ＥＲ−患者におけるガンの予後判定のための方法およびツール
本発明は、表１０および／または表１１から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、および、場合により、１００個、１０５個、１１０個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられる抗体（またはその超可変部分）を含むか、または、それらからなる遺伝子セットまたはタンパク質セットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答が乳ガン予後の重要な役割を果たすエストロゲン受容体（ＥＲ）−患者における乳ガンの効率的な予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ））を得るための方法およびツールに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳ガン、特に浸潤性腺管ガンは、西洋諸国では女性における最も一般的なガンである。遺伝子プロファイリングに基づくいくつかの予後的なサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が明らかにされている。これらの異なるサインのすべてが、腫瘍細胞が増殖する能力を反映する１。それらの使用により、低い増殖活性を有する腫瘍と、高い増殖活性を有する腫瘍とを識別すること、すなわち、それぞれ、低い増殖速度によって特徴づけられ、かつ、良好な予後を伴う管腔Ａ型腫瘍と、大きい増殖速度を有し、かつ、不良な予後を伴う基底様腫瘍、ＥＲＢＢ２腫瘍および管腔Ｂ型腫瘍を含む別の一群とを識別することが可能である。
【０００３】
いくつかの研究が、ヒト腫瘍の成長および再発を制御することにおける適応免疫応答の役割に関して実現されている。ヒト結腸直腸ガンでは、腫瘍浸潤性免疫細胞のインサイチュ分析が有益な予後的ツールとなり得ることが示された２。Ｂａｔｅｓ他は、乳腫瘍におけるＦＯＸＰ３陽性ＴＲの定量が、疾患の予後および進行を評価するために有益であることを示した３。したがって、乳ガンの進行の引き金を引き、かつ、特定の分子的サブタイプに依存する生物学的プロセスを調べることが求められており、また、インシリコデータまたは免疫応答を調節するＣＤ４＋細胞を研究することのいずれかを使用することによって、乳ガン予後に対する免疫応答の寄与を調べることが求められている。
【０００４】
ＣＤ４＋細胞は、乳腫瘍の微小環境の主要な成分である白血球ファミリーに属する。ＣＤ４マーカーがヘルパーＴ細胞において主に発現され、また、限られたレベルながら、単球／マクロファージおよび樹状細胞において発現される。様々な免疫細胞が、とりわけ乳腫瘍では、腫瘍の成長および拡大において役割を果たしており、また、ＣＤ４＋細胞が免疫応答の調節において重要な役割を果たしている。
【０００５】
さらに、乳ガンの予後および管理が、様々な古典的変数によって、例えば、組織学的なタイプおよび悪性度、腫瘍サイズ、リンパ節の関与、ならびに、腫瘍のホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ；ＥＳＲ１）およびプロゲステロン受容体）およびＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）受容体の状態などによって常に影響されていることが知られている。近年では、異なる研究グループにより、臨床結果を予測するいくつかの遺伝子発現サインが特定された。これらの遺伝子発現サインのすべてに対する共通する特徴とは、それらは、主として、さらなる全身的な補助処置を必ずしも必要としない低リスクの患者のより大きい割合を特定し、一方で、高リスクの患者を依然として正しく特定することによって従来の臨床病理学的基準よりも優れていることである。それらはすべてが、同じ臨床的問題に取り組んでいるが、重なりがそのような異なる遺伝子リストの間にはほんのわずかしかないか、または、全くないことは驚くべきことであるかもしれない。このことは、それらの生物学的意味に関する疑問を生じさせている。また、乳ガンは、臨床的に不均一な疾患であることに加えて、ＥＲ（ＥＳＲ１）発現、ＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）発現によって主に規定されるサブグループに関しては、分子的にもまた不均一であることが繰り返し一貫して明らかにされているが、これらの異なる予後的サインは、これらの異なる分子的サブグループにおいて一度も明瞭に評価および比較されなかった。これはおそらくは、個々の研究の規模が比較的小さく、このことがこれらの発見を統計学的に不安定にしていることに起因した。
【０００６】
上皮−間質相互作用が正常な乳腺発達において重要であること、および、乳ガン発生において役割を果たすことが知られている。したがって、原発性腫瘍の成長、乳ガンのサブタイプ決定および転移に関して乳腫瘍の微小環境の影響を調べることが求められている。
【０００７】
したがって、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ；ＥＳＲ１））の状態に属しない、特定の分子的サブタイプに関与する生物学的プロセスおよび腫瘍マーカーを調べること、特に、ＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）受容体の分子的サブタイプに関与する生物学的プロセスおよび腫瘍マーカーを調べることもまた求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＣＤ４＋細胞が免疫応答の調節において重要な役割を果たしているＥＲ−の患者として特定される患者において、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）の診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ））、特に予後を改善するために使用することができる方法およびツールを提供することを目的としている。
【０００９】
本発明は、患者の予後を改善し、かつ、最新技術の欠点を示さないが、腫瘍（特に、乳腫瘍）の発達に対する素因を示すすべての患者（これは、ＥＲ−として特定される患者を意味するが、ＥＲ＋の患者およびＨＥＲ２＋／ＥＲＢＢ２患者もまた意味する）の予後を提案することができる方法およびツールを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＥＲ−の患者におけるガンの予後（予後、検出、病期決定、予測、発生、攻撃性の段階、モニタリング、予測、および、場合により予防）のために使用される、哺乳動物（好ましくは、ヒト）の、免疫応答に関連する（または関連づけられる）遺伝子またはタンパク質から選択される遺伝子／タンパク質セットに関する。
【００１１】
本発明者らは、哺乳動物患者の免疫応答に関連する遺伝子が、ＥＲ−患者におけるガンの特異的かつ適切な診断および予後のために使用されうることを思いがけなく発見した。
【００１２】
これらの遺伝子は、ＥＲ−患者の生検に含まれる腫瘍細胞および／またはリンパ球において高度に発現される。したがって、これらの遺伝子、それらの対応するコードされたタンパク質、およびこれらのタンパク質に向けられる抗体またはその超可変部分は、ＥＲ−患者におけるこの病理の重要なマーカーとして使用されうる。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、表１０および／または表１１から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、および、場合により、１００個、１０５個、１１０個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、および、それらの対応するコードされたタンパク質に対して特異的に向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子セットもしくはタンパク質セット（場合により、ＥＲ−の患者のガンの効率的な予後だけを対象とする、Ａ．Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ他（ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｎｒ８、Ｒ１５７−２００７）によって記載されるような１組の遺伝子のうちの１個または複数の遺伝子と組み合わせられる）に関する。
【００１４】
好都合には、本発明による遺伝子セットおよびタンパク質セットは、好ましくはアレイに従って、固体担体表面に結合される遺伝子もしくはタンパク質の配列、またはそれらのコードされるタンパク質に対して向けられる抗体（またはその超可変部分）から選択された。
【００１５】
本発明はまた、アレイに従って固体担体表面に場合により固定される本発明による遺伝子セット／タンパク質セットと、場合により、（遺伝子セットから選択されるこれらの遺伝子の１つまたは複数の特異的な増幅を可能にする好適なプライマーによる）リアルタイムＰＣＲ分析またはタンパク質分析のための他の手段とを含む診断キットまたは診断デバイスに関する。
【００１６】
固体担体表面は、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド、ガラス製スライド、ガラスビーズ、ポリスチレンプレート、ガラス担体上の膜、ＣＤ表面またはＤＶＤ表面、シリコンチップまたは金チップからなる群から選択することができる。
【００１７】
好ましくは、リアルタイムＰＣＲ分析のためのこれらの所定の手段が、遺伝子セットの各遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ（特に、これらの遺伝子の発現分析、過剰発現または過少発現）のための手段である。
【００１８】
本発明の別の態様が、本発明による遺伝子セット／タンパク質セットから選択される遺伝子／タンパク質の１つまたは複数を、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）の効率的な診断のために、好ましくは、予後のために、他の遺伝子／タンパク質セットから選択される他の遺伝子／タンパク質と場合により組み合わされて含むマイクロアレイに関する。
【００１９】
本発明の別の態様が、下記のモジュールを含む、好ましくはコンピューター化システムであるキットまたはデバイスに関する：
・腫瘍サンプルからの遺伝子発現（またはタンパク質合成）を好ましくは本発明による遺伝子／タンパク質セットに基づいて検出するために構成されるバイオアッセイモジュール、および
・これらの遺伝子の発現（過剰発現または過少発現）（または、対応するコードされたタンパク質の合成）を計算するために、また、腫瘍サンプルについてのリスク評価（悪性腫瘍を発達させるリスク評価）をもたらすために構成されるプロセッサーモジュール。
【００２０】
好ましくは、腫瘍サンプルは、対象から採取（摘出）され得る、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）に対する素因または感受性を示す対象から得られる任意のタイプの組織サンプルまたは細胞サンプルである。
【００２１】
対象は任意の哺乳物対象が可能であり、好ましくはヒト患者が可能であり、サンプルを、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路のガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマまたは脳ガンからなる群から選択される組織から得ることができ、好ましくは、腫瘍サンプルは乳腫瘍のサンプルである。
【００２２】
好都合には、本発明による遺伝子セットは、好ましくは診断キットまたは診断デバイスにおいて、他のタイプの乳ガン（ＨＥＲ２＋、ＥＲＢＢ２、乳ガンタイプ）の効率的な予後のために、他の遺伝子セット／タンパク質セットから選択される他の遺伝子セット／タンパク質セット、好ましくは、表１２および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個および、場合により、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個の遺伝子もしくは遺伝子／タンパク質セットのセット全体、もしくは、それらの対応するコードされたタンパク質に対して向けられる抗体およびその超可変部分を含むか、または、それらからなる他の遺伝子／タンパク質セットから選択される他の遺伝子／タンパク質と組み合わせることができる。好ましくは、これらの遺伝子は、腫瘍浸潤に関連する遺伝子である。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の遺伝子セットは、国際公開ＷＯ２００６／１１９５９３の表３における悪性度３の腫瘍においてアップレギュレーションされた遺伝子として示される遺伝子／タンパク質から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはセット全体、もしくは、それらの対応するコードされたタンパク質に対して向けられた抗体およびその超可変領域を含むか、または、それらからなる。好ましくは、これらの遺伝子／タンパク質は、増殖に関連づけられる遺伝子／タンパク質である。
【００２４】
好ましくは、遺伝子／タンパク質セットは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＡ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、ＭＹＢＬ２、ＫＰＮＡ２およびＳＴＫ６からなる群から選択される少なくとも遺伝子／タンパク質を含む。
【００２５】
好ましくは、選択された遺伝子／タンパク質は下記の４つの遺伝子／タンパク質である：一部係属出願による米国特許出願第１１／９２９０４３号に記載されるような、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、または、より好ましくは、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＹＢＬ２およびＫＰＮＡ２。これらの遺伝子／タンパク質配列が好都合には、アレイとして固体担体に結合する。
【００２６】
（診断）キットまたはデバイスに存在するこれらの遺伝子／タンパク質はまた、これらの好ましい遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析のための手段をさらに含むことができ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲのためのこれらの手段はｑＲＴ−ＰＣＲのための手段であり、配列番号１〜配列番号１６のプライマー配列のうちの少なくとも８個の配列を含む。
【００２７】
さらに、これらの遺伝子／タンパク質セットはまた、参照用の遺伝子／タンパク質をさらに含むことができ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ分析のための４つの参照用遺伝子をさらに含むことができ、これらは、好ましくは、ＴＦＲＣ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯおよびＴＢＰの遺伝子からなる群から選択される。
【００２８】
これらの参照用遺伝子は、特異的なプライマー配列によって特定され、好ましくは、配列番号１７〜配列番号２４からなる群から選択されるプライマー配列によって特定される。
【００２９】
この遺伝子／タンパク質セットにより、当業者はまた、遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）または再発スコア（ＲＳ）を得る（計算する）ことができる。
【００３０】
この前記ＰＣＴ特許出願（ＷＯ２００６／１１９５９３）の内容およびその一部係属出願第１１／９２９０４３号は参照により本明細書中に組み込まれる。
【００３１】
当業者はまた、他の予後的手段（サイン）または遺伝子／タンパク質リスト（ＥＲ−の患者およびＥＲ＋の患者におけるガンの効率的な予後のために使用することができる遺伝子／タンパク質セット）を選択することができ、例えば、下記によって記載される遺伝子／タンパク質セットなどを選択することができる：
Ｗａｎｇ他（ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４６０）ｐ．６７１−６７９（２００５））、Ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ ４１５（６８７１）ｐ．５３０−５３６（２００２））、Ｐａｉｋ他（Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５１（２７）ｐ．２８１７−２８２６（２００４））、Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，７（１０）Ｒ１０１（２００６））、Ｖａｎ Ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他（Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７（２５）ｐ．１９９９−２００９（２００２））、Ｐｅｒｏｕ他（Ｎａｔｕｒｅ，４０６，ｐ７４７−７５２（２０００））、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他（ＰＮＡＳ １００（１８）ｐ．８４１４−８４２３（２００３））、Ｓｏｒｌｉｅ他（ＳＴＮＯ−Ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ／Ｎｏｒｗａｙ ｄａｔａｓｅｔ ＰＮＡＳ，９８（１９）ｐ．１０８６９−１０８７４（２００１））、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｒｅａｓｔ．ｃａｎｃｅｒ／ｍｏｐｏ．ｃｌｉｎｉｃａｌ／ｄａｔａ．ｓｈｔｍｌ
ならびに、アファディン、オーロラＡ、ａ−カテニン、ｂ−カテニン、ＢＣＬ２、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、サイトケラチン５／６、サイトケラチン８／１８、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、エストロゲン受容体、ＦＧＦＲ１、ＦＨＩＴ、ＧＡＴＡ３、Ｋｉ６７、ムチン１、Ｐ５３、Ｐ−カドヘリン、プロゲステロン受容体、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、ＴＡＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれ以上の遺伝子またはタンパク質、および、場合により、サイトケラチン６、サイトケラチン１８、Ａｎｇ１、オーロラＢ、ＢＣＲＰ１、カテプシンＤ、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＫ１４、Ｃｏｘ２、ＦＧＦ２、ＧＡＴＡ４、Ｈｉｆｌａ、ＭＭＰ９、ＭＴＡ１、ＮＭ２３、ＮＲＧｌａ、ＮＲＧ１ベータ、Ｐ２７、パーキン、ＰＬＡＵ、Ｓ１００、ＳＣＲＩＢＢＬＥ、平滑筋アクチン、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質を含む国際公開ＷＯ２００５／０７１４１９に記載されるような乳ガン予後において使用される発現プロファイリング用タンパク質。
【００３２】
当業者はまた、国際公開ＷＯ２００５／０２１７８８に記載されるような、乳腫瘍に関連する示差的遺伝子発現の分析のために使用される１つまたは複数の遺伝子を選択することができ、特に、ＥＲＢＢ２、ＧＡＴＡ４、ＣＤＨ１５、ＧＲＢ７、ＮＲ１Ｄ１、ＬＴＡ、ＭＡＰ２、Ｋ６、ＰＫＭ１、ＰＰＡＲＢＰ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＲＰＬ１９、ＰＳＢ３、ＬＯＣ１４８６９６、ＮＯＬ３、ｌｏｃ２８３８４９、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＡＤＩ２、ＳＴＡＴ３、ＯＡＳ２、ＣＤＫＬ５、ＳＴＡＩＴＧＢ３、ＭＫＩ６７、ＰＢＥＦ、ＦＡＤＳ２、ＬＯＸ、ＩＴＧＡ２、ＥＳＴＡ１８７８９１５／ＮＡ、ＪＤＰＡ、ＮＡＴＡ、ＣＥＬＳＲ２、ＥＳＴＮ３３２４３／ＮＡ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＴＨ２９３０１／ＮＡ、ＦＬＪ１０１９３、ＥＳＲＡの各遺伝子の配列、および、本ＰＣＴ特許出願の遺伝子セットに記載される他の遺伝子配列またはタンパク質配列を選択することができる。
【００３３】
したがって、本発明によるキットまたはデバイスは、好ましくは各タイプの患者群（ＥＲ−の患者群、ＥＲ２＋の患者群、および、ＨＥＲ２＋の患者群）だけを対象とする１つ、２つ、３つまたはそれ以上の遺伝子／タンパク質セットを含む場合があり、また、乳ガンのすべてのタイプ（ＥＲ＋、ＥＲ−、ＨＥＲ２＋）の効率的な診断（予後）のためのこれらの遺伝子／タンパク質セットの１つまたは複数の遺伝子発現（またはタンパク質合成）のために構成される１つ、２つまたは３つのバイオアッセイモジュールを含むコンピューター化システムであるシステムに含めることができる。このシステムは、好都合には、本発明の選択された遺伝子セットの１つまたは複数と、この遺伝子セットの遺伝子発現を計算するために構成されるプロセッサーモジュール、好ましくは、診断に付される選択された腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすための遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）を計算するために構成されるプロセッサーモジュールとを含む。
【００３４】
好都合には、本発明による遺伝子セットおよびタンパク質セットの分子は（直接的または間接的に）標識される。好ましくは、標識は、検出を行うための、好ましくは、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、または、当業者によって広く知られているいずれかの他の方法による検出を行うための放射性標識、比色測定標識、酵素標識、生物発光標識、化学発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００３５】
本発明はまた、下記の工程を含む、哺乳動物対象における、好ましくは、ヒト患者における、好ましくは、少なくともＥＲ−の患者におけるガンの予後のための方法に関する：腫瘍サンプル（好ましくは、乳腫瘍サンプル）を哺乳動物対象（好ましくは、ヒト患者）から採取する工程、および、腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を、様々な配列（特に、ｍＲＮＡ配列）を本発明による遺伝子／タンパク質セットまたは本発明によるキットもしくはデバイスと接触させることによって測定する工程、および、場合により、この腫瘍サンプルについてのリスク評価を（好ましくは、腫瘍サンプルを、ＥＲ−のタイプに含まれる異なるサブタイプとして示し、また、場合により、ＥＲ＋のタイプおよびＨＥＲ２＋のタイプにおいては、より高リスクであり、患者の処置療法（例えば、特定の化学療法処置または特異的に分子標的化された抗ガン治療（例えば、免疫療法またはホルモン療法など）に調節された処置療法）を必要とするとして示すことによって）もたらす工程。
【００３６】
具体的には、本発明はまた、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、ＣＨＯＰまたは他の薬物（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ゴセレリン、イリノテカン、チオテパ、トポテカンまたはトレミフェン、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＶＥＧＦ、ＲＴＫ阻害剤、抗ＶＥＧＦＲ、ＧＲＨ、抗ＥＧＦＲ／ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＥＧＦ−Ｒまたは抗ＨＥＲ２のような薬物）をとりわけ挙げることができるが、様々な化学療法剤および／もしくは（バイオ）医薬品および／もしくは標的化薬剤の適切な用量ならびに／またはスケジュールを選択するために有用である。
【００３７】
本発明の別の態様が、ガン治療における処置された方法または活性な化合物の効率を制御するための方法に関する。実際、様々な乳ガン患者タイプにおけるガンの効率的な予後のために適用される本発明による方法およびツールはまた、このガンに罹患する哺乳動物対象（ヒト患者）に適用された処置の効率的なモニタリングのためにも使用することができる。
【００３８】
したがって、本発明の別の態様が、乳腫瘍に罹患する対象（患者）の処置において使用される効率的な化合物による哺乳動物対象（ヒト患者）の処置の前（および後）に、本発明による予後方法を含む方法に関する。このことは、この方法は、前記対象（患者）が処置を受ける前での、患者に適用される（第１の）予後工程と、この処置の後での（第２の）診断工程とを必要とすることを意味する。
【００３９】
より具体的には、本発明は、表１０および／または表１１によるＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインを診断として、および／または、好適な医薬品の選択を助けるための使用に関する。
【００４０】
この方法は、サンプル対象における遺伝子発現（またはタンパク質合成）の改変が処置後に得られるかを明らかにするために、処置期間中に、または、処置が終了した数週間後もしくは数ヶ月後での処置のモニタリングの期間中に、哺乳動物対象（ヒト患者）に対して数回適用することができる。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様が、腫瘍（特に、乳腫瘍）に対する抗腫瘍活性のために使用される化合物のスクリーニング方法に関する。この場合、そのような化合物の十分な量が、ガンに罹患する哺乳動物対象（好ましくは、ヒト患者）に投与され、かつ、活性な化合物が哺乳動物対象の遺伝子プロフィル（遺伝子発現またはタンパク質合成）を改変し得るかを特定するために、本発明による予後方法が、前記活性な化合物の投与の前に前記哺乳動物対象に適用され、そして、前記活性な化合物の投与の後で適用される。
【００４２】
対象（患者）の遺伝子プロフィル（遺伝子発現またはタンパク質合成）における改変は、活性な化合物の投与前または投与後の得られた腫瘍サンプルが改変されており、（本発明による遺伝子／タンパク質セットによって検出可能である）サンプルにおける異なる遺伝子発現（またはタンパク質合成）をもたらすことを意味する。したがって、この方法は、活性な化合物が哺乳動物対象（特に、ヒト患者）における前記腫瘍（特に、乳腫瘍）の処置において効率的であるかを確認するために適用される。
好都合には、この方法では、この試験方法またはスクリーニング方法に付される活性な化合物は、哺乳動物対象（ヒト患者）の効率的な処置のために回収され、適用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、中央相関（ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）および平均連結を使用する、クラスター化実験のための樹状図である。
【図２】図２は、サブタイプＩ乳ガンの患者における転移の危険性を示す。
【図３】図３は、サブタイプＩ乳ガンの患者における転移の危険性を示す。
【図４】図４は、ＮＫＩ２（Ａ）、ＵＮＣ（Ｂ）、ＶＤＸ（Ｃ）の３例のデータセットについてのＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールスコアと、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールスコアとの間における同時分布を表す。クラスターが、３つの成分を有するガウシアン混合モデルによって確認される。示される楕円は各クラスターのガウシアンの標準偏差の多変量アナログである。
【図５】図５は、ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−、ＥＲＢＢ２＋およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−の分子的サブタイプによって階層化された非処置患者についての生存曲線を表す。
【図６】図６は、非処置の乳ガン患者の、母集団（Ａ）における、ならびに、ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループ（Ｃ）およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｄ）におけるｌｏｇ２（一変量生存分析のハザード比（および９５％ＣＩ））を示すフォレスト（ｆｏｒｅｓｔ）プロットを表す。
【図７】図７は、分子的サブグループの分析における一変量分析において有意であったモジュールスコアのカプラン−マイヤー曲線を表す。モジュールスコアがその３３％分位点および６６％分位点に従って分けられた。ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−サブグループにおけるＳＴＡＴ１モジュール（Ａ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループにおけるＰＬＡＵモジュール（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループにおけるＳＴＡＴ１モジュール（Ｃ）、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおけるＡＵＲＫＡモジュール（Ｄ）。
【図８】図８は、腫瘍浸潤モジュールスコアおよび免疫モジュールスコアの組合せについて、低いスコア、中間スコアおよび高いスコアを有する患者のＥＲＢ２＋サブグループについてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ＣＤ４＋細胞を調べることによる免疫応答の調査
本発明者らは、原発性浸潤性腺管ガンから単離されたＣＤ４＋細胞のプロファイリングを行っている。非管理下での階層的クラスター化アルゴリズムにより、我々は、免疫応答に関与する経路に関して異なった２つの腫瘍群を区別することができた。これらの免疫経路を考慮して、腫瘍に浸潤するＣＤ４＋細胞において示差的に発現する１１１個の遺伝子が特定され、それらは、乳ガンにおける以前に報告されている遺伝子サインとは実質的に異なる「ＣＤ４浸潤腫瘍サイン」（ＣＤ４ＩＴＳ）と呼ばれる遺伝子サインをもたらした。公開されているデータセットに列挙される２６００名を越える患者における、ＣＤ４ＩＴＳと、臨床結果との関係もまた分析した。重要な発見は、ＣＤ４ＩＴＳが、通常最も不良な予後と関連するＥＲ陰性乳ガンの患者において転移の危険性と関連したことであった。
【００４５】
材料および方法
患者のサンプル。浸潤性乳管ガンの患者を研究のために募集した。どの患者も、補助的な全身治療を何ら受けていなかった。ヒト乳ガン組織を手術時に得た。
【００４６】
患者データセット。合計で２６４１名の原発性乳ガン患者から得られる腫瘍標本のマイクロアレイ分析によって得られる９つの遺伝子発現データセットを使用した：ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ（２００２）４、Ｂｕｙｓｅ（２００６）５、Ｄｅｓｍｅｄｔ（２００７）２６、Ｌｏｉ（２００７）６、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ（２００３）７、Ｍｉｌｌｅｒ（２００５）８、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ（２００６）９、ｖａｎ’ｔ ｖｅｅｒ（２００２）１０およびＳｏｒｌｉｅ（２００３）１１からのデータセット。
【００４７】
ＣＤ４＋細胞の単離。ＣＤ４＋細胞を乳管ガンから単離するための手法を確立した。簡単に記載すると、ガン腫サンプルを、外科用メスを使用して機械的に解離した。断片を、サンプルのサイズに依存して２０分間〜６０分間絶えず撹拌しながら、５％ＣＯ２を伴う３７℃のインキュベーターで、ｘ−ｖｉｖｏ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）における４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）の混合物とともに１２ウエル培養ディッシュにおいてインキュベーションした。解離後、消化生成物を、ピストンシリンジを使用してナイロンメッシュでろ過し、ｘ−ｖｉｖｏで洗浄した。ＣＤ４＋細胞を、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＣＤ４陽性単離キットを製造者の説明書に従って使用して単一細胞懸濁物から単離した。集団の純度をフローサイトメトリーによって調べた。
【００４８】
フローサイトメトリー。Ｔ ＣＤ４＋細胞の単離物の品質を確認するために、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の表面発現が、フローサイトメトリーによって分析された。この課題のために、細胞のアリコートのビーズを製造者の説明書に従って分離した。簡単に記載すると、５μｌのそれぞれの特異的なＯＩｔｅｓｔコンジュゲート化抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、５０μｌのＨＡＦＡ緩衝液（フェノールレッド非含有のＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、３％の不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＮａＮ３）に再懸濁された細胞を含有する試験チューブに加えた。チューブをボルテックス撹拌し、光から保護して４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理した。蛍光分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用によって行った。
【００４９】
リンパ球からのＲＮＡの単離。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム手順をＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とともに使用して新鮮なＣＤ４＋細胞から抽出した。簡単に記載すると、Ｔｒｉｐｕｒｅ（１ｍｌ）を、ＣＤ４＋細胞を含有するそれぞれのチューブに加えた。チューブをボルテックス撹拌し、クロロホルムを加えた。サンプルをＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ（商標）（Ｅｘｐｅｎｄｅｒｓ）上に置き、１５６８２ｒｃｆで遠心分離した。上側の水相を取り除き、新しいチューブに入れた。イソプロパノールおよびグリコーゲンを加え、その後、チューブを遠心分離して、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃｋを使用して乾燥し、ヌクレアーゼ非含有の水に再懸濁した。ＲＮＡの量および品質を、ＮａｎｏｄｒｏｐおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｐｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用してそれぞれ求めた。
【００５０】
遺伝子発現分析。１０個の、患者の乳ガンを、良好な品質のＲＮＡの十分な量とともに、原発性腫瘍に浸潤する精製されたＣＤ４＋細胞から単離した。マイクロアレイ分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。ＲＮＡの２サイクルの増幅、ハイブリダイゼーションおよび走査を標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。画像分析およびプローブ定量を、処理されていない生のプローブ強度データをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＣＥＬファイルにもたらしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウエアを用いて行った。プログラムＲＭＡを使用して、データを正規化した。
【００５１】
統計学的分析。浸潤性腺管ガンから単離されたＣＤ４＋細胞の１０の発現プロフィルを考慮して、非管理下での階層的クラスター化を確立した。ＢｉｏＣａｒｔａ経路に基づいて、クラスター間の差を分析した。免疫応答に関連づけられる経路に関与し、かつ、発現レベルにおける有意な差をもたらす遺伝子を選択して、ＣＤ４ＩＴＳを構成した。ＣＤ４ＩＴＳ指数（ＣＤ４ＩＴＳＩ）と呼ばれるスコアを導入して、免疫反応に関連づけられる発現プロフィルと、臨床結果との間における類似性をまとめた。ＣＤ４ＩＴＳを構成する遺伝子を考慮して、ＣＤ４ＩＴＳＩは、ダウンレギュレーションを受けた遺伝子における遺伝子発現の符号つき平均の和から引かれた、アップレギュレーションを受けた遺伝子における遺伝子発現の符号つき平均の和として定義された。その後、このスコアが、データセットに示されるそれぞれの患者について計算された（ｎ＝２６４１）。データセットは全体で利用されたか、または、患者の腫瘍の異なるサブタイプ、および／もしくは、何らかの治療の施与（非施与）を区別して利用された。コックス比例ハザード法の使用による再発の一変量分析および多変量分析をＳＰＳＳ（バージョン１５．０）で行った。時間に沿った全体の無転移生存率を推定するために、カプラン−マイヤー法を使用した。この課題において、考慮された患者データは、その後、スコアが大きくなる順に並び替えられ、カットオフ点を、患者を２つのグループに分けた７５パーセンタイルで定義した。低スコアの患者および高スコアの患者がグループ１およびグループ２にそれぞれ割り当てられた。結果を生存曲線で例示した。
【００５２】
結果−腫瘍浸潤ＣＤ４＋細胞の発現プロフィルがＥＲ状態に従って異なる。
マイクロアレイ技術を使用して、１０個の乳ガン（すなわち、５個のＥＲ＋および５個のＥＲ−）から単離されたＣＤ４＋細胞の遺伝子プロフィルを確立した。これらのプロフィルに関して、非管理下でのクラスター化により、２つの大きなクラスターが明らかにされた（図１を参照のこと）。興味深いことに、これらの２つのクラスターは実際には腫瘍のＥＲ状態に対応する。これらのクラスターは、異なるクラスター化法（中心化連結、非中心化連結、完全化連結または平均連結）を使用しても、非常に安定的かつ再現的であった。
【００５３】
ＣＤ４＋（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の局在化−ＣＤ４＋浸潤腫瘍サイン（ＣＤ４ＩＴＳ）の生成。
細胞経路を考慮して、乳腫瘍に浸潤するＣＤ４＋細胞の発現プロフィルを分割する２つの主要なクラスターの間における差を調べた。これら２つのクラスターの間で異なった３７の統計学的に有意な経路が存在した。興味深いことに、そのような経路のうちの３１が免疫反応と関連した（表１を参照のこと）。
表１は、ＣＤ４ＩＴＳサインに含まれる遺伝子の分類を表す。
「ＣＤ４＋浸潤腫瘍サイン」（ＣＤ４ＩＴＳ）と呼ばれる遺伝的サインが確立された。この課題に近づくために、有意な差（０．０５未満のｐ値）に基づいてこれら３１の免疫経路に関与する遺伝子を選択した。
表２は、基準に従って選択され、かつＣＤ４ＩＴＳを構成する１０８個の遺伝子を表す。
【００５４】
乳ガンにおけるＣＤ４ＩＴＳおよび結果。ＣＤ４ＩＴＳ指数（ＣＤ４ＩＴＳＩ）を、患者および方法の節で記載される式を使用して公的に利用できる乳ガンデータベースにおけるそれぞれの患者について計算した。この指数を、コックス比例ハザードモデルをいくつかデータセットにおいて使用する時間無再発生存分析において臨床結果とのその関連について検定した（ｎ＝２６４１）（結果について、表３を参照のこと）。
この全データセットを考慮して、低い相関が、ＣＤ４ＩＴＳＩと、臨床結果との間において明らかにされ、ハザード比が０．９０９であった（９５％ＣＩ、０．８４０〜０．９８４；Ｐ＝０．０１８）。この結果を考慮して、乳ガンの３つのサブタイプ、すなわち、ＥＳＲ１− ＥＲＢＢ２−（サブタイプ１または「基底様」）、ＥＲＢＢ２＋（サブタイプ２）、および、ＥＳＲ１＋ ＥＲＢＢ２−（サブタイプ３または「管腔」）が、サンプルをこれらのサブタイプに基づいて識別するために区別された。結果は、強い統計学的に有意な相関を、サブタイプ１の乳ガンに関して、ＣＤ４ＩＳＩと、臨床結果との間において示し、ハザード比が０．７３３であった（９５％ＣＩ、０．６２０〜０．８６７；Ｐ＝０．０００）。類似した相関が、よりわずかな影響を伴ったが、サブタイプ２に関して示され、ハザード比が０．７９０であった（９５％ＣＩ、０．６３５〜０．９８２；Ｐ＝０．０３３）。相関がサブタイプ３に関しては何ら示されず、ハザード比が０．９２０であった（９５％ＣＩ、０．８１２〜１．０４２；Ｐ＝０．１８７）。
【００５５】
さらなる調査をサブタイプ１型乳ガンの患者の間で行うために、また、時間無再発生存を推定するために、カプラン−マイヤー法を使用した。この課題において、患者が、患者および方法の節で記載されるようにＣＤ４ＩＴＳに従って階層化された。推定される全体の５年無転移生存率が５７．７％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．８％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）であった（図２を参照のこと）。
【００５６】
サブタイプ１型乳ガンの処置された患者および非処置の患者に対するＣＤ４ＩＳの予後的値を調べた。ＣＤ４ＩＴＳの予後的値は、０．６７３のハザード比（９５％ＣＩ、０．５１２〜０．８８４；Ｐ＝０．００４）を有する処置患者の方が、０．７９２のハザード比（９５％ＣＩ、０．６３８〜０．９８３；Ｐ＝０．０３４）を有する非処置患者よりも強かった（表４を参照のこと）。
カプラン−マイヤー法を上記のように行い、処置患者および非処置患者の間での推定される全体の５年無転移生存率がそれぞれ、４８．７％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．５％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）；６０．９％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．２５％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）であった（図３を参照のこと）。
【００５７】
ＣＤ４ＩＴＳおよび他の予後的サイン。サインのロバスト性を推定するために、本発明に従って、本発明者らは、サブタイプ１型乳ガンの処置患者および／または非処置患者に関して、ＣＤ４ＩＴＳを、発表されている予測的サインに対して、すなわち、Ｗｏｕｎｄ１２、ＩＧＳ１３、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ１４、ＧＧＩ９、Ｇｅｎｅ７０４、Ｇｅｎｅ７６１５に対して比較している。コックス比例ハザードモデルは、ＣＤ４ＩＴＳが、０．７３３のハザード比（９５％ＣＩ、０．６２０〜０．８６７；Ｐ＝０．０００）を有するサブタイプ１型乳ガンの患者の中で統計学的に有意な予測値を有した特有なサインであったことを示した。処置患者および非処置患者を識別すると、ＣＤ４ＩＴＳの排他的妥当性が処置患者の間で強く保たれる。
【００５８】
インシリコ分析による免疫応答および腫瘍浸潤の調査
材料および方法
遺伝子発現データ
遺伝子発現データセットを公開のデータベースまたは著者らのウエブサイトから検索した。本発明者らは、最初の研究によって発表されるような正規化されたデータ（ｌｏｇ２（１チャンネルプラットフォームでの強度）またはｌｏｇ２（２チャンネルプラットフォームでの比率））を使用している。遺伝子発現データの処理は、この研究のメタ分析的枠組みのために何ら必要なかった。
【００５９】
プローブの注釈およびマッピング
ハイブリダイゼーションプローブを、ＲｅｆＳｅｑのバージョン２１（２００７．０１．２１）およびＥｎｔｒｅｚデータベースのバージョン２００７．０１．２１を使用して、Ｓｈｉ他［２０］による方法と同様に、（ＮＭ）サブセットにおけるＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡに対する配列アラインメントによりＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ［１９］にマッピングした。多数のプローブを同じＧｅｎｅＩＤにマッピングしたとき、特定のデータセットにおいて最も大きい不一致を有するプローブを、そのＧｅｎｅＩＤを表すために選択した。
【００６０】
プロトタイプに基づく共発現モジュール
本発明者らは、１組のプロトタイプ、すなわち、乳ガン（ＢＣ）において様々な特定の生物学的プロセスに関連づけられることが知られている遺伝子を考慮しており、また、それらのそれぞれとともに特異的に共発現するそのような遺伝子を特定することを目的としている。この目的を達成するために、本発明者らは、それぞれの遺伝子について、直接的関連および複合的関連をコンピューター計算した。直接的関連は、遺伝子ｉと、それぞれのプロトタイプｊとの間における線形相関として個々に定義され、これに対して、複合的関連は、遺伝子ｉと、特徴選択（直交Ｇｒａｍ−Ｓｃｈｍｉｄｔ特徴選択［２１］）によって特定されるような、プロトタイプの最も良好な線形組合せとの間における線形相関として定義される。遺伝子ｉについて得られる直接的関連および複合的関連のすべてを考慮して、フリードマン検定を、有意に非常に高い関連を特定するために使用した。（プロトタイプｊとの）１つだけの直接的関連が残された場合には、遺伝子ｉがモジュールｊに割り当てられ、プロトタイプｊに対して「特異的」であるとして留意された。対照的に、最も高い関連が多変量関連またはいくつかの直接的関連を含んでいた場合、遺伝子ｉはどのモジュールｊにも割り当てられず、最も高い関連に関与するすべてのプロトタイプに「関連づけられる」として留意された。相関に対する閾値によって、どのプロトタイプにも相関しなかった遺伝子を棄却することが可能となった。この方法はメタ分析的枠組みにおいて適用され、ＮＫＩ２データセット（４）およびＶＤＸデータセット（１６）からの結果を組み合わせた（５８１名の患者、表５を参照のこと）。表５は、公表されている遺伝子発現データセットの特徴を表す。一部のサンプルがいくつかの研究において使用されていることに留意すること。下記の研究ｉｄはサンプルを共通して有する：ＮＫＩ／ＮＫＩ２およびＵＰＰ／ＳＴＫ／ＵＮＴ／ＴＢＡＧＤ／ＴＢＶＤＸ／ＴＡＭ。すべての分析のために、本発明者らは、重複した患者を小さいデータセット（例えば、ＮＫＩ）から除いて、大きいデータセット（例えば、ＮＫＩ２）のサンプルサイズが小さくなることを避けた。
全手順が補足図１に概略的に示される。１つの特定のプロトタイプとともに共発現する遺伝子を特定するために、本発明者らは、ＮＫＩ２データセットおよびＶＤＸデータセットに由来する５８１名の患者のデータセットを使用した。最初に、本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームと、Ａｇｉｌｅｎｔプラットフォームとの間における遺伝子の共通部分のみを、上記のようなマッピング手順（プローブの注釈およびマッピングの節を参照のこと）を適用した後で考慮した。本発明者らは下記では、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットをこの共通部分の遺伝子発現として示す。下記の手順（これは補足図１に概略的に示される）がＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットの各遺伝子について行われる：
１ すべての一変量線形モデルを、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットにおいて、プロトタイプを説明変数として、遺伝子ｉを応答変数として使用してフィッティングし、これにより、７対の一変量線形モデルを得た。
２ これら２つのプラットフォームの間での係数推定値におけるばらつきがサンプリング誤差だけに起因するかどうかを調べるために、本発明者らは、各対の係数についての不均一性のストリンジェントな検定［Ｃｏｃｈｒａｎｅ、１９５４；２５］を適用した。少なくとも１つの係数が不均一である場合（ｐ値＜０．０１）、遺伝子ｉはさらなる分析については棄却された。
３ 本発明者らは、遺伝子ｉが１つだけのプロトタイプによって予測可能であるかを確認するために、すなわち、１つのモデルがそれ以外の候補のすべてよりも有意に良好であるかを確認するために１組の線形モデルを比較した。そうするために、本発明者らは、リーブワンアウト交差検定（ＬＯＯＣＶ）誤差を効率的にコンピューター計算するためにＰＲＥＳＳ統計学［Ａｌｌｅｎ、１９７４；２２］を使用し、２つのモデルをＬＯＯＣＶ誤差のそれらのベクトルに基づいて比較した。フリードマン検定を使用して、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットについての１組の最も良好なモデルを別個に確認した。それぞれの比較のために、２つのｐ値を、Ｚ変換法［Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、２００５］を使用してメタ分析的に組み合わせた。組み合わされたｐ値が０．０５未満であった場合、モデルは、別のモデルよりも著しく良好であると見なされた。コンピューター計算の限界のために、本発明者らは、遺伝子ｉを予測するためのプロトタイプの可能なすべての組合せを調べることができなかった。対応する多変量線形モデルの平均二乗ＬＯＯＣＶ誤差に関する最も良好な１組のプロトタイプのみが、直交Ｇｒａｍ−Ｓｃｈｍｉｄｔ特徴選択を使用して確認された［Ｃｈｅｎ他、１９８９；２１］。この多変量モデルをその１組の一変量モデルに加えて使用した。
４ 本発明者らは、１組の最も良好なモデルを検討することによって、１つのプロトタイプに対する遺伝子ｉの特異性を調べた。１つの一変量モデルだけがこの１組に属した場合、それは、プロトタイプｊのみを使用するモデルが、他のプロトタイプに関するモデルのすべてよりも有意に良好であることを意味した。加えて、多変量モデルが、１組の最も良好なモデルに属した場合、それは、この多変量モデルが、プロトタイプｊに関するモデルよりも有意に良好でないことを意味した。
５ 遺伝子ｉを、プロトタイプｊに対して特異的であることを確認し、モジュールｊ（これはまた、遺伝子リストｊと呼ばれる）に含めた。
モジュールのサイズを小さくするために、本発明者らは、正規化された平均二乗ＬＯＯＣＶ誤差に対する０．９５の閾値を使用して、特異的な遺伝子を選別した。
【００６１】
モジュールスコア
特異的なデータセットについて、モジュールスコアを、
（式中、ｘｉは、データセットのプラットフォームに存在するモジュールにおける遺伝子の発現である。ｗｉは、プロトタイプとの関連の符号に依存して、＋１または−１のどちらかである。）
として、それぞれのサンプルについてコンピューター計算した。ロバストな尺度化を、１に等しい四分位数間範囲と、０に等しいメジアンとをそれぞれのデータセット内において有するようにそれぞれのモジュールスコアに対して行い、これにより、モジュールスコア間の比較を可能にした。
【００６２】
遺伝子オントロジーおよび機能的分析
遺伝子オントロジー分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ａｎａｌｙｓｉｓツール（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）（遺伝子発現データにおける分子相互作用ネットワークの発見、可視化および調査を可能にするウエブ配信アプリケーション）を使用して実施した。ＨＵＧＯ遺伝子記号、同様にまた、正または負の共発現の目安を含有する、異なるプロトタイプと特異的に関連することが確認された遺伝子の様々なリストが、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析にアップロードされ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路知識ベースに保存される機能的注釈と相関された。
【００６３】
クラスター化
異なるデータセットにまたがる分子的サブグループを矛盾なく特定するために、本発明者らは、等しい対角分散をすべてのクラスターについて有するガウス混合モデル［２３］にフィッティングすることによって、ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールスコアおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールスコアを使用して腫瘍をクラスター化した。本発明者らは、成分の数を調べるためにベイズ情報量基準［２４］を使用している。それぞれの腫瘍が、クラスターにおける構成要素の最大事後確率を使用して特定された分子的サブグループの１つに自動的に分類された。
【００６４】
関連分析
本発明者らは、ピアソン相関係数を使用してモジュールスコアのペアワイズ相関を推定している。それぞれの相関係数をそれぞれのデータセットについて個々に推定し、母数モデルによる分散逆数重み付け（ｉｎｖｅｒｓｅ ｖａｒｉａｎｃｅ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）法［２５］と組み合わせた。加えて、本発明者らは、モジュールスコアと、サブタイプとの間における関連を、クルスカル−ウォリス検定を使用して検定している。本発明者らは、モジュールスコアと、臨床的変数との間における関連を、ウィルコクスン順位和検定を使用して検定している。それぞれの統計学的検定をそれぞれのデータセットについて個々に適用し、ｐ値を、母数モデルによる逆正規（ｉｎｖｅｒｓｅ ｎｏｒｍａｌ）法［２９］を使用して組み合わせた。これらの関連分析を母集団および種々の分子的サブグループの両方において行った。
【００６５】
生存分析
本発明者らは、非処置患者の無再発生存（ＲＦＳ）を生存の終点と見なしている。ＲＦＳを得ることができなかったとき、本発明者らは無遠隔転移生存（ＤＭＦＳ）データを使用している。生存データのすべてが１０年で打ち切られた。生存曲線はカプラン−マイヤー推定値に基づいており、グリーンウッド法が、９５％信頼区間をコンピューター計算するために用いられた。２つまたは３つのグループ（サブタイプおよび３元モジュールスコア）の間におけるハザード比が、データセットを層指標として用いるコックス回帰を使用して計算され、したがって、これにより、コホート間における異なる基準ハザード関数が考慮された。臨床的変数およびモジュールスコアについては、ハザード比をそれぞれのデータセットについて個々に推定し、母数モデルによる分散逆数重み付け法［２５］と組み合わせた。本発明者らは、最も良好な多変数コックスモデルを特定するためにメタ分析的枠組みにおいて段階的増加特徴選択を使用している。新しい特徴（変数）の包含のための、また、以前に選択された特徴（変数）の排除のために組み合わせたｐ値（ハザード比についてのワルド検定）に関する有意性閾値が０．０５に設定された。
【００６６】
予後的遺伝子サインの適用
プラットフォーム間のマッピングが必要であったとき、本発明者らは、ＧｅｎｅＩＤにマッピングされ得るサインにおける遺伝子を考慮しているだけである。予測スコアを、上記のモジュールスコアについての式に類似する線形結合を使用してそれぞれのサインについてコンピューター計算した。最初の研究からの遺伝子特異的な重み（係数、相関または他の尺度）を、各遺伝子の元々のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに依存して、＋１または−１で変換した。以前に発表されている遺伝子分類子についてのこのコンピューター計算法は、最初のデータセットに対する正式の分類と比較して非常に類似した結果を与え、また、異なるマイクロアレイプラットフォームでの遺伝子サインの適用を可能にした。ロバストな尺度化を、１に等しい四分位数間範囲と、０に等しいメジアンとをそれぞれのデータセット内において有するようにそれぞれの遺伝子サインに対して行って、異なる遺伝子サインの間における比較を可能にした。
【００６７】
結果
乳ガンの分子モジュールの明確化
分子モジュールを明らかにするために、本発明者らは、最初に、それぞれの生物学的プロセスについて「プロトタイプ」として作用するための典型的な遺伝子を文献に基づいて選択し、その後、乳ガンにおける種々の生物学的プロセスの根底にあるプロトタイプ遺伝子のそれぞれと特異的に関連する遺伝子のモジュールを作製するために線形モデルの比較を適用している（方法を参照のこと）。選択されたプロトタイプ遺伝子は、ＡＵＲＫＡ（ＳＴＫ６、７または１５として知られている）、ＰＬＡＵ（ｕＰＡとして知られている）、ＳＴＡＴ１、ＶＥＧＦ、ＣＡＳＰ３、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）であった。これらは、増殖、腫瘍浸潤／転移、免疫応答、血管形成、アポトーシスの各表現型、ならびに、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２のシグナル伝達をそれぞれ表す。
【００６８】
多数のマイクロアレイプラットフォームおよび異なる乳ガン集団にわたって十分に機能する遺伝子を特定するために、本発明者らは、ＡｇｉｌｅｎｔアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイにおいてそれぞれハイブリダイゼーションしたｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒらのシリーズ［４］およびＷａｎｇらのシリーズ［１６］に含まれる５８１名の乳腫瘍サンプルのデータセットを分析することによってこれらの分子モジュールを定義している。それぞれのモジュールスコアが、選ばれたプロトタイプだけについて、正に相関する遺伝子の和および負に相関する遺伝子の和の差によって定義された。遺伝子が２つ以上のプロトタイプと相関した場合、その遺伝子はどのモジュールにも含まれなかった。遺伝子のこれらのリストが補足表１として利用可能である（下記参照）。本発明者らは、その後、合計で２１００を越える腫瘍サンプルを含むいくつかの発表されたマイクロアレイデータセットに関してこれらのモジュールスコアのそれぞれをマッピングし、コンピューター計算した（表５を参照のこと）。
これらの分子モジュールの主要な特徴は、それらが、ＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプラットフォームおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイプラットフォームを使用するデータセットにおける選ばれたプロトタイプと一貫して共発現される遺伝子として特定されることであり、また、それらが、臨床的変数および遺伝子注釈を調べることなく特定されることである。
【００６９】
分子モジュールに含まれる遺伝子の特徴づけ
分子モジュールを表す遺伝子の７つのリストが、それらの符号と一緒に、機能的注釈の分析のためにＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路知識データベース（ＩＰＫＢ）にアップロードされた。
【００７０】
ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールは４６９個の遺伝子から構成され、そして、予想されるように、以前のマイクロアレイ研究によって既に報告されているいくつかの管腔遺伝子および基礎的遺伝子（例えば、ＸＢＰ１、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＭＹＢ、ＧＡＴＡ３、ＰＧＲおよびいくつかのケラチンなど）の共発現によって特徴づけられた。情報が、これらの遺伝子のうちの３２６個についてはＩＰＫＢに見出され、１３９個が特定の機能（例えば、小分子の生化学、ガン関連の機能、脂質代謝、細胞の運動、細胞の成長および増殖または細胞死など）と有意に関連した。ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールは２８個の遺伝子を含み、それらのほぼ半数が１７ｑ１１−２２アンプリコンに同一に存在した（例えば、ＴＨＲＡ、ＩＴＧＡ３およびＰＮＭＴなど）。１６個を機能的分析のために使用することができ、１５個が下記のオントロジークラスと有意に関連した：ガン関連の機能、細胞間のシグナル伝達、細胞の成長および増殖、分子輸送、ならびに、細胞形態学。増殖モジュール（ＡＵＲＫＡ）は２２９個の遺伝子を含み、それらのうちの３４個が、以前に報告されたゲノム悪性度指数において示された。１４３個の遺伝子がＩＰＫＢと一致し、それらのうち９３個が特定の機能と有意に関連した。予想されるように、これらの遺伝子の大多数、例えば、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＢＩＲＣ５などが、細胞の成長および増殖、ガンおよび細胞周期に関連づけられる機能に関与した。腫瘍浸潤／転移モジュール（ＰＬＡＵ）は、中でもいくつかのメタロプロテイナーゼとともに６８個の遺伝子を含んでいた。ＩＰＫＢをマッピングした５５個のうち、４６個が様々な機能（例えば、細胞の運動、組織の発達、細胞の発達およびガン関連の機能など）と有意に関連した。免疫応答モジュール（ＳＴＡＴ１）は９５個の遺伝子を含み、それらのうちの８２個に対して行われた機能的分析により、大多数が免疫応答と関連し、その後に、細胞の成長および増殖、細胞シグナル伝達、ならびに、細胞死が続くことが明らかにされた。血管形成モジュール（ＶＥＧＦ）は、ガン、遺伝子発現、脂質代謝および小分子生化学と関連づけられる１０個の遺伝子を含み、最後に、アポトーシスモジュール（ＣＡＳＰ３）は、タンパク質の合成および分解、ならびに、細胞の組み立ておよび運動と主に関連する９個の遺伝子を含んでいた。
【００７１】
これらのプロトタイプのすべてについて、それぞれのプロトタイプに関連づけられる遺伝子のリストは、他のプロトタイプとの相関を考慮に入れて所与のプロトタイプに特異的に関連する遺伝子を表す、ここで示されるリストよりもはるかに長かったことは注目に値する（表６）。
表６は、それぞれのプロトタイプと関連する遺伝子の数を表す。
＊これらの数字は、所与のプロトタイプと関連づけられる遺伝子の数を表す。すなわち、これらの遺伝子はまた、別のプロトタイプと関連する場合がある。
＊＊これらの数字は、所与のプロトタイプと特異的に関連する遺伝子の数を表す。このことは、これらの遺伝子はこのプロトタイプに関連するだけであり、他のプロトタイプには関連しないことを意味する。
例えば、ケモカインＩＬ８（これは、血管新生促進作用を有することが報告されている）の発現が実際に、ＶＥＧＦの発現と関連した。しかしながら、その発現はまた、ＰＬＡＵの発現とも相関したので、これはどのモジュールにも含まれなかった。アポトーシスに関連づけられる遺伝子のＢＣＬ２Ａ１、ＢＩＲＣ３、ＣＤ２およびＣＤ６９は、それらの発現はまたＥＲ（ＥＳＲ１）とも関連したので、アポトーシスモジュールに組み込まれなかった。また、さらなるメタロプロテアーゼがＰＬＡＵと関連することが見出され（例えば、ＭＭＰ１およびＭＰ９など）たが、それらの発現レベルはまた、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＳＴＡＴ１とも相関したので、浸潤モジュールには含まれなかった。このことは、異なる生物学的プロセスがほぼ確実に、相互に連絡していることを示す。しかし、ここで、本発明者らは、乳ガンの生物学および予後に対するそれらの個々の影響をより良く示すために、それらを「特異的」にすることを望んだ。
【００７２】
異なるモジュールに含まれる遺伝子の発現値がさらなる分析のためにモジュールスコアにまとめられた（コンピューター計算に関する詳細については、方法における「モジュールスコア」の節を参照のこと）。
【００７３】
ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−およびＥＲＢＢ２＋の分子的サブグループの特定および特徴づけ
本発明者らは、母集団に対する分析、しかもＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールおよびＨＥＲ２モジュールに基づく異なるサブグループにおいても分析を行うことを望んだので、これらの３つの分子的サブグループを定義する必要があった。この目的を達成するために、本発明者らは、ＥＳＲ１−の患者がいないこと、および、プローブの数が少ないことにそれぞれ起因してＭＧＨデータセットおよびＶＤＸ２／ＴＢＡＧＤデータセットを除いて、異なるデータセットにおいて３つの患者群を矛盾なく特定するクラスター化法を使用した。ＮＫＩ２コホート、ＶＤＸコホートおよびＵＮＣコホートについてのクラスターが、一例として図４に示される。
【００７４】
分子的サブグループ毎の臨床病理学的特徴を表７に例示する。
表７は、生存分析のために考慮された非処置の乳ガン患者について分子的サブグループ毎の臨床病理学的特徴を表す。予想されるように、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループおよびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおける腫瘍の圧倒的多数は、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態についてそれぞれ陰性および陽性であった。これに反して、ＥＲＢＢ２＋サブグループは、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態に関して腫瘍の混合物によって構成された。これら３つの分子的サブグループの生存曲線をこのメタ分析の非処置患者のすべてにわたって比較したとき、本発明者らは、他者［２７〜３１］によって既に報告されているように、分子的サブグループの間における差を認めた。実際、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−から得られる生存曲線はそれ以外の２つとは著しく異なっていた（ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−についてはｐ＝０．０３、ＥＲＢＢ２＋についてはｐ＝０．００３）。しかしながら、生存における差が、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループと、ＥＲＢＢ２＋サブグループとの間において何ら認められなかった（ｐ＝０．５６；図５を参照のこと）。
【００７５】
臨床病理学的パラメーターと、分子モジュールスコアとの間における関連
２１８０名の患者についての情報を調査することを、本発明者らは、異なるモジュールスコアの間に何らかの関連が存在したかどうかを調べることによって開始した。１つの興味深い発見が、例えば、一方では増殖モジュールスコアと、他方では血管形成モジュールスコアおよび腫瘍浸潤モジュールスコアとの間における正の相関および負の相関であった。これらの関連は、異なる分子的サブグループの全体を通して保存され、最も高い相関がＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて認められた。すべての結果を補足表２（下記を参照のこと）に示す。
補足表２は下記の４つの表を示す：母集団からの２１８０名の処置された乳ガン患者および非処の置乳ガン患者（Ａ）、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２サブグループからの３１９名のガン患者（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループからの２５２名の患者（Ｃ）、ならびに、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループからの１６１０名の患者（Ｄ）のモジュールスコアの間におけるペアワイズ−ピアソン相関係数のメタ推定量。
【００７６】
本発明者らはさらに、モジュールスコアと、十分に確立された臨床病理学的パラメーター（例えば、年齢、腫瘍サイズ、節の状態、組織学的悪性度、および、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはリガンド結合アッセイのどちらかによって定義されるＥＲ（ＥＳＲ１）状態など）との間における関連を特徴づけようと努めた。意味のある関連が見出され、これにより、モジュールスコアの妥当性が立証された。例えば、非常に有意な関連が、ＥＲ（ＥＳＲ１）／増殖モジュールスコアと、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態／組織学的悪性度との間において認められた。本発明者らはまた、それほど知られていない関連または新しい関連（例えば、組織学的悪性度モジュール値と、血管形成モジュール値との間における関連、免疫応答モジュール値と、アポトーシスモジュール値との間における関連など）を認めた。同じ関連がまた、節の関与について報告された。しかしながら、本発明者らは、浸潤モジュール値と、臨床病理学的マーカーとの間には関連を何ら認めなかった。これらの関連を異なる分子的サブグループにおいて調べたとき、本発明者らは、類似した関連をＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて見出した。この場合、１つの大きな違いが、母集団では認められなかった、ＥＲＢＢ２モジュールスコアと、組織学的悪性度との間における非常に有意な相関であった。これに反して、あまり有意でない関連がそれ以外の２つサブグループにおいて報告された。これらの結果を補足表３（下記を参照のこと）にまとめる。
補足表３は下記の４つの表を示す：母集団（Ａ）、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２サブグループ（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループ（Ｃ）およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｄ）についての、モジュールスコアと、臨床病理学的パラメーターとの間における関連。「＋」符号は変数間における正の関連を表し、ｐ値が０．０１〜０．０５の間に含まれる場合には（＋）であり、０．０１〜０．００１の間に含まれる場合には（＋＋）であり、０．００１未満の場合には（＋＋＋）である。「−」符号は変数間における負の関連を表し、ｐ値が０．０１〜０．０５の間に含まれる場合には（−）であり、０．０１〜０．００１の間に含まれる場合には（−−）である。
【００７７】
分子モジュール、臨床病理学的パラメーターおよび予後
これらのモジュールスコアの予後値を疾患の自然史に関連して評価するために、本発明者らは、１２３５個の腫瘍サンプルを含む非処置の乳ガン患者のみを考慮した。その目的のために、本発明者らは、十分に確立された臨床病理学的変数、同様にまた、本研究において定義される分子モジュールを含む７．４年の平均追跡調査とともに、全身的に処置されていない患者に対する無再発生存についての一変量分析および多変量分析の両方を行った。これらの分析は、これらの３つのサブグループの患者の経時的な生存における違いを考慮に入れるために分子的サブグループに従って階層化された（図５を参照のこと）。
【００７８】
一変量モデルにおいて、ほとんどすべての「十分に確立された」臨床病理学的パラメーター、すなわち、腫瘍サイズ、組織学的悪性度および節浸潤が、臨床結果と有意に関連した。分子モジュールの中で、増殖、血管形成および免疫応答はまた、無再発生存との統計学的に有意な関連を示した。節の関与を伴う患者の割合が少ないこと（６．７％、１２２５個中８３個）を考えると、節の状態についての生存分析の結果は、注意して解釈しなければならない。この一変量分析の結果を図６に例示し、補足表４（下記を参照のこと）においてより詳しく示す。
補足表４は、非処置の乳ガン患者の分子的サブグループ毎の異なる遺伝子分類子の一変量分析に対応する。すべてのサインがここでは、連続変数であると見なされる。ＧＥＮＥ７０＝７０遺伝子のサイン［１０、４］；ＧＥＮＥ７６＝７６遺伝子のサイン［１６、１７］；Ｐ５３＝ｐ５３のサイン［８］；ＷＯＵＮＤ＝傷害応答サイン［１２、１８］；ＧＧＩ＝ゲノム悪性度指数［９］；ＯＮＣＯＴＹＰＥ＝２１遺伝子の再発スコア［１４］；ＩＧＳ：１８６遺伝子の「浸潤性」遺伝子サイン［１３］。
【００７９】
多変量分析（ｎ＝７７５）において、増殖［ＨＲ＝２．４８（１．８８〜３．２８）、ｐ＝２×１０−１０］、腫瘍浸潤［１．４１（１．１６〜１．７２）、ｐ＝７×１０−４］、免疫応答［ＨＲ＝０．７２（０．５９〜０．８７）、ｐ＝６×１０−４］、アポトーシス［ＨＲ＝１．１８（１．００〜１．３８）、ｐ＝０．０５］、組織学的悪性度［ＨＲ＝１．８０（１．１２〜２．８８）、ｐ＝０．０２］が無再発生存（ＲＦＳ）と有意に関連し、増殖モジュールが分子モジュールの中で最も大きいＨＲおよび最も有意なｐ値を示した。
【００８０】
本発明者らがプロトタイプ遺伝子だけを考慮したとき、成績は、それらのそれぞれのモジュールと比較してそれほど顕著ではなかった。このことは、共発現した遺伝子をモジュールスコアに平均化することは、１つだけの遺伝子の発現レベルよりも安定しており、また、プラットフォーム間の比較に対する依存性が低いことを示唆している。
【００８１】
ＥＳＲ１−／ＥＳＲ２−、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−およびＥＲＢＢ２＋の分子的サブグループにおける分子モジュールスコア、臨床病理学的パラメーターおよび予後
モジュールおよび臨床病理学的パラメーターの予後値を上記で定義した分子的サブグループに従って調べたとき、我々は、高リスクのＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−のサブ集団（ｎ＝１８９）において、免疫応答モジュールのみが一変量分析および多変量分析の両方で臨床結果との有意な関連を示したことを確認した［ＨＲ＝０．７０（０．５０〜０．９８）、ｐ＝０．０４］（図６〜図７、および補足表４）。
【００８２】
興味深いことに、ほとんどすべてのＥＲ（ＥＳＲ１）陰性腫瘍が高い増殖モジュールスコアを示したので、増殖モジュールはその有意性を失っていた。
【００８３】
ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−のサブ集団（ｎ＝５３１）において、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度が、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュール、増殖モジュールおよび血管形成モジュールとともに、ＲＦＳと関連した。多変量分析において、増殖モジュール［ＨＲ＝２．６８（２．０２〜３．５５）、ｐ＝９×１０−１２］および組織学的悪性度［ＨＲ＝２．００（１．１８〜３．３７）、ｐ＝０．０１］だけが依然として有意のままであり、増殖モジュールが最も大きいＨＲおよび最も有意なｐ値を有した。
【００８４】
ＥＲＢＢ２＋の腫瘍（ｎ＝１２６）において、節の状態、腫瘍浸潤、血管形成および免疫応答のモジュールまたはスコアが、一変量モデルではＲＦＳと有意に関連し、これに対して、腫瘍浸潤モジュール［ＨＲ＝２．０７（１．３２〜３．２５）、ｐ＝０．００１］および免疫応答モジュール［ＨＲ＝０．５６（０．３６〜０．８６）、ｐ＝０．００９］だけが依然として、多変量モデルではＲＦＳと有意に関連したままであった。その後、本発明者らは、分類を改善するために、これらの２つの変数を組み合わせようと努めた。＋１および−１の重みを腫瘍浸潤モジュールおよび免疫応答モジュールの組合せにおいてそれぞれ使用した。しかしながら、本発明者らは、この単純な組合せが、図８に示されるように、予後に関するＥＲＢＢ２＋サブグループにおける患者の分類を著しく改善しなかったことを観察した。
【００８５】
分子モジュールを使用する予後的遺伝子発現サインの詳細な分析
いくつかの発表されている予後的サイン（１０、４、１６、１７、１２、１８、９、１４、８、１３）に含まれる個々の遺伝子の生物学的意味を調べるために、本発明者らは、これらのサインに含まれるそれぞれの個々の遺伝子がどの分子的カテゴリーに属するかを明らかにするために、線形モデルの同じ比較をいくつかの予後的サインに対して適用した。表８は、特定のプロトタイプに関連づけられるそれぞれのサインの遺伝子の割合、または、特異的に関連するそれぞれのサインの遺伝子の割合（括弧内の値）を例示する。
表８は、７つのプロトタイプによる遺伝子発現予後的サインの分析を表す。数字は、特定のプロトタイプに関連づけられるそれぞれのリストの遺伝子の割合、または、特定のプロトタイプに特異的に関連するそれぞれのリストの遺伝子の割合（括弧内の値）を表す。ＧＥＮＥ７０＝７０遺伝子のサイン［１０、４］；ＧＥＮＥ７６＝７６遺伝子のサイン［１６、１７］；Ｐ５３＝ｐ５３のサイン［８］；ＷＯＵＮＤ＝傷害応答サイン［１２、１８］；ＧＧＩ＝ゲノム悪性度指数［９］；ＯＮＣＯＴＹＰＥ＝２１遺伝子の再発スコア［１４］；ＩＧＳ：１８６遺伝子の「浸潤性」遺伝子サイン［１３］。
【００８６】
この分析によって、本研究で調べられたそれぞれのサインにおける遺伝子の半分を越えるものが増殖プロトタイプと統計学的に関連したことが明らかになった。また、特異的な関連の割合、すなわち、１つのプロトタイプと関連し、それ以外のプロトタイプとは関連しないことの割合が非常に高いことがまた、ＡＵＲＫＡについては報告され、このことはいくつかの予後的サインにおける増殖の重要性を強調している。
【００８７】
その後、本発明者らは、上記で報告されている予後的遺伝子サインの３つについて、すなわち、７０遺伝子［１０、４］、７６遺伝子［１６、１７］およびゲノム悪性度［９］について、「詳細に分析された」サインのそれぞれの分子モジュールの予後値を元々の予後値と比較することによって工程をさらに進めた。そうするために、本発明者らは、これらのサインが、最初のアルゴリズムおよびマイクロアレイプラットフォームを使用してコンピューター計算された非処置の原発性乳ガン患者のＴＲＡＮＳＢＩＧ独立妥当性確認シリーズを使用している［５、２６］。このことはまた、この集団がこれらのサインのどの展開のためにも使用されなかったという利点を提供した。本発明者らは、プロトタイプの１つと特異的に関連した元々のサインからの遺伝子の一群について無遠隔転移生存についてのハザード比を、元々のサインに関して得られるハザード比と比較した。興味深いことに、図８に示されるように、増殖モジュールの成績が、３つの調べられたサインのすべてについて元々のサインと等しかった。このことは、増殖が原動力となり得ることを示唆する。
【００８８】
本発明者らはさらに、表１３および／または表１２に記載のＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインが、化学療法（アントラサイクリン）に対する抵抗性と相関することを見出した。
【００８９】
本発明者らは、診断として、および／または、好適な医薬品の選択を助けるためにＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインを使用する。
【００９０】
異なる分子的サブグループにおける予後的サインの影響の評価
乳ガンのどの分子的サブグループがこれらの予後的サインから利益を受け得るかを調べるために、本発明者らは、ＥＲ（ＥＳＲ１）の分子モジュールスコアおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の分子モジュールスコアによって定義される異なる分子的サブグループにおいて上記で報告される異なる遺伝子サインの予後的影響を分析した。異なる遺伝子サインを生じさせるための的確なアルゴリズムを、異なるマイクロアレイプラットフォームには適用することができないので、本発明者らは、それぞれの最初の刊行物において報告された関連の方向を使用して、モジュールスコアについて行われたように分類子をコンピューター計算することを決めた。符号つき平均は元々のアルゴリズムよりも効率的でないかもしれないという事実が懸念されたので、本発明者らは、最初の刊行物での同じ比較研究を行い、元々のスコアおよび修正されたスコアが非常に相関したこと、および、それらの成績が非常に類似していたことを見出した。ほとんどの予測子が多くの場合、単峰型分布を使用して最も良く記載されるので、また、二分化された結果変数を使用することは、有意なバイアスを、異なる予後的サインを比較する際に持ち込むことがあるので、本発明者らはここでは、異なるサインを連続変数と見なした。また、ロバストな尺度化の適用を行った場合、異なるサインが互いに比較され得ることにも留意しなければならない。
【００９１】
分子的サブグループによるこれらのサインの予後力の分析は、これらの予測子の開発において使用されなかった患者に対してだけ行われたが、これらのサインの成績は、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループの患者に限定されるようであったことを示した（表９）。実際、異なるサインはそれ以外の２つの分子的サブグループにおいて全く情報をもたらさなかった。
【００９２】
乳ガン（ＢＣ）細胞と、それらの間質成分との間でのインビボ相互作用：遺伝子発現における変化の分析
本発明者らは、Ａｌｌｉｎｅｎおよび共同研究者ら（２００４）によって記載されるプロトコルを間質細胞の単離のために適合化し、腫瘍上皮細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）、白血球（ＣＤ４５陽性）、筋線維芽細胞（ＣＤ１０陽性）および内皮細胞の４つの異なる細胞サブ集団を分離および単離することを成し遂げている。本発明者らはまた、いくつかのＲＮＡ増幅／標識化プロトコルを本発明者らの遺伝子発現実験のために試験している。
【００９３】
今日まで、筋線維芽細胞（ＣＤ１０）が２８の乳腫瘍および４つの正常な組織から単離および精製された。遺伝子発現分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイを使用して行った。生存分析を、１２００名を越える全身処置されていない乳ガン患者を含む１２の公表されているマイクロアレイデータセットを使用して行った。
【００９４】
乳腫瘍の筋線維芽細胞間質細胞は、正常な乳房組織から単離された筋線維芽細胞間質細胞に対する変化した遺伝子発現パターンを示した（表１２および表１３を参照のこと）。示差的に発現する遺伝子のいくつかが細胞外マトリックスの形成／分解および血管形成と関連することが見出される一方で、いくつかの他の遺伝子の機能は依然として、大部分が不明のままである。
【００９５】
非管理下での階層的クラスター化分析では、乳腫瘍の筋線維芽細胞が、ＥＲ、ＨＥＲ２状態および腫瘍分化に基づいて乳ガンの分子的ポートレートを要約する４つの主要なサブグループにクラスター化された。
【００９６】
腫瘍の発現プロファイリング研究と同様に、中間悪性度の腫瘍から単離されたＢＣ筋線維芽細胞は明確な遺伝子発現パターンを示さないが、高分化腫瘍および低分化腫瘍にそれぞれ由来する遺伝子発現プロフィルと類似する遺伝子発現プロフィルの混合を示した。
【００９７】
ＢＣ組織に対して正常組織から単離された筋線維芽細胞から明らかになる間質の遺伝子発現サインは、臨床結果との統計学的に有意な関連を示した。間質サインの高い発現レベルを有する乳腫瘍は、より不良な予後と有意に関連した（ＨＲ １．５５；ＣＩ １．２０〜１．９９；ｐ＝５．５７×１０−４）。この関連が、臨床的に高リスクのＨＥＲ２＋サブタイプ内において主に観測された。興味深いことに、間質サインの発現レベルが高いＨＥＲ２＋腫瘍、および、間質サインの発現レベルが低いＨＥＲ２＋腫瘍は、４５％および８５％の無遠隔転移生存率を５年の追跡調査でそれぞれ示した（ＨＲ ２．５３；ＣＩ １．３１〜４．９０；ｐ＝５．２９×１０−３）。
【００９８】
予備的結果から、乳ガン発生および乳ガンサブタイプ決定における腫瘍上皮−間質細胞相互作用の重要性が強調される。そのうえ、この重要性は、特にＨＥＲ２＋サブタイプ内での腫瘍伝播における間質細胞の役割を示し、また、新規な治療戦略を開発するための基礎を提供する。
【００９９】
本研究において、本発明者らは、乳ガンにおいて以前に記載されたいくつかの生物学的プロセス、すなわち、増殖、腫瘍浸潤、免疫応答、血管形成、アポトーシス、ならびに、エストロゲンおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）のシグナル伝達を表す分子モジュールを開発した。乳ガンをその分子的成分に詳しく分析することによって、本発明者らはこの疾患の性質を単純化したが、本研究は、乳ガンに関与する主要な生物学的プロセスおよび予後に対するそれらの影響を理解することに関するたくさんの情報をもたらした。
【０１００】
本発明者らは、最初に、分子モジュールを表す遺伝子の７つのリストを特定した。最多数の遺伝子を含むモジュールがＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールであった（４６８個の遺伝子）。乳ガンの分子的分類に関するいくつかの刊行物は乳ガンのエストロゲン受容体の状態を発現サブグループの主たる識別子として繰り返し一貫して特定しているので［２７、２８、２９、３０］、これは驚くことではなかった。最多数の遺伝子を伴う第２のリストが、増殖モジュールに関連づけられるリストであった（２２８個の遺伝子）。これは、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他［３０］によって以前に報告された発見と一致している。これらの長いリストとは対照的に、血管形成、アポトーシスおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）シグナル伝達を反映するモジュールは、非常に限定された数の遺伝子とともに終わっただけであった（それぞれ、１３個、９個および２７個の遺伝子）。このことは、これらのモジュールと関連する多くの遺伝子はＥＲ（ＥＳＲ１）または増殖（ＡＵＲＫＡ）とも関連し、したがって、他の分子モジュールの開発において保持されなかったという事実によって部分的に説明することができる。
【０１０１】
この分子モジュールの機能的分析ではまた、興味深い情報が明らかにされた。予想されたように、これらのモジュールに含まれる多くの遺伝子は、選ばれた生物学的プロセスと関連することが知られていた。しかし、多くの他の遺伝子（これらは時にはモジュールの半数以上を表す）は、乳ガンに関連づけられることが未だ報告されていなかったか、または、別の生物学的表現型と関連することが以前に報告されていた。
【０１０２】
従来の臨床病理学的マーカーと、種々の分子モジュールとの間における関係を調べることにより、ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールと、患者の年齢との間における正の関連、すなわち、ＥＲ（ＥＳＲ１）のタンパク質レベルについてこれまでしばしば報告されている関連［３１］、同様にまた、ＥＲ（ＥＳＲ１）状態との正の関連が明らかにされた。このことは、ＥＲ（ＥＳＲ１）のタンパク質レベルおよび発現レベルの間における非常に良好な相関を強調する。
【０１０３】
興味深いことに、本発明者らは、正の関連を、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールと、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質発現状態との間において認めた。内分泌療法の臨床効力がＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の増幅または過剰発現の存在によって損なわれ得ることが示唆されているので［３２、３３、３４、３５、３６］、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の相互関係が乳ガンの管理において重要な役割を有するようになってきている。ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の増幅／過剰発現は一般に、ＥＲ（ＥＳＲ１）の発現と逆相関するので、この相関の正確な範囲が最近になってやっと、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）試験についての２つの標準化されたＦＤＡ承認の方法を使用して、３６５５個の乳ガン腫瘍の大きなシリーズにおいてＬａｌ他［３７］によって報告されている。興味深いことに、Ｌａｌ他は、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陽性腫瘍のほとんど半数（４９．１％）がＥＲ（ＥＳＲ１）を依然として発現したことを報告した。このことは、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュール陽性腫瘍が陽性のＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態と関連するという今回の発見を裏付けている。
【０１０４】
本発明者らは、腫瘍浸潤モジュール（ＰＬＡＵ）と、臨床病理学的マーカーとの間には関連を何ら認めなかった。このことは、リンパ節およびホルモン受容体が陽性である乳ガンにおけるＰＬＡＵのｍＲＮＡ発現を調べたＬｅｉｓｓｎｅｒ他［３８］によって発表された研究と一致している。
【０１０５】
血管形成モジュールに関しては、Ｂｏｌａｔ他もまた、正の相関を、ＶＥＧＦと、腫瘍サイズとの間において認めたのだが、興味深いことに、この発見は、侵襲性小葉ガンではなく、侵襲性腺管ガンに限定されるようであった［３９］。
【０１０６】
７３名の乳ガン患者を含む研究において、Ｗｉｄｃｈｗｅｎｄｔｅｒ他は、高いＳＴＡＴ１活性化が、広く知られている予後マーカーに依存しない良好な予後の有意な予測子であったこと、および、ＳＴＡＴ１活性化と相関した唯一のパラメーターが節の状態であったこと、すなわち、ＬＮ陰性患者に由来する腫瘍の大多数が高いＳＴＡＴ１活性化と関連したことを見出した［４０］。このことは、本発明者らもまた報告したことである。この観測結果は、節陰性の患者および高いＳＴＡＴ１がより良好な予後と関連するという事実と一致している。
【０１０７】
乳ガンは、臨床的に不均一な疾患である。いくつかのグループが乳ガンの異なる分子的サブクラスを一貫して特定しており、この場合、基底様（ほとんどがＥＲ（ＥＳＲ１）陰性およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陰性）サブグループおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）（ほとんどがＥＲＢＢ２増幅型）サブグループが、最も短い無再発の全体的生存を示し、これに対して、管腔様タイプ（エストロゲン受容体陽性）腫瘍がより好都合な臨床結果を有した（［４１］にまとめられる）。本発明者らは、これらのサブグループが乳ガン疾患の異なるタイプを表すという事実をもはや無視することができないので、本発明者らは、同じ分析を、主要な識別子によって、すなわち、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）によって特定される３つのサブグループにおいて行った。
【０１０８】
ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて、増殖モジュールおよび組織学的悪性度は、多変量分析において依然として生存と関連したままであった２つの変数であり、増殖モジュールが最も有意なｐ値を有していた。このことは、２つの臨床的に異なったＥＳＲ１陽性の分子的サブグループがゲノム悪性度によって定義され得るという発見と一致している［６］。ＥＲＢＢ２＋サブグループでは、腫瘍浸潤および免疫応答が、腫瘍の進行と関連する主なプロセスであるように思われた。この発見は、ＰＬＡＵのｍＲＮＡ発現がＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陽性腫瘍における強力な予後指標であったこと［４２］を裏付けている。
【０１０９】
第３のサブグループ（ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−）において、免疫応答のみが、予後を予測するように思われた。ホルモン受容体およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）を発現しない腫瘍（これは一般には「三重陰性」腫瘍または「基底様」腫瘍と呼ばれる）はより攻撃的であることが報告されている。それらの三重陰性の状態を考えると、これらの患者は、乳ガンのために現在用いることができる従来の標的化された治療（例えば、内分泌治療またはＥＲＢＢ２標的化治療など）により処置することができず、このため、化学療法が唯一の武器として残されている。
これに関連して、数人の著者らが、化学療法がこの疾患のこのサブタイプではより効率的であり得ることを示唆している［４３、４４］。しかしながら、最適な化学療法様式を明確にすることは依然として議論の余地を残している。ＢＲＣＡ１経路の活性がこれらの腫瘍の多くでは損なわれるようであるので、また、ＢＲＣＡ１がＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントにおいて機能するので、一部の著者らは、これらの腫瘍は、ＤＮＡ損傷の化学療法に対する感受性と関連し得ること、そしてまた、紡錘体毒に対する抵抗性と関連し得ることを示唆している［４９］。本研究において、本発明者らは、損なわれた免疫応答が（この特定のサブグループの患者において）遠隔転移の発達とつながり得ることを示した。実際、免疫モジュールの高い発現レベル（表１０および表１１）が、一変量レベルおよび多変量レベルの両方で、有意により良好な結果と関連した。
【０１１０】
ＳＴＡＴ１が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびその抗腫瘍効果を活性化することにおいて特に重要であることが示されている。増殖および生存を阻害することに加えて、ＩＦＮ−γは、部分的にはＭＨＣタンパク質のＳＴＡＴ１依存的発現を高めることによって腫瘍細胞の免疫原性を高める［４６］。この観測結果に基づいて、また、腫瘍における弱められたＳＴＡＴ１シグナル伝達はその悪性挙動と相関し得るという事実に基づいて、Ｌｙｎｃｈ他は近年、ＳＴＡＴ１によって媒介される遺伝子転写を高めることが、ガン治療に対する効果的な取り組みとなり得ることを主張した［４７］。したがって、Ｌｙｎｃｈ他は５１２０個の化合物をスクリーニングし、ＳＴＡＴ１媒介による遺伝子活性化を一層高め、その結果ＩＦＮの最大有効濃度により認められる１つの分子、すなわち、２−（１，８−ナフチリジン−２−イル）フェノールを特定した。ＳＴＡＴ１活性化は、生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）遺伝子の抑制およびアポトーシス遺伝子の活性化を介して細胞毒性剤に応答して腫瘍細胞を殺すことにおける重要な要素であるように思われるので、その活性化は、化学療法を受ける患者において、特に、ほとんどの治療的取り組みが、細胞死を非特異的な様式で誘導する細胞毒性剤に頼るこれらのＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−の患者においては特に重要であり得る。
【０１１１】
本発明者らが、それらの生物学的意味をより良く理解するために、文献に今までに報告された主な予後的遺伝子サインを詳しく調べたとき、本発明者らは、これらの予後的遺伝子サインはすべてが、増殖に関連づけられる遺伝子の著しい割合によって構成されたことを認めた。本発明者らが、独立した患者シリーズにおいて、元々のサインをそれらの分子モジュールと比較したときにもまた、本発明者らは、元々のサインに含まれる増殖遺伝子がその予後的成績を取り戻すことができたことを認めた。このことは、増殖に関連づけられる遺伝子がいくつかの既存の予後的遺伝子発現サインの一般的な共通点であると思われるという事実を強調する。細胞周期の脱調節における欠陥が乳ガンの基本的特徴であるので、これらの遺伝子が乳ガン予後に関与することは驚くことではない。いくつかの研究では、細胞周期および増殖関連遺伝子の増大した発現が、不良な結果と相関したことが実際に示された（［４８］に総説される）。当然のことながら、分析された集団または使用されたプラットフォームにおける違いのために、的確な増殖関連遺伝子には違いがある。増殖関連の細胞マーカーの使用は新しいことではなく、例えば、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡのタンパク質発現レベルが何十年間にわたって予後的マーカーとして既に使用されているが、遺伝子発現のプロファイリング研究により、増殖を、より客観的な自動化された定量的方法を使用して測定することが、それほど定量的でないアッセイ（例えば、免疫組織化学など）と比較して、よりロバストであり得ることが示唆された。
【０１１２】
種々の乳ガンサブタイプに従って今までに報告された主な遺伝子サインの予後的能力を調べることによって、本発明者らは、これらのサインの予後力が、エストロゲン受容体陽性の患者によって構成されるＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−の分子的サブグループに限定されたことを認めている。このことは下記の発見と一致している：１）増殖がこれらのサインの主たる一因であると思われるという発見、および、２）ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループが、広い範囲の増殖値を示す唯一の分子的サブグループであるという発見。
【０１１３】
この発見はまた、さらなる予後的マーカーが、それ以外の２つの分子的サブグループについては、より具体的には、不良な予後および限定された治療選択肢と関連するＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループについては必要であることを強調する。したがって、本発明者らは、免疫応答を調べることによって、この特定のサブグループの患者における機構が、これらの腫瘍をより良く理解するために、また、効率的な標的化された治療を開発するために役立ち得ると考えている。
【０１１４】
結論として言えば、乳ガンに関与する主な生物学的機構を表す分子モジュールを特定することによって、本発明者らは、種々の予後的サインの生物学的基礎をより良く特徴づけることができ、また、種々の腫瘍を進行させる機構を理解することができた。真に個人に合わせた医療に向けて一歩前進するために、これらの発見は、新しい臨床ゲノムモデルを定義するために、また、特定の分子的サブグループにおける新しい標的を特定するために役立ち得る。
【０１１５】
【０１１６】
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１及び２は、プライマーＭＹＢＬ２の配列である。
配列番号３及び４は、プライマーＣＣＮＡ２の配列である。
配列番号５及び６は、プライマーＳＴＫ６の配列である。
配列番号７及び８は、プライマーＫＰＮＡ２の配列である。
配列番号９及び１０は、プライマーＣＣＮＢ１の配列である。
配列番号１１及び１２は、プライマーＣＤＣ２の配列である。
配列番号１３及び１４は、プライマーＣＤＣ２０の配列である。
配列番号１５及び１６は、プライマーＭＣＭ２の配列である。
配列番号１７及び１８は、プライマーＧＵＳＢの配列である。
配列番号１９及び２０は、プライマーＴＢＰの配列である。
配列番号２１及び２２は、プライマーＲＰＬＰ０の配列である。
配列番号２３及び２４は、プライマーＴＦＲＣの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答が乳ガン予後の重要な役割を果たすエストロゲン受容体（ＥＲ）−患者における乳ガンの効率的な予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ））を得るための方法およびツールに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳ガン、特に浸潤性腺管ガンは、西洋諸国では女性における最も一般的なガンである。遺伝子プロファイリングに基づくいくつかの予後的なサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が明らかにされている。これらの異なるサインのすべてが、腫瘍細胞が増殖する能力を反映する１。それらの使用により、低い増殖活性を有する腫瘍と、高い増殖活性を有する腫瘍とを識別すること、すなわち、それぞれ、低い増殖速度によって特徴づけられ、かつ、良好な予後を伴う管腔Ａ型腫瘍と、大きい増殖速度を有し、かつ、不良な予後を伴う基底様腫瘍、ＥＲＢＢ２腫瘍および管腔Ｂ型腫瘍を含む別の一群とを識別することが可能である。
【０００３】
いくつかの研究が、ヒト腫瘍の成長および再発を制御することにおける適応免疫応答の役割に関して実現されている。ヒト結腸直腸ガンでは、腫瘍浸潤性免疫細胞のインサイチュ分析が有益な予後的ツールとなり得ることが示された２。Ｂａｔｅｓ他は、乳腫瘍におけるＦＯＸＰ３陽性ＴＲの定量が、疾患の予後および進行を評価するために有益であることを示した３。したがって、乳ガンの進行の引き金を引き、かつ、特定の分子的サブタイプに依存する生物学的プロセスを調べることが求められており、また、インシリコデータまたは免疫応答を調節するＣＤ４＋細胞を研究することのいずれかを使用することによって、乳ガン予後に対する免疫応答の寄与を調べることが求められている。
【０００４】
ＣＤ４＋細胞は、乳腫瘍の微小環境の主要な成分である白血球ファミリーに属する。ＣＤ４マーカーがヘルパーＴ細胞において主に発現され、また、限られたレベルながら、単球／マクロファージおよび樹状細胞において発現される。様々な免疫細胞が、とりわけ乳腫瘍では、腫瘍の成長および拡大において役割を果たしており、また、ＣＤ４＋細胞が免疫応答の調節において重要な役割を果たしている。
【０００５】
さらに、乳ガンの予後および管理が、様々な古典的変数によって、例えば、組織学的なタイプおよび悪性度、腫瘍サイズ、リンパ節の関与、ならびに、腫瘍のホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ；ＥＳＲ１）およびプロゲステロン受容体）およびＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）受容体の状態などによって常に影響されていることが知られている。近年では、異なる研究グループにより、臨床結果を予測するいくつかの遺伝子発現サインが特定された。これらの遺伝子発現サインのすべてに対する共通する特徴とは、それらは、主として、さらなる全身的な補助処置を必ずしも必要としない低リスクの患者のより大きい割合を特定し、一方で、高リスクの患者を依然として正しく特定することによって従来の臨床病理学的基準よりも優れていることである。それらはすべてが、同じ臨床的問題に取り組んでいるが、重なりがそのような異なる遺伝子リストの間にはほんのわずかしかないか、または、全くないことは驚くべきことであるかもしれない。このことは、それらの生物学的意味に関する疑問を生じさせている。また、乳ガンは、臨床的に不均一な疾患であることに加えて、ＥＲ（ＥＳＲ１）発現、ＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）発現によって主に規定されるサブグループに関しては、分子的にもまた不均一であることが繰り返し一貫して明らかにされているが、これらの異なる予後的サインは、これらの異なる分子的サブグループにおいて一度も明瞭に評価および比較されなかった。これはおそらくは、個々の研究の規模が比較的小さく、このことがこれらの発見を統計学的に不安定にしていることに起因した。
【０００６】
上皮−間質相互作用が正常な乳腺発達において重要であること、および、乳ガン発生において役割を果たすことが知られている。したがって、原発性腫瘍の成長、乳ガンのサブタイプ決定および転移に関して乳腫瘍の微小環境の影響を調べることが求められている。
【０００７】
したがって、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ；ＥＳＲ１））の状態に属しない、特定の分子的サブタイプに関与する生物学的プロセスおよび腫瘍マーカーを調べること、特に、ＨＥＲ−２（ＥＲＢＢ２）受容体の分子的サブタイプに関与する生物学的プロセスおよび腫瘍マーカーを調べることもまた求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＣＤ４＋細胞が免疫応答の調節において重要な役割を果たしているＥＲ−の患者として特定される患者において、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）の診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ））、特に予後を改善するために使用することができる方法およびツールを提供することを目的としている。
【０００９】
本発明は、患者の予後を改善し、かつ、最新技術の欠点を示さないが、腫瘍（特に、乳腫瘍）の発達に対する素因を示すすべての患者（これは、ＥＲ−として特定される患者を意味するが、ＥＲ＋の患者およびＨＥＲ２＋／ＥＲＢＢ２患者もまた意味する）の予後を提案することができる方法およびツールを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＥＲ−の患者におけるガンの予後（予後、検出、病期決定、予測、発生、攻撃性の段階、モニタリング、予測、および、場合により予防）のために使用される、哺乳動物（好ましくは、ヒト）の、免疫応答に関連する（または関連づけられる）遺伝子またはタンパク質から選択される遺伝子／タンパク質セットに関する。
【００１１】
本発明者らは、哺乳動物患者の免疫応答に関連する遺伝子が、ＥＲ−患者におけるガンの特異的かつ適切な診断および予後のために使用されうることを思いがけなく発見した。
【００１２】
これらの遺伝子は、ＥＲ−患者の生検に含まれる腫瘍細胞および／またはリンパ球において高度に発現される。したがって、これらの遺伝子、それらの対応するコードされたタンパク質、およびこれらのタンパク質に向けられる抗体またはその超可変部分は、ＥＲ−患者におけるこの病理の重要なマーカーとして使用されうる。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、表１０および／または表１１から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、および、場合により、１００個、１０５個、１１０個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、および、それらの対応するコードされたタンパク質に対して特異的に向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子セットもしくはタンパク質セット（場合により、ＥＲ−の患者のガンの効率的な予後だけを対象とする、Ａ．Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ他（ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｎｒ８、Ｒ１５７−２００７）によって記載されるような１組の遺伝子のうちの１個または複数の遺伝子と組み合わせられる）に関する。
【００１４】
好都合には、本発明による遺伝子セットおよびタンパク質セットは、好ましくはアレイに従って、固体担体表面に結合される遺伝子もしくはタンパク質の配列、またはそれらのコードされるタンパク質に対して向けられる抗体（またはその超可変部分）から選択された。
【００１５】
本発明はまた、アレイに従って固体担体表面に場合により固定される本発明による遺伝子セット／タンパク質セットと、場合により、（遺伝子セットから選択されるこれらの遺伝子の１つまたは複数の特異的な増幅を可能にする好適なプライマーによる）リアルタイムＰＣＲ分析またはタンパク質分析のための他の手段とを含む診断キットまたは診断デバイスに関する。
【００１６】
固体担体表面は、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド、ガラス製スライド、ガラスビーズ、ポリスチレンプレート、ガラス担体上の膜、ＣＤ表面またはＤＶＤ表面、シリコンチップまたは金チップからなる群から選択することができる。
【００１７】
好ましくは、リアルタイムＰＣＲ分析のためのこれらの所定の手段が、遺伝子セットの各遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ（特に、これらの遺伝子の発現分析、過剰発現または過少発現）のための手段である。
【００１８】
本発明の別の態様が、本発明による遺伝子セット／タンパク質セットから選択される遺伝子／タンパク質の１つまたは複数を、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）の効率的な診断のために、好ましくは、予後のために、他の遺伝子／タンパク質セットから選択される他の遺伝子／タンパク質と場合により組み合わされて含むマイクロアレイに関する。
【００１９】
本発明の別の態様が、下記のモジュールを含む、好ましくはコンピューター化システムであるキットまたはデバイスに関する：
・腫瘍サンプルからの遺伝子発現（またはタンパク質合成）を好ましくは本発明による遺伝子／タンパク質セットに基づいて検出するために構成されるバイオアッセイモジュール、および
・これらの遺伝子の発現（過剰発現または過少発現）（または、対応するコードされたタンパク質の合成）を計算するために、また、腫瘍サンプルについてのリスク評価（悪性腫瘍を発達させるリスク評価）をもたらすために構成されるプロセッサーモジュール。
【００２０】
好ましくは、腫瘍サンプルは、対象から採取（摘出）され得る、腫瘍（好ましくは、乳腫瘍）に対する素因または感受性を示す対象から得られる任意のタイプの組織サンプルまたは細胞サンプルである。
【００２１】
対象は任意の哺乳物対象が可能であり、好ましくはヒト患者が可能であり、サンプルを、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路のガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマまたは脳ガンからなる群から選択される組織から得ることができ、好ましくは、腫瘍サンプルは乳腫瘍のサンプルである。
【００２２】
好都合には、本発明による遺伝子セットは、好ましくは診断キットまたは診断デバイスにおいて、他のタイプの乳ガン（ＨＥＲ２＋、ＥＲＢＢ２、乳ガンタイプ）の効率的な予後のために、他の遺伝子セット／タンパク質セットから選択される他の遺伝子セット／タンパク質セット、好ましくは、表１２および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個および、場合により、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個の遺伝子もしくは遺伝子／タンパク質セットのセット全体、もしくは、それらの対応するコードされたタンパク質に対して向けられる抗体およびその超可変部分を含むか、または、それらからなる他の遺伝子／タンパク質セットから選択される他の遺伝子／タンパク質と組み合わせることができる。好ましくは、これらの遺伝子は、腫瘍浸潤に関連する遺伝子である。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の遺伝子セットは、国際公開ＷＯ２００６／１１９５９３の表３における悪性度３の腫瘍においてアップレギュレーションされた遺伝子として示される遺伝子／タンパク質から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはセット全体、もしくは、それらの対応するコードされたタンパク質に対して向けられた抗体およびその超可変領域を含むか、または、それらからなる。好ましくは、これらの遺伝子／タンパク質は、増殖に関連づけられる遺伝子／タンパク質である。
【００２４】
好ましくは、遺伝子／タンパク質セットは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＡ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、ＭＹＢＬ２、ＫＰＮＡ２およびＳＴＫ６からなる群から選択される少なくとも遺伝子／タンパク質を含む。
【００２５】
好ましくは、選択された遺伝子／タンパク質は下記の４つの遺伝子／タンパク質である：一部係属出願による米国特許出願第１１／９２９０４３号に記載されるような、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、または、より好ましくは、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＹＢＬ２およびＫＰＮＡ２。これらの遺伝子／タンパク質配列が好都合には、アレイとして固体担体に結合する。
【００２６】
（診断）キットまたはデバイスに存在するこれらの遺伝子／タンパク質はまた、これらの好ましい遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析のための手段をさらに含むことができ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲのためのこれらの手段はｑＲＴ−ＰＣＲのための手段であり、配列番号１〜配列番号１６のプライマー配列のうちの少なくとも８個の配列を含む。
【００２７】
さらに、これらの遺伝子／タンパク質セットはまた、参照用の遺伝子／タンパク質をさらに含むことができ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ分析のための４つの参照用遺伝子をさらに含むことができ、これらは、好ましくは、ＴＦＲＣ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯおよびＴＢＰの遺伝子からなる群から選択される。
【００２８】
これらの参照用遺伝子は、特異的なプライマー配列によって特定され、好ましくは、配列番号１７〜配列番号２４からなる群から選択されるプライマー配列によって特定される。
【００２９】
この遺伝子／タンパク質セットにより、当業者はまた、遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）または再発スコア（ＲＳ）を得る（計算する）ことができる。
【００３０】
この前記ＰＣＴ特許出願（ＷＯ２００６／１１９５９３）の内容およびその一部係属出願第１１／９２９０４３号は参照により本明細書中に組み込まれる。
【００３１】
当業者はまた、他の予後的手段（サイン）または遺伝子／タンパク質リスト（ＥＲ−の患者およびＥＲ＋の患者におけるガンの効率的な予後のために使用することができる遺伝子／タンパク質セット）を選択することができ、例えば、下記によって記載される遺伝子／タンパク質セットなどを選択することができる：
Ｗａｎｇ他（ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４６０）ｐ．６７１−６７９（２００５））、Ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ ４１５（６８７１）ｐ．５３０−５３６（２００２））、Ｐａｉｋ他（Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５１（２７）ｐ．２８１７−２８２６（２００４））、Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，７（１０）Ｒ１０１（２００６））、Ｖａｎ Ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他（Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７（２５）ｐ．１９９９−２００９（２００２））、Ｐｅｒｏｕ他（Ｎａｔｕｒｅ，４０６，ｐ７４７−７５２（２０００））、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他（ＰＮＡＳ １００（１８）ｐ．８４１４−８４２３（２００３））、Ｓｏｒｌｉｅ他（ＳＴＮＯ−Ｔｈｅ Ｓｔａｎｆｏｒｄ／Ｎｏｒｗａｙ ｄａｔａｓｅｔ ＰＮＡＳ，９８（１９）ｐ．１０８６９−１０８７４（２００１））、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｒｅａｓｔ．ｃａｎｃｅｒ／ｍｏｐｏ．ｃｌｉｎｉｃａｌ／ｄａｔａ．ｓｈｔｍｌ
ならびに、アファディン、オーロラＡ、ａ−カテニン、ｂ−カテニン、ＢＣＬ２、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、サイトケラチン５／６、サイトケラチン８／１８、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、エストロゲン受容体、ＦＧＦＲ１、ＦＨＩＴ、ＧＡＴＡ３、Ｋｉ６７、ムチン１、Ｐ５３、Ｐ−カドヘリン、プロゲステロン受容体、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、ＴＡＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれ以上の遺伝子またはタンパク質、および、場合により、サイトケラチン６、サイトケラチン１８、Ａｎｇ１、オーロラＢ、ＢＣＲＰ１、カテプシンＤ、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＫ１４、Ｃｏｘ２、ＦＧＦ２、ＧＡＴＡ４、Ｈｉｆｌａ、ＭＭＰ９、ＭＴＡ１、ＮＭ２３、ＮＲＧｌａ、ＮＲＧ１ベータ、Ｐ２７、パーキン、ＰＬＡＵ、Ｓ１００、ＳＣＲＩＢＢＬＥ、平滑筋アクチン、ＴＨＢＳ１、ＴＩＭＰ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質を含む国際公開ＷＯ２００５／０７１４１９に記載されるような乳ガン予後において使用される発現プロファイリング用タンパク質。
【００３２】
当業者はまた、国際公開ＷＯ２００５／０２１７８８に記載されるような、乳腫瘍に関連する示差的遺伝子発現の分析のために使用される１つまたは複数の遺伝子を選択することができ、特に、ＥＲＢＢ２、ＧＡＴＡ４、ＣＤＨ１５、ＧＲＢ７、ＮＲ１Ｄ１、ＬＴＡ、ＭＡＰ２、Ｋ６、ＰＫＭ１、ＰＰＡＲＢＰ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＲＰＬ１９、ＰＳＢ３、ＬＯＣ１４８６９６、ＮＯＬ３、ｌｏｃ２８３８４９、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＡＤＩ２、ＳＴＡＴ３、ＯＡＳ２、ＣＤＫＬ５、ＳＴＡＩＴＧＢ３、ＭＫＩ６７、ＰＢＥＦ、ＦＡＤＳ２、ＬＯＸ、ＩＴＧＡ２、ＥＳＴＡ１８７８９１５／ＮＡ、ＪＤＰＡ、ＮＡＴＡ、ＣＥＬＳＲ２、ＥＳＴＮ３３２４３／ＮＡ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＴＨ２９３０１／ＮＡ、ＦＬＪ１０１９３、ＥＳＲＡの各遺伝子の配列、および、本ＰＣＴ特許出願の遺伝子セットに記載される他の遺伝子配列またはタンパク質配列を選択することができる。
【００３３】
したがって、本発明によるキットまたはデバイスは、好ましくは各タイプの患者群（ＥＲ−の患者群、ＥＲ２＋の患者群、および、ＨＥＲ２＋の患者群）だけを対象とする１つ、２つ、３つまたはそれ以上の遺伝子／タンパク質セットを含む場合があり、また、乳ガンのすべてのタイプ（ＥＲ＋、ＥＲ−、ＨＥＲ２＋）の効率的な診断（予後）のためのこれらの遺伝子／タンパク質セットの１つまたは複数の遺伝子発現（またはタンパク質合成）のために構成される１つ、２つまたは３つのバイオアッセイモジュールを含むコンピューター化システムであるシステムに含めることができる。このシステムは、好都合には、本発明の選択された遺伝子セットの１つまたは複数と、この遺伝子セットの遺伝子発現を計算するために構成されるプロセッサーモジュール、好ましくは、診断に付される選択された腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすための遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）を計算するために構成されるプロセッサーモジュールとを含む。
【００３４】
好都合には、本発明による遺伝子セットおよびタンパク質セットの分子は（直接的または間接的に）標識される。好ましくは、標識は、検出を行うための、好ましくは、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、または、当業者によって広く知られているいずれかの他の方法による検出を行うための放射性標識、比色測定標識、酵素標識、生物発光標識、化学発光標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【００３５】
本発明はまた、下記の工程を含む、哺乳動物対象における、好ましくは、ヒト患者における、好ましくは、少なくともＥＲ−の患者におけるガンの予後のための方法に関する：腫瘍サンプル（好ましくは、乳腫瘍サンプル）を哺乳動物対象（好ましくは、ヒト患者）から採取する工程、および、腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を、様々な配列（特に、ｍＲＮＡ配列）を本発明による遺伝子／タンパク質セットまたは本発明によるキットもしくはデバイスと接触させることによって測定する工程、および、場合により、この腫瘍サンプルについてのリスク評価を（好ましくは、腫瘍サンプルを、ＥＲ−のタイプに含まれる異なるサブタイプとして示し、また、場合により、ＥＲ＋のタイプおよびＨＥＲ２＋のタイプにおいては、より高リスクであり、患者の処置療法（例えば、特定の化学療法処置または特異的に分子標的化された抗ガン治療（例えば、免疫療法またはホルモン療法など）に調節された処置療法）を必要とするとして示すことによって）もたらす工程。
【００３６】
具体的には、本発明はまた、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、ＣＨＯＰまたは他の薬物（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ゴセレリン、イリノテカン、チオテパ、トポテカンまたはトレミフェン、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＶＥＧＦ、ＲＴＫ阻害剤、抗ＶＥＧＦＲ、ＧＲＨ、抗ＥＧＦＲ／ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＥＧＦ−Ｒまたは抗ＨＥＲ２のような薬物）をとりわけ挙げることができるが、様々な化学療法剤および／もしくは（バイオ）医薬品および／もしくは標的化薬剤の適切な用量ならびに／またはスケジュールを選択するために有用である。
【００３７】
本発明の別の態様が、ガン治療における処置された方法または活性な化合物の効率を制御するための方法に関する。実際、様々な乳ガン患者タイプにおけるガンの効率的な予後のために適用される本発明による方法およびツールはまた、このガンに罹患する哺乳動物対象（ヒト患者）に適用された処置の効率的なモニタリングのためにも使用することができる。
【００３８】
したがって、本発明の別の態様が、乳腫瘍に罹患する対象（患者）の処置において使用される効率的な化合物による哺乳動物対象（ヒト患者）の処置の前（および後）に、本発明による予後方法を含む方法に関する。このことは、この方法は、前記対象（患者）が処置を受ける前での、患者に適用される（第１の）予後工程と、この処置の後での（第２の）診断工程とを必要とすることを意味する。
【００３９】
より具体的には、本発明は、表１０および／または表１１によるＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインを診断として、および／または、好適な医薬品の選択を助けるための使用に関する。
【００４０】
この方法は、サンプル対象における遺伝子発現（またはタンパク質合成）の改変が処置後に得られるかを明らかにするために、処置期間中に、または、処置が終了した数週間後もしくは数ヶ月後での処置のモニタリングの期間中に、哺乳動物対象（ヒト患者）に対して数回適用することができる。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様が、腫瘍（特に、乳腫瘍）に対する抗腫瘍活性のために使用される化合物のスクリーニング方法に関する。この場合、そのような化合物の十分な量が、ガンに罹患する哺乳動物対象（好ましくは、ヒト患者）に投与され、かつ、活性な化合物が哺乳動物対象の遺伝子プロフィル（遺伝子発現またはタンパク質合成）を改変し得るかを特定するために、本発明による予後方法が、前記活性な化合物の投与の前に前記哺乳動物対象に適用され、そして、前記活性な化合物の投与の後で適用される。
【００４２】
対象（患者）の遺伝子プロフィル（遺伝子発現またはタンパク質合成）における改変は、活性な化合物の投与前または投与後の得られた腫瘍サンプルが改変されており、（本発明による遺伝子／タンパク質セットによって検出可能である）サンプルにおける異なる遺伝子発現（またはタンパク質合成）をもたらすことを意味する。したがって、この方法は、活性な化合物が哺乳動物対象（特に、ヒト患者）における前記腫瘍（特に、乳腫瘍）の処置において効率的であるかを確認するために適用される。
好都合には、この方法では、この試験方法またはスクリーニング方法に付される活性な化合物は、哺乳動物対象（ヒト患者）の効率的な処置のために回収され、適用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、中央相関（ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）および平均連結を使用する、クラスター化実験のための樹状図である。
【図２】図２は、サブタイプＩ乳ガンの患者における転移の危険性を示す。
【図３】図３は、サブタイプＩ乳ガンの患者における転移の危険性を示す。
【図４】図４は、ＮＫＩ２（Ａ）、ＵＮＣ（Ｂ）、ＶＤＸ（Ｃ）の３例のデータセットについてのＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールスコアと、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールスコアとの間における同時分布を表す。クラスターが、３つの成分を有するガウシアン混合モデルによって確認される。示される楕円は各クラスターのガウシアンの標準偏差の多変量アナログである。
【図５】図５は、ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−、ＥＲＢＢ２＋およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−の分子的サブタイプによって階層化された非処置患者についての生存曲線を表す。
【図６】図６は、非処置の乳ガン患者の、母集団（Ａ）における、ならびに、ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループ（Ｃ）およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｄ）におけるｌｏｇ２（一変量生存分析のハザード比（および９５％ＣＩ））を示すフォレスト（ｆｏｒｅｓｔ）プロットを表す。
【図７】図７は、分子的サブグループの分析における一変量分析において有意であったモジュールスコアのカプラン−マイヤー曲線を表す。モジュールスコアがその３３％分位点および６６％分位点に従って分けられた。ＥＳＲ−／ＥＲＢＢ２−サブグループにおけるＳＴＡＴ１モジュール（Ａ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループにおけるＰＬＡＵモジュール（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループにおけるＳＴＡＴ１モジュール（Ｃ）、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおけるＡＵＲＫＡモジュール（Ｄ）。
【図８】図８は、腫瘍浸潤モジュールスコアおよび免疫モジュールスコアの組合せについて、低いスコア、中間スコアおよび高いスコアを有する患者のＥＲＢ２＋サブグループについてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ＣＤ４＋細胞を調べることによる免疫応答の調査
本発明者らは、原発性浸潤性腺管ガンから単離されたＣＤ４＋細胞のプロファイリングを行っている。非管理下での階層的クラスター化アルゴリズムにより、我々は、免疫応答に関与する経路に関して異なった２つの腫瘍群を区別することができた。これらの免疫経路を考慮して、腫瘍に浸潤するＣＤ４＋細胞において示差的に発現する１１１個の遺伝子が特定され、それらは、乳ガンにおける以前に報告されている遺伝子サインとは実質的に異なる「ＣＤ４浸潤腫瘍サイン」（ＣＤ４ＩＴＳ）と呼ばれる遺伝子サインをもたらした。公開されているデータセットに列挙される２６００名を越える患者における、ＣＤ４ＩＴＳと、臨床結果との関係もまた分析した。重要な発見は、ＣＤ４ＩＴＳが、通常最も不良な予後と関連するＥＲ陰性乳ガンの患者において転移の危険性と関連したことであった。
【００４５】
材料および方法
患者のサンプル。浸潤性乳管ガンの患者を研究のために募集した。どの患者も、補助的な全身治療を何ら受けていなかった。ヒト乳ガン組織を手術時に得た。
【００４６】
患者データセット。合計で２６４１名の原発性乳ガン患者から得られる腫瘍標本のマイクロアレイ分析によって得られる９つの遺伝子発現データセットを使用した：ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ（２００２）４、Ｂｕｙｓｅ（２００６）５、Ｄｅｓｍｅｄｔ（２００７）２６、Ｌｏｉ（２００７）６、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ（２００３）７、Ｍｉｌｌｅｒ（２００５）８、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ（２００６）９、ｖａｎ’ｔ ｖｅｅｒ（２００２）１０およびＳｏｒｌｉｅ（２００３）１１からのデータセット。
【００４７】
ＣＤ４＋細胞の単離。ＣＤ４＋細胞を乳管ガンから単離するための手法を確立した。簡単に記載すると、ガン腫サンプルを、外科用メスを使用して機械的に解離した。断片を、サンプルのサイズに依存して２０分間〜６０分間絶えず撹拌しながら、５％ＣＯ２を伴う３７℃のインキュベーターで、ｘ−ｖｉｖｏ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）における４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）の混合物とともに１２ウエル培養ディッシュにおいてインキュベーションした。解離後、消化生成物を、ピストンシリンジを使用してナイロンメッシュでろ過し、ｘ−ｖｉｖｏで洗浄した。ＣＤ４＋細胞を、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＣＤ４陽性単離キットを製造者の説明書に従って使用して単一細胞懸濁物から単離した。集団の純度をフローサイトメトリーによって調べた。
【００４８】
フローサイトメトリー。Ｔ ＣＤ４＋細胞の単離物の品質を確認するために、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の表面発現が、フローサイトメトリーによって分析された。この課題のために、細胞のアリコートのビーズを製造者の説明書に従って分離した。簡単に記載すると、５μｌのそれぞれの特異的なＯＩｔｅｓｔコンジュゲート化抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、５０μｌのＨＡＦＡ緩衝液（フェノールレッド非含有のＲＰＭＩ１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、３％の不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＮａＮ３）に再懸濁された細胞を含有する試験チューブに加えた。チューブをボルテックス撹拌し、光から保護して４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにおいて固定処理した。蛍光分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用によって行った。
【００４９】
リンパ球からのＲＮＡの単離。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム手順をＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とともに使用して新鮮なＣＤ４＋細胞から抽出した。簡単に記載すると、Ｔｒｉｐｕｒｅ（１ｍｌ）を、ＣＤ４＋細胞を含有するそれぞれのチューブに加えた。チューブをボルテックス撹拌し、クロロホルムを加えた。サンプルをＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ（商標）（Ｅｘｐｅｎｄｅｒｓ）上に置き、１５６８２ｒｃｆで遠心分離した。上側の水相を取り除き、新しいチューブに入れた。イソプロパノールおよびグリコーゲンを加え、その後、チューブを遠心分離して、ＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃｋを使用して乾燥し、ヌクレアーゼ非含有の水に再懸濁した。ＲＮＡの量および品質を、ＮａｎｏｄｒｏｐおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｐｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用してそれぞれ求めた。
【００５０】
遺伝子発現分析。１０個の、患者の乳ガンを、良好な品質のＲＮＡの十分な量とともに、原発性腫瘍に浸潤する精製されたＣＤ４＋細胞から単離した。マイクロアレイ分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。ＲＮＡの２サイクルの増幅、ハイブリダイゼーションおよび走査を標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。画像分析およびプローブ定量を、処理されていない生のプローブ強度データをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＣＥＬファイルにもたらしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウエアを用いて行った。プログラムＲＭＡを使用して、データを正規化した。
【００５１】
統計学的分析。浸潤性腺管ガンから単離されたＣＤ４＋細胞の１０の発現プロフィルを考慮して、非管理下での階層的クラスター化を確立した。ＢｉｏＣａｒｔａ経路に基づいて、クラスター間の差を分析した。免疫応答に関連づけられる経路に関与し、かつ、発現レベルにおける有意な差をもたらす遺伝子を選択して、ＣＤ４ＩＴＳを構成した。ＣＤ４ＩＴＳ指数（ＣＤ４ＩＴＳＩ）と呼ばれるスコアを導入して、免疫反応に関連づけられる発現プロフィルと、臨床結果との間における類似性をまとめた。ＣＤ４ＩＴＳを構成する遺伝子を考慮して、ＣＤ４ＩＴＳＩは、ダウンレギュレーションを受けた遺伝子における遺伝子発現の符号つき平均の和から引かれた、アップレギュレーションを受けた遺伝子における遺伝子発現の符号つき平均の和として定義された。その後、このスコアが、データセットに示されるそれぞれの患者について計算された（ｎ＝２６４１）。データセットは全体で利用されたか、または、患者の腫瘍の異なるサブタイプ、および／もしくは、何らかの治療の施与（非施与）を区別して利用された。コックス比例ハザード法の使用による再発の一変量分析および多変量分析をＳＰＳＳ（バージョン１５．０）で行った。時間に沿った全体の無転移生存率を推定するために、カプラン−マイヤー法を使用した。この課題において、考慮された患者データは、その後、スコアが大きくなる順に並び替えられ、カットオフ点を、患者を２つのグループに分けた７５パーセンタイルで定義した。低スコアの患者および高スコアの患者がグループ１およびグループ２にそれぞれ割り当てられた。結果を生存曲線で例示した。
【００５２】
結果−腫瘍浸潤ＣＤ４＋細胞の発現プロフィルがＥＲ状態に従って異なる。
マイクロアレイ技術を使用して、１０個の乳ガン（すなわち、５個のＥＲ＋および５個のＥＲ−）から単離されたＣＤ４＋細胞の遺伝子プロフィルを確立した。これらのプロフィルに関して、非管理下でのクラスター化により、２つの大きなクラスターが明らかにされた（図１を参照のこと）。興味深いことに、これらの２つのクラスターは実際には腫瘍のＥＲ状態に対応する。これらのクラスターは、異なるクラスター化法（中心化連結、非中心化連結、完全化連結または平均連結）を使用しても、非常に安定的かつ再現的であった。
【００５３】
ＣＤ４＋（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の局在化−ＣＤ４＋浸潤腫瘍サイン（ＣＤ４ＩＴＳ）の生成。
細胞経路を考慮して、乳腫瘍に浸潤するＣＤ４＋細胞の発現プロフィルを分割する２つの主要なクラスターの間における差を調べた。これら２つのクラスターの間で異なった３７の統計学的に有意な経路が存在した。興味深いことに、そのような経路のうちの３１が免疫反応と関連した（表１を参照のこと）。
表１は、ＣＤ４ＩＴＳサインに含まれる遺伝子の分類を表す。
「ＣＤ４＋浸潤腫瘍サイン」（ＣＤ４ＩＴＳ）と呼ばれる遺伝的サインが確立された。この課題に近づくために、有意な差（０．０５未満のｐ値）に基づいてこれら３１の免疫経路に関与する遺伝子を選択した。
表２は、基準に従って選択され、かつＣＤ４ＩＴＳを構成する１０８個の遺伝子を表す。
【００５４】
乳ガンにおけるＣＤ４ＩＴＳおよび結果。ＣＤ４ＩＴＳ指数（ＣＤ４ＩＴＳＩ）を、患者および方法の節で記載される式を使用して公的に利用できる乳ガンデータベースにおけるそれぞれの患者について計算した。この指数を、コックス比例ハザードモデルをいくつかデータセットにおいて使用する時間無再発生存分析において臨床結果とのその関連について検定した（ｎ＝２６４１）（結果について、表３を参照のこと）。
この全データセットを考慮して、低い相関が、ＣＤ４ＩＴＳＩと、臨床結果との間において明らかにされ、ハザード比が０．９０９であった（９５％ＣＩ、０．８４０〜０．９８４；Ｐ＝０．０１８）。この結果を考慮して、乳ガンの３つのサブタイプ、すなわち、ＥＳＲ１− ＥＲＢＢ２−（サブタイプ１または「基底様」）、ＥＲＢＢ２＋（サブタイプ２）、および、ＥＳＲ１＋ ＥＲＢＢ２−（サブタイプ３または「管腔」）が、サンプルをこれらのサブタイプに基づいて識別するために区別された。結果は、強い統計学的に有意な相関を、サブタイプ１の乳ガンに関して、ＣＤ４ＩＳＩと、臨床結果との間において示し、ハザード比が０．７３３であった（９５％ＣＩ、０．６２０〜０．８６７；Ｐ＝０．０００）。類似した相関が、よりわずかな影響を伴ったが、サブタイプ２に関して示され、ハザード比が０．７９０であった（９５％ＣＩ、０．６３５〜０．９８２；Ｐ＝０．０３３）。相関がサブタイプ３に関しては何ら示されず、ハザード比が０．９２０であった（９５％ＣＩ、０．８１２〜１．０４２；Ｐ＝０．１８７）。
【００５５】
さらなる調査をサブタイプ１型乳ガンの患者の間で行うために、また、時間無再発生存を推定するために、カプラン−マイヤー法を使用した。この課題において、患者が、患者および方法の節で記載されるようにＣＤ４ＩＴＳに従って階層化された。推定される全体の５年無転移生存率が５７．７％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．８％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）であった（図２を参照のこと）。
【００５６】
サブタイプ１型乳ガンの処置された患者および非処置の患者に対するＣＤ４ＩＳの予後的値を調べた。ＣＤ４ＩＴＳの予後的値は、０．６７３のハザード比（９５％ＣＩ、０．５１２〜０．８８４；Ｐ＝０．００４）を有する処置患者の方が、０．７９２のハザード比（９５％ＣＩ、０．６３８〜０．９８３；Ｐ＝０．０３４）を有する非処置患者よりも強かった（表４を参照のこと）。
カプラン−マイヤー法を上記のように行い、処置患者および非処置患者の間での推定される全体の５年無転移生存率がそれぞれ、４８．７％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．５％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）；６０．９％（ＣＤ４ＩＴＳＩ＜７５パーセンタイル）および８１．２５％（ＣＤ４ＩＴＳＩ≧７５パーセンタイル）であった（図３を参照のこと）。
【００５７】
ＣＤ４ＩＴＳおよび他の予後的サイン。サインのロバスト性を推定するために、本発明に従って、本発明者らは、サブタイプ１型乳ガンの処置患者および／または非処置患者に関して、ＣＤ４ＩＴＳを、発表されている予測的サインに対して、すなわち、Ｗｏｕｎｄ１２、ＩＧＳ１３、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ１４、ＧＧＩ９、Ｇｅｎｅ７０４、Ｇｅｎｅ７６１５に対して比較している。コックス比例ハザードモデルは、ＣＤ４ＩＴＳが、０．７３３のハザード比（９５％ＣＩ、０．６２０〜０．８６７；Ｐ＝０．０００）を有するサブタイプ１型乳ガンの患者の中で統計学的に有意な予測値を有した特有なサインであったことを示した。処置患者および非処置患者を識別すると、ＣＤ４ＩＴＳの排他的妥当性が処置患者の間で強く保たれる。
【００５８】
インシリコ分析による免疫応答および腫瘍浸潤の調査
材料および方法
遺伝子発現データ
遺伝子発現データセットを公開のデータベースまたは著者らのウエブサイトから検索した。本発明者らは、最初の研究によって発表されるような正規化されたデータ（ｌｏｇ２（１チャンネルプラットフォームでの強度）またはｌｏｇ２（２チャンネルプラットフォームでの比率））を使用している。遺伝子発現データの処理は、この研究のメタ分析的枠組みのために何ら必要なかった。
【００５９】
プローブの注釈およびマッピング
ハイブリダイゼーションプローブを、ＲｅｆＳｅｑのバージョン２１（２００７．０１．２１）およびＥｎｔｒｅｚデータベースのバージョン２００７．０１．２１を使用して、Ｓｈｉ他［２０］による方法と同様に、（ＮＭ）サブセットにおけるＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡに対する配列アラインメントによりＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ［１９］にマッピングした。多数のプローブを同じＧｅｎｅＩＤにマッピングしたとき、特定のデータセットにおいて最も大きい不一致を有するプローブを、そのＧｅｎｅＩＤを表すために選択した。
【００６０】
プロトタイプに基づく共発現モジュール
本発明者らは、１組のプロトタイプ、すなわち、乳ガン（ＢＣ）において様々な特定の生物学的プロセスに関連づけられることが知られている遺伝子を考慮しており、また、それらのそれぞれとともに特異的に共発現するそのような遺伝子を特定することを目的としている。この目的を達成するために、本発明者らは、それぞれの遺伝子について、直接的関連および複合的関連をコンピューター計算した。直接的関連は、遺伝子ｉと、それぞれのプロトタイプｊとの間における線形相関として個々に定義され、これに対して、複合的関連は、遺伝子ｉと、特徴選択（直交Ｇｒａｍ−Ｓｃｈｍｉｄｔ特徴選択［２１］）によって特定されるような、プロトタイプの最も良好な線形組合せとの間における線形相関として定義される。遺伝子ｉについて得られる直接的関連および複合的関連のすべてを考慮して、フリードマン検定を、有意に非常に高い関連を特定するために使用した。（プロトタイプｊとの）１つだけの直接的関連が残された場合には、遺伝子ｉがモジュールｊに割り当てられ、プロトタイプｊに対して「特異的」であるとして留意された。対照的に、最も高い関連が多変量関連またはいくつかの直接的関連を含んでいた場合、遺伝子ｉはどのモジュールｊにも割り当てられず、最も高い関連に関与するすべてのプロトタイプに「関連づけられる」として留意された。相関に対する閾値によって、どのプロトタイプにも相関しなかった遺伝子を棄却することが可能となった。この方法はメタ分析的枠組みにおいて適用され、ＮＫＩ２データセット（４）およびＶＤＸデータセット（１６）からの結果を組み合わせた（５８１名の患者、表５を参照のこと）。表５は、公表されている遺伝子発現データセットの特徴を表す。一部のサンプルがいくつかの研究において使用されていることに留意すること。下記の研究ｉｄはサンプルを共通して有する：ＮＫＩ／ＮＫＩ２およびＵＰＰ／ＳＴＫ／ＵＮＴ／ＴＢＡＧＤ／ＴＢＶＤＸ／ＴＡＭ。すべての分析のために、本発明者らは、重複した患者を小さいデータセット（例えば、ＮＫＩ）から除いて、大きいデータセット（例えば、ＮＫＩ２）のサンプルサイズが小さくなることを避けた。
全手順が補足図１に概略的に示される。１つの特定のプロトタイプとともに共発現する遺伝子を特定するために、本発明者らは、ＮＫＩ２データセットおよびＶＤＸデータセットに由来する５８１名の患者のデータセットを使用した。最初に、本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームと、Ａｇｉｌｅｎｔプラットフォームとの間における遺伝子の共通部分のみを、上記のようなマッピング手順（プローブの注釈およびマッピングの節を参照のこと）を適用した後で考慮した。本発明者らは下記では、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットをこの共通部分の遺伝子発現として示す。下記の手順（これは補足図１に概略的に示される）がＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットの各遺伝子について行われる：
１ すべての一変量線形モデルを、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットにおいて、プロトタイプを説明変数として、遺伝子ｉを応答変数として使用してフィッティングし、これにより、７対の一変量線形モデルを得た。
２ これら２つのプラットフォームの間での係数推定値におけるばらつきがサンプリング誤差だけに起因するかどうかを調べるために、本発明者らは、各対の係数についての不均一性のストリンジェントな検定［Ｃｏｃｈｒａｎｅ、１９５４；２５］を適用した。少なくとも１つの係数が不均一である場合（ｐ値＜０．０１）、遺伝子ｉはさらなる分析については棄却された。
３ 本発明者らは、遺伝子ｉが１つだけのプロトタイプによって予測可能であるかを確認するために、すなわち、１つのモデルがそれ以外の候補のすべてよりも有意に良好であるかを確認するために１組の線形モデルを比較した。そうするために、本発明者らは、リーブワンアウト交差検定（ＬＯＯＣＶ）誤差を効率的にコンピューター計算するためにＰＲＥＳＳ統計学［Ａｌｌｅｎ、１９７４；２２］を使用し、２つのモデルをＬＯＯＣＶ誤差のそれらのベクトルに基づいて比較した。フリードマン検定を使用して、ＮＫＩ２およびＶＤＸの縮小されたデータセットについての１組の最も良好なモデルを別個に確認した。それぞれの比較のために、２つのｐ値を、Ｚ変換法［Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、２００５］を使用してメタ分析的に組み合わせた。組み合わされたｐ値が０．０５未満であった場合、モデルは、別のモデルよりも著しく良好であると見なされた。コンピューター計算の限界のために、本発明者らは、遺伝子ｉを予測するためのプロトタイプの可能なすべての組合せを調べることができなかった。対応する多変量線形モデルの平均二乗ＬＯＯＣＶ誤差に関する最も良好な１組のプロトタイプのみが、直交Ｇｒａｍ−Ｓｃｈｍｉｄｔ特徴選択を使用して確認された［Ｃｈｅｎ他、１９８９；２１］。この多変量モデルをその１組の一変量モデルに加えて使用した。
４ 本発明者らは、１組の最も良好なモデルを検討することによって、１つのプロトタイプに対する遺伝子ｉの特異性を調べた。１つの一変量モデルだけがこの１組に属した場合、それは、プロトタイプｊのみを使用するモデルが、他のプロトタイプに関するモデルのすべてよりも有意に良好であることを意味した。加えて、多変量モデルが、１組の最も良好なモデルに属した場合、それは、この多変量モデルが、プロトタイプｊに関するモデルよりも有意に良好でないことを意味した。
５ 遺伝子ｉを、プロトタイプｊに対して特異的であることを確認し、モジュールｊ（これはまた、遺伝子リストｊと呼ばれる）に含めた。
モジュールのサイズを小さくするために、本発明者らは、正規化された平均二乗ＬＯＯＣＶ誤差に対する０．９５の閾値を使用して、特異的な遺伝子を選別した。
【００６１】
モジュールスコア
特異的なデータセットについて、モジュールスコアを、
（式中、ｘｉは、データセットのプラットフォームに存在するモジュールにおける遺伝子の発現である。ｗｉは、プロトタイプとの関連の符号に依存して、＋１または−１のどちらかである。）
として、それぞれのサンプルについてコンピューター計算した。ロバストな尺度化を、１に等しい四分位数間範囲と、０に等しいメジアンとをそれぞれのデータセット内において有するようにそれぞれのモジュールスコアに対して行い、これにより、モジュールスコア間の比較を可能にした。
【００６２】
遺伝子オントロジーおよび機能的分析
遺伝子オントロジー分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ａｎａｌｙｓｉｓツール（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）（遺伝子発現データにおける分子相互作用ネットワークの発見、可視化および調査を可能にするウエブ配信アプリケーション）を使用して実施した。ＨＵＧＯ遺伝子記号、同様にまた、正または負の共発現の目安を含有する、異なるプロトタイプと特異的に関連することが確認された遺伝子の様々なリストが、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析にアップロードされ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路知識ベースに保存される機能的注釈と相関された。
【００６３】
クラスター化
異なるデータセットにまたがる分子的サブグループを矛盾なく特定するために、本発明者らは、等しい対角分散をすべてのクラスターについて有するガウス混合モデル［２３］にフィッティングすることによって、ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールスコアおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールスコアを使用して腫瘍をクラスター化した。本発明者らは、成分の数を調べるためにベイズ情報量基準［２４］を使用している。それぞれの腫瘍が、クラスターにおける構成要素の最大事後確率を使用して特定された分子的サブグループの１つに自動的に分類された。
【００６４】
関連分析
本発明者らは、ピアソン相関係数を使用してモジュールスコアのペアワイズ相関を推定している。それぞれの相関係数をそれぞれのデータセットについて個々に推定し、母数モデルによる分散逆数重み付け（ｉｎｖｅｒｓｅ ｖａｒｉａｎｃｅ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）法［２５］と組み合わせた。加えて、本発明者らは、モジュールスコアと、サブタイプとの間における関連を、クルスカル−ウォリス検定を使用して検定している。本発明者らは、モジュールスコアと、臨床的変数との間における関連を、ウィルコクスン順位和検定を使用して検定している。それぞれの統計学的検定をそれぞれのデータセットについて個々に適用し、ｐ値を、母数モデルによる逆正規（ｉｎｖｅｒｓｅ ｎｏｒｍａｌ）法［２９］を使用して組み合わせた。これらの関連分析を母集団および種々の分子的サブグループの両方において行った。
【００６５】
生存分析
本発明者らは、非処置患者の無再発生存（ＲＦＳ）を生存の終点と見なしている。ＲＦＳを得ることができなかったとき、本発明者らは無遠隔転移生存（ＤＭＦＳ）データを使用している。生存データのすべてが１０年で打ち切られた。生存曲線はカプラン−マイヤー推定値に基づいており、グリーンウッド法が、９５％信頼区間をコンピューター計算するために用いられた。２つまたは３つのグループ（サブタイプおよび３元モジュールスコア）の間におけるハザード比が、データセットを層指標として用いるコックス回帰を使用して計算され、したがって、これにより、コホート間における異なる基準ハザード関数が考慮された。臨床的変数およびモジュールスコアについては、ハザード比をそれぞれのデータセットについて個々に推定し、母数モデルによる分散逆数重み付け法［２５］と組み合わせた。本発明者らは、最も良好な多変数コックスモデルを特定するためにメタ分析的枠組みにおいて段階的増加特徴選択を使用している。新しい特徴（変数）の包含のための、また、以前に選択された特徴（変数）の排除のために組み合わせたｐ値（ハザード比についてのワルド検定）に関する有意性閾値が０．０５に設定された。
【００６６】
予後的遺伝子サインの適用
プラットフォーム間のマッピングが必要であったとき、本発明者らは、ＧｅｎｅＩＤにマッピングされ得るサインにおける遺伝子を考慮しているだけである。予測スコアを、上記のモジュールスコアについての式に類似する線形結合を使用してそれぞれのサインについてコンピューター計算した。最初の研究からの遺伝子特異的な重み（係数、相関または他の尺度）を、各遺伝子の元々のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに依存して、＋１または−１で変換した。以前に発表されている遺伝子分類子についてのこのコンピューター計算法は、最初のデータセットに対する正式の分類と比較して非常に類似した結果を与え、また、異なるマイクロアレイプラットフォームでの遺伝子サインの適用を可能にした。ロバストな尺度化を、１に等しい四分位数間範囲と、０に等しいメジアンとをそれぞれのデータセット内において有するようにそれぞれの遺伝子サインに対して行って、異なる遺伝子サインの間における比較を可能にした。
【００６７】
結果
乳ガンの分子モジュールの明確化
分子モジュールを明らかにするために、本発明者らは、最初に、それぞれの生物学的プロセスについて「プロトタイプ」として作用するための典型的な遺伝子を文献に基づいて選択し、その後、乳ガンにおける種々の生物学的プロセスの根底にあるプロトタイプ遺伝子のそれぞれと特異的に関連する遺伝子のモジュールを作製するために線形モデルの比較を適用している（方法を参照のこと）。選択されたプロトタイプ遺伝子は、ＡＵＲＫＡ（ＳＴＫ６、７または１５として知られている）、ＰＬＡＵ（ｕＰＡとして知られている）、ＳＴＡＴ１、ＶＥＧＦ、ＣＡＳＰ３、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）であった。これらは、増殖、腫瘍浸潤／転移、免疫応答、血管形成、アポトーシスの各表現型、ならびに、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２のシグナル伝達をそれぞれ表す。
【００６８】
多数のマイクロアレイプラットフォームおよび異なる乳ガン集団にわたって十分に機能する遺伝子を特定するために、本発明者らは、ＡｇｉｌｅｎｔアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイにおいてそれぞれハイブリダイゼーションしたｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒらのシリーズ［４］およびＷａｎｇらのシリーズ［１６］に含まれる５８１名の乳腫瘍サンプルのデータセットを分析することによってこれらの分子モジュールを定義している。それぞれのモジュールスコアが、選ばれたプロトタイプだけについて、正に相関する遺伝子の和および負に相関する遺伝子の和の差によって定義された。遺伝子が２つ以上のプロトタイプと相関した場合、その遺伝子はどのモジュールにも含まれなかった。遺伝子のこれらのリストが補足表１として利用可能である（下記参照）。本発明者らは、その後、合計で２１００を越える腫瘍サンプルを含むいくつかの発表されたマイクロアレイデータセットに関してこれらのモジュールスコアのそれぞれをマッピングし、コンピューター計算した（表５を参照のこと）。
これらの分子モジュールの主要な特徴は、それらが、ＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプラットフォームおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイプラットフォームを使用するデータセットにおける選ばれたプロトタイプと一貫して共発現される遺伝子として特定されることであり、また、それらが、臨床的変数および遺伝子注釈を調べることなく特定されることである。
【００６９】
分子モジュールに含まれる遺伝子の特徴づけ
分子モジュールを表す遺伝子の７つのリストが、それらの符号と一緒に、機能的注釈の分析のためにＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路知識データベース（ＩＰＫＢ）にアップロードされた。
【００７０】
ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールは４６９個の遺伝子から構成され、そして、予想されるように、以前のマイクロアレイ研究によって既に報告されているいくつかの管腔遺伝子および基礎的遺伝子（例えば、ＸＢＰ１、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＭＹＢ、ＧＡＴＡ３、ＰＧＲおよびいくつかのケラチンなど）の共発現によって特徴づけられた。情報が、これらの遺伝子のうちの３２６個についてはＩＰＫＢに見出され、１３９個が特定の機能（例えば、小分子の生化学、ガン関連の機能、脂質代謝、細胞の運動、細胞の成長および増殖または細胞死など）と有意に関連した。ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールは２８個の遺伝子を含み、それらのほぼ半数が１７ｑ１１−２２アンプリコンに同一に存在した（例えば、ＴＨＲＡ、ＩＴＧＡ３およびＰＮＭＴなど）。１６個を機能的分析のために使用することができ、１５個が下記のオントロジークラスと有意に関連した：ガン関連の機能、細胞間のシグナル伝達、細胞の成長および増殖、分子輸送、ならびに、細胞形態学。増殖モジュール（ＡＵＲＫＡ）は２２９個の遺伝子を含み、それらのうちの３４個が、以前に報告されたゲノム悪性度指数において示された。１４３個の遺伝子がＩＰＫＢと一致し、それらのうち９３個が特定の機能と有意に関連した。予想されるように、これらの遺伝子の大多数、例えば、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＢＩＲＣ５などが、細胞の成長および増殖、ガンおよび細胞周期に関連づけられる機能に関与した。腫瘍浸潤／転移モジュール（ＰＬＡＵ）は、中でもいくつかのメタロプロテイナーゼとともに６８個の遺伝子を含んでいた。ＩＰＫＢをマッピングした５５個のうち、４６個が様々な機能（例えば、細胞の運動、組織の発達、細胞の発達およびガン関連の機能など）と有意に関連した。免疫応答モジュール（ＳＴＡＴ１）は９５個の遺伝子を含み、それらのうちの８２個に対して行われた機能的分析により、大多数が免疫応答と関連し、その後に、細胞の成長および増殖、細胞シグナル伝達、ならびに、細胞死が続くことが明らかにされた。血管形成モジュール（ＶＥＧＦ）は、ガン、遺伝子発現、脂質代謝および小分子生化学と関連づけられる１０個の遺伝子を含み、最後に、アポトーシスモジュール（ＣＡＳＰ３）は、タンパク質の合成および分解、ならびに、細胞の組み立ておよび運動と主に関連する９個の遺伝子を含んでいた。
【００７１】
これらのプロトタイプのすべてについて、それぞれのプロトタイプに関連づけられる遺伝子のリストは、他のプロトタイプとの相関を考慮に入れて所与のプロトタイプに特異的に関連する遺伝子を表す、ここで示されるリストよりもはるかに長かったことは注目に値する（表６）。
表６は、それぞれのプロトタイプと関連する遺伝子の数を表す。
＊これらの数字は、所与のプロトタイプと関連づけられる遺伝子の数を表す。すなわち、これらの遺伝子はまた、別のプロトタイプと関連する場合がある。
＊＊これらの数字は、所与のプロトタイプと特異的に関連する遺伝子の数を表す。このことは、これらの遺伝子はこのプロトタイプに関連するだけであり、他のプロトタイプには関連しないことを意味する。
例えば、ケモカインＩＬ８（これは、血管新生促進作用を有することが報告されている）の発現が実際に、ＶＥＧＦの発現と関連した。しかしながら、その発現はまた、ＰＬＡＵの発現とも相関したので、これはどのモジュールにも含まれなかった。アポトーシスに関連づけられる遺伝子のＢＣＬ２Ａ１、ＢＩＲＣ３、ＣＤ２およびＣＤ６９は、それらの発現はまたＥＲ（ＥＳＲ１）とも関連したので、アポトーシスモジュールに組み込まれなかった。また、さらなるメタロプロテアーゼがＰＬＡＵと関連することが見出され（例えば、ＭＭＰ１およびＭＰ９など）たが、それらの発現レベルはまた、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＳＴＡＴ１とも相関したので、浸潤モジュールには含まれなかった。このことは、異なる生物学的プロセスがほぼ確実に、相互に連絡していることを示す。しかし、ここで、本発明者らは、乳ガンの生物学および予後に対するそれらの個々の影響をより良く示すために、それらを「特異的」にすることを望んだ。
【００７２】
異なるモジュールに含まれる遺伝子の発現値がさらなる分析のためにモジュールスコアにまとめられた（コンピューター計算に関する詳細については、方法における「モジュールスコア」の節を参照のこと）。
【００７３】
ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−およびＥＲＢＢ２＋の分子的サブグループの特定および特徴づけ
本発明者らは、母集団に対する分析、しかもＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールおよびＨＥＲ２モジュールに基づく異なるサブグループにおいても分析を行うことを望んだので、これらの３つの分子的サブグループを定義する必要があった。この目的を達成するために、本発明者らは、ＥＳＲ１−の患者がいないこと、および、プローブの数が少ないことにそれぞれ起因してＭＧＨデータセットおよびＶＤＸ２／ＴＢＡＧＤデータセットを除いて、異なるデータセットにおいて３つの患者群を矛盾なく特定するクラスター化法を使用した。ＮＫＩ２コホート、ＶＤＸコホートおよびＵＮＣコホートについてのクラスターが、一例として図４に示される。
【００７４】
分子的サブグループ毎の臨床病理学的特徴を表７に例示する。
表７は、生存分析のために考慮された非処置の乳ガン患者について分子的サブグループ毎の臨床病理学的特徴を表す。予想されるように、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループおよびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおける腫瘍の圧倒的多数は、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態についてそれぞれ陰性および陽性であった。これに反して、ＥＲＢＢ２＋サブグループは、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態に関して腫瘍の混合物によって構成された。これら３つの分子的サブグループの生存曲線をこのメタ分析の非処置患者のすべてにわたって比較したとき、本発明者らは、他者［２７〜３１］によって既に報告されているように、分子的サブグループの間における差を認めた。実際、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−から得られる生存曲線はそれ以外の２つとは著しく異なっていた（ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−についてはｐ＝０．０３、ＥＲＢＢ２＋についてはｐ＝０．００３）。しかしながら、生存における差が、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループと、ＥＲＢＢ２＋サブグループとの間において何ら認められなかった（ｐ＝０．５６；図５を参照のこと）。
【００７５】
臨床病理学的パラメーターと、分子モジュールスコアとの間における関連
２１８０名の患者についての情報を調査することを、本発明者らは、異なるモジュールスコアの間に何らかの関連が存在したかどうかを調べることによって開始した。１つの興味深い発見が、例えば、一方では増殖モジュールスコアと、他方では血管形成モジュールスコアおよび腫瘍浸潤モジュールスコアとの間における正の相関および負の相関であった。これらの関連は、異なる分子的サブグループの全体を通して保存され、最も高い相関がＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて認められた。すべての結果を補足表２（下記を参照のこと）に示す。
補足表２は下記の４つの表を示す：母集団からの２１８０名の処置された乳ガン患者および非処の置乳ガン患者（Ａ）、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２サブグループからの３１９名のガン患者（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループからの２５２名の患者（Ｃ）、ならびに、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループからの１６１０名の患者（Ｄ）のモジュールスコアの間におけるペアワイズ−ピアソン相関係数のメタ推定量。
【００７６】
本発明者らはさらに、モジュールスコアと、十分に確立された臨床病理学的パラメーター（例えば、年齢、腫瘍サイズ、節の状態、組織学的悪性度、および、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはリガンド結合アッセイのどちらかによって定義されるＥＲ（ＥＳＲ１）状態など）との間における関連を特徴づけようと努めた。意味のある関連が見出され、これにより、モジュールスコアの妥当性が立証された。例えば、非常に有意な関連が、ＥＲ（ＥＳＲ１）／増殖モジュールスコアと、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態／組織学的悪性度との間において認められた。本発明者らはまた、それほど知られていない関連または新しい関連（例えば、組織学的悪性度モジュール値と、血管形成モジュール値との間における関連、免疫応答モジュール値と、アポトーシスモジュール値との間における関連など）を認めた。同じ関連がまた、節の関与について報告された。しかしながら、本発明者らは、浸潤モジュール値と、臨床病理学的マーカーとの間には関連を何ら認めなかった。これらの関連を異なる分子的サブグループにおいて調べたとき、本発明者らは、類似した関連をＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて見出した。この場合、１つの大きな違いが、母集団では認められなかった、ＥＲＢＢ２モジュールスコアと、組織学的悪性度との間における非常に有意な相関であった。これに反して、あまり有意でない関連がそれ以外の２つサブグループにおいて報告された。これらの結果を補足表３（下記を参照のこと）にまとめる。
補足表３は下記の４つの表を示す：母集団（Ａ）、ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２サブグループ（Ｂ）、ＥＲＢＢ２＋サブグループ（Ｃ）およびＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループ（Ｄ）についての、モジュールスコアと、臨床病理学的パラメーターとの間における関連。「＋」符号は変数間における正の関連を表し、ｐ値が０．０１〜０．０５の間に含まれる場合には（＋）であり、０．０１〜０．００１の間に含まれる場合には（＋＋）であり、０．００１未満の場合には（＋＋＋）である。「−」符号は変数間における負の関連を表し、ｐ値が０．０１〜０．０５の間に含まれる場合には（−）であり、０．０１〜０．００１の間に含まれる場合には（−−）である。
【００７７】
分子モジュール、臨床病理学的パラメーターおよび予後
これらのモジュールスコアの予後値を疾患の自然史に関連して評価するために、本発明者らは、１２３５個の腫瘍サンプルを含む非処置の乳ガン患者のみを考慮した。その目的のために、本発明者らは、十分に確立された臨床病理学的変数、同様にまた、本研究において定義される分子モジュールを含む７．４年の平均追跡調査とともに、全身的に処置されていない患者に対する無再発生存についての一変量分析および多変量分析の両方を行った。これらの分析は、これらの３つのサブグループの患者の経時的な生存における違いを考慮に入れるために分子的サブグループに従って階層化された（図５を参照のこと）。
【００７８】
一変量モデルにおいて、ほとんどすべての「十分に確立された」臨床病理学的パラメーター、すなわち、腫瘍サイズ、組織学的悪性度および節浸潤が、臨床結果と有意に関連した。分子モジュールの中で、増殖、血管形成および免疫応答はまた、無再発生存との統計学的に有意な関連を示した。節の関与を伴う患者の割合が少ないこと（６．７％、１２２５個中８３個）を考えると、節の状態についての生存分析の結果は、注意して解釈しなければならない。この一変量分析の結果を図６に例示し、補足表４（下記を参照のこと）においてより詳しく示す。
補足表４は、非処置の乳ガン患者の分子的サブグループ毎の異なる遺伝子分類子の一変量分析に対応する。すべてのサインがここでは、連続変数であると見なされる。ＧＥＮＥ７０＝７０遺伝子のサイン［１０、４］；ＧＥＮＥ７６＝７６遺伝子のサイン［１６、１７］；Ｐ５３＝ｐ５３のサイン［８］；ＷＯＵＮＤ＝傷害応答サイン［１２、１８］；ＧＧＩ＝ゲノム悪性度指数［９］；ＯＮＣＯＴＹＰＥ＝２１遺伝子の再発スコア［１４］；ＩＧＳ：１８６遺伝子の「浸潤性」遺伝子サイン［１３］。
【００７９】
多変量分析（ｎ＝７７５）において、増殖［ＨＲ＝２．４８（１．８８〜３．２８）、ｐ＝２×１０−１０］、腫瘍浸潤［１．４１（１．１６〜１．７２）、ｐ＝７×１０−４］、免疫応答［ＨＲ＝０．７２（０．５９〜０．８７）、ｐ＝６×１０−４］、アポトーシス［ＨＲ＝１．１８（１．００〜１．３８）、ｐ＝０．０５］、組織学的悪性度［ＨＲ＝１．８０（１．１２〜２．８８）、ｐ＝０．０２］が無再発生存（ＲＦＳ）と有意に関連し、増殖モジュールが分子モジュールの中で最も大きいＨＲおよび最も有意なｐ値を示した。
【００８０】
本発明者らがプロトタイプ遺伝子だけを考慮したとき、成績は、それらのそれぞれのモジュールと比較してそれほど顕著ではなかった。このことは、共発現した遺伝子をモジュールスコアに平均化することは、１つだけの遺伝子の発現レベルよりも安定しており、また、プラットフォーム間の比較に対する依存性が低いことを示唆している。
【００８１】
ＥＳＲ１−／ＥＳＲ２−、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−およびＥＲＢＢ２＋の分子的サブグループにおける分子モジュールスコア、臨床病理学的パラメーターおよび予後
モジュールおよび臨床病理学的パラメーターの予後値を上記で定義した分子的サブグループに従って調べたとき、我々は、高リスクのＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−のサブ集団（ｎ＝１８９）において、免疫応答モジュールのみが一変量分析および多変量分析の両方で臨床結果との有意な関連を示したことを確認した［ＨＲ＝０．７０（０．５０〜０．９８）、ｐ＝０．０４］（図６〜図７、および補足表４）。
【００８２】
興味深いことに、ほとんどすべてのＥＲ（ＥＳＲ１）陰性腫瘍が高い増殖モジュールスコアを示したので、増殖モジュールはその有意性を失っていた。
【００８３】
ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−のサブ集団（ｎ＝５３１）において、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度が、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュール、増殖モジュールおよび血管形成モジュールとともに、ＲＦＳと関連した。多変量分析において、増殖モジュール［ＨＲ＝２．６８（２．０２〜３．５５）、ｐ＝９×１０−１２］および組織学的悪性度［ＨＲ＝２．００（１．１８〜３．３７）、ｐ＝０．０１］だけが依然として有意のままであり、増殖モジュールが最も大きいＨＲおよび最も有意なｐ値を有した。
【００８４】
ＥＲＢＢ２＋の腫瘍（ｎ＝１２６）において、節の状態、腫瘍浸潤、血管形成および免疫応答のモジュールまたはスコアが、一変量モデルではＲＦＳと有意に関連し、これに対して、腫瘍浸潤モジュール［ＨＲ＝２．０７（１．３２〜３．２５）、ｐ＝０．００１］および免疫応答モジュール［ＨＲ＝０．５６（０．３６〜０．８６）、ｐ＝０．００９］だけが依然として、多変量モデルではＲＦＳと有意に関連したままであった。その後、本発明者らは、分類を改善するために、これらの２つの変数を組み合わせようと努めた。＋１および−１の重みを腫瘍浸潤モジュールおよび免疫応答モジュールの組合せにおいてそれぞれ使用した。しかしながら、本発明者らは、この単純な組合せが、図８に示されるように、予後に関するＥＲＢＢ２＋サブグループにおける患者の分類を著しく改善しなかったことを観察した。
【００８５】
分子モジュールを使用する予後的遺伝子発現サインの詳細な分析
いくつかの発表されている予後的サイン（１０、４、１６、１７、１２、１８、９、１４、８、１３）に含まれる個々の遺伝子の生物学的意味を調べるために、本発明者らは、これらのサインに含まれるそれぞれの個々の遺伝子がどの分子的カテゴリーに属するかを明らかにするために、線形モデルの同じ比較をいくつかの予後的サインに対して適用した。表８は、特定のプロトタイプに関連づけられるそれぞれのサインの遺伝子の割合、または、特異的に関連するそれぞれのサインの遺伝子の割合（括弧内の値）を例示する。
表８は、７つのプロトタイプによる遺伝子発現予後的サインの分析を表す。数字は、特定のプロトタイプに関連づけられるそれぞれのリストの遺伝子の割合、または、特定のプロトタイプに特異的に関連するそれぞれのリストの遺伝子の割合（括弧内の値）を表す。ＧＥＮＥ７０＝７０遺伝子のサイン［１０、４］；ＧＥＮＥ７６＝７６遺伝子のサイン［１６、１７］；Ｐ５３＝ｐ５３のサイン［８］；ＷＯＵＮＤ＝傷害応答サイン［１２、１８］；ＧＧＩ＝ゲノム悪性度指数［９］；ＯＮＣＯＴＹＰＥ＝２１遺伝子の再発スコア［１４］；ＩＧＳ：１８６遺伝子の「浸潤性」遺伝子サイン［１３］。
【００８６】
この分析によって、本研究で調べられたそれぞれのサインにおける遺伝子の半分を越えるものが増殖プロトタイプと統計学的に関連したことが明らかになった。また、特異的な関連の割合、すなわち、１つのプロトタイプと関連し、それ以外のプロトタイプとは関連しないことの割合が非常に高いことがまた、ＡＵＲＫＡについては報告され、このことはいくつかの予後的サインにおける増殖の重要性を強調している。
【００８７】
その後、本発明者らは、上記で報告されている予後的遺伝子サインの３つについて、すなわち、７０遺伝子［１０、４］、７６遺伝子［１６、１７］およびゲノム悪性度［９］について、「詳細に分析された」サインのそれぞれの分子モジュールの予後値を元々の予後値と比較することによって工程をさらに進めた。そうするために、本発明者らは、これらのサインが、最初のアルゴリズムおよびマイクロアレイプラットフォームを使用してコンピューター計算された非処置の原発性乳ガン患者のＴＲＡＮＳＢＩＧ独立妥当性確認シリーズを使用している［５、２６］。このことはまた、この集団がこれらのサインのどの展開のためにも使用されなかったという利点を提供した。本発明者らは、プロトタイプの１つと特異的に関連した元々のサインからの遺伝子の一群について無遠隔転移生存についてのハザード比を、元々のサインに関して得られるハザード比と比較した。興味深いことに、図８に示されるように、増殖モジュールの成績が、３つの調べられたサインのすべてについて元々のサインと等しかった。このことは、増殖が原動力となり得ることを示唆する。
【００８８】
本発明者らはさらに、表１３および／または表１２に記載のＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインが、化学療法（アントラサイクリン）に対する抵抗性と相関することを見出した。
【００８９】
本発明者らは、診断として、および／または、好適な医薬品の選択を助けるためにＣＤ１０および／またはＰＬＡＵのサインを使用する。
【００９０】
異なる分子的サブグループにおける予後的サインの影響の評価
乳ガンのどの分子的サブグループがこれらの予後的サインから利益を受け得るかを調べるために、本発明者らは、ＥＲ（ＥＳＲ１）の分子モジュールスコアおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の分子モジュールスコアによって定義される異なる分子的サブグループにおいて上記で報告される異なる遺伝子サインの予後的影響を分析した。異なる遺伝子サインを生じさせるための的確なアルゴリズムを、異なるマイクロアレイプラットフォームには適用することができないので、本発明者らは、それぞれの最初の刊行物において報告された関連の方向を使用して、モジュールスコアについて行われたように分類子をコンピューター計算することを決めた。符号つき平均は元々のアルゴリズムよりも効率的でないかもしれないという事実が懸念されたので、本発明者らは、最初の刊行物での同じ比較研究を行い、元々のスコアおよび修正されたスコアが非常に相関したこと、および、それらの成績が非常に類似していたことを見出した。ほとんどの予測子が多くの場合、単峰型分布を使用して最も良く記載されるので、また、二分化された結果変数を使用することは、有意なバイアスを、異なる予後的サインを比較する際に持ち込むことがあるので、本発明者らはここでは、異なるサインを連続変数と見なした。また、ロバストな尺度化の適用を行った場合、異なるサインが互いに比較され得ることにも留意しなければならない。
【００９１】
分子的サブグループによるこれらのサインの予後力の分析は、これらの予測子の開発において使用されなかった患者に対してだけ行われたが、これらのサインの成績は、ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループの患者に限定されるようであったことを示した（表９）。実際、異なるサインはそれ以外の２つの分子的サブグループにおいて全く情報をもたらさなかった。
【００９２】
乳ガン（ＢＣ）細胞と、それらの間質成分との間でのインビボ相互作用：遺伝子発現における変化の分析
本発明者らは、Ａｌｌｉｎｅｎおよび共同研究者ら（２００４）によって記載されるプロトコルを間質細胞の単離のために適合化し、腫瘍上皮細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）、白血球（ＣＤ４５陽性）、筋線維芽細胞（ＣＤ１０陽性）および内皮細胞の４つの異なる細胞サブ集団を分離および単離することを成し遂げている。本発明者らはまた、いくつかのＲＮＡ増幅／標識化プロトコルを本発明者らの遺伝子発現実験のために試験している。
【００９３】
今日まで、筋線維芽細胞（ＣＤ１０）が２８の乳腫瘍および４つの正常な組織から単離および精製された。遺伝子発現分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイを使用して行った。生存分析を、１２００名を越える全身処置されていない乳ガン患者を含む１２の公表されているマイクロアレイデータセットを使用して行った。
【００９４】
乳腫瘍の筋線維芽細胞間質細胞は、正常な乳房組織から単離された筋線維芽細胞間質細胞に対する変化した遺伝子発現パターンを示した（表１２および表１３を参照のこと）。示差的に発現する遺伝子のいくつかが細胞外マトリックスの形成／分解および血管形成と関連することが見出される一方で、いくつかの他の遺伝子の機能は依然として、大部分が不明のままである。
【００９５】
非管理下での階層的クラスター化分析では、乳腫瘍の筋線維芽細胞が、ＥＲ、ＨＥＲ２状態および腫瘍分化に基づいて乳ガンの分子的ポートレートを要約する４つの主要なサブグループにクラスター化された。
【００９６】
腫瘍の発現プロファイリング研究と同様に、中間悪性度の腫瘍から単離されたＢＣ筋線維芽細胞は明確な遺伝子発現パターンを示さないが、高分化腫瘍および低分化腫瘍にそれぞれ由来する遺伝子発現プロフィルと類似する遺伝子発現プロフィルの混合を示した。
【００９７】
ＢＣ組織に対して正常組織から単離された筋線維芽細胞から明らかになる間質の遺伝子発現サインは、臨床結果との統計学的に有意な関連を示した。間質サインの高い発現レベルを有する乳腫瘍は、より不良な予後と有意に関連した（ＨＲ １．５５；ＣＩ １．２０〜１．９９；ｐ＝５．５７×１０−４）。この関連が、臨床的に高リスクのＨＥＲ２＋サブタイプ内において主に観測された。興味深いことに、間質サインの発現レベルが高いＨＥＲ２＋腫瘍、および、間質サインの発現レベルが低いＨＥＲ２＋腫瘍は、４５％および８５％の無遠隔転移生存率を５年の追跡調査でそれぞれ示した（ＨＲ ２．５３；ＣＩ １．３１〜４．９０；ｐ＝５．２９×１０−３）。
【００９８】
予備的結果から、乳ガン発生および乳ガンサブタイプ決定における腫瘍上皮−間質細胞相互作用の重要性が強調される。そのうえ、この重要性は、特にＨＥＲ２＋サブタイプ内での腫瘍伝播における間質細胞の役割を示し、また、新規な治療戦略を開発するための基礎を提供する。
【００９９】
本研究において、本発明者らは、乳ガンにおいて以前に記載されたいくつかの生物学的プロセス、すなわち、増殖、腫瘍浸潤、免疫応答、血管形成、アポトーシス、ならびに、エストロゲンおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）のシグナル伝達を表す分子モジュールを開発した。乳ガンをその分子的成分に詳しく分析することによって、本発明者らはこの疾患の性質を単純化したが、本研究は、乳ガンに関与する主要な生物学的プロセスおよび予後に対するそれらの影響を理解することに関するたくさんの情報をもたらした。
【０１００】
本発明者らは、最初に、分子モジュールを表す遺伝子の７つのリストを特定した。最多数の遺伝子を含むモジュールがＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールであった（４６８個の遺伝子）。乳ガンの分子的分類に関するいくつかの刊行物は乳ガンのエストロゲン受容体の状態を発現サブグループの主たる識別子として繰り返し一貫して特定しているので［２７、２８、２９、３０］、これは驚くことではなかった。最多数の遺伝子を伴う第２のリストが、増殖モジュールに関連づけられるリストであった（２２８個の遺伝子）。これは、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他［３０］によって以前に報告された発見と一致している。これらの長いリストとは対照的に、血管形成、アポトーシスおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）シグナル伝達を反映するモジュールは、非常に限定された数の遺伝子とともに終わっただけであった（それぞれ、１３個、９個および２７個の遺伝子）。このことは、これらのモジュールと関連する多くの遺伝子はＥＲ（ＥＳＲ１）または増殖（ＡＵＲＫＡ）とも関連し、したがって、他の分子モジュールの開発において保持されなかったという事実によって部分的に説明することができる。
【０１０１】
この分子モジュールの機能的分析ではまた、興味深い情報が明らかにされた。予想されたように、これらのモジュールに含まれる多くの遺伝子は、選ばれた生物学的プロセスと関連することが知られていた。しかし、多くの他の遺伝子（これらは時にはモジュールの半数以上を表す）は、乳ガンに関連づけられることが未だ報告されていなかったか、または、別の生物学的表現型と関連することが以前に報告されていた。
【０１０２】
従来の臨床病理学的マーカーと、種々の分子モジュールとの間における関係を調べることにより、ＥＲ（ＥＳＲ１）モジュールと、患者の年齢との間における正の関連、すなわち、ＥＲ（ＥＳＲ１）のタンパク質レベルについてこれまでしばしば報告されている関連［３１］、同様にまた、ＥＲ（ＥＳＲ１）状態との正の関連が明らかにされた。このことは、ＥＲ（ＥＳＲ１）のタンパク質レベルおよび発現レベルの間における非常に良好な相関を強調する。
【０１０３】
興味深いことに、本発明者らは、正の関連を、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュールと、ＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質発現状態との間において認めた。内分泌療法の臨床効力がＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の増幅または過剰発現の存在によって損なわれ得ることが示唆されているので［３２、３３、３４、３５、３６］、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の相互関係が乳ガンの管理において重要な役割を有するようになってきている。ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）の増幅／過剰発現は一般に、ＥＲ（ＥＳＲ１）の発現と逆相関するので、この相関の正確な範囲が最近になってやっと、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）試験についての２つの標準化されたＦＤＡ承認の方法を使用して、３６５５個の乳ガン腫瘍の大きなシリーズにおいてＬａｌ他［３７］によって報告されている。興味深いことに、Ｌａｌ他は、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陽性腫瘍のほとんど半数（４９．１％）がＥＲ（ＥＳＲ１）を依然として発現したことを報告した。このことは、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）モジュール陽性腫瘍が陽性のＥＲ（ＥＳＲ１）タンパク質状態と関連するという今回の発見を裏付けている。
【０１０４】
本発明者らは、腫瘍浸潤モジュール（ＰＬＡＵ）と、臨床病理学的マーカーとの間には関連を何ら認めなかった。このことは、リンパ節およびホルモン受容体が陽性である乳ガンにおけるＰＬＡＵのｍＲＮＡ発現を調べたＬｅｉｓｓｎｅｒ他［３８］によって発表された研究と一致している。
【０１０５】
血管形成モジュールに関しては、Ｂｏｌａｔ他もまた、正の相関を、ＶＥＧＦと、腫瘍サイズとの間において認めたのだが、興味深いことに、この発見は、侵襲性小葉ガンではなく、侵襲性腺管ガンに限定されるようであった［３９］。
【０１０６】
７３名の乳ガン患者を含む研究において、Ｗｉｄｃｈｗｅｎｄｔｅｒ他は、高いＳＴＡＴ１活性化が、広く知られている予後マーカーに依存しない良好な予後の有意な予測子であったこと、および、ＳＴＡＴ１活性化と相関した唯一のパラメーターが節の状態であったこと、すなわち、ＬＮ陰性患者に由来する腫瘍の大多数が高いＳＴＡＴ１活性化と関連したことを見出した［４０］。このことは、本発明者らもまた報告したことである。この観測結果は、節陰性の患者および高いＳＴＡＴ１がより良好な予後と関連するという事実と一致している。
【０１０７】
乳ガンは、臨床的に不均一な疾患である。いくつかのグループが乳ガンの異なる分子的サブクラスを一貫して特定しており、この場合、基底様（ほとんどがＥＲ（ＥＳＲ１）陰性およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陰性）サブグループおよびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）（ほとんどがＥＲＢＢ２増幅型）サブグループが、最も短い無再発の全体的生存を示し、これに対して、管腔様タイプ（エストロゲン受容体陽性）腫瘍がより好都合な臨床結果を有した（［４１］にまとめられる）。本発明者らは、これらのサブグループが乳ガン疾患の異なるタイプを表すという事実をもはや無視することができないので、本発明者らは、同じ分析を、主要な識別子によって、すなわち、ＥＲ（ＥＳＲ１）およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）によって特定される３つのサブグループにおいて行った。
【０１０８】
ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループにおいて、増殖モジュールおよび組織学的悪性度は、多変量分析において依然として生存と関連したままであった２つの変数であり、増殖モジュールが最も有意なｐ値を有していた。このことは、２つの臨床的に異なったＥＳＲ１陽性の分子的サブグループがゲノム悪性度によって定義され得るという発見と一致している［６］。ＥＲＢＢ２＋サブグループでは、腫瘍浸潤および免疫応答が、腫瘍の進行と関連する主なプロセスであるように思われた。この発見は、ＰＬＡＵのｍＲＮＡ発現がＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）陽性腫瘍における強力な予後指標であったこと［４２］を裏付けている。
【０１０９】
第３のサブグループ（ＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−）において、免疫応答のみが、予後を予測するように思われた。ホルモン受容体およびＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）を発現しない腫瘍（これは一般には「三重陰性」腫瘍または「基底様」腫瘍と呼ばれる）はより攻撃的であることが報告されている。それらの三重陰性の状態を考えると、これらの患者は、乳ガンのために現在用いることができる従来の標的化された治療（例えば、内分泌治療またはＥＲＢＢ２標的化治療など）により処置することができず、このため、化学療法が唯一の武器として残されている。
これに関連して、数人の著者らが、化学療法がこの疾患のこのサブタイプではより効率的であり得ることを示唆している［４３、４４］。しかしながら、最適な化学療法様式を明確にすることは依然として議論の余地を残している。ＢＲＣＡ１経路の活性がこれらの腫瘍の多くでは損なわれるようであるので、また、ＢＲＣＡ１がＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントにおいて機能するので、一部の著者らは、これらの腫瘍は、ＤＮＡ損傷の化学療法に対する感受性と関連し得ること、そしてまた、紡錘体毒に対する抵抗性と関連し得ることを示唆している［４９］。本研究において、本発明者らは、損なわれた免疫応答が（この特定のサブグループの患者において）遠隔転移の発達とつながり得ることを示した。実際、免疫モジュールの高い発現レベル（表１０および表１１）が、一変量レベルおよび多変量レベルの両方で、有意により良好な結果と関連した。
【０１１０】
ＳＴＡＴ１が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびその抗腫瘍効果を活性化することにおいて特に重要であることが示されている。増殖および生存を阻害することに加えて、ＩＦＮ−γは、部分的にはＭＨＣタンパク質のＳＴＡＴ１依存的発現を高めることによって腫瘍細胞の免疫原性を高める［４６］。この観測結果に基づいて、また、腫瘍における弱められたＳＴＡＴ１シグナル伝達はその悪性挙動と相関し得るという事実に基づいて、Ｌｙｎｃｈ他は近年、ＳＴＡＴ１によって媒介される遺伝子転写を高めることが、ガン治療に対する効果的な取り組みとなり得ることを主張した［４７］。したがって、Ｌｙｎｃｈ他は５１２０個の化合物をスクリーニングし、ＳＴＡＴ１媒介による遺伝子活性化を一層高め、その結果ＩＦＮの最大有効濃度により認められる１つの分子、すなわち、２−（１，８−ナフチリジン−２−イル）フェノールを特定した。ＳＴＡＴ１活性化は、生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）遺伝子の抑制およびアポトーシス遺伝子の活性化を介して細胞毒性剤に応答して腫瘍細胞を殺すことにおける重要な要素であるように思われるので、その活性化は、化学療法を受ける患者において、特に、ほとんどの治療的取り組みが、細胞死を非特異的な様式で誘導する細胞毒性剤に頼るこれらのＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−の患者においては特に重要であり得る。
【０１１１】
本発明者らが、それらの生物学的意味をより良く理解するために、文献に今までに報告された主な予後的遺伝子サインを詳しく調べたとき、本発明者らは、これらの予後的遺伝子サインはすべてが、増殖に関連づけられる遺伝子の著しい割合によって構成されたことを認めた。本発明者らが、独立した患者シリーズにおいて、元々のサインをそれらの分子モジュールと比較したときにもまた、本発明者らは、元々のサインに含まれる増殖遺伝子がその予後的成績を取り戻すことができたことを認めた。このことは、増殖に関連づけられる遺伝子がいくつかの既存の予後的遺伝子発現サインの一般的な共通点であると思われるという事実を強調する。細胞周期の脱調節における欠陥が乳ガンの基本的特徴であるので、これらの遺伝子が乳ガン予後に関与することは驚くことではない。いくつかの研究では、細胞周期および増殖関連遺伝子の増大した発現が、不良な結果と相関したことが実際に示された（［４８］に総説される）。当然のことながら、分析された集団または使用されたプラットフォームにおける違いのために、的確な増殖関連遺伝子には違いがある。増殖関連の細胞マーカーの使用は新しいことではなく、例えば、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡのタンパク質発現レベルが何十年間にわたって予後的マーカーとして既に使用されているが、遺伝子発現のプロファイリング研究により、増殖を、より客観的な自動化された定量的方法を使用して測定することが、それほど定量的でないアッセイ（例えば、免疫組織化学など）と比較して、よりロバストであり得ることが示唆された。
【０１１２】
種々の乳ガンサブタイプに従って今までに報告された主な遺伝子サインの予後的能力を調べることによって、本発明者らは、これらのサインの予後力が、エストロゲン受容体陽性の患者によって構成されるＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−の分子的サブグループに限定されたことを認めている。このことは下記の発見と一致している：１）増殖がこれらのサインの主たる一因であると思われるという発見、および、２）ＥＳＲ１＋／ＥＲＢＢ２−サブグループが、広い範囲の増殖値を示す唯一の分子的サブグループであるという発見。
【０１１３】
この発見はまた、さらなる予後的マーカーが、それ以外の２つの分子的サブグループについては、より具体的には、不良な予後および限定された治療選択肢と関連するＥＳＲ１−／ＥＲＢＢ２−サブグループについては必要であることを強調する。したがって、本発明者らは、免疫応答を調べることによって、この特定のサブグループの患者における機構が、これらの腫瘍をより良く理解するために、また、効率的な標的化された治療を開発するために役立ち得ると考えている。
【０１１４】
結論として言えば、乳ガンに関与する主な生物学的機構を表す分子モジュールを特定することによって、本発明者らは、種々の予後的サインの生物学的基礎をより良く特徴づけることができ、また、種々の腫瘍を進行させる機構を理解することができた。真に個人に合わせた医療に向けて一歩前進するために、これらの発見は、新しい臨床ゲノムモデルを定義するために、また、特定の分子的サブグループにおける新しい標的を特定するために役立ち得る。
【０１１５】
【０１１６】
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１及び２は、プライマーＭＹＢＬ２の配列である。
配列番号３及び４は、プライマーＣＣＮＡ２の配列である。
配列番号５及び６は、プライマーＳＴＫ６の配列である。
配列番号７及び８は、プライマーＫＰＮＡ２の配列である。
配列番号９及び１０は、プライマーＣＣＮＢ１の配列である。
配列番号１１及び１２は、プライマーＣＤＣ２の配列である。
配列番号１３及び１４は、プライマーＣＤＣ２０の配列である。
配列番号１５及び１６は、プライマーＭＣＭ２の配列である。
配列番号１７及び１８は、プライマーＧＵＳＢの配列である。
配列番号１９及び２０は、プライマーＴＢＰの配列である。
配列番号２１及び２２は、プライマーＲＰＬＰ０の配列である。
配列番号２３及び２４は、プライマーＴＦＲＣの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１０および／または表１１から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、および、場合により、１００個、１０５個、１１０個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられる抗体（またはその超可変部分）を含むか、または、それらからなる遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項２】
遺伝子もしくはタンパク質の配列または抗体は、アレイのような固体担体表面に結合される、請求項１に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セットと、場合により、リアルタイムＰＣＲ分析またはタンパク質分析のための他の手段とを含む診断キットまたは診断デバイス。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲのための手段は、ｑＲＴ−ＰＣＲのための手段である、請求項３に記載のキットまたはデバイス。
【請求項５】
表１２および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、および、場合により、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子のセットまたはタンパク質のセットをさらに含む、請求項３または４に記載のキットまたはデバイス。
【請求項６】
国際公開ＷＯ２００６／１１９５９３の表３における悪性度３の腫瘍においてアップレギュレーションされた遺伝子／タンパク質として示される遺伝子またはタンパク質から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられた抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子のセットまたはタンパク質のセットをさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項７】
遺伝子は、増殖に関連づけられる遺伝子であり、好ましくは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＡ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、ＭＹＢＬ２、ＫＰＮＡ２およびＳＴＫ６からなる群から選択される、より好ましくは、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＹＢＬ２およびＫＰＮＡ２である、請求項６に記載のキットまたはデバイス。
【請求項８】
好ましくは、ＴＦＲＣ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯおよびＴＢＰからなる群から選択される、１個以上の参照用の遺伝子をさらに含む、請求項３〜７のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項９】
− 腫瘍サンプルからの遺伝子発現またはタンパク質合成を、請求項１または２に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット、および、場合により、請求項４〜８に記載のキットに含まれる遺伝子セットまたはタンパク質セットに基づいて検出するために構成されるバイオアッセイモジュール、および
− これらの遺伝子の発現またはタンパク質合成を計算するために、および、腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすために構成されるプロセッサーモジュール
を含むコンピューター化システムである、請求項３〜８のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項１０】
腫瘍サンプルは乳腫瘍のサンプルである、請求項９に記載のキットまたはデバイス。
【請求項１１】
表１１および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子にコードされたタンパク質に対して向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項１２】
哺乳動物対象における、好ましくは、ヒト患者における、好ましくは、少なくともＥＲ−のヒト患者におけるガンの予後のための方法であって、腫瘍サンプル、好ましくは、乳腫瘍サンプルを、哺乳動物対象から採取する工程、および、腫瘍サンプルにおける遺伝子発現またはタンパク質合成を、この腫瘍サンプルから得られたヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列と、請求項１または２または１１に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット、あるいは請求項３〜１０に記載のキットまたはデバイスと接触させることによって測定する工程、および、場合により、腫瘍サンプルについてのリスク評価を、ＥＲ−のタイプ、および、場合により、ＨＥＲ２＋のタイプおよび／またはＥＲ＋のタイプに含まれる異なるサブタイプとして腫瘍サンプルを指定することによって、腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらす工程を含む方法。
【請求項１】
表１０および／または表１１から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、および、場合により、１００個、１０５個、１１０個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられる抗体（またはその超可変部分）を含むか、または、それらからなる遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項２】
遺伝子もしくはタンパク質の配列または抗体は、アレイのような固体担体表面に結合される、請求項１に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セットと、場合により、リアルタイムＰＣＲ分析またはタンパク質分析のための他の手段とを含む診断キットまたは診断デバイス。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲのための手段は、ｑＲＴ−ＰＣＲのための手段である、請求項３に記載のキットまたはデバイス。
【請求項５】
表１２および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、および、場合により、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子のセットまたはタンパク質のセットをさらに含む、請求項３または４に記載のキットまたはデバイス。
【請求項６】
国際公開ＷＯ２００６／１１９５９３の表３における悪性度３の腫瘍においてアップレギュレーションされた遺伝子／タンパク質として示される遺伝子またはタンパク質から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質に対して向けられた抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子のセットまたはタンパク質のセットをさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項７】
遺伝子は、増殖に関連づけられる遺伝子であり、好ましくは、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＡ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＣＭ２、ＭＹＢＬ２、ＫＰＮＡ２およびＳＴＫ６からなる群から選択される、より好ましくは、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＭＹＢＬ２およびＫＰＮＡ２である、請求項６に記載のキットまたはデバイス。
【請求項８】
好ましくは、ＴＦＲＣ、ＧＵＳ、ＲＰＬＰＯおよびＴＢＰからなる群から選択される、１個以上の参照用の遺伝子をさらに含む、請求項３〜７のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項９】
− 腫瘍サンプルからの遺伝子発現またはタンパク質合成を、請求項１または２に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット、および、場合により、請求項４〜８に記載のキットに含まれる遺伝子セットまたはタンパク質セットに基づいて検出するために構成されるバイオアッセイモジュール、および
− これらの遺伝子の発現またはタンパク質合成を計算するために、および、腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすために構成されるプロセッサーモジュール
を含むコンピューター化システムである、請求項３〜８のいずれかに記載のキットまたはデバイス。
【請求項１０】
腫瘍サンプルは乳腫瘍のサンプルである、請求項９に記載のキットまたはデバイス。
【請求項１１】
表１１および／または表１３から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個の遺伝子もしくはタンパク質、もしくはセット全体、または、これらの遺伝子にコードされたタンパク質に対して向けられる抗体またはその超可変部分を含むか、または、それらからなる遺伝子セットまたはタンパク質セット。
【請求項１２】
哺乳動物対象における、好ましくは、ヒト患者における、好ましくは、少なくともＥＲ−のヒト患者におけるガンの予後のための方法であって、腫瘍サンプル、好ましくは、乳腫瘍サンプルを、哺乳動物対象から採取する工程、および、腫瘍サンプルにおける遺伝子発現またはタンパク質合成を、この腫瘍サンプルから得られたヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列と、請求項１または２または１１に記載の遺伝子セットまたはタンパク質セット、あるいは請求項３〜１０に記載のキットまたはデバイスと接触させることによって測定する工程、および、場合により、腫瘍サンプルについてのリスク評価を、ＥＲ−のタイプ、および、場合により、ＨＥＲ２＋のタイプおよび／またはＥＲ＋のタイプに含まれる異なるサブタイプとして腫瘍サンプルを指定することによって、腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらす工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３７６５９（Ｐ２０１０−５３７６５９Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２３５２１（Ｐ２０１０−５２３５２１）
【出願日】平成２０年９月５日（２００８．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１８２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３０７７０
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５１００４１２７８）ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月５日（２００８．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１８２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３０７７０
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５１００４１２７８）ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル (12)
【Ｆターム（参考）】
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