ＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法
【課題】 ハイブリダイゼーション法を用いて、短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定する。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって、目的とするＤＮＡ配列が存在するか否かを識別することが可能なＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法を提供する。
【解決手段】 一対のプライマー間にハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素と相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡとする。
【解決手段】 一対のプライマー間にハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素と相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法に関する。特に、ＤＮＡを任意に設計し、該ＤＮＡを添加物として含有させた含有物、その含有物を用いた用紙及び印刷物等としての利用、並びに該ＤＮＡの異同識別方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年、カラー複写機の普及により誰でも簡単に高精度な複写物を得ることができるようになっており、銀行券、有価証券、身分証明書及び重要書類等の印刷物が容易に偽造されるということが問題になっている。このような偽造印刷物の作製を牽制する目的で、種々の偽造防止技術が考えられ提案されている。
【０００３】
情報の分野では電子すかしを入れたり、インキ材料の分野では蛍光又は燐光等の機能性インキを用いて印刷物を作製する技術が数多く提案されている。
【０００４】
また、最近では特定のＤＮＡの塩基配列を利用してＤＮＡインキを作製し、このＤＮＡインキを用いて商品等に印刷することで、偽造又は改ざんを防止する技術も提案されている。特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物として含む添加物を、セキュリティー管理における個人の識別や商品の真偽鑑定などに利用する識別情報保持物（例えば、特許文献１参照）が開示されている。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び／又はダミーＤＮＡを含有する組成物及びその利用物を得ることで、偽造や複製をより困難とするインキ及び印刷物（例えば、特許文献２参照）が開示されている。
【０００６】
また、ＤＮＡ試料に含まれる４種類のヌクレオチド配列を決定する速度は重要な技術的課題であり、従来よりＤＮＡを重合酵素連続反応（以下、「ＰＣＲ」という。（Polymerase Chain Reaction））を通じ、同じ塩基配列を有する核酸として大量増幅が可能で、増幅された核酸の塩基配列を、ゲル電気泳動法及びシークエンシング（塩基配列の決定）又はＤＮＡチップで分析することにより、極微量として存在する元の核酸の塩基配列を決定していた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献２】特開２００５−９７３４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、特定の物質で作製した人工ＤＮＡの組成物や人の口腔から採取したもの、つまり唾液を単純に添加しているだけなので、最新の分析技術を駆使すればその塩基配列が解読されてしまうという問題がある。
【０００９】
また、特許文献２では、数種類の合成ＤＮＡと、より多くのダミーＤＮＡを混入させたＤＮＡインキを作製しているが、一つの合成ＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるので、偽造を防止するために多くの情報を付与するためには、多種類の合成ＤＮＡが必要になり、インキの組成物のＤＮＡ分析に際して非常に多くの時間が必要となり、その結果、その塩基配列情報を読み出すまでの膨大な手間と時間を要するという問題がある。
【００１０】
さらに、従来の測定法では、結果が判別できるまでに長時間を要していた。また、判定に要する時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで判定を行う方法がとられていたが、ゲル電気泳動法のみでは精度が悪かった。精度を上げるためのシークエンシング又はＤＮＡチップ等で確認を行う方法では、高度の技術と設備が必要となり、時間もかかるという問題があった。
【００１１】
そこで、近年、核酸の配列を決定する方法としては、ハイブリダイゼーション法が有利となってきた。本発明の目的は、上記した従来技術の問題点を解決するために、ハイブリダイゼーション法を用いて短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することにある。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって、目的とするＤＮＡ配列が存在するかを識別することが可能なＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは今般、ゲル電気泳動法を用いることなく、ハイブリダイゼーション法により短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することができるＤＮＡを設計することができた。また、これらのＤＮＡを、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計することにより、特定の塩基配列に情報を付与することができるという知見を得た。本発明は、かかる知見によるものである。
すなわち、本発明のＤＮＡは、一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置して設計されたものである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されたものである。
【００１４】
また、本発明の別の態様としてのＤＮＡに組み込まれた塩基配列の識別方法は、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分を切り出す工程と、切り出した部分をバッファを加えた抽出溶液中に入れ、切り出した部分からＤＮＡを抽出する工程と、抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーション法によって、特定の波長での蛍光発光の有無を検出する工程と、検出した蛍光発光する特定の波長を、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光と比較する工程と、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別する工程とよりなるものである。
【００１５】
本発明によれば、このようなＤＮＡは、例えば、組成物、ＤＮＡインキ、ＤＮＡ塗工液、ＤＮＡ含有物及びＤＮＡ繊維等として、さらにＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物、ＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙、ＤＮＡ含有物を含む用紙及びＤＮＡ繊維を含む混抄紙等の真偽判別及び偽造防止を要求される分野に好適に利用できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、設計した塩基配列を有するＤＮＡを短時間で精度よく識別することができる。また、ＤＮＡに付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に読み出すことができ、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在する否かを、破壊又は非破壊のどちらの方法でも識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態による、ＤＮＡ及びＤＮＡの異同識別方法について、図面を用いて説明する。本発明において、ＤＮＡ、プローブ、ハイブリダイゼーション、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ法、ＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ等の用語は、現在分子生物学、遺伝子工学及び微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１８】
本実施の形態により設計されるＤＮＡは、従来のＤＮＡが、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有するというような構成であるので、多くの情報を付与するためには、多種類のＤＮＡが必要になり、かつ判別に長時間を要し、判定の時間を短縮するためゲル電気泳動法を用いると、ゲル電気泳動法では精度が悪いという問題を解決するためになされたものである。
【００１９】
本実施の形態において設計したＤＮＡの構成としては、一対のプライマー間にハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡとしている。
蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定及び検定に用いられるものが使用でき、例えば、フルオレイセン又はその誘導体類、ローダミン又はその誘導体類等が好適に用いられる。
【００２０】
例えば、２種類の塩基配列を組み込んで構成されるＤＮＡの場合、一般的な６波長での検出が可能であるとするならば２１種類、３種類の塩基配列を組み込んで構成されるＤＮＡの場合は５０種類以上のＤＮＡを識別することが可能となる。
このように組み込むプローブの数を増やすことにより、情報部分であるプローブの数が多くなるので、一つのＤＮＡに多くの情報を入れることが可能となる。
【００２１】
ＤＮＡの識別方法としては、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているかどうかを短時間で迅速かつ精度良く情報の分析を行うため、特定の塩基配列と相補的な関係にある蛍光色素とドナー色素とを含んだプローブを使用するハイブリダイゼーションプローブ法を用いる。
【００２２】
本実施の形態において、設計されたＤＮＡを用いた用紙又は印刷物等の識別に用いるハイブリダイゼーションプローブ法についての概要を述べる。
ハイブリダイゼーションプローブ法（以下、「リアルタイム検出ＰＣＲ法」ということもある。）は定量性が高く、被検核酸の定量には優れた方法である。ハイブリダイゼーションプローブ法では、その原理においてドナー色素とアクセプター蛍光色素とを標識とした一組のハイブリダイゼーションプローブが用いられる。ドナー色素の例としてフルオレイセン、アクセプター蛍光色素の例としてＬＣ Ｒｅｄ６４０等があり、蛍光色素の組合せは周知であり市販もされている。
【００２３】
目的とするＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）に所定のプライマーとハイブリダイゼーションプローブを入れてＰＣＲを行うと、プライマーのアニーリングと同時にハイブリダイゼーションプローブが目的とするＤＮＡとアニーリングする。この状態において、一組のハイブリダイゼーションプローブが近接して存在する場合、蛍光共鳴エネルギー転移効果が起き、蛍光を発する。
その後、通常のＰＣＲと同様に、ポリメラーゼ反応により新しいＤＮＡが複製され、ハイブリダイゼーションプローブがＤＮＡ鎖からはずれ、消光する。
【００２４】
（実施例１）
図１及び図２に、実施例１としてＤＮＡの設計の一例を示す。本実施例において、用いるＤＮＡとしてはタカラバイオ社製の塩基鎖長２５０ｂｐをＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。
【００２５】
実施例１では、一対のプライマー間に３種類のプローブを含むＤＮＡの設計をする。各プローブとは、蛍光物質とドナー色素で標識した相補的な塩基配列の関係にあるプローブがハイブリッド形成を行うことができる。また、設計されたＤＮＡのプローブに、あらかじめ特定情報を組み込み、このＤＮＡの各プローブと、該プローブに組み込んだ特定情報を関連付けてデータベースに記憶しておく。
【００２６】
リアルタイムＰＣＲ装置におけるＰＣＲ中のＤＮＡの蛍光標識方法には幾つかの種類があり、一つには、２本鎖状態のＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識（一般にはサイバーグリーンとして知られている）を利用するサイバーグリーン法、また一つには、ＰＣＲにより合成されたＤＮＡの内部の塩基配列に特異的に結合する蛍光標識を利用するハイブリダイゼーションプローブ法がある。
【００２７】
（ＤＮＡ（Ｘ）の設計）
図１に、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んで設計したＤＮＡ（Ｘ）の設計図の一例を示す。
ＤＮＡ（Ｘ）の構成としては、一対のプライマー（Ｆ）とプライマー（Ｒ）の間に、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の３種類を配置する。また、３種類のプローブには特定情報を付与することとする。
【００２８】
図２に、ＤＮＡ（Ｘ）の全体の塩基配列を示した。
本実施例では、塩基鎖数は２５０ｂｐ、アンプリコンサイズは２４０ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
【００２９】
プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の情報の付与の方法に関しての制限はない。また、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列はそれぞれ異なっていても、また同じでも良い。さらに、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）、がＤＮＡ（Ｘ）上にあれば、同一の鎖上でなくともよい。
【００３０】
本実施例１では、ＤＮＡ（Ｘ）がハイブリダイゼーションプローブを用いて蛍光が観察できた場合のみ、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列を同定できたとし、ＤＮＡの存在の有無と同時に特定情報を読み取れたことになる、という設定条件としている。
【００３１】
具体的には、ハイブリダイゼーションプローブを次のように設計した。
プローブ（Ａ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ’の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２５番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２７番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６４０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６４０nmである。
【００３２】
プローブ（Ｂ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ’の組）は、塩基鎖長５６ｂｐで２７番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２９番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ７０５ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は７０５nmである。
【００３３】
プローブ（Ｃ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ’の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２７番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２９番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６１０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６１０ｎｍである。
【００３４】
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素で標識されるプローブと、蛍光発光する色素で標識したプローブとの間隔は１〜５塩基以内が望ましく、１〜２塩基が最も望ましい。
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素は特にフルオレイセンに限定されるものではなく、また、蛍光発光する色素は、前述の色素に限定されるものではない。
【００３５】
次に、ＤＮＡ含有物を含む用紙からの抽出液及び特定情報を付与したＤＮＡ（Ｘ）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）装置によりＤＮＡの検出を行う。本実施例１においては、ロッシュ社製のＲＴ−ＰＣＲ装置（ライトサイクラー４００ ＤＸシステム（商品名））を使用した。
また、本発明のＤＮＡを含有して成る各種組成物、印刷物、用紙、混抄紙又は塗工紙等からＤＮＡを抽出する方法としては、ＤＮＡを含む部分を破壊しないで抽出する方法又はＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して用いる方法等がある。本実施例においては、ＤＮＡ部分を切り抜き、破断して用いる方法を用いたが、非破壊で溶出転写する方法でも同様の結果を得ることができる。
【００３６】
ＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｘｙ）の作製方法としては、ＤＮＡ（Ｘ）と、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物を用紙に含んで作製した。このＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｘｙ）を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた用紙をＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて超音波抽出を行い、抽出液（ＸＬ）を得た。
【００３７】
抽出液（ＸＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＰＴ−ＰＣＲを行った。蛍光検出の結果を図３に示す。
図３（ａ）は、ＬＣＲｅｄ６４０で標識されたプローブ（Ａ）が検出波長６４０ｎｍで蛍光発光した図である。
図３（ｂ）は、ＬＣＲｅｄ７０５で標識されたプローブ（Ｂ）が検出波長７０５ｎｍで蛍光発光した図である。
図３（ｃ）は、ＬＣＲｅｄ６１０で標識されたプローブ（Ｃ）が検出波長６１０ｎｍで蛍光発光した図である。
いずれの検出波長においても、抽出液（ＸＬ）では１４サイクル以降で蛍光を確認することができた。
【００３８】
本実施例１の方法を用いることで、目的とするＤＮＡの存在を確認するとともに、塩基配列に含まれる特定情報を読み出すことができた。本実施例１の方法を用いた一例としての作業時間は約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能だった。それぞれの工程に要した時間の概略は、ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調製及び準備が２０分、ＲＴ−ＰＣＲが３０分（４０サイクル）であった。
【００３９】
（比較例）
（ＤＮＡ（Ｙ）の設計）
図４に、上記実施例１による比較例として、ＤＮＡ（Ｙ）の設計の一例を示す。比較例において、用いるＤＮＡとしてはタカラバイオ社製の塩基鎖長２５０ｂｐをＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。塩基鎖数及び塩基配合率はＤＮＡ（Ｘ）と同一である。
【００４０】
（比較例１）
図５に、ＤＮＡ（Ｙ）の塩基配列を示した。本比較例１では、塩基鎖数は２５０ｂｐ、アンプリコンサイズは２４０ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
【００４１】
ＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｙｙ）の作製方法としては、ＤＮＡ（Ｙ）と、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物を、用紙に含んで作製した。ＤＮＡ含有用紙（Ｙｙ）を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた用紙をＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて、超音波抽出を行い、抽出液（ＹＬ）を得た。
【００４２】
増幅産物の検出は、サイバーグリーン法を用いた融解曲線分析により増幅産物の確認を行う。
抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）、ＤＮＡ（Ｙ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、サイバーグリーン法によりＲＴ−ＰＣＲを行い、融解曲線を測定した。結果を図６に示す。増幅産物の配列に固有の値が融解温度（Ｔｍ値）であるので、融解曲線から、抽出液（ＹＬ）のＰＣＲ産物、ＤＮＡ（Ｘ）のＰＣＲ産物、ＤＮＡ（Ｙ）のＰＣＲ産物の塩基組成が同一であることが分かる。したがって、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）の識別を融解曲線から判別することはできないことが分かる。
【００４３】
（比較例２）
次に、ゲル電気泳動による確認を行う。
抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）のそれぞれのＲＴ−ＰＣＲ産物を用いてゲル電気泳動を行った。図７にゲル電気泳動写真を示す。
レーン１がＤＮＡマーカー、レーン２が抽出液（ＹＬ）のＲＴ−ＰＣＲ産物、レーン３がＤＮＡ（Ｘ）のＲＴ−ＰＣＲ産物、レーン４がＤＮＡ（Ｙ）のＲＴ−ＰＣＲ産物であり、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）の塩基鎖長が同じであることが分かる。したがって、ゲル電気泳動から判別することはできないことが分かる。
【００４４】
（比較例３）
以上の従来法を用いた判別方法では確認することができなかった。そこで、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＲＴ−ＰＣＲを行った。蛍光検出の結果を図８に示す。６４０ｎｍ及び７０５ｎｍの検出波長のいずれにおいても発光は検出されず、抽出液（ＹＬ）には、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）に対応する塩基配列を含んでいないことが分かった。６１０ｎｍの検出波長では発光が検出された。このことから、抽出液（ＹＬ）には、プローブ（Ｃ）に対応する塩基配列を含んでいることが分かった。
【００４５】
ハイブリダイゼーションプローブは、波長の異なる蛍光物質の組合せが可能であるため、実施例１のように、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んでもよいが、Ａ、Ｂ及びＣの３種類の蛍光物質を用いる場合には、ＡＡＢ、ＡＢＢ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＢＢＣ、ＢＣＣ及びＡＢＣの７種類の組合せが考えられるので、それぞれの場合に応じた強度情報を加味しての異同識別が可能となる。
【００４６】
すなわち、同一のプローブを複数使用した組み合わせにおいては、さらに検出のための増幅に関わる時間の短縮が可能となると共に、発光強度比による判別も可能となる。
【００４７】
また、ＤＮＡの構成として、波長が異なる蛍光発光するプローブを一対のプライマー間に、以下に示した６種類の蛍光物質を用いて一つのＤＮＡに３種類のプローブを組み込んだ場合は、５０種類以上の組合せの利用が考えられ、その判別が可能となる。
プローブ１：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５３０標識・・検出波長５３０ｎｍ
プローブ２：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５５５標識・・検出波長５５５ｎｍ
プローブ３：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６１０標識・・検出波長６１０ｎｍ
プローブ４：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６４０標識・・検出波長６４０ｎｍ
プローブ５：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６７０標識・・検出波長６７０ｎｍ
プローブ６：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ７１０標識・・検出波長７１０ｎｍ
【００４８】
以上のようにして設計したＤＮＡ（Ｘ）を用いた使用例としては、複数の特定情報を有するＤＮＡ入り用紙、塗工紙又は印刷物等を製造することができる。
【００４９】
また、以上のように設計されたＤＮＡ（Ｘ）を構成するプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の蛍光発光をいずれか２つ以上又はすべての発光を確認することによって、ＤＮＡの存在を確認すると共にプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）に基づく塩基配列を識別できたことになる。
【００５０】
（実施例２）
実施例１で作製したＤＮＡ（Ｘ）を０．００５％含むＤＮＡ入りオフセットインキを一般に公知のインキ製造方法により作製し、このオフセットインキを用いて印刷適性印刷機にて印刷物を作製する。
【００５１】
本実施例２では、ＤＮＡ（Ｘ）がハイブリダイゼーションプローブを用いて蛍光が観察できた場合のみ、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列を同定できたとし、ＤＮＡの存在の有無と同時に塩基配列の読み取れたことになる、という設定条件としている。
【００５２】
（ＤＮＡ入りオフセット印刷物からのＤＮＡの抽出）
得られた印刷物を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた印刷部分にＤＮＡ（Ｘ）を含んだ印刷画線が含まれた印刷用紙を、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて超音波抽出を行って、抽出液（Ｘｐ）を得た。抽出液（Ｘｐ）を用いて、実施例１の用紙の場合と同様にハイブリダイゼーションプローブ法を用いてＰＴ−ＰＣＲを行った結果、いずれの検出波長においても、抽出液（Ｘｐ）では１４サイクル以降で蛍光を確認することができた。
【００５３】
本実施例２の方法を用いることで、目的とするＤＮＡの存在を確認すると共に塩基配列から特定の情報を読み出すことができた。本実施例２の方法を用いた一例としての作業時間は約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能だった。それぞれの工程に要した時間の概略は、ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調製及び準備が２０分、ＲＴ-ＰＣＲが３０分（４０サイクル）であった。
【００５４】
以上詳述したように、ハイブリダイゼーションプローブ法によってプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）に由来する波長の蛍光が検出された場合に、ＤＮＡの存在を確認でき、かつ組み込まれた塩基配列を読み取れたこととなる。
【００５５】
表１に、ＤＮＡの分析による本実施例と比較例による結果の比較をまとめたものを示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
以上の実施例は、プローブに相当する部分の塩基配列を異なるように設計しているが、同じ塩基配列情報を有するプローブを組み込んだＤＮＡを使用した場合には、鍵となる蛍光発光させる波長の強度差を利用すれば検出精度を上げ、識別をより高度なものとすることができる。
【００５８】
以上、本発明に係るＤＮＡ入り用紙、ＤＮＡインキを用いた印刷物を作製した実施例について説明したが、本発明のＤＮＡの使用物に係るＤＮＡ入り含有物を用いた用紙又は塗工物を使用した印刷物等も同様の操作で迅速に識別を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１における特定情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を示す図である。
【図２】実施例１におけるＤＮＡ（Ｘ）の全体配列を示す図である。
【図３】実施例１における抽出液（Ｘｙ）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】比較例における特定情報を有する合成ＤＮＡ（Ｙ）を示す図である。
【図５】比較例におけるＤＮＡ（Ｙ）の全体配列を示す図である。
【図６】比較例１における、融解曲線を示す図である。
【図７】比較例１における、ゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図８】比較例１における、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法に関する。特に、ＤＮＡを任意に設計し、該ＤＮＡを添加物として含有させた含有物、その含有物を用いた用紙及び印刷物等としての利用、並びに該ＤＮＡの異同識別方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年、カラー複写機の普及により誰でも簡単に高精度な複写物を得ることができるようになっており、銀行券、有価証券、身分証明書及び重要書類等の印刷物が容易に偽造されるということが問題になっている。このような偽造印刷物の作製を牽制する目的で、種々の偽造防止技術が考えられ提案されている。
【０００３】
情報の分野では電子すかしを入れたり、インキ材料の分野では蛍光又は燐光等の機能性インキを用いて印刷物を作製する技術が数多く提案されている。
【０００４】
また、最近では特定のＤＮＡの塩基配列を利用してＤＮＡインキを作製し、このＤＮＡインキを用いて商品等に印刷することで、偽造又は改ざんを防止する技術も提案されている。特定の物質で作製した人工ＤＮＡを組成物として含む添加物を、セキュリティー管理における個人の識別や商品の真偽鑑定などに利用する識別情報保持物（例えば、特許文献１参照）が開示されている。
【０００５】
また、合成ＤＮＡ及び／又はダミーＤＮＡを含有する組成物及びその利用物を得ることで、偽造や複製をより困難とするインキ及び印刷物（例えば、特許文献２参照）が開示されている。
【０００６】
また、ＤＮＡ試料に含まれる４種類のヌクレオチド配列を決定する速度は重要な技術的課題であり、従来よりＤＮＡを重合酵素連続反応（以下、「ＰＣＲ」という。（Polymerase Chain Reaction））を通じ、同じ塩基配列を有する核酸として大量増幅が可能で、増幅された核酸の塩基配列を、ゲル電気泳動法及びシークエンシング（塩基配列の決定）又はＤＮＡチップで分析することにより、極微量として存在する元の核酸の塩基配列を決定していた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１５７００４号公報
【特許文献２】特開２００５−９７３４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、特定の物質で作製した人工ＤＮＡの組成物や人の口腔から採取したもの、つまり唾液を単純に添加しているだけなので、最新の分析技術を駆使すればその塩基配列が解読されてしまうという問題がある。
【０００９】
また、特許文献２では、数種類の合成ＤＮＡと、より多くのダミーＤＮＡを混入させたＤＮＡインキを作製しているが、一つの合成ＤＮＡは一つの情報部分を有する構成であるので、偽造を防止するために多くの情報を付与するためには、多種類の合成ＤＮＡが必要になり、インキの組成物のＤＮＡ分析に際して非常に多くの時間が必要となり、その結果、その塩基配列情報を読み出すまでの膨大な手間と時間を要するという問題がある。
【００１０】
さらに、従来の測定法では、結果が判別できるまでに長時間を要していた。また、判定に要する時間を短縮するために、ゲル電気泳動法のみで判定を行う方法がとられていたが、ゲル電気泳動法のみでは精度が悪かった。精度を上げるためのシークエンシング又はＤＮＡチップ等で確認を行う方法では、高度の技術と設備が必要となり、時間もかかるという問題があった。
【００１１】
そこで、近年、核酸の配列を決定する方法としては、ハイブリダイゼーション法が有利となってきた。本発明の目的は、上記した従来技術の問題点を解決するために、ハイブリダイゼーション法を用いて短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することにある。また、付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に増幅し、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって、目的とするＤＮＡ配列が存在するかを識別することが可能なＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用並びにＤＮＡの異同識別方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは今般、ゲル電気泳動法を用いることなく、ハイブリダイゼーション法により短時間でＤＮＡ試料を効率よく同定し、かつ塩基配列を決定することができるＤＮＡを設計することができた。また、これらのＤＮＡを、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計することにより、特定の塩基配列に情報を付与することができるという知見を得た。本発明は、かかる知見によるものである。
すなわち、本発明のＤＮＡは、一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置して設計されたものである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されたものである。
【００１４】
また、本発明の別の態様としてのＤＮＡに組み込まれた塩基配列の識別方法は、印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分を切り出す工程と、切り出した部分をバッファを加えた抽出溶液中に入れ、切り出した部分からＤＮＡを抽出する工程と、抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーション法によって、特定の波長での蛍光発光の有無を検出する工程と、検出した蛍光発光する特定の波長を、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光と比較する工程と、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別する工程とよりなるものである。
【００１５】
本発明によれば、このようなＤＮＡは、例えば、組成物、ＤＮＡインキ、ＤＮＡ塗工液、ＤＮＡ含有物及びＤＮＡ繊維等として、さらにＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物、ＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙、ＤＮＡ含有物を含む用紙及びＤＮＡ繊維を含む混抄紙等の真偽判別及び偽造防止を要求される分野に好適に利用できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、設計した塩基配列を有するＤＮＡを短時間で精度よく識別することができる。また、ＤＮＡに付与した特定情報を短時間で精度よく、迅速に読み出すことができ、埋め込まれた特定情報に基づく蛍光発光によって目的とするＤＮＡ配列が存在する否かを、破壊又は非破壊のどちらの方法でも識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態による、ＤＮＡ及びＤＮＡの異同識別方法について、図面を用いて説明する。本発明において、ＤＮＡ、プローブ、ハイブリダイゼーション、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ法、ＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ等の用語は、現在分子生物学、遺伝子工学及び微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１８】
本実施の形態により設計されるＤＮＡは、従来のＤＮＡが、一つのＤＮＡは一つの情報部分を有するというような構成であるので、多くの情報を付与するためには、多種類のＤＮＡが必要になり、かつ判別に長時間を要し、判定の時間を短縮するためゲル電気泳動法を用いると、ゲル電気泳動法では精度が悪いという問題を解決するためになされたものである。
【００１９】
本実施の形態において設計したＤＮＡの構成としては、一対のプライマー間にハイブリッド形成が可能な蛍光物質とドナー色素とで標識したプローブと相補的な関係にある塩基配列を含んだ、少なくとも２種類以上のプローブを組み込んで構成されるＤＮＡとしている。
蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定及び検定に用いられるものが使用でき、例えば、フルオレイセン又はその誘導体類、ローダミン又はその誘導体類等が好適に用いられる。
【００２０】
例えば、２種類の塩基配列を組み込んで構成されるＤＮＡの場合、一般的な６波長での検出が可能であるとするならば２１種類、３種類の塩基配列を組み込んで構成されるＤＮＡの場合は５０種類以上のＤＮＡを識別することが可能となる。
このように組み込むプローブの数を増やすことにより、情報部分であるプローブの数が多くなるので、一つのＤＮＡに多くの情報を入れることが可能となる。
【００２１】
ＤＮＡの識別方法としては、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているかどうかを短時間で迅速かつ精度良く情報の分析を行うため、特定の塩基配列と相補的な関係にある蛍光色素とドナー色素とを含んだプローブを使用するハイブリダイゼーションプローブ法を用いる。
【００２２】
本実施の形態において、設計されたＤＮＡを用いた用紙又は印刷物等の識別に用いるハイブリダイゼーションプローブ法についての概要を述べる。
ハイブリダイゼーションプローブ法（以下、「リアルタイム検出ＰＣＲ法」ということもある。）は定量性が高く、被検核酸の定量には優れた方法である。ハイブリダイゼーションプローブ法では、その原理においてドナー色素とアクセプター蛍光色素とを標識とした一組のハイブリダイゼーションプローブが用いられる。ドナー色素の例としてフルオレイセン、アクセプター蛍光色素の例としてＬＣ Ｒｅｄ６４０等があり、蛍光色素の組合せは周知であり市販もされている。
【００２３】
目的とするＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）に所定のプライマーとハイブリダイゼーションプローブを入れてＰＣＲを行うと、プライマーのアニーリングと同時にハイブリダイゼーションプローブが目的とするＤＮＡとアニーリングする。この状態において、一組のハイブリダイゼーションプローブが近接して存在する場合、蛍光共鳴エネルギー転移効果が起き、蛍光を発する。
その後、通常のＰＣＲと同様に、ポリメラーゼ反応により新しいＤＮＡが複製され、ハイブリダイゼーションプローブがＤＮＡ鎖からはずれ、消光する。
【００２４】
（実施例１）
図１及び図２に、実施例１としてＤＮＡの設計の一例を示す。本実施例において、用いるＤＮＡとしてはタカラバイオ社製の塩基鎖長２５０ｂｐをＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。
【００２５】
実施例１では、一対のプライマー間に３種類のプローブを含むＤＮＡの設計をする。各プローブとは、蛍光物質とドナー色素で標識した相補的な塩基配列の関係にあるプローブがハイブリッド形成を行うことができる。また、設計されたＤＮＡのプローブに、あらかじめ特定情報を組み込み、このＤＮＡの各プローブと、該プローブに組み込んだ特定情報を関連付けてデータベースに記憶しておく。
【００２６】
リアルタイムＰＣＲ装置におけるＰＣＲ中のＤＮＡの蛍光標識方法には幾つかの種類があり、一つには、２本鎖状態のＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識（一般にはサイバーグリーンとして知られている）を利用するサイバーグリーン法、また一つには、ＰＣＲにより合成されたＤＮＡの内部の塩基配列に特異的に結合する蛍光標識を利用するハイブリダイゼーションプローブ法がある。
【００２７】
（ＤＮＡ（Ｘ）の設計）
図１に、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んで設計したＤＮＡ（Ｘ）の設計図の一例を示す。
ＤＮＡ（Ｘ）の構成としては、一対のプライマー（Ｆ）とプライマー（Ｒ）の間に、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の３種類を配置する。また、３種類のプローブには特定情報を付与することとする。
【００２８】
図２に、ＤＮＡ（Ｘ）の全体の塩基配列を示した。
本実施例では、塩基鎖数は２５０ｂｐ、アンプリコンサイズは２４０ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
【００２９】
プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の情報の付与の方法に関しての制限はない。また、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列はそれぞれ異なっていても、また同じでも良い。さらに、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）、がＤＮＡ（Ｘ）上にあれば、同一の鎖上でなくともよい。
【００３０】
本実施例１では、ＤＮＡ（Ｘ）がハイブリダイゼーションプローブを用いて蛍光が観察できた場合のみ、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列を同定できたとし、ＤＮＡの存在の有無と同時に特定情報を読み取れたことになる、という設定条件としている。
【００３１】
具体的には、ハイブリダイゼーションプローブを次のように設計した。
プローブ（Ａ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ａ−ａ’の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２５番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２７番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６４０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６４０nmである。
【００３２】
プローブ（Ｂ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ｂ−ｂ’の組）は、塩基鎖長５６ｂｐで２７番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２９番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ７０５ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は７０５nmである。
【００３３】
プローブ（Ｃ）と相補的な塩基配列の関係にあるハイブリダイゼーションプローブ（ｃ−ｃ’の組）は、塩基鎖長５４ｂｐで２７番目の３’末端にドナー色素としてフルオレイセンで標識した。さらに２９番目の５’末端を蛍光発光する色素ＬＣＲｅｄ６１０ で標識し、３’末端はリン酸化を行った。検出波長は６１０ｎｍである。
【００３４】
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素で標識されるプローブと、蛍光発光する色素で標識したプローブとの間隔は１〜５塩基以内が望ましく、１〜２塩基が最も望ましい。
ハイブリダイゼーションプローブを構成するドナー色素は特にフルオレイセンに限定されるものではなく、また、蛍光発光する色素は、前述の色素に限定されるものではない。
【００３５】
次に、ＤＮＡ含有物を含む用紙からの抽出液及び特定情報を付与したＤＮＡ（Ｘ）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）装置によりＤＮＡの検出を行う。本実施例１においては、ロッシュ社製のＲＴ−ＰＣＲ装置（ライトサイクラー４００ ＤＸシステム（商品名））を使用した。
また、本発明のＤＮＡを含有して成る各種組成物、印刷物、用紙、混抄紙又は塗工紙等からＤＮＡを抽出する方法としては、ＤＮＡを含む部分を破壊しないで抽出する方法又はＤＮＡを含む部分を切り抜き、破断して用いる方法等がある。本実施例においては、ＤＮＡ部分を切り抜き、破断して用いる方法を用いたが、非破壊で溶出転写する方法でも同様の結果を得ることができる。
【００３６】
ＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｘｙ）の作製方法としては、ＤＮＡ（Ｘ）と、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物を用紙に含んで作製した。このＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｘｙ）を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた用紙をＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて超音波抽出を行い、抽出液（ＸＬ）を得た。
【００３７】
抽出液（ＸＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＰＴ−ＰＣＲを行った。蛍光検出の結果を図３に示す。
図３（ａ）は、ＬＣＲｅｄ６４０で標識されたプローブ（Ａ）が検出波長６４０ｎｍで蛍光発光した図である。
図３（ｂ）は、ＬＣＲｅｄ７０５で標識されたプローブ（Ｂ）が検出波長７０５ｎｍで蛍光発光した図である。
図３（ｃ）は、ＬＣＲｅｄ６１０で標識されたプローブ（Ｃ）が検出波長６１０ｎｍで蛍光発光した図である。
いずれの検出波長においても、抽出液（ＸＬ）では１４サイクル以降で蛍光を確認することができた。
【００３８】
本実施例１の方法を用いることで、目的とするＤＮＡの存在を確認するとともに、塩基配列に含まれる特定情報を読み出すことができた。本実施例１の方法を用いた一例としての作業時間は約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能だった。それぞれの工程に要した時間の概略は、ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調製及び準備が２０分、ＲＴ−ＰＣＲが３０分（４０サイクル）であった。
【００３９】
（比較例）
（ＤＮＡ（Ｙ）の設計）
図４に、上記実施例１による比較例として、ＤＮＡ（Ｙ）の設計の一例を示す。比較例において、用いるＤＮＡとしてはタカラバイオ社製の塩基鎖長２５０ｂｐをＩＣＡＮ法により増幅したものを用いた。塩基鎖数及び塩基配合率はＤＮＡ（Ｘ）と同一である。
【００４０】
（比較例１）
図５に、ＤＮＡ（Ｙ）の塩基配列を示した。本比較例１では、塩基鎖数は２５０ｂｐ、アンプリコンサイズは２４０ｂｐとしているが、塩基配列及び鎖長においての制限は特にない。また、プライマー部分に関しても特に制限はないが、８塩基鎖長以上が適当である。
【００４１】
ＤＮＡ含有物を含む用紙（Ｙｙ）の作製方法としては、ＤＮＡ（Ｙ）と、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成るＤＮＡ含有物を、用紙に含んで作製した。ＤＮＡ含有用紙（Ｙｙ）を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた用紙をＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて、超音波抽出を行い、抽出液（ＹＬ）を得た。
【００４２】
増幅産物の検出は、サイバーグリーン法を用いた融解曲線分析により増幅産物の確認を行う。
抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）、ＤＮＡ（Ｙ）及びネガティブコントロールとしての水を用い、サイバーグリーン法によりＲＴ−ＰＣＲを行い、融解曲線を測定した。結果を図６に示す。増幅産物の配列に固有の値が融解温度（Ｔｍ値）であるので、融解曲線から、抽出液（ＹＬ）のＰＣＲ産物、ＤＮＡ（Ｘ）のＰＣＲ産物、ＤＮＡ（Ｙ）のＰＣＲ産物の塩基組成が同一であることが分かる。したがって、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）の識別を融解曲線から判別することはできないことが分かる。
【００４３】
（比較例２）
次に、ゲル電気泳動による確認を行う。
抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）のそれぞれのＲＴ−ＰＣＲ産物を用いてゲル電気泳動を行った。図７にゲル電気泳動写真を示す。
レーン１がＤＮＡマーカー、レーン２が抽出液（ＹＬ）のＲＴ−ＰＣＲ産物、レーン３がＤＮＡ（Ｘ）のＲＴ−ＰＣＲ産物、レーン４がＤＮＡ（Ｙ）のＲＴ−ＰＣＲ産物であり、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）の塩基鎖長が同じであることが分かる。したがって、ゲル電気泳動から判別することはできないことが分かる。
【００４４】
（比較例３）
以上の従来法を用いた判別方法では確認することができなかった。そこで、抽出液（ＹＬ）、ＤＮＡ（Ｘ）及びＤＮＡ（Ｙ）を用い、ハイブリダイゼーションプローブ法によりＲＴ−ＰＣＲを行った。蛍光検出の結果を図８に示す。６４０ｎｍ及び７０５ｎｍの検出波長のいずれにおいても発光は検出されず、抽出液（ＹＬ）には、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）に対応する塩基配列を含んでいないことが分かった。６１０ｎｍの検出波長では発光が検出された。このことから、抽出液（ＹＬ）には、プローブ（Ｃ）に対応する塩基配列を含んでいることが分かった。
【００４５】
ハイブリダイゼーションプローブは、波長の異なる蛍光物質の組合せが可能であるため、実施例１のように、一対のプライマー間に３種類のプローブを組み込んでもよいが、Ａ、Ｂ及びＣの３種類の蛍光物質を用いる場合には、ＡＡＢ、ＡＢＢ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＢＢＣ、ＢＣＣ及びＡＢＣの７種類の組合せが考えられるので、それぞれの場合に応じた強度情報を加味しての異同識別が可能となる。
【００４６】
すなわち、同一のプローブを複数使用した組み合わせにおいては、さらに検出のための増幅に関わる時間の短縮が可能となると共に、発光強度比による判別も可能となる。
【００４７】
また、ＤＮＡの構成として、波長が異なる蛍光発光するプローブを一対のプライマー間に、以下に示した６種類の蛍光物質を用いて一つのＤＮＡに３種類のプローブを組み込んだ場合は、５０種類以上の組合せの利用が考えられ、その判別が可能となる。
プローブ１：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５３０標識・・検出波長５３０ｎｍ
プローブ２：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ５５５標識・・検出波長５５５ｎｍ
プローブ３：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６１０標識・・検出波長６１０ｎｍ
プローブ４：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６４０標識・・検出波長６４０ｎｍ
プローブ５：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ６７０標識・・検出波長６７０ｎｍ
プローブ６：フルオレイセン／ＬｃＲｅｄ７１０標識・・検出波長７１０ｎｍ
【００４８】
以上のようにして設計したＤＮＡ（Ｘ）を用いた使用例としては、複数の特定情報を有するＤＮＡ入り用紙、塗工紙又は印刷物等を製造することができる。
【００４９】
また、以上のように設計されたＤＮＡ（Ｘ）を構成するプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の蛍光発光をいずれか２つ以上又はすべての発光を確認することによって、ＤＮＡの存在を確認すると共にプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）に基づく塩基配列を識別できたことになる。
【００５０】
（実施例２）
実施例１で作製したＤＮＡ（Ｘ）を０．００５％含むＤＮＡ入りオフセットインキを一般に公知のインキ製造方法により作製し、このオフセットインキを用いて印刷適性印刷機にて印刷物を作製する。
【００５１】
本実施例２では、ＤＮＡ（Ｘ）がハイブリダイゼーションプローブを用いて蛍光が観察できた場合のみ、プローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）の塩基配列を同定できたとし、ＤＮＡの存在の有無と同時に塩基配列の読み取れたことになる、という設定条件としている。
【００５２】
（ＤＮＡ入りオフセット印刷物からのＤＮＡの抽出）
得られた印刷物を５ｍｍφに打ち抜き、打ち抜いた印刷部分にＤＮＡ（Ｘ）を含んだ印刷画線が含まれた印刷用紙を、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５０μLを用いて超音波抽出を行って、抽出液（Ｘｐ）を得た。抽出液（Ｘｐ）を用いて、実施例１の用紙の場合と同様にハイブリダイゼーションプローブ法を用いてＰＴ−ＰＣＲを行った結果、いずれの検出波長においても、抽出液（Ｘｐ）では１４サイクル以降で蛍光を確認することができた。
【００５３】
本実施例２の方法を用いることで、目的とするＤＮＡの存在を確認すると共に塩基配列から特定の情報を読み出すことができた。本実施例２の方法を用いた一例としての作業時間は約６０分でＤＮＡの抽出及び確認を終了することが可能だった。それぞれの工程に要した時間の概略は、ＤＮＡ抽出が１０分、試薬調製及び準備が２０分、ＲＴ-ＰＣＲが３０分（４０サイクル）であった。
【００５４】
以上詳述したように、ハイブリダイゼーションプローブ法によってプローブ（Ａ）、プローブ（Ｂ）及びプローブ（Ｃ）に由来する波長の蛍光が検出された場合に、ＤＮＡの存在を確認でき、かつ組み込まれた塩基配列を読み取れたこととなる。
【００５５】
表１に、ＤＮＡの分析による本実施例と比較例による結果の比較をまとめたものを示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
以上の実施例は、プローブに相当する部分の塩基配列を異なるように設計しているが、同じ塩基配列情報を有するプローブを組み込んだＤＮＡを使用した場合には、鍵となる蛍光発光させる波長の強度差を利用すれば検出精度を上げ、識別をより高度なものとすることができる。
【００５８】
以上、本発明に係るＤＮＡ入り用紙、ＤＮＡインキを用いた印刷物を作製した実施例について説明したが、本発明のＤＮＡの使用物に係るＤＮＡ入り含有物を用いた用紙又は塗工物を使用した印刷物等も同様の操作で迅速に識別を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１における特定情報を有するＤＮＡ（Ｘ）を示す図である。
【図２】実施例１におけるＤＮＡ（Ｘ）の全体配列を示す図である。
【図３】実施例１における抽出液（Ｘｙ）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】比較例における特定情報を有する合成ＤＮＡ（Ｙ）を示す図である。
【図５】比較例におけるＤＮＡ（Ｙ）の全体配列を示す図である。
【図６】比較例１における、融解曲線を示す図である。
【図７】比較例１における、ゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図８】比較例１における、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置して設計されたことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されている請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記プローブの少なくとも１つには、特定の塩基配列に基づく情報が付与される請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡを添加物として含有する組成物。
【請求項５】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、染料又は／及び顔料と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡインキ。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡ塗工液。
【請求項７】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成る、ＤＮＡ含有物。
【請求項８】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、高分子とを含む混合物から成る、ＤＮＡ繊維。
【請求項９】
請求項５に記載のＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物。
【請求項１０】
請求項６に記載のＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙。
【請求項１１】
請求項７に記載のＤＮＡ含有物を含む用紙。
【請求項１２】
請求項８に記載のＤＮＡ繊維を含む混抄紙。
【請求項１３】
請求項９〜請求項１２のいずれかに記載の印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙に含有されるＤＮＡに組み込まれた塩基配列の識別方法であって、
前記印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分からＤＮＡを抽出する工程と、
前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法によって、特定の波長での蛍光発光の有無を検出する工程と、
前記検出した蛍光発光する特定の波長を、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光と比較する工程と、
前記抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別する工程とを備えたＤＮＡの異同識別方法。
【請求項１４】
請求項１３において、特定の波長における蛍光発光のサイクル数及び蛍光強度比を検出し、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別するＤＮＡの異同識別方法。
【請求項１】
一対のプライマー間に、前記プライマーとは異なる塩基配列を有する少なくとも２種類以上のプローブを配置して設計されたことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブ法によって蛍光を発するように設計されている請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記プローブの少なくとも１つには、特定の塩基配列に基づく情報が付与される請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡを添加物として含有する組成物。
【請求項５】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、染料又は／及び顔料と、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡインキ。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、バインダーとを含有することを特徴とするＤＮＡ塗工液。
【請求項７】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、水溶性高分子とを含む混合物を固化して得られた硬化物を含んで成る、ＤＮＡ含有物。
【請求項８】
請求項１、２又は３に記載のＤＮＡと、高分子とを含む混合物から成る、ＤＮＡ繊維。
【請求項９】
請求項５に記載のＤＮＡインキを用いて基材に印刷した印刷物。
【請求項１０】
請求項６に記載のＤＮＡ塗工液を塗工してなる塗工紙。
【請求項１１】
請求項７に記載のＤＮＡ含有物を含む用紙。
【請求項１２】
請求項８に記載のＤＮＡ繊維を含む混抄紙。
【請求項１３】
請求項９〜請求項１２のいずれかに記載の印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙に含有されるＤＮＡに組み込まれた塩基配列の識別方法であって、
前記印刷物、塗工紙、用紙又は混抄紙のＤＮＡを含む部分からＤＮＡを抽出する工程と、
前記抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブ法によって、特定の波長での蛍光発光の有無を検出する工程と、
前記検出した蛍光発光する特定の波長を、あらかじめ記録部に記録してある特定の波長における蛍光発光と比較する工程と、
前記抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別する工程とを備えたＤＮＡの異同識別方法。
【請求項１４】
請求項１３において、特定の波長における蛍光発光のサイクル数及び蛍光強度比を検出し、抽出したＤＮＡに目的とする塩基配列が含まれているか否かを識別するＤＮＡの異同識別方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−１８７９９１（Ｐ２００８−１８７９９１Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８９５２（Ｐ２００７−２８９５２）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（３０３０１７６７９）独立行政法人 国立印刷局 (471)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（３０３０１７６７９）独立行政法人 国立印刷局 (471)
【Ｆターム（参考）】
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