細胞がＤＮＡ精製用カラムに適用された。培養液を遠心し、洗浄し、再懸濁し、そしてカラムに適用した。
【０１７７】
実施例２５．溶解マトリックスにおけるＤＮＡ精製
例２４からのサンプルを、溶解マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅカラムTM，Ｇｅｎｔｒａ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて次のように精製した：
ｉ．サンプル精製
１．十分混合したサンプル容量２００μｌを、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMに添加し、そして室温で少なくとも１分〜１時間吸着させた。
【０１７８】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量４００μｌを添加し、そして室温で１分間インキュベートした。
【０１７９】
３．ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、２，０００〜１２，０００ｘｇで１０秒間遠心した。廃液容量６００μｌを廃液回収チューブ中に集めた。
【０１８０】
４．ＤＮＡ精製溶液TM容量４００μｌを再びＣａｐｔｕｒｅカラムTMに添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。
【０１８１】
５．次いで、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、２，０００〜１２，０００ｘｇで１０秒間遠
心し、そして廃液容量を集めた。
【０１８２】
６．次いで、ＤＮＡ溶出溶液TM容量２００μｌを添加した。ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを上記のように遠心した。
【０１８３】
７．ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、ＤＮＡ回収チューブに移し、そして廃液を捨てた。
【０１８４】
８．ＤＮＡ溶出溶液TM容量２００μｌを添加し、そして９９℃に予備加熱した乾燥ブロックヒーター中で１０分間インキュベートさせた。次いで、ＣａｐｔｕｒｅカラムTMを、先に記したように遠心して、溶解マトリックスからＤＮＡを放出した。
【０１８５】
９．次いで、精製ＤＮＡを分析に使用した。
【０１８６】
ｉｉ．ＤＮＡ保存
精製ＤＮＡは、４℃において少なくとも３カ月間安定である。長期保存のためには、それは−２０℃で保存できる。
【０１８７】
実施例２６．ＵＶ分光光度分析を用いるＤＮＡ定量
ＵＶ分光光度分析用のＤＮＡを希釈するために、しばしば水が使用される。しかしながら、水が希釈液として使用される場合、測定されたＡ260／Ａ280比および収量の両方には、有意な変化が生じることがある。市販緩衝剤、例えばＴｒｉｓもしくはリン酸に基づく緩衝剤は、これらの問題に打ち勝つために使用できる。確実な結果は、下記のようなＴＥ緩衝剤TM（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中にＤＮＡサンプルを希釈することによって得られる。さらに確実には、マスクされた石英キュベット（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｓｅｍｉ−Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ Ｍａｓｋｅｄ Ｃｕｖｅｔｔｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．５３３０４１）を用いることによって得られる。
【０１８８】
ｉｉ．サンプル調製およびＵＶ分光光度分析
１．精製ＤＮＡサンプルを、５秒間静かに旋回させる。
【０１８９】
２．希釈チューブは、ＴＥ緩衝剤TM１９０μｌを０．６ｍｌミクロフュージチューブに添加することによって調製した。
【０１９０】
３．ブランク溶液は、０．６ｍｌミクロフュージチューブ中で、ＴＥ緩衝剤TM１９０μｌによりＤＮＡ溶出試薬（ＤＮＡ溶出溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量１０μｌを希釈することによって調製した。
【０１９１】
４．ＤＮＡ １０μｌを、各サンプルから採取し、そしてＴＥ緩衝剤TMと混合して全容量２００μｌにすると１：２０希釈になる。
【０１９２】
５．次いで、希釈サンプルを、高速で５秒間回転した。
【０１９３】
６．希釈サンプル容量２００μｌを使用し、ＵＶ分光光度計を用いて２６０ｎｍ，２８０ｎｍおよび３２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、収量および純度を測定した。
【０１９４】
ｉｉｉ．ＤＮＡ収量および純度計算
１．各サンプルのＤＮＡ濃度を算出するために：（Ａ260−Ａ320）ｘ５０ｘ希釈ファクター（例えば２００／１０）＝ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。注意：Ａ320はバックグラウ
ンド散乱を測定する。
【０１９５】
２．ＤＮＡ収量を算出するために：ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）ｘ溶出溶液の容量（０．２ｍｌ）＝ＤＮＡ収量（μｇ）。
【０１９６】
３．ＤＮＡ純度を算出するために：（Ａ260−Ａ320）／Ａ280−Ａ320）＝ＤＮＡの純度。Ａ260/280比は、少なくとも１．５でなければならないが、この比は、ＤＮＡ純度の正確な測定値ではないかも知れない（引用１，２，３、参照）。この比は、タンパク質調製物中の核酸汚染を検出するために最初に使用され、そしてそれ自体、ＤＮＡ品質の不正確な指標である。ＤＮＡ品質は、アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡを単純に分析するか、または性能を評価する（例えばＰＣＲ増幅によって）ことによって、より良く検査できる。
【０１９７】
実施例２７．平板固形支持体におけるＤＮＡ精製
新鮮もしくは凍結生物サンプルを収集し、そして例２４．に記述されたように処理した。大サンプル容量（例えば３００μｌ）を平板固形支持体（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣａｒｄTM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）上にピペットで添加し、乾燥し、次いで、ＤＮＡ精製前にディスクを打ち抜くことによってサンプリングした。サンプルは、室温で少なくとも９カ月、または長期保存では−２０℃で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄ上で保存できる。
【０１９８】
次のサンプルを収集し、そして室温で２時間、水平位置のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄ上で乾燥させた。
【０１９９】
ｉ．全血（皮膚穿刺もしくは静脈穿刺により得る）
ｉｉ．頬細胞（頬内側からの上皮細胞）
ｉｉｉ．体液（唾液、尿、血漿、血清）
ｉｖ．培養細胞
【０２００】
ＤＮＡ精製
サンプルを、清潔なホールパンチを用いて３ｍｍディスクを打ち抜くことによって、Ｃｏｏｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｒｄから採取し、次いで、９６穴プレート、０．２ｍｌもしくは０．６ｍｌミクロフュージ・チューブにおいて精製した。３ｍｍディスクを、９６穴プレートのウェルに置き、そしてプレートを自動ワークステーション中に設置した。（さもなくば、サンプルを、マルチチャンネルピペットを用いて９６穴プレート中に、またはミクロピペットを用いて０．２もしくは０．６ｍｌチューブ中に、手動で処理してもよい）。ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液TM，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量２００μｌを添加し、そして室温で１５分間インキュベートさせて、汚染物が遊離される間、ＤＮＡをディスクに結合させたままにした。溶液をピペッティングによって混合し、次いで除去した。この処理を２回繰り返した。次いで、１００％イソプロパノールもしくは１００％エタノール容量２００μｌを添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。アルコールを除去し、そしてアルコール洗浄を繰り返した。次いで、ディスクを、室温で少なくとも１〜１６時間乾燥させてアルコールを蒸発させた。乾燥後、サンプルディスクは、明橙色ないし白色であった。精製ディスクは、室温で少なくとも９カ月、または長期保存では−２０℃で安定である。
【０２０１】
ＤＮＡ増幅
１．ディスクを、０．２もしくは０．６ｍｌ増幅チューブで精製する場合は、少なくとも５０μｌの増幅溶液を、直接チューブに添加した。ディスクを、９６穴平底プレートで精製する場合は、精製ＤＮＡサンプルディスクを増幅チューブに移し、次いで、少なくと
も５０μｌの増幅溶液を添加した。ディスクを完全に増幅溶液中に沈めた。次いで、サンプルを標準条件を用いて増幅した。
【０２０２】
２．ディスクは、増幅溶液中、室温で少なくとも４カ月間保存できる。
【０２０３】
ＤＮＡサンプルディスクの再使用
精製ＤＮＡディスクを洗浄し、そして少なくとも５回再使用してもよい。
【０２０４】
１．ディスクを増幅チューブから取り除き、続いて、２ｍｌレシーバー遠心チューブ内に含有されたフィルター挿入物に移す。
【０２０５】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）２００μｌをフィルター挿入物中にピペッティングし、そして１３，０００〜１６，０００ｘｇ５秒間で遠心してディスクを洗浄する。この洗浄を、全２回洗浄の間もう１回繰り返す。
【０２０６】
３．レシーバーチューブ中の洗浄溶液を廃棄し、そして洗浄されたディスクを、新しい増幅チューブに移す。増幅溶液を添加し、上記のように増幅する。
【０２０７】
実施例２８．溶解マトリックスディスクにおける生物サンプルからのＤＮＡ精製、および続いての増幅
ＤＮＡは、溶解マトリックスディスク（Ｃａｐｔｕｒｅディスク，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）において、５種の生物サンプルから精製した。ＤＮＡの品質はＰＣＲ増幅を用いて確認された。
【０２０８】
生物サンプルを収集し、そして次のように調製した：ヒト全血および骨髄は、ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｎｏ．６４５７）を含有するチューブ中に収集した；軟膜は、ＥＤＴＡ中に収集された全血０．２ｍｌから単離した；尿沈降物０．５ｍｌは、尿サンプル４０ｍｌを８００ｘｇ１０分間の遠心によって調製した；そして１０6Ｋ５６２細胞は、培養基０．３ｍｌ中に懸濁した。ＤＮＡを、次節に記述されるように各調製サンプル３μｌから精製した。精製ＤＮＡを含有する各３ｍｍディスクを、ＨＬＡ−Ｈ座（遺伝的血色素症スクリーニングのために使用される）の特異的プライマーを用いて反応液５０μｌにおいて増幅した。３８８塩基対の増幅産物が期待された。
【０２０９】
サンプル収集および取り扱い
ｉ．軟膜調製物
全血もしくは骨髄を、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを、成功裏に使用できる。白血細胞は、ＲＢＣ溶解試薬（ＰＵＲＥＧＥＮＥR ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、サンプル中の赤血細胞から単離された。あるいはまた、軟膜は、室温で１０分間８００ｘｇでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。白血細胞の薄層（軟膜）は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて収集し、そして氷上に保つ。少なくとも２，１００の白血細胞を含有する軟膜の懸濁液３μｌを、次いで、Ｃａｐｔｕｒｅディスクに添加した。
【０２１０】
ｉｉ．体液
体液の例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心によって濃縮する。体液３〜４０ｍｌからの細胞を、８００ｘｇ１０分間の遠心によってペレットにする。上澄液を除去し、そしてペレットを、残液中
に懸濁し、そして氷上に維持する。
【０２１１】
ｉｉｉ．培養細胞
細胞数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて測定された。少なくとも２，１００培養細胞を含有する懸濁液３μｌを、溶解マトリックスディスクに添加した。
【０２１２】
ｉｖ．グラム陰性細菌
少なくとも６００，０００細菌細胞を含有する懸濁液３μｌを溶解マトリックスディスクに添加した。典型的には、細菌の一夜培養液は、１〜３ｘ１０9細胞／ｍｌを含有する。かくして、培養液は直接使用されても、また必要ならば、遠心によって濃縮されてもよい。
【０２１３】
ｖ．マウス唾液
マウスを直立位に拘束し、そして唾液３〜５μｌを、ミクロピペッターを用いてマウスの舌下から採取した。
【０２１４】
ｖｉ．全血もしくは骨髄
全血もしくは骨髄は、ＤＮＡ分解を減少させるためにＥＤＴＡ中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばＡＣＤ（クエン酸塩）およびヘパリンを成功裏に使用できる。血液もしくは骨髄の３μｌ容量がＤＮＡ精製のために使用された。
【０２１５】
ＤＮＡ精製
上記サンプルを次のように精製する：
１．十分混合したサンプル容量３μｌを、２ｍｌスピンチューブの挿入物中の３ｍｍ溶解マトリックスディスク上にピペッティングした。サンプルを、室温で少なくとも１分もしくは２時間まで吸収させた。
【０２１６】
２．ＤＮＡ精製試薬（ＤＮＡ精製溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）容量２００μｌを挿入物に添加し、そして室温で１分間インキュベートさせた。
【０２１７】
３．スピンチューブを、２，０００〜１６，０００ｘｇで１０秒間遠心して、洗浄溶液をレシーバーチューブ中に集めた。
【０２１８】
４．ＤＮＡ精製試薬とのインキュベーションおよび遠心を２回繰り返した。固定化精製ＤＮＡを含有する溶解マトリックスディスクは、白色もしくはオフホワイト色であった。次いで、固定化されたＤＮＡを、ＤＮＡ増幅のために使用した。
【０２１９】
ＤＮＡ増幅
ディスクを、直接、増幅チューブ中に置いた。増幅主混合液容量２５〜５０μｌをチューブに添加し、そしてＤＮＡを標準条件を用いて増幅した。ディスクは、増幅溶液中で少なくとも４カ月間室温で保存された。
【０２２０】
サンプル再使用
ディスクは、さらなる増幅のために再使用されてもよい。方法は次のとおりである：ディスクをＤＮＡ精製溶液２００μｌで２回洗浄し、そして増幅前に、２，０００〜１６，０００ｘｇ５秒間遠心する。
【０２２１】
＜本発明の主たる態様＞
本発明の特徴または主たる態様を以下に挙げる。
【０２２２】
態様１： （ａ）緩衝剤；
（ｂ）塩基；
（ｃ）キレート剤；および
（ｄ）水、
を含んで成るＤＮＡ溶出試薬。
【０２２３】
態様２： キレート剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて約０．１ｍＭより大きくない量で使用される、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２４】
態様３： ＤＮＡ溶出試薬が最低約７のｐＨを有する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２５】
態様４： 塩基が、アルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２６】
態様５： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２７】
態様６： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．００１から２０ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２８】
態様７： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．０１から１５ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２２９】
態様８： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３０】
態様９： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて１から１０ｍＭの量で存在する、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３１】
態様１０： 緩衝剤、塩基およびキレート剤の合わせられた量が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて約２０ｍＭより大きくない、態様１のＤＮＡ溶出試薬。
【０２３２】
態様１１： （ａ）ＤＮＡを含有する生物学的物質を固体支持体と接触させること；
（ｂ）ＤＮＡを含有する生物学的物質をＤＮＡ精製試薬で処理すること；
（ｃ）ＤＮＡを生物学的物質の残余から精製すること；そして
（ｄ）ＤＮＡを、ＤＮＡ溶出試薬を用いて固体支持体から溶出すること、
の段階を含んで成る、ＤＮＡの単離方法であって、ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成る方法。
【０２３３】
態様１２： ＤＮＡ溶出試薬が最低約７のｐＨを有する、態様１１の方法。
【０２３４】
態様１３： 固体支持体が、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンおよびそれらの組み合わせより成る群から選択される、態様１１の方法。
【０２３５】
態様１４： 固体支持体が容器中に含有され、容器が、遠心管、回転チューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、複数のウェルのプレート、試験管およびそれらの組み合わせより成る群から選択される、態様１３の方法。
【０２３６】
態様１５： 生物学的物質が、真核生物細胞、原核生物細胞、微生物細胞、細菌細胞、植物細胞、マイコプラスマ、原生動物、細菌、真菌、ウイルスならびにそれらのライセートおよびホモジェネートより成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３７】
態様１６： 生物学的物質が、体液、身体の廃棄生成物、排泄物および組織より成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３８】
態様１７： 生物学的物質が、空気、水、堆積物および土壌から採取された環境サンプルより成る群から選択される、態様１２の方法。
【０２３９】
態様１８： 塩基が、アルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１１の方法。
【０２４０】
態様１９： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４１】
態様２０： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．００１から２０ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４２】
態様２１： 緩衝剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．０１から１５ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４３】
態様２２： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて２０ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４４】
態様２３： 塩基が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて１から１０ｍＭの量で存在する、態様１１の方法。
【０２４５】
態様２４： キレート剤が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量に基づいて０．１ｍＭより大きくない量で存在する、態様１１の方法。
【０２４６】
態様２５： 緩衝剤、塩基およびキレート剤の組み合わせられた量が、ＤＮＡ溶出試薬の総容量を基礎として約２０ｍＭより大きくない、態様１１の方法。
【０２４７】
態様２６： 緩衝剤がトリスであり、キレート剤がＥＤＴＡであり、そして塩基がアルカリ金属水酸化物より成る群から選ばれる、態様１１の方法。
【０２４８】
態様２７： ６０℃より上で加熱する段階をさらに含んで成る、態様１１の方法。
【０２４９】
態様２８： （ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；
（ｂ）ＤＮＡ精製試薬；および
（ｃ）ＤＮＡ溶出試薬、
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキットであって、
ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成るキット。
【０２５０】
態様２９： 固体支持体をさらに含んで成る、態様２８のキット。
【０２５１】
態様３０：（ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；および
（ｂ）ＤＮＡ溶出試薬
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキットであって、
ＤＮＡ溶出試薬が、
（ｉ）緩衝剤；
（ｉｉ）塩基；
（ｉｉｉ）キレート剤；および
（ｉｖ）水、
を含んで成るキット。
【０２５２】
態様３１： 固体支持体をさらに含んで成る、態様３０のキット。
【０２５３】
態様３２： 溶解試薬が固体支持体に結合されるように、
（ａ）生物学的サンプルから本質的に純粋なＤＮＡを単離するための説明手段；
（ｂ）ＤＮＡ精製試薬；および
（ｃ）溶解試薬で処理された固体支持体、
を含んで成る、ＤＮＡを単離するためのキット。
【０２５４】
態様３３： 固体支持体を保持するための容器をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５５】
態様３４： 固体支持体が溶解試薬で処理される、態様２９および３１のキット。
【０２５６】
態様３５： 固体支持体がＲＮＡ消化酵素で処理される、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５７】
態様３６： ＤＮＡ単離に先立つ哺乳動物の全血中の赤血球からの白血球の分離での使用のための、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含んで成るＲＢＣ溶解試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【０２５８】
態様３７： （ａ）トリス、ＥＤＴＡおよびソルビトールを含んで成る細胞懸濁試薬；ならびに
（ｂ）溶解酵素、グリセロール、トリスおよび塩化カルシウムを含んで成る溶解酵素試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキットであって、
当該細胞懸濁試薬および当該溶解酵素試薬が酵母およびグラム陽性細菌の細胞壁を消化するための組み合わせでの使用に適するキット。
【０２５９】
態様３８： （ａ）ＲＢＣ溶解試薬；
（ｂ）細胞懸濁試薬；
（ｃ）溶解酵素試薬；
（ｄ）タンパク質消化試薬；および
（ｅ）等張溶液、
より成る群から選択される試薬をさらに含んで成る、態様２９、３１および３２のキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）緩衝剤；
（ｂ）塩基；
（ｃ）キレート剤；および
（ｄ）水、
を含んで成るＤＮＡ溶離試薬。
【請求項１】
（ａ）緩衝剤；
（ｂ）塩基；
（ｃ）キレート剤；および
（ｄ）水、
を含んで成るＤＮＡ溶離試薬。
【公開番号】特開２０１２−１５７３６６（Ｐ２０１２−１５７３６６Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０９５３３（Ｐ２０１２−１０９５３３）
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【分割の表示】特願２０００−５２９４６７（Ｐ２０００−５２９４６７）の分割
【原出願日】平成１１年２月２日（１９９９．２．２）
【出願人】（５０７２７９２９９）キアジエン・ノース・アメリカン・ホールデイングス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【分割の表示】特願２０００−５２９４６７（Ｐ２０００−５２９４６７）の分割
【原出願日】平成１１年２月２日（１９９９．２．２）
【出願人】（５０７２７９２９９）キアジエン・ノース・アメリカン・ホールデイングス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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