ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子多型検出用プライマー及びその用途
【課題】ＥＧＦＲ（上皮増殖因子レセプター）エクソン２１の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプライマー及びその用途を提供する。
【解決手段】特定塩基配列の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの遺伝子変異を検出するための多型検出用プライマーセット：（Ｐ１）特定塩基配列に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、（Ｐ２）特定塩基配列の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド、及び当該プライマーセットを用いてＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出する多型検出方法。
【解決手段】特定塩基配列の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの遺伝子変異を検出するための多型検出用プライマーセット：（Ｐ１）特定塩基配列に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、（Ｐ２）特定塩基配列の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド、及び当該プライマーセットを用いてＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出する多型検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子多型検出用プライマー及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、肺癌において重要な役割を果たすと考えられている。ＥＧＦＲの機能抑制を目的とする薬剤が、肺癌治療の分野で用いられている。このような薬剤としては、非小細胞肺癌患者の治療に用いられているゲフィチニブ又はエルロチニブ等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が知られている。これらの薬剤については、肺癌の他に腺癌への適用が試みられている。しかしながら、ある範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果が充分に得られないことがある。また別の範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して初期には反応があるものの、次第に薬剤の効果が期待された以上に上がらなくなることがある。
このため、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するために予測因子の探索が試みられ、ＥＧＦＲ遺伝子変異が重要な因子であることが見出されてきた。このような予測因子として、ＥＧＦＲエクソン２０のコドン７９０における変異（Ｔ７９０Ｍ）（特許文献１、非特許文献１）、エクソン１８のコドン７１９における変異（Ｇ７１９Ｘ）などが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
なかでも、ＥＧＦＲエクソン２１のコドン８５８におけるロイシンからアルギニンへの変異（ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ）は、ゲフィチニブの腫瘍縮小効果が高くなると考えられている変異である。肺癌におけるこのＥＧＦＲの変異割合は４５％程度と高いため、投薬前の予測因子として重要である。
ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを検出する技術としては、ダイレクトシークエンス法による検出（非特許文献２）又は、ＳＭＡＰ（SMart-Abplification Process) 法による検出方法（非特許文献３）が知られている。
【０００４】
一方、簡便に且つ、感度と信頼性に優れた変異検出方法としては、変異型プライマーと野生型（正常型）プライマーとを同一の反応系で用いて、変異型塩基を有する核酸配列を優先的に増幅させることを含む変異検出方法が知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５２９５３２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００１９６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Research, Vol.66, No.16, 2006, pp. 7854-7858
【非特許文献２】J. Clin. Oncology, Vol 23, No 11 (April 10), 2005: pp. 2513-2520
【非特許文献３】Clin Cancer Res 2007;Vol.13(17) September 1, 2007: pp.4974-4983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、実際に検査で用いられる試料は血漿又は血清由来の可溶性のＤＮＡが用いられており、このようなＤＮＡからの変異検出では高い特異性が要求されている。上記のダイレクトシークエンス法の場合、一般に、特異性は１０％程度と言われており、可溶性ＤＮＡからの変異検出を行うには充分に高い特異性とは言えない。一方、ＳＭＡＰ法は、感度の点では充分とも言えるが、プライマー等の材料の設計が容易ではなく、実際の操作が複雑である。
本発明は上記課題を意図してなされたものである。本発明は、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプローブ及びその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセット：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
［２］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する［１］に記載の多型検出用プライマーセット。
［３］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列である［１］又は［２］に記載の多型検出用プライマーセット。
［４］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基である［１］〜［３］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［５］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する［１］〜［４］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［６］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値より０．１℃〜２０℃高い［１］〜［５］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［７］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号１に示す塩基配列の領域よりも５’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む［１］〜［６］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［８］ 配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む［１］〜［７］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［９］ 前記［１］記載のＰ１オリゴヌクレオチドのみからなるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマー。
［１０］ 配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する［９］記載の多型検出用プライマー。
［１１］ 配列番号１の１７２７９２番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない１つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した３〜１０塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である［９］又は［１０］記載の多型検出用プライマー。
［１２］ 配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する［９］〜［１１］のいずれかに記載の多型検出用プライマー。
［１３］ （Ｉ） 核酸試料と、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドを含む［１］〜［８］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸配列を接触させて、該一本鎖増幅核酸配列と該プローブとのハイブリッドを得ること、（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価すること、及び、（Ｖ） 前記Ｔｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、を含む、ＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法。
［１４］ 前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う［１３］のいずれかに記載の多型検出方法。
［１５］ ［１３］又は［１４］の記載の多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。
［１６］ 配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチド及び、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドのいずれかである［１３］又は［１４］の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
［１７］ ［１］〜［８］のいずれか記載のプライマーセットを含むＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
［１８］ さらに、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒを検出可能なプローブを含む［１７］記載の試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプライマー及びその用途を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は核酸混合物の微分融解曲線の一例である。
【図２】検量線の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０％の核酸混合物の融解曲線である。
【図４】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０．１％の核酸混合物の融解曲線である。
【図５】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０．３％の核酸混合物の融解曲線である。
【図６】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量１％の核酸混合物の融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［プライマーセット］
本発明のプライマーセットは、配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１及びＰ２オリゴヌクレオチドであるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセットである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
【００１２】
前記プライマーセットは、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために用いられる配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基がＣであるＰ１オリゴヌクレオチド即ち、変異型プライマーと、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるＰ２オリゴヌクレオチド、即ち、野生型プライマーとを、Ｔｍ値がＰ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも高い相対関係又は、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長い相対関係を有するプライマーセットとして有する。これらの２種のオリゴヌクレオチドを、プライマーとして一反応系で使用することにより、簡便且つ高感度にＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出することができる。
【００１３】
本発明において「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」とは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における変異であって、コドン８５８における変異がアミノ酸としてロイシンからアルギニンへの変異であることを意味する。また本発明において「ＥＧＦＲエクソン２１の多型」とは、「ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ」を意味する。ＥＧＦＲエクソン２１の塩基配列とは、ＧｅｎｅＩＤ：１９５６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ０００００７（バージョン：ＮＣ０００００７．１３）の５５０８６７２４〜５５２７５０３０の配列（配列番号１）を意味する。本発明においてＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの変異とは、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｔ（チミン）」から「Ｇ（グアニン）」への変異をいう。
本明細書では、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の位置を、特に「変異部位」という。また、本明細書において「鋳型核酸配列」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型としてアニーリングする配列番号１に示す塩基配列の一部を意味する。
【００１４】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【００１５】
本明細書において「工程」との語には、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書における数値範囲の表示は、当該数値範囲の下限値として表示される数値を最小値として含み、当該数値範囲の上限値として表示される数値を最大値として含む範囲を示す。
組成物中のある成分の量について言及する場合において、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１６】
［プライマーセット］
本発明におけるプライマーセットは、少なくとも１種の変異型プライマーのＰ１オリゴヌクレオチドと少なくとも１種の野生型プライマーのＰ２オリゴヌクレオチドで構成される。
Ｐ１オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１７２７９２番目（変異部位）の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドである。
Ｐ２オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１７２７９２番目（変異部位）の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、Ｔｍ値の点で、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が高いという相関関係又は、塩基長の点でＰ１オリゴヌクレオチドの方が長いという相関関係を有することが必要である。これにより、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも全体として鋳型核酸配列に対する親和性が高くなり、鋳型核酸配列に対する結合性が高くなる。この結果、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて核酸増幅を行う際、同一反応系で用いた場合に、Ｐ１オリゴヌクレオチドによる増幅が優先的に行われることになり、変異型のＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便に感度よく検出することができる。
Ｔｍ値に関する相関関係と塩基長に関する相関関係とは、いずれか一方の相関関係が満たされていればよく、これらの両方が満たされていてもよい。
【００１８】
Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が高いＴｍ値を有する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとのＴｍ値の差は、特に制限されないが、例えば、０．１℃以上２０℃以下が好ましく、より好ましくは０．１℃以上１０℃以下であり、特に好ましくは０．１℃以上５℃以下である。この範囲であれば、例えば、擬陽性を抑制できる。本明細書におけるＴｍ値とは、１００％相補的な塩基配列同士からなるハイブリッドのＴｍ値を意味する。
【００１９】
ＧＣ含量の調節によってＴｍ値を調節する場合、例えば、ＧＣ含量が相対的に高い程、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。Ｐ１オリゴヌクレオチドのＧＣ含量を、Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも高く設定することが好ましい。また、プライマーの長さとＧＣ含量との両方によって、Ｔｍ値を設定することもできる。これらの他にも、例えば、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等を含む配列にすることで、例えば、これらを含まない配列よりも、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。
【００２０】
また、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が、Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長い場合には、鋳型となる配列に対して高い親和性を示す。このため、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとでは、Ｐ１オリゴヌクレオチドによる増幅が優先的に行われる。
【００２１】
上記のＴｍ値に関する相対関係又は塩基長に関する相対関係は、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方を、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドとすることによって、達成されることが好ましい。これにより、例えば、配列上の構成によってこれらの相関関係を調整可能に構築することができる。
なお、このような変異部位以外の相補的でない塩基の、オリゴヌクレオチドにおける挿入又は追加位置、塩基数、塩基の種類、等を選択することによって、当該オリゴヌクレオチドのＴｍ値又は塩基長を調整することが可能であるため、当該塩基はＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドのいずれに配置されてもよく、双方に配置されてもよい。
【００２２】
Ｐ１オリゴヌクレオチドの長さを長くするために塩基を追加する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドにおいて、上記の変異部位よりも５’末端側に追加することが好ましく、Ｐ１オリゴヌクレオチドの、鋳型核酸配列に相補的な領域よりも５’末端に追加することがより好ましい。これにより、例えば擬陽性を抑制することができる。
Ｐ１オリゴヌクレオチドをＰ２オリゴヌクレオチドよりも長く設定する場合、両者の長さの差は、特に制限されない。１塩基〜２０塩基であり得、好ましくは１塩基〜１０塩基であってもよく、より好ましくは１塩基〜５塩基であってもよい。
Ｐ１オリゴヌクレオチドの長さを長くするために追加される塩基は、配列番号１に示す塩基配列に相補的であってもよく、対応しないものであってもよい。配列番号１に示す塩基配列に相補的でない塩基の場合には、後述する付加配列に連続していてもいなくてもよい。
【００２３】
各オリゴヌクレオチドが「配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能である」とは、該オリゴヌクレオチドをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの増幅反応におけるプライマーとして使用した場合に、該オリゴヌクレオチドが変異部位を含む所定の領域にアニールして、変異部位を含む配列に相補的な配列を増幅し得ることを意味する。従って、各オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列に対して、変異部位を含む所定の領域に特異的にアニールできればよく、完全に相補的な配列であってもよいし、部分的に相補的な配列、又は、部分的に非相補的な塩基（ミスマッチ塩基）を有する配列であってもよい。ミスマッチ塩基とは、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ以外の核酸塩基ペアを意味し、具体的には、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｔ、Ａ−Ａ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｔのペアのことである。
例えば、上述したＴｍ値における関係又は塩基長における関係を妨げない限り、各オリゴヌクレオチドは、後述するように、部分的に相補的な配列又は部分的にミスマッチ塩基を有する配列であることが好ましい。このような配列を用いた場合には、例えば、変異の検出感度を高めると共に擬陽性を低く抑制できる。
【００２４】
各オリゴヌクレオチドの長さは、塩基長として１０〜５０であればよく、上述したＴｍ値における関係又は塩基長における関係を妨げない限り、１５〜４０であることが好ましく、１８〜２５であることがより好ましい。この範囲の長さであれば、例えば検出感度を高め、かつ擬陽性を効果的に抑制できる。この塩基長は、各オリゴヌクレオチドの他の構造上の特徴に併せて適宜調整することが可能である。
【００２５】
変異部位以外の相補的でない塩基としては、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列としてもよい。このような付加配列を設けることによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにそれぞれ付加され得る付加配列は、上述の通り、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない３〜１０塩基であってもよく、４〜９塩基であることが好ましく、５〜７塩基であることがより好ましい。この付加配列を５’末端に有することによって、例えば、感度を向上させると共に、各オリゴヌクレオチドが互いの鋳型核酸配列にアニールすることを効果的に抑制されて、又は増殖効率を高くすることができる。また、付加配列をこの範囲の長さにすることで、例えば、擬陽性を抑制でき、又は増幅効率を高めることができる。
【００２６】
付加配列は、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおいて、同一の長さであっても異なる長さであってもよく、同一の配列であっても異なる配列であってもよいが、異なる配列が好ましい。付加配列を構成する塩基配列としては、特に制限はないが、ＧＣ含量が４０〜６０％程度であることが好ましい。このＧＣ含量の範囲とすることによって、例えば、変異型又は野性型配列の増幅効率を維持することができる。またＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方に付加配列を付加する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドの付加配列のＧＣ含量を高くすることが好ましい。この場合には、変異型配列の検出感度を高くすることができる。
【００２７】
Ｐ１オリゴヌクレオチドは、その３’領域に、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの変異部位に対して相補的な塩基として、変異部位に対する相補的な塩基（「Ｃ」）を有すればよい。Ｐ１オリゴヌクレオチドでは、３’末端の１番目〜３番目のいずれかの塩基が、変異部位の塩基に対して相補的な塩基であることが好ましい。この変異部位の塩基に対する相補的な塩基をこのような位置に配置することによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。なお、本明細書において、３’末端の１番目の塩基とは、３’末端の塩基であり、３’末端の３番目の塩基とは、３’末端の塩基を１番目として、５’方向に向って３番目の塩基を意味する。
【００２８】
一方、Ｐ２オリゴヌクレオチドは、その３’領域に、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの変異部位に対して相補的な塩基として、野生型の塩基に対する相補的な塩基（「Ａ」）を有すればよい。Ｐ２オリゴヌクレオチドでは、３’末端の１番目〜３番目のいずれかの塩基が、変異部位の塩基に相補的な塩基であることが好ましい。この変異部位の塩基に対する相補的な塩基をこのような位置に配置した場合には、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
【００２９】
Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドにおける上記の変異部位に相補的である塩基の３'末端からの距離（位置）は、同一であってもよく、異なってもよい。Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおける変異部位に対する塩基の位置は、同一であることが好ましい。変異部位に対する塩基の位置をＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとで同一とした場合には、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
【００３０】
変異部位以外の相補的でない塩基としては、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は、連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基としてもよい。このようなミスマッチ塩基を導入することによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
このようなミスマッチ塩基の総数は、それぞれのオリゴヌクレオチドを構成する塩基の配列によって異なるが、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましく、３個以下であることが更に好ましい。この程度のミスマッチ塩基の数であれば、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できるという利点を有する。
【００３１】
また、このようなミスマッチ塩基は、上述した変異部位の位置よりも５’末端側に配置することが好ましく、中でも、変異部位の位置よりも５’末端側に３番目〜７番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、変異部位の位置よりも５’末端側に３〜５番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。この位置であれば、例えば、検出感度を高くする又は、擬陽性を抑制できる。
【００３２】
Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドが共にミスマッチ塩基を有する場合、Ｐ１オリゴヌクレオチド上のミスマッチ塩基の位置とＰ２オリゴヌクレオチド上のミスマッチ塩基の位置とは互いに対応しない位置であることが好ましい。ミスマッチ塩基の位置は互いに異なっていればよく、好ましくは、１塩基〜６塩基離れた位置に設定することができ、より好ましくは２塩基〜３塩基離れた位置に設定することができる。また、例えば、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方がミスマッチを有する場合、Ｐ１オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置の方がＰ２オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置よりも３’末端側にあることが好ましい。このようなＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置関係とした場合には、例えば擬陽性を抑制することができる。
なお、ミスマッチ塩基の種類としては、配列番号１に示す塩基配列に対応していない塩基であればよく、特に制限はないが、一般に、比較的結合力が弱い「Ａ」又は「Ｔ」であることが好ましい。「Ａ」又は「Ｔ」とすることによって、例えば、擬陽性を抑制することができる。
【００３３】
なお、ＥＧＦＲエクソン２１における変異部位周辺には、検出対象となる多型とは無関係の多型が存在するため、必要に応じて、この検出対象外の部位の塩基について、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方に、無関係な多型に基づく影響を無効化するための変異を追加してもよい。このような塩基を、本明細書では、「無効化変異」とする。
【００３４】
上述した付加配列は、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの双方に設けてもよく、いずれか一方に設けてもよい。また上述したミスマッチ塩基は、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの双方に設けてもよく、いずれか一方に設けてもよい。
【００３５】
本発明における多型検出用プライマーセットは、上述の通り、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドを少なくとも１種ずつ含むものであればよく、上述したＰ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドにおけるＴｍ値の関係又は塩基長の関係が全体として損なわれない限り、いずれか一方又はこれら双方を、２種以上含むものであってもよい。
【００３６】
本発明におけるＰ１オリゴヌクレオチドの一例を表１に示し、Ｐ２オリゴヌクレオチドの一例を表２に示す。なお、表１及び表２中「Ａ」又は「Ｔ」は、ミスマッチ塩基を意味し、５’末端側の大文字アルファベットは付加配列を意味する。表１及び表２における各３’末端側が、変異部位の塩基である。また、表１及び表２中「（ａ）」は無効化変異を意味する。なお、Ｔｍ値は、ＭｅｌｔＣａｌｃ（登録商標）で計算した値である。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
これらのＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、それぞれＴｍ値などに基づいて選択されて、用いられる。なお、上記配列のうち、Ｍｔ−Ｒ２及びＷｔ−Ｒ１は、いずれも変異部位を除き配列番号１の相補配列の塩基配列と同一であって所定の塩基長のオリゴヌクレオチドであり、それ以外は、いずれも変異部位以外に配列番号１の相補配列の塩基配列と相同的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドである。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、例えば、以下の組み合わせが挙げられる。中でも、同一長さの付加配列と、異なる位置のミスマッチ塩基を共に含むＮｏ．５〜Ｎｏ．７の組み合わせが、例えば感度及び擬陽性出現の抑制などの観点から好ましい。
【００４０】
【表３】
【００４１】
本発明の多型検出用プライマーセットは、変異プライマーであるＰ１オリゴヌクレオチドと野生型プライマーであるＰ２オリゴヌクレオチドの他に、配列番号１の塩基配列中におけるＰ１オリゴヌクレオチドまたはＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸配列よりも５’末端側の領域に対する相補配列に相補的なプライマー（Ｆプライマー）を更に含んでもよい。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドは共に、配列番号１に示す塩基配列に対して、所謂リバース側のプライマーを構成する。このため、Ｆプライマーは、所謂フォワード側のプライマーを構成し、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドに対する対のプライマーとして作用する。
【００４２】
Ｆプライマーは、検出目的の前記塩基部位とは異なる領域にアニーリングするプライマーであるため、前記塩基部位が変異型であるか正常型であるかに関わらず、鋳型核酸を増幅できる。これにより、Ｆプライマーを共存させることで、鋳型核酸の本来の配列を維持した増幅産物をあわせて得ることができ、より一層、変異検出の信頼性を向上することができる。
【００４３】
Ｆプライマーの長さは、特に制限されないが、通常、１０〜５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０塩基であり、特に好ましくは１６〜３５塩基である。また、Ｆプライマーは、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドがアニーリングする鋳型核酸配列における変異部位よりも５’側の領域に対する相補配列にアニーリングできればよく、その配列は特に制限されず、従来公知の一般的なプライマーの設計方法に従って設計できる。
【００４４】
［多型検出用プライマー］
また、本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１多型検出用プライマーは、上述したプライマーセットにおける前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのいずれか一方のみを含むものである。このプライマーは、各オリゴヌクレオチドは、１種のみオリゴヌクレオチドを有してもよく、例えば、長さ、ミスマッチ塩基の位置、ＧＣ含量などが異なる２種以上のオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
多型検出用プライマーとしてのＰ１オリゴヌクレオチド又はＰ２オリゴヌクレオチドについては、個々のオリゴヌクレオチドに関して前述した事項を、そのまま適用可能である。
【００４５】
［多型検出方法］
本発明におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出方法は、（Ｉ） 核酸試料と、前記プライマーセットとを接触させ、前記核酸を鋳型として増幅を行うこと、
（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブと、前記増幅により得られた一本鎖核酸とを接触させて、該一本鎖核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍを評価すること、及び、
（Ｖ） 前記Ｔｍに基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在を確認することまたはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む。
本多型検出方法では、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとを含む前記プライマーセットを同一試料に対して用いることにより、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅される。増幅で得られた核酸は、検出用プローブを使用したハイブリダイゼーション工程並びに、Ｔｍ値による評価工程及び多型の評価工程に付される。これにより、試料中の核酸における変異型配列を有する核酸の割合が少量であっても、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅され、感度よく変異型配列を有する核酸を検出し、多型の確認及び／又は評価を行うことができる。
【００４６】
本多型検出方法において用いられる核酸試料は、鋳型となる核酸を含む試料であればよく、特に制限されない。例えば、生体試料由来の核酸を含む試料があげられる。前記生体試料としては、例えば、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪および毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等、ならびに、それらの懸濁波等があげられる。また、前述のように、生体試料由来の核酸を鋳型として核酸増幅法を行った反応液を核酸試料とし、前記反応液に含まれる増幅産物を鋳型核酸としてもよい。
【００４７】
なお、試料は、例えば、目的の塩基部位が変異型および正常型のいずれを示すか不明である核酸を含む試料、変異型配列を有する核酸と正常型配列を有する核酸とを含むことが既知である試料、変異型配列を有する核酸と正常型配列を有する核酸とのいずれかを含む可能性のある試料等のいずれであってもよい。試料中の核酸、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の由来は、制限されない。例えば、各種癌細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等が挙げられる。特に前記方法は、変異型核酸と正常型核酸とを有する試料への適用が好ましい。例えば、白血病等の各種癌細胞等の生体試料、具体例としては、血液中に遊離する細胞等に適用することが好ましい。血液中に含まれる癌化した細胞には、変異型核酸を有する細胞と、正常型核酸を有する細胞とが含まれるため、このような細胞由来の核酸試料に対して、本多型検出方法を適用することは、要求される感度を実現できる点で、好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００４８】
前述のような生体試料由来の核酸は、例えば、従来公知の方法によって、生体試料から単離できる。全血からのゲノムＤＮＡの単離には、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００４９】
鋳型となる試料中の核酸は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。鋳型核酸としては、例えば、ＤＮＡ、および、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等が挙げられる。また、鋳型核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写−ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物が挙げられる。これらの増幅産物を、本発明における鋳型核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【００５０】
増幅工程では、核酸を含有する試料と、プライマーセットとを接触させて、核酸試料中の核酸を鋳型とした核酸の増幅を行う。このとき、プライマーセット中のＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、同一の試料（同一の反応液）中で、それぞれ鋳型核酸配列にアニールし、核酸の増幅が開始される。
【００５１】
増幅工程における核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５２】
増幅工程において、増幅反応の反応系（例えば、反応液）における核酸試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記核酸試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されない。例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。
【００５３】
また、後述する変異の検出において、例えば、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応系における全血試料等の生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈穀物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
【００５４】
また増幅反応の開始前に、反応系にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物または濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。
前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されない。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられる。これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
【００５５】
増幅工程における増幅について、ＰＣＲ法を例にあげて説明するが、本発明は、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。例えば、ＷＯ２０１０／００１９６９に開示されている条件及び方法を好ましく用いることができる。
【００５６】
まず、鋳型核酸と前述の各種プライマーとを含むＰＣＲ反応液を調製する。前記ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されないが、変異型プライマー（Ｐ１オリゴヌクレオチド）は、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。正常型プライマー（Ｐ２オリゴヌクレオチド）は、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌである。変異型プライマー（Ｐ１）と野生型プライマー（Ｐ２）とのモル比（Ｐ１：Ｐ２）は、例えば、１：０．００１〜１：１０であることが好ましく、より好ましくは、１：０．０１〜１：２であり、特に好ましくは、１：０．１〜１：１である。
このような各プライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができ、また擬陽性を抑制することができる。
【００５７】
変異型Ｐ１オリゴヌクレオチドと野生型Ｐ２オリゴヌクレオチドとに加えて、Ｆプライマーを併用する場合、Ｆプライマーは、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。変異型プライマー（Ｐ１）とプライマー（Ｆ）とのモル比（Ｐ１：Ｆ）は、例えば、１：０．００１〜１：１０であることが好ましく、より好ましくは、１：０．０１〜１：２であり、特に好ましくは、１：０．１〜１：１である。
このようなＦプライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができる。
【００５８】
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチドおよび溶媒等が挙げられる。前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【００５９】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏ９１／０９９５０）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９２／９６８９）（Pfu DNA polymerase：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ０４５５４３０）（商標Vent：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
【００６０】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ等）が挙げられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。また、ＰＣＲ反応液には、更に、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等を含んでいてもよい。
【００６１】
ＰＣＲは、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）プライマーの鋳型核酸配列へのアニーリング、（３）ポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（ポリメラーゼ反応）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程では、例えば、９０〜９９℃、１〜１２０秒が好ましく、９２〜９５℃、１〜６０秒がより好ましく、アニーリング工程では、例えば４０℃〜７０℃、１〜３００秒が好ましく、５０〜７０℃、５〜６０秒がより好ましく、また、伸長工程では、例えば、５０〜８０℃、１〜３００秒が好ましく、５０〜８０℃、５〜６０秒がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【００６２】
ハイブリダイゼーション工程では、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブと、増幅工程で得られた一本鎖増幅核酸とを接触させて、これらのハイブリッドが得られる。
ここで用いられるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブは、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基（変異部位）に対応する塩基を含む領域の核酸配列、又は、この核酸配列に相補的な配列に対してハイブリダイズ可能な配列を有すればよい。
プローブの長さには、特に制限はないが、５〜５０ｍｅｒであることが好ましく、１０〜３０ｍｅｒであることがより好ましい。プローブの長さがこのような範囲であれば、例えば検出感度を高めることができる。
【００６３】
プローブには、変異部位の塩基に相補的な塩基が含まれていれば特に制限はない。変異部位の塩基に相補的な塩基が、プローブの５’末端から数えて４番目〜１５番目に位置していることが好ましい。プローブにおける変異部位に対する塩基の位置がこのような位置であれば、例えば、検出感度を高めることができる。
【００６４】
プローブの配列には、制限はない。プローブの配列における変異部位は、変異型に対応する塩基としてもよく、野生型に対応させた塩基としてもよい。多型検出用プローブの配列としては、変異型に対応した塩基を有する配列であることが好ましく、この変異部位の塩基を除いて、配列番号１に示す塩基配列と相補的な配列に対して、９０％〜１００％同じ配列であることがより好ましく、１００％同一であることが特に好ましい。多型検出用プローブの配列を変異型に対応した塩基とすることによって、例えば、検出感度を高めることができる。
また、多型検出用プローブを増幅工程でプライマーと共に存在させて使用する場合には、ＤＮＡポリメラーゼの反応対象となってプローブ自体の伸長を予防するために、３’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、プローブの３’末端に更にリン酸基が付加されていることが好ましい。
【００６５】
多型検出用プローブは、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、蛍光色素で標識され、単独（相補配列にハイブリダイズしていないとき）で蛍光を示し且つハイブリッド形成（相補配列にハイブリダイズしているとき）により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが挙げられる。
【００６６】
このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。前記プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）もしくは５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ （登録商標）として知られている。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出目的配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。また、前記標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【００６７】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法又はＲＦＬＰ法などを挙げることができる。
【００６８】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ （商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ （商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ （検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
【００６９】
また、前記プローブが、蛍光色素等の標識化物質で標識化された標識化プローブである場合、前記標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節することができる等の利点が得られる。この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。
【００７０】
多型検出用プローブの反応系への添加のタイミングは、特に制限されない。例えば、増幅反応前、増幅工程の開始時、増幅反応途中および増幅反応後のいずれであってもよい。増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションを連続的に行うことができるため好ましい。即ち、増幅を行うこととハイブリッドを得ることとは、同時に行うことが、例えば、処理効率の観点から好ましい。
反応系における多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されない。例えば、前記プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００７１】
多型検出用プローブと、一本鎖増幅核酸とのハイブリッドを得るために適用されるハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖核酸を変性して一本鎖核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。また、解離した一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば、４０℃〜５０℃である。
なお、ここで「一本鎖増幅核酸」の範囲には、試験対象となっている当初の核酸試料における一本鎖核酸も包含される。
【００７２】
測定工程では、ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する。
前記増幅一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であることが好ましい。標識物質のシグナル測定とすることによって、例えば検出感度を高めることができる。
【００７３】
標識化ブローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出目的配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出目的配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の観察ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
【００７４】
ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、前記標識化プローブを使用する場合、前記シグナル値は、例えば、前記標識化プローブの標識物質に応じた条件で測定することができる。
【００７５】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５°Ｃであり、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００７６】
Ｔｍ値評価工程では、測定工程で得られたシグナルの変動を解析してＴｍ値を決定し、評価する。具体的には、得られた蛍光強度から、例えば、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、変化量を（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）とする場合は、例えば、最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７７】
Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http:/www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、隣接法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。
【００７８】
多型評価工程では、決定されたＴｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価する。
Ｔｍ値測定工程で得られたＴｍ値からは、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒに相当する配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基の種類、すなわち、変異型または野生型等の遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、―塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、目的の塩基部位における遺伝子型を決定することができる。
【００７９】
例えば、目的の塩基部位の塩基を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む検出目的配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、―塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、目的塩基は正常型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、例えば、変異型を示す核酸と、正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。
【００８０】
また、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。つまり、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００８１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８２】
ＥＧＦＲエクソン２１における変異型及び野生型の核酸配列に存在比を定量的に測定するには、予め、変異型及び野生型それぞれの核酸配列を作製して得られた検量線を作成し、それに基づいてそれぞれの存在比を評価することが好ましい。
【００８３】
検量線の作成の一例について以下に説明する。
まず、例えば、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図（Ｂ）に温度と検出信号の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。
【００８４】
ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。
【００８５】
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
【００８６】
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
【００８７】
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ） である。
【００８８】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。例えば、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線とすることができる。図２に、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線の一例を示す。なお、面積比はＳＷ／ＳＭで定めてもよい。
【００８９】
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００９０】
また、野生型及び変異型の各ピークの存在に従って存在比を計算することができるが、単にピークの存在を確認することによって、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の存在（有無）を評価してもよい。
【００９１】
［ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法］
本発明のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法は、前記多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること（遺伝子多型検出工程）、及び、前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること（薬効評価工程）、を含む。
前記多型検出方法では、本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセットを用いて、感度よく且つ簡便にＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを検出するので、ＥＧＦＲエクソン２１におけるこの多型に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【００９２】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法における遺伝子多型検出工程については、上述したＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法に関して記述した内容をそのまま適用することができる。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼは、ＥＧＦＲエクソン２１における多型によって反応性が異なることが知られている。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子が野生型である場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による腫瘍縮小効果が期待できると評価することができる。
このように、前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法を適用することによって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果に対する予測を、信頼性高く且つ簡便に行うことができる。
【００９３】
［キット］
本発明のＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するためのキットは、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを含む。
このキットには、ＥＧＦＲ遺伝子における多型を簡便にかつ感度よく検出するために使用可能な上述したプライマーセットが含まれるので、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の検出をより簡便に行うことができる。
【００９４】
プライマーセットを構成するＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。なお、本明細書における「異なる容器」とは、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとが非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも、独立して取扱い可能な個別の容器でなくてもよい。
【００９５】
本キットには、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸配列よりも５’末端側の領域に対する相補配列に相補的なプライマー、即ち、Ｆプライマーを更に含んでもよい。このＦプライマーについては、前述したＦプライマーに関する事項をそのまま適用することができる。これにより、より感度欲ＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するためのプライマーをキットに含むことができるので、感度よい多型の検出をより簡便に行うことができる。
Ｆプライマーは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
【００９６】
本キットには、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブを更に含んでもよい。この多型検出用プローブについては、前記多型検出用プローブに関する事項をそのまま適用することができる。これにより、被検体試料における多型検出を行う際、プライマーセットによる核酸増幅と、プローブによる検出とを同時に又は連続して簡便に行うことができる。
多型検出用プローブは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
【００９７】
本キットには、上記の他に、増幅に必要なポリメラーゼ等の試薬又は緩衝液、ハイブリダイズのために必要な試薬又は緩衝液、検体試料を希釈するための希釈剤等を含んでもよい。更に、本キットには、キットに含まれる又は、追加的に含むことが可能な各種の試薬に関する使用説明書等を含むことが好ましい。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」又は「％」は質量基準である。
【００９９】
＜評価例１＞
［実施例１］
ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために、配列番号１の１７２６４３〜１７２９４１番目の塩基配列で、１７２７９２番目の塩基がＧまたはＴである塩基配列を含むプラスミドを、上記塩基配列以外の部位で制限酵素処理し、リニアライズしたものを準備した。得られたプラスミド、即ち、配列番号１に示される塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｇ」である変異型プラスミド（以下、「ｍｔ」という）と、配列番号１に示される塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｔ」である野生型プラスミド（以下、（以下、「ｗｔ」という）を、所定の割合で混合し、複数の核酸試料を調製した。この複数の核酸試料におけるｍｔ含有割合は、それぞれ、３％、１％及び０％とした。
【０１００】
ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために、配列番号１に示される配列の１７２７９２〜１７２８０７番目に相補的な配列であって、１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基として「Ｃ」を含む配列に対する変異型プライマー（以下、「Ｍｔプライマー」という）ｍｔ−Ｒ２（表１又は表５参照）と、配列番号１に示される配列の１７２７９２〜１７２８０７番目に相補的な配列であって、１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基として「Ａ」を含む配列に対する野生型プライマー（以下、（以下、「Ｗｔプライマー」という）ｗｔ−Ｒ１（表２又は表５参照）を準備した。
【０１０１】
チューブ内に、表４に示すように、核酸試料１μＬ（２×１０４ ｃｏｐｉｅｓ／ｔｅｓｔ）と、Ｍｔプライマー及びＷｔプライマーとを含む各ＰＣＲ反応液２４μＬとを添加し、サーマルサイクラー（商品名Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒及び６０℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。
【０１０２】
さらに、前記ＰＣＲ反応液が入ったチューブを、ｉ−ｄｅｎｓｙ（アークレイ社製）に移し、９５℃１秒、４０℃で６０秒処理した後、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から７５℃まで加熱し、その間の経時的な蛍光強度を測定しＴｍ解析を行った。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いたので、励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍで蛍光強度の変化を測定した。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
プローブには、配列番号１の１７２７８２〜１７２７９８番目の配列を認識し、３’末端に標識を有する３Ｔ−ＥＧＦＲ−８５８−Ｒ２（ttggccCgcccaaaatc-(TAMRA)：配列番号２２。「Ｃ」は変異部位の塩基に相補的な塩基）を用いた。Ｆプライマー（フォワードプライマー）としては、配列番号１の１７２７３９〜１７２７６４番目の配列に対応するＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒ−Ｆ２（aggaacgtactggtgaaaacaccgc：配列番号２３）を用いた。鋳型核酸としては、ＥＧＦＲエクソン２１の野生型ＤＮＡ（ロッシュ社製、ヒトゲノム）と、プラスミド（ｍｔを１％又は３％の割合で混合したもの）を用いた。
【０１０５】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示すグラフを得た。Ｔｍ値は実測値より求め、解析の開始・終了温度はＴｍ値の±５℃として、面積解析法により解析して、下記の式に従って、面積比としての変異型増幅産物と野生型増幅産物の存在比率を求めた。結果を表５に示す。
面積比＝（ｍｔの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積)／（Ｗｔの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積）
【０１０６】
実施例２〜８
変異型プライマーと野生型プライマーを表５に示される組み合わせに変更した以外は、実施例１と同様にして、実施例２〜８のプライマーセットによる多型検出を行った。結果を表５に示す。
比較例１
野生型プライマーを使用せず、変異型プライマーのみを用いて処方を水の量で調整した以外は、実施例１と同様にして多型検出を行った。結果を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５に示されるように、変異型プライマーのみを用いた多型検出よりも、塩基長又はＴｍ値が異なる変異型プライマーと野生型プライマーの双方を一反応系で用いた多型検出の方が、変異０％、１％及び３％をそれぞれ含有量依存的に検出可能であり、本実施例のプライマーセットを用いることによって、核酸試料中の多型、即ち、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを高い感度で検出可能であることがわかる。
特に、付加配列に加えてミスマッチ変異も有する変異型プライマーを、野生型プライマーと共に用いることによって（実施例５〜７）、ｍｔ０％における擬陽性を抑えることができ、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの検出において、感度に加えて擬陽性抑制も良好であることがわかる。
【０１０９】
＜評価例２＞
実施例５のプライマーセットを用いて、ｍｔ０％、０．１％、０．３％及び１％の試料に対する多型検出を行った。
実施例１で作成した各プラスミド混合物を鋳型核酸として、鋳型核酸５，０００コピー／μＬ（２０，０００ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）のものを使用し、かつ、実施例５のプライマーセットを用いた。全自動ＳＮＰｓ検査装置（ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）と、ＤＮＡポリメラーゼを含有するｉ−ｄｅｎｓｙ Ｐａｃｋ ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ（アークレイ社製）を用いてＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。ＰＣＲ反応条件及びＴｍ解析条件は、評価例１と同様としてＴｍ値解析を行った。Ｔｍ値解析により得られたグラフを図３〜６に示す。なお、図３〜図６において縦軸は蛍光強度の温度微分値、横軸は温度をそれぞれ示す。
図３〜図６に示されるように、実施例５のプライマーセットを用いて多型検出を行うと、６０℃付近の変異型のピークがｍｔ含有量に応じた大きさのピークとして確認できる。従って、実施例５のプライマーセットを用いることによって、ｍｔ含量１％以下であっても変異型の存在比に応じた感度で多型を検出することができることがわかる。
【０１１０】
このように本発明によれば、簡便に且つ高感度にＥＧＦＲエクソン２１における多型を検出することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子多型検出用プライマー及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、肺癌において重要な役割を果たすと考えられている。ＥＧＦＲの機能抑制を目的とする薬剤が、肺癌治療の分野で用いられている。このような薬剤としては、非小細胞肺癌患者の治療に用いられているゲフィチニブ又はエルロチニブ等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が知られている。これらの薬剤については、肺癌の他に腺癌への適用が試みられている。しかしながら、ある範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果が充分に得られないことがある。また別の範囲の患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して初期には反応があるものの、次第に薬剤の効果が期待された以上に上がらなくなることがある。
このため、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するために予測因子の探索が試みられ、ＥＧＦＲ遺伝子変異が重要な因子であることが見出されてきた。このような予測因子として、ＥＧＦＲエクソン２０のコドン７９０における変異（Ｔ７９０Ｍ）（特許文献１、非特許文献１）、エクソン１８のコドン７１９における変異（Ｇ７１９Ｘ）などが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
なかでも、ＥＧＦＲエクソン２１のコドン８５８におけるロイシンからアルギニンへの変異（ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ）は、ゲフィチニブの腫瘍縮小効果が高くなると考えられている変異である。肺癌におけるこのＥＧＦＲの変異割合は４５％程度と高いため、投薬前の予測因子として重要である。
ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを検出する技術としては、ダイレクトシークエンス法による検出（非特許文献２）又は、ＳＭＡＰ（SMart-Abplification Process) 法による検出方法（非特許文献３）が知られている。
【０００４】
一方、簡便に且つ、感度と信頼性に優れた変異検出方法としては、変異型プライマーと野生型（正常型）プライマーとを同一の反応系で用いて、変異型塩基を有する核酸配列を優先的に増幅させることを含む変異検出方法が知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５２９５３２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００１９６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Research, Vol.66, No.16, 2006, pp. 7854-7858
【非特許文献２】J. Clin. Oncology, Vol 23, No 11 (April 10), 2005: pp. 2513-2520
【非特許文献３】Clin Cancer Res 2007;Vol.13(17) September 1, 2007: pp.4974-4983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、実際に検査で用いられる試料は血漿又は血清由来の可溶性のＤＮＡが用いられており、このようなＤＮＡからの変異検出では高い特異性が要求されている。上記のダイレクトシークエンス法の場合、一般に、特異性は１０％程度と言われており、可溶性ＤＮＡからの変異検出を行うには充分に高い特異性とは言えない。一方、ＳＭＡＰ法は、感度の点では充分とも言えるが、プライマー等の材料の設計が容易ではなく、実際の操作が複雑である。
本発明は上記課題を意図してなされたものである。本発明は、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプローブ及びその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセット：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
［２］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する［１］に記載の多型検出用プライマーセット。
［３］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列である［１］又は［２］に記載の多型検出用プライマーセット。
［４］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基である［１］〜［３］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［５］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する［１］〜［４］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［６］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値より０．１℃〜２０℃高い［１］〜［５］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［７］ 前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号１に示す塩基配列の領域よりも５’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む［１］〜［６］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［８］ 配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む［１］〜［７］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
［９］ 前記［１］記載のＰ１オリゴヌクレオチドのみからなるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマー。
［１０］ 配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する［９］記載の多型検出用プライマー。
［１１］ 配列番号１の１７２７９２番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない１つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した３〜１０塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である［９］又は［１０］記載の多型検出用プライマー。
［１２］ 配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する［９］〜［１１］のいずれかに記載の多型検出用プライマー。
［１３］ （Ｉ） 核酸試料と、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドを含む［１］〜［８］のいずれかに記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸配列を接触させて、該一本鎖増幅核酸配列と該プローブとのハイブリッドを得ること、（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価すること、及び、（Ｖ） 前記Ｔｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、を含む、ＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法。
［１４］ 前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う［１３］のいずれかに記載の多型検出方法。
［１５］ ［１３］又は［１４］の記載の多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。
［１６］ 配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチド及び、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドのいずれかである［１３］又は［１４］の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
［１７］ ［１］〜［８］のいずれか記載のプライマーセットを含むＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
［１８］ さらに、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒを検出可能なプローブを含む［１７］記載の試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプライマー及びその用途を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は核酸混合物の微分融解曲線の一例である。
【図２】検量線の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０％の核酸混合物の融解曲線である。
【図４】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０．１％の核酸混合物の融解曲線である。
【図５】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量０．３％の核酸混合物の融解曲線である。
【図６】本発明の実施例にかかるプライマーセットを用いて得られた変異含量１％の核酸混合物の融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［プライマーセット］
本発明のプライマーセットは、配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１及びＰ２オリゴヌクレオチドであるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセットである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
【００１２】
前記プライマーセットは、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために用いられる配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基がＣであるＰ１オリゴヌクレオチド即ち、変異型プライマーと、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるＰ２オリゴヌクレオチド、即ち、野生型プライマーとを、Ｔｍ値がＰ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも高い相対関係又は、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長い相対関係を有するプライマーセットとして有する。これらの２種のオリゴヌクレオチドを、プライマーとして一反応系で使用することにより、簡便且つ高感度にＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出することができる。
【００１３】
本発明において「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」とは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における変異であって、コドン８５８における変異がアミノ酸としてロイシンからアルギニンへの変異であることを意味する。また本発明において「ＥＧＦＲエクソン２１の多型」とは、「ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒ」を意味する。ＥＧＦＲエクソン２１の塩基配列とは、ＧｅｎｅＩＤ：１９５６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ０００００７（バージョン：ＮＣ０００００７．１３）の５５０８６７２４〜５５２７５０３０の配列（配列番号１）を意味する。本発明においてＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの変異とは、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｔ（チミン）」から「Ｇ（グアニン）」への変異をいう。
本明細書では、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の位置を、特に「変異部位」という。また、本明細書において「鋳型核酸配列」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型としてアニーリングする配列番号１に示す塩基配列の一部を意味する。
【００１４】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【００１５】
本明細書において「工程」との語には、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書における数値範囲の表示は、当該数値範囲の下限値として表示される数値を最小値として含み、当該数値範囲の上限値として表示される数値を最大値として含む範囲を示す。
組成物中のある成分の量について言及する場合において、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１６】
［プライマーセット］
本発明におけるプライマーセットは、少なくとも１種の変異型プライマーのＰ１オリゴヌクレオチドと少なくとも１種の野生型プライマーのＰ２オリゴヌクレオチドで構成される。
Ｐ１オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１７２７９２番目（変異部位）の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドである。
Ｐ２オリゴヌクレオチドは、配列番号１の１７２７９２番目（変異部位）の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、Ｔｍ値の点で、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が高いという相関関係又は、塩基長の点でＰ１オリゴヌクレオチドの方が長いという相関関係を有することが必要である。これにより、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方がＰ２オリゴヌクレオチドよりも全体として鋳型核酸配列に対する親和性が高くなり、鋳型核酸配列に対する結合性が高くなる。この結果、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて核酸増幅を行う際、同一反応系で用いた場合に、Ｐ１オリゴヌクレオチドによる増幅が優先的に行われることになり、変異型のＥＧＦＲエクソン２１の多型を簡便に感度よく検出することができる。
Ｔｍ値に関する相関関係と塩基長に関する相関関係とは、いずれか一方の相関関係が満たされていればよく、これらの両方が満たされていてもよい。
【００１８】
Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が高いＴｍ値を有する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとのＴｍ値の差は、特に制限されないが、例えば、０．１℃以上２０℃以下が好ましく、より好ましくは０．１℃以上１０℃以下であり、特に好ましくは０．１℃以上５℃以下である。この範囲であれば、例えば、擬陽性を抑制できる。本明細書におけるＴｍ値とは、１００％相補的な塩基配列同士からなるハイブリッドのＴｍ値を意味する。
【００１９】
ＧＣ含量の調節によってＴｍ値を調節する場合、例えば、ＧＣ含量が相対的に高い程、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。Ｐ１オリゴヌクレオチドのＧＣ含量を、Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも高く設定することが好ましい。また、プライマーの長さとＧＣ含量との両方によって、Ｔｍ値を設定することもできる。これらの他にも、例えば、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等を含む配列にすることで、例えば、これらを含まない配列よりも、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。
【００２０】
また、Ｐ１オリゴヌクレオチドの方が、Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長い場合には、鋳型となる配列に対して高い親和性を示す。このため、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとでは、Ｐ１オリゴヌクレオチドによる増幅が優先的に行われる。
【００２１】
上記のＴｍ値に関する相対関係又は塩基長に関する相対関係は、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方を、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドとすることによって、達成されることが好ましい。これにより、例えば、配列上の構成によってこれらの相関関係を調整可能に構築することができる。
なお、このような変異部位以外の相補的でない塩基の、オリゴヌクレオチドにおける挿入又は追加位置、塩基数、塩基の種類、等を選択することによって、当該オリゴヌクレオチドのＴｍ値又は塩基長を調整することが可能であるため、当該塩基はＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドのいずれに配置されてもよく、双方に配置されてもよい。
【００２２】
Ｐ１オリゴヌクレオチドの長さを長くするために塩基を追加する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドにおいて、上記の変異部位よりも５’末端側に追加することが好ましく、Ｐ１オリゴヌクレオチドの、鋳型核酸配列に相補的な領域よりも５’末端に追加することがより好ましい。これにより、例えば擬陽性を抑制することができる。
Ｐ１オリゴヌクレオチドをＰ２オリゴヌクレオチドよりも長く設定する場合、両者の長さの差は、特に制限されない。１塩基〜２０塩基であり得、好ましくは１塩基〜１０塩基であってもよく、より好ましくは１塩基〜５塩基であってもよい。
Ｐ１オリゴヌクレオチドの長さを長くするために追加される塩基は、配列番号１に示す塩基配列に相補的であってもよく、対応しないものであってもよい。配列番号１に示す塩基配列に相補的でない塩基の場合には、後述する付加配列に連続していてもいなくてもよい。
【００２３】
各オリゴヌクレオチドが「配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能である」とは、該オリゴヌクレオチドをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの増幅反応におけるプライマーとして使用した場合に、該オリゴヌクレオチドが変異部位を含む所定の領域にアニールして、変異部位を含む配列に相補的な配列を増幅し得ることを意味する。従って、各オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列に対して、変異部位を含む所定の領域に特異的にアニールできればよく、完全に相補的な配列であってもよいし、部分的に相補的な配列、又は、部分的に非相補的な塩基（ミスマッチ塩基）を有する配列であってもよい。ミスマッチ塩基とは、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ以外の核酸塩基ペアを意味し、具体的には、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｔ、Ａ−Ａ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｔのペアのことである。
例えば、上述したＴｍ値における関係又は塩基長における関係を妨げない限り、各オリゴヌクレオチドは、後述するように、部分的に相補的な配列又は部分的にミスマッチ塩基を有する配列であることが好ましい。このような配列を用いた場合には、例えば、変異の検出感度を高めると共に擬陽性を低く抑制できる。
【００２４】
各オリゴヌクレオチドの長さは、塩基長として１０〜５０であればよく、上述したＴｍ値における関係又は塩基長における関係を妨げない限り、１５〜４０であることが好ましく、１８〜２５であることがより好ましい。この範囲の長さであれば、例えば検出感度を高め、かつ擬陽性を効果的に抑制できる。この塩基長は、各オリゴヌクレオチドの他の構造上の特徴に併せて適宜調整することが可能である。
【００２５】
変異部位以外の相補的でない塩基としては、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列としてもよい。このような付加配列を設けることによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにそれぞれ付加され得る付加配列は、上述の通り、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない３〜１０塩基であってもよく、４〜９塩基であることが好ましく、５〜７塩基であることがより好ましい。この付加配列を５’末端に有することによって、例えば、感度を向上させると共に、各オリゴヌクレオチドが互いの鋳型核酸配列にアニールすることを効果的に抑制されて、又は増殖効率を高くすることができる。また、付加配列をこの範囲の長さにすることで、例えば、擬陽性を抑制でき、又は増幅効率を高めることができる。
【００２６】
付加配列は、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおいて、同一の長さであっても異なる長さであってもよく、同一の配列であっても異なる配列であってもよいが、異なる配列が好ましい。付加配列を構成する塩基配列としては、特に制限はないが、ＧＣ含量が４０〜６０％程度であることが好ましい。このＧＣ含量の範囲とすることによって、例えば、変異型又は野性型配列の増幅効率を維持することができる。またＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方に付加配列を付加する場合には、Ｐ１オリゴヌクレオチドの付加配列のＧＣ含量を高くすることが好ましい。この場合には、変異型配列の検出感度を高くすることができる。
【００２７】
Ｐ１オリゴヌクレオチドは、その３’領域に、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの変異部位に対して相補的な塩基として、変異部位に対する相補的な塩基（「Ｃ」）を有すればよい。Ｐ１オリゴヌクレオチドでは、３’末端の１番目〜３番目のいずれかの塩基が、変異部位の塩基に対して相補的な塩基であることが好ましい。この変異部位の塩基に対する相補的な塩基をこのような位置に配置することによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。なお、本明細書において、３’末端の１番目の塩基とは、３’末端の塩基であり、３’末端の３番目の塩基とは、３’末端の塩基を１番目として、５’方向に向って３番目の塩基を意味する。
【００２８】
一方、Ｐ２オリゴヌクレオチドは、その３’領域に、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの変異部位に対して相補的な塩基として、野生型の塩基に対する相補的な塩基（「Ａ」）を有すればよい。Ｐ２オリゴヌクレオチドでは、３’末端の１番目〜３番目のいずれかの塩基が、変異部位の塩基に相補的な塩基であることが好ましい。この変異部位の塩基に対する相補的な塩基をこのような位置に配置した場合には、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
【００２９】
Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドにおける上記の変異部位に相補的である塩基の３'末端からの距離（位置）は、同一であってもよく、異なってもよい。Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおける変異部位に対する塩基の位置は、同一であることが好ましい。変異部位に対する塩基の位置をＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとで同一とした場合には、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
【００３０】
変異部位以外の相補的でない塩基としては、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は、連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基としてもよい。このようなミスマッチ塩基を導入することによって、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できる。
このようなミスマッチ塩基の総数は、それぞれのオリゴヌクレオチドを構成する塩基の配列によって異なるが、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましく、３個以下であることが更に好ましい。この程度のミスマッチ塩基の数であれば、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できるという利点を有する。
【００３１】
また、このようなミスマッチ塩基は、上述した変異部位の位置よりも５’末端側に配置することが好ましく、中でも、変異部位の位置よりも５’末端側に３番目〜７番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、変異部位の位置よりも５’末端側に３〜５番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。この位置であれば、例えば、検出感度を高くする又は、擬陽性を抑制できる。
【００３２】
Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドが共にミスマッチ塩基を有する場合、Ｐ１オリゴヌクレオチド上のミスマッチ塩基の位置とＰ２オリゴヌクレオチド上のミスマッチ塩基の位置とは互いに対応しない位置であることが好ましい。ミスマッチ塩基の位置は互いに異なっていればよく、好ましくは、１塩基〜６塩基離れた位置に設定することができ、より好ましくは２塩基〜３塩基離れた位置に設定することができる。また、例えば、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方がミスマッチを有する場合、Ｐ１オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置の方がＰ２オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置よりも３’末端側にあることが好ましい。このようなＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基の位置関係とした場合には、例えば擬陽性を抑制することができる。
なお、ミスマッチ塩基の種類としては、配列番号１に示す塩基配列に対応していない塩基であればよく、特に制限はないが、一般に、比較的結合力が弱い「Ａ」又は「Ｔ」であることが好ましい。「Ａ」又は「Ｔ」とすることによって、例えば、擬陽性を抑制することができる。
【００３３】
なお、ＥＧＦＲエクソン２１における変異部位周辺には、検出対象となる多型とは無関係の多型が存在するため、必要に応じて、この検出対象外の部位の塩基について、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの双方に、無関係な多型に基づく影響を無効化するための変異を追加してもよい。このような塩基を、本明細書では、「無効化変異」とする。
【００３４】
上述した付加配列は、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの双方に設けてもよく、いずれか一方に設けてもよい。また上述したミスマッチ塩基は、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの双方に設けてもよく、いずれか一方に設けてもよい。
【００３５】
本発明における多型検出用プライマーセットは、上述の通り、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドを少なくとも１種ずつ含むものであればよく、上述したＰ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドにおけるＴｍ値の関係又は塩基長の関係が全体として損なわれない限り、いずれか一方又はこれら双方を、２種以上含むものであってもよい。
【００３６】
本発明におけるＰ１オリゴヌクレオチドの一例を表１に示し、Ｐ２オリゴヌクレオチドの一例を表２に示す。なお、表１及び表２中「Ａ」又は「Ｔ」は、ミスマッチ塩基を意味し、５’末端側の大文字アルファベットは付加配列を意味する。表１及び表２における各３’末端側が、変異部位の塩基である。また、表１及び表２中「（ａ）」は無効化変異を意味する。なお、Ｔｍ値は、ＭｅｌｔＣａｌｃ（登録商標）で計算した値である。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
これらのＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、それぞれＴｍ値などに基づいて選択されて、用いられる。なお、上記配列のうち、Ｍｔ−Ｒ２及びＷｔ−Ｒ１は、いずれも変異部位を除き配列番号１の相補配列の塩基配列と同一であって所定の塩基長のオリゴヌクレオチドであり、それ以外は、いずれも変異部位以外に配列番号１の相補配列の塩基配列と相同的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドである。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、例えば、以下の組み合わせが挙げられる。中でも、同一長さの付加配列と、異なる位置のミスマッチ塩基を共に含むＮｏ．５〜Ｎｏ．７の組み合わせが、例えば感度及び擬陽性出現の抑制などの観点から好ましい。
【００４０】
【表３】
【００４１】
本発明の多型検出用プライマーセットは、変異プライマーであるＰ１オリゴヌクレオチドと野生型プライマーであるＰ２オリゴヌクレオチドの他に、配列番号１の塩基配列中におけるＰ１オリゴヌクレオチドまたはＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸配列よりも５’末端側の領域に対する相補配列に相補的なプライマー（Ｆプライマー）を更に含んでもよい。
Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドは共に、配列番号１に示す塩基配列に対して、所謂リバース側のプライマーを構成する。このため、Ｆプライマーは、所謂フォワード側のプライマーを構成し、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドに対する対のプライマーとして作用する。
【００４２】
Ｆプライマーは、検出目的の前記塩基部位とは異なる領域にアニーリングするプライマーであるため、前記塩基部位が変異型であるか正常型であるかに関わらず、鋳型核酸を増幅できる。これにより、Ｆプライマーを共存させることで、鋳型核酸の本来の配列を維持した増幅産物をあわせて得ることができ、より一層、変異検出の信頼性を向上することができる。
【００４３】
Ｆプライマーの長さは、特に制限されないが、通常、１０〜５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０塩基であり、特に好ましくは１６〜３５塩基である。また、Ｆプライマーは、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドがアニーリングする鋳型核酸配列における変異部位よりも５’側の領域に対する相補配列にアニーリングできればよく、その配列は特に制限されず、従来公知の一般的なプライマーの設計方法に従って設計できる。
【００４４】
［多型検出用プライマー］
また、本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１多型検出用プライマーは、上述したプライマーセットにおける前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのいずれか一方のみを含むものである。このプライマーは、各オリゴヌクレオチドは、１種のみオリゴヌクレオチドを有してもよく、例えば、長さ、ミスマッチ塩基の位置、ＧＣ含量などが異なる２種以上のオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
多型検出用プライマーとしてのＰ１オリゴヌクレオチド又はＰ２オリゴヌクレオチドについては、個々のオリゴヌクレオチドに関して前述した事項を、そのまま適用可能である。
【００４５】
［多型検出方法］
本発明におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出方法は、（Ｉ） 核酸試料と、前記プライマーセットとを接触させ、前記核酸を鋳型として増幅を行うこと、
（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブと、前記増幅により得られた一本鎖核酸とを接触させて、該一本鎖核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍを評価すること、及び、
（Ｖ） 前記Ｔｍに基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在を確認することまたはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む。
本多型検出方法では、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとを含む前記プライマーセットを同一試料に対して用いることにより、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅される。増幅で得られた核酸は、検出用プローブを使用したハイブリダイゼーション工程並びに、Ｔｍ値による評価工程及び多型の評価工程に付される。これにより、試料中の核酸における変異型配列を有する核酸の割合が少量であっても、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅され、感度よく変異型配列を有する核酸を検出し、多型の確認及び／又は評価を行うことができる。
【００４６】
本多型検出方法において用いられる核酸試料は、鋳型となる核酸を含む試料であればよく、特に制限されない。例えば、生体試料由来の核酸を含む試料があげられる。前記生体試料としては、例えば、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪および毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等、ならびに、それらの懸濁波等があげられる。また、前述のように、生体試料由来の核酸を鋳型として核酸増幅法を行った反応液を核酸試料とし、前記反応液に含まれる増幅産物を鋳型核酸としてもよい。
【００４７】
なお、試料は、例えば、目的の塩基部位が変異型および正常型のいずれを示すか不明である核酸を含む試料、変異型配列を有する核酸と正常型配列を有する核酸とを含むことが既知である試料、変異型配列を有する核酸と正常型配列を有する核酸とのいずれかを含む可能性のある試料等のいずれであってもよい。試料中の核酸、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の由来は、制限されない。例えば、各種癌細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等が挙げられる。特に前記方法は、変異型核酸と正常型核酸とを有する試料への適用が好ましい。例えば、白血病等の各種癌細胞等の生体試料、具体例としては、血液中に遊離する細胞等に適用することが好ましい。血液中に含まれる癌化した細胞には、変異型核酸を有する細胞と、正常型核酸を有する細胞とが含まれるため、このような細胞由来の核酸試料に対して、本多型検出方法を適用することは、要求される感度を実現できる点で、好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００４８】
前述のような生体試料由来の核酸は、例えば、従来公知の方法によって、生体試料から単離できる。全血からのゲノムＤＮＡの単離には、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００４９】
鋳型となる試料中の核酸は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。鋳型核酸としては、例えば、ＤＮＡ、および、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等が挙げられる。また、鋳型核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写−ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物が挙げられる。これらの増幅産物を、本発明における鋳型核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【００５０】
増幅工程では、核酸を含有する試料と、プライマーセットとを接触させて、核酸試料中の核酸を鋳型とした核酸の増幅を行う。このとき、プライマーセット中のＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、同一の試料（同一の反応液）中で、それぞれ鋳型核酸配列にアニールし、核酸の増幅が開始される。
【００５１】
増幅工程における核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５２】
増幅工程において、増幅反応の反応系（例えば、反応液）における核酸試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記核酸試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されない。例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。
【００５３】
また、後述する変異の検出において、例えば、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応系における全血試料等の生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈穀物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
【００５４】
また増幅反応の開始前に、反応系にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物または濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。
前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されない。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられる。これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
【００５５】
増幅工程における増幅について、ＰＣＲ法を例にあげて説明するが、本発明は、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。例えば、ＷＯ２０１０／００１９６９に開示されている条件及び方法を好ましく用いることができる。
【００５６】
まず、鋳型核酸と前述の各種プライマーとを含むＰＣＲ反応液を調製する。前記ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されないが、変異型プライマー（Ｐ１オリゴヌクレオチド）は、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。正常型プライマー（Ｐ２オリゴヌクレオチド）は、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌである。変異型プライマー（Ｐ１）と野生型プライマー（Ｐ２）とのモル比（Ｐ１：Ｐ２）は、例えば、１：０．００１〜１：１０であることが好ましく、より好ましくは、１：０．０１〜１：２であり、特に好ましくは、１：０．１〜１：１である。
このような各プライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができ、また擬陽性を抑制することができる。
【００５７】
変異型Ｐ１オリゴヌクレオチドと野生型Ｐ２オリゴヌクレオチドとに加えて、Ｆプライマーを併用する場合、Ｆプライマーは、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。変異型プライマー（Ｐ１）とプライマー（Ｆ）とのモル比（Ｐ１：Ｆ）は、例えば、１：０．００１〜１：１０であることが好ましく、より好ましくは、１：０．０１〜１：２であり、特に好ましくは、１：０．１〜１：１である。
このようなＦプライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができる。
【００５８】
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチドおよび溶媒等が挙げられる。前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【００５９】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏ９１／０９９５０）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９２／９６８９）（Pfu DNA polymerase：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ０４５５４３０）（商標Vent：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
【００６０】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ等）が挙げられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。また、ＰＣＲ反応液には、更に、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等を含んでいてもよい。
【００６１】
ＰＣＲは、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）プライマーの鋳型核酸配列へのアニーリング、（３）ポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（ポリメラーゼ反応）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程では、例えば、９０〜９９℃、１〜１２０秒が好ましく、９２〜９５℃、１〜６０秒がより好ましく、アニーリング工程では、例えば４０℃〜７０℃、１〜３００秒が好ましく、５０〜７０℃、５〜６０秒がより好ましく、また、伸長工程では、例えば、５０〜８０℃、１〜３００秒が好ましく、５０〜８０℃、５〜６０秒がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【００６２】
ハイブリダイゼーション工程では、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブと、増幅工程で得られた一本鎖増幅核酸とを接触させて、これらのハイブリッドが得られる。
ここで用いられるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能なプローブは、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基（変異部位）に対応する塩基を含む領域の核酸配列、又は、この核酸配列に相補的な配列に対してハイブリダイズ可能な配列を有すればよい。
プローブの長さには、特に制限はないが、５〜５０ｍｅｒであることが好ましく、１０〜３０ｍｅｒであることがより好ましい。プローブの長さがこのような範囲であれば、例えば検出感度を高めることができる。
【００６３】
プローブには、変異部位の塩基に相補的な塩基が含まれていれば特に制限はない。変異部位の塩基に相補的な塩基が、プローブの５’末端から数えて４番目〜１５番目に位置していることが好ましい。プローブにおける変異部位に対する塩基の位置がこのような位置であれば、例えば、検出感度を高めることができる。
【００６４】
プローブの配列には、制限はない。プローブの配列における変異部位は、変異型に対応する塩基としてもよく、野生型に対応させた塩基としてもよい。多型検出用プローブの配列としては、変異型に対応した塩基を有する配列であることが好ましく、この変異部位の塩基を除いて、配列番号１に示す塩基配列と相補的な配列に対して、９０％〜１００％同じ配列であることがより好ましく、１００％同一であることが特に好ましい。多型検出用プローブの配列を変異型に対応した塩基とすることによって、例えば、検出感度を高めることができる。
また、多型検出用プローブを増幅工程でプライマーと共に存在させて使用する場合には、ＤＮＡポリメラーゼの反応対象となってプローブ自体の伸長を予防するために、３’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、プローブの３’末端に更にリン酸基が付加されていることが好ましい。
【００６５】
多型検出用プローブは、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、蛍光色素で標識され、単独（相補配列にハイブリダイズしていないとき）で蛍光を示し且つハイブリッド形成（相補配列にハイブリダイズしているとき）により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが挙げられる。
【００６６】
このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。前記プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）もしくは５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ （登録商標）として知られている。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出目的配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。また、前記標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
【００６７】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法又はＲＦＬＰ法などを挙げることができる。
【００６８】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ （商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ （商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ （検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
【００６９】
また、前記プローブが、蛍光色素等の標識化物質で標識化された標識化プローブである場合、前記標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節することができる等の利点が得られる。この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。
【００７０】
多型検出用プローブの反応系への添加のタイミングは、特に制限されない。例えば、増幅反応前、増幅工程の開始時、増幅反応途中および増幅反応後のいずれであってもよい。増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションを連続的に行うことができるため好ましい。即ち、増幅を行うこととハイブリッドを得ることとは、同時に行うことが、例えば、処理効率の観点から好ましい。
反応系における多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されない。例えば、前記プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００７１】
多型検出用プローブと、一本鎖増幅核酸とのハイブリッドを得るために適用されるハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖核酸を変性して一本鎖核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。また、解離した一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば、４０℃〜５０℃である。
なお、ここで「一本鎖増幅核酸」の範囲には、試験対象となっている当初の核酸試料における一本鎖核酸も包含される。
【００７２】
測定工程では、ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する。
前記増幅一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であることが好ましい。標識物質のシグナル測定とすることによって、例えば検出感度を高めることができる。
【００７３】
標識化ブローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出目的配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出目的配列とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の観察ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
【００７４】
ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、前記標識化プローブを使用する場合、前記シグナル値は、例えば、前記標識化プローブの標識物質に応じた条件で測定することができる。
【００７５】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５°Ｃであり、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００７６】
Ｔｍ値評価工程では、測定工程で得られたシグナルの変動を解析してＴｍ値を決定し、評価する。具体的には、得られた蛍光強度から、例えば、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、変化量を（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）とする場合は、例えば、最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７７】
Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http:/www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、隣接法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。
【００７８】
多型評価工程では、決定されたＴｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価する。
Ｔｍ値測定工程で得られたＴｍ値からは、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒに相当する配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基の種類、すなわち、変異型または野生型等の遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、―塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、目的の塩基部位における遺伝子型を決定することができる。
【００７９】
例えば、目的の塩基部位の塩基を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む検出目的配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、―塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、目的塩基は正常型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、例えば、変異型を示す核酸と、正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。
【００８０】
また、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。つまり、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００８１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８２】
ＥＧＦＲエクソン２１における変異型及び野生型の核酸配列に存在比を定量的に測定するには、予め、変異型及び野生型それぞれの核酸配列を作製して得られた検量線を作成し、それに基づいてそれぞれの存在比を評価することが好ましい。
【００８３】
検量線の作成の一例について以下に説明する。
まず、例えば、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図（Ｂ）に温度と検出信号の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを検出して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。
【００８４】
ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を下限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で検出信号の微分値が最小となる温度を上限、検出信号のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。
なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定してもよい。
【００８５】
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける検出信号の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
【００８６】
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔｓ＋１）−Ｂ（Ｔｓ＋１）｝＋｛ｆ（Ｔｓ＋２）−Ｂ（Ｔｓ＋２）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔｅ−１）−Ｂ（Ｔｅ−１）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔｅは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
【００８７】
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔｓ）＋ｆ（Ｔｓ） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔｅ）−ｆ（Ｔｓ）｝／（Ｔｅ−Ｔｓ） である。
【００８８】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴＷにおける面積ＳＷ及び温度範囲ΔＴＭにおける面積ＳＭを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。例えば、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線とすることができる。図２に、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳＭ／ＳＷ）をとった検量線の一例を示す。なお、面積比はＳＷ／ＳＭで定めてもよい。
【００８９】
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００９０】
また、野生型及び変異型の各ピークの存在に従って存在比を計算することができるが、単にピークの存在を確認することによって、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の存在（有無）を評価してもよい。
【００９１】
［ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法］
本発明のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法は、前記多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること（遺伝子多型検出工程）、及び、前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること（薬効評価工程）、を含む。
前記多型検出方法では、本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセットを用いて、感度よく且つ簡便にＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを検出するので、ＥＧＦＲエクソン２１におけるこの多型に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【００９２】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法における遺伝子多型検出工程については、上述したＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法に関して記述した内容をそのまま適用することができる。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼは、ＥＧＦＲエクソン２１における多型によって反応性が異なることが知られている。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子が野生型である場合には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による腫瘍縮小効果が期待できると評価することができる。
このように、前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法を適用することによって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果に対する予測を、信頼性高く且つ簡便に行うことができる。
【００９３】
［キット］
本発明のＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するためのキットは、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを含む。
このキットには、ＥＧＦＲ遺伝子における多型を簡便にかつ感度よく検出するために使用可能な上述したプライマーセットが含まれるので、ＥＧＦＲ遺伝子における多型の検出をより簡便に行うことができる。
【００９４】
プライマーセットを構成するＰ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。なお、本明細書における「異なる容器」とは、Ｐ１オリゴヌクレオチドとＰ２オリゴヌクレオチドとが非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも、独立して取扱い可能な個別の容器でなくてもよい。
【００９５】
本キットには、Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸配列よりも５’末端側の領域に対する相補配列に相補的なプライマー、即ち、Ｆプライマーを更に含んでもよい。このＦプライマーについては、前述したＦプライマーに関する事項をそのまま適用することができる。これにより、より感度欲ＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するためのプライマーをキットに含むことができるので、感度よい多型の検出をより簡便に行うことができる。
Ｆプライマーは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
【００９６】
本キットには、ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブを更に含んでもよい。この多型検出用プローブについては、前記多型検出用プローブに関する事項をそのまま適用することができる。これにより、被検体試料における多型検出を行う際、プライマーセットによる核酸増幅と、プローブによる検出とを同時に又は連続して簡便に行うことができる。
多型検出用プローブは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
【００９７】
本キットには、上記の他に、増幅に必要なポリメラーゼ等の試薬又は緩衝液、ハイブリダイズのために必要な試薬又は緩衝液、検体試料を希釈するための希釈剤等を含んでもよい。更に、本キットには、キットに含まれる又は、追加的に含むことが可能な各種の試薬に関する使用説明書等を含むことが好ましい。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」又は「％」は質量基準である。
【００９９】
＜評価例１＞
［実施例１］
ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために、配列番号１の１７２６４３〜１７２９４１番目の塩基配列で、１７２７９２番目の塩基がＧまたはＴである塩基配列を含むプラスミドを、上記塩基配列以外の部位で制限酵素処理し、リニアライズしたものを準備した。得られたプラスミド、即ち、配列番号１に示される塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｇ」である変異型プラスミド（以下、「ｍｔ」という）と、配列番号１に示される塩基配列の１７２７９２番目の塩基が「Ｔ」である野生型プラスミド（以下、（以下、「ｗｔ」という）を、所定の割合で混合し、複数の核酸試料を調製した。この複数の核酸試料におけるｍｔ含有割合は、それぞれ、３％、１％及び０％とした。
【０１００】
ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するために、配列番号１に示される配列の１７２７９２〜１７２８０７番目に相補的な配列であって、１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基として「Ｃ」を含む配列に対する変異型プライマー（以下、「Ｍｔプライマー」という）ｍｔ−Ｒ２（表１又は表５参照）と、配列番号１に示される配列の１７２７９２〜１７２８０７番目に相補的な配列であって、１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基として「Ａ」を含む配列に対する野生型プライマー（以下、（以下、「Ｗｔプライマー」という）ｗｔ−Ｒ１（表２又は表５参照）を準備した。
【０１０１】
チューブ内に、表４に示すように、核酸試料１μＬ（２×１０４ ｃｏｐｉｅｓ／ｔｅｓｔ）と、Ｍｔプライマー及びＷｔプライマーとを含む各ＰＣＲ反応液２４μＬとを添加し、サーマルサイクラー（商品名Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒及び６０℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。
【０１０２】
さらに、前記ＰＣＲ反応液が入ったチューブを、ｉ−ｄｅｎｓｙ（アークレイ社製）に移し、９５℃１秒、４０℃で６０秒処理した後、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から７５℃まで加熱し、その間の経時的な蛍光強度を測定しＴｍ解析を行った。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いたので、励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍで蛍光強度の変化を測定した。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
プローブには、配列番号１の１７２７８２〜１７２７９８番目の配列を認識し、３’末端に標識を有する３Ｔ−ＥＧＦＲ−８５８−Ｒ２（ttggccCgcccaaaatc-(TAMRA)：配列番号２２。「Ｃ」は変異部位の塩基に相補的な塩基）を用いた。Ｆプライマー（フォワードプライマー）としては、配列番号１の１７２７３９〜１７２７６４番目の配列に対応するＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒ−Ｆ２（aggaacgtactggtgaaaacaccgc：配列番号２３）を用いた。鋳型核酸としては、ＥＧＦＲエクソン２１の野生型ＤＮＡ（ロッシュ社製、ヒトゲノム）と、プラスミド（ｍｔを１％又は３％の割合で混合したもの）を用いた。
【０１０５】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示すグラフを得た。Ｔｍ値は実測値より求め、解析の開始・終了温度はＴｍ値の±５℃として、面積解析法により解析して、下記の式に従って、面積比としての変異型増幅産物と野生型増幅産物の存在比率を求めた。結果を表５に示す。
面積比＝（ｍｔの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積)／（Ｗｔの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積）
【０１０６】
実施例２〜８
変異型プライマーと野生型プライマーを表５に示される組み合わせに変更した以外は、実施例１と同様にして、実施例２〜８のプライマーセットによる多型検出を行った。結果を表５に示す。
比較例１
野生型プライマーを使用せず、変異型プライマーのみを用いて処方を水の量で調整した以外は、実施例１と同様にして多型検出を行った。結果を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５に示されるように、変異型プライマーのみを用いた多型検出よりも、塩基長又はＴｍ値が異なる変異型プライマーと野生型プライマーの双方を一反応系で用いた多型検出の方が、変異０％、１％及び３％をそれぞれ含有量依存的に検出可能であり、本実施例のプライマーセットを用いることによって、核酸試料中の多型、即ち、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを高い感度で検出可能であることがわかる。
特に、付加配列に加えてミスマッチ変異も有する変異型プライマーを、野生型プライマーと共に用いることによって（実施例５〜７）、ｍｔ０％における擬陽性を抑えることができ、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの検出において、感度に加えて擬陽性抑制も良好であることがわかる。
【０１０９】
＜評価例２＞
実施例５のプライマーセットを用いて、ｍｔ０％、０．１％、０．３％及び１％の試料に対する多型検出を行った。
実施例１で作成した各プラスミド混合物を鋳型核酸として、鋳型核酸５，０００コピー／μＬ（２０，０００ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）のものを使用し、かつ、実施例５のプライマーセットを用いた。全自動ＳＮＰｓ検査装置（ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）と、ＤＮＡポリメラーゼを含有するｉ−ｄｅｎｓｙ Ｐａｃｋ ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ（アークレイ社製）を用いてＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。ＰＣＲ反応条件及びＴｍ解析条件は、評価例１と同様としてＴｍ値解析を行った。Ｔｍ値解析により得られたグラフを図３〜６に示す。なお、図３〜図６において縦軸は蛍光強度の温度微分値、横軸は温度をそれぞれ示す。
図３〜図６に示されるように、実施例５のプライマーセットを用いて多型検出を行うと、６０℃付近の変異型のピークがｍｔ含有量に応じた大きさのピークとして確認できる。従って、実施例５のプライマーセットを用いることによって、ｍｔ含量１％以下であっても変異型の存在比に応じた感度で多型を検出することができることがわかる。
【０１１０】
このように本発明によれば、簡便に且つ高感度にＥＧＦＲエクソン２１における多型を検出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセット：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する請求項１記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項３】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列である請求項１又は請求項２記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項４】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項５】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項６】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値より０．１℃〜２０℃高い請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項７】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド又はＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号１に示す塩基配列の領域よりも５’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項８】
配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項９】
請求項１記載のＰ１オリゴヌクレオチドのみからなるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマー。
【請求項１０】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する請求項９記載の多型検出用プライマー。
【請求項１１】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない１つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した３〜１０塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である請求項９又は請求項１０記載の多型検出用プライマー。
【請求項１２】
配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する請求項９〜請求項１１のいずれか１項記載の多型検出用プライマー。
【請求項１３】
（Ｉ） 核酸試料と、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドを含む請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、
（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸を接触させて、該一本鎖増幅核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価すること、及び、
（Ｖ） 前記Ｔｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む、ＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法。
【請求項１４】
前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う請求項１３記載の多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４記載の多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること、及び、
前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、
を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。
【請求項１６】
配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチド及び、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドのいずれかである請求項１３又は請求項１４記載の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
【請求項１７】
請求項１〜請求項８のいずれか１項記載のプライマーセットを含むＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための多型検出用キット。
【請求項１８】
さらに、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒを検出可能なプローブを含む請求項１７記載の多型検出用キット。
【請求項１】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が１０〜５０塩基長である下記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも１種含むＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマーセット：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＣであるオリゴヌクレオチドであって、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値と比較して高いＴｍ値を示すか、又は前記Ｐ２オリゴヌクレオチドよりも１塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ２）配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基がＡであるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する請求項１記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項３】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及びＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した２〜１０塩基の付加配列である請求項１又は請求項２記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項４】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項５】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項６】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、前記Ｐ２オリゴヌクレオチドのＴｍ値より０．１℃〜２０℃高い請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項７】
前記Ｐ１オリゴヌクレオチド又はＰ２オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号１に示す塩基配列の領域よりも５’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項８】
配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の多型検出用プライマーセット。
【請求項９】
請求項１記載のＰ１オリゴヌクレオチドのみからなるＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出するための多型検出用プライマー。
【請求項１０】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも１つ有する請求項９記載の多型検出用プライマー。
【請求項１１】
配列番号１の１７２７９２番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号１に示す塩基配列と相補的でない１つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に位置する連続した３〜１０塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された１塩基又は連続した２〜２０塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である請求項９又は請求項１０記載の多型検出用プライマー。
【請求項１２】
配列番号１に示す塩基配列の１７２７９２番目の塩基に相補的な塩基を、３’末端側から１〜３番目のいずれかの位置に有する請求項９〜請求項１１のいずれか１項記載の多型検出用プライマー。
【請求項１３】
（Ｉ） 核酸試料と、前記Ｐ１オリゴヌクレオチド及び前記Ｐ２オリゴヌクレオチドを含む請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、
（ＩＩ） ＥＧＦＲエクソン２１の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸を接触させて、該一本鎖増幅核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
（ＩＩＩ） 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
（ＩＶ） 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価すること、及び、
（Ｖ） 前記Ｔｍ値に基づいて、ＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒの存在またはＥＧＦＲエクソン２１Ｌ８５８Ｒを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む、ＥＧＦＲ遺伝子における多型検出方法。
【請求項１４】
前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う請求項１３記載の多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４記載の多型検出方法によりＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出すること、及び、
前記検出結果に基づいてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、
を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。
【請求項１６】
配列番号２〜配列番号１１で示されるＰ１オリゴヌクレオチド及び、配列番号１２〜配列番号２１で示されるＰ２オリゴヌクレオチドのいずれかである請求項１３又は請求項１４記載の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
【請求項１７】
請求項１〜請求項８のいずれか１項記載のプライマーセットを含むＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための多型検出用キット。
【請求項１８】
さらに、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒを検出可能なプローブを含む請求項１７記載の多型検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１０５６４５（Ｐ２０１２−１０５６４５Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３５７８４（Ｐ２０１１−２３５７８４）
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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