ＤＮＡマイクロアレイの保存方法及びバイオアッセイ用キット
【課題】核酸プローブとして搭載するポリヌクレオチドが、温度や光等の影響により経時的に劣化せず、長期間保存可能なDNAマイクロアレイの保存方法を提供する。
【解決手段】 ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させ保存することにより、ＤＮＡマイクロアレイの品質を長期間、安定に保持することができる。このような保存方法は、特に、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているＤＮＡマイクロアレイに好適に使用される。
【解決手段】 ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させ保存することにより、ＤＮＡマイクロアレイの品質を長期間、安定に保持することができる。このような保存方法は、特に、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているＤＮＡマイクロアレイに好適に使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出に使用するバイオアッセイ用基盤を含むキット及びバイオアッセイ用基盤の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析のツールとして、近年様々なデバイスが開発されている。その代表的なデバイスの一つに、ＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片を基盤上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とハイブリダイゼーション反応を基盤上で行うことにより、遺伝子の発現解析や多型解析等を行う有用なデバイスである。それは、遺伝子研究用途等の学術研究を中心に既に実用化されている。ＤＮＡマイクロアレイとしては、フォトリソグラフィー技術を利用して直接ＤＮＡを基盤上に合成することにより得られるマイクロアレイ（特許文献１、特許文献２）、スライドグラス上にＤＮＡをピン等でスポッティングすることにより得られるマイクロアレイ（非特許文献１）等が知られている。また、電気化学的にＤＮＡを基盤に固定化することにより得られるマイクロアレイ（特許文献３、特許文献４）、中空繊維を３次元に配列固定して製造することにより得られる貫通孔型のＤＮＡマイクロアレイ（特許文献５）等も知られている。
【０００３】
これらのＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子に関連するＤＮＡ情報を微小な基盤上へ高集積化することが可能である。従来の解析方法であるノーザンブロッドあるいはドットブロッドハイブリダイゼーション等に比べ、遺伝子発現等の情報を1度の解析から大量に得ることが出来る。よって、医療、農業、水産、食品、環境等様々な分野で、核酸検出用ツールとして、応用が研究、検討されている。特に医療分野では、疾病に関する個人差、疾病の予兆を遺伝子レベルで迅速に見つける診断、疾病の進行具合、手術後予後の診断などの応用に期待が高まっている。
【０００４】
診断、検査用途に用いられるデバイスは、結果が出るまでの時間（迅速性）や操作の簡便性、並びに品質保持が重要視される。特に診断・検査分野で使用する場合、定常的に大量の試料を処理する必要のあるため、常に一定量のデバイスを保管、確保されている必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、現在のＤＮＡマイクロアレイは、核酸プローブとして搭載するポリヌクレオチドが、温度や光等の影響により経時的に劣化する。またグラスアレイタイプのＤＮＡマイクロアレイでは、ガラス基盤表面にプローブ固定化のためのコーティングがされているが、湿度等の影響から長期間保管しておくと、コーティング面に剥離が生じる。従って、長期間、保存する際は、温度、湿度、遮光が適切な保存環境を選ぶ必要がある。このようなことから、ＤＮＡマイクロアレイの品質を保存期間中維持させるために、保存温度を室温以下に保ち、遮光性のある包装材や保存ケースに保存し、更にはデシケーター内に保存して湿気を遮断する等の対処がなされているのが現状である。しかも、このような保存条件でも、ＤＮＡマイクロアレイの品質保持期間は1ヶ月〜２ヶ月程度である。
【０００６】
現状での品質保持期間は、ＤＮＡマイクロアレイにより大量の試料を処理する診断や検査用デバイスとして実用化するためには、十分とはいい難く、核酸プローブが安定に維持出来るための保存方法の確立が実用上の重要な課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ（以下、マイクロアレイと称する場合もある）の品質を長期間保持できる方法を検討した結果、マイクロアレイに固定化されている核酸プローブに安定化因子を接触させることにより、核酸プローブの安定性が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法、である。
【０００９】
また、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット、である。
【特許文献１】米国特許第5445934号明細書
【特許文献２】米国特許第5774305号明細書
【特許文献３】米国特許第5605662号明細書
【特許文献４】米国特許第6023302号明細書
【特許文献５】特許第3510882号公報
【非特許文献１】Science 270, 467-470(1995)
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、マイクロアレイを長期間、保存した場合でも、シグナル低下のない、安定したシグナル感度を保つプローブが配置されたマイクロアレイを提供することができる。また、本発明によりマイクロアレイの品質管理が容易となり、疾病の予知、診断の他菌の同定やＳＮＰｓなどの遺伝子解析用途に、一度に大量の利用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、実施形態の詳細について説明する。
【００１２】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法、である。
【００１３】
ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片（核酸プローブ）を基盤上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とハイブリダイゼーション反応を基盤上で行うことにより、遺伝子解析又は診断等のアッセイに利用されるデバイスである。ここでＤＮＡマイクロアレイとしては、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているＤＮＡマイクロアレイが好ましい。このマイクロアレイの製造方法の一例としては、以下の１）〜４）の工程を含む製造方法が挙げられる。
【００１４】
１）複数の管状体を、それらの管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し配列体を製造する工程。
【００１５】
２）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
【００１６】
３）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各管状体に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を管状体内に保持する工程。
【００１７】
４）管状体の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００１８】
核酸プローブとは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）である。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸のアナログも含まれる。これらは合成されたものでも、生物体から調製されたものでも良い。
【００１９】
電解質溶液とは、水中でイオン解離する電解質成分を含む溶液をいう。例えば、電気泳動用緩衝液として用いられるＴＢＥ緩衝液、種々化学分析用に用いられるｐＨ緩衝液、バイオアッセイ実験等のハイブリダイゼーション用バッファー液などが挙げられる。好ましくは、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、NaH2PO4、HCl、NaOH、EDTAのうち、少なくも１種の成分を含む電解質溶液を使用する。より好ましくは、クエン酸ナトリウム塩及び塩化ナトリウムを含む電解質溶液を使用する。電解質溶液のｐＨは、中性領域（ｐＨ６〜８前後）が好ましく、ｐＨ７前後がより好ましい。また、保存期間中にｐＨ変動が起こらないように、中性領域の緩衝液成分を使用するも可能である。
【００２０】
以上の条件を満たす電解質溶液は、SSC溶液、SSPE溶液である。さらには、以下の組成を含む電解質溶液である。
【００２１】
１）クエン酸三ナトリウム水和物 100mmol/L
２）塩化ナトリウム 100mmol/L
ＤＮＡマイクロアレイは、その核酸プローブが上述の電解質溶液に接触させた状態で保存される。上述の通り、核酸プローブは経時的に劣化が進行するため、接触させておく期間は、ＤＮＡマイクロアレイを製造してから、それをアッセイに供するまでが好ましい。また、接触は、ＤＮＡマイクロアレイに固定されている核酸プローブが電解質溶液と十分に接触していればよい。よって電解質溶液は、核酸プローブが固定された領域又はマイクロアレイ全体に満たされている状態が好ましい。
【００２２】
電解質溶液と核酸プローブとの接触を確実に行うためには、容器内にそれらを封入し、接触状態を保つことが好ましい。即ち、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット、である。
【００２３】
ここで、容器の形態としては、核酸プローブと電解質溶液が接触するように、電解質溶液と核酸プローブが容器内に封入できるものであれば特に制限はない。例えば、図１に示す、密封できる袋状の容器である。袋状の容器は、ナイロン、ポリエチレンなどの熱融着樹脂製の袋が好ましい。水蒸気の蒸発等を防ぐ点で、水蒸気透過性の低い材料、すなわちナイロンがより好ましい。また、水蒸気透過性の高い材料であっても、例えばフッ化ビニリデン等の水蒸気透過を防ぐ皮膜で被覆することにより利用することができる。封入方法としては、熱融着により熱シールする方法が挙げられる。
【００２４】
また容器の形態としては、石英、ガラス等の無機材料、プラスチック等の樹脂材料からなる箱状物が挙げられる。この場合、封入方法としては、蓋等による密封による方法が挙げられる。なお、箱状物は、上述の袋状容器と同様、その壁面等に水蒸気透過を防止する被覆等の処置を施してもよい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例で実施形態の詳細について説明する。なお、ＤＮＡマイクロアレイの長期保存による品質安定性評価は、高温環境下に一定期間、その対象物を置き、その経時的機能低下を調べることにより実施した。
【００２６】
＜実施例１＞
（１）ＤＮＡマイクロアレイの調製
＜核酸プローブの調製＞
核酸プローブとしては、以下に記載した配列情報（配列番号１〜２９）をもつ5‘末端ビニル化核酸（６５mer）を用いた。これら核酸は、以下の方法により合成した。
【００２７】
まず、配列番号１〜２９のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
【００２８】
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
【００２９】
配列番号１（YAL005C）
gaaggagttgcaagacattgccaacccaatcatgtctaagttgtaccaagctggtggtgctccag
配列番号２（YDR012W）
tgctatcagaccagctggccaagctactcaaaagcgtactcacgttttgaagaagaacccattga
配列番号３（YDR418W）
ggtagaactttggcttccgttactaaggaaattttgggtactgctcaatctgtcggttgtcgtgt
配列番号４（YKL217W）
gcttccacgattgagacacagttagctgatagatacccattagaaagagatgcctctggtgctgt
配列番号５（YKR097W）
tggttcttcctacgtatctggtggtaaacgttgcccattgaagtacacaagggccattctggatt
配列番号６（YLR249W）
gtctacgtcgaacacgacattgatggtactcactctgacacttccgtcttggatttcgttttcga
配列番号７（YLR377C）
cggtcaacgatcgcggagagagaatcttggatttggtgccaagtcatatccatgacaaatcttct
配列番号８（YML028W）
ttgggcccaatcaacattccattgttggctgacaccaaccactctttgtccagagactatggtgt
配列番号９（YNL209W）
acttcaaggctgaattcaagaagaagactggtttggacatctccgacgatgccagagctttgaga
配列番号１０（YOL039W）
gtcggtatcgaaatcgaagacgaaaaggtttcctccgttttgtccgctttggaaggtaagtctgt
配列番号１１（M12481）
tccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccag
配列番号１２（M29618）agcgtcctggctccagttggaacactttcctgagatgcacttacttctcagcttctgcgatcaga
配列番号１３（NM008084） gacatttccctgcaggattacattgcagtgaaggagaagtatgccaagtacctccctcacagtgc
配列番号１４（NM009093） gcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccctttcttgacaaaacctaacttgcgcaga
配列番号１５（NM010863）
aagcccgcctccaccaactcagatgacgtccgtgatgagaaggtcaaggtgttgaaatgcatctc
配列番号１６（NM011296） gctacacatatagcccgtaaagctgtggaattggacttggttcctgggaggagccccatctctgt
配列番号１７（NM011341） gacctttcatacagggcagccacaccttgtccctgtaccacctcttcctgaatacggaggaaaag
配列番号１８（NM013556）
tcgtgtgtccgtggaaccagtcctagccgcgtgtgacagtcttgcattctgtttgtctcgtgggg
配列番号１９（NM013614）
tgtttgtggacctggagcccactgtggtcgatgaagtgcgcacaggaacctataggcagctcttc
配列番号２０（NM015799）ctatgccaacacagtgttgtctggtggtaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatgcaga
配列番号２１（M33197） agtttgctgacaccatcaagcagctgcagcagaatacatacactcctcgtgaggctggatctcaa
配列番号２２（U03090） cgtggatctgacgtgccgcctggagaaacctgccaagtatgatgacatcaagaaggtggtgaagc
配列番号２３（U14970） gccagtgcttccggcagtacgcgaaggacataggcttcattaagttggactaagcgaccttgaat
配列番号２４（X00351） ctcaaggagggttcagaagcggctagtaaaggggactttctcttcagcagtgaccacctgattga
配列番号２５（X03674） aggatgtgaaggatgggaagtacagccaggttctggccaacggtctagacaacaagctgcgtgag
配列番号２６（X59268） caagtacagtgagttcttcaccggcagcaagctcatggactatgcccgcaacgtgcatgaagagt
配列番号２７（X60221） gacttgctcgagatgtcatgaaggagatgggaggccatcacattgtggccctctgtgtgctcaag
配列番号２８（AF016365） tttgggatgtctttgtgagagtagggttggcaccaatgcagtatggaaggctaggagatgggggg
配列番号２９（AF005392） tgcaatgctggtgcgccatattttctcagtgtggttgtcatgccgttgcttacccagaaagcggt
＜中空繊維束薄片の製造＞
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００３０】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
【００３１】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００３２】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００３３】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００３４】
ゲル充填中空繊維配列体の製造次に、表１に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【表１】
【００３５】
次に、プローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００３６】
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００３７】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。
【００３８】
（２）標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）の調製
次にハイブリダイゼーションに用いる標的核酸分子を含む、検体液の調製を以下の手順に従って行った。なお、本手順はマイクロアレイ１枚に対する調製量である。
【００３９】
まず、２００μｌのマイクロチューブに表２に示す成分を加え、７０℃で５分間静置した。
【表２】
【００４０】
更に以下の表３に示す成分を順次加え、４２℃で５０分間、次いで７０℃で更に５分間静置した。
【表３】
【００４１】
上記の試薬は、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。
【００４２】
次に０．５μｌのＲｎａｓｅＨを更に加え３７℃で１５分間静置した。
【００４３】
次に０．５μｌの０．５M ＥＤＴＡ、２μｌのQick Clean Resin を加え、Voltexで１分間処理した後、２２um Spin-Filterに入れて、遠心分離機で処理した（14000RPM、１分間）。
【００４４】
次に処理後の通過液分をエタノール沈殿処理して、沈殿物を２×Fluorecent labeling
Buffer １０μｌに溶解した後、Cy３ Monofunctional reactive dye （アマシャムバイオサイエンス社製）１０μｌを加えて３０分間静置した。
【００４５】
次にQlAquick PCR purification Kit (QIAGEN #28104) ［キアゲン社製］で精製し、エタノール沈殿濃縮した後、水で希釈して、２０μｌの蛍光標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）を得た。
【００４６】
なお、Quick Clean Resin、Spin-Filter、2×Fluorescent labeling bufferは、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン、ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。
【００４７】
（３）ＤＮＡマイクロアレイの保存試験１
ＳＳＣ溶液で保存したマイクロアレイの熱安定性の評価を行った。
【００４８】
まず、保存溶液として２０×ＳＳＣ溶液（Ambion社製）を希釈して、６×ＳＳＣ溶液を２５０ｍｌ準備した。下記に６×ＳＳＣの組成を表４に示す。
【表４】
【００４９】
次に６×ＳＳＣ溶液をサンプル瓶に小分けし、（１）で製造したＤＮＡマイクロアレイ３枚を、先に小分けしたビンに入れ、保存液に浸漬させた。サンプル瓶を密封し、表５に示した各温度条件（Ａ〜Ｃ）で7日間、ＤＮＡマイクロアレイを保存した。
【表５】
【００５０】
（４）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション
次に（３）で保存したDNAマイクロアレイを、以下の手順でハイブリダイゼーション操作を行った。
【００５１】
まず、表６に示す組成のハイブリ液を調製した。
【表６】
【００５２】
次いで調製した溶液を94℃で2分間加熱した後、37℃まで冷却し、ハイブリ液とした。
【００５３】
次に保存条件毎にDNAマイクロアレイを1枚につき、ハイブリパックを1枚用意し、上記で調製したハイブリ液（１００μｌ）および各保存条件のＤＮＡマイクロアレイ1枚をそれぞれパックに入れ、熱融着でシールし、密封した。
【００５４】
次にこのハイブリパックをインキュベーター内に入れ、３７℃で１7時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５５】
（５）ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作
まず、洗浄バッファー液として、2×SSC/0.2％ SDS溶液20mlを２セットおよび2×SSC溶液20mlを１セット円筒ケースにそれぞれ入れ、45℃に設定した恒温槽に入れ、45℃に保温しておいた。次にインキュベーターからハイブリパックを取り出し、マイクロアレイを取り出し、先の操作であらかじめ45℃にしておいた2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに浸漬させ、45℃に保温して20分間静置した。
【００５６】
次に、45℃にしておいた新たな2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、さらに45℃で20分間静置した。
【００５７】
最後に、45℃にしておいた2×SSC溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、45℃で10分間静置した。
【００５８】
（６）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルの検出
洗浄を施した各条件のマイクロアレイ３枚を、それぞれ水を入れたシャーレに完全に浸漬させて、固定し、冷却ＣＣＤカメラ蛍光顕微鏡でハイブリダイゼーションシグナルを検出した。結果を図３（ａ）（ｂ）及び表５に示した。
【００５９】
保存液として、６×ＳＳＣ溶液を使用した保存条件では、６５℃で７日間後でもシグナル強度に変化は特に認められなかった。また、シグナル強度の経時変化をシグナル強度低下率として、条件毎に集計した結果を表７に記載した。表５のシグナル強度低下率の値は、各スポットの蛍光シグナル強度を条件毎にシグナル強度低下率を算出し、そのスポット値の平均値にしたものである。保存液を６×SSCにした条件では、４℃、３７℃、６５℃の何れの条件においてもシグナル強度の低下は認めらなかった。
【表７】
【００６０】
＜比較例１＞
ＳＳＣ溶液で保存したマイクロアレイの熱安定性の評価を比較するために対象として、純水を滅菌処理した滅菌水を保存液として用いた以外は実施例１と同様の操作を行なった。結果を図４（ａ）（ｂ）及び表６に示した。
【００６１】
滅菌水を保存液とした場合は、６５℃で７日間後のシグナルに顕著な低下が目視レベルで認められた（図４参照）。また、シグナル強度の経時変化をシグナル強度低下率として、各条件に集計した結果を表８に記載した。保持温度を高くするにつれ、シグナル強度の低下傾向が見られ、６５℃では著しく低下していた。
【表８】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明のバイオアッセイ用キットの形態例に関する図
【図２】繊維配列体を製造する配列固定治具の図
【図３−ａ】ハイブリダイゼーション検出画像（保存液；６×ＳＳＣ）
【図３−ｂ】Ｃｙ３シグナル強度比較（保存液；６×ＳＳＣ）
【図４−ａ】ハイブリダイゼーション検出画像（保存液；滅菌水）
【図４−ｂ】Ｃｙ３シグナル強度比較（保存液；滅菌水）
【符号の説明】
【００６３】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１０：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２０：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出に使用するバイオアッセイ用基盤を含むキット及びバイオアッセイ用基盤の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析のツールとして、近年様々なデバイスが開発されている。その代表的なデバイスの一つに、ＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片を基盤上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とハイブリダイゼーション反応を基盤上で行うことにより、遺伝子の発現解析や多型解析等を行う有用なデバイスである。それは、遺伝子研究用途等の学術研究を中心に既に実用化されている。ＤＮＡマイクロアレイとしては、フォトリソグラフィー技術を利用して直接ＤＮＡを基盤上に合成することにより得られるマイクロアレイ（特許文献１、特許文献２）、スライドグラス上にＤＮＡをピン等でスポッティングすることにより得られるマイクロアレイ（非特許文献１）等が知られている。また、電気化学的にＤＮＡを基盤に固定化することにより得られるマイクロアレイ（特許文献３、特許文献４）、中空繊維を３次元に配列固定して製造することにより得られる貫通孔型のＤＮＡマイクロアレイ（特許文献５）等も知られている。
【０００３】
これらのＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子に関連するＤＮＡ情報を微小な基盤上へ高集積化することが可能である。従来の解析方法であるノーザンブロッドあるいはドットブロッドハイブリダイゼーション等に比べ、遺伝子発現等の情報を1度の解析から大量に得ることが出来る。よって、医療、農業、水産、食品、環境等様々な分野で、核酸検出用ツールとして、応用が研究、検討されている。特に医療分野では、疾病に関する個人差、疾病の予兆を遺伝子レベルで迅速に見つける診断、疾病の進行具合、手術後予後の診断などの応用に期待が高まっている。
【０００４】
診断、検査用途に用いられるデバイスは、結果が出るまでの時間（迅速性）や操作の簡便性、並びに品質保持が重要視される。特に診断・検査分野で使用する場合、定常的に大量の試料を処理する必要のあるため、常に一定量のデバイスを保管、確保されている必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、現在のＤＮＡマイクロアレイは、核酸プローブとして搭載するポリヌクレオチドが、温度や光等の影響により経時的に劣化する。またグラスアレイタイプのＤＮＡマイクロアレイでは、ガラス基盤表面にプローブ固定化のためのコーティングがされているが、湿度等の影響から長期間保管しておくと、コーティング面に剥離が生じる。従って、長期間、保存する際は、温度、湿度、遮光が適切な保存環境を選ぶ必要がある。このようなことから、ＤＮＡマイクロアレイの品質を保存期間中維持させるために、保存温度を室温以下に保ち、遮光性のある包装材や保存ケースに保存し、更にはデシケーター内に保存して湿気を遮断する等の対処がなされているのが現状である。しかも、このような保存条件でも、ＤＮＡマイクロアレイの品質保持期間は1ヶ月〜２ヶ月程度である。
【０００６】
現状での品質保持期間は、ＤＮＡマイクロアレイにより大量の試料を処理する診断や検査用デバイスとして実用化するためには、十分とはいい難く、核酸プローブが安定に維持出来るための保存方法の確立が実用上の重要な課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ（以下、マイクロアレイと称する場合もある）の品質を長期間保持できる方法を検討した結果、マイクロアレイに固定化されている核酸プローブに安定化因子を接触させることにより、核酸プローブの安定性が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法、である。
【０００９】
また、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット、である。
【特許文献１】米国特許第5445934号明細書
【特許文献２】米国特許第5774305号明細書
【特許文献３】米国特許第5605662号明細書
【特許文献４】米国特許第6023302号明細書
【特許文献５】特許第3510882号公報
【非特許文献１】Science 270, 467-470(1995)
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、マイクロアレイを長期間、保存した場合でも、シグナル低下のない、安定したシグナル感度を保つプローブが配置されたマイクロアレイを提供することができる。また、本発明によりマイクロアレイの品質管理が容易となり、疾病の予知、診断の他菌の同定やＳＮＰｓなどの遺伝子解析用途に、一度に大量の利用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、実施形態の詳細について説明する。
【００１２】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法、である。
【００１３】
ＤＮＡマイクロアレイとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片（核酸プローブ）を基盤上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とハイブリダイゼーション反応を基盤上で行うことにより、遺伝子解析又は診断等のアッセイに利用されるデバイスである。ここでＤＮＡマイクロアレイとしては、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているＤＮＡマイクロアレイが好ましい。このマイクロアレイの製造方法の一例としては、以下の１）〜４）の工程を含む製造方法が挙げられる。
【００１４】
１）複数の管状体を、それらの管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し配列体を製造する工程。
【００１５】
２）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
【００１６】
３）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各管状体に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を管状体内に保持する工程。
【００１７】
４）管状体の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００１８】
核酸プローブとは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）である。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸のアナログも含まれる。これらは合成されたものでも、生物体から調製されたものでも良い。
【００１９】
電解質溶液とは、水中でイオン解離する電解質成分を含む溶液をいう。例えば、電気泳動用緩衝液として用いられるＴＢＥ緩衝液、種々化学分析用に用いられるｐＨ緩衝液、バイオアッセイ実験等のハイブリダイゼーション用バッファー液などが挙げられる。好ましくは、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、NaH2PO4、HCl、NaOH、EDTAのうち、少なくも１種の成分を含む電解質溶液を使用する。より好ましくは、クエン酸ナトリウム塩及び塩化ナトリウムを含む電解質溶液を使用する。電解質溶液のｐＨは、中性領域（ｐＨ６〜８前後）が好ましく、ｐＨ７前後がより好ましい。また、保存期間中にｐＨ変動が起こらないように、中性領域の緩衝液成分を使用するも可能である。
【００２０】
以上の条件を満たす電解質溶液は、SSC溶液、SSPE溶液である。さらには、以下の組成を含む電解質溶液である。
【００２１】
１）クエン酸三ナトリウム水和物 100mmol/L
２）塩化ナトリウム 100mmol/L
ＤＮＡマイクロアレイは、その核酸プローブが上述の電解質溶液に接触させた状態で保存される。上述の通り、核酸プローブは経時的に劣化が進行するため、接触させておく期間は、ＤＮＡマイクロアレイを製造してから、それをアッセイに供するまでが好ましい。また、接触は、ＤＮＡマイクロアレイに固定されている核酸プローブが電解質溶液と十分に接触していればよい。よって電解質溶液は、核酸プローブが固定された領域又はマイクロアレイ全体に満たされている状態が好ましい。
【００２２】
電解質溶液と核酸プローブとの接触を確実に行うためには、容器内にそれらを封入し、接触状態を保つことが好ましい。即ち、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット、である。
【００２３】
ここで、容器の形態としては、核酸プローブと電解質溶液が接触するように、電解質溶液と核酸プローブが容器内に封入できるものであれば特に制限はない。例えば、図１に示す、密封できる袋状の容器である。袋状の容器は、ナイロン、ポリエチレンなどの熱融着樹脂製の袋が好ましい。水蒸気の蒸発等を防ぐ点で、水蒸気透過性の低い材料、すなわちナイロンがより好ましい。また、水蒸気透過性の高い材料であっても、例えばフッ化ビニリデン等の水蒸気透過を防ぐ皮膜で被覆することにより利用することができる。封入方法としては、熱融着により熱シールする方法が挙げられる。
【００２４】
また容器の形態としては、石英、ガラス等の無機材料、プラスチック等の樹脂材料からなる箱状物が挙げられる。この場合、封入方法としては、蓋等による密封による方法が挙げられる。なお、箱状物は、上述の袋状容器と同様、その壁面等に水蒸気透過を防止する被覆等の処置を施してもよい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例で実施形態の詳細について説明する。なお、ＤＮＡマイクロアレイの長期保存による品質安定性評価は、高温環境下に一定期間、その対象物を置き、その経時的機能低下を調べることにより実施した。
【００２６】
＜実施例１＞
（１）ＤＮＡマイクロアレイの調製
＜核酸プローブの調製＞
核酸プローブとしては、以下に記載した配列情報（配列番号１〜２９）をもつ5‘末端ビニル化核酸（６５mer）を用いた。これら核酸は、以下の方法により合成した。
【００２７】
まず、配列番号１〜２９のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。
【００２８】
次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
【００２９】
配列番号１（YAL005C）
gaaggagttgcaagacattgccaacccaatcatgtctaagttgtaccaagctggtggtgctccag
配列番号２（YDR012W）
tgctatcagaccagctggccaagctactcaaaagcgtactcacgttttgaagaagaacccattga
配列番号３（YDR418W）
ggtagaactttggcttccgttactaaggaaattttgggtactgctcaatctgtcggttgtcgtgt
配列番号４（YKL217W）
gcttccacgattgagacacagttagctgatagatacccattagaaagagatgcctctggtgctgt
配列番号５（YKR097W）
tggttcttcctacgtatctggtggtaaacgttgcccattgaagtacacaagggccattctggatt
配列番号６（YLR249W）
gtctacgtcgaacacgacattgatggtactcactctgacacttccgtcttggatttcgttttcga
配列番号７（YLR377C）
cggtcaacgatcgcggagagagaatcttggatttggtgccaagtcatatccatgacaaatcttct
配列番号８（YML028W）
ttgggcccaatcaacattccattgttggctgacaccaaccactctttgtccagagactatggtgt
配列番号９（YNL209W）
acttcaaggctgaattcaagaagaagactggtttggacatctccgacgatgccagagctttgaga
配列番号１０（YOL039W）
gtcggtatcgaaatcgaagacgaaaaggtttcctccgttttgtccgctttggaaggtaagtctgt
配列番号１１（M12481）
tccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccag
配列番号１２（M29618）agcgtcctggctccagttggaacactttcctgagatgcacttacttctcagcttctgcgatcaga
配列番号１３（NM008084） gacatttccctgcaggattacattgcagtgaaggagaagtatgccaagtacctccctcacagtgc
配列番号１４（NM009093） gcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccctttcttgacaaaacctaacttgcgcaga
配列番号１５（NM010863）
aagcccgcctccaccaactcagatgacgtccgtgatgagaaggtcaaggtgttgaaatgcatctc
配列番号１６（NM011296） gctacacatatagcccgtaaagctgtggaattggacttggttcctgggaggagccccatctctgt
配列番号１７（NM011341） gacctttcatacagggcagccacaccttgtccctgtaccacctcttcctgaatacggaggaaaag
配列番号１８（NM013556）
tcgtgtgtccgtggaaccagtcctagccgcgtgtgacagtcttgcattctgtttgtctcgtgggg
配列番号１９（NM013614）
tgtttgtggacctggagcccactgtggtcgatgaagtgcgcacaggaacctataggcagctcttc
配列番号２０（NM015799）ctatgccaacacagtgttgtctggtggtaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatgcaga
配列番号２１（M33197） agtttgctgacaccatcaagcagctgcagcagaatacatacactcctcgtgaggctggatctcaa
配列番号２２（U03090） cgtggatctgacgtgccgcctggagaaacctgccaagtatgatgacatcaagaaggtggtgaagc
配列番号２３（U14970） gccagtgcttccggcagtacgcgaaggacataggcttcattaagttggactaagcgaccttgaat
配列番号２４（X00351） ctcaaggagggttcagaagcggctagtaaaggggactttctcttcagcagtgaccacctgattga
配列番号２５（X03674） aggatgtgaaggatgggaagtacagccaggttctggccaacggtctagacaacaagctgcgtgag
配列番号２６（X59268） caagtacagtgagttcttcaccggcagcaagctcatggactatgcccgcaacgtgcatgaagagt
配列番号２７（X60221） gacttgctcgagatgtcatgaaggagatgggaggccatcacattgtggccctctgtgtgctcaag
配列番号２８（AF016365） tttgggatgtctttgtgagagtagggttggcaccaatgcagtatggaaggctaggagatgggggg
配列番号２９（AF005392） tgcaatgctggtgcgccatattttctcagtgtggttgtcatgccgttgcttacccagaaagcggt
＜中空繊維束薄片の製造＞
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００３０】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
【００３１】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００３２】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００３３】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００３４】
ゲル充填中空繊維配列体の製造次に、表１に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【表１】
【００３５】
次に、プローブ核酸を含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００３６】
このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００３７】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。
【００３８】
（２）標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）の調製
次にハイブリダイゼーションに用いる標的核酸分子を含む、検体液の調製を以下の手順に従って行った。なお、本手順はマイクロアレイ１枚に対する調製量である。
【００３９】
まず、２００μｌのマイクロチューブに表２に示す成分を加え、７０℃で５分間静置した。
【表２】
【００４０】
更に以下の表３に示す成分を順次加え、４２℃で５０分間、次いで７０℃で更に５分間静置した。
【表３】
【００４１】
上記の試薬は、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。
【００４２】
次に０．５μｌのＲｎａｓｅＨを更に加え３７℃で１５分間静置した。
【００４３】
次に０．５μｌの０．５M ＥＤＴＡ、２μｌのQick Clean Resin を加え、Voltexで１分間処理した後、２２um Spin-Filterに入れて、遠心分離機で処理した（14000RPM、１分間）。
【００４４】
次に処理後の通過液分をエタノール沈殿処理して、沈殿物を２×Fluorecent labeling
Buffer １０μｌに溶解した後、Cy３ Monofunctional reactive dye （アマシャムバイオサイエンス社製）１０μｌを加えて３０分間静置した。
【００４５】
次にQlAquick PCR purification Kit (QIAGEN #28104) ［キアゲン社製］で精製し、エタノール沈殿濃縮した後、水で希釈して、２０μｌの蛍光標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）を得た。
【００４６】
なお、Quick Clean Resin、Spin-Filter、2×Fluorescent labeling bufferは、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン、ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。
【００４７】
（３）ＤＮＡマイクロアレイの保存試験１
ＳＳＣ溶液で保存したマイクロアレイの熱安定性の評価を行った。
【００４８】
まず、保存溶液として２０×ＳＳＣ溶液（Ambion社製）を希釈して、６×ＳＳＣ溶液を２５０ｍｌ準備した。下記に６×ＳＳＣの組成を表４に示す。
【表４】
【００４９】
次に６×ＳＳＣ溶液をサンプル瓶に小分けし、（１）で製造したＤＮＡマイクロアレイ３枚を、先に小分けしたビンに入れ、保存液に浸漬させた。サンプル瓶を密封し、表５に示した各温度条件（Ａ〜Ｃ）で7日間、ＤＮＡマイクロアレイを保存した。
【表５】
【００５０】
（４）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション
次に（３）で保存したDNAマイクロアレイを、以下の手順でハイブリダイゼーション操作を行った。
【００５１】
まず、表６に示す組成のハイブリ液を調製した。
【表６】
【００５２】
次いで調製した溶液を94℃で2分間加熱した後、37℃まで冷却し、ハイブリ液とした。
【００５３】
次に保存条件毎にDNAマイクロアレイを1枚につき、ハイブリパックを1枚用意し、上記で調製したハイブリ液（１００μｌ）および各保存条件のＤＮＡマイクロアレイ1枚をそれぞれパックに入れ、熱融着でシールし、密封した。
【００５４】
次にこのハイブリパックをインキュベーター内に入れ、３７℃で１7時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５５】
（５）ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作
まず、洗浄バッファー液として、2×SSC/0.2％ SDS溶液20mlを２セットおよび2×SSC溶液20mlを１セット円筒ケースにそれぞれ入れ、45℃に設定した恒温槽に入れ、45℃に保温しておいた。次にインキュベーターからハイブリパックを取り出し、マイクロアレイを取り出し、先の操作であらかじめ45℃にしておいた2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに浸漬させ、45℃に保温して20分間静置した。
【００５６】
次に、45℃にしておいた新たな2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、さらに45℃で20分間静置した。
【００５７】
最後に、45℃にしておいた2×SSC溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、45℃で10分間静置した。
【００５８】
（６）ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルの検出
洗浄を施した各条件のマイクロアレイ３枚を、それぞれ水を入れたシャーレに完全に浸漬させて、固定し、冷却ＣＣＤカメラ蛍光顕微鏡でハイブリダイゼーションシグナルを検出した。結果を図３（ａ）（ｂ）及び表５に示した。
【００５９】
保存液として、６×ＳＳＣ溶液を使用した保存条件では、６５℃で７日間後でもシグナル強度に変化は特に認められなかった。また、シグナル強度の経時変化をシグナル強度低下率として、条件毎に集計した結果を表７に記載した。表５のシグナル強度低下率の値は、各スポットの蛍光シグナル強度を条件毎にシグナル強度低下率を算出し、そのスポット値の平均値にしたものである。保存液を６×SSCにした条件では、４℃、３７℃、６５℃の何れの条件においてもシグナル強度の低下は認めらなかった。
【表７】
【００６０】
＜比較例１＞
ＳＳＣ溶液で保存したマイクロアレイの熱安定性の評価を比較するために対象として、純水を滅菌処理した滅菌水を保存液として用いた以外は実施例１と同様の操作を行なった。結果を図４（ａ）（ｂ）及び表６に示した。
【００６１】
滅菌水を保存液とした場合は、６５℃で７日間後のシグナルに顕著な低下が目視レベルで認められた（図４参照）。また、シグナル強度の経時変化をシグナル強度低下率として、各条件に集計した結果を表８に記載した。保持温度を高くするにつれ、シグナル強度の低下傾向が見られ、６５℃では著しく低下していた。
【表８】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明のバイオアッセイ用キットの形態例に関する図
【図２】繊維配列体を製造する配列固定治具の図
【図３−ａ】ハイブリダイゼーション検出画像（保存液；６×ＳＳＣ）
【図３−ｂ】Ｃｙ３シグナル強度比較（保存液；６×ＳＳＣ）
【図４−ａ】ハイブリダイゼーション検出画像（保存液；滅菌水）
【図４−ｂ】Ｃｙ３シグナル強度比較（保存液；滅菌水）
【符号の説明】
【００６３】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１０：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号１９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２０：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２１：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２２：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２３：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２４：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２５：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２６：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２７：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２８：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
配列番号２９：5’-O-アミノヘキシル化合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法。
【請求項２】
ＤＮＡマイクロアレイが、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているものである、請求項１記載の保存方法。
【請求項３】
ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット。
【請求項１】
ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブを、電解質溶液に接触させることを含むＤＮＡマイクロアレイの保存方法。
【請求項２】
ＤＮＡマイクロアレイが、複数の貫通孔を有し、それらの貫通孔にゲルが保持されており、ゲルには核酸プローブが保持されているものである、請求項１記載の保存方法。
【請求項３】
ＤＮＡマイクロアレイを含むキットであって、ＤＮＡマイクロアレイと、電解質溶液と、それらを封入する容器を含み、容器内では、ＤＮＡマイクロアレイに配置されている核酸プローブが電解質溶液に接触するように、マイクロアレイが配置されているバイオアッセイ用キット。
【図１】
【図２】
【図３−ａ】
【図３−ｂ】
【図４−ａ】
【図４−ｂ】
【図２】
【図３−ａ】
【図３−ｂ】
【図４−ａ】
【図４−ｂ】
【公開番号】特開２００６−１８９３０７（Ｐ２００６−１８９３０７Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９６７（Ｐ２００５−９６７）
【出願日】平成１７年１月５日（２００５．１．５）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月５日（２００５．１．５）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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