Ｅ１領域内の発現カセットと不活性化されたＥ２Ｂポリメラーゼを有するアデノウイルス発現ベクター
【課題】アデノウイルスＥ２Ｂ機能を部分的に欠失または全欠失し、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【解決手段】本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失によって特徴付けられ、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を低減または排除するために設計される。さらにベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、および／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができる１つ以上の調節エレメントを含み得る。ウイルスタンパク質の発現におけるこの減少はインビボで投与される場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減させる。
【解決手段】本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失によって特徴付けられ、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を低減または排除するために設計される。さらにベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、および／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができる１つ以上の調節エレメントを含み得る。ウイルスタンパク質の発現におけるこの減少はインビボで投与される場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下での仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．：６０／７５０，０１２号（２００５年１２月１２日出願）に対する優先権の利益を主張する。仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．：６０／７５０，０１２号の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失、およびＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有することによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは、複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を低減または排除するために設計される。さらに、ベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、そして／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができる、調節エレメントを１つ以上含み得る。ウイルスタンパク質の発現におけるこのような低減は、インビボで投与した場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減させる。形質転換される産生宿主細胞および組換えタンパク質の生成法および遺伝子治療も、本発明の適用範囲内に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターは、広範な組織および細胞の指向性、大型の発現カセットを収容する能力と高い形質導入効率、および休止細胞を感染させる能力を含む、遺伝子送達のための望ましい特徴を有する。アデノウイルスの極めて低い組み込み傾向は、挿入変異誘発および腫瘍形成性の活性化のリスクを最小限に抑えるために、さらなる安全策の面で有益である。ヒトアデノウイルスの多数の種々の血清型も、極めて異なる指向性を有する種々のウイルス鞘の選択を提供する。例えば、Ｃ群のウイルスは、肝臓または筋肉への感染性が極めて高く、Ｄ群は中枢神経系の細胞への、またはＢ群は造血系の細胞への感染性が極めて高い。さらに、アデノウイルスは、該ウイルスが高い比力価まで増殖し、拡張可能な製造プロセスが確立されている（非特許文献１；非特許文献２）ので医薬品開発に十分に適している。
これらの決定的な利点にもかかわらず、アデノウイルスベクターの応用の可能性は、依然として限定されている。これは、アデノウイルスベクターが標的組織内で発現されるウイルス遺伝子を含むという事実に起因している。直接毒性、カットオフ発現、組織の炎症（非特許文献３）、および細胞障害性Ｔリンパ球の攻撃が、最終的に感染細胞の破壊につながる結果となる。数多くの研究グループが、アデノウイルスベクターの免疫原性を低減させようと試みてきた。トランス活性化機能も有するＥ２領域およびＥ４領域は、ウイルスゲノムから排除され、かつヘルパー細胞株に移入された。しかしながら、ウイルスの力価の低減をさらに引き起こすこれらの変化が、インビボでの発現の持続時間を拡大させることができるかどうかは不確かなままである。この概念の必然的な延長として、ウイルス遺伝子が存在しないアデノウイルスベクターが近年開発された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。しかしながら、このようなベクターは、大規模な医薬品生産にはほとんど役に立たない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｓｕｔｊｉｐｔｏ，Ｓ．，Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．（１９９５ａ）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐ５３ ｂｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，ｐｐ．１４０３−１４１６．
【非特許文献２】Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．Ｗ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｄ．Ｄ．，Ｇｏｕｄｒｅａｕ，Ａ．Ｍ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｎｕｎｎａｌｌｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｕｔｊｉｐｔｏ，Ｓ．（１９９７ａ）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ＨＰＬＣ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｙｐｅ−５ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，ｐｐ．４５３−４６５．
【非特許文献３】Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｚｅｐｅｄａ，Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ−Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦＴＲ ｇｅｎｅ ｔｏ ｌｕｎｇ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ： ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４，７７１−７８０．
【非特許文献４】Ｈａｒｄｙ，Ｓ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｓ−Ｓｔａｎｓｉｌ，Ｔ．，Ｄａｉ，Ｙ．，ａｎｄ Ｐｈｉｐｐｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｒｅ−ｌｏｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１，１８４２−１８４９．
【非特許文献５】Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓ．，Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９６）．Ａ ｎｅｗ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ： Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌ ｖｉｒａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ２８ ｋｂ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｔｈ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，５７３１−５７３６．
【非特許文献６】Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９６）．Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｌｌｏｗ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ １４ ｋｂ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｃＤＮＡ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ ５，９１３−９２１．
【非特許文献７】Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．，ａｎｄ Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓ．（１９９５）．Ｒｅｓｃｕｅ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２，３８５４−３８５８．
【非特許文献８】Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎ，Ｍ．，Ｓａｎｋａｒ，Ｕ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９６）．Ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ： ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，１３５６５−１３５７０．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（３．発明の要旨）
本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有することによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは、複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を減少させるよう設計される。さらに、ベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、そして／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができるエレメントを１つ以上含み得る。このようなウイルスタンパク質の発現の低減は、インビボで投与された場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減することを意図している。
【０００６】
ベクターの発現カセットは、目的のタンパク質、またはその機能的な断片もしくは変異体をコードする異種配列（すなわち導入遺伝子）を含むように操作される。このような導入遺伝子は、治療的有用性を有する任意のタンパク質をコードする遺伝子、標的宿主細胞内の欠陥遺伝子（例えば、遺伝子欠陥に基づく病的状態の原因である遺伝子）を置換する遺伝子、ならびに／または癌、自己免疫疾患および／もしくは感染性疾患の処置において治療的有用性を有する遺伝子を含むが、これらに限定されない。形質転換された宿主細胞および組換えタンパク質の生成法および遺伝子治療も、本発明の範囲内に含まれる。
【０００７】
発現カセットはさらに、ウイルスタンパク質の発現を低減させる一方、導入遺伝子の発現を増加させるよう設計されるさらなる核酸配列を１つ以上含み得る。例えば、発現カセットは、該カセットに隣接して見られる遺伝子の発現が活性化されるのを阻止するよう機能する「インスレーター配列」を含むように操作され得る。このように、インスレーター配列を発現カセットの３’末端に挿入することによって、発現カセットに隣接して見られるウイルス遺伝子の発現は、低いままのはずである。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、ＲＮＡのポリアデニル化および安定性を増強させることで知られている異種ポリＡ配列と置き換えたＥ１ＢポリＡ配列を有し得る。このような置換は、導入遺伝子の発現のレベルを増加させるという結果になり得る。利用され得るポリＡ配列は、当業者に周知のことであり、ウシ成長ホルモンポリＡ配列を含むが、これに限定されない。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、さらに哺乳類のヘパドナウイルス由来のもの等の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含み得る。このようなＰＲＥ配列としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）由来のものが挙げられる。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、さらに、導入遺伝子の発現を増加させるために発現カセットの５’末端反復配列（ＬＴＲ）に挿入されるイントロン配列を含み得る。本発明の実施で使用され得るイントロン配列は、当業者に周知である。このような配列は、公知のコンセンサススプライシング配列から生成され得る。
本発明はまた、組換えアデノウイルスベクターおよびこのような組換え体の使用を含む治療法（例えば、遺伝子治療関連、ワクチン接種等）を提供する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
組換えアデノウイルスベクターであって、
（ａ）該アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入される発現カセットであって、
（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子に作動可能に結合する調節エレメント；ならびに
（ｉｉ）インスレーター配列、Ｅ１ＢポリＡシグナル配列と置き換えたポリＡシグナル配列、および転写後調節エレメントからなる群から選択される１つ以上のエレメント
を含む、発現カセット；ならびに
（ｂ）Ｅ２Ｂポリメラーゼを欠失させるかまたはＥ２Ｂポリメラーゼの活性を不活性化する変異、
を含む、ベクター。
（項目２）
前記発現カセットがさらに、ＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、ＷＰＲＥ配列、ＣＴＣＦ結合部位から選択される１つ以上の因子を含む、項目１に記載のベクター。
（項目３）
核酸配列がインターフェロンをコードする、項目１に記載のベクター。
（項目４）
前記インターフェロンがインターフェロンα２ｂである、項目３に記載のベクター。
（項目５）
前記発現カセットが、図５に示される発現カセットである、項目１に記載のベクター。
（項目６）
前記ベクターが、図６に示される配列を含む、項目１に記載のベクター。
（項目７）
ヒトアデノウイルス血清型５型に由来する、項目１に記載のベクター。
（項目８）
ヌクレオチド３５７から始まり、ヌクレオチド４０３０もしくは４０５０で終わる欠失、ヌクレオチド２８，５９７から始まり、ヌクレオチド３０，４７１で終わる欠失、およびヌクレオチド２８，５９７から始まり、ヌクレオチド３０，４７１で終わる欠失を含む、項目７に記載のベクター。
（項目９）
癌を処置するための方法であって、項目１に記載のベクターをこのような処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目１０）
前記癌が膀胱癌である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ベクターが、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間の範囲で投与される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ベクターが、約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲で投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ベクターが、促進剤と併せて投与される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記促進剤がＳＹＮ−３である、項目１３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｔ２ＶＰベクターの構造の概略図である。図示のとおり、このベクターは、ウイルスのＥ１、Ｅ２Ｂ、およびＥ３の領域に欠失を含み、かつＥ１領域への導入遺伝子カセットの挿入を含む。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス５型トリパータイトリーダー、導入遺伝子に対して５’側の合成イントロン配列（すなわちｒＳＥＡＰ）、ＷＰＲＥ配列、ＢＧＨポリＡ配列、および合成インスレーター配列を含む。
【図２】図２は、Ｔ２ＶＰに感染したＫｕ−７膀胱細胞のＳＥＡＰ発現と他のコントロールウイルスに感染したＫｕ−７膀胱細胞のＳＥＡＰ発現との比較を表す。インビトロでの試験は、コントロールベクターと比較して、ＳＥＡＰの同等または増加した発現を実証する。
【図３】図３は、Ｔ２ＶＰおよびＲＣＣＢ（コントロール）の膀胱内送達後の尿のＳＥＡＰ発現のインビボでの分析である。一例として、この実験は、ラットの膀胱へのＴ２ＶＰの膀胱内投与が、標準的なＥ１欠失アデノウイルスであるＲＣＣＢと比べて、短縮した再投与時間で発現の持続期間を改善させたことを実証した。コントロールＲＣＣＢベクターのＳＥＡＰ発現は、初回投与より再投与が約１０倍低く、一方Ｔ２ＶＰベクターの初回投与と再投与との間でレベルは同じままであった。麻酔下の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに組換えアデノウイルス（５００μＬ中約５×１０１０粒子）を膀胱内投与した。被験物質を膀胱内に約１時間保持し、ついで動物を排尿させ、回復させた。投与から２４時間後に開始して時間を決めて尿のサンプルを回収し、ＥＬＩＳＡによってＳＥＡＰに関して分析した。１回目の膀胱内投与後のＳＥＡＰ濃度を黒塗り記号として示す（初回投与）。２回目の膀胱内投与（５３日後）の後に測定したＳＥＡＰ濃度を白塗り記号としてプロットする（５３日目の再投与）。方法についてはＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５に詳述される。
【図４】図４は、ＩＡＣＢベクターまたはｒＡｄＩＦＮベクターと比較したＴ８ＢＦベクターの構造の概略図である（内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｅｍｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ；Ｄｅｍｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ；Ｉｑｂａｌ Ａｈｍｅｄ，ｅｔ ａｌ．，２００１；米国特許第６２１０９３９号）。Ｅ２ｂ領域と導入遺伝子カセットとの違いを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｅ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｉ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｊ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｋ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図７】図７は、ＩＡＣＢおよびＴ８ＢＦからのインターフェロンα２ｂの発現のインビトロでの比較である。Ａ５４９細胞を感染させ、感染から７２時間後に分析した。図示のとおり、Ｅ１欠失を含むコントロールウイルスＩＡＣＢと比較すると、インターフェロンα２ｂの発現の改善が観察された。
【図８】図８は、初回投与と６２日目の再投与の両方におけるＩＡＣＢおよびＴ８ＢＦからのインターフェロンα２ｂの発現のインビボでの比較である。この例では、Ｔ８ＢＦ（丸）およびＩＡＣＢ（四角）のデータを、ｎ＝５（黒塗り記号）とｎ＝６（白塗り記号）の２つの実験の平均値±ＳＥとして示す。図３の説明文およびＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５に記載されるように正常なラットに投与し、ヒトインターフェロンα２ｂをＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、アデノウイルスＥ２Ｂ遺伝子の部分欠失または全欠失、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードすることができる発現カセットを有するによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、治療的応用で使用され、そこでベクターは、治療用核酸（例えば遺伝子）を標的細胞のゲノムに発現させるため（すなわち遺伝子治療応用）に使用される。本発明のベクターは、広範な種類の治療用核酸を送達するために使用され得る。目的の治療用核酸としては、標的宿主細胞内の欠陥遺伝子（例えば、遺伝子欠陥に基づく病的状態の原因である遺伝子）を置換する遺伝子；癌、自己免疫疾患および／または感染性疾患の処置において治療的有用性を有する遺伝子などが挙げられる。
【００１３】
本発明によれば、従来の当該技術分野の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献において説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００１４】
５．１ 用語
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語は、そのウイルスゲノムが従来の組換えＤＮＡ技術によって改変された細胞を感染させることができるアデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語はまた、キメラベクター（またはさらには多量体ベクター）、すなわち１種より多くのサブタイプ由来の相補的なコード配列を使用して構築されるベクターを含む。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「組換えアデノウルスベクター」という用語は、アデノウイルスヌクレオチド配列および必要に応じて１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むベクター構築物を指す。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、相同性をヘルパーアデノウイルスの核酸配列まで低減させたアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。本実施形態によれば、組換えアデノウイルスベクターは、（例えば、１つ以上の変異をアデノウイルスゲノムに導入する（例えば、アデノウイルスタンパク質の１つ以上のコード領域に欠失を導入する）ことによって）変異アデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス科」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されないマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的に指す。特に、ヒトアデノウイルスは、Ａ〜Ｆの亜属ならびにその個別の血清型を含む。Ａ〜Ｆの亜属としては、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、７ａ型、７ｄ型、８型、９型、１０型、１１型（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、および９１型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「Ｅ１Ａ遺伝子」および「Ｅ１Ｂ領域」とは、感染後に最初に転写される、アデノウイルスゲノムの前初期遺伝子を指す。例えば、Ｅ１Ａコード領域は、ヌクレオチド５６０〜１５４２に及び、Ｅ１Ｂコード領域は、ヌクレオチド１７１４〜２２４２に及ぶ。本明細書で使用される場合、「Ｅ２Ｂ遺伝子」という用語は、１４０ｋＤのＤＮＡポリメラーゼをコードする、アデノウイルスゲノムの初期遺伝子を指す。Ｅ２領域はまた、ウイルスアセンブリー中に切断されて、ＤＮＡに共有結合されたまま５５ｋＤとなる末端タンパク質（８０ｋＤ）の前駆体をコードする。Ｅ２Ｂコード領域は、アデノウイルス５型のヌクレオチド８３６７〜５１９７に及ぶ。完全なヒトアデノウイルス５型ゲノムのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託物が入手可能であり、例えばＡＹ３３９８６５およびＡＣ０００００８を参照されたい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、異種コード配列の転写および翻訳を指示することができるヌクレオチド配列、ならびに発現されるべき異種コード配列を定義するために本明細書で使用される。発現カセットは、細胞内の上記異種コード配列によってコードされるタンパク質産物の発現を達成するために、異種コード配列に作動可能に結合される調節エレメントを含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、核酸配列、アミノ酸配列および抗原と関連して「異種」という用語は、外来であってかつ特定のアデノウイルスと関連して天然では見いだされない、核酸配列、アミノ酸配列、および抗原を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「作動可能に結合される」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸配列が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、それは「作動可能に結合されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に結合されている。作動可能に結合されるとは、結合されるヌクレオチド配列が、代表的には、近接していることを意味する。しかしながら、プロモーターから数キロベース離れており、かつイントロン配列が種々の長さであるとき、エンハンサーは一般的に機能するので、一部のポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に結合され得るが、直接的に隣接されず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスで機能することさえあり得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、インスレーター領域、サイレンシング領域、ポリアデニル化部位、イントロン配列、転写後調節エレメント等を指す。「プロモーター」という用語は、その従来の意味で使用され、コード配列の転写開始および転写速度を制御するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する部位を含み、また調節エレメント（例えば、リプレッサーまたは転写因子）の結合のための部位を含む。プロモーターは、天然に存在する場合もあれば、合成である場合もある。使用されるベクターがウイルスベクターであるとき、プロモーターは、そのウイルスにとって内因性であってもよく、または他の供給源由来であってもよい。特定の細胞型でのみ導入遺伝子の発現を可能にする、増強する、または促進するために、調節エレメントが配置されることも可能である。例えば、導入遺伝子が構成的に活性であるか、または一時的に制御される（一時的プロモーター）、外部の刺激に応えて活性化される（誘導性）、特定の細胞型または細胞状態で活性である（選択的）という、構成的プロモーター、一時的ウイルスプロモーター、または調節可能なプロモータープロモーターの制御下になるように、発現カセットを設計することが可能である。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「感染させる」という用語は、組換えアデノウイルスでの産生細胞の感染を促進するための条件下で補完する細胞株に組換えアデノウイルスを曝露することを意味する。複数コピーの所定のウイルスによって感染した細胞を補完するに際して、ウイルス複製およびビリオンのパッケージングのために必要な活性は、協同的である。従って、細胞がウイルスによって多重に感染する有意な可能性があるように、条件を調節することが好ましい。細胞内でウイルスの産生を増進させる条件の例は、感染段階での増加したウイルス濃度である。しかしながら、細胞につきウイルス感染の総回数は、度を超すこともあり得、細胞にとって毒作用がもたらされる可能性がある。従って、ウイルス濃度の感染を１０６〜１０１０の範囲で、好ましくは約１０９のビリオン／ｍＬで維持するよう努力するべきである。化学薬品も、細胞株の感染性を高めるために使用され得る。例えば、本発明は、カルパイン阻害剤の包含によってウイルス感染性に対する細胞株の感染性を増加させる方法を提供する。本発明の実施に有用なカルパイン阻害剤の例としては、カルパイン阻害剤１（Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナールとしても知られており、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されている）が挙げられるが、これに限定されない。カルパイン阻害剤１は、組換えアデノウイルスへの細胞株の感染性を増加させることが観察されている（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第７，００１，７７０号を参照）。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノムの複製が可能な条件下で培養する」という用語は、組換えアデノウイルスが細胞内で増殖することを可能にするように補完条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されるウイルス粒子の数を最大にするために、条件を制御することが望ましい。従って、温度、溶存酸素、ｐＨ等の反応条件をモニターして制御することが必要である。ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４ Ｔａｌｍａｄｇｅ Ｒｏａｄ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪから市販されている）等の市販されているバイオリアクターは、このようなパラメータのモニタリングおよび維持についての条件を有する。感染、トランスフェクション、および培養条件の最適化は、多少変化するが、ウイルスの効率的な複製および産生のための条件は、例えば、産生細胞株の公知の特性、ウイルスの特性およびバイオリアクターの種類を考慮して、当業者によって達成され得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ヘルパーアデノウイルス核酸配列」という用語は、（ｉ）感染性ビリオンへの組換えアデノウイルスベクターおよび／またはそのパッケージングの複製のウイルス機能を提供し、かつ（ｉｉ）測定可能な程度までウイルス粒子を複製も構築もしない、核酸配列を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「組換えアデノウイルス産生細胞株」、「組換えアデノウイルス補完細胞」、「組換えアデノウイルス補完細胞株」という用語は同義語であり、感染性ビリオンへの組換えアデノウイルスおよび／またはそのパッケージングの複製のウイルス機能を提供することによって組換えアデノウイルスを増殖することのできる細胞を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」または「形質転換」という用語は、細胞への核酸の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取った宿主細胞は、「形質転換」されており、かつ「形質転換体」または「クローン」である。当該技術分野で極めて周知の形質転換方法の例としては、リポソーム送達、電気穿孔、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥデキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が挙げられる。
【００２７】
５．２ 組換えアデノウイルス構築物
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列および必要に応じて１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、補完する細胞株のアデノウイルス核酸配列に対して低減した相同性を有するアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。アデノウイルスヘルパー核酸配列と組換えアデノウイルスベクターの間の相同性の欠如は、ウイルスゲノムが組み換わって複製能力のあるアデノウイルスを生成する可能性を低減させる。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは複製欠損アデノウイルスをコードする。本実施形態によれば、組換えアデノウイルスベクターは、（例えば、アデノウイルスゲノムに１つ以上の変異を導入する（例えば、アデノウイルスタンパク質のための１つ以上のコード領域に欠失を導入する）ことによって）変異アデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。好ましくは、アデノウイルスゲノムの変異は、野生型アデノウイルスよりも低いレベルのアデノウイルスタンパク質の発現をもたらす。アデノウイルスタンパク質発現の減少は、被験体におけるアデノウイルスタンパク質への免疫応答を低減させる。
【００２８】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１を欠失した複製欠損アデノウイルスをコードし、Ｅ２Ｂポリメラーゼ機能が部分欠失または全欠失（好ましくは、全欠失）した変異したゲノムを含み、異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、かつＥ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは、全欠失）した変異したゲノムを含み、欠失したＥ１コード領域に異種ヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明の一実施形態において、Ｅ２Ｂ領域の欠失は、非機能的ＤＮＡポリメラーゼの産生につながるのに十分な欠失を含む。本発明の好ましい実施形態において、Ｅ２Ｂ領域の欠失は、逆鎖上にウイルスタンパク質をコードする配列を保持する。本発明の実施で使用され得る変異としては、ヌクレオチド７２７４〜約７８８１のＥ２ｂ欠失を含むがこれに限定されない（全体が参考として本明細書で援用される、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８を参照）。本発明のさらに別の実施形態において、点変異は、Ｅ２Ｂコード領域に遺伝的に操作されることが可能であり、それによって機能的なアデノウイルスポリメラーゼ発現の低下という結果になる。本発明の特定の実施形態において、Ｅ２Ｂ遺伝子の開始コドンは、Ｅ２Ｂ ｍＲＮＡの翻訳を回避し、それによってＥ２Ｂポリメラーゼ活性の機能を除去するよう変異されることが可能である。
【００３０】
異種ヌクレオチド配列は、ゲノムの任意の領域（例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端）に導入され得る。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異したアデノウイルスのゲノムのＥ１、Ｅ２Ｂ、またはＥ３コード領域等の欠失したアデノウイルスコード領域の１つに導入される。本発明の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異したアデノウイルスのゲノムの欠失したＥ１コード領域に導入される。
【００３１】
本発明によれば、組換えアデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス科由来もしくはアデノウイルス科の組み合わせから得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス科から得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２型または５型から得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。
【００３２】
一実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型５型に由来し、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびタンパク質ＩＸ機能の欠失、ならびにＥ３領域（例えば、全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，２１０，９３９号および第５，９３２，２１０号を参照）およびＥ２ｂ領域での欠失を含む。一例として、限定するものではないが、ヒトアデノウイルス血清型５型由来の組換えアデノウイルスベクターは、塩基対３５７〜塩基対約４０５０の欠失（例えば、塩基対３６０〜塩基対約４０３０までの間の欠失）、塩基対２８，５９７〜塩基対約３０，４７１までの間の欠失、および全体が参考として本明細書で援用される、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）に記載されるようなＥ２ｂ領域での欠失を含むことが可能である。
【００３３】
別の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型５型に由来し、図６のアデノウイルスベクターに示されるのと同じアデノウイルス配列の欠失を含む。
【００３４】
本発明は、変異したアデノウイルスゲノムに挿入される「発現カセット」を含む組換えアデノウイルス発現ベクターに関する。本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、異種コード配列の転写および翻訳を指示することのできるヌクレオチド配列ならびに発現されるべき異種コード配列として定義される。発現カセットは、細胞内で異種コード配列によってコードされるタンパク質産物の発現を達成するために、この異種コード配列に作動可能に結合された調節エレメントを含む。
【００３５】
本発明の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクター以外の供給源から得られる、および／または由来する。本発明によれば、異種ヌクレオチド配列は、所望の生物学的特性または活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし得る。
【００３６】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、サイトカイン、サイトカイン受容体、ホルモン、成長因子、または成長因子受容体等の生物学的応答調節物質をコードする。このような生物学的応答調節物質の非限定的な例としては、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦＲＳＦ１８およびＴＮＦＳＦ１８を含むＴＮＦＲおよびＴＮＦＲリガンドスーパーファミリーメンバーが挙げられる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、インターフェロンα２ｂ（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，８３５，５５７号を参照）等のインターフェロンをコードする。
【００３７】
他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、抗体をコードする。さらに他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質または融合タンパク質をコードする。
【００３８】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクターが由来する種、亜群、または変異体以外のアデノウイルスの異なる種、亜群、または変異体に属するウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、病原性微生物から得たおよび／または由来する抗原タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードする。
【００３９】
本発明のさらに別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、癌の治療遺伝子である。このような遺伝子は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を強化する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列等を含む。従って、例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、細胞周期を調節する際に効果的なタンパク質の発現のための外来遺伝子（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、もしくはマイトシン）、または細胞死を誘発する際に効果的なタンパク質の発現のための外来遺伝子（例えば、条件的自殺遺伝子チミジンキナーゼ）を含み得る。
【００４０】
本発明によれば、組換えアデノウイルスベクターの異種ヌクレオチド配列が宿主細胞で発現されるべき場合、転写調節エレメント（プロモーター／エンハンサー配列とも呼ばれる）を供給するべきである。プロモーター／エンハンサー配列は、広範に活性であり得、または組織特異的であり得る。プロモーター／エンハンサー配列は、非アデノウイルス供給源由来であり得、またはアデノウイルスプロモーターであり得る。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、ヘルパーアデノウイルス核酸配列の発現を調節するプロモーター／エンハンサー配列と共有されない。本実施形態によれば、プロモーターは、当業者に公知の任意のプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。本発明に従って使用され得るプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８２）、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター、Ｅｌｆ−１プロモーター、Ｔｅｔプロモーター、エクジソンプロモーター、およびラパマイシンプロモーター。
【００４１】
特定の実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節するために天然のプロモーターが利用される。別の実施形態において、タンパク質の発現を調節するために、発現されるタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子に固有でないプロモーター（すなわち、異種プロモーター）が利用される。特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ウイルス、細胞、またはハイブリッドの構成的プロモーター）である。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。さらに他の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【００４２】
特定の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター等の構成的プロモーターを使用するのが望ましい。特定の他の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＥｌｆ−１プロモーター等の構成的プロモーターを使用するのが望ましい。さらに他の実施形態においては、アデノウイルスベクターの異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、Ｔｅｔプロモーターまたはエクジソンプロモーター等の誘導性プロモーターを使用するのが望ましい。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態において、誘導性プロモーターは、本発明のアデノウイルスベクターで使用され得る。これらのプロモーターは、追加の分子の存在下でのみ転写を開始する。誘導性プロモーターの例としては、β−インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子から入手可能なもの、またはステロイドホルモン応答性遺伝子から入手可能なものが挙げられる。組織特異的発現は、遺伝子発現の分野で十分に特徴付けられており、これらのような組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターは、当該技術分野で極めて周知である。外来遺伝子が標的細胞に導入された後にその外来遺伝子の発現を調節するために、これらの遺伝子は使用される。
【００４４】
挿入された非アデノウイルスまたは異種ヌクレオチド配列の望ましい大きさは、ビリオンへの組換えアデノウイルスベクターのパッケージングを可能にする大きさに限定され、かつ保持されるアデノウイルス配列の大きさに依存する。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約３６キロ塩基対の長さである（Ｄａｖｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３によって長さが３５９３８ヌクレオチドであると測定）。ビリオンにパッケージングされる組換えアデノウイルスの全体の大きさは、約３７７３５ヌクレオチドの長さであるはずである（通常のゲノム長の約１０５％）。従って、挿入された異種ヌクレオチド配列の発現を最大限にするために、組換えアデノウイルスベクター内のアデノウイルスゲノムの付加的な部分（例えば、Ｅ３領域）を排除することが望ましいこともある。
【００４５】
本発明の組換えアデノウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、異種ヌクレオチド配列によるウイルスコード領域の完全置換もしくは部分置換によって、または異種ヌクレオチド配列をウイルスゲノムに添加することによってのいずれかで達成され得る。完全な置換は、ＰＣＲによる変異誘発（ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用することによって最も良く達成されると思われる。手短に言えば、ＰＣＲプライマーＡは、５’末端から３’末端に、独特の制限酵素部位（例えば、クラスＩＩＳ制限酵素部位（すなわち、特異的配列を認識するが、その配列の上流もしくは下流のＤＮＡを切断する、「シフター」酵素））；置換されるべき遺伝子のある領域に相補的な一続きのヌクレオチド；および異種ヌクレオチド配列のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌクレオチドを含む。ＰＣＲプライマーＢは、５’末端から３’末端に、独特の制限酵素部位；置換されるべき遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；および異種遺伝子または非天然の遺伝子の５’コード部分に対応する一続きのヌクレオチドを含む。異種遺伝子もしくは非天然の遺伝子のクローン化コピーとこれらのプライマーを使用するＰＣＲ反応の後に、産物は、独特の制限酵素部位を使用して切り出されてクローン化され得る。クラスＩＩＳ酵素による消化および精製ファージポリメラーゼによる転写は、ここで、異種遺伝子挿入物もしくは非天然の遺伝子挿入物を有するウイルス遺伝子の非翻訳の正確な両端を含むＲＮＡ分子を作製する。別の実施形態において、バクテリオファージプロモーター配列、およびＲＮＡテンプレートがクローニングなしで直接的に転写され得るようなハイブリッド遺伝子配列を含む二重鎖ＤＮＡを調製するために、ＰＣＲプライミング反応が使用され得る。
【００４６】
本発明の組換えアデノウイルスベクターに異種ヌクレオチド配列を挿入するとき、異種ヌクレオチド配列のコード配列の末端と下流遺伝子のコード配列の開始部との間の遺伝子間領域は、所望の効果を達成するために改変され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」という用語は、１つの遺伝子の停止シグナルと次の下流のオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン（例えばＡＵＧ）との間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域（すなわち、遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始部（ＡＵＧ）との間）を含み得る。この非コード領域は、一部のウイルス遺伝子には天然に存在する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、「インスレーター」と呼ばれる配列が、異種ヌクレオチド配列の下流の遺伝子間領域で、発現カセットに挿入され得る（Ｄｉ Ｓｉｍｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００４ａ；Ｐｌｕｔａ，ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｉｎｃｏｎ−Ａｒａｎｏ ａｎｄ Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，２００４；Ｔａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。このようなインスレーターの挿入は、野生型と比べて、アデノウイルスタンパク質の低下した発現をもたらす可能性があり、これはアデノウイルスベクターの免疫原性および毒性を低減する際に有用である。本発明の実施で使用され得るインスレーター配列は、当業者には周知であり、例えば、βグロビン遺伝子座の高感受性領域４（ＨＳ４）を含む。ＨＳ４座は、レトロウイルス（Ｅｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐａｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００１；Ｙａｎｎａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３）およびアデノウイルスベクターでも使用されてきた（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ；Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒ，２０００；Ｙｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。クロマチン再配列およびブロッキング活性による遺伝子発現の制御の原因となるＨＳ４座の領域は、転写調節因子ＣＴＣＦに起因すると考えられてきた（Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅ，２００３；Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｅｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋａｎｄｕｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｍｕｒｒｅｌｌ，２００４；Ｌｕｔｚ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐａｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００１；Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓａｉｔｏｈ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｚａｂｏ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｖａｌａｄｅｚ−Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｙａｎｎａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙｕｓｕｆｚａｉ ａｎｄ Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，２００４；Ｙｕｓｕｆｚａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｄｅａｎ，２００４）。本発明の一実施形態において、βグロビン遺伝子座の高感受性部位４からＣＴＣＦ結合部位のヘッドからテイルまでの４コピーを含むインスレーターは、インスレーターとして使用され得る。別の実施形態においては、他の合成インスレーター配列（Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｒａｓｓｅｔ ａｎｄ Ｖａｕｒｙ，２００５；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｄｅａｎ，２００４）も使用され得る。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｅ１ＢポリＡシグナル配列は、異種遺伝子のポリアデニル化およびＲＮＡ安定化を増大させる異種ポリＡ配列によって置換され得る。ポリアデニル化およびＲＮＡ安定化のこのような増大は、異種遺伝子産物のより効率的な発現をもたらし得る。本発明の非限定的な実施形態において、ポリＡシグナル配列は、以下のコンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＴＴＡＡを含有する配列を含む。本発明の実施形態において、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ウイルス等のウイルス由来であり得る。本発明の特定の実施形態において、Ｅ１ＢポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙｏｕｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２００３）によって置換され得る。ＢＧＨポリＡ配列は、既存の市販のプラスミドからＰＣＲによって得られ得る。
【００４９】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明の組換えアデノウイルスは、導入遺伝子発現を増大させるよう機能する転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ＰＲＥ（Ｄｏｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８）、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｙｅｎ，１９９４）、または単純ヘルペスＰＲＥ（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ，１９９５）を含むこのようなエレメントは、異種遺伝子の下流位置で発現カセットに挿入される（Ａｐｐｌｅｂｙ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｒｅｃｋｐｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｒｕｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｒｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｎｇｅｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｏｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｃｈｗｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗｅｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙａｍ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００５０】
本発明はまた、発現カセットが異種遺伝子の５’非翻訳領域へ操作されたイントロン配列を含むように操作される組換えアデノウイルスを提供する（Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｈｅｒｍｅｎｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。本発明の実施で使用されるべきイントロン配列は、例えば、必要なコンセンサススプライシングシグナルを取り込むプライマーを使用するＰＣＲを使用して既知のコンセンサススプライシング配列から生成され得る。イントロン配列は、５’スプライス供与体部位、および分岐点配列と３’スプライス受容体ＡＧ部位とを含む３’スプライス領域を含む。３’スプライス領域は、さらにポリピリミジントラクトを含み得る。ＲＮＡスプライシングで使用される５’スプライス供与体部位および３’スプライス領域のコンセンサス配列は、当該技術分野で周知である（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３０３−３５８を参照）。さらに、５’スプライス供与体部位および３’スプライス領域として機能する能力を維持する改変されたコンセンサス配列は、本発明の実施で使用され得る。手短に言えば、５’スプライス部位のコンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン、および／＝スプライス部位）である。３’スプライス部位は、次の３つの別々の配列エレメントからなる：分岐点もしくは分枝部位、ポリピリミジントラクト、および３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）。哺乳類における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン、Ｎ＝任意のヌクレオチド）である。下線をしたＡは、分枝形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス受容体部位の間に位置し、分岐点の効率的な利用および３’スプライス部位の認識のために重要である。ジヌクレオチドＡＵから始まりジヌクレオチドＡＣで終わる他のプレメッセンジャーＲＮＡイントロンは同定されており、Ｕ１２イントロンと呼ばれる。スプライス受容体／供与体配列として機能するＵ１２イントロン配列ならびに任意の追加の配列も、本発明の発現カセットを作製するために使用され得る。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットの５’非翻訳領域は、アデノウイルストリパータイトリーダーを含む。
【００５２】
一実施形態において、発現ベクターは、１つ以上の異種ヌクレオチド配列、ＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、合成イントロン、ＷＰＲＥ配列、ポリＡ領域、およびＣＴＣＦ結合部位を含む。一例として、限定するものではないが、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、図５に示す発現カセットを含み得る。
【００５３】
挿入された異種ヌクレオチド配列の発現は、タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを含むがこれらに限定されない種々の指標によって決定されることが可能であり、以下のアッセイの非限定的な例によって測定され得る：免疫染色法、免疫沈降法および免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出（例えば、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析）、レポーター遺伝子の使用（例えば、タンパク質発現を観察するために目的の異種遺伝子と同じ方法でウイルスゲノムに組み込まれる、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））、またはこれらの組み合わせ。これらのアッセイを実施する手順は、当該技術分野で周知である（例えば、テキスト全体が参考として本明細書で援用される、Ｆｌｉｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ，ＡＮＤ ＣＯＮＴＲＯＬ，２０００，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ ２５−５６を参照）。
【００５４】
例えば、発現レベルは、培養中の細胞を本発明の組換えアデノウイルスに感染させ、続いて異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、例えばウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡによってタンパク質の発現のレベルを測定するか、または異種配列に特異的なプローブを使用して、例えばノーザンブロット分析によってＲＮＡ発現のレベルを測定することによって決定され得る。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルを感染させ、この動物モデルで本発明の組換えウイルスの異種ヌクレオチド配列から発現されたタンパク質のレベルを測定することによって決定され得る。タンパク質レベルは、感染した動物から組織試料を採取し、次いで、組織試料を、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用する、ウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡにかけることによって測定され得る。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対してこの動物によって産生される抗体の力価は、ＥＬＩＳＡを含むがこれに限定されない、当業者に公知の任意の技術によって決定され得る。
【００５５】
本発明によれば、大量の組換えアデノウイルスベクターを得るために、組換えアデノウイルスベクターは、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージの一部として微生物中で増殖され得る。
【００５６】
５．４ 組換えアデノウイルスの産生
本発明によれば、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）は、組換えアデノウイルスベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列を使用して適切な細胞型を共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することによって生成され得る。同時トランスフェクションは、ＤＥＡＥデキストラン法（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ，１９６８）によって、リン酸カルシウム手順（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３）によって、またはマイクロインジェクション、リポフェクション、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない当該技術分野で公知の任意の他の方法によって実施され得る。トランスフェクションで使用される組換えアデノウイルスベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列の量は、１０６細胞あたり約０．２〜１０μｇのＤＮＡであるが、種々のＤＮＡ構築物および細胞型によって異なり得る。トランスフェクションに好適な細胞としては、ＨｅＬａ細胞、２９３−Ｄ２２細胞、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−１細胞、Ｕ８７細胞、およびＷ１６２細胞が挙げられるがこれらに限定されないアデノウイルス感染が可能な任意の細胞株が挙げられる。
【００５７】
あるいは、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）を生成するために、組換えアデノウイルス補完細胞株は、組換えアデノウイルスベクターをトランスフェクションされることも可能である。特定の実施形態において、本発明は、細胞株中でのウイルスゲノムの複製を許容する条件下で、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクションされた、細胞株を補完する組換えアデノウイルスを培養することを含む組換えアデノウイルスの生成法を提供する。ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質（および好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子；および（ｃ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子。
【００５８】
本発明の非限定的な実施形態において、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ２Ｂポリメラーゼを発現するように操作され、かつ米国特許出願第６０／６７４，４８８号および米国特許出願公開第２００６／０２７００４１号（その開示が参考として本明細書で援用される）に記載されるＳＬ０００６形質転換細胞株は、本発明の組換えアデノウイルスを増殖させるために使用され得る。ＳＬ０００６細胞株は、ブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６６６３で寄託されている。
【００５９】
本発明の組換えアデノウイルスは、任意の適切な方法によって生成されることが可能であり、その方法の多くは当該技術分野で公知である（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８４；Ｂｒｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照）。本発明の好ましい実施において、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス科に由来する。本発明の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２型または５型に由来する。
【００６０】
本発明の好ましい実施において、生成される組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含む複製欠損アデノウイルスであり、かつＥ１領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ３コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ４コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、Ｅ３コード領域、およびＥ４コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
本発明の好ましい組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルス産生細胞中にアデノウイルスＤＮＡ配列との相同性が低減したウイルスＤＮＡ配列を含み、それはウイルスゲノムが細胞ＤＮＡと組み換わってＲＣＡを生成する可能性を低減させる。
【００６５】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスの量は力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）される。培養物中のアデノウイルスの量を力価測定することは、当該技術分野で公知の技術によって実施され得る。特定の実施形態において、ウイルス粒子の濃度は、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂに記載されるリソースＱアッセイによって決定される。本明細書で使用される「溶解（ｌｙｓｉｓ）」という用語は、ウイルス含有細胞の破裂を指す。溶解は、当該技術分野で周知の種々の手段によって達成され得る。例えば、哺乳類細胞は、低圧力（１００〜２００ｐｓｉ差圧）条件下で、均質化によって、マイクロフルイダイゼーションによって、または従来の凍結融解方法によって、溶解され得る。外来性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを使用する分解によって除去され得る。
【００６６】
ウイルス含有細胞は凍結され得る。ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地から採取され得る。一実施形態において、ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地の両方から同時に採取される。特定の実施形態において、ウイルスを産生する細胞および培地は、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号に記載されるように、ウイルス含有細胞を溶解すること、浄化しなければウイルスの精製を妨げる培地の細胞残屑を浄化することを同時に行う条件下で直交流精密ろ過にかけられる。
【００６７】
本明細書で使用される「採取する」という用語は、培地から組換えアデノウイルス含有細胞を収集することを意味し、培地からの組換えアデノウイルスの収集も含み得る。これは、分画遠心分離またはクロマトグラフィー手段等の従来の方法によって達成され得る。この段階で、採取した細胞は貯蔵される場合もあれば、組換えウイルスを単離するために溶解または精製によってさらに処理される場合もある。貯蔵のためには、採取された細胞は、生理的ｐＨでもしくはほぼそのｐＨで緩衝化され、−７０℃で凍結されるべきである。
【００６８】
ウイルスはまた、ウイルス含有細胞および培地から別々に採取され得る。ウイルス含有細胞は、分画遠心分離等の従来の方法によって培地から別々に収集され得る。採取した細胞は、凍結貯蔵される場合もあれば、ウイルスを遊離させるために溶解によってさらに処理される場合もある。ウイルスは、クロマトグラフィー手段によって培地から採取され得る。外来性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）等のＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを使用する分解によって除去され得る。
【００６９】
ウイルスの採取物はさらに、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号、同第６，５４４，７６９号、および同第６，７８３，９８３号に記載されるように、限外ろ過または接線流ろ過等の方法によってウイルスを濃縮するために処理され得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「回収する」という用語は、溶解した産生細胞から、および必要に応じて上清培地からの、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団の単離を意味する。本発明の細胞培養物中で生成されるウイルス粒子は、当該技術分野で一般的に知られている任意の方法によって単離および精製され得る。クロマトグラフィー等の従来の精製技術、または示差密度勾配遠心法が使用され得る。例えば、ウイルス粒子は、塩化セシウム勾配精製；カラムもしくはバッチクロマトグラフィー；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａ，ｅｔ ａｌ．，１９６１；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｅｉｒａ，１９５９；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ，１９６０）；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００２／００６４８６０号）；ならびにソフトゲル（例えばアガロース）を含む均質な架橋した多糖等、大きい「スルーポア」を有する灌流クロマトグラフィー樹脂を含む合成ポリマーに基づくマクロポーラスポリマー、タンパク質とより迅速に相互作用するように設計されたテンタクル（触手）を有する「テンタクル構造」吸収剤（例えばフラクトゲル）、およびソフトゲルの高容量と複合材料の剛性を利用する、剛性シェル中のソフトゲルに基づく物質（例えばセラミックハイパーＤ（登録商標）Ｆ）（Ｂｒｏｓｃｈｅｔｔｉ，１９９４；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，１９９７）等の他の樹脂を使用するクロマトグラフィーによって精製され得る。本発明の好ましい実施において、ウイルスは、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８３７，５２０号（１９９８年１１月１７日発行）に記載されるように、Ｈｕｙｇｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９５ｂのプロセスに実質的に従って、カラムクロマトグラフィーによって精製される。また、開示が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，２６６１，８２３号を参照されたい。
【００７１】
ウイルスを産生する組換えアデノウイルス産生細胞株は、当該技術分野で公知の任意の好適な容器で培養され得る。例えば、細胞は増殖され、感染した細胞はバイオジェネレーターまたはバイオリアクターで培養され得る。通常、「バイオジェネレーター」または「バイオリアクター」は、一般的に０．５リットル以上の容量のステンレス鋼製またはガラス製で、攪拌システム、ＣＯ２ガスの流れを注入するためのデバイス、および酸素添加デバイスを備える培養タンクを意味する。一般的に、これは、ｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧力または培養物の特定の生理化学的パラメータ（例えば、グルコースもしくはグルタミンの消費または乳酸イオンもしくはアンモニウムイオンの産生）等のバイオジェネレーターの内部パラメータを測定するプローブを備えている。ｐＨ、酸素、および温度のプローブは、これらのパラメータを永久に調節するバイオプロセッサに接続される。他の実施形態において、容器は、スピナーフラスコ、回転ボトル、振盪フラスコ、またはフラスコ内に機械的攪拌を提供するスターラーバーが付いたフラスコである。別の実施形態において、容器は、ウェ−ブバイオリアクター（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ［米国ニュージャージー州ブリッジウォーター］）である。
【００７２】
組換えアデノウイルスは、本発明の組換えアデノウイルス産生細胞株で増殖され得る。ウイルスは、細胞を培養し；必要に応じて細胞に新たな増殖培地を加え；細胞にウイルスを接種し：接種した細胞をインキュベートし；必要に応じて播種した細胞に新たな増殖培地を加え；および必要に応じて細胞および培地からウイルスを採取することによって生成され得る。一般的に、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂに記載されるように、リソースＱカラムを使用する高性能液体クロマトグラフィー等の従来の方法によって決定した場合に、ウイルス粒子の濃度がプラトーに達し始めるときに、採取を実施する。
【００７３】
本発明の組換えアデノウイルス産生細胞株で増殖させた組換えアデノウイルス（例えば、Ｅ１ＡとＥ１Ｂのコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、あるいはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ２Ｂのポリメラーゼコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、およびＥ３のコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、あるいはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂのポリメラーゼコード領域の欠失、Ｅ３とＥ４のコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス）により生成されるタンパク質も、単離および精製され得る。タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドは、塩析沈澱もしくはアルコール沈澱、親和性クロマトグラフィー、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配を含むがこれらに限定されない標準方法によって精製され得る。このような精製方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｅｄ．１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示される。
【００７４】
５．５ 組換えアデノウイルスの有用性
本発明の組換えアデノウイルスは、目的のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを発現させるためにインビトロで使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスはまた、遺伝子治療でも使用され得る。組換えアデノウイルスは、インビボでのまたはエキソビボでの遺伝子治療で使用され得る。インビボでの遺伝子治療については、組換えアデノウイルスは、被験体に直接投与される。エキソビボでの遺伝子治療については、細胞は、インビトロで組換えアデノウイルスに感染させられ、次いで感染した細胞は、被験体に移植される。特定の実施形態において、組換えアデノウイルスは、インビボで直接投与され、目的のタンパク質が発現される。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量を被験体に投与することを含む癌の処置のための方法を含む。治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターは、腫瘍内または膀胱内の投与を含むがこれらに限定されない当該技術分野で公知の任意の送達方法を使用して、任意の癌組織または器官に送達され得る。これらの方法によって処置され得る癌の例としては、膀胱および上気道、外陰部、頚部、膣もしくは気管支の癌腫；腹膜の局所転移性腫瘍；気管支肺胞癌腫；胸膜転移性癌腫；口腔および扁桃の癌腫；上咽頭、鼻部、喉頭、食道、胃、卵巣、前立腺、結腸および直腸、胆嚢、もしくは皮膚の癌腫；または黒色腫もしくは白血病等の血液癌が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、限定するものではないが、インターフェロンα２ｂをコードする発現カセットを含む本発明の組換えアデノウイルスは、膀胱癌の処置において使用され得る。一実施形態において、図６に示される組換えアデノウイルスベクターは、膀胱癌を処置するために本明細書に記載される方法で使用される。
【００７６】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。一実施形態において、図６に示される組換えアデノウイルスベクターは、膀胱癌の被験体に約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの範囲で投与される。
【００７７】
別の実施形態において、細胞は、組換えアデノウイルスを感染させられ、得られた組換え細胞が、被験体に投与される。得られた組換え細胞は、当該技術分野で公知の種々の方法によって被験体に送達され得る。組換え体の血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与される。使用上想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存し、当業者によって決定され得る。本発明によれば、組換えアデノウイルスに感染され得るいかなる細胞も、遺伝子治療のためのものとなり得る。非限定的な例としては、上皮細胞（例えば呼吸上皮細胞）、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、貪食細胞、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等）、および種々の幹細胞もしくは前駆細胞（特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎仔肝等から採取されるような、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞）が挙げられる。好ましい実施形態において、遺伝子治療のために使用される細胞は、被験体に対して自家である。組換え細胞が遺伝子治療で使用される実施形態において、組換えアデノウイルスのゲノムによってコードされるタンパク質は、細胞またはそれらの子孫によって発現されることが可能であり、この組換え細胞は、次いで、治療効果のためにインビボで投与される。
【００７８】
本発明の組換えアデノウイルスは、被験体を免疫するために使用され得る。例えば、組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスによってコードされる異種抗原に対する抗体を生成するために使用され得る。被験体を免疫するために使用されるべき組換えアデノウイルスの量および免疫スケジュールは、当該技術分野の熟練した医師によって決定され、かつ被験体の免疫応答および抗体力価を参照することによって投与される。
【００７９】
組換えアデノウイルスによる免疫によって抗原に対して生成される抗体は、診断免疫アッセイ、受動免疫療法、および抗イディオタイプ抗体の生成で使用され得る。生成された抗体は、当該技術分野で公知の標準的な技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈澱等）によって単離され得、そして診断免疫アッセイで使用され得る。抗体はまた、治療および／または疾患進行をモニターするために使用され得る。数例を挙げれば、組換えアデノウイルス免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の免疫アッセイ系がこの目的で使用され得る。
【００８０】
本発明の組換えアデノウイルスは、受動免疫療法で使用する抗体を生成するために使用することが可能であり、この受動免疫療法では、異種抗原に対して予め形成された抗体の投与によって、被験体の短期的な保護が達成される。本発明の組換えアデノウイルスによって生成される抗体はまた、抗イディオタイプ抗体の生成においても使用され得る。そして次に、抗イディオタイプ抗体は、最初の抗原に結合する抗体の亜集団を生成するために、免疫で使用され得る（Ｊｅｒｎｅ，１９７４；Ｊｅｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８２）。
【００８１】
ある実施形態において、組換えアデノウイルスを使用した免疫によって産生される抗体は、改変されてから被験体に投与される。例えば、抗体はヒト化されおよび／または親和性が成熟され得る。
【００８２】
５．６ 組換えアデノウイルスを投与する組成物および方法
本発明は、本発明の方法によって生成される組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）を含む組成物を包含する。好ましい実施形態において、組成物は、被験体への投与に好適な薬学的組成物である。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、有効量の組換えアデノウイルス、および薬学的に許容されるキャリアを含む。特定の実施形態において、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用を連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されるか、または米国薬局方もしくは、他の一般的に認識される薬局方に記載されることを意味する。「キャリア」という用語は、薬学的組成物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを指す。特に注射可能な溶液に関して、生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセリン水溶液も、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレ−ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態を採り得る。これらの組成物は、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、患者への投与に適切な形態を提供するために、好適な量のキャリアと共に有効量の組換えアデノウイルス（好ましくは精製された形で）を含有する。処方物は、投与様式に適合するべきである。
【００８４】
特定の障害または病態の処置に効果的である本発明の薬学的組成物の量は、障害または病態の性質に依存し、かつ標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロでのアッセイは、最適な用量範囲を同定するのに役立てるために、必要に応じて使用され得る。処方物で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重篤度に依存し、実施者の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルでの試験系から導かれる用量応答曲線から外挿され得る。
【００８５】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。
【００８６】
一例として、限定するものではないが、被験体における表在性膀胱癌の処置のために、約１００ｍＬの容積中のインターフェロンα２ｂをコードする約１×１０１０粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、最も好ましくは、約１×１０１１粒子／ｍＬの用量を含む処置コースが、約１時間にわたって膀胱内に滴下注入される。一例として、限定するものではないが、別の処置コースは、約１００ｍＬ容積中のインターフェロンα２ｂをコードする１×１０１０粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、最も好ましくは、約１×１０１１粒子／ｍＬの用量の約１時間にわたる膀胱内滴下注入、その後の第１の用量から７日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内または連日の実質的に同等の第２の用量を含み得る。各処置コースは、疾患の進行経過によって、反復可能である。膀胱癌の処置のために膀胱内に投与される組換えベクターの場合、処置コースの間に少なくとも１４日間、より好ましくは約３０日間、最も好ましくは約９０日間の間隔を置くと、最適なインターフェロン遺伝子発現が通常観察される。
【００８７】
組成物の投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮表層もしくは粘膜表層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸管粘膜等）を通した吸収によって投与され得、そして他の生物活性薬剤と共に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を任意の好適な経路により肺に導入することが望ましいこともある。経肺投与は、例えば、吸入器もしくは噴霧器、およびエアゾール化剤を使用する処方の使用によって使用され得る。
【００８８】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に本発明の薬学的組成物を局所的に投与することが望ましいこともある。これは、例えば、外科手術時の局所注入、局所適用（例えば、外科手術後の創傷被覆材と併せて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラントにより達成されることが可能であるがこれらに限定されず、このインプラントは、シアラスティック膜等の膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン質の材料である。一実施形態において、投与は、悪性腫瘍または腫瘍性組織もしくは前腫瘍性組織の部位（または前部位）での直接注射により行われ得る。別の実施形態において、投与は膀胱内投与であり得る。
【００８９】
別の実施形態において、薬学的組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態においては、ポンプが使用され得る（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｌａｎｇｅｒ，１９８３；Ｓａｕｄｅｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７）。別の実施形態においては、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３）；（Ｄｕｒｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８５を参照）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、組成物の標的（すなわち肺）のすぐ近くに配置されることが可能であり、従って、全身用量のうちの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０によるレビューで考察される。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、本発明の方法で生成される組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）および好適な賦形剤を含む、ワクチンまたは免疫組成物である。ワクチン組成物を導入するために多数の方法が使用され得、これらの方法としては、鼻腔内、気管内、口腔、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。アデノウイルスの自然な感染経路を介して組換えアデノウイルスワクチン組成物を導入することが好ましいこともある。
【００９１】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、例えばインターフェロン等の治療用タンパク質をコードする核酸の標的細胞（例えば癌細胞等）への移入を促進する促進剤と併せて組換えアデノウイルスベクターを投与することが望ましいこともある。このような送達促進剤の例としては、洗浄剤、アルコール、グリコール、界面活性物質、胆汁酸塩、ヘパリン拮抗薬、シクロオキシゲナーゼ阻害薬、高張食塩液、および酢酸塩が挙げられる。アルコールとしては、例えば、エタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコール等の脂肪族アルコールが挙げられる。グリコールとしては、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ならびにグリセロールおよびチオグリセロール等の他の低分子量グリコールが挙げられる。酢酸、グルコン酸、および酢酸ナトリウム等の酢酸塩は、送達促進剤のさらなる例である。１Ｍ ＮａＣｌのような高張食塩液も、送達促進剤の例である。タウロコレート、タウロデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコレート、ケノデオキシレート、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸等の胆汁酸塩、および硝酸銀等の他の収斂薬が使用され得る。硫酸プロタミン等の第４級アミンのようなヘパリン拮抗薬も使用され得る。遺伝子導入を促進させるために、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、および非イオン性の洗浄剤も使用され得る。典型的な洗浄剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、Ｚｗｉｔｔｅｒｔｇｅｎｔ ３−１４洗浄剤、ＣＨＡＰＳ （３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール］−１−プロパンスルホン−エート水和物）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００洗浄剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ−Ｆ６８洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ ２０洗浄剤、およびＴＷＥＥＮ ８０洗浄剤（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。特に好ましい促進剤および方法は、それぞれ教示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３１２，６８１号（２００１年１１月６日発行）、Ｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１６５，７７９号（２０００年１２月２６日発行）、およびＥｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３９２，０６９号（２００２年５月２１日発行）に記載される。本発明の実施に有用な特に好ましい促進剤は、米国特許第６，３９２，０６９号の式ＩのＳｙｎ３と呼ばれる化合物である。本発明の実施に有用なさらなる促進剤としては、国際特許公開第２００４／１０８０８８号の化学式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶの化合物ならびにそれらの薬学的に許容される塩を含むが、これらに限定されない。一例として、限定するものではないが、促進剤はベクターと同時に投与され得るか、またはベクターの投与前に投与され得る。
【００９３】
本発明の組成物および方法は、単独で、または従来の化学療法薬もしくは処置レジメンと併用して実施され得る。このような化学療法薬の例としては、プリン合成の阻害剤（例えば、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート）もしくはピリミジン合成の阻害剤（例えば、パラ、アザルビン（ａｚａｒｂｉｎｅ））、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの転換の阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素）、ｄＴＭＰ合成の阻害剤（５−フルオロウラシル）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、放射線、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、アルキル化剤、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン）、ならびに微小管機能の阻害剤（例えば、ビンカアルカロイドおよびコルヒチン）が挙げられる。化学療法の処置レジメンは、主として放射線治療などの腫瘍細胞を切断するよう設計された非化学的手順を指す。これらの化学療法薬は、別々に投与される場合もあれば、同時投与のために本発明の処方物に含まれる場合もある。本発明はまた、表在性膀胱癌の場合にＢＣＧ等の従来の免疫療法の処置レジメンと併用して実施され得る。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されないものとする。実際に、本明細書に記載される改変に加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとして意図される。
【００９４】
特許、特許出願、刊行物、製品説明、およびプロトコールは、本出願全体を通して引用され、これらの開示内容は、全体が参考として本明細書で援用される。
【００９５】
【表１−１】
【００９６】
【表１−２】
【００９７】
【表１−３】
【００９８】
【表１−４】
【００９９】
【表１−５】
【０１００】
【表１−６】
【０１０１】
【表１−７】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下での仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．：６０／７５０，０１２号（２００５年１２月１２日出願）に対する優先権の利益を主張する。仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．：６０／７５０，０１２号の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失、およびＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有することによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは、複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を低減または排除するために設計される。さらに、ベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、そして／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができる、調節エレメントを１つ以上含み得る。ウイルスタンパク質の発現におけるこのような低減は、インビボで投与した場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減させる。形質転換される産生宿主細胞および組換えタンパク質の生成法および遺伝子治療も、本発明の適用範囲内に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターは、広範な組織および細胞の指向性、大型の発現カセットを収容する能力と高い形質導入効率、および休止細胞を感染させる能力を含む、遺伝子送達のための望ましい特徴を有する。アデノウイルスの極めて低い組み込み傾向は、挿入変異誘発および腫瘍形成性の活性化のリスクを最小限に抑えるために、さらなる安全策の面で有益である。ヒトアデノウイルスの多数の種々の血清型も、極めて異なる指向性を有する種々のウイルス鞘の選択を提供する。例えば、Ｃ群のウイルスは、肝臓または筋肉への感染性が極めて高く、Ｄ群は中枢神経系の細胞への、またはＢ群は造血系の細胞への感染性が極めて高い。さらに、アデノウイルスは、該ウイルスが高い比力価まで増殖し、拡張可能な製造プロセスが確立されている（非特許文献１；非特許文献２）ので医薬品開発に十分に適している。
これらの決定的な利点にもかかわらず、アデノウイルスベクターの応用の可能性は、依然として限定されている。これは、アデノウイルスベクターが標的組織内で発現されるウイルス遺伝子を含むという事実に起因している。直接毒性、カットオフ発現、組織の炎症（非特許文献３）、および細胞障害性Ｔリンパ球の攻撃が、最終的に感染細胞の破壊につながる結果となる。数多くの研究グループが、アデノウイルスベクターの免疫原性を低減させようと試みてきた。トランス活性化機能も有するＥ２領域およびＥ４領域は、ウイルスゲノムから排除され、かつヘルパー細胞株に移入された。しかしながら、ウイルスの力価の低減をさらに引き起こすこれらの変化が、インビボでの発現の持続時間を拡大させることができるかどうかは不確かなままである。この概念の必然的な延長として、ウイルス遺伝子が存在しないアデノウイルスベクターが近年開発された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。しかしながら、このようなベクターは、大規模な医薬品生産にはほとんど役に立たない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｓｕｔｊｉｐｔｏ，Ｓ．，Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．（１９９５ａ）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐ５３ ｂｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，ｐｐ．１４０３−１４１６．
【非特許文献２】Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．Ｗ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｄ．Ｄ．，Ｇｏｕｄｒｅａｕ，Ａ．Ｍ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｎｕｎｎａｌｌｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｕｔｊｉｐｔｏ，Ｓ．（１９９７ａ）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ＨＰＬＣ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｙｐｅ−５ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，ｐｐ．４５３−４６５．
【非特許文献３】Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｚｅｐｅｄａ，Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ−Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦＴＲ ｇｅｎｅ ｔｏ ｌｕｎｇ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ： ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４，７７１−７８０．
【非特許文献４】Ｈａｒｄｙ，Ｓ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｓ−Ｓｔａｎｓｉｌ，Ｔ．，Ｄａｉ，Ｙ．，ａｎｄ Ｐｈｉｐｐｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｒｅ−ｌｏｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１，１８４２−１８４９．
【非特許文献５】Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓ．，Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９６）．Ａ ｎｅｗ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ： Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌ ｖｉｒａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ２８ ｋｂ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｔｈ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，５７３１−５７３６．
【非特許文献６】Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９６）．Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｌｌｏｗ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ １４ ｋｂ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｃＤＮＡ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ ５，９１３−９２１．
【非特許文献７】Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．，ａｎｄ Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓ．（１９９５）．Ｒｅｓｃｕｅ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２，３８５４−３８５８．
【非特許文献８】Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎ，Ｍ．，Ｓａｎｋａｒ，Ｕ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９６）．Ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ： ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，１３５６５−１３５７０．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（３．発明の要旨）
本発明は、アデノウイルスＥ２Ｂ機能の部分欠失または全欠失、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードする異種配列を含む発現カセットを有することによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは、複製能力のあるアデノウイルスの混入の発生を減少させるよう設計される。さらに、ベクターの発現カセットは、異種配列の発現を増加させることができ、そして／またはウイルスタンパク質の発現を低減させることができるエレメントを１つ以上含み得る。このようなウイルスタンパク質の発現の低減は、インビボで投与された場合のアデノウイルスベクターの細胞障害性および免疫原性を低減することを意図している。
【０００６】
ベクターの発現カセットは、目的のタンパク質、またはその機能的な断片もしくは変異体をコードする異種配列（すなわち導入遺伝子）を含むように操作される。このような導入遺伝子は、治療的有用性を有する任意のタンパク質をコードする遺伝子、標的宿主細胞内の欠陥遺伝子（例えば、遺伝子欠陥に基づく病的状態の原因である遺伝子）を置換する遺伝子、ならびに／または癌、自己免疫疾患および／もしくは感染性疾患の処置において治療的有用性を有する遺伝子を含むが、これらに限定されない。形質転換された宿主細胞および組換えタンパク質の生成法および遺伝子治療も、本発明の範囲内に含まれる。
【０００７】
発現カセットはさらに、ウイルスタンパク質の発現を低減させる一方、導入遺伝子の発現を増加させるよう設計されるさらなる核酸配列を１つ以上含み得る。例えば、発現カセットは、該カセットに隣接して見られる遺伝子の発現が活性化されるのを阻止するよう機能する「インスレーター配列」を含むように操作され得る。このように、インスレーター配列を発現カセットの３’末端に挿入することによって、発現カセットに隣接して見られるウイルス遺伝子の発現は、低いままのはずである。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、ＲＮＡのポリアデニル化および安定性を増強させることで知られている異種ポリＡ配列と置き換えたＥ１ＢポリＡ配列を有し得る。このような置換は、導入遺伝子の発現のレベルを増加させるという結果になり得る。利用され得るポリＡ配列は、当業者に周知のことであり、ウシ成長ホルモンポリＡ配列を含むが、これに限定されない。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、さらに哺乳類のヘパドナウイルス由来のもの等の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含み得る。このようなＰＲＥ配列としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）由来のものが挙げられる。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットは、さらに、導入遺伝子の発現を増加させるために発現カセットの５’末端反復配列（ＬＴＲ）に挿入されるイントロン配列を含み得る。本発明の実施で使用され得るイントロン配列は、当業者に周知である。このような配列は、公知のコンセンサススプライシング配列から生成され得る。
本発明はまた、組換えアデノウイルスベクターおよびこのような組換え体の使用を含む治療法（例えば、遺伝子治療関連、ワクチン接種等）を提供する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
組換えアデノウイルスベクターであって、
（ａ）該アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入される発現カセットであって、
（ｉ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子に作動可能に結合する調節エレメント；ならびに
（ｉｉ）インスレーター配列、Ｅ１ＢポリＡシグナル配列と置き換えたポリＡシグナル配列、および転写後調節エレメントからなる群から選択される１つ以上のエレメント
を含む、発現カセット；ならびに
（ｂ）Ｅ２Ｂポリメラーゼを欠失させるかまたはＥ２Ｂポリメラーゼの活性を不活性化する変異、
を含む、ベクター。
（項目２）
前記発現カセットがさらに、ＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、ＷＰＲＥ配列、ＣＴＣＦ結合部位から選択される１つ以上の因子を含む、項目１に記載のベクター。
（項目３）
核酸配列がインターフェロンをコードする、項目１に記載のベクター。
（項目４）
前記インターフェロンがインターフェロンα２ｂである、項目３に記載のベクター。
（項目５）
前記発現カセットが、図５に示される発現カセットである、項目１に記載のベクター。
（項目６）
前記ベクターが、図６に示される配列を含む、項目１に記載のベクター。
（項目７）
ヒトアデノウイルス血清型５型に由来する、項目１に記載のベクター。
（項目８）
ヌクレオチド３５７から始まり、ヌクレオチド４０３０もしくは４０５０で終わる欠失、ヌクレオチド２８，５９７から始まり、ヌクレオチド３０，４７１で終わる欠失、およびヌクレオチド２８，５９７から始まり、ヌクレオチド３０，４７１で終わる欠失を含む、項目７に記載のベクター。
（項目９）
癌を処置するための方法であって、項目１に記載のベクターをこのような処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目１０）
前記癌が膀胱癌である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ベクターが、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間の範囲で投与される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ベクターが、約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲で投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ベクターが、促進剤と併せて投与される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記促進剤がＳＹＮ−３である、項目１３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｔ２ＶＰベクターの構造の概略図である。図示のとおり、このベクターは、ウイルスのＥ１、Ｅ２Ｂ、およびＥ３の領域に欠失を含み、かつＥ１領域への導入遺伝子カセットの挿入を含む。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス５型トリパータイトリーダー、導入遺伝子に対して５’側の合成イントロン配列（すなわちｒＳＥＡＰ）、ＷＰＲＥ配列、ＢＧＨポリＡ配列、および合成インスレーター配列を含む。
【図２】図２は、Ｔ２ＶＰに感染したＫｕ−７膀胱細胞のＳＥＡＰ発現と他のコントロールウイルスに感染したＫｕ−７膀胱細胞のＳＥＡＰ発現との比較を表す。インビトロでの試験は、コントロールベクターと比較して、ＳＥＡＰの同等または増加した発現を実証する。
【図３】図３は、Ｔ２ＶＰおよびＲＣＣＢ（コントロール）の膀胱内送達後の尿のＳＥＡＰ発現のインビボでの分析である。一例として、この実験は、ラットの膀胱へのＴ２ＶＰの膀胱内投与が、標準的なＥ１欠失アデノウイルスであるＲＣＣＢと比べて、短縮した再投与時間で発現の持続期間を改善させたことを実証した。コントロールＲＣＣＢベクターのＳＥＡＰ発現は、初回投与より再投与が約１０倍低く、一方Ｔ２ＶＰベクターの初回投与と再投与との間でレベルは同じままであった。麻酔下の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに組換えアデノウイルス（５００μＬ中約５×１０１０粒子）を膀胱内投与した。被験物質を膀胱内に約１時間保持し、ついで動物を排尿させ、回復させた。投与から２４時間後に開始して時間を決めて尿のサンプルを回収し、ＥＬＩＳＡによってＳＥＡＰに関して分析した。１回目の膀胱内投与後のＳＥＡＰ濃度を黒塗り記号として示す（初回投与）。２回目の膀胱内投与（５３日後）の後に測定したＳＥＡＰ濃度を白塗り記号としてプロットする（５３日目の再投与）。方法についてはＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５に詳述される。
【図４】図４は、ＩＡＣＢベクターまたはｒＡｄＩＦＮベクターと比較したＴ８ＢＦベクターの構造の概略図である（内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｅｍｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ；Ｄｅｍｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ；Ｉｑｂａｌ Ａｈｍｅｄ，ｅｔ ａｌ．，２００１；米国特許第６２１０９３９号）。Ｅ２ｂ領域と導入遺伝子カセットとの違いを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図５Ｅ】図５Ａ〜Ｅは、Ｔ８ＢＦ由来の導入遺伝子カセットの特徴の配列および所在を提示する。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｉ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｊ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図６Ｋ】図６Ａ〜Ｋは、インターフェロンα２ｂの配列を含む導入遺伝子カセット（ヌクレオチド３６５から開始；図５を参照）を含むＴ８ＢＦアデノウイルスベクターの全長配列を示す。
【図７】図７は、ＩＡＣＢおよびＴ８ＢＦからのインターフェロンα２ｂの発現のインビトロでの比較である。Ａ５４９細胞を感染させ、感染から７２時間後に分析した。図示のとおり、Ｅ１欠失を含むコントロールウイルスＩＡＣＢと比較すると、インターフェロンα２ｂの発現の改善が観察された。
【図８】図８は、初回投与と６２日目の再投与の両方におけるＩＡＣＢおよびＴ８ＢＦからのインターフェロンα２ｂの発現のインビボでの比較である。この例では、Ｔ８ＢＦ（丸）およびＩＡＣＢ（四角）のデータを、ｎ＝５（黒塗り記号）とｎ＝６（白塗り記号）の２つの実験の平均値±ＳＥとして示す。図３の説明文およびＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５に記載されるように正常なラットに投与し、ヒトインターフェロンα２ｂをＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、アデノウイルスＥ２Ｂ遺伝子の部分欠失または全欠失、かつＥ１領域に挿入された目的のタンパク質をコードすることができる発現カセットを有するによって特徴づけられる、組換えアデノウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、治療的応用で使用され、そこでベクターは、治療用核酸（例えば遺伝子）を標的細胞のゲノムに発現させるため（すなわち遺伝子治療応用）に使用される。本発明のベクターは、広範な種類の治療用核酸を送達するために使用され得る。目的の治療用核酸としては、標的宿主細胞内の欠陥遺伝子（例えば、遺伝子欠陥に基づく病的状態の原因である遺伝子）を置換する遺伝子；癌、自己免疫疾患および／または感染性疾患の処置において治療的有用性を有する遺伝子などが挙げられる。
【００１３】
本発明によれば、従来の当該技術分野の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献において説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００１４】
５．１ 用語
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語は、そのウイルスゲノムが従来の組換えＤＮＡ技術によって改変された細胞を感染させることができるアデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語はまた、キメラベクター（またはさらには多量体ベクター）、すなわち１種より多くのサブタイプ由来の相補的なコード配列を使用して構築されるベクターを含む。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「組換えアデノウルスベクター」という用語は、アデノウイルスヌクレオチド配列および必要に応じて１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むベクター構築物を指す。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、相同性をヘルパーアデノウイルスの核酸配列まで低減させたアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。本実施形態によれば、組換えアデノウイルスベクターは、（例えば、１つ以上の変異をアデノウイルスゲノムに導入する（例えば、アデノウイルスタンパク質の１つ以上のコード領域に欠失を導入する）ことによって）変異アデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス科」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されないマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的に指す。特に、ヒトアデノウイルスは、Ａ〜Ｆの亜属ならびにその個別の血清型を含む。Ａ〜Ｆの亜属としては、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、７ａ型、７ｄ型、８型、９型、１０型、１１型（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、および９１型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「Ｅ１Ａ遺伝子」および「Ｅ１Ｂ領域」とは、感染後に最初に転写される、アデノウイルスゲノムの前初期遺伝子を指す。例えば、Ｅ１Ａコード領域は、ヌクレオチド５６０〜１５４２に及び、Ｅ１Ｂコード領域は、ヌクレオチド１７１４〜２２４２に及ぶ。本明細書で使用される場合、「Ｅ２Ｂ遺伝子」という用語は、１４０ｋＤのＤＮＡポリメラーゼをコードする、アデノウイルスゲノムの初期遺伝子を指す。Ｅ２領域はまた、ウイルスアセンブリー中に切断されて、ＤＮＡに共有結合されたまま５５ｋＤとなる末端タンパク質（８０ｋＤ）の前駆体をコードする。Ｅ２Ｂコード領域は、アデノウイルス５型のヌクレオチド８３６７〜５１９７に及ぶ。完全なヒトアデノウイルス５型ゲノムのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託物が入手可能であり、例えばＡＹ３３９８６５およびＡＣ０００００８を参照されたい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、異種コード配列の転写および翻訳を指示することができるヌクレオチド配列、ならびに発現されるべき異種コード配列を定義するために本明細書で使用される。発現カセットは、細胞内の上記異種コード配列によってコードされるタンパク質産物の発現を達成するために、異種コード配列に作動可能に結合される調節エレメントを含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、核酸配列、アミノ酸配列および抗原と関連して「異種」という用語は、外来であってかつ特定のアデノウイルスと関連して天然では見いだされない、核酸配列、アミノ酸配列、および抗原を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「作動可能に結合される」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸配列が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、それは「作動可能に結合されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に結合されている。作動可能に結合されるとは、結合されるヌクレオチド配列が、代表的には、近接していることを意味する。しかしながら、プロモーターから数キロベース離れており、かつイントロン配列が種々の長さであるとき、エンハンサーは一般的に機能するので、一部のポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に結合され得るが、直接的に隣接されず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスで機能することさえあり得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、インスレーター領域、サイレンシング領域、ポリアデニル化部位、イントロン配列、転写後調節エレメント等を指す。「プロモーター」という用語は、その従来の意味で使用され、コード配列の転写開始および転写速度を制御するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する部位を含み、また調節エレメント（例えば、リプレッサーまたは転写因子）の結合のための部位を含む。プロモーターは、天然に存在する場合もあれば、合成である場合もある。使用されるベクターがウイルスベクターであるとき、プロモーターは、そのウイルスにとって内因性であってもよく、または他の供給源由来であってもよい。特定の細胞型でのみ導入遺伝子の発現を可能にする、増強する、または促進するために、調節エレメントが配置されることも可能である。例えば、導入遺伝子が構成的に活性であるか、または一時的に制御される（一時的プロモーター）、外部の刺激に応えて活性化される（誘導性）、特定の細胞型または細胞状態で活性である（選択的）という、構成的プロモーター、一時的ウイルスプロモーター、または調節可能なプロモータープロモーターの制御下になるように、発現カセットを設計することが可能である。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「感染させる」という用語は、組換えアデノウイルスでの産生細胞の感染を促進するための条件下で補完する細胞株に組換えアデノウイルスを曝露することを意味する。複数コピーの所定のウイルスによって感染した細胞を補完するに際して、ウイルス複製およびビリオンのパッケージングのために必要な活性は、協同的である。従って、細胞がウイルスによって多重に感染する有意な可能性があるように、条件を調節することが好ましい。細胞内でウイルスの産生を増進させる条件の例は、感染段階での増加したウイルス濃度である。しかしながら、細胞につきウイルス感染の総回数は、度を超すこともあり得、細胞にとって毒作用がもたらされる可能性がある。従って、ウイルス濃度の感染を１０６〜１０１０の範囲で、好ましくは約１０９のビリオン／ｍＬで維持するよう努力するべきである。化学薬品も、細胞株の感染性を高めるために使用され得る。例えば、本発明は、カルパイン阻害剤の包含によってウイルス感染性に対する細胞株の感染性を増加させる方法を提供する。本発明の実施に有用なカルパイン阻害剤の例としては、カルパイン阻害剤１（Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナールとしても知られており、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されている）が挙げられるが、これに限定されない。カルパイン阻害剤１は、組換えアデノウイルスへの細胞株の感染性を増加させることが観察されている（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第７，００１，７７０号を参照）。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノムの複製が可能な条件下で培養する」という用語は、組換えアデノウイルスが細胞内で増殖することを可能にするように補完条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されるウイルス粒子の数を最大にするために、条件を制御することが望ましい。従って、温度、溶存酸素、ｐＨ等の反応条件をモニターして制御することが必要である。ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４ Ｔａｌｍａｄｇｅ Ｒｏａｄ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪから市販されている）等の市販されているバイオリアクターは、このようなパラメータのモニタリングおよび維持についての条件を有する。感染、トランスフェクション、および培養条件の最適化は、多少変化するが、ウイルスの効率的な複製および産生のための条件は、例えば、産生細胞株の公知の特性、ウイルスの特性およびバイオリアクターの種類を考慮して、当業者によって達成され得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ヘルパーアデノウイルス核酸配列」という用語は、（ｉ）感染性ビリオンへの組換えアデノウイルスベクターおよび／またはそのパッケージングの複製のウイルス機能を提供し、かつ（ｉｉ）測定可能な程度までウイルス粒子を複製も構築もしない、核酸配列を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「組換えアデノウイルス産生細胞株」、「組換えアデノウイルス補完細胞」、「組換えアデノウイルス補完細胞株」という用語は同義語であり、感染性ビリオンへの組換えアデノウイルスおよび／またはそのパッケージングの複製のウイルス機能を提供することによって組換えアデノウイルスを増殖することのできる細胞を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」または「形質転換」という用語は、細胞への核酸の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取った宿主細胞は、「形質転換」されており、かつ「形質転換体」または「クローン」である。当該技術分野で極めて周知の形質転換方法の例としては、リポソーム送達、電気穿孔、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥデキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が挙げられる。
【００２７】
５．２ 組換えアデノウイルス構築物
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列および必要に応じて１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、補完する細胞株のアデノウイルス核酸配列に対して低減した相同性を有するアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。アデノウイルスヘルパー核酸配列と組換えアデノウイルスベクターの間の相同性の欠如は、ウイルスゲノムが組み換わって複製能力のあるアデノウイルスを生成する可能性を低減させる。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは複製欠損アデノウイルスをコードする。本実施形態によれば、組換えアデノウイルスベクターは、（例えば、アデノウイルスゲノムに１つ以上の変異を導入する（例えば、アデノウイルスタンパク質のための１つ以上のコード領域に欠失を導入する）ことによって）変異アデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。好ましくは、アデノウイルスゲノムの変異は、野生型アデノウイルスよりも低いレベルのアデノウイルスタンパク質の発現をもたらす。アデノウイルスタンパク質発現の減少は、被験体におけるアデノウイルスタンパク質への免疫応答を低減させる。
【００２８】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１を欠失した複製欠損アデノウイルスをコードし、Ｅ２Ｂポリメラーゼ機能が部分欠失または全欠失（好ましくは、全欠失）した変異したゲノムを含み、異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、かつＥ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは、全欠失）した変異したゲノムを含み、欠失したＥ１コード領域に異種ヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明の一実施形態において、Ｅ２Ｂ領域の欠失は、非機能的ＤＮＡポリメラーゼの産生につながるのに十分な欠失を含む。本発明の好ましい実施形態において、Ｅ２Ｂ領域の欠失は、逆鎖上にウイルスタンパク質をコードする配列を保持する。本発明の実施で使用され得る変異としては、ヌクレオチド７２７４〜約７８８１のＥ２ｂ欠失を含むがこれに限定されない（全体が参考として本明細書で援用される、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８を参照）。本発明のさらに別の実施形態において、点変異は、Ｅ２Ｂコード領域に遺伝的に操作されることが可能であり、それによって機能的なアデノウイルスポリメラーゼ発現の低下という結果になる。本発明の特定の実施形態において、Ｅ２Ｂ遺伝子の開始コドンは、Ｅ２Ｂ ｍＲＮＡの翻訳を回避し、それによってＥ２Ｂポリメラーゼ活性の機能を除去するよう変異されることが可能である。
【００３０】
異種ヌクレオチド配列は、ゲノムの任意の領域（例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端）に導入され得る。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異したアデノウイルスのゲノムのＥ１、Ｅ２Ｂ、またはＥ３コード領域等の欠失したアデノウイルスコード領域の１つに導入される。本発明の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異したアデノウイルスのゲノムの欠失したＥ１コード領域に導入される。
【００３１】
本発明によれば、組換えアデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス科由来もしくはアデノウイルス科の組み合わせから得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス科から得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２型または５型から得たおよび／または誘導した、アデノウイルスゲノムまたはその一部を含む。
【００３２】
一実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型５型に由来し、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびタンパク質ＩＸ機能の欠失、ならびにＥ３領域（例えば、全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，２１０，９３９号および第５，９３２，２１０号を参照）およびＥ２ｂ領域での欠失を含む。一例として、限定するものではないが、ヒトアデノウイルス血清型５型由来の組換えアデノウイルスベクターは、塩基対３５７〜塩基対約４０５０の欠失（例えば、塩基対３６０〜塩基対約４０３０までの間の欠失）、塩基対２８，５９７〜塩基対約３０，４７１までの間の欠失、および全体が参考として本明細書で援用される、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）に記載されるようなＥ２ｂ領域での欠失を含むことが可能である。
【００３３】
別の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型５型に由来し、図６のアデノウイルスベクターに示されるのと同じアデノウイルス配列の欠失を含む。
【００３４】
本発明は、変異したアデノウイルスゲノムに挿入される「発現カセット」を含む組換えアデノウイルス発現ベクターに関する。本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、異種コード配列の転写および翻訳を指示することのできるヌクレオチド配列ならびに発現されるべき異種コード配列として定義される。発現カセットは、細胞内で異種コード配列によってコードされるタンパク質産物の発現を達成するために、この異種コード配列に作動可能に結合された調節エレメントを含む。
【００３５】
本発明の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクター以外の供給源から得られる、および／または由来する。本発明によれば、異種ヌクレオチド配列は、所望の生物学的特性または活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし得る。
【００３６】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、サイトカイン、サイトカイン受容体、ホルモン、成長因子、または成長因子受容体等の生物学的応答調節物質をコードする。このような生物学的応答調節物質の非限定的な例としては、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦＲＳＦ１８およびＴＮＦＳＦ１８を含むＴＮＦＲおよびＴＮＦＲリガンドスーパーファミリーメンバーが挙げられる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、インターフェロンα２ｂ（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，８３５，５５７号を参照）等のインターフェロンをコードする。
【００３７】
他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、抗体をコードする。さらに他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質または融合タンパク質をコードする。
【００３８】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクターが由来する種、亜群、または変異体以外のアデノウイルスの異なる種、亜群、または変異体に属するウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、病原性微生物から得たおよび／または由来する抗原タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードする。
【００３９】
本発明のさらに別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、癌の治療遺伝子である。このような遺伝子は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を強化する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列等を含む。従って、例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、細胞周期を調節する際に効果的なタンパク質の発現のための外来遺伝子（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、もしくはマイトシン）、または細胞死を誘発する際に効果的なタンパク質の発現のための外来遺伝子（例えば、条件的自殺遺伝子チミジンキナーゼ）を含み得る。
【００４０】
本発明によれば、組換えアデノウイルスベクターの異種ヌクレオチド配列が宿主細胞で発現されるべき場合、転写調節エレメント（プロモーター／エンハンサー配列とも呼ばれる）を供給するべきである。プロモーター／エンハンサー配列は、広範に活性であり得、または組織特異的であり得る。プロモーター／エンハンサー配列は、非アデノウイルス供給源由来であり得、またはアデノウイルスプロモーターであり得る。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、ヘルパーアデノウイルス核酸配列の発現を調節するプロモーター／エンハンサー配列と共有されない。本実施形態によれば、プロモーターは、当業者に公知の任意のプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。本発明に従って使用され得るプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８２）、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター、Ｅｌｆ−１プロモーター、Ｔｅｔプロモーター、エクジソンプロモーター、およびラパマイシンプロモーター。
【００４１】
特定の実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節するために天然のプロモーターが利用される。別の実施形態において、タンパク質の発現を調節するために、発現されるタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子に固有でないプロモーター（すなわち、異種プロモーター）が利用される。特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ウイルス、細胞、またはハイブリッドの構成的プロモーター）である。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。さらに他の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【００４２】
特定の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター等の構成的プロモーターを使用するのが望ましい。特定の他の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＥｌｆ−１プロモーター等の構成的プロモーターを使用するのが望ましい。さらに他の実施形態においては、アデノウイルスベクターの異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために、Ｔｅｔプロモーターまたはエクジソンプロモーター等の誘導性プロモーターを使用するのが望ましい。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態において、誘導性プロモーターは、本発明のアデノウイルスベクターで使用され得る。これらのプロモーターは、追加の分子の存在下でのみ転写を開始する。誘導性プロモーターの例としては、β−インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子から入手可能なもの、またはステロイドホルモン応答性遺伝子から入手可能なものが挙げられる。組織特異的発現は、遺伝子発現の分野で十分に特徴付けられており、これらのような組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターは、当該技術分野で極めて周知である。外来遺伝子が標的細胞に導入された後にその外来遺伝子の発現を調節するために、これらの遺伝子は使用される。
【００４４】
挿入された非アデノウイルスまたは異種ヌクレオチド配列の望ましい大きさは、ビリオンへの組換えアデノウイルスベクターのパッケージングを可能にする大きさに限定され、かつ保持されるアデノウイルス配列の大きさに依存する。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約３６キロ塩基対の長さである（Ｄａｖｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３によって長さが３５９３８ヌクレオチドであると測定）。ビリオンにパッケージングされる組換えアデノウイルスの全体の大きさは、約３７７３５ヌクレオチドの長さであるはずである（通常のゲノム長の約１０５％）。従って、挿入された異種ヌクレオチド配列の発現を最大限にするために、組換えアデノウイルスベクター内のアデノウイルスゲノムの付加的な部分（例えば、Ｅ３領域）を排除することが望ましいこともある。
【００４５】
本発明の組換えアデノウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、異種ヌクレオチド配列によるウイルスコード領域の完全置換もしくは部分置換によって、または異種ヌクレオチド配列をウイルスゲノムに添加することによってのいずれかで達成され得る。完全な置換は、ＰＣＲによる変異誘発（ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用することによって最も良く達成されると思われる。手短に言えば、ＰＣＲプライマーＡは、５’末端から３’末端に、独特の制限酵素部位（例えば、クラスＩＩＳ制限酵素部位（すなわち、特異的配列を認識するが、その配列の上流もしくは下流のＤＮＡを切断する、「シフター」酵素））；置換されるべき遺伝子のある領域に相補的な一続きのヌクレオチド；および異種ヌクレオチド配列のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌクレオチドを含む。ＰＣＲプライマーＢは、５’末端から３’末端に、独特の制限酵素部位；置換されるべき遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；および異種遺伝子または非天然の遺伝子の５’コード部分に対応する一続きのヌクレオチドを含む。異種遺伝子もしくは非天然の遺伝子のクローン化コピーとこれらのプライマーを使用するＰＣＲ反応の後に、産物は、独特の制限酵素部位を使用して切り出されてクローン化され得る。クラスＩＩＳ酵素による消化および精製ファージポリメラーゼによる転写は、ここで、異種遺伝子挿入物もしくは非天然の遺伝子挿入物を有するウイルス遺伝子の非翻訳の正確な両端を含むＲＮＡ分子を作製する。別の実施形態において、バクテリオファージプロモーター配列、およびＲＮＡテンプレートがクローニングなしで直接的に転写され得るようなハイブリッド遺伝子配列を含む二重鎖ＤＮＡを調製するために、ＰＣＲプライミング反応が使用され得る。
【００４６】
本発明の組換えアデノウイルスベクターに異種ヌクレオチド配列を挿入するとき、異種ヌクレオチド配列のコード配列の末端と下流遺伝子のコード配列の開始部との間の遺伝子間領域は、所望の効果を達成するために改変され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」という用語は、１つの遺伝子の停止シグナルと次の下流のオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン（例えばＡＵＧ）との間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域（すなわち、遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始部（ＡＵＧ）との間）を含み得る。この非コード領域は、一部のウイルス遺伝子には天然に存在する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、「インスレーター」と呼ばれる配列が、異種ヌクレオチド配列の下流の遺伝子間領域で、発現カセットに挿入され得る（Ｄｉ Ｓｉｍｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００４ａ；Ｐｌｕｔａ，ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｉｎｃｏｎ−Ａｒａｎｏ ａｎｄ Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，２００４；Ｔａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。このようなインスレーターの挿入は、野生型と比べて、アデノウイルスタンパク質の低下した発現をもたらす可能性があり、これはアデノウイルスベクターの免疫原性および毒性を低減する際に有用である。本発明の実施で使用され得るインスレーター配列は、当業者には周知であり、例えば、βグロビン遺伝子座の高感受性領域４（ＨＳ４）を含む。ＨＳ４座は、レトロウイルス（Ｅｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐａｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００１；Ｙａｎｎａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３）およびアデノウイルスベクターでも使用されてきた（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｕｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ；Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒ，２０００；Ｙｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。クロマチン再配列およびブロッキング活性による遺伝子発現の制御の原因となるＨＳ４座の領域は、転写調節因子ＣＴＣＦに起因すると考えられてきた（Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅ，２００３；Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｅｍｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋａｎｄｕｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｍｕｒｒｅｌｌ，２００４；Ｌｕｔｚ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐａｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００１；Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓａｉｔｏｈ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｚａｂｏ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｖａｌａｄｅｚ−Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｙａｎｎａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙｕｓｕｆｚａｉ ａｎｄ Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，２００４；Ｙｕｓｕｆｚａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｄｅａｎ，２００４）。本発明の一実施形態において、βグロビン遺伝子座の高感受性部位４からＣＴＣＦ結合部位のヘッドからテイルまでの４コピーを含むインスレーターは、インスレーターとして使用され得る。別の実施形態においては、他の合成インスレーター配列（Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｒａｓｓｅｔ ａｎｄ Ｖａｕｒｙ，２００５；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｄｅａｎ，２００４）も使用され得る。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｅ１ＢポリＡシグナル配列は、異種遺伝子のポリアデニル化およびＲＮＡ安定化を増大させる異種ポリＡ配列によって置換され得る。ポリアデニル化およびＲＮＡ安定化のこのような増大は、異種遺伝子産物のより効率的な発現をもたらし得る。本発明の非限定的な実施形態において、ポリＡシグナル配列は、以下のコンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＴＴＡＡを含有する配列を含む。本発明の実施形態において、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ウイルス等のウイルス由来であり得る。本発明の特定の実施形態において、Ｅ１ＢポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙｏｕｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２００３）によって置換され得る。ＢＧＨポリＡ配列は、既存の市販のプラスミドからＰＣＲによって得られ得る。
【００４９】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明の組換えアデノウイルスは、導入遺伝子発現を増大させるよう機能する転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ＰＲＥ（Ｄｏｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８）、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｙｅｎ，１９９４）、または単純ヘルペスＰＲＥ（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ，１９９５）を含むこのようなエレメントは、異種遺伝子の下流位置で発現カセットに挿入される（Ａｐｐｌｅｂｙ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｒｅｃｋｐｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｒｕｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｒｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｎｇｅｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｏｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｃｈｗｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗｅｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙａｍ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００５０】
本発明はまた、発現カセットが異種遺伝子の５’非翻訳領域へ操作されたイントロン配列を含むように操作される組換えアデノウイルスを提供する（Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｈｅｒｍｅｎｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。本発明の実施で使用されるべきイントロン配列は、例えば、必要なコンセンサススプライシングシグナルを取り込むプライマーを使用するＰＣＲを使用して既知のコンセンサススプライシング配列から生成され得る。イントロン配列は、５’スプライス供与体部位、および分岐点配列と３’スプライス受容体ＡＧ部位とを含む３’スプライス領域を含む。３’スプライス領域は、さらにポリピリミジントラクトを含み得る。ＲＮＡスプライシングで使用される５’スプライス供与体部位および３’スプライス領域のコンセンサス配列は、当該技術分野で周知である（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３０３−３５８を参照）。さらに、５’スプライス供与体部位および３’スプライス領域として機能する能力を維持する改変されたコンセンサス配列は、本発明の実施で使用され得る。手短に言えば、５’スプライス部位のコンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン、および／＝スプライス部位）である。３’スプライス部位は、次の３つの別々の配列エレメントからなる：分岐点もしくは分枝部位、ポリピリミジントラクト、および３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）。哺乳類における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン、Ｎ＝任意のヌクレオチド）である。下線をしたＡは、分枝形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス受容体部位の間に位置し、分岐点の効率的な利用および３’スプライス部位の認識のために重要である。ジヌクレオチドＡＵから始まりジヌクレオチドＡＣで終わる他のプレメッセンジャーＲＮＡイントロンは同定されており、Ｕ１２イントロンと呼ばれる。スプライス受容体／供与体配列として機能するＵ１２イントロン配列ならびに任意の追加の配列も、本発明の発現カセットを作製するために使用され得る。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、発現カセットの５’非翻訳領域は、アデノウイルストリパータイトリーダーを含む。
【００５２】
一実施形態において、発現ベクターは、１つ以上の異種ヌクレオチド配列、ＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、合成イントロン、ＷＰＲＥ配列、ポリＡ領域、およびＣＴＣＦ結合部位を含む。一例として、限定するものではないが、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、図５に示す発現カセットを含み得る。
【００５３】
挿入された異種ヌクレオチド配列の発現は、タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを含むがこれらに限定されない種々の指標によって決定されることが可能であり、以下のアッセイの非限定的な例によって測定され得る：免疫染色法、免疫沈降法および免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出（例えば、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析）、レポーター遺伝子の使用（例えば、タンパク質発現を観察するために目的の異種遺伝子と同じ方法でウイルスゲノムに組み込まれる、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））、またはこれらの組み合わせ。これらのアッセイを実施する手順は、当該技術分野で周知である（例えば、テキスト全体が参考として本明細書で援用される、Ｆｌｉｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ，ＡＮＤ ＣＯＮＴＲＯＬ，２０００，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ ２５−５６を参照）。
【００５４】
例えば、発現レベルは、培養中の細胞を本発明の組換えアデノウイルスに感染させ、続いて異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、例えばウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡによってタンパク質の発現のレベルを測定するか、または異種配列に特異的なプローブを使用して、例えばノーザンブロット分析によってＲＮＡ発現のレベルを測定することによって決定され得る。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルを感染させ、この動物モデルで本発明の組換えウイルスの異種ヌクレオチド配列から発現されたタンパク質のレベルを測定することによって決定され得る。タンパク質レベルは、感染した動物から組織試料を採取し、次いで、組織試料を、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用する、ウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡにかけることによって測定され得る。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対してこの動物によって産生される抗体の力価は、ＥＬＩＳＡを含むがこれに限定されない、当業者に公知の任意の技術によって決定され得る。
【００５５】
本発明によれば、大量の組換えアデノウイルスベクターを得るために、組換えアデノウイルスベクターは、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージの一部として微生物中で増殖され得る。
【００５６】
５．４ 組換えアデノウイルスの産生
本発明によれば、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）は、組換えアデノウイルスベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列を使用して適切な細胞型を共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することによって生成され得る。同時トランスフェクションは、ＤＥＡＥデキストラン法（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ，１９６８）によって、リン酸カルシウム手順（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３）によって、またはマイクロインジェクション、リポフェクション、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない当該技術分野で公知の任意の他の方法によって実施され得る。トランスフェクションで使用される組換えアデノウイルスベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列の量は、１０６細胞あたり約０．２〜１０μｇのＤＮＡであるが、種々のＤＮＡ構築物および細胞型によって異なり得る。トランスフェクションに好適な細胞としては、ＨｅＬａ細胞、２９３−Ｄ２２細胞、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−１細胞、Ｕ８７細胞、およびＷ１６２細胞が挙げられるがこれらに限定されないアデノウイルス感染が可能な任意の細胞株が挙げられる。
【００５７】
あるいは、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）を生成するために、組換えアデノウイルス補完細胞株は、組換えアデノウイルスベクターをトランスフェクションされることも可能である。特定の実施形態において、本発明は、細胞株中でのウイルスゲノムの複製を許容する条件下で、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクションされた、細胞株を補完する組換えアデノウイルスを培養することを含む組換えアデノウイルスの生成法を提供する。ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）アデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質（および好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子；および（ｃ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子。
【００５８】
本発明の非限定的な実施形態において、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ２Ｂポリメラーゼを発現するように操作され、かつ米国特許出願第６０／６７４，４８８号および米国特許出願公開第２００６／０２７００４１号（その開示が参考として本明細書で援用される）に記載されるＳＬ０００６形質転換細胞株は、本発明の組換えアデノウイルスを増殖させるために使用され得る。ＳＬ０００６細胞株は、ブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６６６３で寄託されている。
【００５９】
本発明の組換えアデノウイルスは、任意の適切な方法によって生成されることが可能であり、その方法の多くは当該技術分野で公知である（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８４；Ｂｒｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照）。本発明の好ましい実施において、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス科に由来する。本発明の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２型または５型に由来する。
【００６０】
本発明の好ましい実施において、生成される組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含む複製欠損アデノウイルスであり、かつＥ１領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ３コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ４コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域、Ｅ３コード領域、およびＥ４コード領域が部分欠失または全欠失（好ましくは全欠失）している、変異したゲノムを含み、かつ欠失したＥ１コード領域に１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
本発明の好ましい組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルス産生細胞中にアデノウイルスＤＮＡ配列との相同性が低減したウイルスＤＮＡ配列を含み、それはウイルスゲノムが細胞ＤＮＡと組み換わってＲＣＡを生成する可能性を低減させる。
【００６５】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスの量は力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）される。培養物中のアデノウイルスの量を力価測定することは、当該技術分野で公知の技術によって実施され得る。特定の実施形態において、ウイルス粒子の濃度は、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂに記載されるリソースＱアッセイによって決定される。本明細書で使用される「溶解（ｌｙｓｉｓ）」という用語は、ウイルス含有細胞の破裂を指す。溶解は、当該技術分野で周知の種々の手段によって達成され得る。例えば、哺乳類細胞は、低圧力（１００〜２００ｐｓｉ差圧）条件下で、均質化によって、マイクロフルイダイゼーションによって、または従来の凍結融解方法によって、溶解され得る。外来性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを使用する分解によって除去され得る。
【００６６】
ウイルス含有細胞は凍結され得る。ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地から採取され得る。一実施形態において、ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地の両方から同時に採取される。特定の実施形態において、ウイルスを産生する細胞および培地は、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号に記載されるように、ウイルス含有細胞を溶解すること、浄化しなければウイルスの精製を妨げる培地の細胞残屑を浄化することを同時に行う条件下で直交流精密ろ過にかけられる。
【００６７】
本明細書で使用される「採取する」という用語は、培地から組換えアデノウイルス含有細胞を収集することを意味し、培地からの組換えアデノウイルスの収集も含み得る。これは、分画遠心分離またはクロマトグラフィー手段等の従来の方法によって達成され得る。この段階で、採取した細胞は貯蔵される場合もあれば、組換えウイルスを単離するために溶解または精製によってさらに処理される場合もある。貯蔵のためには、採取された細胞は、生理的ｐＨでもしくはほぼそのｐＨで緩衝化され、−７０℃で凍結されるべきである。
【００６８】
ウイルスはまた、ウイルス含有細胞および培地から別々に採取され得る。ウイルス含有細胞は、分画遠心分離等の従来の方法によって培地から別々に収集され得る。採取した細胞は、凍結貯蔵される場合もあれば、ウイルスを遊離させるために溶解によってさらに処理される場合もある。ウイルスは、クロマトグラフィー手段によって培地から採取され得る。外来性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）等のＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを使用する分解によって除去され得る。
【００６９】
ウイルスの採取物はさらに、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号、同第６，５４４，７６９号、および同第６，７８３，９８３号に記載されるように、限外ろ過または接線流ろ過等の方法によってウイルスを濃縮するために処理され得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「回収する」という用語は、溶解した産生細胞から、および必要に応じて上清培地からの、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団の単離を意味する。本発明の細胞培養物中で生成されるウイルス粒子は、当該技術分野で一般的に知られている任意の方法によって単離および精製され得る。クロマトグラフィー等の従来の精製技術、または示差密度勾配遠心法が使用され得る。例えば、ウイルス粒子は、塩化セシウム勾配精製；カラムもしくはバッチクロマトグラフィー；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａ，ｅｔ ａｌ．，１９６１；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｅｉｒａ，１９５９；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ，１９６０）；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００２／００６４８６０号）；ならびにソフトゲル（例えばアガロース）を含む均質な架橋した多糖等、大きい「スルーポア」を有する灌流クロマトグラフィー樹脂を含む合成ポリマーに基づくマクロポーラスポリマー、タンパク質とより迅速に相互作用するように設計されたテンタクル（触手）を有する「テンタクル構造」吸収剤（例えばフラクトゲル）、およびソフトゲルの高容量と複合材料の剛性を利用する、剛性シェル中のソフトゲルに基づく物質（例えばセラミックハイパーＤ（登録商標）Ｆ）（Ｂｒｏｓｃｈｅｔｔｉ，１９９４；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，１９９７）等の他の樹脂を使用するクロマトグラフィーによって精製され得る。本発明の好ましい実施において、ウイルスは、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８３７，５２０号（１９９８年１１月１７日発行）に記載されるように、Ｈｕｙｇｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９５ｂのプロセスに実質的に従って、カラムクロマトグラフィーによって精製される。また、開示が参考として本明細書で援用される、米国特許第６，２６６１，８２３号を参照されたい。
【００７１】
ウイルスを産生する組換えアデノウイルス産生細胞株は、当該技術分野で公知の任意の好適な容器で培養され得る。例えば、細胞は増殖され、感染した細胞はバイオジェネレーターまたはバイオリアクターで培養され得る。通常、「バイオジェネレーター」または「バイオリアクター」は、一般的に０．５リットル以上の容量のステンレス鋼製またはガラス製で、攪拌システム、ＣＯ２ガスの流れを注入するためのデバイス、および酸素添加デバイスを備える培養タンクを意味する。一般的に、これは、ｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧力または培養物の特定の生理化学的パラメータ（例えば、グルコースもしくはグルタミンの消費または乳酸イオンもしくはアンモニウムイオンの産生）等のバイオジェネレーターの内部パラメータを測定するプローブを備えている。ｐＨ、酸素、および温度のプローブは、これらのパラメータを永久に調節するバイオプロセッサに接続される。他の実施形態において、容器は、スピナーフラスコ、回転ボトル、振盪フラスコ、またはフラスコ内に機械的攪拌を提供するスターラーバーが付いたフラスコである。別の実施形態において、容器は、ウェ−ブバイオリアクター（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ［米国ニュージャージー州ブリッジウォーター］）である。
【００７２】
組換えアデノウイルスは、本発明の組換えアデノウイルス産生細胞株で増殖され得る。ウイルスは、細胞を培養し；必要に応じて細胞に新たな増殖培地を加え；細胞にウイルスを接種し：接種した細胞をインキュベートし；必要に応じて播種した細胞に新たな増殖培地を加え；および必要に応じて細胞および培地からウイルスを採取することによって生成され得る。一般的に、Ｓｈａｂｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂに記載されるように、リソースＱカラムを使用する高性能液体クロマトグラフィー等の従来の方法によって決定した場合に、ウイルス粒子の濃度がプラトーに達し始めるときに、採取を実施する。
【００７３】
本発明の組換えアデノウイルス産生細胞株で増殖させた組換えアデノウイルス（例えば、Ｅ１ＡとＥ１Ｂのコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、あるいはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ２Ｂのポリメラーゼコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、およびＥ３のコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、あるいはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂのポリメラーゼコード領域の欠失、Ｅ３とＥ４のコード領域の欠失を含み、かつ異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス）により生成されるタンパク質も、単離および精製され得る。タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドは、塩析沈澱もしくはアルコール沈澱、親和性クロマトグラフィー、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配を含むがこれらに限定されない標準方法によって精製され得る。このような精製方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｅｄ．１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示される。
【００７４】
５．５ 組換えアデノウイルスの有用性
本発明の組換えアデノウイルスは、目的のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを発現させるためにインビトロで使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスはまた、遺伝子治療でも使用され得る。組換えアデノウイルスは、インビボでのまたはエキソビボでの遺伝子治療で使用され得る。インビボでの遺伝子治療については、組換えアデノウイルスは、被験体に直接投与される。エキソビボでの遺伝子治療については、細胞は、インビトロで組換えアデノウイルスに感染させられ、次いで感染した細胞は、被験体に移植される。特定の実施形態において、組換えアデノウイルスは、インビボで直接投与され、目的のタンパク質が発現される。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量を被験体に投与することを含む癌の処置のための方法を含む。治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターは、腫瘍内または膀胱内の投与を含むがこれらに限定されない当該技術分野で公知の任意の送達方法を使用して、任意の癌組織または器官に送達され得る。これらの方法によって処置され得る癌の例としては、膀胱および上気道、外陰部、頚部、膣もしくは気管支の癌腫；腹膜の局所転移性腫瘍；気管支肺胞癌腫；胸膜転移性癌腫；口腔および扁桃の癌腫；上咽頭、鼻部、喉頭、食道、胃、卵巣、前立腺、結腸および直腸、胆嚢、もしくは皮膚の癌腫；または黒色腫もしくは白血病等の血液癌が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、限定するものではないが、インターフェロンα２ｂをコードする発現カセットを含む本発明の組換えアデノウイルスは、膀胱癌の処置において使用され得る。一実施形態において、図６に示される組換えアデノウイルスベクターは、膀胱癌を処置するために本明細書に記載される方法で使用される。
【００７６】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。一実施形態において、図６に示される組換えアデノウイルスベクターは、膀胱癌の被験体に約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの範囲で投与される。
【００７７】
別の実施形態において、細胞は、組換えアデノウイルスを感染させられ、得られた組換え細胞が、被験体に投与される。得られた組換え細胞は、当該技術分野で公知の種々の方法によって被験体に送達され得る。組換え体の血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与される。使用上想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存し、当業者によって決定され得る。本発明によれば、組換えアデノウイルスに感染され得るいかなる細胞も、遺伝子治療のためのものとなり得る。非限定的な例としては、上皮細胞（例えば呼吸上皮細胞）、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、貪食細胞、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等）、および種々の幹細胞もしくは前駆細胞（特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎仔肝等から採取されるような、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞）が挙げられる。好ましい実施形態において、遺伝子治療のために使用される細胞は、被験体に対して自家である。組換え細胞が遺伝子治療で使用される実施形態において、組換えアデノウイルスのゲノムによってコードされるタンパク質は、細胞またはそれらの子孫によって発現されることが可能であり、この組換え細胞は、次いで、治療効果のためにインビボで投与される。
【００７８】
本発明の組換えアデノウイルスは、被験体を免疫するために使用され得る。例えば、組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスによってコードされる異種抗原に対する抗体を生成するために使用され得る。被験体を免疫するために使用されるべき組換えアデノウイルスの量および免疫スケジュールは、当該技術分野の熟練した医師によって決定され、かつ被験体の免疫応答および抗体力価を参照することによって投与される。
【００７９】
組換えアデノウイルスによる免疫によって抗原に対して生成される抗体は、診断免疫アッセイ、受動免疫療法、および抗イディオタイプ抗体の生成で使用され得る。生成された抗体は、当該技術分野で公知の標準的な技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈澱等）によって単離され得、そして診断免疫アッセイで使用され得る。抗体はまた、治療および／または疾患進行をモニターするために使用され得る。数例を挙げれば、組換えアデノウイルス免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の免疫アッセイ系がこの目的で使用され得る。
【００８０】
本発明の組換えアデノウイルスは、受動免疫療法で使用する抗体を生成するために使用することが可能であり、この受動免疫療法では、異種抗原に対して予め形成された抗体の投与によって、被験体の短期的な保護が達成される。本発明の組換えアデノウイルスによって生成される抗体はまた、抗イディオタイプ抗体の生成においても使用され得る。そして次に、抗イディオタイプ抗体は、最初の抗原に結合する抗体の亜集団を生成するために、免疫で使用され得る（Ｊｅｒｎｅ，１９７４；Ｊｅｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８２）。
【００８１】
ある実施形態において、組換えアデノウイルスを使用した免疫によって産生される抗体は、改変されてから被験体に投与される。例えば、抗体はヒト化されおよび／または親和性が成熟され得る。
【００８２】
５．６ 組換えアデノウイルスを投与する組成物および方法
本発明は、本発明の方法によって生成される組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）を含む組成物を包含する。好ましい実施形態において、組成物は、被験体への投与に好適な薬学的組成物である。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、有効量の組換えアデノウイルス、および薬学的に許容されるキャリアを含む。特定の実施形態において、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用を連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されるか、または米国薬局方もしくは、他の一般的に認識される薬局方に記載されることを意味する。「キャリア」という用語は、薬学的組成物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを指す。特に注射可能な溶液に関して、生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセリン水溶液も、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレ−ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態を採り得る。これらの組成物は、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、患者への投与に適切な形態を提供するために、好適な量のキャリアと共に有効量の組換えアデノウイルス（好ましくは精製された形で）を含有する。処方物は、投与様式に適合するべきである。
【００８４】
特定の障害または病態の処置に効果的である本発明の薬学的組成物の量は、障害または病態の性質に依存し、かつ標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロでのアッセイは、最適な用量範囲を同定するのに役立てるために、必要に応じて使用され得る。処方物で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重篤度に依存し、実施者の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルでの試験系から導かれる用量応答曲線から外挿され得る。
【００８５】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。
【００８６】
一例として、限定するものではないが、被験体における表在性膀胱癌の処置のために、約１００ｍＬの容積中のインターフェロンα２ｂをコードする約１×１０１０粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、最も好ましくは、約１×１０１１粒子／ｍＬの用量を含む処置コースが、約１時間にわたって膀胱内に滴下注入される。一例として、限定するものではないが、別の処置コースは、約１００ｍＬ容積中のインターフェロンα２ｂをコードする１×１０１０粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬ、最も好ましくは、約１×１０１１粒子／ｍＬの用量の約１時間にわたる膀胱内滴下注入、その後の第１の用量から７日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内または連日の実質的に同等の第２の用量を含み得る。各処置コースは、疾患の進行経過によって、反復可能である。膀胱癌の処置のために膀胱内に投与される組換えベクターの場合、処置コースの間に少なくとも１４日間、より好ましくは約３０日間、最も好ましくは約９０日間の間隔を置くと、最適なインターフェロン遺伝子発現が通常観察される。
【００８７】
組成物の投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮表層もしくは粘膜表層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸管粘膜等）を通した吸収によって投与され得、そして他の生物活性薬剤と共に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を任意の好適な経路により肺に導入することが望ましいこともある。経肺投与は、例えば、吸入器もしくは噴霧器、およびエアゾール化剤を使用する処方の使用によって使用され得る。
【００８８】
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に本発明の薬学的組成物を局所的に投与することが望ましいこともある。これは、例えば、外科手術時の局所注入、局所適用（例えば、外科手術後の創傷被覆材と併せて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラントにより達成されることが可能であるがこれらに限定されず、このインプラントは、シアラスティック膜等の膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン質の材料である。一実施形態において、投与は、悪性腫瘍または腫瘍性組織もしくは前腫瘍性組織の部位（または前部位）での直接注射により行われ得る。別の実施形態において、投与は膀胱内投与であり得る。
【００８９】
別の実施形態において、薬学的組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態においては、ポンプが使用され得る（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｌａｎｇｅｒ，１９８３；Ｓａｕｄｅｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７）。別の実施形態においては、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３）；（Ｄｕｒｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８５を参照）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、組成物の標的（すなわち肺）のすぐ近くに配置されることが可能であり、従って、全身用量のうちの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０によるレビューで考察される。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、本発明の方法で生成される組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）および好適な賦形剤を含む、ワクチンまたは免疫組成物である。ワクチン組成物を導入するために多数の方法が使用され得、これらの方法としては、鼻腔内、気管内、口腔、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。アデノウイルスの自然な感染経路を介して組換えアデノウイルスワクチン組成物を導入することが好ましいこともある。
【００９１】
治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの治療有効量の非限定的な例は、約１×１０８粒子／ｍＬ〜約１×１０１２粒子／ｍＬの間、または約１×１０９粒子／ｍＬ〜約１×１０１１粒子／ｍＬの間の範囲である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、例えばインターフェロン等の治療用タンパク質をコードする核酸の標的細胞（例えば癌細胞等）への移入を促進する促進剤と併せて組換えアデノウイルスベクターを投与することが望ましいこともある。このような送達促進剤の例としては、洗浄剤、アルコール、グリコール、界面活性物質、胆汁酸塩、ヘパリン拮抗薬、シクロオキシゲナーゼ阻害薬、高張食塩液、および酢酸塩が挙げられる。アルコールとしては、例えば、エタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコール等の脂肪族アルコールが挙げられる。グリコールとしては、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ならびにグリセロールおよびチオグリセロール等の他の低分子量グリコールが挙げられる。酢酸、グルコン酸、および酢酸ナトリウム等の酢酸塩は、送達促進剤のさらなる例である。１Ｍ ＮａＣｌのような高張食塩液も、送達促進剤の例である。タウロコレート、タウロデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコレート、ケノデオキシレート、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸等の胆汁酸塩、および硝酸銀等の他の収斂薬が使用され得る。硫酸プロタミン等の第４級アミンのようなヘパリン拮抗薬も使用され得る。遺伝子導入を促進させるために、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、および非イオン性の洗浄剤も使用され得る。典型的な洗浄剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、Ｚｗｉｔｔｅｒｔｇｅｎｔ ３−１４洗浄剤、ＣＨＡＰＳ （３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール］−１−プロパンスルホン−エート水和物）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００洗浄剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ−Ｆ６８洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ ２０洗浄剤、およびＴＷＥＥＮ ８０洗浄剤（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。特に好ましい促進剤および方法は、それぞれ教示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３１２，６８１号（２００１年１１月６日発行）、Ｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１６５，７７９号（２０００年１２月２６日発行）、およびＥｎｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３９２，０６９号（２００２年５月２１日発行）に記載される。本発明の実施に有用な特に好ましい促進剤は、米国特許第６，３９２，０６９号の式ＩのＳｙｎ３と呼ばれる化合物である。本発明の実施に有用なさらなる促進剤としては、国際特許公開第２００４／１０８０８８号の化学式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶの化合物ならびにそれらの薬学的に許容される塩を含むが、これらに限定されない。一例として、限定するものではないが、促進剤はベクターと同時に投与され得るか、またはベクターの投与前に投与され得る。
【００９３】
本発明の組成物および方法は、単独で、または従来の化学療法薬もしくは処置レジメンと併用して実施され得る。このような化学療法薬の例としては、プリン合成の阻害剤（例えば、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート）もしくはピリミジン合成の阻害剤（例えば、パラ、アザルビン（ａｚａｒｂｉｎｅ））、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの転換の阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素）、ｄＴＭＰ合成の阻害剤（５−フルオロウラシル）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、放射線、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、アルキル化剤、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン）、ならびに微小管機能の阻害剤（例えば、ビンカアルカロイドおよびコルヒチン）が挙げられる。化学療法の処置レジメンは、主として放射線治療などの腫瘍細胞を切断するよう設計された非化学的手順を指す。これらの化学療法薬は、別々に投与される場合もあれば、同時投与のために本発明の処方物に含まれる場合もある。本発明はまた、表在性膀胱癌の場合にＢＣＧ等の従来の免疫療法の処置レジメンと併用して実施され得る。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されないものとする。実際に、本明細書に記載される改変に加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとして意図される。
【００９４】
特許、特許出願、刊行物、製品説明、およびプロトコールは、本出願全体を通して引用され、これらの開示内容は、全体が参考として本明細書で援用される。
【００９５】
【表１−１】
【００９６】
【表１−２】
【００９７】
【表１−３】
【００９８】
【表１−４】
【００９９】
【表１−５】
【０１００】
【表１−６】
【０１０１】
【表１−７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図６Ｋ】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図６Ｋ】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１６３５９（Ｐ２０１２−１６３５９Ａ）
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２３１１７２（Ｐ２０１１−２３１１７２）
【出願日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【分割の表示】特願２００８−５４５６７８（Ｐ２００８−５４５６７８）の分割
【原出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【出願人】（３９９０２５２８４）カンジ，インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３１１７２（Ｐ２０１１−２３１１７２）
【出願日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【分割の表示】特願２００８−５４５６７８（Ｐ２００８−５４５６７８）の分割
【原出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【出願人】（３９９０２５２８４）カンジ，インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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