ＥＧＦＲ遺伝子の多型検出用プローブ、増幅用プライマーおよびその用途
【課題】ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）遺伝子について、異なる多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な、多型検出用プローブ、増幅用プライマーおよびその用途を提供する。
【解決手段】蛍光標識オリゴヌクレオチドを、多型検出用プローブとして使用する。特定の塩基配列において、以下の塩基配列において相補的な配列を有し、特定のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基。
【解決手段】蛍光標識オリゴヌクレオチドを、多型検出用プローブとして使用する。特定の塩基配列において、以下の塩基配列において相補的な配列を有し、特定のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型検出用プローブ、増幅用プライマーおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）のチロシンキナーゼ型受容体である。ＥＧＦＲは、多くの固形癌で高頻度に発現し、その過剰発現は癌の悪性度や予後と関連することが知られている。そこで、例えば、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）であるゲフィチニブ等が、癌治療薬として使用されている。しかしながら、患者の中には、ゲフィニチブによる腫瘍縮小効果が向上する場合があれば、ゲフィチニブに耐性を示し、治療効果が得られない場合もある。そして、近年、このような薬剤に対する感受性が、ＥＧＦＲの変異と関連することが明らかになっている（非特許文献１、２）。
【０００３】
前記変異は、例えば、ＥＧＦＲの７９０番目および８５８番目における置換変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異等が知られている（非特許文献１、２）。前記７９０番目における変異は、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換された変異であり、配列番号２１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、３４７番目の塩基シトシン（ｃ）がチミン（ｔ）に置換されている。前記８５８番目における変異は、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異であり、配列番号１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、２６１番目の塩基チミン（ｔ）がグアニン（ｇ）に置換されている。前記ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異は、前記エクソン１９において、連続した数塩基〜十数塩基が欠失した変異であり、配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、例えば、１１２〜１６４番目の塩基のいずれかが欠失している。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子における、この変異の有無（多型）を検出すれば、治療前に、ゲフィチニブに対する感受性を評価できるため、より効率的なテーラーメイド癌治療が可能となる。
【０００４】
他方、遺伝子の多型を検出する方法は、様々な方法が報告されており、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等があげられる。
【０００５】
しかしながら、前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、手間がかかり増幅産物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、多型の検出を自動化し難いという問題もある。
【０００６】
このような問題から、近年、遺伝子多型の検出方法として、融解曲線分析（Ｔｍ分析）を利用した検出が行われている。これは、検出目的の遺伝子多型を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって目的多型の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、目的多型を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同じであれば、標的ＤＮＡに目的多型が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、標的ＤＮＡに目的多型が存在しないと判断できる。
【０００７】
「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【０００８】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法は、少なくとも一塩基の違いをＴｍ値によって判断するため、複数の遺伝子多型を有する場合には、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、Ｖｏｌ.２、Ｎｏ.３、ｐ．２２５−２３５
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１３−２５２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような理由から、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出は、例えば、前記疾患の治療法の選択において非常に重要である。そこで、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子について、一塩基が異なる多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な多型検出用プローブおよび多型検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P18から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００１２】
本発明の多型検出方法は、EGFR遺伝子における多型の検出方法であって、本発明のプローブを用いることを特徴とする。
【００１３】
本発明の判定方法は、本発明の方法によりEGFR遺伝子における多型を検出する工程、および、多型の有無に基づいてEGFR-TKIに対する耐性または薬効を判定する工程を含むことを特徴とする、EGFR-TKIに対する耐性またはEGFR-TKIの薬効の判定方法である。
【００１４】
本発明のキットは、EGFR遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明のプライマーは、EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプライマーであって、下記P8〜P13から選択される多型検出用プライマーである。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【発明の効果】
【００１６】
本発明の多型検出方法によれば、本発明の多型検出用プローブを使用することによって、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＥＧＦＲ遺伝子と変異型であるＥＧＦＲ遺伝子とが共存している場合であっても、野生型と変異型の多型を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。また、本発明のプライマーによれば、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を含む領域を、特異的に増幅できる。このように、本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で増幅および判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の治療法の選択等に反映できる。例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性または薬効を判定できる。なお、本発明は、例えば、医療分野に関わらす、生化学等の広い分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例４における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例５−１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例５−２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例５−３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、比較例１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、比較例２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例３−１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３−２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例３−３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、比較例３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、遺伝子の多型とは、例えば、変異により生じた、一つまたは複数の遺伝子座における多様性をいう。前記変異は、例えば、置換、欠失、挿入および付加があげられる。
【００１９】
ＥＧＦＲ遺伝子として、配列番号１、２および２１に示す部分配列は、例えば、それぞれ、以下に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．に登録されている。
（配列番号１）
ＮＴ＿０３３９６８
４８４８６２４〜４８４９０３３番目の塩基配列
（配列番号２）
ＮＴ＿０３３９６８．６
４８３１７１７番目〜４８３２００３番目の塩基配列
（配列番号２１）
ＮＧ＿００７７２６
１６７００１番目〜１６８０２０番目の塩基配列
【００２０】
本発明において、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型とは、例えば、以下の多型である。
配列番号１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において２６１番目の塩基（ｋ）の多型
配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において１０４〜１３３番目の少なくともいずれかの塩基の多型
配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において１３０〜１６４番目の塩基の少なくともいずれかの多型
配列番号２１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において３４７番目の塩基（ｙ）の多型
【００２１】
以下、配列番号１の前記多型を「ＥＧＦＲエクソン２１ ８５８多型」といい、配列番号２の前記多型を「ＥＧＦＲエクソン１９多型」といい、配列番号２１の前記多型を「ＥＧＦＲ７９０多型」という。前記多型は、それぞれ、野生型、変異型が存在する。前記各多型について、野生型のＥＧＦＲ遺伝子を、野生型遺伝子、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を、変異型遺伝子という。
【００２２】
前記配列番号１における２６１番目の塩基（ｋ）の多型は、野生型がチミン（ｔ）であり、変異型がグアニン（ｇ）である。野生型の場合、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸はロイシン（Ｌ）となり、変異型の場合、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）となる。
【００２３】
本発明において、「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」との表現は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における変異であって、コドン８５８における変異がアミノ酸としてロイシンからアルギニンへの変異であることを意味する。また、本発明において、「ＥＧＦＲエクソン２１の変異型」との表現は、「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」を意味する。本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＴ＿０３３９６８における４８４８６２４〜４８４９０３３番目を意味し、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＴ＿０３３９６８におけるに示す塩基配列の４８４８８８４番目の塩基が「Ｔ（チミン）」から「Ｇ（グアニン）」への変異をいう。
【００２４】
前記配列番号２の１０４〜１６４番目の塩基の多型は、例えば、下記表１に示す多型があげられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１３−２５２０参照）。下記表１において、多型１は、野生型である。下記多型１の塩基配列は、配列番号２における１０４〜１６４番目のオリゴヌクレオチドに対応する。下記表１において、多型２〜１８は、配列番号２の１１２〜１６４番目の領域において、少なくともいずれかの塩基が欠失した変異型（エクソン１９欠失変異）である。中でも、下記多型２〜１７は、配列番号２の１２２〜１３２番目の領域において、少なくともいずれかの塩基が欠失しており、具体的には、前記１１２〜１４０番目の領域において、複数の塩基が欠失した変異型である。下記多型１８は、配列番号２の１３７〜１５１番目の塩基が欠失した変異型である。下記表１の多型２〜１８において、「−」は、多型１に対応する部位の塩基が欠失していることを示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
ＥＧＦＲ遺伝子において、前記二カ所の多型のうち少なくとも一つが前述のような変異型であれば、例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性が高い可能性があると判断できる。
【００２７】
前記配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、野生型がシトシン（ｃ）であり、この場合、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）となる。変異型は、チミン（ｔ）であり、この場合、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸はメチオニン（Ｍ）となる。ＥＧＦＲ遺伝子において、この多型が前述のような変異型であれば、例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに耐性を示す可能性があると判断できる。
【００２８】
本発明において、「相同性を有する配列」は、特定の塩基配列に対して、例えば、８０％以上の相同性を有する配列が好ましい。前記相同性は、例えば、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。すなわち、本発明において、相同性を有する配列は、前記特定の塩基配列からなる配列（相同性１００％）でもよいし、前記特定の塩基配列について、１塩基以上が置換、欠失、挿入および／または付加された配列（例えば、相同性が８０％以上１００％未満）でもよい（以下、同様）。前述した前記多型が発生する部位、すなわち、センス鎖における部位およびそれに相補的なアンチセンス鎖における部位を、「検出部位」といい、前記検出部位を含み、前記多型検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、「ハイブリダイズ領域または検出配列」という。前記検出部位が野生型である検出配列を、「野生型検出配列」、検出部位が変異型である検出配列を、「変異型検出配列」ともいう。
【００２９】
本発明において、前記ＥＧＦＲ８５８多型（ｔ／ｇ）を検出するためのプローブを、「ＥＧＦＲ８５８用プローブ」、前記エクソン１９多型を検出するためのプローブを、「エクソン１９用プローブ」、前記ＥＧＦＲ７９０多型（ｃ／ｔ）を検出するためのプローブを、「ＥＧＦＲ７９０用プローブ」ともいう。また、前記検出配列において、前記変異型検出配列より、前記野生型検出配列に対して、より強くハイブリダイズするプローブを、「野生型プローブ」という。一方、前記検出配列において、前記野生型検出配列より、前記変異型検出配列に対して、より強くハイブリダイズするプローブを、「変異型プローブ」という。「ハイブリダイズする強さ」は、例えば、Ｔｍ値の関係、具体的には、プローブと野生型検出配列とのＴｍ値および前記プローブと変異型検出配列とのＴｍ値について、両Ｔｍ値の高低の関係により表すことができる。すなわち、前記野生型プローブは、例えば、野生型検出配列とのＴｍ値が、変異型検出配列とのＴｍ値より、高い値を示すプローブである。一方、前記変異型プローブは、変異型検出配列とのＴｍ値が、野生型検出配列とのＴｍ値より、高い値を示すプローブである。
【００３０】
前記高い値を示すとは、例えば、各Ｔｍ値におけるピークの違いが検出可能であればよく、具体的には、前記各Ｔｍ値の差が３℃以上であることが好ましく、より好ましくは４℃以上であり、さらに好ましくは５℃以上であり、前記各Ｔｍ値の差の上限は何ら制限されず、例えば、３０℃である。
【００３１】
本発明において、ＥＧＦＲ遺伝子における増幅領域は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方であってもよい。
【００３２】
本発明において、塩基配列の末端とは、塩基配列の５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。また、５’末端領域とは、塩基配列の５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域とは、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基とは、例えば、末端から１塩基〜１０塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）とは、末端の塩基を１番目とした順番である。
【００３３】
＜多型検出用プローブ＞
（１）ＥＧＦＲ８５８用プローブ
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、EGFR exon21 L858Rの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3およびP15〜P18の少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００３４】
前記P1、P3およびP15〜P18のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、前記ＥＧＦＲ８５８多型（ｔ／ｇ）を検出するためのプローブ、すなわち、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブである。これらのプローブは、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、２６１番目の塩基の置換変異の有無を検出するためのプローブである。
【００３５】
前記P1、P3およびP15〜P18の各オリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の２６１番目の塩基（ｔまたはｇ）に相補的な（対応する）塩基は、アデニン（ａ）またはシトシン（ｃ）である。前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいて、前記塩基がアデニン（ａ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ１−ｗｔ」ともいい、前記塩基がシトシン（ｃ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ１−ｍｔ」ともいう。前記Ｐ１−ｗｔは、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブといえる。前記Ｐ１−ｍｔは、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列またはＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。
【００３６】
前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の２６１番目（ｔまたはｇ）に相補的な（対応する）塩基は、アデニン（ａ）またはシトシン（ｃ）である。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドにおいて、前記塩基がアデニン（ａ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ３−ｗｔ」ともいい、前記塩基がシトシン（ｃ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ３−ｍｔ」ともいう。前記Ｐ３−ｗｔは、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブといえる。前記Ｐ３−ｍｔは、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列またはＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。
【００３７】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-858-R2）は、前述のように、11〜50塩基長であり、好ましくは、11〜40塩基長であり、より好ましくは、11〜30塩基長であり、さらに好ましくは、12〜20塩基長である。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-858-R1）は、前述のように、5〜50塩基長であり、好ましくは、10〜40塩基長であり、より好ましくは、10〜30塩基長であり、さらに好ましくは、12〜20塩基長である。
【００３８】
前記各オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。
【００３９】
前記P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に相補的な（対応する）塩基を、3’末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号251に相補的な（対応する）塩基」とは、前記オリゴヌクレオチドと配列番号１の塩基配列とをアライメントした際に、配列番号１の塩基配列における251番目の塩基（g）に相補的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号251に相補的な塩基は、P1のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００４０】
前記P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に相補的な塩基を3’末端に有することが好ましい。
【００４１】
前記Ｐ１−ｍｔは、例えば、配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、前記Ｐ１−ｗｔは、例えば、配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-ttggcccgcccaaaatc-3' （配列番号７）（3T-EGFR-858-R2）
5'-ttggccagcccaaaatc-3' （配列番号８）
【００４２】
前記P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に相補的な（対応する）塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号257に相補的な（対応する）塩基」とは、前記オリゴヌクレオチドと配列番号１の塩基配列とをアライメントした際に、配列番号１の塩基配列における257番目の塩基（g）に相補的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号257に相補的な塩基は、P3のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００４３】
前記Ｐ３−ｗｔは、例えば、配列番号１２〜１４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ３−ｍｔは、例えば、配列番号９〜１１に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cagtttggccagccc-3' （配列番号１２）
5'-ctgtttggccagccc-3' （配列番号１３）
5'-ccgtttggccagccc-3' （配列番号１４）
5'-cagtttggcccgccc-3' （配列番号９）（3T-EGFR-858-R1）
5'-ctgtttggcccgccc-3' （配列番号１０）
5'-ccgtttggcccgccc-3' （配列番号１１）
【００４４】
前記P15のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P15-1〜P15-5のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P15-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号235〜264を含む30〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号235に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号239〜264を含む26〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号239に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号244〜264を含む21〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号244に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜264を含む7〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号258に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号259に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４５】
前記P16のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P16-1〜P16-10のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P16-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜263を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号263に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号262に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜271を含む14〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号271に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜274を含む17〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号274に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜275を含む18〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号275に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-6)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜276を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号276に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-7)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜278を含む21〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号278に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-8)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜280を含む23〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号280に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-9)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜281を含む24〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号281に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-10)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜284を含む27〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号284に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４６】
前記P17のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P17-1〜P17-4のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P17-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号236〜264を含む29〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号236に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号241〜264を含む24〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号241に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号247〜264を含む18〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号247に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号249に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４７】
前記P18のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P18-1〜P18-5のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P18-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号264に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜265を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号265に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜269を含む13〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号269に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜272を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号272に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜279を含む23〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号279に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４８】
本発明のＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、プローブの両端の塩基がシトシンであり、前記両シトシンが蛍光標識されているプローブでもよい。このようなプローブは、例えば、下記P19の蛍光標識オリゴヌクレオチドがあげられる。
(P19)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜274を含む18〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基および塩基番号274に対応する塩基がシトシンであり、前記両シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４９】
前記P15〜P19のオリゴヌクレオチドは、特に示さない限り、例えば、前記P1およびP３の各オリゴヌクレオチドに関する説明等を援用できる。例えば、各オリゴヌクレオチドにおける標識化部位は、前述のようにシトシン残基が好ましく、前記P15、P16およびP19は、例えば、配列番号１におけるグアニンに対応するシトシン残基が好ましく、前記P17およびP18は、例えば、配列番号１におけるシトシン残基が好ましい。
【００５０】
P15のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は6塩基長であり、好ましくは16塩基長である。P16のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は5塩基長であり、好ましくは、6塩基長であり、さらに好ましくは18塩基長である。P17のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は16塩基長であり、好ましくは20塩基長である。P18のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は8塩基長であり、好ましくは20塩基長である。前記P15〜P19の各オリゴヌクレオチドの塩基長の上限は50塩基長であり、好ましくは40塩基長であり、さらに好ましくは30塩基長である。
【００５１】
前記P15〜P19のオリゴヌクレオチドについて、以下に、それぞれの配列の具体例をあげる。下記配列において、目的の多型部位に対応する塩基は、例えば、野生型でも変異型でもよい。具体的に、前記P15、P16およびP19は、例えば、配列において、前記塩基をｍ（ａまたはｃ）で表わすことができ、前記P17およびP18は、例えば、配列において、前記塩基をｋ（ｔまたはｇ）で表わすことができる。なお、本発明は、これらの配列には制限されない。
【００５２】
P15-1（配列番号７２）
5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgacatgc-3' （3T-EGFR-858-R4）
P15-2（配列番号７３）
5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgac-3' （3T-EGFR-858-R5）
P15-3（配列番号７４）
5'-tggccCgcccaaaatctgtgatc-3' （3T-EGFR-858-R6）
P15-4（配列番号７５）
5'-agcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R7）
P15-5（配列番号７６）
5'-acccagcagtttggccCgc-3' （3T-EGFR-858-R8）
【００５３】
P16-1（配列番号７７）
5'-ccCgcccaaaatctgtga-3' （3T-EGFR-858-R9）
P16-2（配列番号７８）
5'-cCgcccaaaatctgtgat-3' （3T-EGFR-858-R10）
P16-3（配列番号７９）
5'-cagtttggccCgcccaaaatct-3' （3T-EGFR-858-R11）
P16-4（配列番号８０）
5'-cagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R12）
P16-5（配列番号８１）
5'-ccagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R13）
P16-6（配列番号８２）
5'-cccagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R14）
P16-7（配列番号８３）
5'-cacccagcagtttggccCgcccaa-3' （3T-EGFR-858-R15）
P16-8（配列番号８４）
5'-cgcacccagcagtttggccCgccc-3' （3T-EGFR-858-R16）
P16-9（配列番号８５）
5'-ccgcacccagcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R17）
P16-10（配列番号８６）
5'-cttccgcacccagcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R18）
【００５４】
P17-1（配列番号８９）
5'-catgtcaagatcacagattttgggcGggc-3' （5T-EGFR-858-F1）
P17-2（配列番号９０）
5'-caagatcacagattttgggcGggc-3' （5T-EGFR-858-F2）
P17-3（配列番号９１）
5'-cacagattttgggcGggccaaa-3' （5T-EGFR-858-F3）
P17-4（配列番号９２）
5'-cagattttgggcGggccaaa-3' （5T-EGFR-858-F4）
【００５５】
P18-1（配列番号９４）
5'-atcacagattttgggcGggc-3' （3T-EGFR-858-F6）
P18-2（配列番号９５）
5'-atcacagattttgggcGggcc-3' （3T-EGFR-858-F7）
P18-3（配列番号９６）
5'-attttgggcGggccaaac-3' （3T-EGFR-858-F8）
P18-4（配列番号９７）
5'-attttgggcGggccaaacTgc-3' （3T-EGFR-858-F9）
P18-5（配列番号９８）
5'-ggcGggccaaacTgctgggtgc-3' （3T-EGFR-858-F10）
【００５６】
P19-1（配列番号８８）
5'-cagcagtttggccCgccc-3' （35T-EGFR-858-R21）
【００５７】
（２）エクソン１９用プローブ
本発明のエクソン１９用プローブは、前述のように、EGFR exon19 deletionの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P5〜P7から選択される少なくとも1種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００５８】
前記Ｐ５〜Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、前記エクソン１９多型を検出するためのプローブ、すなわち、前記エクソン１９用プローブである。
【００５９】
前記Ｐ５〜Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖と相補的であり、前記アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００６０】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の１０４〜１１２番目の塩基が野生型である場合、前記塩基が欠失変異した変異型である場合よりも、前記検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、前記野生型または変異型のいずれに対して、より強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型２〜１７）であるかを検出できる。以下、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用野生型プローブという。
【００６１】
前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の104〜119番目の塩基が野生型である場合、119番目の塩基を除いて、検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、Ｐ６のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列に対して、より強くハイブリダイズするか否かによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型２〜１５および１７）であるかを検出できる。以下、前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブという。
【００６２】
前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の１３７〜１５１番目の塩基が欠失変異した変異型である場合、前記塩基が欠失変異していない野生型である場合よりも、前記検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、Ｐ７のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、前記野生型または変異型のいずれに対して、より強くハイブリダイズするか否かによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型１８）であるかを検出できる。以下、Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブという。
【００６３】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチド（5FL-EGFR-EX19-F2）は、前述のように、9〜50塩基長であり、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、25〜35塩基長であり、さらに好ましくは、10〜30塩基長である。前記Ｐ６のオリゴヌクレオチド（5T-EGFR-EX19-No19-F2-3）は、前述のように、9〜50塩基長であり、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、25〜35塩基長であり、さらに好ましくは、10〜30塩基長である。前記Ｐ７のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-EX19-No18-F1）は、前述のように、10〜50塩基長であり、好ましくは、10〜30塩基長であり、より好ましくは、12〜30塩基長であり、さらに好ましくは、15〜20塩基長である。
【００６４】
前記各オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。
【００６５】
前記P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましく、前記P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号104に相同的な塩基」とは、配列番号２の塩基配列における104番目の塩基（c）に相同的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号104に相同的な塩基は、P5およびP6のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。前記P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号145に相同的な塩基」とは、配列番号3の塩基配列における145番目の塩基（ｃ）に相同的な塩基（ｃ）を意味する。具体的に、塩基番号145に相同的な塩基は、P7のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００６６】
前記P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有することが好ましく、前記P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有することが好ましく、前記P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端に有することが好ましい。
【００６７】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号５に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3' （配列番号５）(5FL-EGFR-EX19-F2)
【００６８】
前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3'（配列番号４）(5T-EGFR-EX19-No19-F2-3)
【００６９】
前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-agcaacaaaggaaatc-3' （配列番号６）(3T-EGFR-EX19-No18-F1)
【００７０】
本発明において、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のオリゴヌクレオチドは、前述のものには限定されず、それぞれ、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドの意味も含む。
（ａ）前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のいずれかのオリゴヌクレオチドに相同性を有する配列を有し、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19の前記いずれかのオリゴヌクレオチドと同程度の作用（例えば、プローブとしての結合能）を示すオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のいずれかのオリゴヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19の前記いずれかのオリゴヌクレオチドと同程度の作用（例えば、プローブとしての結合能）を示すオリゴヌクレオチド
【００７１】
前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイおよびストリンジェントな条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）〕等に記載されている方法および条件を採用できる。
【００７２】
本発明において、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のオリゴヌクレオチドは、前述のように、例示列挙した前記配列のいずれかに相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドでもよい。前記相同性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。本発明のプローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよい。
【００７３】
前記プローブは、例えば、天然核酸で構成されてよく、非天然核酸で構成されてよい。前記天然核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡがあげられる。前記非天然核酸は、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ：ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ともいう）等の架橋化核酸、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）等があげられる。前記プローブは、例えば、前記非天然核酸により構成されることで、検出対象配列に対してハイブリダイズする能力を向上できるため、例えば、プローブの配列を短く設計できる。前記ＬＮＡにより構成されるプローブと前記検出対象配列とのＴｍ値の予測は、例えば、EXIQON社のホームページ（http://www.exiqon.com/oligo-tools）等で計算できる。
【００７４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加するものがあげられる。また、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するものがあげられる。
【００７５】
前記蛍光色素は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光色素は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）等があげられる。前記蛍光色素の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光色素の種類により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【００７６】
多型検出用プローブには、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。
【００７７】
このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）もしくは５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出目的配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。また、前記標識物質は、例えば、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合できる。
【００７８】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００７９】
なお、ＱＰｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式は、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法またはＲＦＬＰ法などを挙げることができる。
【００８０】
前記蛍光色素は、特に制限されず、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素は、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されず、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
【００８１】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出する方法であって、前記検出配列とハイブリダイズするプローブを使用することを特徴とする。
【００８２】
なお、本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。本発明は、例えば、医療分野の他、診断および治療方法を除く分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【００８３】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と本発明の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
【００８４】
前記（Ａ）工程において、前記本発明の多型検出用プローブは、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。使用する前記多型検出用プローブの種類は、例えば、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。
【００８５】
前記（Ａ）工程において使用する前記多型検出用プローブは、少なくとも一種類が、本発明の多型検出用プローブであればよい。前記プローブの種類は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型に応じて、適宜決定できる。本発明においては、例えば、ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出してもよいし、エクソン１９多型のみを検出してもよいし、両方の多型を一つの反応系で検出することもできる。また、前記ＥＧＦＲ８５８多型およびエクソン１９多型の少なくとも一方と、その他の多型とを、一つの反応系で検出することも可能である。前記その他の多型は、特に制限されず、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ７９０多型等があげられる。
【００８６】
前記ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブを使用することが好ましい。前記ＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブでもよいし、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブでもよいし、両方を併用してもよい。
【００８７】
前記エクソン１９多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記エクソン１９用野生型プローブ、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブの少なくともいずれか一種類を使用することが好ましい。前記エクソン１９用野生型プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９多型が、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型２〜多型１７）かを検出でき、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型２〜１５、１７）かを検出でき、前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型１８）かを検出できる。本発明において、前記エクソン１９用野生型プローブ、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブのいずれを用いてもよいし、前記多型１か、前記多型２〜１８かを判断できることから、２種類以上を併用してもよい。プローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、P5とP7との組み合わせが、多型1〜18の18種類を検出可能であり、P6とP7との組み合わせが、多型16を除く17種類を検出可能であり(P5は自己消光するが、P6は自己消光しない)、P5単独が、多型18を除く17種類を検出可能であり、P6単独が、多型16、18を除く16種類を検出可能であり(P5は自己消光するが、P6は自己消光しない)、P7単独が、多型18のみの1種類を検出可能であり、好ましい。
【００８８】
本発明は、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと、前記エクソン１９用プローブとを併用することが望ましい。本発明のプローブは、前述のように、優れた信頼性で多型を検出できるため、例えば、一つの反応液において、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと、前記エクソン１９用プローブとを使用しても、前記ＥＧＦＲ８５８多型と、エクソン１９多型とを、それぞれ特異的に検出可能である。前記エクソン１９用プローブは、前述のように、前記エクソン１９用野生型プローブと、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとを併用することが好ましい。
【００８９】
本発明は、例えば、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０の多型を検出してもよく、前記ＥＧＦＲ８５８の多型および／またはエクソン１９の多型と同時に検出することが好ましい。「同時に検出」とは、例えば、同じ一つの反応系を用いた検出の意味を含む。この場合、本発明は、前記両プローブ以外に、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブを併用してもよい。
【００９０】
前記ＥＧＦＲ７９０用プローブは、特に制限されず、例えば、下記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドからなるプローブがあげられる。
（Ｐ１４）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号２１に示す塩基配列において、３３４番目の塩基（ｇ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列又は前記相補的な配列に相同性を有する塩基配列からなり、３４７番目の塩基に対応する塩基がグアニンまたはアデニンであり、３３４番目に対応する塩基がシトシンであるオリゴヌクレオチド
【００９１】
前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、例えば、配列番号２１に示す塩基配列において、３４７番目の塩基の置換変異の有無を検出するためのプローブである。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号２１の３４７番目に対応する相補的な塩基は、ｒで表され、前記ｒは、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）である。ｒがグアニン（ｇ）である前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ７９０用野生型プローブといえる。ｒがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列またはＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、３’末端がシトシンとなる。
【００９２】
前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２２に示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、この塩基配列において、ｒは、前述の通りである。前記オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブである、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチド、およびＥＧＦＲ７９０用野生型プローブである、配列番号２４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-tgagctgcrtgatgaggtgcac-3' （配列番号２２）
5'-tgagctgcatgatgaggtgcac-3' （配列番号２３）（3T-EGFR-T790M-mt-R3）
5'-tgagctgcgtgatgaggtgcac-3' （配列番号２４）
【００９３】
本発明において、前記Ｐ１４のオリゴヌクレオチドは、前述のように、例示列挙した前記配列のいずれかに相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドでもよい。前記相同性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。
【００９４】
前記（Ａ）工程において、前記多型検出用プローブを二種類以上併用する場合、例えば、各プローブが、異なる標識物質を有する標識プローブであることが好ましい。前記異なる標識物質は、例えば、検出条件の異なる標識物質があげられる。
【００９５】
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が前記二本鎖核酸の場合、例えば、後述するように、前記（Ａ）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の前記被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。前記二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、例えば、本発明の多型検出用プローブと前記一本鎖核酸とがハイブリダイズしやすくなる。
【００９６】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、試料中に元来含まれる核酸でもよいし、検出精度を向上できることから、前記核酸を鋳型核酸として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物でもよい。前記増幅産物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。また、前記被検核酸は、例えば、前記試料中のトータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡでもよいし、前記ｃＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。前記増幅産物は、例えば、前記検出配列を含む領域の増幅産物であることが好ましい。前記検出配列は、前記検出部位として、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位のみを含んでもよいし、前記エクソン１９多型の検出部位のみを含んでもよい。また、前記検出部位として、前記ＥＧＦＲ８５８多型と前記エクソン１９多型とを含んでもよい。また、前記検出部位として、さらに、前述のＥＧＦＲ７９０多型を含んでもよい。
【００９７】
本発明の多型検出方法は、例えば、前記被検核酸が前記増幅産物の場合、例えば、さらに、前記鋳型核酸から前記増幅産物を生成する工程を含んでもよい。前記増幅産物の生成工程は、例えば、前記（Ａ）工程に先立って行ってもよいし、前記（Ａ）工程において、行ってもよい。
【００９８】
前記被検核酸が前記増幅産物の場合、前記（Ａ）工程において、例えば、予め調製した増幅産物を用いて、本発明の多型検出用プローブと前記増幅産物とを含む反応系を準備してもよいし、本発明の多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅産物を生成し、前記多型検出用プローブと前記増幅産物とを含む反応系を準備してもよい。
【００９９】
前記核酸の増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、前記増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【０１００】
前記鋳型核酸からの前記増幅産物の生成には、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅することの可能なプライマーを使用することが好ましい。
【０１０１】
前記プライマーによる増幅領域は、特に制限されず、検出目的の多型に応じて適宜設定できる。すなわち、検出目的の多型が前記ＥＧＦＲ８５８多型の場合、前記増幅領域は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位を含む領域、すなわち、配列番号１の塩基配列において２６１番目の塩基を含む領域が好ましい。具体的には、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P19の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域が好ましい。また、検出目的の多型が前記エクソン１９多型の場合、前記増幅領域は、例えば、前記エクソン１９多型の検出部位を含む領域、すなわち、配列番号２の塩基配列において１１２〜１５１番目の塩基を含む領域が好ましい。具体的には、配列番号2に示す塩基配列におけるP5〜P6のオリゴヌクレオチドおよび配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つが、ハイブリダイズする配列を含む領域が好ましい。また、検出目的の多型が前記ＥＧＦＲ８５８多型および前記エクソン１９多型である場合、前記増幅領域は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位を含む領域と前記エクソン１９多型の検出部位を含む領域との二領域でもよい。前記増幅領域は、さらに、例えば、前記ＥＧＦＲ７９０多型の検出部位を含む領域を含んでもよい。
【０１０２】
なお、前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出部位を含む検出配列を増幅できればよく、前記検出配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜５０塩基長があげられる。
【０１０３】
前記プライマーは、例えば、センス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。前記プライマーの一例として、以下に、本発明のプライマーを説明する。
【０１０４】
EGFRexon21 L858Rの遺伝子変異を検出するためのプライマーは、例えば、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P19の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーがあげられ、具体例として、下記P8〜P10から選択される多型検出用プライマーがあげられる。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【０１０５】
前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１５に記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１７記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１０のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１６記載のオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3' （配列番号１５）(EGFR-L858R-F2)
5'-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3' （配列番号１６）(EGFR-L858R-R2)
5'-gcctccttctgcatggtattctttctc-3' （配列番号１７）(EGFR-L858R-R1)
【０１０６】
また、EGFRexon19 deletionの遺伝子変異を検出するためのプライマーは、例えば、EGFR遺伝子の配列番号2に示す塩基配列におけるP5およびP6の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする配列を含む領域、または、配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーがあげられ、具体例として、例えば、下記P11〜P13から選択される多型検出用プライマーがあげられる。
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【０１０７】
前記Ｐ１１のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１２のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１９記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１３のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-gatcccagaaggtgagaaag-3' （配列番号１８）(EGFR-EX19-F1)
5'-tctctctgtcatagggactc-3' （配列番号１９）(EGFR-EX19-F2)
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3' （配列番号２０）(EGFR-EX19-R1)
【０１０８】
前記反応系において、前記プライマーの添加濃度は、特に制限されず、例えば、一種類のプライマーについて、例えば、０．１〜４μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、前記Ｆプライマー（Ｆ）とＲプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【０１０９】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、特に制限されず、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましい。この際、前記被検核酸とは、例えば、野生型検出配列を含む核酸と変異型検出配列を含む核酸との合計でもよいし、野生型検出配列を含む増幅産物と変異型検出配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、被検核酸において、前記多型検出用プローブにより強くハイブリダイズする検出配列を含む核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、より強くハイブリダイズする検出配列を含む核酸（前記検出配列を含む増幅産物）に対して２０倍以下となることが好ましく、より好ましくは１０倍以下、さらに、好ましくは５倍以下である。また、その下限は特に制限されず、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１１０】
前記反応系における本発明の多型検出用プローブの添加濃度は、特に制限されず、例えば、一種類の前記多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【０１１１】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、特に制限されず、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記生体試料が全血の場合、前記反応系における前記全血の濃度は、例えば、０．０１〜２体積％であり、好ましくは、０．０５〜１．５体積％であり、より好ましくは、０．１〜１体積％である。また、前記生体試料が血清の場合、前記反応系における前記血清の濃度は、例えば、０．１〜２０体積％であり、好ましくは、０．２５〜１５体積％であり、より好ましくは、０．５〜１０体積％である。
【０１１２】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析（融解曲線解析ともいう）に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【０１１３】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述したように、前記蛍光色素のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記蛍光色素のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。前記蛍光色素のシグナル検出は、例えば、前記蛍光色素のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。なお、前記標識プローブならびに前記蛍光色素については、前述のとおりである。
【０１１４】
次に、本発明の多型検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明の多型検出用プローブとして、蛍光色素で標識された標識プローブを使用し、前記多型検出用プローブの存在下、鋳型核酸からの増幅を行い、得られた増幅産物を、前記被検核酸とする例である。なお、本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【０１１５】
まず、前記生体試料からゲノムＤＮＡを単離する。前記生体試料からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。具体例としては、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【０１１６】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識プローブを添加して、反応液を調製する。前記標識プローブは、例えば、前述のように、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）が好ましい。
【０１１７】
前記標識プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の増幅用反応液等、従来公知のものがあげられる。
【０１１８】
なお、前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、増幅反応の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記増幅反応前に前記反応液に添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【０１１９】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識プローブの存在下、ＰＣＲ等の増幅法によって、目的の多型が発生する検出部位を含む配列を増幅させる。以下、増幅法としてＰＣＲを例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【０１２０】
具体的には、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーを含む前記反応液を用いて、ＰＣＲを行う。この反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できるが、例えば、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。前記反応液における前記標識プローブおよび前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、それぞれ前述の範囲があげられる。
【０１２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９２／９６８９）（Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ ４５５ ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【０１２２】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜４０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【０１２３】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１２４】
前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【０１２５】
また、前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【０１２６】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【０１２７】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されず、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ下記表２の条件が例示できる。また、サイクル数も特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
前記反応液における標識プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１３０】
次に、得られた増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【０１３１】
前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅産物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【０１３２】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。また、前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【０１３３】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１３４】
前記蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されず、開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【０１３５】
次に、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）の最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、前記標識プローブとして、蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１３６】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。
【０１３７】
そして、前記Ｔｍ値から、ＥＧＦＲ遺伝子の多型が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。前記Ｔｍ解析において、野生型プローブは、前記変異型検出配列より前記野生型検出配列に対して、強くハイブリダイズする。このため、前記野生型プローブと前記野生型検出配列とのＴｍ値は、前記野生型プローブと前記変異型検出配列とのＴｍ値より高い値を示す。一方、変異型プローブは、前記野生型検出配列より前記変異型検出配列に対して強くハイブリダイズする。このため、前記変異型プローブと前記変異型検出配列とのＴｍ値は、前記変異型プローブと前記野生型検出配列とのＴｍ値より高い値を示す。前記プローブが検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）と、そのＴｍ値（ＴｍＨ）より低い値でプローブが検出配列にハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＬ）とを決定しておくことにより、前記検出配列が、前記野生型多型と、前記変異型多型とのいずれを含むかを決定できる。また、前記野生型プローブが前記野生型検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）を決定しておくことで、前記野生型プローブを用いて前記Ｔｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）が得られた場合は、前記変異型検出配列であることが決定できる。一方、前記変異型プローブが前記変異型検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）を決定しておくことで、前記変異型プローブを用いて前記Ｔｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）が得られた場合は、野生型検出配列であることが決定できる。
【０１３８】
例えば、前記プローブとして、変異型プローブを使用した場合、既定した変異型検出配列とのＴｍ値（ＴｍＨ）を示せば、多型は変異型、その既定したＴｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）を示せば、多型は野生型と判断できる。一方、例えば、前記プローブとして、野生型プローブを使用した場合、既定した野生型検出配列とのＴｍ値（ＴｍＨ）を示せば、多型は野生型、その既定したＴｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）を示せば、多型は変異型と判断できる。
【０１３９】
また、本発明においては、前述のように、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【０１４０】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１４１】
本発明は、前述のように、例えば、一つの反応系において、二種類以上の多型検出用プローブを使用できる。複数の多型検出用プローブを使用する場合、各プローブの添加のタイミングは、例えば、前述と同様であり、前記（Ａ）工程に先立って、同時に添加することが好ましく、増幅反応を行う場合、増幅反応前に、同時に添加することが好ましい。
【０１４２】
複数のプローブは、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブとの組み合わせがあげられ、具体的には、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用野生型プローブとの組み合わせ、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとの組み合わせ、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用野生型プローブと前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとの組み合わせが例示できる。本発明においては、例えば、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブを組み合わせてもよい。
【０１４３】
前記ＥＧＦＲ８５８多型およびエクソン１９多型の二つを、一反応系で検出する際、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブとを併用できる。この際、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブは、前述のように、それぞれ異なる標識物質を有することが好ましい。そして、前記反応液の温度を変化させ、各標識物質の測定条件に応じてシグナルを検出することによって、それぞれのＴｍ値を決定できる。
【０１４４】
また、前記ＥＧＦＲ８５８多型または前記ＥＧＦＲ７９０多型の検出には、それぞれ、例えば、目的の多型について、前記野生型プローブおよび変異型プローブを併用することもできる。この場合、例えば、完全に相補なマッチのハイブリッドのＴｍを示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類を決定することもできる。例えば、異なる標識物質を有する変異型プローブと野生型プローブとを使用した場合、変異型プローブについて、完全に相補なマッチハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は変異型と判断でき、野生型プローブについて、完全に相補なマッチハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は野生型と判断できる。
【０１４５】
また、本発明の多型検出方法は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出するための本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子の多型を検出するためのプローブとを併用できる。本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子を検出するためのプローブとを併用することによって、一つの反応系において、ＥＧＦＲ遺伝子を含む二種類以上の遺伝子の多型を検出できる。ＥＧＦＲ遺伝子の前記その他の多型は、特に制限されず、例えば、前述のＥＧＦＲ７９０多型があげられる。
【０１４６】
＜判定方法＞
本発明の判定方法は、本発明の多型検出用プローブを用いた多型検出方法を行うことが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。また、多型によるEGFR-TKIに対する耐性または薬効の判定は、例えば、公知の基準に基づいて行うことができる。
【０１４７】
＜試薬キット＞
本発明の試薬キットは、ＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、前記本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の試薬キットは、本発明のプローブを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の試薬キットに含まれる本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよく、組み合わせは、例えば、前述の通りである。本発明の試薬キットは、例えば、さらに、前述した本発明のプライマーを含むことが好ましく、プライマーの組み合わせは、特に制限されず、前述の通りである。本発明の試薬キットは、例えば、さらに、核酸増幅反応に必要な成分、使用説明書等を含んでもよい。
【０１４８】
＜プライマー試薬＞
本発明のプライマー試薬において、前記本発明のプライマーは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。前記プライマーの種類は、例えば、目的の増幅領域に応じて適宜決定できる。前記ＥＧＦＲ８５８多型を含む検出配列を増幅する場合は、前記Ｐ８、Ｐ９およびＰ１０のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうち少なくとも一つを含むことが好ましく、特に、前述の配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーを含むことが好ましい。また、前記エクソン１９多型を含む検出配列を増幅する場合は、前記Ｐ１１、Ｐ１２およびＰ１３のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうち少なくとも一つを含むことが好ましく、特に、前述の配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーを含むことが好ましい。本発明のプライマー試薬は、例えば、前記プライマーとして、前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドと、Ｐ９またはＰ１０のオリゴヌクレオチドと、Ｐ１１またはＰ１２のオリゴヌクレオチドと、Ｐ１３のオリゴヌクレオチドとを含むことにより、前記ＥＧＦＲ８５８多型を含む検出配列および前記エクソン１９多型を含む検出配列を増幅できる。また、前記プライマーの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１４９】
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出するための試薬であって、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、本発明の多型検出用試薬は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
【０１５０】
前記多型検出用試薬は、例えば、前記多型検出用プローブを一種類含んでもよいし、二種類以上含んでもよく、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。前記ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出する場合は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブを含むことが好ましい。前記ＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブでもよいし、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブでもよいし、両方を含んでもよい。また、前記エクソン１９多型のみを検出する場合は、例えば、前記エクソン１９用プローブを含むことが好ましい。前記エクソン１９用プローブは、例えば、エクソン１９用野生型プローブ、エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブ、エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブのいずれか１種類でもよいし、２種類でもよいし、全てを含んでもよい。前記プローブの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１５１】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明のＥＧＦＲ遺伝子多型検出用試薬キットは、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出に使用する試薬キットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の試薬キットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのＴｍ分析を行う場合、各プローブは、別個の蛍光物質で標識化されていることが好ましい。このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記蛍光物質は、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【０１５２】
また、ＥＧＦＲ遺伝子多型検出用試薬キットは上記多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むものであってもよい。
【実施例】
【０１５３】
本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【０１５４】
［実施例１］
野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０１５５】
前記野生型プラスミドおよび変異型プラスミドとして、ＥＧＦＲ８５８野生型プラスミド（Ｌ８５８ＷＴ）と、ＥＧＦＲ８５８変異型プラスミド（Ｌ８５８Ｒ）とを準備した。前記ＥＧＦＲ８５８野生型プラスミド（Ｌ８５８ＷＴ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号１の１１２番目から４１１番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号１の２６１番目の塩基（ｋ）は、チミン（ｔ）である。前記ＥＧＦＲ８５８変異型プラスミド（Ｌ８５８Ｒ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号１の１１２番目から４１１番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号１の２６１番目の塩基（ｋ）は、グアニン（ｇ）である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、３種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０１５６】
【表３】
【０１５７】
下記表４のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
前記ＥＧＦＲ８５８用プライマーの配列を以下に示す。
Ｆプライマー （配列番号１５）（EGFR-L858R-F2）
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3'
Ｒプライマー （配列番号１６）（EGFR-L858R-R2）
5'-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3'
【０１６０】
前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、下記配列のＥＧＦＲ８５８用変異型プローブを使用した。下記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、ＥＧＦＲ８５８変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における変異型プローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ用変異型プローブ （配列番号７）（3T-EGFR-858-R2）
5'-ttggcccgcccaaaatc-(TAMRA)-3'
【０１６１】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）はＬ８５８ＷＴ １００％、（Ｂ）はＬ８５８Ｒ ５％、（Ｃ）はＬ８５８Ｒ １０％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｌ８５８ＷＴとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５５℃付近、Ｌ８５８ＲとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６４℃付近である。
【０１６２】
図１（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図１（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＬ８５８Ｒ １０％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図１（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＬ８５８Ｒ ５％についても、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０１６３】
［実施例２］
本例では、野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０１６４】
下記配列に示す、配列番号１における２４１番目〜２９０番目に相同なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（EGFR-L858R(WT)-F）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（EGFR-L858R(MT)-F）を調製した。以下の２つの配列において、下線部が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μ／Ｌに調整して、試料とした。
EGFR-L858R(WT)-F（配列番号３２）
caagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
EGFR-L858R(MT)-F（配列番号３３）
caagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
【０１６５】
下記表５の反応液２５μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
下記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、ＥＧＦＲ８５８変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における変異型プローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ（配列番号９）（3T-EGFR-858-R1）
5'-cagtttggcccgccc-(TAMRA)-3'
【０１６８】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）はEGFR-L858R(WT)-F、（Ｂ）はEGFR-L858R(MT)-Fの結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、EGFR-L858R(WT)-FとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５４℃付近、EGFR-L858R(MT)-FＬとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６６℃付近である。
【０１６９】
図２（Ａ）に示すように、EGFR-L858R(WT)-Fは、EGFR-L858R(WT)-FのＴｍ値でのみピークが確認され、図２（Ｂ）に示すように、EGFR-L858R(MT)-Fは、EGFR-L858R(MT)-FのＴｍ値でのみピークが確認された。
【０１７０】
［実施例３］
本例では、野生型オリゴヌクレオチドおよび変異型オリゴヌクレオチドについてＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。BODIPY FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした。
【０１７１】
（１）オリゴヌクレオチド
前記野生型および変異型オリゴヌクレオチドとして、下記表６に示すオリゴヌクレオチド１〜１８を準備した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖に相補的な配列である。下記オリゴヌクレオチド１は、野生型オリゴヌクレオチドであり、前記ｅｘｏｎ１９の多型１を含むセンス鎖の部分配列に相補的である。下記オリゴヌクレオチド２〜１８は、変異型オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、前記ｅｘｏｎ１９の多型２〜１８を含むセンス鎖の部分配列に相補的である。下記表６に、各オリゴヌクレオチドについて、配列番号２の塩基配列における対応領域を示す。なお、△に続く塩基配列の範囲は、欠失部位である。下記表６における１〜１８の配列は、それぞれ、配列番号４９〜６６に示す。
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
（２）Ｔｍ解析
下記表７の反応液２５μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、各蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。また、ネガティブコントロールとして、試料５μＬに代えて、蒸留水５μＬを添加した反応液２５μＬについて、同様に蛍光強度の変化を測定した。
【０１７４】
【表７】
【０１７５】
（実施例３−１）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整した。そして、前記オリゴヌクレオチド１が単独である試料１ｓ、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２〜１８とを体積比１：４で混合した試料２ｍ〜１８ｍを、前記反応液の試料として使用した。
【０１７６】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、野生型オリゴヌクレオチド１と完全に相補的な配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、７４℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
【０１７７】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、（Ａ）〜（Ｑ）は、順に、前記試料１ｓ、２ｍ〜１７ｍについて、蛍光色素を検出した結果であり、（Ｒ）は、ネガティブコントロールの結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１７８】
また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）との差（Δ℃）を、下記表８に示す。下記表８および図９に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）でのみピークが確認された。一方、野生型オリゴヌクレオチド１および変異型オリゴヌクレオチド２〜１７を含む試料２ｍ〜１７ｍは、それぞれ、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、前記試料２ｍ〜１７ｍは、野生型オリゴヌクレオチド１とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値と、それより低い温度との両方で、ピークが確認された。また、変異型オリゴヌクレオチド１８を含む試料１８については、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）でのみピークが確認され、それ以外の温度では、ピークが確認できなかった。
【０１７９】
【表８】
【０１８０】
（実施例３−２）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整した。そして、前記オリゴヌクレオチド１が単独である試料１ｓ、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２〜１８とを体積比１：４で混合した試料２ｍ〜１８ｍを、前記反応液の試料として使用した。
【０１８１】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、変異型オリゴヌクレオチド１８と完全に相補的な配列であり、前記プローブと前記変異型オリゴヌクレオチド１８とのＴｍ値は、５８℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブ（配列番号６）（3T-EGFR-EX19-No18-F１）
5'-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3'
【０１８２】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１０において、（Ａ）〜（Ｒ）は、順に、前記試料１ｓ、２ｍ〜１８ｍについて、蛍光色素を検出した結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１８３】
また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記変異型オリゴヌクレオチド１８のＴｍ値（５８℃）との差（Δ℃）を、下記表９に示す。下記表９および図１０に示すように、変異型オリゴヌクレオチド１８を含む試料１８ｍは、変異型オリゴヌクレオチド１８のＴｍ値（５８℃）でのみピークが確認された。一方、野生型オリゴヌクレオチドのみを含む試料１ｓは、ピークが検出されなかった。また、変異型オリゴヌクレオチド１８以外のオリゴヌクレオチドを含む試料２ｍ〜１７ｍは、それぞれ、試料１８ｍより低い温度でピークが確認された。
【０１８４】
【表９】
【０１８５】
（実施例３−３）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、それぞれを単独で、前記ＰＣＲ反応液の試料（１ｓ〜１８ｓ）として使用した。
【０１８６】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、配列番号１における塩基番号119の塩基がｔであることを除いて、野生型オリゴヌクレオチド１と、相補的な配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、６７℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｓｕｂ）プローブ（配列番号４）（5FL-EGFR-EX19-No19-F2-3）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3'
【０１８７】
これらの結果を図１１に示す。図１１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１１において、（Ａ）〜（Ｑ）は、順に、前記試料１ｓ〜１７ｓについて、蛍光色素を検出した結果であり、（Ｒ）は、ネガティブコントロールの結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１８８】
Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（６７℃）との差（Δ℃）を、下記表１０に示す。下記表１０および図１１に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（６７℃）でのみピークが確認された。一方、変異型オリゴヌクレオチド２〜１５および１７のみを含む試料２ｓ〜１５ｓおよび１７ｓは、それぞれ、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値より低い温度で、ピークが確認された。また、変異型オリゴヌクレオチド１６または１８のみを含む試料１６ｓおよび１８ｓについては、ピークが確認できなかった。
【０１８９】
【表１０】
【０１９０】
[比較例３]
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、それぞれを単独で、前記反応液の試料１ｓ〜１８ｓとして使用した。
【０１９１】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、野生型オリゴヌクレオチド１と強くハイブリダイズする配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、７２℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号２８）（5FL-EGFR-EX19-WT-F1）
5'-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3'
【０１９２】
これらの結果を図１２に示す。図１２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１２において、（Ａ）〜（Ｒ）は、順に、前記試料１ｓ〜１８ｓについて、蛍光色素を検出した結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、最も大きなピークのＴｍ値および前記ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７２℃）との差（Δ℃）を、下記表１１に示す。
【０１９３】
図１２に示すように、試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含むにも関わらず、ピークに肩が見られるため、野生型オリゴヌクレオチドか変異型オリゴヌクレオチドかを判別することができなかった。また、変異型オリゴヌクレオチド２〜１８のみを含む試料２ｓ〜１８ｓについても、複数のピークが確認された。さらに、試料２ｓ〜１８ｓは、下記表１１に示すように、最も大きなピークを示すＴｍ値が、前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値とほとんど差がみられなかった。
【０１９４】
【表１１】
【０１９５】
［実施例４］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。
【０１９６】
ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、前記表６のオリゴヌクレオチドが挿入されたプラスミドを準備した。具体的には、前記野生型オリゴヌクレオチド１が挿入されたｅｘｏｎ１９野生型プラスミド（ｅｘ１９ＷＴ）、前記変異型オリゴヌクレオチド２が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド２（ｅｘ１９ｍｔ２）、前記変異型オリゴヌクレオチド４が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド４（ｅｘ１９ｍｔ４）および変異型オリゴヌクレオチド６が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド６（ｅｘ１９ｍｔ６）を準備した。これらのプラスミドを、下記表１２に示す所定の割合で混合し、４種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０１９７】
【表１２】
【０１９８】
下記表１３のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、検出波長を、５２０〜５５５ｎｍおよび５８５〜７００ｎｍとした以外は、前記実施例１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
【０１９９】
【表１３】
【０２００】
前記ｅｘｏｎ１９用プライマーの配列を以下に示す。また、前記ｅｘｏｎ１９用プローブは、前記実施例３のｅｘｏｎ１９用野生型プローブおよびｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブを使用した。
Ｆプライマー （配列番号１８）（EGFR-EX19-F1）
5'-gatcccagaaggtgagaaag-3'
Ｒプライマー （配列番号２０）（EGFR-EX19-R1）
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3'
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブ（配列番号６）（3T-EGFR-EX19-No18-F１）
5'-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3'
【０２０１】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）はｅｘ１９ＷＴ １００％、（Ｂ）はｅｘ１９ｍｔ２ ５％、（Ｃ）はｅｘ１９ｍｔ４ ５％、（Ｄ）はｅｘ１９ｍｔ６ ５％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、６８℃付近であり、ｅｘ１９ｍｔ２、ｅｘ１９ｍｔ４およびｅｘ１９ｍｔ６とｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとのＴｍ値は、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとのＴｍ値よりも低い温度であり、それぞれ、５１℃、５９℃、６０℃である。
【０２０２】
図３（Ａ）に示すように、ｅｘ１９ＷＴ １００％は、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含む試料では、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、それぞれ、野生型ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値と、それよりも低い温度との両方で、ピークが確認された。このように、本実施例のＦプライマー、Ｒプライマーおよびｅｘｏｎ１９用プローブを用いれば、野生型と変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、ｅｘｏｎ１９多型を検出可能であることがわかった。
【０２０３】
［実施例５］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。Pacific Blueの検出波長は、４４５−４８０ｎｍ、BODIPY FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした。
【０２０４】
（実施例５−１）
前記実施例１の３種類の試料（Ｌ８５８ＷＴ １００％、Ｌ８５８Ｒ ５％およびＬ８５８Ｒ １０％）を準備した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２０５】
下記表１４のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒および６０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、各プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
【０２０６】
【表１４】
【０２０７】
前記各ＦプライマーおよびＲプライマーの配列を以下に示す。
（ＥＧＦＲ８５８用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号１５）（EGFR-L858R-F2）
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3'
Ｒプライマー （配列番号１７）（EGFR-L858R-R1）
5'-gcctccttctgcatggtattctttctc-3'
（ｅｘｏｎ１９用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号１９）（EGFR-EX19-F2）
5'-tctctctgtcatagggactc-3'
Ｒプライマー （配列番号２０）（EGFR-EX19-R1）
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3'
（ＥＧＦＲ７９０用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号２５）（EGFR-T790M-F2）
5'-tccaggaagcctacgtgatggccag-3'
Ｒプライマー （配列番号２６）（EGFR-T790M-R1）
5'-ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3'
【０２０８】
前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、ＴＡＭＲＡに代えて、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識化した前記実施例１と同じ配列のＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ（配列番号７）を用いた。前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、前記実施例３のｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）を用いた。また、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。下記ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブは、ＥＧＦＲ７９０変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ７９０変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ （配列番号７）（3PB-EGFR-858-R2）
5'-ttggcccgcccaaaatc-(Pacific Blue)-3'
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブ （配列番号２３）（3T-EGFR-790M-mt-R3）
5'-tgagctgcatgatgaggtgcac-(TAMRA)-3'
【０２０９】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４において、（Ａ）はＬ８５８ＷＴ １００％、（Ｂ）はＬ８５８Ｒ ５％、（Ｃ）はＬ８５８Ｒ １０％の結果であり、それぞれ、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｌ８５８ＷＴとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５１℃付近であり、Ｌ８５８ＲとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６１℃付近である。
【０２１０】
図４（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図４（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＬ８５８Ｒ １０％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図４（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＬ８５８Ｒ ５％についても、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２１１】
（実施例５−２）
本例では、前記試料として、下記３種類の試料を用い、検出波長を５２５〜５５５ｎｍとした以外は、前記実施例５−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。
【０２１２】
前記試料は、前記実施例４の前記ｅｘｏｎ１９野生型プラスミド（ｅｘ１９ＷＴ）およびｅｘｏｎ１９変異型プラスミド６（ｅｘ１９ｍｔ６）を、以下に示す所定の割合で混合して調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２１３】
【表１５】
【０２１４】
これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）はｅｘ１９ＷＴ １００％、（Ｂ）はｅｘ１９ｍｔ６ ５％、（Ｃ）はｅｘ１９ｍｔ６ １０％の結果であり、それぞれ、ｅｘｏｎ１９用野生型プローブのＢＯＤＩＰＹ ＦＬを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、６８℃付近であり、ｅｘ１９ｍｔ６とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、５９℃付近である。
【０２１５】
図５（Ａ）に示すように、ｅｘ１９ＷＴ １００％はｅｘ１９ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図５（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むｅｘ１９ｍｔ６ １０％は、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値およびｅｘ１９ｍｔ６のＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図５（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたｅｘ１９ｍｔ６ ５％についても、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値およびｅｘ１９ｍｔ６のＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２１６】
（実施例５−３）
本例では、前記試料として、下記３種類の試料を用い、検出波長を５８５−７００ｎｍとした以外は、前記実施例５−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ７９０多型を検出した。
【０２１７】
前記野生型プラスミドおよび変異型プラスミドとして、ＥＧＦＲ７９０野生型プラスミド（Ｔ７９０ＷＴ）と、ＥＧＦＲ７９０変異型プラスミド（Ｔ７９０Ｍ）とを準備した。前記ＥＧＦＲ７９０野生型プラスミド（Ｔ７９０ＷＴ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号２１の１９７番目から４９６番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、シトシン（ｃ）である。前記ＥＧＦＲ７９０変異型プラスミド（Ｔ７９０Ｍ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号２１の１９７番目から４９６番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、チミン（ｔ）である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、３種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２１８】
【表１６】
【０２１９】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）はＴ７９０ＷＴ １００％、（Ｂ）はＴ７９０Ｍ ５％、（Ｃ）はＴ７９０Ｍ １０％の結果であり、それぞれ、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブのＴＡＭＲＡを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｔ７９０ＷＴとＥＧＦＲ７９０用変異型プローブとのＴｍ値は、６０℃付近であり、Ｔ７９０ＭとＥＧＦＲ７９０用変異型プローブとのＴｍ値は、６６℃付近である。
【０２２０】
図６（Ａ）に示すように、Ｔ７９０ＷＴ １００％はＴ７９０ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図６（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＴ７９０Ｍ １０％は、Ｔ７９０ＷＴのＴｍ値およびＴ７９０ＭのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図６（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＴ７９０Ｍ ５％についても、Ｔ７９０ＷＴのＴｍ値およびＴ７９０ＭのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２２１】
［比較例１］
本例では、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、下記ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブを用いた以外は、前記実施例２と同様にして、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０２２２】
下記ＥＧＦＲ８５８野生型プローブは、ＥＧＦＲ８５８野生型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８野生型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブは、５’末端を、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブ （配列番号２７）（5PB-EGFR858861WT-R1）
5'-(Pacific Blue)-ccagcagtttggccagc-3'
【０２２３】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）はEGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)、（Ｂ）はEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）、（Ｃ）はEGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)とEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）を1:1の割合で混合した試料の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０２２４】
図７（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、６８℃でのみピークが確認され、図７（Ｂ）に示すように、Ｌ８５８Ｒ １００％は、７１℃でのみピークが確認された。しかし、両ピークの温度の差は３℃であり、その差が小さかった。また、図７（Ｃ）に示すように、EGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)とEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）の混合試料は、７１℃で、Ｌ８５８ＷＴとＬ８５８Ｒのピークが重なり、両者を検出し分けることができなかった。このように、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出ピークと、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出ピークとが接近するため、例えば、野生型と変異型とが混在する場合、正確な検出が困難である。
【０２２５】
［比較例２］
本例では、４種類の試料を用い、前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブを用い、検出波長を５２０〜５５５ｎｍとした以外は、前記実施例３と同様にして、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。なお、前記試料として、前記実施例３のオリゴヌクレオチド１、２、４および６を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、前記オリゴヌクレオチド１単独の試料１、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２、４または６とを体積比１：５で混合した、試料２、試料４および試料６を調製した。
【０２２６】
下記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブは、ｅｘｏｎ１９野生型のＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ｅｘｏｎ１９野生型に相補的な塩基である。前記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブは、５’末端を、蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識化した。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号２８）（5FL-EGFR-EX19-WT-F1）
5'-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3'
【０２２７】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、前記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブを使用した結果であり、（Ａ）は試料１、（Ｂ）は試料２、（Ｃ）は試料４、（Ｄ）は試料６の検出結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、オリゴヌクレオチド１とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近、オリゴヌクレオチド２とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近、オリゴヌクレオチド４とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、４９℃付近、オリゴヌクレオチド６とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近である。
【０２２８】
図８（Ａ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１は、オリゴヌクレオチド１のＴｍ値でのみピークが確認された。また、図８（Ｃ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１および変異型オリゴヌクレオチド４を含む試料４は、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値と、変異型オリゴヌクレオチド４のＴｍ値との両方で、ピークが確認された。しかしながら、図８（Ｂ）および（Ｄ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１と変異型オリゴヌクレオチド２または６とを含む試料２および６は、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値ではピークが確認されたが、各変異型オリゴヌクレオチドのＴｍ値では、ピークが確認されなかった。
【０２２９】
［実施例６］
本例では、下記表１７に示すプローブを使用し、下記野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行った以外は、実施例２と同様の方法で、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。なお、下記表１７において、配列番号７１および配列番号８７に示すプローブは、本発明のプローブには該当しないプローブである。
【０２３０】
配列番号１における２１７番目〜３０６番目に相同なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（配列番号６７：EGFR-L858R(WT)-F90）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（配列番号６８：EGFR-L858R(MT)-F90）を調製した。以下の２つの配列において、下線部の塩基が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μｍｏｌ／Ｌに調製して、８５８野生型試料および８５８変異型試料とした。
EGFR-L858R(WT)-F90（配列番号６７）
actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg
EGFR-L858R(MT)-F90（配列番号６８）
actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg
【０２３１】
Ｔｍ解析において、各プローブについて、前記野生型試料とのＴｍ値および前記変異型試料とのＴｍ値を測定し、その差（ΔＴｍ）を算出した。そして、その算出値から、下記評価基準に従って、各プローブが、ＥＧＦＲ８５８の野生型および変異型を判別できるか否かを評価した。これらの結果を、下記表１７にあわせて示す。
（評価基準）
○ ：ΔＴｍが３℃以上であり、野生型と変異型とを有効に判別可能
× ：ΔＴｍが３℃未満であり、野生型と変異型とを有効に判別不可
【０２３２】
【表１７】
【０２３３】
前記表１７に示すように、実施例の各プローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認され、前記野生型試料とのＴｍ値よりも、前記変異型試料とのＴｍ値が、３℃以上高い値を示した（ΔＴｍ≧３℃）。一方、比較例のプローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認されたが、ΔＴｍが３℃未満であった。このことから、実施例のプローブによれば、例えば、野生型検出配列と変異型検出配列とが共存する際に、両者を有効に判別できることがわかった。
【０２３４】
［実施例７］
本例では、下記表１８に示すプローブを使用し、下記野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行った以外は、実施例２と同様の方法で、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。なお、下記表１８において、配列番号９３に示すプローブは、本発明のプローブに該当しないプローブである。
【０２３５】
配列番号１における２１７番目〜３０６番目に相補的なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（配列番号６９：EGFR-L858R(WT)-R90）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（配列番号７０：EGFR-L858R(MT)-R90）を調製した。以下の２つの配列において、下線部の塩基が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μｍｏｌ／Ｌに調製して、ＥＧＦＲ８５８野生型試料および８５８変異型試料とした。
EGFR-L858R(WT)-R90（配列番号６９）
ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggccagcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt
EGFR-L858R(MT)-R90（配列番号７０）
ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggcccgcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt
【０２３６】
Ｔｍ解析において、各プローブについて、前記野生型試料とのＴｍ値および前記変異型試料とのＴｍ値を測定した。そして、前記実施例６と同様にして、各プローブを評価した。これらの結果を、下記表１８にあわせて示す。
【０２３７】
【表１８】
【０２３８】
前記表１８に示すように、実施例の各プローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認され、前記野生型試料とのＴｍ値よりも、前記変異型試料とのＴｍ値が、３℃以上高い値を示した（ΔＴｍ≧３℃）。一方、比較例のプローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認されたが、ΔＴｍが３℃未満であった。このことから、実施例のプローブによれば、例えば、野生型検出配列と変異型検出配列とが共存する際に、両者を有効に判別できることがわかった。
【０２３９】
以上の実施例１〜７および比較例１〜３の結果より、これらの実施例におけるＦプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを用いれば、例えば、野生型と変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型、ｅｘｏｎ１９多型およびＥＧＦＲ７９０多型を検出可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２４０】
本発明の多型検出方法によれば、本発明の多型検出用プローブを使用することによって、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＥＧＦＲ遺伝子と変異型であるＥＧＦＲ遺伝子とが共存している場合であっても、野生型と変異型の多型を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。また、本発明のプライマーによれば、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を含む領域を、特異的に増幅できる。このように、本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で増幅および判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の治療法の選択等に反映できるため、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。なお、本発明は、例えば、医療分野に関わらす、生化学等の広い分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型検出用プローブ、増幅用プライマーおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）のチロシンキナーゼ型受容体である。ＥＧＦＲは、多くの固形癌で高頻度に発現し、その過剰発現は癌の悪性度や予後と関連することが知られている。そこで、例えば、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）であるゲフィチニブ等が、癌治療薬として使用されている。しかしながら、患者の中には、ゲフィニチブによる腫瘍縮小効果が向上する場合があれば、ゲフィチニブに耐性を示し、治療効果が得られない場合もある。そして、近年、このような薬剤に対する感受性が、ＥＧＦＲの変異と関連することが明らかになっている（非特許文献１、２）。
【０００３】
前記変異は、例えば、ＥＧＦＲの７９０番目および８５８番目における置換変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異等が知られている（非特許文献１、２）。前記７９０番目における変異は、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換された変異であり、配列番号２１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、３４７番目の塩基シトシン（ｃ）がチミン（ｔ）に置換されている。前記８５８番目における変異は、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異であり、配列番号１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、２６１番目の塩基チミン（ｔ）がグアニン（ｇ）に置換されている。前記ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における欠失変異は、前記エクソン１９において、連続した数塩基〜十数塩基が欠失した変異であり、配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列においては、例えば、１１２〜１６４番目の塩基のいずれかが欠失している。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子における、この変異の有無（多型）を検出すれば、治療前に、ゲフィチニブに対する感受性を評価できるため、より効率的なテーラーメイド癌治療が可能となる。
【０００４】
他方、遺伝子の多型を検出する方法は、様々な方法が報告されており、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等があげられる。
【０００５】
しかしながら、前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、手間がかかり増幅産物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、多型の検出を自動化し難いという問題もある。
【０００６】
このような問題から、近年、遺伝子多型の検出方法として、融解曲線分析（Ｔｍ分析）を利用した検出が行われている。これは、検出目的の遺伝子多型を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって目的多型の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、目的多型を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同じであれば、標的ＤＮＡに目的多型が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、標的ＤＮＡに目的多型が存在しないと判断できる。
【０００７】
「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【０００８】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法は、少なくとも一塩基の違いをＴｍ値によって判断するため、複数の遺伝子多型を有する場合には、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、Ｖｏｌ.２、Ｎｏ.３、ｐ．２２５−２３５
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１３−２５２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような理由から、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出は、例えば、前記疾患の治療法の選択において非常に重要である。そこで、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子について、一塩基が異なる多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な多型検出用プローブおよび多型検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P18から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００１２】
本発明の多型検出方法は、EGFR遺伝子における多型の検出方法であって、本発明のプローブを用いることを特徴とする。
【００１３】
本発明の判定方法は、本発明の方法によりEGFR遺伝子における多型を検出する工程、および、多型の有無に基づいてEGFR-TKIに対する耐性または薬効を判定する工程を含むことを特徴とする、EGFR-TKIに対する耐性またはEGFR-TKIの薬効の判定方法である。
【００１４】
本発明のキットは、EGFR遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明のプライマーは、EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプライマーであって、下記P8〜P13から選択される多型検出用プライマーである。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【発明の効果】
【００１６】
本発明の多型検出方法によれば、本発明の多型検出用プローブを使用することによって、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＥＧＦＲ遺伝子と変異型であるＥＧＦＲ遺伝子とが共存している場合であっても、野生型と変異型の多型を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。また、本発明のプライマーによれば、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を含む領域を、特異的に増幅できる。このように、本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で増幅および判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の治療法の選択等に反映できる。例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性または薬効を判定できる。なお、本発明は、例えば、医療分野に関わらす、生化学等の広い分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例４における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例５−１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例５−２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例５−３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、比較例１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、比較例２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例３−１における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３−２における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例３−３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、比較例３における、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、遺伝子の多型とは、例えば、変異により生じた、一つまたは複数の遺伝子座における多様性をいう。前記変異は、例えば、置換、欠失、挿入および付加があげられる。
【００１９】
ＥＧＦＲ遺伝子として、配列番号１、２および２１に示す部分配列は、例えば、それぞれ、以下に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．に登録されている。
（配列番号１）
ＮＴ＿０３３９６８
４８４８６２４〜４８４９０３３番目の塩基配列
（配列番号２）
ＮＴ＿０３３９６８．６
４８３１７１７番目〜４８３２００３番目の塩基配列
（配列番号２１）
ＮＧ＿００７７２６
１６７００１番目〜１６８０２０番目の塩基配列
【００２０】
本発明において、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型とは、例えば、以下の多型である。
配列番号１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において２６１番目の塩基（ｋ）の多型
配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において１０４〜１３３番目の少なくともいずれかの塩基の多型
配列番号２に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において１３０〜１６４番目の塩基の少なくともいずれかの多型
配列番号２１に示すＥＧＦＲ遺伝子の部分配列において３４７番目の塩基（ｙ）の多型
【００２１】
以下、配列番号１の前記多型を「ＥＧＦＲエクソン２１ ８５８多型」といい、配列番号２の前記多型を「ＥＧＦＲエクソン１９多型」といい、配列番号２１の前記多型を「ＥＧＦＲ７９０多型」という。前記多型は、それぞれ、野生型、変異型が存在する。前記各多型について、野生型のＥＧＦＲ遺伝子を、野生型遺伝子、変異型のＥＧＦＲ遺伝子を、変異型遺伝子という。
【００２２】
前記配列番号１における２６１番目の塩基（ｋ）の多型は、野生型がチミン（ｔ）であり、変異型がグアニン（ｇ）である。野生型の場合、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸はロイシン（Ｌ）となり、変異型の場合、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）となる。
【００２３】
本発明において、「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」との表現は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１における変異であって、コドン８５８における変異がアミノ酸としてロイシンからアルギニンへの変異であることを意味する。また、本発明において、「ＥＧＦＲエクソン２１の変異型」との表現は、「ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ」を意味する。本発明におけるＥＧＦＲエクソン２１の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＴ＿０３３９６８における４８４８６２４〜４８４９０３３番目を意味し、ＥＧＦＲエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＴ＿０３３９６８におけるに示す塩基配列の４８４８８８４番目の塩基が「Ｔ（チミン）」から「Ｇ（グアニン）」への変異をいう。
【００２４】
前記配列番号２の１０４〜１６４番目の塩基の多型は、例えば、下記表１に示す多型があげられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１３−２５２０参照）。下記表１において、多型１は、野生型である。下記多型１の塩基配列は、配列番号２における１０４〜１６４番目のオリゴヌクレオチドに対応する。下記表１において、多型２〜１８は、配列番号２の１１２〜１６４番目の領域において、少なくともいずれかの塩基が欠失した変異型（エクソン１９欠失変異）である。中でも、下記多型２〜１７は、配列番号２の１２２〜１３２番目の領域において、少なくともいずれかの塩基が欠失しており、具体的には、前記１１２〜１４０番目の領域において、複数の塩基が欠失した変異型である。下記多型１８は、配列番号２の１３７〜１５１番目の塩基が欠失した変異型である。下記表１の多型２〜１８において、「−」は、多型１に対応する部位の塩基が欠失していることを示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
ＥＧＦＲ遺伝子において、前記二カ所の多型のうち少なくとも一つが前述のような変異型であれば、例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する耐性が高い可能性があると判断できる。
【００２７】
前記配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、野生型がシトシン（ｃ）であり、この場合、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸はトレオニン（Ｔ）となる。変異型は、チミン（ｔ）であり、この場合、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸はメチオニン（Ｍ）となる。ＥＧＦＲ遺伝子において、この多型が前述のような変異型であれば、例えば、ゲフィニチブ等のＥＧＦＲ−ＴＫＩに耐性を示す可能性があると判断できる。
【００２８】
本発明において、「相同性を有する配列」は、特定の塩基配列に対して、例えば、８０％以上の相同性を有する配列が好ましい。前記相同性は、例えば、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。すなわち、本発明において、相同性を有する配列は、前記特定の塩基配列からなる配列（相同性１００％）でもよいし、前記特定の塩基配列について、１塩基以上が置換、欠失、挿入および／または付加された配列（例えば、相同性が８０％以上１００％未満）でもよい（以下、同様）。前述した前記多型が発生する部位、すなわち、センス鎖における部位およびそれに相補的なアンチセンス鎖における部位を、「検出部位」といい、前記検出部位を含み、前記多型検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、「ハイブリダイズ領域または検出配列」という。前記検出部位が野生型である検出配列を、「野生型検出配列」、検出部位が変異型である検出配列を、「変異型検出配列」ともいう。
【００２９】
本発明において、前記ＥＧＦＲ８５８多型（ｔ／ｇ）を検出するためのプローブを、「ＥＧＦＲ８５８用プローブ」、前記エクソン１９多型を検出するためのプローブを、「エクソン１９用プローブ」、前記ＥＧＦＲ７９０多型（ｃ／ｔ）を検出するためのプローブを、「ＥＧＦＲ７９０用プローブ」ともいう。また、前記検出配列において、前記変異型検出配列より、前記野生型検出配列に対して、より強くハイブリダイズするプローブを、「野生型プローブ」という。一方、前記検出配列において、前記野生型検出配列より、前記変異型検出配列に対して、より強くハイブリダイズするプローブを、「変異型プローブ」という。「ハイブリダイズする強さ」は、例えば、Ｔｍ値の関係、具体的には、プローブと野生型検出配列とのＴｍ値および前記プローブと変異型検出配列とのＴｍ値について、両Ｔｍ値の高低の関係により表すことができる。すなわち、前記野生型プローブは、例えば、野生型検出配列とのＴｍ値が、変異型検出配列とのＴｍ値より、高い値を示すプローブである。一方、前記変異型プローブは、変異型検出配列とのＴｍ値が、野生型検出配列とのＴｍ値より、高い値を示すプローブである。
【００３０】
前記高い値を示すとは、例えば、各Ｔｍ値におけるピークの違いが検出可能であればよく、具体的には、前記各Ｔｍ値の差が３℃以上であることが好ましく、より好ましくは４℃以上であり、さらに好ましくは５℃以上であり、前記各Ｔｍ値の差の上限は何ら制限されず、例えば、３０℃である。
【００３１】
本発明において、ＥＧＦＲ遺伝子における増幅領域は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方であってもよい。
【００３２】
本発明において、塩基配列の末端とは、塩基配列の５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。また、５’末端領域とは、塩基配列の５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域とは、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基とは、例えば、末端から１塩基〜１０塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）とは、末端の塩基を１番目とした順番である。
【００３３】
＜多型検出用プローブ＞
（１）ＥＧＦＲ８５８用プローブ
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、EGFR exon21 L858Rの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3およびP15〜P18の少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００３４】
前記P1、P3およびP15〜P18のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、前記ＥＧＦＲ８５８多型（ｔ／ｇ）を検出するためのプローブ、すなわち、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブである。これらのプローブは、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、２６１番目の塩基の置換変異の有無を検出するためのプローブである。
【００３５】
前記P1、P3およびP15〜P18の各オリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の２６１番目の塩基（ｔまたはｇ）に相補的な（対応する）塩基は、アデニン（ａ）またはシトシン（ｃ）である。前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいて、前記塩基がアデニン（ａ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ１−ｗｔ」ともいい、前記塩基がシトシン（ｃ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ１−ｍｔ」ともいう。前記Ｐ１−ｗｔは、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブといえる。前記Ｐ１−ｍｔは、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列またはＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。
【００３６】
前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１の２６１番目（ｔまたはｇ）に相補的な（対応する）塩基は、アデニン（ａ）またはシトシン（ｃ）である。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドにおいて、前記塩基がアデニン（ａ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ３−ｗｔ」ともいい、前記塩基がシトシン（ｃ）であるオリゴヌクレオチドを、「Ｐ３−ｍｔ」ともいう。前記Ｐ３−ｗｔは、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブといえる。前記Ｐ３−ｍｔは、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出配列またはＥＧＦＲ８５８変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。
【００３７】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-858-R2）は、前述のように、11〜50塩基長であり、好ましくは、11〜40塩基長であり、より好ましくは、11〜30塩基長であり、さらに好ましくは、12〜20塩基長である。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-858-R1）は、前述のように、5〜50塩基長であり、好ましくは、10〜40塩基長であり、より好ましくは、10〜30塩基長であり、さらに好ましくは、12〜20塩基長である。
【００３８】
前記各オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。
【００３９】
前記P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に相補的な（対応する）塩基を、3’末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号251に相補的な（対応する）塩基」とは、前記オリゴヌクレオチドと配列番号１の塩基配列とをアライメントした際に、配列番号１の塩基配列における251番目の塩基（g）に相補的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号251に相補的な塩基は、P1のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００４０】
前記P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に相補的な塩基を3’末端に有することが好ましい。
【００４１】
前記Ｐ１−ｍｔは、例えば、配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、前記Ｐ１−ｗｔは、例えば、配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-ttggcccgcccaaaatc-3' （配列番号７）（3T-EGFR-858-R2）
5'-ttggccagcccaaaatc-3' （配列番号８）
【００４２】
前記P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に相補的な（対応する）塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号257に相補的な（対応する）塩基」とは、前記オリゴヌクレオチドと配列番号１の塩基配列とをアライメントした際に、配列番号１の塩基配列における257番目の塩基（g）に相補的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号257に相補的な塩基は、P3のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００４３】
前記Ｐ３−ｗｔは、例えば、配列番号１２〜１４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ３−ｍｔは、例えば、配列番号９〜１１に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cagtttggccagccc-3' （配列番号１２）
5'-ctgtttggccagccc-3' （配列番号１３）
5'-ccgtttggccagccc-3' （配列番号１４）
5'-cagtttggcccgccc-3' （配列番号９）（3T-EGFR-858-R1）
5'-ctgtttggcccgccc-3' （配列番号１０）
5'-ccgtttggcccgccc-3' （配列番号１１）
【００４４】
前記P15のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P15-1〜P15-5のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P15-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号235〜264を含む30〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号235に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号239〜264を含む26〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号239に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号244〜264を含む21〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号244に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜264を含む7〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号258に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号259に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４５】
前記P16のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P16-1〜P16-10のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P16-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜263を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号263に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号262に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜271を含む14〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号271に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜274を含む17〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号274に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜275を含む18〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号275に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-6)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜276を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号276に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-7)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜278を含む21〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号278に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-8)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜280を含む23〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号280に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-9)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜281を含む24〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号281に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16-10)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜284を含む27〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号284に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４６】
前記P17のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P17-1〜P17-4のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P17-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号236〜264を含む29〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号236に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号241〜264を含む24〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号241に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号247〜264を含む18〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号247に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号249に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４７】
前記P18のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記P18-1〜P18-5のオリゴヌクレオチドがあげられる。
(P18-1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号264に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜265を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号265に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜269を含む13〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号269に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-4)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜272を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号272に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18-5)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜279を含む23〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、塩基番号279に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４８】
本発明のＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、プローブの両端の塩基がシトシンであり、前記両シトシンが蛍光標識されているプローブでもよい。このようなプローブは、例えば、下記P19の蛍光標識オリゴヌクレオチドがあげられる。
(P19)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜274を含む18〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基および塩基番号274に対応する塩基がシトシンであり、前記両シトシンが蛍光標識で標識されているオリゴヌクレオチド
【００４９】
前記P15〜P19のオリゴヌクレオチドは、特に示さない限り、例えば、前記P1およびP３の各オリゴヌクレオチドに関する説明等を援用できる。例えば、各オリゴヌクレオチドにおける標識化部位は、前述のようにシトシン残基が好ましく、前記P15、P16およびP19は、例えば、配列番号１におけるグアニンに対応するシトシン残基が好ましく、前記P17およびP18は、例えば、配列番号１におけるシトシン残基が好ましい。
【００５０】
P15のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は6塩基長であり、好ましくは16塩基長である。P16のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は5塩基長であり、好ましくは、6塩基長であり、さらに好ましくは18塩基長である。P17のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は16塩基長であり、好ましくは20塩基長である。P18のオリゴヌクレオチドの塩基長の下限は8塩基長であり、好ましくは20塩基長である。前記P15〜P19の各オリゴヌクレオチドの塩基長の上限は50塩基長であり、好ましくは40塩基長であり、さらに好ましくは30塩基長である。
【００５１】
前記P15〜P19のオリゴヌクレオチドについて、以下に、それぞれの配列の具体例をあげる。下記配列において、目的の多型部位に対応する塩基は、例えば、野生型でも変異型でもよい。具体的に、前記P15、P16およびP19は、例えば、配列において、前記塩基をｍ（ａまたはｃ）で表わすことができ、前記P17およびP18は、例えば、配列において、前記塩基をｋ（ｔまたはｇ）で表わすことができる。なお、本発明は、これらの配列には制限されない。
【００５２】
P15-1（配列番号７２）
5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgacatgc-3' （3T-EGFR-858-R4）
P15-2（配列番号７３）
5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgac-3' （3T-EGFR-858-R5）
P15-3（配列番号７４）
5'-tggccCgcccaaaatctgtgatc-3' （3T-EGFR-858-R6）
P15-4（配列番号７５）
5'-agcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R7）
P15-5（配列番号７６）
5'-acccagcagtttggccCgc-3' （3T-EGFR-858-R8）
【００５３】
P16-1（配列番号７７）
5'-ccCgcccaaaatctgtga-3' （3T-EGFR-858-R9）
P16-2（配列番号７８）
5'-cCgcccaaaatctgtgat-3' （3T-EGFR-858-R10）
P16-3（配列番号７９）
5'-cagtttggccCgcccaaaatct-3' （3T-EGFR-858-R11）
P16-4（配列番号８０）
5'-cagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R12）
P16-5（配列番号８１）
5'-ccagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R13）
P16-6（配列番号８２）
5'-cccagcagtttggccCgcccaaaa-3' （3T-EGFR-858-R14）
P16-7（配列番号８３）
5'-cacccagcagtttggccCgcccaa-3' （3T-EGFR-858-R15）
P16-8（配列番号８４）
5'-cgcacccagcagtttggccCgccc-3' （3T-EGFR-858-R16）
P16-9（配列番号８５）
5'-ccgcacccagcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R17）
P16-10（配列番号８６）
5'-cttccgcacccagcagtttggccCgcc-3' （3T-EGFR-858-R18）
【００５４】
P17-1（配列番号８９）
5'-catgtcaagatcacagattttgggcGggc-3' （5T-EGFR-858-F1）
P17-2（配列番号９０）
5'-caagatcacagattttgggcGggc-3' （5T-EGFR-858-F2）
P17-3（配列番号９１）
5'-cacagattttgggcGggccaaa-3' （5T-EGFR-858-F3）
P17-4（配列番号９２）
5'-cagattttgggcGggccaaa-3' （5T-EGFR-858-F4）
【００５５】
P18-1（配列番号９４）
5'-atcacagattttgggcGggc-3' （3T-EGFR-858-F6）
P18-2（配列番号９５）
5'-atcacagattttgggcGggcc-3' （3T-EGFR-858-F7）
P18-3（配列番号９６）
5'-attttgggcGggccaaac-3' （3T-EGFR-858-F8）
P18-4（配列番号９７）
5'-attttgggcGggccaaacTgc-3' （3T-EGFR-858-F9）
P18-5（配列番号９８）
5'-ggcGggccaaacTgctgggtgc-3' （3T-EGFR-858-F10）
【００５６】
P19-1（配列番号８８）
5'-cagcagtttggccCgccc-3' （35T-EGFR-858-R21）
【００５７】
（２）エクソン１９用プローブ
本発明のエクソン１９用プローブは、前述のように、EGFR exon19 deletionの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P5〜P7から選択される少なくとも1種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【００５８】
前記Ｐ５〜Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、前記エクソン１９多型を検出するためのプローブ、すなわち、前記エクソン１９用プローブである。
【００５９】
前記Ｐ５〜Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖と相補的であり、前記アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【００６０】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の１０４〜１１２番目の塩基が野生型である場合、前記塩基が欠失変異した変異型である場合よりも、前記検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、前記野生型または変異型のいずれに対して、より強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型２〜１７）であるかを検出できる。以下、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用野生型プローブという。
【００６１】
前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の104〜119番目の塩基が野生型である場合、119番目の塩基を除いて、検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、Ｐ６のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列に対して、より強くハイブリダイズするか否かによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型２〜１５および１７）であるかを検出できる。以下、前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブという。
【００６２】
前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の１３７〜１５１番目の塩基が欠失変異した変異型である場合、前記塩基が欠失変異していない野生型である場合よりも、前記検出配列に強くハイブリダイズする。したがって、Ｐ７のオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、前記野生型または変異型のいずれに対して、より強くハイブリダイズするか否かによって、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９多型、すなわち、エクソン１９野生型（前記表１の多型１）であるか、エクソン１９変異型（前記表１の多型１８）であるかを検出できる。以下、Ｐ７のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブという。
【００６３】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチド（5FL-EGFR-EX19-F2）は、前述のように、9〜50塩基長であり、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、25〜35塩基長であり、さらに好ましくは、10〜30塩基長である。前記Ｐ６のオリゴヌクレオチド（5T-EGFR-EX19-No19-F2-3）は、前述のように、9〜50塩基長であり、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、25〜35塩基長であり、さらに好ましくは、10〜30塩基長である。前記Ｐ７のオリゴヌクレオチド（3T-EGFR-EX19-No18-F1）は、前述のように、10〜50塩基長であり、好ましくは、10〜30塩基長であり、より好ましくは、12〜30塩基長であり、さらに好ましくは、15〜20塩基長である。
【００６４】
前記各オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。
【００６５】
前記P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましく、前記P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号104に相同的な塩基」とは、配列番号２の塩基配列における104番目の塩基（c）に相同的な塩基（c）を意味する。具体的に、塩基番号104に相同的な塩基は、P5およびP6のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。前記P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有することが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおける「塩基番号145に相同的な塩基」とは、配列番号3の塩基配列における145番目の塩基（ｃ）に相同的な塩基（ｃ）を意味する。具体的に、塩基番号145に相同的な塩基は、P7のオリゴヌクレオチドにおいて、ｃで表わされる。
【００６６】
前記P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有することが好ましく、前記P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有することが好ましく、前記P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端に有することが好ましい。
【００６７】
前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号５に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3' （配列番号５）(5FL-EGFR-EX19-F2)
【００６８】
前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3'（配列番号４）(5T-EGFR-EX19-No19-F2-3)
【００６９】
前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-agcaacaaaggaaatc-3' （配列番号６）(3T-EGFR-EX19-No18-F1)
【００７０】
本発明において、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のオリゴヌクレオチドは、前述のものには限定されず、それぞれ、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドの意味も含む。
（ａ）前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のいずれかのオリゴヌクレオチドに相同性を有する配列を有し、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19の前記いずれかのオリゴヌクレオチドと同程度の作用（例えば、プローブとしての結合能）を示すオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のいずれかのオリゴヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19の前記いずれかのオリゴヌクレオチドと同程度の作用（例えば、プローブとしての結合能）を示すオリゴヌクレオチド
【００７１】
前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイおよびストリンジェントな条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）〕等に記載されている方法および条件を採用できる。
【００７２】
本発明において、前記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P19のオリゴヌクレオチドは、前述のように、例示列挙した前記配列のいずれかに相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドでもよい。前記相同性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。本発明のプローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよい。
【００７３】
前記プローブは、例えば、天然核酸で構成されてよく、非天然核酸で構成されてよい。前記天然核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡがあげられる。前記非天然核酸は、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ：ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ともいう）等の架橋化核酸、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）等があげられる。前記プローブは、例えば、前記非天然核酸により構成されることで、検出対象配列に対してハイブリダイズする能力を向上できるため、例えば、プローブの配列を短く設計できる。前記ＬＮＡにより構成されるプローブと前記検出対象配列とのＴｍ値の予測は、例えば、EXIQON社のホームページ（http://www.exiqon.com/oligo-tools）等で計算できる。
【００７４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加するものがあげられる。また、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するものがあげられる。
【００７５】
前記蛍光色素は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光色素は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）等があげられる。前記蛍光色素の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光色素の種類により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【００７６】
多型検出用プローブには、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。
【００７７】
このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）もしくは５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出目的配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。また、前記標識物質は、例えば、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合できる。
【００７８】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００７９】
なお、ＱＰｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式は、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法またはＲＦＬＰ法などを挙げることができる。
【００８０】
前記蛍光色素は、特に制限されず、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素は、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されず、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
【００８１】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出する方法であって、前記検出配列とハイブリダイズするプローブを使用することを特徴とする。
【００８２】
なお、本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。本発明は、例えば、医療分野の他、診断および治療方法を除く分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【００８３】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と本発明の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
【００８４】
前記（Ａ）工程において、前記本発明の多型検出用プローブは、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。使用する前記多型検出用プローブの種類は、例えば、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。
【００８５】
前記（Ａ）工程において使用する前記多型検出用プローブは、少なくとも一種類が、本発明の多型検出用プローブであればよい。前記プローブの種類は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型に応じて、適宜決定できる。本発明においては、例えば、ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出してもよいし、エクソン１９多型のみを検出してもよいし、両方の多型を一つの反応系で検出することもできる。また、前記ＥＧＦＲ８５８多型およびエクソン１９多型の少なくとも一方と、その他の多型とを、一つの反応系で検出することも可能である。前記その他の多型は、特に制限されず、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ７９０多型等があげられる。
【００８６】
前記ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブを使用することが好ましい。前記ＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブでもよいし、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブでもよいし、両方を併用してもよい。
【００８７】
前記エクソン１９多型のみを検出する場合、前記本発明の多型検出用プローブの中でも、前記エクソン１９用野生型プローブ、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブの少なくともいずれか一種類を使用することが好ましい。前記エクソン１９用野生型プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９多型が、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型２〜多型１７）かを検出でき、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型２〜１５、１７）かを検出でき、前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブを使用することにより、例えば、エクソン１９野生型（前記多型１）か、エクソン１９変異型（前記多型１８）かを検出できる。本発明において、前記エクソン１９用野生型プローブ、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブのいずれを用いてもよいし、前記多型１か、前記多型２〜１８かを判断できることから、２種類以上を併用してもよい。プローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、P5とP7との組み合わせが、多型1〜18の18種類を検出可能であり、P6とP7との組み合わせが、多型16を除く17種類を検出可能であり(P5は自己消光するが、P6は自己消光しない)、P5単独が、多型18を除く17種類を検出可能であり、P6単独が、多型16、18を除く16種類を検出可能であり(P5は自己消光するが、P6は自己消光しない)、P7単独が、多型18のみの1種類を検出可能であり、好ましい。
【００８８】
本発明は、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと、前記エクソン１９用プローブとを併用することが望ましい。本発明のプローブは、前述のように、優れた信頼性で多型を検出できるため、例えば、一つの反応液において、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと、前記エクソン１９用プローブとを使用しても、前記ＥＧＦＲ８５８多型と、エクソン１９多型とを、それぞれ特異的に検出可能である。前記エクソン１９用プローブは、前述のように、前記エクソン１９用野生型プローブと、前記エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブおよび前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとを併用することが好ましい。
【００８９】
本発明は、例えば、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０の多型を検出してもよく、前記ＥＧＦＲ８５８の多型および／またはエクソン１９の多型と同時に検出することが好ましい。「同時に検出」とは、例えば、同じ一つの反応系を用いた検出の意味を含む。この場合、本発明は、前記両プローブ以外に、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブを併用してもよい。
【００９０】
前記ＥＧＦＲ７９０用プローブは、特に制限されず、例えば、下記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドからなるプローブがあげられる。
（Ｐ１４）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号２１に示す塩基配列において、３３４番目の塩基（ｇ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列又は前記相補的な配列に相同性を有する塩基配列からなり、３４７番目の塩基に対応する塩基がグアニンまたはアデニンであり、３３４番目に対応する塩基がシトシンであるオリゴヌクレオチド
【００９１】
前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、例えば、配列番号２１に示す塩基配列において、３４７番目の塩基の置換変異の有無を検出するためのプローブである。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号２１の３４７番目に対応する相補的な塩基は、ｒで表され、前記ｒは、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）である。ｒがグアニン（ｇ）である前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列より、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ７９０用野生型プローブといえる。ｒがアデニン（ａ）である前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列より、ＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列に強くハイブリダイズするため、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブといえる。これらのオリゴヌクレオチドが、前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出配列のうち、ＥＧＦＲ７９０野生型の検出配列またはＥＧＦＲ７９０変異型の検出配列のいずれと強くハイブリダイズするかによって、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出できる。前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、３’末端がシトシンとなる。
【００９２】
前記（Ｐ１４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２２に示されるオリゴヌクレオチドがあげられ、この塩基配列において、ｒは、前述の通りである。前記オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブである、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチド、およびＥＧＦＲ７９０用野生型プローブである、配列番号２４に示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-tgagctgcrtgatgaggtgcac-3' （配列番号２２）
5'-tgagctgcatgatgaggtgcac-3' （配列番号２３）（3T-EGFR-T790M-mt-R3）
5'-tgagctgcgtgatgaggtgcac-3' （配列番号２４）
【００９３】
本発明において、前記Ｐ１４のオリゴヌクレオチドは、前述のように、例示列挙した前記配列のいずれかに相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドでもよい。前記相同性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。
【００９４】
前記（Ａ）工程において、前記多型検出用プローブを二種類以上併用する場合、例えば、各プローブが、異なる標識物質を有する標識プローブであることが好ましい。前記異なる標識物質は、例えば、検出条件の異なる標識物質があげられる。
【００９５】
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が前記二本鎖核酸の場合、例えば、後述するように、前記（Ａ）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の前記被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。前記二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、例えば、本発明の多型検出用プローブと前記一本鎖核酸とがハイブリダイズしやすくなる。
【００９６】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、試料中に元来含まれる核酸でもよいし、検出精度を向上できることから、前記核酸を鋳型核酸として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物でもよい。前記増幅産物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。また、前記被検核酸は、例えば、前記試料中のトータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡでもよいし、前記ｃＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。前記増幅産物は、例えば、前記検出配列を含む領域の増幅産物であることが好ましい。前記検出配列は、前記検出部位として、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位のみを含んでもよいし、前記エクソン１９多型の検出部位のみを含んでもよい。また、前記検出部位として、前記ＥＧＦＲ８５８多型と前記エクソン１９多型とを含んでもよい。また、前記検出部位として、さらに、前述のＥＧＦＲ７９０多型を含んでもよい。
【００９７】
本発明の多型検出方法は、例えば、前記被検核酸が前記増幅産物の場合、例えば、さらに、前記鋳型核酸から前記増幅産物を生成する工程を含んでもよい。前記増幅産物の生成工程は、例えば、前記（Ａ）工程に先立って行ってもよいし、前記（Ａ）工程において、行ってもよい。
【００９８】
前記被検核酸が前記増幅産物の場合、前記（Ａ）工程において、例えば、予め調製した増幅産物を用いて、本発明の多型検出用プローブと前記増幅産物とを含む反応系を準備してもよいし、本発明の多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅産物を生成し、前記多型検出用プローブと前記増幅産物とを含む反応系を準備してもよい。
【００９９】
前記核酸の増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、前記増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【０１００】
前記鋳型核酸からの前記増幅産物の生成には、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅することの可能なプライマーを使用することが好ましい。
【０１０１】
前記プライマーによる増幅領域は、特に制限されず、検出目的の多型に応じて適宜設定できる。すなわち、検出目的の多型が前記ＥＧＦＲ８５８多型の場合、前記増幅領域は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位を含む領域、すなわち、配列番号１の塩基配列において２６１番目の塩基を含む領域が好ましい。具体的には、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P19の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域が好ましい。また、検出目的の多型が前記エクソン１９多型の場合、前記増幅領域は、例えば、前記エクソン１９多型の検出部位を含む領域、すなわち、配列番号２の塩基配列において１１２〜１５１番目の塩基を含む領域が好ましい。具体的には、配列番号2に示す塩基配列におけるP5〜P6のオリゴヌクレオチドおよび配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つが、ハイブリダイズする配列を含む領域が好ましい。また、検出目的の多型が前記ＥＧＦＲ８５８多型および前記エクソン１９多型である場合、前記増幅領域は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８多型の検出部位を含む領域と前記エクソン１９多型の検出部位を含む領域との二領域でもよい。前記増幅領域は、さらに、例えば、前記ＥＧＦＲ７９０多型の検出部位を含む領域を含んでもよい。
【０１０２】
なお、前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出部位を含む検出配列を増幅できればよく、前記検出配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜５０塩基長があげられる。
【０１０３】
前記プライマーは、例えば、センス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。前記プライマーの一例として、以下に、本発明のプライマーを説明する。
【０１０４】
EGFRexon21 L858Rの遺伝子変異を検出するためのプライマーは、例えば、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P19の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーがあげられ、具体例として、下記P8〜P10から選択される多型検出用プライマーがあげられる。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【０１０５】
前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１５に記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１７記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１０のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１６記載のオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3' （配列番号１５）(EGFR-L858R-F2)
5'-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3' （配列番号１６）(EGFR-L858R-R2)
5'-gcctccttctgcatggtattctttctc-3' （配列番号１７）(EGFR-L858R-R1)
【０１０６】
また、EGFRexon19 deletionの遺伝子変異を検出するためのプライマーは、例えば、EGFR遺伝子の配列番号2に示す塩基配列におけるP5およびP6の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする配列を含む領域、または、配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーがあげられ、具体例として、例えば、下記P11〜P13から選択される多型検出用プライマーがあげられる。
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【０１０７】
前記Ｐ１１のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１２のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１９記載のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記Ｐ１３のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドがあげられる。
5'-gatcccagaaggtgagaaag-3' （配列番号１８）(EGFR-EX19-F1)
5'-tctctctgtcatagggactc-3' （配列番号１９）(EGFR-EX19-F2)
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3' （配列番号２０）(EGFR-EX19-R1)
【０１０８】
前記反応系において、前記プライマーの添加濃度は、特に制限されず、例えば、一種類のプライマーについて、例えば、０．１〜４μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、前記Ｆプライマー（Ｆ）とＲプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【０１０９】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、特に制限されず、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましい。この際、前記被検核酸とは、例えば、野生型検出配列を含む核酸と変異型検出配列を含む核酸との合計でもよいし、野生型検出配列を含む増幅産物と変異型検出配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、被検核酸において、前記多型検出用プローブにより強くハイブリダイズする検出配列を含む核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、より強くハイブリダイズする検出配列を含む核酸（前記検出配列を含む増幅産物）に対して２０倍以下となることが好ましく、より好ましくは１０倍以下、さらに、好ましくは５倍以下である。また、その下限は特に制限されず、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１１０】
前記反応系における本発明の多型検出用プローブの添加濃度は、特に制限されず、例えば、一種類の前記多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【０１１１】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、特に制限されず、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記生体試料が全血の場合、前記反応系における前記全血の濃度は、例えば、０．０１〜２体積％であり、好ましくは、０．０５〜１．５体積％であり、より好ましくは、０．１〜１体積％である。また、前記生体試料が血清の場合、前記反応系における前記血清の濃度は、例えば、０．１〜２０体積％であり、好ましくは、０．２５〜１５体積％であり、より好ましくは、０．５〜１０体積％である。
【０１１２】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析（融解曲線解析ともいう）に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【０１１３】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述したように、前記蛍光色素のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記蛍光色素のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。前記蛍光色素のシグナル検出は、例えば、前記蛍光色素のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。なお、前記標識プローブならびに前記蛍光色素については、前述のとおりである。
【０１１４】
次に、本発明の多型検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明の多型検出用プローブとして、蛍光色素で標識された標識プローブを使用し、前記多型検出用プローブの存在下、鋳型核酸からの増幅を行い、得られた増幅産物を、前記被検核酸とする例である。なお、本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【０１１５】
まず、前記生体試料からゲノムＤＮＡを単離する。前記生体試料からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。具体例としては、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【０１１６】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識プローブを添加して、反応液を調製する。前記標識プローブは、例えば、前述のように、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）が好ましい。
【０１１７】
前記標識プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の増幅用反応液等、従来公知のものがあげられる。
【０１１８】
なお、前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、増幅反応の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記増幅反応前に前記反応液に添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【０１１９】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識プローブの存在下、ＰＣＲ等の増幅法によって、目的の多型が発生する検出部位を含む配列を増幅させる。以下、増幅法としてＰＣＲを例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【０１２０】
具体的には、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーを含む前記反応液を用いて、ＰＣＲを行う。この反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できるが、例えば、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。前記反応液における前記標識プローブおよび前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、それぞれ前述の範囲があげられる。
【０１２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９２／９６８９）（Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ ４５５ ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【０１２２】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜４０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【０１２３】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１２４】
前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【０１２５】
また、前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【０１２６】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【０１２７】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されず、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ下記表２の条件が例示できる。また、サイクル数も特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
前記反応液における標識プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１３０】
次に、得られた増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【０１３１】
前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅産物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【０１３２】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。また、前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【０１３３】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１３４】
前記蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されず、開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【０１３５】
次に、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）の最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、前記標識プローブとして、蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１３６】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。
【０１３７】
そして、前記Ｔｍ値から、ＥＧＦＲ遺伝子の多型が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。前記Ｔｍ解析において、野生型プローブは、前記変異型検出配列より前記野生型検出配列に対して、強くハイブリダイズする。このため、前記野生型プローブと前記野生型検出配列とのＴｍ値は、前記野生型プローブと前記変異型検出配列とのＴｍ値より高い値を示す。一方、変異型プローブは、前記野生型検出配列より前記変異型検出配列に対して強くハイブリダイズする。このため、前記変異型プローブと前記変異型検出配列とのＴｍ値は、前記変異型プローブと前記野生型検出配列とのＴｍ値より高い値を示す。前記プローブが検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）と、そのＴｍ値（ＴｍＨ）より低い値でプローブが検出配列にハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＬ）とを決定しておくことにより、前記検出配列が、前記野生型多型と、前記変異型多型とのいずれを含むかを決定できる。また、前記野生型プローブが前記野生型検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）を決定しておくことで、前記野生型プローブを用いて前記Ｔｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）が得られた場合は、前記変異型検出配列であることが決定できる。一方、前記変異型プローブが前記変異型検出配列に対して強くハイブリダイズするＴｍ値（ＴｍＨ）を決定しておくことで、前記変異型プローブを用いて前記Ｔｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）が得られた場合は、野生型検出配列であることが決定できる。
【０１３８】
例えば、前記プローブとして、変異型プローブを使用した場合、既定した変異型検出配列とのＴｍ値（ＴｍＨ）を示せば、多型は変異型、その既定したＴｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）を示せば、多型は野生型と判断できる。一方、例えば、前記プローブとして、野生型プローブを使用した場合、既定した野生型検出配列とのＴｍ値（ＴｍＨ）を示せば、多型は野生型、その既定したＴｍ値（ＴｍＨ）より低いＴｍ値（ＴｍＬ）を示せば、多型は変異型と判断できる。
【０１３９】
また、本発明においては、前述のように、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【０１４０】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１４１】
本発明は、前述のように、例えば、一つの反応系において、二種類以上の多型検出用プローブを使用できる。複数の多型検出用プローブを使用する場合、各プローブの添加のタイミングは、例えば、前述と同様であり、前記（Ａ）工程に先立って、同時に添加することが好ましく、増幅反応を行う場合、増幅反応前に、同時に添加することが好ましい。
【０１４２】
複数のプローブは、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブとの組み合わせがあげられ、具体的には、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用野生型プローブとの組み合わせ、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとの組み合わせ、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用野生型プローブと前記エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとの組み合わせが例示できる。本発明においては、例えば、さらに、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブを組み合わせてもよい。
【０１４３】
前記ＥＧＦＲ８５８多型およびエクソン１９多型の二つを、一反応系で検出する際、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブとを併用できる。この際、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブと前記エクソン１９用プローブは、前述のように、それぞれ異なる標識物質を有することが好ましい。そして、前記反応液の温度を変化させ、各標識物質の測定条件に応じてシグナルを検出することによって、それぞれのＴｍ値を決定できる。
【０１４４】
また、前記ＥＧＦＲ８５８多型または前記ＥＧＦＲ７９０多型の検出には、それぞれ、例えば、目的の多型について、前記野生型プローブおよび変異型プローブを併用することもできる。この場合、例えば、完全に相補なマッチのハイブリッドのＴｍを示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類を決定することもできる。例えば、異なる標識物質を有する変異型プローブと野生型プローブとを使用した場合、変異型プローブについて、完全に相補なマッチハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は変異型と判断でき、野生型プローブについて、完全に相補なマッチハイブリッドのＴｍ値を示せば、多型は野生型と判断できる。
【０１４５】
また、本発明の多型検出方法は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出するための本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子の多型を検出するためのプローブとを併用できる。本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子を検出するためのプローブとを併用することによって、一つの反応系において、ＥＧＦＲ遺伝子を含む二種類以上の遺伝子の多型を検出できる。ＥＧＦＲ遺伝子の前記その他の多型は、特に制限されず、例えば、前述のＥＧＦＲ７９０多型があげられる。
【０１４６】
＜判定方法＞
本発明の判定方法は、本発明の多型検出用プローブを用いた多型検出方法を行うことが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。また、多型によるEGFR-TKIに対する耐性または薬効の判定は、例えば、公知の基準に基づいて行うことができる。
【０１４７】
＜試薬キット＞
本発明の試薬キットは、ＥＧＦＲ遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、前記本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の試薬キットは、本発明のプローブを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の試薬キットに含まれる本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよく、組み合わせは、例えば、前述の通りである。本発明の試薬キットは、例えば、さらに、前述した本発明のプライマーを含むことが好ましく、プライマーの組み合わせは、特に制限されず、前述の通りである。本発明の試薬キットは、例えば、さらに、核酸増幅反応に必要な成分、使用説明書等を含んでもよい。
【０１４８】
＜プライマー試薬＞
本発明のプライマー試薬において、前記本発明のプライマーは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。前記プライマーの種類は、例えば、目的の増幅領域に応じて適宜決定できる。前記ＥＧＦＲ８５８多型を含む検出配列を増幅する場合は、前記Ｐ８、Ｐ９およびＰ１０のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうち少なくとも一つを含むことが好ましく、特に、前述の配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーを含むことが好ましい。また、前記エクソン１９多型を含む検出配列を増幅する場合は、前記Ｐ１１、Ｐ１２およびＰ１３のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうち少なくとも一つを含むことが好ましく、特に、前述の配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーを含むことが好ましい。本発明のプライマー試薬は、例えば、前記プライマーとして、前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドと、Ｐ９またはＰ１０のオリゴヌクレオチドと、Ｐ１１またはＰ１２のオリゴヌクレオチドと、Ｐ１３のオリゴヌクレオチドとを含むことにより、前記ＥＧＦＲ８５８多型を含む検出配列および前記エクソン１９多型を含む検出配列を増幅できる。また、前記プライマーの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１４９】
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を検出するための試薬であって、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、本発明の多型検出用試薬は、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
【０１５０】
前記多型検出用試薬は、例えば、前記多型検出用プローブを一種類含んでもよいし、二種類以上含んでもよく、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。前記ＥＧＦＲ８５８多型のみを検出する場合は、例えば、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブを含むことが好ましい。前記ＥＧＦＲ８５８用プローブは、例えば、ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブでもよいし、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブでもよいし、両方を含んでもよい。また、前記エクソン１９多型のみを検出する場合は、例えば、前記エクソン１９用プローブを含むことが好ましい。前記エクソン１９用プローブは、例えば、エクソン１９用野生型プローブ、エクソン１９用変異型（ｓｕｂ）プローブ、エクソン１９用変異型（ｄｅｌ）プローブのいずれか１種類でもよいし、２種類でもよいし、全てを含んでもよい。前記プローブの組み合わせは、前述のとおりに例示できるが、これには制限されない。
【０１５１】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明のＥＧＦＲ遺伝子多型検出用試薬キットは、ＥＧＦＲ遺伝子の多型の検出に使用する試薬キットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の試薬キットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのＴｍ分析を行う場合、各プローブは、別個の蛍光物質で標識化されていることが好ましい。このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記蛍光物質は、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【０１５２】
また、ＥＧＦＲ遺伝子多型検出用試薬キットは上記多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むものであってもよい。
【実施例】
【０１５３】
本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【０１５４】
［実施例１］
野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０１５５】
前記野生型プラスミドおよび変異型プラスミドとして、ＥＧＦＲ８５８野生型プラスミド（Ｌ８５８ＷＴ）と、ＥＧＦＲ８５８変異型プラスミド（Ｌ８５８Ｒ）とを準備した。前記ＥＧＦＲ８５８野生型プラスミド（Ｌ８５８ＷＴ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号１の１１２番目から４１１番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号１の２６１番目の塩基（ｋ）は、チミン（ｔ）である。前記ＥＧＦＲ８５８変異型プラスミド（Ｌ８５８Ｒ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号１の１１２番目から４１１番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号１の２６１番目の塩基（ｋ）は、グアニン（ｇ）である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、３種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０１５６】
【表３】
【０１５７】
下記表４のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
前記ＥＧＦＲ８５８用プライマーの配列を以下に示す。
Ｆプライマー （配列番号１５）（EGFR-L858R-F2）
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3'
Ｒプライマー （配列番号１６）（EGFR-L858R-R2）
5'-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3'
【０１６０】
前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、下記配列のＥＧＦＲ８５８用変異型プローブを使用した。下記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、ＥＧＦＲ８５８変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における変異型プローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ用変異型プローブ （配列番号７）（3T-EGFR-858-R2）
5'-ttggcccgcccaaaatc-(TAMRA)-3'
【０１６１】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）はＬ８５８ＷＴ １００％、（Ｂ）はＬ８５８Ｒ ５％、（Ｃ）はＬ８５８Ｒ １０％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｌ８５８ＷＴとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５５℃付近、Ｌ８５８ＲとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６４℃付近である。
【０１６２】
図１（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図１（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＬ８５８Ｒ １０％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図１（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＬ８５８Ｒ ５％についても、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０１６３】
［実施例２］
本例では、野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０１６４】
下記配列に示す、配列番号１における２４１番目〜２９０番目に相同なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（EGFR-L858R(WT)-F）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（EGFR-L858R(MT)-F）を調製した。以下の２つの配列において、下線部が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μ／Ｌに調整して、試料とした。
EGFR-L858R(WT)-F（配列番号３２）
caagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
EGFR-L858R(MT)-F（配列番号３３）
caagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
【０１６５】
下記表５の反応液２５μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
下記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、ＥＧＦＲ８５８変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における変異型プローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ（配列番号９）（3T-EGFR-858-R1）
5'-cagtttggcccgccc-(TAMRA)-3'
【０１６８】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）はEGFR-L858R(WT)-F、（Ｂ）はEGFR-L858R(MT)-Fの結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、EGFR-L858R(WT)-FとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５４℃付近、EGFR-L858R(MT)-FＬとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６６℃付近である。
【０１６９】
図２（Ａ）に示すように、EGFR-L858R(WT)-Fは、EGFR-L858R(WT)-FのＴｍ値でのみピークが確認され、図２（Ｂ）に示すように、EGFR-L858R(MT)-Fは、EGFR-L858R(MT)-FのＴｍ値でのみピークが確認された。
【０１７０】
［実施例３］
本例では、野生型オリゴヌクレオチドおよび変異型オリゴヌクレオチドについてＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。BODIPY FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした。
【０１７１】
（１）オリゴヌクレオチド
前記野生型および変異型オリゴヌクレオチドとして、下記表６に示すオリゴヌクレオチド１〜１８を準備した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖に相補的な配列である。下記オリゴヌクレオチド１は、野生型オリゴヌクレオチドであり、前記ｅｘｏｎ１９の多型１を含むセンス鎖の部分配列に相補的である。下記オリゴヌクレオチド２〜１８は、変異型オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、前記ｅｘｏｎ１９の多型２〜１８を含むセンス鎖の部分配列に相補的である。下記表６に、各オリゴヌクレオチドについて、配列番号２の塩基配列における対応領域を示す。なお、△に続く塩基配列の範囲は、欠失部位である。下記表６における１〜１８の配列は、それぞれ、配列番号４９〜６６に示す。
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
（２）Ｔｍ解析
下記表７の反応液２５μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、各蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。また、ネガティブコントロールとして、試料５μＬに代えて、蒸留水５μＬを添加した反応液２５μＬについて、同様に蛍光強度の変化を測定した。
【０１７４】
【表７】
【０１７５】
（実施例３−１）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整した。そして、前記オリゴヌクレオチド１が単独である試料１ｓ、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２〜１８とを体積比１：４で混合した試料２ｍ〜１８ｍを、前記反応液の試料として使用した。
【０１７６】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、野生型オリゴヌクレオチド１と完全に相補的な配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、７４℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
【０１７７】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、（Ａ）〜（Ｑ）は、順に、前記試料１ｓ、２ｍ〜１７ｍについて、蛍光色素を検出した結果であり、（Ｒ）は、ネガティブコントロールの結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１７８】
また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）との差（Δ℃）を、下記表８に示す。下記表８および図９に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）でのみピークが確認された。一方、野生型オリゴヌクレオチド１および変異型オリゴヌクレオチド２〜１７を含む試料２ｍ〜１７ｍは、それぞれ、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、前記試料２ｍ〜１７ｍは、野生型オリゴヌクレオチド１とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値と、それより低い温度との両方で、ピークが確認された。また、変異型オリゴヌクレオチド１８を含む試料１８については、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７４℃）でのみピークが確認され、それ以外の温度では、ピークが確認できなかった。
【０１７９】
【表８】
【０１８０】
（実施例３−２）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整した。そして、前記オリゴヌクレオチド１が単独である試料１ｓ、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２〜１８とを体積比１：４で混合した試料２ｍ〜１８ｍを、前記反応液の試料として使用した。
【０１８１】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、変異型オリゴヌクレオチド１８と完全に相補的な配列であり、前記プローブと前記変異型オリゴヌクレオチド１８とのＴｍ値は、５８℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブ（配列番号６）（3T-EGFR-EX19-No18-F１）
5'-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3'
【０１８２】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１０において、（Ａ）〜（Ｒ）は、順に、前記試料１ｓ、２ｍ〜１８ｍについて、蛍光色素を検出した結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１８３】
また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記変異型オリゴヌクレオチド１８のＴｍ値（５８℃）との差（Δ℃）を、下記表９に示す。下記表９および図１０に示すように、変異型オリゴヌクレオチド１８を含む試料１８ｍは、変異型オリゴヌクレオチド１８のＴｍ値（５８℃）でのみピークが確認された。一方、野生型オリゴヌクレオチドのみを含む試料１ｓは、ピークが検出されなかった。また、変異型オリゴヌクレオチド１８以外のオリゴヌクレオチドを含む試料２ｍ〜１７ｍは、それぞれ、試料１８ｍより低い温度でピークが確認された。
【０１８４】
【表９】
【０１８５】
（実施例３−３）
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、それぞれを単独で、前記ＰＣＲ反応液の試料（１ｓ〜１８ｓ）として使用した。
【０１８６】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、配列番号１における塩基番号119の塩基がｔであることを除いて、野生型オリゴヌクレオチド１と、相補的な配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、６７℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｓｕｂ）プローブ（配列番号４）（5FL-EGFR-EX19-No19-F2-3）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3'
【０１８７】
これらの結果を図１１に示す。図１１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１１において、（Ａ）〜（Ｑ）は、順に、前記試料１ｓ〜１７ｓについて、蛍光色素を検出した結果であり、（Ｒ）は、ネガティブコントロールの結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１８８】
Ｔｍ解析の結果として、各試料について、ピークの数、各ピークのＴｍ値および前記各ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（６７℃）との差（Δ℃）を、下記表１０に示す。下記表１０および図１１に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（６７℃）でのみピークが確認された。一方、変異型オリゴヌクレオチド２〜１５および１７のみを含む試料２ｓ〜１５ｓおよび１７ｓは、それぞれ、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値より低い温度で、ピークが確認された。また、変異型オリゴヌクレオチド１６または１８のみを含む試料１６ｓおよび１８ｓについては、ピークが確認できなかった。
【０１８９】
【表１０】
【０１９０】
[比較例３]
前記オリゴヌクレオチド１〜１８を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、それぞれを単独で、前記反応液の試料１ｓ〜１８ｓとして使用した。
【０１９１】
前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、野生型オリゴヌクレオチド１と強くハイブリダイズする配列であり、前記プローブと前記野生型オリゴヌクレオチド１とのＴｍ値は、７２℃付近である。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号２８）（5FL-EGFR-EX19-WT-F1）
5'-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3'
【０１９２】
これらの結果を図１２に示す。図１２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１２において、（Ａ）〜（Ｒ）は、順に、前記試料１ｓ〜１８ｓについて、蛍光色素を検出した結果である。各グラフにおいて、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。また、Ｔｍ解析の結果として、各試料について、最も大きなピークのＴｍ値および前記ピークのＴｍ値と前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（７２℃）との差（Δ℃）を、下記表１１に示す。
【０１９３】
図１２に示すように、試料１ｓは、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含むにも関わらず、ピークに肩が見られるため、野生型オリゴヌクレオチドか変異型オリゴヌクレオチドかを判別することができなかった。また、変異型オリゴヌクレオチド２〜１８のみを含む試料２ｓ〜１８ｓについても、複数のピークが確認された。さらに、試料２ｓ〜１８ｓは、下記表１１に示すように、最も大きなピークを示すＴｍ値が、前記野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値とほとんど差がみられなかった。
【０１９４】
【表１１】
【０１９５】
［実施例４］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。
【０１９６】
ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、前記表６のオリゴヌクレオチドが挿入されたプラスミドを準備した。具体的には、前記野生型オリゴヌクレオチド１が挿入されたｅｘｏｎ１９野生型プラスミド（ｅｘ１９ＷＴ）、前記変異型オリゴヌクレオチド２が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド２（ｅｘ１９ｍｔ２）、前記変異型オリゴヌクレオチド４が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド４（ｅｘ１９ｍｔ４）および変異型オリゴヌクレオチド６が挿入されたｅｘｏｎ１９変異型プラスミド６（ｅｘ１９ｍｔ６）を準備した。これらのプラスミドを、下記表１２に示す所定の割合で混合し、４種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０１９７】
【表１２】
【０１９８】
下記表１３のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、検出波長を、５２０〜５５５ｎｍおよび５８５〜７００ｎｍとした以外は、前記実施例１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
【０１９９】
【表１３】
【０２００】
前記ｅｘｏｎ１９用プライマーの配列を以下に示す。また、前記ｅｘｏｎ１９用プローブは、前記実施例３のｅｘｏｎ１９用野生型プローブおよびｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブを使用した。
Ｆプライマー （配列番号１８）（EGFR-EX19-F1）
5'-gatcccagaaggtgagaaag-3'
Ｒプライマー （配列番号２０）（EGFR-EX19-R1）
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3'
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
ｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブ（配列番号６）（3T-EGFR-EX19-No18-F１）
5'-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3'
【０２０１】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）はｅｘ１９ＷＴ １００％、（Ｂ）はｅｘ１９ｍｔ２ ５％、（Ｃ）はｅｘ１９ｍｔ４ ５％、（Ｄ）はｅｘ１９ｍｔ６ ５％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、６８℃付近であり、ｅｘ１９ｍｔ２、ｅｘ１９ｍｔ４およびｅｘ１９ｍｔ６とｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとのＴｍ値は、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用変異型（ｄｅｌ）プローブとのＴｍ値よりも低い温度であり、それぞれ、５１℃、５９℃、６０℃である。
【０２０２】
図３（Ａ）に示すように、ｅｘ１９ＷＴ １００％は、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含む試料では、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、それぞれ、野生型ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値と、それよりも低い温度との両方で、ピークが確認された。このように、本実施例のＦプライマー、Ｒプライマーおよびｅｘｏｎ１９用プローブを用いれば、野生型と変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、ｅｘｏｎ１９多型を検出可能であることがわかった。
【０２０３】
［実施例５］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。Pacific Blueの検出波長は、４４５−４８０ｎｍ、BODIPY FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした。
【０２０４】
（実施例５−１）
前記実施例１の３種類の試料（Ｌ８５８ＷＴ １００％、Ｌ８５８Ｒ ５％およびＬ８５８Ｒ １０％）を準備した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２０５】
下記表１４のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒および６０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、各プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
【０２０６】
【表１４】
【０２０７】
前記各ＦプライマーおよびＲプライマーの配列を以下に示す。
（ＥＧＦＲ８５８用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号１５）（EGFR-L858R-F2）
5'-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3'
Ｒプライマー （配列番号１７）（EGFR-L858R-R1）
5'-gcctccttctgcatggtattctttctc-3'
（ｅｘｏｎ１９用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号１９）（EGFR-EX19-F2）
5'-tctctctgtcatagggactc-3'
Ｒプライマー （配列番号２０）（EGFR-EX19-R1）
5'-gaaactcacatcgaggatttc-3'
（ＥＧＦＲ７９０用プライマー）
Ｆプライマー （配列番号２５）（EGFR-T790M-F2）
5'-tccaggaagcctacgtgatggccag-3'
Ｒプライマー （配列番号２６）（EGFR-T790M-R1）
5'-ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3'
【０２０８】
前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、ＴＡＭＲＡに代えて、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識化した前記実施例１と同じ配列のＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ（配列番号７）を用いた。前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、前記実施例３のｅｘｏｎ１９用野生型プローブ（配列番号５）を用いた。また、前記ＥＧＦＲ７９０用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。下記ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブは、ＥＧＦＲ７９０変異型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ７９０変異型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブ （配列番号７）（3PB-EGFR-858-R2）
5'-ttggcccgcccaaaatc-(Pacific Blue)-3'
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号５）（5FL-EGFR-EX19-F2）
5'-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3'
ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブ （配列番号２３）（3T-EGFR-790M-mt-R3）
5'-tgagctgcatgatgaggtgcac-(TAMRA)-3'
【０２０９】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４において、（Ａ）はＬ８５８ＷＴ １００％、（Ｂ）はＬ８５８Ｒ ５％、（Ｃ）はＬ８５８Ｒ １０％の結果であり、それぞれ、ＥＧＦＲ８５８用変異型プローブのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｌ８５８ＷＴとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、５１℃付近であり、Ｌ８５８ＲとＥＧＦＲ８５８変異型プローブとのＴｍ値は、６１℃付近である。
【０２１０】
図４（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図４（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＬ８５８Ｒ １０％は、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図４（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＬ８５８Ｒ ５％についても、Ｌ８５８ＷＴのＴｍ値およびＬ８５８ＲのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２１１】
（実施例５−２）
本例では、前記試料として、下記３種類の試料を用い、検出波長を５２５〜５５５ｎｍとした以外は、前記実施例５−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。
【０２１２】
前記試料は、前記実施例４の前記ｅｘｏｎ１９野生型プラスミド（ｅｘ１９ＷＴ）およびｅｘｏｎ１９変異型プラスミド６（ｅｘ１９ｍｔ６）を、以下に示す所定の割合で混合して調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２１３】
【表１５】
【０２１４】
これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）はｅｘ１９ＷＴ １００％、（Ｂ）はｅｘ１９ｍｔ６ ５％、（Ｃ）はｅｘ１９ｍｔ６ １０％の結果であり、それぞれ、ｅｘｏｎ１９用野生型プローブのＢＯＤＩＰＹ ＦＬを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、ｅｘ１９ＷＴとｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、６８℃付近であり、ｅｘ１９ｍｔ６とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、５９℃付近である。
【０２１５】
図５（Ａ）に示すように、ｅｘ１９ＷＴ １００％はｅｘ１９ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図５（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むｅｘ１９ｍｔ６ １０％は、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値およびｅｘ１９ｍｔ６のＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図５（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたｅｘ１９ｍｔ６ ５％についても、ｅｘ１９ＷＴのＴｍ値およびｅｘ１９ｍｔ６のＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２１６】
（実施例５−３）
本例では、前記試料として、下記３種類の試料を用い、検出波長を５８５−７００ｎｍとした以外は、前記実施例５−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ７９０多型を検出した。
【０２１７】
前記野生型プラスミドおよび変異型プラスミドとして、ＥＧＦＲ７９０野生型プラスミド（Ｔ７９０ＷＴ）と、ＥＧＦＲ７９０変異型プラスミド（Ｔ７９０Ｍ）とを準備した。前記ＥＧＦＲ７９０野生型プラスミド（Ｔ７９０ＷＴ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号２１の１９７番目から４９６番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、シトシン（ｃ）である。前記ＥＧＦＲ７９０変異型プラスミド（Ｔ７９０Ｍ）は、ＥＧＦＲ遺伝子の部分配列として、配列番号２１の１９７番目から４９６番目のオリゴヌクレオチドが挿入されており、配列番号２１の３４７番目の塩基（ｙ）は、チミン（ｔ）である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、３種類の試料を調製した。前記試料は、１μＬあたり、プラスミド２５０コピーとした。
【０２１８】
【表１６】
【０２１９】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）はＴ７９０ＷＴ １００％、（Ｂ）はＴ７９０Ｍ ５％、（Ｃ）はＴ７９０Ｍ １０％の結果であり、それぞれ、ＥＧＦＲ７９０用変異型プローブのＴＡＭＲＡを検出した結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、Ｔ７９０ＷＴとＥＧＦＲ７９０用変異型プローブとのＴｍ値は、６０℃付近であり、Ｔ７９０ＭとＥＧＦＲ７９０用変異型プローブとのＴｍ値は、６６℃付近である。
【０２２０】
図６（Ａ）に示すように、Ｔ７９０ＷＴ １００％はＴ７９０ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図６（Ｃ）に示すように、１０％の変異型プラスミドを含むＴ７９０Ｍ １０％は、Ｔ７９０ＷＴのＴｍ値およびＴ７９０ＭのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。また、図６（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドの含有量を５％に低下させたＴ７９０Ｍ ５％についても、Ｔ７９０ＷＴのＴｍ値およびＴ７９０ＭのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。
【０２２１】
［比較例１］
本例では、前記ＥＧＦＲ８５８用プローブとして、下記ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブを用いた以外は、前記実施例２と同様にして、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。
【０２２２】
下記ＥＧＦＲ８５８野生型プローブは、ＥＧＦＲ８５８野生型のＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ＥＧＦＲ８５８野生型に相補的な塩基である。前記ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブは、５’末端を、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅで標識化した。
ＥＧＦＲ８５８用野生型プローブ （配列番号２７）（5PB-EGFR858861WT-R1）
5'-(Pacific Blue)-ccagcagtttggccagc-3'
【０２２３】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）はEGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)、（Ｂ）はEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）、（Ｃ）はEGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)とEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）を1:1の割合で混合した試料の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０２２４】
図７（Ａ）に示すように、Ｌ８５８ＷＴ １００％は、６８℃でのみピークが確認され、図７（Ｂ）に示すように、Ｌ８５８Ｒ １００％は、７１℃でのみピークが確認された。しかし、両ピークの温度の差は３℃であり、その差が小さかった。また、図７（Ｃ）に示すように、EGFR-L858R(WT)-F(配列番号32)とEGFR-L858R（MT）-F（配列番号33）の混合試料は、７１℃で、Ｌ８５８ＷＴとＬ８５８Ｒのピークが重なり、両者を検出し分けることができなかった。このように、ＥＧＦＲ８５８野生型の検出ピークと、ＥＧＦＲ８５８変異型の検出ピークとが接近するため、例えば、野生型と変異型とが混在する場合、正確な検出が困難である。
【０２２５】
［比較例２］
本例では、４種類の試料を用い、前記ｅｘｏｎ１９用プローブとして、下記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブを用い、検出波長を５２０〜５５５ｎｍとした以外は、前記実施例３と同様にして、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９多型を検出した。なお、前記試料として、前記実施例３のオリゴヌクレオチド１、２、４および６を５μｍｏｌ／Ｌに調整し、前記オリゴヌクレオチド１単独の試料１、前記オリゴヌクレオチド１と前記オリゴヌクレオチド２、４または６とを体積比１：５で混合した、試料２、試料４および試料６を調製した。
【０２２６】
下記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブは、ｅｘｏｎ１９野生型のＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖における検出配列に強くハイブリダイズするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、ｅｘｏｎ１９野生型に相補的な塩基である。前記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブは、５’末端を、蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬで標識化した。
ｅｘｏｎ１９用野生型プローブ （配列番号２８）（5FL-EGFR-EX19-WT-F1）
5'-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3'
【０２２７】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、前記ｅｘｏｎ１９用野生型プローブを使用した結果であり、（Ａ）は試料１、（Ｂ）は試料２、（Ｃ）は試料４、（Ｄ）は試料６の検出結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。なお、オリゴヌクレオチド１とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近、オリゴヌクレオチド２とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近、オリゴヌクレオチド４とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、４９℃付近、オリゴヌクレオチド６とｅｘｏｎ１９用野生型プローブとのＴｍ値は、７１℃付近である。
【０２２８】
図８（Ａ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１のみを含む試料１は、オリゴヌクレオチド１のＴｍ値でのみピークが確認された。また、図８（Ｃ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１および変異型オリゴヌクレオチド４を含む試料４は、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値と、変異型オリゴヌクレオチド４のＴｍ値との両方で、ピークが確認された。しかしながら、図８（Ｂ）および（Ｄ）に示すように、野生型オリゴヌクレオチド１と変異型オリゴヌクレオチド２または６とを含む試料２および６は、野生型オリゴヌクレオチド１のＴｍ値ではピークが確認されたが、各変異型オリゴヌクレオチドのＴｍ値では、ピークが確認されなかった。
【０２２９】
［実施例６］
本例では、下記表１７に示すプローブを使用し、下記野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行った以外は、実施例２と同様の方法で、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。なお、下記表１７において、配列番号７１および配列番号８７に示すプローブは、本発明のプローブには該当しないプローブである。
【０２３０】
配列番号１における２１７番目〜３０６番目に相同なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（配列番号６７：EGFR-L858R(WT)-F90）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（配列番号６８：EGFR-L858R(MT)-F90）を調製した。以下の２つの配列において、下線部の塩基が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μｍｏｌ／Ｌに調製して、８５８野生型試料および８５８変異型試料とした。
EGFR-L858R(WT)-F90（配列番号６７）
actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg
EGFR-L858R(MT)-F90（配列番号６８）
actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg
【０２３１】
Ｔｍ解析において、各プローブについて、前記野生型試料とのＴｍ値および前記変異型試料とのＴｍ値を測定し、その差（ΔＴｍ）を算出した。そして、その算出値から、下記評価基準に従って、各プローブが、ＥＧＦＲ８５８の野生型および変異型を判別できるか否かを評価した。これらの結果を、下記表１７にあわせて示す。
（評価基準）
○ ：ΔＴｍが３℃以上であり、野生型と変異型とを有効に判別可能
× ：ΔＴｍが３℃未満であり、野生型と変異型とを有効に判別不可
【０２３２】
【表１７】
【０２３３】
前記表１７に示すように、実施例の各プローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認され、前記野生型試料とのＴｍ値よりも、前記変異型試料とのＴｍ値が、３℃以上高い値を示した（ΔＴｍ≧３℃）。一方、比較例のプローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認されたが、ΔＴｍが３℃未満であった。このことから、実施例のプローブによれば、例えば、野生型検出配列と変異型検出配列とが共存する際に、両者を有効に判別できることがわかった。
【０２３４】
［実施例７］
本例では、下記表１８に示すプローブを使用し、下記野生型人工核酸および変異型人工核酸のそれぞれに対して、Ｔｍ解析を行った以外は、実施例２と同様の方法で、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型を検出した。なお、下記表１８において、配列番号９３に示すプローブは、本発明のプローブに該当しないプローブである。
【０２３５】
配列番号１における２１７番目〜３０６番目に相補的なＥＧＦＲ８５８野生型人工核酸（配列番号６９：EGFR-L858R(WT)-R90）およびＥＧＦＲ８５８変異型人工核酸（配列番号７０：EGFR-L858R(MT)-R90）を調製した。以下の２つの配列において、下線部の塩基が配列番号１における２６１番目の塩基に該当する。各人工核酸を５μｍｏｌ／Ｌに調製して、ＥＧＦＲ８５８野生型試料および８５８変異型試料とした。
EGFR-L858R(WT)-R90（配列番号６９）
ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggccagcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt
EGFR-L858R(MT)-R90（配列番号７０）
ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggcccgcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt
【０２３６】
Ｔｍ解析において、各プローブについて、前記野生型試料とのＴｍ値および前記変異型試料とのＴｍ値を測定した。そして、前記実施例６と同様にして、各プローブを評価した。これらの結果を、下記表１８にあわせて示す。
【０２３７】
【表１８】
【０２３８】
前記表１８に示すように、実施例の各プローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認され、前記野生型試料とのＴｍ値よりも、前記変異型試料とのＴｍ値が、３℃以上高い値を示した（ΔＴｍ≧３℃）。一方、比較例のプローブは、野生型試料および変異型試料のいずれに対しても、１つのピークが確認されたが、ΔＴｍが３℃未満であった。このことから、実施例のプローブによれば、例えば、野生型検出配列と変異型検出配列とが共存する際に、両者を有効に判別できることがわかった。
【０２３９】
以上の実施例１〜７および比較例１〜３の結果より、これらの実施例におけるＦプライマー、Ｒプライマーおよびプローブを用いれば、例えば、野生型と変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、ＥＧＦＲ遺伝子のＥＧＦＲ８５８多型、ｅｘｏｎ１９多型およびＥＧＦＲ７９０多型を検出可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２４０】
本発明の多型検出方法によれば、本発明の多型検出用プローブを使用することによって、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＥＧＦＲ遺伝子と変異型であるＥＧＦＲ遺伝子とが共存している場合であっても、野生型と変異型の多型を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。また、本発明のプライマーによれば、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を含む領域を、特異的に増幅できる。このように、本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で増幅および判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の治療法の選択等に反映できるため、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。なお、本発明は、例えば、医療分野に関わらす、生化学等の広い分野におけるＥＧＦＲ遺伝子の多型検出に適用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P18から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【請求項２】
P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に対応する塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に対応する塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P15のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P16のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P17のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P18のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端から数えて1〜3番目の位置に有する請求項1記載のプローブ。
【請求項３】
P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に対応する塩基を3’末端に有し、
P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に対応する塩基を3’末端に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端に有し、
P15のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端に有し、
P16のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端に有し、
P17のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端に有し、
P18のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端に有する請求項1記載のプローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項4記載のプローブ。
【請求項６】
P1のオリゴヌクレオチドの塩基長が11〜30で、P3およびP5〜7のオリゴヌクレオチドの塩基長が10〜30塩基であり、P15のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜30塩基であり、P16のオリゴヌクレオチドの塩基長が18〜30塩基であり、P17のオリゴヌクレオチドの塩基長が20〜30塩基であり、P18のオリゴヌクレオチドの塩基長が20〜30塩基である請求項1〜5のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項８】
EGFR遺伝子における多型の検出方法であって、請求項１〜7のいずれか一項に記載のプローブを用いることを特徴とする方法。
【請求項９】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出することを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項8または9記載の方法によりEGFR遺伝子における多型を検出する工程、および、多型の有無に基づいてEGFR-TKIに対する耐性または薬効を判定する工程を含む、EGFR-TKIに対する耐性またはEGFR-TKIの薬効の判定方法。
【請求項１１】
EGFR遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、請求項１〜7のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
【請求項１２】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出するプローブを含む、請求項11記載のキット。
【請求項１３】
さらに、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P18の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域、配列番号2に示す塩基配列におけるP5およびP6の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする配列を含む領域、または、配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項11記載のキット。
【請求項１４】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出するプローブを含む、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプライマーであって、下記P8〜P13から選択される多型検出用プライマー。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【請求項１】
EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプローブであって、下記P1、P3、P5〜P7およびP15〜P18から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号251〜261を含む11〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号251に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P3)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜261を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、塩基番号257に対応する塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜112を含む9〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号112に相同的な塩基がチミンであり、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号104〜119を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号119の塩基がG以外の塩基に置換されており、塩基番号104に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P7)配列番号3に示す塩基配列において、塩基番号136〜145を含む10〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号145に相同的な塩基がシトシンであり、前記シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P15)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号259〜264を含む6〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より３’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P16)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号258〜262を含む5〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、塩基番号261に対応する塩基がアデニンまたはシトシンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P17)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号249〜264を含む16〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より5’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
(P18)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号257〜264を含む8〜50塩基長の塩基配列を有し、塩基番号261に相同的な塩基がチミンまたはグアニンであり、前記塩基より3’側に位置するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【請求項２】
P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に対応する塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に対応する塩基を3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P15のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P16のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P17のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P18のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端から数えて1〜3番目の位置に有する請求項1記載のプローブ。
【請求項３】
P1のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号251に対応する塩基を3’末端に有し、
P3のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号257に対応する塩基を3’末端に有し、
P5のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有し、
P6のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号104に相同的な塩基を5'末端に有し、
P7のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に相同的な塩基を3'末端に有し、
P15のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端に有し、
P16のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端に有し、
P17のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを5’末端に有し、
P18のオリゴヌクレオチドは、前記蛍光色素で標識されたシトシンを3’末端に有する請求項1記載のプローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項4記載のプローブ。
【請求項６】
P1のオリゴヌクレオチドの塩基長が11〜30で、P3およびP5〜7のオリゴヌクレオチドの塩基長が10〜30塩基であり、P15のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜30塩基であり、P16のオリゴヌクレオチドの塩基長が18〜30塩基であり、P17のオリゴヌクレオチドの塩基長が20〜30塩基であり、P18のオリゴヌクレオチドの塩基長が20〜30塩基である請求項1〜5のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項８】
EGFR遺伝子における多型の検出方法であって、請求項１〜7のいずれか一項に記載のプローブを用いることを特徴とする方法。
【請求項９】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出することを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項8または9記載の方法によりEGFR遺伝子における多型を検出する工程、および、多型の有無に基づいてEGFR-TKIに対する耐性または薬効を判定する工程を含む、EGFR-TKIに対する耐性またはEGFR-TKIの薬効の判定方法。
【請求項１１】
EGFR遺伝子における多型を検出するための試薬キットであって、請求項１〜7のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
【請求項１２】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出するプローブを含む、請求項11記載のキット。
【請求項１３】
さらに、EGFR遺伝子の配列番号１に示す塩基配列におけるP1、P3およびP15〜P18の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域、配列番号2に示す塩基配列におけるP5およびP6の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする配列を含む領域、または、配列番号3に示す塩基配列におけるP7のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項11記載のキット。
【請求項１４】
さらに、EGFR exon20 T790Mの多型を検出するプローブを含む、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
EGFRの遺伝子変異を検出することの可能なプライマーであって、下記P8〜P13から選択される多型検出用プライマー。
(P8)233番目の塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P9)284番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P10)290番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3’末端とし、配列番号1に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P11)95番目の塩基Gを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P12)73番目の塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
(P13)155番目の塩基Gに相補的な塩基Cを3'末端とし、配列番号2に相補的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
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【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−１０５６４６（Ｐ２０１２−１０５６４６Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３７８８０（Ｐ２０１１−２３７８８０）
【出願日】平成２３年１０月２８日（２０１１．１０．２８）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２８日（２０１１．１０．２８）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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