ＥＣ−ＳＯＤの新規な用途及びその製造方法
本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質、又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患又はアレルギー疾患の予防又は治療用組成物及びＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法に関する。前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは血管新生を誘導するＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現を抑制して、血管新生を抑制する効果が優れ、血管新生による疾患予防及び治療に有用に使用することができ、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断して転写因子（ＮＦ−ｋＢ）活性を阻害し、人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させることにより、アレルギー疾患の予防及び治療に有用に使用し得る。さらに、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法は、前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を大量に生産することができて産業的に有用に使用し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の新規な用途及びその製造方法に関する。具体的に本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質、又はこれらをコーディングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする、血管新生による疾患又はアレルギー疾患の予防又は治療用組成物及びＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）は活性酸素を除去するばかりでなく、他の抗酸化酵素が作用し得るようにして、細胞を保護するよう機能し、今までに知られているＳＯＤには銅と亜鉛原子を有しているＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ１），マンガン原子を有しているＭｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ２）及び細胞表面、又は細胞外液に存在するＥＣ−ＳＯＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）等がある。
【０００３】
特に、ＥＣ−ＳＯＤはＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのように銅及び亜鉛原子を有しているものの、Ｃ−末端側にヘパリン結合ドメイン（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）が存在すると言う特徴がある。ＥＣ−ＳＯＤはヘパリン結合ドメインを有している為、細胞膜のヘパリンに結合され、細胞膜を保護する役割をするものと推定されている。文献によれば、ＥＣ−ＳＯＤは血漿と細胞外基質等において、生体防御作用を担当しているものとして知られている（Ｍａｒｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６６，２１３−２１９，１９９０；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ １６（２），１６２−７０，１９９７；Ｌｕｏｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏ．１８，１５７−１６７，１９９８）。ＥＣ−ＳＯＤのヘパリン結合ドメインが、核局在化シグナル（ｎｕｃｉｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）として働き、胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）と睾丸細胞（ｔｅｓｔｉｓ ｃｅｌｌ）において、核内に位置して酸化的ストレスからゲノムＤＮＡを保護し、酸化還元反応に敏感な転写作用を調節するとして報告されている（Ｏｏｋａｗａｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，２９６，５４−６１，２００２）。本発明者等は、大韓民国特許第１０−０６７６５０２号において、ＥＣ−ＳＯＤが皮膚細胞内活性酸素腫を除去し、表皮細胞の過増殖を抑制して乾癬等の皮膚疾患を治療する効果があることを開示している。
【０００４】
一方、血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の微細血管から新たな毛細血管が形成される過程である。正常には胚芽の発達（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の際、傷の治癒、周期的な女性の生殖器系統の変化の時にのみ起こり、その他の正常な条件では殆ど起こらない現象である。しかしながら、血管新生が自律的に調節できない時、病的に成長することにより癌のような疾患が誘発される。
【０００５】
前記血管新生過程は腫瘍サイトカイン、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び塩基繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）により、内皮細胞の成長を促進させる段階、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により細胞外基質蛋白質を分解させる段階、細胞膜接着分子、内皮細胞分化及び管形成により媒介される内皮細胞の移動段階のような多様な段階で構成されている（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２：２５１−２５６，１９９７；Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４０：５５６−５７２，２００１；Ｒｉｓａｎ，Ｗ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ４４：４１６−４１７，１９９４）。従って、前記過程等の阻害は血管新生と関連した癌及び他の人間の疾病の治療の為の新たな治療戦略として台頭するようになった。前記目的の為、多様な種類の血管新生抑制剤が開発された。前記抑制剤は天然的であるか又は合成された物質にして、蛋白質分解酵素抑制剤、チロシンリン酸化酵素の抑制剤、ケモカイン、インタルキン及び基質蛋白質の分解切片を含む（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５４４２−１５４５１，１９９７；Ｃａｏ，Ｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３３：３５７−３６９，２００１；Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ａｅｔ ａｌ． ，Ｃａｎｃｅｗ Ｒｅｓ．５９：９９−１０６，１９９９；Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ ｉｎｅｒｍｉｓ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：６５６−６６２，２００１．）。前記抗血管新生分子等は内皮細胞増殖、移動、蛋白質分解活性及び管形成の抑制ばかりでなく、細胞自殺（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導を含む多くの過程に影響を及ぼす（Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．３：８９−９６，１９９２；Ｋｉｓ ｈｉ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５８：１７４７−１７６２，２０００；Ｍａｒｍｅ，Ｄ．，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ １：１−５，２００１）。
【０００６】
前記分子等の抗血管新生機能はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて良く研究されたものの、幾つかの物質は現在臨床試験を実施している（Ｄｅｐｌａｎｑｕｅ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３６：１７１３−１７２４，２０００；Ｌｉ ｅｋｅｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１：２５３−２ ７０，２００１；Ｍｒｏｓｓ，Ｋ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．３：２２ ３−２３５，２０００）。
【０００７】
活性酸素腫が血管新生の主要な調節者として報告されているものの（Ｊｏｌａｎｔａ Ｇｒｚｅｎｋｏｗｉｃｚ−Ｗｙｄｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４（１−２）：１６９−８１，２００４）、活性酸素腫を除去するＳＯＤと血管新生との関連性に対しては十分に調査されたものがない。最近ＳＯＤの中で銅と亜鉛原子を有しているＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ１）を過発現させると、血管新生が促進され、前記ＳＯＤ１を抑制すると血管新生を抑制し（Ｊｏｌａｎｔａ Ｇｒｚｅｎｋｏｗｉｃｚ−Ｗｙｄｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４（１−２）：１６９−８１，２００４）、ＳＯＤ１の抑制剤であるＡＴＮ−２２４が血管新生を抑制して抗癌剤として使用することができ、現在第２相臨床試験中であるとして報告されている（Ｊｕａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：４９７４−４９８２，２００６）。しかしながら、ＥＣ−ＳＯＤと血管新生の関連性に対しては報告された例が全くない。
【０００８】
一方、産業の発達により、環境汚染、新たな合成新物質の増加、住居環境の変化によりアレルギーを誘発する因子が増加し、これに伴い喘息、アレルギー疾患により苦痛にさらされている人間等の数が漸次増加してきた。一旦侵入した異物に対して生体が特異な抵抗を示す機能を免疫と称し、アレルギーとは、免疫反応の過敏症の一つであり、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、花粉症は代表的なアレルギー性疾患である。アレルギー反応に伴う臨床的症状等は、大きくは、アレルギー疾患の種類に伴う反応初期の特異な免疫反応と反応後期の炎症反応とに区分される。このようなアレルギー反応は大部分が肥満細胞を媒介に起こるものの、肥満細胞は皮膚、呼吸器、胃腸管の粘膜、リンパ管周囲、血管周囲、脳等全身の臓器に広く分布し、アレルギー反応の原因細胞として知られている。肥満細胞を活性化させる媒介物質としては、細胞の細胞膜に存在する高親和性のＩｇＥ収容体に結合されているＩｇＥ抗体（ＦｃεＲＩ）、化合物４８／８０（ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０）等が知られている。ＩｇＥ抗体による肥満細胞の活性化機序は次の通りである。ＩｇＥ収容体に結合されているＩｇＥ抗体が抗原により、架橋（Ｂｒｉｄｇｅ）を形成すると、ホスホリパーゼＣ、蛋白質リン酸化酵素Ｃ、カルシウムイオンの作用を経て顆粒に貯蔵されていたヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸塩、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、蛋白質分解酵素等が遊離されることにより、前記の初期反応段階を媒介する。ヒスタミンを含む電気化学伝達物質等はアレルギー初期反応で現れる臨床的症状等を誘発する原因物質等であり、この内、ヒスタミンが最も多くの量を占める。つまり、アレルギー初期反応では、ヒスタミンの発現による作用が主を為し、その臨床的症状としては血管拡張、浮腫等がある。
【０００９】
現在前記アレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン剤やステロイド剤等が多く活用されている。しかしながら、このような薬物はその効果が一時的な場合が大部分であって、副作用が甚だしい場合も多い。従って、急増するアレルギー性疾患の予防及び治療効果を有しながら、副作用が少なく効果が持続的な新たな物質の開発が切実に要請される状況である。ただ、ＥＣ−ＳＯＤがアレルギー疾患の治療効果があるか、否かに対しては全く知られていない。
【００１０】
さらに、前記ＥＣ−ＳＯＤが多様な活性を有しているとしても、これの大量生産方法が開発されないと、産業において効率的に利用できない問題点がある。しかしながら、今まで開発された蛋白質の大量生産方法は、大腸菌等の宿主細胞を発現ベクターで形質転換してこれらの発現を誘導するものであるものの、蛋白質の大量生産は、しばしば内包体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成を招き、これにより蛋白質の元来の活性がなくなるか、又は減少する問題点があった。
【００１１】
本発明者等はＥＣ−ＳＯＤに対する研究を重ねて行く中で、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質が血管新生又はアレルギー疾患を治療又は予防し得る活性があることを発見し、前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を生産し得る方法を見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような目的を達成する為に、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。さらに、本発明は（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養してＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現する段階；（ｄ）発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明で発現ベクターとは、適当な宿主細胞より目的蛋白質又は目的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子製作物を言う。
本発明で用語、“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、一般的な機能を遂行できるように核酸発現調節配列と、目的とする蛋白質又はＲＮＡをコーデイングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。例えば、プロモータと蛋白質又はＲＮＡをコーデイングする核酸配列が作動可能に連結され、コーデイングする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野で広く知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＲＮＡ切断及び連結は当該技術分野で一般的に知られた酵素等を使用する。
【００１５】
本発明は、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、天然型又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を言う。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、マウス又は人間より由来したものであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したものであることを特徴とする。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号３及び配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号３を有することを特徴とする。一方、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号１アミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１６】
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の一実施例では、公知された方法でマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスを製造し（＜実施例１＞参照）前記マウスにＵＶＢを照射した後、組織の形態変化を野生型マウスと比較した。その結果、野生型マウスではＵＶＢ照射により血管新生が誘導されたものの、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスではＵＶＢ照射による血管新生が著しく抑制されていることを確認できた（＜実施例２ー１＞参照）。
【００１８】
さらに、本発明の他の実施例では前記ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおいて、紫外線照射による血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及びＭＭＰ−９の発現程度をウェスタンブロット（＜実施例２ー２＞）、免疫組織化学的方法（＜実施例２ー３＞）及びザイモグラフィー方法（＜実施例２ー４＞）を利用して調査した。その結果、紫外線照射により野生型マウスではＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現が増加されたものの、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスではＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現が著しく抑制されることを確認することができた。前記実験結果からＥＣ−ＳＯＤが血管新生を誘導するＶＥＧＦの発現を抑制して、血管新生を調節するＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を抑制することが分った。
【００１９】
さらに、本発明者等はさらに他の実施例でヘパリンドメインが除去された組換えＥＣ−ＳＯＤを大腸菌で発現させ、分離してリホールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）と精製過程を経た組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を生産（＜実施例１＞参照）して前記蛋白質が血管新生を抑制するか否かを確認（＜実施例３＞）した。その結果、紫外線照射によりＶＥＧＦの発現が誘導されるものの、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理した場合には、前記ＶＥＧＦの発現が抑制されることが確認できた。
【００２０】
従って、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生による疾患の予防及び治療に効果的に使用できる。前記血管新生による疾患には、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）発現及びＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−９の発現により誘発されることを全て含み、これに限定はされないものの、好ましくは癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビが挙げられる（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０２，１２６１−１２６２，１９９５；Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍ ３４（３）：４８６−４９７，１９９６；Ｃｉｒｃｕｌｔｉｏｎ ９３（４）：６３２−６８２，１９９６；Ｃｅｌｌ ８６：３５３−３６４，１９９６）。
【００２１】
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
上述した通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは天然型又は組換え蛋白質を言う。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくはマウス又は人間より由来したことであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したことを特徴とする。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号３及び配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号３を有することを特徴とする。一方、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は前記天然型ＥＣ−ＳＯＤから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは配列番号１アミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
上述した通り、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
【００２３】
本発明の一実施例では、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響を確認した結果、前記組換えＥＣ−ＳＯＤはＴ細胞でＴｈｌ側のサイトカインＩＦＮ−γの形成を誘導し、Ｔｈ２側のサイトカインであるＩＬ−４の形成を抑制することが分った。従って、組換えＥＣ−ＳＯＤはＴ細胞の分化に影響を及ぼすことが分り、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、Ｔｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防するにおいて有用に使用できることが分った（＜実施例４＞参照）。
【００２４】
さらに、本発明のさらに他の一実施例では、天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質である人間由来のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＴ細胞分化に及ぼす影響を確認した結果、前記ＥＣ−ＳＯＤもやはりアレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断してＴｈ１細胞への分化を誘導することが分った（＜実施例５＞参照）。
【００２５】
さらに、本発明のさらに他の一実施例では組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の転写因子活性を阻害する効果があるか、否かを確認した結果、組換えＥＣ−ＳＯＤはＮＦ−κＢの非正常的な活性を阻害し得ることが分かり（＜実施例６＞参照）、さらに、人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させる効果があることを確認し、肥満細胞の脱顆粒により肥満細胞内にあったヒスタミン等の媒介物質が現れ、アレルギー等の炎症反応が起こると言う事実を考慮するに、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはアレルギー疾患を予防又は治療に有用に使用できることが分った（＜実施例７＞参照）。
【００２６】
従って、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、アレルギー疾患の予防及び治療用組成物として有用に使用できる。前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー皮膚炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたものであることを特徴とする。
【００２７】
前記本発明の組成物に含まれるＥＣ−ＳＯＤ蛋白質にはこれらと実質的に同等な生理活性を有する蛋白質を含む。実質的に同等な生理活性を有する蛋白質には、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の機能的同等物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）及び機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が含まれる。
本発明で“機能的同等物”とは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を有するＥＣ−ＳＯＤと実質的に同等な生理活性を示すポリペプチドを言う。
【００２８】
前記にて“同等な生理活性”とは、血管新生又はアレルギーを抑制する活性を言う。前記機能的同等物は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するポリペプチドでもあり得る。前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換又は欠失の結果、配列番号３で表示されるペプチドと少なくとも７０％以上の、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％以上の配列相同性（つまり、同一性）を有するものにして、例えば、７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，５８％，９９％，１００％の配列相同性を有することを含み、配列番号３で表示されるペプチドと実質的に同質の生理活性を示すペプチドを言う。本明細書で配列相同性及び同質性は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列と、候補配列を整列してギャップ（ｇａｐｓ）を導入した後、配列番号３で表示されるアミノ酸配列に対する候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。必要な場合、最大百分率配列同質性を収得する為に、配列同質性の部分として保存的置換は考慮しない。配列番号３で表示されるアミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端又は内部伸長、欠損又は挿入は配列同質性又は相同性に影響を及ぼす配列として解析されない。さらに、前記配列同質性は２個のポリペプチドのアミノ酸配列の類似した部分を比較する為に使用される一般的な標準方法により決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムは、２個のポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適にマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）するように整列する（一つ又は二つの配列の全長配列に沿って又は一つ又は二つの配列の予測された部分に沿って）。前記プログラムはデフォルトオープニングペナルティー（ｄｅｆａｕｌｔ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティー（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を提供し、コンピュータプログラムと共に、連携されて使用され得るＰＡＭ２５０（標準スコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ ５，ｓｕｐｐ．３，１９７８）のようなスコアリングマトリックスを提供する。例えば、百分率同質性は次のように計算できる：一致する配列（ｉｎｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）の総数に１００を掛け、対応されるスパン（ｍａｃｈｔｅｄ ｓｐａｎ）内のより長い配列の長さと、二つの配列を整列する為に、より長い配列内に導入されたギャップ（ｇａｐｓ）の数の和で割る。本発明の機能的同等物の範囲には、本発明に伴うポリペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながら、ポリペプチドの一部化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させる為の構造変更がこれに含まれる。
【００２９】
さらに、本発明の組成物に使用されるポリヌクレオチド配列はＤＮＡ，ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を全て含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有する。本発明の組成物は前記ポリヌクレオチドを含むプラスミド又はウイルスべクターのような発現べクターを有効成分とする。前記本発明に伴う発現べクターはＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のｃＤＮＡ及びこれらの発現を調節できる発現調節配列を含めている。前記ポリヌクレオチドはて天然で分離されるか、又は当業界に公知された遺伝工学的方法により製造できる。
【００３０】
前記にて発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結された配列の発現に必須のＤＮＡ配列を意味する。前記発現調節配列には、転写を実施する為のプロモーター、前記転写を調節する為の任意のオペレータ配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列はプロモータ、オペレータ配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーがこれに含まれ得る。
【００３１】
前記発現べクターを挿入した後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）等の当業界に公知された方法により発現型で標的細胞内に導入させ得る。
【００３２】
プラスミド発現べクターを利用した遺伝子伝達方法は、哺乳動物細胞に直接的にプラスミドＤＮＡを伝達する方法として、ＦＤＡから承認を得た人間に使用し得る方法である（Ｎｏｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１ ２８８，１９９０）。プラスミドＤＮＡはウイルスべクターとは異なり均質に精製できる長所がある。本発明で使用し得るプラスミド発現べクターは、当業界に公知された哺乳動物発現プラスミドを使用し得る。例えば、これに限定はされないものの、ｐＲＫ５（ヨーロッパ特許第３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（国際特許公開第９１／０８２ ９１号）及びｐＶＬ１３９２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）等が代表的である。前記核酸を 含むプラスミド発現べクター（ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）は当業界に公知された方法、例えば、これに限定はされないものの、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質感染（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介された形質感染（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介された形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）及び細胞内にＤＮＡを流入させる為の他の公知の方法により標的細胞内に導入できる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２６７：９６３−９６７，１９９２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２６３；１４６２１−１４６２４，１９８８）。
【００３３】
さらに、前記ポリヌクレオチドを含むウイルス発現べクターでは、これに限定はされないものの、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、アビポックス ウイルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）及びレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）等が含まれる。前記レトロウイルスべクターはウイルス遺伝子が全て除去されたか、若しくは変更され非ウイルス蛋白質がウイルスべクターにより、感染された細胞内で作れるように作製されたものである。遺伝子療法の為のレトロウイルスべクターの主要長所は多量の遺伝子を複製細胞内に伝達し、細胞ＤＮＡウイルスに伝達された遺伝子を正確に統合し、遺伝子形質感染後連続的な感染が誘発されないことである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０，１９９２）。ＦＤＡで認証されたレトロウイルスべクターはＰＡ３１７アンフォトロフイックレトロウイルスパッケージ細胞を利用して製造したものである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ，Ｃ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：２８９５−２９０２，１９８６）。非レトロウイルスべクターには、前記にて言及した通り、アデノウイルスがある（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５，１９９２；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７２−３７８，１９９２；Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６４８２−６４８６，１９９２）。アデノウイルスの主要長所は多量のＤＮＡ断片（３６ｋｂゲノム）を運搬し、極めて高い力価で非複製細胞を感染させる能力があることである。さらに、ヘルペスウイルスも人間遺伝子療法の為有用に使用できる（Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７９−３８４，１９９２）。レンチウイルスはレトロウイルスの一種にして１９９０年代後半から開発され始めた新たなレトロウイルス輸送体としてＨＩＶ骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を変形したものである。既存のレトロウイルス輸送体等とは違って細胞分裂周期に影響されずに、分裂が活発な細胞ばかりでなく、分裂が活発でない細胞でも遺伝子発現効率が比較的良い。従って、造血幹細胞等のように分裂が遅い細胞でも他のウイルス性水素体より発現効率が良いことから、最近造血幹細胞角質細胞を利用した細胞治療分野で遺伝子伝達用輸送体として研究が活発に進行されている。この他にも公知された適切なウィルスベクターが本発明に使用できる。
【００３４】
前記本発明の組成物には、薬学的に許容される担体を追加して含め得る。前記にて“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容されて、人間に投与される時、通常的に胃腸障害、眩気症等のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない組成物を言う。
【００３５】
薬学的に許容される担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体を追加して含め得る。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸等を含め得る。さらに、非経口投与用担体は水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができ、安定化剤及び保存剤を追加して含め得る。適切な安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコロビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピールパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、次の文献に記載されていることを参考にする（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ． ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。本発明に伴う蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、上述したような薬学的に許容される担体と混合して公知の方法により、多様な非経口又は経口投与用形態で製造され得る。非経口投与用剤形には、等張性水溶液又は懸濁液形態のような注射用剤形及び軟膏剤形態の剤形が好ましい。注射用剤形は適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界に公知された技術により製造できる。例えば、各成分を食塩水又は緩衝液に溶解させ、注射用として剤形化できる。さらに、経口投与用剤形には、これに限定はされないものの、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセル等があり、これらの剤形は有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリーシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含め得る。製剤はさらに、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含むことができ、場合によっては、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩のような崩解剤又は沸騰混合剤及び／又は吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含め得る。前記剤形は通常的な混合、顆粒化又はコーテイング方法により製造できる。
【００３６】
本発明に伴う組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、生命工学的技法を利用するか、又は既存の製造法を利用して口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸が含まれる。
【００３７】
好ましくは、本発明に伴う組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、境膜内、病巣内及び頭蓋骨内注射又は注入のような方法で非経口的に投与できる。例えば、注射用として剤形化された本発明に伴う組成物を、４〜６ｍｍの細い針で皮膚の下層に一定量を注入、又は３０ゲージ（ｇａｇｅ）注射用針で皮膚を軽く短刺（ｐｒｉｃｋ）する方法であるメッソーテラピー（Ｍｅｓｓｏ ｔｈｅｒａｐｙ）法により投与できる。さらに、皮膚に適用する場合、軟膏剤のような形態で剤形化して経皮投与できる。前記にて“経皮投与”とは、組成物を局所的に皮膚に投与して組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。特に、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする組成物の場合には、皮膚に直接塗布する経皮投与方法により、投与するのが好ましい。さらには、本発明の組成物は蛋白質伝達方法と関連した生命工学的技法を利用して投与できる。
【００３８】
前記本発明に伴う組成物は、予防又は治療効果を示す量で患者に投与し得る。一般的な１日投与量としては体重１ｋｇに対し約０．０００１乃至１００ｍｇの範囲で投与できる。好ましくは、体重１ｋｇに対し約０．０１乃至１ｍｇの範囲で投与できる。本発明の組成物は好ましい投与量範囲内で１回又は複数回に分割投与できる。しかしながら、本発明に伴う組成物の投与量は投与経路、投与対象、年令、性別、体重、個人差及び疾病状態により適切に選択できる。
【００３９】
さらに、本発明は（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現する段階；（ｄ）前記発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディングを誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供する。
【００４０】
前記（ａ）段階におけるＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることは、当業界に公知された通常の組換えＤＮＡ技法を利用して行うことができ、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングできるポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。前記ポリヌクレオチドは適切なプライマーを使用してＰＣＲ増幅することにより作製できる。他の方法として当業界に公知された標準方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で販売するもの）を使用してＤＮＡ配列を合成することもできる。発現ベクターは当業界で使用する通常の発現ベクターを使用することができ、その宿主細胞によって適切なものを選択して使用することができ、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ，米国）を使用することができる。本発明の製造方法はＥＣ−ＳＯＤを大量発現して生産しようとすることから、この目的を達する限りにおいて任意の発現ベクターを適切に選択して使用できる。
【００４１】
本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター等を含むもののこれに限定はされない。適切な発現ベクターはプロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサ（促進遺伝子）のような発現調節配列の他にも、膜標的化又は分泌の為のシグナル配列又はリーダ配列を含み、目的により多様に製造できる。ベクターのプロモータは構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）又は誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）でもあり得る。さらに、発現ベクターはベクターを含有する宿主細胞を選択する為の選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合複製起源を含む。
【００４２】
前記（ｂ）段階の発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換することは、核酸を宿主細胞に導入する如何なる方法も含まれ、当業者に公知された形質転換技術により行われ得る。微細射出法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰ０４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、ＰＥＧ−媒介融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）等が含まれるもののこれに限定はされない。
【００４３】
上記場合において、宿主細胞は原核細胞又は眞核細胞を使用できるものの、好ましくは、宿主細胞としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスターフィロコキュス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のような原核宿主細胞、眞菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、酵母（例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、サカロマイセスセルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ニュロスポラクラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のような下等眞核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物等を含む高等眞核生物由来の細胞を宿主細胞として使用できるものの、これに限定はされない。さらに、好ましくは、本発明の宿主細胞は大腸菌を使用できる。前記（ｃ）段階の宿主細胞の培養及び発現は、形質転換された宿主細胞内でＥＣ−ＳＯＤ蛋白質が発現されるように、適切な培地及び条件下で培養することを含む。前記形質転換された細胞を培養して蛋白質を発現させる方法は、当業界に公知されており、例えば、形質転換された細胞が成長できる適切な培地に接種して種培養した後、これを本培養用培地に接種して適切な条件で培養することにより、蛋白質の発現を誘導することができる。
【００４４】
前記（ｄ）段階の内包体の収得は不溶性の内包体を分離して収得する為の、公知の方法を使用することができ、例えば、遠心分離により細胞沈澱物内で内包体を収得することができる。
【００４５】
前記（ｅ）段階の内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、当業界に公知された通常の方法、例えば、蛋白質変成剤を含む緩衝溶液で内包体を溶解させ、金属親和性樹脂コラムに吸着させ、変成剤の濃度を下げながらリホールディングを誘導する方法により行われる。
【００４６】
例えば、前記内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、変成剤である８Ｍウレア（ｕｒｅａ）を添加したＴｒｉｓ緩衝溶液（８Ｍ ｕｒｅａ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に内包体を溶解し、金属親和性樹脂が充填されたコラムに吸着させ、１Ｍウレアを添加したＴｒｉｓ緩衝溶液でコラムに濃度勾配を与えながら、ウレアを除々に除去してリホールディングを誘導する方法により行える。引き続き、前記コラムとの吸着性が強い溶出緩衝溶液や、ｐＨが低い（一般的に４以下）溶出緩衝溶液を前記コラムの上部から流入させることにより、これをコラム下部から収得してリホールディングされた純粋な蛋白質を得ることができる。例えば、これは金属親和性クロマトグラフィーコラムとの吸着性が強い、イミダゾル（一般的に１Ｍ）が含有された溶出緩衝溶液を前記コラムの上部から流入させることにより、これをコラム下部から収得してリホールディングされた純粋な蛋白質を得ることができる。さらに、前記溶出緩衝溶液は時間により漸次的に濃い濃度の溶液が投入されるように、つまり、濃度勾配を有するようにコラムに投入することが、リホールディングされた蛋白質の収得率を高めることができて好ましい。
【００４７】
本発明のＥＣ−ＳＯＤの製造方法は（ｆ）ゲル濾過コラム（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）により、分離、精製する段階を追加して含めることができ、以降追加精製、濃縮、溶媒交換等の目的により、当業界に公知された多様な分離及び精 製方法を介して行うことができ、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈澱及びリン酸ナトリウム沈澱）、溶媒沈澱（アセトン、エタノール等を利用した蛋白質分画沈澱）、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相コラムクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー等の技法を、単独又は組合わせで適用させＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を製造できる。
【００４８】
本発明で使用される標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野に広く公知されており、下記の文献に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；ｂｙ Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８４）；ａｎｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７））。
【００４９】
上述した通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、必要とする個体に有効な量で投与して血管新生による疾患又はアレルギー疾患の予防又は治療方法に有用に使用することができ、従って、血管新 生による疾患又はアレルギー疾患の治療剤製造の為にも有用に使用できる。
【発明の効果】
【００５０】
前記の通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生を誘導するＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現を抑制して、血管新生を抑制する効果が優れているので、血管新生による疾患の予防及び治療に有用に使用することができ、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断して、転写因子（ＮＦ−κ８）活性を阻害し、人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させることにより、アレルギー疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。さらに、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法は、前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤを大量に生産することができて、産業的に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィーの結果を示したグラフである（Ａ：線平衡区間、Ｂ：試料投入区間、Ｃ：コラム洗滌区間、Ｄ：リホールディング区間、Ｅ：リホールディング平衡区間、Ｆ：溶出区間、Ｇ：コラム洗浄区間、Ｘ軸：時間及び体積（時：分：秒、ｍＬ），Ｙ軸：ＵＶ吸光度（Ｕｎｉｔ））。
【図２】図２は本発明に伴うリホールディング及び精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したクマシーブルー蛋白質染色写真である（Ｍ：分子量サイズマーカー、Ａ：８Ｍウレア緩衝溶液で溶解された内包体（リホールディング精製前の試料）、Ｂ：コラムに吸着されずに溶出された内包体不純物、Ｃ：リホールディング精製後溶出されたＥＣ−ＳＯＤ、Ｄ：脱塩精製後限外濾過法により濃縮されたＥＣ−ＳＯＤ）。
【図３】図３は抗ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質抗体を利用して、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をウェスタンブロットで確認した結果である（ＳＭ：ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ，１：対照群（ＨａＣａＴ人間ＥＣ−ＳＯＤ）、２：本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質）。
【図４】図４は精製過程中ＥＣ−ＳＯＤ活性を確認した結果である（２０９ ＦＴ：精製工程中吸着されずに溶出された試料、２０９Ｅ１：金属親和性クロマトグラフィーコラムでリホールディングされた１次精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質、２０９ Ｅ２：ゲル濾過コラムで分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質）。
【図５】図５は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＨａＣａＴ細胞において、ＵＶＢの誘発されたＲＯＳの阻害効果を確認した結果である（ＵＶＢ：ＵＶＢのみ照射した場合、ＥＣ−ＳＯＤ＋ＵＶＢ：ＵＶＢを照射してＥＣ−ＳＯＤを処理した場合）。
【図６】図６は紫外線照射によるマウスの背皮膚組織の形態相変化を示した写真である（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、Ｃ：野生型マウスにＵＶＢを照射、Ｄ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢを照射）。
【図７】図７は紫外線照射によるマウス濃度組織において、ＶＥＧＦの発現様相をウェスタンブロットで分析した結果を示したものである。Ａｃｔｉｎはローディング対照群として使用した（ＷＴ：野生型マウス、ＴＧ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス）。
【図８】図８はマウスにＵＶＢを照射した後、ＶＥＧＦの発現様相を免疫組織化学的方法で分析した結果を示したものである（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、Ｃ：野生型マウスにＵＶＢを照射、Ｄ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢを照射）。
【図９】図９はマウスにＵＶＢを照射し、ＭＭＰ−９の発現様相をザイモグラフィーで分析した結果である（レーン１：野生型マウス、レーン２：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、レーン３：野生型マウスにＵＶＢ照射、レーン４：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢ照射）
【図１０】図１０は皮膚角質形成細胞株に紫外線を照射して、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ処理に伴うＶＥＧＦの発現様相を免疫組織化学的方法で照射した結果である（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＵＶＢ照射、Ｃ：組換えＥＣ−ＳＯＤ処理＋ＵＶＢ照射、Ｄ：組換えＥＣ−ＳＯＤ処理）。
【図１１】図１１は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理した場合、Ｔ−細胞増殖に及ぼす影響を確認した結果である（Ｎｅｇ：何等の処理も施さない試験群）。
【図１２】図１２は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質処理時、Ｔ−細胞の分化に及ぼす影響をＩＬ−４分泌量で確認した結果である（ｎｅｇ：抗原が処理されていない試験群、−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理された試験群、ｐ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＰＢＳに含まれているＥＣ−ＳＯＤを共に処理した試験群、ＮＢ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＳｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅに含まれているＥＣ−ＳＯＤを共に処理した試験群）。
【図１３】図１３は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質処理時、Ｔ−細胞の分化に及ぼす影響をサイトカインＩＬ−４とＩＮＦ−ｇの分泌量で確認した結果である（ｎｅｇ：抗原が処理されていない試験群。−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理した試験群）。
【図１４】図１４は人間のＥＣ−ＳＯＤ遺伝子を過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質と免疫補助剤ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅａｔ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与した場合、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖とサイトカイン生成にどんな影響を与えるかを観察した結果である。
【図１５】図１５は人間のＥＣ−ＳＯＤ遺伝子を過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質と免疫補助剤Ａｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を投与した場合、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖と、サイトカイン生成にどんな影響を与えるかを観察した結果である。
【図１６】図１６は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＮＦ−κＢの活性化抑制を確認した結果である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＥＣ−ＳＯＤが形質感染されたＨａＣａＴ細胞にＵＶ処理をしない群、ＵＶＢ：ＨａＣａＴ細胞にＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群、ＥＣ−ＳＯＤ／ＵＶＢ：ＨａＣａＴ細胞に組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理してＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）。
【図１７】図１７は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の肥満細胞脱顆粒抑制効果を確認した結果、（Ａ）及びこれの顕微鏡写真（Ｂ）である（Ｃ０ｎ：何等の処理も施さない人間肥満細胞群、ＥＣ−ＳＯＤ：ＥＣ−ＳＯＤを処理した群、Ａ＋Ｐ：細胞内のカルシウム濃度が高い群、Ａ＋Ｐ＋ＥＣ−ＳＯＤ：ＥＣ−ＳＯＤを前処理して細胞内のカルシウム濃度が高い群）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、実施例には本発明を単に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５３】
＜実験例１＞
ＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスの製造
先ず、マウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスを下記のような方法で製造した。一方、前記マウスより由来したＥＣ−ＳＯＤ塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号５に記載した。
野生型ＢＤＦ１マウスは８乃至１０週齢ＢＤＦ１マウス（中央実験動物）を使用した。ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスは８乃至１０週齢ＢＤＦ１マウスを使用し、公知された方法により製造した（Ｈ．Ｙ．Ｈａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４８：４５０−４５８，２００６）。動物使用の為の実験方法はカトリック医科学研究所生命倫理委員会により承認を受けて使用した。
【００５４】
具体的には、韓国生命工学研究所で交雑種マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Χ ＣＢＡのＦ１）を購入し、過剰排卵を誘発するためにＰＭＳＧ（ｐｒｅｇｎａｎｔ ｍａｒｅ′ｓ ｓｅｒｕｍ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）と、ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を４８時間間隔で、それぞれ５ＩＵずつ雌の二十日鼠の腹腔内に注射し、同一系統の雄の二十日鼠と１：１で交尾させた。翌日の朝腟栓を確認し、腟栓がある個体のみ屠殺して卵管を切取した後、卵管膨大部から受精卵を回収した。培養液は０．４％ＢＳＡが添加されたＭ１６培養液を使用した。
【００５５】
皮膚組織に選別的なＥＣ−ＳＯＤ過発現が誘導されたマウスを作る為に、マウスＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡ（配列番号６）を含むｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯベクター（翰林大学校医科大学、徐俊教教授より提供）において制限酵素でマウスＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡ部分を切断して、人間ゼラチンＫ１４プロモータを含んでいるｐＢＳ ＫＳベクターに挿入した。さらに、このベクターに鶏のオブアルブミンポリ（Ａ）（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｐｏｌｙ（Ａ））を挿入して試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での発現を容易にした。受精卵にＤＮＡを注入する為に、発現ベクターを制限酵素ＨｉｎｄとＸｈｏｌで切断して使用した。制限酵素で切断したＤＮＡは１％アガロスゲルに電気泳動した後、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して回収した後、フェノールクロロホルムで分離して生成した。これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）濃度で透析して最終濃度が４ｎｇ／ｌになるようにした。外来遺伝子を含むＤＮＡ溶液を１細胞期受精卵の全核に注入した。外来遺伝子が注入された受精卵等を２細胞期まで培養した後、健康な状態の受精卵のみを選別した。発情した雌ＩＣＲを雄と交尾させた後、翌日腟栓を確認して確認されたものを代理母として使用した。２細胞期までよく育った受精卵を１５−２０個程を採り代理母の卵管膨大部に微細管を利用して移植した後、筋肉層と表皮を縫合した。移植後生まれた産子を３週程度育て、これらの尻尾を１ｃｍ程切断した後、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）に入れ、５５℃で処理した後、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）添加してゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。前記ゲノムＤＮＡを下記のＰＣＲプライマーセットを利用してＰＣＲ増幅することにより、形質転換可否を確認した。ＰＣＲ条件は９４℃で１回、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２．５℃で４５秒間３０回繰返した後、７２．５℃で５分間１回実施した。
センスプライマー（配列番号７）
５′−ＴＴＧ ＴＣＴ ＣＴＡ ＡＴＡ ＧＡＧ ＧＧＴ Ｃ−３′
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５′−ＴＣＡ ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ Ｔ−３′
【００５６】
一方、人間より由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスは、米国コロラドＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから寄贈を受けた（Ｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２６８（２１）：１５３９４，１９９３）。
【００５７】
＜実施例１＞
生物学的活性を有する組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造
＜１−１＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質発現の為の融合ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のクローニング
生物学的活性を有する組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を製造する為に、人間由来のＥＣ−ＳＯＤのＮ−末端部位にある信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を除去して、Ｃ−末端部位の１３個アミノ酸が除去された２０９個のアミノ酸からなる、組換えＥＣ−ＳＯＤを次のような方法でクローニングした（前記組換えＥＣ−ＳＯＤ塩基配 列と、アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号１に記載し、前記人間由来のＥＣ−ＳＯＤ塩基配列と、アミノ酸配列はそれぞれ配列番号４及び配列番号３に記載した）。
【００５８】
人間由来のＥＣ−ＳＯＤ ｃＤＮＡ（配列番号４）を含むｐＵＣ １８−ｈＥＣ−ＳＯＤ（スウエーデン、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｋｌｕｎｄ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒより提供）べクターを鋳型として下記プライマーを利用してＰＣＲ増幅することにより、人間ＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡを製造した。
センスプライマー（配列番号９）
５′−ｔａｇａｔｔｃｔｇｇａｃｇｇｇｃｇａｇｇａ−３′
アンチセンスプライマー（配列番号１０）
５′−ｔａｃｔｃｇａｇｔｃａｃｔｃｔｇａｇｔｇｃｔ−３′
【００５９】
ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（３０回）、７２℃で５分の条件でＰｆｕｌ重合酵素を利用して行った。増幅された遺伝子産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後、同一な制限酵素で切断されたｐＥＴ２８ａべクター（ＮｏｖａＧｅｎｅ，米国）に４℃で１２時間Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを利用して接合した。前記べクターを大腸菌ＤＨ５ａに形質感染させ、前記形質転換体をカナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ固体培地で培養して選別した。選別された形質転換体に組換えＥＣ−ＳＯＤ遺伝子が正しく挿入されたか、否かを遺伝子配列分析を実施して確認した。組換えＥＣ−ＳＯＤ遺伝子が挿入されたことが確認された形質転換体でべクターを分離して、過発現用大腸菌宿主細胞である大腸菌ＢＬ２１（ＮｏｖａＧｅｎｅ，米国）に挿入してカナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ固体培地で培養しながら過発現菌株を選別した。
【００６０】
＜１−２＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の発現
前記＜実施例１−１＞で選別された菌株を３７℃，カナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地で培養した。これをＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）６００ｎｍで０．６に達した時、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して蛋白質発現を誘導し、３７℃で６時間本培養をして組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現させた。
【００６１】
＜１−３＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のリホールディング誘導及び精製
発現が終了された培養液で遠心分離により、細胞を収得した後、１００ｍＭ塩化カルシウムが含有された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で懸濁し、超音波粉砕機で細胞を破壊した。これを遠心分離して沈殿層のみを分離し、前記１００ｍＭ塩化カルシウムが含有された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液で３回繰返して洗浄した。洗浄された細胞沈殿物には、不溶性蛋白質内包体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を含有している。洗浄された内包体（融合蛋白質含量５０％）１０ｍｇをＴｒｉｓ緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に入れ、８Ｍウレアを添加して溶解した。室温で２時間完全に懸濁して、遠心分離により相分離し、上層の水溶液層は溶解された不溶性組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質内包体を含有していることからこれを収得した（内包体溶液）。
【００６２】
組換えＥＣ−ＳＯＤリホールディングと精製の為に、高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィー機器（ＦＰＬＣ，Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して下記の通り行った：前記緩衝溶液（８Ｍ ｕｒｅａ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を流速１ｍｌ／ｍｉｎで金属親和性樹脂が満たされた平衡状態のクロマトグラフィーコラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ ５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）に流入させて平衡させ、前記にて収得した内包体溶液５ｍｌを金属親和性樹脂が満たされた平衡状態のクロマトグラフィーコラム（３ｍｌ）の上部方向に１ｍＬ／ｍｉｎで注入して、前記コラム内の固体支持体に前記折り畳み不全（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）蛋白質を吸着させた。
【００６３】
注入終了後、吸着されない固形物質等を除去する為に、前記緩衝溶液５０ｍｌをコラム上部方向に１ｍＬ／ｍｉｎで注入した。このようにコラム内で細胞の滓を完全に除去した後、ＥＣ−ＳＯＤ活性に影響及ぼすＺｎとＣｕを含み、１Ｍウレアが含有されたトリス緩衝溶液（８Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝溶液、１Ｍ ｕｒｅａ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ ＺｎＣｌ２ ，５０ｍＭ ＣｕＳＯ４ 、ｐＨ７．５）をコラム上部方向に０．５ｍＬ／ｍｉｎで線形的濃度勾配を与えながら注入し、コラム内の変性剤濃度を漸次減らすことにより、固体マトリックスに吸着された折り畳み不全（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）蛋白質を天然状態の３次元的構造を有して金属イオン（ＺｎとＣｕ）が完全に目的蛋白質に置換させて活性を有するようにリホールディングさせた。
その後、２Ｍイミダゾールと１Ｍウレアが含有されたトリス緩衝溶液を濃度勾配を与えてコラムの上部から下部方向に供給した。リホールディング融合蛋白質は０．５Ｍイミダゾール濃度の溶出緩衝液が供給された時、溶出された（図１参照）。
【００６４】
＜１−４＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質分離精製
前記＜実施例１−３＞から溶出された蛋白質より多量のイミダゾールを除去して、完全にリホールディングさせ、複合体を大きさ別に分離する為に、高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィー機器と、ゲル濾過クロマトグラフィー（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）コラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １２ ｃｏｌｕｍｎ）を利用した。この工程ではトリス緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ １００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）又はリン酸緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｐＨ７．５）をコラム上部方向に０．５ｍＬ／ｍｉｎで流入させ、分離及び精製した。分離された目的蛋白質は限外濾過法で濃縮した。
その結果、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を得ることができ、それぞれの精製段階における試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、図２に示した通り、組換えＥＣ−ＳＯＤが良く分離されたことが分かった。
【００６５】
＜１−５＞ウェスタンブロットを介した組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の確認
前記＜実施例１−４＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤが確かであるか、否かを確認する為に、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を実施した。ＥＣ−ＳＯＤ標準蛋白質には、人間の皮膚角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）細胞株であるＨａＣａＴ（ドイツＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎ．Ｆｕｓｅｎｉｇ教授より提供）から発現された人間ＥＣ−ＳＯＤを使用した。ＨａＣａＴから発現された人間ＥＣ−ＳＯＤと、前記＜実施例１−４＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質等を１０％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動で分離し、ポリビニリデンフルオライトメンブレーン（Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩ，米国）に移した。その後、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを５％の脱脂粉乳でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、抗ＥＣ−ＳＯＤポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、ＵＳＡ）と共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている２次抗体ＩｇＧ（サンタクルズ、米国）を使って培養し、再度水洗した後、ＥＣＬ検出キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を利用して製造社の指針に従い発色した。
その結果、図３に示した通り、ＨａＣａＴから発現された人間ＥＣ−ＳＯＤ（レーン１）で陽性を示し、分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（レーン２）でも検出され、精製された蛋白質が人間ＥＣ−ＳＯＤであることが分かった。
【００６６】
＜１−６＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の活性検査
前記分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質がＳＯＤの生物学的活性を有するか否かを確認する為に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を利用して製造社の指針に従い活性テストをした。
その結果、図４に示した通り、精製工程中に吸着されずに溶出された試料（２０９ＦＴ）は、活性を示さず金属親和性クロマトグラフィーコラムでリホールディングされた、１次精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（２０９Ｅ１）の活性は、２５０ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、ゲル濾過コラムを利用して分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（２０９Ｅ２）の活性は３６０ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎを呈した。
【００６７】
＜１−７＞分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＲＯＳ除去効果確認
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＨａＣａＴ ｃｅｌｌにおけるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）除去効果を見る為に、前記＜実施例１−４＞にて分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を以下の通り処理した。
皮膚角質形成細胞（ＨａＣａＴ）を１８ｍｍカバースリップに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分株した後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンと、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを１％添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）培地を使用して、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。付着された細胞が約３０〜４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、牛胎児血清を取除いて２４時間培養した。細胞が５０〜６０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、前記ＥＣ−ＳＯＤ１０μｇで細胞を３０分間前処理した。ＵＶＢ（１００Ｊ／ｍ２）で３時間照射した後、１０ＭｍＤＣＦＨ−ＤＡと３７℃で３０分間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。写真はＺｅｉｓｓデジタルカメラを利用して撮影した。
その結果、図５に示した通り、ＵＶＢのみ照射した場合（ＵＶＢ）ＲＯＳが除去されなかったものの、ＵＶＢを照射して本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤを処理した場合（ＥＣＳＯＤ＋ＵＶＢ）、ＲＯＳが効果的に除去されたことが分った。
【００６８】
＜実施例２＞
天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生抑制効果
＜２−１＞ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと野生型マウスの形態学的比較
前記＜実験例１＞にて製造されたマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスと、野生型ＢＤＦ１マウスの背側皮膚に２ｋＪ／ｍ２で２４時間間隔でＵＶＢを４回照射した。つまり、前記マウス等の背側皮膚をＵＶＢ照射２日前に除毛し、２８０ｎｍ〜３４０ｎｍ波長範囲で３０５ｎｍの最大エネルギーを有する６個のＵＶＢランプ（ＦＳ２４Ｔ１２／ＵＶＢ／ＨＯ，２９０−３２０ｎｍ，Ｖｏｌｔａｒｅ社、Ｆａｉｒｆｅｉｌｄ，ＣＴ，米国）を使用して、８週齢のマウス２４匹に２００ｍＪ／ｃｍ２で一定に照射した。ＵＶＢ照射する間ランプの高さは、麻酔されたマウスの背側皮膚表面に０．３ｍＷ／ｃｍ２で照射されるように調節した。各群のマウス（各群（ｎ−６））等に２４時間間隔で４回ＵＶＢを照射し、実験の為、４回目照射１時間後にマウスを犠牲にした。犠牲にしたマウスの背側皮膚患部を切開して肉眼で観察した結果を図６に示した。
前記図６に示した通り、野生型マウスに紫外線ＵＶＢを照射ＤＱ場合（図６Ｃ）には、紫外線を照射しなかった場合（図６Ａ）と比較して新生血管形成、皮膚炎症反応と紅斑が著しく誘導された。しかしながら、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスでは、紫外線照射前（図６Ｂ）と、照射後（図６Ｄ）に統計学的に意味のある差が無かった。つまり、紫外線ＵＶＢ照射により、誘導された野生型マウスにおいて（図６Ｂ）の新生血管形成がＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス（図６Ｄ）において著しく抑制されることが分った。前記結果からＥＣ−ＳＯＤは新生血管形成を抑制する機能があることを推定することができた。
【００６９】
＜２−２＞ウェスタンブロット
前記＜実験例１＞で製造されたマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスにおいて、血管新生過程を誘導する血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の発現程度をウェスタンブロットを利用して調査した。
前記実施例＜２−１＞で犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織又は細胞を抽出溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ１ ｐＨ８．０，５ｍＭのＥＤＴＡ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．５％のｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅナトリウム、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，０．１％のＳＤＳ，１ｍＭのＰＭＳＦ，１ｍＭのＮａＦ，１ｍＭのＮａＶＯ４さらに、プロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）で均質に抽出した。蛋白質濃度を決定する為に、バイオラド蛋白質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用した。前記蛋白質抽出物等を１０％のポリアクリルアミドゲルの上で分離し、ポリビニリデンフルオリドメンブレン（Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩ，米国）に移し、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを５％の脱脂粉乳でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、米国）と、抗ベータアクチン抗体それぞれと共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている２次抗体ＩｇＧ（サンタクルズ、米国）と培養し再び水洗した後、ＥＣＬ検出キットを利用して発色した。
実験の結果、ＵＶＢ照射により野生型マウスにおいてＶＥＧＦの発現量が増加したものの、ＵＶＢ照射されたＥＣ−ＳＯＤ過発現されたマウスでは、ＶＥＧＦの発現が著しく減少された（図７）。前記の結果からＥＣ−ＳＯＤが血管新生抑制効果があることが再び確認できた。
【００７０】
＜２−３＞免疫組織化学的調査（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｍｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）
ＥＣ−ＳＯＤがＶＥＧＦの発現を抑制するか、否かを免疫組織化学的方法により再び確認した。
前記実施例＜２−１＞において、犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織を０．５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で作った４％のパラホルムアルデヒドで固定させた。流水で水洗後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋させ、５ｍｍの厚さで切片してガラススライドに付着した。前記切片をキシレン溶液を使用して脱パラフィンし、エタノールで含水した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。脱パラフィンされた組織切片に３％の過酸化水素を処理してブロッキングした。非特異的結合と背景染色を減らす為に、前記切片を１０％羊の血清で処理した。各組織スライドを抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、米国）で処理し、ストレプタビジン−バイオチンキット（ＬＳＡＢ，Ｄａｋｏ，ＣＡ，米国）を利用してアビジンーバイオチンーイムノパーオキシダーゼコンプレックス法で視覚化した。染色された組織を水洗した後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）で発色し、０．２％のメイアーヘマトキシリン（シグマ、ＭＯ，米国）で対照染色を行いその結果を図８に示した。
前記図８に示した通り、野生型マウスにおいて、ＵＶＢ照射によりＶＥＧＦが多く発現されたものの、ＥＣ−ＳＯＤが過発現されたマウスでは野生型マウスに比べてＶＥＧＦの発現が著しく抑制され、前記実施例＜１−２＞の結果と一致する結果を得た。前記結果等から、生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）で天然型ＥＣ−ＳＯＤが血管新生を誘導するＶＥＧＦ発現を抑制して血管新生を抑制する効果があることが分った。
【００７１】
＜２−４＞ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおけるＭＭＰ−９の発現水準調査
細胞外の基質蛋白質を分解するＭＭＰ蛋白質は、ＶＥＧＦと共に、血管新生の重要調節因子である。特に、ＭＭＰ９はＶＥＧＦーＶＥＧＦＲシステムを介して腫瘍の血管新生過程を調節する因子として知られている（Ｂｅｒｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２：７３７−７４４，２０００）。従って、本発明者等はＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおいて、ＵＶＢ照射によるＭＭＰ−９発現水準を調査した。
前記実施例＜２−１＞で犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織に１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｌａｔｉｎ（１００ｍｇ／ｍｌ）を混合してＳＯＤーＰＡＧＥを行った後、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００で２０分間処理して水洗する。Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ反応溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＣａＣｌ２，５Ｍ ＮａＣｌ，０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２，２５％ＴＸ−１００，０．２％ ＮａＮ３）で３７℃にて１６時間反応させ、１時間染色した後、１時間脱色する。オーブンで１時間乾燥させ分析した結果を図９に示した。
前記図９に示した通り、紫外線照射する前の野生型マウスとＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスのＭＭＰ−９の発現水準は別段の差がなかった。しかしながら、ＵＶＢ照射により、野生型マウスはＭＭＰ−９の発現が増加するものの、ＥＣ−ＳＯＤマウスの場合には、ＭＭＰ−９の発現が野生型マウスに比べて著しく抑制される。
前記結果から、生体内で天然型ＥＣ−ＳＯＤがＶＥＧＦの発現を抑制するばかりでなく、ＶＥＧＦーＶＥＧＦＲシステムを介した血管新生関連信号伝達に関与するＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を効果的に抑制することが分った。
【００７２】
＜実施例３＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生抑制効果
前記＜実施例１＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を利用して、血管新生を抑制する効果があるか、否かを調査した。皮膚角質形成細胞（ＨａＣａＴ）を１８ｍｍカバースリップに１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分株する。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）と、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を１％添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）培地を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。付着された細胞が３０〜４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、牛胎児血清を取除いた後、２４時間培養した。細胞が５０〜６０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、ＥＣ−ＳＯＤ１０μｇで前処理する。３０分間、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質で処理した後、紫外線１００Ｊで処理し、２４時間後皮膚角質形成細胞株をパラホルムアルデヒドで固定して、免疫染色を実施した。固定された細胞を１０％正常羊血清（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回水洗した。ここにＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に対する免疫染色の為、兎抗ＶＥＧＦ抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓａｎｔａｃｕｚ，米国）でそれぞれ処理した後、４℃で１６時間以上反応させた。ＦＩＴＣが融合された抗二十日鼠ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｚｙｍｅｄ，米国）を利用して蛍光染色した後、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で観察した。
その結果、図１０に示した通り、ＵＶＢを照射しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてＵＶＢを照射した場合（ＵＶＢ）ＶＥＧＦの発現が著しく増加された。さらに、ＵＶＢ照射した群に前記組換え蛋白質を処理した場合（ＥＣ−ＳＯＤ／ＵＶＢ）には、ＶＥＧＦの発現が著しく抑制されることを確認し、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質により、血管新生が抑制されることが分った。
【００７３】
＜実施例４＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響
＜４−１＞組換えＥＣ−ＳＯＤのＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響の確認
ＥＣ−ＳＯＤが免疫細胞であるＴ細胞に影響を及ぼすか、否かを調べるために、特異抗原（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）に反応するＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）形質転換マウス（ＤＯ．１１．１０．浦項工大成永哲教授より提供）を使用して下記の通り調査した。
ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の増殖に影響を与えるか否かを確認する為、前記形質転換したマウス脾臓より分離した細胞を、抗原であるオブアルブミンペプチド（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）と共に、７２時間培養し、最後の１６時間３Ｈと培養した後、放射線量を測定してＴ細胞の増殖を確認した。
その結果、図１１に示した通り、ＥＣ−ＳＯＤを添加しない群と、ＥＣ−ＳＯＤをそれぞれ１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ添加した群で放射線量の差が殆どなく、ＥＣ−ＳＯＤが殆どＴ細胞増殖に影響を与えないことが分った。
【００７４】
＜４−２＞組換えＥＣ−ＳＯＤのＴ細胞分化に及ぼす影響確認
Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさなくてもＴ細胞の分化に影響を及ぼし得る為、分化を知り得るＴ細胞のサイトカインを測定した。
脾臓細胞を抗原であるオブアルブミンペプチドと共に、４８時間培養後培養培地に生成されたＩＬ−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）サイトカインを測定した。測定方法は、ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）会社のＥＬＩＳＡ−ｋｉｔを利用して、製造社の指針に従い測定した。
その結果、図１２に示した通り、ＥＣ−ＳＯＤがＩＬ−４の形成を減少させることが分った。この結果により、ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の分化に影響を及ぼし得る（ｎｅｇ．：抗原が処理されない試験群、−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理された試験群、ｐ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＰＢＳに入っているＥＣ−ＳＯＤを一緒に処理した試験群、ＮＢ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＳｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅに含まれているＥＣ−ＳＯＤを一緒に処理した試験群、全ての試験群は一緒に４８時間培養培地に入れて処理された）。
一方、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤＴ細胞分化に及ぼす影響を具体的に調べる為に、前記組換えＥＣ−ＳＯＤをマウスのＴ細胞に投与してＩＬ−４及びＩＮＦ−γ等のサイトカインの生成量を比較した。
具体的に特定抗原であるＯｖａペプチドのみを認知するＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子過発現マウスであるＤＯ １１．１０（浦項工大成永哲教授より提供）脾臓においてＣＤ４細胞をＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用して分離した。抗原提示細胞で正常マウスであるＢａｌｂ／ｃマウス脾臓細胞全体をγーｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎし、Ｏｖａペプチド（１μｇ／ｍｌ，Ｏｖａ３２３−３３９，ペプトロン社）及びＭＡＣＳで分離したＣＤ４ Ｔ細胞と共にＲＰＭＩ１６４０培地で１０％ＦＢＳを入れて培養した。培養過程で、前記＜実施例１＞で分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤを前記培養に与えた。７２時間後に培養液を採集してＥＬＩＳＡ（抗体：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養液内のＩＬ−４とＩＦＮ−γの量を定量した。
その結果、図１３に示した通り、前記＜実施例１＞で分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤは、Ｔ細胞において、Ｔｈｌ側のサイトカインであるＩＦＮ−γの形成を誘導し、Ｔｈ２側のサイトカインであるＩＬ−４の形成を抑制することが分った。従って、組換えＥＣ−ＳＯＤは免疫細胞に影響を及ぼし、特に、Ｔ細胞の分化に影響を及ぼすことが分った。
従って、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはアレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、Ｔｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できるとこが分った。
【００７５】
＜実施例５＞
天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＴ細胞分化に及ぼす影響
前記＜実験例１＞に記載された人間のＥＣ−ＳＯＤを過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質とＴｈ１側に免疫を誘導する免疫補助剤ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｓｉｇｍａ社）を、Ｔｈ２側にはＡｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，Ｐｉｅｒｃｅ社）を混合して、それぞれ２５μｇずつ足裏と尻尾に免疫処理した後、１１日後に炎症が発生したリンパ球で細胞を分離し、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖とサイトカイン生成に影響を及ぼすか否かを観察した。
前記細胞増殖には、リンパ球細胞５×１０５を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養し、培養３日後に同位元素である３Ｈを培養液にいれて、１６時間後に細胞内の同位元素含量をβ−ｃｏｕｎｔｅｒを利用して促進することにより細胞増殖を観察した。さらに、抗原特異的な反応であることを確認する為に、Ｏｖａ蛋白質の量を異にして細胞増殖を観察した。サイトカイン発現を観察する為に、リンパ球細胞５×１０６を４６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養し、７２時間後に培養液を採取して、ＥＬＩＳＡで培養液内のＩＬ−４とＩＦＮ−γの量を定量してその結果を図１４及び図１５に記載した。
前記図１４及び図１５に記載された通り、Ｔｈ１分化を誘導するＣＦＡを免疫補助剤として使用した場合、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より若干増加することを観察した。ＩＦＮ−γの発現が増加されたことを観察した。さらに、Ｔｈ２分化を誘導するＡｌｕｍを免疫補助剤として使用した時、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より減少し、ＩＬ−４の発現が減少されたことを観察した。このような結果は、ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の分化に影響を及ぼすものの、特に、主にＴｈ１側に分化させ、Ｔｈ２側への分化を抑制させることが分った。
従って、天然型ＥＣ−ＳＯＤは、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断してＴｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できることが分った。
【００７６】
＜実施例６＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の転写因子活性阻害効果確認
紫外線によるＮＦ−κＢ活性化に対するＥＣ−ＳＯＤ効果を調べる為に、ＨａＣａＴ ｃｅｌｌを１４ｍｍ培養スライドに細胞を接種した後、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が１０％含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地で２４時間培養した。２４時間培養後、牛胎児血清が１％含まれたＤＭＥＭ培地で２４時間飢餓処理（ｓｔａｒｖａｔｉ ｏｎ）をした。処理後それぞれ１０μｇのＥＣ−ＳＯＤを３０分間処理した後（前処理）リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）を利用して細胞を３回水洗した後、ＮＦ−κＢ活性化を誘導する為に、１００Ｊ／ｍ２の紫外線を照射した。紫外線照射直後、細胞を再びリン酸緩衝液で水洗して牛胎児血清が１％含まれたＤＭＥＭ培地にＥＣ−ＳＯＤを前処理濃度と同じく処理して、さらに４時間培養した。以降、細胞をメタノールで５分間固定して免疫染色を実施した。このように固定された細胞を１０％正常羊血清（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回水洗した。 ここに、ＥＣ−ＳＯＤとＮＦ−κＢに対する免疫染色の為に、二十日鼠抗ＥＣ−ＳＯＤ 抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ ＥＣ−ＳＯＤ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｌａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ，韓国）と、兎抗ＮＦ−κＢ抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＮＦ−κＢ ａｎ ｔｉｂｏｄｙ，ｓａｎｔａｃｕｚ，米国）をそれぞれ処理し、４℃で１６時間反応させた。これをＴＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉ ｏｃｙａｎａｔｅ）が融合された抗兎ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉーｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｅｒｏｔｅｃ，英国）とＦＩＴＣが融合された、抗二十日鼠ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉーｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｓｅ ｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｚｙｍｅｄ，米国）を利用して蛍光染色した後、ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ，米国）でカウンター染色した。
その結果、図１６（２００倍比率）に示した通り、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ，ＥＣ−ＳＯＤが形質感染されたＨａＣａＴ細胞にＵＶ処理を施していない群）において、ＮＦ−κＢは細胞質及び核で免疫染色がなされず、ＮＦ−κＢが不活性されたことが分った（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ）。ＵＶＢ群（ＨａＣａＴ細胞にＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）では、速やかに核（ｎｕｃｌｅａｒ）部位と核周囲（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ）部位で、ＮＦ−κＢが活性化されることが観察された（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）。これに比べて、ＥＣＳＯＤ／ＵＶＢ群（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌに本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理し、ＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）では、ＵＶＢ群に比べて著しく核部位のＮＦ−κＢの活性化が阻害されることが観察された（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ）。このような結果により、本願発明の組換えＥＣ−ＳＯＤが転写因子であるＮＦ−κＢの活性化を抑制することが分った。
従って、本願発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはＮＦ−κＢの非正常的な活性を防ぎ、アレルギー等の自己免疫疾患を予防又は治療に有用に使用できることが分った。
【００７７】
＜実施例７＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の人間肥満細胞脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）の減少効果確認
ＥＣ−ＳＯＤが人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）にどのような影響を及ぼすか、否かを調べる為に、トルイジンブルーで染色した後、細胞１００個の内、脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
人間肥満細胞（ｓｅｍｉ，Ｈｕｍａｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ−１（ＨＭＣ−１），慶熙大学校金炯敏教授より提供）を１８×１８ｍｍカバースリーブに１×１０４ｃｅｌｌｓ／カバースリーブで分株した。培地は１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンと１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン１％で添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この細胞は半付着細胞（ｓｅｍｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ）である為、付着された細胞と付着されない細胞の比率は４：６程度であるものの、付着された細胞が約３０−４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）した時、ＥＣ−ＳＯＤ５μｇで、１時間前処理した後、カルシウムチャンネルであるＡ２３１８７ １μＭとホルボルミリステートアセテート（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）５０ｎＭで処理して、細胞内のカルシウム濃度を高めた。
１２時間後に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で人間肥満細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１０分間固定させた。リン酸緩衝溶液で洗浄し、酸性を帯びた（ｐＨ２．３）１％の塩水に溶解されている０．１％トルイジン（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ）ブルー溶液で２−３分間染色した。再び水で洗浄した後、９５％，１００％アルコールで脱水させ、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で固定させ、１００個の染色させた細胞のうち脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
その結果、図１７Ａに示した通り、何等の処理もしていない人間肥満細胞群（対照群，ｃｏｎ）で脱顆粒された細胞数は１０個、ＥＣ−ＳＯＤを処理した群（ＥＣ−ＳＯＤ）で脱顆粒された細胞数は１６個であった。これに比べて肥満細胞を活性化させ、脱顆粒を誘導する為に、細胞内のカルシウム濃度を高めた群（Ａ＋Ｐ）では脱顆粒された細胞数が５５個で、５倍以上増加したものの、ＥＣ−ＳＯＤを前処理して細胞内のカルシウム濃度を高めた群（Ａ＋Ｐ＋ＥＣ−ＳＯＤ）では、脱顆粒された細胞数が２５個までさらに減少した。これはＥＣ−ＳＯＤの作用による活性酸素抑制により、脱顆粒減少が起こったことを示している。肥満細胞脱顆粒に対する顕微鏡写真は図１７Ｂの通りである。
従って、肥満細胞の脱顆粒により肥満細胞内にあったヒスタミン等の媒介物質がでてきて、アレルギー等の炎症反応が起るとの事実を考慮するに、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤは人間肥満細胞脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させ、アレルギー疾患を予防又は治療に有用に使用でき得ることが分った。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生を誘導するＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を抑制する効果が優れているので、血管新生による疾患の予防及び治療に有用に使用することができ、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、転写因子（ＮＦ−ｋＢ）活性を阻害し、人間肥満細胞の脱顆粒を減少させることにより、アレルギー疾患の予防及び治療に有用に使用できる。さらに、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法は前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤを大量に生産することができ、産業的に有用に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の新規な用途及びその製造方法に関する。具体的に本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質、又はこれらをコーディングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする、血管新生による疾患又はアレルギー疾患の予防又は治療用組成物及びＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）は活性酸素を除去するばかりでなく、他の抗酸化酵素が作用し得るようにして、細胞を保護するよう機能し、今までに知られているＳＯＤには銅と亜鉛原子を有しているＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ１），マンガン原子を有しているＭｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ２）及び細胞表面、又は細胞外液に存在するＥＣ−ＳＯＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）等がある。
【０００３】
特に、ＥＣ−ＳＯＤはＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのように銅及び亜鉛原子を有しているものの、Ｃ−末端側にヘパリン結合ドメイン（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）が存在すると言う特徴がある。ＥＣ−ＳＯＤはヘパリン結合ドメインを有している為、細胞膜のヘパリンに結合され、細胞膜を保護する役割をするものと推定されている。文献によれば、ＥＣ−ＳＯＤは血漿と細胞外基質等において、生体防御作用を担当しているものとして知られている（Ｍａｒｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６６，２１３−２１９，１９９０；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ １６（２），１６２−７０，１９９７；Ｌｕｏｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏ．１８，１５７−１６７，１９９８）。ＥＣ−ＳＯＤのヘパリン結合ドメインが、核局在化シグナル（ｎｕｃｉｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）として働き、胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）と睾丸細胞（ｔｅｓｔｉｓ ｃｅｌｌ）において、核内に位置して酸化的ストレスからゲノムＤＮＡを保護し、酸化還元反応に敏感な転写作用を調節するとして報告されている（Ｏｏｋａｗａｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，２９６，５４−６１，２００２）。本発明者等は、大韓民国特許第１０−０６７６５０２号において、ＥＣ−ＳＯＤが皮膚細胞内活性酸素腫を除去し、表皮細胞の過増殖を抑制して乾癬等の皮膚疾患を治療する効果があることを開示している。
【０００４】
一方、血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の微細血管から新たな毛細血管が形成される過程である。正常には胚芽の発達（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の際、傷の治癒、周期的な女性の生殖器系統の変化の時にのみ起こり、その他の正常な条件では殆ど起こらない現象である。しかしながら、血管新生が自律的に調節できない時、病的に成長することにより癌のような疾患が誘発される。
【０００５】
前記血管新生過程は腫瘍サイトカイン、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び塩基繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）により、内皮細胞の成長を促進させる段階、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により細胞外基質蛋白質を分解させる段階、細胞膜接着分子、内皮細胞分化及び管形成により媒介される内皮細胞の移動段階のような多様な段階で構成されている（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２：２５１−２５６，１９９７；Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４０：５５６−５７２，２００１；Ｒｉｓａｎ，Ｗ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ４４：４１６−４１７，１９９４）。従って、前記過程等の阻害は血管新生と関連した癌及び他の人間の疾病の治療の為の新たな治療戦略として台頭するようになった。前記目的の為、多様な種類の血管新生抑制剤が開発された。前記抑制剤は天然的であるか又は合成された物質にして、蛋白質分解酵素抑制剤、チロシンリン酸化酵素の抑制剤、ケモカイン、インタルキン及び基質蛋白質の分解切片を含む（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５４４２−１５４５１，１９９７；Ｃａｏ，Ｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３３：３５７−３６９，２００１；Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ａｅｔ ａｌ． ，Ｃａｎｃｅｗ Ｒｅｓ．５９：９９−１０６，１９９９；Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｌｙｃｉｇｏｒｇｉａ ｉｎｅｒｍｉｓ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：６５６−６６２，２００１．）。前記抗血管新生分子等は内皮細胞増殖、移動、蛋白質分解活性及び管形成の抑制ばかりでなく、細胞自殺（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導を含む多くの過程に影響を及ぼす（Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．３：８９−９６，１９９２；Ｋｉｓ ｈｉ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５８：１７４７−１７６２，２０００；Ｍａｒｍｅ，Ｄ．，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ １：１−５，２００１）。
【０００６】
前記分子等の抗血管新生機能はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて良く研究されたものの、幾つかの物質は現在臨床試験を実施している（Ｄｅｐｌａｎｑｕｅ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３６：１７１３−１７２４，２０００；Ｌｉ ｅｋｅｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１：２５３−２ ７０，２００１；Ｍｒｏｓｓ，Ｋ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．３：２２ ３−２３５，２０００）。
【０００７】
活性酸素腫が血管新生の主要な調節者として報告されているものの（Ｊｏｌａｎｔａ Ｇｒｚｅｎｋｏｗｉｃｚ−Ｗｙｄｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４（１−２）：１６９−８１，２００４）、活性酸素腫を除去するＳＯＤと血管新生との関連性に対しては十分に調査されたものがない。最近ＳＯＤの中で銅と亜鉛原子を有しているＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（ＳＯＤ１）を過発現させると、血管新生が促進され、前記ＳＯＤ１を抑制すると血管新生を抑制し（Ｊｏｌａｎｔａ Ｇｒｚｅｎｋｏｗｉｃｚ−Ｗｙｄｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４（１−２）：１６９−８１，２００４）、ＳＯＤ１の抑制剤であるＡＴＮ−２２４が血管新生を抑制して抗癌剤として使用することができ、現在第２相臨床試験中であるとして報告されている（Ｊｕａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：４９７４−４９８２，２００６）。しかしながら、ＥＣ−ＳＯＤと血管新生の関連性に対しては報告された例が全くない。
【０００８】
一方、産業の発達により、環境汚染、新たな合成新物質の増加、住居環境の変化によりアレルギーを誘発する因子が増加し、これに伴い喘息、アレルギー疾患により苦痛にさらされている人間等の数が漸次増加してきた。一旦侵入した異物に対して生体が特異な抵抗を示す機能を免疫と称し、アレルギーとは、免疫反応の過敏症の一つであり、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、花粉症は代表的なアレルギー性疾患である。アレルギー反応に伴う臨床的症状等は、大きくは、アレルギー疾患の種類に伴う反応初期の特異な免疫反応と反応後期の炎症反応とに区分される。このようなアレルギー反応は大部分が肥満細胞を媒介に起こるものの、肥満細胞は皮膚、呼吸器、胃腸管の粘膜、リンパ管周囲、血管周囲、脳等全身の臓器に広く分布し、アレルギー反応の原因細胞として知られている。肥満細胞を活性化させる媒介物質としては、細胞の細胞膜に存在する高親和性のＩｇＥ収容体に結合されているＩｇＥ抗体（ＦｃεＲＩ）、化合物４８／８０（ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０）等が知られている。ＩｇＥ抗体による肥満細胞の活性化機序は次の通りである。ＩｇＥ収容体に結合されているＩｇＥ抗体が抗原により、架橋（Ｂｒｉｄｇｅ）を形成すると、ホスホリパーゼＣ、蛋白質リン酸化酵素Ｃ、カルシウムイオンの作用を経て顆粒に貯蔵されていたヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸塩、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、蛋白質分解酵素等が遊離されることにより、前記の初期反応段階を媒介する。ヒスタミンを含む電気化学伝達物質等はアレルギー初期反応で現れる臨床的症状等を誘発する原因物質等であり、この内、ヒスタミンが最も多くの量を占める。つまり、アレルギー初期反応では、ヒスタミンの発現による作用が主を為し、その臨床的症状としては血管拡張、浮腫等がある。
【０００９】
現在前記アレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン剤やステロイド剤等が多く活用されている。しかしながら、このような薬物はその効果が一時的な場合が大部分であって、副作用が甚だしい場合も多い。従って、急増するアレルギー性疾患の予防及び治療効果を有しながら、副作用が少なく効果が持続的な新たな物質の開発が切実に要請される状況である。ただ、ＥＣ−ＳＯＤがアレルギー疾患の治療効果があるか、否かに対しては全く知られていない。
【００１０】
さらに、前記ＥＣ−ＳＯＤが多様な活性を有しているとしても、これの大量生産方法が開発されないと、産業において効率的に利用できない問題点がある。しかしながら、今まで開発された蛋白質の大量生産方法は、大腸菌等の宿主細胞を発現ベクターで形質転換してこれらの発現を誘導するものであるものの、蛋白質の大量生産は、しばしば内包体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成を招き、これにより蛋白質の元来の活性がなくなるか、又は減少する問題点があった。
【００１１】
本発明者等はＥＣ−ＳＯＤに対する研究を重ねて行く中で、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質が血管新生又はアレルギー疾患を治療又は予防し得る活性があることを発見し、前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を生産し得る方法を見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような目的を達成する為に、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。さらに、本発明は（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養してＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現する段階；（ｄ）発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明で発現ベクターとは、適当な宿主細胞より目的蛋白質又は目的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子製作物を言う。
本発明で用語、“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、一般的な機能を遂行できるように核酸発現調節配列と、目的とする蛋白質又はＲＮＡをコーデイングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。例えば、プロモータと蛋白質又はＲＮＡをコーデイングする核酸配列が作動可能に連結され、コーデイングする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野で広く知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＲＮＡ切断及び連結は当該技術分野で一般的に知られた酵素等を使用する。
【００１５】
本発明は、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、天然型又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を言う。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、マウス又は人間より由来したものであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したものであることを特徴とする。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号３及び配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号３を有することを特徴とする。一方、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは、配列番号１アミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１６】
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の一実施例では、公知された方法でマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスを製造し（＜実施例１＞参照）前記マウスにＵＶＢを照射した後、組織の形態変化を野生型マウスと比較した。その結果、野生型マウスではＵＶＢ照射により血管新生が誘導されたものの、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスではＵＶＢ照射による血管新生が著しく抑制されていることを確認できた（＜実施例２ー１＞参照）。
【００１８】
さらに、本発明の他の実施例では前記ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおいて、紫外線照射による血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及びＭＭＰ−９の発現程度をウェスタンブロット（＜実施例２ー２＞）、免疫組織化学的方法（＜実施例２ー３＞）及びザイモグラフィー方法（＜実施例２ー４＞）を利用して調査した。その結果、紫外線照射により野生型マウスではＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現が増加されたものの、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスではＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現が著しく抑制されることを確認することができた。前記実験結果からＥＣ−ＳＯＤが血管新生を誘導するＶＥＧＦの発現を抑制して、血管新生を調節するＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を抑制することが分った。
【００１９】
さらに、本発明者等はさらに他の実施例でヘパリンドメインが除去された組換えＥＣ−ＳＯＤを大腸菌で発現させ、分離してリホールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）と精製過程を経た組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を生産（＜実施例１＞参照）して前記蛋白質が血管新生を抑制するか否かを確認（＜実施例３＞）した。その結果、紫外線照射によりＶＥＧＦの発現が誘導されるものの、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理した場合には、前記ＶＥＧＦの発現が抑制されることが確認できた。
【００２０】
従って、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生による疾患の予防及び治療に効果的に使用できる。前記血管新生による疾患には、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）発現及びＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−９の発現により誘発されることを全て含み、これに限定はされないものの、好ましくは癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビが挙げられる（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０２，１２６１−１２６２，１９９５；Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍ ３４（３）：４８６−４９７，１９９６；Ｃｉｒｃｕｌｔｉｏｎ ９３（４）：６３２−６８２，１９９６；Ｃｅｌｌ ８６：３５３−３６４，１９９６）。
【００２１】
さらに、本発明はＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
上述した通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質はこれに限定はされないものの、好ましくは天然型又は組換え蛋白質を言う。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくはマウス又は人間より由来したことであることを特徴とし、最も好ましくは、人間より由来したことを特徴とする。前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号３及び配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とし、最も好ましくは、配列番号３を有することを特徴とする。一方、前記組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は前記天然型ＥＣ−ＳＯＤから組換え技術により製造され、その活性を維持するものであればこれに限定はされないものの、好ましくは配列番号１アミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明は前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
上述した通り、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングし得るポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。
【００２３】
本発明の一実施例では、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響を確認した結果、前記組換えＥＣ−ＳＯＤはＴ細胞でＴｈｌ側のサイトカインＩＦＮ−γの形成を誘導し、Ｔｈ２側のサイトカインであるＩＬ−４の形成を抑制することが分った。従って、組換えＥＣ−ＳＯＤはＴ細胞の分化に影響を及ぼすことが分り、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、Ｔｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防するにおいて有用に使用できることが分った（＜実施例４＞参照）。
【００２４】
さらに、本発明のさらに他の一実施例では、天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質である人間由来のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＴ細胞分化に及ぼす影響を確認した結果、前記ＥＣ−ＳＯＤもやはりアレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断してＴｈ１細胞への分化を誘導することが分った（＜実施例５＞参照）。
【００２５】
さらに、本発明のさらに他の一実施例では組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の転写因子活性を阻害する効果があるか、否かを確認した結果、組換えＥＣ−ＳＯＤはＮＦ−κＢの非正常的な活性を阻害し得ることが分かり（＜実施例６＞参照）、さらに、人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させる効果があることを確認し、肥満細胞の脱顆粒により肥満細胞内にあったヒスタミン等の媒介物質が現れ、アレルギー等の炎症反応が起こると言う事実を考慮するに、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはアレルギー疾患を予防又は治療に有用に使用できることが分った（＜実施例７＞参照）。
【００２６】
従って、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、アレルギー疾患の予防及び治療用組成物として有用に使用できる。前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー皮膚炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたものであることを特徴とする。
【００２７】
前記本発明の組成物に含まれるＥＣ−ＳＯＤ蛋白質にはこれらと実質的に同等な生理活性を有する蛋白質を含む。実質的に同等な生理活性を有する蛋白質には、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の機能的同等物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）及び機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が含まれる。
本発明で“機能的同等物”とは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を有するＥＣ−ＳＯＤと実質的に同等な生理活性を示すポリペプチドを言う。
【００２８】
前記にて“同等な生理活性”とは、血管新生又はアレルギーを抑制する活性を言う。前記機能的同等物は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するポリペプチドでもあり得る。前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換又は欠失の結果、配列番号３で表示されるペプチドと少なくとも７０％以上の、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％以上の配列相同性（つまり、同一性）を有するものにして、例えば、７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，５８％，９９％，１００％の配列相同性を有することを含み、配列番号３で表示されるペプチドと実質的に同質の生理活性を示すペプチドを言う。本明細書で配列相同性及び同質性は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列と、候補配列を整列してギャップ（ｇａｐｓ）を導入した後、配列番号３で表示されるアミノ酸配列に対する候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。必要な場合、最大百分率配列同質性を収得する為に、配列同質性の部分として保存的置換は考慮しない。配列番号３で表示されるアミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端又は内部伸長、欠損又は挿入は配列同質性又は相同性に影響を及ぼす配列として解析されない。さらに、前記配列同質性は２個のポリペプチドのアミノ酸配列の類似した部分を比較する為に使用される一般的な標準方法により決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムは、２個のポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適にマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）するように整列する（一つ又は二つの配列の全長配列に沿って又は一つ又は二つの配列の予測された部分に沿って）。前記プログラムはデフォルトオープニングペナルティー（ｄｅｆａｕｌｔ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティー（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を提供し、コンピュータプログラムと共に、連携されて使用され得るＰＡＭ２５０（標準スコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ ５，ｓｕｐｐ．３，１９７８）のようなスコアリングマトリックスを提供する。例えば、百分率同質性は次のように計算できる：一致する配列（ｉｎｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）の総数に１００を掛け、対応されるスパン（ｍａｃｈｔｅｄ ｓｐａｎ）内のより長い配列の長さと、二つの配列を整列する為に、より長い配列内に導入されたギャップ（ｇａｐｓ）の数の和で割る。本発明の機能的同等物の範囲には、本発明に伴うポリペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながら、ポリペプチドの一部化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させる為の構造変更がこれに含まれる。
【００２９】
さらに、本発明の組成物に使用されるポリヌクレオチド配列はＤＮＡ，ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を全て含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有する。本発明の組成物は前記ポリヌクレオチドを含むプラスミド又はウイルスべクターのような発現べクターを有効成分とする。前記本発明に伴う発現べクターはＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のｃＤＮＡ及びこれらの発現を調節できる発現調節配列を含めている。前記ポリヌクレオチドはて天然で分離されるか、又は当業界に公知された遺伝工学的方法により製造できる。
【００３０】
前記にて発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結された配列の発現に必須のＤＮＡ配列を意味する。前記発現調節配列には、転写を実施する為のプロモーター、前記転写を調節する為の任意のオペレータ配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列はプロモータ、オペレータ配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーがこれに含まれ得る。
【００３１】
前記発現べクターを挿入した後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）等の当業界に公知された方法により発現型で標的細胞内に導入させ得る。
【００３２】
プラスミド発現べクターを利用した遺伝子伝達方法は、哺乳動物細胞に直接的にプラスミドＤＮＡを伝達する方法として、ＦＤＡから承認を得た人間に使用し得る方法である（Ｎｏｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１ ２８８，１９９０）。プラスミドＤＮＡはウイルスべクターとは異なり均質に精製できる長所がある。本発明で使用し得るプラスミド発現べクターは、当業界に公知された哺乳動物発現プラスミドを使用し得る。例えば、これに限定はされないものの、ｐＲＫ５（ヨーロッパ特許第３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（国際特許公開第９１／０８２ ９１号）及びｐＶＬ１３９２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）等が代表的である。前記核酸を 含むプラスミド発現べクター（ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）は当業界に公知された方法、例えば、これに限定はされないものの、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質感染（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介された形質感染（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介された形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）及び細胞内にＤＮＡを流入させる為の他の公知の方法により標的細胞内に導入できる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２６７：９６３−９６７，１９９２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２６３；１４６２１−１４６２４，１９８８）。
【００３３】
さらに、前記ポリヌクレオチドを含むウイルス発現べクターでは、これに限定はされないものの、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、アビポックス ウイルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）及びレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）等が含まれる。前記レトロウイルスべクターはウイルス遺伝子が全て除去されたか、若しくは変更され非ウイルス蛋白質がウイルスべクターにより、感染された細胞内で作れるように作製されたものである。遺伝子療法の為のレトロウイルスべクターの主要長所は多量の遺伝子を複製細胞内に伝達し、細胞ＤＮＡウイルスに伝達された遺伝子を正確に統合し、遺伝子形質感染後連続的な感染が誘発されないことである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０，１９９２）。ＦＤＡで認証されたレトロウイルスべクターはＰＡ３１７アンフォトロフイックレトロウイルスパッケージ細胞を利用して製造したものである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ，Ｃ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：２８９５−２９０２，１９８６）。非レトロウイルスべクターには、前記にて言及した通り、アデノウイルスがある（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５，１９９２；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７２−３７８，１９９２；Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６４８２−６４８６，１９９２）。アデノウイルスの主要長所は多量のＤＮＡ断片（３６ｋｂゲノム）を運搬し、極めて高い力価で非複製細胞を感染させる能力があることである。さらに、ヘルペスウイルスも人間遺伝子療法の為有用に使用できる（Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７９−３８４，１９９２）。レンチウイルスはレトロウイルスの一種にして１９９０年代後半から開発され始めた新たなレトロウイルス輸送体としてＨＩＶ骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を変形したものである。既存のレトロウイルス輸送体等とは違って細胞分裂周期に影響されずに、分裂が活発な細胞ばかりでなく、分裂が活発でない細胞でも遺伝子発現効率が比較的良い。従って、造血幹細胞等のように分裂が遅い細胞でも他のウイルス性水素体より発現効率が良いことから、最近造血幹細胞角質細胞を利用した細胞治療分野で遺伝子伝達用輸送体として研究が活発に進行されている。この他にも公知された適切なウィルスベクターが本発明に使用できる。
【００３４】
前記本発明の組成物には、薬学的に許容される担体を追加して含め得る。前記にて“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容されて、人間に投与される時、通常的に胃腸障害、眩気症等のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない組成物を言う。
【００３５】
薬学的に許容される担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体を追加して含め得る。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸等を含め得る。さらに、非経口投与用担体は水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができ、安定化剤及び保存剤を追加して含め得る。適切な安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコロビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピールパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、次の文献に記載されていることを参考にする（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ． ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。本発明に伴う蛋白質又はこれをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、上述したような薬学的に許容される担体と混合して公知の方法により、多様な非経口又は経口投与用形態で製造され得る。非経口投与用剤形には、等張性水溶液又は懸濁液形態のような注射用剤形及び軟膏剤形態の剤形が好ましい。注射用剤形は適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界に公知された技術により製造できる。例えば、各成分を食塩水又は緩衝液に溶解させ、注射用として剤形化できる。さらに、経口投与用剤形には、これに限定はされないものの、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセル等があり、これらの剤形は有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリーシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含め得る。製剤はさらに、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含むことができ、場合によっては、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩のような崩解剤又は沸騰混合剤及び／又は吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含め得る。前記剤形は通常的な混合、顆粒化又はコーテイング方法により製造できる。
【００３６】
本発明に伴う組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、生命工学的技法を利用するか、又は既存の製造法を利用して口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸が含まれる。
【００３７】
好ましくは、本発明に伴う組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、境膜内、病巣内及び頭蓋骨内注射又は注入のような方法で非経口的に投与できる。例えば、注射用として剤形化された本発明に伴う組成物を、４〜６ｍｍの細い針で皮膚の下層に一定量を注入、又は３０ゲージ（ｇａｇｅ）注射用針で皮膚を軽く短刺（ｐｒｉｃｋ）する方法であるメッソーテラピー（Ｍｅｓｓｏ ｔｈｅｒａｐｙ）法により投与できる。さらに、皮膚に適用する場合、軟膏剤のような形態で剤形化して経皮投与できる。前記にて“経皮投与”とは、組成物を局所的に皮膚に投与して組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。特に、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする組成物の場合には、皮膚に直接塗布する経皮投与方法により、投与するのが好ましい。さらには、本発明の組成物は蛋白質伝達方法と関連した生命工学的技法を利用して投与できる。
【００３８】
前記本発明に伴う組成物は、予防又は治療効果を示す量で患者に投与し得る。一般的な１日投与量としては体重１ｋｇに対し約０．０００１乃至１００ｍｇの範囲で投与できる。好ましくは、体重１ｋｇに対し約０．０１乃至１ｍｇの範囲で投与できる。本発明の組成物は好ましい投与量範囲内で１回又は複数回に分割投与できる。しかしながら、本発明に伴う組成物の投与量は投与経路、投与対象、年令、性別、体重、個人差及び疾病状態により適切に選択できる。
【００３９】
さらに、本発明は（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現する段階；（ｄ）前記発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディングを誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法を提供する。
【００４０】
前記（ａ）段階におけるＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることは、当業界に公知された通常の組換えＤＮＡ技法を利用して行うことができ、前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドは、前記天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングできるポリヌクレオチドを意味し、これに限定はされないものの、好ましくは、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする。前記ポリヌクレオチドは適切なプライマーを使用してＰＣＲ増幅することにより作製できる。他の方法として当業界に公知された標準方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で販売するもの）を使用してＤＮＡ配列を合成することもできる。発現ベクターは当業界で使用する通常の発現ベクターを使用することができ、その宿主細胞によって適切なものを選択して使用することができ、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ，米国）を使用することができる。本発明の製造方法はＥＣ−ＳＯＤを大量発現して生産しようとすることから、この目的を達する限りにおいて任意の発現ベクターを適切に選択して使用できる。
【００４１】
本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター等を含むもののこれに限定はされない。適切な発現ベクターはプロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサ（促進遺伝子）のような発現調節配列の他にも、膜標的化又は分泌の為のシグナル配列又はリーダ配列を含み、目的により多様に製造できる。ベクターのプロモータは構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）又は誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）でもあり得る。さらに、発現ベクターはベクターを含有する宿主細胞を選択する為の選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合複製起源を含む。
【００４２】
前記（ｂ）段階の発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換することは、核酸を宿主細胞に導入する如何なる方法も含まれ、当業者に公知された形質転換技術により行われ得る。微細射出法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰ０４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、ＰＥＧ−媒介融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）等が含まれるもののこれに限定はされない。
【００４３】
上記場合において、宿主細胞は原核細胞又は眞核細胞を使用できるものの、好ましくは、宿主細胞としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスターフィロコキュス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のような原核宿主細胞、眞菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、酵母（例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、サカロマイセスセルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ニュロスポラクラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のような下等眞核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物等を含む高等眞核生物由来の細胞を宿主細胞として使用できるものの、これに限定はされない。さらに、好ましくは、本発明の宿主細胞は大腸菌を使用できる。前記（ｃ）段階の宿主細胞の培養及び発現は、形質転換された宿主細胞内でＥＣ−ＳＯＤ蛋白質が発現されるように、適切な培地及び条件下で培養することを含む。前記形質転換された細胞を培養して蛋白質を発現させる方法は、当業界に公知されており、例えば、形質転換された細胞が成長できる適切な培地に接種して種培養した後、これを本培養用培地に接種して適切な条件で培養することにより、蛋白質の発現を誘導することができる。
【００４４】
前記（ｄ）段階の内包体の収得は不溶性の内包体を分離して収得する為の、公知の方法を使用することができ、例えば、遠心分離により細胞沈澱物内で内包体を収得することができる。
【００４５】
前記（ｅ）段階の内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、当業界に公知された通常の方法、例えば、蛋白質変成剤を含む緩衝溶液で内包体を溶解させ、金属親和性樹脂コラムに吸着させ、変成剤の濃度を下げながらリホールディングを誘導する方法により行われる。
【００４６】
例えば、前記内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、変成剤である８Ｍウレア（ｕｒｅａ）を添加したＴｒｉｓ緩衝溶液（８Ｍ ｕｒｅａ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に内包体を溶解し、金属親和性樹脂が充填されたコラムに吸着させ、１Ｍウレアを添加したＴｒｉｓ緩衝溶液でコラムに濃度勾配を与えながら、ウレアを除々に除去してリホールディングを誘導する方法により行える。引き続き、前記コラムとの吸着性が強い溶出緩衝溶液や、ｐＨが低い（一般的に４以下）溶出緩衝溶液を前記コラムの上部から流入させることにより、これをコラム下部から収得してリホールディングされた純粋な蛋白質を得ることができる。例えば、これは金属親和性クロマトグラフィーコラムとの吸着性が強い、イミダゾル（一般的に１Ｍ）が含有された溶出緩衝溶液を前記コラムの上部から流入させることにより、これをコラム下部から収得してリホールディングされた純粋な蛋白質を得ることができる。さらに、前記溶出緩衝溶液は時間により漸次的に濃い濃度の溶液が投入されるように、つまり、濃度勾配を有するようにコラムに投入することが、リホールディングされた蛋白質の収得率を高めることができて好ましい。
【００４７】
本発明のＥＣ−ＳＯＤの製造方法は（ｆ）ゲル濾過コラム（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）により、分離、精製する段階を追加して含めることができ、以降追加精製、濃縮、溶媒交換等の目的により、当業界に公知された多様な分離及び精 製方法を介して行うことができ、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈澱及びリン酸ナトリウム沈澱）、溶媒沈澱（アセトン、エタノール等を利用した蛋白質分画沈澱）、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相コラムクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー等の技法を、単独又は組合わせで適用させＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を製造できる。
【００４８】
本発明で使用される標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野に広く公知されており、下記の文献に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；ｂｙ Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８４）；ａｎｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７））。
【００４９】
上述した通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、必要とする個体に有効な量で投与して血管新生による疾患又はアレルギー疾患の予防又は治療方法に有用に使用することができ、従って、血管新 生による疾患又はアレルギー疾患の治療剤製造の為にも有用に使用できる。
【発明の効果】
【００５０】
前記の通り、ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生を誘導するＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現を抑制して、血管新生を抑制する効果が優れているので、血管新生による疾患の予防及び治療に有用に使用することができ、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断して、転写因子（ＮＦ−κ８）活性を阻害し、人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させることにより、アレルギー疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。さらに、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法は、前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤを大量に生産することができて、産業的に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィーの結果を示したグラフである（Ａ：線平衡区間、Ｂ：試料投入区間、Ｃ：コラム洗滌区間、Ｄ：リホールディング区間、Ｅ：リホールディング平衡区間、Ｆ：溶出区間、Ｇ：コラム洗浄区間、Ｘ軸：時間及び体積（時：分：秒、ｍＬ），Ｙ軸：ＵＶ吸光度（Ｕｎｉｔ））。
【図２】図２は本発明に伴うリホールディング及び精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したクマシーブルー蛋白質染色写真である（Ｍ：分子量サイズマーカー、Ａ：８Ｍウレア緩衝溶液で溶解された内包体（リホールディング精製前の試料）、Ｂ：コラムに吸着されずに溶出された内包体不純物、Ｃ：リホールディング精製後溶出されたＥＣ−ＳＯＤ、Ｄ：脱塩精製後限外濾過法により濃縮されたＥＣ−ＳＯＤ）。
【図３】図３は抗ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質抗体を利用して、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をウェスタンブロットで確認した結果である（ＳＭ：ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ，１：対照群（ＨａＣａＴ人間ＥＣ−ＳＯＤ）、２：本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質）。
【図４】図４は精製過程中ＥＣ−ＳＯＤ活性を確認した結果である（２０９ ＦＴ：精製工程中吸着されずに溶出された試料、２０９Ｅ１：金属親和性クロマトグラフィーコラムでリホールディングされた１次精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質、２０９ Ｅ２：ゲル濾過コラムで分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質）。
【図５】図５は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＨａＣａＴ細胞において、ＵＶＢの誘発されたＲＯＳの阻害効果を確認した結果である（ＵＶＢ：ＵＶＢのみ照射した場合、ＥＣ−ＳＯＤ＋ＵＶＢ：ＵＶＢを照射してＥＣ−ＳＯＤを処理した場合）。
【図６】図６は紫外線照射によるマウスの背皮膚組織の形態相変化を示した写真である（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、Ｃ：野生型マウスにＵＶＢを照射、Ｄ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢを照射）。
【図７】図７は紫外線照射によるマウス濃度組織において、ＶＥＧＦの発現様相をウェスタンブロットで分析した結果を示したものである。Ａｃｔｉｎはローディング対照群として使用した（ＷＴ：野生型マウス、ＴＧ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス）。
【図８】図８はマウスにＵＶＢを照射した後、ＶＥＧＦの発現様相を免疫組織化学的方法で分析した結果を示したものである（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、Ｃ：野生型マウスにＵＶＢを照射、Ｄ：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢを照射）。
【図９】図９はマウスにＵＶＢを照射し、ＭＭＰ−９の発現様相をザイモグラフィーで分析した結果である（レーン１：野生型マウス、レーン２：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス、レーン３：野生型マウスにＵＶＢ照射、レーン４：ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにＵＶＢ照射）
【図１０】図１０は皮膚角質形成細胞株に紫外線を照射して、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ処理に伴うＶＥＧＦの発現様相を免疫組織化学的方法で照射した結果である（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＵＶＢ照射、Ｃ：組換えＥＣ−ＳＯＤ処理＋ＵＶＢ照射、Ｄ：組換えＥＣ−ＳＯＤ処理）。
【図１１】図１１は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理した場合、Ｔ−細胞増殖に及ぼす影響を確認した結果である（Ｎｅｇ：何等の処理も施さない試験群）。
【図１２】図１２は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質処理時、Ｔ−細胞の分化に及ぼす影響をＩＬ−４分泌量で確認した結果である（ｎｅｇ：抗原が処理されていない試験群、−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理された試験群、ｐ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＰＢＳに含まれているＥＣ−ＳＯＤを共に処理した試験群、ＮＢ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＳｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅに含まれているＥＣ−ＳＯＤを共に処理した試験群）。
【図１３】図１３は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質処理時、Ｔ−細胞の分化に及ぼす影響をサイトカインＩＬ−４とＩＮＦ−ｇの分泌量で確認した結果である（ｎｅｇ：抗原が処理されていない試験群。−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理した試験群）。
【図１４】図１４は人間のＥＣ−ＳＯＤ遺伝子を過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質と免疫補助剤ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅａｔ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与した場合、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖とサイトカイン生成にどんな影響を与えるかを観察した結果である。
【図１５】図１５は人間のＥＣ−ＳＯＤ遺伝子を過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質と免疫補助剤Ａｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を投与した場合、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖と、サイトカイン生成にどんな影響を与えるかを観察した結果である。
【図１６】図１６は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＮＦ−κＢの活性化抑制を確認した結果である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＥＣ−ＳＯＤが形質感染されたＨａＣａＴ細胞にＵＶ処理をしない群、ＵＶＢ：ＨａＣａＴ細胞にＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群、ＥＣ−ＳＯＤ／ＵＶＢ：ＨａＣａＴ細胞に組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理してＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）。
【図１７】図１７は組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の肥満細胞脱顆粒抑制効果を確認した結果、（Ａ）及びこれの顕微鏡写真（Ｂ）である（Ｃ０ｎ：何等の処理も施さない人間肥満細胞群、ＥＣ−ＳＯＤ：ＥＣ−ＳＯＤを処理した群、Ａ＋Ｐ：細胞内のカルシウム濃度が高い群、Ａ＋Ｐ＋ＥＣ−ＳＯＤ：ＥＣ−ＳＯＤを前処理して細胞内のカルシウム濃度が高い群）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、実施例には本発明を単に例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５３】
＜実験例１＞
ＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスの製造
先ず、マウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスを下記のような方法で製造した。一方、前記マウスより由来したＥＣ−ＳＯＤ塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号５に記載した。
野生型ＢＤＦ１マウスは８乃至１０週齢ＢＤＦ１マウス（中央実験動物）を使用した。ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスは８乃至１０週齢ＢＤＦ１マウスを使用し、公知された方法により製造した（Ｈ．Ｙ．Ｈａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４８：４５０−４５８，２００６）。動物使用の為の実験方法はカトリック医科学研究所生命倫理委員会により承認を受けて使用した。
【００５４】
具体的には、韓国生命工学研究所で交雑種マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Χ ＣＢＡのＦ１）を購入し、過剰排卵を誘発するためにＰＭＳＧ（ｐｒｅｇｎａｎｔ ｍａｒｅ′ｓ ｓｅｒｕｍ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）と、ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を４８時間間隔で、それぞれ５ＩＵずつ雌の二十日鼠の腹腔内に注射し、同一系統の雄の二十日鼠と１：１で交尾させた。翌日の朝腟栓を確認し、腟栓がある個体のみ屠殺して卵管を切取した後、卵管膨大部から受精卵を回収した。培養液は０．４％ＢＳＡが添加されたＭ１６培養液を使用した。
【００５５】
皮膚組織に選別的なＥＣ−ＳＯＤ過発現が誘導されたマウスを作る為に、マウスＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡ（配列番号６）を含むｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯベクター（翰林大学校医科大学、徐俊教教授より提供）において制限酵素でマウスＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡ部分を切断して、人間ゼラチンＫ１４プロモータを含んでいるｐＢＳ ＫＳベクターに挿入した。さらに、このベクターに鶏のオブアルブミンポリ（Ａ）（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｐｏｌｙ（Ａ））を挿入して試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での発現を容易にした。受精卵にＤＮＡを注入する為に、発現ベクターを制限酵素ＨｉｎｄとＸｈｏｌで切断して使用した。制限酵素で切断したＤＮＡは１％アガロスゲルに電気泳動した後、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して回収した後、フェノールクロロホルムで分離して生成した。これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）濃度で透析して最終濃度が４ｎｇ／ｌになるようにした。外来遺伝子を含むＤＮＡ溶液を１細胞期受精卵の全核に注入した。外来遺伝子が注入された受精卵等を２細胞期まで培養した後、健康な状態の受精卵のみを選別した。発情した雌ＩＣＲを雄と交尾させた後、翌日腟栓を確認して確認されたものを代理母として使用した。２細胞期までよく育った受精卵を１５−２０個程を採り代理母の卵管膨大部に微細管を利用して移植した後、筋肉層と表皮を縫合した。移植後生まれた産子を３週程度育て、これらの尻尾を１ｃｍ程切断した後、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）に入れ、５５℃で処理した後、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）添加してゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。前記ゲノムＤＮＡを下記のＰＣＲプライマーセットを利用してＰＣＲ増幅することにより、形質転換可否を確認した。ＰＣＲ条件は９４℃で１回、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２．５℃で４５秒間３０回繰返した後、７２．５℃で５分間１回実施した。
センスプライマー（配列番号７）
５′−ＴＴＧ ＴＣＴ ＣＴＡ ＡＴＡ ＧＡＧ ＧＧＴ Ｃ−３′
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５′−ＴＣＡ ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ Ｔ−３′
【００５６】
一方、人間より由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスは、米国コロラドＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから寄贈を受けた（Ｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２６８（２１）：１５３９４，１９９３）。
【００５７】
＜実施例１＞
生物学的活性を有する組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造
＜１−１＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質発現の為の融合ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のクローニング
生物学的活性を有する組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を製造する為に、人間由来のＥＣ−ＳＯＤのＮ−末端部位にある信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を除去して、Ｃ−末端部位の１３個アミノ酸が除去された２０９個のアミノ酸からなる、組換えＥＣ−ＳＯＤを次のような方法でクローニングした（前記組換えＥＣ−ＳＯＤ塩基配 列と、アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号１に記載し、前記人間由来のＥＣ−ＳＯＤ塩基配列と、アミノ酸配列はそれぞれ配列番号４及び配列番号３に記載した）。
【００５８】
人間由来のＥＣ−ＳＯＤ ｃＤＮＡ（配列番号４）を含むｐＵＣ １８−ｈＥＣ−ＳＯＤ（スウエーデン、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｋｌｕｎｄ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒより提供）べクターを鋳型として下記プライマーを利用してＰＣＲ増幅することにより、人間ＥＣ−ＳＯＤのｃＤＮＡを製造した。
センスプライマー（配列番号９）
５′−ｔａｇａｔｔｃｔｇｇａｃｇｇｇｃｇａｇｇａ−３′
アンチセンスプライマー（配列番号１０）
５′−ｔａｃｔｃｇａｇｔｃａｃｔｃｔｇａｇｔｇｃｔ−３′
【００５９】
ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（３０回）、７２℃で５分の条件でＰｆｕｌ重合酵素を利用して行った。増幅された遺伝子産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後、同一な制限酵素で切断されたｐＥＴ２８ａべクター（ＮｏｖａＧｅｎｅ，米国）に４℃で１２時間Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを利用して接合した。前記べクターを大腸菌ＤＨ５ａに形質感染させ、前記形質転換体をカナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ固体培地で培養して選別した。選別された形質転換体に組換えＥＣ−ＳＯＤ遺伝子が正しく挿入されたか、否かを遺伝子配列分析を実施して確認した。組換えＥＣ−ＳＯＤ遺伝子が挿入されたことが確認された形質転換体でべクターを分離して、過発現用大腸菌宿主細胞である大腸菌ＢＬ２１（ＮｏｖａＧｅｎｅ，米国）に挿入してカナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ固体培地で培養しながら過発現菌株を選別した。
【００６０】
＜１−２＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の発現
前記＜実施例１−１＞で選別された菌株を３７℃，カナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地で培養した。これをＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）６００ｎｍで０．６に達した時、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して蛋白質発現を誘導し、３７℃で６時間本培養をして組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現させた。
【００６１】
＜１−３＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のリホールディング誘導及び精製
発現が終了された培養液で遠心分離により、細胞を収得した後、１００ｍＭ塩化カルシウムが含有された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で懸濁し、超音波粉砕機で細胞を破壊した。これを遠心分離して沈殿層のみを分離し、前記１００ｍＭ塩化カルシウムが含有された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液で３回繰返して洗浄した。洗浄された細胞沈殿物には、不溶性蛋白質内包体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を含有している。洗浄された内包体（融合蛋白質含量５０％）１０ｍｇをＴｒｉｓ緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に入れ、８Ｍウレアを添加して溶解した。室温で２時間完全に懸濁して、遠心分離により相分離し、上層の水溶液層は溶解された不溶性組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質内包体を含有していることからこれを収得した（内包体溶液）。
【００６２】
組換えＥＣ−ＳＯＤリホールディングと精製の為に、高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィー機器（ＦＰＬＣ，Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して下記の通り行った：前記緩衝溶液（８Ｍ ｕｒｅａ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を流速１ｍｌ／ｍｉｎで金属親和性樹脂が満たされた平衡状態のクロマトグラフィーコラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ ５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）に流入させて平衡させ、前記にて収得した内包体溶液５ｍｌを金属親和性樹脂が満たされた平衡状態のクロマトグラフィーコラム（３ｍｌ）の上部方向に１ｍＬ／ｍｉｎで注入して、前記コラム内の固体支持体に前記折り畳み不全（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）蛋白質を吸着させた。
【００６３】
注入終了後、吸着されない固形物質等を除去する為に、前記緩衝溶液５０ｍｌをコラム上部方向に１ｍＬ／ｍｉｎで注入した。このようにコラム内で細胞の滓を完全に除去した後、ＥＣ−ＳＯＤ活性に影響及ぼすＺｎとＣｕを含み、１Ｍウレアが含有されたトリス緩衝溶液（８Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝溶液、１Ｍ ｕｒｅａ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ ＺｎＣｌ２ ，５０ｍＭ ＣｕＳＯ４ 、ｐＨ７．５）をコラム上部方向に０．５ｍＬ／ｍｉｎで線形的濃度勾配を与えながら注入し、コラム内の変性剤濃度を漸次減らすことにより、固体マトリックスに吸着された折り畳み不全（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）蛋白質を天然状態の３次元的構造を有して金属イオン（ＺｎとＣｕ）が完全に目的蛋白質に置換させて活性を有するようにリホールディングさせた。
その後、２Ｍイミダゾールと１Ｍウレアが含有されたトリス緩衝溶液を濃度勾配を与えてコラムの上部から下部方向に供給した。リホールディング融合蛋白質は０．５Ｍイミダゾール濃度の溶出緩衝液が供給された時、溶出された（図１参照）。
【００６４】
＜１−４＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質分離精製
前記＜実施例１−３＞から溶出された蛋白質より多量のイミダゾールを除去して、完全にリホールディングさせ、複合体を大きさ別に分離する為に、高速蛋白質精製用液状クロマトグラフィー機器と、ゲル濾過クロマトグラフィー（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）コラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １２ ｃｏｌｕｍｎ）を利用した。この工程ではトリス緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ １００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）又はリン酸緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｐＨ７．５）をコラム上部方向に０．５ｍＬ／ｍｉｎで流入させ、分離及び精製した。分離された目的蛋白質は限外濾過法で濃縮した。
その結果、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を得ることができ、それぞれの精製段階における試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、図２に示した通り、組換えＥＣ−ＳＯＤが良く分離されたことが分かった。
【００６５】
＜１−５＞ウェスタンブロットを介した組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の確認
前記＜実施例１−４＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤが確かであるか、否かを確認する為に、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を実施した。ＥＣ−ＳＯＤ標準蛋白質には、人間の皮膚角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）細胞株であるＨａＣａＴ（ドイツＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎ．Ｆｕｓｅｎｉｇ教授より提供）から発現された人間ＥＣ−ＳＯＤを使用した。ＨａＣａＴから発現された人間ＥＣ−ＳＯＤと、前記＜実施例１−４＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質等を１０％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動で分離し、ポリビニリデンフルオライトメンブレーン（Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩ，米国）に移した。その後、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを５％の脱脂粉乳でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、抗ＥＣ−ＳＯＤポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、ＵＳＡ）と共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている２次抗体ＩｇＧ（サンタクルズ、米国）を使って培養し、再度水洗した後、ＥＣＬ検出キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を利用して製造社の指針に従い発色した。
その結果、図３に示した通り、ＨａＣａＴから発現された人間ＥＣ−ＳＯＤ（レーン１）で陽性を示し、分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（レーン２）でも検出され、精製された蛋白質が人間ＥＣ−ＳＯＤであることが分かった。
【００６６】
＜１−６＞組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の活性検査
前記分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質がＳＯＤの生物学的活性を有するか否かを確認する為に、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を利用して製造社の指針に従い活性テストをした。
その結果、図４に示した通り、精製工程中に吸着されずに溶出された試料（２０９ＦＴ）は、活性を示さず金属親和性クロマトグラフィーコラムでリホールディングされた、１次精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（２０９Ｅ１）の活性は、２５０ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、ゲル濾過コラムを利用して分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質（２０９Ｅ２）の活性は３６０ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎを呈した。
【００６７】
＜１−７＞分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＲＯＳ除去効果確認
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＨａＣａＴ ｃｅｌｌにおけるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）除去効果を見る為に、前記＜実施例１−４＞にて分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を以下の通り処理した。
皮膚角質形成細胞（ＨａＣａＴ）を１８ｍｍカバースリップに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分株した後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンと、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを１％添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）培地を使用して、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。付着された細胞が約３０〜４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、牛胎児血清を取除いて２４時間培養した。細胞が５０〜６０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、前記ＥＣ−ＳＯＤ１０μｇで細胞を３０分間前処理した。ＵＶＢ（１００Ｊ／ｍ２）で３時間照射した後、１０ＭｍＤＣＦＨ−ＤＡと３７℃で３０分間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。写真はＺｅｉｓｓデジタルカメラを利用して撮影した。
その結果、図５に示した通り、ＵＶＢのみ照射した場合（ＵＶＢ）ＲＯＳが除去されなかったものの、ＵＶＢを照射して本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤを処理した場合（ＥＣＳＯＤ＋ＵＶＢ）、ＲＯＳが効果的に除去されたことが分った。
【００６８】
＜実施例２＞
天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生抑制効果
＜２−１＞ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと野生型マウスの形態学的比較
前記＜実験例１＞にて製造されたマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスと、野生型ＢＤＦ１マウスの背側皮膚に２ｋＪ／ｍ２で２４時間間隔でＵＶＢを４回照射した。つまり、前記マウス等の背側皮膚をＵＶＢ照射２日前に除毛し、２８０ｎｍ〜３４０ｎｍ波長範囲で３０５ｎｍの最大エネルギーを有する６個のＵＶＢランプ（ＦＳ２４Ｔ１２／ＵＶＢ／ＨＯ，２９０−３２０ｎｍ，Ｖｏｌｔａｒｅ社、Ｆａｉｒｆｅｉｌｄ，ＣＴ，米国）を使用して、８週齢のマウス２４匹に２００ｍＪ／ｃｍ２で一定に照射した。ＵＶＢ照射する間ランプの高さは、麻酔されたマウスの背側皮膚表面に０．３ｍＷ／ｃｍ２で照射されるように調節した。各群のマウス（各群（ｎ−６））等に２４時間間隔で４回ＵＶＢを照射し、実験の為、４回目照射１時間後にマウスを犠牲にした。犠牲にしたマウスの背側皮膚患部を切開して肉眼で観察した結果を図６に示した。
前記図６に示した通り、野生型マウスに紫外線ＵＶＢを照射ＤＱ場合（図６Ｃ）には、紫外線を照射しなかった場合（図６Ａ）と比較して新生血管形成、皮膚炎症反応と紅斑が著しく誘導された。しかしながら、ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスでは、紫外線照射前（図６Ｂ）と、照射後（図６Ｄ）に統計学的に意味のある差が無かった。つまり、紫外線ＵＶＢ照射により、誘導された野生型マウスにおいて（図６Ｂ）の新生血管形成がＥＣ−ＳＯＤ過発現マウス（図６Ｄ）において著しく抑制されることが分った。前記結果からＥＣ−ＳＯＤは新生血管形成を抑制する機能があることを推定することができた。
【００６９】
＜２−２＞ウェスタンブロット
前記＜実験例１＞で製造されたマウスより由来したＥＣ−ＳＯＤを過発現するマウスにおいて、血管新生過程を誘導する血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の発現程度をウェスタンブロットを利用して調査した。
前記実施例＜２−１＞で犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織又は細胞を抽出溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ１ ｐＨ８．０，５ｍＭのＥＤＴＡ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．５％のｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅナトリウム、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，０．１％のＳＤＳ，１ｍＭのＰＭＳＦ，１ｍＭのＮａＦ，１ｍＭのＮａＶＯ４さらに、プロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）で均質に抽出した。蛋白質濃度を決定する為に、バイオラド蛋白質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用した。前記蛋白質抽出物等を１０％のポリアクリルアミドゲルの上で分離し、ポリビニリデンフルオリドメンブレン（Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩ，米国）に移し、ポリビニリデンフルオリドメンブレンを５％の脱脂粉乳でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、米国）と、抗ベータアクチン抗体それぞれと共に培養した。前記膜を水洗した後、パーオキシダーゼが結合されている２次抗体ＩｇＧ（サンタクルズ、米国）と培養し再び水洗した後、ＥＣＬ検出キットを利用して発色した。
実験の結果、ＵＶＢ照射により野生型マウスにおいてＶＥＧＦの発現量が増加したものの、ＵＶＢ照射されたＥＣ−ＳＯＤ過発現されたマウスでは、ＶＥＧＦの発現が著しく減少された（図７）。前記の結果からＥＣ−ＳＯＤが血管新生抑制効果があることが再び確認できた。
【００７０】
＜２−３＞免疫組織化学的調査（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｍｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）
ＥＣ−ＳＯＤがＶＥＧＦの発現を抑制するか、否かを免疫組織化学的方法により再び確認した。
前記実施例＜２−１＞において、犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織を０．５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で作った４％のパラホルムアルデヒドで固定させた。流水で水洗後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋させ、５ｍｍの厚さで切片してガラススライドに付着した。前記切片をキシレン溶液を使用して脱パラフィンし、エタノールで含水した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。脱パラフィンされた組織切片に３％の過酸化水素を処理してブロッキングした。非特異的結合と背景染色を減らす為に、前記切片を１０％羊の血清で処理した。各組織スライドを抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体（１：５００，サンタクルズ、米国）で処理し、ストレプタビジン−バイオチンキット（ＬＳＡＢ，Ｄａｋｏ，ＣＡ，米国）を利用してアビジンーバイオチンーイムノパーオキシダーゼコンプレックス法で視覚化した。染色された組織を水洗した後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）で発色し、０．２％のメイアーヘマトキシリン（シグマ、ＭＯ，米国）で対照染色を行いその結果を図８に示した。
前記図８に示した通り、野生型マウスにおいて、ＵＶＢ照射によりＶＥＧＦが多く発現されたものの、ＥＣ−ＳＯＤが過発現されたマウスでは野生型マウスに比べてＶＥＧＦの発現が著しく抑制され、前記実施例＜１−２＞の結果と一致する結果を得た。前記結果等から、生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）で天然型ＥＣ−ＳＯＤが血管新生を誘導するＶＥＧＦ発現を抑制して血管新生を抑制する効果があることが分った。
【００７１】
＜２−４＞ＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおけるＭＭＰ−９の発現水準調査
細胞外の基質蛋白質を分解するＭＭＰ蛋白質は、ＶＥＧＦと共に、血管新生の重要調節因子である。特に、ＭＭＰ９はＶＥＧＦーＶＥＧＦＲシステムを介して腫瘍の血管新生過程を調節する因子として知られている（Ｂｅｒｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２：７３７−７４４，２０００）。従って、本発明者等はＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスにおいて、ＵＶＢ照射によるＭＭＰ−９発現水準を調査した。
前記実施例＜２−１＞で犠牲にしたＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスと、野生型マウスそれぞれの背皮膚組織に１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｌａｔｉｎ（１００ｍｇ／ｍｌ）を混合してＳＯＤーＰＡＧＥを行った後、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００で２０分間処理して水洗する。Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ反応溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＣａＣｌ２，５Ｍ ＮａＣｌ，０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２，２５％ＴＸ−１００，０．２％ ＮａＮ３）で３７℃にて１６時間反応させ、１時間染色した後、１時間脱色する。オーブンで１時間乾燥させ分析した結果を図９に示した。
前記図９に示した通り、紫外線照射する前の野生型マウスとＥＣ−ＳＯＤ過発現マウスのＭＭＰ−９の発現水準は別段の差がなかった。しかしながら、ＵＶＢ照射により、野生型マウスはＭＭＰ−９の発現が増加するものの、ＥＣ−ＳＯＤマウスの場合には、ＭＭＰ−９の発現が野生型マウスに比べて著しく抑制される。
前記結果から、生体内で天然型ＥＣ−ＳＯＤがＶＥＧＦの発現を抑制するばかりでなく、ＶＥＧＦーＶＥＧＦＲシステムを介した血管新生関連信号伝達に関与するＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を効果的に抑制することが分った。
【００７２】
＜実施例３＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生抑制効果
前記＜実施例１＞で分離、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を利用して、血管新生を抑制する効果があるか、否かを調査した。皮膚角質形成細胞（ＨａＣａＴ）を１８ｍｍカバースリップに１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分株する。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）と、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を１％添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）培地を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。付着された細胞が３０〜４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、牛胎児血清を取除いた後、２４時間培養した。細胞が５０〜６０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、ＥＣ−ＳＯＤ１０μｇで前処理する。３０分間、精製された組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質で処理した後、紫外線１００Ｊで処理し、２４時間後皮膚角質形成細胞株をパラホルムアルデヒドで固定して、免疫染色を実施した。固定された細胞を１０％正常羊血清（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回水洗した。ここにＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に対する免疫染色の為、兎抗ＶＥＧＦ抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓａｎｔａｃｕｚ，米国）でそれぞれ処理した後、４℃で１６時間以上反応させた。ＦＩＴＣが融合された抗二十日鼠ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｚｙｍｅｄ，米国）を利用して蛍光染色した後、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）で観察した。
その結果、図１０に示した通り、ＵＶＢを照射しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてＵＶＢを照射した場合（ＵＶＢ）ＶＥＧＦの発現が著しく増加された。さらに、ＵＶＢ照射した群に前記組換え蛋白質を処理した場合（ＥＣ−ＳＯＤ／ＵＶＢ）には、ＶＥＧＦの発現が著しく抑制されることを確認し、組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質により、血管新生が抑制されることが分った。
【００７３】
＜実施例４＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質によるＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響
＜４−１＞組換えＥＣ−ＳＯＤのＴ細胞増殖及び分化に及ぼす影響の確認
ＥＣ−ＳＯＤが免疫細胞であるＴ細胞に影響を及ぼすか、否かを調べるために、特異抗原（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）に反応するＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）形質転換マウス（ＤＯ．１１．１０．浦項工大成永哲教授より提供）を使用して下記の通り調査した。
ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の増殖に影響を与えるか否かを確認する為、前記形質転換したマウス脾臓より分離した細胞を、抗原であるオブアルブミンペプチド（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）と共に、７２時間培養し、最後の１６時間３Ｈと培養した後、放射線量を測定してＴ細胞の増殖を確認した。
その結果、図１１に示した通り、ＥＣ−ＳＯＤを添加しない群と、ＥＣ−ＳＯＤをそれぞれ１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ添加した群で放射線量の差が殆どなく、ＥＣ−ＳＯＤが殆どＴ細胞増殖に影響を与えないことが分った。
【００７４】
＜４−２＞組換えＥＣ−ＳＯＤのＴ細胞分化に及ぼす影響確認
Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさなくてもＴ細胞の分化に影響を及ぼし得る為、分化を知り得るＴ細胞のサイトカインを測定した。
脾臓細胞を抗原であるオブアルブミンペプチドと共に、４８時間培養後培養培地に生成されたＩＬ−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）サイトカインを測定した。測定方法は、ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）会社のＥＬＩＳＡ−ｋｉｔを利用して、製造社の指針に従い測定した。
その結果、図１２に示した通り、ＥＣ−ＳＯＤがＩＬ−４の形成を減少させることが分った。この結果により、ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の分化に影響を及ぼし得る（ｎｅｇ．：抗原が処理されない試験群、−：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）のみ処理された試験群、ｐ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＰＢＳに入っているＥＣ−ＳＯＤを一緒に処理した試験群、ＮＢ：抗原（Ｏｖａ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＳｏｄｉｕｍ ｂｏｒａｔｅに含まれているＥＣ−ＳＯＤを一緒に処理した試験群、全ての試験群は一緒に４８時間培養培地に入れて処理された）。
一方、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤＴ細胞分化に及ぼす影響を具体的に調べる為に、前記組換えＥＣ−ＳＯＤをマウスのＴ細胞に投与してＩＬ−４及びＩＮＦ−γ等のサイトカインの生成量を比較した。
具体的に特定抗原であるＯｖａペプチドのみを認知するＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子過発現マウスであるＤＯ １１．１０（浦項工大成永哲教授より提供）脾臓においてＣＤ４細胞をＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用して分離した。抗原提示細胞で正常マウスであるＢａｌｂ／ｃマウス脾臓細胞全体をγーｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎし、Ｏｖａペプチド（１μｇ／ｍｌ，Ｏｖａ３２３−３３９，ペプトロン社）及びＭＡＣＳで分離したＣＤ４ Ｔ細胞と共にＲＰＭＩ１６４０培地で１０％ＦＢＳを入れて培養した。培養過程で、前記＜実施例１＞で分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤを前記培養に与えた。７２時間後に培養液を採集してＥＬＩＳＡ（抗体：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養液内のＩＬ−４とＩＦＮ−γの量を定量した。
その結果、図１３に示した通り、前記＜実施例１＞で分離精製された組換えＥＣ−ＳＯＤは、Ｔ細胞において、Ｔｈｌ側のサイトカインであるＩＦＮ−γの形成を誘導し、Ｔｈ２側のサイトカインであるＩＬ−４の形成を抑制することが分った。従って、組換えＥＣ−ＳＯＤは免疫細胞に影響を及ぼし、特に、Ｔ細胞の分化に影響を及ぼすことが分った。
従って、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはアレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、Ｔｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できるとこが分った。
【００７５】
＜実施例５＞
天然型ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のＴ細胞分化に及ぼす影響
前記＜実験例１＞に記載された人間のＥＣ−ＳＯＤを過発現させたマウスにＯｖａ蛋白質とＴｈ１側に免疫を誘導する免疫補助剤ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｓｉｇｍａ社）を、Ｔｈ２側にはＡｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，Ｐｉｅｒｃｅ社）を混合して、それぞれ２５μｇずつ足裏と尻尾に免疫処理した後、１１日後に炎症が発生したリンパ球で細胞を分離し、ＥＣ−ＳＯＤが細胞増殖とサイトカイン生成に影響を及ぼすか否かを観察した。
前記細胞増殖には、リンパ球細胞５×１０５を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養し、培養３日後に同位元素である３Ｈを培養液にいれて、１６時間後に細胞内の同位元素含量をβ−ｃｏｕｎｔｅｒを利用して促進することにより細胞増殖を観察した。さらに、抗原特異的な反応であることを確認する為に、Ｏｖａ蛋白質の量を異にして細胞増殖を観察した。サイトカイン発現を観察する為に、リンパ球細胞５×１０６を４６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに培養し、７２時間後に培養液を採取して、ＥＬＩＳＡで培養液内のＩＬ−４とＩＦＮ−γの量を定量してその結果を図１４及び図１５に記載した。
前記図１４及び図１５に記載された通り、Ｔｈ１分化を誘導するＣＦＡを免疫補助剤として使用した場合、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より若干増加することを観察した。ＩＦＮ−γの発現が増加されたことを観察した。さらに、Ｔｈ２分化を誘導するＡｌｕｍを免疫補助剤として使用した時、リンパ細胞増殖が正常マウスのリンパ細胞より減少し、ＩＬ−４の発現が減少されたことを観察した。このような結果は、ＥＣ−ＳＯＤがＴ細胞の分化に影響を及ぼすものの、特に、主にＴｈ１側に分化させ、Ｔｈ２側への分化を抑制させることが分った。
従って、天然型ＥＣ−ＳＯＤは、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断してＴｈ１細胞への分化を誘導することにより、アレルギー疾患を治療又は予防に有用に使用できることが分った。
【００７６】
＜実施例６＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の転写因子活性阻害効果確認
紫外線によるＮＦ−κＢ活性化に対するＥＣ−ＳＯＤ効果を調べる為に、ＨａＣａＴ ｃｅｌｌを１４ｍｍ培養スライドに細胞を接種した後、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が１０％含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地で２４時間培養した。２４時間培養後、牛胎児血清が１％含まれたＤＭＥＭ培地で２４時間飢餓処理（ｓｔａｒｖａｔｉ ｏｎ）をした。処理後それぞれ１０μｇのＥＣ−ＳＯＤを３０分間処理した後（前処理）リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）を利用して細胞を３回水洗した後、ＮＦ−κＢ活性化を誘導する為に、１００Ｊ／ｍ２の紫外線を照射した。紫外線照射直後、細胞を再びリン酸緩衝液で水洗して牛胎児血清が１％含まれたＤＭＥＭ培地にＥＣ−ＳＯＤを前処理濃度と同じく処理して、さらに４時間培養した。以降、細胞をメタノールで５分間固定して免疫染色を実施した。このように固定された細胞を１０％正常羊血清（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）を利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回水洗した。 ここに、ＥＣ−ＳＯＤとＮＦ−κＢに対する免疫染色の為に、二十日鼠抗ＥＣ−ＳＯＤ 抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ ＥＣ−ＳＯＤ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｌａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ，韓国）と、兎抗ＮＦ−κＢ抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＮＦ−κＢ ａｎ ｔｉｂｏｄｙ，ｓａｎｔａｃｕｚ，米国）をそれぞれ処理し、４℃で１６時間反応させた。これをＴＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉ ｏｃｙａｎａｔｅ）が融合された抗兎ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉーｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｅｒｏｔｅｃ，英国）とＦＩＴＣが融合された、抗二十日鼠ＩｇＧ２次抗体（ａｎｔｉーｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｓｅ ｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｚｙｍｅｄ，米国）を利用して蛍光染色した後、ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ，米国）でカウンター染色した。
その結果、図１６（２００倍比率）に示した通り、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ，ＥＣ−ＳＯＤが形質感染されたＨａＣａＴ細胞にＵＶ処理を施していない群）において、ＮＦ−κＢは細胞質及び核で免疫染色がなされず、ＮＦ−κＢが不活性されたことが分った（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ）。ＵＶＢ群（ＨａＣａＴ細胞にＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）では、速やかに核（ｎｕｃｌｅａｒ）部位と核周囲（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ）部位で、ＮＦ−κＢが活性化されることが観察された（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）。これに比べて、ＥＣＳＯＤ／ＵＶＢ群（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌに本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を処理し、ＵＶＢを１００Ｊ／ｍ２で照射した群）では、ＵＶＢ群に比べて著しく核部位のＮＦ−κＢの活性化が阻害されることが観察された（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ）。このような結果により、本願発明の組換えＥＣ−ＳＯＤが転写因子であるＮＦ−κＢの活性化を抑制することが分った。
従って、本願発明の組換えＥＣ−ＳＯＤはＮＦ−κＢの非正常的な活性を防ぎ、アレルギー等の自己免疫疾患を予防又は治療に有用に使用できることが分った。
【００７７】
＜実施例７＞
組換えＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の人間肥満細胞脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）の減少効果確認
ＥＣ−ＳＯＤが人間肥満細胞の脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）にどのような影響を及ぼすか、否かを調べる為に、トルイジンブルーで染色した後、細胞１００個の内、脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
人間肥満細胞（ｓｅｍｉ，Ｈｕｍａｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ−１（ＨＭＣ−１），慶熙大学校金炯敏教授より提供）を１８×１８ｍｍカバースリーブに１×１０４ｃｅｌｌｓ／カバースリーブで分株した。培地は１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンと１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン１％で添加したＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この細胞は半付着細胞（ｓｅｍｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ）である為、付着された細胞と付着されない細胞の比率は４：６程度であるものの、付着された細胞が約３０−４０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）した時、ＥＣ−ＳＯＤ５μｇで、１時間前処理した後、カルシウムチャンネルであるＡ２３１８７ １μＭとホルボルミリステートアセテート（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）５０ｎＭで処理して、細胞内のカルシウム濃度を高めた。
１２時間後に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で人間肥満細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１０分間固定させた。リン酸緩衝溶液で洗浄し、酸性を帯びた（ｐＨ２．３）１％の塩水に溶解されている０．１％トルイジン（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ）ブルー溶液で２−３分間染色した。再び水で洗浄した後、９５％，１００％アルコールで脱水させ、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で固定させ、１００個の染色させた細胞のうち脱顆粒が起こった細胞数を数えてみた。
その結果、図１７Ａに示した通り、何等の処理もしていない人間肥満細胞群（対照群，ｃｏｎ）で脱顆粒された細胞数は１０個、ＥＣ−ＳＯＤを処理した群（ＥＣ−ＳＯＤ）で脱顆粒された細胞数は１６個であった。これに比べて肥満細胞を活性化させ、脱顆粒を誘導する為に、細胞内のカルシウム濃度を高めた群（Ａ＋Ｐ）では脱顆粒された細胞数が５５個で、５倍以上増加したものの、ＥＣ−ＳＯＤを前処理して細胞内のカルシウム濃度を高めた群（Ａ＋Ｐ＋ＥＣ−ＳＯＤ）では、脱顆粒された細胞数が２５個までさらに減少した。これはＥＣ−ＳＯＤの作用による活性酸素抑制により、脱顆粒減少が起こったことを示している。肥満細胞脱顆粒に対する顕微鏡写真は図１７Ｂの通りである。
従って、肥満細胞の脱顆粒により肥満細胞内にあったヒスタミン等の媒介物質がでてきて、アレルギー等の炎症反応が起るとの事実を考慮するに、本発明の組換えＥＣ−ＳＯＤは人間肥満細胞脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を減少させ、アレルギー疾患を予防又は治療に有用に使用でき得ることが分った。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質又はこれらをコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、血管新生を誘導するＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現を抑制して血管新生を抑制する効果が優れているので、血管新生による疾患の予防及び治療に有用に使用することができ、アレルギー疾患を誘発するＴｈ２細胞の過分化を遮断し、転写因子（ＮＦ−ｋＢ）活性を阻害し、人間肥満細胞の脱顆粒を減少させることにより、アレルギー疾患の予防及び治療に有用に使用できる。さらに、本発明のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法は前記のような活性を有するＥＣ−ＳＯＤを大量に生産することができ、産業的に有用に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項２】
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
前記血管新生による疾患は、癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれたことを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とすることを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第４項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項６】
前記血管新生による疾患は、癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれたことを特徴とする第４項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項７】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項８】
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項９】
前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー性鼻炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたことを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とすることを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第１０項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１２】
前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮 膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー皮膚炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたことを特徴とする第１０項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１３】
（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現するベクターにクローニングする段階；
（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養してＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現させる段階；
（ｄ）前記発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び
（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディングを誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
前記製造方法は（ｆ）ゲル濾過コラム（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）により分離及び生成する段階を追加して含むことを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は大腸菌であることを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１７】
前記（ｅ）段階の内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、蛋白質変性剤を含む緩衝溶液で内包体を溶解させ、金属親和性樹脂コラムに吸着させ、変性剤の濃度を低めながらリホールディングを誘導する方法により実施することを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
第１３項の方法により製造されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質。
【請求項１９】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を必要とする個体に有効な量で投与することを含む血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項２０】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生による治療剤製造の為の用途。
【請求項２１】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを必要とする個体に有効な量で投与することを含む血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項２２】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターの血管新生による疾患の治療剤製造の為の用途。
【請求項２３】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を必要とする個体に有効な量で投与することを含むアレルギー疾患の予防又は治療方法。
【請求項２４】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のアレルギー疾患の治療剤製造の為の用途。
【請求項２５】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを必要とする個体に有効な量で投与することを含むアレルギー疾患の予防又は治療方法。
【請求項２６】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターのアレルギー疾患の治療剤製造の為の用途。
【請求項１】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とする血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項２】
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
前記血管新生による疾患は、癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれたことを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とすることを特徴とする第１項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第４項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項６】
前記血管新生による疾患は、癌、糖尿病、リウマチ性関節炎、動脈硬化、血管腫、血管繊維腫、糖尿病性網膜症、早熟児の網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患、退化斑、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫及びニキビからなる群より選ばれたことを特徴とする第４項記載の血管新生による疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項７】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を有効成分とするアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項８】
前記ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質は配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項９】
前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー性鼻炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたことを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを有効成分とすることを特徴とする第７項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第１０項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１２】
前記アレルギー疾患はアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシショック（ａｎａｐｈｙｌａｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、アレルギー性皮 膚疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性アレルギー皮膚炎及び蕁麻疹からなる群より選ばれたことを特徴とする第１０項記載のアレルギー疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１３】
（ａ）ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドを発現するベクターにクローニングする段階；
（ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換する段階；
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養してＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を発現させる段階；
（ｄ）前記発現されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の内包体を収得する段階；及び
（ｅ）前記内包体の溶解及びリホールディングを誘導する段階を含むことを特徴とするＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれた塩基配列を有することを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
前記製造方法は（ｆ）ゲル濾過コラム（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）により分離及び生成する段階を追加して含むことを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は大腸菌であることを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１７】
前記（ｅ）段階の内包体の溶解及びリホールディングの誘導は、蛋白質変性剤を含む緩衝溶液で内包体を溶解させ、金属親和性樹脂コラムに吸着させ、変性剤の濃度を低めながらリホールディングを誘導する方法により実施することを特徴とする第１３項記載のＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
第１３項の方法により製造されたＥＣ−ＳＯＤ蛋白質。
【請求項１９】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を必要とする個体に有効な量で投与することを含む血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項２０】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の血管新生による治療剤製造の為の用途。
【請求項２１】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを必要とする個体に有効な量で投与することを含む血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項２２】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターの血管新生による疾患の治療剤製造の為の用途。
【請求項２３】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質を必要とする個体に有効な量で投与することを含むアレルギー疾患の予防又は治療方法。
【請求項２４】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質のアレルギー疾患の治療剤製造の為の用途。
【請求項２５】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを必要とする個体に有効な量で投与することを含むアレルギー疾患の予防又は治療方法。
【請求項２６】
ＥＣ−ＳＯＤ蛋白質をコーデイングするポリヌクレオチドが挿入されたベクターのアレルギー疾患の治療剤製造の為の用途。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５２２１５９（Ｐ２０１０−５２２１５９Ａ）
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５４４５４（Ｐ２００９−５５４４５４）
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００１６３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５０３９
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０９００４８３７）インダストリーアカデミック コーポレーション ファンデーション， ザ カトリックユニバーシティ オブ コリア (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００１６３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５０３９
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０９００４８３７）インダストリーアカデミック コーポレーション ファンデーション， ザ カトリックユニバーシティ オブ コリア (2)
【Ｆターム（参考）】
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