ＤＮＡアプタマーの選択方法およびＤＮＡアプタマー
【課題】標的分子に対する汎用性に優れたＤＮＡアプタマーの選択方法を提供する。
【解決手段】ＤＮＡアプタマーの選択方法は、標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に標的分子を接触させることにより、ＤＮＡアプタマーと標的分子とから構成される複合体を得る工程と、上記複合体を構成しない上記一群中の一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、上記複合体を残す工程と、を含む。
【解決手段】ＤＮＡアプタマーの選択方法は、標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に標的分子を接触させることにより、ＤＮＡアプタマーと標的分子とから構成される複合体を得る工程と、上記複合体を構成しない上記一群中の一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、上記複合体を残す工程と、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアプタマーの選択方法およびＤＮＡアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、特定の標的分子と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。このアプタマーは、標的分子に対する特異性が高いことから、抗体と同様に標的分子の検出に用いられており、さらに治療薬として医療への応用にも期待が高まっている。
【０００３】
このようなアプタマーを得る方法としては、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いることが知られている。このＳＥＬＥＸ法については、例えば、非特許文献１に記載されている。
非特許文献１に記載のＳＥＬＥＸ法を用いたアプタマーの取得方法は、次の工程を含む。まず、ランダム配列を有する一本鎖ＤＮＡの一群（以下、ＤＮＡ断片群またはＤＮＡプールとも称することがある）を化学合成により作製する。これらのＤＮＡプールには、標的分子と特異的に結合するＤＮＡアプタマーが含まれるものとする。次いで、ＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡプールと担体に固定化された標的分子とを混合し、インキュベートを行う。これにより、標的分子との結合能を有する一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマーとなる）と標的分子とを結合させることができる。次いで、固定化された標的分子に結合していないＤＮＡプールのＤＮＡアプタマー以外のＤＮＡ断片（他の一本鎖ＤＮＡ）を洗い流して、当該標的分子に結合しているアプタマーを選択的に残す。このようにして、固定化された標的分子を反応系から分離することで、ＤＮＡプールの中から、標的分子に結合したＤＮＡアプタマーを回収することができる。この後、標的分子に結合した状態で回収したＤＮＡアプタマーをＰＣＲにより増幅する。増幅された二本鎖から分離して得られた一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）を含む混合物を新たなプールとして、前述の一連の工程を繰り返す。このようにして増幅されたＤＮＡアプタマーを取得することができると記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒ ｗｈｉｃｈ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ａ ｎｅｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆ ｆｏｒ ＤＮＡ， Ｋｅ Ｙｕ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３２， ｐｐ１８９９−１９０４ （１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者らが検討した結果、非特許文献１に代表的に開示されているＳＥＬＥＸ法においては、使用できる標的分子が限定的であり、標的分子に対する汎用性に改善の余地があった。
たとえば、従来のＳＥＬＥＸ法では、アプタマーをＤＮＡプールから選択的に分離することが求められている。従来のＳＥＬＥＸ法においては、アプタマーを担体に固定化された標的分子に結合させた後、アプタマー以外のＤＮＡ断片を洗浄除去することによって、この固定化された標的分子上にアプタマーを選択的に残すことができる。
しかし、標的分子によっては、例えばその分子量が小さい等により担体への結合に必要な官能基を有しないものが存在する。こうした標的分子を利用した場合には、担体に標的分子を介してアプタマーを固定化できないために、上記の洗浄除去により、アプタマーとアプタマー以外のＤＮＡ断片とを分離することができなくなるので、従来のＳＥＬＥＸ法を使用することが困難となり得る。
【０００６】
本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、使用できる標的分子が限定されないような、標的分子に対する汎用性に優れたアプタマーの選択方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、
標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に前記標的分子を接触させることにより、前記ＤＮＡアプタマーと前記標的分子とから構成される複合体を得る工程と、
前記複合体を構成しない前記一群中の前記一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、前記複合体を残す工程と、を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、上記ＤＮＡアプタマーの選択方法を用いて得られたＤＮＡアプタマーが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、標的分子に対する汎用性に優れたＤＮＡアプタマーの選択方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施の形態におけるアプタマー選択方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施の形態におけるアプタマー選択方法を説明する模式図である。
【図３】エキソヌクレアーゼＩによるストレプトアビジンアプタマーの分解の結果を示す図である。
【図４】エキソヌクレアーゼＩによるトロンビンアプタマーの分解の結果を示す図である。
【図５】トロンビン存在下あるいは非存在下におけるトロンビンアプタマー量の時間変化を示す図である。
【図６】トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーおよびプールＤＮＡ量の時間変化を示す図である。
【図７】トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーとプールＤＮＡの量比の時間変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１２】
図１は、本実施の形態のアプタマーの選択方法を示すフローチャートである。また、図２は、本実施の形態におけるアプタマーの選択方法を説明するための模式図である。
【００１３】
以下、本実施の形態のアプタマーの選択方法の概要を説明した後、当該選択方法の各工程の詳細を説明する。
【００１４】
本実施の形態のＤＮＡアプタマー１００の選択方法は、標的分子１０２に特異的に結合するＤＮＡアプタマー１００を含む一本鎖ＤＮＡの一群（ＤＮＡ断片群）に標的分子１０２を接触させることにより、ＤＮＡアプタマー１００と標的分子１０２とから構成される複合体１１０を得る工程と、当該複合体１１０を構成しない当該ＤＮＡ断片群中の一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ断片１０１）を一本鎖ＤＮＡ分解酵素（分解酵素１０４）で分解することにより、複合体１１０を残す工程と、を含む。
【００１５】
標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、又は各種の有機分子等で構成される。本実施の形態では、標的分子は、基質や担体などの基材に結合する官能基を有しているものや、当該官能基を有していないもののいずれでもよい。なお、こうした基材への結合方法としては各種の手法が確立されている。
【００１６】
アプタマーとは、特定の標的分子と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。したがって、本実施の形態において、ＤＮＡアプタマーとは、当該核酸がＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）である場合を意味するものであり、一本鎖ＤＮＡを有するものである。ＤＮＡアプタマーにおける標的分子への結合特性は、特に限定されないが、高親和性であることが好ましい。
【００１７】
また、ＤＮＡ断片群とは、ランダム配列を有する一本鎖ＤＮＡの一群（以下、ＤＮＡプールと称することもある）を指す。例えば、ＤＮＡ断片群中の２種の一本鎖ＤＮＡにおいては、所定の領域内で、互いの塩基配列が一致しないものでもよい。本実施の形態では、こうしたＤＮＡプールには、所望のＤＮＡアプタマーが含有されているものとして説明する。
【００１８】
また、複合体とは、一本鎖ＤＮＡが標的分子に補足されて、標的分子と特異的な結合を形成しているものである。こうした特異的な結合としては、各種公知のものが知られている。
【００１９】
本発明者らの検討によれば、一本鎖ＤＮＡと標的分子とが特異的に結合して構成された複合体は、一本鎖ＤＮＡを分解する分解酵素に対して耐性を有しており、複合体を構成しない単なる一本鎖ＤＮＡと比較して当該分解酵素に分解されにくいという特性を有することが判明した。
こうした当該分解酵素に対する耐性特性の差を利用することにより、複合体を構成する一本鎖ＤＮＡ及び単なる一本鎖ＤＮＡを含む混合物において、単なる一本鎖ＤＮＡのみを分解除去できると考えた。
本発明者らは、こうした知見に基づいて検討した結果、ＤＮＡアプタマーと標的分子とから構成される複合体と標的分子と結合しない不要な一本鎖ＤＮＡとの混合物に一本鎖ＤＮＡ分解酵素を添加することにより、複合体の分解を抑制しつつ、不要な一本鎖ＤＮＡを分解除去して、複合体を構成するＤＮＡアプタマーを選択的に取得できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
こうした分解酵素による分解メカニズムは明確ではないが以下のように推察される。
図２（ａ）に示すように、複合体１１０は、ＤＮＡアプタマー１００と標的分子１０２とから構成されている。このＤＮＡアプタマー１００は、標的分子１０２との特異的結合形成領域１０８を有する。このような複合体１１０に対して、例えば、３'末端から５'末端方向に一塩基ずつ除去する分解酵素１０４を接触させると、ＤＮＡアプタマー１００を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端の一部は、分解酵素１０４に分解されて分解された領域１０６となる。
しかし、特異的結合形成領域１０８では分解酵素１０４は進めないので、ＤＮＡアプタマー１００が分解されずに残る。すなわち、この特異的結合形成領域１０８が分解酵素１０４による分解を抑制する機能を果たしていると考えられる。また、こうした特異的結合形成領域１０８が残っているので、複合体１１０を構成する一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡアプタマーとして機能すると言える。なお、分解酵素１０４で分解された領域１０６は、予め一本鎖ＤＮＡのランダム配列（標的分子との特異的結合形成領域１０８となる）の端部に設けられたプライマー配列に相当する。
【００２１】
これに対して、図２（ｂ）に示すように、ＤＮＡ断片１０１は、標的分子との特異的結合形成領域が形成されていない、単なる一本鎖ＤＮＡである。このため、分解酵素１０４は、通常通り、ＤＮＡ断片１０１を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端から、停止させずに次々と塩基を除去する。これにより、分解された領域１０７がＤＮＡ断片１０１の全体に広がり、ＤＮＡ断片１０１が完全に分解される。
【００２２】
このように同種の分解酵素１０４を用いて、その分解に対する耐性の差を利用することにより、ＤＮＡ断片１０１を分解しつつも、複合体１１０を残すことができる。以上の分解メカニズムにより、本実施の形態では、複合体１１０を構成する一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡアプタマー１００を選択的に取得することが可能となる。
【００２３】
したがって、本実施の形態によれば、基材に標的分子を固定化する必要がないので、基材への固定化が困難な標的分子を用いたとしても、当該標的分子に特異的な結合活性を有する核酸アプタマーを選択することが可能となる。これにより、標的分子に対する汎用性に優れたＤＮＡアプタマーの選択方法を実現することができる。
【００２４】
次に、本実施の形態のＤＮＡアプタマーの選択方法の各工程について詳細に説明する。なお、本実施の形態では、酵素反応に用いる緩衝液、反応温度又は反応時間などの条件は酵素に添付される指示書に従って行われるが、標的分子やアプタマーに適した条件を検討することも可能である。また、本実施の形態では、分解酵素としてエキソヌクレアーゼを用いた例について説明する。
【００２５】
図１に示すＤＮＡアプタマーの選択方法は、下記ステップ１００〜ステップ１１４の工程を含む。ステップ１００では、ＤＮＡプールを作製する。ステップ１０２では、ＤＮＡプールと標的分子とを混合して、当該標的分子にＤＮＡアプタマーを補足させる。ステップ１０４では、分解酵素により、ＤＮＡアプタマー以外の一本鎖ＤＮＡを分解する。ステップ１０６では、未分解のＤＮＡアプタマーを回収する。ステップ１０８では、回収されたＤＮＡアプタマーの３'末端にオリゴマーを付加する。ステップ１１０では、ＤＮＡアプタマーをＰＣＲにより増幅する。ステップ１０２〜ステップ１１０を含む一連の工程を複数回繰り返す。ステップ１１２では、複製されたＤＮＡアプタマーの塩基配列を決定する。また、このＤＮＡアプタマーと標的分子との結合能（例えば、親和性度合い）を評価する。ステップ１１４では、得られたＤＮＡアプタマーの中から当該結合能に優れたものを選択する。
【００２６】
まず、ステップ１００に示すように、ランダム配列の両端にプライマー配列を有する一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡプール（一本鎖ＤＮＡの一群）を化学合成により作製する。ランダム配列の長さは、任意であるが、通常は３０ｍｅｒ程度である。また、プライマー配列の長さも、任意であるが、２０ｍｅｒ程度のものがよく使われる。以後のステップでは、ランダム配列を有するＤＮＡプール中の全ての一本鎖ＤＮＡをＤＮＡアプタマー候補と仮定し、ＤＮＡアプタマー候補の中から、標的分子と特異的に結合する好適なＤＮＡアプタマーを選択する。なお、ＤＮＡアプタマーとなる当該候補はＤＮＡプール中に複数存在していてもよい。
【００２７】
次いで、ステップ１０２に示すように、ＤＮＡプールと標的分子との混合液をインキュベートする。こうしたＤＮＡプール中の一本鎖ＤＮＡは塩基配列に応じた一定の立体構造を取るようになり、混合液中の標的分子との結合能を有する一本鎖ＤＮＡは、当該標的分子と特異的結合を形成する。これにより、標的分子と（ＤＮＡアプタマーとなる）一本鎖ＤＮＡとの複合体が得られる。
【００２８】
次いで、当該複合体を含む混合液中に一本鎖ＤＮＡを分解する分解酵素を添加して所定の温度および時間インキュベートする。たとえば、混合液中にエキソヌクレアーゼＩを添加し、３７℃で適当な時間インキュベートする。これにより、前述のとおり、複合体を形成していない未結合の一本鎖ＤＮＡを分解できる。ここでは、一本鎖ＤＮＡに特異的であり、３'末端から５'末端方向に一塩基ずつ除去するという酵素活性を有しているエキソヌクレアーゼＩを用いることができる。
【００２９】
この後、分解されずに残存する一本鎖ＤＮＡを回収する。回収手段は、公知の各種手段を用いて、複合体を構成している一本鎖ＤＮＡを回収することができる。この回収工程を実行することにより、操作のバラツキにより、分解を免れている不要なＤＮＡ断片が増幅されることによるノイズを除くことができる。これにより、後述の工程で得られる増幅ＤＮＡアプタマーの精製度合いを向上させることできる。
【００３０】
また、この回収段階では、分解酵素の添加前に存在していた複合体を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端のプライマー配列は分解されていると考えられる。しかしながら、３'末端プライマーが残存している一本鎖ＤＮＡも残存する可能性があり、こうした一本鎖ＤＮＡは単に分解を免れたものと推測される。こうした分解を免れた一本鎖ＤＮＡを除去することにより、上記ノイズを小さくすることができる。除去する手段としては、例えば、プライマー配列の相補鎖を固定化した磁気ビーズ等を用いて、このような未分解の一本鎖ＤＮＡを除去する手法を用いることができる。
【００３１】
続いて、回収された複合体から一本鎖ＤＮＡを分離して、当該一本鎖ＤＮＡの３'末端に任意のヌクレオチドを重合させる。たとえば、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、当該一本鎖ＤＮＡの３'末端にヌクレオチドのホモポリマーを付加する。
【００３２】
続いて、５'末端のＤＮＡ増幅用のプライマー配列と３'末端のホモポリマーを利用してＰＣＲにより複合体から分離された一本鎖ＤＮＡを増幅する。この後、増幅された二本鎖ＤＮＡを分離して、増幅工程で鋳型になった＋鎖（一本鎖）を回収する。回収された一本鎖ＤＮＡを含む混合物を新たなプールとして、さらに選択のラウンドを繰り返し進める。たとえば、１０回程度繰り返してもよい。これにより、標的分子と特異的に結合する一本鎖ＤＮＡを濃縮し、この一本鎖ＤＮＡを標的分子に対するＤＮＡアプタマーとして選択することが可能である。
【００３３】
以上のように、本実施の形態のＤＮＡアプタマーの選択方法によれば、基質等に固定化できない標的分子、あるいは固定化可能な分子でも固定化する段階を経ることなく、ＤＮＡアプタマーの選択が可能になる。すなわち、本実施の形態の方法によれば、標的分子に結合したＤＮＡアプタマーと結合していない非特異的ＤＮＡの識別をエクソヌクレアーゼ等の分解酵素が溶液に浮遊状態で行うことができようになる。従って、基質等に固定化できない標的分子、あるいは固定化可能な分子でも固定化する段階を省略して、アプタマーの選択が可能になる。また、標的分子が基材に固定されていないので、溶液中に拡散しやすくなり、ＤＮＡとの接触頻度が向上する。これにより、標的分子とＤＮＡアプタマーとの結合が促進するので、本実施の形態の方法の生産性が向上する。したがって、本実施の形態の方法によれば、ＤＮＡアプタマーの作製が容易になり、ＤＮＡアプタマーがより広い分野に応用されていくことを支援するものと期待される。
【００３４】
本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは標的分子に対する特異性が高く、抗体と同様に標的分子の検出に用いることができる。また、このＤＮＡアプタマーは、抗体に比べて、蛍光色素等の修飾基を容易に導入することができる。このことは、検出に用いるための様々な仕掛けをＤＮＡアプタマー分子内に持たせることを可能にしており、ＤＮＡアプタマーを用いた分子検出法の多様化につながっている。たとえば、本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した光学的検出法や電子伝達分子を利用した電気化学的検出法などに利用できる。このように、ＤＮＡアプタマーはバイオセンサーのセンサー分子として利用することが可能である。
【００３５】
また、本実施の形態の方法によれば、標的分子に特異的なＤＮＡアプタマーを分離し、塩基配列を決定すれば、理論的には制限なく、当該ＤＮＡアプタマーの化学合成が可能であることも、抗体に比べて有利な点としてあげられる。また、本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは、抗体に比べて合成が容易であり、前述のとおり、測定法が多様であることなどから、臨床検査、食品検査等々への応用が考えられる。さらには治療薬として医療への応用にも期待が高まっている
【００３６】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
実施例１では、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合アプタマーを用いた実験を例に説明する。プラスチック遠心チューブ（１．５ｍｌ）に、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ、 ４．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）を８７μｌ入れる。長さが７０ｍｅｒのＳＡアプタマー（１００μＭ）を２マイクロリットル添加する。ＳＡ（＋）反応チューブにはＳＡ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加し、ＳＡ（−）反応チューブには同量のＰＢＳを添加する。室温で３０分間、静置した後、エキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μｌ）を１μｌ添加し、３７℃で１０、３０、および６０分間インキュベートする。その後、酵素を熱処理（８０℃、１５分間）により失活させる。各サンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ ＧＯＬＤでＤＮＡを染色した。結果を図３に示す。図３中、＋ＳＡはストレプトアビジン添加を示し、−ＳＡはストレプトアビジン無添加を示し、ＭはＤＮＡマーカーを示す。ＳＡを添加した場合、エキソヌクレアーゼＩによる消化を完全に免れることはできないが、６０分間のインキュベーションの後でも相当な量のＤＮＡが残存すること分かった。一方、ＳＡ（−）の場合は３０分のインキュベーションでほぼ完全に消失していた。このことから、標的分子に結合した形で存在するＤＮＡアプタマーはエキソヌクレアーゼＩに耐性をもつと考えられる。
【００３８】
（実施例２）
実施例２では、トロンビン結合アプタマーを用いた実験を例に説明する。７．５ｍＭ ＫＣｌと５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳに、長さ２０ｍｅｒのトロンビンアプタマーと６６ｍｅｒのランダムプールＤＮＡをそれぞれ最終濃度１０μＭで添加する。反応液を２本のプラスチックチューブに分け、一方にトロンビンを最終濃度２５μＭで添加する。室温で３０分間、静置した後、両チューブにエキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μｌ）を１μｌ添加し、３７℃で１０、３０、および６０分間インキュベートする。その後、酵素を熱処理（８０℃、１５分間）により失活させる。各サンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ ＧＯＬＤでＤＮＡを染色した。
【００３９】
ゲルイメージを図４に示す。図４中、＋Ｔｈｒｏｍｂｉｎはトロンビン添加を示し、−Ｔｈｒｏｍｂｉｎはトロンビン無添加を示し、ＭはＤＮＡマーカーを示す。また、図５は、バンドの蛍光量から推測されるトロンビン存在下あるいは非存在下におけるトロンビンアプタマー量の時間変化を示す。この図５は、図４中のトロンビン存在下におけるＤＮＡ量の変化をプロットした。ＤＮＡ量はそれぞれのバンドの蛍光量をもとに推測し、時間０を１とした相対量で表した。図６は、トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーおよびプールＤＮＡ量の時間変化を示す。この図６は、図４中のトロンビン存在下におけるＤＮＡ量の変化をプロットした。ＤＮＡ量はそれぞれのバンドの蛍光量をもとに推測し、時間０を１とした相対量で表した。トロンビンを含まない溶液中でトロンビンアプタマーは６０分後には当初の１０％以下まで減少する。一方、トロンビンを添加しておくと６０分後において、５０％程度のトロンビンアプタマーが残存していた。
【００４０】
また、図７は、トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーとプールＤＮＡの量比の時間変化を示す。この図７は、図４中の各時間における両者のＤＮＡ量比をプロットした。両者の量比は当初の０．２７から１．０へと、約４倍の増加が見られた。この結果は、本手法を用いることによってランダムプールから標的分子に結合したＤＮＡアプタマーを濃縮できることを示している。
【００４１】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
【符号の説明】
【００４２】
１００ ＤＮＡアプタマー
１０１ ＤＮＡ断片
１０２ 標的分子
１０４ 分解酵素
１０６ 分解された領域
１０７ 分解された領域
１０８ 特異的結合形成領域
１１０ 複合体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアプタマーの選択方法およびＤＮＡアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、特定の標的分子と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。このアプタマーは、標的分子に対する特異性が高いことから、抗体と同様に標的分子の検出に用いられており、さらに治療薬として医療への応用にも期待が高まっている。
【０００３】
このようなアプタマーを得る方法としては、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いることが知られている。このＳＥＬＥＸ法については、例えば、非特許文献１に記載されている。
非特許文献１に記載のＳＥＬＥＸ法を用いたアプタマーの取得方法は、次の工程を含む。まず、ランダム配列を有する一本鎖ＤＮＡの一群（以下、ＤＮＡ断片群またはＤＮＡプールとも称することがある）を化学合成により作製する。これらのＤＮＡプールには、標的分子と特異的に結合するＤＮＡアプタマーが含まれるものとする。次いで、ＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡプールと担体に固定化された標的分子とを混合し、インキュベートを行う。これにより、標的分子との結合能を有する一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマーとなる）と標的分子とを結合させることができる。次いで、固定化された標的分子に結合していないＤＮＡプールのＤＮＡアプタマー以外のＤＮＡ断片（他の一本鎖ＤＮＡ）を洗い流して、当該標的分子に結合しているアプタマーを選択的に残す。このようにして、固定化された標的分子を反応系から分離することで、ＤＮＡプールの中から、標的分子に結合したＤＮＡアプタマーを回収することができる。この後、標的分子に結合した状態で回収したＤＮＡアプタマーをＰＣＲにより増幅する。増幅された二本鎖から分離して得られた一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）を含む混合物を新たなプールとして、前述の一連の工程を繰り返す。このようにして増幅されたＤＮＡアプタマーを取得することができると記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒ ｗｈｉｃｈ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ａ ｎｅｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆ ｆｏｒ ＤＮＡ， Ｋｅ Ｙｕ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３２， ｐｐ１８９９−１９０４ （１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、本発明者らが検討した結果、非特許文献１に代表的に開示されているＳＥＬＥＸ法においては、使用できる標的分子が限定的であり、標的分子に対する汎用性に改善の余地があった。
たとえば、従来のＳＥＬＥＸ法では、アプタマーをＤＮＡプールから選択的に分離することが求められている。従来のＳＥＬＥＸ法においては、アプタマーを担体に固定化された標的分子に結合させた後、アプタマー以外のＤＮＡ断片を洗浄除去することによって、この固定化された標的分子上にアプタマーを選択的に残すことができる。
しかし、標的分子によっては、例えばその分子量が小さい等により担体への結合に必要な官能基を有しないものが存在する。こうした標的分子を利用した場合には、担体に標的分子を介してアプタマーを固定化できないために、上記の洗浄除去により、アプタマーとアプタマー以外のＤＮＡ断片とを分離することができなくなるので、従来のＳＥＬＥＸ法を使用することが困難となり得る。
【０００６】
本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、使用できる標的分子が限定されないような、標的分子に対する汎用性に優れたアプタマーの選択方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、
標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に前記標的分子を接触させることにより、前記ＤＮＡアプタマーと前記標的分子とから構成される複合体を得る工程と、
前記複合体を構成しない前記一群中の前記一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、前記複合体を残す工程と、を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、上記ＤＮＡアプタマーの選択方法を用いて得られたＤＮＡアプタマーが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、標的分子に対する汎用性に優れたＤＮＡアプタマーの選択方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施の形態におけるアプタマー選択方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施の形態におけるアプタマー選択方法を説明する模式図である。
【図３】エキソヌクレアーゼＩによるストレプトアビジンアプタマーの分解の結果を示す図である。
【図４】エキソヌクレアーゼＩによるトロンビンアプタマーの分解の結果を示す図である。
【図５】トロンビン存在下あるいは非存在下におけるトロンビンアプタマー量の時間変化を示す図である。
【図６】トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーおよびプールＤＮＡ量の時間変化を示す図である。
【図７】トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーとプールＤＮＡの量比の時間変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１２】
図１は、本実施の形態のアプタマーの選択方法を示すフローチャートである。また、図２は、本実施の形態におけるアプタマーの選択方法を説明するための模式図である。
【００１３】
以下、本実施の形態のアプタマーの選択方法の概要を説明した後、当該選択方法の各工程の詳細を説明する。
【００１４】
本実施の形態のＤＮＡアプタマー１００の選択方法は、標的分子１０２に特異的に結合するＤＮＡアプタマー１００を含む一本鎖ＤＮＡの一群（ＤＮＡ断片群）に標的分子１０２を接触させることにより、ＤＮＡアプタマー１００と標的分子１０２とから構成される複合体１１０を得る工程と、当該複合体１１０を構成しない当該ＤＮＡ断片群中の一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ断片１０１）を一本鎖ＤＮＡ分解酵素（分解酵素１０４）で分解することにより、複合体１１０を残す工程と、を含む。
【００１５】
標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、又は各種の有機分子等で構成される。本実施の形態では、標的分子は、基質や担体などの基材に結合する官能基を有しているものや、当該官能基を有していないもののいずれでもよい。なお、こうした基材への結合方法としては各種の手法が確立されている。
【００１６】
アプタマーとは、特定の標的分子と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。したがって、本実施の形態において、ＤＮＡアプタマーとは、当該核酸がＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）である場合を意味するものであり、一本鎖ＤＮＡを有するものである。ＤＮＡアプタマーにおける標的分子への結合特性は、特に限定されないが、高親和性であることが好ましい。
【００１７】
また、ＤＮＡ断片群とは、ランダム配列を有する一本鎖ＤＮＡの一群（以下、ＤＮＡプールと称することもある）を指す。例えば、ＤＮＡ断片群中の２種の一本鎖ＤＮＡにおいては、所定の領域内で、互いの塩基配列が一致しないものでもよい。本実施の形態では、こうしたＤＮＡプールには、所望のＤＮＡアプタマーが含有されているものとして説明する。
【００１８】
また、複合体とは、一本鎖ＤＮＡが標的分子に補足されて、標的分子と特異的な結合を形成しているものである。こうした特異的な結合としては、各種公知のものが知られている。
【００１９】
本発明者らの検討によれば、一本鎖ＤＮＡと標的分子とが特異的に結合して構成された複合体は、一本鎖ＤＮＡを分解する分解酵素に対して耐性を有しており、複合体を構成しない単なる一本鎖ＤＮＡと比較して当該分解酵素に分解されにくいという特性を有することが判明した。
こうした当該分解酵素に対する耐性特性の差を利用することにより、複合体を構成する一本鎖ＤＮＡ及び単なる一本鎖ＤＮＡを含む混合物において、単なる一本鎖ＤＮＡのみを分解除去できると考えた。
本発明者らは、こうした知見に基づいて検討した結果、ＤＮＡアプタマーと標的分子とから構成される複合体と標的分子と結合しない不要な一本鎖ＤＮＡとの混合物に一本鎖ＤＮＡ分解酵素を添加することにより、複合体の分解を抑制しつつ、不要な一本鎖ＤＮＡを分解除去して、複合体を構成するＤＮＡアプタマーを選択的に取得できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
こうした分解酵素による分解メカニズムは明確ではないが以下のように推察される。
図２（ａ）に示すように、複合体１１０は、ＤＮＡアプタマー１００と標的分子１０２とから構成されている。このＤＮＡアプタマー１００は、標的分子１０２との特異的結合形成領域１０８を有する。このような複合体１１０に対して、例えば、３'末端から５'末端方向に一塩基ずつ除去する分解酵素１０４を接触させると、ＤＮＡアプタマー１００を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端の一部は、分解酵素１０４に分解されて分解された領域１０６となる。
しかし、特異的結合形成領域１０８では分解酵素１０４は進めないので、ＤＮＡアプタマー１００が分解されずに残る。すなわち、この特異的結合形成領域１０８が分解酵素１０４による分解を抑制する機能を果たしていると考えられる。また、こうした特異的結合形成領域１０８が残っているので、複合体１１０を構成する一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡアプタマーとして機能すると言える。なお、分解酵素１０４で分解された領域１０６は、予め一本鎖ＤＮＡのランダム配列（標的分子との特異的結合形成領域１０８となる）の端部に設けられたプライマー配列に相当する。
【００２１】
これに対して、図２（ｂ）に示すように、ＤＮＡ断片１０１は、標的分子との特異的結合形成領域が形成されていない、単なる一本鎖ＤＮＡである。このため、分解酵素１０４は、通常通り、ＤＮＡ断片１０１を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端から、停止させずに次々と塩基を除去する。これにより、分解された領域１０７がＤＮＡ断片１０１の全体に広がり、ＤＮＡ断片１０１が完全に分解される。
【００２２】
このように同種の分解酵素１０４を用いて、その分解に対する耐性の差を利用することにより、ＤＮＡ断片１０１を分解しつつも、複合体１１０を残すことができる。以上の分解メカニズムにより、本実施の形態では、複合体１１０を構成する一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡアプタマー１００を選択的に取得することが可能となる。
【００２３】
したがって、本実施の形態によれば、基材に標的分子を固定化する必要がないので、基材への固定化が困難な標的分子を用いたとしても、当該標的分子に特異的な結合活性を有する核酸アプタマーを選択することが可能となる。これにより、標的分子に対する汎用性に優れたＤＮＡアプタマーの選択方法を実現することができる。
【００２４】
次に、本実施の形態のＤＮＡアプタマーの選択方法の各工程について詳細に説明する。なお、本実施の形態では、酵素反応に用いる緩衝液、反応温度又は反応時間などの条件は酵素に添付される指示書に従って行われるが、標的分子やアプタマーに適した条件を検討することも可能である。また、本実施の形態では、分解酵素としてエキソヌクレアーゼを用いた例について説明する。
【００２５】
図１に示すＤＮＡアプタマーの選択方法は、下記ステップ１００〜ステップ１１４の工程を含む。ステップ１００では、ＤＮＡプールを作製する。ステップ１０２では、ＤＮＡプールと標的分子とを混合して、当該標的分子にＤＮＡアプタマーを補足させる。ステップ１０４では、分解酵素により、ＤＮＡアプタマー以外の一本鎖ＤＮＡを分解する。ステップ１０６では、未分解のＤＮＡアプタマーを回収する。ステップ１０８では、回収されたＤＮＡアプタマーの３'末端にオリゴマーを付加する。ステップ１１０では、ＤＮＡアプタマーをＰＣＲにより増幅する。ステップ１０２〜ステップ１１０を含む一連の工程を複数回繰り返す。ステップ１１２では、複製されたＤＮＡアプタマーの塩基配列を決定する。また、このＤＮＡアプタマーと標的分子との結合能（例えば、親和性度合い）を評価する。ステップ１１４では、得られたＤＮＡアプタマーの中から当該結合能に優れたものを選択する。
【００２６】
まず、ステップ１００に示すように、ランダム配列の両端にプライマー配列を有する一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡプール（一本鎖ＤＮＡの一群）を化学合成により作製する。ランダム配列の長さは、任意であるが、通常は３０ｍｅｒ程度である。また、プライマー配列の長さも、任意であるが、２０ｍｅｒ程度のものがよく使われる。以後のステップでは、ランダム配列を有するＤＮＡプール中の全ての一本鎖ＤＮＡをＤＮＡアプタマー候補と仮定し、ＤＮＡアプタマー候補の中から、標的分子と特異的に結合する好適なＤＮＡアプタマーを選択する。なお、ＤＮＡアプタマーとなる当該候補はＤＮＡプール中に複数存在していてもよい。
【００２７】
次いで、ステップ１０２に示すように、ＤＮＡプールと標的分子との混合液をインキュベートする。こうしたＤＮＡプール中の一本鎖ＤＮＡは塩基配列に応じた一定の立体構造を取るようになり、混合液中の標的分子との結合能を有する一本鎖ＤＮＡは、当該標的分子と特異的結合を形成する。これにより、標的分子と（ＤＮＡアプタマーとなる）一本鎖ＤＮＡとの複合体が得られる。
【００２８】
次いで、当該複合体を含む混合液中に一本鎖ＤＮＡを分解する分解酵素を添加して所定の温度および時間インキュベートする。たとえば、混合液中にエキソヌクレアーゼＩを添加し、３７℃で適当な時間インキュベートする。これにより、前述のとおり、複合体を形成していない未結合の一本鎖ＤＮＡを分解できる。ここでは、一本鎖ＤＮＡに特異的であり、３'末端から５'末端方向に一塩基ずつ除去するという酵素活性を有しているエキソヌクレアーゼＩを用いることができる。
【００２９】
この後、分解されずに残存する一本鎖ＤＮＡを回収する。回収手段は、公知の各種手段を用いて、複合体を構成している一本鎖ＤＮＡを回収することができる。この回収工程を実行することにより、操作のバラツキにより、分解を免れている不要なＤＮＡ断片が増幅されることによるノイズを除くことができる。これにより、後述の工程で得られる増幅ＤＮＡアプタマーの精製度合いを向上させることできる。
【００３０】
また、この回収段階では、分解酵素の添加前に存在していた複合体を構成する一本鎖ＤＮＡの３'末端のプライマー配列は分解されていると考えられる。しかしながら、３'末端プライマーが残存している一本鎖ＤＮＡも残存する可能性があり、こうした一本鎖ＤＮＡは単に分解を免れたものと推測される。こうした分解を免れた一本鎖ＤＮＡを除去することにより、上記ノイズを小さくすることができる。除去する手段としては、例えば、プライマー配列の相補鎖を固定化した磁気ビーズ等を用いて、このような未分解の一本鎖ＤＮＡを除去する手法を用いることができる。
【００３１】
続いて、回収された複合体から一本鎖ＤＮＡを分離して、当該一本鎖ＤＮＡの３'末端に任意のヌクレオチドを重合させる。たとえば、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、当該一本鎖ＤＮＡの３'末端にヌクレオチドのホモポリマーを付加する。
【００３２】
続いて、５'末端のＤＮＡ増幅用のプライマー配列と３'末端のホモポリマーを利用してＰＣＲにより複合体から分離された一本鎖ＤＮＡを増幅する。この後、増幅された二本鎖ＤＮＡを分離して、増幅工程で鋳型になった＋鎖（一本鎖）を回収する。回収された一本鎖ＤＮＡを含む混合物を新たなプールとして、さらに選択のラウンドを繰り返し進める。たとえば、１０回程度繰り返してもよい。これにより、標的分子と特異的に結合する一本鎖ＤＮＡを濃縮し、この一本鎖ＤＮＡを標的分子に対するＤＮＡアプタマーとして選択することが可能である。
【００３３】
以上のように、本実施の形態のＤＮＡアプタマーの選択方法によれば、基質等に固定化できない標的分子、あるいは固定化可能な分子でも固定化する段階を経ることなく、ＤＮＡアプタマーの選択が可能になる。すなわち、本実施の形態の方法によれば、標的分子に結合したＤＮＡアプタマーと結合していない非特異的ＤＮＡの識別をエクソヌクレアーゼ等の分解酵素が溶液に浮遊状態で行うことができようになる。従って、基質等に固定化できない標的分子、あるいは固定化可能な分子でも固定化する段階を省略して、アプタマーの選択が可能になる。また、標的分子が基材に固定されていないので、溶液中に拡散しやすくなり、ＤＮＡとの接触頻度が向上する。これにより、標的分子とＤＮＡアプタマーとの結合が促進するので、本実施の形態の方法の生産性が向上する。したがって、本実施の形態の方法によれば、ＤＮＡアプタマーの作製が容易になり、ＤＮＡアプタマーがより広い分野に応用されていくことを支援するものと期待される。
【００３４】
本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは標的分子に対する特異性が高く、抗体と同様に標的分子の検出に用いることができる。また、このＤＮＡアプタマーは、抗体に比べて、蛍光色素等の修飾基を容易に導入することができる。このことは、検出に用いるための様々な仕掛けをＤＮＡアプタマー分子内に持たせることを可能にしており、ＤＮＡアプタマーを用いた分子検出法の多様化につながっている。たとえば、本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した光学的検出法や電子伝達分子を利用した電気化学的検出法などに利用できる。このように、ＤＮＡアプタマーはバイオセンサーのセンサー分子として利用することが可能である。
【００３５】
また、本実施の形態の方法によれば、標的分子に特異的なＤＮＡアプタマーを分離し、塩基配列を決定すれば、理論的には制限なく、当該ＤＮＡアプタマーの化学合成が可能であることも、抗体に比べて有利な点としてあげられる。また、本実施の形態に係るＤＮＡアプタマーは、抗体に比べて合成が容易であり、前述のとおり、測定法が多様であることなどから、臨床検査、食品検査等々への応用が考えられる。さらには治療薬として医療への応用にも期待が高まっている
【００３６】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
実施例１では、ストレプトアビジン（ＳＡ）結合アプタマーを用いた実験を例に説明する。プラスチック遠心チューブ（１．５ｍｌ）に、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ、 ４．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）を８７μｌ入れる。長さが７０ｍｅｒのＳＡアプタマー（１００μＭ）を２マイクロリットル添加する。ＳＡ（＋）反応チューブにはＳＡ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加し、ＳＡ（−）反応チューブには同量のＰＢＳを添加する。室温で３０分間、静置した後、エキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μｌ）を１μｌ添加し、３７℃で１０、３０、および６０分間インキュベートする。その後、酵素を熱処理（８０℃、１５分間）により失活させる。各サンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ ＧＯＬＤでＤＮＡを染色した。結果を図３に示す。図３中、＋ＳＡはストレプトアビジン添加を示し、−ＳＡはストレプトアビジン無添加を示し、ＭはＤＮＡマーカーを示す。ＳＡを添加した場合、エキソヌクレアーゼＩによる消化を完全に免れることはできないが、６０分間のインキュベーションの後でも相当な量のＤＮＡが残存すること分かった。一方、ＳＡ（−）の場合は３０分のインキュベーションでほぼ完全に消失していた。このことから、標的分子に結合した形で存在するＤＮＡアプタマーはエキソヌクレアーゼＩに耐性をもつと考えられる。
【００３８】
（実施例２）
実施例２では、トロンビン結合アプタマーを用いた実験を例に説明する。７．５ｍＭ ＫＣｌと５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳに、長さ２０ｍｅｒのトロンビンアプタマーと６６ｍｅｒのランダムプールＤＮＡをそれぞれ最終濃度１０μＭで添加する。反応液を２本のプラスチックチューブに分け、一方にトロンビンを最終濃度２５μＭで添加する。室温で３０分間、静置した後、両チューブにエキソヌクレアーゼＩ（５ユニット／μｌ）を１μｌ添加し、３７℃で１０、３０、および６０分間インキュベートする。その後、酵素を熱処理（８０℃、１５分間）により失活させる。各サンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ ＧＯＬＤでＤＮＡを染色した。
【００３９】
ゲルイメージを図４に示す。図４中、＋Ｔｈｒｏｍｂｉｎはトロンビン添加を示し、−Ｔｈｒｏｍｂｉｎはトロンビン無添加を示し、ＭはＤＮＡマーカーを示す。また、図５は、バンドの蛍光量から推測されるトロンビン存在下あるいは非存在下におけるトロンビンアプタマー量の時間変化を示す。この図５は、図４中のトロンビン存在下におけるＤＮＡ量の変化をプロットした。ＤＮＡ量はそれぞれのバンドの蛍光量をもとに推測し、時間０を１とした相対量で表した。図６は、トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーおよびプールＤＮＡ量の時間変化を示す。この図６は、図４中のトロンビン存在下におけるＤＮＡ量の変化をプロットした。ＤＮＡ量はそれぞれのバンドの蛍光量をもとに推測し、時間０を１とした相対量で表した。トロンビンを含まない溶液中でトロンビンアプタマーは６０分後には当初の１０％以下まで減少する。一方、トロンビンを添加しておくと６０分後において、５０％程度のトロンビンアプタマーが残存していた。
【００４０】
また、図７は、トロンビン存在下におけるトロンビンアプタマーとプールＤＮＡの量比の時間変化を示す。この図７は、図４中の各時間における両者のＤＮＡ量比をプロットした。両者の量比は当初の０．２７から１．０へと、約４倍の増加が見られた。この結果は、本手法を用いることによってランダムプールから標的分子に結合したＤＮＡアプタマーを濃縮できることを示している。
【００４１】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
【符号の説明】
【００４２】
１００ ＤＮＡアプタマー
１０１ ＤＮＡ断片
１０２ 標的分子
１０４ 分解酵素
１０６ 分解された領域
１０７ 分解された領域
１０８ 特異的結合形成領域
１１０ 複合体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に前記標的分子を接触させることにより、前記ＤＮＡアプタマーと前記標的分子とから構成される複合体を得る工程と、
前記複合体を構成しない前記一群中の前記一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、前記複合体を残す工程と、を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記一本鎖ＤＮＡ分解酵素は、前記一本鎖ＤＮＡを３'末端から５'末端方向に分解する、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記複合体を構成する前記ＤＮＡアプタマーを増幅する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーが５'末端にＤＮＡ増幅用のプライマー配列を有する、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーを増幅する前記工程が、前記ＤＮＡアプタマーの３'末端に任意のヌクレオチドを重合させる工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーを増幅する前記工程で得られた前記ＤＮＡアプタマーを含む混合物に対して、少なくとも前記複合体を得る前記工程および前記複合体を残す前記工程とから構成される一連の工程を繰り返し行う、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記複合体を回収する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーの塩基配列を特定する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法を用いて得られたＤＮＡアプタマー。
【請求項１】
標的分子に特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む一本鎖ＤＮＡの一群に前記標的分子を接触させることにより、前記ＤＮＡアプタマーと前記標的分子とから構成される複合体を得る工程と、
前記複合体を構成しない前記一群中の前記一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ分解酵素で分解することにより、前記複合体を残す工程と、を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記一本鎖ＤＮＡ分解酵素は、前記一本鎖ＤＮＡを３'末端から５'末端方向に分解する、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記複合体を構成する前記ＤＮＡアプタマーを増幅する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーが５'末端にＤＮＡ増幅用のプライマー配列を有する、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーを増幅する前記工程が、前記ＤＮＡアプタマーの３'末端に任意のヌクレオチドを重合させる工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーを増幅する前記工程で得られた前記ＤＮＡアプタマーを含む混合物に対して、少なくとも前記複合体を得る前記工程および前記複合体を残す前記工程とから構成される一連の工程を繰り返し行う、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記複合体を回収する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法であって、
前記ＤＮＡアプタマーの塩基配列を特定する工程を含む、ＤＮＡアプタマーの選択方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーの選択方法を用いて得られたＤＮＡアプタマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１４３１９７（Ｐ２０１２−１４３１９７Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４６９（Ｐ２０１１−４４６９）
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【出願人】（０００２３２０９２）ＮＥＣソフト株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【出願人】（０００２３２０９２）ＮＥＣソフト株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
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