ＤＮＡセグメント及び多糖類の高生産方法
【課題】スフィンゴモナス菌株を操作してスフィンガンの大量生産菌を生産する方法、細菌がスフィンガンを増産する際に有用なＤＮＡフラグメントの同定方法と利用方法、ならびに大量生産菌を提供する。
【解決手段】スフィンゴモナス菌株がスフィンガン多糖類を増産するために用いられるＤＮＡセグメント又はフラグメントを、スフィンゴモナス菌株から単離し、その多数のコピーを他の菌株に挿入し、スフィンガン多糖類の大量生産菌を生産する。
【解決手段】スフィンゴモナス菌株がスフィンガン多糖類を増産するために用いられるＤＮＡセグメント又はフラグメントを、スフィンゴモナス菌株から単離し、その多数のコピーを他の菌株に挿入し、スフィンガン多糖類の大量生産菌を生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス属菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ）のスフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）多糖類の生合成生産に関与し、且つこのスフィンゴモナス属菌から単離されるＤＮＡ配列、及びそのフラグメントに関する。単離されたＤＮＡフラグメントの多数のコピーをスフィンゴモナス属菌又は関連菌の同じ又は異なる菌株に挿入して、多糖類、好ましくはスフィンガンを増産することができる。このような操作により外因性ＤＮＡを含有する細菌の多糖類生産量は、同一の発酵条件下で、操作をしない細菌よりも有意に大きくなる。さらに、本発明はスフィンゴモナス属菌、その他の関連菌の菌株を操作して多糖類の大量生産菌とする方法、ならびにこのようにして操作された細菌に関する。さらにまた、スフィンゴモナス属菌がスフィンガン多糖類を増産するために有用なＤＮＡ配列の同定方法及び単離方法も説明する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物がエクソポリサッカライド類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、あるいはＥＰＳとしても知られている細胞外多糖類を生産する。エクソポリサッカライド類には、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ）及び「スフィンガン類」として知られている一群の多糖類が含まれるている。「スフィンガン類」はスフィンゴモナス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）のグラム陰性菌によって生産される。
【０００３】
「スフィンガン類」は莢膜多糖類で、構造は互いに似ているが同一ではなく、スフィンゴモナス属細菌によって分泌される（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｔ．Ｊ．１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：１９３９−１９４５）。スフィンガンはそれぞれ異なる側基を持っているが、主鎖のある場所では、Ｌ−ラムノースかＬ−マンノースのどちらかが存在する。Ｌ−マンノースそのものは天然では非常に稀である。ポリマーの水溶液には独特で有用な流動特性がある（Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ，Ｒ．１９８７，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”ｐ１８９−２０６． Ｉｎ Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ（ｅｄ．），Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照されたい）。ポリマーの構造を変えることによって、どのようにして異なる流動特性が生じるのかまだ分かっていない。
【０００４】
キサントモナス カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）はグラム陰性菌で、エクソポリサッカライドの一つであるキサンタンガムを構成的に大量生産する（Ｊｅａｎｅｓ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．，５, ５１９〜５２６，１９６１）。キサンタンガムの生合成については、産業上の重要性からかなり詳細な研究がなされてきた。最近にいたり、新しい細菌性エクソポリサッカライドであるジェラン（ｇｅｌｌａｎ）がゲル化剤として開発された。ジェランは、Ｓ−８８（Ｋａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｅｄｅｒ, 米国特許第４, ５３５, １５３号を参照）、ウエラン（ｗｅｌａｎ）（Ｋａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｅｄｅｒ, 米国特許第４, ３４２, ８６６号を参照）、ＮＷ１１（Ｒｏｂｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｔｉｐａｎｏｖｉｃ, 米国特許第４,８７４, ０４４号を参照）、ラムザン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｐｅｉｋ ｅｔ ａｌ., 米国特許第４, ４０１, ７６０号を参照）、Ｓ−１９８（Ｐｅｉｋ ｅｔａｌ., 米国特許第４, ５２９, ７９７号を参照）、Ｓ−６５７（Ｐｅｉｋｅｔ ａｌ., 欧州特許出願第２０９２７７Ａ１号を参照）、及びヘテロポリサッカライド−７（Ｋａｎｇ ａｎｄ ＭｃＮｅｅｌｙ, 米国特許第４, ３４２, ８６６号を参照）を含む関連多糖類の一群に分類されている一つである。
【０００５】
上記の引例ではスフィンガン多糖類組成に関する特許が数件含まれている。これらの特許はいずれも本発明の対象とはなんら関連性もない。
【０００６】
【表１】
【０００７】
スフィンガン多糖類の化学構造は、すべてある程度の関連性がある。スフィンガン各々の主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−マンノース及びＬ−ラムノースの四つの糖の関連性のある配列からなっている。スフィンガン群の多糖類は、ポリマーの主軸（主鎖）と側鎖を含む炭水化物によって互いに区別することができる。スフィンガンの構成糖には、アセチル基又はピルビル（ｐｙｒｕｖｙｌ）基が結合している場合もある。
【０００８】
各種のスフィンガン類は、特殊ポリマーとして、あるいは繊維への応用、食品、化粧品、紙、ペンキ、セメントの添加剤、例えば粘度調整剤として、あるいは各種のコーティングへの応用において、さらには石油製品の接着剤や添加剤、特殊化学薬品として有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明がなされるに至った研究の初期段階では、代表的なスフィンガン多糖類であるＳ−８８の生合成第一工程が重要な課題であった。このスフィンガンは、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８によって生合成される。本研究以前では、スフィンガン以外の細菌性多糖類の生合成のすべてではないが、一部の製法において、リン酸イソプレニルを担体として使用されることが知られていた。例えば、Ｘ. カンペストリスが生合成するキサンタンガムの場合、キサンタンガムの主鎖にはグルコースしか含まれていないので、合成第一工程ではおそらくＵＤＰ−グルコースのグルコース−リン酸をＣ５５−イソプレニルリン酸（ＩＰ）担体に転移させる必要がある。Ｉｅｌｐｉら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１３０, ２５３，１９８２及びＪ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ，１７５, ２４９０，１９９３）は、無細胞取り込み検定を行って、グルコースの次に第二のグルコース、その後、マンノース、グルクロン酸、そしてマンノースの順序でＩＰ担体に連続添加して、キサンタンガムの繰り返し単位が構成されていることを確認した。まったく同様にして、エスチェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）のコレニン酸のサブユニットの繰り返し単位も、まずグルコース−Ｐを担体ＩＰに転移することにより構成されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２９, ２２５，１９７７）。対照的に、リゾビウム メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）によるスクシノグリカン（ｓｕｃｃｉｎｏｇｌｙｃａｎ）多糖類の合成の場合には、まずガラクトース−ＰをＩＰに転移している（Ｔｏｌｍａｓｋｙ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２５７, ６７５１，１９８２を参照）。しかしながら、イソプレニル担体は、デキストランあるいはレバン（ｌｅｖａｎ）多糖類の合成には関与しないので、アルギン酸塩の合成におけるイソプレニル担体の役割は分かっていない。
【００１０】
本発明の研究以前では、多糖類生合成の複合反応速度論（ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）から見て、担体の役割が重要であることについては分かっていなかった。さらに、スフィンゴモナス菌がスフィンガン多糖類を合成する全体を通して、イソプレニルリン酸担体がどんな役割を果たしているのかも分かっていなかった。
【００１１】
同時にＢａｃr でもありＧｕｍ- でもある（バシトラシン耐性とキサンタンガム陰性）Ｘ. カンペストリス変異菌の特別クラスは、ＵＤＰ−Ｇｌｃのグルコース−ＰがＩＰに転移してＧｌｃ−ＰＰＩを形成するのに必要なｇｕｍＤ遺伝子中に認められることが、遺伝子相補性検定によって以前から証明されていた。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ.１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７, Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ, ｅｔ ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ”, ｐ. １４５〜１５６, ｉｎ Ｖ. Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ, ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ, Ｇｏｒｄｏｎａｎｄ Ｂｒｅａｃｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｎ. Ｅ. Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｙ. Ｎ. Ｐａｔｅｌ, １９９３, Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ, Ｖｏｌ. ７, Ｎｕｍｂｅｒ７）。後者の引例では、生産能がない変異菌がスフィンガンＳ−６０の合成を復活できるＤＮＡフラグメントを開示しているが、合成量が野生型菌株より大きいか、否かについては触れられていない。さらにまた、Ｘ. カンペストリスの野生型ｇｕｍＤ遺伝子によって、スフィンゴモナス菌株のＳ８８とＮＷ１１の相似菌であるＢａｃr Ｓｐｓ- （スフィンガン多糖類陰性）変異菌がスフィンガン類の合成を復活できることが実験で証明された。さらに、Ｂａｃr Ｓｐｓ- スフィンゴモナス変異菌は、グルコース−ＰがＩＰに転移するのを阻害されるらしいと示唆された。
【００１２】
本発明の目的は、スフィンゴモナス属菌から単離されて、多くの微生物、及び特に多くのスフィンゴモナス菌株が、スフィンガン多糖類を増産するために用いられるＤＮＡセグメントを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、スフィンガン多糖類の生産量が操作されていない菌株よりも有意に大きい、微生物、及び特に多くのスフィンゴモナス菌株から得られる大量生産菌株を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、スフィンガン多糖類大量生産菌である微生物の菌株、及び特にスフィンゴモナス属菌の菌株の生産方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、ＤＮＡセグメントを単離してスフィンゴモナス菌株に挿入することにより、このようにして操作された微生物がスフィンガン多糖類大量生産菌となる方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のこれらの目的及び／又は他の目的は、次に述べる本発明の説明によって容易に理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のＤＮＡ配列は、セグメントあるいはフラグメントのいずれも、スフィンガン生産能を持つ細菌、一般にはスフィンゴモナス菌株から単離する。このようにして得た遺伝子材料は、クローニングした後、多数のコピーをスフィンガン生産能を持つ、あるいは生産能をもたないスフィンゴモナス又は関連菌の変異体に組み入れる。このようなＤＮＡ配列は、スフィンガンを生産しない変異菌のスフィンガン生産を復活するのに有用であることが立証されている。さらに、予期していないことであったが、これらの変異菌はスフィンガンを生産できるばかりでなく、スフィンガン生産量が、本来スフィンガンを生産できる野生型菌株に期待されている生産量よりも有意に大きいことが見いだされた。
【００１８】
さらにまた、ＤＮＡセグメントあるいはフラグメントをスフィンゴモナスの一菌株から単離し、多数のコピーをスフィンガン生産能を持つ、あるいは生産能を持たない同じスフィンゴモナス変異菌株又は異なる菌株に挿入すると、このようにして操作した細菌がスフィンガンの大量生産菌となることを発見できたことも、予期していないことであった。この発見は特に次の点で思いもよらないものであった。すなわち、ＤＮＡセグメント又はフラグメントを、例えば、スフィンゴモナスＳ６０から単離して、スフィンゴモナスＳ８８の野生型あるいは非ムコイド性変異菌に挿入すると、この操作によってＳ−８８スフィンガンの大量生産菌ができ、しかも生産されるＳ−８８は一般にＳ−６０スフィンガンが混入していない。この相補性はスフィンゴモナスの各種菌株間でかなり広く適用したり（菌株間相補性）、またキサントモナス カンペストリスのキサンタンガム生産にも適用できる可能性がある（属間相補性）。
【００１９】
さらにまた本発明者らは、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株からＤＮＡセグメント又はフラグメントを単離して組み入れる操作によって、大量生産能を持つスフィンゴモナス菌株を生産する方法を発見した。スフィンガン生産能を持つ細菌から単離したＤＮＡは、まずクローニングした後、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株、又はスフィンガン生産能を持つ菌株から派生した非ムコイド性変異体に挿入する。
【００２０】
さらに本発明は、上記の単離したＤＮＡセグメント又はフラグメントを挿入することにより得た、操作されているスフィンゴモナス菌を包含している。これらの操作されている細菌は、本発明により単離されたＤＮＡセグメント又はフラグメントの多数のコピーを含有している。本発明により操作された細菌は、スフィンガンの大量生産菌である。
【００２１】
本発明によれば、ＤＮＡフラグメントは、当業者が容易に利用できる技術により単離回収して、クローニングすることができる。その後、ＤＮＡの多数のコピーを、一般には染色体外又はプラスミドＤＮＡとしてスフィンゴモナス属の細菌に挿入する。標的細菌に挿入した後、操作されている細菌により、同じ菌株の操作されていない、スフィンガン生産能を持つ細菌と同一の濃度で発酵させて、スフィンガン生産量を測定する。操作されていない、生産能を持つ菌株よりも、スフィンガン生産量が大きいものを大量生産菌として決定する。この方法を使えば、ほとんどすべてのスフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス属菌から得られた、スフィンガン多糖類を増産できるＤＮＡ配列を容易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ寄託番号３１５５４）の染色体ＤＮＡから単離した３４ｋｂｐヌクレオチド単位のＤＮＡ配列を、制限酵素により消化した部位の概略図である。図１に示した多くのＤＮＡ配列をスフィンゴモナス菌に挿入して、これらのスフィンゴモナス菌がスフィンガンを増産する能力を検討した。つぎの数個の酵素の制限部位も、図１（さらに、図２、３、８、９及び１０）に示す。Ｂ（ＢａｍＨＩ）、Ｂｇ（Ｂｇ１ＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＳ（ＳａｌＩ）。図１に示すｓｐｓＢ領域は、タンパク質ＳｐｓＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図２】スフィンゴモナス菌株Ｓ６０（ＡＴＣＣ寄託番号３１４６１）の染色体ＤＮＡから単離したＤＮＡ配列を（約２８ｋｂｐ単位）、制限酵素により消化した部位の概略図である。このＤＮＡ配列の制限部位をＢ、Ｅ及びＨ部位として図２に示す。ｓｇｅＢ領域は、タンパク質ＳｇｅＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図３】スフィンゴモナス菌株ＮＷ１１（ＡＴＣＣ寄託番号５３２７２）の染色体ＤＮＡから単離したＤＮＡ配列（約３３ｋｂｐ単位）の制限酵素部位の概略図である。この配列の制限部位をＥ、Ｈ、Ｂ、Ｂｇ及びＳ部位として図３に示す。ｓｎｗＢ領域は、タンパク質ＳｎｗＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図４】本発明により生産する代表的な一スフィンガン多糖類の化学構造の概略図である。
【図５】本願の実施例６及び１２で詳述するプラスミドｐＳＥＢ２４及びｐＳＥＢ２６の構成地図である。ＭｃｓＩは次の制限部位、即ちＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳＡｌＩ、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを（上から時計廻りに）含んでいるマルチクローニング部位である。同様に、ＭｃｓIIもＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳｓｔＩ及びＥｃｏＲＩを（上から時計廻りに）含んでいる。ＯｒｉＴは接合転移開始点で、ＯｒｉＶは広範囲宿主複製開始点、及びｏｒｉはｐＵＣ１２と１３から始まる複製開始点である。
【図６】スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ寄託番号３１５５４）の染色体ＤＮＡから単離された３４ｋｂｐヌクレオチド単位のＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。次の数個の酵素の制限部位、即ちＢ（ＢａｍＨＩ）、Ｂｇ（ＢｇｌＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＳ（ＳａｌＩ）が、図１に（さらには、図２及び図３でも）示されている。図６に（さらに、図１でも）示しているｓｐｓＢ領域は、タンパク質ＳｐｓＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。スフィンガン生合成に関与する他の「ｓｐｓ」遺伝子は、大文字Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｑ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｊ、Ｆ、Ｄ、Ｃ及びＥで示してある。ｒｈｓＡＣＢＤはスフィンガン先駆物質ｄＴＤＰ−（Ｌ）ラムノースの合成に関与する遺伝子の地図上の位置を示す遺伝子の名称である。遺伝子３２、２６、３１及び３４は、まだ同定されていない翻訳の読み取り枠（ＯＲＦ）であり、ａｔｒＤＢ遺伝子は、スフィンガン合成に無関係の輸送機能をコードしている。「Ｓｅｃ」はスフィンガン類の分泌に必要な遺伝子を示し、「Ｔｒａｓｅ」はスフィンガンの繰り返しサブユニットを組み立てるときに、ヌクレオチド−糖先駆物質からスフィンガンに糖を転移する酵素をコードしている遺伝子を示している。
【図７】スフィンゴモナス菌株Ｓ１９８（ＡＴＣＣ寄託番号３１８５３）の染色体ＤＮＡから単離された（約４２ｋｂｐ単位の）ＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。図７では、このＤＮＡ配列の制限部位をＨ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＥ（ＥｃｏＲＩ）として表示してある。括弧内の間隔が詰って並んでいる部位の順序は、不明である。コスミドクローンｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５及びサブクローンＬ２４２の外側方向への広がりは、破線で示してある。四角で囲んでいる「Ｂ」領域は、Ｓ８８遺伝子ｓｐｓＢの変異体を相補するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に相当する。
【図８】スフィンゴモナス菌株Ｓ７（ＡＴＣＣ寄託番号２１４２３）の染色体ＤＮＡから単離された（約４２ｋｂｐ単位の）ＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。図８では、このＤＮＡ配列の制限部位をＨ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）及びＢ（ＢａｍＨＩ）として表示してある。コスミドクローンｃ１、ｃ２、ｃ３、及びｃ６の外側方向への広がりは、破線で示してある。クローンｃ２とｃ３は、図８の右側の領域を超えて伸びている。同様に、クローンｃ６は左側方向に伸びている。四角で囲んでいる「Ｂ」領域は、Ｓ８８遺伝子ｓｐｓＢの変異体を相補するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に相当する。
【図９】スフィンガンＳ−８８合成に用いられる遺伝子クラスターの概略図である。地図の下部には遺伝子名、境界、予定している機能、及び制限酵素による切断部位（ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩである）でのヌクレオチドの位置を示している。図の上部に向って、自然Ｓｐｓ- 突然変異の名称と位置、Ｓｐｓ+ またはＳｐｓ- の相補結果、及びプラスミドとＳ８８染色体における特異的な挿入変異によるＳｐｓ表現型を示している。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入があるｐＺ１６７、ｐＺ１６８、ｐＺ１８０、ｐＺ２０２及びｐＺ２０６は、プラスミドｐＲＫ３１１にクローニングされたｃ２セグメントにあり、２種の欠失菌株△Ｔｎ４９３か△Ｔｎ４９５のいずれかに導入された。同様にして、この他のプラスミドに対するトランスポゾン挿入はすべてｃ３セグメントに行い、欠失菌株である△Ｔｎ３５８と３６５に導入した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ挿入位置の精度は、配列決定された制限部位に対して±５０ｂｐ、グラフの精度は±１００ｂｐである。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１０と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の上部を示してある。
【図１０】スフィンガンＳ−８８合成に用いられる遺伝子クラスターの概略図である。地図の上部には遺伝子名、境界、推定される機能、及び制限酵素による切断部位（ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩである）でのヌクレオチドの位置を示している。クローニングされたフラグメント（ｃ１△３、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５及びｃ６）、サブクローニングされたセグメント（使用した制限酵素とｋｂｐ単位のおおよその長さに応じて名前を付けた）、及びＳ８８染色体に生じた欠失（各線はＤＮＡの存在を示す）は遺伝子地図の下に示している。 なお、外国書面出願時では、この図は、図９と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の下部を示してある。
【図１１】ＳｐｓＢ及びグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列のアラインメントである。右側の数は各配列の最右側のアミノ酸残基数である。各配列とも、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼはＳｐｓＢ配列の真上に示してあり、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼはＳｐｓＢ配列の下に示している。次の遺伝子産物は右側に示している。ＥｘｏＹｎ、リゾビウムの一種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＮＧＲ２３４（Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１９３）。ＣｐｓＤ、Ｓ．アガラクチエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｒｕｂｅｎｔｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８：８４３）。ＲｆｂＰ、Ｓ．エンテリカ ＬＴ２（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）。ＧｕｍＤ、Ｘ．カンペストリス Ｂ１４５９Ｓ−４Ｌ（Ｃａｐａｇｅ，ｅｔａｌ．，１９８７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ／０５９３８）。Ｐｓｓ４、Ｒ．レグミノサラム（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ｂｖ．ｖｉｃａｅ菌株ＶＦ３９（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ９３０４２）。Ｐｓｓ２、Ｒ．レグミノサラム ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ（Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１３：１５５）。記号について。｜はＳｐｓＢ及び上下各々に示すガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼまたはグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼの同一アミノ酸を示す。：は次の関連したアミノ酸、即ちＩＦＶＷＭＬ、ＳＴ、ＱＮＥＤ及びＨＫＲのグループに基づいた保存的なアミノ酸置換を示している。アンダーラインをしてある配列は、疎水性アミノ酸約２０個からなる連続セグメントである。
【図１２】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＡ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１３から図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１３】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＢ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２及び図１４から図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１４】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＣ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２から図１３及び図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１５】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＤ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２から図１４と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次の用語は本発明の明細書全体を通して使用されるもので、その意味を次のように定義する。
【００２４】
１. 「スフィンガン」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナス属細菌により分泌される、関連性はあるがお互いに別個であるエクソポリサッカライド群を意味する（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｊ. Ｇｅｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３９：１９３９〜１９４５, １９９３）。スフィンガン類の構造は、すべていくらかの関連性がある。スフィンガンおのおのの主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−マンノース、Ｌ−ラムノースの四つの糖の関連性のある配列からなっている。スフィンガン群の多糖類は、ポリマー主鎖と複数の側鎖を含む構成糖の配列によってお互いに区別することができる。スフィンガン多糖類はまた、その構成糖にアセチル基又はピルビル基が結合していてる場合もある（Ｍｉｋｏｌａｊｃｚａｋ, ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ. ａｎｄ Ｅｎｖ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：４０２, １９９４参照）。本発明のＤＮＡセグメントとフラグメント及び一般方法を使用して生産した各種スフィンガンの化学構造の概略図は、おおむね図４に示してある。スフィンガン類の、ジェラン（Ｓ−６０）、ウェラン（Ｓ−１３０）、ラムザン（Ｓ−１９４）、Ｓ−８８、ＮＷ−１１、Ｓ−１９８及びＳ−６５７の構造も、おおむね図４に示している。
【００２５】
典型的には、スフィンガン多糖類群の各単体は、一般的に次の繰り返し化学構造によって表される。
【００２６】
【化５】
【００２７】
式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＡはグルクロン酸、Ｒｈａはラムノース、Ｍａｎはマンノースである。ＸはＲｈａでも、Ｍａｎのいずれでもよい。Ｚは二番のＧｌｃ残基に結合している、α−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａのいずれかである。Ｗは１番のＧｌｃ残基に結合し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａのいずれかであって、下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７又は１である。式中、ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の近くに位置している。本明細書で用いる「主鎖」なる語は、この構造からＷ鎖とＺ鎖とを除いた、すなわちｖとｙが０に等しいときの残部を指す。ポリマーの「還元末端」は、糖単位が加えられるポリマーの末端である。
【００２８】
スフィンガン多糖類群のうち、一部の単体はいろいろな位置でアセチル化されている。しかしながら、多糖類は常法により化学的に脱アシル化して、アシル基を除くことができる。例えば、ジェランにはウェランと同じ炭水化物の主鎖（すなわち、Ｘ＝Ｒｈａ）があるが、側鎖の糖が欠けており（すなわち、ｖ＝０及びｙ＝０）、しかもグルコース残基１はグリセリン酸塩で完全に置換されている。ジェランのサブユニットの構造も、位置は分からないがどこかでアシル化されている。
【００２９】
２. 「スフィンゴモナス」なる語は、明細書全体を通して、上記のエクソポリサッカライド類、すなわちスフィンガン類を生産するスフィンゴモナス属グラム陰性菌を意味する。本発明においては、スフィンゴモナス属グラム陰性菌の多くは、単離されたＤＮＡ配列源として、スフィンガン生産能を持つ他の菌株（好ましくは、スフィンゴモナス属のグラム陰性菌）に再挿入して、本発明のスフィンガン大量生産菌を生産するため、あるいは標的細菌として、これに外因性ＤＮＡ配列を挿入してスフィンガン大量生産菌を生産するために用いることができる。
【００３０】
グラム陰性菌のスフィンガン生産能を持つ科は、１９９３年にまずスフィンゴモナス属に分類されるものとして同定された。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｊ. Ｇｅｎ.Ｍｉｃｒｏｂ. , １３９, １９３９，１９９３を参照）。しかしながら、各菌株をどの種に分類すべきかは、まだ正確には確立されていない。スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株に最も近い種は、スフィンゴモナス ポーシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）と考えられる。しかしながら、詳細な、決定的分類学分析結果を利用できる時まで、これらの菌株が上記の種に分類されるべきであると言うのは時期尚早である。スフィンゴモナス属のスフィンガン生産菌は当初数個の異なる属に分類されていたことを付言する。
【００３１】
スフィンゴモナスのうち現在までに確認されている種としては、Ｓ. ポーシモビリス（Ｓ. ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓ. パラポーシモビリス（Ｓ. ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓ. アドヘイシバ（Ｓ. ａｄｈａｅｓｉｖａ）、Ｓ. カプスラタ（Ｓ. ｃａｐｓｕｌａｔａ）及びＳ. ヤノイクヤエ( Ｓ. ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）が挙げられる（Ｙａｂｕｕｃｈｉ, ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４, ９９，１９９０を参照）。過去ではこれらスフィンゴモナスの種が、誤ってシュードモナス属（ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に分類されたこともあった。
【００３２】
３. 「供与菌」及び「受容菌」なる語はおのおの、ＤＮＡ配列を採取した細菌及びＤＮＡ配列を挿入又は組み入れる細菌を指すのに用いられる。
【００３３】
４. 「菌株」又は「スフィンゴモナス菌株」なる語は、（化学構造に基づいて）特定のスフィンガンエクソポリサッカライドを生産するスフィンゴモナス属グラム陰性菌を指すのに用いる。スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株を、簡単に、この菌株が生産するスフィンガン多糖類で呼ぶこととする。例えば、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８はスフィンガン多糖類Ｓ−８８を生産し、スフィンゴモナス菌株Ｓ６０はスフィンガン多糖類Ｓ−６０（ジェラン）を生産するなどである。スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１５５４）、Ｓ６０（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１４６１）、ＮＷ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ５３２７２）、Ｓ１３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１５５５）、Ｓ１９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１６９１）、Ｓ１９８（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１８５３）、Ｓ６５７（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ５３１５９）、及びＳ７（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ２１４２３）は、特に本発明に有用な代表的菌株である。
【００３４】
５. 「大量生産菌」なる語は、明細書全体を通して、操作された細菌であって、同じ菌株又は異なる菌株のスフィンガン生産能を持つ細菌から単離したＤＮＡセグメント又はフラグメントの多数のコピーを含有し、同じ菌株の操作されていない細菌、又は野生型細菌を同一又は実質的に同一の発酵条件で発酵して比較するとき、スフィンガン多糖類生産量が有意により大きい（重量／重量比で、少なくとも約５％以上）細菌を指すのに用いる。
【００３５】
６. 「単離された」なる語は、微生物から採取して、少なくともある程度精製した、すなわち一以上の精製工程を通過したＤＮＡを指すのに用いる。単離されたＤＮＡは、実質的に純粋な形で用意しておくことが好ましい。すなわち、制限酵素によりフラグメントあるいはセグメントに切断したり、クローニングにより多数のコピーとしたり、又はプラスミドベクターその他の手段に挿入したり、又は細菌中に組み入れたりするＤＮＡの性能に影響がない程度まで、汚染物質含有量を抑制する。
【００３６】
７. 「ＤＮＡ」又は「染色体ＤＮＡ」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナスから単離されたＤＮＡに関し、一般には微生物から単離する前に、スフィンゴモナス属菌の染色体又は内因性プラスミド中に見いだされるＤＮＡを指すのに用いる。
【００３７】
８. 「配列」なる語は、明細書全体を通して、ヌクレオチド単位又は制限酵素による切断部位のパターンによって同定されるＤＮＡの特異的セグメントであって、一般的にはスフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス属菌のＤＮＡから制限酵素により単離し、このようにして得たＤＮＡ配列を細菌に挿入して大量生産菌を生産したり、あるいはさらに制限して前記の配列より小さいＤＮＡの小部分、又はフラグメントを生産する配列を指すのに用いる。「部分」又は「フラグメント」なる語は、一般にＤＮＡセグメントより小さいＤＮＡ配列を指すのに用いる。本発明に用いる好適なＤＮＡセグメントは、グリコシルトランスフェラーゼ（グルコシル、ガラクトシル、ラムノシル及びグルクロノシルトランスフェラーゼ）、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼ（グルコシル−ＩＰトランスフェラーゼ、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼ酵素などを含む）、ラムノースオペロン（あるラムノース含有スフィンガンへ挿入するためのラムノース前駆体の合成）、及び細菌の多糖類の分泌を含む様々なタンパク質をコードするセグメントである。
【００３８】
９. 「挿入された」、「挿入する」、「組み入れられた」又は「組み入れる」なる語は、明細書全体を通して、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株の染色体ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡから単離したＤＮＡセグメントを、スフィンガン生産能を持つ、同じあるいは異なる受容菌になるスフィンゴモナス菌株に転移する工程と結果を指す。結果として、転移されたＤＮＡセグメントの少なくとも実質部分の多数のコピーを含有する大量生産菌株を得る。
【００３９】
例を挙げると、まず単離されたＤＮＡを当業者に周知の技術によりプラスミドベクター、例えば特にｐＲＫ３１１やｐＳＥＢ２４に導入し、クローニングした後、接合により受容菌となるスフィンゴモナス菌に転移する。受容菌となるスフィンゴモナス菌に挿入後、受容菌の細胞中で上記のＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターが複製されて、スフィンガン多糖類の大量生産に必要なＤＮＡセグメントが数コピー（少なくとも２コピーで、通常は４〜２０コピー）できる。プラスミドベクターの他に、バクテリオファージベクターや、トランスポゾンベクターを使ってもよい。
【００４０】
多くのプラスミドベクターが、単離されたＤＮＡセグメントやフラグメントを受容菌に挿入する際に好適である。上記で説明したｐＲＫ３１１やｐＳＥＢ２４の他に、特に、以下のプラスミドも有用である。不和合群Ｐ−１の広範囲宿主プラスミドであるＲＫ２などや、そのプラスミドから派生したｐＲＫ２９０、ｐＲＫ２９３、ｐＲＫ４０４など（Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｖｏｌ. １３, ｐｐ. １４９〜１５３）、及びプラスミドの転移を可能にするプラスミドＲＰ４のｏｒｉＴ遺伝子を含むその他の派生体であるｐＳＵＰ１０１など（Ｓｉｍｏｎ, ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｎｏｖｅｍｂｅｒ, １９８３を参照）並びにプラスミドｐＬＡＦＲ１及びｐＬＡＦＲ３（Ｆｒｉｅｄｍａｎ, ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ, １８, ２８９, １９８２）、及び不和合群Ｉｎｃ−Ｑの広範囲宿主プラスミドであるＲＳＦ１０１０や、そのプラスミドから派生したｐＭＭＢ２２及びｐＭＭＢ６６（Ｆｕｅｒｓｔｅ, ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４８, １１９, １９８６）などである。
【００４１】
プラスミドベクターを受容菌内に挿入する際に、接合を用いるのは一般に有効である。しかしながら、属が異なる細菌同志では、コンピテント細胞を精製ＤＮＡで形質転換させるのがより一般的である。
【００４２】
スフィンゴモナスの場合、細菌にＤＮＡフラグメントやプラスミドを導入するのに電気穿孔法も使われてきた（１９９２, Ｍｏｎｔｅｉｒｏ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. ｏｆ Ａｐｐ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７２, ４２３を参照）。この方法を使えば、単に単離されたＤＮＡを細菌に添加し、電気穿孔で細胞膜を通して転移させるだけで、単離されたＤＮＡセグメントやフラグメントの細胞コピーを２コピー以上受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れることができる。
【００４３】
前掲のＭｏｎｔｅｉｒｏらは、ＤＮＡをスフィンゴモナスに導入する手段としての電気穿孔法を説明している。電気穿孔法の機能は、コンピテント細胞を化学的に処理して、例えば細胞を塩化カルシウムやルビジウム塩で処理した後に形質転換するのと同じである。形質転換させるＤＮＡは標準法で精製するが、この場合プラスミドの形をとってもよいし、またとらなくてもよい。しかしながら、通常、二本鎖閉環型のＤＮＡの場合、形質転換が最も効率的である。したがって、この場合、接合法でＤＮＡをスフィンゴモナスに導入する必要もなければ、セグメントをクローニングしてからプラスミド、バクテリオファージあるいはトランスポゾンベクターに挿入する必要もない。しかしながら、単離されたＤＮＡをまずプラスミドベクターに導入してから、単離ＤＮＡフラグメントを含有するプラスミドを細菌中に転移することが好ましい。
【００４４】
受容菌となるスフィンゴモナス菌中で、プラスミドあるいはその他ベクター、例えばバクテリオファージ又はトランスポゾンベクターにＤＮＡセグメントの担持を続ける必要はない。細菌ＤＮＡ中にＤＮＡセグメントのコピーをさらに導入して、細菌ＤＮＡを複製するのと同じメカニズムによりセグメントを世代毎に複製することは、常法として行われている。下記の実施例の部において、細菌ＤＮＡにＤＮＡのコピーをさらに導入して、細菌ＤＮＡを複製するのと同じメカニズムによりセグメントを世代毎に複製する方法を詳述する二つの実施例を説明する。
【００４５】
１０. 「多数のコピー」なる語は、明細書全体を通して、少なくとも２コピー、好ましくは少なくとも４コピーをスフィンゴモナス細菌に組み入れる外因性ＤＮＡ配列、フラグメント又はセグメント（前記のＤＮＡの少なくとも実質部分）を指すのに用いられる。より好ましくは、スフィンゴモナス属菌に挿入するＤＮＡ配列、フラグメント又はセグメントのコピー数は、実際には約４から約２０までの範囲である。ある例においては、ＤＮＡ配列を１個のプラスミドベクターに組み入れて、接合によりスフィンゴモナス菌に転移し、受容菌中でプラスミドを複製して、２コピー以上のＤＮＡ配列、セグメント又はフラグメントを得ることもあることを付記する。
【００４６】
１１. 「生合成」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナス菌がスフィンガンを生物生産又は合成することを指すのに用いる。スフィンガン多糖類は、複数の細菌の酵素でコントロールされている一連の工程により炭水化物単位毎に合成される。
【００４７】
１２. 「操作されている」なる語は、明細書全体を通して、外因性ＤＮＡ、好ましくはその多数のコピーが組み入れられている受容菌となるスフィンゴモナス菌を指すのに用いる。本発明の操作されている細菌とは、スフィンガン多糖類大量生産菌のことである。
【００４８】
１３. 「遺伝情報をコードする」なる語は、明細書全体を通して、特定の順序で並んでいるヌクレオチド単位の遺伝情報を内容とするＤＮＡ配列を指すのに用いる。ＤＮＡ配列の遺伝情報（どんな長さでも）は、多数のコピーが組み入れられて、これにより得た操作されている細菌がスフィンガンを増産する場合、スフィンゴモナス菌によるスフィンガン合成に「有益又は不可欠」であると見なされる。「有益又は不可欠」なる語は、ＤＮＡがスフィンゴモナス細菌から単離され、遺伝情報をコードし、この遺伝情報の多数のコピーが組み入れられたスフィンゴモナス菌が、スフィンガン多糖類の大量生産菌に形質転換するＤＮＡを指すのに用いる。本発明で使用する有益又は不可欠なＤＮＡは、例えば、グルコシルＩＰ−トランスフェラーゼ、ガラクトシルＩＰ−トランスフェラーゼなど、グリコシルトランスフェラーゼの生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、ラムノース、マンノース、グルコース、ガラクトースのような糖のシントンや、例えばｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースなど、上記の糖の置換シントンの生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、例えばポリメラーゼのようなスフィンガンを生産するための糖シントンの重合に関与する酵素の生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、無処理の細胞構造から多糖類を分泌するための遺伝子又はオペロンを一以上含む。
【００４９】
１４. 「菌株間相補性」なる語は、第一のスフィンゴモナス菌株からＤＮＡ配列、セグメント又はフラグメントを単離して、異なる第二のスフィンゴモナス菌株に組み入れることを指すのに用いる。本発明の実施態様の一つとして、異なるスフィンゴモナス菌株からＤＮＡフラグメントを取り、その多数のコピーを別のスフィンゴモナス菌株に組み入れると、スフィンガン多糖類の大量生産菌が生産できることを発見したことは、予期せざるところであった。本発明で有用なＤＮＡフラグメントは、属間相補性（例えば、キサントモナス カンペストリス菌にキサンタンの増産をさせるなど）も示している。
【００５０】
１５. 「シントン」なる語は、本発明により細菌がスフィンガンを生合成する間に重合される糖又は糖単位を指すのに用いる。シントンは、スフィンガン多糖類の構成部分又は構成単位を含み、スフィンガン類の生合成に使用される糖成分、例えばアセチル化及びアシル化糖や関連先駆物質を含むグルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノース、その他の糖シントン類などを含有する。
【００５１】
１６．「ラムノースオペロン」なる語は、本発明によるスフィンガン多糖類の生合成に利用される、ラムノース又はラムノースシントン類（ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースなど）の生合成に関与する遺伝子やオペロンをコードするＤＮＡ配列を指すのに用いる。
【００５２】
本発明は、スフィンガン生産能を持つ供与菌となるスフィンゴモナス菌からＤＮＡ配列を取って、多数のコピーを同じ菌株あるいは異なる菌株の受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れると、この受容菌となるスフィンゴモナス菌がスフィンガン多糖類大量生産菌に形質転換するとの発見に関する。さらに、ある種のスフィンガン多糖類を生産する細菌からＤＮＡ配列を単離し、異なる菌株のスフィンゴモナス菌に多数のコピーを組み入れると、この異なる菌株から大量生産菌を生産することができるばかりでなく、この場合供与菌の特性を持つスフィンガン多糖類の混入が起こることがないことも発見されている。
【００５３】
受容菌に組み入れられたＤＮＡ配列には、スフィンガン多糖類の生合成に有益又は不可欠の遺伝情報がコードされている。例えば、有益又は不可欠の遺伝情報は、細菌のスフィンガン生合成にいろいろな形で役割を果たしたり、あるいは関与する。外因性ＤＮＡは、例えば、律速酵素の過程に関与する酵素その他のタンパクの合成を発現したり、酵素、補因子、その他の生化学的成分の合成を誘導して多糖類を増産させたり、多糖類のサブユニットの連結を促進するポリメラーゼのような酵素の産生を増加させたり、あるいは一以上のリプレッサー遺伝子と結合したり、細菌から多糖類の分泌を促進させたり、通常、多糖類生合成の間は律速される工程の生産を阻害するリプレッサーの発現を押さえるなど、スフィンガン生合成に有益な効果をもたらすことができる。
【００５４】
ＤＮＡ配列は、当業者の標準的な技術や方法によりスフィンゴモナスの各種菌株から単離する。通常、細菌は（下記で詳細説明するように、約０. ５％より低い、好ましくは約０. １％〜０. ２％のグルコース濃度を用いる標準発酵法により）培養され、高濃度の細菌を含有するブロスを作る。その後、細菌細胞を遠心分離し、ＤＮＡ抽出のために再懸濁する。ＤＮＡは、まず混合液からタンパクを除いて、エタノール又はイソプロパノールにより高分子量のＤＮＡを沈澱させることによって細菌から抽出する（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ, Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７, １５１３，１９７９を参照）。
【００５５】
上記のように沈澱させたら、通常は単離されたＤＮＡセグメントあるいはフラグメントのクローニングを行って、受容菌となるスフィンゴモナス菌挿入用のＤＮＡを形成する。例として挙げると、上記した高分子量のＤＮＡ配列は、制限酵素（例えば、ＳａｌＩ酵素）により部分的に消化し、標準方法により電気泳動する（Ｌｏｆｔｕｓ, ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, １２, １７２，１９９２を参照）。電気泳動後、大きなＤＮＡフラグメント（２０ｋｂｐ以上）をさらに精製する（抽出及び沈澱）。
【００５６】
その後、細菌から単離したＤＮＡフラグメントを、クローニングベクター（一般には、プラスミド）に直接挿入してＤＮＡのクローニングを行うか、代わりに制限酵素によりさらに処理することにより、より小さなＤＮＡフラグメントにして、クローニングベクターに挿入する。本発明のＤＮＡクローニングは、当業者が標準としている一般的な技術と方法によって行う。本発明によれば多くの方法を用いてＤＮＡセグメントのクローニングを行うことができ、したがって、本発明は、例えばプラスミドのクローニングベクターの使用に限定されない。例えば、ＤＮＡフラグメントをｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ３（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ, Ｖｅｃｔｏｒｓ, Ｃｈａｐｔｅｒ ２, ｐｇ. ４３, １９８８, Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｂｏｓｔｏｎ）、又はＰ１（１９９０, Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ.Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７, １０３〜１０７）などのバクテリオファージベクターに挿入してクローニングすることもできる。
【００５７】
下記の実施例１及び１２で詳述するように、まず、クローニングベクターに挿入するＤＮＡフラグメントを用意する。本発明によれば、ＤＮＡセグメント又はフラグメント形成用として、数多くのクローニングベクターを使用することができる。しかしながら、本発明においては、ＤＮＡセグメント又はフラグメントのクローンを形成したプラスミドベクターをそのまま使用して、接合により外因性ＤＮＡを受容菌に挿入するのが有利であることが見いだされている。しかしながら、特にＤＮＡを受容菌へ挿入する際に形質転換法を使用しようとする場合には、受容菌に接合するベクターとは異なる（プラスミドその他の）クローニングベクターを使用することもできる。
【００５８】
クローニングベクターに挿入を終えたら、単離されたＤＮＡを含有するベクターをバクテリオファージ中でパッケージングして、トランスフェクション法により細菌（一般に、大腸菌）に転移し、トランスフェクションされた細菌中で複製する。このようにして得たＤＮＡクローンを含有する細菌細胞のコロニーをプールして、貯蔵するか、あるいは直接使用する。
【００５９】
その後、ＤＮＡクローンのスクリーニングを行って、スフィンゴモナスによるスフィンガン生産に対するＤＮＡフラグメントの相対的増産効果を決定する。スクリーニング法においては、ＤＮＡを適当なベクターに担持させた後、接合法（例えば、Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ．，ＵＳＡ, ７７, ７３４７，１９８０が説明している三元交配（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ））により受容菌となるスフィンゴモナス菌株に挿入し、このようにして得たＤＮＡの多数のコピーを含有する操作された細菌とそのスフィンガン生産を試験して、活性を決定する。
【００６０】
スフィンガン生産に増産効果があると決定されたＤＮＡセグメント又はフラグメントを、受容菌となるスフィンゴモナス菌株に転移して、前述のように転移されたＤＮＡの少なくとも実質部分を少なくとも２コピー含有する大量生産菌株を生産する。
【００６１】
本発明で使用する際に好ましいスクリーニング法を開発した。この方法では、ＤＮＡを生産能を持たない受容菌となるスフィンゴモナス菌株に挿入することにより、このＤＮＡ中にスフィンガン合成に有益又は不可欠である遺伝子が存在しているか、否かをスクリーニングするのである。すなわち、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株から、生産能を持たない変異菌（例えば、菌株Ｓ８８のＳｐｓ- Ｂａｃr ）を派生させ、スクリーニング対象となるＤＮＡの多数のコピーを含有するように操作する。グルコース１〜３％を含有する普通寒天平板培地でこのように操作した、生産能を持たない変異菌を増殖する。別に、生産能を持たないスフィンゴモナス変異菌を同一条件で増殖して、この変異菌と操作された細菌のコロニーの外観を比較する。このようにした後、一般的にスフィンゴモナス菌にスフィンガン合成を開始させるＤＮＡの能力を、目視により測定する。
【００６２】
スフィンガン生産活性を向上させるＤＮＡセグメント又はフラグメントの能力は、培養皿上で容易に認識できる、スフィンガン生産能を持つ細菌とスフィンガン生産能を持たない変異菌の表現型の相違により判定される。例えば、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株はムコイドを産生するため、簡単な目視検査で容易に見分けることできるコロニーを形成することが多い（例えば、スフィンガン生産菌のコロニーが盛り上がって丸く、明るい輪で取り囲まれているのに対して、非生産菌のコロニーは平坦で、粗く、半透明である）。
【００６３】
ある事例では、下記の実施例２で詳述するように、一つのスフィンゴモナス菌株において、スフィンガン生産能を持つ細菌とスフィンガン生産能を持たない細菌の表現型が容易にあるいは短時間で区別できない場合がある。このような場合には、生産性と非生産性の表現型の相違が目視検査で容易に識別できる細菌によって対象ＤＮＡの活性を判定するように、スクリーニング法を変更する。この本発明の実施態様では、本発明に有用なＤＮＡフラグメントは菌株間でも、属間でも相補性を示す事実、及びこのＤＮＡフラグメントの多数のコピーによって実際上すべてのスフィンゴモナス菌株がスフィンガンを増産することができる事実を利用するのである。
【００６４】
本発明に有用なＤＮＡセグメント又はフラグメントは、キサントモナス カンペストリスにおいても活性を示す。したがって、一以上のスフィンゴモナス菌株を使って容易にスクリーニングできなかったＤＮＡフラグメントの多数のコピーを、キサンタン生産能を持たない、Ｘ. カンペストリス変異菌、例えば特にＸ５９ｍ３１に組み入れて、目視検査によりキサンタン生産のスクリーニングを行うことができる。Ｘ５９ｍ３１などの生産能を持たないＸ. カンペストリス変異菌は、バシトラシンにさらした後の生存菌を選び、このバシトラシン耐性変異菌にＤＮＡフラグメントの重複コピーを組み入れ、ＹＭ寒天培養皿で培養し、形成されたコロニーの外観がムコイド性（生産菌）であるか、非ムコイド性（非生産菌）であるかを観察することにより、容易に得ることができる。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７、及び米国特許第５, ３３８, ８４１号を参照）。スクリーニングされた細菌が多糖類（スフィンガン又はキサンタン）を増産するＤＮＡは、菌株間あるいは属間相補性の証拠であって、異なるスフィンゴモナス菌株ばかりでなく、異なる属の細菌（キサントモナス）によるスフィンガン多糖類生産を増産させることができる。
【００６５】
概して簡単に、スフィンガンの生産菌と非生産菌の表現型の相違を同定できる本発明の実施態様による簡便スクリーニング法を用いれば、通常の技術を有する当業者は容易に利用できるクローニング及び転移技術により、過度の又は理由のない実験を行うことなく、本発明で使用されるＤＮＡセグメントやフラグメントを容易に得て、スフィンゴモナス菌によるスフィンガン多糖類を増産することができる。
【００６６】
本発明の他の実施態様は、スフィンガン多糖類の増産に関する。スフィンガン多糖類を生産するためには、本発明の操作した細菌を周知の方法により適当な発酵条件下で培養する。操作されたスフィンゴモナス菌を培養する適当な培地又は発酵ブロスとしては、例えば、一般にグルコース、ラクトース、スクロース、マルトースやマルトデキストリンを含む炭水化物類などの炭素源、例えば無機アンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸類又は加水分解した酵母，大豆粉又はカゼインなどのタンパク性材料、蒸留業者によって提供される可溶性物質（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｂｌｅｓ）又はコーン スチープ リカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、無機塩類などの窒素源及びビタミン類を含有する水性培地が挙げられる。本発明では、非常に多種類の発酵培地を使ってスフィンガン類の生産を実施することができる。
【００６７】
発酵ブロス中の炭水化物含量はいろいろあるが、通常は発酵培地に対して約１〜５重量％である。炭水化物類は発酵前あるいは発酵中のいずれかで全部を一どきに添加する。窒素用量は水性培地に対して約０. ０１％〜約０. ４重量％の範囲である。炭素源と窒素源は１種のみの炭素源又は１種のみの窒素源を使用しても良いし、何種類かの炭素源又は窒素源を混合して使用してもよい。
【００６８】
スフィンゴモナス菌の発酵に用いる無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、硝酸塩、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩及びこれらに類似するイオン類を含有する塩類が挙げられる。マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、ヨウ化物及びホウ酸塩などの微量金属も、含有すると有利である。また、ビオチン、葉酸塩、リポ酸塩、ナイアシンアミド、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン及びビタミンＢ12などのビタミン類、ならびにこれらの混合物もまた、有利に使用することができる。
【００６９】
発酵温度は約２５℃〜約３５℃であるが、至適生産性を得るには約２８℃〜約３２℃の温度範囲がよい。接種源は、振盪フラスコ培養と小規模の浸漬攪伴発酵を含む、標準的な方法で容量をスケールアップして調製する。接種源の調製用培地は、生産用培地と同じものでも良いし、また当業者間で周知のいくつかの標準培地の一つであるルリア ブロス培地や、ＹＭ培地であってもよい。種培養では、炭水化物濃度を約１重量％より低くするとができる。所望の接種量を得るためには、種培養工程を一工程よりも多くすることができる。典型的な接種量は、最終発酵総量に対して約０. ５％〜約１０％の範囲である。
【００７０】
典型的には、発酵容器に内容物を攪伴する攪伴機を備える。容器に自動ｐＨ制御装置と自動発泡制御装置をつけてもよい。生産培地を容器に添加して、加熱によりその場で殺菌する。かわりに、添加前に、炭水化物や炭素源を別個に殺菌してもよい。予め増殖しておいた種培養を冷却してある培地（一般には、発酵温度の約２８℃〜約３２℃）に添加し、培養物を攪伴しながら約４８〜約９６時間発酵して、高粘度のブロスを調製する。標準法によりスフィンガン多糖類をアルコール、一般的にはイソプロパノールで沈澱させて、ブロスから回収する。
【００７１】
本出願は、具体例として、数種の菌株、特にスフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７、及びＳ１９４（それぞれ、寄託番号ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ５３２７２、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１９６１としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から利用することができる）から単離したＤＮＡセグメントや、フラグメントを開示する。これらのＤＮＡセグメントや、フラグメントを染色体外（プラスミド）ＤＮＡとして多数のコピーをスフィンゴモナス菌株中に組み入れることにより、これら菌株が生産するスフィンガンＳ−８８、Ｓ−６０及びＮＷ−１１を増産する際に有用であることが見いだされている。
【００７２】
スフィンゴモナス菌株Ｓ８８の場合、単離された染色体ＤＮＡセグメントの大きさは３４ｋｂｐで、２３から２５の遺伝子を含む。図１のＳ８８のクローン地図に示す通り、３４ｋｂｐ領域とは二つのクローン、ｃ３とｃ２を合わせた広さである。この３４ｋｂｐのＤＮＡ配列を複数のＤＮＡ配列に分けて、そのおのおのにｃｌ△３、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５、ｃ６、Ｈ１５. ６、Ｂ７. １、Ｂ８.６、Ｅ５. ９、Ｅ１. ５、Ｅ２. ４、Ｅ４. ５、Ｅ６. ６、Ｅ１２. ８など標識したものを、図１に示す。図６、図９及び図１０は、単離されたＳ８８染色体ＤＮＡをさらに詳細に示す。
【００７３】
スフィンゴモナス菌株Ｓ６０の場合、染色体ＤＮＡからｃ１、ｃ２及びｃ３（図２を参照）を始めとする複数のＤＮＡ配列が単離された。配列ｃ２をクローニングした後、ｐＲＫ３１１ベクター中に置き、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１に挿入して、スフィンガン生産活性を評価した（実施例９に詳述してあるので、参照のこと）。
【００７４】
スフィンゴモナス菌株Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４の場合、これらの菌株からもＤＮＡセグメントを単離した（図７及び８を参照されたい）。これらの菌株からは、本願明細書で詳述する一般方法によりさらに多くのＤＮＡセグメントを単離して、本発明により細菌のスフィンガン生産を増産するのに利用することができる。
【００７５】
スフィンゴモナス菌株ＮＷ１１の場合、ＤＮＡフラグメントｃｌ、ｃ２、ｃ２. １、ｃ２. ２、ｃ２Ｈｄ、ｃ２Ｈ１、ｃ２Ｈ２、ｃ２Ｈ３、ｃ２Ｈ１０を単離した（図３参照）。配列ｃ２. ２をクローニングした後、ｐＲＫ３１１ベクター中に置いて、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１に挿入して、スフィンガン生産活性を評価した（実施例９に詳述してあるので、参照のこと）。
【００７６】
スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から、上記で一般的に説明した方法により次のＤＮＡセグメントを調製した。これらのＤＮＡセグメントおのおのを（プラスミドベクター中の全長のＤＮＡセグメントとして）、一以上のスフィンゴモナス菌株（野生型スフィンガン生産菌、又は野生型生産菌から派生した非ムコイド性変異菌）に挿入すると、それらの細菌はスフィンガン多糖類の大量生産菌に変わる。これらのＤＮＡセグメントやフラグメントおのおのは、スフィンゴモナス菌株から単離されるＤＮＡセグメント又はフラグメントから派生させ、前述したようにプラスミドベクター中に挿入する。ＤＮＡセグメント又はフラグメントの特徴は、制限酵素切断部位地図によって定まる（図１、２及び３）。
【００７７】
菌株 Ｓ８８
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ△３
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ２
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ３
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ４
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ５
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｈ１５. ６
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｂ８. ６
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ４. ５
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ６. ６
菌株 Ｓ６０
ｐＲＫ３１１−Ｓ６０ｃ２
菌株 ＮＷ１１
ｐＲＫ３１１−ＮＷ１１ｃ２. ２
【００７８】
ＤＮＡクローンは、スフィンガン生産能を持つ野生型スフィンゴモナス菌、あるいはスフィンガン生産能を持たない変異菌に導入して、大量生産効果を実現することができる。例えば、ＤＮＡクローンの多数のコピーを、スフィンガン生産能を持つ野生型菌株や、スフィンガン生産能を持つ菌株から派生した非ムコイド性変異菌おのおのに導入する。このように操作した細菌は、同じ菌株由来のスフィンガン生産能を持つ野生型菌、あるいはスフィンガン生産能のない変異菌と比較すると、スフィンガンの大量生産菌である。
【００７９】
ＤＮＡをスクリーニングして多数のコピーを、これらのスフィンゴモナス菌の菌株に導入したところ、予期しないところであったが、このようにして得た組換え菌のスフィンガン生産量は、一般的に野生型菌のスフィンガン生産水準よりも高かった。これは一般性を持つ現象であり、しかもこのスフィンガンの増産には菌株間の相補性が認められた。
【００８０】
本発明においては、ＤＮＡクローンの多数のコピーを挿入して得る組換え菌は、野生型より高い水準のスフィンガン多糖類合成活性を持っている。また、本発明で有用なＤＮＡセグメントは、菌株がスフィンガンを組み立てたり、生合成する初期工程で初めのグルコース残基をイソプレニルリン酸担体に結合するのに必要なタンパクをコードしているＤＮＡフラグメントを始めとして、スフィンゴモナス菌株がスフィンガンを合成するのに有益あるいは不可欠な遺伝子を持っている。
【００８１】
ｓｐｓＢ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）と、ＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列（配列番号２）も開示する。ＳｐｓＢタンパク（又は、スフィンゴモナス菌株によっては、特にＳｇｅＢ、ＳｎｗＢ、ＳｎｅＢ、ＳｓｓＢ、及びＳｒｈＢなどの相似タンパク）をコードしているＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントはすべて、多数のコピーを組み入れてスフィンゴモナス菌株を操作された菌とし、この操作された菌によってスフィンガンを増産することができる。
【００８２】
同様に、Ｓ６０スフィンゴモナスから単離されるｓｇｅＢ遺伝子（ＳｐｓＢに相似するＳｇｅＢタンパクをコードする）及びＮＷ１１スフィンゴモナスから単離されるｓｎｗＢ遺伝子を含有するＤＮＡセグメントやフラグメントについても同じことが言える。ｓｇｅＢ遺伝子（図２）は、Ｓ８８染色体ＤＮＡのｓｐｓＢ遺伝子（及び、相当するｓｎｅＢ、ｓｓｓＢ、ｓｒｈＢ遺伝子、それらはそれぞれスフィンゴモナスのＳ１９８、Ｓ７及びＳ１９４株に由来し、ＳｎｅＢ、ＳｓｓＢ、ＳｒｈＢタンパクをコードする）と（Ｓ８８のｓｐｓＢ遺伝子に相当するフラグメントとのＤＮＡハイブリッド形成に基づいて）相似するタンパクをコードしていると信じられている点で、お互いに相似している。図３に示すｓｎｗＢ領域は、ＳｎｗＢタンパクをコードするＤＮＡ配列に相当する。また、ｓｎｗＢ遺伝子は、Ｓ８８染色体ＤＮＡのｓｐｓＢ遺伝子及びＳ６０染色体ＤＮＡのｓｇｅＢ遺伝子と相似する。これらのＤＮＡフラグメントは、上記で一般的に述べたようにプラスミド中に挿入して、スフィンゴモナスがスフィンガンを増産するための多数のコピーを形成する。
【００８３】
スフィンゴモナスＳ８８のｓｐｓＢ遺伝子はグルコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードしていると信じられている。ＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列は、異なる属の菌の推定グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼと、かなりの相同性があることが立証されている。この推定アミノ酸配列は一般にグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードしていると信じられている他の遺伝子の配列と似ているが、この類似性がｓｐｓＢ遺伝子はグルコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードするということの最も強い証拠となっている。実際、グルコシル−ＩＰトランスフェラーゼのカルボキシル部分と、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼのカルボキシル部分とには、かなりの相同性がある。アミノ末端領域にはこのように大きな相同性はないが、ＳｐｓＢタンパクには膜貫通領域であると示唆されている疎水性の広がりが複数存在している点で、Ｓ. エンテリカ（Ｓ. ｅｎｔｅｒｉｃａ）のＲｆｂＰタンパクと似ている（１９９１, Ｊｉａｎｇ, ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５, ６９５）。ＳｐｓＢの疎水性領域は、３５〜３９の位置のアミノ酸（平均ハイドロパシー＋２. ２）、６８〜８６の位置のアミノ酸（＋１. ７）、１０５〜１２３の位置のアミノ酸（＋２. ３）及び２８２〜３０３の位置のアミノ酸（＋２. ９）を含んでいる。後者の疎水性領域の位置はこれらの関連遺伝子産物に共通していて、最大相同領域の隣に存在している。
【００８４】
本発明の最良の実施態様において、ＤＮＡセグメントやフラグメントには、Ｓ８８、Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１３０、Ｓ１９４、Ｓ１９８、Ｓ６５７及びＳ７を始めとするスフィンゴモナス菌の各種菌株の、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が含有されている。これらのＤＮＡセグメント及びフラグメントの多数のコピーを、受容菌となるスフィンゴモナス菌中で使用して、この受容菌がスフィンガンをより多く生産できる利得を実現することができる。グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメントの組み込みに加えて、糖シントン又は糖前駆体（すなわち、スフィンガンポリサッカライドの構成部分を含み、スフィンガンの生合成に使われる糖成分、例えばグルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノース、他の糖シントンや前駆体）をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメント、又は、重合を促進したり、無処理の細胞構造からの多糖類分泌を促進する酵素や蛋白質をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメントを好適に本発明で使うことができる。
【００８５】
次の実施例により本発明を説明する。如何なる方法によっても実施例の説明を本発明の範囲を限定するものと誤解してはならない。
【実施例】
【００８６】
次の実施例１〜２１では、細菌の菌株、プラスミド及びバクテリオファージを表２に列記する。ルリア−ベルタニ培地及びＹＭ培地を標準培地とする（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。抗生物質（Ｓｉｇｍａ社）の用量は次の通りである。バシトラシン（Ｂａｃ）は、特に本例では、７３単位／ｍｇ又は０．０１〜８ｍｇ／ｍｌ。リファンピシン（Ｒｉｆ）は、５０μｇ／ｍｌ。ストレプトマイシン（Ｓｔｍ）は、５０μｇ／ｍｌ。カナマイシン（Ｋａｎ）は、２５μｇ／ｍｌ。クロラムフェニコール（Ｃａｍ）は、１５μｇ／ｍｌ。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）は、４〜１２μｇ／ｍｌ。
【００８７】
【表２】
【００８８】
実施例１
スフィンゴモナスのＤＮＡセグメントライブラリーの構成
スフィンゴモナス菌株から、スフィンガン類の合成に不可欠なＤＮＡセグメントのクローンを形成した。次のようにして、ＤＮＡセグメントの完全なライブラリーを調製した。ＹＭ液体培地２５ｍｌ中に菌株（この実施例ではＳ８８）を置き、３０℃で一晩振盪して、多量の細胞を含有する粘液性ブロスを作成した。
ＹＭ培地には、水１リットルあたり、バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母エキス３ｇ、バクト麦芽エキス３ｇ、バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ、及びＤ−グルコース( Ｄｉｆｃｏ）１０ｇが含有されていた。アジ化ナトリウムを０. ０１％まで加え、さらにスフィンガナーゼ（ｓｐｈｉｎｇａｎａｓｅ）酵素（１９９４, Ｍｉｋｏｌａｊｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０,４０２）を３７℃で８時間添加し、スフィンガンエクソポリサッカライドを消化して、粘度を部分的に低下させて細胞の増量を図った。細胞を遠心分離し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３（１９７９）の方法によりＤＮＡを抽出するために再懸濁した。ライセート（分離物）に等量のフェノール：ＣＨＣ13：イソアミルアルコール（２４：２４：１）混液を加え、２５℃で１６時間緩やかに振とうし、その後、１容量のＣＨＣ13：イソアミルアルコール（２４：１）混液を加え、２５℃で３時間緩やかに振とうした。このようにして澄明としたライセートからタンパクを除いた。３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５. ２）１／１０容量を加え、高分子量のＤＮＡを２容量のエタノールで沈澱させた後、乾燥して、さらにＴＥ（１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ）０. ５ｍｌ中に再懸濁した。
【００８９】
Ｌｏｆｔｕｓ, Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｓ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, １２，１７２，１９９２）のコスミドクローニング計略により、Ｓ８８ＤＮＡをＳａｌＩ酵素により部分的に消化し、トリス・酢酸塩・ＥＤＴＡ緩衝液中、１％の低融点アガロースで電気泳動した。２０ｋｂｐより大きなフラグメントをフェノール抽出とエタノール沈澱により精製した。このＳａｌＩで消化したＳ８８ＤＮＡは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して、ｄＣＭＰとｄＴＭＰを付着端に添加し、７０℃で２０分間加熱した後、エタノールで沈澱させた。ベクタープラスミドｐＲＫ３１１（１９８５, Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１３, １４９〜１５３）は、ＢａｍＨＩ酵素で完全に消化し、６５℃で１５分間加熱して、フェノール抽出とエタノール沈澱により精製した。このようにしてＢａｍＨＩで消化したｐＲＫ３１１ＤＮＡは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して、ｄＧＭＰとｄＡＭＰを添加して、上記のようにして精製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応に含まれていたベクターと挿入フラグメントのモル量は等しかった。すべての制限酵素、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社から入手し、このメーカーの反応条件を使用した。バクテリオファージ（ストラタジーン社のＧｉｇａｐａｃｋTMＩＩＸＬ）中にパッケージングした後、ライゲーションした分子をトランスフェクションにより大腸菌ＤＨ５αTMに転移し、細胞を濃度４〜１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上に広げた。テトラサイクリン耐性コロニー１７００個のうちの１つのライブラリー、及びテトラサイクリン耐性コロニー３４００個のうちの１つのライブラリーのそれぞれを別個にプールして、凍結した。テトラサイクリン耐性コロニーは（試験した１０個のうち１０個が）内部にＳａｌＩ制限酵素部位をもつ、長さ２５〜３０ｋｂｐの挿入断片を含有していた。
【００９０】
同様にして、ＮＷ１１、Ｓ６０、Ｓ１９８、Ｓ１９４、及びＳ７を含む他の各種スフィンゴモナス菌株から、染色体ＤＮＡセグメントのライブラリーを作成した。この場合、クローニングしたＤＮＡの供給源である細胞を、０. ５％ｗ／ｖ以下のグルコースを含む培地中で増殖させ、スフィンガナーゼ処理は省いた。
【００９１】
実施例２
スフィンガンＳ−８８生合成用ＤＮＡフラグメントの単離
プラスミド中にクローニングしたＤＮＡのフラグメントのスクリーニングを行い、スフィンガン陰性変異菌がスフィンガン合成を復活するか、否かを観察することにより、スフィンガンＳ−８８の合成に不可欠な遺伝子が存在するか、否かを判定した。かねて本発明者らは、バシトラシン５００〜８００μｇ／ｍｌを含有するＹＭ皿上で増殖できるスフィンゴモナスＳ８８菌株の自然バシトラシン耐性変異菌のほとんどが、スフィンガン多糖類を生産できないことを見いだしていた（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７）。この所見に基づいてこの特別クラスの変異菌の簡便スクリーニング法を完成した。
【００９２】
変異菌Ｓ８８ｍ２６０はこのＳｐｓ- Ｂａｃr 群の代表的な変異菌である。Ｓ８８ｍ２６０その他のＳｐｓ- Ｂａｃr 変異菌がエクソポリサッカライドを生産できなかった際のコロニーの外観は、野生型コロニーと比較して、平坦で、表面が粗く半透明であった。また、野生型のコロニーは光にかざして下から見ると狭い、光を屈折するハローで取り囲まれていた。これらの表現型の違いは、Ｘ. カンペストリスにおいて、野生型におびただしいムコイドがあるのに対して、対応するＧｕｍ- 変異菌は平坦な外観を持っている違いほど明白ではなかった。コロニーの表現型は、培養物を液体ＹＭ培地で増殖し、エクソポリサッカライドをイソプロピルアルコールで沈澱し、乾燥計量して確認した。いくつかのＳｐｓ- 変異菌はバシトラシンに感受性を持っていて、後にスフィンガン合成に不可欠であり、しかもバシトラシン耐性表現型に関する遺伝子とは区別されるべき遺伝子の特徴を備えていることが分かった。
【００９３】
遺伝子ライブラリーからプラスミドＤＮＡを取り、三元交配法により大腸菌からキサントモナスや、スフィンゴモナスに転移した（Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ，７７, ７３４７, １９８０）。Ｍｏｂ+ Ｔｒａ- 組換えプラスミド（Ｓ８８挿入断片を持つｐＲＫ３１１）を含有する供与菌の細胞、Ｍｏｂ+ Ｔｒａ+ ｐＲＫ２０１３プラスミドを含有するヘルパー細胞及びエクソポリサッカライド陰性の受容菌の細胞を比率５：２：１０で混合した混液を、グルコースを入れない非選択的ＹＭプレート中にスポットし、３０℃で６〜１６時間インキュベートした。次に、プレート中に、ヘルパー細胞と供与菌の細胞を排除するためのリファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）を入れ、かつ、組換えプラスミドを選択するために、ｐＲＫ３１１用としてテトラサイクリン（４〜１２μｇ／ｍｌ）、又はｐＳＥＢ２４用としてクラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を入れた。これらのプレート上に上記の交配混液１白金耳を展開して、プラスミドを受容したキサントモナスの株を単離した。スフィンゴモナスは元来ストレプトマイシンに耐性を持っているので、スフィンゴモナスが受容菌のとき、供与菌及びヘルパー細胞に対してストレプトマイシンがスフィンゴモナスの選択に使われる。
【００９４】
このようにして得たＳ８８菌株のプラスミドを受容した株が、Ｓｐｓ+ （盛り上がって丸く不透明で、光にかざして下から見ると、明るい輪で取り囲まれている）あるいはＳｐｓ- （平たく、粗く、半透明のコロニーで、輪がない）の、どちらであるか裸眼で判断して、その相補性を評価した。同様に、プラスミドを受容したキサントモナス菌から生育したＧｕｍ+ のコロニーは、Ｇｕｍ- の受容菌の艶がなく、光らないコロニーと比べて、外観がムコイド性である。
【００９５】
ライブラリー中のＳ８８のクローンをＳ８８の非ムコイド性変異菌中で直接同定しようとしたが、（ムコイドの表現型を明確に立証できなかったため）成功しなかった。そこでライブラリーを、一旦Ｘ. カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子の非ムコイド性変異体に転移してから、クローンを見いだす方法に切り替えた。これにより初期クローン「Ｓ８８ｃｌ」を見いだすことができたが、これについては下記で詳しく説明する。
【００９６】
Ｓ８８遺伝子ライブラリーを大腸菌から、ｇｕｍＤ遺伝子中にＢａｃr Ｇｕｍ- が欠損しているＸ. カンペストリス菌株Ｘ５９ｍ３１中に交配した（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７, １９９４; Ｔｈｏｒｎｅｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，３５９３, １９８７）。この属間交配では、いくつかのＧｕｍ+ Ｔｅｔr コロニーがＹＭプレート上で認められたが、このコロニーは約１０-3〜１０-4の頻度で出現すると考えられた。相補された変異体から、プラスミドをおのおの精製し、再び大腸菌に転移して制限酵素解析を行った。精製プラスミドをスフィンゴモナスＳ８８ｍ２６０に交配したところ、約１０％の接合完了体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）がＳｐｓ+ となった。一つのプラスミド（ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ）を回収し、これを使用してさらに実験を続けた。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、さらにいくつかのスフィンゴモナス菌株Ｓ８８から別個に単離したＢａｃr Ｓｐｓ- 変異菌、及びＸ. カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異菌とも相補した。属間交配ごとのプラスミドを受容した株が培地に分泌するエクソポリサッカライドを単離し、次に、薄層クロマトグラフィーを行い、酸水解物が受容菌の細胞の多糖類に存在している筈の糖残基を含有しているとの結果を得て、これらが多糖類であることを確認した。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、スフィンゴモナスではスフィンガン合成を、Ｘ. カンペストリスではキサンタンガム合成をそれぞれ復活させた。これらの結果は、プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、Ｂａｃr 多糖類陰性変異菌が失っていたエクソポリサッカライド生合成機能をコードしていたこと、及びある属の遺伝子が他の属の失なわれていた機能を回復できたことを示している。セグメントＳ８８ｃｌは、図１に示されるＳ８８ｃｌ△３の最も右の末端に７. ５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが付加されている点を除けば、Ｓ８８ｃｌ△３と同一である。Ｓ８８ｃｌからこの７. ５ｋｂｐセグメントを特異的に欠失させて、その派生物であるＳ８８ｃｌ△３を産生した。
【００９７】
上記で説明した、ガム生産（スフィンゴモナス属菌のスフィンガンガム、又はＸ. カンペストリスのキサンタンガム）の復活に有用なＤＮＡフラグメントの測定方法には再現性があり、別個の実験では新しいクローンが単離された。スフィンゴモナスＳ８８のＳｐｓ- Ｂａｃs 変異菌７６及び７８を相補するセグメントを、クローンライブラリーから直接スクリーニングする際、Ｓ８８ｃｌと部分的に重なり合っている三つの新しいクローンが形成された。これらのセグメントクローン３個は、おのおの長さが約２３〜２７ｋｂであった。３個のセグメントのうち、二つは変異菌Ｓ８８ｍ２６０を相補した。制限酵素切断部位地図を図１及び図６に示す。
【００９８】
上記の方法は、これらの菌株おのおののスフィンガンを増産するために有用な、スフィンゴモナス菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７、Ｓ１９４及びスフィンガン生産能を持つその他のスフィンガン菌株から単離したＤＮＡセグメントの決定に用いられる。
【００９９】
実施例３
ｓｐｓＢ遺伝子のＤＮＡ配列とＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列
プラスミドｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ４. ５::Ｔｎ＃７２からサブクローニングした３３００ｂｐのフラグメントのうち、ｓｐｓＢ領域の１９５０ｂｐの二本鎖ヌクレオチド配列を得た。コード鎖の配列を配列表（配列番号１）に示す。１つの長い読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）があり、これをｓｐｓＢと名付けた。コード領域はヌクレオチド３６１の位置のＡＴＧに始まり、１７７１の位置のＴＧＡ終止コドンまで続いていた。このＯＲＦはアミノ酸４７０個をコードし、ＯＲＦの先には推定リボソーム結合部位があった。標準三文字略記法による推定アミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示す。
【０１００】
実施例４
Ｓ８８セグメントのクローンと、Ｓ８８及びＳ６０の染色体ＤＮＡとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ△３のＤＮＡクローンは、隣接するＳ８８ＤＮＡ配列から派生したものであることを立証するため、プラスミドＳ８８ｃｌ△３ＤＮＡに標識を付け、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、変異菌Ｓ８８ｍ２６０、及び野生型ジェラン生産菌であるＳ６０から分離したＤＮＡ制限フラグメントとハイブリッド形成をおこなった。約１. ５、２. ４、４. ５、５. ９及び１２ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント中にハイブリッドを形成すると、野生型ＤＮＡ及び変異菌Ｓ８８ＤＮＡ両方のＤＮＡクローンの連続体と一致する。ＥｃｏＲＩ部位の一つはベクターのマルチクローニング部位から始まっているので、重なり合っているクローンであるＳ８８ｃ２、Ｓ８８ｃ３、及びＳ８８ｃ４をＥｃｏＲＩで消化すると、Ｓ８８ｃｌ△３であることが証明されている最も左の６. ６ｋｂｐフラグメントは、実際には１２. ８ｋｂｐとなる。Ｓ８８ＤＮＡとジェランを生産するＳ６０ＤＮＡとでハイブリッドを形成できることから、似ている遺伝子配列が存在しているが、遺伝子の組成が異なっている可能性があることが示唆された。これら二つのスフィンゴモナス菌株が分泌するエクソポリサッカライドの構造が似ているので、類似したトランスフェラーゼ遺伝子を持っていると考えられる。Ｓ８８−Ｓ６０の相同領域を図２に示す。別個のＤＮＡ相同性解析で、図３で示すように菌株ＮＷ１１とＳ８８の間の相同領域の位置を確定した。
【０１０１】
実施例５
菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４のスフィンガン生合成遺伝子クラスターのクローニング
スフィンゴモナスＳ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４からＤＮＡフラグメントを単離した。方法としては、菌株Ｓ８８に関する上記実施例と同様にした。菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４のＤＮＡフラグメントの制限部位地図は、それぞれ図２、図３、図９及び図１０に示す。１種又は多種の制限酵素によるＤＮＡの消化によって生じた制限酵素フラグメントの大きさを、２つの独立に単離されたクローンであるｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１及びｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ２についてここで挙げる。この大きさは、そのフラグメントのアガロースゲル電気泳動の移動度を、大きさが既知のフラグメント、つまり、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後のバクテリオファージラムダＤＮＡ、及びストラタジーンの「ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ」と比較して決定した。フラグメントの大きさは、上記の２つのクローンに含まれるＤＮＡ配列と一致する。
【０１０２】
スフィンゴモナスＳ１９４から単離したｃ１セグメントを含有するプラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１のフラグメントの大きさのデータを次に示す。ｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１のフラメントの大きさは次の通りである。（ＥｃｏＲＩ）＞２５、８．３、５．４及び１．５ｋｂｐ。（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３．０、９．７、８．３、５．４、２．８及び１．５ｋｂｐ。（ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２５及び２．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２５、５．８、３．９、２．０及び０．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ）＞２５、５．８及び４．７ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３．０、８．３、５．８、５．４、３．９、２．０、１．５及び０．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ）１５．０、８．３、５．８、５．４、４．７及び１．５ｋｂｐ。ｐＲＫ３１１ーＳ１９４ｃ２のフラグメントサイズは次の通りである。（ＥｃｏＲＩ）１４．５、１０．０、８．３、６．１、２．６及び１．３５ｋｂｐ。（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３、８．３、５．７、４．６、４．０、２．６、１．８、１．３５、０．７５、０．３５．及び０．２５ｋｂｐ。（ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２０、１２．８、４．６、２．１、０．７５及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２０、３．８、３．１、２．８、２．３、１．６５、１．６、１．３、１．２、０．９５、０．９、０．８及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ）＞２０、５．８、３．１、２．８、２．６、２．３、２．０、１．６及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３、８．３、３．８、３．１、２．４、２．３、１．６、１．３５、１．３、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．４５、０．３５及び０．３ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ）１４．５、８．３、４．９、３．１、２．４、２．３、２．０、１．６、１．３５、１．３、０．８５、０．４５及び０．２ｋｂｐ。
【０１０３】
実施例６
プラスミドｐＳＥＢ２６の構成
特異的な複製機能と接合交配機能、並びに、スフィンゴモナス属に好適で、かつ、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎと和合性がある薬剤耐性遺伝子を含有し、マルチクローニング部位を有する、プラスミドｐＳＥＢ２４とｐＳＥＢ２６（図５）を組み立てた。プラスミドｐＳＥＢ２４が広範囲宿主域を持つ反面、ｐＳＥＢ２６は大腸菌では複製できるが、スフィンゴモナス属やキサントモナス属のどちらでも複製することができない。まず、スタフィロコッカス・アウレウスのプラスミドｐＣ１９４（１９８２，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ａｎｄ Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５）から取られた１０３１ｂｐのＨｐａＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメント上のＣａｍr を、平滑末端に加工して、プラスミドｐＵＣ１３（１９８２，Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ，２５９）のＸｂａＩ平滑末端にライゲーションした。ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩセグメント上のこのプラスミドからＣａｍr カセットを取り除き、平滑末端にした後、ｐＵＣ１２中の独特なＳｓｐＩ部位と、二つあるＰｖｕＩＩ部位のうちの最も近い部位（これも平滑末端）との間に挿入した。このようして、Ａｍｐr かつＣａｍr であり、Ｘ−ＧａｌとＩＰＴＧとを添加すると青いコロニーを形成するプラスミドｐＳＥＢ２３を得て、ｐＳＥＢ２４を構成するため、ｐＳＥＢ２３から約２１３０ｂｐのＳｃａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをとり、ｐＭＭＢ６６ＥＨ（１９８６，Ｆｕｅｒｓｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４８，１１９）のＳｃａＩ−ＰｖｕＩＩ部分とライゲーションさせ、ｏｒｉＶ（ＲＳＦ１０１０からの広範囲宿主複製開始点）を保持させ、Ａｍｐr 遺伝子を再生した。プラスミドｐＮＨ−Ｋａｎ／ｏｒｉＴ（Ｈｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９２，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５７−６２）のｏｒｉＴ配列を含む２７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、３２００ｂｐのＰｖｕＩＩで直鎖状にしたｐＳＥＢ２３プラスミドと、平滑末端同志で結合してｐＳＥＢ２６を形成した。ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩのライゲーションにより再生したＢａｍＨＩ部位は、制限酵素処理に引き続き、付着末端にキャッピングを施し、再びライゲーションすることにより取り除かれた。
【０１０４】
実施例７
Ｓ８８ＤＮＡフラグメントのコピーを菌株Ｓ８８に導入したことによる多糖類Ｓ−８８の増産
菌株Ｓ８８から単離した図１に示すＤＮＡセグメントの特異的な制限フラグメントを、ＤＮＡライゲーションによりマルチコピープラスミドベクター中に挿入した後、上記の実施例２で説明した三元交配により野生型菌株Ｓ８８とＳ８８の子である非ムコイド性変異菌に転移した。ＤＮＡクローンを変異菌に転移すると、多糖類合成が復活する。細菌を液体培地で培養した後、組換えプラスミド含有菌株とプラスミド遺伝子を付加しなかった菌株が生産したスフィンガン多糖類の累積量を測定した。じゃま板付きフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋｓ）中で振盪しながら３０℃で２４時間増殖した後、２容量のイソプロピルアルコールを加えて、エクソポリサッカライドを沈澱させた。各菌株ごとに２〜３回づつ独立に培養して、実験を行った。沈澱物をフィルターに集め、８０℃で乾燥して、計量した。菌株毎の沈澱物の平均重量と標準偏差値を表３に示す。遺伝子のクローンのコピーを付加した組換え菌株のスフィンガンＳ−８８生産量は、通常セットの生合成遺伝子しか持たなかった野生型菌株のそれよりも大きかった。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
制限酵素地図、ｓｐｓＢ遺伝子のヌクレオチド配列及びこれを取り巻くＤＮＡは、標準組換えＤＮＡ法によって約３２ｋｂの領域の新しいサブフラグメントを無数に形成するに充分な情報であることが、当業者にとり明白である（図６）。さらに、これらの新しいフラグメントを本明細書で説明した方法により試験して、スフィンガン多糖類を同様に増産するセグメントを同定できることも、当業者にとり明白である。表３から、このサブフラグメントが小断片であると（例えば、ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ１２. ８）充分な生産刺激効果を示さないことが読み取れる。しかしながら、ほぼ全てのサブフラグメントは、増産を可能にしている。今日までの実験により、本発明者らは、ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｂ８. ６とｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ３がスフィンガン生産に対して最大の刺激効果があると信じている。
【０１０７】
この増産法では、継続的に組換えプラスミドを選択するために、培養物に抗生物質を存在させておく必要はない。
【０１０８】
この増産法は、一以上のＤＮＡフラグメントを染色体又は内因性の本来菌が持っていたプラスミドに挿入して、好ましくはこの染色体セグメントの単数又は複数の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを挿入することによって達成される。通常の技倆を持つ当業者であれば、内在の（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）細菌染色体、内因性の本来菌が持っていたプラスミド、あるいは外因性プラスミドベクターに、スフィンガン生産能を持つ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを挿入することにより、スフィンガン生産能を持つ細菌にＤＮＡフラグメントを導入することは容易である。本出願で立証されている試験結果では、このスフィンガン増産には、特定のプラスミドベクターの使用に対して依存性が認められないことは注目に値する。
【０１０９】
本発明の範囲には、上記で説明した遺伝子セグメント又は遺伝子群をコードするＤＮＡフラグメントのどれかと、遺伝子の発現をコントロールすることで知られているＤＮＡ配列、本発明を限定することなく例を挙げると、大腸菌のｌａｃプロモーターとを、融合させることも含まれている。
【０１１０】
実施例８
組換えＳ８８菌株が生産したエクソポリサッカライドがスフィンガンＳ−８８であることの同定
操作された菌株によって生産されたエクソポリサッカライドが受容菌の型と同一であることを確認するため、薄層クロマトグラフィーによって酸水解物中のモノサッカライド類を同定した。
【０１１１】
Ｘ. カンペストリスの細胞外キサンタンとスフィンゴモナスのスフィンガンＳ−８８を、２〜３容量のイソプロピルアルコールにより沈澱させて、液体培地から分離し、８０℃で乾燥して計量した。多糖類を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の水に５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。０. ６ｍｌ超小型遠心分離管中で、無水トリフルオロ酢酸（８８μｌ、Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ. から入手）を、７５μｌのＨＰＬＣ用の水（Ｂａｋｅｒ）及び２２５μｌの多糖類（５ｍｇ／ｍｌ）と混合して、９５℃で１６時間インキュベートした。加水分解物を真空乾燥し、ＨＰＬＣの水２００μｌに再懸濁して、新しい超小型遠心分離管に入れ、再び乾燥した後、ＨＰＬＣの水４５μｌに懸濁した。サンプル（２５μｇ／ｍｌ）は凍結して貯蔵した。糖標準液（Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンノース、Ｌ−マンノース、Ｌ−ラムノース及びＬ−フコース）を４ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＰＬＣの水に再懸濁した。コート済みで、チャンネルを形成した（ｃｈａｎｎｅｌｌｅｄ）シリカゲルクロマトグラフィープレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ ＣＦ２５４、１０２０ｃｍ、Ｅ. Ｍｅｒｃｋ）を、一晩０. ３ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 中に浸漬した後、室温で３０分間、さらに９５℃で１０分間乾燥した。サンプル１〜２μｌをスポットし、室温で２. ５〜３時間アセトン４０ｍｌ、ブタノール５ｍｌ及び脱イオン水５ｍｌからなる溶媒混液にクロマトグラムをさらして、混液を上昇させた。プレートは６５℃で３分間乾燥し、アセトン２５ｍｌ、アニリン０. ５ｍｌ、ジフェニルアミン０. ５ｇ及びリン酸３. ７５ｍｌからなる溶液に浸して染色した後、９５℃で３０分間乾燥した。Ｘ. カンペストリスがＳ８８ＤＮＡフラグメントの受容菌である場合は、グルコース、マンノース及びグルクロン酸が存在した。スフィンゴモナス菌株Ｓ８８がＸ. カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子の受容菌である場合は、ラムノース、グルコース、マンノース及びグルクロン酸がＳ−８８エクソポリサッカライドとほぼ等量で存在した。
【０１１２】
実施例９
スフィンガンＳ−８８、Ｓ−６０、ＮＷ−１１及びＳ−１３０の生産に対する、菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から得たＤＮＡフラグメントの刺激効果
上記の実施例５、６及び７で述べた一般法に従って菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から得たＤＮＡフラグメントを使用することにより、スフィンゴモナス菌株がスフィンガンＳ−８８、ジェラン（Ｓ６０）及びＮＷ１１を増産した。結果を次の表４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
一般法としては上記の実施例、特に実施例７で説明した技術や方法を用いて単離されたＤＮＡフラグメントの多数のコピーを挿入することにより、特定のスフィンゴモナス菌株から単離されたＤＮＡフラグメントを使って、異なるスフィンゴモナス菌株に（初めの菌株が生産するものとは異なる）スフィンガンを増産させようとするものである。
【０１１５】
本実験で確立された一般法においては、いずれかのスフィンゴモナス菌株のスフィンガン生産に不可欠な遺伝子材料を含有するＤＮＡフラグメントを、適当なプラスミドベクターその他の手段に挿入する。このようにＤＮＡを挿入したプラスミドベクターの多数のコピーを、ＤＮＡを単離したスフィゴモナスと同じ菌株あるいは異なる菌株のスフィンガン生産能を持つ菌又は非ムコイド性変異菌に導入する。この場合ＤＮＡが導入されたスフィンゴモナス菌株は、スフィンガン生産菌又はスフィンガン生産能を持つ菌のスフィンガン生産能を持たない変異菌のいずれでもよい。同一の発酵条件では、このように操作したスフィンゴモナス菌のスフィンガン生産量は一般に、操作しない、変異体ではないスフィンガン生産菌の生産量より大きい。
【０１１６】
次の実験により、ＤＮＡフラグメントの多数のコピーをスフィンゴモナス菌株その他の細菌に組み入れることは常法であることを証明する。
【０１１７】
実施例１０
Ｘ. カンペストリスの染色体へのラクトース消費遺伝子（ｌａｃｔｏｓｅ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）の挿入
制限酵素とＤＮＡライゲーションを用いる標準クローニング法により、Ｘ. カンペストリス中で複製できないプラスミドに担持させた、Ｘ. カンペストリスの予めクローニングしたＤＮＡセグメントに隣接して、トランスポゾンＴｎ９５１から得られたラクトース消費遺伝子を挿入した（Ｔｈｏｒｎｅ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｉｎｄｕｓｔ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３, ３２１，１９８８）。その後、この組換えプラスミドを接合によりＸ. カンペストリス中に転移した。受容菌内では、ラクトース消費遺伝子の隣に位置するＸ. カンペストリスから得られた相同ＤＮＡが、通常の相同組換えによって細胞ＤＮＡと組換えられ、ラクトース消費遺伝子が細菌染色体と隣合わせに結合した。この結果、クローニングされたセグメントが細菌染色体に安定して挿入されることになった。このことは、上記の論文中で図を用いてより完全に説明されている。本発明以外でも、この方法によって遺伝子を細菌に挿入している例が数多く存在している。
【０１１８】
上記で説明したＤＮＡ組換えでは、事前に、プラスミドをベクターとして使用し、外因性ＤＮＡを細菌中に導入する必要がないことは注目に値する。ＤＮＡセグメントをバクテリオファージあるいはトランスポゾンに担持させると、部位特異的ＤＮＡ組換えによって自然に細菌染色体に挿入されることが広く知られている。通常、バクテリオファージは特異的に１ないし２〜３個の位置で挿入するに過ぎないが、トランスポゾンは通常、多くの、実質的に任意の位置で挿入することができる。また、プラスミドなどのクローニングベクターと結合したＤＮＡを細胞内に輸送する必要はない。ＤＮＡフラグメントは形質転換によって、細胞ＤＮＡと組換える能力を保持しながら細菌細胞内に入ることができることがよく知られている。
【０１１９】
実施例１１
任意に選択された数個の異なる位置において、カナマイシン耐性をコードする遺伝子を、スフィンゴモナスＳ８８菌ＤＮＡへ部位特異性挿入する
この実施例においては、クローニングされたＤＮＡのセグメントをスフィンゴモナスの細胞ＤＮＡに挿入することは、容易に実施できるものであることを証明する。まず、Ｓ８８Ｅ１２. ８フラグメント（図１参照）を、プラスミドベクターｐＳＥＢ２６のマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＩ部位にライゲーションした（図７）。プラスミドｐＳＥＢ２６は、図５で示すｐＳＥＢ２４のように、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、マルチクローニング部位、Ｌａｃセグメント及びｏｒｉＴを持っている（図５参照）。しかしながら、プラスミドｐＳＥＢ２４が広範囲宿主域のｏｒｉＶ配列を持つが、プラスミドｐＳＥＢ２６は狭い宿主域の複製開始点を持つということで、プラスミドｐＢＲ３２２とは異なる。ｐＢＲ３２２の複製開始点は、大腸菌内におけるプラスミドの複製はできるが、スフィンゴモナス内では複製できない。したがって、プラスミドｐＳＥＢ２６内にクローニングされたＤＮＡ配列がスフィンゴモナス内で存続する唯一の方法は、プラスミドｐＳＥＢ２６が細胞あるいは培養物から消失する前に、プラスミドｐＳＥＢ２６を染色体や、内因性プラスミドなどの細菌ＤＮＡに組み込むことである。次に、このようにして得たｐＳＥＢ２６−Ｓ８８Ｅ１２. ８プラスミドを、常法によりトランスポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ（１９９１, Ｋｌｅｃｋｎｅｒ, ｅｔ ａｌ．，２０４, ｐｐ. １３９〜１８０）との突然変異生成にさらした。非抑制的な宿主ＨＭＳ１７４における転位による突然変異誘発は、ラムダバクテリオファージＮＫ１３１６によって担持されるＴｎ１０派生物１０３（ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ／Ｐｔａｃ−ＡＴＳｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）による。その結果、カナマイシン耐性遺伝子がプラスミドに挿入された。また、Ｓ８８Ｅ１２. ８セグメント内のそれぞれ異なる位置にあるカナマイシン耐性遺伝子の数個の別個の挿入断片を単離した。次に、このようにして得た組換えプラスミドおのおのを、三元交配法によりスフィンゴモナスＳ８８内に別個に転移して、カナマイシン耐性の子孫を選択した。事実上すべての場合、カナマイシン耐性遺伝子の両側に位置するＳ８８ＤＮＡ配列が受容細胞の染色体と組換えられ、カナマイシン耐性遺伝子が細菌染色体に組み込まれた。細菌染色体に組み込まれることにより、ベクタープラスミドがスフィンゴモナス内で複製することができないにも拘らず、カナマイシン遺伝子は存続することができた。
【０１２０】
この実施例は、外因性ＤＮＡ配列（この場合、カナマイシン耐性遺伝子）を受容菌に導入して、導入遺伝子を細菌染色体に組み込むことができることを示している。組み込みの位置は、その遺伝子に隣接するＤＮＡ配列によって決定される。この実施例では、外因性遺伝子は菌株Ｓ８８のＥ１２. ８セグメント内の、相異なる部位に組み込まれた。相同組換えによる組み込みは、日常的に実施されている遺伝子操作法である。
【０１２１】
実施例１２
ＤＮＡの配列決定の追加実験とその解析
図６に示すようにＤＮＡの両鎖について、ＢａｍＨＩ部位の１ｂｐから２８．８０４ｂｐまでの間の配列を決定した。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシヌクレオチド鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３−５４６７）が、エクソヌクレアーゼＩＩＩとＳＩヌクレアーゼを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）上にクローニングされたＤＮＡの配列決定に用いられた。内部シーケンシングプライマーも使用した。さらに、ＣｏｒａｌＳｏｆｔｗａｒｅ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のＳｕｐｅｒＣｌｏｎｅ及びＳｕｐｅｒＳｅｅプログラム、並びにＫｙｔｅａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）により、膜貫通タンパク質領域の配列を解析した。また、「ｂｌａｓｔｐ」プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０）により、ＮＣＢＩの膨大なデーターライブラリーから相同タンパク質セグメントを同定した。ナイロン膜とＧｅｎｉｕｓTM１キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いる標準法により、ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。
【０１２２】
実施例１３
スフィンガンＳ−８８生合成に関与する遺伝子のクローニング
本実施例は一部を実施例２と同様にして行った。本発明者らは、かねてから、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８のスフィンガン多糖陰性（Ｓｐｓ- ）変異株のほとんどは、バシトラシンを含有するＹＭプレートでも増殖できることを見いだしていた（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。マッピング実験（後述）の結果、これらの変異株をすべてｓｐｓＢと名付ける遺伝子に分類した。図９及び図１０に列記した代表的なＳｐｓＢ- 変異株（２６０、２６５及び１０２ｗ）は、バシトラシン耐性（Ｂａｃr ）でもあった。反対に、ｂａｃ８菌株は、始めＢａｃr として選択された代表的な菌株であったが、同時にＳｐｓ- でもあることが示された。実施例２で述べたように、Ｓｐｓ- Ｂａｃr 変異株でスフィンガンＳ−８８を形成しようとする試みは失敗に終り、代わりに野生型コロニーよりも平坦で、表面が粗く、半透明の外観を持つコロニーが得られ、いずれのコロニーも下から光にかざして見ると、光を屈折する狭いハローによって囲まれていた。アルコールに沈澱するエクソポリサッカライド類が出現しなかったので、Ｓｐｓ- 変異株はスフィンガン類を液体ＹＭ培地中に分泌できないものと判断した。Ｓｐｓ- Ｂａｃr 変異株の小さいフラクションは、第二の突然変異を持っていた。例えば、変異株１０２ｗのコロニーは黄色ではなく白色であった。変異株１３４ではｓｐｓＢばかりでなく、ｒｈｓＤでも変異があった。変異株５４と３０２では、ｓｐｓＢのみでなくｓｐｓＫもが欠損していた。図９の遺伝子地図の真上に示しているＳｐｓ-変異には、自然発生のものと、紫外線又はエチルメタンスルホン酸にさらして変異させたものとがある。本実施例で実験したこの他の突然変異は、すべて（接頭字「Ｙ」又は「Ｂ」を付けて、図９、１０に示している）、トランポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ１０１ｋａｎの無作意挿入により形成したものである。
【０１２３】
広範囲宿主コスミドｐＲＫ３１１に、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８から遺伝子ライブラリーを構築し、プールしておいたクローンを接合交配により大腸菌からＳ８８ｍ２６０に転移した。しかしながら、Ｓｐｓ+ のコロニーは、スクリーニングした１０3 〜１０4 のＴｅｔr プラスミドを受容した株に、またも、生じなかった。そこで、ライブラリーを予め単離してあったＸ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- （ｇｕｍＤ）変異株（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７、及び、Ｔｈｏｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：３５９３−３６００）に転移した。ｇｕｍＤ遺伝子は、キサンタンガムを組み立てる第一工程で、グルコース−６−リン酸をＵＤＰ−グルコースからイソプレニル−リン酸に転移するために必要である（Ｃａｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰａｔｅｎｔＷＯ８７／０５９３８、及び、Ｉｅｌｐｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：２４９０−２５００）。Ｘ．カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子を含有するＤＮＡセグメントによって、スフィンゴモナスのＢａｃr Ｓｐｓ- 変異株がスフィンガンＳ−８８合成を回復できたことから、スフィンガンＳ−８８の組み立ても、グルコースで始まり、スフィンゴモナスからの酵素は、Ｘ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異株を相補できるかもしれないと考えた（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。属間交配からは、ＹＭプレート上のＴｅｔr プラスミドを受容した株１０3 〜１０4 につき約１の頻度で、Ｘ．カンペストリスのＧｕｍ+ コロニーが認められた。
【０１２４】
大腸菌を用いた形質転換によって、相補されたＸ．カンペストリス変異株からプラスミドを精製した後、スフィンゴモナスＳ８８変異株２６０に交配した。プラスミドを受容した株のうち約５〜２５％がＳｐｓ+ となった。ベクター単独（ｐＲＫ３１１）の場合の方が、より大きな組替えプラスミドの場合よりも、転移の頻度が１００倍ないし１０００倍高かった。ほとんどの組替えプラスミドはスフィンゴモナスと交配させると、大きな欠失が発生するが、ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１だけは、欠失を起こすことなくポリマー生産能を回復し、これを使用して実験を継続した。図１、図６、図９及び図１０ではＳ８８ｃ１の２１ｋｂｐからなる最左側部分をサブクローンｃ１△３として示している。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１によって、各々別個に単離した菌株Ｓ８８のＢａｃr Ｓｐｓ-変異株及びＸ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異株の数種が多糖の合成を回復した。属間交配の度に、プラスミドを受容した株が培養基中に分泌する多糖類を単離して、薄層クロマトグラフィーを実施し、酸水解物が受容細胞の多糖として期待されている中性糖を含有していることを確認した。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１を持つスフィンゴモナス変異株２６０が分泌するエキソポリサッカライドにはグルコース、マンノース及びラムノースが含有されていたが、プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１を持つＸ．カンペストリス変異株ｍ３１からのものにはグルコースとマンノースしか含有されていなかった。さらに、加水分解条件下のため酸性糖の回収量は一貫して低かったが、多糖は各々グルクロン酸を含有していた。
【０１２５】
ライブラリーをスクリーニングしてＳｐｓ- Ｂａｃr 変異株７６及び７８を相補するセグメント求め、図９及び図１０の左側方向にクローニングした領域を広げていった。プラスミドを受容した株１０4 〜１０6 をスクリーニングして、部分的にＳ８８ｃ１セグメントと重なり合うさらに４個のクローン（Ｓ８８ｃ２、ｃ３、ｃ４及びｃ５）を得た。同様にして、Ｓｐｓ- 変異株４３、７１及び１０４を相補することにより、クローンｃ６を単離した。これら５個のクローニングされたセグメントは、各々長さが２２〜２８ｋｂである。各セグメントの少なくとも１末端を図１０に示す。さらに、クローンｃ２とサブクローンｃ１△３のどちらにも相補されない約１５個からなる１群のＳｐｓ- 変異株を同定した。これらの変異株の中で、ｃ１△３よりも約８ｋｂｐだけ長く右側に広がっているｃ１全長クローンにより相補されたものは一つもなかった。また図３のｃ２よりも約１８ｋｂｐだけ長く左側に広がっているｃ６によって相補されたものも一つとしてなかった。このように「同一連鎖群から外れた」（「ｕｎｌｉｎｋｅｄ」）１群の変異株は、スフィンガン合成に不可欠であるが、しかし図９及び図１０に示す遺伝子クラスターとは直接に連続しない、さらに他の遺伝子の存在を示唆している。
【０１２６】
実施例１４
機能的相補によるｓｐｓ遺伝子のマッピング
Ｓｐｓ- 点変異株を接合の受容菌として用いる相補性検定により、ｓｐｓＧ、ｓｐｓＫ、ｓｐｓＦ、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ、ｓｐｓＢ及びｒｈｓＤ遺伝子の境界を決定した。結果を要約して図９に示す。サブクローニングされた小さいセグメント又はそれより大きいＤＮＡセグメントのを持つ組替えプラスミドを、大腸菌の中でｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる挿入突然変異にさらし、菌株Ｓ８８のＳｐｓ- 変異株との交配によって転移した。これには交配可能な広範囲宿主プラスミドベクターであるｐＲＫ３１１及びｐＳＥＢ２４（図５）を使用した。担持しているプラスミドの耐薬性遺伝マーカーを受け取ったプラスミドを受容した株は、コロニーの外観によって、Ｓｐｓ+ 又はＳｐｓ- と記録した。Ｂａｃr Ｓｐｓ- Ｓ８８変異株は始めＥ４．５サブクローンとして位置づけ、その後、Ｅ４．５セグメントをｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの無作意挿入変異にさらした。位置Ｂ２３１及びＢ２３０（図９及び図１０）に挿入した時には、変異株２６０がスフィンガン合成を回復するのに影響しなかったが、Ｂ２３３、Ｂ２３９及びＢ２３８に挿入した時には相補が阻止された。変異株１３４は、セグメントＢ８．６によって相補されたが、Ｅ４．５又はＥ５．９のいずれによっても相補されなかった。変異株１３４では、ｓｐｓＢ遺伝子と、さらに隣接のｒｈｓＤ遺伝子の両方が欠損していた。Ｂ８．６セグメントをｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる突然変異にさらし、Ｂ４４１、Ｂ４４０、Ｂ４３８、Ｂ４３７及びＢ４３５に挿入することによる相補性のパターンを分析して、ｒｈｓＤ突然変異のより正確な位置を測定した。変異株５４及び３０２も、ｓｐｓＫとｓｐｓＢ遺伝子が欠損している二重変異株であると考えられた。ｓｐｓＦ変異株（図９の６２、６８及び９４）は局在し、かつ、セグメントＢ１２．６及びｃ１△３によって相補されず、またクローンｃ３とｃ５によってスフィンガンＳ−８８の合成が回復されるため、隣接のｓｐｓＤＣＥと分けた。Ｅ６．６フラグメントの挿入突然変異に続いて、連続しているｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ及びｓｐｓＥ遺伝子が相補された結果も併せて図９及び図１０に示す。この相補結果から変異株７６と７８を含むグループと、変異株６９、７２、ｂ１０４、３、９及び４１を含むグループの二つのグループがあることが示唆された。その後、ＤＮＡ配列の分析によって、後者のグループは連続している二つの別個の遺伝子、ｓｐｓＣとｓｐｓＥとに分けられた。ｓｐｓＧ突然変異（図９の１１、４３、７１、８１及び１０４）は、ｃ６クローンとフラグメントＢ１２．６のＢ４．５サブフラグメントとによって相補された（図９及び図１０を参照されたい）。Ｂ１２．６セグメントの挿入突然変異によって、プラスミドＹ６５２、Ｙ６３５、Ｙ６３６、Ｙ６５３、Ｙ６４０及びＹ６４１が産生された。このうち、Ｙ６５２とＹ６４１のみがｓｐｓＧ変異株を相補することができた。
【０１２７】
実施例１５
ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを染色体とプラスミドに挿入したことによる表現型
Ｓ８８ＤＮＡクローンのセグメントを交配可能な狭域宿主Ｃａｍr プラスミドｐＳＥＢ２６（図９及び図１０）にライゲーションし、大腸菌内でｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる挿入突然変異にさらした後、接合によって野生型（Ｓｐｓ+）スフィンゴモナス菌株Ｓ８８に転移した。これらのプラスミドはスフィンゴモナス属では複製できないため、Ｋａｎr 遺伝子を維持するためには、細菌の染色体との組み替えが必要である。Ｋａｎr 及びＣａｍs である組み替え体はプラスミド配列を保持しないため、この群のみを選択した。これらのＤＮＡ置換の物理的構造の確認は行っていないが、常に同一のプラスミド、菌株及び選択方法を使用することによって、部位特異性な染色体欠失を生じさせ、制限地図作製とＤＮＡハイブリダイゼーションによってこれらの二重組替えを確認した。Ｋａｎr Ｃａｍs 染色体の組み替え体のコロニーは、Ｓｐｓ+ 又はＳｐｓ- と判定した（挿入体には接頭字「ｃ」を付けて図９に示している）。Ｓｐｓ- 表現型を示す変異株（ｃＹ７７６、ｃＹ７５７、ｃＹ７７１、ｃＹ７７０、ｃＹ６７６、ｃＢ５８９、ｃＢ５８３、ｃＢ５８０、ｃＢ５７９、ｃＢ３００、ｃＹ７２６、ｃＹ７２５、ｃＹ６７６、ｃＹ６７３、ｃＹ７２１及びｃＹ６０２）については、二重組替えが実際に発生したと信じることが、合理的である。しかしながら、相同領域の一個所にて組換えの行われたＳｐｓ+ 組み替え体は、プラスミド全体が染色体に組み込まれたため、その染色体では、ある遺伝子は欠損し、ある遺伝子は正常のままである可能性がある。
【０１２８】
相同領域の二個所にて組替えを行う際の不確実性を排除するため、染色体に大きな部位特異的欠失をつくった後、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの単独挿入したＳ８８ｃ２の全ＤＮＡセグメント、又は、Ｓ８８ｃ３の全ＤＮＡセグメントのいずれかを持つ複製プラスミドを導入して、一部の遺伝子を不活性化させた。挿入位置とこれによるＳｐｓ+ 又はＳｐｓ- の表現型を、接頭字「ｐ」を付けて図９に示す。染色体の変異戦略とプラスミドの変異戦略とはお互い整合し、必須（- ）領域と非必須（+ ）領域の両方が観察された。
【０１２９】
実施例１６
ＤＮＡ配列：Ｇ＋Ｃ含量、希少コドンの使用及び翻訳開始配列
２８、８０４ｂｐのＤＮＡ配列について、両鎖を測定した（配列番号３を参照されたい）。このクラスター中の典型的なスフィンゴモナス遺伝子の平均プロフィル（及び標準偏差）を、Ｇ＋Ｃ含量のゆがみ、希少コドンの頻度、及び「シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）」配列又は翻訳開始配列によって決定した。（表５）。各遺伝子とも第三コドンの位置でＧあるいはＣの頻度が高いことが特色となっていた。この研究の初期において、ｒｈｓＡＣＢＤオペロンのコドン、及びｓｐｓＢ、Ｄ、Ｃ及びＥ遺伝子のコドン２５００個を解析して、一群のスフィンゴモナス属のまれにしか使われないコドンを同定した。希少コドン各々が、この群に存在する比率は全体に対して０．２％以下で、群の構成はＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＴＧＴ、ＧＧＡ、ＡＴＡ、ＣＴＡ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＡＡＡ、ＴＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＡＣＡ及びＡＣＴを含んでいた。大腸菌においては、通常、１６ＳｒＲＮＡの３’末端を相補する配列に連続する下流から翻訳が開始される（Ｓｈａｉｎｅ ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ，２９７４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１：１３４）。Ｓ．ポウシモビリスＤＳＭ１０９８の１６ＳｒＲＮＡを相補する「シャイン−ダルガノ」の相同配列は、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧである（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：１１５−１１８）。
【０１３０】
このクラスター中の遺伝子が平均遺伝子プロフィルに合致し、かつ、変異してＳｐｓ- 表現型が生じたならば、そのものこそ「ｓｐｓ」なる名称を与えることができる。しかしながら、本発明者らのタンパク質類似性サーチからは、ｓｐｓＧ、Ｉ及びＦ遺伝子の機能について、有意の示唆を得ることができなかった。さらにまた、典型的な遺伝子プロフィルを満足する読み取り枠（ＯＲＦ）が４個あったが、コンピューターデーターバンクではタンパク質配列について有意の類似性を発見することはできなかった。しかしながら、これらの推定遺伝子が変異しても、目に見えて多糖合成に変化をおこさなかったため、同定していないフレームとの意味から、「Ｕｒｆ」なる略記を付けた。４個のＵｒｆ配列（３２、２６、３１及び３４）があり、推定されるタンパク質のキロダルトン単位の大きさに応じて名称を付けた。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
実施例１７
グリコシルーＩＰトランスフェラーゼをｓｐｓＢ遺伝子として同定
紫外線放射又は化学的変異原にさらした後に単離されたＳｐｓ- 突然変異のほとんどは、ｓｐｓＢ遺伝子上のものであった。グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードすると信じられている他の遺伝子産物とＳｐｓＢの推定アミノ酸は非常に似ているので、このＳｐｓＢタンパク質はスフィンガンＳ−８８を組み立てる第一工程を触媒すると信じられている。図１１は、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼとガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼと推定されるアミノ酸配列のアラインメントである。これらのタンパク質のＣ末端半分は、お互いにかなり相同性がある。Ｎ末端領域ではこれほど大きな相同性はないが、ＳｐｓＢタンパク質には膜貫通ドメインであると示唆されている数個の疎水性の領域があるので（図１１のアンダーライン部分）、ＳｐｓＢタンパク質はＳ．エンテリカのＲｆｂＰタンパク質（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，６９５−７１３）と相似している。ＳｐｓＢの疎水性ドメインはアミノ酸３５〜５９（＋２．２平均ハイドロパシー）、６８〜８６（＋１．７）、１０５〜１２３（＋２．３）及び２８２〜３０３（＋２．９）を含んでいる。また、ＳｐｓＢタンパク質の最後の疎水性セグメントの位置は、これらの関連遺伝子産物に共通していて、相同性が最大である領域に続いているタンパク質の中央部分に所在している。
【０１３３】
ＤＮＡ配列から推定されるドメインをコードするｓｐｓＢを、相補性検定により確認した。Ｅ４．５セグメント中のｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入を変化させることより、Ｂａｃr Ｓｐｓ- 変異株の相補に干渉するかどうかを観察した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入部位と、相補の結果としての「＋」又は「−」を図９のｓｐｓＢ遺伝子の上部に示す。三つの部位のｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入では、Ｓｐｓ- 変異株Ｓ８８ｍ２６０（Ｂ２３３、Ｂ２３９及びＢ２３８）にスフィンガン合成を回復することができなかった。その反面、Ｂ２３１とＢ２３０を含む数個の隣接する部位に挿入したところ失われていた機能を回復することができた。
【０１３４】
実施例１８
スフィンゴモナスＳ８８のラムノース生合成オペロン
ｒｈｓＡＣＢＤ遺伝子によってコードされているタンパク質の推定アミノ酸配列は、ｄＴＴＰ及びグルコース−１−リン酸から４工程でｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースを合成する、Ｓ．エンテリカのグループＢの酵素及びＸ．カンペストリスの酵素とよく似ている（図１２から図１５）。本発明者らは、グルコース−１−リン酸、ｒｈｓＡ遺伝子によってコードされているチミジリルトランスフェラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びｒｈｓＢ、Ｃ及びＤ遺伝子によってコードされている連続した触媒工程には、従来からの命名法を用いた。しかしながら、スフィンゴモナス属のオペロンは次の４点で独特である。第一に、遺伝子の順序ＡＣＢＤ→が、Ｓ．エンテリカ（ＢＤＡＣ→）や、Ｘ．カンペストリス（ＢＡＣＤ→）のいずれとも異なる。第二に、シストロン間領域がほとんど存在していない。開始コドンと終止コドンとが重なり合っているか、間隔が狭く、ｒｈｓＡ−ＡＴＧＡ−ｒｈｓＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＴＧ−ｒｈｓＢ−ＴＧＡＴＧ−ｒｈｓＤとなっている。第三に、ｒｈｓＡＣＢＤの平均Ｇ＋Ｃ含量が比較的高く（６６％）、三番目のコドンの位置では特に高く（８９％）、しかもオペロンを通じて一様である。第四に、このクラスター中の周囲の遺伝子でも、またスフィンゴモナス属において関係がない他の種の遺伝子でも同様にＧ＋Ｃ含量が高い。
【０１３５】
当初ｒｈｓクラスターからは変異株（＃１３４）一個のみが単離されたが、同時にｓｐｓＢ遺伝子でも第二の突然変異が生じたように見えた。Ｒｈｓ- 突然変異は、致死性である可能性があると思われた。したがって、ｒｈｓクラスター内で単一の突然変異を特異的に操作することによって、スフィンガン合成が阻止されるかどうかを試験した。まず、ｒｈｓ遺伝子の端から端までｓｐｓＤ遺伝子にわたって大きく染色体を欠失させたＳ８８変異株を構築し（図１０の△Ｔｎ３６５）、失われたＤＮＡを持ち、特定部位にｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入したプラスミドを導入した。プラスミドの挿入位置がｓｐｓＤ、Ｃ、Ｅ、Ｂ又はｒｈｓオペロンにある場合には、細胞はＳｐｓ- のままであった。しかしながら、Ｕｒｆ３２、２６、３１、３４、ａｔｒＤ又はａｔｒＢのいずれかに挿入した場合は、欠失突然変異の相補に干渉せず、その細胞はＳｐｓ+ となった。
【０１３６】
実施例１９
スフィンゴモナスＳ８８のグリコシルトランスフェラーゼ
ｓｐｓＱ、ｓｐｓＫ及びｓｐｓＬの３遺伝子がグリコシルトランスフェラーゼをコードしているように見受けられる。しかしながら、タンパク質がこれ以外のグルコシルトランスフェラーゼ及びラムノシルトランスフェラーゼ類に対して限られた局所的な相同性しか示さなかったため、グリコシルトランスフェラーゼ類の糖特異性は、配列解析のみで決定することはできなかった。他の研究者らも着目しているように、グリコシルトランスフェラーゼは、同一の結合における同一の糖に付着する、単一の細菌由来の酵素でも全く互いに異なる（Ｇｌｕｃｋｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０４５−７０５５）。推定ｓｐｓＱ遺伝子産物は、ラムノシルトランスフェラーゼをコードすると信じられている大腸菌Ｋ−１２のｇｎｄに隣接するｏｒｆ１１（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．, １７４：４１４４−４１５６）に類似し、さらに、Ｒ．メリロチのＥｘｏＯ及びＥｘｏＵグルコシルトランスフェラーゼ（Ｒｅｕｂｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９３，Ｃｅｌｌ，７４：２６９−２８０）とも類似していた。ｓｐｓＱ遺伝子はスフィンガンＳ−８８合成に必須である。Ｓ８８ｃ２セグメントを有するプラスミド内のｓｐｓＱ遺伝子に（図９のＺ２０６）、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入して、突然変異を起こしたプラスミドをｓｐｓＧＳＲＱＩ遺伝子の染色体を欠失しているＳ８８細胞に導入した。受容細胞は生存可能であったが、多糖の合成は阻止された。推定ｓｐｓＬ遺伝子産物は、ドッドマトリックス分析による比較では、ｓｐｓＱ産物と類似し、さらにＳ．エンテリカのラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｔｂＮ）及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの推定アベクオシルトランスフェラーゼ（ａｂｅｑｕｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ともいくらか局所的に類似していた（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４０８４−４０８８）。ｓｐｓＫ類似タンパク質の検索を行ったが、圧倒的多数が共通して推定ＵＤＰ結合部位を含有するグリコシルトランスフェラーゼであるという僅かな類似性を認めたに過ぎなかった。これには、ＵＤＰが関与している可能性があるので、グルコシル又はグルクロノシルトランスフェラーゼであることが示唆されている。トランスポゾン挿入によらない変異株５４と３０２同様、ｓｐｓＫ遺伝子に特異的な挿入を行った変異株（図９のｐＹ８８２）は、生存可能ではあったが、多糖を作ることはできなかった。
【０１３７】
実施例２０
細菌による多糖の分泌
必須遺伝子産物の配列が類似していることから、各種細菌によって多糖類を分泌させる共通の機構が考えらる。この配列の比較（表６）では、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ、ｓｐｓＪ、及びｓｐｓＳの五つものｓｐｓ遺伝子がスフィンガン類の分泌に関与しうることを示していた。Ｒ．メリロチの「エクソ」タンパク質など、かなりの情報が蓄積しているタンパク質の配列関係を要約して表６に示す。しかしながら、機能的に関係のあるタンパク質類は、この表が示しているものよりも大きい集団である。５１、２９及び２２個のアミノ酸からなるＳｐｓＤタンパク質の各々異なる三つセグメントは、それぞれＥｘｏＦと２９％、３１％及び３６％の同一性があった。開始と終止コドンが重なり合い（ＴＧＡＴＧ）、しかも互いに連続するｓｐｓＣとｓｐｓＥ遺伝子は、ＥｘｏＰ内の二つの異なるドメインに似たタンパク質をコードしている。類似するＳｐｓＣ−ＥｘｏＰ配列には、最近、細菌性Ｏ−抗原の鎖長測定で示されたモチーフ（ＰＸ2 ＰＸ4 ＳＰＫＸIIＧＸＭＸＧ）が含まれていた（Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：ｌ９１−２０３）。９２、３０及び１９個のアミノ酸からなるＳｐｓＣの三つのセグメントは、ＥｘｏＰのＮ末端半分から取った同様な順序の配列に、それぞれ２２％、３０％及び４２％同一であり、７５及び９８個のアミノ酸からなるＳｐｓＥの二つのセグメントは、ＥｘｏＰのＣ末端半分に３２％及び２９％同一であった。３７、２０及び４４個のアミノ酸からなるＳｐｓＳの三つのセグメントは、ＥｘｏＴにそれぞれ３８％、５５％及び２３％同一であった。推定ＳｐｓＪタンパク質は、ＫｐｓＴ、ＢｅｘＡ及びＡＢＣ担体と推定ヌクレオチド結合ドメインを共有していて、お互いにある程度の類似性を持っていた。ｓｐｓＲ遺伝子は、スフィンガン合成に必要ではないが、その遺伝子産物は、細菌性及び真菌性多糖リアーゼに僅かに類似していた。したがって、ｓｐｓＲ遺伝子は、細胞あるいは基質の表面のいずれかからグルクロン酸含有スフィンガン類を放出したり、あるいはポリマーを炭素源として再使用することに重要であるかもしれない。
【０１３８】
図９及び図１０に示すように、自然点突然変異や、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ及びｓｐｓＳ遺伝子へのｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入では、生存可能であるが、培養上清中にスフィンガンＳ−８８を蓄積しなかった。一方、Ｒ．メリロチの類似遺伝子の突然変異（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：４４７−４５７）、及びＸ．カンペストリスの類似遺伝子の突然変異は、致死性であった。ｓｐｓＪの染色体にｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入すると、Ｓｐｓ- となる。しかしながら、染色体が大きく欠失している変異菌株中のマルチコピープラスミドに保持されたｓｐｓＪに、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入すると、Ｓｐｓ+ か、Ｓｐｓ- のいづれかになった。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
各タンパク質の分泌の役割に対しての参考文献
ＥｘｏＦ，ＥｘｏＰ，ＥｘｏＴ（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：１９１、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ａｎｄＷｅｉｓｂｌｕｍ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５、及び、Ｒｅｕｂｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９３，Ｃｅｌｌ，７４：２６９）
ＧｕｍＢ，ＧｕｍＣ，ＧｕｍＪ（Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０３３、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：１９１、及び、Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０４５）
ＫｐｓＤ ａｎｄ ＫｐｓＴ（Ｗｕｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４０２５、及び、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：１８６３）
ＢｅｘＤ，ＢｅｘＣ，ａｎｄ ＢｅｘＡ（Ｋｒｏｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：１８５３）
【０１４１】
実施例２１
溶菌性又は毒性タンパク質のＡＢＣ輸送体
二つの連続した遺伝子であるａｔｒＢとａｔｒＤが、ｓｐｓクラスター内に位置していた。この２つの遺伝子は、溶菌性又は毒素様タンパク質のＡＢＣ輸送体や、輸送用補助タンパク質をコードしていると考えられる、これまでに、溶血素遺伝子（ｈｌｙＡ）が、現在ではスフィンゴモナス属として再分類されているシュードモナス ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）に同定された。本発明者らの菌株では、ヒツジ赤血球を含有する寒天プレート上で決定的な溶血現象を検出できなかったので、今回は「ｈｌｙ」なる略称を使用しなかった。ａｔｒＢ遺伝子のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸の約４８％は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のシクロリシン（ｃｙｃｌｏｌｙｓｉｎ）ＡＢＣ担体のアミノ酸と同一であった。ａｔｒＢ遺伝子産物は、それぞれ溶血素と白血球毒素を輸送する大腸菌のＨｌｙＢタンパク質及びパスツレラ ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）のＬｋｔＢタンパク質と非常によく類似していた。また、ａｔｒＢのＣ末端半分は、Ｒ．メリロチのＮｄｖＡタンパク質のＣ末端半分や、ヒト多剤耐性タンパク質Ｍｄｒ１内の二つの繰り返しＡＴＰ結合ドメインを含む、上記以外の多くのＡＢＣ輸送体に類似していた。ａｔｒＤ遺伝子産物の配列は、大腸菌のＨｌｙＤタンパク質及びＰ．ヘモリチカのＬｋｔＤタンパク質の配列と類似していた。他の属由来の関連輸送遺伝子とは違って、スフィンゴモナスａｔｒＢ及びａｔｒＤ遺伝子と隣接したり、あるいはｓｐｓクラスター内に存在する溶菌性又は毒性の類似遺伝子はなかった。
【０１４２】
結論
一つの属の細菌の多糖陰性変異株を第二の属のＤＮＡで相互に遺伝的に相補することは、最初にキサントモナス属とリゾビウム属との間で立証された（Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１３：１５５）。この初期の研究では、寒天プレート上で粘液性が回復したことが観察された。後年になって、Ｘ．カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子とスフィンゴモナス菌株Ｓ８８のｓｐｓＢ遺伝子との間でお互に属間で相補がおこったことが報告され（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９）、本発明者らも組成分析によって、供与菌の相補遺伝子により、受容菌がエクソポリサッカライドの合成を回復したことを立証した。
【０１４３】
本願の実験では、ｓｐｓＢ遺伝子がグルコシルＩＰ−トランスフェラーゼをコードすることは、スフィンガン類生合成の重要な工程であることを証明している。したがって、本発明により受容菌に組み入れるＤＮＡフラグメントは、グルコシルＩＰ−トランスフェラーゼ酵素（グルコシル−トランスフェラーゼ、ガラクトシル−トランスフェラーゼ、又は関連ＩＰ−トランスフェラーゼのどれでもよい）をコードしている遺伝子を含有することが好ましい。例えば、スフィンガンＳ−８８を組み立てる最初の工程は、グルコース−Ｐを担体ＩＰに転移することである可能性が最も高いと信じられている。したがって、この生合成反応を促進する酵素をコードする遺伝子を、本発明によりＤＮＡフラグメントに含有させることが有利である。
【０１４４】
本発明者らの研究により、スフィンゴモナスＳ８８の大きなｓｐｓ遺伝子クラスターには、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの生合成をコードするより小さなオペロン（ｒｈｓＡＣＢＤ）のあることが証明された。ｒｈｓオペロンと他のラムノースオペロンの配列が類似していることは、スフィンゴモナス属がＬ−ラムノースの合成に同じ４つの酵素工程を有することを示唆すると共に、ｒｈｓオペロンがＤＮＡフラグメント中において不可欠であることを立証している。
【０１４５】
侵襲してくる多くの病原菌がカプセルで保護されているように、各種のスフィンガンエクソポリサッカライド類も防御的性格として解釈することができる。また、エクソポリサッカライド類は、細胞を基質に付着させる役割を果たしているとも考えられる。スフィンゴモナス属のスフィンガン生産能を持つ他の菌株も、本願明細書で詳述したＳ８８クラスターと同様に組織だった遺伝子クラスターがあるので、本願明細書の実施例で説明した結果から、通常の技術を持つ当業者が、すべてのスフィンゴモナス属細菌から実用に使用できるＤＮＡフラグメントを得ることができる。
【０１４６】
スフィンガン生産能力を有する供与菌のスフィンゴモナス属細菌からスフィンガンの生合成に有用又は不可欠な遺伝情報をコードするＤＮＡを単離して、受容菌の細菌に挿入することによって、スフィンガン生産能力がない細菌、又は通常の生産能力しか持たない細菌（受容菌）を、容易にスフィンガンガムの大量生産菌に作ることができることを本願明細書の開示により示した。大量生産菌は容易に得ることができるし、またその方法もスフィンガン生産能力を持っていさえすれば、スフィンゴモナス属のどの菌株にも一般適用することができる。
【０１４７】
本発明の実施態様の一部において、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードする（スフィンガン炭水化物を組み立てる第一工程）Ｓ８８のｓｐｓＢなどの遺伝子その他のＤＮＡフラグメントを含有する供与菌から得たＤＮＡフラグメントを、本発明で有利に使用している。本発明の他の実施態様、特にラムノースが多糖の形成に重要な糖シントン又は構築材料（例えば、スフィンガンの場合は、Ｓ−８８、ジェランの場合は、Ｓ−６０、及びウェランの場合は、Ｓ−１３０）である実施態様において、本発明の大量生産菌によるある種のスフィンガン多糖類の生産を最大に増産するために、ラムノースオペロン又は遺伝子（Ｓ−８８のｒｈｓＡＢＣＤ遺伝子など）を含めて使用することが好ましい。さらに、グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその他のＤＮＡフラグメント、例えばスフィンゴモナス菌株Ｓ８８のｓｐｓＱ、ｓｐｓＫ及びｓｐｓＬ、あるいは形成される最終的な多糖を分泌のためにコードする遺伝子又はその他のＤＮＡフラグメント（例えば、スフィンゴモナス属菌株Ｓ８８のｓｐｓＤ、Ｃ、Ｅ、Ｊ及びＳ）を含めて有利に使用し、これらの酵素を最終的な多糖の生産に貢献させることができる。さらにまた、上記の酵素又は機能のすべてをコードするその他のＤＮＡフラグメント又は遺伝子も、所望の多糖次第では有利に使用することができる。
【０１４８】
通常の技術を持つ当業者が、本明細書の開示に従って容易にＤＮＡフラグメントを得ることができ、これらのフラグメントを受容菌に組み入れて、スフィンガン大量生産菌を作ることが可能であることに注目すべきである。これらの大量生産菌は公知の簡単な遺伝操作方法を使って容易に作ることができる。
【０１４９】
〔微生物の寄託〕
下記に記す上から６番目までの微生物は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従い、メリーランド州２０８５２ ロックビル、パークラウンドライブ １２３０１に所在する、アメリカン タイプ カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に国際寄託されている。寄託物の利用可能性に対する制限は、寄託物についての特許の付与と同時に、取り消し不能条件を付してすべて撤廃される。下から３番目以降の微生物は、メリーランド州のロックビルのアメリカン タイプ カルチャー コレクションから公的に入手することができる。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
上記で説明した実施例及び実施態様は、例示によって本発明を説明することを目的とするものであって、如何なる方法によってもこれをもって本発明を制限するものと見なしてはならない。通常の技術を有する当業者によって、本発明で説明する事項及び対象に各種の修正また変更を行うことは可能であるが、これらはすべて本発明で予め考慮されていて、本発明の技術的範囲内に含まれている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス属菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ）のスフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）多糖類の生合成生産に関与し、且つこのスフィンゴモナス属菌から単離されるＤＮＡ配列、及びそのフラグメントに関する。単離されたＤＮＡフラグメントの多数のコピーをスフィンゴモナス属菌又は関連菌の同じ又は異なる菌株に挿入して、多糖類、好ましくはスフィンガンを増産することができる。このような操作により外因性ＤＮＡを含有する細菌の多糖類生産量は、同一の発酵条件下で、操作をしない細菌よりも有意に大きくなる。さらに、本発明はスフィンゴモナス属菌、その他の関連菌の菌株を操作して多糖類の大量生産菌とする方法、ならびにこのようにして操作された細菌に関する。さらにまた、スフィンゴモナス属菌がスフィンガン多糖類を増産するために有用なＤＮＡ配列の同定方法及び単離方法も説明する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物がエクソポリサッカライド類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、あるいはＥＰＳとしても知られている細胞外多糖類を生産する。エクソポリサッカライド類には、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ）及び「スフィンガン類」として知られている一群の多糖類が含まれるている。「スフィンガン類」はスフィンゴモナス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）のグラム陰性菌によって生産される。
【０００３】
「スフィンガン類」は莢膜多糖類で、構造は互いに似ているが同一ではなく、スフィンゴモナス属細菌によって分泌される（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｔ．Ｊ．１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：１９３９−１９４５）。スフィンガンはそれぞれ異なる側基を持っているが、主鎖のある場所では、Ｌ−ラムノースかＬ−マンノースのどちらかが存在する。Ｌ−マンノースそのものは天然では非常に稀である。ポリマーの水溶液には独特で有用な流動特性がある（Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ，Ｒ．１９８７，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”ｐ１８９−２０６． Ｉｎ Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ（ｅｄ．），Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照されたい）。ポリマーの構造を変えることによって、どのようにして異なる流動特性が生じるのかまだ分かっていない。
【０００４】
キサントモナス カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）はグラム陰性菌で、エクソポリサッカライドの一つであるキサンタンガムを構成的に大量生産する（Ｊｅａｎｅｓ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．，５, ５１９〜５２６，１９６１）。キサンタンガムの生合成については、産業上の重要性からかなり詳細な研究がなされてきた。最近にいたり、新しい細菌性エクソポリサッカライドであるジェラン（ｇｅｌｌａｎ）がゲル化剤として開発された。ジェランは、Ｓ−８８（Ｋａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｅｄｅｒ, 米国特許第４, ５３５, １５３号を参照）、ウエラン（ｗｅｌａｎ）（Ｋａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｅｄｅｒ, 米国特許第４, ３４２, ８６６号を参照）、ＮＷ１１（Ｒｏｂｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｔｉｐａｎｏｖｉｃ, 米国特許第４,８７４, ０４４号を参照）、ラムザン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｐｅｉｋ ｅｔ ａｌ., 米国特許第４, ４０１, ７６０号を参照）、Ｓ−１９８（Ｐｅｉｋ ｅｔａｌ., 米国特許第４, ５２９, ７９７号を参照）、Ｓ−６５７（Ｐｅｉｋｅｔ ａｌ., 欧州特許出願第２０９２７７Ａ１号を参照）、及びヘテロポリサッカライド−７（Ｋａｎｇ ａｎｄ ＭｃＮｅｅｌｙ, 米国特許第４, ３４２, ８６６号を参照）を含む関連多糖類の一群に分類されている一つである。
【０００５】
上記の引例ではスフィンガン多糖類組成に関する特許が数件含まれている。これらの特許はいずれも本発明の対象とはなんら関連性もない。
【０００６】
【表１】
【０００７】
スフィンガン多糖類の化学構造は、すべてある程度の関連性がある。スフィンガン各々の主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−マンノース及びＬ−ラムノースの四つの糖の関連性のある配列からなっている。スフィンガン群の多糖類は、ポリマーの主軸（主鎖）と側鎖を含む炭水化物によって互いに区別することができる。スフィンガンの構成糖には、アセチル基又はピルビル（ｐｙｒｕｖｙｌ）基が結合している場合もある。
【０００８】
各種のスフィンガン類は、特殊ポリマーとして、あるいは繊維への応用、食品、化粧品、紙、ペンキ、セメントの添加剤、例えば粘度調整剤として、あるいは各種のコーティングへの応用において、さらには石油製品の接着剤や添加剤、特殊化学薬品として有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明がなされるに至った研究の初期段階では、代表的なスフィンガン多糖類であるＳ−８８の生合成第一工程が重要な課題であった。このスフィンガンは、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８によって生合成される。本研究以前では、スフィンガン以外の細菌性多糖類の生合成のすべてではないが、一部の製法において、リン酸イソプレニルを担体として使用されることが知られていた。例えば、Ｘ. カンペストリスが生合成するキサンタンガムの場合、キサンタンガムの主鎖にはグルコースしか含まれていないので、合成第一工程ではおそらくＵＤＰ−グルコースのグルコース−リン酸をＣ５５−イソプレニルリン酸（ＩＰ）担体に転移させる必要がある。Ｉｅｌｐｉら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１３０, ２５３，１９８２及びＪ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. ，１７５, ２４９０，１９９３）は、無細胞取り込み検定を行って、グルコースの次に第二のグルコース、その後、マンノース、グルクロン酸、そしてマンノースの順序でＩＰ担体に連続添加して、キサンタンガムの繰り返し単位が構成されていることを確認した。まったく同様にして、エスチェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）のコレニン酸のサブユニットの繰り返し単位も、まずグルコース−Ｐを担体ＩＰに転移することにより構成されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２９, ２２５，１９７７）。対照的に、リゾビウム メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）によるスクシノグリカン（ｓｕｃｃｉｎｏｇｌｙｃａｎ）多糖類の合成の場合には、まずガラクトース−ＰをＩＰに転移している（Ｔｏｌｍａｓｋｙ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２５７, ６７５１，１９８２を参照）。しかしながら、イソプレニル担体は、デキストランあるいはレバン（ｌｅｖａｎ）多糖類の合成には関与しないので、アルギン酸塩の合成におけるイソプレニル担体の役割は分かっていない。
【００１０】
本発明の研究以前では、多糖類生合成の複合反応速度論（ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）から見て、担体の役割が重要であることについては分かっていなかった。さらに、スフィンゴモナス菌がスフィンガン多糖類を合成する全体を通して、イソプレニルリン酸担体がどんな役割を果たしているのかも分かっていなかった。
【００１１】
同時にＢａｃr でもありＧｕｍ- でもある（バシトラシン耐性とキサンタンガム陰性）Ｘ. カンペストリス変異菌の特別クラスは、ＵＤＰ−Ｇｌｃのグルコース−ＰがＩＰに転移してＧｌｃ−ＰＰＩを形成するのに必要なｇｕｍＤ遺伝子中に認められることが、遺伝子相補性検定によって以前から証明されていた。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ.１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７, Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ, ｅｔ ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ”, ｐ. １４５〜１５６, ｉｎ Ｖ. Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ, ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ, Ｇｏｒｄｏｎａｎｄ Ｂｒｅａｃｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｎ. Ｅ. Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｙ. Ｎ. Ｐａｔｅｌ, １９９３, Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ, Ｖｏｌ. ７, Ｎｕｍｂｅｒ７）。後者の引例では、生産能がない変異菌がスフィンガンＳ−６０の合成を復活できるＤＮＡフラグメントを開示しているが、合成量が野生型菌株より大きいか、否かについては触れられていない。さらにまた、Ｘ. カンペストリスの野生型ｇｕｍＤ遺伝子によって、スフィンゴモナス菌株のＳ８８とＮＷ１１の相似菌であるＢａｃr Ｓｐｓ- （スフィンガン多糖類陰性）変異菌がスフィンガン類の合成を復活できることが実験で証明された。さらに、Ｂａｃr Ｓｐｓ- スフィンゴモナス変異菌は、グルコース−ＰがＩＰに転移するのを阻害されるらしいと示唆された。
【００１２】
本発明の目的は、スフィンゴモナス属菌から単離されて、多くの微生物、及び特に多くのスフィンゴモナス菌株が、スフィンガン多糖類を増産するために用いられるＤＮＡセグメントを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、スフィンガン多糖類の生産量が操作されていない菌株よりも有意に大きい、微生物、及び特に多くのスフィンゴモナス菌株から得られる大量生産菌株を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、スフィンガン多糖類大量生産菌である微生物の菌株、及び特にスフィンゴモナス属菌の菌株の生産方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、ＤＮＡセグメントを単離してスフィンゴモナス菌株に挿入することにより、このようにして操作された微生物がスフィンガン多糖類大量生産菌となる方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のこれらの目的及び／又は他の目的は、次に述べる本発明の説明によって容易に理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のＤＮＡ配列は、セグメントあるいはフラグメントのいずれも、スフィンガン生産能を持つ細菌、一般にはスフィンゴモナス菌株から単離する。このようにして得た遺伝子材料は、クローニングした後、多数のコピーをスフィンガン生産能を持つ、あるいは生産能をもたないスフィンゴモナス又は関連菌の変異体に組み入れる。このようなＤＮＡ配列は、スフィンガンを生産しない変異菌のスフィンガン生産を復活するのに有用であることが立証されている。さらに、予期していないことであったが、これらの変異菌はスフィンガンを生産できるばかりでなく、スフィンガン生産量が、本来スフィンガンを生産できる野生型菌株に期待されている生産量よりも有意に大きいことが見いだされた。
【００１８】
さらにまた、ＤＮＡセグメントあるいはフラグメントをスフィンゴモナスの一菌株から単離し、多数のコピーをスフィンガン生産能を持つ、あるいは生産能を持たない同じスフィンゴモナス変異菌株又は異なる菌株に挿入すると、このようにして操作した細菌がスフィンガンの大量生産菌となることを発見できたことも、予期していないことであった。この発見は特に次の点で思いもよらないものであった。すなわち、ＤＮＡセグメント又はフラグメントを、例えば、スフィンゴモナスＳ６０から単離して、スフィンゴモナスＳ８８の野生型あるいは非ムコイド性変異菌に挿入すると、この操作によってＳ−８８スフィンガンの大量生産菌ができ、しかも生産されるＳ−８８は一般にＳ−６０スフィンガンが混入していない。この相補性はスフィンゴモナスの各種菌株間でかなり広く適用したり（菌株間相補性）、またキサントモナス カンペストリスのキサンタンガム生産にも適用できる可能性がある（属間相補性）。
【００１９】
さらにまた本発明者らは、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株からＤＮＡセグメント又はフラグメントを単離して組み入れる操作によって、大量生産能を持つスフィンゴモナス菌株を生産する方法を発見した。スフィンガン生産能を持つ細菌から単離したＤＮＡは、まずクローニングした後、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株、又はスフィンガン生産能を持つ菌株から派生した非ムコイド性変異体に挿入する。
【００２０】
さらに本発明は、上記の単離したＤＮＡセグメント又はフラグメントを挿入することにより得た、操作されているスフィンゴモナス菌を包含している。これらの操作されている細菌は、本発明により単離されたＤＮＡセグメント又はフラグメントの多数のコピーを含有している。本発明により操作された細菌は、スフィンガンの大量生産菌である。
【００２１】
本発明によれば、ＤＮＡフラグメントは、当業者が容易に利用できる技術により単離回収して、クローニングすることができる。その後、ＤＮＡの多数のコピーを、一般には染色体外又はプラスミドＤＮＡとしてスフィンゴモナス属の細菌に挿入する。標的細菌に挿入した後、操作されている細菌により、同じ菌株の操作されていない、スフィンガン生産能を持つ細菌と同一の濃度で発酵させて、スフィンガン生産量を測定する。操作されていない、生産能を持つ菌株よりも、スフィンガン生産量が大きいものを大量生産菌として決定する。この方法を使えば、ほとんどすべてのスフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス属菌から得られた、スフィンガン多糖類を増産できるＤＮＡ配列を容易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ寄託番号３１５５４）の染色体ＤＮＡから単離した３４ｋｂｐヌクレオチド単位のＤＮＡ配列を、制限酵素により消化した部位の概略図である。図１に示した多くのＤＮＡ配列をスフィンゴモナス菌に挿入して、これらのスフィンゴモナス菌がスフィンガンを増産する能力を検討した。つぎの数個の酵素の制限部位も、図１（さらに、図２、３、８、９及び１０）に示す。Ｂ（ＢａｍＨＩ）、Ｂｇ（Ｂｇ１ＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＳ（ＳａｌＩ）。図１に示すｓｐｓＢ領域は、タンパク質ＳｐｓＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図２】スフィンゴモナス菌株Ｓ６０（ＡＴＣＣ寄託番号３１４６１）の染色体ＤＮＡから単離したＤＮＡ配列を（約２８ｋｂｐ単位）、制限酵素により消化した部位の概略図である。このＤＮＡ配列の制限部位をＢ、Ｅ及びＨ部位として図２に示す。ｓｇｅＢ領域は、タンパク質ＳｇｅＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図３】スフィンゴモナス菌株ＮＷ１１（ＡＴＣＣ寄託番号５３２７２）の染色体ＤＮＡから単離したＤＮＡ配列（約３３ｋｂｐ単位）の制限酵素部位の概略図である。この配列の制限部位をＥ、Ｈ、Ｂ、Ｂｇ及びＳ部位として図３に示す。ｓｎｗＢ領域は、タンパク質ＳｎｗＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。
【図４】本発明により生産する代表的な一スフィンガン多糖類の化学構造の概略図である。
【図５】本願の実施例６及び１２で詳述するプラスミドｐＳＥＢ２４及びｐＳＥＢ２６の構成地図である。ＭｃｓＩは次の制限部位、即ちＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳＡｌＩ、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを（上から時計廻りに）含んでいるマルチクローニング部位である。同様に、ＭｃｓIIもＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳｓｔＩ及びＥｃｏＲＩを（上から時計廻りに）含んでいる。ＯｒｉＴは接合転移開始点で、ＯｒｉＶは広範囲宿主複製開始点、及びｏｒｉはｐＵＣ１２と１３から始まる複製開始点である。
【図６】スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ寄託番号３１５５４）の染色体ＤＮＡから単離された３４ｋｂｐヌクレオチド単位のＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。次の数個の酵素の制限部位、即ちＢ（ＢａｍＨＩ）、Ｂｇ（ＢｇｌＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＳ（ＳａｌＩ）が、図１に（さらには、図２及び図３でも）示されている。図６に（さらに、図１でも）示しているｓｐｓＢ領域は、タンパク質ＳｐｓＢをコードするＤＮＡ配列に相当する。スフィンガン生合成に関与する他の「ｓｐｓ」遺伝子は、大文字Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｑ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｊ、Ｆ、Ｄ、Ｃ及びＥで示してある。ｒｈｓＡＣＢＤはスフィンガン先駆物質ｄＴＤＰ−（Ｌ）ラムノースの合成に関与する遺伝子の地図上の位置を示す遺伝子の名称である。遺伝子３２、２６、３１及び３４は、まだ同定されていない翻訳の読み取り枠（ＯＲＦ）であり、ａｔｒＤＢ遺伝子は、スフィンガン合成に無関係の輸送機能をコードしている。「Ｓｅｃ」はスフィンガン類の分泌に必要な遺伝子を示し、「Ｔｒａｓｅ」はスフィンガンの繰り返しサブユニットを組み立てるときに、ヌクレオチド−糖先駆物質からスフィンガンに糖を転移する酵素をコードしている遺伝子を示している。
【図７】スフィンゴモナス菌株Ｓ１９８（ＡＴＣＣ寄託番号３１８５３）の染色体ＤＮＡから単離された（約４２ｋｂｐ単位の）ＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。図７では、このＤＮＡ配列の制限部位をＨ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＥ（ＥｃｏＲＩ）として表示してある。括弧内の間隔が詰って並んでいる部位の順序は、不明である。コスミドクローンｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５及びサブクローンＬ２４２の外側方向への広がりは、破線で示してある。四角で囲んでいる「Ｂ」領域は、Ｓ８８遺伝子ｓｐｓＢの変異体を相補するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に相当する。
【図８】スフィンゴモナス菌株Ｓ７（ＡＴＣＣ寄託番号２１４２３）の染色体ＤＮＡから単離された（約４２ｋｂｐ単位の）ＤＮＡセグメントの制限酵素による切断部位の概略図である。図８では、このＤＮＡ配列の制限部位をＨ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）及びＢ（ＢａｍＨＩ）として表示してある。コスミドクローンｃ１、ｃ２、ｃ３、及びｃ６の外側方向への広がりは、破線で示してある。クローンｃ２とｃ３は、図８の右側の領域を超えて伸びている。同様に、クローンｃ６は左側方向に伸びている。四角で囲んでいる「Ｂ」領域は、Ｓ８８遺伝子ｓｐｓＢの変異体を相補するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に相当する。
【図９】スフィンガンＳ−８８合成に用いられる遺伝子クラスターの概略図である。地図の下部には遺伝子名、境界、予定している機能、及び制限酵素による切断部位（ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩである）でのヌクレオチドの位置を示している。図の上部に向って、自然Ｓｐｓ- 突然変異の名称と位置、Ｓｐｓ+ またはＳｐｓ- の相補結果、及びプラスミドとＳ８８染色体における特異的な挿入変異によるＳｐｓ表現型を示している。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入があるｐＺ１６７、ｐＺ１６８、ｐＺ１８０、ｐＺ２０２及びｐＺ２０６は、プラスミドｐＲＫ３１１にクローニングされたｃ２セグメントにあり、２種の欠失菌株△Ｔｎ４９３か△Ｔｎ４９５のいずれかに導入された。同様にして、この他のプラスミドに対するトランスポゾン挿入はすべてｃ３セグメントに行い、欠失菌株である△Ｔｎ３５８と３６５に導入した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ挿入位置の精度は、配列決定された制限部位に対して±５０ｂｐ、グラフの精度は±１００ｂｐである。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１０と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の上部を示してある。
【図１０】スフィンガンＳ−８８合成に用いられる遺伝子クラスターの概略図である。地図の上部には遺伝子名、境界、推定される機能、及び制限酵素による切断部位（ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄＩＩＩである）でのヌクレオチドの位置を示している。クローニングされたフラグメント（ｃ１△３、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５及びｃ６）、サブクローニングされたセグメント（使用した制限酵素とｋｂｐ単位のおおよその長さに応じて名前を付けた）、及びＳ８８染色体に生じた欠失（各線はＤＮＡの存在を示す）は遺伝子地図の下に示している。 なお、外国書面出願時では、この図は、図９と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の下部を示してある。
【図１１】ＳｐｓＢ及びグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列のアラインメントである。右側の数は各配列の最右側のアミノ酸残基数である。各配列とも、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼはＳｐｓＢ配列の真上に示してあり、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼはＳｐｓＢ配列の下に示している。次の遺伝子産物は右側に示している。ＥｘｏＹｎ、リゾビウムの一種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＮＧＲ２３４（Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１９３）。ＣｐｓＤ、Ｓ．アガラクチエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｒｕｂｅｎｔｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８：８４３）。ＲｆｂＰ、Ｓ．エンテリカ ＬＴ２（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）。ＧｕｍＤ、Ｘ．カンペストリス Ｂ１４５９Ｓ−４Ｌ（Ｃａｐａｇｅ，ｅｔａｌ．，１９８７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ／０５９３８）。Ｐｓｓ４、Ｒ．レグミノサラム（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ｂｖ．ｖｉｃａｅ菌株ＶＦ３９（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ９３０４２）。Ｐｓｓ２、Ｒ．レグミノサラム ｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ（Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１３：１５５）。記号について。｜はＳｐｓＢ及び上下各々に示すガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼまたはグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼの同一アミノ酸を示す。：は次の関連したアミノ酸、即ちＩＦＶＷＭＬ、ＳＴ、ＱＮＥＤ及びＨＫＲのグループに基づいた保存的なアミノ酸置換を示している。アンダーラインをしてある配列は、疎水性アミノ酸約２０個からなる連続セグメントである。
【図１２】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＡ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１３から図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１３】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＢ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２及び図１４から図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１４】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＣ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２から図１３及び図１５と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【図１５】Ｓ．エンテリカ（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：６９５）、及びＸ．カンペストリス（Ｋｏｅｐｌｉｎ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７７８６−７７９２）のｒｈｓＤ遺伝子産物と、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノース生合成酵素のアラインメントを示す。記号は図１１と同一である。 なお、外国書面出願時では、この図は、図１２から図１４と合わせて一つの図であったが、大きさの関係上、日本語書面では、元の図の一部を示してある。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次の用語は本発明の明細書全体を通して使用されるもので、その意味を次のように定義する。
【００２４】
１. 「スフィンガン」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナス属細菌により分泌される、関連性はあるがお互いに別個であるエクソポリサッカライド群を意味する（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｊ. Ｇｅｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３９：１９３９〜１９４５, １９９３）。スフィンガン類の構造は、すべていくらかの関連性がある。スフィンガンおのおのの主鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−マンノース、Ｌ−ラムノースの四つの糖の関連性のある配列からなっている。スフィンガン群の多糖類は、ポリマー主鎖と複数の側鎖を含む構成糖の配列によってお互いに区別することができる。スフィンガン多糖類はまた、その構成糖にアセチル基又はピルビル基が結合していてる場合もある（Ｍｉｋｏｌａｊｃｚａｋ, ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ. ａｎｄ Ｅｎｖ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：４０２, １９９４参照）。本発明のＤＮＡセグメントとフラグメント及び一般方法を使用して生産した各種スフィンガンの化学構造の概略図は、おおむね図４に示してある。スフィンガン類の、ジェラン（Ｓ−６０）、ウェラン（Ｓ−１３０）、ラムザン（Ｓ−１９４）、Ｓ−８８、ＮＷ−１１、Ｓ−１９８及びＳ−６５７の構造も、おおむね図４に示している。
【００２５】
典型的には、スフィンガン多糖類群の各単体は、一般的に次の繰り返し化学構造によって表される。
【００２６】
【化５】
【００２７】
式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＡはグルクロン酸、Ｒｈａはラムノース、Ｍａｎはマンノースである。ＸはＲｈａでも、Ｍａｎのいずれでもよい。Ｚは二番のＧｌｃ残基に結合している、α−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａのいずれかである。Ｗは１番のＧｌｃ残基に結合し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａのいずれかであって、下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７又は１である。式中、ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の近くに位置している。本明細書で用いる「主鎖」なる語は、この構造からＷ鎖とＺ鎖とを除いた、すなわちｖとｙが０に等しいときの残部を指す。ポリマーの「還元末端」は、糖単位が加えられるポリマーの末端である。
【００２８】
スフィンガン多糖類群のうち、一部の単体はいろいろな位置でアセチル化されている。しかしながら、多糖類は常法により化学的に脱アシル化して、アシル基を除くことができる。例えば、ジェランにはウェランと同じ炭水化物の主鎖（すなわち、Ｘ＝Ｒｈａ）があるが、側鎖の糖が欠けており（すなわち、ｖ＝０及びｙ＝０）、しかもグルコース残基１はグリセリン酸塩で完全に置換されている。ジェランのサブユニットの構造も、位置は分からないがどこかでアシル化されている。
【００２９】
２. 「スフィンゴモナス」なる語は、明細書全体を通して、上記のエクソポリサッカライド類、すなわちスフィンガン類を生産するスフィンゴモナス属グラム陰性菌を意味する。本発明においては、スフィンゴモナス属グラム陰性菌の多くは、単離されたＤＮＡ配列源として、スフィンガン生産能を持つ他の菌株（好ましくは、スフィンゴモナス属のグラム陰性菌）に再挿入して、本発明のスフィンガン大量生産菌を生産するため、あるいは標的細菌として、これに外因性ＤＮＡ配列を挿入してスフィンガン大量生産菌を生産するために用いることができる。
【００３０】
グラム陰性菌のスフィンガン生産能を持つ科は、１９９３年にまずスフィンゴモナス属に分類されるものとして同定された。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, Ｊ. Ｇｅｎ.Ｍｉｃｒｏｂ. , １３９, １９３９，１９９３を参照）。しかしながら、各菌株をどの種に分類すべきかは、まだ正確には確立されていない。スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株に最も近い種は、スフィンゴモナス ポーシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）と考えられる。しかしながら、詳細な、決定的分類学分析結果を利用できる時まで、これらの菌株が上記の種に分類されるべきであると言うのは時期尚早である。スフィンゴモナス属のスフィンガン生産菌は当初数個の異なる属に分類されていたことを付言する。
【００３１】
スフィンゴモナスのうち現在までに確認されている種としては、Ｓ. ポーシモビリス（Ｓ. ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓ. パラポーシモビリス（Ｓ. ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓ. アドヘイシバ（Ｓ. ａｄｈａｅｓｉｖａ）、Ｓ. カプスラタ（Ｓ. ｃａｐｓｕｌａｔａ）及びＳ. ヤノイクヤエ( Ｓ. ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）が挙げられる（Ｙａｂｕｕｃｈｉ, ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４, ９９，１９９０を参照）。過去ではこれらスフィンゴモナスの種が、誤ってシュードモナス属（ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に分類されたこともあった。
【００３２】
３. 「供与菌」及び「受容菌」なる語はおのおの、ＤＮＡ配列を採取した細菌及びＤＮＡ配列を挿入又は組み入れる細菌を指すのに用いられる。
【００３３】
４. 「菌株」又は「スフィンゴモナス菌株」なる語は、（化学構造に基づいて）特定のスフィンガンエクソポリサッカライドを生産するスフィンゴモナス属グラム陰性菌を指すのに用いる。スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株を、簡単に、この菌株が生産するスフィンガン多糖類で呼ぶこととする。例えば、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８はスフィンガン多糖類Ｓ−８８を生産し、スフィンゴモナス菌株Ｓ６０はスフィンガン多糖類Ｓ−６０（ジェラン）を生産するなどである。スフィンゴモナス菌株Ｓ８８（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１５５４）、Ｓ６０（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１４６１）、ＮＷ１１（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ５３２７２）、Ｓ１３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１５５５）、Ｓ１９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１６９１）、Ｓ１９８（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ３１８５３）、Ｓ６５７（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ５３１５９）、及びＳ７（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ２１４２３）は、特に本発明に有用な代表的菌株である。
【００３４】
５. 「大量生産菌」なる語は、明細書全体を通して、操作された細菌であって、同じ菌株又は異なる菌株のスフィンガン生産能を持つ細菌から単離したＤＮＡセグメント又はフラグメントの多数のコピーを含有し、同じ菌株の操作されていない細菌、又は野生型細菌を同一又は実質的に同一の発酵条件で発酵して比較するとき、スフィンガン多糖類生産量が有意により大きい（重量／重量比で、少なくとも約５％以上）細菌を指すのに用いる。
【００３５】
６. 「単離された」なる語は、微生物から採取して、少なくともある程度精製した、すなわち一以上の精製工程を通過したＤＮＡを指すのに用いる。単離されたＤＮＡは、実質的に純粋な形で用意しておくことが好ましい。すなわち、制限酵素によりフラグメントあるいはセグメントに切断したり、クローニングにより多数のコピーとしたり、又はプラスミドベクターその他の手段に挿入したり、又は細菌中に組み入れたりするＤＮＡの性能に影響がない程度まで、汚染物質含有量を抑制する。
【００３６】
７. 「ＤＮＡ」又は「染色体ＤＮＡ」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナスから単離されたＤＮＡに関し、一般には微生物から単離する前に、スフィンゴモナス属菌の染色体又は内因性プラスミド中に見いだされるＤＮＡを指すのに用いる。
【００３７】
８. 「配列」なる語は、明細書全体を通して、ヌクレオチド単位又は制限酵素による切断部位のパターンによって同定されるＤＮＡの特異的セグメントであって、一般的にはスフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス属菌のＤＮＡから制限酵素により単離し、このようにして得たＤＮＡ配列を細菌に挿入して大量生産菌を生産したり、あるいはさらに制限して前記の配列より小さいＤＮＡの小部分、又はフラグメントを生産する配列を指すのに用いる。「部分」又は「フラグメント」なる語は、一般にＤＮＡセグメントより小さいＤＮＡ配列を指すのに用いる。本発明に用いる好適なＤＮＡセグメントは、グリコシルトランスフェラーゼ（グルコシル、ガラクトシル、ラムノシル及びグルクロノシルトランスフェラーゼ）、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼ（グルコシル−ＩＰトランスフェラーゼ、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼ酵素などを含む）、ラムノースオペロン（あるラムノース含有スフィンガンへ挿入するためのラムノース前駆体の合成）、及び細菌の多糖類の分泌を含む様々なタンパク質をコードするセグメントである。
【００３８】
９. 「挿入された」、「挿入する」、「組み入れられた」又は「組み入れる」なる語は、明細書全体を通して、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株の染色体ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡから単離したＤＮＡセグメントを、スフィンガン生産能を持つ、同じあるいは異なる受容菌になるスフィンゴモナス菌株に転移する工程と結果を指す。結果として、転移されたＤＮＡセグメントの少なくとも実質部分の多数のコピーを含有する大量生産菌株を得る。
【００３９】
例を挙げると、まず単離されたＤＮＡを当業者に周知の技術によりプラスミドベクター、例えば特にｐＲＫ３１１やｐＳＥＢ２４に導入し、クローニングした後、接合により受容菌となるスフィンゴモナス菌に転移する。受容菌となるスフィンゴモナス菌に挿入後、受容菌の細胞中で上記のＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターが複製されて、スフィンガン多糖類の大量生産に必要なＤＮＡセグメントが数コピー（少なくとも２コピーで、通常は４〜２０コピー）できる。プラスミドベクターの他に、バクテリオファージベクターや、トランスポゾンベクターを使ってもよい。
【００４０】
多くのプラスミドベクターが、単離されたＤＮＡセグメントやフラグメントを受容菌に挿入する際に好適である。上記で説明したｐＲＫ３１１やｐＳＥＢ２４の他に、特に、以下のプラスミドも有用である。不和合群Ｐ−１の広範囲宿主プラスミドであるＲＫ２などや、そのプラスミドから派生したｐＲＫ２９０、ｐＲＫ２９３、ｐＲＫ４０４など（Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｖｏｌ. １３, ｐｐ. １４９〜１５３）、及びプラスミドの転移を可能にするプラスミドＲＰ４のｏｒｉＴ遺伝子を含むその他の派生体であるｐＳＵＰ１０１など（Ｓｉｍｏｎ, ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｎｏｖｅｍｂｅｒ, １９８３を参照）並びにプラスミドｐＬＡＦＲ１及びｐＬＡＦＲ３（Ｆｒｉｅｄｍａｎ, ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ, １８, ２８９, １９８２）、及び不和合群Ｉｎｃ−Ｑの広範囲宿主プラスミドであるＲＳＦ１０１０や、そのプラスミドから派生したｐＭＭＢ２２及びｐＭＭＢ６６（Ｆｕｅｒｓｔｅ, ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４８, １１９, １９８６）などである。
【００４１】
プラスミドベクターを受容菌内に挿入する際に、接合を用いるのは一般に有効である。しかしながら、属が異なる細菌同志では、コンピテント細胞を精製ＤＮＡで形質転換させるのがより一般的である。
【００４２】
スフィンゴモナスの場合、細菌にＤＮＡフラグメントやプラスミドを導入するのに電気穿孔法も使われてきた（１９９２, Ｍｏｎｔｅｉｒｏ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. ｏｆ Ａｐｐ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７２, ４２３を参照）。この方法を使えば、単に単離されたＤＮＡを細菌に添加し、電気穿孔で細胞膜を通して転移させるだけで、単離されたＤＮＡセグメントやフラグメントの細胞コピーを２コピー以上受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れることができる。
【００４３】
前掲のＭｏｎｔｅｉｒｏらは、ＤＮＡをスフィンゴモナスに導入する手段としての電気穿孔法を説明している。電気穿孔法の機能は、コンピテント細胞を化学的に処理して、例えば細胞を塩化カルシウムやルビジウム塩で処理した後に形質転換するのと同じである。形質転換させるＤＮＡは標準法で精製するが、この場合プラスミドの形をとってもよいし、またとらなくてもよい。しかしながら、通常、二本鎖閉環型のＤＮＡの場合、形質転換が最も効率的である。したがって、この場合、接合法でＤＮＡをスフィンゴモナスに導入する必要もなければ、セグメントをクローニングしてからプラスミド、バクテリオファージあるいはトランスポゾンベクターに挿入する必要もない。しかしながら、単離されたＤＮＡをまずプラスミドベクターに導入してから、単離ＤＮＡフラグメントを含有するプラスミドを細菌中に転移することが好ましい。
【００４４】
受容菌となるスフィンゴモナス菌中で、プラスミドあるいはその他ベクター、例えばバクテリオファージ又はトランスポゾンベクターにＤＮＡセグメントの担持を続ける必要はない。細菌ＤＮＡ中にＤＮＡセグメントのコピーをさらに導入して、細菌ＤＮＡを複製するのと同じメカニズムによりセグメントを世代毎に複製することは、常法として行われている。下記の実施例の部において、細菌ＤＮＡにＤＮＡのコピーをさらに導入して、細菌ＤＮＡを複製するのと同じメカニズムによりセグメントを世代毎に複製する方法を詳述する二つの実施例を説明する。
【００４５】
１０. 「多数のコピー」なる語は、明細書全体を通して、少なくとも２コピー、好ましくは少なくとも４コピーをスフィンゴモナス細菌に組み入れる外因性ＤＮＡ配列、フラグメント又はセグメント（前記のＤＮＡの少なくとも実質部分）を指すのに用いられる。より好ましくは、スフィンゴモナス属菌に挿入するＤＮＡ配列、フラグメント又はセグメントのコピー数は、実際には約４から約２０までの範囲である。ある例においては、ＤＮＡ配列を１個のプラスミドベクターに組み入れて、接合によりスフィンゴモナス菌に転移し、受容菌中でプラスミドを複製して、２コピー以上のＤＮＡ配列、セグメント又はフラグメントを得ることもあることを付記する。
【００４６】
１１. 「生合成」なる語は、明細書全体を通して、スフィンゴモナス菌がスフィンガンを生物生産又は合成することを指すのに用いる。スフィンガン多糖類は、複数の細菌の酵素でコントロールされている一連の工程により炭水化物単位毎に合成される。
【００４７】
１２. 「操作されている」なる語は、明細書全体を通して、外因性ＤＮＡ、好ましくはその多数のコピーが組み入れられている受容菌となるスフィンゴモナス菌を指すのに用いる。本発明の操作されている細菌とは、スフィンガン多糖類大量生産菌のことである。
【００４８】
１３. 「遺伝情報をコードする」なる語は、明細書全体を通して、特定の順序で並んでいるヌクレオチド単位の遺伝情報を内容とするＤＮＡ配列を指すのに用いる。ＤＮＡ配列の遺伝情報（どんな長さでも）は、多数のコピーが組み入れられて、これにより得た操作されている細菌がスフィンガンを増産する場合、スフィンゴモナス菌によるスフィンガン合成に「有益又は不可欠」であると見なされる。「有益又は不可欠」なる語は、ＤＮＡがスフィンゴモナス細菌から単離され、遺伝情報をコードし、この遺伝情報の多数のコピーが組み入れられたスフィンゴモナス菌が、スフィンガン多糖類の大量生産菌に形質転換するＤＮＡを指すのに用いる。本発明で使用する有益又は不可欠なＤＮＡは、例えば、グルコシルＩＰ−トランスフェラーゼ、ガラクトシルＩＰ−トランスフェラーゼなど、グリコシルトランスフェラーゼの生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、ラムノース、マンノース、グルコース、ガラクトースのような糖のシントンや、例えばｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースなど、上記の糖の置換シントンの生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、例えばポリメラーゼのようなスフィンガンを生産するための糖シントンの重合に関与する酵素の生合成のための遺伝子又はオペロン、及び、無処理の細胞構造から多糖類を分泌するための遺伝子又はオペロンを一以上含む。
【００４９】
１４. 「菌株間相補性」なる語は、第一のスフィンゴモナス菌株からＤＮＡ配列、セグメント又はフラグメントを単離して、異なる第二のスフィンゴモナス菌株に組み入れることを指すのに用いる。本発明の実施態様の一つとして、異なるスフィンゴモナス菌株からＤＮＡフラグメントを取り、その多数のコピーを別のスフィンゴモナス菌株に組み入れると、スフィンガン多糖類の大量生産菌が生産できることを発見したことは、予期せざるところであった。本発明で有用なＤＮＡフラグメントは、属間相補性（例えば、キサントモナス カンペストリス菌にキサンタンの増産をさせるなど）も示している。
【００５０】
１５. 「シントン」なる語は、本発明により細菌がスフィンガンを生合成する間に重合される糖又は糖単位を指すのに用いる。シントンは、スフィンガン多糖類の構成部分又は構成単位を含み、スフィンガン類の生合成に使用される糖成分、例えばアセチル化及びアシル化糖や関連先駆物質を含むグルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノース、その他の糖シントン類などを含有する。
【００５１】
１６．「ラムノースオペロン」なる語は、本発明によるスフィンガン多糖類の生合成に利用される、ラムノース又はラムノースシントン類（ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースなど）の生合成に関与する遺伝子やオペロンをコードするＤＮＡ配列を指すのに用いる。
【００５２】
本発明は、スフィンガン生産能を持つ供与菌となるスフィンゴモナス菌からＤＮＡ配列を取って、多数のコピーを同じ菌株あるいは異なる菌株の受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れると、この受容菌となるスフィンゴモナス菌がスフィンガン多糖類大量生産菌に形質転換するとの発見に関する。さらに、ある種のスフィンガン多糖類を生産する細菌からＤＮＡ配列を単離し、異なる菌株のスフィンゴモナス菌に多数のコピーを組み入れると、この異なる菌株から大量生産菌を生産することができるばかりでなく、この場合供与菌の特性を持つスフィンガン多糖類の混入が起こることがないことも発見されている。
【００５３】
受容菌に組み入れられたＤＮＡ配列には、スフィンガン多糖類の生合成に有益又は不可欠の遺伝情報がコードされている。例えば、有益又は不可欠の遺伝情報は、細菌のスフィンガン生合成にいろいろな形で役割を果たしたり、あるいは関与する。外因性ＤＮＡは、例えば、律速酵素の過程に関与する酵素その他のタンパクの合成を発現したり、酵素、補因子、その他の生化学的成分の合成を誘導して多糖類を増産させたり、多糖類のサブユニットの連結を促進するポリメラーゼのような酵素の産生を増加させたり、あるいは一以上のリプレッサー遺伝子と結合したり、細菌から多糖類の分泌を促進させたり、通常、多糖類生合成の間は律速される工程の生産を阻害するリプレッサーの発現を押さえるなど、スフィンガン生合成に有益な効果をもたらすことができる。
【００５４】
ＤＮＡ配列は、当業者の標準的な技術や方法によりスフィンゴモナスの各種菌株から単離する。通常、細菌は（下記で詳細説明するように、約０. ５％より低い、好ましくは約０. １％〜０. ２％のグルコース濃度を用いる標準発酵法により）培養され、高濃度の細菌を含有するブロスを作る。その後、細菌細胞を遠心分離し、ＤＮＡ抽出のために再懸濁する。ＤＮＡは、まず混合液からタンパクを除いて、エタノール又はイソプロパノールにより高分子量のＤＮＡを沈澱させることによって細菌から抽出する（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ, Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７, １５１３，１９７９を参照）。
【００５５】
上記のように沈澱させたら、通常は単離されたＤＮＡセグメントあるいはフラグメントのクローニングを行って、受容菌となるスフィンゴモナス菌挿入用のＤＮＡを形成する。例として挙げると、上記した高分子量のＤＮＡ配列は、制限酵素（例えば、ＳａｌＩ酵素）により部分的に消化し、標準方法により電気泳動する（Ｌｏｆｔｕｓ, ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, １２, １７２，１９９２を参照）。電気泳動後、大きなＤＮＡフラグメント（２０ｋｂｐ以上）をさらに精製する（抽出及び沈澱）。
【００５６】
その後、細菌から単離したＤＮＡフラグメントを、クローニングベクター（一般には、プラスミド）に直接挿入してＤＮＡのクローニングを行うか、代わりに制限酵素によりさらに処理することにより、より小さなＤＮＡフラグメントにして、クローニングベクターに挿入する。本発明のＤＮＡクローニングは、当業者が標準としている一般的な技術と方法によって行う。本発明によれば多くの方法を用いてＤＮＡセグメントのクローニングを行うことができ、したがって、本発明は、例えばプラスミドのクローニングベクターの使用に限定されない。例えば、ＤＮＡフラグメントをｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ３（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ, Ｖｅｃｔｏｒｓ, Ｃｈａｐｔｅｒ ２, ｐｇ. ４３, １９８８, Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｂｏｓｔｏｎ）、又はＰ１（１９９０, Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ.Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７, １０３〜１０７）などのバクテリオファージベクターに挿入してクローニングすることもできる。
【００５７】
下記の実施例１及び１２で詳述するように、まず、クローニングベクターに挿入するＤＮＡフラグメントを用意する。本発明によれば、ＤＮＡセグメント又はフラグメント形成用として、数多くのクローニングベクターを使用することができる。しかしながら、本発明においては、ＤＮＡセグメント又はフラグメントのクローンを形成したプラスミドベクターをそのまま使用して、接合により外因性ＤＮＡを受容菌に挿入するのが有利であることが見いだされている。しかしながら、特にＤＮＡを受容菌へ挿入する際に形質転換法を使用しようとする場合には、受容菌に接合するベクターとは異なる（プラスミドその他の）クローニングベクターを使用することもできる。
【００５８】
クローニングベクターに挿入を終えたら、単離されたＤＮＡを含有するベクターをバクテリオファージ中でパッケージングして、トランスフェクション法により細菌（一般に、大腸菌）に転移し、トランスフェクションされた細菌中で複製する。このようにして得たＤＮＡクローンを含有する細菌細胞のコロニーをプールして、貯蔵するか、あるいは直接使用する。
【００５９】
その後、ＤＮＡクローンのスクリーニングを行って、スフィンゴモナスによるスフィンガン生産に対するＤＮＡフラグメントの相対的増産効果を決定する。スクリーニング法においては、ＤＮＡを適当なベクターに担持させた後、接合法（例えば、Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ．，ＵＳＡ, ７７, ７３４７，１９８０が説明している三元交配（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ））により受容菌となるスフィンゴモナス菌株に挿入し、このようにして得たＤＮＡの多数のコピーを含有する操作された細菌とそのスフィンガン生産を試験して、活性を決定する。
【００６０】
スフィンガン生産に増産効果があると決定されたＤＮＡセグメント又はフラグメントを、受容菌となるスフィンゴモナス菌株に転移して、前述のように転移されたＤＮＡの少なくとも実質部分を少なくとも２コピー含有する大量生産菌株を生産する。
【００６１】
本発明で使用する際に好ましいスクリーニング法を開発した。この方法では、ＤＮＡを生産能を持たない受容菌となるスフィンゴモナス菌株に挿入することにより、このＤＮＡ中にスフィンガン合成に有益又は不可欠である遺伝子が存在しているか、否かをスクリーニングするのである。すなわち、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株から、生産能を持たない変異菌（例えば、菌株Ｓ８８のＳｐｓ- Ｂａｃr ）を派生させ、スクリーニング対象となるＤＮＡの多数のコピーを含有するように操作する。グルコース１〜３％を含有する普通寒天平板培地でこのように操作した、生産能を持たない変異菌を増殖する。別に、生産能を持たないスフィンゴモナス変異菌を同一条件で増殖して、この変異菌と操作された細菌のコロニーの外観を比較する。このようにした後、一般的にスフィンゴモナス菌にスフィンガン合成を開始させるＤＮＡの能力を、目視により測定する。
【００６２】
スフィンガン生産活性を向上させるＤＮＡセグメント又はフラグメントの能力は、培養皿上で容易に認識できる、スフィンガン生産能を持つ細菌とスフィンガン生産能を持たない変異菌の表現型の相違により判定される。例えば、スフィンガン生産能を持つスフィンゴモナス菌株はムコイドを産生するため、簡単な目視検査で容易に見分けることできるコロニーを形成することが多い（例えば、スフィンガン生産菌のコロニーが盛り上がって丸く、明るい輪で取り囲まれているのに対して、非生産菌のコロニーは平坦で、粗く、半透明である）。
【００６３】
ある事例では、下記の実施例２で詳述するように、一つのスフィンゴモナス菌株において、スフィンガン生産能を持つ細菌とスフィンガン生産能を持たない細菌の表現型が容易にあるいは短時間で区別できない場合がある。このような場合には、生産性と非生産性の表現型の相違が目視検査で容易に識別できる細菌によって対象ＤＮＡの活性を判定するように、スクリーニング法を変更する。この本発明の実施態様では、本発明に有用なＤＮＡフラグメントは菌株間でも、属間でも相補性を示す事実、及びこのＤＮＡフラグメントの多数のコピーによって実際上すべてのスフィンゴモナス菌株がスフィンガンを増産することができる事実を利用するのである。
【００６４】
本発明に有用なＤＮＡセグメント又はフラグメントは、キサントモナス カンペストリスにおいても活性を示す。したがって、一以上のスフィンゴモナス菌株を使って容易にスクリーニングできなかったＤＮＡフラグメントの多数のコピーを、キサンタン生産能を持たない、Ｘ. カンペストリス変異菌、例えば特にＸ５９ｍ３１に組み入れて、目視検査によりキサンタン生産のスクリーニングを行うことができる。Ｘ５９ｍ３１などの生産能を持たないＸ. カンペストリス変異菌は、バシトラシンにさらした後の生存菌を選び、このバシトラシン耐性変異菌にＤＮＡフラグメントの重複コピーを組み入れ、ＹＭ寒天培養皿で培養し、形成されたコロニーの外観がムコイド性（生産菌）であるか、非ムコイド性（非生産菌）であるかを観察することにより、容易に得ることができる。（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７、及び米国特許第５, ３３８, ８４１号を参照）。スクリーニングされた細菌が多糖類（スフィンガン又はキサンタン）を増産するＤＮＡは、菌株間あるいは属間相補性の証拠であって、異なるスフィンゴモナス菌株ばかりでなく、異なる属の細菌（キサントモナス）によるスフィンガン多糖類生産を増産させることができる。
【００６５】
概して簡単に、スフィンガンの生産菌と非生産菌の表現型の相違を同定できる本発明の実施態様による簡便スクリーニング法を用いれば、通常の技術を有する当業者は容易に利用できるクローニング及び転移技術により、過度の又は理由のない実験を行うことなく、本発明で使用されるＤＮＡセグメントやフラグメントを容易に得て、スフィンゴモナス菌によるスフィンガン多糖類を増産することができる。
【００６６】
本発明の他の実施態様は、スフィンガン多糖類の増産に関する。スフィンガン多糖類を生産するためには、本発明の操作した細菌を周知の方法により適当な発酵条件下で培養する。操作されたスフィンゴモナス菌を培養する適当な培地又は発酵ブロスとしては、例えば、一般にグルコース、ラクトース、スクロース、マルトースやマルトデキストリンを含む炭水化物類などの炭素源、例えば無機アンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸類又は加水分解した酵母，大豆粉又はカゼインなどのタンパク性材料、蒸留業者によって提供される可溶性物質（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｂｌｅｓ）又はコーン スチープ リカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、無機塩類などの窒素源及びビタミン類を含有する水性培地が挙げられる。本発明では、非常に多種類の発酵培地を使ってスフィンガン類の生産を実施することができる。
【００６７】
発酵ブロス中の炭水化物含量はいろいろあるが、通常は発酵培地に対して約１〜５重量％である。炭水化物類は発酵前あるいは発酵中のいずれかで全部を一どきに添加する。窒素用量は水性培地に対して約０. ０１％〜約０. ４重量％の範囲である。炭素源と窒素源は１種のみの炭素源又は１種のみの窒素源を使用しても良いし、何種類かの炭素源又は窒素源を混合して使用してもよい。
【００６８】
スフィンゴモナス菌の発酵に用いる無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、硝酸塩、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩及びこれらに類似するイオン類を含有する塩類が挙げられる。マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、ヨウ化物及びホウ酸塩などの微量金属も、含有すると有利である。また、ビオチン、葉酸塩、リポ酸塩、ナイアシンアミド、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン及びビタミンＢ12などのビタミン類、ならびにこれらの混合物もまた、有利に使用することができる。
【００６９】
発酵温度は約２５℃〜約３５℃であるが、至適生産性を得るには約２８℃〜約３２℃の温度範囲がよい。接種源は、振盪フラスコ培養と小規模の浸漬攪伴発酵を含む、標準的な方法で容量をスケールアップして調製する。接種源の調製用培地は、生産用培地と同じものでも良いし、また当業者間で周知のいくつかの標準培地の一つであるルリア ブロス培地や、ＹＭ培地であってもよい。種培養では、炭水化物濃度を約１重量％より低くするとができる。所望の接種量を得るためには、種培養工程を一工程よりも多くすることができる。典型的な接種量は、最終発酵総量に対して約０. ５％〜約１０％の範囲である。
【００７０】
典型的には、発酵容器に内容物を攪伴する攪伴機を備える。容器に自動ｐＨ制御装置と自動発泡制御装置をつけてもよい。生産培地を容器に添加して、加熱によりその場で殺菌する。かわりに、添加前に、炭水化物や炭素源を別個に殺菌してもよい。予め増殖しておいた種培養を冷却してある培地（一般には、発酵温度の約２８℃〜約３２℃）に添加し、培養物を攪伴しながら約４８〜約９６時間発酵して、高粘度のブロスを調製する。標準法によりスフィンガン多糖類をアルコール、一般的にはイソプロパノールで沈澱させて、ブロスから回収する。
【００７１】
本出願は、具体例として、数種の菌株、特にスフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７、及びＳ１９４（それぞれ、寄託番号ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ５３２７２、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１９６１としてアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から利用することができる）から単離したＤＮＡセグメントや、フラグメントを開示する。これらのＤＮＡセグメントや、フラグメントを染色体外（プラスミド）ＤＮＡとして多数のコピーをスフィンゴモナス菌株中に組み入れることにより、これら菌株が生産するスフィンガンＳ−８８、Ｓ−６０及びＮＷ−１１を増産する際に有用であることが見いだされている。
【００７２】
スフィンゴモナス菌株Ｓ８８の場合、単離された染色体ＤＮＡセグメントの大きさは３４ｋｂｐで、２３から２５の遺伝子を含む。図１のＳ８８のクローン地図に示す通り、３４ｋｂｐ領域とは二つのクローン、ｃ３とｃ２を合わせた広さである。この３４ｋｂｐのＤＮＡ配列を複数のＤＮＡ配列に分けて、そのおのおのにｃｌ△３、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５、ｃ６、Ｈ１５. ６、Ｂ７. １、Ｂ８.６、Ｅ５. ９、Ｅ１. ５、Ｅ２. ４、Ｅ４. ５、Ｅ６. ６、Ｅ１２. ８など標識したものを、図１に示す。図６、図９及び図１０は、単離されたＳ８８染色体ＤＮＡをさらに詳細に示す。
【００７３】
スフィンゴモナス菌株Ｓ６０の場合、染色体ＤＮＡからｃ１、ｃ２及びｃ３（図２を参照）を始めとする複数のＤＮＡ配列が単離された。配列ｃ２をクローニングした後、ｐＲＫ３１１ベクター中に置き、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１に挿入して、スフィンガン生産活性を評価した（実施例９に詳述してあるので、参照のこと）。
【００７４】
スフィンゴモナス菌株Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４の場合、これらの菌株からもＤＮＡセグメントを単離した（図７及び８を参照されたい）。これらの菌株からは、本願明細書で詳述する一般方法によりさらに多くのＤＮＡセグメントを単離して、本発明により細菌のスフィンガン生産を増産するのに利用することができる。
【００７５】
スフィンゴモナス菌株ＮＷ１１の場合、ＤＮＡフラグメントｃｌ、ｃ２、ｃ２. １、ｃ２. ２、ｃ２Ｈｄ、ｃ２Ｈ１、ｃ２Ｈ２、ｃ２Ｈ３、ｃ２Ｈ１０を単離した（図３参照）。配列ｃ２. ２をクローニングした後、ｐＲＫ３１１ベクター中に置いて、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１に挿入して、スフィンガン生産活性を評価した（実施例９に詳述してあるので、参照のこと）。
【００７６】
スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から、上記で一般的に説明した方法により次のＤＮＡセグメントを調製した。これらのＤＮＡセグメントおのおのを（プラスミドベクター中の全長のＤＮＡセグメントとして）、一以上のスフィンゴモナス菌株（野生型スフィンガン生産菌、又は野生型生産菌から派生した非ムコイド性変異菌）に挿入すると、それらの細菌はスフィンガン多糖類の大量生産菌に変わる。これらのＤＮＡセグメントやフラグメントおのおのは、スフィンゴモナス菌株から単離されるＤＮＡセグメント又はフラグメントから派生させ、前述したようにプラスミドベクター中に挿入する。ＤＮＡセグメント又はフラグメントの特徴は、制限酵素切断部位地図によって定まる（図１、２及び３）。
【００７７】
菌株 Ｓ８８
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ△３
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ２
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ３
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ４
ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ５
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｈ１５. ６
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｂ８. ６
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ４. ５
ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ６. ６
菌株 Ｓ６０
ｐＲＫ３１１−Ｓ６０ｃ２
菌株 ＮＷ１１
ｐＲＫ３１１−ＮＷ１１ｃ２. ２
【００７８】
ＤＮＡクローンは、スフィンガン生産能を持つ野生型スフィンゴモナス菌、あるいはスフィンガン生産能を持たない変異菌に導入して、大量生産効果を実現することができる。例えば、ＤＮＡクローンの多数のコピーを、スフィンガン生産能を持つ野生型菌株や、スフィンガン生産能を持つ菌株から派生した非ムコイド性変異菌おのおのに導入する。このように操作した細菌は、同じ菌株由来のスフィンガン生産能を持つ野生型菌、あるいはスフィンガン生産能のない変異菌と比較すると、スフィンガンの大量生産菌である。
【００７９】
ＤＮＡをスクリーニングして多数のコピーを、これらのスフィンゴモナス菌の菌株に導入したところ、予期しないところであったが、このようにして得た組換え菌のスフィンガン生産量は、一般的に野生型菌のスフィンガン生産水準よりも高かった。これは一般性を持つ現象であり、しかもこのスフィンガンの増産には菌株間の相補性が認められた。
【００８０】
本発明においては、ＤＮＡクローンの多数のコピーを挿入して得る組換え菌は、野生型より高い水準のスフィンガン多糖類合成活性を持っている。また、本発明で有用なＤＮＡセグメントは、菌株がスフィンガンを組み立てたり、生合成する初期工程で初めのグルコース残基をイソプレニルリン酸担体に結合するのに必要なタンパクをコードしているＤＮＡフラグメントを始めとして、スフィンゴモナス菌株がスフィンガンを合成するのに有益あるいは不可欠な遺伝子を持っている。
【００８１】
ｓｐｓＢ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）と、ＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列（配列番号２）も開示する。ＳｐｓＢタンパク（又は、スフィンゴモナス菌株によっては、特にＳｇｅＢ、ＳｎｗＢ、ＳｎｅＢ、ＳｓｓＢ、及びＳｒｈＢなどの相似タンパク）をコードしているＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントはすべて、多数のコピーを組み入れてスフィンゴモナス菌株を操作された菌とし、この操作された菌によってスフィンガンを増産することができる。
【００８２】
同様に、Ｓ６０スフィンゴモナスから単離されるｓｇｅＢ遺伝子（ＳｐｓＢに相似するＳｇｅＢタンパクをコードする）及びＮＷ１１スフィンゴモナスから単離されるｓｎｗＢ遺伝子を含有するＤＮＡセグメントやフラグメントについても同じことが言える。ｓｇｅＢ遺伝子（図２）は、Ｓ８８染色体ＤＮＡのｓｐｓＢ遺伝子（及び、相当するｓｎｅＢ、ｓｓｓＢ、ｓｒｈＢ遺伝子、それらはそれぞれスフィンゴモナスのＳ１９８、Ｓ７及びＳ１９４株に由来し、ＳｎｅＢ、ＳｓｓＢ、ＳｒｈＢタンパクをコードする）と（Ｓ８８のｓｐｓＢ遺伝子に相当するフラグメントとのＤＮＡハイブリッド形成に基づいて）相似するタンパクをコードしていると信じられている点で、お互いに相似している。図３に示すｓｎｗＢ領域は、ＳｎｗＢタンパクをコードするＤＮＡ配列に相当する。また、ｓｎｗＢ遺伝子は、Ｓ８８染色体ＤＮＡのｓｐｓＢ遺伝子及びＳ６０染色体ＤＮＡのｓｇｅＢ遺伝子と相似する。これらのＤＮＡフラグメントは、上記で一般的に述べたようにプラスミド中に挿入して、スフィンゴモナスがスフィンガンを増産するための多数のコピーを形成する。
【００８３】
スフィンゴモナスＳ８８のｓｐｓＢ遺伝子はグルコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードしていると信じられている。ＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列は、異なる属の菌の推定グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼと、かなりの相同性があることが立証されている。この推定アミノ酸配列は一般にグリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードしていると信じられている他の遺伝子の配列と似ているが、この類似性がｓｐｓＢ遺伝子はグルコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードするということの最も強い証拠となっている。実際、グルコシル−ＩＰトランスフェラーゼのカルボキシル部分と、ガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼのカルボキシル部分とには、かなりの相同性がある。アミノ末端領域にはこのように大きな相同性はないが、ＳｐｓＢタンパクには膜貫通領域であると示唆されている疎水性の広がりが複数存在している点で、Ｓ. エンテリカ（Ｓ. ｅｎｔｅｒｉｃａ）のＲｆｂＰタンパクと似ている（１９９１, Ｊｉａｎｇ, ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５, ６９５）。ＳｐｓＢの疎水性領域は、３５〜３９の位置のアミノ酸（平均ハイドロパシー＋２. ２）、６８〜８６の位置のアミノ酸（＋１. ７）、１０５〜１２３の位置のアミノ酸（＋２. ３）及び２８２〜３０３の位置のアミノ酸（＋２. ９）を含んでいる。後者の疎水性領域の位置はこれらの関連遺伝子産物に共通していて、最大相同領域の隣に存在している。
【００８４】
本発明の最良の実施態様において、ＤＮＡセグメントやフラグメントには、Ｓ８８、Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１３０、Ｓ１９４、Ｓ１９８、Ｓ６５７及びＳ７を始めとするスフィンゴモナス菌の各種菌株の、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が含有されている。これらのＤＮＡセグメント及びフラグメントの多数のコピーを、受容菌となるスフィンゴモナス菌中で使用して、この受容菌がスフィンガンをより多く生産できる利得を実現することができる。グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメントの組み込みに加えて、糖シントン又は糖前駆体（すなわち、スフィンガンポリサッカライドの構成部分を含み、スフィンガンの生合成に使われる糖成分、例えばグルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノース、他の糖シントンや前駆体）をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメント、又は、重合を促進したり、無処理の細胞構造からの多糖類分泌を促進する酵素や蛋白質をコードする遺伝子又はＤＮＡフラグメントを好適に本発明で使うことができる。
【００８５】
次の実施例により本発明を説明する。如何なる方法によっても実施例の説明を本発明の範囲を限定するものと誤解してはならない。
【実施例】
【００８６】
次の実施例１〜２１では、細菌の菌株、プラスミド及びバクテリオファージを表２に列記する。ルリア−ベルタニ培地及びＹＭ培地を標準培地とする（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。抗生物質（Ｓｉｇｍａ社）の用量は次の通りである。バシトラシン（Ｂａｃ）は、特に本例では、７３単位／ｍｇ又は０．０１〜８ｍｇ／ｍｌ。リファンピシン（Ｒｉｆ）は、５０μｇ／ｍｌ。ストレプトマイシン（Ｓｔｍ）は、５０μｇ／ｍｌ。カナマイシン（Ｋａｎ）は、２５μｇ／ｍｌ。クロラムフェニコール（Ｃａｍ）は、１５μｇ／ｍｌ。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）は、４〜１２μｇ／ｍｌ。
【００８７】
【表２】
【００８８】
実施例１
スフィンゴモナスのＤＮＡセグメントライブラリーの構成
スフィンゴモナス菌株から、スフィンガン類の合成に不可欠なＤＮＡセグメントのクローンを形成した。次のようにして、ＤＮＡセグメントの完全なライブラリーを調製した。ＹＭ液体培地２５ｍｌ中に菌株（この実施例ではＳ８８）を置き、３０℃で一晩振盪して、多量の細胞を含有する粘液性ブロスを作成した。
ＹＭ培地には、水１リットルあたり、バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母エキス３ｇ、バクト麦芽エキス３ｇ、バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ、及びＤ−グルコース( Ｄｉｆｃｏ）１０ｇが含有されていた。アジ化ナトリウムを０. ０１％まで加え、さらにスフィンガナーゼ（ｓｐｈｉｎｇａｎａｓｅ）酵素（１９９４, Ｍｉｋｏｌａｊｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０,４０２）を３７℃で８時間添加し、スフィンガンエクソポリサッカライドを消化して、粘度を部分的に低下させて細胞の増量を図った。細胞を遠心分離し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３（１９７９）の方法によりＤＮＡを抽出するために再懸濁した。ライセート（分離物）に等量のフェノール：ＣＨＣ13：イソアミルアルコール（２４：２４：１）混液を加え、２５℃で１６時間緩やかに振とうし、その後、１容量のＣＨＣ13：イソアミルアルコール（２４：１）混液を加え、２５℃で３時間緩やかに振とうした。このようにして澄明としたライセートからタンパクを除いた。３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５. ２）１／１０容量を加え、高分子量のＤＮＡを２容量のエタノールで沈澱させた後、乾燥して、さらにＴＥ（１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ）０. ５ｍｌ中に再懸濁した。
【００８９】
Ｌｏｆｔｕｓ, Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｓ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, １２，１７２，１９９２）のコスミドクローニング計略により、Ｓ８８ＤＮＡをＳａｌＩ酵素により部分的に消化し、トリス・酢酸塩・ＥＤＴＡ緩衝液中、１％の低融点アガロースで電気泳動した。２０ｋｂｐより大きなフラグメントをフェノール抽出とエタノール沈澱により精製した。このＳａｌＩで消化したＳ８８ＤＮＡは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して、ｄＣＭＰとｄＴＭＰを付着端に添加し、７０℃で２０分間加熱した後、エタノールで沈澱させた。ベクタープラスミドｐＲＫ３１１（１９８５, Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１３, １４９〜１５３）は、ＢａｍＨＩ酵素で完全に消化し、６５℃で１５分間加熱して、フェノール抽出とエタノール沈澱により精製した。このようにしてＢａｍＨＩで消化したｐＲＫ３１１ＤＮＡは、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して、ｄＧＭＰとｄＡＭＰを添加して、上記のようにして精製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応に含まれていたベクターと挿入フラグメントのモル量は等しかった。すべての制限酵素、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社から入手し、このメーカーの反応条件を使用した。バクテリオファージ（ストラタジーン社のＧｉｇａｐａｃｋTMＩＩＸＬ）中にパッケージングした後、ライゲーションした分子をトランスフェクションにより大腸菌ＤＨ５αTMに転移し、細胞を濃度４〜１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上に広げた。テトラサイクリン耐性コロニー１７００個のうちの１つのライブラリー、及びテトラサイクリン耐性コロニー３４００個のうちの１つのライブラリーのそれぞれを別個にプールして、凍結した。テトラサイクリン耐性コロニーは（試験した１０個のうち１０個が）内部にＳａｌＩ制限酵素部位をもつ、長さ２５〜３０ｋｂｐの挿入断片を含有していた。
【００９０】
同様にして、ＮＷ１１、Ｓ６０、Ｓ１９８、Ｓ１９４、及びＳ７を含む他の各種スフィンゴモナス菌株から、染色体ＤＮＡセグメントのライブラリーを作成した。この場合、クローニングしたＤＮＡの供給源である細胞を、０. ５％ｗ／ｖ以下のグルコースを含む培地中で増殖させ、スフィンガナーゼ処理は省いた。
【００９１】
実施例２
スフィンガンＳ−８８生合成用ＤＮＡフラグメントの単離
プラスミド中にクローニングしたＤＮＡのフラグメントのスクリーニングを行い、スフィンガン陰性変異菌がスフィンガン合成を復活するか、否かを観察することにより、スフィンガンＳ−８８の合成に不可欠な遺伝子が存在するか、否かを判定した。かねて本発明者らは、バシトラシン５００〜８００μｇ／ｍｌを含有するＹＭ皿上で増殖できるスフィンゴモナスＳ８８菌株の自然バシトラシン耐性変異菌のほとんどが、スフィンガン多糖類を生産できないことを見いだしていた（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，１９９４, Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７）。この所見に基づいてこの特別クラスの変異菌の簡便スクリーニング法を完成した。
【００９２】
変異菌Ｓ８８ｍ２６０はこのＳｐｓ- Ｂａｃr 群の代表的な変異菌である。Ｓ８８ｍ２６０その他のＳｐｓ- Ｂａｃr 変異菌がエクソポリサッカライドを生産できなかった際のコロニーの外観は、野生型コロニーと比較して、平坦で、表面が粗く半透明であった。また、野生型のコロニーは光にかざして下から見ると狭い、光を屈折するハローで取り囲まれていた。これらの表現型の違いは、Ｘ. カンペストリスにおいて、野生型におびただしいムコイドがあるのに対して、対応するＧｕｍ- 変異菌は平坦な外観を持っている違いほど明白ではなかった。コロニーの表現型は、培養物を液体ＹＭ培地で増殖し、エクソポリサッカライドをイソプロピルアルコールで沈澱し、乾燥計量して確認した。いくつかのＳｐｓ- 変異菌はバシトラシンに感受性を持っていて、後にスフィンガン合成に不可欠であり、しかもバシトラシン耐性表現型に関する遺伝子とは区別されるべき遺伝子の特徴を備えていることが分かった。
【００９３】
遺伝子ライブラリーからプラスミドＤＮＡを取り、三元交配法により大腸菌からキサントモナスや、スフィンゴモナスに転移した（Ｄｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ，７７, ７３４７, １９８０）。Ｍｏｂ+ Ｔｒａ- 組換えプラスミド（Ｓ８８挿入断片を持つｐＲＫ３１１）を含有する供与菌の細胞、Ｍｏｂ+ Ｔｒａ+ ｐＲＫ２０１３プラスミドを含有するヘルパー細胞及びエクソポリサッカライド陰性の受容菌の細胞を比率５：２：１０で混合した混液を、グルコースを入れない非選択的ＹＭプレート中にスポットし、３０℃で６〜１６時間インキュベートした。次に、プレート中に、ヘルパー細胞と供与菌の細胞を排除するためのリファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）を入れ、かつ、組換えプラスミドを選択するために、ｐＲＫ３１１用としてテトラサイクリン（４〜１２μｇ／ｍｌ）、又はｐＳＥＢ２４用としてクラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を入れた。これらのプレート上に上記の交配混液１白金耳を展開して、プラスミドを受容したキサントモナスの株を単離した。スフィンゴモナスは元来ストレプトマイシンに耐性を持っているので、スフィンゴモナスが受容菌のとき、供与菌及びヘルパー細胞に対してストレプトマイシンがスフィンゴモナスの選択に使われる。
【００９４】
このようにして得たＳ８８菌株のプラスミドを受容した株が、Ｓｐｓ+ （盛り上がって丸く不透明で、光にかざして下から見ると、明るい輪で取り囲まれている）あるいはＳｐｓ- （平たく、粗く、半透明のコロニーで、輪がない）の、どちらであるか裸眼で判断して、その相補性を評価した。同様に、プラスミドを受容したキサントモナス菌から生育したＧｕｍ+ のコロニーは、Ｇｕｍ- の受容菌の艶がなく、光らないコロニーと比べて、外観がムコイド性である。
【００９５】
ライブラリー中のＳ８８のクローンをＳ８８の非ムコイド性変異菌中で直接同定しようとしたが、（ムコイドの表現型を明確に立証できなかったため）成功しなかった。そこでライブラリーを、一旦Ｘ. カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子の非ムコイド性変異体に転移してから、クローンを見いだす方法に切り替えた。これにより初期クローン「Ｓ８８ｃｌ」を見いだすことができたが、これについては下記で詳しく説明する。
【００９６】
Ｓ８８遺伝子ライブラリーを大腸菌から、ｇｕｍＤ遺伝子中にＢａｃr Ｇｕｍ- が欠損しているＸ. カンペストリス菌株Ｘ５９ｍ３１中に交配した（Ｐｏｌｌｏｃｋ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６, ｐｐ. ６２２９〜６２３７, １９９４; Ｔｈｏｒｎｅｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，３５９３, １９８７）。この属間交配では、いくつかのＧｕｍ+ Ｔｅｔr コロニーがＹＭプレート上で認められたが、このコロニーは約１０-3〜１０-4の頻度で出現すると考えられた。相補された変異体から、プラスミドをおのおの精製し、再び大腸菌に転移して制限酵素解析を行った。精製プラスミドをスフィンゴモナスＳ８８ｍ２６０に交配したところ、約１０％の接合完了体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）がＳｐｓ+ となった。一つのプラスミド（ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ）を回収し、これを使用してさらに実験を続けた。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、さらにいくつかのスフィンゴモナス菌株Ｓ８８から別個に単離したＢａｃr Ｓｐｓ- 変異菌、及びＸ. カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異菌とも相補した。属間交配ごとのプラスミドを受容した株が培地に分泌するエクソポリサッカライドを単離し、次に、薄層クロマトグラフィーを行い、酸水解物が受容菌の細胞の多糖類に存在している筈の糖残基を含有しているとの結果を得て、これらが多糖類であることを確認した。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、スフィンゴモナスではスフィンガン合成を、Ｘ. カンペストリスではキサンタンガム合成をそれぞれ復活させた。これらの結果は、プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌは、Ｂａｃr 多糖類陰性変異菌が失っていたエクソポリサッカライド生合成機能をコードしていたこと、及びある属の遺伝子が他の属の失なわれていた機能を回復できたことを示している。セグメントＳ８８ｃｌは、図１に示されるＳ８８ｃｌ△３の最も右の末端に７. ５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが付加されている点を除けば、Ｓ８８ｃｌ△３と同一である。Ｓ８８ｃｌからこの７. ５ｋｂｐセグメントを特異的に欠失させて、その派生物であるＳ８８ｃｌ△３を産生した。
【００９７】
上記で説明した、ガム生産（スフィンゴモナス属菌のスフィンガンガム、又はＸ. カンペストリスのキサンタンガム）の復活に有用なＤＮＡフラグメントの測定方法には再現性があり、別個の実験では新しいクローンが単離された。スフィンゴモナスＳ８８のＳｐｓ- Ｂａｃs 変異菌７６及び７８を相補するセグメントを、クローンライブラリーから直接スクリーニングする際、Ｓ８８ｃｌと部分的に重なり合っている三つの新しいクローンが形成された。これらのセグメントクローン３個は、おのおの長さが約２３〜２７ｋｂであった。３個のセグメントのうち、二つは変異菌Ｓ８８ｍ２６０を相補した。制限酵素切断部位地図を図１及び図６に示す。
【００９８】
上記の方法は、これらの菌株おのおののスフィンガンを増産するために有用な、スフィンゴモナス菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７、Ｓ１９４及びスフィンガン生産能を持つその他のスフィンガン菌株から単離したＤＮＡセグメントの決定に用いられる。
【００９９】
実施例３
ｓｐｓＢ遺伝子のＤＮＡ配列とＳｐｓＢタンパクの推定アミノ酸配列
プラスミドｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ４. ５::Ｔｎ＃７２からサブクローニングした３３００ｂｐのフラグメントのうち、ｓｐｓＢ領域の１９５０ｂｐの二本鎖ヌクレオチド配列を得た。コード鎖の配列を配列表（配列番号１）に示す。１つの長い読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）があり、これをｓｐｓＢと名付けた。コード領域はヌクレオチド３６１の位置のＡＴＧに始まり、１７７１の位置のＴＧＡ終止コドンまで続いていた。このＯＲＦはアミノ酸４７０個をコードし、ＯＲＦの先には推定リボソーム結合部位があった。標準三文字略記法による推定アミノ酸配列を配列表（配列番号２）に示す。
【０１００】
実施例４
Ｓ８８セグメントのクローンと、Ｓ８８及びＳ６０の染色体ＤＮＡとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃｌ△３のＤＮＡクローンは、隣接するＳ８８ＤＮＡ配列から派生したものであることを立証するため、プラスミドＳ８８ｃｌ△３ＤＮＡに標識を付け、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８、変異菌Ｓ８８ｍ２６０、及び野生型ジェラン生産菌であるＳ６０から分離したＤＮＡ制限フラグメントとハイブリッド形成をおこなった。約１. ５、２. ４、４. ５、５. ９及び１２ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント中にハイブリッドを形成すると、野生型ＤＮＡ及び変異菌Ｓ８８ＤＮＡ両方のＤＮＡクローンの連続体と一致する。ＥｃｏＲＩ部位の一つはベクターのマルチクローニング部位から始まっているので、重なり合っているクローンであるＳ８８ｃ２、Ｓ８８ｃ３、及びＳ８８ｃ４をＥｃｏＲＩで消化すると、Ｓ８８ｃｌ△３であることが証明されている最も左の６. ６ｋｂｐフラグメントは、実際には１２. ８ｋｂｐとなる。Ｓ８８ＤＮＡとジェランを生産するＳ６０ＤＮＡとでハイブリッドを形成できることから、似ている遺伝子配列が存在しているが、遺伝子の組成が異なっている可能性があることが示唆された。これら二つのスフィンゴモナス菌株が分泌するエクソポリサッカライドの構造が似ているので、類似したトランスフェラーゼ遺伝子を持っていると考えられる。Ｓ８８−Ｓ６０の相同領域を図２に示す。別個のＤＮＡ相同性解析で、図３で示すように菌株ＮＷ１１とＳ８８の間の相同領域の位置を確定した。
【０１０１】
実施例５
菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４のスフィンガン生合成遺伝子クラスターのクローニング
スフィンゴモナスＳ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４からＤＮＡフラグメントを単離した。方法としては、菌株Ｓ８８に関する上記実施例と同様にした。菌株Ｓ６０、ＮＷ１１、Ｓ１９８、Ｓ７及びＳ１９４のＤＮＡフラグメントの制限部位地図は、それぞれ図２、図３、図９及び図１０に示す。１種又は多種の制限酵素によるＤＮＡの消化によって生じた制限酵素フラグメントの大きさを、２つの独立に単離されたクローンであるｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１及びｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ２についてここで挙げる。この大きさは、そのフラグメントのアガロースゲル電気泳動の移動度を、大きさが既知のフラグメント、つまり、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後のバクテリオファージラムダＤＮＡ、及びストラタジーンの「ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ」と比較して決定した。フラグメントの大きさは、上記の２つのクローンに含まれるＤＮＡ配列と一致する。
【０１０２】
スフィンゴモナスＳ１９４から単離したｃ１セグメントを含有するプラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１のフラグメントの大きさのデータを次に示す。ｐＲＫ３１１−Ｓ１９４ｃ１のフラメントの大きさは次の通りである。（ＥｃｏＲＩ）＞２５、８．３、５．４及び１．５ｋｂｐ。（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３．０、９．７、８．３、５．４、２．８及び１．５ｋｂｐ。（ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２５及び２．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２５、５．８、３．９、２．０及び０．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ）＞２５、５．８及び４．７ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３．０、８．３、５．８、５．４、３．９、２．０、１．５及び０．８ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ）１５．０、８．３、５．８、５．４、４．７及び１．５ｋｂｐ。ｐＲＫ３１１ーＳ１９４ｃ２のフラグメントサイズは次の通りである。（ＥｃｏＲＩ）１４．５、１０．０、８．３、６．１、２．６及び１．３５ｋｂｐ。（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３、８．３、５．７、４．６、４．０、２．６、１．８、１．３５、０．７５、０．３５．及び０．２５ｋｂｐ。（ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２０、１２．８、４．６、２．１、０．７５及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）＞２０、３．８、３．１、２．８、２．３、１．６５、１．６、１．３、１．２、０．９５、０．９、０．８及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ）＞２０、５．８、３．１、２．８、２．６、２．３、２．０、１．６及び０．２５ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）１３、８．３、３．８、３．１、２．４、２．３、１．６、１．３５、１．３、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．４５、０．３５及び０．３ｋｂｐ。（ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ）１４．５、８．３、４．９、３．１、２．４、２．３、２．０、１．６、１．３５、１．３、０．８５、０．４５及び０．２ｋｂｐ。
【０１０３】
実施例６
プラスミドｐＳＥＢ２６の構成
特異的な複製機能と接合交配機能、並びに、スフィンゴモナス属に好適で、かつ、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎと和合性がある薬剤耐性遺伝子を含有し、マルチクローニング部位を有する、プラスミドｐＳＥＢ２４とｐＳＥＢ２６（図５）を組み立てた。プラスミドｐＳＥＢ２４が広範囲宿主域を持つ反面、ｐＳＥＢ２６は大腸菌では複製できるが、スフィンゴモナス属やキサントモナス属のどちらでも複製することができない。まず、スタフィロコッカス・アウレウスのプラスミドｐＣ１９４（１９８２，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ａｎｄ Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５）から取られた１０３１ｂｐのＨｐａＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメント上のＣａｍr を、平滑末端に加工して、プラスミドｐＵＣ１３（１９８２，Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ，２５９）のＸｂａＩ平滑末端にライゲーションした。ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩセグメント上のこのプラスミドからＣａｍr カセットを取り除き、平滑末端にした後、ｐＵＣ１２中の独特なＳｓｐＩ部位と、二つあるＰｖｕＩＩ部位のうちの最も近い部位（これも平滑末端）との間に挿入した。このようして、Ａｍｐr かつＣａｍr であり、Ｘ−ＧａｌとＩＰＴＧとを添加すると青いコロニーを形成するプラスミドｐＳＥＢ２３を得て、ｐＳＥＢ２４を構成するため、ｐＳＥＢ２３から約２１３０ｂｐのＳｃａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをとり、ｐＭＭＢ６６ＥＨ（１９８６，Ｆｕｅｒｓｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４８，１１９）のＳｃａＩ−ＰｖｕＩＩ部分とライゲーションさせ、ｏｒｉＶ（ＲＳＦ１０１０からの広範囲宿主複製開始点）を保持させ、Ａｍｐr 遺伝子を再生した。プラスミドｐＮＨ−Ｋａｎ／ｏｒｉＴ（Ｈｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９２，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５７−６２）のｏｒｉＴ配列を含む２７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、３２００ｂｐのＰｖｕＩＩで直鎖状にしたｐＳＥＢ２３プラスミドと、平滑末端同志で結合してｐＳＥＢ２６を形成した。ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩのライゲーションにより再生したＢａｍＨＩ部位は、制限酵素処理に引き続き、付着末端にキャッピングを施し、再びライゲーションすることにより取り除かれた。
【０１０４】
実施例７
Ｓ８８ＤＮＡフラグメントのコピーを菌株Ｓ８８に導入したことによる多糖類Ｓ−８８の増産
菌株Ｓ８８から単離した図１に示すＤＮＡセグメントの特異的な制限フラグメントを、ＤＮＡライゲーションによりマルチコピープラスミドベクター中に挿入した後、上記の実施例２で説明した三元交配により野生型菌株Ｓ８８とＳ８８の子である非ムコイド性変異菌に転移した。ＤＮＡクローンを変異菌に転移すると、多糖類合成が復活する。細菌を液体培地で培養した後、組換えプラスミド含有菌株とプラスミド遺伝子を付加しなかった菌株が生産したスフィンガン多糖類の累積量を測定した。じゃま板付きフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋｓ）中で振盪しながら３０℃で２４時間増殖した後、２容量のイソプロピルアルコールを加えて、エクソポリサッカライドを沈澱させた。各菌株ごとに２〜３回づつ独立に培養して、実験を行った。沈澱物をフィルターに集め、８０℃で乾燥して、計量した。菌株毎の沈澱物の平均重量と標準偏差値を表３に示す。遺伝子のクローンのコピーを付加した組換え菌株のスフィンガンＳ−８８生産量は、通常セットの生合成遺伝子しか持たなかった野生型菌株のそれよりも大きかった。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
制限酵素地図、ｓｐｓＢ遺伝子のヌクレオチド配列及びこれを取り巻くＤＮＡは、標準組換えＤＮＡ法によって約３２ｋｂの領域の新しいサブフラグメントを無数に形成するに充分な情報であることが、当業者にとり明白である（図６）。さらに、これらの新しいフラグメントを本明細書で説明した方法により試験して、スフィンガン多糖類を同様に増産するセグメントを同定できることも、当業者にとり明白である。表３から、このサブフラグメントが小断片であると（例えば、ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｅ１２. ８）充分な生産刺激効果を示さないことが読み取れる。しかしながら、ほぼ全てのサブフラグメントは、増産を可能にしている。今日までの実験により、本発明者らは、ｐＳＥＢ２４−Ｓ８８Ｂ８. ６とｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ３がスフィンガン生産に対して最大の刺激効果があると信じている。
【０１０７】
この増産法では、継続的に組換えプラスミドを選択するために、培養物に抗生物質を存在させておく必要はない。
【０１０８】
この増産法は、一以上のＤＮＡフラグメントを染色体又は内因性の本来菌が持っていたプラスミドに挿入して、好ましくはこの染色体セグメントの単数又は複数の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを挿入することによって達成される。通常の技倆を持つ当業者であれば、内在の（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）細菌染色体、内因性の本来菌が持っていたプラスミド、あるいは外因性プラスミドベクターに、スフィンガン生産能を持つ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを挿入することにより、スフィンガン生産能を持つ細菌にＤＮＡフラグメントを導入することは容易である。本出願で立証されている試験結果では、このスフィンガン増産には、特定のプラスミドベクターの使用に対して依存性が認められないことは注目に値する。
【０１０９】
本発明の範囲には、上記で説明した遺伝子セグメント又は遺伝子群をコードするＤＮＡフラグメントのどれかと、遺伝子の発現をコントロールすることで知られているＤＮＡ配列、本発明を限定することなく例を挙げると、大腸菌のｌａｃプロモーターとを、融合させることも含まれている。
【０１１０】
実施例８
組換えＳ８８菌株が生産したエクソポリサッカライドがスフィンガンＳ−８８であることの同定
操作された菌株によって生産されたエクソポリサッカライドが受容菌の型と同一であることを確認するため、薄層クロマトグラフィーによって酸水解物中のモノサッカライド類を同定した。
【０１１１】
Ｘ. カンペストリスの細胞外キサンタンとスフィンゴモナスのスフィンガンＳ−８８を、２〜３容量のイソプロピルアルコールにより沈澱させて、液体培地から分離し、８０℃で乾燥して計量した。多糖類を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の水に５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。０. ６ｍｌ超小型遠心分離管中で、無水トリフルオロ酢酸（８８μｌ、Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ. から入手）を、７５μｌのＨＰＬＣ用の水（Ｂａｋｅｒ）及び２２５μｌの多糖類（５ｍｇ／ｍｌ）と混合して、９５℃で１６時間インキュベートした。加水分解物を真空乾燥し、ＨＰＬＣの水２００μｌに再懸濁して、新しい超小型遠心分離管に入れ、再び乾燥した後、ＨＰＬＣの水４５μｌに懸濁した。サンプル（２５μｇ／ｍｌ）は凍結して貯蔵した。糖標準液（Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンノース、Ｌ−マンノース、Ｌ−ラムノース及びＬ−フコース）を４ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＰＬＣの水に再懸濁した。コート済みで、チャンネルを形成した（ｃｈａｎｎｅｌｌｅｄ）シリカゲルクロマトグラフィープレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ ＣＦ２５４、１０２０ｃｍ、Ｅ. Ｍｅｒｃｋ）を、一晩０. ３ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 中に浸漬した後、室温で３０分間、さらに９５℃で１０分間乾燥した。サンプル１〜２μｌをスポットし、室温で２. ５〜３時間アセトン４０ｍｌ、ブタノール５ｍｌ及び脱イオン水５ｍｌからなる溶媒混液にクロマトグラムをさらして、混液を上昇させた。プレートは６５℃で３分間乾燥し、アセトン２５ｍｌ、アニリン０. ５ｍｌ、ジフェニルアミン０. ５ｇ及びリン酸３. ７５ｍｌからなる溶液に浸して染色した後、９５℃で３０分間乾燥した。Ｘ. カンペストリスがＳ８８ＤＮＡフラグメントの受容菌である場合は、グルコース、マンノース及びグルクロン酸が存在した。スフィンゴモナス菌株Ｓ８８がＸ. カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子の受容菌である場合は、ラムノース、グルコース、マンノース及びグルクロン酸がＳ−８８エクソポリサッカライドとほぼ等量で存在した。
【０１１２】
実施例９
スフィンガンＳ−８８、Ｓ−６０、ＮＷ−１１及びＳ−１３０の生産に対する、菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から得たＤＮＡフラグメントの刺激効果
上記の実施例５、６及び７で述べた一般法に従って菌株Ｓ８８、Ｓ６０及びＮＷ１１から得たＤＮＡフラグメントを使用することにより、スフィンゴモナス菌株がスフィンガンＳ−８８、ジェラン（Ｓ６０）及びＮＷ１１を増産した。結果を次の表４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
一般法としては上記の実施例、特に実施例７で説明した技術や方法を用いて単離されたＤＮＡフラグメントの多数のコピーを挿入することにより、特定のスフィンゴモナス菌株から単離されたＤＮＡフラグメントを使って、異なるスフィンゴモナス菌株に（初めの菌株が生産するものとは異なる）スフィンガンを増産させようとするものである。
【０１１５】
本実験で確立された一般法においては、いずれかのスフィンゴモナス菌株のスフィンガン生産に不可欠な遺伝子材料を含有するＤＮＡフラグメントを、適当なプラスミドベクターその他の手段に挿入する。このようにＤＮＡを挿入したプラスミドベクターの多数のコピーを、ＤＮＡを単離したスフィゴモナスと同じ菌株あるいは異なる菌株のスフィンガン生産能を持つ菌又は非ムコイド性変異菌に導入する。この場合ＤＮＡが導入されたスフィンゴモナス菌株は、スフィンガン生産菌又はスフィンガン生産能を持つ菌のスフィンガン生産能を持たない変異菌のいずれでもよい。同一の発酵条件では、このように操作したスフィンゴモナス菌のスフィンガン生産量は一般に、操作しない、変異体ではないスフィンガン生産菌の生産量より大きい。
【０１１６】
次の実験により、ＤＮＡフラグメントの多数のコピーをスフィンゴモナス菌株その他の細菌に組み入れることは常法であることを証明する。
【０１１７】
実施例１０
Ｘ. カンペストリスの染色体へのラクトース消費遺伝子（ｌａｃｔｏｓｅ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）の挿入
制限酵素とＤＮＡライゲーションを用いる標準クローニング法により、Ｘ. カンペストリス中で複製できないプラスミドに担持させた、Ｘ. カンペストリスの予めクローニングしたＤＮＡセグメントに隣接して、トランスポゾンＴｎ９５１から得られたラクトース消費遺伝子を挿入した（Ｔｈｏｒｎｅ, ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｉｎｄｕｓｔ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３, ３２１，１９８８）。その後、この組換えプラスミドを接合によりＸ. カンペストリス中に転移した。受容菌内では、ラクトース消費遺伝子の隣に位置するＸ. カンペストリスから得られた相同ＤＮＡが、通常の相同組換えによって細胞ＤＮＡと組換えられ、ラクトース消費遺伝子が細菌染色体と隣合わせに結合した。この結果、クローニングされたセグメントが細菌染色体に安定して挿入されることになった。このことは、上記の論文中で図を用いてより完全に説明されている。本発明以外でも、この方法によって遺伝子を細菌に挿入している例が数多く存在している。
【０１１８】
上記で説明したＤＮＡ組換えでは、事前に、プラスミドをベクターとして使用し、外因性ＤＮＡを細菌中に導入する必要がないことは注目に値する。ＤＮＡセグメントをバクテリオファージあるいはトランスポゾンに担持させると、部位特異的ＤＮＡ組換えによって自然に細菌染色体に挿入されることが広く知られている。通常、バクテリオファージは特異的に１ないし２〜３個の位置で挿入するに過ぎないが、トランスポゾンは通常、多くの、実質的に任意の位置で挿入することができる。また、プラスミドなどのクローニングベクターと結合したＤＮＡを細胞内に輸送する必要はない。ＤＮＡフラグメントは形質転換によって、細胞ＤＮＡと組換える能力を保持しながら細菌細胞内に入ることができることがよく知られている。
【０１１９】
実施例１１
任意に選択された数個の異なる位置において、カナマイシン耐性をコードする遺伝子を、スフィンゴモナスＳ８８菌ＤＮＡへ部位特異性挿入する
この実施例においては、クローニングされたＤＮＡのセグメントをスフィンゴモナスの細胞ＤＮＡに挿入することは、容易に実施できるものであることを証明する。まず、Ｓ８８Ｅ１２. ８フラグメント（図１参照）を、プラスミドベクターｐＳＥＢ２６のマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＩ部位にライゲーションした（図７）。プラスミドｐＳＥＢ２６は、図５で示すｐＳＥＢ２４のように、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、マルチクローニング部位、Ｌａｃセグメント及びｏｒｉＴを持っている（図５参照）。しかしながら、プラスミドｐＳＥＢ２４が広範囲宿主域のｏｒｉＶ配列を持つが、プラスミドｐＳＥＢ２６は狭い宿主域の複製開始点を持つということで、プラスミドｐＢＲ３２２とは異なる。ｐＢＲ３２２の複製開始点は、大腸菌内におけるプラスミドの複製はできるが、スフィンゴモナス内では複製できない。したがって、プラスミドｐＳＥＢ２６内にクローニングされたＤＮＡ配列がスフィンゴモナス内で存続する唯一の方法は、プラスミドｐＳＥＢ２６が細胞あるいは培養物から消失する前に、プラスミドｐＳＥＢ２６を染色体や、内因性プラスミドなどの細菌ＤＮＡに組み込むことである。次に、このようにして得たｐＳＥＢ２６−Ｓ８８Ｅ１２. ８プラスミドを、常法によりトランスポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ（１９９１, Ｋｌｅｃｋｎｅｒ, ｅｔ ａｌ．，２０４, ｐｐ. １３９〜１８０）との突然変異生成にさらした。非抑制的な宿主ＨＭＳ１７４における転位による突然変異誘発は、ラムダバクテリオファージＮＫ１３１６によって担持されるＴｎ１０派生物１０３（ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎ／Ｐｔａｃ−ＡＴＳｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）による。その結果、カナマイシン耐性遺伝子がプラスミドに挿入された。また、Ｓ８８Ｅ１２. ８セグメント内のそれぞれ異なる位置にあるカナマイシン耐性遺伝子の数個の別個の挿入断片を単離した。次に、このようにして得た組換えプラスミドおのおのを、三元交配法によりスフィンゴモナスＳ８８内に別個に転移して、カナマイシン耐性の子孫を選択した。事実上すべての場合、カナマイシン耐性遺伝子の両側に位置するＳ８８ＤＮＡ配列が受容細胞の染色体と組換えられ、カナマイシン耐性遺伝子が細菌染色体に組み込まれた。細菌染色体に組み込まれることにより、ベクタープラスミドがスフィンゴモナス内で複製することができないにも拘らず、カナマイシン遺伝子は存続することができた。
【０１２０】
この実施例は、外因性ＤＮＡ配列（この場合、カナマイシン耐性遺伝子）を受容菌に導入して、導入遺伝子を細菌染色体に組み込むことができることを示している。組み込みの位置は、その遺伝子に隣接するＤＮＡ配列によって決定される。この実施例では、外因性遺伝子は菌株Ｓ８８のＥ１２. ８セグメント内の、相異なる部位に組み込まれた。相同組換えによる組み込みは、日常的に実施されている遺伝子操作法である。
【０１２１】
実施例１２
ＤＮＡの配列決定の追加実験とその解析
図６に示すようにＤＮＡの両鎖について、ＢａｍＨＩ部位の１ｂｐから２８．８０４ｂｐまでの間の配列を決定した。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシヌクレオチド鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３−５４６７）が、エクソヌクレアーゼＩＩＩとＳＩヌクレアーゼを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）上にクローニングされたＤＮＡの配列決定に用いられた。内部シーケンシングプライマーも使用した。さらに、ＣｏｒａｌＳｏｆｔｗａｒｅ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のＳｕｐｅｒＣｌｏｎｅ及びＳｕｐｅｒＳｅｅプログラム、並びにＫｙｔｅａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）により、膜貫通タンパク質領域の配列を解析した。また、「ｂｌａｓｔｐ」プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０）により、ＮＣＢＩの膨大なデーターライブラリーから相同タンパク質セグメントを同定した。ナイロン膜とＧｅｎｉｕｓTM１キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いる標準法により、ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。
【０１２２】
実施例１３
スフィンガンＳ−８８生合成に関与する遺伝子のクローニング
本実施例は一部を実施例２と同様にして行った。本発明者らは、かねてから、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８のスフィンガン多糖陰性（Ｓｐｓ- ）変異株のほとんどは、バシトラシンを含有するＹＭプレートでも増殖できることを見いだしていた（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。マッピング実験（後述）の結果、これらの変異株をすべてｓｐｓＢと名付ける遺伝子に分類した。図９及び図１０に列記した代表的なＳｐｓＢ- 変異株（２６０、２６５及び１０２ｗ）は、バシトラシン耐性（Ｂａｃr ）でもあった。反対に、ｂａｃ８菌株は、始めＢａｃr として選択された代表的な菌株であったが、同時にＳｐｓ- でもあることが示された。実施例２で述べたように、Ｓｐｓ- Ｂａｃr 変異株でスフィンガンＳ−８８を形成しようとする試みは失敗に終り、代わりに野生型コロニーよりも平坦で、表面が粗く、半透明の外観を持つコロニーが得られ、いずれのコロニーも下から光にかざして見ると、光を屈折する狭いハローによって囲まれていた。アルコールに沈澱するエクソポリサッカライド類が出現しなかったので、Ｓｐｓ- 変異株はスフィンガン類を液体ＹＭ培地中に分泌できないものと判断した。Ｓｐｓ- Ｂａｃr 変異株の小さいフラクションは、第二の突然変異を持っていた。例えば、変異株１０２ｗのコロニーは黄色ではなく白色であった。変異株１３４ではｓｐｓＢばかりでなく、ｒｈｓＤでも変異があった。変異株５４と３０２では、ｓｐｓＢのみでなくｓｐｓＫもが欠損していた。図９の遺伝子地図の真上に示しているＳｐｓ-変異には、自然発生のものと、紫外線又はエチルメタンスルホン酸にさらして変異させたものとがある。本実施例で実験したこの他の突然変異は、すべて（接頭字「Ｙ」又は「Ｂ」を付けて、図９、１０に示している）、トランポゾンｍｉｎｉ−Ｔｎ１０１ｋａｎの無作意挿入により形成したものである。
【０１２３】
広範囲宿主コスミドｐＲＫ３１１に、スフィンゴモナス菌株Ｓ８８から遺伝子ライブラリーを構築し、プールしておいたクローンを接合交配により大腸菌からＳ８８ｍ２６０に転移した。しかしながら、Ｓｐｓ+ のコロニーは、スクリーニングした１０3 〜１０4 のＴｅｔr プラスミドを受容した株に、またも、生じなかった。そこで、ライブラリーを予め単離してあったＸ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- （ｇｕｍＤ）変異株（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７、及び、Ｔｈｏｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：３５９３−３６００）に転移した。ｇｕｍＤ遺伝子は、キサンタンガムを組み立てる第一工程で、グルコース−６−リン酸をＵＤＰ−グルコースからイソプレニル−リン酸に転移するために必要である（Ｃａｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰａｔｅｎｔＷＯ８７／０５９３８、及び、Ｉｅｌｐｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：２４９０−２５００）。Ｘ．カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子を含有するＤＮＡセグメントによって、スフィンゴモナスのＢａｃr Ｓｐｓ- 変異株がスフィンガンＳ−８８合成を回復できたことから、スフィンガンＳ−８８の組み立ても、グルコースで始まり、スフィンゴモナスからの酵素は、Ｘ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異株を相補できるかもしれないと考えた（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９−６２３７）。属間交配からは、ＹＭプレート上のＴｅｔr プラスミドを受容した株１０3 〜１０4 につき約１の頻度で、Ｘ．カンペストリスのＧｕｍ+ コロニーが認められた。
【０１２４】
大腸菌を用いた形質転換によって、相補されたＸ．カンペストリス変異株からプラスミドを精製した後、スフィンゴモナスＳ８８変異株２６０に交配した。プラスミドを受容した株のうち約５〜２５％がＳｐｓ+ となった。ベクター単独（ｐＲＫ３１１）の場合の方が、より大きな組替えプラスミドの場合よりも、転移の頻度が１００倍ないし１０００倍高かった。ほとんどの組替えプラスミドはスフィンゴモナスと交配させると、大きな欠失が発生するが、ｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１だけは、欠失を起こすことなくポリマー生産能を回復し、これを使用して実験を継続した。図１、図６、図９及び図１０ではＳ８８ｃ１の２１ｋｂｐからなる最左側部分をサブクローンｃ１△３として示している。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１によって、各々別個に単離した菌株Ｓ８８のＢａｃr Ｓｐｓ-変異株及びＸ．カンペストリスのＢａｃr Ｇｕｍ- 変異株の数種が多糖の合成を回復した。属間交配の度に、プラスミドを受容した株が培養基中に分泌する多糖類を単離して、薄層クロマトグラフィーを実施し、酸水解物が受容細胞の多糖として期待されている中性糖を含有していることを確認した。プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１を持つスフィンゴモナス変異株２６０が分泌するエキソポリサッカライドにはグルコース、マンノース及びラムノースが含有されていたが、プラスミドｐＲＫ３１１−Ｓ８８ｃ１を持つＸ．カンペストリス変異株ｍ３１からのものにはグルコースとマンノースしか含有されていなかった。さらに、加水分解条件下のため酸性糖の回収量は一貫して低かったが、多糖は各々グルクロン酸を含有していた。
【０１２５】
ライブラリーをスクリーニングしてＳｐｓ- Ｂａｃr 変異株７６及び７８を相補するセグメント求め、図９及び図１０の左側方向にクローニングした領域を広げていった。プラスミドを受容した株１０4 〜１０6 をスクリーニングして、部分的にＳ８８ｃ１セグメントと重なり合うさらに４個のクローン（Ｓ８８ｃ２、ｃ３、ｃ４及びｃ５）を得た。同様にして、Ｓｐｓ- 変異株４３、７１及び１０４を相補することにより、クローンｃ６を単離した。これら５個のクローニングされたセグメントは、各々長さが２２〜２８ｋｂである。各セグメントの少なくとも１末端を図１０に示す。さらに、クローンｃ２とサブクローンｃ１△３のどちらにも相補されない約１５個からなる１群のＳｐｓ- 変異株を同定した。これらの変異株の中で、ｃ１△３よりも約８ｋｂｐだけ長く右側に広がっているｃ１全長クローンにより相補されたものは一つもなかった。また図３のｃ２よりも約１８ｋｂｐだけ長く左側に広がっているｃ６によって相補されたものも一つとしてなかった。このように「同一連鎖群から外れた」（「ｕｎｌｉｎｋｅｄ」）１群の変異株は、スフィンガン合成に不可欠であるが、しかし図９及び図１０に示す遺伝子クラスターとは直接に連続しない、さらに他の遺伝子の存在を示唆している。
【０１２６】
実施例１４
機能的相補によるｓｐｓ遺伝子のマッピング
Ｓｐｓ- 点変異株を接合の受容菌として用いる相補性検定により、ｓｐｓＧ、ｓｐｓＫ、ｓｐｓＦ、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ、ｓｐｓＢ及びｒｈｓＤ遺伝子の境界を決定した。結果を要約して図９に示す。サブクローニングされた小さいセグメント又はそれより大きいＤＮＡセグメントのを持つ組替えプラスミドを、大腸菌の中でｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる挿入突然変異にさらし、菌株Ｓ８８のＳｐｓ- 変異株との交配によって転移した。これには交配可能な広範囲宿主プラスミドベクターであるｐＲＫ３１１及びｐＳＥＢ２４（図５）を使用した。担持しているプラスミドの耐薬性遺伝マーカーを受け取ったプラスミドを受容した株は、コロニーの外観によって、Ｓｐｓ+ 又はＳｐｓ- と記録した。Ｂａｃr Ｓｐｓ- Ｓ８８変異株は始めＥ４．５サブクローンとして位置づけ、その後、Ｅ４．５セグメントをｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの無作意挿入変異にさらした。位置Ｂ２３１及びＢ２３０（図９及び図１０）に挿入した時には、変異株２６０がスフィンガン合成を回復するのに影響しなかったが、Ｂ２３３、Ｂ２３９及びＢ２３８に挿入した時には相補が阻止された。変異株１３４は、セグメントＢ８．６によって相補されたが、Ｅ４．５又はＥ５．９のいずれによっても相補されなかった。変異株１３４では、ｓｐｓＢ遺伝子と、さらに隣接のｒｈｓＤ遺伝子の両方が欠損していた。Ｂ８．６セグメントをｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる突然変異にさらし、Ｂ４４１、Ｂ４４０、Ｂ４３８、Ｂ４３７及びＢ４３５に挿入することによる相補性のパターンを分析して、ｒｈｓＤ突然変異のより正確な位置を測定した。変異株５４及び３０２も、ｓｐｓＫとｓｐｓＢ遺伝子が欠損している二重変異株であると考えられた。ｓｐｓＦ変異株（図９の６２、６８及び９４）は局在し、かつ、セグメントＢ１２．６及びｃ１△３によって相補されず、またクローンｃ３とｃ５によってスフィンガンＳ−８８の合成が回復されるため、隣接のｓｐｓＤＣＥと分けた。Ｅ６．６フラグメントの挿入突然変異に続いて、連続しているｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ及びｓｐｓＥ遺伝子が相補された結果も併せて図９及び図１０に示す。この相補結果から変異株７６と７８を含むグループと、変異株６９、７２、ｂ１０４、３、９及び４１を含むグループの二つのグループがあることが示唆された。その後、ＤＮＡ配列の分析によって、後者のグループは連続している二つの別個の遺伝子、ｓｐｓＣとｓｐｓＥとに分けられた。ｓｐｓＧ突然変異（図９の１１、４３、７１、８１及び１０４）は、ｃ６クローンとフラグメントＢ１２．６のＢ４．５サブフラグメントとによって相補された（図９及び図１０を参照されたい）。Ｂ１２．６セグメントの挿入突然変異によって、プラスミドＹ６５２、Ｙ６３５、Ｙ６３６、Ｙ６５３、Ｙ６４０及びＹ６４１が産生された。このうち、Ｙ６５２とＹ６４１のみがｓｐｓＧ変異株を相補することができた。
【０１２７】
実施例１５
ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを染色体とプラスミドに挿入したことによる表現型
Ｓ８８ＤＮＡクローンのセグメントを交配可能な狭域宿主Ｃａｍr プラスミドｐＳＥＢ２６（図９及び図１０）にライゲーションし、大腸菌内でｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎによる挿入突然変異にさらした後、接合によって野生型（Ｓｐｓ+）スフィンゴモナス菌株Ｓ８８に転移した。これらのプラスミドはスフィンゴモナス属では複製できないため、Ｋａｎr 遺伝子を維持するためには、細菌の染色体との組み替えが必要である。Ｋａｎr 及びＣａｍs である組み替え体はプラスミド配列を保持しないため、この群のみを選択した。これらのＤＮＡ置換の物理的構造の確認は行っていないが、常に同一のプラスミド、菌株及び選択方法を使用することによって、部位特異性な染色体欠失を生じさせ、制限地図作製とＤＮＡハイブリダイゼーションによってこれらの二重組替えを確認した。Ｋａｎr Ｃａｍs 染色体の組み替え体のコロニーは、Ｓｐｓ+ 又はＳｐｓ- と判定した（挿入体には接頭字「ｃ」を付けて図９に示している）。Ｓｐｓ- 表現型を示す変異株（ｃＹ７７６、ｃＹ７５７、ｃＹ７７１、ｃＹ７７０、ｃＹ６７６、ｃＢ５８９、ｃＢ５８３、ｃＢ５８０、ｃＢ５７９、ｃＢ３００、ｃＹ７２６、ｃＹ７２５、ｃＹ６７６、ｃＹ６７３、ｃＹ７２１及びｃＹ６０２）については、二重組替えが実際に発生したと信じることが、合理的である。しかしながら、相同領域の一個所にて組換えの行われたＳｐｓ+ 組み替え体は、プラスミド全体が染色体に組み込まれたため、その染色体では、ある遺伝子は欠損し、ある遺伝子は正常のままである可能性がある。
【０１２８】
相同領域の二個所にて組替えを行う際の不確実性を排除するため、染色体に大きな部位特異的欠失をつくった後、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの単独挿入したＳ８８ｃ２の全ＤＮＡセグメント、又は、Ｓ８８ｃ３の全ＤＮＡセグメントのいずれかを持つ複製プラスミドを導入して、一部の遺伝子を不活性化させた。挿入位置とこれによるＳｐｓ+ 又はＳｐｓ- の表現型を、接頭字「ｐ」を付けて図９に示す。染色体の変異戦略とプラスミドの変異戦略とはお互い整合し、必須（- ）領域と非必須（+ ）領域の両方が観察された。
【０１２９】
実施例１６
ＤＮＡ配列：Ｇ＋Ｃ含量、希少コドンの使用及び翻訳開始配列
２８、８０４ｂｐのＤＮＡ配列について、両鎖を測定した（配列番号３を参照されたい）。このクラスター中の典型的なスフィンゴモナス遺伝子の平均プロフィル（及び標準偏差）を、Ｇ＋Ｃ含量のゆがみ、希少コドンの頻度、及び「シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）」配列又は翻訳開始配列によって決定した。（表５）。各遺伝子とも第三コドンの位置でＧあるいはＣの頻度が高いことが特色となっていた。この研究の初期において、ｒｈｓＡＣＢＤオペロンのコドン、及びｓｐｓＢ、Ｄ、Ｃ及びＥ遺伝子のコドン２５００個を解析して、一群のスフィンゴモナス属のまれにしか使われないコドンを同定した。希少コドン各々が、この群に存在する比率は全体に対して０．２％以下で、群の構成はＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＴＧＴ、ＧＧＡ、ＡＴＡ、ＣＴＡ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＡＡＡ、ＴＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＡＣＡ及びＡＣＴを含んでいた。大腸菌においては、通常、１６ＳｒＲＮＡの３’末端を相補する配列に連続する下流から翻訳が開始される（Ｓｈａｉｎｅ ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ，２９７４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１：１３４）。Ｓ．ポウシモビリスＤＳＭ１０９８の１６ＳｒＲＮＡを相補する「シャイン−ダルガノ」の相同配列は、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧである（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：１１５−１１８）。
【０１３０】
このクラスター中の遺伝子が平均遺伝子プロフィルに合致し、かつ、変異してＳｐｓ- 表現型が生じたならば、そのものこそ「ｓｐｓ」なる名称を与えることができる。しかしながら、本発明者らのタンパク質類似性サーチからは、ｓｐｓＧ、Ｉ及びＦ遺伝子の機能について、有意の示唆を得ることができなかった。さらにまた、典型的な遺伝子プロフィルを満足する読み取り枠（ＯＲＦ）が４個あったが、コンピューターデーターバンクではタンパク質配列について有意の類似性を発見することはできなかった。しかしながら、これらの推定遺伝子が変異しても、目に見えて多糖合成に変化をおこさなかったため、同定していないフレームとの意味から、「Ｕｒｆ」なる略記を付けた。４個のＵｒｆ配列（３２、２６、３１及び３４）があり、推定されるタンパク質のキロダルトン単位の大きさに応じて名称を付けた。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
実施例１７
グリコシルーＩＰトランスフェラーゼをｓｐｓＢ遺伝子として同定
紫外線放射又は化学的変異原にさらした後に単離されたＳｐｓ- 突然変異のほとんどは、ｓｐｓＢ遺伝子上のものであった。グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードすると信じられている他の遺伝子産物とＳｐｓＢの推定アミノ酸は非常に似ているので、このＳｐｓＢタンパク質はスフィンガンＳ−８８を組み立てる第一工程を触媒すると信じられている。図１１は、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼとガラクトシル−ＩＰトランスフェラーゼと推定されるアミノ酸配列のアラインメントである。これらのタンパク質のＣ末端半分は、お互いにかなり相同性がある。Ｎ末端領域ではこれほど大きな相同性はないが、ＳｐｓＢタンパク質には膜貫通ドメインであると示唆されている数個の疎水性の領域があるので（図１１のアンダーライン部分）、ＳｐｓＢタンパク質はＳ．エンテリカのＲｆｂＰタンパク質（Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，６９５−７１３）と相似している。ＳｐｓＢの疎水性ドメインはアミノ酸３５〜５９（＋２．２平均ハイドロパシー）、６８〜８６（＋１．７）、１０５〜１２３（＋２．３）及び２８２〜３０３（＋２．９）を含んでいる。また、ＳｐｓＢタンパク質の最後の疎水性セグメントの位置は、これらの関連遺伝子産物に共通していて、相同性が最大である領域に続いているタンパク質の中央部分に所在している。
【０１３３】
ＤＮＡ配列から推定されるドメインをコードするｓｐｓＢを、相補性検定により確認した。Ｅ４．５セグメント中のｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入を変化させることより、Ｂａｃr Ｓｐｓ- 変異株の相補に干渉するかどうかを観察した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入部位と、相補の結果としての「＋」又は「−」を図９のｓｐｓＢ遺伝子の上部に示す。三つの部位のｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入では、Ｓｐｓ- 変異株Ｓ８８ｍ２６０（Ｂ２３３、Ｂ２３９及びＢ２３８）にスフィンガン合成を回復することができなかった。その反面、Ｂ２３１とＢ２３０を含む数個の隣接する部位に挿入したところ失われていた機能を回復することができた。
【０１３４】
実施例１８
スフィンゴモナスＳ８８のラムノース生合成オペロン
ｒｈｓＡＣＢＤ遺伝子によってコードされているタンパク質の推定アミノ酸配列は、ｄＴＴＰ及びグルコース−１−リン酸から４工程でｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースを合成する、Ｓ．エンテリカのグループＢの酵素及びＸ．カンペストリスの酵素とよく似ている（図１２から図１５）。本発明者らは、グルコース−１−リン酸、ｒｈｓＡ遺伝子によってコードされているチミジリルトランスフェラーゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びｒｈｓＢ、Ｃ及びＤ遺伝子によってコードされている連続した触媒工程には、従来からの命名法を用いた。しかしながら、スフィンゴモナス属のオペロンは次の４点で独特である。第一に、遺伝子の順序ＡＣＢＤ→が、Ｓ．エンテリカ（ＢＤＡＣ→）や、Ｘ．カンペストリス（ＢＡＣＤ→）のいずれとも異なる。第二に、シストロン間領域がほとんど存在していない。開始コドンと終止コドンとが重なり合っているか、間隔が狭く、ｒｈｓＡ−ＡＴＧＡ−ｒｈｓＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＴＧ−ｒｈｓＢ−ＴＧＡＴＧ−ｒｈｓＤとなっている。第三に、ｒｈｓＡＣＢＤの平均Ｇ＋Ｃ含量が比較的高く（６６％）、三番目のコドンの位置では特に高く（８９％）、しかもオペロンを通じて一様である。第四に、このクラスター中の周囲の遺伝子でも、またスフィンゴモナス属において関係がない他の種の遺伝子でも同様にＧ＋Ｃ含量が高い。
【０１３５】
当初ｒｈｓクラスターからは変異株（＃１３４）一個のみが単離されたが、同時にｓｐｓＢ遺伝子でも第二の突然変異が生じたように見えた。Ｒｈｓ- 突然変異は、致死性である可能性があると思われた。したがって、ｒｈｓクラスター内で単一の突然変異を特異的に操作することによって、スフィンガン合成が阻止されるかどうかを試験した。まず、ｒｈｓ遺伝子の端から端までｓｐｓＤ遺伝子にわたって大きく染色体を欠失させたＳ８８変異株を構築し（図１０の△Ｔｎ３６５）、失われたＤＮＡを持ち、特定部位にｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入したプラスミドを導入した。プラスミドの挿入位置がｓｐｓＤ、Ｃ、Ｅ、Ｂ又はｒｈｓオペロンにある場合には、細胞はＳｐｓ- のままであった。しかしながら、Ｕｒｆ３２、２６、３１、３４、ａｔｒＤ又はａｔｒＢのいずれかに挿入した場合は、欠失突然変異の相補に干渉せず、その細胞はＳｐｓ+ となった。
【０１３６】
実施例１９
スフィンゴモナスＳ８８のグリコシルトランスフェラーゼ
ｓｐｓＱ、ｓｐｓＫ及びｓｐｓＬの３遺伝子がグリコシルトランスフェラーゼをコードしているように見受けられる。しかしながら、タンパク質がこれ以外のグルコシルトランスフェラーゼ及びラムノシルトランスフェラーゼ類に対して限られた局所的な相同性しか示さなかったため、グリコシルトランスフェラーゼ類の糖特異性は、配列解析のみで決定することはできなかった。他の研究者らも着目しているように、グリコシルトランスフェラーゼは、同一の結合における同一の糖に付着する、単一の細菌由来の酵素でも全く互いに異なる（Ｇｌｕｃｋｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０４５−７０５５）。推定ｓｐｓＱ遺伝子産物は、ラムノシルトランスフェラーゼをコードすると信じられている大腸菌Ｋ−１２のｇｎｄに隣接するｏｒｆ１１（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．, １７４：４１４４−４１５６）に類似し、さらに、Ｒ．メリロチのＥｘｏＯ及びＥｘｏＵグルコシルトランスフェラーゼ（Ｒｅｕｂｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９３，Ｃｅｌｌ，７４：２６９−２８０）とも類似していた。ｓｐｓＱ遺伝子はスフィンガンＳ−８８合成に必須である。Ｓ８８ｃ２セグメントを有するプラスミド内のｓｐｓＱ遺伝子に（図９のＺ２０６）、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入して、突然変異を起こしたプラスミドをｓｐｓＧＳＲＱＩ遺伝子の染色体を欠失しているＳ８８細胞に導入した。受容細胞は生存可能であったが、多糖の合成は阻止された。推定ｓｐｓＬ遺伝子産物は、ドッドマトリックス分析による比較では、ｓｐｓＱ産物と類似し、さらにＳ．エンテリカのラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｔｂＮ）及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの推定アベクオシルトランスフェラーゼ（ａｂｅｑｕｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ともいくらか局所的に類似していた（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４０８４−４０８８）。ｓｐｓＫ類似タンパク質の検索を行ったが、圧倒的多数が共通して推定ＵＤＰ結合部位を含有するグリコシルトランスフェラーゼであるという僅かな類似性を認めたに過ぎなかった。これには、ＵＤＰが関与している可能性があるので、グルコシル又はグルクロノシルトランスフェラーゼであることが示唆されている。トランスポゾン挿入によらない変異株５４と３０２同様、ｓｐｓＫ遺伝子に特異的な挿入を行った変異株（図９のｐＹ８８２）は、生存可能ではあったが、多糖を作ることはできなかった。
【０１３７】
実施例２０
細菌による多糖の分泌
必須遺伝子産物の配列が類似していることから、各種細菌によって多糖類を分泌させる共通の機構が考えらる。この配列の比較（表６）では、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ、ｓｐｓＪ、及びｓｐｓＳの五つものｓｐｓ遺伝子がスフィンガン類の分泌に関与しうることを示していた。Ｒ．メリロチの「エクソ」タンパク質など、かなりの情報が蓄積しているタンパク質の配列関係を要約して表６に示す。しかしながら、機能的に関係のあるタンパク質類は、この表が示しているものよりも大きい集団である。５１、２９及び２２個のアミノ酸からなるＳｐｓＤタンパク質の各々異なる三つセグメントは、それぞれＥｘｏＦと２９％、３１％及び３６％の同一性があった。開始と終止コドンが重なり合い（ＴＧＡＴＧ）、しかも互いに連続するｓｐｓＣとｓｐｓＥ遺伝子は、ＥｘｏＰ内の二つの異なるドメインに似たタンパク質をコードしている。類似するＳｐｓＣ−ＥｘｏＰ配列には、最近、細菌性Ｏ−抗原の鎖長測定で示されたモチーフ（ＰＸ2 ＰＸ4 ＳＰＫＸIIＧＸＭＸＧ）が含まれていた（Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：ｌ９１−２０３）。９２、３０及び１９個のアミノ酸からなるＳｐｓＣの三つのセグメントは、ＥｘｏＰのＮ末端半分から取った同様な順序の配列に、それぞれ２２％、３０％及び４２％同一であり、７５及び９８個のアミノ酸からなるＳｐｓＥの二つのセグメントは、ＥｘｏＰのＣ末端半分に３２％及び２９％同一であった。３７、２０及び４４個のアミノ酸からなるＳｐｓＳの三つのセグメントは、ＥｘｏＴにそれぞれ３８％、５５％及び２３％同一であった。推定ＳｐｓＪタンパク質は、ＫｐｓＴ、ＢｅｘＡ及びＡＢＣ担体と推定ヌクレオチド結合ドメインを共有していて、お互いにある程度の類似性を持っていた。ｓｐｓＲ遺伝子は、スフィンガン合成に必要ではないが、その遺伝子産物は、細菌性及び真菌性多糖リアーゼに僅かに類似していた。したがって、ｓｐｓＲ遺伝子は、細胞あるいは基質の表面のいずれかからグルクロン酸含有スフィンガン類を放出したり、あるいはポリマーを炭素源として再使用することに重要であるかもしれない。
【０１３８】
図９及び図１０に示すように、自然点突然変異や、ｓｐｓＤ、ｓｐｓＣ、ｓｐｓＥ及びｓｐｓＳ遺伝子へのｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎの挿入では、生存可能であるが、培養上清中にスフィンガンＳ−８８を蓄積しなかった。一方、Ｒ．メリロチの類似遺伝子の突然変異（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：４４７−４５７）、及びＸ．カンペストリスの類似遺伝子の突然変異は、致死性であった。ｓｐｓＪの染色体にｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入すると、Ｓｐｓ- となる。しかしながら、染色体が大きく欠失している変異菌株中のマルチコピープラスミドに保持されたｓｐｓＪに、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０ｋａｎを挿入すると、Ｓｐｓ+ か、Ｓｐｓ- のいづれかになった。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
各タンパク質の分泌の役割に対しての参考文献
ＥｘｏＦ，ＥｘｏＰ，ＥｘｏＴ（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：１９１、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ａｎｄＷｅｉｓｂｌｕｍ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５、及び、Ｒｅｕｂｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９３，Ｃｅｌｌ，７４：２６９）
ＧｕｍＢ，ＧｕｍＣ，ＧｕｍＪ（Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０３３、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：１９１、及び、Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：７０４５）
ＫｐｓＤ ａｎｄ ＫｐｓＴ（Ｗｕｎｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４０２５、及び、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：１８６３）
ＢｅｘＤ，ＢｅｘＣ，ａｎｄ ＢｅｘＡ（Ｋｒｏｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：１８５３）
【０１４１】
実施例２１
溶菌性又は毒性タンパク質のＡＢＣ輸送体
二つの連続した遺伝子であるａｔｒＢとａｔｒＤが、ｓｐｓクラスター内に位置していた。この２つの遺伝子は、溶菌性又は毒素様タンパク質のＡＢＣ輸送体や、輸送用補助タンパク質をコードしていると考えられる、これまでに、溶血素遺伝子（ｈｌｙＡ）が、現在ではスフィンゴモナス属として再分類されているシュードモナス ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）に同定された。本発明者らの菌株では、ヒツジ赤血球を含有する寒天プレート上で決定的な溶血現象を検出できなかったので、今回は「ｈｌｙ」なる略称を使用しなかった。ａｔｒＢ遺伝子のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸の約４８％は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のシクロリシン（ｃｙｃｌｏｌｙｓｉｎ）ＡＢＣ担体のアミノ酸と同一であった。ａｔｒＢ遺伝子産物は、それぞれ溶血素と白血球毒素を輸送する大腸菌のＨｌｙＢタンパク質及びパスツレラ ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）のＬｋｔＢタンパク質と非常によく類似していた。また、ａｔｒＢのＣ末端半分は、Ｒ．メリロチのＮｄｖＡタンパク質のＣ末端半分や、ヒト多剤耐性タンパク質Ｍｄｒ１内の二つの繰り返しＡＴＰ結合ドメインを含む、上記以外の多くのＡＢＣ輸送体に類似していた。ａｔｒＤ遺伝子産物の配列は、大腸菌のＨｌｙＤタンパク質及びＰ．ヘモリチカのＬｋｔＤタンパク質の配列と類似していた。他の属由来の関連輸送遺伝子とは違って、スフィンゴモナスａｔｒＢ及びａｔｒＤ遺伝子と隣接したり、あるいはｓｐｓクラスター内に存在する溶菌性又は毒性の類似遺伝子はなかった。
【０１４２】
結論
一つの属の細菌の多糖陰性変異株を第二の属のＤＮＡで相互に遺伝的に相補することは、最初にキサントモナス属とリゾビウム属との間で立証された（Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１３：１５５）。この初期の研究では、寒天プレート上で粘液性が回復したことが観察された。後年になって、Ｘ．カンペストリスのｇｕｍＤ遺伝子とスフィンゴモナス菌株Ｓ８８のｓｐｓＢ遺伝子との間でお互に属間で相補がおこったことが報告され（Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６２２９）、本発明者らも組成分析によって、供与菌の相補遺伝子により、受容菌がエクソポリサッカライドの合成を回復したことを立証した。
【０１４３】
本願の実験では、ｓｐｓＢ遺伝子がグルコシルＩＰ−トランスフェラーゼをコードすることは、スフィンガン類生合成の重要な工程であることを証明している。したがって、本発明により受容菌に組み入れるＤＮＡフラグメントは、グルコシルＩＰ−トランスフェラーゼ酵素（グルコシル−トランスフェラーゼ、ガラクトシル−トランスフェラーゼ、又は関連ＩＰ−トランスフェラーゼのどれでもよい）をコードしている遺伝子を含有することが好ましい。例えば、スフィンガンＳ−８８を組み立てる最初の工程は、グルコース−Ｐを担体ＩＰに転移することである可能性が最も高いと信じられている。したがって、この生合成反応を促進する酵素をコードする遺伝子を、本発明によりＤＮＡフラグメントに含有させることが有利である。
【０１４４】
本発明者らの研究により、スフィンゴモナスＳ８８の大きなｓｐｓ遺伝子クラスターには、ｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの生合成をコードするより小さなオペロン（ｒｈｓＡＣＢＤ）のあることが証明された。ｒｈｓオペロンと他のラムノースオペロンの配列が類似していることは、スフィンゴモナス属がＬ−ラムノースの合成に同じ４つの酵素工程を有することを示唆すると共に、ｒｈｓオペロンがＤＮＡフラグメント中において不可欠であることを立証している。
【０１４５】
侵襲してくる多くの病原菌がカプセルで保護されているように、各種のスフィンガンエクソポリサッカライド類も防御的性格として解釈することができる。また、エクソポリサッカライド類は、細胞を基質に付着させる役割を果たしているとも考えられる。スフィンゴモナス属のスフィンガン生産能を持つ他の菌株も、本願明細書で詳述したＳ８８クラスターと同様に組織だった遺伝子クラスターがあるので、本願明細書の実施例で説明した結果から、通常の技術を持つ当業者が、すべてのスフィンゴモナス属細菌から実用に使用できるＤＮＡフラグメントを得ることができる。
【０１４６】
スフィンガン生産能力を有する供与菌のスフィンゴモナス属細菌からスフィンガンの生合成に有用又は不可欠な遺伝情報をコードするＤＮＡを単離して、受容菌の細菌に挿入することによって、スフィンガン生産能力がない細菌、又は通常の生産能力しか持たない細菌（受容菌）を、容易にスフィンガンガムの大量生産菌に作ることができることを本願明細書の開示により示した。大量生産菌は容易に得ることができるし、またその方法もスフィンガン生産能力を持っていさえすれば、スフィンゴモナス属のどの菌株にも一般適用することができる。
【０１４７】
本発明の実施態様の一部において、グリコシル−ＩＰトランスフェラーゼをコードする（スフィンガン炭水化物を組み立てる第一工程）Ｓ８８のｓｐｓＢなどの遺伝子その他のＤＮＡフラグメントを含有する供与菌から得たＤＮＡフラグメントを、本発明で有利に使用している。本発明の他の実施態様、特にラムノースが多糖の形成に重要な糖シントン又は構築材料（例えば、スフィンガンの場合は、Ｓ−８８、ジェランの場合は、Ｓ−６０、及びウェランの場合は、Ｓ−１３０）である実施態様において、本発明の大量生産菌によるある種のスフィンガン多糖類の生産を最大に増産するために、ラムノースオペロン又は遺伝子（Ｓ−８８のｒｈｓＡＢＣＤ遺伝子など）を含めて使用することが好ましい。さらに、グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその他のＤＮＡフラグメント、例えばスフィンゴモナス菌株Ｓ８８のｓｐｓＱ、ｓｐｓＫ及びｓｐｓＬ、あるいは形成される最終的な多糖を分泌のためにコードする遺伝子又はその他のＤＮＡフラグメント（例えば、スフィンゴモナス属菌株Ｓ８８のｓｐｓＤ、Ｃ、Ｅ、Ｊ及びＳ）を含めて有利に使用し、これらの酵素を最終的な多糖の生産に貢献させることができる。さらにまた、上記の酵素又は機能のすべてをコードするその他のＤＮＡフラグメント又は遺伝子も、所望の多糖次第では有利に使用することができる。
【０１４８】
通常の技術を持つ当業者が、本明細書の開示に従って容易にＤＮＡフラグメントを得ることができ、これらのフラグメントを受容菌に組み入れて、スフィンガン大量生産菌を作ることが可能であることに注目すべきである。これらの大量生産菌は公知の簡単な遺伝操作方法を使って容易に作ることができる。
【０１４９】
〔微生物の寄託〕
下記に記す上から６番目までの微生物は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従い、メリーランド州２０８５２ ロックビル、パークラウンドライブ １２３０１に所在する、アメリカン タイプ カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に国際寄託されている。寄託物の利用可能性に対する制限は、寄託物についての特許の付与と同時に、取り消し不能条件を付してすべて撤廃される。下から３番目以降の微生物は、メリーランド州のロックビルのアメリカン タイプ カルチャー コレクションから公的に入手することができる。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
上記で説明した実施例及び実施態様は、例示によって本発明を説明することを目的とするものであって、如何なる方法によってもこれをもって本発明を制限するものと見なしてはならない。通常の技術を有する当業者によって、本発明で説明する事項及び対象に各種の修正また変更を行うことは可能であるが、これらはすべて本発明で予め考慮されていて、本発明の技術的範囲内に含まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンガンを生産するスフィンゴモナス属菌のＤＮＡから単離されたＤＮＡ配列であって、受容菌となるスフィンゴモナス属菌に該ＤＮＡ配列の多数コピーを組み入れたとき、該受容菌に関連するスフィンガン多糖類の大量生産菌を産生する、上記受容菌となるスフィンゴモナス属菌がスフィンガンを生合成する際に有益又は不可欠な遺伝情報をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス属の細菌株から単離された請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス属の細菌株から単離された請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
該セグメントの一部分である請求項５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、Ｓ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項７に記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
該配列のフラグメントである請求項８に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１１】
ＮＷｃ２．１及びＮＷｃ２．２からなる群から選ばれたセグメント制限酵素地図を持つ請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
該セグメントのフラグメントである請求項１１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１３】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【化１】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項１４】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項１４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１６】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１７】
供与菌となるスフィンガンを生成するスフィンゴモナス属菌のＤＮＡからＤＮＡ配列を単離すること、該配列は、供与菌となるスフィンガン生産菌がスフィンガンを生合成する際に有益又は不可欠な遺伝情報をコードすること、受容菌に該配列を挿入すること、該受容菌は、該配列の多数のコピーを組み入れること、該供与菌に関連するスフィンガン多糖類の生産量が同一の発酵条件下で高まっていることを含むスフィンゴモナス属菌の菌株から派生した細菌を操作して、スフィンガン多糖類の大量生産菌とする方法。
【請求項１８】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、ＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項１７に記載の方法。
【化２】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項３２】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
スフィンゴモナス属菌の菌株から派生する細菌であって、該細菌がスフィンガン多糖類の生合成に有益又は不可欠の遺伝情報をコードしているＤＮＡ配列の多数のコピーを含有し、該ＤＮＡ配列がスフィンガン生産菌であってその供与菌となるスフィンゴモナス属菌の染色体ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡから単離され、受容菌に挿入されることにより該受容菌がスフィンガン多糖類の大量生産菌となる細菌。
【請求項３６】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から派生する請求項３５に記載の細菌。
【請求項３７】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から派生する請求項３５に記載の細菌。
【請求項３８】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項３５に記載の細菌。
【請求項３９】
該菌株が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれる請求項３５に記載の細菌。
【請求項４０】
該菌株が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４１】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４２】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項３５に記載の細菌。
【請求項４３】
該菌株が、ＡＴＣＣ３１４６１である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４４】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４５】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項３５に記載の細菌。
【請求項４６】
該菌株が、ＡＴＣＣ５３２７２である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４７】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４８】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４９】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項３５に記載の細菌。
【化３】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項５０】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項３５に記載の細菌。
【請求項５１】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項５０に記載の細菌。
【請求項５２】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項３５に記載の細菌。
【請求項５３】
スフィンゴモナス属菌によってスフィンガンを増産する方法において、
１） スフィンガン生産菌であって供与菌となるスフィンゴモナス菌株から供与菌となるスフィンゴモナス属菌に、該スフィンガン生合成に有益又は不可欠の遺伝情報をコードしているＤＮＡ配列の多数のコピーを組み込み、
２） 工程１で単離した該ＤＮＡ配列の多数のコピーを受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れること、
３） 工程２から得られた細菌を発酵ブロス中で培養してスフィンガンを生産すること、
及び
４） 工程３からスフィンガンを単離すること
を含む方法。
【請求項５４】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＳ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、又はＳ６０ｃ３の制限酵素地図を持つ請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項５３に記載の方法。
【化４】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項６８】
該ＤＮＡ配列はグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
該組み込みの工程１の前に、該ＤＮＡ配列を単離する工程を、該方法がさらに含む請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
ＡＴＣＣ６９７３５、ＡＴＣＣ６９７４４、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、及びＡＴＣＣ３１９６１からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌の微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項７３】
大腸菌であるＡＴＣＣ６９７３２、ＡＴＣＣ６９７３３、又はＡＴＣＣ６９７３４の生物学的に純粋な培養物。
【請求項７４】
配列番号３に示す配列と実質的に一致するＤＮＡ配列。
【請求項１】
スフィンガンを生産するスフィンゴモナス属菌のＤＮＡから単離されたＤＮＡ配列であって、受容菌となるスフィンゴモナス属菌に該ＤＮＡ配列の多数コピーを組み入れたとき、該受容菌に関連するスフィンガン多糖類の大量生産菌を産生する、上記受容菌となるスフィンゴモナス属菌がスフィンガンを生合成する際に有益又は不可欠な遺伝情報をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス属の細菌株から単離された請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス属の細菌株から単離された請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
該セグメントの一部分である請求項５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、Ｓ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項７に記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
該配列のフラグメントである請求項８に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１１】
ＮＷｃ２．１及びＮＷｃ２．２からなる群から選ばれたセグメント制限酵素地図を持つ請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
該セグメントのフラグメントである請求項１１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１３】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【化１】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項１４】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項１４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１６】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１７】
供与菌となるスフィンガンを生成するスフィンゴモナス属菌のＤＮＡからＤＮＡ配列を単離すること、該配列は、供与菌となるスフィンガン生産菌がスフィンガンを生合成する際に有益又は不可欠な遺伝情報をコードすること、受容菌に該配列を挿入すること、該受容菌は、該配列の多数のコピーを組み入れること、該供与菌に関連するスフィンガン多糖類の生産量が同一の発酵条件下で高まっていることを含むスフィンゴモナス属菌の菌株から派生した細菌を操作して、スフィンガン多糖類の大量生産菌とする方法。
【請求項１８】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、ＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項１７に記載の方法。
【化２】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項３２】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
スフィンゴモナス属菌の菌株から派生する細菌であって、該細菌がスフィンガン多糖類の生合成に有益又は不可欠の遺伝情報をコードしているＤＮＡ配列の多数のコピーを含有し、該ＤＮＡ配列がスフィンガン生産菌であってその供与菌となるスフィンゴモナス属菌の染色体ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡから単離され、受容菌に挿入されることにより該受容菌がスフィンガン多糖類の大量生産菌となる細菌。
【請求項３６】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から派生する請求項３５に記載の細菌。
【請求項３７】
ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から派生する請求項３５に記載の細菌。
【請求項３８】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項３５に記載の細菌。
【請求項３９】
該菌株が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれる請求項３５に記載の細菌。
【請求項４０】
該菌株が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４１】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４２】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項３５に記載の細菌。
【請求項４３】
該菌株が、ＡＴＣＣ３１４６１である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４４】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４５】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項３５に記載の細菌。
【請求項４６】
該菌株が、ＡＴＣＣ５３２７２である請求項３５に記載の細菌。
【請求項４７】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４８】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、及びＳ６０ｃ３からなる群から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項３５に記載の細菌。
【請求項４９】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項３５に記載の細菌。
【化３】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項５０】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有する請求項３５に記載の細菌。
【請求項５１】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項５０に記載の細菌。
【請求項５２】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項３５に記載の細菌。
【請求項５３】
スフィンゴモナス属菌によってスフィンガンを増産する方法において、
１） スフィンガン生産菌であって供与菌となるスフィンゴモナス菌株から供与菌となるスフィンゴモナス属菌に、該スフィンガン生合成に有益又は不可欠の遺伝情報をコードしているＤＮＡ配列の多数のコピーを組み込み、
２） 工程１で単離した該ＤＮＡ配列の多数のコピーを受容菌となるスフィンゴモナス菌に組み入れること、
３） 工程２から得られた細菌を発酵ブロス中で培養してスフィンガンを生産すること、
及び
４） 工程３からスフィンガンを単離すること
を含む方法。
【請求項５４】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該ＤＮＡ配列を挿入する該細菌が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、ＡＴＣＣ３１５５５、ＡＴＣＣ３１９６１、ＡＴＣＣ５３１５９、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
該ＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣ３１５５４、ＡＴＣＣ３１４６１、及びＡＴＣＣ５３２７２からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌株から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１５５４から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
該ＤＮＡ配列が、Ｓ８８ｃｌ△３、Ｓ８８ｃ２、及びＳ８８ｃ３から選ばれたセグメントの制限酵素地図を持つ請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ３１４６１から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＳ６０ｃ１、Ｓ６０ｃ２、又はＳ６０ｃ３の制限酵素地図を持つ請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該ＤＮＡ配列が、スフィンゴモナス菌株ＡＴＣＣ５３２７２から単離された請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
該ＤＮＡ配列が、セグメントＮＷｃ２．１又はＮＷｃ２．２の制限酵素地図を持つ請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
該ＤＮＡ配列が、該セグメントのフラグメントである請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該スフィンガンが次の一般式で表される請求項５３に記載の方法。
【化４】
式中Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、Ｘはラムノース又はマンノースである。ＺはＧｌｃ残基２に付着し、かつ、Ｚはα−Ｌ−Ｒｈａ−（１−−６）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。ＷはＧｌｃ残基１に付着し、かつ、Ｗはβ−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、又はα−Ｌ−Ｒｈａである。下付き文字ｖ及びｙは０、０. ３３、０. ５、０. ６７、又は、１である。ポリマーの還元末端は、主鎖のＸ残基の側であり、ｖとｙが０のときにはＷ及びＺは主鎖の上に存在しない。
【請求項６８】
該ＤＮＡ配列はグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
該グリコシルトランスフェラーゼ酵素がグリコシルＩＰ−トランスフェラーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ラムノースオペロン又はラムノース遺伝子を含有する請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
該組み込みの工程１の前に、該ＤＮＡ配列を単離する工程を、該方法がさらに含む請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
ＡＴＣＣ６９７３５、ＡＴＣＣ６９７４４、ＡＴＣＣ３１８５３、ＡＴＣＣ２１４２３、及びＡＴＣＣ３１９６１からなる群から選ばれたスフィンゴモナス菌の微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項７３】
大腸菌であるＡＴＣＣ６９７３２、ＡＴＣＣ６９７３３、又はＡＴＣＣ６９７３４の生物学的に純粋な培養物。
【請求項７４】
配列番号３に示す配列と実質的に一致するＤＮＡ配列。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１５５９８３（Ｐ２０１１−１５５９８３Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６２４０８（Ｐ２０１１−６２４０８）
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【分割の表示】特願平８−４３９７７の分割
【原出願日】平成８年１月２４日（１９９６．１．２４）
【出願人】（５０６１２８３５２）シーピー・ケルコ・ユーエス・インコーポレーテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【分割の表示】特願平８−４３９７７の分割
【原出願日】平成８年１月２４日（１９９６．１．２４）
【出願人】（５０６１２８３５２）シーピー・ケルコ・ユーエス・インコーポレーテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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