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DNAアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
説明

DNAアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定

本発明は、標的ポリヌクレオチド中に散在したアダプターを用いる、標的配列のヌクレオチド配列情報を獲得するための方法および組成物に関する。配列情報は新規なもの、例えば未知核酸の配列決定でもよいし、再配列決定、または遺伝子型同定でもよい。本発明は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片中の分散した位置に複数のアダプターを挿入する方法を含む。かかるアダプターは、様々な配列決定化学、例えば、プライマー伸長、プローブライゲーション等によりヌクレオチドを同定する化学を用いて隣接配列を調べるためのプラットフォームとして役立ちうる。本発明には、アダプターにより近接する標的配列の途切れが生じるように既知のアダプター配列を標的配列に挿入するための方法および組成物も含まれる。アダプターの「上流」と「下流」の両方を配列決定することにより、完全な標的配列の同定が達成されうる。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む、複数の検出位置を含む標的配列の1つの検出位置における第一のヌクレオチドの実体を決定する方法:
(a)複数のコンカテマーを提供する工程、ここで各コンカテマーは複数のモノマーを含み、各モノマーは以下を含む:
i)標的検出位置の第一のセットを含む該標的配列の第一の標的ドメイン;
ii)IIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第一のアダプター;
iii)標的検出位置の第二のセットを含む該標的配列の第二の標的ドメイン;および、
iv) IIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第二の散在したアダプター;
(b)該第一のヌクレオチドを同定する工程。
【請求項2】
該標的配列コンカテマーが表面上に固定化されている請求項 1の方法。
【請求項3】
該同定する工程が以下の工程を含む請求項 2の方法:
(a)該コンカテマーとそれぞれ以下を含む配列決定プローブのセットとを、
i)該アダプターの1つに相補的な第一のドメイン;
ii)第一の調査位置における特有のヌクレオチド; および、
iii)標識;
該特有のヌクレオチドが該第一のヌクレオチドに相補的であれば、配列決定プローブが該コンカテマーにハイブリダイズする条件下で接触させる工程:および、
(b) 該第一のヌクレオチドを同定する工程。
【請求項4】
各アダプターがアンカープローブハイブリダイゼーション部位を含み、該同定する工程が以下の工程を含む請求項 2の方法:
(a)アンカープローブを該アンカープローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズさせる工程;
(b)配列決定プローブを該アダプターに隣接する標的検出位置とハイブリダイズさせる工程;
(c)隣接するハイブリダイズした配列決定プローブとアンカープローブとをライゲーションし、ライゲーションしたプローブを形成する工程;および、
(d) 該ライゲーションしたプローブを検出し、該第一のヌクレオチドを同定する工程。
【請求項5】
各アダプターがアンカープローブハイブリダイゼーション部位を含み、該同定する工程が以下の工程を含む請求項 2の方法:
(a)アンカープローブを該アンカープローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズさせる工程;
(b) dNTPが完全に検出位置に相補的であれば、該 dNTP がアンカープローブに付加され伸長したプローブを形成し、それにより伸長したプローブの調査位置を作成する条件下で、ポリメラーゼおよび標識を含む少なくとも1つのdNTPを添加する工程;および、
(c)伸長したプローブの調査位置におけるヌクレオチドを決定する工程。
【請求項6】
第二の検出位置におけるヌクレオチドが同定される、請求項 2の方法。
【請求項7】
第三の検出位置におけるヌクレオチドが同定される、請求項 6の方法。
【請求項8】
第四の検出位置におけるヌクレオチドが同定される、請求項 7の方法。
【請求項9】
第五の検出位置におけるヌクレオチドが同定される、請求項 8の方法。
【請求項10】
第六の検出位置におけるヌクレオチドが同定される、請求項 9の方法。
【請求項11】
該表面が官能化されている請求項 2の方法。
【請求項12】
該官能化された表面が、アミン、シランおよびヒドロキシルからなる群から選択される官能部分を含む請求項 11の方法。
【請求項13】
該表面が該固定化コンカテマーを含む複数の空間個別的な領域を含む、請求項 2の方法。
【請求項14】
該コンカテマーが該表面上に捕捉プローブを用いて固定化されている、請求項 2の方法。
【請求項15】
ゲノム核酸を断片化して標的配列を形成する工程をさらに含む請求項 1の方法。
【請求項16】
該第一および第二のアダプターのIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位が同一である請求項 1の方法。
【請求項17】
該第一および第二のアダプターのIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位が異なる請求項 1の方法。
【請求項18】
複数の固定化コンカテマーを含む基体であって、該コンカテマーの各モノマーが以下を含む基体:
a) 第一の標的配列;
b) IIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第一のアダプター;
c) 第二の標的配列;および、
d) IIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第二の散在したアダプター。
【請求項19】
各モノマーがさらに第三の標的配列およびIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第三の散在したアダプターを含む、請求項 18の基体。
【請求項20】
各モノマーがさらに第四の標的配列およびIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む第四の散在したアダプターを含む、請求項 19の基体。
【請求項21】
該基体がガラスである請求項 18の基体。
【請求項22】
該ガラスが官能化されている請求項 21の基体。
【請求項23】
該基体が捕捉プローブを含み、該コンカテマーが該捕捉プローブへのハイブリダイゼーションにより固定化されている請求項 18の基体。
【請求項24】
該第一および第二のアダプターのIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位が同一である請求項 18の基体。
【請求項25】
該第一および第二のアダプターのIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位が異なる請求項 18の基体。
【請求項26】
該標的配列がゲノム核酸配列である請求項 18 の基体。
【請求項27】
該ゲノム核酸配列がヒトのものである請求項 26の基体。
【請求項28】
以下の工程を含む、標的配列中に複数のアダプターを挿入する方法:
(a)第一のアダプターを該標的配列の一つの末端にライゲーションする工程、ここで該アダプターは制限酵素のための結合部位を含む;
(b)工程 (i)からの産物を環状化して第一の環状ポリヌクレオチドを作成する工程;
(c)環状ポリヌクレオチドを制限酵素で切断する工程、ここで制限酵素は第一のアダプター内の結合部位に結合することが出来る;
(d)第二のアダプターをライゲーションする工程、ここで該第二のアダプターは制限酵素のための結合部位を含む;
(e)工程 (d)からの産物を環状化して第二の環状ポリヌクレオチドを作成する工程;
ここで工程 (c)から(e)を所望により標的配列中に所望の数のアダプターが挿入されるよう反復する。
【請求項29】
該第一のアダプターの該結合部位がIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む請求項 28 の方法。
【請求項30】
該第二のアダプターの該結合部位がIIs型エンドヌクレアーゼ制限部位を含む請求項 28 の方法。
【請求項31】
該環状化工程が CircLigase(商標) 酵素の添加を含む請求項 28 の方法。
【請求項32】
該環状化工程が以下の工程を含む請求項 28 の方法:
(a)環状化配列を該標的配列の第二の末端に付加する工程;
(b)架橋テンプレートを該アダプターの少なくとも一部および該環状化配列の一部にハイブリダイズさせる工程;
(c)該第一および第二の末端が一緒になるようライゲーションして標的配列を環状化する工程。
【請求項33】
以下の工程を含む標的配列のヌクレオチド配列を同定する方法:
(a)標的配列内に複数の散在したアダプターを提供する工程、ここで各散在したアダプターは標的配列との少なくとも一つの境界を有する; および、
(b)少なくとも二つの散在したアダプターの少なくとも一つの境界に隣接する少なくとも一つのヌクレオチドの実体を決定し、それにより標的配列のヌクレオチド配列を同定する工程。
【請求項34】
各断片が複数の散在したアダプターを含む二以上の核酸断片を含むポリヌクレオチドのライブラリーであって、各散在したアダプターが複数の散在したアダプターのその他のあらゆる配列に対してクロスハイブリダイズすることができない異なる配列を有する少なくとも1つの末端を有する、ライブラリー。
【請求項35】
複数の散在したアダプターがあらかじめ決められた順序にある請求項 34のライブラリー。
【請求項36】
散在したアダプターのあらかじめ決められた順序が各核酸断片について同一である請求項 35のライブラリー。
【請求項37】
該核酸断片のそれぞれが閉じた一本鎖 DNA環である請求項 34 のライブラリー。
【請求項38】
以下の工程を含む標的配列のヌクレオチド配列を同定する方法:
(a)標的配列の複数の断片のそれぞれからのアンプリコンを提供する工程、各断片はあらかじめ決められた位置に複数の散在したアダプターを含み、各アンプリコンは断片の複数コピーを含み、アンプリコンは標的配列を実質的にカバーする多数の断片を含む;
(b)アンプリコンの少なくとも大部分が光学的に分解可能な密度で表面に固定化されたアンプリコンのランダムアレイを提供する工程;
(c) 一以上の配列決定プローブと散在したアダプター上の相補的配列との完全に一致した二本鎖の形成を可能とする条件下で一以上の配列決定プローブをランダムアレイにハイブリダイズさせる工程、
(d)一以上の配列決定プローブを配列特異的反応により伸長することにより少なくとも一つの散在したアダプターに隣接する少なくとも一つのヌクレオチドを同定する工程; および、
(e)標的配列のヌクレオチド配列が同定されるまで工程(c) および(d)を反復する工程。
【請求項39】
以下の工程を含む標的配列のヌクレオチド配列を同定する方法:
(a)平面状表面に固定化されたコンカテマーのランダムアレイを提供する工程、ここで該表面は光学的に分解可能な別々の空間的に離れた領域のアレイを有し、各別々の空間的に離れた領域は 1 μm2未満 の面積を有し、かかる領域の実質的にすべてが該コンカテマーの多くとも1つを結合して有し、各コンカテマーは標的配列の断片の複数コピーを含み、各かかる断片は複数の散在したアダプターをあらかじめ決められた位置に連続して含み、異なるコンカテマーの数がそれぞれの断片が標的ポリヌクレオチドを実質的にカバーするような数である;
(b) 一以上のプローブとコンカテマー上の相補的配列の間の完全に一致した二本鎖の形成を可能とする条件下でプローブの第一のセットからの一以上のプローブをランダムアレイにハイブリダイズさせる工程;
(c)一以上の プローブとコンカテマー上の相補的配列の間の完全に一致した二本鎖の形成を可能とする条件下でプローブの第二のセットからの一以上のプローブをランダムアレイにハイブリダイズさせる工程;
(d) 近接する部位にてコンカテマーにハイブリダイズした第一および第二のセットからのプローブをライゲーションする工程;
(e)ライゲーションしたプローブの配列を同定する工程;および、
(f)工程(b) から (e)を標的配列のヌクレオチド配列が同定されるまで反復する工程。
【請求項40】
以下の工程を含む標的配列のヌクレオチド配列を同定する方法:
(a)標的配列からの複数のコンカテマーを提供する工程、各コンカテマーは標的配列の断片の複数コピーを含み、各断片はあらかじめ決められた位置に複数の散在したアダプターを含む;
(b)少なくともコンカテマーの大部分が光学的に分解可能な密度で表面に固定化されたコンカテマーのランダムアレイを提供する工程;
(c)少なくとも一つのコンカテマーにおける少なくとも一つの散在したアダプターに隣接する各断片の少なくとも一部の配列を同定し、それにより標的配列のヌクレオチド配列を同定する工程。
【請求項41】
該複数のコンカテマーが該断片が該標的配列を実質的にカバーするように多数の断片を含む請求項 40の方法。
【請求項42】
該コンカテマーの該断片の該一部の配列の実体から標的配列のヌクレオチド配列を再構築する工程をさらに含む請求項 41の方法。

【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【公表番号】特表2010−500002(P2010−500002A)
【公表日】平成22年1月7日(2010.1.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−556583(P2008−556583)
【出願日】平成19年2月26日(2007.2.26)
【国際出願番号】PCT/US2007/062825
【国際公開番号】WO2007/133831
【国際公開日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【出願人】(507411419)カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】CALLIDA GENOMICS, INC.
【Fターム(参考)】