ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼ基質
ＡＰエンドヌクレアーゼ、および酵素のグリコシラーゼ／リアーゼファミリーの一員の核酸基質の新たなクラスについて記述する。各々のファミリーの代表、それぞれ酵素Ｎｆｏおよびｆｐｇは、様々な標識部分が取り付けられているリンカーによって塩基が置換される位置で核酸主鎖を開裂する。これらの合成基質をオリゴヌクレオチド内に埋め込んで使用すると、多くの用途に有用である。一実施形態において、標的核酸の存在または不在を検出するプロセスが提供され、このプロセスは、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸に接触させ、それによりプローブと標的核酸との間に複合体を形成するステップと、（ｂ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択したヌクレアーゼにプローブ／核酸複合体を接触させるステップと、（ｃ）切除または開裂が行われたかどうかを検出するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１７９，７９３号（これは、参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド基質およびその使用、たとえば核酸増幅反応のためのプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
一次配列、主鎖構造、または基本特性（多くの場合、傷害塩基または修飾塩基）により指定される方法で核酸を代謝する酵素は、生物工学的用途に有用である。このような酵素のいくつかのファミリーは、核酸ベースの技術に普通に使用されており、制限エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼおよびエクソヌクレアーゼが含まれる。さらに、特定の配列ストリングに依存するのではなく、普通でない塩基、傷害塩基または欠落塩基の認識に依存する種々のシングルサブユニットの（非制限）エンドヌクレアーゼについては、これまで長年にわたって記述されてきた。これらの酵素は、おおまかに２つのグループ、つまり一例として大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）および大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩがあるＡＰエンドヌクレアーゼと、一例として大腸菌ｆｐｇ、ＭＵＧおよびＮｔｈがあるＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼファミリーとに分割することができる。
【０００４】
ＡＰエンドヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡに関連して発見された場合、無塩基部位（その他の酵素活性も存在し得る）で糖−リン酸主鎖を認識し、開裂する能力に特徴がある。無塩基部位における認識および切開は、グリコシラーゼ／リアーゼファミリーに独特な生化学的な方法で行われ、ベータ脱離またはベータ／デルタ脱離によって行われるのではない。したがって、これらは、真の無塩基部位だけでなく、糖環の’１炭素に酸素原子が欠けているテトラヒドロフラン部分を含むその他の基質も攻撃する。（非特許文献１）（図１の化学構造を参照）。
【０００５】
対照的に、ｆｐｇタンパク質（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、大腸菌ｆｐｇ、および哺乳動物のＯＧＧ１）、またはＮｔｈタンパク質（大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ヒトのＮｔｈ１など）を含むグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は、第１に、傷害塩基が、タンパク質とＤＮＡとの間のシッフ塩基の形成を介して認識されて切除され、第２に、このように生成された無塩基部位が、ＡＰエンドヌクレアーゼに独特な方法でベータ脱離またはベータ／デルタ脱離によって処理される２段階の触媒作用方法で機能する。この場合、Ｃ１’酸素原子はこの無塩基部位の模擬は存在せず、このような位置に酸素が欠如している糖は攻撃に耐性があるため、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）残基はリアーゼ活性の基質ではない（非特許文献１）（図１）。
【０００６】
分子生物学的技術におけるＡＰエンドヌクレアーゼおよびグリコシラーゼ／リアーゼの使用について説明した。１つの用途は、インビトロＤＮＡ増幅反応の際に生成される基質を処理するためにこれらの酵素を使用するか、または類似の用途であり、特に、合成オリゴヌクレオチドが、サンプル中の分子に特異的にハイブリダイズする場合に、酵素の基質になる可能性がある修飾糖または塩基を含む合成「プローブ」オリゴヌクレオチドが提供された場合の用途である。このような用途の一例は、特許文献１および非特許文献２に記載されており、テトラヒドロフラン修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの増幅を測定する方法で、大腸菌Ｎｆｏ（エンドヌクレアーゼＩＶ）タンパク質の基質として使用される（Ｎｆｏは、大腸菌の２つのＡＰエンドヌクレアーゼの１つである）。
【０００７】
グリコシラーゼ／リアーゼを類似の方法に用途することも想定可される。ｆｐｇタンパク質が、反応監視のためのＤＮＡ増幅反応の範囲内で８−オキソグアニンなどの修飾塩基を同様に処理する能力について記載されている（特許文献１）。さらに、ｆｐｇおよびＮｔｈなどのグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は３’伸長可能末端を離れないが、むしろブロック３’末端を離れる（触媒モードの違いにより）という事実は、処理プローブがポリメラーゼの対応基質にも、３’ヒドロキシル部分に依存するその他の活性にもなり得ないことを確実にすることが望まれる状況で特に有用であると思われる。
【０００８】
これらの酵素は、その電位にも関わらず、ある用途に使用するには適さなくなる特定の特徴を有する。特に、ＴＨＦ残基と違って、主鎖に必要な真の無塩基部位 − ＤＮＡリアーゼの切開活性は、生理学的条件下で安定せず、水溶液中で急速に加水分解するため、最も分子的な手順に使用するのには実際的ではない。その代わり、特定の傷害塩基は、リアーゼ活性による主鎖加水分解の前に、無塩基部位を一時的に生成するために、グリコシラーゼ活性のための一次基質として包含して使用することができる。しかし、残念ながら、８−オキソグアニン（ｆｐｇ）またはチミジングリコール（Ｎｔｈ）などの代表的な傷害塩基類似体は、理想的には、特異塩基の反対側で逆鎖上で対にする必要があるため、むしろ合成が高く付き、プローブに配列要件を課すことになる。原則として、ＡＰエンドヌクレアーゼに使用できる一般的なＴＨＦ残基に類似する安定した基質を有するものの、グリコシラーゼ／リアーゼ酵素のリアーゼ活性との反応性を維持するとはるかに好都合であると思われる。
【０００９】
本明細書では、塩基が欠如しているが、炭素ベースのリンカー［Ｃ］ｎに共有結合する１’酸素原子を含む様々な基質を含むＤＮＡ主鎖をｆｐｇタンパク質、および大腸菌（Ｎｆｏ）のＡＰエンドヌクレアーゼＩＶが効果的に開裂することを証明する。このリンカーは、その他の部分、たとえばビオチン、蛍光体およびその他の結合基を結合するために単独で使用することができ、アミン末端リンカーを使用して様々な物質を結合できる場合に特に有用である。意外なことに、この配列を有し、一般にｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎと呼ばれるヌクレオチドは、多くの状況でｆｐｇタンパク質の良好な基質であり、エンドヌクレアーゼＩＶタンパク質の基質でもあると思われるが、大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩには比較的不良な基質であると思われる。多くの状況で、特に、核酸検出方法のための検出策の部分など、特にインビトロ反応の範囲内で、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基を基質として含むオリゴヌクレオチドを使用することが想定される。この研究に使用するリンカーの長さは、市販の一定のヌクレオチドで使用可能であるように６炭素原子であるが、多様な炭素鎖の長さを使用することができ、後続の立体容積が小さく、酵素に対する十分な可塑性をこれらの構造に与える炭素−酸素−炭素構造であると想定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，４３５，５６１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９８７年）２６２（２１）：１０１７ｌ
【非特許文献２】Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら、ＰｌｏｓＢｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）４（７）：ｅ２０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は一部には、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼ、たとえばｆｐｇおよびＮｆｏタンパク質が、塩基が糖のＣ１’位に存在しないが、当該位置に酸素原子を保持しているｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含む部位でＤＮＡ主鎖の切断を触媒することが可能であるという発見に関する。酸素原子は、ｎ個（たとえば１〜８）の炭素原子（つまり、［Ｃ］ｎ）の炭素リンカーの炭素原子に糖を架橋する。したがって、市販のホスホルアミダイトを使用することにより、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含む核酸プローブを構成することができ、相補的核酸と二本鎖を形成する場合、ＡＰエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼ酵素のための基質でよい。様々な部分は、蛍光体、および特定の標的核酸が存在する証拠であるプローブの上手くいった処理を検出するための多くの方法を提示するその他の標識を含むｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎのリンカー部分に結合することができる。出願人は、蛍光分子およびクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を使用し、ｆｐｇもしくはＮｆｏ、またはその他の可能なＡＰエンドヌクレアーゼもしくはリアーゼの標的部位としてｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎを使用してどのようにプローブを構成することができるかを示す。出願人は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基質のその他の用途を他の検出計画で想定している。たとえば、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基は、ヌクレアーゼの活性が標識を遊離させた直後、または後続のプロセスを介するか、もしくは結合体化状態と遊離状態との測定可能な相違を介して検出することが可能な検出可能な標識に結合体化し得る。
【００１３】
一態様では、二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択されるヌクレアーゼと接触させることにより、核酸とともに二本鎖を形成するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドはその３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえば、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化する。
【００１４】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドと核酸とを接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップをさらに含む。実施態様によっては、これは、オリゴヌクレオチドを核酸にハイブリダイズさせることを含む。実施態様によっては、これは、（ｉ）オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼと接触させて、リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を核酸に接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップとを含む。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。
【００１５】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む。実施態様によっては、この検出はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、実施態様によっては、検出は、反応の終点で監視される。
【００１６】
実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方は炭素リンカーに結合体化する。ヌクレアーゼ活性は、結合体化した蛍光体またはクエンチャーをオリゴヌクレオチドから切除し、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差の測定を含む。
【００１７】
別の態様では、標的核酸の存在または不在を検出するプロセスを本明細書で提供する。このプロセスは、以下のステップを含む。（ａ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基またはヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを標的核酸と接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、（ｂ）二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼと接触させて、リンカーを複合体から切除するか、および／またはプローブをｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドにおいて特異的に開裂する、並びに（ｃ）こうした切除または開裂が行われたかどうかを検出する。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の生成物である。実施態様によっては、増幅反応はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、増幅反応は反応の終点で監視される。
【００１８】
実施態様によっては、二本鎖は、プローブを核酸にハイブリダイズさせることによって形成される。実施態様によっては、二本鎖は（ｉ）プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成する、（ｉｉ）リコンビナーゼ／プローブ複合体を核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、ことによって形成される。
【００１９】
実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００２０】
実施態様によっては、プローブは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方が炭素リンカーに結合体化される。たとえば、蛍光体およびクエンチャーは、プローブ中の４〜６個の塩基によって分離される。実施態様によっては、炭素リンカーに結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。ヌクレアーゼ活性は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に関連して結合体化された蛍光体またはクエンチャーをプローブから切除して遊離させ、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００２１】
別の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを本明細書で提供する。実施態様によっては、プローブは、３０〜６０ヌクレオチド長であり、１０ヌクレオチド以下（たとえば、４〜６ヌクレオチド）で分離された蛍光体クエンチャー対を含み、蛍光体またはクエンチャーの何れかがｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化しない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化する。実施態様によっては、プローブは、３０〜４０ヌクレオチド（たとえば、３５ヌクレオチド）長である。
【００２２】
さらに別の態様では、（ｉ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼとを含むキットを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
【００２３】
さらに他の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基およびＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼ（たとえば、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ））を含有するオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を本明細書で提供する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえば、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化する。実施態様によっては、反応混合物は冷凍乾燥、つまり凍結乾燥される。
【００２４】
実施態様によっては、反応混合物は容器をさらに含む。たとえば、反応混合物は、チューブまたは多ウェル容器のウェル内に含むことができる。反応混合物は乾燥させて、ビードもしくはストリップなどの可動性固体支持体、またはウェル上に取り付けることができる。
【００２５】
実施態様によっては、反応混合物は、オリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含む標的またはテンプレート核酸をさらに含む。
【００２６】
本発明のその他の実施態様、目的、態様、特徴および利点は、添付の明細書および請求の範囲から明らかになる。実施態様が、本発明の異なる態様に関して説明されている場合でも、適切であれば、本発明の任意の実施態様を本発明の１つまたは複数の他の実施態様と結合できることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、以下：１’炭素位置にヒドロキシルを含む通常の無塩基部位の化学構造、１’位に水素を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）残基の化学構造、ＤＮＡリボース基のＣ１’と、結合したマーカー部分に対するリンカーとの間の炭素−酸素−炭素架橋の位置を示す、一般的なｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基の化学構造、および最後に、実施例１に使用され、かつｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ構造に適合するｄＲ−ビオチンヌクレオチドの化学構造を記載する。
【図２】図２は、ｄＲ−ビオチンプローブの設計である：プローブ配列に一致する標的配列が増幅されるＲＰＡ反応の際に、Ｎｆｏおよびｆｐｇタンパク質の開裂活性を評価するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブの配列および配置図。オリゴヌクレオチドの配列が指示されている。プライマーは、５’末端にＦＡＭ蛍光体で標識付けされ、配列本体内にｄＲ−ビオチンを含み、２’、３’ジオキシチジン残基によりブロックされる。
【図３】図３は、ヌクレアーゼがないか、またはＮｆｏもしくはｆｐｇ酵素を含む増幅反応の比較である：両方の酵素が、開裂生成物、Ｎｆｏの場合、開裂生成物の伸長によって生じる生成物を迅速に移動させるｄＲ−ビオチン部分を処理することができることを明らかにする。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドプローブの設計である：オリゴヌクレオチド本体（この場合、３５ヌクレオチド長）、５’クエンチャー修飾（この場合、５’−ＢＨＱ１）、クエンチャーに近接する内部ｄＲ−蛍光体ヌクレオチド（この場合、ｄＲ−ＦＡＭオリゴヌクレオチド位置６）、および３’ポリメラーゼ伸長ブロックを含むプローブ設計の例。
【図５】図５は、感受性および特性を示す：ＤＮＡ ｄＲ−プローブを使用して、指示されたヒトゲノム標的について２回のテンプレート滴定実験をリアルタイムで蛍光監視した結果。どちらの場合も、蛍光信号の増加（０〜３分の基準線に対して）は、テンプレートを含む反応でのみ観察され、非テンプレート対照では観察されない。信号増加の開始時間は、開始テンプレートの量（１０００、１００または１０コピー）と相関する。反応時間は分（Ｘ軸）、蛍光は任意の蛍光単位（Ｙ軸）である。
【図６】図６は、様々なプローブの性能である：図２に概略を示す設計のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いて、指示されたヒトゲノム標的に関するＲＰＡ反応の４セット（重複）をリアルタイムで監視した結果。６〜８分の蛍光の増加は、プローブのｄＲ基（この場合、ｄＲ−ＦＡＭ）のｆｐｇ依存処理から生じ、ＤＮＡ増幅が進行しており、その結果標的ＤＮＡテンプレートの存在を示す。反応時間は分（Ｘ軸）、蛍光は任意の蛍光単位（Ｙ軸）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、付随する以下の説明に記載する。本明細書に記載されている方法および材料に類似するか、または等価な任意の方法および材料を実際に、または本発明の試験に使用することができるが、この方法および材料について説明する。本発明のその他の特徴、目的および利点は、本明細書から明らかであろう。本明細書では、単数形は、文脈上そうではないことが明らかではない限り、複数形も含む。特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本明細書が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先される。
【００２９】
実験室で分析および操作に使用する酵素と合成基質の組合せは先行技術で公知である。グリコシラーゼｆｐｇおよびＮｔｈなどのＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ、並びに大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩおよびエンドヌクレアーゼＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼは、この組合せの良い例である。現在のオリゴヌクレオチド合成法、およびＤＮＡプライマーに組み込まれる既存の多様な合成ヌクレオチドを使用することにより、これらのＤＮＡ修復酵素のための合成基質を生成することは容易である。これらのＤＮＡ修復酵素は様々な目的で容易に使用することができ、最近開拓された１つの目的は、等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応の監視を支援する剤として使用することである。
【００３０】
ＲＰＡは、ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドのリコンビナーゼ媒介標的が、ポリメラーゼによりＤＮＡ合成に結合するプロセスである（米国特許第７，２７０，９８１ Ｂ２号；米国特許第７，３９９，５９０号；米国特許第７，４３５，５６１ Ｂ２号；米国特許第７，４８５，４２８ Ｂ２号；米国特許第 ７，６６６，５９８ Ｂ２号および海外の対応特許）。ＲＰＡは、細胞ＤＮＡ複製および修復機構の構成要素によって決まり、特定のクラウディング剤の存在で達成される高レベルの再結合活性を維持する適切な速度のリコンビナーゼのロードおよびアンロードの両方を有する「動的」再結合環境の確立に依存する。ＲＰＡは、ＰＣＲの感受性、特異性およびその他ほとんどの特徴を結合し、熱サイクリングの必要がなく、異例の速度、および異常温度設定に対する頑健性という利点を有する。ＲＰＡは、熱安定性の等価物が必要であるか、または単鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの付属タンパク質、ＲＰＡ反応の天然成分がない場合は調節が不良であることが実証されているため、他のプロセスには利用されていなかった多様な核酸処理酵素、たとえば公知の修復エンドヌクレアーゼの潜在的な使用から既に利益が得られている。
【００３１】
簡潔に述べると、ＲＰＡは以下のステップを含む：第１に、リコンビナーゼ因子が第１および第２核酸プライマーと接触して、第１および第２核タンパク質プライマーを形成する。第２に、第１および第２核タンパク質プライマーは、二本鎖標的配列と接触して、前記第１鎖の第１部分に第１二本鎖構造を形成し、前記第２鎖の第２部分に二本鎖構造を形成し、よって前記第１核酸プライマーおよび前記第２核酸プライマーの３’末端は、所定のテンプレートＤＮＡ分子上で互いに対して方向付けられる。第３に、前記第１および第２核タンパク質プライマーの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、第１および第２二本鎖核酸、および核酸の第１および第２変位鎖を生成する。最後に、第２および第３ステップは、所望の程度の増幅に達するまで繰り返される。
【００３２】
以前の研究は、ＲＰＡ法のためのプローブシステムの開発で、合成ヌクレオチドテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）がきわめて有用であることを実証している（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ等、２００６年；米国特許第７，４３５，５６１ Ｂ２号）。この塩基類似体は、しばしば無塩基部位を模倣するために使用され、安定しているという自然な利点を有し、天然の無塩基部位の１’ヒドロキシルを水素原子に置き換えることによりヌクレオチドは安定し、瞬間的な開環およびオリゴヌクレオチドの分裂が生じなくなる。この類似体は容易に入手可能であり、オリゴヌクレオチドに組み込むのも安価である。しかし、生化学的機序の違いにより、大腸菌ＡＰエンドヌクレアーゼＮｆｏおよびＥｘｏＩＩＩは合成プライマーのこうしたＴＨＦ残基で開裂することが可能である一方、他のＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼは開裂することができない。これらの後者の酵素は通常、傷害塩基（グリコシラーゼ活性）および／またはヒドロキシル基が糖の１’位（リアーゼ活性）に存在する必要があり、ＴＨＦはその酵素活性に対して完全に不活性である。これらのグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は、プローブがＲＰＡ、またはその他の状況および方法で標的ＤＮＡ蓄積に応じて処理される反応などのインビトロ反応にも有用なツールになり得るため、多少厄介になる。より自然な基質、たとえばｆｐｇ用の８−オキソグアニンは、オリゴヌクレオチド内に挿入して、これらのグリコシラーゼ／リアーゼの開裂部位を生成することができるが、これらの修飾は一般に高価であり、さらに、修飾ヌクレオチドに対向することが可能な塩基を制限することが多い。比較的安価で、さらに一般的であり、これらの酵素の基質であるヌクレオチド修飾は、非常に有用であると思われる。
【００３３】
多くの異常な塩基類似体のＤＮＡ修復酵素の基質としての効果を調査するために、完全に塩基が欠如しているが、糖の１’位に炭素−酸素−炭素連結を保持するヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成した。このようなヌクレオチド試薬は容易に入手可能で安価であり、一般に、蛍光体またはビオチンなどの標識基をオリゴヌクレオチドの本体内の複数のオリゴヌクレオチド内に組み込むために使用される。一般に、酸素を介して糖の１’炭素に結合する炭素原子は、多くの場合、最終的に標識基、アミン、または試薬が容易に結合し得るその他の化学的部分（たとえば、チオ）で終端するリンカーの第１炭素原子である。こうした試薬は、文献にはｄＲ−Ｘと記述されることが多く、この場合、ｄＲはデオキシリボースを意味し、Ｘはリンカーアミン、リンカー蛍光体、リンカービオチン、またはいくつかのその他の基または標識である。修復エンドヌクレアーゼが、塩基は欠如しているが、炭素−酸素−炭素共有結合を１’糖位置に保持する構造を認識するかどうか、以前に調査されたことはなかった。ヒドロキシルの欠如は、リアーゼの開環プロセスが、リンカー基を事前に処理し、それに関連して切除することなく実施すべきではないことを意味する。公知のグリコシラーゼは、通常、異常な炭素リンカーではなく傷害塩基に作用するので、これらのｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基はｆｐｇなどのＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼの基質であろうという先例はなかった。
【００３４】
図１は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基の一般的な構造、特に、本明細書で使用され、ベルギーのＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃが市販するオリゴヌクレオチド中に組み込まれるｄＲ−ビオチン試薬の構造を示す。本明細書で使用するこれらの試薬は、１’糖と、オリゴヌクレオチド合成の前または後にその他の試薬を結合するために使用されることが多い窒素原子との間に一般的な６炭素原子リンカーを有する。この研究では、ｄＲ−ビオチンオリゴヌクレオチドのビオチン部分は、この窒素原子を介してアミド結合として結合し、さらに４炭素原子リンカーを通して結合する。この研究に使用されるその他の標識試薬 − ｄＲ−ＦＡＭおよびｄＲ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ − は同様に配置され、この場合、蛍光体は６炭素原子リンカーの末端でアミド結合を通して結合する。
【００３５】
検出可能な標識は、現在の方法で検出できる任意の部分と定義される。これらの標識は、少なくとも蛍光体（蛍光分子、蛍光色素とも呼ばれる）、酵素、クエンチャー、酵素抑制物質、放射性標識、結合対の一員、ジオキシゲニン残基、ペプチド、およびこれらの組合せを含む。
【００３６】
「結合対の一員」とは、第１部分および第２部分の一方を意味し、前記第１部分および第２部分は互いに特異的な結合親和性を有する。本発明に使用するのに適する結合対としては、抗原／抗体（たとえば、ジゴキシゲニン／抗−ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル （ＤＮＰ）／抗−ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗−ダンシル、フルオロセイン／抗−フルオロセイン、ルシファーイエロー／抗−ルシファーイエロー、ペプチド／抗−ペプチド、リガンド／受容体およびローダミン／抗−ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられるが、これらだけに限らない。その他の適切な結合対としては、ポリペプチド、たとえばＦＬＡＧ−ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）［Ｈｏｐｐ 等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４ １２１０（１９８８年）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ 等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１９２ １９４（１９９２年））；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６：１５１６３ １５１６６（１９９１年））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ 等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３ ６３９７（１９９０年））並びにこれらに対する抗体が挙げられる。一般に、好ましい実施態様では、結合対パートナーのより小さい方は、立体配置に関する考察が重要な場合があるため、検出可能な標識として役立つ。
【００３７】
一態様では、二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼに接触させることによって、核酸とともに二本鎖を形成するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００３８】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドを核酸と接触させてオリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップをさらに含む。実施態様によっては、これは、オリゴヌクレオチドを核酸にハイブリダイズさせることを含む。実施態様によっては、これは、（ｉ）オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼと接触させてリコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を核酸と接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップとを含む。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。
【００３９】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む。実施態様によっては、検出はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、検出は、反応の終点で監視される。
【００４０】
実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方は炭素リンカーに結合体化する。ヌクレアーゼ活性は、結合体化した蛍光体またはクエンチャーをオリゴヌクレオチドから切除し、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００４１】
別の態様では、標的核酸の存在または不在を検出するプロセスを本明細書で提供する。このプロセスは、以下のステップを含む：（ａ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基またはヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを標的核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成するステップと、（ｂ）二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼと接触させて、リンカーを複合体から切除するか、および／またはプローブをｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドで特異的に開裂するステップと、（ｃ）こうした切除または開裂が生じたかどうかを検出するステップ。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。実施態様によっては、増幅反応はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、増幅反応は反応の終点で監視される。
【００４２】
実施態様によっては、二本鎖は、プローブを核酸にハイブリダイズさせることによって形成される。実施態様によっては、二本鎖は、（ｉ）プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成する、（ｉｉ）リコンビナーゼ／プローブ複合体を核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、ことによって形成される。
【００４３】
実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００４４】
実施態様によっては、プローブは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方が炭素リンカーに結合体化される。たとえば、蛍光体およびクエンチャーは、プローブ中の４〜６個の塩基によって分離される。実施態様によっては、炭素リンカーに結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。ヌクレアーゼ活性は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に関連して結合体化された蛍光体またはクエンチャーをプローブから切除して遊離させ、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００４５】
別の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを本明細書で提供する。実施態様によっては、プローブは、３０〜６０ヌクレオチド長であり、１０ヌクレオチド以下（たとえば、４〜６ヌクレオチド）で分離された蛍光体クエンチャー対を含み、蛍光体またはクエンチャーの何れかがｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。実施態様によっては、プローブは、３０〜４０ヌクレオチド（たとえば、３５ヌクレオチド）長である。
【００４６】
さらに別の態様では、（ｉ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼとを含むキットを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
【００４７】
さらに他の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基、およびＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼ（たとえば、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ））を含有するオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を本明細書で提供する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。実施態様によっては、反応混合物は冷凍乾燥、つまり凍結乾燥される。
【００４８】
実施態様によっては、反応混合物は容器をさらに含む。たとえば、反応混合物は、チューブまたは多ウェル容器のウェル内に含むことができる。反応混合物は乾燥させるか、またはビードもしくはストリップなどの可動性固体支持体、またはウェル上に取り付けることができる。
【００４９】
実施態様によっては、反応混合物は、オリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含む標的またはテンプレート核酸をさらに含む。
【００５０】
図２は、プローブに指定される配列を含むＤＮＡ分子を標的として使用して、ＲＰＡのＤＮＡ増幅反応に使用するために生成されるｄＲ−ビオチンプローブの一次配列、およびおおまかなその性質の両方を示す。プローブはブロックされ（増幅段階でポリメラーゼ伸長を防止するため）、内部ｄＲ−ビオチンを酵素の試験基質として含む。プローブは、５’−ＦＡＭも含む。したがって、原則として、ＤＮＡが、このプローブを含む反応で増幅される場合、プローブが、増幅時に形成された相補的単鎖に対する「従来の」ハイブリダイゼーションにより、またはリコンビナーゼ媒介プロセスにより、増幅されたＤＮＡと特異的に結合して相互作用する可能性がある。こうした実験の結果を図３に示し、以下の実施例１で説明する。
【００５１】
第２セットの実験は、この開裂活性の普遍性を調査するために実施され、この場合、蛍光試薬を使用し、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドは、図４に示すように蛍光体に結合する。この場合、ｄＲ−蛍光体は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近に位置し、その５’末端に結合するクエンチャーにきわめて接近して位置する。従来どおり、プローブの３’末端は異常な伸長またはプライマーのアーティファクトを防止するために適切にブロックされる。図４に示すように、プローブは、相補的増幅材料とハイブリダイズする場合、ｆｐｇ（またはＮｆｏ）の基質になる可能性があり、この場合、この位置で主鎖を開裂することができる（そして、グリコシラーゼ活性がｆｐｇまたはその他の非ＡＰエンドヌクレアーゼ酵素中に存在する場合、オリゴヌクレオチドの断片から分離した水媒体中に潜在的に蛍光体を直接遊離させる）。開裂が生じる場合、蛍光体およびクエンチャーが物理的に分離し、その結果、大腸菌ＮｆｏまたはｅｘｏＩＩＩタンパク質を使用してＴＨＦベースの蛍光プローブに関して前に説明した方法に類似する方法で、検出可能な蛍光が増加する。図５および図６はこうした実験の結果を示し、公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）領域を特異的に対象としたプライマーおよびプローブを使用して、ＲＰＡ反応をヒトゲノム標的に関して実施した実施例２で説明されている。
【００５２】
これらの実験は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基はＮｆｏおよびｆｐｇヌクレアーゼの基質であることを全体的に明確に証明する。さらに、相補的核酸鎖が蓄積して二本鎖の形成が可能になり、それによって、増幅が蛍光またはその他の機序によって生じたかどうかの判断を可能にする状況でのみ、プローブのヌクレアーゼ活性が生じるような基を含むプローブを構成することが可能である。したがって、これらのｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチド試薬は、ｆｐｇ、Ｎｆｏまたはグリコシラーゼ／リアーゼ、および多様な用途の等価な酵素と組み合わせて広く応用することができる。
【００５３】
配列に関するすべての引用、言及、特許、特許出願、その他の引用文献は、引用することにより本明細書に包含する。
【実施例】
【００５４】
本発明について、以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、具体的に説明するために記載されているにすぎないと考えるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて様々な用途および条件に適合させることができる。
【００５５】
実施例１
内部ｄＲ−ビオチンを含むオリゴヌクレオチドプローブは、Ｎｆｏおよびｆｐｇにより切断される。
【００５６】
この実施例では、図２に大まかに示され、内部ｄＲ−ビオチンを含むオリゴヌクレオチドプローブは、Ｎｆｏおよびｆｐｇにより切断することができる。この反応（全量１５０μＬ）は新鮮な試薬から混合し、７５分間にわたって３７℃で培養する。使用した条件は、５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ ７．９）、１４ｍＭのＭｇ−アセテート、１００ ｍＭのカリウムアセテート、２ｍＭのＤＴＴ、それぞれ２００ｎＭのｄＮＴＰ、６％ＰＥＧ ３５，０００、３ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのクレアチンリン酸、９００ｎｇ／μＬのＴ４ｇｐ３２、１２０ｎｇ／μＬのＴ４ｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのＴ４ｕｖｓＹ、３６０ｎｇ／μＬの枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩであった。ＤＮＡテンプレート３０００コピーまたは水（負の対照として）は、指示どおりに加えた。ヌクレアーゼ、２００ｎｇ／μＬのＮｆｏまたは５０ｎｇ／μＬのｆｐｇは、指示どおりに加えた。プライマー、Ｋ２およびＪ１は、それぞれ４８０ｎＭで含め、プローブ、ＦｐｇＰｒｏｂ１は１２０ｎＭで加え、これらの配列は以下のとおりである。サンプルは、１容積の２％ＳＤＳ／１容積のフェノール中で急冷し、２０分間にわたって６５℃で培養した。その後、サンプルは、標準の分子生物学的技術によりフェノール／クロロフォルム抽出し、２回エタノール沈殿させた。次に、各々のサンプルの半分は、１６．５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素）上でホルムアミドのローディングバッファーに再懸濁させ、標準のプロトコルに従って視覚化した（ＦＡＭ蛍光を使用して）。マーカーは、２ｐｍｏｌのプローブおよび２ｐｍｏｌの３２ｎｔマーカーオリゴヌクレオチドであった。
【００５７】
【化１】
プローブおよび何らかの生物は、本明細書では、紫外線照射して活性化した場合、可視光を放出するＦＡＭ部分により視覚化した。標的ＤＮＡ、２つの適切な増幅プライマー、ｄＲ−ビオチンプローブ、およびヌクレアーゼなし、Ｎｆｏタンパク質またはｆｐｇタンパク質のいずれかを含む増幅反応（ＲＰＡ）は、培養後に洗浄し、変性アクリルアミドゲル上でサイズ別に分離した後、紫外線に曝露した。次に、５’−ＦＡＭを保持するプローブまたは何らかの派生物が視覚化される（図３）。添加ヌクレアーゼが存在しない場合、４２ヌクレオチド長のプローブはほとんど、３２ヌクレオチド（指示）の対照標識付きプライマーより緩慢にその予想位置に移動する。わずかに緩慢に移動する（長めの）断片も、ＲＰＡ中で培養されない適切なプローブ（♯１）と比べて観察される。これはおそらく、酵素調合物の一部に存在すると考えられるヌクレアーゼ（３’末端で徐々に減少する）によって、プローブのブロックが徐々に解除され、一度ブロックが解除されると、増幅標的に対するハイブリダイゼーション後に拡張可能であり、この種のネスト化した複製配列を形成するために生じる。しかし、Ｎｆｏが存在すると、この現象は予想よりはるかに顕著になり、プローブの大部分が伸長する。さらに、少量の比較的迅速に移動するプローブＤＮＡ（♯２）も見え、その後の伸長を伴わないｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ位置における開裂を示すため、Ｎｆｏタンパク質は、３’末端を単に「研磨する」のではなく、実際にｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を攻撃していた。最後に、ｆｐｇタンパク質が反応環境に含まれる場合、ｆｐｇは、開裂後にブロック３’−末端を離れ、その結果、混合物中に存在するポリメラーゼ酵素によって伸長しないため、比較的迅速に移動する開裂プローブの大部分が見え、伸長した材料は検出されない。
【００５８】
実施例２
内部ｄＲ蛍光体を含むオリゴヌクレオチドプローブによるＤＮＡ増幅
この実施例では、ＲＰＡは、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドが図４に示すように蛍光体に結合する蛍光試薬を使用して実験する。この場合、ｄＲ蛍光体は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近に位置し、その５’末端に結合するクエンチャーにきわめて接近して位置する。従来の実施例のとおり、プローブの３’末端は異常な伸長またはプライマーのアーティファクトを防止するために適切にブロックされる。
【００５９】
この反応（全量５０μＬ）は、冷凍−乾燥反応に関する標準ＲＰＡプロトコルに従って実施された。簡潔に述べると、凍結乾燥試薬はＰＥＧ、マグネシウム−アセテートおよびテンプレートと混合し、蛍光光度計内で３８℃で２０分間にわたって培養した（Ｔｗｉｓｔａプロトタイプ；ＥＳＥ ＧｍｂＨ、ドイツ）。使用した条件は、５０ｍＭのトリス／アセテート（ｐＨ ８．３）、１４ｍＭのマグネシウム−アセテート、１００ｍＭのカリウム−アセテート、５ｍＭのＤＴＴ、それぞれ２４０ｎＭのｄＮＴＰ、５％のＰＥＧ ３５，０００、４％トレハロース２．５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭのホスホ−クレアチン、３００ｎｇ／μＬのｒｂ６９ｇｐ３２、２７３ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、１２０ｎｇ／μＬ ｕｖｓＹ、５０ｎｇ／μＬの黄色ブドウ状球菌ＤＮＡポリメラーゼＩであった。図５の実験では、１０００、１００、１０ または０コピーのＤＮＡテンプレートを図に示されているように包含し、図６の実験では１０００コピーのＤＮＡテンプレートを包含した。２５ｎｇ／μＬのｆｐｇヌクレアーゼを包含した。プライマーは、それぞれ３６０ｎＭで包含し、プローブは１２０ｎＭで包含し、それぞれの配列は以下のとおりであった。蛍光は２０秒ごとに測定した（励起４７０ｎＭ、発光５２０ｎＭ）。サンプルは、４分間の培養時間で短時間の混合／回転を行って培養器から取り出し、培養器／蛍光光度計に戻した。分の時間に対して任意の蛍光単位をプロットした。
【００６０】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓ４８２４８７１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ２およびＲ１並びにプローブは、以下のとおりであった。
【００６１】
【化２】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓｌ２０７４４５の場合、使用したプライマーの配列Ｆ２およびＲ２並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６２】
【化３】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓｌ１０５５６１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ１およびＲ１並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６３】
【化４】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓ５９２３９３１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ１およびＲ１並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６４】
【化５】
図５および６は、上記の実験の結果を示し、ＲＰＡ反応は、公知のＳＮＰ領域を特異的に対象としたプライマーおよびプローブを使用して、ヒトゲノム標的に関して実施した。図５では、このような２つのゲノム領域は、ｆｐｇタンパク質の封入と共に、ＲＰＡおよび図４に示されている一般的な構造を持つプローブを使用して増幅した。標的ゲノムＤＮＡは、合計標的コピー数を１０００、１００、１０またはゼロ標的分子にするために追加し、こうして、標的に一致する単位複製配列の特異的な蓄積要件が確保される。６〜１２分後（標的およびコピー数に応じて）、標的を含むこれらのサンプルの蛍光は明らかに上昇するが、標的が欠如しているサンプルは事実上蛍光は安定していることに注意する。図６では、４つのヒトゲノムＤＮＡ標的／プローブのセット（そのうち２つは図５にも使用されている）に関して類似のデータが示されており、何れの場合も、蛍光はＤＮＡ増幅のほぼ予想時間に上昇している。上記およびその他の好結果のプローブのほかに、ＲＰＡ増幅／検出システムで十分に作用しなかったと思われるプローブが時折みられたが（おそらく、分析したプローブの１０〜２０％）、こうした欠陥の原因は未だ明らかではなく、場合によってはプローブの欠陥ではなく、可能性として他の場合のプローブの欠陥の結果としてＲＰＡ増幅の欠陥を表していることが考えられる。場合によっては、近接塩基の位置および性質、またはｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基に対向する塩基の性質が、プローブの効果に影響した可能性があると考えられる。
【００６５】
本明細書で特定の実施態様について詳細に開示しているが、これは、具体的に示すために一例として説明したのであって、添付の請求の範囲の範囲に関して制限することを意図しているのではない。特に、発明人は、請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に様々な置き換え、変更および修飾が施されることを意図している。その他の態様、利点および修正は、添付の請求項の範囲内と考えられる。提示される請求の範囲は、本明細書で開示されている本発明を表す。請求されていないその他の発明も想定されている。出願人は、かかる発明を後の請求の範囲で追跡する権利を留保する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１７９，７９３号（これは、参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド基質およびその使用、たとえば核酸増幅反応のためのプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
一次配列、主鎖構造、または基本特性（多くの場合、傷害塩基または修飾塩基）により指定される方法で核酸を代謝する酵素は、生物工学的用途に有用である。このような酵素のいくつかのファミリーは、核酸ベースの技術に普通に使用されており、制限エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼおよびエクソヌクレアーゼが含まれる。さらに、特定の配列ストリングに依存するのではなく、普通でない塩基、傷害塩基または欠落塩基の認識に依存する種々のシングルサブユニットの（非制限）エンドヌクレアーゼについては、これまで長年にわたって記述されてきた。これらの酵素は、おおまかに２つのグループ、つまり一例として大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）および大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩがあるＡＰエンドヌクレアーゼと、一例として大腸菌ｆｐｇ、ＭＵＧおよびＮｔｈがあるＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼファミリーとに分割することができる。
【０００４】
ＡＰエンドヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡに関連して発見された場合、無塩基部位（その他の酵素活性も存在し得る）で糖−リン酸主鎖を認識し、開裂する能力に特徴がある。無塩基部位における認識および切開は、グリコシラーゼ／リアーゼファミリーに独特な生化学的な方法で行われ、ベータ脱離またはベータ／デルタ脱離によって行われるのではない。したがって、これらは、真の無塩基部位だけでなく、糖環の’１炭素に酸素原子が欠けているテトラヒドロフラン部分を含むその他の基質も攻撃する。（非特許文献１）（図１の化学構造を参照）。
【０００５】
対照的に、ｆｐｇタンパク質（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、大腸菌ｆｐｇ、および哺乳動物のＯＧＧ１）、またはＮｔｈタンパク質（大腸菌のエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ヒトのＮｔｈ１など）を含むグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は、第１に、傷害塩基が、タンパク質とＤＮＡとの間のシッフ塩基の形成を介して認識されて切除され、第２に、このように生成された無塩基部位が、ＡＰエンドヌクレアーゼに独特な方法でベータ脱離またはベータ／デルタ脱離によって処理される２段階の触媒作用方法で機能する。この場合、Ｃ１’酸素原子はこの無塩基部位の模擬は存在せず、このような位置に酸素が欠如している糖は攻撃に耐性があるため、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）残基はリアーゼ活性の基質ではない（非特許文献１）（図１）。
【０００６】
分子生物学的技術におけるＡＰエンドヌクレアーゼおよびグリコシラーゼ／リアーゼの使用について説明した。１つの用途は、インビトロＤＮＡ増幅反応の際に生成される基質を処理するためにこれらの酵素を使用するか、または類似の用途であり、特に、合成オリゴヌクレオチドが、サンプル中の分子に特異的にハイブリダイズする場合に、酵素の基質になる可能性がある修飾糖または塩基を含む合成「プローブ」オリゴヌクレオチドが提供された場合の用途である。このような用途の一例は、特許文献１および非特許文献２に記載されており、テトラヒドロフラン修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの増幅を測定する方法で、大腸菌Ｎｆｏ（エンドヌクレアーゼＩＶ）タンパク質の基質として使用される（Ｎｆｏは、大腸菌の２つのＡＰエンドヌクレアーゼの１つである）。
【０００７】
グリコシラーゼ／リアーゼを類似の方法に用途することも想定可される。ｆｐｇタンパク質が、反応監視のためのＤＮＡ増幅反応の範囲内で８−オキソグアニンなどの修飾塩基を同様に処理する能力について記載されている（特許文献１）。さらに、ｆｐｇおよびＮｔｈなどのグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は３’伸長可能末端を離れないが、むしろブロック３’末端を離れる（触媒モードの違いにより）という事実は、処理プローブがポリメラーゼの対応基質にも、３’ヒドロキシル部分に依存するその他の活性にもなり得ないことを確実にすることが望まれる状況で特に有用であると思われる。
【０００８】
これらの酵素は、その電位にも関わらず、ある用途に使用するには適さなくなる特定の特徴を有する。特に、ＴＨＦ残基と違って、主鎖に必要な真の無塩基部位 − ＤＮＡリアーゼの切開活性は、生理学的条件下で安定せず、水溶液中で急速に加水分解するため、最も分子的な手順に使用するのには実際的ではない。その代わり、特定の傷害塩基は、リアーゼ活性による主鎖加水分解の前に、無塩基部位を一時的に生成するために、グリコシラーゼ活性のための一次基質として包含して使用することができる。しかし、残念ながら、８−オキソグアニン（ｆｐｇ）またはチミジングリコール（Ｎｔｈ）などの代表的な傷害塩基類似体は、理想的には、特異塩基の反対側で逆鎖上で対にする必要があるため、むしろ合成が高く付き、プローブに配列要件を課すことになる。原則として、ＡＰエンドヌクレアーゼに使用できる一般的なＴＨＦ残基に類似する安定した基質を有するものの、グリコシラーゼ／リアーゼ酵素のリアーゼ活性との反応性を維持するとはるかに好都合であると思われる。
【０００９】
本明細書では、塩基が欠如しているが、炭素ベースのリンカー［Ｃ］ｎに共有結合する１’酸素原子を含む様々な基質を含むＤＮＡ主鎖をｆｐｇタンパク質、および大腸菌（Ｎｆｏ）のＡＰエンドヌクレアーゼＩＶが効果的に開裂することを証明する。このリンカーは、その他の部分、たとえばビオチン、蛍光体およびその他の結合基を結合するために単独で使用することができ、アミン末端リンカーを使用して様々な物質を結合できる場合に特に有用である。意外なことに、この配列を有し、一般にｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎと呼ばれるヌクレオチドは、多くの状況でｆｐｇタンパク質の良好な基質であり、エンドヌクレアーゼＩＶタンパク質の基質でもあると思われるが、大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩには比較的不良な基質であると思われる。多くの状況で、特に、核酸検出方法のための検出策の部分など、特にインビトロ反応の範囲内で、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基を基質として含むオリゴヌクレオチドを使用することが想定される。この研究に使用するリンカーの長さは、市販の一定のヌクレオチドで使用可能であるように６炭素原子であるが、多様な炭素鎖の長さを使用することができ、後続の立体容積が小さく、酵素に対する十分な可塑性をこれらの構造に与える炭素−酸素−炭素構造であると想定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，４３５，５６１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９８７年）２６２（２１）：１０１７ｌ
【非特許文献２】Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら、ＰｌｏｓＢｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）４（７）：ｅ２０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は一部には、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼ、たとえばｆｐｇおよびＮｆｏタンパク質が、塩基が糖のＣ１’位に存在しないが、当該位置に酸素原子を保持しているｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含む部位でＤＮＡ主鎖の切断を触媒することが可能であるという発見に関する。酸素原子は、ｎ個（たとえば１〜８）の炭素原子（つまり、［Ｃ］ｎ）の炭素リンカーの炭素原子に糖を架橋する。したがって、市販のホスホルアミダイトを使用することにより、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含む核酸プローブを構成することができ、相補的核酸と二本鎖を形成する場合、ＡＰエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼ酵素のための基質でよい。様々な部分は、蛍光体、および特定の標的核酸が存在する証拠であるプローブの上手くいった処理を検出するための多くの方法を提示するその他の標識を含むｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎのリンカー部分に結合することができる。出願人は、蛍光分子およびクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を使用し、ｆｐｇもしくはＮｆｏ、またはその他の可能なＡＰエンドヌクレアーゼもしくはリアーゼの標的部位としてｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎを使用してどのようにプローブを構成することができるかを示す。出願人は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基質のその他の用途を他の検出計画で想定している。たとえば、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基は、ヌクレアーゼの活性が標識を遊離させた直後、または後続のプロセスを介するか、もしくは結合体化状態と遊離状態との測定可能な相違を介して検出することが可能な検出可能な標識に結合体化し得る。
【００１３】
一態様では、二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択されるヌクレアーゼと接触させることにより、核酸とともに二本鎖を形成するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドはその３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえば、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化する。
【００１４】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドと核酸とを接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップをさらに含む。実施態様によっては、これは、オリゴヌクレオチドを核酸にハイブリダイズさせることを含む。実施態様によっては、これは、（ｉ）オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼと接触させて、リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を核酸に接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップとを含む。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。
【００１５】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む。実施態様によっては、この検出はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、実施態様によっては、検出は、反応の終点で監視される。
【００１６】
実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方は炭素リンカーに結合体化する。ヌクレアーゼ活性は、結合体化した蛍光体またはクエンチャーをオリゴヌクレオチドから切除し、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差の測定を含む。
【００１７】
別の態様では、標的核酸の存在または不在を検出するプロセスを本明細書で提供する。このプロセスは、以下のステップを含む。（ａ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基またはヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを標的核酸と接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、（ｂ）二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼと接触させて、リンカーを複合体から切除するか、および／またはプローブをｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドにおいて特異的に開裂する、並びに（ｃ）こうした切除または開裂が行われたかどうかを検出する。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の生成物である。実施態様によっては、増幅反応はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、増幅反応は反応の終点で監視される。
【００１８】
実施態様によっては、二本鎖は、プローブを核酸にハイブリダイズさせることによって形成される。実施態様によっては、二本鎖は（ｉ）プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成する、（ｉｉ）リコンビナーゼ／プローブ複合体を核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、ことによって形成される。
【００１９】
実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００２０】
実施態様によっては、プローブは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方が炭素リンカーに結合体化される。たとえば、蛍光体およびクエンチャーは、プローブ中の４〜６個の塩基によって分離される。実施態様によっては、炭素リンカーに結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。ヌクレアーゼ活性は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に関連して結合体化された蛍光体またはクエンチャーをプローブから切除して遊離させ、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００２１】
別の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを本明細書で提供する。実施態様によっては、プローブは、３０〜６０ヌクレオチド長であり、１０ヌクレオチド以下（たとえば、４〜６ヌクレオチド）で分離された蛍光体クエンチャー対を含み、蛍光体またはクエンチャーの何れかがｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化しない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化する。実施態様によっては、プローブは、３０〜４０ヌクレオチド（たとえば、３５ヌクレオチド）長である。
【００２２】
さらに別の態様では、（ｉ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼとを含むキットを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
【００２３】
さらに他の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基およびＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼ（たとえば、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ））を含有するオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を本明細書で提供する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえば、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化する。実施態様によっては、反応混合物は冷凍乾燥、つまり凍結乾燥される。
【００２４】
実施態様によっては、反応混合物は容器をさらに含む。たとえば、反応混合物は、チューブまたは多ウェル容器のウェル内に含むことができる。反応混合物は乾燥させて、ビードもしくはストリップなどの可動性固体支持体、またはウェル上に取り付けることができる。
【００２５】
実施態様によっては、反応混合物は、オリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含む標的またはテンプレート核酸をさらに含む。
【００２６】
本発明のその他の実施態様、目的、態様、特徴および利点は、添付の明細書および請求の範囲から明らかになる。実施態様が、本発明の異なる態様に関して説明されている場合でも、適切であれば、本発明の任意の実施態様を本発明の１つまたは複数の他の実施態様と結合できることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、以下：１’炭素位置にヒドロキシルを含む通常の無塩基部位の化学構造、１’位に水素を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）残基の化学構造、ＤＮＡリボース基のＣ１’と、結合したマーカー部分に対するリンカーとの間の炭素−酸素−炭素架橋の位置を示す、一般的なｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基の化学構造、および最後に、実施例１に使用され、かつｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ構造に適合するｄＲ−ビオチンヌクレオチドの化学構造を記載する。
【図２】図２は、ｄＲ−ビオチンプローブの設計である：プローブ配列に一致する標的配列が増幅されるＲＰＡ反応の際に、Ｎｆｏおよびｆｐｇタンパク質の開裂活性を評価するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブの配列および配置図。オリゴヌクレオチドの配列が指示されている。プライマーは、５’末端にＦＡＭ蛍光体で標識付けされ、配列本体内にｄＲ−ビオチンを含み、２’、３’ジオキシチジン残基によりブロックされる。
【図３】図３は、ヌクレアーゼがないか、またはＮｆｏもしくはｆｐｇ酵素を含む増幅反応の比較である：両方の酵素が、開裂生成物、Ｎｆｏの場合、開裂生成物の伸長によって生じる生成物を迅速に移動させるｄＲ−ビオチン部分を処理することができることを明らかにする。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチドプローブの設計である：オリゴヌクレオチド本体（この場合、３５ヌクレオチド長）、５’クエンチャー修飾（この場合、５’−ＢＨＱ１）、クエンチャーに近接する内部ｄＲ−蛍光体ヌクレオチド（この場合、ｄＲ−ＦＡＭオリゴヌクレオチド位置６）、および３’ポリメラーゼ伸長ブロックを含むプローブ設計の例。
【図５】図５は、感受性および特性を示す：ＤＮＡ ｄＲ−プローブを使用して、指示されたヒトゲノム標的について２回のテンプレート滴定実験をリアルタイムで蛍光監視した結果。どちらの場合も、蛍光信号の増加（０〜３分の基準線に対して）は、テンプレートを含む反応でのみ観察され、非テンプレート対照では観察されない。信号増加の開始時間は、開始テンプレートの量（１０００、１００または１０コピー）と相関する。反応時間は分（Ｘ軸）、蛍光は任意の蛍光単位（Ｙ軸）である。
【図６】図６は、様々なプローブの性能である：図２に概略を示す設計のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いて、指示されたヒトゲノム標的に関するＲＰＡ反応の４セット（重複）をリアルタイムで監視した結果。６〜８分の蛍光の増加は、プローブのｄＲ基（この場合、ｄＲ−ＦＡＭ）のｆｐｇ依存処理から生じ、ＤＮＡ増幅が進行しており、その結果標的ＤＮＡテンプレートの存在を示す。反応時間は分（Ｘ軸）、蛍光は任意の蛍光単位（Ｙ軸）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、付随する以下の説明に記載する。本明細書に記載されている方法および材料に類似するか、または等価な任意の方法および材料を実際に、または本発明の試験に使用することができるが、この方法および材料について説明する。本発明のその他の特徴、目的および利点は、本明細書から明らかであろう。本明細書では、単数形は、文脈上そうではないことが明らかではない限り、複数形も含む。特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本明細書が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先される。
【００２９】
実験室で分析および操作に使用する酵素と合成基質の組合せは先行技術で公知である。グリコシラーゼｆｐｇおよびＮｔｈなどのＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ、並びに大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩおよびエンドヌクレアーゼＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼは、この組合せの良い例である。現在のオリゴヌクレオチド合成法、およびＤＮＡプライマーに組み込まれる既存の多様な合成ヌクレオチドを使用することにより、これらのＤＮＡ修復酵素のための合成基質を生成することは容易である。これらのＤＮＡ修復酵素は様々な目的で容易に使用することができ、最近開拓された１つの目的は、等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応の監視を支援する剤として使用することである。
【００３０】
ＲＰＡは、ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドのリコンビナーゼ媒介標的が、ポリメラーゼによりＤＮＡ合成に結合するプロセスである（米国特許第７，２７０，９８１ Ｂ２号；米国特許第７，３９９，５９０号；米国特許第７，４３５，５６１ Ｂ２号；米国特許第７，４８５，４２８ Ｂ２号；米国特許第 ７，６６６，５９８ Ｂ２号および海外の対応特許）。ＲＰＡは、細胞ＤＮＡ複製および修復機構の構成要素によって決まり、特定のクラウディング剤の存在で達成される高レベルの再結合活性を維持する適切な速度のリコンビナーゼのロードおよびアンロードの両方を有する「動的」再結合環境の確立に依存する。ＲＰＡは、ＰＣＲの感受性、特異性およびその他ほとんどの特徴を結合し、熱サイクリングの必要がなく、異例の速度、および異常温度設定に対する頑健性という利点を有する。ＲＰＡは、熱安定性の等価物が必要であるか、または単鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの付属タンパク質、ＲＰＡ反応の天然成分がない場合は調節が不良であることが実証されているため、他のプロセスには利用されていなかった多様な核酸処理酵素、たとえば公知の修復エンドヌクレアーゼの潜在的な使用から既に利益が得られている。
【００３１】
簡潔に述べると、ＲＰＡは以下のステップを含む：第１に、リコンビナーゼ因子が第１および第２核酸プライマーと接触して、第１および第２核タンパク質プライマーを形成する。第２に、第１および第２核タンパク質プライマーは、二本鎖標的配列と接触して、前記第１鎖の第１部分に第１二本鎖構造を形成し、前記第２鎖の第２部分に二本鎖構造を形成し、よって前記第１核酸プライマーおよび前記第２核酸プライマーの３’末端は、所定のテンプレートＤＮＡ分子上で互いに対して方向付けられる。第３に、前記第１および第２核タンパク質プライマーの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、第１および第２二本鎖核酸、および核酸の第１および第２変位鎖を生成する。最後に、第２および第３ステップは、所望の程度の増幅に達するまで繰り返される。
【００３２】
以前の研究は、ＲＰＡ法のためのプローブシステムの開発で、合成ヌクレオチドテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）がきわめて有用であることを実証している（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ等、２００６年；米国特許第７，４３５，５６１ Ｂ２号）。この塩基類似体は、しばしば無塩基部位を模倣するために使用され、安定しているという自然な利点を有し、天然の無塩基部位の１’ヒドロキシルを水素原子に置き換えることによりヌクレオチドは安定し、瞬間的な開環およびオリゴヌクレオチドの分裂が生じなくなる。この類似体は容易に入手可能であり、オリゴヌクレオチドに組み込むのも安価である。しかし、生化学的機序の違いにより、大腸菌ＡＰエンドヌクレアーゼＮｆｏおよびＥｘｏＩＩＩは合成プライマーのこうしたＴＨＦ残基で開裂することが可能である一方、他のＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼは開裂することができない。これらの後者の酵素は通常、傷害塩基（グリコシラーゼ活性）および／またはヒドロキシル基が糖の１’位（リアーゼ活性）に存在する必要があり、ＴＨＦはその酵素活性に対して完全に不活性である。これらのグリコシラーゼ／リアーゼ酵素は、プローブがＲＰＡ、またはその他の状況および方法で標的ＤＮＡ蓄積に応じて処理される反応などのインビトロ反応にも有用なツールになり得るため、多少厄介になる。より自然な基質、たとえばｆｐｇ用の８−オキソグアニンは、オリゴヌクレオチド内に挿入して、これらのグリコシラーゼ／リアーゼの開裂部位を生成することができるが、これらの修飾は一般に高価であり、さらに、修飾ヌクレオチドに対向することが可能な塩基を制限することが多い。比較的安価で、さらに一般的であり、これらの酵素の基質であるヌクレオチド修飾は、非常に有用であると思われる。
【００３３】
多くの異常な塩基類似体のＤＮＡ修復酵素の基質としての効果を調査するために、完全に塩基が欠如しているが、糖の１’位に炭素−酸素−炭素連結を保持するヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成した。このようなヌクレオチド試薬は容易に入手可能で安価であり、一般に、蛍光体またはビオチンなどの標識基をオリゴヌクレオチドの本体内の複数のオリゴヌクレオチド内に組み込むために使用される。一般に、酸素を介して糖の１’炭素に結合する炭素原子は、多くの場合、最終的に標識基、アミン、または試薬が容易に結合し得るその他の化学的部分（たとえば、チオ）で終端するリンカーの第１炭素原子である。こうした試薬は、文献にはｄＲ−Ｘと記述されることが多く、この場合、ｄＲはデオキシリボースを意味し、Ｘはリンカーアミン、リンカー蛍光体、リンカービオチン、またはいくつかのその他の基または標識である。修復エンドヌクレアーゼが、塩基は欠如しているが、炭素−酸素−炭素共有結合を１’糖位置に保持する構造を認識するかどうか、以前に調査されたことはなかった。ヒドロキシルの欠如は、リアーゼの開環プロセスが、リンカー基を事前に処理し、それに関連して切除することなく実施すべきではないことを意味する。公知のグリコシラーゼは、通常、異常な炭素リンカーではなく傷害塩基に作用するので、これらのｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基はｆｐｇなどのＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼの基質であろうという先例はなかった。
【００３４】
図１は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基の一般的な構造、特に、本明細書で使用され、ベルギーのＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃが市販するオリゴヌクレオチド中に組み込まれるｄＲ−ビオチン試薬の構造を示す。本明細書で使用するこれらの試薬は、１’糖と、オリゴヌクレオチド合成の前または後にその他の試薬を結合するために使用されることが多い窒素原子との間に一般的な６炭素原子リンカーを有する。この研究では、ｄＲ−ビオチンオリゴヌクレオチドのビオチン部分は、この窒素原子を介してアミド結合として結合し、さらに４炭素原子リンカーを通して結合する。この研究に使用されるその他の標識試薬 − ｄＲ−ＦＡＭおよびｄＲ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ − は同様に配置され、この場合、蛍光体は６炭素原子リンカーの末端でアミド結合を通して結合する。
【００３５】
検出可能な標識は、現在の方法で検出できる任意の部分と定義される。これらの標識は、少なくとも蛍光体（蛍光分子、蛍光色素とも呼ばれる）、酵素、クエンチャー、酵素抑制物質、放射性標識、結合対の一員、ジオキシゲニン残基、ペプチド、およびこれらの組合せを含む。
【００３６】
「結合対の一員」とは、第１部分および第２部分の一方を意味し、前記第１部分および第２部分は互いに特異的な結合親和性を有する。本発明に使用するのに適する結合対としては、抗原／抗体（たとえば、ジゴキシゲニン／抗−ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル （ＤＮＰ）／抗−ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗−ダンシル、フルオロセイン／抗−フルオロセイン、ルシファーイエロー／抗−ルシファーイエロー、ペプチド／抗−ペプチド、リガンド／受容体およびローダミン／抗−ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられるが、これらだけに限らない。その他の適切な結合対としては、ポリペプチド、たとえばＦＬＡＧ−ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）［Ｈｏｐｐ 等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４ １２１０（１９８８年）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ 等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１９２ １９４（１９９２年））；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６：１５１６３ １５１６６（１９９１年））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ 等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３ ６３９７（１９９０年））並びにこれらに対する抗体が挙げられる。一般に、好ましい実施態様では、結合対パートナーのより小さい方は、立体配置に関する考察が重要な場合があるため、検出可能な標識として役立つ。
【００３７】
一態様では、二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼに接触させることによって、核酸とともに二本鎖を形成するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００３８】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドを核酸と接触させてオリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップをさらに含む。実施態様によっては、これは、オリゴヌクレオチドを核酸にハイブリダイズさせることを含む。実施態様によっては、これは、（ｉ）オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼと接触させてリコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を核酸と接触させて、オリゴヌクレオチド／核酸二本鎖を形成するステップとを含む。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。
【００３９】
実施態様によっては、このプロセスは、オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む。実施態様によっては、検出はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、検出は、反応の終点で監視される。
【００４０】
実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方は炭素リンカーに結合体化する。ヌクレアーゼ活性は、結合体化した蛍光体またはクエンチャーをオリゴヌクレオチドから切除し、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００４１】
別の態様では、標的核酸の存在または不在を検出するプロセスを本明細書で提供する。このプロセスは、以下のステップを含む：（ａ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基またはヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを標的核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成するステップと、（ｂ）二本鎖をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼと接触させて、リンカーを複合体から切除するか、および／またはプローブをｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドで特異的に開裂するステップと、（ｃ）こうした切除または開裂が生じたかどうかを検出するステップ。実施態様によっては、核酸は、核酸増幅反応（たとえば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））の生成物である。実施態様によっては、増幅反応はリアルタイムで監視される。実施態様によっては、増幅反応は反応の終点で監視される。
【００４２】
実施態様によっては、二本鎖は、プローブを核酸にハイブリダイズさせることによって形成される。実施態様によっては、二本鎖は、（ｉ）プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成する、（ｉｉ）リコンビナーゼ／プローブ複合体を核酸に接触させて、プローブ／核酸二本鎖を形成する、ことによって形成される。
【００４３】
実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。
【００４４】
実施態様によっては、プローブは蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体またはクエンチャーの一方が炭素リンカーに結合体化される。たとえば、蛍光体およびクエンチャーは、プローブ中の４〜６個の塩基によって分離される。実施態様によっては、炭素リンカーに結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。ヌクレアーゼ活性は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に関連して結合体化された蛍光体またはクエンチャーをプローブから切除して遊離させ、検出ステップは、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む。
【００４５】
別の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを本明細書で提供する。実施態様によっては、プローブは、３０〜６０ヌクレオチド長であり、１０ヌクレオチド以下（たとえば、４〜６ヌクレオチド）で分離された蛍光体クエンチャー対を含み、蛍光体またはクエンチャーの何れかがｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合体化されない蛍光体またはクエンチャーは、プローブの末端（たとえば、５’末端）に結合体化される。実施態様によっては、プローブは、３０〜４０ヌクレオチド（たとえば、３５ヌクレオチド）長である。
【００４６】
さらに別の態様では、（ｉ）ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を含むオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼとを含むキットを本明細書で提供する。実施態様によっては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である。
【００４７】
さらに他の態様では、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基、およびＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼから選択したヌクレアーゼ（たとえば、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ））を含有するオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を本明細書で提供する。実施態様によっては、リンカーは、３〜６炭素原子リンカー（たとえば、６炭素原子リンカー）である。実施態様によっては、オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する。実施態様によっては、リンカーは、検出可能な標識（たとえばビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体または量子ドット）に結合体化される。実施態様によっては、反応混合物は冷凍乾燥、つまり凍結乾燥される。
【００４８】
実施態様によっては、反応混合物は容器をさらに含む。たとえば、反応混合物は、チューブまたは多ウェル容器のウェル内に含むことができる。反応混合物は乾燥させるか、またはビードもしくはストリップなどの可動性固体支持体、またはウェル上に取り付けることができる。
【００４９】
実施態様によっては、反応混合物は、オリゴヌクレオチドに対して相補的である配列を含む標的またはテンプレート核酸をさらに含む。
【００５０】
図２は、プローブに指定される配列を含むＤＮＡ分子を標的として使用して、ＲＰＡのＤＮＡ増幅反応に使用するために生成されるｄＲ−ビオチンプローブの一次配列、およびおおまかなその性質の両方を示す。プローブはブロックされ（増幅段階でポリメラーゼ伸長を防止するため）、内部ｄＲ−ビオチンを酵素の試験基質として含む。プローブは、５’−ＦＡＭも含む。したがって、原則として、ＤＮＡが、このプローブを含む反応で増幅される場合、プローブが、増幅時に形成された相補的単鎖に対する「従来の」ハイブリダイゼーションにより、またはリコンビナーゼ媒介プロセスにより、増幅されたＤＮＡと特異的に結合して相互作用する可能性がある。こうした実験の結果を図３に示し、以下の実施例１で説明する。
【００５１】
第２セットの実験は、この開裂活性の普遍性を調査するために実施され、この場合、蛍光試薬を使用し、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドは、図４に示すように蛍光体に結合する。この場合、ｄＲ−蛍光体は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近に位置し、その５’末端に結合するクエンチャーにきわめて接近して位置する。従来どおり、プローブの３’末端は異常な伸長またはプライマーのアーティファクトを防止するために適切にブロックされる。図４に示すように、プローブは、相補的増幅材料とハイブリダイズする場合、ｆｐｇ（またはＮｆｏ）の基質になる可能性があり、この場合、この位置で主鎖を開裂することができる（そして、グリコシラーゼ活性がｆｐｇまたはその他の非ＡＰエンドヌクレアーゼ酵素中に存在する場合、オリゴヌクレオチドの断片から分離した水媒体中に潜在的に蛍光体を直接遊離させる）。開裂が生じる場合、蛍光体およびクエンチャーが物理的に分離し、その結果、大腸菌ＮｆｏまたはｅｘｏＩＩＩタンパク質を使用してＴＨＦベースの蛍光プローブに関して前に説明した方法に類似する方法で、検出可能な蛍光が増加する。図５および図６はこうした実験の結果を示し、公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）領域を特異的に対象としたプライマーおよびプローブを使用して、ＲＰＡ反応をヒトゲノム標的に関して実施した実施例２で説明されている。
【００５２】
これらの実験は、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基はＮｆｏおよびｆｐｇヌクレアーゼの基質であることを全体的に明確に証明する。さらに、相補的核酸鎖が蓄積して二本鎖の形成が可能になり、それによって、増幅が蛍光またはその他の機序によって生じたかどうかの判断を可能にする状況でのみ、プローブのヌクレアーゼ活性が生じるような基を含むプローブを構成することが可能である。したがって、これらのｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチド試薬は、ｆｐｇ、Ｎｆｏまたはグリコシラーゼ／リアーゼ、および多様な用途の等価な酵素と組み合わせて広く応用することができる。
【００５３】
配列に関するすべての引用、言及、特許、特許出願、その他の引用文献は、引用することにより本明細書に包含する。
【実施例】
【００５４】
本発明について、以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、具体的に説明するために記載されているにすぎないと考えるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて様々な用途および条件に適合させることができる。
【００５５】
実施例１
内部ｄＲ−ビオチンを含むオリゴヌクレオチドプローブは、Ｎｆｏおよびｆｐｇにより切断される。
【００５６】
この実施例では、図２に大まかに示され、内部ｄＲ−ビオチンを含むオリゴヌクレオチドプローブは、Ｎｆｏおよびｆｐｇにより切断することができる。この反応（全量１５０μＬ）は新鮮な試薬から混合し、７５分間にわたって３７℃で培養する。使用した条件は、５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ ７．９）、１４ｍＭのＭｇ−アセテート、１００ ｍＭのカリウムアセテート、２ｍＭのＤＴＴ、それぞれ２００ｎＭのｄＮＴＰ、６％ＰＥＧ ３５，０００、３ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのクレアチンリン酸、９００ｎｇ／μＬのＴ４ｇｐ３２、１２０ｎｇ／μＬのＴ４ｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのＴ４ｕｖｓＹ、３６０ｎｇ／μＬの枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩであった。ＤＮＡテンプレート３０００コピーまたは水（負の対照として）は、指示どおりに加えた。ヌクレアーゼ、２００ｎｇ／μＬのＮｆｏまたは５０ｎｇ／μＬのｆｐｇは、指示どおりに加えた。プライマー、Ｋ２およびＪ１は、それぞれ４８０ｎＭで含め、プローブ、ＦｐｇＰｒｏｂ１は１２０ｎＭで加え、これらの配列は以下のとおりである。サンプルは、１容積の２％ＳＤＳ／１容積のフェノール中で急冷し、２０分間にわたって６５℃で培養した。その後、サンプルは、標準の分子生物学的技術によりフェノール／クロロフォルム抽出し、２回エタノール沈殿させた。次に、各々のサンプルの半分は、１６．５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素）上でホルムアミドのローディングバッファーに再懸濁させ、標準のプロトコルに従って視覚化した（ＦＡＭ蛍光を使用して）。マーカーは、２ｐｍｏｌのプローブおよび２ｐｍｏｌの３２ｎｔマーカーオリゴヌクレオチドであった。
【００５７】
【化１】
プローブおよび何らかの生物は、本明細書では、紫外線照射して活性化した場合、可視光を放出するＦＡＭ部分により視覚化した。標的ＤＮＡ、２つの適切な増幅プライマー、ｄＲ−ビオチンプローブ、およびヌクレアーゼなし、Ｎｆｏタンパク質またはｆｐｇタンパク質のいずれかを含む増幅反応（ＲＰＡ）は、培養後に洗浄し、変性アクリルアミドゲル上でサイズ別に分離した後、紫外線に曝露した。次に、５’−ＦＡＭを保持するプローブまたは何らかの派生物が視覚化される（図３）。添加ヌクレアーゼが存在しない場合、４２ヌクレオチド長のプローブはほとんど、３２ヌクレオチド（指示）の対照標識付きプライマーより緩慢にその予想位置に移動する。わずかに緩慢に移動する（長めの）断片も、ＲＰＡ中で培養されない適切なプローブ（♯１）と比べて観察される。これはおそらく、酵素調合物の一部に存在すると考えられるヌクレアーゼ（３’末端で徐々に減少する）によって、プローブのブロックが徐々に解除され、一度ブロックが解除されると、増幅標的に対するハイブリダイゼーション後に拡張可能であり、この種のネスト化した複製配列を形成するために生じる。しかし、Ｎｆｏが存在すると、この現象は予想よりはるかに顕著になり、プローブの大部分が伸長する。さらに、少量の比較的迅速に移動するプローブＤＮＡ（♯２）も見え、その後の伸長を伴わないｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ位置における開裂を示すため、Ｎｆｏタンパク質は、３’末端を単に「研磨する」のではなく、実際にｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基を攻撃していた。最後に、ｆｐｇタンパク質が反応環境に含まれる場合、ｆｐｇは、開裂後にブロック３’−末端を離れ、その結果、混合物中に存在するポリメラーゼ酵素によって伸長しないため、比較的迅速に移動する開裂プローブの大部分が見え、伸長した材料は検出されない。
【００５８】
実施例２
内部ｄＲ蛍光体を含むオリゴヌクレオチドプローブによるＤＮＡ増幅
この実施例では、ＲＰＡは、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドが図４に示すように蛍光体に結合する蛍光試薬を使用して実験する。この場合、ｄＲ蛍光体は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近に位置し、その５’末端に結合するクエンチャーにきわめて接近して位置する。従来の実施例のとおり、プローブの３’末端は異常な伸長またはプライマーのアーティファクトを防止するために適切にブロックされる。
【００５９】
この反応（全量５０μＬ）は、冷凍−乾燥反応に関する標準ＲＰＡプロトコルに従って実施された。簡潔に述べると、凍結乾燥試薬はＰＥＧ、マグネシウム−アセテートおよびテンプレートと混合し、蛍光光度計内で３８℃で２０分間にわたって培養した（Ｔｗｉｓｔａプロトタイプ；ＥＳＥ ＧｍｂＨ、ドイツ）。使用した条件は、５０ｍＭのトリス／アセテート（ｐＨ ８．３）、１４ｍＭのマグネシウム−アセテート、１００ｍＭのカリウム−アセテート、５ｍＭのＤＴＴ、それぞれ２４０ｎＭのｄＮＴＰ、５％のＰＥＧ ３５，０００、４％トレハロース２．５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭのホスホ−クレアチン、３００ｎｇ／μＬのｒｂ６９ｇｐ３２、２７３ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、１２０ｎｇ／μＬ ｕｖｓＹ、５０ｎｇ／μＬの黄色ブドウ状球菌ＤＮＡポリメラーゼＩであった。図５の実験では、１０００、１００、１０ または０コピーのＤＮＡテンプレートを図に示されているように包含し、図６の実験では１０００コピーのＤＮＡテンプレートを包含した。２５ｎｇ／μＬのｆｐｇヌクレアーゼを包含した。プライマーは、それぞれ３６０ｎＭで包含し、プローブは１２０ｎＭで包含し、それぞれの配列は以下のとおりであった。蛍光は２０秒ごとに測定した（励起４７０ｎＭ、発光５２０ｎＭ）。サンプルは、４分間の培養時間で短時間の混合／回転を行って培養器から取り出し、培養器／蛍光光度計に戻した。分の時間に対して任意の蛍光単位をプロットした。
【００６０】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓ４８２４８７１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ２およびＲ１並びにプローブは、以下のとおりであった。
【００６１】
【化２】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓｌ２０７４４５の場合、使用したプライマーの配列Ｆ２およびＲ２並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６２】
【化３】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓｌ１０５５６１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ１およびＲ１並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６３】
【化４】
ヒトゲノムの遺伝子座ｒｓ５９２３９３１の場合、使用したプライマーの配列Ｆ１およびＲ１並びにプローブは、以下の通りであった。
【００６４】
【化５】
図５および６は、上記の実験の結果を示し、ＲＰＡ反応は、公知のＳＮＰ領域を特異的に対象としたプライマーおよびプローブを使用して、ヒトゲノム標的に関して実施した。図５では、このような２つのゲノム領域は、ｆｐｇタンパク質の封入と共に、ＲＰＡおよび図４に示されている一般的な構造を持つプローブを使用して増幅した。標的ゲノムＤＮＡは、合計標的コピー数を１０００、１００、１０またはゼロ標的分子にするために追加し、こうして、標的に一致する単位複製配列の特異的な蓄積要件が確保される。６〜１２分後（標的およびコピー数に応じて）、標的を含むこれらのサンプルの蛍光は明らかに上昇するが、標的が欠如しているサンプルは事実上蛍光は安定していることに注意する。図６では、４つのヒトゲノムＤＮＡ標的／プローブのセット（そのうち２つは図５にも使用されている）に関して類似のデータが示されており、何れの場合も、蛍光はＤＮＡ増幅のほぼ予想時間に上昇している。上記およびその他の好結果のプローブのほかに、ＲＰＡ増幅／検出システムで十分に作用しなかったと思われるプローブが時折みられたが（おそらく、分析したプローブの１０〜２０％）、こうした欠陥の原因は未だ明らかではなく、場合によってはプローブの欠陥ではなく、可能性として他の場合のプローブの欠陥の結果としてＲＰＡ増幅の欠陥を表していることが考えられる。場合によっては、近接塩基の位置および性質、またはｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ基に対向する塩基の性質が、プローブの効果に影響した可能性があると考えられる。
【００６５】
本明細書で特定の実施態様について詳細に開示しているが、これは、具体的に示すために一例として説明したのであって、添付の請求の範囲の範囲に関して制限することを意図しているのではない。特に、発明人は、請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に様々な置き換え、変更および修飾が施されることを意図している。その他の態様、利点および修正は、添付の請求項の範囲内と考えられる。提示される請求の範囲は、本明細書で開示されている本発明を表す。請求されていないその他の発明も想定されている。出願人は、かかる発明を後の請求の範囲で追跡する権利を留保する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の存在または不在を検出するプロセスであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸に接触させ、それにより前記プローブと前記標的核酸との間に複合体を形成するステップであって、前記プローブは、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合する、ステップと、
（ｂ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択したヌクレアーゼに前記プローブ／核酸複合体を接触させるステップであって、前記ヌクレアーゼが、前記リンカーを前記複合体から切除するか、および／または前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドで前記プローブを特異的に開裂する、ステップと、
（ｃ）前記切除または開裂が行われたかどうかを検出するステップと
を含むプロセス。
【請求項２】
前記標的核酸が核酸増幅反応の生成物である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記増幅反応がリアルタイムで監視される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記増幅反応が前記反応の終点で監視される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記増幅反応がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスである、請求項２〜５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、前記プローブを前記標的核酸にハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（ａ）が、（ｉ）前記プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）前記リコンビナーゼ／プローブ複合体を前記核酸に接触させて、前記プローブ／標的核酸複合体を形成するステップとを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項１〜７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
ｎが３〜６である、請求項１〜８の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
ｎが６である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プローブが、その３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項１〜１１の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が蛍光体であり、前記プローブがクエンチャーにさらに結合体化されるか、または前記検出可能な標識がクエンチャーであり、前記プローブが蛍光体にさらに結合体化される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記プローブにさらに結合体化する前記クエンチャーまたは蛍光体が、前記プローブの一方の端部に結合体化する、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記プローブの前記結合体化した末端が５’末端である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
ヌクレアーゼ活性が、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合した前記蛍光体またはクエンチャーを切除して遊離させ、前記検出ステップが、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む、請求項１４〜１６の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記蛍光体およびクエンチャーが４〜６塩基離れている、請求項１４〜１７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
核酸を含む複合体のオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスであって、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼに接触させるステップを含み、
前記オリゴヌクレオチドが、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合し、
前記ヌクレアーゼが、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドにおいて前記プローブを特異的に開裂するプロセス。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
ｎが３〜６である、請求項１９または請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
ｎが６である、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する、請求項１９〜２２の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項１９〜２３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記プロセスが、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させて、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体を形成するステップをさらに含む、請求項１９〜２５の何れかの１項
に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記標的核酸が核酸増幅反応の生成物である、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記増幅反応がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させるステップが、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸にハイブリダイズさせるステップを含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させるステップが、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼに接触させてリコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）前記リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を前記核酸に接触させて、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体を形成するステップとを含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む、請求項１９〜２５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項３２】
検出がリアルタイムで監視される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
検出が、前記反応の終点で監視される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３４】
（ｉ）前記リンカーが蛍光体に結合体化され、かつ前記オリゴヌクレオチドがクエンチャーにさらに結合体化されるか、または（ｉｉ）前記リンカーがクエンチャーに結合体化され、かつ前記オリゴヌクレオチドが蛍光体にさらに結合体化される、のいずれかである、請求項３１〜３３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項３５】
ヌクレアーゼ活性が、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合した前記蛍光体またはクエンチャーを切除して遊離させ、前記検出ステップが結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３６】
３０〜６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記オリゴヌクレオチドが、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合し、前記オリゴヌクレオチドが、１０ヌクレオチド以下離れた蛍光体−クエンチャーの対を含み、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドが、前記蛍光体または前記クエンチャーに結合体化される、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】
ｎが３〜６である、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項３８】
ｎが６である、請求項３７に記載のプローブ。
【請求項３９】
前記プローブがその３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４０】
前記蛍光体およびクエンチャーが４〜６塩基離れている、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４１】
前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドに結合体化されていない前記蛍光体またはクエンチャーが、前記プローブの一方の末端に結合体化している、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４２】
前記プローブの前記結合体化した末端が５’末端である、請求項４１に記載のプローブ。
【請求項４３】
キットであって、
（ｉ）塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合する、オリゴヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼを含む、キット。
【請求項４４】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドであって、前記１’位の炭素が、酸素原子を介して、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に共有結合する、オリゴヌクレオチド、ならびに
ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼ
を含む、反応混合物。
【請求項４６】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項４７】
ｎが３〜６である、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項４８】
ｎが６である、請求項４７に記載の反応混合物。
【請求項４９】
前記プローブがその３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項５０】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項５１】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項５０に記載の反応混合物。
【請求項５２】
前記反応混合物が凍結乾燥される、請求項４５〜５１の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項５３】
容器をさらに含む、請求項４５〜５２の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項５４】
前記容器がチューブである、請求項５３に記載の反応混合物。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む標的核酸をさらに含む、請求項４５〜５４の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項１】
標的核酸の存在または不在を検出するプロセスであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸に接触させ、それにより前記プローブと前記標的核酸との間に複合体を形成するステップであって、前記プローブは、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合する、ステップと、
（ｂ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択したヌクレアーゼに前記プローブ／核酸複合体を接触させるステップであって、前記ヌクレアーゼが、前記リンカーを前記複合体から切除するか、および／または前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドで前記プローブを特異的に開裂する、ステップと、
（ｃ）前記切除または開裂が行われたかどうかを検出するステップと
を含むプロセス。
【請求項２】
前記標的核酸が核酸増幅反応の生成物である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記増幅反応がリアルタイムで監視される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記増幅反応が前記反応の終点で監視される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記増幅反応がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスである、請求項２〜５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、前記プローブを前記標的核酸にハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（ａ）が、（ｉ）前記プローブをリコンビナーゼに接触させて、リコンビナーゼ／プローブ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）前記リコンビナーゼ／プローブ複合体を前記核酸に接触させて、前記プローブ／標的核酸複合体を形成するステップとを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項１〜７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
ｎが３〜６である、請求項１〜８の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
ｎが６である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プローブが、その３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項１〜１１の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が蛍光体であり、前記プローブがクエンチャーにさらに結合体化されるか、または前記検出可能な標識がクエンチャーであり、前記プローブが蛍光体にさらに結合体化される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記プローブにさらに結合体化する前記クエンチャーまたは蛍光体が、前記プローブの一方の端部に結合体化する、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記プローブの前記結合体化した末端が５’末端である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
ヌクレアーゼ活性が、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合した前記蛍光体またはクエンチャーを切除して遊離させ、前記検出ステップが、結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む、請求項１４〜１６の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記蛍光体およびクエンチャーが４〜６塩基離れている、請求項１４〜１７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
核酸を含む複合体のオリゴヌクレオチドを開裂するプロセスであって、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体をＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼに接触させるステップを含み、
前記オリゴヌクレオチドが、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合し、
前記ヌクレアーゼが、ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドにおいて前記プローブを特異的に開裂するプロセス。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
ｎが３〜６である、請求項１９または請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
ｎが６である、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、３’末端でブロックされて、ポリメラーゼ伸長を防止する、請求項１９〜２２の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項１９〜２３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記プロセスが、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させて、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体を形成するステップをさらに含む、請求項１９〜２５の何れかの１項
に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記標的核酸が核酸増幅反応の生成物である、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記増幅反応がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させるステップが、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸にハイブリダイズさせるステップを含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に接触させるステップが、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼに接触させてリコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を形成するステップと、（ｉｉ）前記リコンビナーゼ／オリゴヌクレオチド複合体を前記核酸に接触させて、前記オリゴヌクレオチド／核酸複合体を形成するステップとを含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドの開裂を検出するステップをさらに含む、請求項１９〜２５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項３２】
検出がリアルタイムで監視される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
検出が、前記反応の終点で監視される、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３４】
（ｉ）前記リンカーが蛍光体に結合体化され、かつ前記オリゴヌクレオチドがクエンチャーにさらに結合体化されるか、または（ｉｉ）前記リンカーがクエンチャーに結合体化され、かつ前記オリゴヌクレオチドが蛍光体にさらに結合体化される、のいずれかである、請求項３１〜３３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項３５】
ヌクレアーゼ活性が、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎ残基に結合した前記蛍光体またはクエンチャーを切除して遊離させ、前記検出ステップが結合体化状態と遊離状態との間の蛍光性に差がある場合、その差を測定することを含む、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３６】
３０〜６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記オリゴヌクレオチドが、塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含み、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合し、前記オリゴヌクレオチドが、１０ヌクレオチド以下離れた蛍光体−クエンチャーの対を含み、前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドが、前記蛍光体または前記クエンチャーに結合体化される、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】
ｎが３〜６である、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項３８】
ｎが６である、請求項３７に記載のプローブ。
【請求項３９】
前記プローブがその３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４０】
前記蛍光体およびクエンチャーが４〜６塩基離れている、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４１】
前記ｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドに結合体化されていない前記蛍光体またはクエンチャーが、前記プローブの一方の末端に結合体化している、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４２】
前記プローブの前記結合体化した末端が５’末端である、請求項４１に記載のプローブ。
【請求項４３】
キットであって、
（ｉ）塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、前記１’位の炭素が、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に酸素原子を介して共有結合する、オリゴヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼを含む、キット。
【請求項４４】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
塩基を欠き、かつ１’位に炭素がある糖を有するｄＲ−Ｏ−［Ｃ］ｎヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドであって、前記１’位の炭素が、酸素原子を介して、ｎ個の炭素原子を含むリンカーの炭素原子に共有結合する、オリゴヌクレオチド、ならびに
ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼ
を含む、反応混合物。
【請求項４６】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）または８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）である、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項４７】
ｎが３〜６である、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項４８】
ｎが６である、請求項４７に記載の反応混合物。
【請求項４９】
前記プローブがその３’−末端でブロックされてポリメラーゼ伸長を防止する、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項５０】
前記リンカーが検出可能な標識に結合体化する、請求項４５に記載の反応混合物。
【請求項５１】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ジオキシゲニン、ペプチド、蛍光体、クエンチャー、抗体および量子ドットからなる群より選択される、請求項５０に記載の反応混合物。
【請求項５２】
前記反応混合物が凍結乾燥される、請求項４５〜５１の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項５３】
容器をさらに含む、請求項４５〜５２の何れか１項に記載の反応混合物。
【請求項５４】
前記容器がチューブである、請求項５３に記載の反応混合物。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む標的核酸をさらに含む、請求項４５〜５４の何れか１項に記載の反応混合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２７２３９（Ｐ２０１２−５２７２３９Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１９５８（Ｐ２０１２−５１１９５８）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５３１０
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５００２０４５７７）バイオサイト インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５３１０
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５００２０４５７７）バイオサイト インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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