ＥＳ細胞における相同組換え効率を改善する方法
【課題】部位特異的な突然変異体ＥＳ細胞の作成効率を向上させる技術を開発する。
【解決手段】本発明は、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法を提供する。本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法は、ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップを含む。本発明は、本発明の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法を提供する。本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法は、ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップを含む。本発明は、本発明の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞における相同組換え効率を改善する方法、具体的には、前記外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入する前に、非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップを含む、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法と、該方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスその他の動物の染色体上の特定の遺伝子が改変された遺伝子改変動物を作出するには、ＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術と、生殖系列キメラ作成技術とが用いられる（非特許文献１及び２）。
【０００３】
遺伝子相同組換え技術では、所望の遺伝子に部位特異的突然変異を導入するために、目的とする遺伝子の上流側及び下流側の染色体ＤＮＡの配列（以下、「相同配列アーム」という。）が抗生物質耐性遺伝子を挟むように連結されたターゲティングベクターが用意されるのが一般的である。前記ターゲティングベクターは、いずれかの相同配列アームの末端で切断された直鎖ＤＮＡとして前記ＥＳ細胞に導入される。部位特異的突然変異を起こすとき、前記直鎖ターゲティングベクターと、染色体ＤＮＡとが、２本の相同配列アームと、対応する染色体ＤＮＡの相同配列との間で交差対合して、所望の遺伝子の部位で染色体ＤＮＡにインテグレーションされる。この相同配列間での交差対合を伴う組換えは、相同組換えとよばれる。しかし、前記直鎖ターゲティングベクターがＥＳ細胞に導入されると、さまざまな染色体上の部位にインテグレーションされる反応も同時に起こる。これは、インテグレーションされる部位に規則性がないことから、ランダム・インテグレーションとよばれる。前記直鎖ターゲティングベクターがＥＳ細胞に導入した後で、抗生物質を培地に添加して、前記抗生物質耐性遺伝子を発現するＥＳ細胞を選択すると、相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とが同時に選択される。相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とは、サザンブロット法又はＰＣＲ法で目的の遺伝子領域の染色体ＤＮＡの構造を解析することによって区別することができる。
【０００４】
生殖系列キメラ作成技術では、ＥＳ細胞が同種の動物の初期胚に移植されると、前記初期胚の細胞とともに胚発生に参加して、ＥＳ細胞と前記初期胚の細胞とからなるキメラ動物が作出される。ＥＳ細胞は生殖細胞を含む全ての細胞タイプに分化できるので、前記ＥＳ細胞由来の生殖細胞を含むキメラ動物が通常動物と交配されると、前記ＥＳ細胞由来の染色体が全身の細胞に受け継がれたＦ１動物が作出される。したがって、遺伝子相同組換え技術を用いて得られた部位特異的な突然変異体のＥＳ細胞に生殖系列キメラ作成技術が適用されると、部位特異的な突然変異体の動物が作成される。
【０００５】
ＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術の課題の１つは、部位特異的な突然変異体ＥＳ細胞の作成効率が低いことである。すなわち、抗生物質を培地に添加して、前記抗生物質耐性遺伝子を発現するＥＳ細胞を選択したときに、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞が相同組換えを起こしたＥＳ細胞より圧倒的に多い。前者が後者の２０倍を超えるのが一般的である。相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とは、サザンブロット法又はＰＣＲ法で目的の遺伝子領域の染色体ＤＮＡの構造を解析することによって区別することができる。しかし、いずれの方法でも数十個の抗生物質耐性ＥＳ細胞のコロニーをピックアップして、各コロニー由来のＥＳ細胞を増殖させ、凍結保存するとともに、ＤＮＡを抽出して解析しなければならない。この作業は、非常に労働集約的で、かつ、培養及びＤＮＡ解析に多額のコストが必要である。また、同時に取り扱わなければならないコロニーの数が増えると、ＥＳ細胞を操作するために、全能性を保持するうえで好ましくない条件にＥＳ細胞を曝露する機会が増える。これは、同定された部位特異的突然変異体のＥＳ細胞からキメラ動物を作出しても、前記突然変異体ＥＳ細胞が生殖細胞に分化しないために、所望の突然変異遺伝子を受け継いだＦ１動物個体は生まれない可能性が高まることを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｇｙ， Ａ． ら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、米国（２００３）
【非特許文献２】崎村建司ら、生化学、７９：３４０−３４９（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、部位特異的な突然変異体ＥＳ細胞の作成効率を向上させる技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法を提供する。本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法は、ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップと、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤により前記酵素の遺伝子発現が一過性の抑制状態にある間に、前記ＥＳ細胞の染色体ＤＮＡと相同なヌクレオチド配列を含む外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入して、相同組換えによって前記外来ＤＮＡを安定的に前記ＥＳ細胞の染色体にインテグレーションさせるステップとを含む。
【０００９】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの核酸化合物の場合がある。
【００１０】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記ＥＳ細胞はマウス由来であり、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＬｉｇ４と、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＸｒｃｃ５とからなるグループから選択される少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする場合がある。
【００１１】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの場合がある。
【００１２】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１２のＧＡＣＡＡＡＧＡＧＵＧＧＣＡＣＧＡＡＵか、配列番号１３のＧＧＡＣＣＡＡＣＵＧＧＡＣＧＵＵＡＵＡかに列挙されるヌクレオチド配列からなる場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法を提供する。
【００１４】
本明細書における、遺伝子の名称と、遺伝子産物（タンパク質）の名称との表記の規則は以下のとおりである。マウスの遺伝子の名称と、該マウスの遺伝子のｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び染色体上の遺伝子座の名称とを表すときには、斜字体で、「Ｌｉｇ４」、「Ｘｒｃｃ５」、「Ｘｒｃｃ６」及び「Ｈｐｒｔ１」と表記される。なお、日本特許庁の電子出願のテキスト書式では斜字体はサポートされていないので、下線付きの標準体で表記される場合がある。動物種を限定しない遺伝子の名称を表すときには、標準体で、「ＬｉｇａｓｅＩＶ」、「Ｋｕ８０」、「Ｋｕ７０」及び「ＨＰＲＴ」と表記される。遺伝子産物名、すなわち、ある遺伝子由来のタンパク質の名称を表すときには、標準体で、「Ｌｉｇ４」、「Ｘｒｃｃ５」、「Ｘｒｃｃ６」及び「Ｈｐｒｔ１」と表記される。
【００１５】
本発明において、ＥＳ細胞、すなわち、胚性幹細胞とは、生殖細胞を含む全ての細胞タイプに分化する能力を保持する株化細胞をいう。本発明のＥＳ細胞は、全能性があること、すなわち、生殖系列キメラ作成技術で動物個体を作出することができることを条件として、いかなる方法で樹立された細胞であってもかまわない。本発明のＥＳ細胞は、哺乳類の胚盤胞期胚の内部細胞塊か、これと相同な初期胚の細胞かを起原として、初期胚を試験管内で着床させて、培養下で増殖した幹細胞を単離してフィーダー細胞等の上で培養して得られる場合が典型的である。しかし、本発明のＥＳ細胞は、いわゆるｉＰＳ細胞、すなわち、特定の細胞タイプに分化した体細胞に１種類又は２種類以上の細胞分化のリプログラミング因子を導入して、脱分化させて得られる全能性を有する幹細胞であってもかまわない。また、本発明のＥＳ細胞は、全能性があることを条件として、既に１種類又は２種類以上の外来遺伝子がインテグレーションされたり、１種類又は２種類以上の遺伝子について部位特異的突然変異が導入された細胞であってもかまわない。さらに、本発明のＥＳ細胞は、全能性があることを条件として、いかなる動物種に由来する細胞であってもかまわない。本発明のＥＳ細胞は哺乳類の種に由来することが好ましく、マウス、ラット、アカゲザル等の実験動物の種に由来することがより好ましい。本発明のＥＳ細胞がマウス由来の場合には、いずれの系統のマウス由来であってもかまわないが、１２９系統のように生殖細胞への分化が起こりやすい系統を用いることが好ましく、本発明の発明者らによって樹立されたＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ由来のＲＥＮＫＡ株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２２５）のような生殖細胞への分化が起こりやすい株のＥＳ細胞を用いることがより好ましい。
【００１６】
本発明における配列特異的遺伝子発現抑制剤とは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該標的とする遺伝子がコードするタンパク質の発現を一過性に抑制するものをいう。本発明における配列特異的遺伝子発現抑制剤には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。本発明のｓｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２１−２３塩基対程度の２本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制する、２本鎖ＲＮＡをいう。本発明のｍｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制し、長い（数百塩基以上の）転写産物として精製された後、切断、プロセシングを受けて短い（２０−２５塩基程度の）オリゴリボヌクレオチドとなり機能する、１本鎖ＲＮＡをいう。本発明のリボザイムとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡを分解する触媒として働くことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制するＲＮＡをいう。本発明のアンチセンス核酸とは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２０塩基程度の１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡと２本鎖を形成することで分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制する、１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡをいう。これらの配列特異的遺伝子発現抑制剤は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドであって、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが混在するように重合された、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの場合がある。前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、核酸分子の安定性を高める目的等で使用される。
【００１７】
本発明の外来ＤＮＡは、所望の遺伝子に部位特異的突然変異を導入するために、目的とする遺伝子の上流側及び下流側の染色体ＤＮＡの配列（以下、「相同配列アーム」という。）が抗生物質耐性遺伝子を挟むように連結されたターゲティングベクターのように、複数の相同配列を含むＤＮＡの場合と、単一の相同配列が非相同配列と連結したＤＮＡの場合とがある。本発明の外来ＤＮＡは、相同組換えによって部位特異的突然変異を起こすことを条件として、２本鎖であっても１本鎖であってもよく、メチル基その他で修飾されたヌクレオチドからなるＤＮＡの誘導体であってもよい。
【００１８】
本発明の配列特異的遺伝子発現抑制剤及び外来ＤＮＡをＥＳ細胞内に導入するための手段は、該ＥＳ細胞が全能性を失わないことを条件として、エレクトロポレーション、リポフェクションその他、いかなる公知のトランスフェクション技術を利用するものであってもかまわない。
【００１９】
本発明において、相同組換えとは、細胞内に導入された外来ＤＮＡが細胞の染色体ＤＮＡにインテグレーションされる際に、前記外来ＤＮＡに前記染色体ＤＮＡと相同配列が含まれていて、該相同配列部分で前記染色体ＤＮＡと前記外来ＤＮＡとが組換えを起こす反応をいう。
【００２０】
本発明において、非相同末端結合とは、細胞内に導入された外来ＤＮＡが細胞の染色体ＤＮＡにランダム・インテグレーションされる際に、前記外来ＤＮＡと前記染色体ＤＮＡとの配列の相同性に関係なく、染色体ＤＮＡがランダムに２本鎖とも切断され、そこに前記外来ＤＮＡが連結される反応をいう。非相同末端結合反応には、Ｋｕ７０及びＫｕ８０のヘテロ２量体が２本鎖切断部位に結合し、該ヘテロ２量体が、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）とＡｒｔｅｍｉｓタンパク質との複合体を引き寄せて、前記２本鎖切断部位の末端のプロセッシングを行い、Ｘｒｃｃ４、ＸＬＦ（Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓともよばれる。）及びＬｉｇａｓｅＩＶの複合体が参加することが知られている（Ｍａｒｉ，Ｐ−Ｏ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ、１０３：１８５９７−１８６０２（２００６））。しかしながら、Ｋｕ７０及びＫｕ８０の複合体に始まる非相同末端結合反応の経路の抑制は、ニワトリのＢ細胞リンパ芽腫細胞株ＤＴ４０ではランダム・インテグレーションの低下をもたらしたが、ヒトプレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ−６ではランダム・インテグレーションの低下は起こらなかった。また、前記非相同末端結合反応の経路を抑制すると、相同配列アームを有するターゲティングベクターのランダム・インテグレーションが増大することが報告された（Ｉｉｉｚｕｍｉ、Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３６：６３３３−６３４２（２００８））。そこで従来技術に基づいて、ＬｉｇａｓｅＩＶ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０を含む前記非相同末端結合反応の経路の抑制が、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させるかどうか予測することはできない。
【００２１】
本発明において、外来ＤＮＡの相同組換え効率とは、ある一定数の細胞に外来ＤＮＡを導入するとき、ランダム・インテグレーションで外来ＤＮＡがインテグレーションを起こした細胞のコロニーが形成される頻度をＦＲＩとし、相同組換えで外来ＤＮＡがインテグレーションを起こした細胞のコロニーが形成される頻度をＦＨＲとするとき、ＦＲＩとＦＨＲとの和に対するＦＨＲの割合の百分率として定義される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係を示す模式図。
【図２】Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＬｉｇ４のｍＲＮＡ量をノザンブロット法で解析した結果のオートラジオグラム（上半分）と、同じサンプルが泳動されたアガロースゲルの臭化エチジウム染色後の蛍光写真（下半分）。
【図３】Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ５遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図。
【図４】Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ６遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図。
【図５】Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのサザンブロット法による遺伝子型解析結果を示すオートラジオグラム。
【図６】Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＰＣＲ法による遺伝子型解析結果を示す電気泳動ゲル写真。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００２４】
（Ａ）材料と方法
（１）ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ由来のＲＥＮＫＡ株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２２５）が全ての実施例で用いられた。ＥＳ細胞の培養に用いるフィーダー細胞として、ＳＩＭ系統マウスの胎仔由来線維芽細胞ＳＴＯ株か、Ｇｒｉｎ２ａノックアウトマウスのホモ変異雄マウスを雌ＩＣＲマウスと交配して得られたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）かが用いられた。ＥＳ細胞はマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、３７°Ｃ、５％ＣＯ２中で培養された。
【００２５】
ＥＳ細胞培養用の培地として、１７．７％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 ）と、８８．４μＭの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）と、８８４μＭのピルビン酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、８８．４μＭの２−メルカプトエタノール（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、８８４Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、日本ミリポア株式会社）とが添加された４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が用いられた。
【００２６】
継代培養や分析のためにＥＳ細胞を回収する際には、以下のトリプシン処理が行われた。すなわち、マイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上で増殖したＥＳ細胞は、６ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＥＤＴＡ−ＰＢＳ」という。）でリンスされ、その８分の１の体積の０．２５％トリプシン液が添加されて、培養ディッシュから解離された。
【００２７】
（２）Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターの作成
マウスＨｐｒｔ１遺伝子の第３エクソンを相同組換えによって破壊するためのベクター（以下、「Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクター」という。）は、マウスＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体ＤＮＡのうち、第３エクソンの５’末端側の４．１ｋｂの染色体ＤＮＡ（以下、「５’末端側相同配列アーム」という。）と、第３エクソンの３’末端側の７．４ｋｂの染色体ＤＮＡ（以下、「３’末端側相同配列アーム」という。）とを含む。前記ターゲティングベクターは、さらに、該ターゲティングベクターを染色体のいずれかの場所にインテグレーションした未分化ＥＳ細胞クローンを選択（以下、「ポジティブ選択」という。）するためのネオマイシンカセットと、相同組換えによって前記ターゲティングベクターをＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体上にインテグレーションした未分化ＥＳ細胞クローンを選択（以下、「ネガティブ選択」という。）するためのジフテリア毒素遺伝子発現ユニットとをさらに含む。前記ネオマイシンカセットは、未分化状態のＥＳ細胞で構成的に発現するように、ホスホグリセレート・キナーゼ遺伝子座のプロモーター（ｐｇｋ−ｐｒ）によって転写が制御される。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）は、未分化状態のＥＳ細胞で構成的に発現するように、未分化テラトカルシノーマで増殖可能な突然変異株ポリオーマウイルス由来のエンハンサーと、チミジンキナーゼ遺伝子の最短プロモーターとを含むＭＣ１プロモーターによって転写が制御される。
【００２８】
本発明のＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターでは、Ｈｐｒｔ１遺伝子の第３エクソンが前記ネオマイシンカセットで置換される。したがって、前記５’末端側相同配列アームと、前記ネオマイシンカセットと、前記３’末端側相同配列アームとは、この順に５’から３’の向きに連結される。前記ネオマイシンカセットは、Ｈｐｒｔ１遺伝子と同じ向きに転写される。前記第３エクソンの５’末端側相同配列アームのさらに５’末端側には、ベクターＤＮＡを介して、前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニットが連結される。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニットは、Ｈｐｒｔ１遺伝子と反対向きに転写される。本発明のターゲティングベクターは、全長が約１８．８ｋｂである。マウスＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体ＤＮＡは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスゲノムＤＮＡの細菌人工染色体クローン（ＢＡＣ Ｎｏ．ＲＰ２３−４１２Ｊ１６）に由来し、Ｃｒｅ、ＦＬＰ等の部位特異的組換え酵素の認識配列であるｌｏｘＰ、ｆｒｔ等を利用するサブクローニング技術を用いて構築された。前記ターゲティングベクターは、制限酵素ＳａｌＩ消化により直鎖化され、フェノール抽出で精製された。その後、前記ターゲティングベクターＤＮＡは、２．５ピコモル（約２８μｇ）ずつ分注されて、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．０５）、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４及び０．１％のデキストロースからなる生理食塩水（以下、「ＨＢＳ」という。）１００μＬに溶解され、エレクトロポレーションに供された。
【００２９】
（３）マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係
図１は、マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係を示す模式図である。上は、正常なマウスＨｐｒｔ１遺伝子領域の染色体（Ｈｐｒｔ１ＷＴ）上のエクソン及び制限酵素切断部位の位置を表す。中央は、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターの構造を表す。下は、第３エクソンが前記ネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）で置換される部位特異的突然変異が導入された染色体（Ｈｐｒｔ１ＫＯ）上のエクソン及び制限酵素切断部位の位置を表す。１点破線は、前記ネオマイシンカセットの５’末端側相同配列アーム及び３’末端側相同配列アームと、Ｈｐｒｔ１ＷＴ及びＨｐｒｔ１ＫＯとの対応関係を示す。ローマ数字のＩ、ＩＩ、・・・、ＩＸは、それぞれ、第１、第２、・・・、第９エクソンの位置を表す。Ｂ、Ｅ及びＮは、それぞれ、制限酵素ＢｇｌＩ、ＥｃｏＴ２２−Ｉ及びＮｃｏＩの切断部位を表す。ターゲティングベクターは、前記ネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）と、その５’末端側及び３’末端側のマウスＨｐｒｔ１遺伝子相同配列アーム（太い実線）と、マウスＨｐｒｔ１遺伝子と相同性がないベクター由来配列（太い破線）と、ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）とを含む。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）は、Ｈｐｒｔ１遺伝子とは逆向きに転写されるので、上下逆に表示される。ｌｏｘＰ及びｆｒｔは、それぞれ配列特異的組換え酵素Ｃｒｅ及びＦＬＰの認識配列を表し、前記ネオマイシンカセットを挟むようにタンデムに並んで配置される。
【００３０】
図１において、「５’ｐｒｏｂｅ」及び「３’ｐｒｏｂｅ」は、それぞれ、ターゲティングベクターに挿入されるネオマイシンカセットの５’末端側及び３’末端側の相同配列の外側の染色体上の領域からＰＣＲ法で増幅される５’及び３’ＤＮＡプローブの位置を表す。５’プローブは、Ｈｐｒｔ−５ＰＦ（配列番号３）及びＨｐｒｔ−５ＰＲ（配列番号４）によって増幅される２６９塩基対のＤＮＡフラグメントである。３’プローブは、Ｈｐｒｔ−３ＰＦ（配列番号５）及びＨｐｒｔ−３ＰＲ（配列番号６）によって増幅される５０２塩基対のＤＮＡフラグメントである。図１において、「Ｎｅｏ ｐｒｏｂｅ」は、ネオマイシンカセットからＰＣＲ法で増幅されるＮｅｏプローブの位置を表す。Ｎｅｏプローブは、ｎｅｏ−ＰＦ（配列番号７）及びｎｅｏ−ＰＲ（配列番号８）によって増幅される６２８塩基対のＤＮＡフラグメントである。
【００３１】
図１において、Ｈｐｒｔ１ＷＴ上のＨＰＲＴ−ＫＯ及びＨＰＲＴ−ＫＯ２は、野生型Ｈｐｒｔ１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を表す。ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号９）及びＨＰＲＴ−ＫＯ２（配列番号１０）によって２９３塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。Ｈｐｒｔ１ＫＯ上のＨＰＲＴ−ＫＯ及びｐｇｋ−ｐｒ２は、部位特異的相同組換えが起こったＨｐｒｔ１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を表す。ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号１０）及びｐｇｋ−ｐｒ２（配列番号１１）によって４０８塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。
【００３２】
（４）ｓｉＲＮＡの調製
マウスＬｉｇ４、Ｘｒｃｃ５及びＸｒｃｃ６遺伝子の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡは、それぞれ、配列番号１２、１３及び１４に列挙されるヌクレオチド配列からなり、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ修飾を施された、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）ｓｉＲＮＡ製品としてサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社によって合成された。陰性対照には、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＃２（カタログ番号Ｄ−００１８１０−０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）が用いられた。各ｓｉＲＮＡは、添付されたバッファー３０μＬ中に１．５ナノモル（約２０μｇ）ずつ溶解され、エレクトロポレーションに供された。
【００３３】
（５）ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーション
前記トリプシン処理によって培養ディッシュから解離されたＥＳ細胞は、遠心により氷冷されたＨＢＳで１回リンスされた後、氷冷ＨＢＳ中の細胞の濃度が６．５×１０６個／ｍＬとなるように懸濁された。前記ｓｉＲＮＡのそれぞれが３０μＬ中に１．５ナノモル含まれるバッファーに、前記ＥＳ細胞の氷冷ＨＢＳ懸濁液４７０μＬが混合され、電極間距離が０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（カタログ番号１６５−２０８８、バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）に移され、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて、２５０Ｖ、２５０ｍＦ、Ｒ＝∞（無限大）の条件で、エレクトロポレーション処理が行われた。前記エレクトロポレーション処理後のキュベットは室温で１０分間静置され、ＥＳ細胞培養用の培地１０ｍＬと混合され、マイトマイシンＣ処理されたＭＥＦ細胞が培養された１００ｍｍ培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種された。
【００３４】
（６）ノザンブロット法による標的遺伝子の転写抑制の検証
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから２４、４８、７２及び９６時間経過後に、前記トリプシン処理によってＥＳ細胞が回収され、常法に従って全ＲＮＡが抽出された。前記ＥＳ細胞全ＲＮＡは、１レーンあたり１０μｇずつ１８％ホルムアミドを含む１％アガロースゲルに適用され、常法に従って、ノザンブロット法で解析された。プローブには前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子のｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が用いられた。例えば、Ｌｉｇ４の場合には、ｃＤＮＡの第９３６−１４９４番目のヌクレオチド配列からなるプローブＤＮＡ断片が、Ｌｉｇ４−ＮＰＦ（配列番号１５）及びＬｉｇ４−ＮＰＲ（配列番号１６）のプライマーを用いるＰＣＲ法により増幅された。得られたプローブＤＮＡ断片は、ランダムプライマーによるＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ株式会社）を用いてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、ハイブリダイゼーション反応に供された。ハイブリダイゼーション反応には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、１００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー及び１０％硫酸デキストランからなるハイブリダイゼーション溶液が用いられ、４２°Ｃ、６時間以上行われた。
【００３５】
（７）ウェスタンブロット法による標的遺伝子の翻訳抑制の検証
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから２４、４８、７２及び９６時間経過後に、培養ディッシュに１ｍＬのサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１％ ２−メルカプトエタノール）が添加され、１００°Ｃ、５分間煮沸処理された。各サンプルのタンパク質濃度は、ＢＣＡ法によって定量された。前記サンプルバッファー中のＥＳ細胞タンパク質サンプルは１レーンあたり２０μｇずつＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用され、常法に従って、ウェスタンブロット法で解析された。１次抗体には、前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子産物に対する特異抗体が用いられた。例えば、Ｘｒｃｃ５遺伝子産物に対する抗体として、抗Ｋｕ８０抗体（カタログ番号２７５３、ＣＳＴジャパン株式会社）が用いられた。Ｘｒｃｃ６遺伝子産物に対する抗体として、抗Ｋｕ７０抗体（カタログ番号６１１８９２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が用いられた。抗アクチン抗体（ＭＡＢ１５０１Ｒ、日本ミリポア株式会社）が陰性対照の１次抗体として用いられた。それぞれ２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体又は抗マウスＩｇＧ抗体が用いられた。
【００３６】
（８）Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーション
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから約４８時間経過後に、前記トリプシン処理によって培養ディッシュから解離されたＥＳ細胞は、遠心により氷冷されたＨＢＳで１回リンスされた後、氷冷ＨＢＳ中の細胞の濃度が２×１０７個／ｍＬとなるように懸濁された。Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクター２．５ピコモル（約２８μｇ）を含む１００μＬのＨＢＳと、前記ＥＳ細胞の氷冷ＨＢＳ懸濁液４００μＬとが混合され、電極間距離が０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移され、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて、２００Ｖ、２５０μＦ、Ｒ＝∞（無限大）の条件で、エレクトロポレーション処理が行われた。前記エレクトロポレーション処理後のキュベットは室温で１０分間静置され、ＥＳ細胞培養用の培地２０ｍＬと混合され、マイトマイシンＣ処理されたＳＴＯ細胞が培養された１００ｍｍ培養ディッシュ２枚に播種された。
【００３７】
（９）Ｈｐｒｔ１遺伝子座の相同組換え体ＥＳ細胞の選択
ＥＳ細胞培養用培地には、前記ターゲティングベクターのエレクトロポレーションから３６−４８時間後から、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加された。同時にエレクトロポレーション処理されたＥＳ細胞の培養ディッシュ２枚のうち１枚は、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加されたＥＳ細胞培養用培地中で１１日間培養された。前記培養ディッシュ２枚のうち残る１枚は、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加されたＥＳ細胞培養用培地中で７日間培養され、引き続いて、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８と、６μＭの６-チオグアニン（６−ＴＧ）とが添加されたＥＳ細胞培養用培地中で１０日間培養された。その後、各培養ディッシュ中のコロニー数が計測された。また、必要に応じてコロニーピックアップが行われた。すなわち、各コロニーの細胞が顕微鏡下でピペットで吸引されて、２４ウェルプレートのウェル中のマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、各コロニー由来のＥＳ細胞が別々に培養された。各コロニー由来のＥＳ細胞は、コロニーピックアップの４日後に一部が凍結保存され、残りは、新たな２４ウェルプレートのウェル中のマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、ＥＳ細胞が増殖され、ゲノムＤＮＡが抽出された。
【００３８】
（１０）サザンブロット法による相同組換え体ＥＳ細胞の同定
本発明の実験に用いられたＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞と、前記コロニーピックアップにより得られた、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローンとから抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＴ２２−Ｉ、ＢｇｌＩ等の制限酵素で完全消化され、常法に従ってサザンブロット法により解析された。プローブとして、図１に示される５’プローブ、３’プローブ及びＮｅｏ プローブが用いられた。５’プローブは、Ｈｐｒｔ−５ＰＦ（配列番号４）及びＨｐｒｔ−５ＰＲ（配列番号５）を用いて細菌人工染色体クローン（ＢＡＣ Ｎｏ． ＲＰ２３−４１２Ｊ１６）から増幅された。３’プローブは、Ｈｐｒｔ−３ＰＦ（配列番号６）及びＨｐｒｔ−３ＰＲ（配列番号７）を用いて前記細菌人工染色体クローンから増幅された。Ｎｅｏ プローブは、ｎｅｏ−ＰＦ（配列番号７）及びｎｅｏ−ＰＲ（配列番号８）を用いて前記細菌人工染色体クローンから増幅された。得られたプローブＤＮＡ断片は、ランダムプライマーによるＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ株式会社）を用いてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、ハイブリダイゼーション反応に供された。ハイブリダイゼーション反応には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、５００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー及び１％グリシンからなるハイブリダイゼーション溶液が用いられ、４２°Ｃ、６時間以上行われた。
【００３９】
（１１）ＰＣＲ法による相同組換え体ＥＳ細胞の同定
本発明の実験に用いられたＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４、Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３、Ｘ５ １−４、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３クローンとから抽出されたゲノムＤＮＡは、ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号９）、ＨＰＲＴ−ＫＯ２（配列番号１０）及びｐｇｋ−ｐｒ２（配列番号１１）の３本のプライマーと、ＫＯＤ Ｄａｓｈ（カタログ番号：ＬＤＰ−１０１、東洋紡績株式会社）とともにＰＣＲ反応に供され、ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動法によって解析された。
【００４０】
（１２）ＥＳ細胞由来の遺伝子改変マウスの作製
本発明の発明者らは、本発明のＨｐｒｔ１遺伝子の他にも、１００個を超える数の遺伝子についてＥＳ細胞での相同組換えを利用する遺伝子改変マウスを作成してきた。いずれの場合も、当該遺伝子座について遺伝子の機能が阻害されるような相同組換えによる突然変異が導入されたＥＳ細胞クローンが、サザンブロット法又はＰＣＲ法によって同定され、凍結保存された。その後、前記ＥＳ細胞はキメラマウス作成の数日前に解凍され、短期間培養された。キメラマウス作成の数時間前に前記トリプシン処理により培養ディッシュから前記ＥＳ細胞が回収され、常法に従って、集合キメラ法又は顕微注入法によるＣＤ−１マウス胚のＥＳ細胞キメラマウスが作成された。前記キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスと交配させられ、得られたＦ１マウスは、ゲノムＤＮＡをサザンブロット法又はＰＣＲ法で解析され、前記相同組換えによる突然変異が導入された染色体を受け継いだマウス個体が同定された。遺伝子改変マウスの系統は、いずれも、前記相同組換えによる突然変異が導入された染色体を受け継いだ個体の近親交配により維持された。飼育中は常に外観観察で異常個体がスクリーニングされ、当該異常個体の表現型が遺伝するかどうか、交配試験により確認された。
【００４１】
（Ｂ）結果
（１）ｓｉＲＮＡ導入による標的遺伝子発現の抑制
図２の上半分は、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＬｉｇ４のｍＲＮＡ量をノザンブロット法で解析した結果のオートラジオグラムである。黒い矢尻記号はＬｉｇ４の４．７ｋｂバンドの位置を示す。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全ＲＮＡと、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全ＲＮＡとである。図２の下半分は同じサンプルが泳動されたアガロースゲルの臭化エチジウム染色後の蛍光写真である。黒い矢尻記号は２８Ｓ及び１８ＳのｒＲＮＡバンドの位置を示す。蛍光写真は、どのレーンもほぼ等量の全ＲＮＡが適用されたことを示した。そして、オートラジオグラムでは、エレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後ではＬｉｇ４ｍＲＮＡ量が他より少ないことを示した。そこで、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＬｉｇ４遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４２】
図３は、Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ５遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図である。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全タンパク質と、Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全タンパク質とである。抗Ｋｕ８０抗体及び抗アクチン抗体で検出されたバンドを比較すると、アクチンはどのレーンでもほぼ等量存在するのに対し、Ｘｒｃｃ５遺伝子産物の量はエレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後では他より少ないことを示した。そこで、Ｘｒｃｃ５を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＸｒｃｃ５遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４３】
図４は、Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ６遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図である。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全タンパク質と、Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全タンパク質とである。抗Ｋｕ７０抗体及び抗アクチン抗体で検出されたバンドを比較すると、アクチンはどのレーンでもほぼ等量存在するのに対し、Ｘｒｃｃ６遺伝子産物の量はエレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後では他より少ないことを示した。そこで、Ｘｒｃｃ６を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＸｒｃｃ６遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４４】
（２）Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの遺伝子型決定
図５は、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのサザンブロット法による遺伝子型解析結果を示すオートラジオグラムである。左側は、ＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞（ＷＴ）と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローン（ＫＯ）とから抽出されたゲノムＤＮＡのＮｃｏＩ消化産物と、５’ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。中央は、ＷＴ及びＫＯのゲノムＤＮＡのＥｃｏＴ２２−Ｉ消化産物と、３’ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。右側は、ＷＴ及びＫＯのゲノムＤＮＡのＢｇｌＩ消化産物と、Ｎｅｏ ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。野生型ＥＳ細胞から抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩで消化されるとき、５’ｐｒｏｂｅで２３．１ｋｂのバンドが検出され、ＥｃｏＴ２２−Ｉで消化されるとき、３’ｐｒｏｂｅで１３．２ｋｂのバンドが検出され、ＢｇｌＩで消化されるとき、Ｎｅｏ ｐｏｂｅではいかなるバンドも検出されなかった。Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＢ−２４クローン（ＫＯ）から抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩで消化されるとき、５’ｐｒｏｂｅで１１．２ｋｂのバンドが検出され、ＥｃｏＴ２２−Ｉで消化されるとき、３’ｐｒｏｂｅで１４．７ｋｂのバンドが検出され、ＢｇｌＩで消化されるとき、Ｎｅｏ ｐｏｂｅで１７．７ｋｂのバンドが検出された。したがって、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーＢ−２４クローンの細胞が設計通りの相同組換え体であることが証明された。
【００４５】
図６は、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＰＣＲ法による遺伝子型解析結果を示す電気泳動ゲル写真である。左端のレーンには、φＸ１７４ファージＤＮＡのＨｉｎｃＩＩ消化産物がＤＮＡサイズマーカーとして流された。Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３及びＸ５ １−４と、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３とは、ピックアップされた２重耐性コロニー由来のＥＳ細胞クローンのＤＮＡのＰＣＲ反応産物である。右端の２本のレーンには、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローン（以下、「Ｈｐｒｔ１−ＫＯ細胞」という。）と、野生型ＲＥＮＫＡ細胞とのＤＮＡのＰＣＲ産物が流された。なお、Ｘ５ １−４のレーンと、Ｘ５ ２−１のレーンとの間にはサンプルは流されなかった。Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３、Ｘ５ １−４、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３のすべての２重耐性コロニーの細胞のレーンと、陽性対照のＨｐｒｔ１−ＫＯ細胞のレーンとでは、ＨＰＲＴ−ＫＯ及びｐｇｋ−ｐｒ２のプライマーの対から増幅された４０８ｂｐのバンドが検出された。これに対し、陰性対照の野生型ＲＥＮＫＡ細胞のレーンでは、ＨＰＲＴ−ＫＯ及びＨＰＲＴ−ＫＯ２のプライマーの対から増幅された２９３ｂｐのバンドが検出された。したがって、６個の２重耐性コロニーの細胞がすべて設計通りの相同組換え体であった。この実験以外でも、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーはすべて設計通りの相同組換え体であった（データは示されない。）。
【００４６】
以下では、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーは相同組換え体であり、Ｇ４１８耐性コロニーは、相同組換え体と、ランダムに染色体にインテグレーションされた非相同組換え体との両方からなるとして、Ｇ４１８耐性コロニーの数に対するＧ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数の百分率が、相同組換え効率として算出される。
【００４７】
（３）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＬｉｇ４ｓｉＲＮＡの効果
表１は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。ｓｉＲＮＡ非存在下でのエレクトロポレーション（−）、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｌｉｇ４）の実験条件ごとに、それぞれ、８回、１０回及び６回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。アステリスクは、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５未満となり、統計的有意差が認められたことを表す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
（４）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＸｒｃｃ５ｓｉＲＮＡの効果
表２は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＸｒｃｃ５ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｘｒｃｃ５）の実験条件ごとにそれぞれ９回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。アステリスクは、Ｘｒｃｃ５ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５未満となり、統計的有意差が認められたことを表す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
（５）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＸｒｃｃ６ｓｉＲＮＡの効果
表３は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＸｒｃｃ６ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｘｒｃｃ６）の実験条件ごとにそれぞれ９回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。Ｘｒｃｃ６ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５より大きく、統計的有意差は認められなかった。
【００５２】
【表３】
【００５３】
図４に示されるとおり、Ｘｒｃｃ６遺伝子はＬｉｇ４遺伝子及びＸｒｃｃ５遺伝子と同様にＥＳ細胞で発現しており、ｓｉＲＮＡにより遺伝子発現が抑制されるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ導入によるＥＳ細胞での非相同組換え抑制を通じて相同組換え効率を向上させる効果が認められなかった。ＬｉｇａｓｅＩＶ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０はいずれも非相同末端結合に関与する酵素として周知であるが、非相同末端結合に関与する酵素の間でｓｉＲＮＡ導入によるＥＳ細胞での非相同末端結合の抑制を通じて相同組換え効率を向上させる効果に大きな違いがあることは、従来技術から予測できなかった。さらに、コロニー数に注目すると、Ｇ４１８のみに耐性のコロニーの数は、ＮＴと比較すると、Ｌｉｇ４ではやや減少し、Ｘｒｃｃ５ではやや増加するにすぎない。これに対し、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数は、ＮＴと比較すると、Ｌｉｇ４でもＸｒｃｃ５でも２倍近く増大している。明らかに、Ｌｉｇ４及びＸｒｃｃ５をエンコードする遺伝子の発現抑制は、非相同末端結合の抑制ではなく、なんらかの形で相同組換えそのものを亢進していると考えられる。したがって、本発明は従来技術から予測できない作用効果を奏するといえる。
【００５４】
（６）相同組換え体ＥＳ細胞からの生殖系列伝達キメラマウス作成効率に及ぼすＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理の影響
Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施しないで作成された相同組換え体ＥＳ細胞２１クローンのうち、生殖系列伝達キメラマウス作成によりＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の樹立に成功したのは１２クローンで、生殖系列伝達キメラマウス作成効率は５７．１％であった。これに対し、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施したうえで作成された相同組換え体ＥＳ細胞３５クローンのうち、生殖系列伝達キメラマウス作成によりＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の樹立に成功したのは１９クローンで、生殖系列伝達キメラマウス作成効率は５４．３％であった。したがって、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理は、生殖系列伝達キメラマウス作成効率には影響がないことが示唆された。
【００５５】
（７）相同組換え体ＥＳ細胞由来の遺伝子改変マウス系統における突然変異出現に及ぼすＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理の影響
Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施しないで作成された相同組換え体ＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の数は５８あったが、改変が意図された遺伝子の他に明らかな突然変異を起こしたマウスの系統は１つであった。これに対し、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施したうえで作成された相同組換え体ＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の数は５０だが、改変が意図された遺伝子の他に明らかな突然変異を起こしたマウスの系統はいままでに１つもなかった。そこでＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理は、ＥＳ細胞へのターゲティングベクターの導入、相同組換え、耐性コロニーの選択、生殖系列伝達キメラマウス作成及び遺伝子改変マウス系統樹立の過程において、突然変異出現頻度を顕著に増大させるものではないことが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞における相同組換え効率を改善する方法、具体的には、前記外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入する前に、非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップを含む、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法と、該方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスその他の動物の染色体上の特定の遺伝子が改変された遺伝子改変動物を作出するには、ＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術と、生殖系列キメラ作成技術とが用いられる（非特許文献１及び２）。
【０００３】
遺伝子相同組換え技術では、所望の遺伝子に部位特異的突然変異を導入するために、目的とする遺伝子の上流側及び下流側の染色体ＤＮＡの配列（以下、「相同配列アーム」という。）が抗生物質耐性遺伝子を挟むように連結されたターゲティングベクターが用意されるのが一般的である。前記ターゲティングベクターは、いずれかの相同配列アームの末端で切断された直鎖ＤＮＡとして前記ＥＳ細胞に導入される。部位特異的突然変異を起こすとき、前記直鎖ターゲティングベクターと、染色体ＤＮＡとが、２本の相同配列アームと、対応する染色体ＤＮＡの相同配列との間で交差対合して、所望の遺伝子の部位で染色体ＤＮＡにインテグレーションされる。この相同配列間での交差対合を伴う組換えは、相同組換えとよばれる。しかし、前記直鎖ターゲティングベクターがＥＳ細胞に導入されると、さまざまな染色体上の部位にインテグレーションされる反応も同時に起こる。これは、インテグレーションされる部位に規則性がないことから、ランダム・インテグレーションとよばれる。前記直鎖ターゲティングベクターがＥＳ細胞に導入した後で、抗生物質を培地に添加して、前記抗生物質耐性遺伝子を発現するＥＳ細胞を選択すると、相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とが同時に選択される。相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とは、サザンブロット法又はＰＣＲ法で目的の遺伝子領域の染色体ＤＮＡの構造を解析することによって区別することができる。
【０００４】
生殖系列キメラ作成技術では、ＥＳ細胞が同種の動物の初期胚に移植されると、前記初期胚の細胞とともに胚発生に参加して、ＥＳ細胞と前記初期胚の細胞とからなるキメラ動物が作出される。ＥＳ細胞は生殖細胞を含む全ての細胞タイプに分化できるので、前記ＥＳ細胞由来の生殖細胞を含むキメラ動物が通常動物と交配されると、前記ＥＳ細胞由来の染色体が全身の細胞に受け継がれたＦ１動物が作出される。したがって、遺伝子相同組換え技術を用いて得られた部位特異的な突然変異体のＥＳ細胞に生殖系列キメラ作成技術が適用されると、部位特異的な突然変異体の動物が作成される。
【０００５】
ＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術の課題の１つは、部位特異的な突然変異体ＥＳ細胞の作成効率が低いことである。すなわち、抗生物質を培地に添加して、前記抗生物質耐性遺伝子を発現するＥＳ細胞を選択したときに、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞が相同組換えを起こしたＥＳ細胞より圧倒的に多い。前者が後者の２０倍を超えるのが一般的である。相同組換えを起こしたＥＳ細胞と、ランダム・インテグレーションを起こしたＥＳ細胞とは、サザンブロット法又はＰＣＲ法で目的の遺伝子領域の染色体ＤＮＡの構造を解析することによって区別することができる。しかし、いずれの方法でも数十個の抗生物質耐性ＥＳ細胞のコロニーをピックアップして、各コロニー由来のＥＳ細胞を増殖させ、凍結保存するとともに、ＤＮＡを抽出して解析しなければならない。この作業は、非常に労働集約的で、かつ、培養及びＤＮＡ解析に多額のコストが必要である。また、同時に取り扱わなければならないコロニーの数が増えると、ＥＳ細胞を操作するために、全能性を保持するうえで好ましくない条件にＥＳ細胞を曝露する機会が増える。これは、同定された部位特異的突然変異体のＥＳ細胞からキメラ動物を作出しても、前記突然変異体ＥＳ細胞が生殖細胞に分化しないために、所望の突然変異遺伝子を受け継いだＦ１動物個体は生まれない可能性が高まることを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｇｙ， Ａ． ら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、米国（２００３）
【非特許文献２】崎村建司ら、生化学、７９：３４０−３４９（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、部位特異的な突然変異体ＥＳ細胞の作成効率を向上させる技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法を提供する。本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法は、ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップと、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤により前記酵素の遺伝子発現が一過性の抑制状態にある間に、前記ＥＳ細胞の染色体ＤＮＡと相同なヌクレオチド配列を含む外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入して、相同組換えによって前記外来ＤＮＡを安定的に前記ＥＳ細胞の染色体にインテグレーションさせるステップとを含む。
【０００９】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの核酸化合物の場合がある。
【００１０】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記ＥＳ細胞はマウス由来であり、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＬｉｇ４と、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＸｒｃｃ５とからなるグループから選択される少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする場合がある。
【００１１】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの場合がある。
【００１２】
本発明のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１２のＧＡＣＡＡＡＧＡＧＵＧＧＣＡＣＧＡＡＵか、配列番号１３のＧＧＡＣＣＡＡＣＵＧＧＡＣＧＵＵＡＵＡかに列挙されるヌクレオチド配列からなる場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含む、遺伝子改変動物の作出方法を提供する。
【００１４】
本明細書における、遺伝子の名称と、遺伝子産物（タンパク質）の名称との表記の規則は以下のとおりである。マウスの遺伝子の名称と、該マウスの遺伝子のｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び染色体上の遺伝子座の名称とを表すときには、斜字体で、「Ｌｉｇ４」、「Ｘｒｃｃ５」、「Ｘｒｃｃ６」及び「Ｈｐｒｔ１」と表記される。なお、日本特許庁の電子出願のテキスト書式では斜字体はサポートされていないので、下線付きの標準体で表記される場合がある。動物種を限定しない遺伝子の名称を表すときには、標準体で、「ＬｉｇａｓｅＩＶ」、「Ｋｕ８０」、「Ｋｕ７０」及び「ＨＰＲＴ」と表記される。遺伝子産物名、すなわち、ある遺伝子由来のタンパク質の名称を表すときには、標準体で、「Ｌｉｇ４」、「Ｘｒｃｃ５」、「Ｘｒｃｃ６」及び「Ｈｐｒｔ１」と表記される。
【００１５】
本発明において、ＥＳ細胞、すなわち、胚性幹細胞とは、生殖細胞を含む全ての細胞タイプに分化する能力を保持する株化細胞をいう。本発明のＥＳ細胞は、全能性があること、すなわち、生殖系列キメラ作成技術で動物個体を作出することができることを条件として、いかなる方法で樹立された細胞であってもかまわない。本発明のＥＳ細胞は、哺乳類の胚盤胞期胚の内部細胞塊か、これと相同な初期胚の細胞かを起原として、初期胚を試験管内で着床させて、培養下で増殖した幹細胞を単離してフィーダー細胞等の上で培養して得られる場合が典型的である。しかし、本発明のＥＳ細胞は、いわゆるｉＰＳ細胞、すなわち、特定の細胞タイプに分化した体細胞に１種類又は２種類以上の細胞分化のリプログラミング因子を導入して、脱分化させて得られる全能性を有する幹細胞であってもかまわない。また、本発明のＥＳ細胞は、全能性があることを条件として、既に１種類又は２種類以上の外来遺伝子がインテグレーションされたり、１種類又は２種類以上の遺伝子について部位特異的突然変異が導入された細胞であってもかまわない。さらに、本発明のＥＳ細胞は、全能性があることを条件として、いかなる動物種に由来する細胞であってもかまわない。本発明のＥＳ細胞は哺乳類の種に由来することが好ましく、マウス、ラット、アカゲザル等の実験動物の種に由来することがより好ましい。本発明のＥＳ細胞がマウス由来の場合には、いずれの系統のマウス由来であってもかまわないが、１２９系統のように生殖細胞への分化が起こりやすい系統を用いることが好ましく、本発明の発明者らによって樹立されたＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ由来のＲＥＮＫＡ株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２２５）のような生殖細胞への分化が起こりやすい株のＥＳ細胞を用いることがより好ましい。
【００１６】
本発明における配列特異的遺伝子発現抑制剤とは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該標的とする遺伝子がコードするタンパク質の発現を一過性に抑制するものをいう。本発明における配列特異的遺伝子発現抑制剤には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。本発明のｓｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２１−２３塩基対程度の２本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制する、２本鎖ＲＮＡをいう。本発明のｍｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制し、長い（数百塩基以上の）転写産物として精製された後、切断、プロセシングを受けて短い（２０−２５塩基程度の）オリゴリボヌクレオチドとなり機能する、１本鎖ＲＮＡをいう。本発明のリボザイムとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡを分解する触媒として働くことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制するＲＮＡをいう。本発明のアンチセンス核酸とは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２０塩基程度の１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡと２本鎖を形成することで分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより標的遺伝子特異的に発現を抑制する、１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡをいう。これらの配列特異的遺伝子発現抑制剤は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドであって、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが混在するように重合された、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの場合がある。前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、核酸分子の安定性を高める目的等で使用される。
【００１７】
本発明の外来ＤＮＡは、所望の遺伝子に部位特異的突然変異を導入するために、目的とする遺伝子の上流側及び下流側の染色体ＤＮＡの配列（以下、「相同配列アーム」という。）が抗生物質耐性遺伝子を挟むように連結されたターゲティングベクターのように、複数の相同配列を含むＤＮＡの場合と、単一の相同配列が非相同配列と連結したＤＮＡの場合とがある。本発明の外来ＤＮＡは、相同組換えによって部位特異的突然変異を起こすことを条件として、２本鎖であっても１本鎖であってもよく、メチル基その他で修飾されたヌクレオチドからなるＤＮＡの誘導体であってもよい。
【００１８】
本発明の配列特異的遺伝子発現抑制剤及び外来ＤＮＡをＥＳ細胞内に導入するための手段は、該ＥＳ細胞が全能性を失わないことを条件として、エレクトロポレーション、リポフェクションその他、いかなる公知のトランスフェクション技術を利用するものであってもかまわない。
【００１９】
本発明において、相同組換えとは、細胞内に導入された外来ＤＮＡが細胞の染色体ＤＮＡにインテグレーションされる際に、前記外来ＤＮＡに前記染色体ＤＮＡと相同配列が含まれていて、該相同配列部分で前記染色体ＤＮＡと前記外来ＤＮＡとが組換えを起こす反応をいう。
【００２０】
本発明において、非相同末端結合とは、細胞内に導入された外来ＤＮＡが細胞の染色体ＤＮＡにランダム・インテグレーションされる際に、前記外来ＤＮＡと前記染色体ＤＮＡとの配列の相同性に関係なく、染色体ＤＮＡがランダムに２本鎖とも切断され、そこに前記外来ＤＮＡが連結される反応をいう。非相同末端結合反応には、Ｋｕ７０及びＫｕ８０のヘテロ２量体が２本鎖切断部位に結合し、該ヘテロ２量体が、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）とＡｒｔｅｍｉｓタンパク質との複合体を引き寄せて、前記２本鎖切断部位の末端のプロセッシングを行い、Ｘｒｃｃ４、ＸＬＦ（Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓともよばれる。）及びＬｉｇａｓｅＩＶの複合体が参加することが知られている（Ｍａｒｉ，Ｐ−Ｏ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ、１０３：１８５９７−１８６０２（２００６））。しかしながら、Ｋｕ７０及びＫｕ８０の複合体に始まる非相同末端結合反応の経路の抑制は、ニワトリのＢ細胞リンパ芽腫細胞株ＤＴ４０ではランダム・インテグレーションの低下をもたらしたが、ヒトプレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ−６ではランダム・インテグレーションの低下は起こらなかった。また、前記非相同末端結合反応の経路を抑制すると、相同配列アームを有するターゲティングベクターのランダム・インテグレーションが増大することが報告された（Ｉｉｉｚｕｍｉ、Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３６：６３３３−６３４２（２００８））。そこで従来技術に基づいて、ＬｉｇａｓｅＩＶ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０を含む前記非相同末端結合反応の経路の抑制が、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させるかどうか予測することはできない。
【００２１】
本発明において、外来ＤＮＡの相同組換え効率とは、ある一定数の細胞に外来ＤＮＡを導入するとき、ランダム・インテグレーションで外来ＤＮＡがインテグレーションを起こした細胞のコロニーが形成される頻度をＦＲＩとし、相同組換えで外来ＤＮＡがインテグレーションを起こした細胞のコロニーが形成される頻度をＦＨＲとするとき、ＦＲＩとＦＨＲとの和に対するＦＨＲの割合の百分率として定義される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係を示す模式図。
【図２】Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＬｉｇ４のｍＲＮＡ量をノザンブロット法で解析した結果のオートラジオグラム（上半分）と、同じサンプルが泳動されたアガロースゲルの臭化エチジウム染色後の蛍光写真（下半分）。
【図３】Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ５遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図。
【図４】Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ６遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図。
【図５】Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのサザンブロット法による遺伝子型解析結果を示すオートラジオグラム。
【図６】Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＰＣＲ法による遺伝子型解析結果を示す電気泳動ゲル写真。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００２４】
（Ａ）材料と方法
（１）ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ由来のＲＥＮＫＡ株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２２５）が全ての実施例で用いられた。ＥＳ細胞の培養に用いるフィーダー細胞として、ＳＩＭ系統マウスの胎仔由来線維芽細胞ＳＴＯ株か、Ｇｒｉｎ２ａノックアウトマウスのホモ変異雄マウスを雌ＩＣＲマウスと交配して得られたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）かが用いられた。ＥＳ細胞はマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、３７°Ｃ、５％ＣＯ２中で培養された。
【００２５】
ＥＳ細胞培養用の培地として、１７．７％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 ）と、８８．４μＭの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）と、８８４μＭのピルビン酸ナトリウム（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、８８．４μＭの２−メルカプトエタノール（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、８８４Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、日本ミリポア株式会社）とが添加された４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が用いられた。
【００２６】
継代培養や分析のためにＥＳ細胞を回収する際には、以下のトリプシン処理が行われた。すなわち、マイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上で増殖したＥＳ細胞は、６ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＥＤＴＡ−ＰＢＳ」という。）でリンスされ、その８分の１の体積の０．２５％トリプシン液が添加されて、培養ディッシュから解離された。
【００２７】
（２）Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターの作成
マウスＨｐｒｔ１遺伝子の第３エクソンを相同組換えによって破壊するためのベクター（以下、「Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクター」という。）は、マウスＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体ＤＮＡのうち、第３エクソンの５’末端側の４．１ｋｂの染色体ＤＮＡ（以下、「５’末端側相同配列アーム」という。）と、第３エクソンの３’末端側の７．４ｋｂの染色体ＤＮＡ（以下、「３’末端側相同配列アーム」という。）とを含む。前記ターゲティングベクターは、さらに、該ターゲティングベクターを染色体のいずれかの場所にインテグレーションした未分化ＥＳ細胞クローンを選択（以下、「ポジティブ選択」という。）するためのネオマイシンカセットと、相同組換えによって前記ターゲティングベクターをＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体上にインテグレーションした未分化ＥＳ細胞クローンを選択（以下、「ネガティブ選択」という。）するためのジフテリア毒素遺伝子発現ユニットとをさらに含む。前記ネオマイシンカセットは、未分化状態のＥＳ細胞で構成的に発現するように、ホスホグリセレート・キナーゼ遺伝子座のプロモーター（ｐｇｋ−ｐｒ）によって転写が制御される。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）は、未分化状態のＥＳ細胞で構成的に発現するように、未分化テラトカルシノーマで増殖可能な突然変異株ポリオーマウイルス由来のエンハンサーと、チミジンキナーゼ遺伝子の最短プロモーターとを含むＭＣ１プロモーターによって転写が制御される。
【００２８】
本発明のＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターでは、Ｈｐｒｔ１遺伝子の第３エクソンが前記ネオマイシンカセットで置換される。したがって、前記５’末端側相同配列アームと、前記ネオマイシンカセットと、前記３’末端側相同配列アームとは、この順に５’から３’の向きに連結される。前記ネオマイシンカセットは、Ｈｐｒｔ１遺伝子と同じ向きに転写される。前記第３エクソンの５’末端側相同配列アームのさらに５’末端側には、ベクターＤＮＡを介して、前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニットが連結される。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニットは、Ｈｐｒｔ１遺伝子と反対向きに転写される。本発明のターゲティングベクターは、全長が約１８．８ｋｂである。マウスＨｐｒｔ１遺伝子座の染色体ＤＮＡは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウスゲノムＤＮＡの細菌人工染色体クローン（ＢＡＣ Ｎｏ．ＲＰ２３−４１２Ｊ１６）に由来し、Ｃｒｅ、ＦＬＰ等の部位特異的組換え酵素の認識配列であるｌｏｘＰ、ｆｒｔ等を利用するサブクローニング技術を用いて構築された。前記ターゲティングベクターは、制限酵素ＳａｌＩ消化により直鎖化され、フェノール抽出で精製された。その後、前記ターゲティングベクターＤＮＡは、２．５ピコモル（約２８μｇ）ずつ分注されて、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．０５）、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４及び０．１％のデキストロースからなる生理食塩水（以下、「ＨＢＳ」という。）１００μＬに溶解され、エレクトロポレーションに供された。
【００２９】
（３）マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係
図１は、マウスＨｐｒｔ１遺伝子の構造と、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターとの関係を示す模式図である。上は、正常なマウスＨｐｒｔ１遺伝子領域の染色体（Ｈｐｒｔ１ＷＴ）上のエクソン及び制限酵素切断部位の位置を表す。中央は、Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターの構造を表す。下は、第３エクソンが前記ネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）で置換される部位特異的突然変異が導入された染色体（Ｈｐｒｔ１ＫＯ）上のエクソン及び制限酵素切断部位の位置を表す。１点破線は、前記ネオマイシンカセットの５’末端側相同配列アーム及び３’末端側相同配列アームと、Ｈｐｒｔ１ＷＴ及びＨｐｒｔ１ＫＯとの対応関係を示す。ローマ数字のＩ、ＩＩ、・・・、ＩＸは、それぞれ、第１、第２、・・・、第９エクソンの位置を表す。Ｂ、Ｅ及びＮは、それぞれ、制限酵素ＢｇｌＩ、ＥｃｏＴ２２−Ｉ及びＮｃｏＩの切断部位を表す。ターゲティングベクターは、前記ネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）と、その５’末端側及び３’末端側のマウスＨｐｒｔ１遺伝子相同配列アーム（太い実線）と、マウスＨｐｒｔ１遺伝子と相同性がないベクター由来配列（太い破線）と、ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）とを含む。前記ジフテリア毒素遺伝子発現ユニット（ＤＴ）は、Ｈｐｒｔ１遺伝子とは逆向きに転写されるので、上下逆に表示される。ｌｏｘＰ及びｆｒｔは、それぞれ配列特異的組換え酵素Ｃｒｅ及びＦＬＰの認識配列を表し、前記ネオマイシンカセットを挟むようにタンデムに並んで配置される。
【００３０】
図１において、「５’ｐｒｏｂｅ」及び「３’ｐｒｏｂｅ」は、それぞれ、ターゲティングベクターに挿入されるネオマイシンカセットの５’末端側及び３’末端側の相同配列の外側の染色体上の領域からＰＣＲ法で増幅される５’及び３’ＤＮＡプローブの位置を表す。５’プローブは、Ｈｐｒｔ−５ＰＦ（配列番号３）及びＨｐｒｔ−５ＰＲ（配列番号４）によって増幅される２６９塩基対のＤＮＡフラグメントである。３’プローブは、Ｈｐｒｔ−３ＰＦ（配列番号５）及びＨｐｒｔ−３ＰＲ（配列番号６）によって増幅される５０２塩基対のＤＮＡフラグメントである。図１において、「Ｎｅｏ ｐｒｏｂｅ」は、ネオマイシンカセットからＰＣＲ法で増幅されるＮｅｏプローブの位置を表す。Ｎｅｏプローブは、ｎｅｏ−ＰＦ（配列番号７）及びｎｅｏ−ＰＲ（配列番号８）によって増幅される６２８塩基対のＤＮＡフラグメントである。
【００３１】
図１において、Ｈｐｒｔ１ＷＴ上のＨＰＲＴ−ＫＯ及びＨＰＲＴ−ＫＯ２は、野生型Ｈｐｒｔ１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を表す。ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号９）及びＨＰＲＴ−ＫＯ２（配列番号１０）によって２９３塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。Ｈｐｒｔ１ＫＯ上のＨＰＲＴ−ＫＯ及びｐｇｋ−ｐｒ２は、部位特異的相同組換えが起こったＨｐｒｔ１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を表す。ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号１０）及びｐｇｋ−ｐｒ２（配列番号１１）によって４０８塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。
【００３２】
（４）ｓｉＲＮＡの調製
マウスＬｉｇ４、Ｘｒｃｃ５及びＸｒｃｃ６遺伝子の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡは、それぞれ、配列番号１２、１３及び１４に列挙されるヌクレオチド配列からなり、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ修飾を施された、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）ｓｉＲＮＡ製品としてサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社によって合成された。陰性対照には、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＃２（カタログ番号Ｄ−００１８１０−０２、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）が用いられた。各ｓｉＲＮＡは、添付されたバッファー３０μＬ中に１．５ナノモル（約２０μｇ）ずつ溶解され、エレクトロポレーションに供された。
【００３３】
（５）ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーション
前記トリプシン処理によって培養ディッシュから解離されたＥＳ細胞は、遠心により氷冷されたＨＢＳで１回リンスされた後、氷冷ＨＢＳ中の細胞の濃度が６．５×１０６個／ｍＬとなるように懸濁された。前記ｓｉＲＮＡのそれぞれが３０μＬ中に１．５ナノモル含まれるバッファーに、前記ＥＳ細胞の氷冷ＨＢＳ懸濁液４７０μＬが混合され、電極間距離が０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（カタログ番号１６５−２０８８、バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）に移され、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて、２５０Ｖ、２５０ｍＦ、Ｒ＝∞（無限大）の条件で、エレクトロポレーション処理が行われた。前記エレクトロポレーション処理後のキュベットは室温で１０分間静置され、ＥＳ細胞培養用の培地１０ｍＬと混合され、マイトマイシンＣ処理されたＭＥＦ細胞が培養された１００ｍｍ培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種された。
【００３４】
（６）ノザンブロット法による標的遺伝子の転写抑制の検証
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから２４、４８、７２及び９６時間経過後に、前記トリプシン処理によってＥＳ細胞が回収され、常法に従って全ＲＮＡが抽出された。前記ＥＳ細胞全ＲＮＡは、１レーンあたり１０μｇずつ１８％ホルムアミドを含む１％アガロースゲルに適用され、常法に従って、ノザンブロット法で解析された。プローブには前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子のｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が用いられた。例えば、Ｌｉｇ４の場合には、ｃＤＮＡの第９３６−１４９４番目のヌクレオチド配列からなるプローブＤＮＡ断片が、Ｌｉｇ４−ＮＰＦ（配列番号１５）及びＬｉｇ４−ＮＰＲ（配列番号１６）のプライマーを用いるＰＣＲ法により増幅された。得られたプローブＤＮＡ断片は、ランダムプライマーによるＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ株式会社）を用いてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、ハイブリダイゼーション反応に供された。ハイブリダイゼーション反応には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、１００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー及び１０％硫酸デキストランからなるハイブリダイゼーション溶液が用いられ、４２°Ｃ、６時間以上行われた。
【００３５】
（７）ウェスタンブロット法による標的遺伝子の翻訳抑制の検証
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから２４、４８、７２及び９６時間経過後に、培養ディッシュに１ｍＬのサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１％ ２−メルカプトエタノール）が添加され、１００°Ｃ、５分間煮沸処理された。各サンプルのタンパク質濃度は、ＢＣＡ法によって定量された。前記サンプルバッファー中のＥＳ細胞タンパク質サンプルは１レーンあたり２０μｇずつＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用され、常法に従って、ウェスタンブロット法で解析された。１次抗体には、前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子産物に対する特異抗体が用いられた。例えば、Ｘｒｃｃ５遺伝子産物に対する抗体として、抗Ｋｕ８０抗体（カタログ番号２７５３、ＣＳＴジャパン株式会社）が用いられた。Ｘｒｃｃ６遺伝子産物に対する抗体として、抗Ｋｕ７０抗体（カタログ番号６１１８９２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が用いられた。抗アクチン抗体（ＭＡＢ１５０１Ｒ、日本ミリポア株式会社）が陰性対照の１次抗体として用いられた。それぞれ２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体又は抗マウスＩｇＧ抗体が用いられた。
【００３６】
（８）Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーション
ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションから約４８時間経過後に、前記トリプシン処理によって培養ディッシュから解離されたＥＳ細胞は、遠心により氷冷されたＨＢＳで１回リンスされた後、氷冷ＨＢＳ中の細胞の濃度が２×１０７個／ｍＬとなるように懸濁された。Ｈｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクター２．５ピコモル（約２８μｇ）を含む１００μＬのＨＢＳと、前記ＥＳ細胞の氷冷ＨＢＳ懸濁液４００μＬとが混合され、電極間距離が０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移され、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて、２００Ｖ、２５０μＦ、Ｒ＝∞（無限大）の条件で、エレクトロポレーション処理が行われた。前記エレクトロポレーション処理後のキュベットは室温で１０分間静置され、ＥＳ細胞培養用の培地２０ｍＬと混合され、マイトマイシンＣ処理されたＳＴＯ細胞が培養された１００ｍｍ培養ディッシュ２枚に播種された。
【００３７】
（９）Ｈｐｒｔ１遺伝子座の相同組換え体ＥＳ細胞の選択
ＥＳ細胞培養用培地には、前記ターゲティングベクターのエレクトロポレーションから３６−４８時間後から、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加された。同時にエレクトロポレーション処理されたＥＳ細胞の培養ディッシュ２枚のうち１枚は、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加されたＥＳ細胞培養用培地中で１１日間培養された。前記培養ディッシュ２枚のうち残る１枚は、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８が添加されたＥＳ細胞培養用培地中で７日間培養され、引き続いて、１７５μｇ／ｍＬのＧ４１８と、６μＭの６-チオグアニン（６−ＴＧ）とが添加されたＥＳ細胞培養用培地中で１０日間培養された。その後、各培養ディッシュ中のコロニー数が計測された。また、必要に応じてコロニーピックアップが行われた。すなわち、各コロニーの細胞が顕微鏡下でピペットで吸引されて、２４ウェルプレートのウェル中のマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、各コロニー由来のＥＳ細胞が別々に培養された。各コロニー由来のＥＳ細胞は、コロニーピックアップの４日後に一部が凍結保存され、残りは、新たな２４ウェルプレートのウェル中のマイトマイシンＣ処理されたフィーダー細胞上に播種され、ＥＳ細胞が増殖され、ゲノムＤＮＡが抽出された。
【００３８】
（１０）サザンブロット法による相同組換え体ＥＳ細胞の同定
本発明の実験に用いられたＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞と、前記コロニーピックアップにより得られた、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローンとから抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＴ２２−Ｉ、ＢｇｌＩ等の制限酵素で完全消化され、常法に従ってサザンブロット法により解析された。プローブとして、図１に示される５’プローブ、３’プローブ及びＮｅｏ プローブが用いられた。５’プローブは、Ｈｐｒｔ−５ＰＦ（配列番号４）及びＨｐｒｔ−５ＰＲ（配列番号５）を用いて細菌人工染色体クローン（ＢＡＣ Ｎｏ． ＲＰ２３−４１２Ｊ１６）から増幅された。３’プローブは、Ｈｐｒｔ−３ＰＦ（配列番号６）及びＨｐｒｔ−３ＰＲ（配列番号７）を用いて前記細菌人工染色体クローンから増幅された。Ｎｅｏ プローブは、ｎｅｏ−ＰＦ（配列番号７）及びｎｅｏ−ＰＲ（配列番号８）を用いて前記細菌人工染色体クローンから増幅された。得られたプローブＤＮＡ断片は、ランダムプライマーによるＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ株式会社）を用いてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、ハイブリダイゼーション反応に供された。ハイブリダイゼーション反応には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、５００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー及び１％グリシンからなるハイブリダイゼーション溶液が用いられ、４２°Ｃ、６時間以上行われた。
【００３９】
（１１）ＰＣＲ法による相同組換え体ＥＳ細胞の同定
本発明の実験に用いられたＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４、Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３、Ｘ５ １−４、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３クローンとから抽出されたゲノムＤＮＡは、ＨＰＲＴ−ＫＯ（配列番号９）、ＨＰＲＴ−ＫＯ２（配列番号１０）及びｐｇｋ−ｐｒ２（配列番号１１）の３本のプライマーと、ＫＯＤ Ｄａｓｈ（カタログ番号：ＬＤＰ−１０１、東洋紡績株式会社）とともにＰＣＲ反応に供され、ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動法によって解析された。
【００４０】
（１２）ＥＳ細胞由来の遺伝子改変マウスの作製
本発明の発明者らは、本発明のＨｐｒｔ１遺伝子の他にも、１００個を超える数の遺伝子についてＥＳ細胞での相同組換えを利用する遺伝子改変マウスを作成してきた。いずれの場合も、当該遺伝子座について遺伝子の機能が阻害されるような相同組換えによる突然変異が導入されたＥＳ細胞クローンが、サザンブロット法又はＰＣＲ法によって同定され、凍結保存された。その後、前記ＥＳ細胞はキメラマウス作成の数日前に解凍され、短期間培養された。キメラマウス作成の数時間前に前記トリプシン処理により培養ディッシュから前記ＥＳ細胞が回収され、常法に従って、集合キメラ法又は顕微注入法によるＣＤ−１マウス胚のＥＳ細胞キメラマウスが作成された。前記キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスと交配させられ、得られたＦ１マウスは、ゲノムＤＮＡをサザンブロット法又はＰＣＲ法で解析され、前記相同組換えによる突然変異が導入された染色体を受け継いだマウス個体が同定された。遺伝子改変マウスの系統は、いずれも、前記相同組換えによる突然変異が導入された染色体を受け継いだ個体の近親交配により維持された。飼育中は常に外観観察で異常個体がスクリーニングされ、当該異常個体の表現型が遺伝するかどうか、交配試験により確認された。
【００４１】
（Ｂ）結果
（１）ｓｉＲＮＡ導入による標的遺伝子発現の抑制
図２の上半分は、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＬｉｇ４のｍＲＮＡ量をノザンブロット法で解析した結果のオートラジオグラムである。黒い矢尻記号はＬｉｇ４の４．７ｋｂバンドの位置を示す。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全ＲＮＡと、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全ＲＮＡとである。図２の下半分は同じサンプルが泳動されたアガロースゲルの臭化エチジウム染色後の蛍光写真である。黒い矢尻記号は２８Ｓ及び１８ＳのｒＲＮＡバンドの位置を示す。蛍光写真は、どのレーンもほぼ等量の全ＲＮＡが適用されたことを示した。そして、オートラジオグラムでは、エレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後ではＬｉｇ４ｍＲＮＡ量が他より少ないことを示した。そこで、Ｌｉｇ４遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＬｉｇ４遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４２】
図３は、Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ５遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図である。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全タンパク質と、Ｘｒｃｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全タンパク質とである。抗Ｋｕ８０抗体及び抗アクチン抗体で検出されたバンドを比較すると、アクチンはどのレーンでもほぼ等量存在するのに対し、Ｘｒｃｃ５遺伝子産物の量はエレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後では他より少ないことを示した。そこで、Ｘｒｃｃ５を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＸｒｃｃ５遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４３】
図４は、Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを導入されたＥＳ細胞におけるＸｒｃｃ６遺伝子産物のタンパク質の量をウェスタンブロット法で解析した結果のブロット図である。各レーンに適用されたサンプルは、それぞれ、エレクトロポレーションを行わなかったＥＳ細胞（Ｃｏｎ）の全タンパク質と、Ｘｒｃｃ６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションされてから、２４、４８、７２及び９６時間経過後に回収されたＥＳ細胞の全タンパク質とである。抗Ｋｕ７０抗体及び抗アクチン抗体で検出されたバンドを比較すると、アクチンはどのレーンでもほぼ等量存在するのに対し、Ｘｒｃｃ６遺伝子産物の量はエレクトロポレーションから２４及び４８時間経過後では他より少ないことを示した。そこで、Ｘｒｃｃ６を標的とするｓｉＲＮＡがエレクトロポレーションされてから２４時間及び４８時間ではＸｒｃｃ６遺伝子の発現抑制が起こることが示された。
【００４４】
（２）Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの遺伝子型決定
図５は、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのサザンブロット法による遺伝子型解析結果を示すオートラジオグラムである。左側は、ＲＥＮＫＡ株の野生型ＥＳ細胞（ＷＴ）と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローン（ＫＯ）とから抽出されたゲノムＤＮＡのＮｃｏＩ消化産物と、５’ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。中央は、ＷＴ及びＫＯのゲノムＤＮＡのＥｃｏＴ２２−Ｉ消化産物と、３’ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。右側は、ＷＴ及びＫＯのゲノムＤＮＡのＢｇｌＩ消化産物と、Ｎｅｏ ｐｒｏｂｅとで得られたサザンブロット法のオートラジオグラムである。野生型ＥＳ細胞から抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩで消化されるとき、５’ｐｒｏｂｅで２３．１ｋｂのバンドが検出され、ＥｃｏＴ２２−Ｉで消化されるとき、３’ｐｒｏｂｅで１３．２ｋｂのバンドが検出され、ＢｇｌＩで消化されるとき、Ｎｅｏ ｐｏｂｅではいかなるバンドも検出されなかった。Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＢ−２４クローン（ＫＯ）から抽出されたゲノムＤＮＡは、ＮｃｏＩで消化されるとき、５’ｐｒｏｂｅで１１．２ｋｂのバンドが検出され、ＥｃｏＴ２２−Ｉで消化されるとき、３’ｐｒｏｂｅで１４．７ｋｂのバンドが検出され、ＢｇｌＩで消化されるとき、Ｎｅｏ ｐｏｂｅで１７．７ｋｂのバンドが検出された。したがって、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーＢ−２４クローンの細胞が設計通りの相同組換え体であることが証明された。
【００４５】
図６は、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーのＰＣＲ法による遺伝子型解析結果を示す電気泳動ゲル写真である。左端のレーンには、φＸ１７４ファージＤＮＡのＨｉｎｃＩＩ消化産物がＤＮＡサイズマーカーとして流された。Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３及びＸ５ １−４と、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３とは、ピックアップされた２重耐性コロニー由来のＥＳ細胞クローンのＤＮＡのＰＣＲ反応産物である。右端の２本のレーンには、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニー由来細胞のＢ−２４クローン（以下、「Ｈｐｒｔ１−ＫＯ細胞」という。）と、野生型ＲＥＮＫＡ細胞とのＤＮＡのＰＣＲ産物が流された。なお、Ｘ５ １−４のレーンと、Ｘ５ ２−１のレーンとの間にはサンプルは流されなかった。Ｘ５ １−１、Ｘ５ １−２、Ｘ５ １−３、Ｘ５ １−４、Ｘ５ ２−１及びＸ５ ２−３のすべての２重耐性コロニーの細胞のレーンと、陽性対照のＨｐｒｔ１−ＫＯ細胞のレーンとでは、ＨＰＲＴ−ＫＯ及びｐｇｋ−ｐｒ２のプライマーの対から増幅された４０８ｂｐのバンドが検出された。これに対し、陰性対照の野生型ＲＥＮＫＡ細胞のレーンでは、ＨＰＲＴ−ＫＯ及びＨＰＲＴ−ＫＯ２のプライマーの対から増幅された２９３ｂｐのバンドが検出された。したがって、６個の２重耐性コロニーの細胞がすべて設計通りの相同組換え体であった。この実験以外でも、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーはすべて設計通りの相同組換え体であった（データは示されない。）。
【００４６】
以下では、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーは相同組換え体であり、Ｇ４１８耐性コロニーは、相同組換え体と、ランダムに染色体にインテグレーションされた非相同組換え体との両方からなるとして、Ｇ４１８耐性コロニーの数に対するＧ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数の百分率が、相同組換え効率として算出される。
【００４７】
（３）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＬｉｇ４ｓｉＲＮＡの効果
表１は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。ｓｉＲＮＡ非存在下でのエレクトロポレーション（−）、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｌｉｇ４）の実験条件ごとに、それぞれ、８回、１０回及び６回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。アステリスクは、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５未満となり、統計的有意差が認められたことを表す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
（４）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＸｒｃｃ５ｓｉＲＮＡの効果
表２は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＸｒｃｃ５ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｘｒｃｃ５）の実験条件ごとにそれぞれ９回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。アステリスクは、Ｘｒｃｃ５ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５未満となり、統計的有意差が認められたことを表す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
（５）ＥＳ細胞における相同組換え効率に対するＸｒｃｃ６ｓｉＲＮＡの効果
表３は、ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にＨｐｒｔ１−ＫＯターゲティングベクターのエレクトロポレーションを行って得られた薬剤耐性コロニー数と、相同組換え効率とを示す。Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（ＮＴ）及びＸｒｃｃ６ｓｉＲＮＡ存在下でのエレクトロポレーション（Ｘｒｃｃ６）の実験条件ごとにそれぞれ９回の実験が繰り返され、１００ｍｍ培養ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの数と、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数との平均値及び標準誤差が算出された。Ｘｒｃｃ６ｓｉＲＮＡ処理群とＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との間でＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、ｐ値が０．０５より大きく、統計的有意差は認められなかった。
【００５２】
【表３】
【００５３】
図４に示されるとおり、Ｘｒｃｃ６遺伝子はＬｉｇ４遺伝子及びＸｒｃｃ５遺伝子と同様にＥＳ細胞で発現しており、ｓｉＲＮＡにより遺伝子発現が抑制されるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ導入によるＥＳ細胞での非相同組換え抑制を通じて相同組換え効率を向上させる効果が認められなかった。ＬｉｇａｓｅＩＶ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０はいずれも非相同末端結合に関与する酵素として周知であるが、非相同末端結合に関与する酵素の間でｓｉＲＮＡ導入によるＥＳ細胞での非相同末端結合の抑制を通じて相同組換え効率を向上させる効果に大きな違いがあることは、従来技術から予測できなかった。さらに、コロニー数に注目すると、Ｇ４１８のみに耐性のコロニーの数は、ＮＴと比較すると、Ｌｉｇ４ではやや減少し、Ｘｒｃｃ５ではやや増加するにすぎない。これに対し、Ｇ４１８及び６−ＴＧ２重耐性コロニーの数は、ＮＴと比較すると、Ｌｉｇ４でもＸｒｃｃ５でも２倍近く増大している。明らかに、Ｌｉｇ４及びＸｒｃｃ５をエンコードする遺伝子の発現抑制は、非相同末端結合の抑制ではなく、なんらかの形で相同組換えそのものを亢進していると考えられる。したがって、本発明は従来技術から予測できない作用効果を奏するといえる。
【００５４】
（６）相同組換え体ＥＳ細胞からの生殖系列伝達キメラマウス作成効率に及ぼすＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理の影響
Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施しないで作成された相同組換え体ＥＳ細胞２１クローンのうち、生殖系列伝達キメラマウス作成によりＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の樹立に成功したのは１２クローンで、生殖系列伝達キメラマウス作成効率は５７．１％であった。これに対し、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施したうえで作成された相同組換え体ＥＳ細胞３５クローンのうち、生殖系列伝達キメラマウス作成によりＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の樹立に成功したのは１９クローンで、生殖系列伝達キメラマウス作成効率は５４．３％であった。したがって、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理は、生殖系列伝達キメラマウス作成効率には影響がないことが示唆された。
【００５５】
（７）相同組換え体ＥＳ細胞由来の遺伝子改変マウス系統における突然変異出現に及ぼすＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理の影響
Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施しないで作成された相同組換え体ＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の数は５８あったが、改変が意図された遺伝子の他に明らかな突然変異を起こしたマウスの系統は１つであった。これに対し、Ｌｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理を実施したうえで作成された相同組換え体ＥＳ細胞由来の染色体を受け継いだ遺伝子改変マウス系統の数は５０だが、改変が意図された遺伝子の他に明らかな突然変異を起こしたマウスの系統はいままでに１つもなかった。そこでＬｉｇ４ｓｉＲＮＡ処理は、ＥＳ細胞へのターゲティングベクターの導入、相同組換え、耐性コロニーの選択、生殖系列伝達キメラマウス作成及び遺伝子改変マウス系統樹立の過程において、突然変異出現頻度を顕著に増大させるものではないことが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップと、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤により前記酵素の遺伝子発現が一過性の抑制状態にある間に、前記ＥＳ細胞の染色体ＤＮＡと相同なヌクレオチド配列を含む外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入して、相同組換えによって前記外来ＤＮＡを安定的に前記ＥＳ細胞の染色体にインテグレーションさせるステップとを含むことを特徴とする、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項２】
前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの核酸化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項３】
前記ＥＳ細胞はマウス由来であり、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＬｉｇ４と、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＸｒｃｃ５とからなるグループから選択される少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とすることを特徴とする、請求項２に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項４】
前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１２又は１３に列挙されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項４に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含むことを特徴とする、遺伝子改変動物の作出方法。
【請求項１】
ＬｉｇａｓｅＩＶと、Ｋｕ８０とからなるグループから選択される、少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、配列特異的遺伝子発現抑制剤をＥＳ細胞に導入するステップと、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤により前記酵素の遺伝子発現が一過性の抑制状態にある間に、前記ＥＳ細胞の染色体ＤＮＡと相同なヌクレオチド配列を含む外来ＤＮＡを前記ＥＳ細胞に導入して、相同組換えによって前記外来ＤＮＡを安定的に前記ＥＳ細胞の染色体にインテグレーションさせるステップとを含むことを特徴とする、ＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項２】
前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの核酸化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項３】
前記ＥＳ細胞はマウス由来であり、前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＬｉｇ４と、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなるマウスＸｒｃｃ５とからなるグループから選択される少なくとも１種類の非相同末端結合に関与する酵素をエンコードする遺伝子を標的とすることを特徴とする、請求項２に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項４】
前記配列特異的遺伝子発現抑制剤は、前記非相同末端結合に関与する酵素の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１２又は１３に列挙されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項４に記載のＥＳ細胞における外来ＤＮＡの相同組換え効率を増大させる方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法により相同組換え体ＥＳ細胞を得るステップを含むことを特徴とする、遺伝子改変動物の作出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−８０８０８（Ｐ２０１２−８０８０８Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２８５２４（Ｐ２０１０−２２８５２４）
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
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