ＤＮＡ構築物、ならびにそれを用いた組換えｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞およびその製造方法
【課題】
ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞における、ｈｐｒｔ遺伝子組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物の提供。
【解決手段】
５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、選択マーカー遺伝子がｄｈｆｒ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物。
ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞における、ｈｐｒｔ遺伝子組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物の提供。
【解決手段】
５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、選択マーカー遺伝子がｄｈｆｒ遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞における、組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物、およびそれを用いた組換え細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産システムにおいて、原核生物や真核生物を宿主とした種々の方法が知られている。哺乳類動物細胞を宿主とした組換えタンパク質生産システムは、ヒトを始めとする高等動物由来のタンパク質に対し、糖鎖付加、フォールディング、リン酸化などの翻訳後修飾をより生体で作られるものと同じように施すことが可能である。
【０００３】
この翻訳後修飾は、タンパク質の本来有する生理活性を組換えタンパク質で再現するために必要なものであり、そのような生理活性が特に必要とされる医薬品などに用いられる組換えタンパク質の生産系には、哺乳類動物細胞を宿主としたタンパク質生産システムがよく用いられている。
【０００４】
現在、工業的生産に用いられている哺乳類動物細胞による主なタンパク質生産システムとしては、ＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムとＧＳ−ＮＳ０システムの二つが挙げられる。これらの生産システムでは、プラスミドベクターに含まれる選択マーカーと適切な薬剤選択プロセスを組み合わせることで、染色体に組み込まれたプラスミドベクターのコピー数が増幅したクローンを選択する。特にＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムは、選択薬剤メトトレキセートによる２段階の選抜工程により、発現レベルが数十倍に増大した細胞クローンを選択しうる。ＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムでは、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞の使用が必須である。
【０００５】
しかしながら、上記タンパク質生産システムには、単純に増幅されたプラスミドベクターのコピー数に比例して目的タンパク質の発現レベルが必ずしも増大しないこと、発現レベルが増大した細胞クローンを選択するまでにかかる時間が長いことなどの問題があることが知られている。さらに、発現レベルが増大した細胞クローンの選択後に、選択薬剤を含まない培地で選択細胞クローンの培養を継続することで、ほとんどのクローンにおいて発現レベルの減少または消失が確認されることが報告されている（特許文献１：特表２００２−５４１８５４公報、非特許文献１：Ｋｉｍ， Ｎ． Ｓ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，６０， ６７９−６８８．）。
【０００６】
また、上記のような哺乳類動物細胞による目的タンパク質生産システムは、一般的に、目的タンパク質遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、該ベクターが染色体へ組み込まれた細胞クローンを選択し、さらに該細胞クローンを適切な培養条件で培養することにより製造されている。
【０００７】
この染色体への組み込みはランダムな位置で起こりうる事象であり、得られる細胞クローンによって目的タンパク質の発現レベルが異なる。また細胞クローンによっては目的タンパク質を発現しないなどの問題がある。これについては、多数のクローンを組換えタンパク質の発現レベルにより選抜して、好ましいクローンを選択するという方法が採られている。しかしながら、このスクリーニングプロセスは非常に手間と労力を要する。このような手間を回避して迅速に好ましいクローンを選択するための種々のプロセスが報告されている。
【０００８】
例えば、マウス細胞の特定染色体位置にベクターを組み込む技術が開示されている（特許文献２：特表平９−５１０８６５公報）。免疫グロブリンγ２Ａ座と相同な塩基配列を有する配列を搭載したベクターにより、組換え細胞クローンのプール中に相同的組換え細胞クローンを生じさせる。標的となる染色体位置は、外来遺伝子が組み込まれた際にランダム組み込みと比較して高い発現レベルを与えうる位置としてあらかじめ同定されている。したがって、スクリーニング対象となる組換え細胞クローンのプール中に、高い発現レベルを有する相同的組換え細胞クローンが一定の頻度で存在することにより、発現レベルによるスクリーニングの際の労力を低減することが可能となる。
【０００９】
また、マーキングプラスミドの利用技術についても開示されている（特許文献３：特表２００１−５１６２２１公報）。あらかじめマーキングプラスミドをランダム組換えした細胞クローン集団の中からマーキングプラスミド内に存在するマーカー遺伝子の発現レベルが高いクローンを選択しておく。次に目的タンパク質遺伝子を有するプラスミドベクターとランダムに組み込まれたマーキングプラスミド配列との間で部位特異的組換えが引き起こされた細胞クローンを選択することにより、マーカー遺伝子の発現レベルを継承した目的タンパク質産生クローンが得られる。
【００１０】
上記技術は、発現レベルの高いクローンの選択に要する労力削減において有利である。しかしながら、例えば、組換え細胞を選択薬剤非添加で継続的に培養した際、得られたクローンが長期的に発現レベルを安定に維持しうるかについては依然として予測できない。
【００１１】
医薬タンパク質の工業的生産においては、タンパク質の発現が高いレベルでかつ安定に維持されることが重要である。特に発現レベルが安定に維持されることに関しては、コスト面のみならず、医薬タンパク質としての同一性および安全性を証明するためにも重要である。組換えタンパク質生産細胞を工業的スケールでの生産に用いるためには生産細胞クローンの培養スケールの拡大を図る必要がある。これには通常少なくとも樹立直後のクローンから約６０回の細胞分裂を経なければならないと見積られており（非特許文献２：Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ２３１−２３６．）、この発現レベルが一定に保たれていなければならない。
【００１２】
また、選択薬剤は培養コストを上昇させることのみならず、医薬品への異物混入リスク回避のために行われる精製プロセスのコストも上昇させる。したがって、選択薬剤を添加することなく発現レベルを安定に維持できる細胞クローンの作製技術の開発が強く望まれている。
【００１３】
上記のような事情があるにも関わらず、目的タンパク質発現レベルの安定性に関して充分な技術的検討が行なわれてきたとはいえない。これまでのところ、多くのタンパク質産生系の製造方法においては、長期培養時における成長速度ならびに生産性に関して蓄積されたデータを元に、経験的にクローン選択が行なわれている。しかしながら、この経験的な方法では発現レベルが安定な細胞クローンを実際に取得できるケースは稀である（非特許文献３：Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８１， ６３１−６３９．）。
【００１４】
近年、細胞ゲノム中の標的遺伝子座に目的タンパク質遺伝子を特異的な組み込み、長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を効率的に取得する手法が検討されている。
【００１５】
この標的遺伝子の一例としては、ｈｐｒｔ遺伝子が挙げられる。ｈｐｒｔ遺伝子は、ヒト等のＸ染色体長腕に存在するハウスキーピング遺伝子の一つとして知られており、ｈｐｒｔ遺伝子のノックアウト後の細胞は、薬剤６−Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｍｅ （６ＴＧ）に対して耐性を示すため、陰性選択が容易に行われる。
【００１６】
そして、本発明者らの一部は、ヒトの雄由来のＨＴ１０８０細胞株のｈｐｒｔ遺伝子座へ目的タンパク質遺伝子を組換えベクターにより導入し、選択薬剤非存在下で長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を取得したことを報告している（特許文献５：特開２００７−３２５５７１公報、非特許文献４：Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．，（２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２−１０６０）。この実施例においては、各々約１ｋｂｐの第一および第二の相同ＤＮＡ断片をホモロジーアームとして用いたところ、１０７細胞あたり１０クローン程度の組換え細胞を取得したことが報告されている。
【００１７】
また、ｈｐｒｔ遺伝子座へのターゲッティングの別の例としては、マウスＥＳ細胞に対してターゲッティングが行われたことが報告されている（特許文献６：特表平５−５０７８５３公報）。
【００１８】
しかしながら、同じ遺伝子座を標的としても、培養細胞の種類によっては、ジーンターゲッティング頻度が大きく異なる場合がある。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ Ｃ． Ｇ． Ｉｔｚｈａｋｉ Ｊ． Ｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１８， ２７３−２８１（非特許文献５）、および広島大学原爆放射線医科学研究所 年報第４４号 （２００３）（非特許文献６）では、ＥＳ細胞と、ＨＴ１０８０細胞とを比較すると、ジーンターゲッティング頻度が異なり、体細胞由来の培養細胞では、ジーンターゲッティング頻度が極めて低いことが報告されている。
【００１９】
一方、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ−ＭＴＸシステムによる抗体医薬タンパク質産生系の宿主細胞として利用されており、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞を用いて高レベルで安定なタンパク質生産システムを製造することが求められている。
【００２０】
しかしながら、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座に対してジーンターゲッティングが行われたことは報告されていない。ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞の親株である、ＣＨＯ細胞の一方の染色体上のａｐｒｔ遺伝子を欠損した特殊な細胞株を用いた研究例が存在するのみである（非特許文献８：ＰＮＡＳ，８８， ９４８８−９５０２（１９９１）、非特許文献９：Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９， ３６３−３７５、非特許文献１０：ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９））。これらの実施例では、一方の染色体上のみにａｐｒｔ遺伝子が存在する細胞株を宿主とし、２．６ｋｂｐ〜４ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片をホモロジーアームとして用いた結果、１０７細胞あたり数クローン〜１５クローン程度の相同組換え体を取得している。
【００２１】
また、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座のゲノムの配列はエキソン以外は何ら報告されていない。したがって、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座に対する特異的なジーンターゲッティングを行うためには、エキソン以外の塩基配列を解析し、取得しなければならないという問題がある。
【００２２】
さらに、ＣＨＯ細胞は、雌由来の細胞であることから、Ｘ染色体を２本有しており、そのｈｐｒｔ遺伝子座も２つ有している。そのため、両方の染色体のｈｐｒｔ遺伝子座に外来遺伝子が組み込まれることで、ＣＨＯ細胞は６ＴＧ等の選択薬剤耐性となる。しかしながら、このように、２本の染色体で組換えが生じる確率は、雄由来細胞の場合と比べて低くなるのが通常である。例えば、Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２−１０６０（非特許文献４）における雄由来ＨＴ１０８０細胞株のｈｐｒｔ遺伝子座への組換え効率を参考として染色体１本で組換えが生じる確率を１０−６と仮定すると、染色体２本で同時に生じる理論上の確率は１０−１２となる。
【００２３】
したがって、目的タンパク質遺伝子を発現する組換えＣＨＯ細胞を効率的に製造する技術の創出が依然として必要とされている。
【００２４】
また、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞は、ＤＮＡのｄｅ ｎｏｖｏ合成能を欠いた細胞株であり、培地中のヒポキサンチン、チミヂンをサルベージすることで自らのＤＮＡをまかなって生存している。サルベージ経路にはｈｐｒｔ遺伝子機能が必須であるため、ｈｐｒｔ遺伝子座へのベクター組み込みは致死となる（非特許文献７：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２０， ２１５−２２０（１９９９））。したがって、ｈｐｒｔ遺伝子座を外来遺伝子組み込みの標的部位として使用できないという問題がある。
【００２５】
ところで、陽性選択遺伝子と陰性選択遺伝子を融合させた二機能選択可能融合遺伝子を発現させる方法が公開されており、陽性選択遺伝子の例としてｄｈｆｒ遺伝子が、陰性選択遺伝子としてｈｐｒｔ遺伝子が例示されている（特許文献７：特表平６−５０４４３２）。
【００２６】
この方法を適応した場合、ｄｈｆｒ−ｈｐｒｔ融合遺伝子をベクターに搭載して細胞に導入することになる。ところが、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞では染色体上のｈｐｒｔが元来活性な状態にあるため、組換え細胞の選択はヒポキサンチン非要求性でしか行えない。ＣＨＯ細胞では、ランダムな挿入が相同組換えのおよそ４千倍の頻度で生じる（非特許文献１０：ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９））。したがって、染色体ｈｐｒｔ遺伝子座と相同性をもつホモロジーアームとともにｄｈｆｒ−ｈｐｒｔ融合遺伝子をｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入しても、ｈｐｒｔ遺伝子座への相同組換え細胞が取得できる見込みはほとんどない。
【００２７】
したがって、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座への目的タンパク質遺伝子組み込み細胞を選択可能にする技術の創出が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】特表２００２−５４１８５４公報
【特許文献２】特表平９−５１０８６５公報
【特許文献３】特表２００１−５１６２２１公報
【特許文献４】ＷＯ２００４／０２２７４１公報
【特許文献５】特開２００７−３２５５７１公報
【特許文献６】特表平５−５０７８５３公報
【特許文献７】特表平６−５０４４３２公報
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｋｉｍ， Ｎ． Ｓ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ６０， ６７９−６８８．
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ２３１−２３６．
【非特許文献３】Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ， ８１， ６３１−６３９．
【非特許文献４】Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ９５， １０５２−１０６０
【非特許文献５】Ｐｏｒｔｅｒ Ｃ． Ｇ． Ｉｔｚｈａｋｉ Ｊ． Ｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１８， ２７３−２８１
【非特許文献６】広島大学原爆放射線医科学研究所 年報第４４号 （２００３）
【非特許文献７】Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２０， ２１５−２２０（１９９９）
【非特許文献８】ＰＮＡＳ，８８， ９４８８−９５０２（１９９１）
【非特許文献９】Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９， ３６３−３７５
【非特許文献１０】ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９）
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、今般、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞におけるｈｐｒｔ遺伝子の相同ＤＮＡ断片と選択マーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｒｆ）を有する特定のＤＮＡ構築物により目的タンパク質遺伝子をｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入したところ、組換え細胞を顕著な高頻度で製造しうることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００３１】
したがって、本発明は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯにおける組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物およびそれを用いた組換え細胞製造方法の提供をその目的とする。
【００３２】
そして、本発明によるＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、選択マーカー遺伝子および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）であることを特徴とするものである。
【００３３】
また、本発明によるｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯにおける組換え細胞の製造方法は、上記ＤＮＡ構築物を含んでなるベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入することを含んでなる。
【００３４】
本発明によれば、目的タンパク質遺伝子を発現する組換えＣＨＯ細胞を顕著な高頻度で取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１で用いられたｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞ｈｐｒｔ相同組換え用ベクターの模式図である。（Ａ）はｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子に由来する相同ＤＮＡ断片を有し、選択マーカー遺伝子としてｄｈｆｒ遺伝子を有するベクターである。（Ｂ）はｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子に由来する相同ＤＮＡ断片を有し、選択マーカー遺伝子としてｄｈｆｒ遺伝子を有し、抗体発現カセットを含むベクターである。
【図２】（Ａ）は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子領域、相同組換え用ベクター、および実施例３において組換え細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）は、組換えｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞中の野生型ｈｐｒｔ遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式図である。左図は、野生型のｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示し、中央図は、ヘテロ接合型の組換え細胞におけるＰＣＲを示し、右図は、ホモ接合型の組換え細胞におけるＰＣＲを示す。（Ｃ）は、実施例３のＰＣＲの結果を示す。
【図３】ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座の模式図である。番号１から９まではｈｐｒｔ遺伝子のエクソン１〜９を示し、各エクソン間の配列は、イントロン１〜８を示す。
【図４】（Ａ）は、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子領域、相同組換え用ベクター、および実施例４において組換え細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｃ）は、実施例４のＰＣＲの結果を示す。
【図５】は、実施例５で作製したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンによって抗体を生産した結果を示す。
【図６】は、実施例５で作製したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの抗体比生産性の長期安定性試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＤＮＡ構築物
本発明によるＤＮＡ構築物は、ＣＨＯ細胞ゲノム中のｈｐｒｔ遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、各々が１ｋｂｐ以上の鎖長を有する、二つの相同ＤＮＡ断片を含んでなることを一つの特徴とする。上記ＤＮＡ構築物によれば、ＣＨＯ細胞が２本のＸ染色体を有するにもかかわらず、顕著な高頻度で組換えＣＨＯ細胞を取得しうるのは意外な事実である。本発明によるＤＮＡ構築物によれば、後述の実施例３に示される通り、２ｘ１０−６あたり４個の組換え細胞が得られている。この結果は、本願出願日当時の技術状況において、染色体２本のｈｐｒｔ遺伝子座において同時に組換えが生じる理論上の確率が１０−１２と予測されていたことを勘案すると、驚くべき事実といえる。
【００３７】
また、本発明によるＤＮＡ構築物は、陽性選択マーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を含んでなることを一つの特徴とする。ｄｈｆｒ遺伝子は、相同組換えを妨げない限り、ＤＮＡ構築物中に適宜配置することができる。ｄｈｆｒ遺伝子を用いることにより、ｄｅ ｎｏｖｏ合成能とｈｐｒｔ遺伝子の不活化が合わさることによる致死性を回避することが可能となる。さらに、組換えＣＨＯ細胞の選択において、ヒポキサンチン、チミジン非要求性を指標とした陽性選択と、ｈｐｒｔ遺伝子の不活化による陰性選択の両者を適用でき、偽陽性クローンを大幅に低減する上で有利である。
【００３８】
本発明によるＤＮＡ構築物は、ｈｐｒｔ遺伝子座の一部を相同組換えの標的領域とするものである。ｈｐｒｔ遺伝子座の一部を標的領域とすることは、目的タンパク質遺伝子を高レベルで安定に発現する上で有利である。また、かかる標的領域に、ＤＮＡ構築物を組み込むことは、ｈｐｒｔ遺伝子の転写・発現を阻害してｈｐｒｔ遺伝子の機能を不活化し、６−ＴＧ等を用いる陰性選択によって効率的に組換え細胞を取得する上でも好ましい。
【００３９】
また、本発明の標的領域は、目的タンパク質遺伝子の発現を妨げない限り、ｈｐｒｔ遺伝子座中において適宜決定してよい。しかしながら、相同組換えに必要な相同ＤＮＡ断片の鎖長等を勘案すれば、上記標的領域は、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域が好ましい。上記イントロンは、本発明者らにより今般、塩基配列が決定されたものであり、具体的には、配列番号３５〜４２のいずれかで表される塩基配列を有する、後述する図３のイントロン１〜８が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の標的領域は、上記イントロンと隣接するエクソンの全部または一部を含んでいてもよい。かかるエクソンとしては、具体的には、図３のエクソン１〜９が挙げられ、これらの塩基配列は、例えば、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等の公知のデータベースにアクセスすることにより取得することができる。
【００４１】
この組み込みの態様としては、（１）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが分断されるタイプ、（２）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが１つ以上欠失するタイプ、（３）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプ、（４）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが分断されるタイプ、（５）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが１つ以上欠失するタイプ、（６）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプが挙げられる。
【００４２】
また、本発明のＤＮＡ断片は、相同組換えに必要な鎖長を勘案すると、上述の通り、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域と相同性を有するものが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片は、配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなるものとされる。
【００４３】
また、上記部分配列の鎖長の下限は１ｂｐであり、その上限は配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列の鎖長の範囲内において、適宜調節することができる。
【００４４】
また、上記相同ＤＮＡ断片と、ｈｐｒｔ遺伝子座との相同性は、相同組換えの効率を勘案して適宜決定されるが、好ましくは９９．０％以上、より好ましくは９９．９％以上、さらに好ましくは１００％である。かかる相同性は、例えば、ＤＮＡシーケンサー等を用いて解析することにより適宜決定することができる。
【００４５】
また、上記相同ＤＮＡ断片は１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものとされており、かかる鎖長は、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組換えを達成する上で好ましい。さらに、上記相同ＤＮＡ断片の鎖長は、組換え効率の向上等を勘案して適宜調整してよく、より好ましくは２．５ｋｂｐ以上である。また、上記相同ＤＮＡ断片の鎖長の上限は、目的タンパク質遺伝子の効率的な導入を妨げないという観点から、好ましくは７．５ｋｂｐ以下であり、最も好ましくは５ｋｂｐ以下である。相同ＤＮＡ断片の鎖長の範囲は上記の上限値、下限値を適宜組み合わせることができる。具体的には好ましくは１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、最も好ましくは２．５ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下である。鎖長がこの範囲であれば、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組換えを達成しながら、組換え細胞の取得頻度を良好に保つことが可能となる。
【００４６】
また、本発明によるＤＮＡ構築物において、目的タンパク質遺伝子は、医薬として有用なタンパク質をコードしていることが好ましい。目的タンパク質遺伝子は、ｃＤＮＡに由来する配列であっても、ゲノムＤＮＡに由来する天然イントロンを含む構造遺伝子であっても、好適に利用可能である。具体的には、目的タンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、調節タンパク質、レセプター等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、エリスロポエチン、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子または顆粒球コロニー活性化因子等である。
【００４７】
また、上記目的タンパク質遺伝子は、プロモーター配列や転写終結シグナル配列等の発現に必要な要素を含む発現ユニットとしてｈｐｒｔ遺伝子座に組み込まれることが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、目的タンパク質遺伝子は、少なくともプロモーター配列および転写終結シグナル配列を含んだ発現ユニットとしてＤＮＡ構築物中に配置される。もっとも、発現に必要な要素としてＣＨＯ細胞の内在性のものを用いるように構成してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００４８】
また、上記プロモーターや転写終結シグナルは、目的タンパク質遺伝子の種類、性質等に応じて適宜決定してよく、かかるプロモーター配列の好適な例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナル配列の好適な例としては、ＢＧＨポリＡシグナル配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列等が挙げられる。
【００４９】
また、プロモーター配列、転写終結シグナル配列の他の発現に必要な要素としては、例えば、目的遺伝子を効率的に発現させるための調節エレメント（例えば、エンハンサー、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列、ＬｏｘＰ配列およびＦＲＴ配列等の組換え酵素認識配列）等を適宜選択して用いてよい。調節エレメントはその性質に応じて、発現ユニットにおける適切な位置に配置することが可能である。これら発現に必要な要素は、目的タンパク質の生産性等を勘案して適宜選択される。
【００５０】
ベクター
本発明によるＤＮＡ構築物は、ベクターに組み込んでｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムに導入することができる。かかるベクターシステムとしては、相同組換え反応によりＤＮＡ構築物を細胞ゲノムに組み込みうる限り特に限定されないが、好ましくは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクター等が挙げられる。
【００５１】
本発明によるＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターは、制限酵素切断反応およびライゲーション反応を組み合わせて好適に構築される。例えば、各構成ユニットの両末端に制限酵素の認識配列を含有させ、該認識配列用の制限酵素で切断反応を行い、不要なＤＮＡ配列（大腸菌内での操作用配列等）をゲル切り出し等の処理によって除去し、得られたユニットのライゲーション反応を行うことにより、ＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターを構築しうる。
【００５２】
ライゲーション反応により構築したベクターＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出等により精製し、ベクターの種類等を勘案して選択した大腸菌、酵母等の宿主細胞において増殖させることができる。
【００５３】
本発明によるベクターは、ＣＨＥＦ１αプロモーターを、目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結して搭載していることが好ましい。ＣＨＯ ｈｐｒｔ遺伝子座に組込んだ外来遺伝子の発現はプロモーターの不活化によって生じる。目的タンパク質遺伝子をＣＨＯ内在性のＣＨＥＦ１αプロモーターで発現させるベクター構造にすることで、ＣＨＯ
ｈｐｒｔ遺伝子座での安定発現が可能となる。
【００５４】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株
本発明の対象となる細胞株はｄｈｆｒ遺伝子を欠損したチャイニーズハムスターの細胞株であり、ＤＧ４４、ＤＸＢ１１などが挙げられる。
【００５５】
組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞／製造方法
本発明によるｄｈｆｒ欠損ＣＨＯの組換え細胞は、上記ベクターをｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入することにより好適に製造することができる。したがって、本発明によるｄｈｆｒ欠損ＣＨＯの組換え細胞は、ｈｐｒｔ座に外来性の目的タンパク質遺伝子が組み込まれてなる。また、本発明の好ましい態様によれば、組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞はｈｐｒｔ遺伝子の機能が不活化している。かかる組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞は、抗体等の目的タンパク質を高レベルで安定に産生する上で有利である。
【００５６】
ベクターの導入
上記ベクターの導入方法としては、一般的に用いられる方法が好適に利用できる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法などが挙げられる。ここで、ベクターが環状である場合、公知の方法により線状化して細胞に導入されてもよい。
【００５７】
また、ベクターや目的タンパク質の性質によっては、組換え細胞の取得効率等を勘案して、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムやＦｌｐ／ＦＲＴシステムなどのような、組換え酵素を利用した部位特異的導入システムも適宜適用してよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５８】
細胞株の選択
また、本発明による製造方法にあっては、上記導入後、組換え細胞の選択を行うことが好ましい。選択工程は、ｈｐｒｔ遺伝子の不活化に基づく陰性選択により行うことができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を陽性マーカー遺伝子として、組換え細胞に導入している場合には、陰性選択と、ヒポキサンチン、チミジン非要求性による陽性選択とを組み合わせて高い精度で細胞選択を行うことが可能となる。
【００５９】
また、上記選択方法の他、プロモータートラップ法やポリＡトラップ法なども適宜組み合わせて利用してよい。
【００６０】
また、本発明による製造方法にあっては、組換え細胞を取得後、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ 培地などに馴化させることにより無血清下での培養も可能である。かかる馴化条件は、組換え細胞の状態に応じて適宜決定することができる。
【００６１】
目的タンパク質の製造方法
また、本発明の別の態様によれば、上記組換え細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法が提供される。上記方法によれば、目的タンパク質を効率的かつ安定に取得することができる。
【００６２】
上記培養工程における培地としては、組換え細胞の状態に応じて公知の培地を適宜選択してよいが、無血清培地が好ましい。また、上記培地は、培養コストおよび精製コストを勘案すれば、選択薬剤を添加しないものが好ましい。上記培地の好適な例としては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ培地等が挙げられる。
【００６３】
上記培養方法としては、バッチカルチャー法、フェッド−バッチカルチャー法、還流培養法など公知の方法が適用可能である。
【００６４】
なお、組換え細胞の製造に使用される種々の手法のさらなる詳細は、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）に記載されており、上記文献の全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６６】
なお、以下の実験において、制限酵素による反応、ＰＣＲ反応、ライゲーション反応等の各反応条件は、メーカーの推奨する反応条件、あるいは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ に記載の方法に従って設定した。また、得られた種々のプラスミドベクターＤＮＡについては、ＤＮＡシーケンサー（３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡ配列を決定した。また、以下に示すホモロジーアーム１および２はそれぞれ、本発明の第一および第二の相同ＤＮＡ断片に対応している。
【００６７】
実施例１： ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換えベクターの構築
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターの構築
以下に記載の手法により、図１（Ａ）で表されるベクター（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクター）を構築した。
【００６８】
インビトロジェン社から入手したｄｈｆｒ欠損チャイニーズハムスター卵母細胞株ＤＧ４４細胞株をＡＭＥＭ培地（組成；Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、５％［ｖ／ｖ］ＦＢＳ、１× ＧｌｕｔａＭＡＸ（インビトロジェン）、１× ＨＴサプリメント（インビトロジェン））を用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）で培養した。得られた培養液を遠心分離し、ＤＧ４４細胞ペレットを得た。このペレットをＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）により処理し、ゲノムＤＮＡを得た。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２、ＴＯＹＯＢＯ）によって、ＤＧ４４細胞のｈｐｒｔ遺伝子座のＤＮＡ断片を２つ得た。プライマー配列は以下に示す通りである。
【００６９】
ホモロジーアーム１センスプライマー：（配列番号１）
５’−ＴＣＧＣＧＡｇｔｃｔｇｔｇｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｔｇａｔａｇｇｃ−３’
ホモロジーアーム１アンチセンスプライマー：（配列番号２）
５’−ＡＣＧＣＧＴｔｇａｔａａａａｔｃｔａｃａｇｔｃａｔｇｇｇ−３’
ホモロジーアーム２センスプライマー：（配列番号３）
５’−ＧＧＡＴＣＣｇａｃｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｇｔｇｔａ−３’
ホモロジーアーム２アンチセンスプライマー：（配列番号４）
５’−ＴＣＧＣＧＡｔｇａａｇｇｔｔａｔａｇａｇｃａｔａｇｇｇｇａｃｃ−３’
【００７０】
上記ＰＣＲ反応においては、ホモロジーアーム１センスプライマーの５’末端には、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識サイトを付加した。同様に、ホモロジーアーム１アンチセンスプライマーの５’末端にはＭｌｕ Ｉの認識サイト、ホモロジーアーム２センスプライマーの５’末端にはＢａｍ ＨＩの認識サイト、ホモロジーアーム２アンチセンスプライマーの５’末端にはＮｒｕ Ｉの認識サイトをそれぞれ付加した。
【００７１】
ｐＱＢＩ２５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、大腸菌内での複製起点であるｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列を、ＰＣＲ反応によりクローニングした。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマー、アンチセンスプライマーの５’末端に、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識サイトをそれぞれ付加した。
【００７２】
Ｅｃｏｌｉセンスプライマー：（配列番号５）
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣｃａｔｇｔｇａｇｃａａａａｇｇｃｃａ−３’
Ｅｃｏｌｉアンチセンスプライマープライマー：（配列番号６）
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇ−３’
【００７３】
次に、リンカーｓオリゴとリンカーａオリゴをアニールさせたＤＮＡリンカーを準備した。
【００７４】
リンカーｓオリゴ：（配列番号７）
５’−ＣＧＣＧＴａｔｃＴＣＴＡＧＡａｔａＡＴＣＧＡＴａｇａＡＡＧＣＴＴａｃａＧ−３’
リンカーａオリゴ：（配列番号８）
５’− ＧＡＴＣＣｔｇｔＡＡＧＣＴＴｔｃｔＡＴＣＧＡＴｔａｔＴＣＴＡＧＡｇａｔＡ−３’
【００７５】
ホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２、およびｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列をそれぞれ、ＰＣＲ反応によりクローニングした。これら３つのＤＮＡ配列を制限酵素Ｎｒｕ Ｉ、Ｍｌｕ ＩおよびＢａｍ ＨＩにより切断し、前記ＤＮＡリンカーとともにライゲーション反応を行うことによりｐＨＡ１２プラスミドベクターを得た。
【００７６】
ｄｈｆｒ発現カセットの作製
また、ｐＱＢＩ１５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、ＳＶ４０プロモーター断片を、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端に制限酵素Ｘｂａ Ｉの認識サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にＰｃｉ Ｉの認識サイトを付加した。
【００７７】
ＳＶ４０センスプライマー：（配列番号９）
５’−ＴＣＴＡＧＡｃｔｔｃｔｇａｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｃ−３’
ＳＶ４０アンチセンスプライマー：（配列番号１０）
５’−ＡＣＡＴＧＴｃｇａａａｃｇａｔｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔ−３’
【００７８】
次に、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒプラスミド（ＡＴＣＣ、３７１４６）のＤＮＡから、ｄｈｆｒ断片をＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端に制限酵素Ｎｃｏ Ｉの認識サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にポリＡシグナル配列およびＣｌａ Ｉの認識サイトを付加した。
【００７９】
ｄｈｆｒセンスプライマー：（配列番号１１）
５’−ＣＣａｔｇｇｔｔｃｇａｃｃａｔｔｇａａｃｔｇ−３’
ｄｈｆｒアンチセンスプライマー：（配列番号１２）
５’−ＡＴＣＧＡＴｔＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴｔｔａｇｔｃｔｔｔｃｔｔｃｔｃｇｔａｇａｃｔ−３’
【００８０】
ＰＣＲ増幅したＳＶ４０プロモーター断片をＰｃｉ Ｉで、ｄｈｆｒ断片をＮｃｏ Ｉでそれぞれ切断し、ライゲーション反応を行うことにより連結し、ｄｈｆｒ遺伝子カセットを得た。
【００８１】
次に、ｐＨＡ１２プラスミドを制限酵素Ｘｂａ Ｉ、Ｃｌａ Ｉで切断し、前記ｄｈｆｒ遺伝子カセットを挿入し、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを得た。
【００８２】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターの構築
以下に記載の手法により、抗体遺伝子をｈｐｒｔ遺伝子座に対して組み込むため、抗体遺伝子を含む、図１（Ｂ）で表されるベクター（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体ベクター）を構築した。
【００８３】
抗体重鎖発現カセットの構築
重鎖可変領域を保持したプラスミド（「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＲＮａｓｅ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ３Ａ２１」：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｖｏｌ．８２， Ｎｏ．３， ｐｐ． ３１２−３１４，１９９９）を鋳型とし、可変領域をＩＧＨ−３Ａ２１ｓ、ＩＧＨ−３Ａ２１ａ１プライマーセットでＰＣＲ増幅し、可変領域断片を得た。
【００８４】
ＩＧＨ−３Ａ２１ｓプライマー：（配列番号１３）
５’− ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＧＧ −３’
ＩＧＨ−３Ａ２１ａ１プライマー：（配列番号１４）
５’− ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴ −３’
【００８５】
ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＨ−Ｃｓ、ＩＧＨ−ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、定常領域断片を得た。
【００８６】
ＩＧＨ−Ｃｓプライマー：（配列番号１５）
５’− ＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴ −３’
ＩＧＨ−Ｃａプライマー：（配列番号１６）
５’− ＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧ −３’
【００８７】
次に、ＩＧＨ−ＬＳ、ＩＧＨ−Ｖａプライマーセットで、可変領域断片を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナル付加可変領域断片を得た。
【００８８】
ＩＧＨ−ＬＳプライマー：（配列番号１７）
５’−ＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧ −３’
ＩＧＨ−Ｖａプライマー：（配列番号１８）
５’− ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ −３’
【００８９】
分泌シグナル付加可変領域断片および定常領域断片を鋳型とし、ＩＧＨ−Ｖｓ、ＩＧＨ−ＣａプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行い、両配列を連結させた抗体重鎖配列を得た。
【００９０】
ＩＧＨ−Ｖｓプライマー：（配列番号１９）
５’− ＴＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ −３’
【００９１】
次に、ＤＧ４４ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＥＦ１ａＰ−ＭｌｕＩ−Ｆ／ＥＦ１ａＰ−ＸｂａＩ−ＲプライマーセットでＣＨＥＦ１αプロモーターを増幅した。
【００９２】
ＥＦ１ａＰ−ＭｌｕＩ−Ｆプライマー：（配列番号２０）
５’−ＡＧＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡ−３’
ＥＦ１ａＰ−ＸｂａＩ−Ｒプライマー：（配列番号２１）
５’−ＧＡＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡ−３’
【００９３】
次に、得られたＣＨＥＦ１αプロモーター、抗体重鎖配列およびＳＶ４０ポリＡを連結し、両末端にＭｌｕ Ｉ認識配列を付加することにより、抗体重鎖発現カセットを得た。
【００９４】
抗体軽鎖発現カセットの構築
同様に、軽鎖可変領域を保持したプラスミドを鋳型とし、可変領域をＩＧＬ−３Ａ２１ｓ１、ＩＧＬ−３Ａ２１ａ１プライマーセットでＰＣＲ増幅し、可変領域断片を得た。
【００９５】
ＩＧＬ−３Ａ２１ｓ１プライマー：（配列番号２２）
５’−ＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’
ＩＧＬ−３Ａ２１ａ１プライマー：（配列番号２３）
５’−ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣ−３’
【００９６】
ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮで抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＬ−Ｃｓ、ＩＧＬ−ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、定常領域断片を得た。
【００９７】
ＩＧＬ−Ｃｓプライマー：（配列番号２４）
５’−ＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴ−３’
ＩＧＬ−Ｃａプライマー：（配列番号２５）
５’−ＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴ−３’
【００９８】
ＩＧＬ−ＬＳ、ＩＧＬ−３Ａ２１ａプライマーセットで、ＤＮＡ配列９を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナル付加可変領域断片を得た。
【００９９】
ＩＧＬ−ＬＳプライマー：（配列番号２６）
５’−ＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡ −３’
ＩＧＬ−３Ａ２１ａプライマー：（配列番号２７）
５’−ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣ−３’
【０１００】
分泌シグナル付加可変領域断片および定常領域断片を鋳型とし、ＩＧＬ−Ｖｓ、ＩＧＬ−ＣａプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行って両産物を連結させた抗体軽鎖配列を得た。
【０１０１】
ＩＧＬ−Ｖｓプライマー：（配列番号２８）
５’− ＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡ −３’
【０１０２】
次に、ＣＨＥＦ１αプロモーター、抗体軽鎖配列およびＳＶ４０ポリＡを連結し、両末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列を付加することにより、抗体軽鎖発現カセットを得た。
【０１０３】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを制限酵素Ｍｌｕ Ｉで切断して抗体重鎖発現カセットを挿入し、次いで制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して抗体軽鎖カセットを挿入し、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターを得た。
【０１０４】
実施例２：細胞へのベクターの導入
ベクター線状化
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクター、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターは、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、Ｎｒｕ Ｉにて切断した。２ｇ／Ｌの濃度になるように滅菌水に溶解し、以下のトランスフェクション実験に用いた。
【０１０５】
トランスフェクションおよびスクリーニング
ＤＧ４４細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｍａｘａ）で１×１０６細胞に調製し、線状化したプラスミドベクター２μｇと混合した。次に、得られた混合液を用いて、ＮｕｃｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（ａｍａｘａ）を用い、プログラムＵ−０２３で電圧印加した。トランスフェクションは各ベクターにつき、２回施行した。トランスフェクトした細胞は、１００ 細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに播種し、インキュベーター中３７ ℃、５ ％ ＣＯ２にて培養した（培地： Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）に５％ ＦＢＳ、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（インビトロジェン社）、１ｘ ＨＴサプリメント（インビトロジェン社）を添加したもの）
【０１０６】
トランスフェクション後、ＨＴサプリメントを除去し、６−ＴＧ（最終濃度； ５０μＭ）（和光純薬工業）を添加した培地に交換し、培養を継続した。培養後、全ウェルを確認し、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性コロニーを単離した。
【０１０７】
結果、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターによって得られたＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性クローンは、２×１０６細胞あたり４クローンであった。
【０１０８】
実施例３：ゲノムＰＣＲによる解析
ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ）を用い、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のクローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的ｈｐｒｔ遺伝子座への位置特異的な組換えの確認を行った。
【０１０９】
図２（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。ｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ中のホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２およびこれに挟まれたｄｈｆｒ遺伝子発現カセットは相同組換えにより組込まれる。
【０１１０】
ホモロジーアーム１と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３６４０ｂｐのＤＮＡ）および、ホモロジーアーム２と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３２８５ｂｐのＤＮＡ）は、相同組換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組換えの指標となる。
【０１１１】
よって、ホモロジーアーム１と標的領域との相同組換えの指標として、図２（Ａ）に示す３６４０ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＣＨＡ１ｓｅｑ−ｓ１１／ｄｈｆｒ−ｓｅｑ−ａ１によるＰＣＲ反応により検出した。一方、ホモロジーアームと標的ｈｐｒｔ遺伝子座との相同組換えの指標として、図２（Ａ）に示す３２８５ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＮｃｏＩ−ｄｈｆｒ−ｓ／ ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ４によるＰＣＲ反応により検出した。
【０１１２】
ＣＨＡ１ｓｅｑ−ｓ１１プライマー：（配列番号２９）
５’−ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧ−３’
ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ４プライマー：（配列番号３０）
５’−ＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣ−３’
ｄｈｆｒ−ｓｅｑ−ａ１プライマー：（配列番号３１）
５’−ｃｔｃａｇｇａａｔｇｇａｇａａｃｃａｇｇ−３’
ＮｃｏＩ−ｄｈｆｒ−ｓプライマー：（配列番号３２）
５’−ｔｔａａＣＣａｔｇｇｔｔｃｇａｃｃａｔｔｇａａｃｔｇ−３’
【０１１３】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図２（Ｃ）に示される通りであった。図２（Ｃ）において、取得したクローンにおいてのみ、３６４０ｂｐおよび３２８５ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組換え反応が確認された。
【０１１４】
次に、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のクローンのゲノムＤＮＡについて、以下に示すＰＣＲ反応により、野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存しているのかを確認した。
【０１１５】
図２（Ｂ）は、野生型ｈｐｒｔ遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式である。まず、図２（Ｂ）左図は２本のＸ染色体を有する野生型ＤＧ４４細胞におけるＰＣＲを示す。ｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されている。ベクター非導入の野生型細胞の場合、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）は、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、これを指標として野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存していることを確認することができる。
【０１１６】
図２（Ｂ）の中央図は、１本のＸ染色体のｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組込まれたヘテロ接合型の相同組換え細胞におけるＰＣＲを示す。一方の染色体では、標的領域中にベクターのＤＮＡは相同組換えによりに組込まれているため、３８６７ｂｐのＰＣＲ増幅産物が生じる。一方、もう１本の染色体は、標的領域を保持しており、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）もまた、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存していることを確認できる。
【０１１７】
一方、図２（Ｂ）の右図に示されるとおり、両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型の相同組換え細胞においては、組換えＤＮＡに由来する３８６７ｂｐのＰＣＲ増幅産物のみが発現し、野生型ｈｐｒｔ遺伝子に由来するＤＮＡ（２３２２ｂｐ）の増幅は生じない。
【０１１８】
以上の理解から、図２（Ｂ）に示す２３２２ｂｐのＤＮＡを上記指標として設定し、このＤＮＡを検出するため、プライマーＣＨＰＲＴｓ／ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ１を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１１９】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図２（Ｃ）に示される通りであった。
【０１２０】
ＣＨＰＲＴｓプライマー：（配列番号３３）
５’−ＴＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＡＧＧＣ−３’
ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ１プライマー：（配列番号３４）
５’−ＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣ−３’
【０１２１】
図２（Ｃ）において、野生型細胞からは２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、野生型ｈｐｒｔ遺伝子の存在が確認された。一方、組換えクローンにおいては２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認されず、３８６７ｂｐの産物のみが確認されたことから、組換え細胞は両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型であった。
【０１２２】
この結果から、本発明によるベクターを用いると、２本のＸ染色体の両ｈｐｒｔ遺伝子座に目的タンパク質遺伝子が組込まれた組換え細胞クローンが高頻度で取得されていることが確認された。
【０１２３】
実施例４：ＤＸＢ１１（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ）ｈｐｒｔ組換えクローン作製
ＤＸＢ１１へのベクター導入およびスクリーニング
実施例１で作製した、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを、実施例２と同様に精製および線状化し、３×１０６個のＤＸＢ１１細胞にトランスフェクションし、スクリーニングを実施した。
【０１２４】
結果、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性のＤＸＢ１１クローンを１クローン取得した。
【０１２５】
ゲノムＰＣＲによる、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子座へのベクター組込みの確認
実施例３と同様に、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のＤＸＢ１１クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的ｈｐｒｔ遺伝子座への位置特異的な組換えの確認を行った。
【０１２６】
図４（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。
【０１２７】
実施例３でのＤＧ４４の場合と全く同様に、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ中のホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２およびこれに挟まれたｄｈｆｒ遺伝子発現カセットは相同組換えにより組込まれる。
【０１２８】
ホモロジーアーム１と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３６４０ｂｐのＤＮＡ）および、ホモロジーアーム２と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３２８５ｂｐのＤＮＡ）は、相同組換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組換えの指標となる。これらのＤＮＡは、取得したＤＸＢ１１クローンのゲノムＤＮＡを鋳型とした、実施例３と同一のプライマーセットによるＰＣＲ反応によって検出した。
【０１２９】
ＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した結果は、図４（Ｂ）に示される通りであり、取得したＤＸＢ１１クローンにおいて３６４０ｂｐおよび３２８５ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組換え反応が確認された。
【０１３０】
以上の結果から、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組み込まれたクローンが取得できたことが確認できた。
【０１３１】
実施例５：ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローン作製および抗体生産
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローン作製
実施例１で作製した、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターを、実施例２と同様に精製および線状化し、３×１０６個のＤＧ４４細胞にトランスフェクションし、スクリーニングを実施した。
【０１３２】
結果、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターによって、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性クローンを１クローン取得した。
【０１３３】
取得クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施例２と同様に実施し、ｈｐｒｔ遺伝子座にｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターが組み込まれていることを確認した。
【０１３４】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの無血清浮遊馴化
１００ｍｍディッシュに捲き込んだＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、７０％コンフルエントまで培養した後、トリプシン処理によって剥離した。
【０１３５】
１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によって細胞を沈殿させ、上澄みを破棄した後、完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（インビトロジェン社）に１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（インビトロジェン社）を添加したもの）で３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整してフラスコに移し、インキュベーター中３７℃、８％ＣＯ２にて、１２１ｒｐｍで振とう培養した。
【０１３６】
細胞密度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを超えた時点で、完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯで３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈継代し、培養を継続した。
【０１３７】
上記継代を３回繰り返した時点で、無血清浮遊培養への馴化を完了した。
【０１３８】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンによる抗体生産
無血清浮遊培養に馴化したＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によってペレット化し、新鮮な完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地に懸濁した。この細胞懸濁液を完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地で希釈し、６０ｍｌの３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調整し、フラスコに移した。
【０１３９】
インキュベーター中３７℃、８％ＣＯ２にて、１２１ｒｐｍで振とう培養し、２４時間ごとに細胞密度を測定して記録した。また、１．５ｍｌの培地を回収し、遠心した上澄みを−８０℃で保存した。
【０１４０】
１８日間のサンプリングを実施後、回収しておいた培地サンプル回収した培地中のＩｇＧ量を、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＩＡ Ｋｉｔ （ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）（宝酒造製）により、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。
【０１４１】
その結果、図５に示すように、培地上澄１Lあたり３５ｍｇのＩｇＧ生産が認められた。
【０１４２】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの発現の長期安定性確認
無血清浮遊培養に馴化したＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、１４回継代培養して維持した。継代操作は１週間あたり２回実施した。その後、細胞集団の一部を、新鮮な完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地６０ｍｌ中に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、フラスコに移し、培養を開始した。
【０１４３】
培養開始後、７日目に培地中の細胞密度を測定した後、培地上澄１．５ｍｌを採取し、遠心分離した上澄みをー８０℃保存した。２４時間後、細胞密度を測定し、培地上澄１．５ｍｌを同様に保存した。
【０１４４】
保存しておいた培地上澄サンプルを溶解し、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＩＡ ＫｉｔでＩｇＧ量を定量し、細胞密度を用いて比生産性（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。また、無血清浮遊培養に馴化した直後のＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンについても、同様に比生産性を測定した。
【０１４５】
１４回の継代操作後のクローンの比生産性は、図６に示すように全く低下していなかった。これは、実生産で最低限要求される５０日間（約７週間）の安定性を満足する、好ましい結果と言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞における、組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物、およびそれを用いた組換え細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産システムにおいて、原核生物や真核生物を宿主とした種々の方法が知られている。哺乳類動物細胞を宿主とした組換えタンパク質生産システムは、ヒトを始めとする高等動物由来のタンパク質に対し、糖鎖付加、フォールディング、リン酸化などの翻訳後修飾をより生体で作られるものと同じように施すことが可能である。
【０００３】
この翻訳後修飾は、タンパク質の本来有する生理活性を組換えタンパク質で再現するために必要なものであり、そのような生理活性が特に必要とされる医薬品などに用いられる組換えタンパク質の生産系には、哺乳類動物細胞を宿主としたタンパク質生産システムがよく用いられている。
【０００４】
現在、工業的生産に用いられている哺乳類動物細胞による主なタンパク質生産システムとしては、ＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムとＧＳ−ＮＳ０システムの二つが挙げられる。これらの生産システムでは、プラスミドベクターに含まれる選択マーカーと適切な薬剤選択プロセスを組み合わせることで、染色体に組み込まれたプラスミドベクターのコピー数が増幅したクローンを選択する。特にＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムは、選択薬剤メトトレキセートによる２段階の選抜工程により、発現レベルが数十倍に増大した細胞クローンを選択しうる。ＣＨＯ−ＤＨＦＲシステムでは、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞の使用が必須である。
【０００５】
しかしながら、上記タンパク質生産システムには、単純に増幅されたプラスミドベクターのコピー数に比例して目的タンパク質の発現レベルが必ずしも増大しないこと、発現レベルが増大した細胞クローンを選択するまでにかかる時間が長いことなどの問題があることが知られている。さらに、発現レベルが増大した細胞クローンの選択後に、選択薬剤を含まない培地で選択細胞クローンの培養を継続することで、ほとんどのクローンにおいて発現レベルの減少または消失が確認されることが報告されている（特許文献１：特表２００２−５４１８５４公報、非特許文献１：Ｋｉｍ， Ｎ． Ｓ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，６０， ６７９−６８８．）。
【０００６】
また、上記のような哺乳類動物細胞による目的タンパク質生産システムは、一般的に、目的タンパク質遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、該ベクターが染色体へ組み込まれた細胞クローンを選択し、さらに該細胞クローンを適切な培養条件で培養することにより製造されている。
【０００７】
この染色体への組み込みはランダムな位置で起こりうる事象であり、得られる細胞クローンによって目的タンパク質の発現レベルが異なる。また細胞クローンによっては目的タンパク質を発現しないなどの問題がある。これについては、多数のクローンを組換えタンパク質の発現レベルにより選抜して、好ましいクローンを選択するという方法が採られている。しかしながら、このスクリーニングプロセスは非常に手間と労力を要する。このような手間を回避して迅速に好ましいクローンを選択するための種々のプロセスが報告されている。
【０００８】
例えば、マウス細胞の特定染色体位置にベクターを組み込む技術が開示されている（特許文献２：特表平９−５１０８６５公報）。免疫グロブリンγ２Ａ座と相同な塩基配列を有する配列を搭載したベクターにより、組換え細胞クローンのプール中に相同的組換え細胞クローンを生じさせる。標的となる染色体位置は、外来遺伝子が組み込まれた際にランダム組み込みと比較して高い発現レベルを与えうる位置としてあらかじめ同定されている。したがって、スクリーニング対象となる組換え細胞クローンのプール中に、高い発現レベルを有する相同的組換え細胞クローンが一定の頻度で存在することにより、発現レベルによるスクリーニングの際の労力を低減することが可能となる。
【０００９】
また、マーキングプラスミドの利用技術についても開示されている（特許文献３：特表２００１−５１６２２１公報）。あらかじめマーキングプラスミドをランダム組換えした細胞クローン集団の中からマーキングプラスミド内に存在するマーカー遺伝子の発現レベルが高いクローンを選択しておく。次に目的タンパク質遺伝子を有するプラスミドベクターとランダムに組み込まれたマーキングプラスミド配列との間で部位特異的組換えが引き起こされた細胞クローンを選択することにより、マーカー遺伝子の発現レベルを継承した目的タンパク質産生クローンが得られる。
【００１０】
上記技術は、発現レベルの高いクローンの選択に要する労力削減において有利である。しかしながら、例えば、組換え細胞を選択薬剤非添加で継続的に培養した際、得られたクローンが長期的に発現レベルを安定に維持しうるかについては依然として予測できない。
【００１１】
医薬タンパク質の工業的生産においては、タンパク質の発現が高いレベルでかつ安定に維持されることが重要である。特に発現レベルが安定に維持されることに関しては、コスト面のみならず、医薬タンパク質としての同一性および安全性を証明するためにも重要である。組換えタンパク質生産細胞を工業的スケールでの生産に用いるためには生産細胞クローンの培養スケールの拡大を図る必要がある。これには通常少なくとも樹立直後のクローンから約６０回の細胞分裂を経なければならないと見積られており（非特許文献２：Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ２３１−２３６．）、この発現レベルが一定に保たれていなければならない。
【００１２】
また、選択薬剤は培養コストを上昇させることのみならず、医薬品への異物混入リスク回避のために行われる精製プロセスのコストも上昇させる。したがって、選択薬剤を添加することなく発現レベルを安定に維持できる細胞クローンの作製技術の開発が強く望まれている。
【００１３】
上記のような事情があるにも関わらず、目的タンパク質発現レベルの安定性に関して充分な技術的検討が行なわれてきたとはいえない。これまでのところ、多くのタンパク質産生系の製造方法においては、長期培養時における成長速度ならびに生産性に関して蓄積されたデータを元に、経験的にクローン選択が行なわれている。しかしながら、この経験的な方法では発現レベルが安定な細胞クローンを実際に取得できるケースは稀である（非特許文献３：Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８１， ６３１−６３９．）。
【００１４】
近年、細胞ゲノム中の標的遺伝子座に目的タンパク質遺伝子を特異的な組み込み、長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を効率的に取得する手法が検討されている。
【００１５】
この標的遺伝子の一例としては、ｈｐｒｔ遺伝子が挙げられる。ｈｐｒｔ遺伝子は、ヒト等のＸ染色体長腕に存在するハウスキーピング遺伝子の一つとして知られており、ｈｐｒｔ遺伝子のノックアウト後の細胞は、薬剤６−Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｍｅ （６ＴＧ）に対して耐性を示すため、陰性選択が容易に行われる。
【００１６】
そして、本発明者らの一部は、ヒトの雄由来のＨＴ１０８０細胞株のｈｐｒｔ遺伝子座へ目的タンパク質遺伝子を組換えベクターにより導入し、選択薬剤非存在下で長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を取得したことを報告している（特許文献５：特開２００７−３２５５７１公報、非特許文献４：Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．，（２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２−１０６０）。この実施例においては、各々約１ｋｂｐの第一および第二の相同ＤＮＡ断片をホモロジーアームとして用いたところ、１０７細胞あたり１０クローン程度の組換え細胞を取得したことが報告されている。
【００１７】
また、ｈｐｒｔ遺伝子座へのターゲッティングの別の例としては、マウスＥＳ細胞に対してターゲッティングが行われたことが報告されている（特許文献６：特表平５−５０７８５３公報）。
【００１８】
しかしながら、同じ遺伝子座を標的としても、培養細胞の種類によっては、ジーンターゲッティング頻度が大きく異なる場合がある。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ Ｃ． Ｇ． Ｉｔｚｈａｋｉ Ｊ． Ｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１８， ２７３−２８１（非特許文献５）、および広島大学原爆放射線医科学研究所 年報第４４号 （２００３）（非特許文献６）では、ＥＳ細胞と、ＨＴ１０８０細胞とを比較すると、ジーンターゲッティング頻度が異なり、体細胞由来の培養細胞では、ジーンターゲッティング頻度が極めて低いことが報告されている。
【００１９】
一方、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ−ＭＴＸシステムによる抗体医薬タンパク質産生系の宿主細胞として利用されており、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞を用いて高レベルで安定なタンパク質生産システムを製造することが求められている。
【００２０】
しかしながら、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座に対してジーンターゲッティングが行われたことは報告されていない。ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞の親株である、ＣＨＯ細胞の一方の染色体上のａｐｒｔ遺伝子を欠損した特殊な細胞株を用いた研究例が存在するのみである（非特許文献８：ＰＮＡＳ，８８， ９４８８−９５０２（１９９１）、非特許文献９：Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９， ３６３−３７５、非特許文献１０：ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９））。これらの実施例では、一方の染色体上のみにａｐｒｔ遺伝子が存在する細胞株を宿主とし、２．６ｋｂｐ〜４ｋｂｐの相同ＤＮＡ断片をホモロジーアームとして用いた結果、１０７細胞あたり数クローン〜１５クローン程度の相同組換え体を取得している。
【００２１】
また、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座のゲノムの配列はエキソン以外は何ら報告されていない。したがって、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座に対する特異的なジーンターゲッティングを行うためには、エキソン以外の塩基配列を解析し、取得しなければならないという問題がある。
【００２２】
さらに、ＣＨＯ細胞は、雌由来の細胞であることから、Ｘ染色体を２本有しており、そのｈｐｒｔ遺伝子座も２つ有している。そのため、両方の染色体のｈｐｒｔ遺伝子座に外来遺伝子が組み込まれることで、ＣＨＯ細胞は６ＴＧ等の選択薬剤耐性となる。しかしながら、このように、２本の染色体で組換えが生じる確率は、雄由来細胞の場合と比べて低くなるのが通常である。例えば、Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２−１０６０（非特許文献４）における雄由来ＨＴ１０８０細胞株のｈｐｒｔ遺伝子座への組換え効率を参考として染色体１本で組換えが生じる確率を１０−６と仮定すると、染色体２本で同時に生じる理論上の確率は１０−１２となる。
【００２３】
したがって、目的タンパク質遺伝子を発現する組換えＣＨＯ細胞を効率的に製造する技術の創出が依然として必要とされている。
【００２４】
また、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞は、ＤＮＡのｄｅ ｎｏｖｏ合成能を欠いた細胞株であり、培地中のヒポキサンチン、チミヂンをサルベージすることで自らのＤＮＡをまかなって生存している。サルベージ経路にはｈｐｒｔ遺伝子機能が必須であるため、ｈｐｒｔ遺伝子座へのベクター組み込みは致死となる（非特許文献７：Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２０， ２１５−２２０（１９９９））。したがって、ｈｐｒｔ遺伝子座を外来遺伝子組み込みの標的部位として使用できないという問題がある。
【００２５】
ところで、陽性選択遺伝子と陰性選択遺伝子を融合させた二機能選択可能融合遺伝子を発現させる方法が公開されており、陽性選択遺伝子の例としてｄｈｆｒ遺伝子が、陰性選択遺伝子としてｈｐｒｔ遺伝子が例示されている（特許文献７：特表平６−５０４４３２）。
【００２６】
この方法を適応した場合、ｄｈｆｒ−ｈｐｒｔ融合遺伝子をベクターに搭載して細胞に導入することになる。ところが、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞では染色体上のｈｐｒｔが元来活性な状態にあるため、組換え細胞の選択はヒポキサンチン非要求性でしか行えない。ＣＨＯ細胞では、ランダムな挿入が相同組換えのおよそ４千倍の頻度で生じる（非特許文献１０：ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９））。したがって、染色体ｈｐｒｔ遺伝子座と相同性をもつホモロジーアームとともにｄｈｆｒ−ｈｐｒｔ融合遺伝子をｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入しても、ｈｐｒｔ遺伝子座への相同組換え細胞が取得できる見込みはほとんどない。
【００２７】
したがって、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座への目的タンパク質遺伝子組み込み細胞を選択可能にする技術の創出が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】特表２００２−５４１８５４公報
【特許文献２】特表平９−５１０８６５公報
【特許文献３】特表２００１−５１６２２１公報
【特許文献４】ＷＯ２００４／０２２７４１公報
【特許文献５】特開２００７−３２５５７１公報
【特許文献６】特表平５−５０７８５３公報
【特許文献７】特表平６−５０４４３２公報
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｋｉｍ， Ｎ． Ｓ． （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ６０， ６７９−６８８．
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ２３１−２３６．
【非特許文献３】Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ， ８１， ６３１−６３９．
【非特許文献４】Ｋｏｙａｍａ Ｙ Ｅｔ Ａｌ．， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ９５， １０５２−１０６０
【非特許文献５】Ｐｏｒｔｅｒ Ｃ． Ｇ． Ｉｔｚｈａｋｉ Ｊ． Ｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１８， ２７３−２８１
【非特許文献６】広島大学原爆放射線医科学研究所 年報第４４号 （２００３）
【非特許文献７】Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２０， ２１５−２２０（１９９９）
【非特許文献８】ＰＮＡＳ，８８， ９４８８−９５０２（１９９１）
【非特許文献９】Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９， ３６３−３７５
【非特許文献１０】ＰＮＡＳ，８６，４５７４−４５７８（１９８９）
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、今般、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞におけるｈｐｒｔ遺伝子の相同ＤＮＡ断片と選択マーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｒｆ）を有する特定のＤＮＡ構築物により目的タンパク質遺伝子をｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入したところ、組換え細胞を顕著な高頻度で製造しうることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００３１】
したがって、本発明は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯにおける組換え細胞の効率的な製造に有用なＤＮＡ構築物およびそれを用いた組換え細胞製造方法の提供をその目的とする。
【００３２】
そして、本発明によるＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、選択マーカー遺伝子および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）であることを特徴とするものである。
【００３３】
また、本発明によるｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯにおける組換え細胞の製造方法は、上記ＤＮＡ構築物を含んでなるベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入することを含んでなる。
【００３４】
本発明によれば、目的タンパク質遺伝子を発現する組換えＣＨＯ細胞を顕著な高頻度で取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１で用いられたｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞ｈｐｒｔ相同組換え用ベクターの模式図である。（Ａ）はｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子に由来する相同ＤＮＡ断片を有し、選択マーカー遺伝子としてｄｈｆｒ遺伝子を有するベクターである。（Ｂ）はｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子に由来する相同ＤＮＡ断片を有し、選択マーカー遺伝子としてｄｈｆｒ遺伝子を有し、抗体発現カセットを含むベクターである。
【図２】（Ａ）は、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子領域、相同組換え用ベクター、および実施例３において組換え細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｂ）は、組換えｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞中の野生型ｈｐｒｔ遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式図である。左図は、野生型のｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞におけるＰＣＲを示し、中央図は、ヘテロ接合型の組換え細胞におけるＰＣＲを示し、右図は、ホモ接合型の組換え細胞におけるＰＣＲを示す。（Ｃ）は、実施例３のＰＣＲの結果を示す。
【図３】ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座の模式図である。番号１から９まではｈｐｒｔ遺伝子のエクソン１〜９を示し、各エクソン間の配列は、イントロン１〜８を示す。
【図４】（Ａ）は、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子領域、相同組換え用ベクター、および実施例４において組換え細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。（Ｃ）は、実施例４のＰＣＲの結果を示す。
【図５】は、実施例５で作製したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンによって抗体を生産した結果を示す。
【図６】は、実施例５で作製したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの抗体比生産性の長期安定性試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＤＮＡ構築物
本発明によるＤＮＡ構築物は、ＣＨＯ細胞ゲノム中のｈｐｒｔ遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、各々が１ｋｂｐ以上の鎖長を有する、二つの相同ＤＮＡ断片を含んでなることを一つの特徴とする。上記ＤＮＡ構築物によれば、ＣＨＯ細胞が２本のＸ染色体を有するにもかかわらず、顕著な高頻度で組換えＣＨＯ細胞を取得しうるのは意外な事実である。本発明によるＤＮＡ構築物によれば、後述の実施例３に示される通り、２ｘ１０−６あたり４個の組換え細胞が得られている。この結果は、本願出願日当時の技術状況において、染色体２本のｈｐｒｔ遺伝子座において同時に組換えが生じる理論上の確率が１０−１２と予測されていたことを勘案すると、驚くべき事実といえる。
【００３７】
また、本発明によるＤＮＡ構築物は、陽性選択マーカー遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を含んでなることを一つの特徴とする。ｄｈｆｒ遺伝子は、相同組換えを妨げない限り、ＤＮＡ構築物中に適宜配置することができる。ｄｈｆｒ遺伝子を用いることにより、ｄｅ ｎｏｖｏ合成能とｈｐｒｔ遺伝子の不活化が合わさることによる致死性を回避することが可能となる。さらに、組換えＣＨＯ細胞の選択において、ヒポキサンチン、チミジン非要求性を指標とした陽性選択と、ｈｐｒｔ遺伝子の不活化による陰性選択の両者を適用でき、偽陽性クローンを大幅に低減する上で有利である。
【００３８】
本発明によるＤＮＡ構築物は、ｈｐｒｔ遺伝子座の一部を相同組換えの標的領域とするものである。ｈｐｒｔ遺伝子座の一部を標的領域とすることは、目的タンパク質遺伝子を高レベルで安定に発現する上で有利である。また、かかる標的領域に、ＤＮＡ構築物を組み込むことは、ｈｐｒｔ遺伝子の転写・発現を阻害してｈｐｒｔ遺伝子の機能を不活化し、６−ＴＧ等を用いる陰性選択によって効率的に組換え細胞を取得する上でも好ましい。
【００３９】
また、本発明の標的領域は、目的タンパク質遺伝子の発現を妨げない限り、ｈｐｒｔ遺伝子座中において適宜決定してよい。しかしながら、相同組換えに必要な相同ＤＮＡ断片の鎖長等を勘案すれば、上記標的領域は、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域が好ましい。上記イントロンは、本発明者らにより今般、塩基配列が決定されたものであり、具体的には、配列番号３５〜４２のいずれかで表される塩基配列を有する、後述する図３のイントロン１〜８が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の標的領域は、上記イントロンと隣接するエクソンの全部または一部を含んでいてもよい。かかるエクソンとしては、具体的には、図３のエクソン１〜９が挙げられ、これらの塩基配列は、例えば、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等の公知のデータベースにアクセスすることにより取得することができる。
【００４１】
この組み込みの態様としては、（１）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが分断されるタイプ、（２）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが１つ以上欠失するタイプ、（３）ＤＮＡ構築物の組み込みによってエクソンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプ、（４）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが分断されるタイプ、（５）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが１つ以上欠失するタイプ、（６）ＤＮＡ構築物の組み込みによってイントロンが２個に増幅し、その間にＤＮＡ構築物が挿入されるタイプが挙げられる。
【００４２】
また、本発明のＤＮＡ断片は、相同組換えに必要な鎖長を勘案すると、上述の通り、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含む領域と相同性を有するものが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片は、配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなるものとされる。
【００４３】
また、上記部分配列の鎖長の下限は１ｂｐであり、その上限は配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列の鎖長の範囲内において、適宜調節することができる。
【００４４】
また、上記相同ＤＮＡ断片と、ｈｐｒｔ遺伝子座との相同性は、相同組換えの効率を勘案して適宜決定されるが、好ましくは９９．０％以上、より好ましくは９９．９％以上、さらに好ましくは１００％である。かかる相同性は、例えば、ＤＮＡシーケンサー等を用いて解析することにより適宜決定することができる。
【００４５】
また、上記相同ＤＮＡ断片は１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものとされており、かかる鎖長は、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組換えを達成する上で好ましい。さらに、上記相同ＤＮＡ断片の鎖長は、組換え効率の向上等を勘案して適宜調整してよく、より好ましくは２．５ｋｂｐ以上である。また、上記相同ＤＮＡ断片の鎖長の上限は、目的タンパク質遺伝子の効率的な導入を妨げないという観点から、好ましくは７．５ｋｂｐ以下であり、最も好ましくは５ｋｂｐ以下である。相同ＤＮＡ断片の鎖長の範囲は上記の上限値、下限値を適宜組み合わせることができる。具体的には好ましくは１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、最も好ましくは２．５ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下である。鎖長がこの範囲であれば、ＤＮＡ構築物の顕著な高頻度での相同組換えを達成しながら、組換え細胞の取得頻度を良好に保つことが可能となる。
【００４６】
また、本発明によるＤＮＡ構築物において、目的タンパク質遺伝子は、医薬として有用なタンパク質をコードしていることが好ましい。目的タンパク質遺伝子は、ｃＤＮＡに由来する配列であっても、ゲノムＤＮＡに由来する天然イントロンを含む構造遺伝子であっても、好適に利用可能である。具体的には、目的タンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、調節タンパク質、レセプター等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、エリスロポエチン、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子または顆粒球コロニー活性化因子等である。
【００４７】
また、上記目的タンパク質遺伝子は、プロモーター配列や転写終結シグナル配列等の発現に必要な要素を含む発現ユニットとしてｈｐｒｔ遺伝子座に組み込まれることが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、目的タンパク質遺伝子は、少なくともプロモーター配列および転写終結シグナル配列を含んだ発現ユニットとしてＤＮＡ構築物中に配置される。もっとも、発現に必要な要素としてＣＨＯ細胞の内在性のものを用いるように構成してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００４８】
また、上記プロモーターや転写終結シグナルは、目的タンパク質遺伝子の種類、性質等に応じて適宜決定してよく、かかるプロモーター配列の好適な例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナル配列の好適な例としては、ＢＧＨポリＡシグナル配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列等が挙げられる。
【００４９】
また、プロモーター配列、転写終結シグナル配列の他の発現に必要な要素としては、例えば、目的遺伝子を効率的に発現させるための調節エレメント（例えば、エンハンサー、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列、ＬｏｘＰ配列およびＦＲＴ配列等の組換え酵素認識配列）等を適宜選択して用いてよい。調節エレメントはその性質に応じて、発現ユニットにおける適切な位置に配置することが可能である。これら発現に必要な要素は、目的タンパク質の生産性等を勘案して適宜選択される。
【００５０】
ベクター
本発明によるＤＮＡ構築物は、ベクターに組み込んでｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムに導入することができる。かかるベクターシステムとしては、相同組換え反応によりＤＮＡ構築物を細胞ゲノムに組み込みうる限り特に限定されないが、好ましくは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクター等が挙げられる。
【００５１】
本発明によるＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターは、制限酵素切断反応およびライゲーション反応を組み合わせて好適に構築される。例えば、各構成ユニットの両末端に制限酵素の認識配列を含有させ、該認識配列用の制限酵素で切断反応を行い、不要なＤＮＡ配列（大腸菌内での操作用配列等）をゲル切り出し等の処理によって除去し、得られたユニットのライゲーション反応を行うことにより、ＤＮＡ構築物およびこれを含むベクターを構築しうる。
【００５２】
ライゲーション反応により構築したベクターＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出等により精製し、ベクターの種類等を勘案して選択した大腸菌、酵母等の宿主細胞において増殖させることができる。
【００５３】
本発明によるベクターは、ＣＨＥＦ１αプロモーターを、目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結して搭載していることが好ましい。ＣＨＯ ｈｐｒｔ遺伝子座に組込んだ外来遺伝子の発現はプロモーターの不活化によって生じる。目的タンパク質遺伝子をＣＨＯ内在性のＣＨＥＦ１αプロモーターで発現させるベクター構造にすることで、ＣＨＯ
ｈｐｒｔ遺伝子座での安定発現が可能となる。
【００５４】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株
本発明の対象となる細胞株はｄｈｆｒ遺伝子を欠損したチャイニーズハムスターの細胞株であり、ＤＧ４４、ＤＸＢ１１などが挙げられる。
【００５５】
組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞／製造方法
本発明によるｄｈｆｒ欠損ＣＨＯの組換え細胞は、上記ベクターをｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入することにより好適に製造することができる。したがって、本発明によるｄｈｆｒ欠損ＣＨＯの組換え細胞は、ｈｐｒｔ座に外来性の目的タンパク質遺伝子が組み込まれてなる。また、本発明の好ましい態様によれば、組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞はｈｐｒｔ遺伝子の機能が不活化している。かかる組換えｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞は、抗体等の目的タンパク質を高レベルで安定に産生する上で有利である。
【００５６】
ベクターの導入
上記ベクターの導入方法としては、一般的に用いられる方法が好適に利用できる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法などが挙げられる。ここで、ベクターが環状である場合、公知の方法により線状化して細胞に導入されてもよい。
【００５７】
また、ベクターや目的タンパク質の性質によっては、組換え細胞の取得効率等を勘案して、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムやＦｌｐ／ＦＲＴシステムなどのような、組換え酵素を利用した部位特異的導入システムも適宜適用してよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５８】
細胞株の選択
また、本発明による製造方法にあっては、上記導入後、組換え細胞の選択を行うことが好ましい。選択工程は、ｈｐｒｔ遺伝子の不活化に基づく陰性選択により行うことができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を陽性マーカー遺伝子として、組換え細胞に導入している場合には、陰性選択と、ヒポキサンチン、チミジン非要求性による陽性選択とを組み合わせて高い精度で細胞選択を行うことが可能となる。
【００５９】
また、上記選択方法の他、プロモータートラップ法やポリＡトラップ法なども適宜組み合わせて利用してよい。
【００６０】
また、本発明による製造方法にあっては、組換え細胞を取得後、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ 培地などに馴化させることにより無血清下での培養も可能である。かかる馴化条件は、組換え細胞の状態に応じて適宜決定することができる。
【００６１】
目的タンパク質の製造方法
また、本発明の別の態様によれば、上記組換え細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法が提供される。上記方法によれば、目的タンパク質を効率的かつ安定に取得することができる。
【００６２】
上記培養工程における培地としては、組換え細胞の状態に応じて公知の培地を適宜選択してよいが、無血清培地が好ましい。また、上記培地は、培養コストおよび精製コストを勘案すれば、選択薬剤を添加しないものが好ましい。上記培地の好適な例としては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ培地等が挙げられる。
【００６３】
上記培養方法としては、バッチカルチャー法、フェッド−バッチカルチャー法、還流培養法など公知の方法が適用可能である。
【００６４】
なお、組換え細胞の製造に使用される種々の手法のさらなる詳細は、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）に記載されており、上記文献の全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６６】
なお、以下の実験において、制限酵素による反応、ＰＣＲ反応、ライゲーション反応等の各反応条件は、メーカーの推奨する反応条件、あるいは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ に記載の方法に従って設定した。また、得られた種々のプラスミドベクターＤＮＡについては、ＤＮＡシーケンサー（３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡ配列を決定した。また、以下に示すホモロジーアーム１および２はそれぞれ、本発明の第一および第二の相同ＤＮＡ断片に対応している。
【００６７】
実施例１： ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換えベクターの構築
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターの構築
以下に記載の手法により、図１（Ａ）で表されるベクター（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクター）を構築した。
【００６８】
インビトロジェン社から入手したｄｈｆｒ欠損チャイニーズハムスター卵母細胞株ＤＧ４４細胞株をＡＭＥＭ培地（組成；Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、５％［ｖ／ｖ］ＦＢＳ、１× ＧｌｕｔａＭＡＸ（インビトロジェン）、１× ＨＴサプリメント（インビトロジェン））を用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）で培養した。得られた培養液を遠心分離し、ＤＧ４４細胞ペレットを得た。このペレットをＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）により処理し、ゲノムＤＮＡを得た。次に、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２、ＴＯＹＯＢＯ）によって、ＤＧ４４細胞のｈｐｒｔ遺伝子座のＤＮＡ断片を２つ得た。プライマー配列は以下に示す通りである。
【００６９】
ホモロジーアーム１センスプライマー：（配列番号１）
５’−ＴＣＧＣＧＡｇｔｃｔｇｔｇｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｔｇａｔａｇｇｃ−３’
ホモロジーアーム１アンチセンスプライマー：（配列番号２）
５’−ＡＣＧＣＧＴｔｇａｔａａａａｔｃｔａｃａｇｔｃａｔｇｇｇ−３’
ホモロジーアーム２センスプライマー：（配列番号３）
５’−ＧＧＡＴＣＣｇａｃｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｇｔｇｔａ−３’
ホモロジーアーム２アンチセンスプライマー：（配列番号４）
５’−ＴＣＧＣＧＡｔｇａａｇｇｔｔａｔａｇａｇｃａｔａｇｇｇｇａｃｃ−３’
【００７０】
上記ＰＣＲ反応においては、ホモロジーアーム１センスプライマーの５’末端には、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識サイトを付加した。同様に、ホモロジーアーム１アンチセンスプライマーの５’末端にはＭｌｕ Ｉの認識サイト、ホモロジーアーム２センスプライマーの５’末端にはＢａｍ ＨＩの認識サイト、ホモロジーアーム２アンチセンスプライマーの５’末端にはＮｒｕ Ｉの認識サイトをそれぞれ付加した。
【００７１】
ｐＱＢＩ２５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、大腸菌内での複製起点であるｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列を、ＰＣＲ反応によりクローニングした。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマー、アンチセンスプライマーの５’末端に、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識サイトをそれぞれ付加した。
【００７２】
Ｅｃｏｌｉセンスプライマー：（配列番号５）
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣｃａｔｇｔｇａｇｃａａａａｇｇｃｃａ−３’
Ｅｃｏｌｉアンチセンスプライマープライマー：（配列番号６）
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇ−３’
【００７３】
次に、リンカーｓオリゴとリンカーａオリゴをアニールさせたＤＮＡリンカーを準備した。
【００７４】
リンカーｓオリゴ：（配列番号７）
５’−ＣＧＣＧＴａｔｃＴＣＴＡＧＡａｔａＡＴＣＧＡＴａｇａＡＡＧＣＴＴａｃａＧ−３’
リンカーａオリゴ：（配列番号８）
５’− ＧＡＴＣＣｔｇｔＡＡＧＣＴＴｔｃｔＡＴＣＧＡＴｔａｔＴＣＴＡＧＡｇａｔＡ−３’
【００７５】
ホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２、およびｏｒｉ配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列をそれぞれ、ＰＣＲ反応によりクローニングした。これら３つのＤＮＡ配列を制限酵素Ｎｒｕ Ｉ、Ｍｌｕ ＩおよびＢａｍ ＨＩにより切断し、前記ＤＮＡリンカーとともにライゲーション反応を行うことによりｐＨＡ１２プラスミドベクターを得た。
【００７６】
ｄｈｆｒ発現カセットの作製
また、ｐＱＢＩ１５プラスミドベクター（和光純薬株式会社）のＤＮＡから、ＳＶ４０プロモーター断片を、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端に制限酵素Ｘｂａ Ｉの認識サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にＰｃｉ Ｉの認識サイトを付加した。
【００７７】
ＳＶ４０センスプライマー：（配列番号９）
５’−ＴＣＴＡＧＡｃｔｔｃｔｇａｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｃ−３’
ＳＶ４０アンチセンスプライマー：（配列番号１０）
５’−ＡＣＡＴＧＴｃｇａａａｃｇａｔｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔ−３’
【００７８】
次に、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒプラスミド（ＡＴＣＣ、３７１４６）のＤＮＡから、ｄｈｆｒ断片をＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。このＰＣＲ反応において、センスプライマーの５’末端に制限酵素Ｎｃｏ Ｉの認識サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にポリＡシグナル配列およびＣｌａ Ｉの認識サイトを付加した。
【００７９】
ｄｈｆｒセンスプライマー：（配列番号１１）
５’−ＣＣａｔｇｇｔｔｃｇａｃｃａｔｔｇａａｃｔｇ−３’
ｄｈｆｒアンチセンスプライマー：（配列番号１２）
５’−ＡＴＣＧＡＴｔＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴｔｔａｇｔｃｔｔｔｃｔｔｃｔｃｇｔａｇａｃｔ−３’
【００８０】
ＰＣＲ増幅したＳＶ４０プロモーター断片をＰｃｉ Ｉで、ｄｈｆｒ断片をＮｃｏ Ｉでそれぞれ切断し、ライゲーション反応を行うことにより連結し、ｄｈｆｒ遺伝子カセットを得た。
【００８１】
次に、ｐＨＡ１２プラスミドを制限酵素Ｘｂａ Ｉ、Ｃｌａ Ｉで切断し、前記ｄｈｆｒ遺伝子カセットを挿入し、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを得た。
【００８２】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターの構築
以下に記載の手法により、抗体遺伝子をｈｐｒｔ遺伝子座に対して組み込むため、抗体遺伝子を含む、図１（Ｂ）で表されるベクター（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体ベクター）を構築した。
【００８３】
抗体重鎖発現カセットの構築
重鎖可変領域を保持したプラスミド（「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＲＮａｓｅ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ３Ａ２１」：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｖｏｌ．８２， Ｎｏ．３， ｐｐ． ３１２−３１４，１９９９）を鋳型とし、可変領域をＩＧＨ−３Ａ２１ｓ、ＩＧＨ−３Ａ２１ａ１プライマーセットでＰＣＲ増幅し、可変領域断片を得た。
【００８４】
ＩＧＨ−３Ａ２１ｓプライマー：（配列番号１３）
５’− ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＧＧ −３’
ＩＧＨ−３Ａ２１ａ１プライマー：（配列番号１４）
５’− ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴ −３’
【００８５】
ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＨ−Ｃｓ、ＩＧＨ−ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、定常領域断片を得た。
【００８６】
ＩＧＨ−Ｃｓプライマー：（配列番号１５）
５’− ＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴ −３’
ＩＧＨ−Ｃａプライマー：（配列番号１６）
５’− ＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧ −３’
【００８７】
次に、ＩＧＨ−ＬＳ、ＩＧＨ−Ｖａプライマーセットで、可変領域断片を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナル付加可変領域断片を得た。
【００８８】
ＩＧＨ−ＬＳプライマー：（配列番号１７）
５’−ＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧ −３’
ＩＧＨ−Ｖａプライマー：（配列番号１８）
５’− ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ −３’
【００８９】
分泌シグナル付加可変領域断片および定常領域断片を鋳型とし、ＩＧＨ−Ｖｓ、ＩＧＨ−ＣａプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行い、両配列を連結させた抗体重鎖配列を得た。
【００９０】
ＩＧＨ−Ｖｓプライマー：（配列番号１９）
５’− ＴＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ −３’
【００９１】
次に、ＤＧ４４ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＥＦ１ａＰ−ＭｌｕＩ−Ｆ／ＥＦ１ａＰ−ＸｂａＩ−ＲプライマーセットでＣＨＥＦ１αプロモーターを増幅した。
【００９２】
ＥＦ１ａＰ−ＭｌｕＩ−Ｆプライマー：（配列番号２０）
５’−ＡＧＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡ−３’
ＥＦ１ａＰ−ＸｂａＩ−Ｒプライマー：（配列番号２１）
５’−ＧＡＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡ−３’
【００９３】
次に、得られたＣＨＥＦ１αプロモーター、抗体重鎖配列およびＳＶ４０ポリＡを連結し、両末端にＭｌｕ Ｉ認識配列を付加することにより、抗体重鎖発現カセットを得た。
【００９４】
抗体軽鎖発現カセットの構築
同様に、軽鎖可変領域を保持したプラスミドを鋳型とし、可変領域をＩＧＬ−３Ａ２１ｓ１、ＩＧＬ−３Ａ２１ａ１プライマーセットでＰＣＲ増幅し、可変領域断片を得た。
【００９５】
ＩＧＬ−３Ａ２１ｓ１プライマー：（配列番号２２）
５’−ＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’
ＩＧＬ−３Ａ２１ａ１プライマー：（配列番号２３）
５’−ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣ−３’
【００９６】
ＲＰＭＩ８２２６培養細胞からＩＳＯＧＥＮで抽出したＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｍＲＮＡを鋳型として定常領域をＩＧＬ−Ｃｓ、ＩＧＬ−ＣａプライマーセットでＰＣＲ増幅し、定常領域断片を得た。
【００９７】
ＩＧＬ−Ｃｓプライマー：（配列番号２４）
５’−ＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴ−３’
ＩＧＬ−Ｃａプライマー：（配列番号２５）
５’−ＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴ−３’
【００９８】
ＩＧＬ−ＬＳ、ＩＧＬ−３Ａ２１ａプライマーセットで、ＤＮＡ配列９を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、分泌シグナル付加可変領域断片を得た。
【００９９】
ＩＧＬ−ＬＳプライマー：（配列番号２６）
５’−ＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡ −３’
ＩＧＬ−３Ａ２１ａプライマー：（配列番号２７）
５’−ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣ−３’
【０１００】
分泌シグナル付加可変領域断片および定常領域断片を鋳型とし、ＩＧＬ−Ｖｓ、ＩＧＬ−ＣａプライマーセットでアセンブルＰＣＲを行って両産物を連結させた抗体軽鎖配列を得た。
【０１０１】
ＩＧＬ−Ｖｓプライマー：（配列番号２８）
５’− ＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡ −３’
【０１０２】
次に、ＣＨＥＦ１αプロモーター、抗体軽鎖配列およびＳＶ４０ポリＡを連結し、両末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列を付加することにより、抗体軽鎖発現カセットを得た。
【０１０３】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを制限酵素Ｍｌｕ Ｉで切断して抗体重鎖発現カセットを挿入し、次いで制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して抗体軽鎖カセットを挿入し、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターを得た。
【０１０４】
実施例２：細胞へのベクターの導入
ベクター線状化
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクター、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターは、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、Ｎｒｕ Ｉにて切断した。２ｇ／Ｌの濃度になるように滅菌水に溶解し、以下のトランスフェクション実験に用いた。
【０１０５】
トランスフェクションおよびスクリーニング
ＤＧ４４細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｍａｘａ）で１×１０６細胞に調製し、線状化したプラスミドベクター２μｇと混合した。次に、得られた混合液を用いて、ＮｕｃｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（ａｍａｘａ）を用い、プログラムＵ−０２３で電圧印加した。トランスフェクションは各ベクターにつき、２回施行した。トランスフェクトした細胞は、１００ 細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに播種し、インキュベーター中３７ ℃、５ ％ ＣＯ２にて培養した（培地： Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）に５％ ＦＢＳ、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（インビトロジェン社）、１ｘ ＨＴサプリメント（インビトロジェン社）を添加したもの）
【０１０６】
トランスフェクション後、ＨＴサプリメントを除去し、６−ＴＧ（最終濃度； ５０μＭ）（和光純薬工業）を添加した培地に交換し、培養を継続した。培養後、全ウェルを確認し、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性コロニーを単離した。
【０１０７】
結果、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターによって得られたＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性クローンは、２×１０６細胞あたり４クローンであった。
【０１０８】
実施例３：ゲノムＰＣＲによる解析
ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ）を用い、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のクローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的ｈｐｒｔ遺伝子座への位置特異的な組換えの確認を行った。
【０１０９】
図２（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。ｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ中のホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２およびこれに挟まれたｄｈｆｒ遺伝子発現カセットは相同組換えにより組込まれる。
【０１１０】
ホモロジーアーム１と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３６４０ｂｐのＤＮＡ）および、ホモロジーアーム２と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３２８５ｂｐのＤＮＡ）は、相同組換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組換えの指標となる。
【０１１１】
よって、ホモロジーアーム１と標的領域との相同組換えの指標として、図２（Ａ）に示す３６４０ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＣＨＡ１ｓｅｑ−ｓ１１／ｄｈｆｒ−ｓｅｑ−ａ１によるＰＣＲ反応により検出した。一方、ホモロジーアームと標的ｈｐｒｔ遺伝子座との相同組換えの指標として、図２（Ａ）に示す３２８５ｂｐのＤＮＡを設定し、このＤＮＡは、以下に示すプライマーＮｃｏＩ−ｄｈｆｒ−ｓ／ ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ４によるＰＣＲ反応により検出した。
【０１１２】
ＣＨＡ１ｓｅｑ−ｓ１１プライマー：（配列番号２９）
５’−ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧ−３’
ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ４プライマー：（配列番号３０）
５’−ＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣ−３’
ｄｈｆｒ−ｓｅｑ−ａ１プライマー：（配列番号３１）
５’−ｃｔｃａｇｇａａｔｇｇａｇａａｃｃａｇｇ−３’
ＮｃｏＩ−ｄｈｆｒ−ｓプライマー：（配列番号３２）
５’−ｔｔａａＣＣａｔｇｇｔｔｃｇａｃｃａｔｔｇａａｃｔｇ−３’
【０１１３】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図２（Ｃ）に示される通りであった。図２（Ｃ）において、取得したクローンにおいてのみ、３６４０ｂｐおよび３２８５ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組換え反応が確認された。
【０１１４】
次に、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のクローンのゲノムＤＮＡについて、以下に示すＰＣＲ反応により、野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存しているのかを確認した。
【０１１５】
図２（Ｂ）は、野生型ｈｐｒｔ遺伝子の残存を確認するためのゲノムＰＣＲの詳細を説明する模式である。まず、図２（Ｂ）左図は２本のＸ染色体を有する野生型ＤＧ４４細胞におけるＰＣＲを示す。ｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されている。ベクター非導入の野生型細胞の場合、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）は、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、これを指標として野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存していることを確認することができる。
【０１１６】
図２（Ｂ）の中央図は、１本のＸ染色体のｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組込まれたヘテロ接合型の相同組換え細胞におけるＰＣＲを示す。一方の染色体では、標的領域中にベクターのＤＮＡは相同組換えによりに組込まれているため、３８６７ｂｐのＰＣＲ増幅産物が生じる。一方、もう１本の染色体は、標的領域を保持しており、標的領域のＤＮＡ（２３２２ｂｐ）もまた、ＰＣＲ反応によって増幅することができ、野生型ｈｐｒｔ遺伝子が残存していることを確認できる。
【０１１７】
一方、図２（Ｂ）の右図に示されるとおり、両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型の相同組換え細胞においては、組換えＤＮＡに由来する３８６７ｂｐのＰＣＲ増幅産物のみが発現し、野生型ｈｐｒｔ遺伝子に由来するＤＮＡ（２３２２ｂｐ）の増幅は生じない。
【０１１８】
以上の理解から、図２（Ｂ）に示す２３２２ｂｐのＤＮＡを上記指標として設定し、このＤＮＡを検出するため、プライマーＣＨＰＲＴｓ／ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ１を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１１９】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した。結果は、図２（Ｃ）に示される通りであった。
【０１２０】
ＣＨＰＲＴｓプライマー：（配列番号３３）
５’−ＴＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＡＧＧＣ−３’
ＣＨＡ２−ｓｅｑ−ａ１プライマー：（配列番号３４）
５’−ＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣ−３’
【０１２１】
図２（Ｃ）において、野生型細胞からは２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、野生型ｈｐｒｔ遺伝子の存在が確認された。一方、組換えクローンにおいては２３２２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認されず、３８６７ｂｐの産物のみが確認されたことから、組換え細胞は両方のＸ染色体にベクターが組込まれたホモ接合型であった。
【０１２２】
この結果から、本発明によるベクターを用いると、２本のＸ染色体の両ｈｐｒｔ遺伝子座に目的タンパク質遺伝子が組込まれた組換え細胞クローンが高頻度で取得されていることが確認された。
【０１２３】
実施例４：ＤＸＢ１１（ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ）ｈｐｒｔ組換えクローン作製
ＤＸＢ１１へのベクター導入およびスクリーニング
実施例１で作製した、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターを、実施例２と同様に精製および線状化し、３×１０６個のＤＸＢ１１細胞にトランスフェクションし、スクリーニングを実施した。
【０１２４】
結果、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性のＤＸＢ１１クローンを１クローン取得した。
【０１２５】
ゲノムＰＣＲによる、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子座へのベクター組込みの確認
実施例３と同様に、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え基礎ベクターのトランスフェクションにより得たＨＴサプリメント非要求性および６ＴＧに耐性のＤＸＢ１１クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とした以下に示すＰＣＲ反応により、標的ｈｐｒｔ遺伝子座への位置特異的な組換えの確認を行った。
【０１２６】
図４（Ａ）は、ゲノムＰＣＲによる相同組換え反応の解析の詳細を説明する模式図である。
【０１２７】
実施例３でのＤＧ４４の場合と全く同様に、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子の相同組換えの標的領域は、エクソン３を含んで設定されており、この領域にベクターＤＮＡ中のホモロジーアーム１、ホモロジーアーム２およびこれに挟まれたｄｈｆｒ遺伝子発現カセットは相同組換えにより組込まれる。
【０１２８】
ホモロジーアーム１と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３６４０ｂｐのＤＮＡ）および、ホモロジーアーム２と、ｄｈｆｒ遺伝子発現カセットの一部とを含むＤＮＡ（３２８５ｂｐのＤＮＡ）は、相同組換えによってのみゲノムから取得することができ、相同組換えの指標となる。これらのＤＮＡは、取得したＤＸＢ１１クローンのゲノムＤＮＡを鋳型とした、実施例３と同一のプライマーセットによるＰＣＲ反応によって検出した。
【０１２９】
ＰＣＲ増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動により解析した結果は、図４（Ｂ）に示される通りであり、取得したＤＸＢ１１クローンにおいて３６４０ｂｐおよび３２８５ｂｐの両方のＰＣＲ増幅産物が確認され、相同組換え反応が確認された。
【０１３０】
以上の結果から、ＤＸＢ１１のｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組み込まれたクローンが取得できたことが確認できた。
【０１３１】
実施例５：ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローン作製および抗体生産
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローン作製
実施例１で作製した、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターを、実施例２と同様に精製および線状化し、３×１０６個のＤＧ４４細胞にトランスフェクションし、スクリーニングを実施した。
【０１３２】
結果、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターによって、ＨＴサプリメント非要求性／６ＴＧ耐性クローンを１クローン取得した。
【０１３３】
取得クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施例２と同様に実施し、ｈｐｒｔ遺伝子座にｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクターが組み込まれていることを確認した。
【０１３４】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの無血清浮遊馴化
１００ｍｍディッシュに捲き込んだＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、７０％コンフルエントまで培養した後、トリプシン処理によって剥離した。
【０１３５】
１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によって細胞を沈殿させ、上澄みを破棄した後、完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（インビトロジェン社）に１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（インビトロジェン社）を添加したもの）で３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整してフラスコに移し、インキュベーター中３７℃、８％ＣＯ２にて、１２１ｒｐｍで振とう培養した。
【０１３６】
細胞密度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを超えた時点で、完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯで３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈継代し、培養を継続した。
【０１３７】
上記継代を３回繰り返した時点で、無血清浮遊培養への馴化を完了した。
【０１３８】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンによる抗体生産
無血清浮遊培養に馴化したＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によってペレット化し、新鮮な完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地に懸濁した。この細胞懸濁液を完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地で希釈し、６０ｍｌの３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調整し、フラスコに移した。
【０１３９】
インキュベーター中３７℃、８％ＣＯ２にて、１２１ｒｐｍで振とう培養し、２４時間ごとに細胞密度を測定して記録した。また、１．５ｍｌの培地を回収し、遠心した上澄みを−８０℃で保存した。
【０１４０】
１８日間のサンプリングを実施後、回収しておいた培地サンプル回収した培地中のＩｇＧ量を、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＩＡ Ｋｉｔ （ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）（宝酒造製）により、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。
【０１４１】
その結果、図５に示すように、培地上澄１Lあたり３５ｍｇのＩｇＧ生産が認められた。
【０１４２】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現クローンの発現の長期安定性確認
無血清浮遊培養に馴化したＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンを、１４回継代培養して維持した。継代操作は１週間あたり２回実施した。その後、細胞集団の一部を、新鮮な完全ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地６０ｍｌ中に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、フラスコに移し、培養を開始した。
【０１４３】
培養開始後、７日目に培地中の細胞密度を測定した後、培地上澄１．５ｍｌを採取し、遠心分離した上澄みをー８０℃保存した。２４時間後、細胞密度を測定し、培地上澄１．５ｍｌを同様に保存した。
【０１４４】
保存しておいた培地上澄サンプルを溶解し、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＩＡ ＫｉｔでＩｇＧ量を定量し、細胞密度を用いて比生産性（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。また、無血清浮遊培養に馴化した直後のＤＧ４４ ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ ｈｐｒｔ組換え抗体発現ベクタークローンについても、同様に比生産性を測定した。
【０１４５】
１４回の継代操作後のクローンの比生産性は、図６に示すように全く低下していなかった。これは、実生産で最低限要求される５０日間（約７週間）の安定性を満足する、好ましい結果と言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、選択マーカー遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）であることを特徴とする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ｈｐｒｔ遺伝子座の一部が、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含んでなる領域である、請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片が、配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなるものである、請求項１〜４の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結されたＣＨＥＦ−１α遺伝子プロモーターを含んでなる、請求項１〜６の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞に導入し、ヒポキサンチン、チミジン非要求性および６−チオグアニン（６ＴＧ）耐性を指標として、ｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組込まれた細胞を選択することを含んでなる、組換えＣＨＯ細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の製造方法により得られる、組換えＣＨＯ細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えＣＨＯ細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法。
【請求項１】
５’末端から３’末端に向かって、第一の相同ＤＮＡ断片、目的タンパク質遺伝子、選択マーカー遺伝子、および第二の相同ＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ構築物であって、
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ゲノムのヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ｈｐｒｔ）遺伝子座の一部と相同組換え可能な相同性を有し、かつ１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものであり、前記選択マーカー遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）であることを特徴とする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上７．５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記第一の相同ＤＮＡ断片および第二の相同ＤＮＡ断片が１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下の鎖長を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ｈｐｒｔ遺伝子座の一部が、ｈｐｒｔ遺伝子のイントロンの少なくとも一部を含んでなる領域である、請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記第一の相同ＤＮＡ断片または第二の相同ＤＮＡ断片が、配列番号３５〜４２のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を含んでなるものである、請求項１〜４の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記目的タンパク質遺伝子に作動可能に連結されたＣＨＥＦ−１α遺伝子プロモーターを含んでなる、請求項１〜６の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞に導入し、ヒポキサンチン、チミジン非要求性および６−チオグアニン（６ＴＧ）耐性を指標として、ｈｐｒｔ遺伝子座にベクターが組込まれた細胞を選択することを含んでなる、組換えＣＨＯ細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の製造方法により得られる、組換えＣＨＯ細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えＣＨＯ細胞を用意し、該細胞を培養して目的タンパク質を産生することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法。
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図２】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１９６２０８（Ｐ２０１２−１９６２０８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９８０（Ｐ２０１２−５１９８０）
【出願日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
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