ＥＰＯの製造方法におけるインプロセス制御
本発明は、次の工程：ａ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程、その際に、エリトロポエチンを含有する試料は、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来するものであり；ｂ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；ｃ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程を含むエリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法並びに発酵による製造方法の範囲内でのエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みをインプロセス制御する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリトロポエチンを検出する方法、特に発酵による製造プロセスの範囲内でエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みをインプロセス制御(Inprozesskontrolle)する方法に関する。本方法は、特に、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて、産生されたエリトロポエチンのアイソフォーム組成が直接決定されることができることに傑出している。エリトロポエチン含量決定のデータ（好ましくはＥＬＩＳＡを用いて算出）と併せて、発酵中又は発酵の終了直後に、合成粗生成物の品質が評価されることができ、そして引き続き精製プロセスが制御されることができる。これはとりわけ、灌流反応器を使用する範囲内で極めて有利である。
【０００２】
エリトロポエチンは、ＥＰＯと略称され、約３４〜３９kDaの分子量を有する糖タンパク質である。エリトロポエチンは、１６５個のアミノ酸を有する非分枝ポリペプチド鎖と、１個のＯ−グリコシド（Ｓｅｒ １２６）及び３個のＮ−グリコシド（Ａｓｎ ２４、Ａｓｎ ３８及びＡｓｎ ８３）結合された糖側鎖（炭水化物部分）とからなる。そしてまた側鎖は、単糖であるマンノース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸から構成される。
【０００３】
エリトロポエチンは、多様なアイソフォームが生じうる。エリトロポエチンの分子質量のこの変動は、末端でノイラミン酸誘導体と結合されている糖鎖の異形性により実現する。前記鎖の多様な長さ及び分枝により、ＥＰＯ分子の全てのアイソフォームの発現(Auspraegung)を生じせしめる多数の"糖分枝"が組み立てられる。
【０００４】
ＥＰＯは、主に腎臓中で形成され、かつ増殖因子として骨髄中での赤血球の形成を刺激する。腎不全の場合に、傷ついた腎臓はＥＰＯを殆ど又は全く産生せず、このことは、骨髄の幹細胞から殆ど赤血球が生じないという結果になる。この腎性貧血は、骨髄中の赤血球の形成を刺激する生理学的な量のＥＰＯの投与により処置されることができる。投与に使用されるＥＰＯは、ヒト尿から取得されることができるか、又は遺伝子工学的な方法により製造されることができる。ＥＰＯは人体中に僅かな痕跡量でのみ含まれているので、天然資源からのＥＰＯの単離は治療学的な利用のためには事実上不可能である。故に、遺伝子工学的な方法は、この物質をより大量に産生する唯一の経済的な可能性を提供する。
【０００５】
エリトロポエチンの組換え型製造は、遺伝子工学的な経路で、とりわけいわゆるＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）中で行われ、その際に、真核生物の宿主細胞の培養のための原則的に３つの異なる方法が使用される（とりわけ欧州特許出願公開(EP-A)第0 148 605号明細書及び欧州特許出願公開(EP-A)第205 564号明細書；BioProcess International 2004, 46 ; Gorenflo et al., Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438及び国際公開(WO)第9501214号に記載されている）。
【０００６】
バッチプロセスの場合に、培地及び細胞は、培養の開始時にバイオリアクター中へ導入される。培養が終了するまで、栄養素は添加されず、細胞も発酵槽から除去されず、酸素のみが供給される。１つ又はそれ以上の基質が消費された際に、プロセスは終了し、かつ生成物は発酵上澄みからから収穫される。
【０００７】
知られた二番目の培養方法は、絶えず新鮮な培地が供給され、かつ同じ分だけ発酵槽内容物が取り出されることによる連続法である。こうして、栄養素を絶えず供給することになり、その際に、同時に成長抑制物質であるアンモニウム及び乳酸塩のような望ましくない物質代謝産物が除去されるかもしくは希釈される。故に、この方法を用いてより高い細胞密度が達成されることができ、かつ比較的長い期間にわたって維持されることができる。連続プロセス実施の特殊例は、タンパク質のような高分子物質が発酵槽中に留められるのに対し、基質のような低分子物質が添加されるか、又は主廃棄生成物であるアンモニウム及び乳酸塩が系から除去されることができる、いわゆる透析反応器を可能にする。同じように、灌流反応器の使用は、多様な細胞保持系を用いる化学化合物及びタンパク質の微生物による製造において一般的に知られており、かつＥＰＯについても記載されている。
【０００８】
最後に、考えられる三番目の方法は、全ての発酵槽体積の小部分を用いて培養が開始され、かつ短い成長段階後に新鮮な基質が添加される、フィード−バッチ発酵である。それにより、バッチ法におけるよりも高い細胞密度及びより長いプロセス時間が可能になる。この方法のさらなる利点は、前記細胞の物質代謝に、飼養の程度を通じて影響を与えることができることであり、このことは、廃棄物質のより少ない製造をもたらすことができる。連続法に比べて、ここでは、前記細胞の生成物は、より長い期間にわたって発酵槽中で蓄積され、ひいてはより高い生成物濃度が達成され、それにより、引き続く後処理が軽減される。
【０００９】
発酵によるプロセスと結びついているのは、大規模なクロマトグラフィーによる精製方法であり、それを用いて前記培養上澄みから、治療学的に利用可能であり、かつ欧州薬局方（Ph. Eur.；01/2002: 1316）に定義された規格もしくは組換え型エリトロポエチンを含有する類似バイオ医薬品に関するガイダンス（EMEA/CHMP/94256/2005）に相応するＥＰＯが単離されることができる。これに関して、技術水準は、多数の方法において、例えば国際公開(WO-A)第05/121173号、欧州特許出願公開(EP-A)第0 228 452号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第0 267 678号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第0 830 376号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第1 127 063号明細書、国際公開(WO-A)第03/045996号、欧州特許出願公開(EP-A)第0 428 267号明細書及び国際公開(WO)第2005/121173号に記載されている。
【００１０】
技術水準の方法によれば、エリトロポエチンを含有する試料は、ポリアクリルアミドゲル中で、分離、例えば等電点電気泳動にかけられ、かつ含まれるタンパク質は、電場の印加により分離される。前記電気泳動の後に、前記タンパク質が膜上へ移動されることによる、いわゆる免疫ブロット（イムノプリントもしくはイムノトランスファー）が続く。その際に、個々のタンパク質の像が前記膜の表面上に得られる。使用される膜は、前記タンパク質が主に疎水性相互作用により極めて堅固に固定され、かつ前記膜がさもなければ化学的に中性に挙動するという利点を有する。ＥＰＯ分子が前記膜表面上に存在することにより、これらの分子は、エリトロポエチンを可視化するために利用される抗体に容易に接近可能である。等電点電気泳動を使用する際に、エリトロポエチンのアイソフォームは分離されることができる。
【００１１】
エリトロポエチンを検出するには、前記膜は、まず最初に、存在している全てのＥＰＯ分子に特異的に結合するモノクローナル抗ＥＰＯ抗体を用いてインキュベーションされる。他のタンパク質は前記抗体と反応しない。ＥＰＯに結合していないモノクローナル抗体は、前記膜から洗浄されることができる、それというのも、残りの膜表面は前もって非特異タンパク質でブロックされたからである。
【００１２】
ＥＰＯへの抗体の結合は可逆的である、それというのも、この結合は、非共有的な相互作用に基づいており、そして例えばｐＨ変動により元に戻されることができるからである。二重ブロット法の場合に、エリトロポエチンに結合した抗体は、第二の膜上へ転写される：酸性環境中で、前記抗体は、その結合ドメインの配座を変え、かつ電場の印加の際に、前記モノクローナル抗体はＥＰＯ分子から解離し、かつ電場中でカソードの方向へ移動し、そこで第二の膜に結合される。
【００１３】
ＥＰＯ分子並びに特異的ではない他のタンパク質は、第一の膜上に残留する、それというのも、第一の膜への結合は、ｐＨ変動により影響を受けないからである。こうして、１つもしくは複数のＥＰＯバンドの新たな像が得られる。しかしながら、第二の膜上には、エリトロポエチン分子が存在するのではなく、むしろ第一の膜上に固定されたエリトロポエチン分子に前もって結合された特異的モノクローナル抗体が存在する。
【００１４】
前記（１つ又は複数の）抗体バンドの可視化は、抗ＥＰＯモノクローナル抗体と反応する第二の抗体（二次抗体）により行われる。この二次抗体は、基質変換を触媒し、その際に呈色反応が行われる特殊な酵素とカップリングしている（例えばアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ）。
【００１５】
第二の転写の必要性は、非特異的信号の低下にある、それというのも、酵素標識された二次抗体は、非特異的に反応せず、第一の膜上で試料の他の成分に変換することができないからである。そのうえ、第一の抗体への抗体−酵素結合体の複数結合による信号増強及びそれと結び付いた感度の増加が考えられる。二重ブロット法にとって不利であるのは、明らかに高められた原料費及び時間浪費である。
【００１６】
それゆえ、技術水準において、エリトロポエチンの検出方法は知られており、かつ当業者に周知であるが、しかしエリトロポエチンを検出するために前記の明らかにより費用のかかる二重ブロット法が使用されるか（Chuan et. al., Cytotechnology 2006, 51, 67-79 ; Hollaender et. al., Laborpraxis Dezember 2004, 56-59 ; Lasne, Journal of Immunological Methods 2003, 276, 223-226）、又は等電点電気泳動を使用する場合に、前記ゲル上で必要なｐＨ範囲の一部のみが写し取られるので、アイソフォームの分離における選択性は、ＥＰＯ粗生成物品質の評価のためには充分ではない（Wimmer et. al., Cytotechnology 1994, 16, 137-146）。
【００１７】
しかし、エリトロポエチンを検出する技術水準の方法は、費用がかかり過ぎ、かつエリトロポエチンの発酵による製造の際のインプロセス制御には適していない。
【００１８】
本発明の課題は、単純化され、かつ改善された、インプロセス制御に利用されるエリトロポエチンを検出する方法を提供することであり、その際に、前記方法は、ＥＰＯ発酵プロセスからの培養上澄みを、選抜されかつ適していると評価された発酵溶液のみがそれぞれ大規模な精製プロセスに供給されるように特性決定することを可能にすべきである。特に、当該方法は、経済的な視点から、技術水準の方法よりも優れているべきである。
【００１９】
前記の技術的課題は、次の工程：
ａ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程、その際に、エリトロポエチンを含有する試料は、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来するものであり；
ｂ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；
ｃ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程
を含む、エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法によって解決される。
【００２０】
好ましい一方法において、工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合され、その際に、前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合が検出される一方で、第一の抗体は、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合されている。
【００２１】
その際に、前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合の検出が、第一の抗体向けの第二の抗体により行われることが好ましい。
【００２２】
このことは、前記方法において、工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ第一の抗体向けの第二の抗体が、エリトロポエチンに結合した第一の抗体に結合することを意味する。
【００２３】
好ましくはＥＬＩＳＡを用いて行われるＥＰＯ含量の決定に加えて、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用い、唯一のブロッティング工程と組み合わせて、発酵上澄みのアイソフォーム組成が直接決定されることにより、発酵プロセスの制御に及び精製すべき培養上澄みの選抜を通じた決定のために利用されることができる、有利でかつ単純化された方法が提供される。
【００２４】
表出した課題設定に直面している当業者は、既存の技術水準を勘案すれば、本発明による方法を精製プロセスの前に発酵画分の選抜のために使用できることを、成功を見込まずになら考慮に入れたかもしれない。これまで、匹敵しうる単純でかつ効率的な方法は文献に記載されていない。特に、等電点電気泳動の際に、本発明によれば、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲、特に３〜６のｐＨ範囲内で、前記ゲル上で写し取られるので、アイソフォームの分離におけるＥＰＯ粗生成物品質の評価に必要な選択性にとって十分であることは有利である。さらに、好ましい一実施態様において、前記方法は、エリトロポエチンの検出が、唯一のタンパク質転写（ブロット）後に既に行われることができる限りでは、単純化されている。それに反して、技術水準においては、検出のためには、明らかにより費用のかかる二重ブロット法が使用される。
【００２５】
好ましい一方法において、酵素、好ましくはアルカリホスファターゼは、基質の触媒反応により呈色反応を発生させる第二の抗体に共有結合されている。それゆえ、好ましいのは、比色法によるＥＰＯ検出のために前記膜上で２つの抗体溶液を使用し、そのうち第二の抗体がアルカリホスファターゼを含有するので、ついで発色試薬としてこの酵素の基質が使用されることができる。特に好ましくは、抗ＥＰＯマウス及び抗マウス−ＩｇＧが、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロテトラゾリウムブルー）と組み合わせて使用される。
【００２６】
さらに、前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に、１つ又はそれ以上の洗浄工程が行われ、かつ引き続き改めて前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションすることが好ましい。前記膜をエリトロポエチン向けの抗体と共にこうして２回もしくは数回インキュベーションすることは、抗原−抗体反応のより完全な形成、そしてエリトロポエチンの特異的信号の増加を可能にする。
【００２７】
特に好ましい一方法において、前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に続く洗浄工程の際に使用される少なくとも１つの溶液は、水性媒体中の有機酸を含有する。そのために、非特異的に結合された抗体は、前記膜から再び除去され、かつ前記ブロッティング膜上で場合により依然として存在している遊離結合部位はブロックされる。全体として、それにより前記バンドの分離シャープは明らかに高められる。その際に、前記溶液が、有機酸を０．１〜１．５質量％、好ましくは０．５〜１質量％、特に好ましくは０．６〜０．８質量％含有することが好ましい。特に、有機酸は、モノカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、アジピン酸又はクエン酸）、特に好ましくは酢酸である。
【００２８】
前記のように、好ましい一方法において、第一の抗体溶液でのインキュベーションは２回行われ、かつその間に４段階の洗浄手順が実施される。その際に、好ましくはＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水−ツイーン(Tween)）及びＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）、希釈された水性有機酸が使用される。特に好ましくは、このためには希釈された水性酢酸及び極めて特に好ましくは０．５％〜１％の濃度範囲内の希釈された水性酢酸が使用される。
【００２９】
好ましい一方法において、膜としてポリフッ化ビニリデン膜が使用される。好ましくは、ブロッティングのために、タンパク質を結合させるのに適している膜が使用される。微孔質ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）が特に好ましく、かつMillipore社のImmobilon−Ｐ−ブロッティング膜が極めて特に好ましい。
【００３０】
好ましいさらなる一方法において、等電点電気泳動のために、不活性な支持体フィルム上に取り付けられているポリアクリルアミドゲルが使用される。好ましくは、ＩＥＦのために規格化されたポリアクリルアミドゲルが使用され、これらは不活性な支持体フィルム、例えばポリエステル製のものに結合されている。ｐＨ勾配が電場中で遊離支持体両親媒性物質により形成されるゲルが特に好ましい。Serva社のBlank PreNetsが極めて特に好ましい。
【００３１】
特に、前記ゲルのｐＨ値を調節するためには、前記ゲル中での等電点電気泳動中にｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ範囲に調節するアンフォライン(Ampholine)を使用することが好ましい。極めて特に好ましくは、Serva社のServalytTM 3-6が使用される。
【００３２】
好ましいさらなる一方法において、エリトロポエチンを含有する試料は、灌流反応器中に保持されるエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来する。好ましくは、エリトロポエチンを含有する試料は、等電点電気泳動の前に脱塩され、かつ場合により濃縮される。
【００３３】
本発明による方法の特に好ましい一実施態様において、エリトロポエチンのアイソフォーム組成の決定は、発酵中に行われる。
【００３４】
同様に好ましくは、培養上澄みのＥＰＯ含量を決定するために、ＥＬＩＳＡテストが使用される。Roche Diagnostics社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡテストが特に好ましい。
【００３５】
本発明による方法を用いると、ＥＰＯ製造プロセスにおいて、明らかにより少ない装置費用及び人件費、ひいては莫大な時間節約及びコスト節約が生じる。例えば灌流発酵プロセスからの、培養上澄みの試料が存在する遅くとも２４h後には、前記発酵溶液の精製が有意義であるかどうか、かつどのように精製プロセスが制御されることができるかが、決定されることができる。
【００３６】
基準材料として、商業的に入手可能なErypo（登録商標）製剤(Janssen-Cilag)が利用される。
【００３７】
さらに、本発明は、次の工程：
ａ）エリトロポエチンのアイソフォーム組成を、本発明による前記のエリトロポエチンを検出する方法により決定する工程；
ｂ）前記試料中のエリトロポエチン含量を、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて決定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）において得られた値及びインフォメーションに基づいて、エリトロポエチンの精製のために発酵溶液を選抜するか、又は発酵を継続する工程
を有する、エリトロポエチンを産生する真核細胞の発酵に由来する培養上澄みをインプロセス制御する方法を提供する。
【００３８】
本方法は、特に、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて、発酵上澄みのアイソフォーム組成が直接決定されることができることに傑出している。ＥＰＯ含量決定からのデータ（好ましくはＥＬＩＳＡを用いて算出）と併せて、発酵中又は発酵が終了した直後に、粗生成物中のＥＰＯ品質が直接評価されることができ、そして精製プロセスが制御されることができる。
【００３９】
次の例は本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】等電点電気泳動及び現像後の、膜上の多様なＥＰＯ画分（画分１〜画分５）のブロットを示す図。前記試料は、４７日の期間にわたるエリトロポエチンを産生するＣＨＯ細胞株の灌流発酵に由来する。
【実施例】
【００４１】
ＥＰＯを、発酵によりＣＨＯ細胞中で産生させる。発酵を、特許文献及び学術文献に真核生物の細胞、特にＣＨＯ細胞について記載されているような標準法により行う。培養を、灌流反応器中で動物性成分不含の培地中で行う。収穫を、５０日までの期間において連続的に行う。
【００４２】
分析すべき各発酵溶液を、等電点電気泳動の前に脱塩し、かつ濃縮する。そのためには、まず最初に、約１４mg/Lの全ＥＰＯ含量（ＥＬＩＳＡテストにより算出）で、試料１５mlを、超遠心分離キット及び１０kDaの分子量カットオフを用いて、遠心分離（４０００gで６０min及び１４０００gで６０min）により２００μLに濃縮し、かつ濃縮物１２μLを超純水２８μL及びエタノール１０μLと混合し、かつ−２０℃で６０min貯蔵する。引き続き、前記試料溶液を冷却遠心機中で遠心分離し（２０min、１６１００g、０℃）、かつ前記溶液の上澄みを等電点電気泳動に使用する（ＩＥＦ試料溶液）。
【００４３】
等電点電気泳動を、ｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ勾配を形成するために（ServalytTM 3-6）、ゲルの予備泳動（Blank PreNets、Serva；約４００Vhまで２０〜６０min）と共に開始する。そのためには、電圧と電流の強さとを、約３００V及び３．５mAに調節する（カソード緩衝液：１Mグリシン；アノード緩衝液：アスパラギン酸及びグルタミン酸、それぞれ２５mM）。その後、ＩＥＦ試料溶液及び対照試料（Erypo（登録商標）製剤）それぞれ１５μLを、Sample Application Piece (Serva)上へピペット滴下し、かつ前記溶液を電圧の印加により約２０００Vhにわたって等電点電気泳動させる。引き続き、前記泳動を短く中断し、かつSample Application Piecesを取り除いてから、前記泳動プロセスをさらに約２５００Vhにわたって継続する。試料泳動時間４５００Vhを超えた後に、等電点電気泳動を終了し、前記ゲルを、予冷した（４℃）ブロッティング緩衝液（１０×トリス／グリシン緩衝液(Bio-Rad)２００mLを超純水及びメタノール４００mLで２Lに希釈する）中で１５minインキュベーションする。
【００４４】
それに並行して、供給業者のデータに従い、Immobilon-P-ブロッティング膜(Millipore)の準備を行う。その後、前記ゲルを、次の条件下に前記膜上へブロッティングする：ブロッティング緩衝液（２０％メタノールを有する１×トリス／グリシン、Bio-Rad）中で５０minにわたり５０V一定。タンパク質転写の直後に、連続して３つの洗浄工程を、まず最初にメタノール中ついで水中で２回、それぞれ３０秒実施する。引き続き、前記膜を、ブロッキング溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)中５％脱脂粉乳溶液(Bio-Rad)）中へ添加し、かつ室温で６０min、軽く振とうしながらインキュベーションする。ブロッキング溶液の除去後に、３回の洗浄をＴＢＳＴ（ＴＢＳ(Bio-Rad)中の０．５％Tween（登録商標） 20）中で行う。引き続き、第一の抗体溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)３０ml中の１％ ＢＳＡ(Sigma)を５００mMアジ化ナトリウム溶液６０μlと共に抗ＥＰＯマウス（RD-Systems）５０μlに添加する）中で少なくとも４時間のインキュベーションを行う。
【００４５】
その後、ＴＢＳＴ、ＴＢＳ、０．７％水性酢酸で、ついで改めてＴＢＳＴでのさらなる洗浄手順が続き、その際に、前記膜を前記酢酸溶液中で６０minインキュベーションする。ついで、第一の抗体溶液での前記膜の処理を、同一の条件下に繰り返す。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後に、前記膜の処理を、第二の抗体溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)３０ml中の１％ＢＳＡ(Sigma)を５００mMアジ化ナトリウム溶液６０μlと共に抗マウス−ＩｇＧ(Sigma) ３５μlに添加する）で行う。ＴＢＳＴ中での３回の洗浄及びＡＰ緩衝液（５M食塩溶液１０mLを、１Mトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ ９．５）５０mL及び１M塩化マグネシウム溶液５mLと一緒に超純水で１L溶液体積に希釈する）での２回のすすぎの後に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Liquid Substrate System(Sigma)での前記ゲルの染色を行う（室温で１０〜２０min、軽く振とうしながら）。ＡＰ−ストップ溶液（０．５M ＥＤＴＡナトリウム溶液１０ml（ｐＨ ８．０）を、１Mトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ ８．０）２０mLと共に超純水で１l溶液体積に希釈する）の添加により、呈色反応が終わり、かつ前記膜をさらにもう１回、超純水で洗浄する。気乾後に、前記膜を、視覚的にか又はデンシトメトリーにより評価することができる（図１参照）。
【００４６】
培養上澄みのＥＰＯ含量決定を、Roche Diagnostics GmbH社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡテスト（抗体の予めコーティングされたマイクロタイタープレートを使用する研究目的用の、ヒト血清／血漿中でのエリトロポエチンの定量的インビトロ決定のための測光法による酵素結合されたイムノソルベントアッセイ）を用いて行う。
【００４７】
灌流反応器からの個々の画分について（全発酵期間４７日）、以下の範囲内のＥＰＯ含量が算出される：
画分１（５日までの発酵）：約８０mg/L
画分２（１３日までの発酵）：約７５mg/L
画分３（２０日までの発酵）：約１４０mg/L
画分４（２５日までの発酵）：約８０mg/L
画分５（３２日までの発酵）：約１５０mg/L。
【００４８】
図１による結果の評価は、特に、画分２及び４及び場合によりさらに画分３の精製が有意義であることを示す。これらの画分中で、全ＥＰＯ含量に対する治療学的に利用可能なアイソフォームの割合が最も高い。それとは異なり、確かに画分５については、最も高いＥＰＯ含量がＥＬＩＳＡテストにより検出されるが、しかしながら所望のアイソフォームは、Erypo（登録商標）基準材料と比較すると、痕跡量でのみ含まれている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリトロポエチンを検出する方法、特に発酵による製造プロセスの範囲内でエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みをインプロセス制御(Inprozesskontrolle)する方法に関する。本方法は、特に、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて、産生されたエリトロポエチンのアイソフォーム組成が直接決定されることができることに傑出している。エリトロポエチン含量決定のデータ（好ましくはＥＬＩＳＡを用いて算出）と併せて、発酵中又は発酵の終了直後に、合成粗生成物の品質が評価されることができ、そして引き続き精製プロセスが制御されることができる。これはとりわけ、灌流反応器を使用する範囲内で極めて有利である。
【０００２】
エリトロポエチンは、ＥＰＯと略称され、約３４〜３９kDaの分子量を有する糖タンパク質である。エリトロポエチンは、１６５個のアミノ酸を有する非分枝ポリペプチド鎖と、１個のＯ−グリコシド（Ｓｅｒ １２６）及び３個のＮ−グリコシド（Ａｓｎ ２４、Ａｓｎ ３８及びＡｓｎ ８３）結合された糖側鎖（炭水化物部分）とからなる。そしてまた側鎖は、単糖であるマンノース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸から構成される。
【０００３】
エリトロポエチンは、多様なアイソフォームが生じうる。エリトロポエチンの分子質量のこの変動は、末端でノイラミン酸誘導体と結合されている糖鎖の異形性により実現する。前記鎖の多様な長さ及び分枝により、ＥＰＯ分子の全てのアイソフォームの発現(Auspraegung)を生じせしめる多数の"糖分枝"が組み立てられる。
【０００４】
ＥＰＯは、主に腎臓中で形成され、かつ増殖因子として骨髄中での赤血球の形成を刺激する。腎不全の場合に、傷ついた腎臓はＥＰＯを殆ど又は全く産生せず、このことは、骨髄の幹細胞から殆ど赤血球が生じないという結果になる。この腎性貧血は、骨髄中の赤血球の形成を刺激する生理学的な量のＥＰＯの投与により処置されることができる。投与に使用されるＥＰＯは、ヒト尿から取得されることができるか、又は遺伝子工学的な方法により製造されることができる。ＥＰＯは人体中に僅かな痕跡量でのみ含まれているので、天然資源からのＥＰＯの単離は治療学的な利用のためには事実上不可能である。故に、遺伝子工学的な方法は、この物質をより大量に産生する唯一の経済的な可能性を提供する。
【０００５】
エリトロポエチンの組換え型製造は、遺伝子工学的な経路で、とりわけいわゆるＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）中で行われ、その際に、真核生物の宿主細胞の培養のための原則的に３つの異なる方法が使用される（とりわけ欧州特許出願公開(EP-A)第0 148 605号明細書及び欧州特許出願公開(EP-A)第205 564号明細書；BioProcess International 2004, 46 ; Gorenflo et al., Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438及び国際公開(WO)第9501214号に記載されている）。
【０００６】
バッチプロセスの場合に、培地及び細胞は、培養の開始時にバイオリアクター中へ導入される。培養が終了するまで、栄養素は添加されず、細胞も発酵槽から除去されず、酸素のみが供給される。１つ又はそれ以上の基質が消費された際に、プロセスは終了し、かつ生成物は発酵上澄みからから収穫される。
【０００７】
知られた二番目の培養方法は、絶えず新鮮な培地が供給され、かつ同じ分だけ発酵槽内容物が取り出されることによる連続法である。こうして、栄養素を絶えず供給することになり、その際に、同時に成長抑制物質であるアンモニウム及び乳酸塩のような望ましくない物質代謝産物が除去されるかもしくは希釈される。故に、この方法を用いてより高い細胞密度が達成されることができ、かつ比較的長い期間にわたって維持されることができる。連続プロセス実施の特殊例は、タンパク質のような高分子物質が発酵槽中に留められるのに対し、基質のような低分子物質が添加されるか、又は主廃棄生成物であるアンモニウム及び乳酸塩が系から除去されることができる、いわゆる透析反応器を可能にする。同じように、灌流反応器の使用は、多様な細胞保持系を用いる化学化合物及びタンパク質の微生物による製造において一般的に知られており、かつＥＰＯについても記載されている。
【０００８】
最後に、考えられる三番目の方法は、全ての発酵槽体積の小部分を用いて培養が開始され、かつ短い成長段階後に新鮮な基質が添加される、フィード−バッチ発酵である。それにより、バッチ法におけるよりも高い細胞密度及びより長いプロセス時間が可能になる。この方法のさらなる利点は、前記細胞の物質代謝に、飼養の程度を通じて影響を与えることができることであり、このことは、廃棄物質のより少ない製造をもたらすことができる。連続法に比べて、ここでは、前記細胞の生成物は、より長い期間にわたって発酵槽中で蓄積され、ひいてはより高い生成物濃度が達成され、それにより、引き続く後処理が軽減される。
【０００９】
発酵によるプロセスと結びついているのは、大規模なクロマトグラフィーによる精製方法であり、それを用いて前記培養上澄みから、治療学的に利用可能であり、かつ欧州薬局方（Ph. Eur.；01/2002: 1316）に定義された規格もしくは組換え型エリトロポエチンを含有する類似バイオ医薬品に関するガイダンス（EMEA/CHMP/94256/2005）に相応するＥＰＯが単離されることができる。これに関して、技術水準は、多数の方法において、例えば国際公開(WO-A)第05/121173号、欧州特許出願公開(EP-A)第0 228 452号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第0 267 678号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第0 830 376号明細書、欧州特許出願公開(EP-A)第1 127 063号明細書、国際公開(WO-A)第03/045996号、欧州特許出願公開(EP-A)第0 428 267号明細書及び国際公開(WO)第2005/121173号に記載されている。
【００１０】
技術水準の方法によれば、エリトロポエチンを含有する試料は、ポリアクリルアミドゲル中で、分離、例えば等電点電気泳動にかけられ、かつ含まれるタンパク質は、電場の印加により分離される。前記電気泳動の後に、前記タンパク質が膜上へ移動されることによる、いわゆる免疫ブロット（イムノプリントもしくはイムノトランスファー）が続く。その際に、個々のタンパク質の像が前記膜の表面上に得られる。使用される膜は、前記タンパク質が主に疎水性相互作用により極めて堅固に固定され、かつ前記膜がさもなければ化学的に中性に挙動するという利点を有する。ＥＰＯ分子が前記膜表面上に存在することにより、これらの分子は、エリトロポエチンを可視化するために利用される抗体に容易に接近可能である。等電点電気泳動を使用する際に、エリトロポエチンのアイソフォームは分離されることができる。
【００１１】
エリトロポエチンを検出するには、前記膜は、まず最初に、存在している全てのＥＰＯ分子に特異的に結合するモノクローナル抗ＥＰＯ抗体を用いてインキュベーションされる。他のタンパク質は前記抗体と反応しない。ＥＰＯに結合していないモノクローナル抗体は、前記膜から洗浄されることができる、それというのも、残りの膜表面は前もって非特異タンパク質でブロックされたからである。
【００１２】
ＥＰＯへの抗体の結合は可逆的である、それというのも、この結合は、非共有的な相互作用に基づいており、そして例えばｐＨ変動により元に戻されることができるからである。二重ブロット法の場合に、エリトロポエチンに結合した抗体は、第二の膜上へ転写される：酸性環境中で、前記抗体は、その結合ドメインの配座を変え、かつ電場の印加の際に、前記モノクローナル抗体はＥＰＯ分子から解離し、かつ電場中でカソードの方向へ移動し、そこで第二の膜に結合される。
【００１３】
ＥＰＯ分子並びに特異的ではない他のタンパク質は、第一の膜上に残留する、それというのも、第一の膜への結合は、ｐＨ変動により影響を受けないからである。こうして、１つもしくは複数のＥＰＯバンドの新たな像が得られる。しかしながら、第二の膜上には、エリトロポエチン分子が存在するのではなく、むしろ第一の膜上に固定されたエリトロポエチン分子に前もって結合された特異的モノクローナル抗体が存在する。
【００１４】
前記（１つ又は複数の）抗体バンドの可視化は、抗ＥＰＯモノクローナル抗体と反応する第二の抗体（二次抗体）により行われる。この二次抗体は、基質変換を触媒し、その際に呈色反応が行われる特殊な酵素とカップリングしている（例えばアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ）。
【００１５】
第二の転写の必要性は、非特異的信号の低下にある、それというのも、酵素標識された二次抗体は、非特異的に反応せず、第一の膜上で試料の他の成分に変換することができないからである。そのうえ、第一の抗体への抗体−酵素結合体の複数結合による信号増強及びそれと結び付いた感度の増加が考えられる。二重ブロット法にとって不利であるのは、明らかに高められた原料費及び時間浪費である。
【００１６】
それゆえ、技術水準において、エリトロポエチンの検出方法は知られており、かつ当業者に周知であるが、しかしエリトロポエチンを検出するために前記の明らかにより費用のかかる二重ブロット法が使用されるか（Chuan et. al., Cytotechnology 2006, 51, 67-79 ; Hollaender et. al., Laborpraxis Dezember 2004, 56-59 ; Lasne, Journal of Immunological Methods 2003, 276, 223-226）、又は等電点電気泳動を使用する場合に、前記ゲル上で必要なｐＨ範囲の一部のみが写し取られるので、アイソフォームの分離における選択性は、ＥＰＯ粗生成物品質の評価のためには充分ではない（Wimmer et. al., Cytotechnology 1994, 16, 137-146）。
【００１７】
しかし、エリトロポエチンを検出する技術水準の方法は、費用がかかり過ぎ、かつエリトロポエチンの発酵による製造の際のインプロセス制御には適していない。
【００１８】
本発明の課題は、単純化され、かつ改善された、インプロセス制御に利用されるエリトロポエチンを検出する方法を提供することであり、その際に、前記方法は、ＥＰＯ発酵プロセスからの培養上澄みを、選抜されかつ適していると評価された発酵溶液のみがそれぞれ大規模な精製プロセスに供給されるように特性決定することを可能にすべきである。特に、当該方法は、経済的な視点から、技術水準の方法よりも優れているべきである。
【００１９】
前記の技術的課題は、次の工程：
ａ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程、その際に、エリトロポエチンを含有する試料は、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来するものであり；
ｂ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；
ｃ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程
を含む、エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法によって解決される。
【００２０】
好ましい一方法において、工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合され、その際に、前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合が検出される一方で、第一の抗体は、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合されている。
【００２１】
その際に、前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合の検出が、第一の抗体向けの第二の抗体により行われることが好ましい。
【００２２】
このことは、前記方法において、工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ第一の抗体向けの第二の抗体が、エリトロポエチンに結合した第一の抗体に結合することを意味する。
【００２３】
好ましくはＥＬＩＳＡを用いて行われるＥＰＯ含量の決定に加えて、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用い、唯一のブロッティング工程と組み合わせて、発酵上澄みのアイソフォーム組成が直接決定されることにより、発酵プロセスの制御に及び精製すべき培養上澄みの選抜を通じた決定のために利用されることができる、有利でかつ単純化された方法が提供される。
【００２４】
表出した課題設定に直面している当業者は、既存の技術水準を勘案すれば、本発明による方法を精製プロセスの前に発酵画分の選抜のために使用できることを、成功を見込まずになら考慮に入れたかもしれない。これまで、匹敵しうる単純でかつ効率的な方法は文献に記載されていない。特に、等電点電気泳動の際に、本発明によれば、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲、特に３〜６のｐＨ範囲内で、前記ゲル上で写し取られるので、アイソフォームの分離におけるＥＰＯ粗生成物品質の評価に必要な選択性にとって十分であることは有利である。さらに、好ましい一実施態様において、前記方法は、エリトロポエチンの検出が、唯一のタンパク質転写（ブロット）後に既に行われることができる限りでは、単純化されている。それに反して、技術水準においては、検出のためには、明らかにより費用のかかる二重ブロット法が使用される。
【００２５】
好ましい一方法において、酵素、好ましくはアルカリホスファターゼは、基質の触媒反応により呈色反応を発生させる第二の抗体に共有結合されている。それゆえ、好ましいのは、比色法によるＥＰＯ検出のために前記膜上で２つの抗体溶液を使用し、そのうち第二の抗体がアルカリホスファターゼを含有するので、ついで発色試薬としてこの酵素の基質が使用されることができる。特に好ましくは、抗ＥＰＯマウス及び抗マウス−ＩｇＧが、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロテトラゾリウムブルー）と組み合わせて使用される。
【００２６】
さらに、前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に、１つ又はそれ以上の洗浄工程が行われ、かつ引き続き改めて前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションすることが好ましい。前記膜をエリトロポエチン向けの抗体と共にこうして２回もしくは数回インキュベーションすることは、抗原−抗体反応のより完全な形成、そしてエリトロポエチンの特異的信号の増加を可能にする。
【００２７】
特に好ましい一方法において、前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に続く洗浄工程の際に使用される少なくとも１つの溶液は、水性媒体中の有機酸を含有する。そのために、非特異的に結合された抗体は、前記膜から再び除去され、かつ前記ブロッティング膜上で場合により依然として存在している遊離結合部位はブロックされる。全体として、それにより前記バンドの分離シャープは明らかに高められる。その際に、前記溶液が、有機酸を０．１〜１．５質量％、好ましくは０．５〜１質量％、特に好ましくは０．６〜０．８質量％含有することが好ましい。特に、有機酸は、モノカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、アジピン酸又はクエン酸）、特に好ましくは酢酸である。
【００２８】
前記のように、好ましい一方法において、第一の抗体溶液でのインキュベーションは２回行われ、かつその間に４段階の洗浄手順が実施される。その際に、好ましくはＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水−ツイーン(Tween)）及びＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）、希釈された水性有機酸が使用される。特に好ましくは、このためには希釈された水性酢酸及び極めて特に好ましくは０．５％〜１％の濃度範囲内の希釈された水性酢酸が使用される。
【００２９】
好ましい一方法において、膜としてポリフッ化ビニリデン膜が使用される。好ましくは、ブロッティングのために、タンパク質を結合させるのに適している膜が使用される。微孔質ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）が特に好ましく、かつMillipore社のImmobilon−Ｐ−ブロッティング膜が極めて特に好ましい。
【００３０】
好ましいさらなる一方法において、等電点電気泳動のために、不活性な支持体フィルム上に取り付けられているポリアクリルアミドゲルが使用される。好ましくは、ＩＥＦのために規格化されたポリアクリルアミドゲルが使用され、これらは不活性な支持体フィルム、例えばポリエステル製のものに結合されている。ｐＨ勾配が電場中で遊離支持体両親媒性物質により形成されるゲルが特に好ましい。Serva社のBlank PreNetsが極めて特に好ましい。
【００３１】
特に、前記ゲルのｐＨ値を調節するためには、前記ゲル中での等電点電気泳動中にｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ範囲に調節するアンフォライン(Ampholine)を使用することが好ましい。極めて特に好ましくは、Serva社のServalytTM 3-6が使用される。
【００３２】
好ましいさらなる一方法において、エリトロポエチンを含有する試料は、灌流反応器中に保持されるエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来する。好ましくは、エリトロポエチンを含有する試料は、等電点電気泳動の前に脱塩され、かつ場合により濃縮される。
【００３３】
本発明による方法の特に好ましい一実施態様において、エリトロポエチンのアイソフォーム組成の決定は、発酵中に行われる。
【００３４】
同様に好ましくは、培養上澄みのＥＰＯ含量を決定するために、ＥＬＩＳＡテストが使用される。Roche Diagnostics社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡテストが特に好ましい。
【００３５】
本発明による方法を用いると、ＥＰＯ製造プロセスにおいて、明らかにより少ない装置費用及び人件費、ひいては莫大な時間節約及びコスト節約が生じる。例えば灌流発酵プロセスからの、培養上澄みの試料が存在する遅くとも２４h後には、前記発酵溶液の精製が有意義であるかどうか、かつどのように精製プロセスが制御されることができるかが、決定されることができる。
【００３６】
基準材料として、商業的に入手可能なErypo（登録商標）製剤(Janssen-Cilag)が利用される。
【００３７】
さらに、本発明は、次の工程：
ａ）エリトロポエチンのアイソフォーム組成を、本発明による前記のエリトロポエチンを検出する方法により決定する工程；
ｂ）前記試料中のエリトロポエチン含量を、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて決定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）において得られた値及びインフォメーションに基づいて、エリトロポエチンの精製のために発酵溶液を選抜するか、又は発酵を継続する工程
を有する、エリトロポエチンを産生する真核細胞の発酵に由来する培養上澄みをインプロセス制御する方法を提供する。
【００３８】
本方法は、特に、特殊な等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて、発酵上澄みのアイソフォーム組成が直接決定されることができることに傑出している。ＥＰＯ含量決定からのデータ（好ましくはＥＬＩＳＡを用いて算出）と併せて、発酵中又は発酵が終了した直後に、粗生成物中のＥＰＯ品質が直接評価されることができ、そして精製プロセスが制御されることができる。
【００３９】
次の例は本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】等電点電気泳動及び現像後の、膜上の多様なＥＰＯ画分（画分１〜画分５）のブロットを示す図。前記試料は、４７日の期間にわたるエリトロポエチンを産生するＣＨＯ細胞株の灌流発酵に由来する。
【実施例】
【００４１】
ＥＰＯを、発酵によりＣＨＯ細胞中で産生させる。発酵を、特許文献及び学術文献に真核生物の細胞、特にＣＨＯ細胞について記載されているような標準法により行う。培養を、灌流反応器中で動物性成分不含の培地中で行う。収穫を、５０日までの期間において連続的に行う。
【００４２】
分析すべき各発酵溶液を、等電点電気泳動の前に脱塩し、かつ濃縮する。そのためには、まず最初に、約１４mg/Lの全ＥＰＯ含量（ＥＬＩＳＡテストにより算出）で、試料１５mlを、超遠心分離キット及び１０kDaの分子量カットオフを用いて、遠心分離（４０００gで６０min及び１４０００gで６０min）により２００μLに濃縮し、かつ濃縮物１２μLを超純水２８μL及びエタノール１０μLと混合し、かつ−２０℃で６０min貯蔵する。引き続き、前記試料溶液を冷却遠心機中で遠心分離し（２０min、１６１００g、０℃）、かつ前記溶液の上澄みを等電点電気泳動に使用する（ＩＥＦ試料溶液）。
【００４３】
等電点電気泳動を、ｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ勾配を形成するために（ServalytTM 3-6）、ゲルの予備泳動（Blank PreNets、Serva；約４００Vhまで２０〜６０min）と共に開始する。そのためには、電圧と電流の強さとを、約３００V及び３．５mAに調節する（カソード緩衝液：１Mグリシン；アノード緩衝液：アスパラギン酸及びグルタミン酸、それぞれ２５mM）。その後、ＩＥＦ試料溶液及び対照試料（Erypo（登録商標）製剤）それぞれ１５μLを、Sample Application Piece (Serva)上へピペット滴下し、かつ前記溶液を電圧の印加により約２０００Vhにわたって等電点電気泳動させる。引き続き、前記泳動を短く中断し、かつSample Application Piecesを取り除いてから、前記泳動プロセスをさらに約２５００Vhにわたって継続する。試料泳動時間４５００Vhを超えた後に、等電点電気泳動を終了し、前記ゲルを、予冷した（４℃）ブロッティング緩衝液（１０×トリス／グリシン緩衝液(Bio-Rad)２００mLを超純水及びメタノール４００mLで２Lに希釈する）中で１５minインキュベーションする。
【００４４】
それに並行して、供給業者のデータに従い、Immobilon-P-ブロッティング膜(Millipore)の準備を行う。その後、前記ゲルを、次の条件下に前記膜上へブロッティングする：ブロッティング緩衝液（２０％メタノールを有する１×トリス／グリシン、Bio-Rad）中で５０minにわたり５０V一定。タンパク質転写の直後に、連続して３つの洗浄工程を、まず最初にメタノール中ついで水中で２回、それぞれ３０秒実施する。引き続き、前記膜を、ブロッキング溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)中５％脱脂粉乳溶液(Bio-Rad)）中へ添加し、かつ室温で６０min、軽く振とうしながらインキュベーションする。ブロッキング溶液の除去後に、３回の洗浄をＴＢＳＴ（ＴＢＳ(Bio-Rad)中の０．５％Tween（登録商標） 20）中で行う。引き続き、第一の抗体溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)３０ml中の１％ ＢＳＡ(Sigma)を５００mMアジ化ナトリウム溶液６０μlと共に抗ＥＰＯマウス（RD-Systems）５０μlに添加する）中で少なくとも４時間のインキュベーションを行う。
【００４５】
その後、ＴＢＳＴ、ＴＢＳ、０．７％水性酢酸で、ついで改めてＴＢＳＴでのさらなる洗浄手順が続き、その際に、前記膜を前記酢酸溶液中で６０minインキュベーションする。ついで、第一の抗体溶液での前記膜の処理を、同一の条件下に繰り返す。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後に、前記膜の処理を、第二の抗体溶液（１×ＴＢＳ緩衝液(Bio-Rad)３０ml中の１％ＢＳＡ(Sigma)を５００mMアジ化ナトリウム溶液６０μlと共に抗マウス−ＩｇＧ(Sigma) ３５μlに添加する）で行う。ＴＢＳＴ中での３回の洗浄及びＡＰ緩衝液（５M食塩溶液１０mLを、１Mトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ ９．５）５０mL及び１M塩化マグネシウム溶液５mLと一緒に超純水で１L溶液体積に希釈する）での２回のすすぎの後に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Liquid Substrate System(Sigma)での前記ゲルの染色を行う（室温で１０〜２０min、軽く振とうしながら）。ＡＰ−ストップ溶液（０．５M ＥＤＴＡナトリウム溶液１０ml（ｐＨ ８．０）を、１Mトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ ８．０）２０mLと共に超純水で１l溶液体積に希釈する）の添加により、呈色反応が終わり、かつ前記膜をさらにもう１回、超純水で洗浄する。気乾後に、前記膜を、視覚的にか又はデンシトメトリーにより評価することができる（図１参照）。
【００４６】
培養上澄みのＥＰＯ含量決定を、Roche Diagnostics GmbH社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡテスト（抗体の予めコーティングされたマイクロタイタープレートを使用する研究目的用の、ヒト血清／血漿中でのエリトロポエチンの定量的インビトロ決定のための測光法による酵素結合されたイムノソルベントアッセイ）を用いて行う。
【００４７】
灌流反応器からの個々の画分について（全発酵期間４７日）、以下の範囲内のＥＰＯ含量が算出される：
画分１（５日までの発酵）：約８０mg/L
画分２（１３日までの発酵）：約７５mg/L
画分３（２０日までの発酵）：約１４０mg/L
画分４（２５日までの発酵）：約８０mg/L
画分５（３２日までの発酵）：約１５０mg/L。
【００４８】
図１による結果の評価は、特に、画分２及び４及び場合によりさらに画分３の精製が有意義であることを示す。これらの画分中で、全ＥＰＯ含量に対する治療学的に利用可能なアイソフォームの割合が最も高い。それとは異なり、確かに画分５については、最も高いＥＰＯ含量がＥＬＩＳＡテストにより検出されるが、しかしながら所望のアイソフォームは、Erypo（登録商標）基準材料と比較すると、痕跡量でのみ含まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法であって、次の工程：
ａ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程、その際に、エリトロポエチンを含有する試料は、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来するものであり；
ｂ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；
ｃ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程
を含むことを特徴とする、エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法。
【請求項２】
工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合を検出する一方で、第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合の検出を、第一の抗体向けの第二の抗体により行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ第一の抗体向けの第二の抗体が、エリトロポエチンに結合した第一の抗体に結合する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
酵素、好ましくはアルカリホスファターゼが、基質の触媒反応により呈色反応を発生させる第二の抗体に共有結合されている、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に、１つ又はそれ以上の洗浄工程を行い、引き続き改めて前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に続く洗浄工程の際に使用される少なくとも１つの溶液が、水性媒体中の有機酸を含有する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、有機酸を０．１〜１．５質量％、好ましくは０．５〜１質量％、特に好ましくは０．６〜０．８質量％含有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
有機酸が、モノカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸であり、好ましくは酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、アジピン酸又はクエン酸からなる群から選択され、かつ特に好ましくは酢酸である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
膜としてポリフッ化ビニリデン膜を使用する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
等電点電気泳動のために、不活性な支持体フィルムに取り付けられているポリアクリルアミドゲルを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲルのｐＨ値の調節のために、前記ゲル中での等電点電気泳動中にｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ範囲に調節するアンフォラインを使用する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
エリトロポエチンを含有する試料が、灌流反応器中に保持されたエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
エリトロポエチンを含有する試料を、等電点電気泳動の前に脱塩し、かつ必要に応じて濃縮する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
エリトロポエチンのアイソフォーム組成の決定を発酵中に行う、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
エリトロポエチンを産生する真核細胞の発酵に由来する特に灌流反応器からの、培養上澄みをインプロセス制御する方法であって、次の工程：
ａ）エリトロポエチンのアイソフォーム組成を、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法により決定する工程；
ｂ）試料中のエリトロポエチンの含量を、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて決定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）において得られた値及びインフォメーションに基づいて、エリトロポエチンの精製のために発酵溶液を選抜するか、又は発酵を継続する工程
を有することを特徴とする、培養上澄みをインプロセス制御する方法。
【請求項１】
エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法であって、次の工程：
ａ）エリトロポエチンを含有する試料をゲル中で、下限が２．５〜３．５であり、かつ上限が５〜８であるｐＨ範囲にわたって等電点電気泳動させる工程、その際に、エリトロポエチンを含有する試料は、エリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来するものであり；
ｂ）ゲル中に含まれ、かつ分離されたタンパク質を膜上へ転写する工程；
ｃ）前記膜に結合したエリトロポエチンを特異的抗体により検出する工程
を含むことを特徴とする、エリトロポエチンのアイソフォーム組成を決定する方法。
【請求項２】
工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合を検出する一方で、第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記膜に結合したエリトロポエチンへの第一の抗体の結合の検出を、第一の抗体向けの第二の抗体により行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）においてエリトロポエチン向けの第一の抗体が、前記膜に結合したエリトロポエチンに結合し、かつ第一の抗体向けの第二の抗体が、エリトロポエチンに結合した第一の抗体に結合する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
酵素、好ましくはアルカリホスファターゼが、基質の触媒反応により呈色反応を発生させる第二の抗体に共有結合されている、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に、１つ又はそれ以上の洗浄工程を行い、引き続き改めて前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記膜をエリトロポエチン向けの第一の抗体と共にインキュベーションした後に続く洗浄工程の際に使用される少なくとも１つの溶液が、水性媒体中の有機酸を含有する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、有機酸を０．１〜１．５質量％、好ましくは０．５〜１質量％、特に好ましくは０．６〜０．８質量％含有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
有機酸が、モノカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸であり、好ましくは酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、アジピン酸又はクエン酸からなる群から選択され、かつ特に好ましくは酢酸である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
膜としてポリフッ化ビニリデン膜を使用する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
等電点電気泳動のために、不活性な支持体フィルムに取り付けられているポリアクリルアミドゲルを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲルのｐＨ値の調節のために、前記ゲル中での等電点電気泳動中にｐＨ ３〜ｐＨ ６のｐＨ範囲に調節するアンフォラインを使用する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
エリトロポエチンを含有する試料が、灌流反応器中に保持されたエリトロポエチンを産生する真核細胞の培養上澄みに由来する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
エリトロポエチンを含有する試料を、等電点電気泳動の前に脱塩し、かつ必要に応じて濃縮する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
エリトロポエチンのアイソフォーム組成の決定を発酵中に行う、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
エリトロポエチンを産生する真核細胞の発酵に由来する特に灌流反応器からの、培養上澄みをインプロセス制御する方法であって、次の工程：
ａ）エリトロポエチンのアイソフォーム組成を、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法により決定する工程；
ｂ）試料中のエリトロポエチンの含量を、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて決定する工程；
ｃ）工程ａ）及びｂ）において得られた値及びインフォメーションに基づいて、エリトロポエチンの精製のために発酵溶液を選抜するか、又は発酵を継続する工程
を有することを特徴とする、培養上澄みをインプロセス制御する方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５１２４０６（Ｐ２０１２−５１２４０６Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１３１５（Ｐ２０１１−５４１３１５）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６５１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６１２５
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６５１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６１２５
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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