説明

DNA魚ワクチン

養殖、特に、漁場システム内の動物用栄養組成物中にデオキシリボ核酸(DNA)ワクチンを含める工程、使用、方法、及び製剤。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
[技術の現状]
養殖中の魚類に影響を及ぼす感染性疾患のうちで、ウイルスは、経済的損失の大きな原因となっている。DNAワクチンは、主に、ラブドウイルス(VHSV及びIHNV)及びビルナウイルス(IPNV)からなるウイルス群に対して実施されてきた。
【0002】
ラブドウイルスは、サケ科ウイルス群の主要な病原体群を形成する。これらは、ヌクレオカプシドを取り囲む外延的な複合脂質による被覆により取り囲まれるリボ核酸ウイルス(ARN)である。ウイルス粒子は杖の形態を有し(「ラブド(rhabdo)」とは「杖」を意味する)、約70nmの直径及び175nmの長さを有する(Brock及びMadiganによる「微生物学」)。ラブドウイルスは、2つの重要な疾患:ウイルス性出血性敗血症(VHSV)及び感染性造血器壊死(IHNV)をもたらす。
【0003】
現在までのところ、サケ科魚類におけるDNAワクチン接種で最も成功した結果は、ラブドウイルス:魚類の養殖においてより大きな世界的影響を有する2つのウイルス性病理を広く構成する、ウイルス性出血性敗血症(VHSV)ウイルス及び感染性造血器壊死(IHNV)ウイルスに対して得られている。
【0004】
これらのDNAワクチンは、真核細胞内における一過性発現用に設計された大腸菌(E.coli)の単離されたプラスミドに主に基づく。すべての場合において、ウイルス糖タンパク質をコードするウイルス遺伝子は、挿入pGである(Andersonら、1996年;Lorensenら、1998年;Boudinotら、1998年;Lorensenら、2000年;Lorenzenら、2005年;Lorenzenら、2002年;McLauchlanら、2003年;Purcellら、2004年;Takanoら、2004年;Veselyら、2004年)。
【0005】
また、ウイルス糖タンパク質(pG)を用いて、ヒラメラブドウイルスHIRR(Takanoら、2004年)及びスネークヘッドラブドウイルスSHRV(Kimら、2000年)など、その地理的な分布の他、それらが影響を及ぼす種に関する限り、発症率が低くより限定された他のラブドウイルスに対して有効なDNAワクチンが開発されてきた。
【0006】
これらのワクチンが、多様な環境条件、サケ科魚類の種、魚類の生活周期の段階、及び異なるウイルスストック(viral stock)に対して高度に有効であることは、様々な研究が示している(Corbeilら、2000年;Garverら、2005年;Kurathら、2001年;LaPatraら、2000年;Lorenzenら、1999年;Lorenzenら、2001年;Traxlerら、1999年)。
【0007】
用量−応答実験は、ナノグラム範囲のプラスミドDNAによる簡略な筋肉内注射が、マス科のニシキベラ(rainbow[arcoiris]fishes)の幼魚におけるウイルス性出血性敗血症(VHS)及び感染性造血器壊死(IHN)に対して防御的な免疫反応を誘導するのに十分であることを示している(Corbeilら、2000年;Lorenzenら、2000年)。
【0008】
感染性膵臓壊死ウイルス(IPNV)ARNのセグメントAから発現されたIPNVの完全ポリタンパク質をコードする(codifying)プラスミドワクチンを用いてアトランティックサーモンに対して実施された研究は、その投与後に高レベルの防御が得られることを示した(Mikalsenら、2004年)。ピスシリケッチア・サルモーニス(Pisciricketsia salmonis)の抗原性配列を含有する高発現プラスミドによりギンザケに免疫感作したところ、比較的小規模の防御が観察された(Miquelら、2003年)。2005年に、シマスズキにおける防御を誘導した抗原Ag85Aをコードするプラスミドに基づき、細菌マイコバクテリウム・マリーン(Mycobacterium marine)に対するDNAワクチンが評価された。
【0009】
ワクチン投与法:
DNAワクチンの組み込み機構は、水産養殖(aquiculture)で用いうる大規模な免疫感作法を開発する必要性のために、探索の重要な対象を構成してきた。
【0010】
より有効であったDNAワクチンの投与経路は、筋肉内注射である。しかしながら、実際には、免疫感作する魚類のサイズにおける限界の他、ワクチン接種の追加費用も、現在までのところ答えの得られない問題である。
【0011】
養殖場内の魚類に適する投与経路は、液浴又は浸漬である。この文脈では、DNAワクチン接種の実際的で大規模な適用法を改善し、それを幼魚にまで拡張する一連の手順の中で、浸漬に基づく投与経路が評価されてきた(Corbeilら、2000年;Fernandez−Alonsoら、1998年)。
【0012】
溶解された裸のプラスミドを含有する水中に浸漬された魚類の側で直接的にDNAを取り込むことはできないので、LF超音波法(Fernandez−Alonsoら、2001年)及び高浸透圧ショック法(Huisingら、2003年)の使用など、浸漬によるプラスミドワクチンの組み込みを最適化する物理又は化学的方法の評価は好結果をもたらした。
【0013】
浸漬により、魚類によるDNAの取り込みを誘導又は促進するため、当面は、以下に基づく方法を評価する:
i)DNA−リポソーム複合体
ii)浸漬又はマイクロカプセル封入されたDNAからの経口摂取
【0014】
陽イオンリポソームは、二層に構成されたリン脂質を含有する極微の脂質小胞であり、その正電荷により、負に荷電したDNAと複合体が形成される。このため、DOPE、DOTAP、DOPE:DOTAP、又はDOTAP:コレステロール(Huang及びLi、1997年)など、合成脂質の混合物が、水産養殖においてプラスミドワクチンを送達する良好な代替物となっている(Rumorenら、2002年)。
【0015】
この点では、Fernandez−Alonsoら(1999年)が、DOTAPリポソームとのプラスミドワクチン複合体を含有する水中にマス科のニシキベラの幼魚(0.2〜0.5g)を浸漬するワクチン接種による組み換えタンパク質発現を生きたままモニターする最初のモデルを開発した。設計されたワクチンを効果的にモニターするために、ワクチンは、その配列中に緑色蛍光タンパク質(GFP)からなるレポーター遺伝子を含有し、同著者らは、浸漬処置後に、大量の幼魚のヒレの中において蛍光発光を定量することができた。蛍光は、プラスミドワクチンへの曝露後2〜3日後から治療(cure)の10日後まで検出された。
【0016】
近年では、Rumorら、(2004年)が、リポソームにより調合されたプラスミドワクチンからの異なる臓器中での発現を調べた。ルシフェラーゼからなるマーカー遺伝子を含むプラスミドを異なる経路(腹腔内、筋肉内、静脈内、浸漬、又は経肛門)を介して投与すると、ワクチン−リポソーム複合体の使用により、他の投与機構と比べてルシフェラーゼのより高度の発現がもたらされる。
【0017】
[参考文献]
・ Anderson E.D., Mourich D.V., Fahrenkrug S.C., LaPatra S., Shepherd J. and Leong J.A. (1996). Genetic immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) against infectious hematopoietic necrosis virus. Molec. Sea. Biol. Biotechnol., 5 (2): 114−122.
・ Lorensen N. & Lorenzen E., Einer−jensen K., Heppell J., Wu T. and Davis H.L. (1998). Protective immunity to VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) following DNA vaccination. Fish Shellfish Inmunol., 8:261 − 270.
・ Boudinot P., Target M. of Kinkelin P. and Benmansour A. (1998). Viral Combined DNA immunization with the glycoprotein gene of hemorrhagic septicaemia virus and infectious hematopoietic necrosis virus induced double−specific protective immunity and non−specific response in rainbow trout. Virology, 249 (2): 297−306
・ Lorenzen E., Einer.Jensen K., Martinussen T., LaPatra S.E and Lorenzen N. (2000). Viral DNA vaccination of rainbow trout against hemorrhagic septicaemia virus: to dose−response and Time−course study. J. aquat. Anim. Hlth., 12 (3): 167−180
・ Lorenzen E., Lorenzen N. Einer.Jensen K., Brudeseth B. and Evensen Or. (2005). Time course study of in situ expression of antigens following DNA vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) fry. Fish Shellfish Immunol., 19 (1): 27−41.
・ Lorenzen E., Lorenzen N. Einer.Jensen K. and LaPatra S.E. (2002). DNA vaccines for ace to tool analyzing the protective immune response against rhabdoviruses in rainbow trout. Fish Shellfish Immunol., 12:439 − 453.
・ McLauchlan EP., Collet B., Ingerslev E., Secombes C.J., Lorenzen N. and Ellis A.E. (2003) Viral DNA vaccination against haemorrhagic septicaemia (VHS) in rainbow trout: size, dose, route of injection and duration of protection − early protection you corelate with MX expression. Fish. Shellfish Immunol., 15 (1): 39−50.
・ Purcell M.K., Kurath G. to graver K.A., Herwin R.P and Winton J.R. (2004). Quantitative expression profiling of immune response genes in rainbow trout following infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) infection or DNA vaccination. Fish. Shellfish Immunol., 17 (5): 447−462.
・ Vesely T., Pokorova D., Einer−Jensen K. and Lorenzen N. (2004). DNA vaccination of small carp (Cyprinus carpio) against SVCV: the protective effect depends on temperature. In Book of Abstract, 6th International Symposium on Fish Immunology. 26−27 May, Turku, Finland, 43.
・ Takano T., Iwahori A., Hirhono I. and Aoki T. (2004). Development of to DNA vaccine against hirame rhabdovirus and analysis of the expression of inmine−related genes to after vaccination. Fish. Shellfish Immunol., 17 (4): 367−374.
・ Kim C.H., the Johnsons M.C., Drain B.E., Simon E., Thomann E. & Leong J.A.C. (2000) The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends Microbiol. 6:23 − 27.
・ Corbeil S., LaPatra S.E., Anderson E.D and Kurath G. (2000). Nanogram quantities of to DNA vaccine protect rainbow trout fry against heterologous strains of infectious hematopoietic necrosis virus. Vaccine, 18 (25): 2817.2824.
・ Garver K.A., LaPatra S.E and Kurath G. (2005). Efficacy of infectious haematopoietic nacrosis (IHN) virs DNA vaccine in Chinook (Oncorynchus tshawytscha) and sockeye (Oncorynchus nerka) salmon. Dis aquat. Organisms, 64 (1): 13−22.
・ Kurath G., Corbeil S., Anderson E.D and LaPatra S. (2001). Efficacy of to DNA vaccine against infectious haematopoietc necrosis virus. Bull. Natl. Head of cattle. Inst. Aquacult., 5:27 − 33.
・ LaPatra S.E., Corbeil S., Jones G.R., Shewmaker W.D and Kurath G. (2000). Humoral The dose−dependant effect on protection and response to DNA vaccine against infectious hematopoietic necrosis to (IHN) virus in subyearling rainbow trout. J. Aquat. Anim. Hlth., 12 (3): 181−188.
・ Lorenzen N., Lorenzen E., Einer−Jensen K., Heppell J. and Davis H.L. (1999). Viral Genetic vaccination of rainbow trout against haemorrhagic septicaemia virus: small amounts of plasmid DNA protect against to heterologous serotype. Virus Head of cattle., 63 (1−2): 19−25.
・ Lorenzen N., Lorenzen E. and Einer−Jensen K. (2001). Viral Immunity of haemorrhagic septicaemia (VHS) following DNA vaccination of rainbow trout AT an early like−stage. Fish Shellfish Immunol., 11 (7): 585−591.
・ Traxler G.S., Anderson E., LaPatra S.E., Richard J., Shewmaker B. and Kurath G. (1999). Naked DNA vaccination of Atlantic Salmon Psalm to salar against IHNV. Dis. Aquat. Organisms, 38 (3): 183−190.
・ Corbeil S., LaPatra S.E., Anderson E.D and Kurath G. (2000). Nanogram quantities of to DNA vaccine protect rainbow trout fry against heterologous strains of infectious hematopoietic necrosis virus. Vaccine, 18 (25): 2817.2824.
・ Lorenzen E., Einer.Jensen K., Martinussen T., LaPatra S.E and Lorenzen N. (2000). Viral DNA vaccination of rainbow trout against hemorrhagic septicaemia virus: to dose−response and Time−course study. J. Aquat. Anim. Hlth., 12 (3): 167−180
・ Mikalsen A.B., Torgensen J., Alestrom P., Hellemann A., Koppang E. and Rimstad E. (2004). Protection of Atlantic salmon Psalm to salar against infectious pancreatic necrosis virus to after DNA vaccination. Dis. Aquat. Organisms, 60 (1): 11−20.
・ Miquel A., Muller I., Ferrer P., Valenzuela P.D and Burzio L.O. (2003). Inmunoresponse of Coho salmon immunized with to gene expression library from Pisciricketsia salmonis. Biol. Head of cattle., 36 (3−4): 313−323.
・ Pasnik D.J and Smith S.A. (2005). Inmunogenic and protective effects of to DNA vaccine for Mycobacterium marinum. Fish. Vet. Inmunol. Inmunopathol., 103 (3−4): 195−206.
・ Corbeil S., Kurath G. and LaPatra S.E. (2000). Fish DNA vaccine against infectious haematopoietc necrosis virus: efficacy of various routes of immunization. Fish Shellfish immunol., 10 (8): 711−723.
・ Fernandez−Alonso M., Alvarez F., Steppe A., Blaco R. and Coll J.M. (1999). To model to study fish DNA immersion vaccination by using the green fluorescent protein. J. Fish Dis., 22 (3): 237−241.
・ Fernandez−Alonso M., Rocha A. and Coll J.M. (2001). Viral DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout haemorrhagic septicaemia virus. Vaccine, 19 (23−24): 3067−3075.
・ Romoren K., Thu B.J., Smistad G. & Evensen Or. (2002) Immersion delivery of plasmid Mrs I. To study of the potentials of to liposomal delivery system in rainbow trout (Oncorhynchus mykis) fry. J. Controlled Releas. 85 (1−3): 203−213.
・ Romoren K., Thu B.J., Smistad G. & Evensen Or. (2002). Immersion delivery of plasmid Mrs II. To study of the potentials of to liposomal delivery system in rainbow trout (Oncorhynchus mykis) fry. J. Controlled Release, 85 (1−3): 215−225.
・ Huising M.O., Guichelaar T., Hoek C., Verburg−go Kemenade B.M.L, Flik G., Savelkoul H.F.J and Rombout J.H.W.M. (2003). Increased efficacy of immersion vaccination in fish with hyperosmotic ptrtreatment. Vaccine, 21:4178 − 4193.
・ Tucker C.M., Endo M., Hirono I. and Auki T. (2000). Assesment of DNA vaccine potential for juvenile Japanese to flounder Paralichthys olivaceus, throut the introduction of to reporter genes by particle bombardment and histopathology. Vaccine, 19 (7−8): 801−809.
・ Fernandez−Alonso M., Alvarez F., Steppe A., Blaco R. and Coll J.M. (1998). Vaccines DNA in aquiculture. AquaTIC 4, http://aquatic.unizar.es/N o/art401/DNA_vac.htm
・ Kurath G., Corbeil S., Anderson E.D and LaPatra S. (2001). Efficacy of to DNA vaccine against infectious haematopoietc necrosis virus. Bull. Natl. Head of cattle. Inst. Aquacult. 5:27 − 33.
・ Lorenzen E., Einer.Jensen K., Martinussen T., LaPatra S.E and Lorenzen N. (2000). Viral DNA vaccination of rainbow trout against hemorrhagic septicemia virus: to dose−response and Time−course study. J. Aquat. Anim. Hlth., 12 (3): 167−180
・ LaPatra S.E., Corbeil S., Jones G.R., Shewmaker W.D and Kurath G. (2000). Humoral The dose−dependant effect on protection and response to DNA vaccine against infectious hematopoietic necrosis to (IHN) virus in subyearling rainbow trout. J. Aquat. Anim. Hlth. 12 (3): 181−188.
・ Lorenzen N., Lorenzen E. and Einer−Jensen K. (2001). Viral Immunity of haemorrhagic septicaemia (VHS) following DNA vaccination of rainbow trout AT an early like−stage. Fish Shellfish Immunol. 11 (7): 585−591.
・ Sommerset I., Lorenzen E., Lorenzen H., Bleie H. and Nerland A.H. (2003). To DNA vaccine direct against to rainbow trout rhabodovirus you induce early protection against to nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32): 4661−4667.
・ Lorenzen N.E., Lorenzen K., Einer−Jensen and LaPatra S.E. (2002b). Immunity induced shortly to after DNA vaccination of rainbow trout against rhabdovirus protects against heterologous bacterial virus but not against pathogens. Devel. Comp. Immunol., 26 (2): 173−179.
・ Chiller J.M., Hofkins H.O and Weiser R.S. (1969). Antibody response in rainbow trout (Psalm gairdnen). II. Studies on the kinetics of development of antibody producing cells and on complement and natural hemolysis. J. Immunol., 102:1202 − 1207.
・ Boudinot P., Target M. of Kinkelin P. and Benmansour A. (1998). Viral Combined DNA immunization with the glycoprotein gene of hemorrhagic septicaemia virus and infectious hematopoietic necrosis virus induced double−specific protective immunity and non−specific response in rainbow trout. Virology, 249 (2): 297−306
・ Lorenzen E., Lorenzen N. Einer.Jensen K. and LaPatra S.E. (2002a). DNA vaccines for ace to tool analyzing the protective immune response against rhabdoviruses in rainbow trout. Fish Shellfish Inmunol., 12:439 − 453.
・ Purcell M.K., Kurath G., Garver K.A., Herwig R.P and Winton J.R. (2004). Quantitative expression profiling of immune response genes in rainbow trout following infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) infection or DNA vaccination. Fish Shellfish Immunol., 17 (5): 447−462.
・ Takano T., Iwahori A., Hirhono I. and Aoki T. (2004). Development of to DNA vaccine against hirame rhabdovirus and analysis of the expression of immune−related genes to after vaccination. Fish. Shellfish Immunol. 17 (4): 367−374.
・ Traxler G.S., Anderson E., LaPatra S.E., Richard J., Shewmaker B. and Kurath G. (1999). Naked DNA vaccination of Atlantic Salmon Psalm to salar against IHNV. Dis. Aquat. Organisms, 38 (3): 183−190.
・ Kanellos T., Sylvester. I.D., Ambali A.G., Howard C.R and Rusell P.H (1999a). The safety and longevity of DNA vaccines for fish. Immunology, 96 (2): 307−313.
・ McLauchlan EP., Collet B., Ingerslev E., Secombes C.J., Lorenzen N. and Ellis A.E. (2003). Viral DNA vaccination against haemorrhagic septicaemia (VHS) in rainbow trout: size, dose, route of injection and duration of protection − early protection you corelate with MX expression. Fish. Shellfish Immunol. 15 (1): 39−50.
・ Boudinot P., Target M. of Kinkelin P. and Benmansour A. (1998). Viral Combined DNA inmunization with the glycoprotein gene of hemorrhagic septicaemia virus and infectious hematopoietic necrosis virus induced double−specific protective immunity and non−specific response in rainbow trout. Virology. 249 (2): 297−306
・ Grace M.F and Manning M.J. (1989). Histogenesis of the lymphoid organs in rainbow trout, psalm gairdneri. Dev. Comp. Immunol., 4:255 − 264.
・ Tatner M.F and Manning M.J. (1983). Growth of the lymphoid organs in rainbow trout, psalm gairdneri, from one to 15 months of age. Journal Zoology London. 199:503 − 520.
・ Castle A., Sanchez C., Dominguez J., Kaatari LIMITED LIABILITY COMPANY and Villena A.J. (1993). Ontogeny of IgM and IgM−bearing cells in rainbow trout. Dev. Comp. Immunol., 17:419 − 424.
・ Tatner M.F and Manning M.J. (1985). The ontogenic development of the endothelial reticulum system in rainbow trout, psalm gairdneri, Richardson. J. Fish. Dis., 8:35 − 41.
・ Ellis A.E. (1988). Ontogeny of the immune system in teleost fish. Fish vaccination. Ed.A.E.Ellis, Academic Press, 20−31.
・ Zapata A.G. (1996). Cells and tissues of the immune system of fish. The fish immune system: organism, pathogen, and environment. Ed Akira Kid. Alberto Varas, 278.
・ Tatner M.F. (1985). Peripheral The migration of labelled thymocytes to the lymphoid organs in the rainbow trout, psalm gairdneri, Richardson. Dev. Comp. Immunol., 9:85 − 91.
・ Johnsom K.A., Flynn J.K and Amend D.F. (1982). Onset of immunity in salmonid fry vaccinated by direct immersion with yersinia ruckeri and Vibrio anguillarum bacterins. Journal of Fish Diseases, 5:197 − 205.
・ Johnsom K.A., Flynn J.K and Amend D.F. (1982). Duration of immunity in salmonids vaccinated by direct immersion with yersinia ruckeri and Vibrio anguillarum bacterins. Journal of Fish Diseases, 5:207 − 212.
・ Perrie, and. Obrenovic, M, McCarthy, D. and Gregoriadis, G. (2002). Oral Liposome−mediated DNA vaccination via the route. Journal of Liposome Research 12, 185−197
・ Fernandez−Alonso M., Alvarez F., Steppe A., Blaco R. and Coll J.M. (1999). To model to study fish DNA immersion vaccination by using the green fluorescent protein. J. Fish Dis., 22 (3): 237−241.
・ K., Thu B.J., Evensen rumor Or. Expression of luciferase in selected organs following delivery of naked and formulated DNA to rainbow trout (Oncorhynchus mykis) by differents routs of administration. Fish Shellfish immunology, 16:251 − 264.
【0018】
[産業財産権の現状]
世界の特許庁の主要なデータベースにおいて探索を行った。この探索は、各場合において用いられた基準が何であったかを含む、6つの基本的部分に分類される。最初の4つの探索が本発明の明確なエレメントに関したのに対し、最後の2つの探索はワクチン製造工程及び栄養製剤への封入に関する。
1.用いられるベイト、
2.用いられるプラスミド、
3.大腸菌JM−109株、
4.DOTAPリポソーム構築物、
5.魚用DNAワクチン、
6.DNA又は他の対象エレメントを用いた製剤の工程
【0019】
1.ベイトに関する探索:
本発明で用いられるベイトは、22及び26pbの新規の2つの配列:
・ S1 5’3TAAAGAAGGCATTCAACCGGGAGA’センス(26)
・ S2 5’3CCCCTTGGCTCCGAGCGTTGCT’アンチセンス(22)
に対応する。
魚類において免疫を誘導するのに用いられる配列に関連する探索は、きわめて限られている。同様の優先権を保護した出願は少ない。
チリに優先権のある米国特許出願第2003147909号明細書は、免疫原性を示しピスシリケッチア・サルモーニス菌に感染したギンザケから単離されたタンパク質CHAPを精製する手順を開示する。チリではCL2086−01の出願番号により出願されたこの出願は、いくつかの理由により本発明には関連しない。
a)本発明は異なる病原体に対する防御を期待する、
b)異なるエピトープに由来するので、関与する配列が異なる、
c)用いられる免疫原性タンパク質が異なり、したがって、ベイトが異なる、
d)この出願は、分子的な基本有効成分の封入装置としてのリポソームの使用に向かって前進するものでもない。これが、この出願により分子的性格の薬剤放出装置を含有する栄養製剤が得られない理由である。
【0020】
上述より、また、他の出願は存在しないので、免疫原性を有するコード配列又はペプチドを生成するベイトの使用及び意図は新規である。
【0021】
2.用いられるプラスミドに関する探索:
挿入配列をクローニングする市販のプラスミドは、pcDNA4/HisMax TOPO(米国、カリフォルニア州、カールスバード、Invitrogen社製)である。この点では、このクローニングベクターの使用を開示するいくつかの先行特許が認められ、その最良の例は、国際公開第2006003100号パンフレットによる発明特許出願である。この出願は、グルタミン酸受容体をコードするベクターの発現を保護し、このために発現ベクター、特に、受容体グループIのメンバーであるヒト受容体mGluRIaをコードするmGluRの核酸配列を付加するpcDNA4/TO(米国、カリフォルニア州、カールスバード、Invitrogen社製)が用いられた。参照される該発明特許出願において、発明者は、テトラサイクリンにより誘導されるヒト代謝調節型グルタミン酸受容体グループIをコードするベクターの発現を保護することを目論んでいる。この出願はまた、宿主細胞株(T−Rex−293)、アゴニスト及び同じ受容体の活性を調節する能力を有する他の化合物を認識する方法の他、トランスジェニック細胞の使用も保護する。
【0022】
国際公開第2006003100号パンフレットによる出願は本発明と大きく異なっており、同じクローニングベクターを用いることのみが共通するが、それも異なる形態において用いられる。該国際公開出願により、グルタミン酸受容体及びこれらを調節する物質をクローニングするプラスミドベクターの使用が保護される。しかし、該出願では、魚類において哺乳動物のクローニング系を用いることを目論んでいる。他方、多くの場合、クローニング配列は、哺乳動物に由来する受容体と関連を有さないが、魚類の病原体であるウイルスタンパク質とは関連を有する。
【0023】
3.大腸菌JM−109株に関する探索
大腸菌K−12に由来する大腸菌JM−109株(Promega社製)は、宿主として広く用いられている。次に、このベクターを用い、本出願に何らかの形で関連する主な発明について考察する。
【0024】
RU2208637によるロシアの発明特許出願は、糖尿病に罹患する患者を治療する構築物の調製を開示している。この構築物用に、新規の菌株を生成する細菌ベクターに遺伝子が導入され、これが大腸菌JM 109/pPINS07と命名された。保護される方法は、封入体中に含有される組み換えタンパク質の広範な単離プロトコールを含む。この手順の利点は、とりわけ、既存の技法と比べた試料調製時間の短縮である。加えて、ヒトインスリン生成のための遺伝子の調製に関連する遺伝子組み換え法は複雑である。ロシアの出願では、ハイブリッドタンパク質生成の増大が示されている。
【0025】
参照される出願の他、本出願で提示される発明においても、大腸菌JM 109株が、大腸菌株の使用に対して当技術分野で広く認知されたプラスミドを増幅させる宿主として用いられていることを言及すべきである。本発明特許出願の新規の態様は、ヒトではなく魚類のゲストである微生物に関連するウイルスペプチド配列を増幅する菌株の使用である。
【0026】
他方、関連しうる出願は、例外なく、薬剤組成物を生成する必要なしにこの菌株の生成物からの抽出物の権利を主張する。特徴的な製剤を保護する他の先行特許が存在する。これらの製剤は、保護することが望ましい手順と同様の技法により、即ち、クローニング法を介して得られる有効成分を含有する。しかしながら、これらの発明の大半はヒト又は魚類と関連するが、一般に、本発明特許出願において用いられるエピトープとは異なるエピトープを用いる、異なる病原体からなるワクチンである。本出願は、プラスミド、タンパク質、又はハイブリッドポリペプチドからの抽出物の域を超えた。クローニング生成物を単離したが、後にこの生成物を処置して、その有効成分がクローニングポリペプチド配列である組成物を生成した。該薬剤、組成物、及び投与経路により、既存のワクチンに対する予想外で新規の利点が示される。該配列は、当技術分野でかつて開示されたことも認知されたこともなく、その上、大腸菌JM 109株内におけるクローニングは、リポソーム媒体内に含有され、病原性生物に対する免疫原性の置換をもたらすDNAワクチンの生成により終結する多岐にわたる手順の1段階にすぎない。リポソームは、有効成分の保護及び組み込みを容易にする製剤を担持する媒体として用いられる。将来のLipoplexであるプラスミド−リポソーム複合体は、飼料製造過程において魚用栄養製剤に添加される。投与されると、該飼料は摂取され、非免疫生体(white organism)の腸管腔領域内で吸収される有効成分は、該領域及び他の組織内で速やかに発現され、防御的な免疫応答をもたらした。これらの態様は、当技術分野における新規性を享受するだけでなく、本発明に大きな主導権(initiative)を賦与する。
【0027】
JP2000295994による日本の発明特許出願は、分子的技法を介して、キシリトール精製の問題を解決する。日本の出願は、プラスミドベクター中に含有される酵素であるキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子により大腸菌を形質転換する段階を含む方法を開示する。後に、形質転換された微生物は、D−キシルロースからキシリトールを生成する能力を獲得する。JP2000295994による日本の発明特許出願は、本発明特許出願との顕著な違いを示す。それらの違いのうちで、本発明者らは、日本の出願が、具体的な大腸菌細胞株を大腸菌JM−109細胞株として主張せず、一般的な形態のみにおいて主張していることを強調しうる。これまでのところ、特許下にある生成物はヒト用である。最後に、該配列、使用、生成物、方法、経路は、本発明特許出願において主張することが望ましい配列、使用、生成物、方法、経路とはきわめて異なる。
【0028】
プラーク形成を阻害する変異菌株の生成は、日本の発明JP2000083665により解決された問題である。日本の出願で開示された工程は、ストレプトコッカス・ダウネイ(Streptococcus downei)のグルコシルトランスフェラーゼI遺伝子を得る目的を有する。該遺伝子は、GTF−I遺伝子に基づく30bpのベイトを用いるPCR法を介して増幅される。生成された増幅物は、大腸菌JM−109を速やかに形質転換する発現ベクターに連結される。その後、組み換え菌株を培養し、該酵素を単離し、上清からグルコシルトランスフェラーゼを抽出する。両発明における発明単位がまったく異なるため、日本の発明の出願は、本明細書で保護することが望ましい発明特許出願とは関連を有さない。両出願において主張される工程は、異なる技術の現状に対する解決を提供する。遺伝子の大量の生成及びその単離は、分子生物学における類似の手順であるが、その生物学的概念は異なる。結果として、用いられるベイトが異なり、培養プロトコールは大きな違いを提供する。これらの発明特許出願は、同一の大腸菌JM−109株の使用など全般的な態様を共有するのみであり、得られる組み換え菌株が異なる他、配列又はこの配列の最終的な使用に関する限り、単離された遺伝子は報告されていない。日本の出願において、発明単位は、生物活性を有する酵素の生成である。本発明特許出願において、発明単位は、飼育される動物用の飼料製造工程の開発である。該工程は、薬剤として有効な物質の添加を可能としなければならない。すべての物質は、組み換えDNA法を介して生成される。
【0029】
発明特許出願JP2000050869は、大腸菌、特に、大腸菌JM−109における自立的な複製能を有する新規のプラスミドを得る段階を開示している。このプラスミドは、グルコバクター(Gluconobacter)属種に特異的なベクターとして用いるのに有用である。該ベクターは、グルコバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)IFO 3171菌株から単離された。日本の特許は、説明的覚書において大腸菌JM−109株の使用を開示するが、日本の提起では、プラスミド構築物の宿主となる具体的な菌株なしに、該細菌種及びその使用が広範で一般的な形のみにおいて主張されているので、本発明特許出願とは関連を有さない。本発明者らの先行特許における大腸菌JM−109株という、プラスミドの大量生成段階で用いられるが、主張することが望まれる全般的な工程段階の内部で用いられる菌株の使用は、特定のレベルにある。ヌクレオチド配列の他、コンセプト、使用、及び工程は、日本の発明特許出願と関連を有さない。
【0030】
RU2143492によるロシアの発明特許出願は、ヒトレベルでクローニングされるシステムである、プロインスリン「A」のIgGドメイン(dominion)に結合するリーダーペプチドを発現する新規の組み換えプラスミドの開発を開示し、ロシアの発明で生成されるプラスミドがpRRproinsである。該プロインスリンは、大腸菌JM−109株−pRRproins(組み換え菌株)の培養を伴う工程により調製される。その後、封入体の単離、可溶化、イオン交換クロマトグラフィー、トリプシン及び他の酵素によるタンパク質分解を用いて、インスリンを確実に単離しなければならない。既に考察したすべての発明の場合と同様、RU2143492によるロシアの発明特許出願が本発明と共有する独自の特徴は、生成物を生成する大腸菌株及びプラスミドによる形質転換の使用である。即ち、該出願は該菌株をベクターとして用い、これは、当技術分野で広く構想されている態様である。しかしながら、該使用は、常にヒト遺伝子に関し、動物で発現されるタンパク質をクローニングするのに用いることを目論む本発明の場合とは異なる。加えて、関与する配列、ベイト、及び使用がきわめて異なる。解析されたすべての出願において、発明単位は、異なるプロトコール下における、プラスミド又は別のベクターにより形質転換された菌株の培養及び生成物の単離のみに寄与する。工程の段階は細菌株によるクローニングであるが、プラスミドが魚類を攻撃する病原体のウイルスタンパク質(VP2)に関する検討を含むため、本発明特許出願における発明単位ははるかにより広範である。その後、クローニングされた配列を含むプラスミドが単離され、陽イオンリポソーム内に封入される。この複合体(リポソーム−プラスミド)が、養殖される動物への有効成分のトランスフェクション媒体及び投与用製剤として用いられる。加えて、ワクチンが飼料中に含まれているので、飼料供給の形でワクチンを与える段階を含むまったく新規の発明技術が産業的工程を介して開発されている。これらの態様は、単独又は全体のいずれであれ、当技術分野のいずれの文献においても考慮されていない。
【0031】
RU2130071によるロシアの出願は、ヒルジンHV1を調製する方法を開示している。該工程は、分泌ベクターpMTS HV1又はpMKS HV1による大腸菌JM−109の組み換え菌株(BP−32266)の形質転換により実施される。該菌株は、形質転換された後で培養され、すぐに培地又は細胞膜周辺腔から最終的なアイテムが単離された。構築されたプラスミドは、3つの主要なエレメント:アルカリホスファターゼをコードするDNAフラグメント、Accl部位と結合したヒルジンのHV1フラグメント、及び遺伝子マーカーとしてのアンピシリンに対する耐性を決定する遺伝子を含有する。該システムは、この使用による出血の低減を改善として示す。ロシアの発明特許出願は、クローニングされる遺伝子が、細菌内で増幅することが望ましい遺伝子との類似性を示さないので、本発明特許出願とはいくつかの重要な違いを示す。本発明特許出願において、細菌株は同一であり、それがクローニングベクターであるという意図も定義上は同一であるが、プラスミドも遺伝子も類似性を示さない。本発明者らは、クローニングが、多数の段階からなる工程を主張することが望ましいと考えるならば小さくはない、保護することが望ましい工程内部の段階にすぎないことを考慮しなければならない。既出のすべての出願と同様、RU2130071によるロシアの出願は、別の生物学的機能を有し、プラスミドの宿主としての大腸菌JM−109株から形質転換される細菌株、及び関連する単離工程を主張するにすぎない。使用及びコンセプトのいずれも、本発明特許出願で用いられる使用及びコンセプトとは異なる。
【0032】
JP2084195の日本の出願は、大量のタンパク質生成過程を開示する。工程は、肝臓タンパク質をコードするDNAフラグメントからなるプラスミドを内蔵する特殊性を有するベクターによる宿主微生物の形質転換に基づく。該工程を開始するため、肝臓を浸軟させ、酵素で直接処理する。ヒトポリタンパク質(HAPE)又はHAPEと類似のポリタンパク質をコードするセグメントは、従来の技法により単離される。次いで、大腸菌のDNAを制限酵素で処理して、両方のDNAのシグナルの配列又はコドンを得る。コドンが得られると、発現ベクターすべてを伴うタンデム形態の構造が生成される。ベクターは、TACプロモーションベクター及びリボソームへの結合ドメインからなる特異性を示す。これらの構成要素の組み込みにより、細菌株から構築物pOFAapoEが得られる。例えば、大腸菌JM−109株は、形質転換状態下でヒトEポリタンパク質を生成する。該タンパク質は、微生物が培養される培地中で分泌される。日本の発明特許出願は、本発明特許出願とはいくつかの違いを示す。例えば、細菌株は同一であるが、本発明特許出願における細菌ベクターはヒト用ではなく、同じクローニングベクターを用いようとする生物学的観点から見る限りプラスミドも遺伝子も類似性を示さず、異なる遺伝子がクローニングされるので、クローニングされる遺伝子が、本発明特許出願における細菌ベクター内でクローニングすることが望ましい遺伝子との類似性を示さず、クローニングベクターの使用というこの段階における意図は同じであるが、完全な違いを表す。したがって、プラスミドのヌクレオチド使用及びその配列の違いが残る。
【0033】
日本の先行特許では大腸菌JM−109株がベクターとして用いられるが、主張することが望まれる本発明特許出願で用いられる配列はヒト配列でなく、したがって、解析されたすべての出願とは異なる。加えて、クローニングはすべての出願に共通する段階であり、これは、細菌株のベクターとしての使用が当技術分野で広く知られる態様であることを意味するが、該使用は常に動物ではなくヒトの遺伝子に関する。加えて、解析されたすべての発明では、発明単位が、異なるプロトコール下におけるプラスミド又は別のDNAベクターにより形質転換された菌株の培養、及び、その後の生成物の単離のみに寄与する限りにおいて、関与する配列、ベイト、及び使用が著しく異なる。主張することが望ましい工程の段階が、宿主細菌を介するウイルスエピトープ(epitonic)のクローニングであるため、本発明特許出願における発明単位は、はるかに多岐にわたる。クローニングすることが望ましいペプチド配列は、魚類を攻撃するIPNVウイルスであるウイルス性病原体のタンパク質VP2の一部である、725bpのポリペプチドである。該細菌は、クローニングされる配列を含有するプラスミドにより形質転換され、次いで、培養され、最後にプラスミドを抽出するように処理され、これが、精製後に陽イオンリポソーム内に封入される。これは、既に考察されたいずれの発明においても用いられていない。このLipoplex複合体(リポソーム−プラスミド)は、魚類において免疫反応を引き起こす能力を有するADN配列からなる媒体として用いられる。この技法を用いて魚類に免疫感作することは、該技法の1つの適用にすぎない。新規でまったく独創的な本発明の重要な態様は、これによって飼料供給の形で魚類及び他の生物に薬剤を与えることが可能となり、これは、当技術分野におけるいずれの文献も、単独又は全体として考慮していない態様である。
【0034】
4.DOTAPリポソームの使用に関連する探索
本発明特許出願では、DOTAPリポソームが、トランスフェクション媒体として、並びに、加えて、複合体及び安定化エレメントとして用いられた。次に、最も重要な発明(initiative)について考察する。
【0035】
国際公開第9807408号パンフレットによる発明特許出願は、生物学的に活性な試薬の送達又はトランスフェクションのシステムとして開発された陽イオンリポソームの使用を保護する。リポソームの構造は、リポソーム二重層間に挿入された1つ又は複数の物質又は有効作用物質を想定する。この構造は、その内側にある作用物質を保護する。該システムは、「生きたままでの」トランスフェクションにおいて高度の有効性を示す。ポリペプチドの最高度の発現は胃内で得られたが、いくつかの臓器及び組織内での発現も上昇した。参照された出願は、熱、及びその後のコレステロール分子の添加、超音波処理、空隙率の低いフィルターを介する脂質成分の連鎖的な形態への押し出し成形によるリポソームの生成を主張する。参照された発明特許出願は、分子媒体としてのリポソームの使用を主張するが、それは一般的な形態においてである。加えて、この先行特許においてリポソームに認められた使用は、相乗作用的であるコレステロール分子と関連する。提起される発明特許出願において、複合体製剤はその製剤又は相乗作用においてコレステロールを用いず、配列は新規であり使用は特徴的である。複合体の生成が全般的な工程の挿間的段階であることは、本発明者らの優先権(initiative)にある。製剤はlipoplexと称し、コレステロールを含有せず、その配列はウイルスタンパク質のエピトープをコードする。本発明は、第4項で考察されるすべての先行特許のように、生体活性それ自体として考案されるのではない。リポソームは、魚類の免疫系内において応答を引き起こす配列の発現を目的とする媒体であり、次に本発明者らが検討するすべての出願などの、ヒトにおける美容及び/又は医薬的なタイプの適用ではないので、発明された製剤は、この項に群別されるすべての発明特許出願の製剤とは異なる。
【0036】
国際公開第9810748号パンフレットによる発明特許出願は、陽イオンリポソームの使用法及び製造手順を保護する。該使用法は、その脱水及び水和技法に基づく。このため、第1に、細胞は無傷で(morning)採取しなければならず、これを培養し、後でそれらが治療作用を有することが望まれる生体の体外でトランスフェクトされる。次いで、「生きた」作用を及ぼすように、細胞が該生体に導入される。参照される発明特許出願は、リポソームの内容物がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであると主張する。リポソームに導入された情報は、その機能が、それらが投与された個体内に免疫反応を引き起こすことである、2本鎖DNA線維又はmARNである。該国際公開出願がポリヌクレオチド、特にその遺伝子構造を主張しており、したがって、場合によっては、これにより、プロモーション配列及びリボソームに対する結合配列が提示されなければならない。加えて、リポソームの陽イオン成分はグリセリドである。リポソームの製造手順は、以下の通りにまとめられる一連の段階を含む工程として主張される:脱水段階、次いで、マイクロ流及び押し出し成形をもたらす水和段階が続く。最後に、国際公開第9810748号パンフレットによる発明特許出願は、「薬剤として許容される」賦形剤を伴う筋肉内経路、皮下経路、静脈内経路、又は腹腔内経路によることが可能である、リポソーム−ポリヌクレオチド複合体の投与経路を主張する。
【0037】
国際公開第9810748号パンフレットには、リポソーム−ヌクレオチド複合体の製造手順を含む本発明特許出願との大きな違いの他、リポソームの使用及び適用に実質的な違いが存在するが、リポソームの使用における全般的なコンセプトが同一であり、結果として、本発明特許の出願は新規性を欠くことになる。にもかかわらず、該手順は、いくつかの違いを示す。個体の細胞を抽出する必要なしに「生きたままの」免疫反応を引き起こすリポソームの使用が強調されることはこれらの違いであり、これは、類似の先行特許(initiative)では主張も開示もされておらず、その優先権が、培養され、速やかにトランスフェクトされなければならない細胞の抽出物を示唆する手順を明らかに主張する国際公開第9810748号パンフレットにおいても示されていない。次いで、ある洗練された方法により細胞は個体に再び組み込まれ、そこで、治療作用をもたらす。本製剤において保護することが望ましい手順は相乗作用を用いず、投与経路が国際公開発明特許出願において主張される投与経路とは異なり、本発明特許出願の新規性及び独創性を強調する違いとなるので、本出願に関連するさらなる独創性が存在する。
【0038】
米国特許出願公開第2005249794号明細書による発明特許出願において主張される組成物は、DOTAPリポソームがその1つである、複数種類のリポソームを保護している。米国の発明特許出願は、オリゴヌクレオチドを封入するリポソームの使用を主張する。これらの物質は、サイトカインの分泌を刺激する機能を有する。該オリゴヌクレオチドは、治療された哺乳動物における免疫反応を改善しない。しかしながら、米国の出願では、非免疫生体中においていずれかの免疫反応を引き起こす特異的な配列である、用いられたオリゴヌクレオチドの性格を確立していない。脂質粒子と連結された抗原分子の投与がこの応答に寄与するため、米国の特許出願は、その中で主張される抗原に対する特異的な免疫反応の生成を保護する。主張された組成物が、オリゴヌクレオチド内では指定されない配列を含有するため、米国の発明特許出願の重要な態様は、主張された配列に関する。米国の出願は、オリゴヌクレオチドの核酸が、陽イオン脂質を含有しうることを示す。しかしながら、これは、ホスホジエステル又はホスホチオレートでなければならない。これは、CpGなどの領域(reason)を含有するヒトゲノムに相補的な配列であってもなくてもよく、機能性により一般化されるパリンドローム配列を含有してもよい。
【0039】
米国の出願は、その残基がホスホジエステル及び相乗作用的な脂質に結合したCpG領域を有するオリゴヌクレオチドを含有する製剤を主張する。該脂質は、PEG若しくはPAO又はガングリオシド型の構造を示す。この組成物は、リポソーム内に含有される。米国特許出願公開第2005249794号明細書による米国の発明特許出願は、DOTAPがその1つである、製剤を産出するのに用いうる一連のリポソームを主張する。本発明者らの優先権の場合、DOTAPリポソーム及びヌクレオチドのみを用いたが、このヌクレオチドは、サケ科魚類のゲストでありその発現が腸内細胞において生じるウイルスペプチドをコードする。本発明者らが検討したすべての先行特許において、リポソームは、非免疫生体に直接に導入される。しかしながら、本発明の大きな違いは、リポソームが、明確に定められたプロトコールにより、魚用飼料をもたらす製剤に組み込まれることである。DOTAPリポソームがすべての哺乳動物における使用ではなくヒトでの使用に向けて考案されているため、同様の出願は、リポソームが魚類において用いられることに言及しない。高等哺乳動物系におけるその使用を主張する先行特許は存在するが、それでも、飼料製造―ヒト以外の生体に腸内放出を介して吸収されうる物質の導入をもたらす一般的な形態における―に関する先行特許は存在しない。
【0040】
米国特許出願公開第2003220284号明細書による米国の発明特許出願において保護される方法は、DOTAPリポソーム、コレステロール、及びウイルスヌクレオチド分子を用いる組成物に関する。該ヌクレオチドは、組み換えアデノウイルスの環状DNAである。この製剤は、ヒト胃癌に対する免疫反応を中和化する治療担体である。製剤、方法、手順、及び使用が、本発明特許出願において主張することが望ましい製剤、方法、手順、及び使用と異なるので、米国の出願は、保護することが望ましい本発明特許出願とは大きな違いを示す。これらの違いは大きく、本先行特許の発明単位に影響を及ぼさないため、これらの全体については考察しない。
【0041】
ES2224836によるスペインの発明特許出願が、腫瘍様細胞への非ウイルスベクターのトランスフェクション、及び、その後の放射線照射に関する手順を主張している。用いられるリポソームはDOTAPであり、このベクターの使用に放射線照射段階が後続する。トランスフェクトされた細胞の発現により、顆粒球コロニー増殖因子(GM−CSF)が生成される。遺伝子治療の領域におけるトランスフェクトされた細胞の使用、及びその抗腫瘍薬としての使用。
【0042】
スペインの出願は、本発明者らの先行特許と異なるコンセプトを示す。例えば、調合工程の他、発明された技法の使用においても、それらは高分子レベルでの違いを示す。いずれの先行特許にも共通するのは、トランスフェクションベクターとしてのリポソームの使用のみであり、用いられるプラスミドの他、情報及び方法は、使用及び意図の大きな違いを示す。
【0043】
米国特許出願公開第2002168662号明細書によるアメリカの発明特許出願が、患者における癌の退縮又は進行を決定する方法を開示している。該手順は、試験抗原としてのSp17分子の検出及び同定に基づく。このため、既に癌と診断された患者の試料が採取(practice)される。試料中では、Sp17タンパク質をコードする核酸分子の発現レベルが決定される。次いで、正常な発現レベルが、患者におけるSp17分子の発現レベルと比較される。それらの間の違いにより、癌の進行又は退縮が示される。
【0044】
該発明の手順並びにコンセプトは、本発明との重大な違いを示す。それらは、本発明の分野とかけ離れており、まったく異なる発明単位であるため考察しない。
【0045】
国際公開第9527508号パンフレットによる国際公開発明特許出願は、哺乳動物において、ある抗原に対する免疫反応をもたらす組成物を開示する。該組成物は、リポソーム(DOTAP)内に取り込まれ、相乗作用物質(ISCOM)により統合される抗原を含む。組成物は、経鼻、気管内、経口、皮内、直腸を含むいくつかの経路、及び注水により投与することができる。抗原は、皮膚、気道、尿生殖路、又は別の粘膜表面の感染に関与する生物に由来する。加えて、該微生物は、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、又は真菌でありうる。国際公開第9527508号パンフレットによる発明出願は、それが攻撃しうる病原体又は用いられる配列を定義せずに、発明の分野を拡張している。該出願は、投与経路も製剤も定義していない。該出願は、DOTAPリポソームを媒体として用いる想定された組成物の最終的な機能のみを定義している。しかしながら、国際公開第9527508号パンフレットによる出願は、同一の抗原を有効成分として定義しているが、該抗原をおそらく生成する配列は定義していない。加えて、国際公開第9527508号パンフレットによる国際公開特許出願が開示する組成物は、相乗作用物質としてのISCOMの使用を組み込まなければならない。本発明者らの出願は、有効成分が製剤中に含まれる同一の抗原ではなく、異なる組織内で発現され病原体に対する免疫反応もまた生成する分子の一部を生成する配列であり、生物学的関係における根本的な違いが生じることを示唆するため、まず組成物の違いが重要である。
【0046】
本明細書で本発明特許出願により主張される製剤のDOTAP−ヌクレオチド複合体は、工程の1段階であるだけでなく、むしろ、新規の栄養製剤の封入媒体であることに注目されたい。それは、DOTAPの使用に関する発明でありそのすべてが薬剤複合体の直接的な使用を主張する過去のすべての出願と異なる。これは、複合体が相乗作用と共に異なる方法下で応答を生成し、生体活性が直接的である場合に、リポソーム−有効成分の複合体が用いられることを意味する。既に考察された発明特許出願において、リポソーム−分子複合体及び相乗作用(すべての出願が相乗作用を主張する)は、同一の生物学的機能を有し、さらに重要なことだが、同一の生体活性を有する。一部の先行特許が、非免疫生体中における免疫反応、一般には癌に対する免疫反応の生成を主張するにすぎない。しかしながら、各製剤に由来する手順及び使用は異なり、結果として、それらは、方法の一部として、及び、手順中において主張されている。用いられるコンセプトのために本発明特許出願は他のすべての出願と異なり、放出ベクターの使用に関し類似のエレメントが用いられるが、本発明は直接的な生体活性及びそれに適用されたプロトコールを示さず、例えば、本発明において用いられる配列は、過去に出願されたすべての出願と異なりヒト用ではないため、手順及び/又は使用のいずれの場合においても、違いが残る。言い換えれば、製剤の有効成分が異なる。加えて、動物用の栄養製剤中に放出媒体(リポソーム−DNA)を含有する場合、主張することが望ましい工程が異なる。したがって、本出願は、解析されたすべての出願と異なる。第1の違いは、用いられる配列の性格に存在する。第2は、プラスミドの使用意図である。第3に、細菌株を用いて、この菌株における形質転換及びクローニングに関して当技術分野では以前に開示されていないプラスミドによりこれを形質転換し、次いで、該プラスミドをある媒体に導入する、即ち、当技術分野では、ヒトにおける遺伝子治療用の媒体としてのプラスミドの使用における場合と同様に媒体が広く考案されているが、本出願は、新規の使用である、動物への免疫感作用のワクチンとしての媒体及びADN配列の使用を開示している。既出において明示した5つの生成物とは異なり、リポソームの使用による工程は回収可能であるがこの工程下での魚類における使用が新規であるので、発明単位は拡張されている。このリポソーム−プラスミド複合体は、その内部にDNAワクチンを含有する媒体として用いられ、加えて、新規でまったく予想外の技法に基づき、飼料供給の形で魚類に提供され、これは、当技術分野における文献が単独又は全体として考慮しない態様である。
【0047】
本発明は、従来のワクチン接種システムに対して多大の利点を提供する。本発明は、弱毒化微生物からなるワクチンなどのように毒力復帰問題が存在しないので、安全なワクチンを開示する。該ワクチンは、何らかの相乗作用物質を伴う場合に生じる有毒な副作用を及ぼさない。投与形態及び放出媒体として大きな安定性を有することの他、毒性の病原性菌株の攻撃に対する有効な防御が示されている。本発明は、長期的な防御を提示するために考案されている。
【0048】
5.魚用ワクチン製剤に関する出願の探索
GB2308367による発明特許出願は、免疫抑制活性を示すタンパク質の使用を開示する。該タンパク質は、アエロモナス(Aeromonas)属種から単離された。それは、非溶血的な性格であり、30KDaの分子量を特徴とし、酵素活性を示さない。該タンパク質は、細胞の免疫反応を抑制する特徴を示し、特に、フルンケル(furunculous)に対する免疫感作を魚類、特に、サケ科魚類に行うワクチン製剤において用いることができる。用いられるコンセプトに関する限り本発明との違いは基本的であり、製造工程に関する違いは多岐にわたる。何にもまして、英国の出願は、ワクチンの投与形態にも最終的な組成にも言及しない。それは、目的及び「ワクチン製剤において又は魚用に用いうる」ことのみに言及する。英国の出願は、魚類へのワクチン接種の方法又は形態にも、そのための具体的な製剤にも一切言及せず、英国の出願では投与形態がまったく看過されている。発明単位が工程保護の目的を具体的に指向し、新規段階の保護を意図し、それらにおける予想外の利点を示す本発明特許出願の場合はまったく異なる。加えて、既存の工程に関する限り、本発明は新規である。加えて、各段階は、例外的な生成物を特に提示する。最終生成物の1つは、その製剤、放出機構、経路、及び製剤が、英国の出願による発明単位とは明確に分離され、本発明特許出願では明確に定義される魚用ワクチンである。
【0049】
米国特許第5939073号明細書による米国の発明特許出願は、魚類において膵臓疾患をもたらすウイルス株の単離を開示する。該ワクチンは、有効成分として不活化ウイルスを提示する。加えて、診断補助キットが保護される。診断は、評価される魚類試料に特異的なウイルス形態を検出する抗体を見出す段階に基づく。該抗体は、検出可能なマーカーを有する。該方法は、魚類試料を採取する段階、試薬による反応、及びその後の試料中におけるウイルス量の検出を含む。該出願は、特異的な組織からのウイルスの検出に関する他の手順も主張する。違いは大きい。第1に、米国の発明特許出願は、弱毒化ウイルスを用い、核酸配列を用いない。ワクチンは同じウイルス(IPNV)に対して効果を及ぼさない。本発明特許出願は、それに対して防御すべき病原体に特異的な製剤を主張する。米国の出願は、プラスミド、菌株、又はリポソームの使用又はこれに対する言及を行わず、その放出は、それに対して防御することを所望するウイルス用の栄養製剤と結合されない。
【0050】
米国特許出願第5914260号明細書による発明は、魚類、特に、アトランティックサーモンにおける膵臓疾患を引き起こす新規のウイルスについて説明する。ウイルスの単離法が開示され、また、ウイルス株又はワクチンなど該ウイルスに由来するタンパク質及び/若しくはポリペプチドの使用も開示される。診断キットは開示されるが保護されない。ウイルス株のみが主張されている。本発明特許出願との違いは大きい。該方法、使用、配列、手順、及び、本発明と異なる特徴については考察しない。
【0051】
サケ感染性貧血症(ISA)ウイルスに対するワクチンは、ノルウェーの優先権及び国際公開第0072878号パンフレットによる国際公開発明特許の提示の下で開示されている。該発明は、ウイルスカプシドからの単離体である免疫原性タンパク質をコードするウイルスADN配列として開発された、ISAウイルスに対するワクチンの開発に関する。ウイルス核酸配列検出用の診断キットもまた開示される。ワクチンは、ウイルスタンパク質をコードするADN配列を含むことを特徴とする。本発明特許出願との違いは大きい。国際公開第0072878号パンフレットによる発明特許出願は、同じ配列又は類似の機能性を示さない。加えて、配列をクローニングするのに用いられるプラスミドは、本発明で用いられる配列と関連を示さない。最後に、国際公開特許の発明は、リポソームも用いず、何らかの製剤についての説明も行わない。工程は、国際公開発明特許出願において言及されていないので、該発明分野の外にある。
【0052】
EP1094069による欧州の発明特許出願は、その主要なエレメントがウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列である製剤を保護する。検討された微生物は、サケ感染性貧血症ウイルスであった。欧州の発明出願では、タンパク質(SP1)の単離、診断又はワクチン用の使用の意図及び試薬が主張されている。ワクチン組成は単純であり、核酸配列又はタンパク質及び「許容される」担体を含む。キットは診断用に主張されている。主成分は、従来の免疫学的側面に基づき、このタンパク質(SP1)を認知する抗体により、試料中における核酸又はタンパク質(SP1)が検出される。本発明特許出願との違いは、配列、クローニングベクター、媒体又は担体、製剤中におけるプラスミド及びリポソームの存在に由来して大きい。製造工程内におけるワクチンの完全性は、新規性又は独創的レベルにおいて既に考察した出願による影響を受けない。
【0053】
米国特許出願公開第2005164176号明細書及び米国特許出願公開第20055261227号明細書による米国の発明特許出願は、ISAウイルスに対するワクチン製剤及び魚類への免疫感作のための異なる核酸配列又はペプチド配列の使用を開示する。該ワクチンは、合成された配列がウイルスに由来するか又は類似形態にあり、該配列がペプチドに翻訳されるという事実に基づく。米国の出願では、該タンパク質がウイルス抗原性応答を引き起こす表面であるという基準が適用されているので、該ペプチドはワクチンの一部である。したがって、いずれの場合も、ISAVに対するワクチンの使用が開示され、特異的なペプチド配列のワクチン内への組み込みが、いずれの先行特許によっても保護されている。加えて、ワクチンは薬剤形態の他、診断キット及び組成物を含有する細胞(形質転換細胞)としても保護されている。本出願との違いは、用いられた配列、ベクター、プラスミド、及び微生物に由来して大きい。共通する態様は、DNAワクチンのコンセプト又は含まれるポリヌクレオチドに関連することに限り、形質転換媒体若しくは放出媒体又はこれらと同じ製剤が大きく異なっているため、なお、重要な違いが残る。これに劣らず重要な別の異なる態様は、本発明の特許出願において構想される意図とは異なる意図である。ワクチンは、本発明特許出願において主張される新規な発明工程の生成物であるので、本発明者らが工程について語っていないことに注目されたい。
【0054】
米国特許出願公開第2005226895号明細書による米国の出願が開示する魚用ワクチンは、配列の保存を除き同じ発明単位を開示する米国特許出願公開第2005164176号明細書及び米国特許出願公開第20055261227号明細書による出願の場合と同様に、有効成分としてのヌクレオチド配列又はペプチド配列及び担体を意図する製剤により、サケ科魚類においてピスシリケッチア・サルモーニスに対する免疫の生成を保護する。本発明は、配列、放出及び製剤に関する違い以外に、微生物、クローニングベクター、動物ではなく主にヒトのDNAをクローニングし、陽イオンDOTAPリポソームなどのトランスフェクション担体中に製剤を導入するのに用いられてきたプラスミドの使用において違いを示す。プラスミドワクチンを含有する飼料の製造工程に関する違いが残る。
【0055】
米国特許出願公開第200423580号による発明は、ISAVに対するワクチンを開示する。抗原性ポリペプチド分子又は抗原性核酸分子が、それらをコードする媒体に封入され、その有効成分が核酸分子であり、加えて担体により構成されるワクチンをもたらす。米国の発明特許出願は、製剤中において相乗作用分子も役割を果たすことを開示し、診断用キットも主張される。本発明は、配列、トランスフェクション、及び製剤の違い以外に、工程及び投与経路に関する違いも示す。
【0056】
米国特許出願公開第2004146860号明細書、国際公開第03/035680号パンフレット、CA2321437、国際公開第01166569号パンフレット、国際公開第0149712号パンフレット、及び米国特許第69119083号明細書による出願は、ISAVウイルスに対するワクチンである。すべての出願は、製剤の有効成分としてのペプチド又はヌクレオチド配列の保護である同じ意図を示す。すべての製剤は、ISAVに感染した動物から得られた抗体に結合するポリペプチドをコードする配列に基づく。診断キットもまた、発明特許出願の一部で主張されている。本発明は、大きな違いを示す。組み換えプラスミドにおいて現れる配列及び陽イオンリポソームにより実施される放出の違い、新規の薬剤組成物を定義する違い以外に、配列がIPNVウイルスなどの異なるウイルスの配列であるため異なり特徴的であることから、第1の大きな違いは有効成分である。栄養製剤における経口経路を含む放出過程によっても大きな違いが残る。
【0057】
KR2003078807、CA2407301、及びCA2381708による出願は、ピスシリケッチア・サルモーニスに対するワクチンを提示する。前出の一連の特許と同様に、本節にまとめられた出願はすべて、その活性物質がハイブリッド的又は分子的な性格を有する魚用ワクチンであり、魚類へのワクチン接種後にヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の放出により免疫反応をもたらす製剤であるために本発明と関連するにすぎない。本発明特許出願との違いは大きく、組成も異なる。クローニング段階において役割を果たすベクターが異なり、放出は他の経路によってなされ、他の作用物質が役割を果たす。まとめると、本発明特許出願において主張されることが望ましい組成物に類似する、IPNVウイルスに対するDNAワクチン製剤は見出されない。
【0058】
国際公開第2003/101482A3号パンフレットによる出願は、リポソームと結合した1つ又は複数の魚類病原体に由来する抗原性物質を含む魚用ワクチン製剤を開示し、場合によって他の治療化合物を含む。ワクチンは、これらの魚類病原体に対する免疫感作又は治療的処置に用いることができる。該発明はまた、リポソームによるワクチンの調製法、投与法、及び保存法も主張する。
【0059】
該国際公開出願は、IPNVに対するワクチンを生成するのに用いられるリポソームを主張するが、記載された配列は、ベイト配列も発現されたペプチド配列も報告されていない。組成物は、その成分によって主張されなければならないが、該国際公開出願では、組成物に由来するどの部分が具体的にDOTAP陽イオンリポソームであるのかを確立していない。加えて、主張された組成物は、決定された魚種用の特異的な使用を有し、本発明特許出願において保護することが望ましい使用と異なる。該国際公開出願の薬剤組成物は、IPNVウイルスのヌクレオチド配列でありうる有効成分である「リポソーム」により構成される。しかし、既存のいずれのリポソームであるかが説明されていないため、1つ又は複数の脂質クラスが、1つ又は複数の生体活性物質、1つ又は複数のアジュバント作用物質、生体活性作用物質、及び「薬剤として許容される」担体であることが曖昧に示されるにとどまる。即ち、ほとんど無関係とは考えられるが、国際公開発明特許出願は、主張されることが望ましい組成物を報告していない。加えて、製造工程が明らかに異なっており、国際公開出願は、有効成分が魚類にどのように与えられるかについても説明していない。国際公開出願が確立するのは、生成物がリポソームによる製剤から生じるということである。しかしながら、本発明特許出願において、生成物は、特に感染性膵臓壊死ウイルス用のワクチンを含有する栄養製剤である。同じ技法を他の病原体にも用いることができる。
【0060】
チリには、魚用DNAワクチン製剤に関連する発明特許出願がただ1つだけ存在する。「抗原及びアジュバント、溶媒又は薬剤として許容される媒体、並びにADN配列及び抗原タンパク質を含む、魚類中のカイアシ類(caligid copepod)による感染に対するDNAワクチン及びペプチド」と称する発明特許出願である。本出願との違いは、用いられた配列、プラスミド、宿主細菌、及び生体に由来して大きい。共通する態様は、DNAワクチンのコンセプト又は含まれるポリヌクレオチドに関連することに限り、例えば、形質転換媒体又は放出媒体及び製剤が大きく異なっているため、なお、重要な違いが残る。別の重要な態様は、本発明の特許において構想される意図とは異なる意図である。ワクチンは、本発明特許出願において主張される新規な発明工程の最終生成物であるので、本発明者らが、工程について語っていないことに注目されたい。
【0061】
6.DNAワクチンを含有する魚用栄養製剤の調製に関する出願の探索:
この探索基準の下で一致する文献は見出されず、このため、主張することが望ましい工程は新規であり、大きな独創性を有する。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】用いられるベイトは、図1で見ることができる。
【図2】図2は、以下のベイト: センス :S1、S1p 608bpのフラグメント(ベイトS1p及びS2p) アンチセンス:S2、S2p 725bpのフラグメント(ベイトS1及びS2) 組合せ 増幅のサイズ(bp) S1p及びS2p 608 S1及びS2 725 により増幅されたウイルスARNに由来する免疫原性配列の増幅スキームを示す。
【図3】図3は、本先行特許のために生成されたIPNVのVP2タンパク質の免疫原性ウイルスペプチドをコードする725bpの遺伝子領域の配列を示す(その配列決定は、チリ大学理学部バイオテクノロジーセンターにおいて実施された)。
【図4】図4では、ベクターpcDNA4/HisMaxTOPOの多重クローニング領域が詳細に検討される。
【図5】図5は、トランスフェクトされた細胞培養物から単離されたpcDNA−VP2プラスミドからの挿入配列の増幅を示す。
【図6】図6は、プラスミドワクチンの構造的安定性の評価結果を示す。
【図7】ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が180°回転して、秤量包装用(pre−encasado)ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図7及び8に付属のフローチャートに見ることができる。
【図8】ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が180°回転して、秤量包装用(pre−encasado)ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図7及び8に付属のフローチャートに見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0063】
[発明の説明]
本発明は、工程及び生成物を保護する意図を有する。該工程により、養殖システムにおける生体の飼料中に含まれる病原性ウイルスに対するある種類のDNAワクチンからなり、分子生物学の技法を介して開発された動物用薬剤組成物の調合が可能となる。保護される生成物は、上述の薬剤組成物であり、その主要な特性は、大量生産システム内にある動物に対して、経口形態で―各個体を操作することなく―投与しうることである。
【0064】
本出願において達成された成果は、より具体的には漁場システムにおけるものであり、魚類病原体に対するものであった。本発明は、ウイルス病原体に対するDNAワクチンの製造工程を主張することを目論む。このワクチンは、魚類、特に、サケ科魚類に適用され、漁場施設向けに考案されている。本発明は、ウイルスポリペプチド成分をコードする遺伝子配列の単離から産業的規模での工程までに及ぶいくつかの段階からなる。該工程は、個体がワクチンを含有する飼料を貪欲に摂取し、これが魚類によって腸溶性の形態で吸収され、魚類の異なる組織において薬理学的作用を及ぼすように、美味の賦形剤を伴う本製剤の作製において存在する。
【0065】
保護される製剤は、その有効成分をリポソームとも組み合わせてプラスミド中に含有される対象の遺伝子配列であり、飼料の一部である製剤として、経口形態で投与されるように考案される。
【0066】
本発明は、任意の種類の生体に免疫感作するワクチンを含有する飼料の製造に適用しうる工程を主張することを目論む。本事例では漁業に適用されるが、本工程は、とりわけ、鳥類、ブタ、ウマ、ヤギの肥育業に適用可能な工程でありうる。
【0067】
ウイルス、タンパク質、及びベイトの生成
感染性膵臓壊死ウイルス(IPNv)は、ビルナウイルス科のウイルスであり、ARN二重鎖からなるそのゲノムは2分され、小型のサブゲノムセグメント(セグメントB)が酵素であるARN依存性ARNポリメラーゼ(VP1)をコードするのに対し、大型のセグメント(セグメントA)は、ポリタンパク質NH2−VP2−VP4−VP3−COO−をコードする(ここで、VP2及びVP3は構造タンパク質であり、VP4は、これにより前駆体である中間体が逐次生成され、次いで、機能的な成熟成分が生じる、タンパク質分解による自己分解過程を担うウイルスプロテアーゼである)。これらは、全面的に曝露されるか又はウイルスカプシドの最外層において部分的に曝露されるVP2、VP1と相互作用する(このためにカプシドの内側に存在すると本発明者らは考える)タンパク質であるVP3、及び自己分解過程の一因をなすプロテアーゼであるVP4である(Duncan及びDobos、1986年;Duncanら、1991年)。
【0068】
第1段階は、病原体の遺伝物質、本例ではARN又はDNAを得る段階である。ARNは、明らかな免疫原性を有するタンパク質セグメントをコードする配列の増幅に必要である。サケ科魚類を攻撃するIPNVウイルスの場合、VP2タンパク質のサブユニット「A」領域をコードする相補的DNAが増幅された。この目的で、サケ胚細胞のコンフルエントの単層であるキングサーモンCHSE−214細胞(ATCC 1681)にIPNウイルスを感染させた。感染後期間の経過後、Trizol(Invitrgen社製)を用いて全ARNを抽出した。細胞からウイルスARNを単離するため、QIAamp(Qiagen社製)キットを適用し、純粋形態におけるウイルスARNを得た。
【0069】
第2段階は、増幅したヌクレオチド配列を得る段階である。この目的で、対象の抗原領域を含有するウイルスタンパク質をコードする遺伝子配列を定義した後で、まずARNによるベイト、その後、相補的DNA(ADNc)を、すべてインバースポリメラーゼ連鎖反応及びポリメラーゼ連鎖反応を介して構築した。用いられるベイトは、図1で見ることができる。これらにより、特に、IPNウイルスのカプシドタンパク質サブユニット2によるエピトープをコードする情報を選択的な形で増幅及びクローニングすることが可能となる。IPNウイルスの具体例において、増幅されたヌクレオチド配列は、その起点がアミノ末端から約250bpに存在するIPNVのセグメント「A」の配列であった。これを検討するため、このウイルスについて記載された6つの遺伝子群に対応する、以下の血清型:Vr299、Ja−ATCC、C2、Ab、ASV、Sp、及びHeの配列に対するバイオインフォーマティックス解析を考慮した。Vr299血清型は、チリ国内におけるその遍在性を踏まえ、基準血清型として採用した。アライメント解析及び相同性解析は、ジーンバンクのデータベース及びヌクレオチド配列のアライメントプログラム(BLAST又はDNAman)により実施した。解析により、ウイルスゲノムの増幅された配列は、残りのIPNV血清型に対して85%を超える相同性を有することが示された。
【0070】
ウイルスの全ARNに由来する逆増幅(RT−PCR)法の実施にプロトコールを適合させた。対象ウイルスゲノム領域のADNcは、後のPCR法による増幅の鋳型として用いられる。2つのアンチセンスベイトであるS2及びS2pを評価し、これらをIPNウイルスのサブユニットAに特異的な配列とハイブリダイズさせ、相補的なDNA線維を生成するよう設計した。
ADNcが得られたところで、ベイトの異なる組合せを有する配列を増幅した:図2は、以下のベイト:
センス :S1、S1p 608bpのフラグメント(ベイトS1p及びS2p)
アンチセンス:S2、S2p 725bpのフラグメント(ベイトS1及びS2)

組合せ 増幅のサイズ(bp)
S1p及びS2p 608
S1及びS2 725

により増幅されたウイルスARNに由来する免疫原性配列の増幅スキームを示す。
【0071】
PCR法により得られるフラグメントは、アガロースゲル中で可視化され、分光光度法により定量された。その後、エタノールを用いる沈殿反応により、608bp及び725bpの単位複製配列を精製する手順が実施された。
【0072】
図3は、本先行特許のために生成されたIPNVのVP2タンパク質の免疫原性ウイルスペプチドをコードする725bpの遺伝子領域の配列を示す(その配列決定は、チリ大学理学部バイオテクノロジーセンターにおいて実施された)。
工程の第3段階は、プラスミド構築物の形成及び発現ベクターへの挿入である。哺乳動物の発現ベクターpcDNA4/HisMaxTOPOにより、効率の高い増幅産物の挿入が可能となる。用いられるウイルスプロモーターは、翻訳ポテンシャルを有するサイトメガロウイルス(CMV)であり、これを用いて高レベルの発現を得た。PCR産物から生成されたポリペプチドを検出及び精製する目的で、このポリペプチドは、エクスプレス(Xpress)(登録商標)のN末端及び残りのヒスチジン(インビトロジェンライフテクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)(登録商標)社製)に隣接する形で発現させる。
【0073】
プラスミド構築物は、プラスミドpcDNA4/HisMaxTOPOを宿主とする所望のポリペプチドをコードする配列を含む。このプラスミド構築物を、pcDNA−VP2と命名する。このベクターを増幅するためには、既知量の対象挿入配列により形質転換された大腸菌JM−109株を用いた。選択圧力(カナマイシン及びアンピシリン)を加える液体培地中での組み換え菌株の増殖後に、プラスミドを有する細菌クローンを単離した。挿入を含む及び含まない状態で制限酵素PvuIIにより切断された配列を比較した後に、また、多重クローニング領域をプラスミドpcDNA4/HisMaxTOPOに特異的なベイトで伸長させたときに、遺伝子の挿入及びその正しい方向を確認した。図4では、ベクターpcDNA4/HisMaxTOPOの多重クローニング領域が詳細に検討される。
【0074】
選択圧力を有する培地中における大腸菌JM−109の細菌コロニーの存在により、遺伝物質を受容する菌株の存在が示される。形質転換菌を確実に維持するために、これらを培養槽中のルリア−ベルターニ培地中で4時間にわたり培養し、速やかに−80℃のグリセロール中で保存した。
【0075】
プラスミドの精製は、細菌の培養後に実施した。実験室での解析には、Biorad社製の「Quantum prep.Plasmid Miniprep」キットを用いた。拡大培養の場合は、500mlを上回る容量の細菌培養物からのプラスミドの精製を可能とする、「QIAGEN Plasmad Mega」キットを用いた。
【0076】
魚類細胞がクローニングプラスミドpcDNA−VP2を取り込む能力を有するかどうか、しかも、IPNVウイルスのVP2ウイルスタンパク質の一部の挿入配列を発現する条件においてそうであるかどうかを判定するため、サブコンフルエントの単層CHSE−214細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクション後の異なる時点で、プラスミドの全DNA及びARNのTrizolによる抽出を実施した。
【0077】
単離されたプラスミドDNAによりPCR法を実施し、選択されたベイト対により定義された増幅産物を得た。1%のアガロースゲル中における725bpの単位増幅配列の存在により、該細胞株が、挿入配列を伴うプラスミドを取り込む能力を有することが示された。全細胞培養物から抽出されたARNに対して、RT−PCR法による何らかの解析を実施して、試料中に存在するメッセンジャーARNからIPNVのVP2配列を増幅すると、これは、図5に示す通り、トランスフェクトされた細胞培養物に由来するpcDNA−VP2プラスミドからのウイルス挿入配列の増幅を検証するアガロースゲルを示す。図5は、トランスフェクトされた細胞培養物から単離されたpcDNA−VP2プラスミドからの挿入配列の増幅を示す。プラスミドDNA及びメッセンジャーARNは、CHSE−214細胞から抽出された(トラック4及び5)。725bpのフラグメントは、PCR法によりプラスミドベクターから増幅されて得られた(トラック1、2、及び3)。「0」は分子量マーカーに対応し、「A」は試料中の全RNAの泳動点であり、「B」はプラスミドの泳動点である。制限酵素による消化後に、予測される長さと同様の長さのヌクレオチドフラグメントが得られることを検証することができる。また、プラスミドを得る段階により、細胞株内へのプラスミドの取り込みが示される。
【0078】
媒体の選択
本発明は、遺伝子構築されたプラスミドにより恒常的に誘導される発現からなるベクターを含有する新規の細菌細胞株を開示する。この細胞株は、大腸菌JM−109株に対応し、図3に示される挿入配列を伴い、図4に示されるプラスミドにより形質転換され、組み換え菌株である大腸菌JM−109(pcDNA−VP2)を構成する。得られた組み換えプラスミドは、IPNVウイルスのカプシドタンパク質サブユニット2の一部である対象ポリペプチドを合成するのに必要な情報を含有する。形質転換後、細菌はベクターを組み込み、この遺伝子成分を増幅する能力を有する。決定された製剤により、経口経路を介してこのプラスミド構築物(pcDNA−VP2)を投与すると、特に魚類の非免疫生体中で免疫反応が生じる。プラスミドはまた、アンピシリンからなるマーカー遺伝子も提示する。組み換え菌株である大腸菌JM−109(pcDNA−VP2)は、BCCM(ベルギー微生物保存機関)に寄託され、その寄託番号はLMBP 5333である。
【0079】
本発明の重要な態様は、プラスミドが、クローニングされた後で単離され、陽イオンリポソーム(DOTAP)と複合され、「Lipoplex」と称する複合体を生成することである。本発明の1段階ではあるが、Lipoplexは、それ自体で免疫グロブリンの合成を誘導する。
【0080】
DOTAPリポソームの使用により本先行特許が解決する問題は、無傷細胞(morning cell)が高いトランスフェクション率でプラスミドによりコードされるポリペプチドを発現する、間接的な形質転換手順を確保することである。
【0081】
「lipoplex」複合体中に含有されるDNAの定量化に関しては、報告におけるDNA:DOTAPが1:4のlipoplex試料を遠心分離にかけ、その後水中で再懸濁させ、次いで、アガロースゲル中に投入したことが指摘できる。DNA含有量の推定は、比重計解析により実施した。左側には分子量マーカーが示される。

トラック1:MEM培地中42ngのプラスミドDNA。
トラック2:MEM培地による処理及び遠心分離後におけるプラスミド抽出物の再懸濁。
トラック3:MEM培地中42ngのLipoplexプラスミド。
トラック4:Lipoplexの遠心分離後におけるMEM培地中での再懸濁。
トラック5:MEM培地中170ngまでのDOTAP
トラック6:MEM培地のみ

【0082】
Lipoplexは、陽イオンリポソーム(DOTAP)に複合又は封入されたDNAベクターとして、それ自体で免疫反応を誘導することができる。該ワクチンは飼料に導入され、これは、IPNウイルスのヌクレオチド配列がプラスミドにより発現され、魚類の飼料ベースと調合されることを意味する。試料は消化管内で消化され、ワクチンは、個体の腸内で放出される。薬剤組成物(リポソーム−DNA)は、必要とされる治療的応答をもたらす。この応答は、ウイルス遺伝子配列の細胞による取り込みの結果であり、これによりウイルスペプチドの発現が生じる。ゲストにより未知のポリペプチド配列が示される時、細胞は免疫反応を誘導し、これにより、該配列を自らの表面又はウイルスカプシド中に含有する作用体による感染に対する防御を誘導する。
【0083】
図6は、プラスミドワクチンの構造的安定性の評価結果を示す。実験的に最適化された条件によるCHSE−214の細胞培養物にトランスフェクトし、6、12、24時間後にプラスミド及びメッセンジャーARN(a)を発現し、プラスミド及びメッセンジャーARN(a)を得た。RT−PCR法により、メッセンジャーARNから725bpのIPNV挿入配列(b)を増幅した。
【0084】
このワクチンの、特に魚類への、飼料の形態における投与はまた、ワクチン接種の過程を容易にし、養殖中の魚類の種に応じた最適のワクチン接種段階を選択する可能性を増大させることも仮定する。魚類が病原体に対してより感受性である段階を決定することもでき、特定の養殖種における挙動の動態及び各影響に基づき応答及び有効な抵抗性を誘導することもできる。
【0085】
導入された病原体を根絶する有効な代替法を我が国に適用することは、微小動物相環境に対する明らかな有害作用を伴う抗生剤の無差別的使用を緩和することに寄与するので、本発明は、加えて、生態学的有益性も提示する。
【0086】
飼料ベース製造工程の説明
1)製剤、用量、及び混合物:
実験結果により、Lipoplex取り込みの条件は、具体的には、水溶液の重量に対して0〜50%の範囲内、より具体的には、飼料重量に対して0〜25%の範囲内になければならないことが決定された。飼料粒子の均一な広がりの範囲に加え、散布要素としての噴霧器の使用が定義された。
【0087】
一連の工程は、動物生産施設用の飼料を生成する任意の種類の生産工程向けであることを意図する。しかしながら、本出願では、その投与形態がペレットである飼料製造に関する工程のみが開示され、そのために一般的となる。
【0088】
第1段階では、飼料ベースを調合するための原料がすりつぶされる。選別する段階は、環境基準及び国際基準に基づいて既に決定されている。
【0089】
完成品が生成される工程は、粉末成分混合バッチ及び油分混合バッチの稼働により動物の特定の食餌を構成する1つずつの成分が投入される食餌の調合により始まる。液体生成物と共に投入しなければならないペレット量の他、特定のワクチンなど、非免疫生体に応じて液体成分により投入しうる特定の成分も、バッチ内でプログラムされる。
【0090】
投入及び混合の段階では、成分及び添加物が秤量及び混合され、食餌乾燥粉末成分に適した比率及び均質化が得られる。
【0091】
2)押し出し成形
この段階では、水、油、及び/又は添加剤と混合された成分が、油分及び圧力を介して既に調製されている。押し出し成形機バレル内のエンドレススクリューにより圧力が加えられる。バレルの端部には穴のあいた層又はマトリックスが配置され、これによって2つの球面部分を伴う円筒形の形態が与えられる。この段階により、マイクロカプセルのエッジと同様の丸型エッジを有するマイクロペレットに最終的な形態が与えられる。湿潤式の押し出し成形により、各種の生成物に必要な形態及び物理的外観を有し一定の形に凝集したペレットベースを得るための、食餌の異なる成分に由来するタンパク質テクスチャーの他、炭水化物の部分的なゼラチン化も可能となる。
【0092】
3)飼料ベースへのLipoplexの添加法の説明
既に示した通り、飼料ベースは、Lipoplex複合体に添加される媒体であり、その添加工程は、2つの機構:1.真空散布、及び2.単純散布を介して実施することができる。
【0093】
1.真空散布:
ワクチンの飼料への組み込み工程は、乾燥経路(a)及び液体経路(b)の2つの供給経路を有するバッチ工程において展開される。
a)乾燥経路は、重量であらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを投入する段階からなり、該飼料ベースは、真空式油分混合機に投入される。真空をかけると、油分混合機内に大気圧よりも低い圧力が生成され、減圧時には、油分混合機の自由空間の他、飼料中に既に存在する油分のうちより低い融点のオレイン酸部分により、ペレット内部からも空気が抜かれる。
b)液体経路は、乾燥経路と並行して、また、2つのデポジット(deposit)を有し、その1つではサイズに応じてあらかじめ投入されたLipoplexを保持し、他のデポジットでは油分混合バッチにおいてプログラムされた量の飼料ベースを保持する、2つの段階を介して稼働する。第1段階では、真空状態下の微粒散布及び混合によりワクチンが添加され、すべてのペレットに適する含浸が確保される。次に、ゆっくりと真空が解除されて空気が流入し、大気圧に復帰することが可能となり、当初は自由油分の一部と共に表面にあるワクチンが、空気によりペレット内部に押し込まれることを促進する。第2に、通常の大気圧下において、第2のデポジット内であらかじめ秤量しておいた魚油もまた混合状態下での散布により微粒状で添加され、配管内に余剰のワクチンがあれば魚油に引き込まれる。この工程は、トップコーティングと呼ばれ、ペレット1粒ずつのすべての表面を被覆し、飼料表面における有効成分の直接的な曝露を最小化する。
【0094】
ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が180°回転して、秤量包装用(pre−encasado)ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図7及び8に付属のフローチャートに見ることができる。
【0095】
2.単純散布
飼料へのワクチン組み込みのこの第2の選択肢は、第1の場合と同様、乾燥経路(a)及び液体経路(b)の2つの供給経路により展開される。
a)乾燥経路は、角度及び速度の変化する回転ボイラー型混合機に組み込まれた、あらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを秤量装置により分類する段階からなる。このシステムにより、回転に基づき、ペレット飼料の均等な混合が得られる。回転数は5〜50rpm、定位角度は水平位置に対して10°〜35°で段階的に変化させ、均等な混合サイクルを得なければならない。次いで、液体経路が実施される。
b)液体経路は、混合機と共に稼働し、飼料ベースのサイズ及び量に応じてあらかじめプログラムされた分注機と接続されたスプリンクラーのみからなる。球形の飼料は高度に吸湿性であり、このため、スプリンクラーにより散布される液体を効率的に吸収するので、実施される含浸段階は瞬間的である。
【0096】
スプリンクラーによりワクチンが飼料ベースに組み込まれると、混合機が180°回転して、秤量包装用ホッパーの投入口に位置合わせする。投入弁により、秤量包装装置へと直接にフィードするホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。
【0097】
4)乾燥及び冷却
これは、最終生成物に必要な水分量を調節することを可能とする物理的過程である。そこで、生成物は冷却され、高温による微生物分解と関連する危険性を回避する。工程は、工業規格により生成物を包装することを目的とする、包装する段階により終了する。
【0098】
5)包装
工程は、一連の規格により生成物を包装することを目的とする、包装する段階により終了する。
【0099】
経口ワクチンを送達すると考えられる異なる生物用の飼料ベースは、生物の必要及び治療を行う時点において生物が置かれる増殖サイクルの段階に応じて、いくつかのサイズ及び栄養組成で実現される。
【0100】
本出願は、個体の大規模なワクチン接種など、複数の技術的問題を解決する。ワクチンの操作を回避する今回の幼魚の場合、本発明により、経口ワクチンの容易な投与に関連する操作的な有益性の他、高度の安定性及び簡便な保存法も示唆されることが強調される。
【0101】
[適用の実施例]
A.遺伝子挿入配列VP2の「in vitro」発現能力の評価
単層CHSE−214細胞を80%のサブコンフルエントに培養した。12ウェルプレート中のMEM培地、2.2g/Lの重炭酸ナトリウム、及び2.5%のウシワクチン血清(SBF)において、20℃の温度で4〜14日間にわたり細胞を培養した。DOTAPリポソームとの複合体であるプラスミド構築物(pcDNA−VP2)を取り込むため、調製されたPBSにより速やかに細胞を洗浄した。
【0102】
説明的な覚書で述べた通り、DNAのアリコート及びDOTAPをMEM培地中に添加した。次いで、それらを混合し、30分間にわたりインキュベートした。トランスフェクションは、各混合物を、細胞単層を伴う総容量0.5mlのMEM培地に添加することにより実施した。トランスフェクションに対して定められたインキュベーション(5%SFBを伴うMEM培地中)時間が経過してから、プラスミドの抽出が実施された。
【0103】
CHSE−214細胞株からのプラスミド抽出は、MEM培地の5%ウシ胎仔血清(FBS)による置換、PBSによる細胞の洗浄、ある量の試薬の添加、室温で5分間のインキュベーション、クロロホルムの添加、及び、その後、12000gで15分間にわたる遠心分離を想定する、Trizol(Invitrogen Life Technologies社製)用に説明されたプロトコールに従い実施された。形成された2相のうち、水様の上相がARN及びプラスミドを含有し、下相がゲノムDNAを含有する。
【0104】
抽出されたプラスミドは、イソプロピルアルコールにより沈殿させ、遠心分離し、70%エタノールで洗浄した。最後に、溶媒を蒸発させ、無菌の脱イオン化水中に試料を再懸濁させた。1%のアガロースゲル中にプラスミドDNA試料を投入し、臭化エチジウム(0.5ug/ml)で染色し、260nmのトランスライター(translighter)で可視化した。ゲル中の泳動プロファイルにより、プラスミド全体の完全性が示された。密度計解析により、異なる試験時点に対し、それぞれ、11.65、13.65、及び461ngのプラスミドワクチンが示された。さらなる試験では、RT−PCR法により、ARNmから725bpのフラグメントが増幅され、3回の評価において所望の増幅産物(725bp)自体を得た。
【0105】
工程の例及び飼料製剤
淡水中における養殖サケ用のペレット飼料を調合したが、その結果を以下に示す。これらの飼料ベースの組成の詳細の他、その使用に関する推奨事項を表1に示す。使用に関する推奨事項は表2に示す。
【0106】
【表1】

【0107】
【表2】

【0108】
治療用量
治療用量は魚類摂食率(SFR)に基づくが、治療される生物量の重量%としても表わされる。飼料中のプラスミド濃度は、ワクチンがサイズに応じた飼料中の固有の用量により均等に投与されるように、あらかじめ確立されたSFRに基づき決定されている。こうして、SFRが低度である条件下におけるプラスミドに関する最小限の要件を満たす送達用量が確認される。ワクチンを伴う飼料投与時に、魚類があらかじめ確立されたSFRよりも高度のSFRを示す場合は、ワクチンを伴う飼料及び伴わない飼料を供給して飼料の量を調整する。異なる飼料サイズに対するワクチン用量及びSFRを、表3に詳しく示す。
【0109】
【表3】

【0110】
表4は球形マイクロペレットに対するサイズ規格を含み、表5は円筒形ペレットに対する同様の規格を含む。
【0111】
【表4】

【0112】
【表5】

【0113】
ワクチンの免疫原性ポテンシャルの評価例
実験を実施して、飼料ベース中に調合されたワクチンの有効性を決定した。経口ワクチンの投与は、調べた魚類において免疫反応を引き起こすのに十分であり、病原性菌株に対するその抵抗性は、曝露生体試験で検証された。
【0114】
経口ワクチン摂取により、アトランティックサーモン(Salmon salar)の5gの幼魚5000匹に免疫感作した。投与スキームは、飼料により異なる所望のレベルに達するよう希釈される、マスター飼料の加工を含んだ。
【0115】
投与及び対照に応じた別個のプール内の幼魚に対して、生解析を実施した。幼魚には7日間にわたりワクチン投与を行った。次いで、ワクチン投与の0.15、45、60日後の時点で試料を得た。Allpharma社製のワクチンAlphajet 1000を陽性対照として選択し、実験を開始してから45日間を経過した後の幼魚群に腹腔内経路を介して投与した。
【0116】
実験解析を開始して0、15、及び45日後の血液試料を得ることにより、レポート遺伝子の発現動態を調べた。ELISA解析により免疫反応推定値の決定が可能となり、ここで、プラスミドワクチンにより免疫感作された魚類の血漿試料中における抗IPNV抗体を見出すため、抗原性異種タンパク質に対する免疫反応の推定値を決定した。
【0117】
解析により、H及びペルオキシドの存在下におけるTMB(テトラメチルベンジジン)反応により生成される生成物の450nmにおける吸光度のリーディングにより総抗体レベルを検出する間接的ELISA法の成果を考察した。96ウェルを血漿の希釈系列(1、1:2、1:4、1:16)でコートし、15℃で4時間にわたりインキュベートした後、0.05%PBS/Twenn 20で洗浄した。0.05%PBS/Tween 20及び5%スキムミルクにより、室温で1時間にわたりブロックした。再び洗浄し、0.05%PBS/Tween 20中における抗サケ抗体の希釈系列(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600)と共に、室温で2時間にわたりインキュベートした。
【0118】
その後、0.05%PBS/Tween 20中に1:3000の、ペルオキシド(peroxide)と結合した抗マウスIgGヤギ抗体の希釈液を添加して、室温で1時間静置した。
【0119】
最後に、0.05%PBS/Tween 20中に1:3000の、ペルオキシダーゼと抱合させた抗マウスIIgGヤギ抗体の希釈液を添加して、室温で2時間静置した。洗浄後、TMBを添加し、室温で20分間待機して着色を観察した。1N HSOにより反応を停止し、450nmでの吸光度の読み取りにより得られた生成物を、ELISAプレートリーダーで定量した。
【0120】
特定の抗体の検出には、マルチウェルプレートを1*105UFP/mlのIPNウイルスと共にインキュベートし、次いで、あらかじめ確立された希釈率(1:16)で血漿を添加し、説明した段階を1つずつ実施し、この分子クラスを間接的に決定した。1mg/KgのPV用量に対して得られた結果により、プラスミドワクチンを含有する栄養製剤を介して45日間にわたり投与されたプラスミドワクチンを摂取した魚類と対照との間において、信頼区間90%による統計学的な有意差が示された。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の段階:
a.ADN配列を増幅するベイトの合成
b.図2の遺伝子配列クローンを含有するプラスミドpcDNA4/HisMaxTOPOに基づく、プラスミド構築物pcDNA−VP2の形成
c.微生物への組み換えプラスミドpcDNA−VP2のトランスフェクション。この場合、大腸菌JM−109株のトランスフェクションは、組み換え菌株である大腸菌JM−109(pcDNA−VP2)を構成する
d.組み換え菌株である大腸菌JM−109(pcDNA−VP2)の培養槽内における培養
e.プラスミド構築物pcDNA−VP2の精製
f.Lipoplexと称する、プラスミドpcDNA−VP2とDOTAPリポソームとの複合体の形成
g.経口ワクチン又は調合ワクチンを構成する、飼料ベースと称する栄養組成物へのLipoplex複合体の散布/混合及び統合
h.DNAワクチンを含有する飼料の包装
を意図することを特徴とする、DNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項2】
ベイトを用いたPCR法の増幅段階において、IPNVウイルスカプシドのタンパク質部分VP2をコードする遺伝子領域が増幅されることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項3】
ベイトを用いた増幅段階により、タンパク質VP2の一部である725bpのヌクレオチド配列が生成されることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項4】
プラスミド形成段階において、プラスミド構築物にpcDNA4/HisMaxTOPOを用い、pcDNA−VP2という名称によりブダペスト条約下で保護され、国際寄託番号がLMBP 5333である組み換えプラスミドを生成することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項5】
トランスフェクション段階において、大腸菌JM−109菌株が宿主として用いられ、大腸菌JM−109(pcDNA−VP2)という名称によりブダペスト条約下で保護され、国際寄託番号がLMBP 5333である組み換え菌株を生成することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項6】
組み換えプラスミドpcDNA−VP2の単離及び精製の段階が、アルカリ溶菌法並びに濾過及び限外濾過の連続する段階を介して実施されることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項7】
Lipoplexと称するプラスミドpcDNA−VP2−リポソーム複合体の形成段階において、DOTAPリポソームが特異的に用いられることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項8】
lipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、飼料へのワクチンの組み込みが、乾燥供給経路及び液体供給経路を共に含む2つの工程選択肢により、バッチ稼働において展開されうることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項9】
飼料ベースへのlipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第1の選択肢に従い、乾燥供給経路でペレット形態における飼料ベースを真空状態下で油分混合機に投入することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項10】
飼料ベースへのlipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第1の選択肢に従い、液体経路が乾燥経路と並行し、2つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。これらは、2つのデポジットに基づき、デポジットの1つではサイズに応じてあらかじめ投入されたLipoplexを保持し、他のデポジットでは油分混合バッチにおいてあらかじめプログラムされた量の飼料ベースを保持する。
【請求項11】
飼料ベースへのlipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第1の選択肢に従い、液体経路が乾燥経路と並行し、2つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。第1段階では、真空状態下の微粒散布によりワクチンが添加され、第2段階では、通常の大気圧下において、第2のデポジット内であらかじめ秤量しておいた魚油が散布される。
【請求項12】
飼料ベースへのlipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第2の選択肢に従い、組み込みが、乾燥経路及び液体経路を含む2つの供給経路を介するバッチ稼働において展開されうることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項13】
飼料ベースへのlipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第2の選択肢に従い、角度及び速度の変化する回転ボイラー型混合機に組み込まれた、あらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを、乾燥経路において秤量装置により分類することを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項14】
lipoplex複合体の散布/混合及び統合段階において、ワクチン添加の第2の選択肢に従い、液体経路が混合機と並行して稼働し、飼料ベースのサイズ及び量に応じてあらかじめプログラムされた分注機と接続された散布システムからなることを特徴とする、請求項1に記載のDNAワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項15】
栄養製剤に含まれるDNAワクチンがペレットの形態で生成され、その治療効果が水生生物におけるウイルス起源の病原体の感染を予防することであることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項16】
栄養製剤に含まれるDNAワクチンが生成され、経口形態で提供され、特にIPNウイルスにより引き起こされる感染が予防されることを特徴とする、請求項1及び15に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項17】
栄養製剤に含まれるDNAワクチンが生成され、前記製剤が以下:
i.有効成分:プラスミド構築物pcDNA−VP2、
j.DOTAPリポソーム、
k.個体の栄養特性を提示する賦形剤
であることを特徴とする、請求項1、15及び16に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項18】
賦形剤がタンパク質、ミネラル脂質、炭水化物、塩分、及びビタミンである経口投与DNAワクチンであることを特徴とする、請求項1〜17に記載の薬剤組成物。
【請求項19】
賦形剤が以下の平均組成(g/kg):
粗タンパク質 530
脂質(酸の加水分解により解析) 200
灰分 100
粗線維 8
窒素以外の抽出物 77
を提示する経口投与DNAワクチンであることを特徴とする、請求項1〜18に記載の薬剤組成物。
【請求項20】
賦形剤が製剤中でより多く用いられる以下の成分:魚粉、魚油及び/又は植物油、小麦及びトウモロコシの副産物、ペプトン濃縮物、小麦及びトウモロコシのグルテン、オキアミ粉、ビタミン及び塩分のミネラルプレミックス、大豆タンパク質濃縮物、小麦、ベタイン、並びにヌクレオチドを提示する経口投与DNAワクチンであることを特徴とする、請求項1〜19に記載の薬剤組成物。
【請求項21】
図3で開示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項22】
ウイルスタンパク質配列をコードする725bpのヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項1及び21に記載の発現ベクター。
【請求項23】
ウイルスタンパク質配列をコードする725bpのヌクレオチド配列を有し、前記配列がIPNウイルスカプシドのVP2タンパク質の大型サブユニットに特異的であることを特徴とする、請求項1、21、及び22に記載の発現ベクター。
【請求項24】
pcDNA−VP2が、図4に開示され国際寄託番号がLMBP 5333であるプラスミド構築物を有することを特徴とする、請求項1に記載の大腸菌JM−109の形質転換細胞。
【請求項25】
CHSE−214細胞株に属し、プラスミドpcDNA4−VP2を含むIPNウイルス由来の発現ベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項26】
CHSE−214細胞株がIPNウイルス由来の発現ベクターを含有し、プラスミドpcDNA−VP2がウイルスタンパク質VP2に関連するポリペプチド配列を合成できることを特徴とする、請求項25に記載の宿主細胞。
【請求項27】
プラスミドpcDNA−VP2の機能的発現を可能とすることを特徴とする、請求項1に記載の細菌の使用。
【請求項28】
配列が構造タンパク質VP2を含み、IPNウイルスに対する免疫をもたらすことを特徴とするポリペプチド。
【請求項29】
図2に開示される配列の発現に対応することを特徴とする、請求項28記載のポリペプチド。
【請求項30】
大腸菌JM−109の形質転換菌内で増幅され、図3に開示された配列が水生生物、特に魚類、具体的にはサケ科魚類においてワクチンとして用いられることを特徴とする、請求項4に記載の発現ベクターpcDNA−VP2。

【図1】
image rotate

【図2】
image rotate

【図3】
image rotate

【図4】
image rotate

【図5】
image rotate

【図6】
image rotate

image rotate

【図7】
image rotate

【図8】
image rotate


【公表番号】特表2010−514412(P2010−514412A)
【公表日】平成22年5月6日(2010.5.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−541771(P2009−541771)
【出願日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【国際出願番号】PCT/EC2007/000004
【国際公開番号】WO2008/077413
【国際公開日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【出願人】(509175850)ソリューシオネス バイオテクノロジカス イノヴァシオン リミターダ (1)
【出願人】(509175849)
【出願人】(509175481)
【Fターム(参考)】