ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド
【課題】本発明の課題は、化学合成法や遺伝子工学的方法により簡単に作製が可能な、ＥｐＣＡＭに結合能を有する新規のペプチドを提供することにある。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、固相化したＥｐＣＡＭタンパク質に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したファージ粒子を回収し、得られたファージ粒子を大腸菌中で増殖させた。次いで、この増殖させたファージ粒子を、再度ＥｐＣＡＭタンパク質に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージクローンを得ることに成功した。このファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアミノ酸配列を特定し、本発明を完成するに至った。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、固相化したＥｐＣＡＭタンパク質に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したファージ粒子を回収し、得られたファージ粒子を大腸菌中で増殖させた。次いで、この増殖させたファージ粒子を、再度ＥｐＣＡＭタンパク質に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージクローンを得ることに成功した。このファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアミノ酸配列を特定し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、かかるペプチドを用いたＥｐＣＡＭの検出・定量方法や、かかるペプチドを含む癌の診断及び／又は治療用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule：ＥｐＣＡＭ）は、１９７９年にG. Riethmuellerにより初めて報告された癌特異的細胞表面抗原タンパク質であり、現在までに知られている癌抗原のなかでも最も重要な癌抗原の一つである。ＥｐＣＡＭは、膜貫通型糖タンパク質であり（非特許文献１）、１７−１Ａ抗原、ＫＳＡ、ＥＧＰ４０、ＧＡ７３３−２、ｋｓ１−４又はｅｓａとも呼ばれている(例えば、非特許文献２)。また、悪性腫瘍患者の血清中ＥｐＣＡＭタンパク質の量を健常者と比較した結果から、悪性腫瘍患者の１０％において有意にＥｐＣＡＭが増加していることが明らかにされている(非特許文献３)。この結果は、ＥｐＣＡＭが腫瘍細胞表面から解離して、体循環中に放出されていることを示しており、ＥｐＣＡＭが血清中の腫瘍マーカーとして利用できる可能性を示唆するものである。これに関連する報告として、ＥｐＣＡＭが細胞増殖を促進するシグナルを誘起する際に、細胞膜上などに存在するプロテアーゼによりＥｐＣＡＭの細胞内ドメインが切り出され、これがＦＨＬ２タンパク質と相互作用することにより、β-catenin/TCF/Lefシグナル伝達経路を活性化することが示されている（特許文献１、非特許文献４）。
【０００３】
既にＥｐＣＡＭを利用した癌ワクチンが開発されており、バキュロウイルス等による昆虫細胞発現系を利用して調製した組換えＥｐＣＡＭタンパク質や、抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原認識部位に結合する抗イディオタイプ抗体ＩＧＮ−１０１(edrecolomab) を用いたワクチン療法が報告されている。また、癌治療用抗ＥｐＣＡＭ抗体も開発され、Adecatumumab（ＭＴ２０１）、ＩＮＧ−１等の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた治験が行われている。これらの抗体を用いた治療では、癌細胞表面上のＥｐＣＡＭに抗体が結合し、生体内の免疫系により細胞性免疫（細胞障害活性）を誘導することにより癌を縮小させることを狙いとしている。さらに、抗ＥｐＣＡＭ抗体による細胞障害活性を高める目的で、抗ＥｐＣＡＭ抗体と緑膿菌外毒素を融合させたProxiniums Vivendiums (ＶＢ４−８４５)や、ＩＬ−２と融合させたＥＭＤ ２７３ ０６６(ｈｕＫＳ−ＩＬ２)や、抗ＣＤ３活性を併せ持つCatumaxomab（ｒｅｍｏｖａｂ）等が開発されている。
【０００４】
さらに、ＥｐＣＡＭを循環癌細胞の表面マーカーとして、磁気ビーズ(非特許文献５)や、ＭＥＭＳデバイス(非特許文献６)に結合させたＥｐＣＡＭ抗体により循環癌細胞の捕捉が試みられている。循環癌細胞は癌の転移と密接な関係にあり、癌患者の予後を予測する指標となりうることから、このような循環癌細胞検出方法の確率は非常に重要である。
【０００５】
抗ＥｐＣＡＭ抗体以外にも、生体内でＥｐＣＡＭと特異的に結合する分子として、αアクチニン、クローディン７、ＣＤ４４のスプライシングバリアントであるＣＤ４４ｖ４‐ｖ７、テトラスパニンの一種であるＤ６．１Ａタンパク質などが知られている (非特許文献７)。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０７／１４１０２９号パンフレット
【非特許文献１】Litvinow et al., J Cell Biology 125: 437-446, 1994
【非特許文献２】Herlyn M et al., Proc Natl Acad SciUSA76: 1438-1442, 1979,
【非特許文献３】Abe H et al., J Immunol Methods 270: 227-233, 2002
【非特許文献４】Baeuerle PA et al., Br J Cancer 96: 417-423, 2007
【非特許文献５】Cohen SJ et al., Clin Colorectal Cancer 6: 125-132, 2006
【非特許文献６】Nagrath S et al., Nature 450: 1235-1239, 2007
【非特許文献７】Kuhn, S. et al., Mol Cancer Res 5: 553-567, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、抗体等のＥｐＣＡＭに特異的に結合する分子は、広く癌の診断・治療に利用できる可能性がある。しかし、これまでに知られている抗体やその他の天然の（生体内に存在する）ＥｐＣＡＭ結合能を有する分子は、単離や調製が難しく、高いコストを必要する。また、培養細胞等を用いたタンパク質調製における有害物のコンタミネーションなどの生物学的なリスクも考えられる。本発明の課題は、化学合成法や遺伝子工学的方法により簡単に作製することができる、ＥｐＣＡＭに結合能を有する新規のペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、固相化したＥｐＣＡＭタンパク質に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したファージ粒子を回収し、得られたファージ粒子を大腸菌中で増殖させた。次いで、この増殖させたファージ粒子を、再度ＥｐＣＡＭタンパク質に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージクローンを得ることに成功した。このファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアミノ酸配列がＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ（配列番号７）であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、（２）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、（３）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（２）記載のペプチドや、（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（２）又は（３）記載のペプチドや、（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されていることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれか記載のペプチドに関する。
【００１０】
また本発明は、（６）検出可能なマーカーで標識された上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドや、（７）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチドや、（８）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ペプチドであることを特徴とする上記（７）記載の融合ペプチドや、（９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（１０）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージや、（１１）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドを認識する抗体や、（１２）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡや、（１３）上記（１２）記載のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターや、（１４）組換えプラスミドベクターである上記（１２）記載の組換えベクターや、（１５）上記（１３）又は（１４）記載の組換えベクターが導入された形質転換体に関する。
【００１２】
また本発明は、（１６）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭの検出・定量方法や、（１７）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離方法や、（１８）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、癌の治療又は診断用組成物や、（１９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムの運搬体に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＥｐＣＡＭに特異的に結合するペプチドは、簡単に化学合成することができ、また、遺伝子工学的手法を用いることで他のタンパク質等と融合させた融合ペプチドを作製することができる。これらのＥｐＣＡＭに特異的に結合するペプチドや融合ペプチドは、ＥｐＣＡＭの検出・定量や、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離に利用できるだけでなく、ＥｐＣＡＭを高発現する癌細胞をターゲットとした癌治療用組成物やドラッグデリバリーシステムの運搬体としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとしては、配列番号７に示されるアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ；以下、「Ｅｐ３０１（ＷＴ）」ということもある）からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド（以下、「Ｅｐ３０１（ＶＴ）」ということもある）であれば特に制限されるものではないが、Ｅｐ３０１（ＶＴ）において「ＥｐＣＡＭに結合能を有する」とは、Ｅｐ３０１（ＷＴ）のＥｐＣＡＭに対する結合能の少なくとも８０％以上の結合能を有することを意味し、Ｅｐ３０１（ＶＴ）としては、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｘａａ（配列番号８；Ｘａａは任意のアミノ酸残基）等の配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されているペプチドを例示することができ、中でも、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｘａａ（配列番号９）等の配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されているペプチドを好適に例示することができ、具体的には、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１０），Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１１），Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１２），Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ（配列番号１３）など、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されているペプチドを、ＥｐＣＡＭへの優れた結合能を有するペプチドとして好適に挙げることができる。
【００１５】
上記本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含され、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とが包含される。本発明のペプチドを合成するには、そのいずれの方法をも採用することができる。上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができ、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００１６】
さらに、上記本発明のペプチドは、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１７】
上記本発明のペプチドは、検出可能なマーカーで標識されていてもよく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られているペプチド標識用のマーカーであれば特に制限されるものではないが、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造や、生物発光化合物や、化学発光化合物や、金属キレート等を具体的に挙げることができる。
【００１８】
また、本発明のペプチドは、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグに結合した融合ペプチドであってもよい。本発明の融合ペプチドとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、上記マーカータンパク質やペプチドタグは従来知られているものであれば特に制限されるものではないが、上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また、上記ペプチドタグとしては、例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチン化ペプチド 、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを具体的に例示することができる。なかでも、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド（Ｅｐ３０１（ＷＴ））とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とを結合させたＭＢＰ−Ｅｐ３０１（ＷＴ）は、後述の実施例でも示されているように、ＥｐＣＡＭへの優れた結合能を有する融合ペプチドであり、特に好例として挙げることができる。以上のような、本発明の標識されたペプチドや融合ペプチドは、常法により作製することができ、本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出の際に有用であるだけでなく、後述するように被検試料中のＥｐＣＡＭを検出・定量やＥｐＣＡＭを発現する細胞の検出・分離等を行う際にも非常に有用である。
【００１９】
さらに、本発明には、上記本発明のペプチドや融合ペプチドを、ＥｐＣＡＭタンパク質と結合させたＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体も含まれる。本発明のＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体としては、本発明のペプチドや融合ペプチドとＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体であれば特に制限されるものではなく、ＥｐＣＡＭと他の分子（タンパク等）との相互作用の検討など、ＥｐＣＡＭの分子レベルでの機能解析に有効に用いることができる。
【００２０】
本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するファージとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるＥｐＣＡＭに結合能を有するファージは、ファージライブラリスクリーニングの過程で、ＥｐＣＡＭに強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより得られる他、本発明のＥｐＣＡＭに結合有するペプチドをコードするＤＮＡを、常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。
【００２１】
本発明のペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、なかでもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかる本発明のペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のペプチド又はその断片を免疫することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。以下に、本発明のペプチドのひとつであるＥｐ３０１（ＷＴ）に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００２２】
上記抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体は、抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、Ｅｐ３０１（ＷＴ）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００２３】
また、上記Ｅｐ３０１（ＷＴ）に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのＥｐ３０１（ＷＴ）を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。さらに、上記抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記Ｅｐ３０１（ＷＴ）を検出・定量等を行うことができる。上記抗体を用いた免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切に挿入することにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが転写できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２５】
上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、シアン蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Red Fluorescence Protein（ＲＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。
【００２６】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつ本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されるものではなく、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）等を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。
【００２７】
本発明のペプチド又は融合ペプチドは、ＥｐＣＡＭの検出・定量に利用することができる。本発明のＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いるものであれば、どのような方法でもよく、検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いる場合は、使用したマーカー等の標識物質の種類に応じて適切な検出・定量手法を選択することができる。また、上記ＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチドと本発明の抗体を組み合わせて行うこともでき、この場合には、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光方法法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法、ウエスタンブロット法等の公知の免疫学的測定方法を選択することができる。
【００２８】
さらに、上記本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いることにより、ＥｐＣＡＭを発現する細胞を検出・分離することができる。ＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離するには、本発明のペプチドと標識された本発明の抗体を組み合わせて用いることができるほか、検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いることもでき、使用したマーカー等の標識物質の種類に応じて適切な分離手法を選択することができる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、効率的かつ高精度のＥｐＣＡＭ発現細胞の分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用してＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離することができる。また、マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いて良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターやマイクロメッシュフィルターを用いてＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離することもできる。
【００２９】
本発明の癌の治療及び／又は診断用組成物としては、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを含むものであれば特に制限されるものではないが、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドに、診断及び／又は治療用作用物質を結合されたものが好ましく、上記用作用物質としては、例えば、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素、リシン毒素等の毒素、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)等のサイトカイン、免疫刺激物質、放射性標識物質、画像処理剤等を挙げることができる。また、本発明には、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを癌の治療用組成物や診断用組成物として使用する方法や、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを癌の治療用組成物や診断用組成物の製造における使用方法も含まれる。
【００３０】
また、上記本発明のペプチド又は融合ペプチドは、ドラッグデリバリーシステムに用いることもできる。ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）とは、癌細胞や標的組織等を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システムを意味するものであり、その中でも特にターゲティング（標的指向）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。ターゲティングＤＤＳの代表的な運搬体として微粒子性キャリアーであるリポソームが挙げられるが、この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法があり、さらに高機能の能動的ターゲティング法として、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法が開発されている。本発明のペプチド又は融合ペプチドをリポソーム膜面上に結合させたＤＤＳ運搬体は、細胞表面上にＥｐＣＡＭを発現する癌細胞をターゲットとしたＤＤＳに用いることができる。また、本発明には、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドをドラッグデリバリーシステムの運搬体として使用する方法や、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドをドラッグデリバリーシステムの運搬体の製造における使用方法も含まれる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチドのスクリーニング］
１．ＥｐＣＡＭコートプレートの作製
ＥｐＣＡＭ細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域の融合タンパク質であるＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質（以下、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃと記載することもある）を用いて、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートを作製した。ＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質（cat# 960-EP、R&D systems社製）は、Phosphate buffered saline （ＰＢＳ：ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇを超純水１０００ｍＬに溶解したもの）を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈した。このＥｐＣＡＭ／Ｆｃ溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（IMMURON 4HBX、Thermo Fisher Scientific社製）に１００μＬ／ウェルとなるように加え、４℃で１晩静置し吸着させた。翌日、溶液を取り除き、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、岩井化学薬品社製）を含むTris Buffered Saline(ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を３００μＬ／ウェルとなるよう加え、３７℃で１時間静置することにより、ブロッキングを行った。その後、０．１％のPolyoxyethylenesorbitan monolaurate（Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ社製）を含むＴＢＳにより１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。また、同様の方法により、ＢＭＰＲII／Ｆｃキメラタンパク質（cat# 811-BR、R&D systems社製）を用いてＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレートを作製した。
【００３３】
２．ファージライブラリを用いたスクリーニング
スクリーニングには、Ph.D 12 peptide phage display kit（Ｄ−１２；New England Biolabs社製）を使用した。このライブラリは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するファージライブラリであり、２．７ｘ１０９種類の多様性を有する。
【００３４】
まず、ヒトＩｇＧ１Ｆｃに結合するファージクローンを取り除く目的で、ＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレートにファージライブラリを結合させた。ファージライブラリを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで希釈し、１．０ｘ１０１１plaque formation unit（ｐｆｕ）／ウェルとなるように、ＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレート加えた後、マイルドミキサー（ＰＡ−１２、タイテック社製）上で穏やかに攪拌しながら室温で１時間反応させた。
【００３５】
次に、反応後の溶液（上清）を採取し、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートに移し、室温で１時間穏やかに攪拌し、ＥｐＣＡＭにファージクローンを結合させた。その後、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートから溶液を取り除き、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で１０回洗浄を行った。ＥｐＣＡＭ／Ｆｃとファージとの結合を解離させるために、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を１００μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温で１０分間穏やかに攪拌した。反応後の溶液をエッペンドルフチューブ（１．５ｍＬ）に回収し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加し中和した。中和後の溶液の一部を用いて解離したファージの力価測定を行い、残りを大腸菌に感染させることにより増幅した。力価測定及びファージの増幅は常法（Phage Display-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い行った。
【００３６】
ファージの増幅の増幅は、次のように行った。対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌｑ△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）］に、得られたファージ溶出液を感染させ、２０ｍＬのＬＢ中で振とう培養を行った。培養は、振とう培養機（ＢＲ−４０ＬＦ、タイテック社製）を用い、３７℃で激しく撹拌しながら４時間３０分行った。ファージ感染菌を含む培養液を遠心チューブ（５０ｍｌクリスタル遠心管、グライナー社製）に移し、ユニバーサル冷却遠心機５９２２（久保田商事、中容量アングルローター）を用いて、４℃、８９００ ｘ ｇで５分間遠心した。遠心後、ＥＲ２７３８菌を取り除き、上清のファージ液を別のチューブに移した。このファージ液に、４ｍＬ（１／５量）の２０％Polyethylene glycol 6000（以下ＰＥＧ６０００、Fluka社製）・ＮａＣｌ（２．５Ｍ）溶液を加え、ミキサー（Ｓ−１００、タイテック社製）により良く撹拌した後に氷上で１時間インキュベートし、ファージを沈殿させた。
【００３７】
インキュベート後のファージ溶液を、ユニバーサル冷却遠心機を用いて、４℃、８９００ ｘ ｇで、１５分間遠心することにより上清を取り除き、さらに、８９００ ｘ ｇで、１分間遠心した。上清を完全に取り除いた後、得られたファージ沈殿に１ｍｌのＴＢＳを加え、氷上で冷却し、穏やかに懸濁した。このファージ懸濁液を、１．５ｍＬ微量遠心管（トレフ社製）に移し、冷却遠心機（５４１５Ｒ及びアングルローターF-45-24-11、エッペンドルフ社製）を用い１３２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を別のチューブに移し、懸濁されない残渣を取り除いた。ファージ懸濁液に再度、２５０μＬの２０％ＰＥＧ６０００・２．５Ｍ ＮａＣｌを加え、ミキサーで良く撹拌した後、氷上で５分間インキュベートしてファージを沈殿させた。次に、冷却遠心機により１３２００ｒｐｍで５分間遠心することによりファージ沈殿を回収した。このようにして得られたファージ沈殿に、２００μｌの０．０２％ＮａＮ３（和光純薬社製）を含むＴＢＳを加え、完全に懸濁させた。懸濁できない残渣は、冷却遠心機により１３２００ｒｐｍで５分間遠心することにより取り除き、得られた濃縮ファージ液の力価を求めた。
【００３８】
３．バイオパニング
以上のような、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに結合するファージの選別実験を複数回繰り返すことにより、結合特異性の高いペプチドを提示しているファージの濃縮を行った。選別作業において、結合・洗浄に用いる緩衝液（ＴＢＳ）中のＴｗｅｅｎ２０の濃度を、２回目の選別作業では０．３％に、３及び４回目では０．５％にした。このように選別条件順次厳しくすることで、より特異性の高いファージを選別した。これらの作業により、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに対して結合するファージが濃縮されているかどうかを確認するため、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートに添加したファージの力価と、最終的に溶出したファージの力価との比を求め選別回数ごとにプロットした。その結果、図１に示すように、３回の選別作業で十分特異性の高いファージが得られていることが確認できた。
【００３９】
４．ファージクローンの配列決定
３回目の選別作業で得られた溶出ファージのクローンの配列を常法（Phage Display A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い決定した。塩基配列の決定は、提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー(−９６ｇIII シーケンシングプライマー：配列番号１）を用いたダイデオキシターミネイト法により行った（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社製）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマン社製）を用いた。３回目の選別作業で得られた溶出ファージ１２クローンについて、ＤＮＡの配列を確認したところ５種類のクローン（ファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７、Ｅｐ３０８）が確認された。それぞれのファージクローンの塩基配列を配列番号２〜６に、予想される提示ペプチドのアミノ酸配列を配列番号７、１４〜１７に示す。また、得られた１２クローンには、ファージクローンＥｐ３０１（配列番号２）と同じＤＮＡ配列のものが７クローン、ファージクローンＥｐ３０８（配列番号６）と同じＤＮＡ配列のものが２クローン含まれていた。また、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列を、ＥｐＣＡＭのアミノ酸配列と比較したところ、図２に示すように、ＥｐＣＡＭの１０６−１１９番目のアミノ酸残基と部分的な相同性を有することが明らかとなった。
【実施例２】
【００４０】
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチドの特徴の決定］
１．結合能
実施例１で得られたファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７及びＥｐ３０８をクローン化し、クローン化状態でのＥｐＣＡＭ／Ｆｃに対する結合能力を評価した。実施例１と同様の方法で、９６ウェルプレートに０．１μｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質を、１００μＬ／ウェルで結合させた、結合能検出用ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートを新たに作製した。結合能検出に用いたファージの力価は１ウェル当たり１．０ｘ１０１０ｐｆｕ、反応及び洗浄には０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを使用した。この実験の結果、ファージクローンＥｐ３０１および、Ｅｐ３０８が強い結合能を示すことが明らかとなった（図３）。
【００４１】
２．特異性
続いて、ファージクローンＥｐ３０１及びＥｐ３０８の結合特異性を確認するため、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃ又はＢＭＰＲ２／Ｆｃによりコートしたプレートと、タンパク質を吸着させていないブロッキングのみを行ったプレート対する、それぞれのファージの結合を調べた。その結果、図４に示すとおり、ファージクローンＥｐ３０１はＥｐＣＡＭ／Ｆｃのみに特異的に結合することが判明した。一方、ファージクローンＥｐ３０８はＥｐＣＡＭ／ＦｃだけでなくＢＭＰＲ２／Ｆｃにも結合したため、ＥｐＣＡＭに対する結合特異性が低いことが確認された。以上の実験により、ファージクローンＥｐ３０１の提示するペプチド（配列番号７）がＥｐＣＡＭに対して特異的に強い結合能を有することが明らかとなった。
【００４２】
３．アラニンスキャン実験
Ｅｐ３０１配列に類似の配列は、他のファージに認められなかったことから、Ｅｐ３０１のＥｐＣＡＭへの結合能に重要なアミノ酸残基を同定することを目的としてアラニンスキャン実験を行った。すなわち、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列（ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ：Ｅｐ３０１（ＷＴ））を１アミノ酸ごとにアラニンへと置換した１２種類のＥｐ３０１変異体（Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｌ３Ａ、Ｑ４Ａ、Ｃ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｎ７Ａ、Ｎ８Ａ、Ｌ９Ａ、Ｃ１０Ａ、Ｗ１１Ａ、Ｐ１２Ａ）を作製し、これらの変異体クローンのＥｐＣＡＭ／Ｆｃへの結合量を検討した。
【００４３】
１２種類の点変異体は、配列番号１８〜２９に示す合成ＤＮＡを用いてＫｕｎｋｅｌ法（Molecular Cloning Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）により作製した。点変異導入の確認は、実施例１と同様の方法でファージＤＮＡの塩基配列を決定することにより行った。また、これらの１２種類の点変異体のＥｐＣＡＭ/Ｆｃへの結合能の測定は、実施例２に示す方法と同様に、結合能検出用ＥｐＣＡＭ/Ｆｃコートプレートを用いて行った。
【００４４】
各点変異体のＥｐＣＡＭ/Ｆｃに対する結合実験の結果を図５に示す。Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｎ７Ａ、Ｐ１２Ａの４種の変異体では、天然型のＥｐ３０１（ＷＴ）と比較して結合能の低下は認められなかったが、それ以外の８種の変異体では結合能が顕著に低下した。これらの結果は、Ｅｐ３０１のＥｐＣＡＭへの結合に、３、４、５、６、８、９、１０、１１番目のアミノ酸が関与している可能性を示唆している。また、前述のように、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列はＥｐＣＡＭの配列の１０６−１１９番目のアミノ酸残基と部分的な相同性を有しているが（図２）、ＥｐＣＡＭと相同性を示した部分のうち、１番目のアミノ酸残基以外、すなわち４、５、１０、１１番目のアミノ酸残基がＥｐＣＡＭへの結合に重要な役割を果たしていることが、この実験で明らかとなった。
【実施例３】
【００４５】
［ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１タンパク質の作製］
本実験で取得したペプチド配列の応用を考慮すると、ファージ上に提示された状態の他に、他のタンパク質の末端などにペプチドを融合して用いる用途が想定される。また、ファージに提示した状態で十分な結合能を有しているペプチドを、合成ペプチドや他のタンパク質の末端などに融合した場合に結合能がしばしば大きく低下することが起こりうる。ファージ上に提示している状態では、たとえばｇＩＩＩｐに提示している場合、ペプチドはファージ粒子当たり約５本提示されており、この多価での提示による、ターゲットへの結合の際におけるエントロピーの寄与、いわゆるAvidity effectが無視できない場合も多く存在する。そこで、今回取得したペプチド提示ファージを元にしてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＮ末端側にペプチドを融合したタンパク質を作製し、ＥｐＣＡＭへの結合能を確認した。
【００４６】
１．発現ベクターの作製
ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１（ＷＴ）及びＭＢＰ融合Ｅｐ３０１（Ｗ１１Ａ）ペプチドの作製用の発現ベクターは、次のように作製した。まず、Ｅｐ３０１（ＷＴ）及びＥｐ３０１（Ｗ１１Ａ）ペプチド提示ファージを作製し、それぞれのファージを大腸菌に感染させ増幅させた後、２本鎖ファージゲノムＤＮＡ抽出した。このファージゲノムＤＮＡを制限酵素Ａｓｐ７１８とＥａｇＩで切断し、ＤＮＡ断片をＭＢＰ融合タンパク作製用ベクターであるｐＭａｌ−ｐＩＩＩベクタープラスミド（ＮＥＢ社製）に、常法（例えば、Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載の方法）に従って挿入した。次に、これらのプラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｃＩで切断し、ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ７系発現系であるｐＥＴ−２０ｂ（＋）ベクター（Ｍｅｒｃｋ社）へ挿入した。このプラスミドによりコードされるタンパク質は、ｇ３ｐシグナル配列-Ｅｐ３０１（ＷＴ）又は（Ｗ１１Ａ）−リンカー配列（ＧＧＧＳ）−ＭＢＰ−Ｈｉｓｘ６タグ配列という形になり、大腸菌において発現を誘導すると、シグナル配列の働きにより細胞質内からペリプラズムへと分泌される。また、その際に、ファージのｇ３ｐシグナル配列が切断され、ＭＢＰのＮ末端にＥｐ３０１（ＷＴ）又は（Ｗ１１Ａ）融合したタンパク質が発現する（配列番号３０及び３１）。また、この２種類のタンパク質と同時に、以降の実験での比較対象用にｐＭａｌ−ｐ２ｘの天然ＭＢＰ遺伝子に相当部分をｐＥＴ−２０ｂ（＋）に組み込んだプラスミドも作製した。
【００４７】
２．形質転換
作製したＴ７発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)（Merck社製）を形質転換させた。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養することによりコロニーを形成させた。このコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むオートインダクション培地（１Ｌあたり、１０ｇのトリプトン（Becton Dickinson社製）、５ｇの酵母エキス（Becton Dickinson社製）、２５ｍＭ (ＮＨ４)２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４, ５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｇのグリセロール、０．５ｇのグルコース、２ｇのα-ラクトースを含：Studier F. W.ら、Protein Expr. Purif.,2005, 41:207-34.を参考にした）２００ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間、振盪培養した。
【００４８】
３．タンパクの精製
培養した形質転換体（菌体）を含む培養液を５０ｍＬチューブ２本に移し、４０００ｘｇで１０分間遠心した。残りの培養液を再度同じ５０ｍＬチューブで遠心し、菌体を全て回収した。回収した菌体に２０％スクロース（ナカライテスク社製）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（３０ｍＭ、ｐＨ８．０）を４０ｍL加え、菌体を再度懸濁させた後、終濃度が１ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えた。これをマイルドミキサー上において室温で穏やかに１０分間攪拌し、４０００ ｘ ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ４を加えて、再度菌体を懸濁し、氷上で１０分間穏やかに攪拌した。その後、８０００ ｘ ｇで１０分間遠心し、ペリプラズム画分と残りの菌体を分離した。その後、分画したタンパク質の安定化のため、ペリプラズム画分溶液に終濃度で１０ｍＭになるように１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。
【００４９】
ＴＡＬＯＮレジン（クロンテック社製）を用いて、採取した分画からＭＢＰ融合ペプチドを精製した。精製は、ＴＡＬＯＮレジンのマニュアル記載の方法に従い、非変性条件、イミダゾール添加による溶出で行った。得られた精製タンパク質はCENTRIPREP-10（ミリポア社製）で限外濾過濃縮を行うと同時に、バッファーをＴＢＳに置換した。得られたタンパク質溶液は使用時まで−８０℃で保存した。また、タンパク質溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、ProtParamプログラム（Gasteiger E. et al. The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005).pp. 571-607）を用いて配列から算出した吸光係数を元に、その濃度を決定した。
【００５０】
４．ＥＬＩＳＡ
以上のようにして得られたＥｐ３０１−ＭＢＰを、ＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質の特異的結合について検討した。
まず、作製した３種類のＭＢＰ融合ペプチドを、ＴＢＳで１０μｇ/ｍＬになるようにそれぞれ希釈した。これらの溶液を、１００μＬ／ウェルとなるようにＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（IMMURON 4HBX）に加え、４℃で一晩静置し吸着させた。１種類のＭＢＰ融合ペプチドにつき３ウェル分を用意した。
【００５１】
反応後のプレートからＭＢＰ溶液を除去し、０．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを、３００μＬ／ウェルとなるように加え、３７℃で１時間静置することによりブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液を除き、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１μｇ／ｍＬになるように希釈したＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質を、１００μＬ／ウェルとなるように加え、マイルドミキサーを用いて室温で穏やかに１時間攪拌した。反応終了後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、二次抗体として、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０００倍希釈した抗ヒトIgG-Fc Horseradish peroxidase conjugate（シグマ社）を１００μＬ／ウェルとなるように加え、マイルドミキサーを用いて室温で穏やかに１時間攪拌した。
【００５２】
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で、再度３回の洗浄を行った後に、発色基質溶液［０．２２ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid：シグマ社製)含有５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）２１ｍＬに、３０％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を３６μＬ加え混合した溶液］を２００ｕＬ／ウェルとなるように添加し、室温で穏やかに攪拌しながら発色させた。１時間後にＭｏｄｅｌ６８０ マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
測定の結果を図６に示す。Ｅｐ３０１（ＷＴ）−ＭＢＰは、ＭＢＰのみ、又はＥｐ３０１（Ｗ１１Ａ）−ＭＢＰよりも顕著に高い吸光度を示したことから、Ｅｐ３０１（ＷＴ）−ＭＢＰは、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに特異的に結合することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｄ−１２ファージライブラリを用いた、ＥｐＣＡＭへのバイオパニングの結果を示す図である。
【図２】本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドＥｐ３０１（ＷＴ）のアミノ酸配列と、ＥｐＣＡＭの１０６−１１９番目のアミノ酸残基とが部分的に相同性を有することを示す図である。
【図３】本発明のファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７及びＥｐ３０８の、ＥｐＣＡＭへの結合の強さを比較した結果を示す図である。
【図４】本発明のファージクローンＥｐ３０１及びＥｐ３０８の結合特異性を、ＥｐＣＡＭ又はＢＭＰＲ２をコートしたプレートを用いて検討した結果を示す図である。
【図５】本発明のＥｐ３０１（ＷＴ）と、その点変異体（Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｌ３Ａ、Ｑ４Ａ、Ｃ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｎ７Ａ、Ｎ８Ａ、Ｌ９Ａ、Ｃ１０Ａ、Ｗ１１Ａ、Ｐ１２Ａ）のＥｐＣＡＭへの結合能を比較した結果を示す図である。
【図６】本発明のＥｐ３０１（ＷＴ）とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合ペプチドであるＥｐ３０１−ＭＢＰが、ＥｐＣＡＭへの結合能を有することを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、かかるペプチドを用いたＥｐＣＡＭの検出・定量方法や、かかるペプチドを含む癌の診断及び／又は治療用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule：ＥｐＣＡＭ）は、１９７９年にG. Riethmuellerにより初めて報告された癌特異的細胞表面抗原タンパク質であり、現在までに知られている癌抗原のなかでも最も重要な癌抗原の一つである。ＥｐＣＡＭは、膜貫通型糖タンパク質であり（非特許文献１）、１７−１Ａ抗原、ＫＳＡ、ＥＧＰ４０、ＧＡ７３３−２、ｋｓ１−４又はｅｓａとも呼ばれている(例えば、非特許文献２)。また、悪性腫瘍患者の血清中ＥｐＣＡＭタンパク質の量を健常者と比較した結果から、悪性腫瘍患者の１０％において有意にＥｐＣＡＭが増加していることが明らかにされている(非特許文献３)。この結果は、ＥｐＣＡＭが腫瘍細胞表面から解離して、体循環中に放出されていることを示しており、ＥｐＣＡＭが血清中の腫瘍マーカーとして利用できる可能性を示唆するものである。これに関連する報告として、ＥｐＣＡＭが細胞増殖を促進するシグナルを誘起する際に、細胞膜上などに存在するプロテアーゼによりＥｐＣＡＭの細胞内ドメインが切り出され、これがＦＨＬ２タンパク質と相互作用することにより、β-catenin/TCF/Lefシグナル伝達経路を活性化することが示されている（特許文献１、非特許文献４）。
【０００３】
既にＥｐＣＡＭを利用した癌ワクチンが開発されており、バキュロウイルス等による昆虫細胞発現系を利用して調製した組換えＥｐＣＡＭタンパク質や、抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原認識部位に結合する抗イディオタイプ抗体ＩＧＮ−１０１(edrecolomab) を用いたワクチン療法が報告されている。また、癌治療用抗ＥｐＣＡＭ抗体も開発され、Adecatumumab（ＭＴ２０１）、ＩＮＧ−１等の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた治験が行われている。これらの抗体を用いた治療では、癌細胞表面上のＥｐＣＡＭに抗体が結合し、生体内の免疫系により細胞性免疫（細胞障害活性）を誘導することにより癌を縮小させることを狙いとしている。さらに、抗ＥｐＣＡＭ抗体による細胞障害活性を高める目的で、抗ＥｐＣＡＭ抗体と緑膿菌外毒素を融合させたProxiniums Vivendiums (ＶＢ４−８４５)や、ＩＬ−２と融合させたＥＭＤ ２７３ ０６６(ｈｕＫＳ−ＩＬ２)や、抗ＣＤ３活性を併せ持つCatumaxomab（ｒｅｍｏｖａｂ）等が開発されている。
【０００４】
さらに、ＥｐＣＡＭを循環癌細胞の表面マーカーとして、磁気ビーズ(非特許文献５)や、ＭＥＭＳデバイス(非特許文献６)に結合させたＥｐＣＡＭ抗体により循環癌細胞の捕捉が試みられている。循環癌細胞は癌の転移と密接な関係にあり、癌患者の予後を予測する指標となりうることから、このような循環癌細胞検出方法の確率は非常に重要である。
【０００５】
抗ＥｐＣＡＭ抗体以外にも、生体内でＥｐＣＡＭと特異的に結合する分子として、αアクチニン、クローディン７、ＣＤ４４のスプライシングバリアントであるＣＤ４４ｖ４‐ｖ７、テトラスパニンの一種であるＤ６．１Ａタンパク質などが知られている (非特許文献７)。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０７／１４１０２９号パンフレット
【非特許文献１】Litvinow et al., J Cell Biology 125: 437-446, 1994
【非特許文献２】Herlyn M et al., Proc Natl Acad SciUSA76: 1438-1442, 1979,
【非特許文献３】Abe H et al., J Immunol Methods 270: 227-233, 2002
【非特許文献４】Baeuerle PA et al., Br J Cancer 96: 417-423, 2007
【非特許文献５】Cohen SJ et al., Clin Colorectal Cancer 6: 125-132, 2006
【非特許文献６】Nagrath S et al., Nature 450: 1235-1239, 2007
【非特許文献７】Kuhn, S. et al., Mol Cancer Res 5: 553-567, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、抗体等のＥｐＣＡＭに特異的に結合する分子は、広く癌の診断・治療に利用できる可能性がある。しかし、これまでに知られている抗体やその他の天然の（生体内に存在する）ＥｐＣＡＭ結合能を有する分子は、単離や調製が難しく、高いコストを必要する。また、培養細胞等を用いたタンパク質調製における有害物のコンタミネーションなどの生物学的なリスクも考えられる。本発明の課題は、化学合成法や遺伝子工学的方法により簡単に作製することができる、ＥｐＣＡＭに結合能を有する新規のペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、固相化したＥｐＣＡＭタンパク質に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したファージ粒子を回収し、得られたファージ粒子を大腸菌中で増殖させた。次いで、この増殖させたファージ粒子を、再度ＥｐＣＡＭタンパク質に接触させるパニング操作を繰り返すことにより、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージクローンを得ることに成功した。このファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するアミノ酸配列がＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ（配列番号７）であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、（２）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、（３）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（２）記載のペプチドや、（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（２）又は（３）記載のペプチドや、（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されていることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれか記載のペプチドに関する。
【００１０】
また本発明は、（６）検出可能なマーカーで標識された上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドや、（７）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチドや、（８）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ペプチドであることを特徴とする上記（７）記載の融合ペプチドや、（９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（１０）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージや、（１１）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドを認識する抗体や、（１２）上記（１）〜（５）のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡや、（１３）上記（１２）記載のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターや、（１４）組換えプラスミドベクターである上記（１２）記載の組換えベクターや、（１５）上記（１３）又は（１４）記載の組換えベクターが導入された形質転換体に関する。
【００１２】
また本発明は、（１６）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭの検出・定量方法や、（１７）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離方法や、（１８）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、癌の治療又は診断用組成物や、（１９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド、若しくは上記（７）又は（８）記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムの運搬体に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＥｐＣＡＭに特異的に結合するペプチドは、簡単に化学合成することができ、また、遺伝子工学的手法を用いることで他のタンパク質等と融合させた融合ペプチドを作製することができる。これらのＥｐＣＡＭに特異的に結合するペプチドや融合ペプチドは、ＥｐＣＡＭの検出・定量や、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離に利用できるだけでなく、ＥｐＣＡＭを高発現する癌細胞をターゲットとした癌治療用組成物やドラッグデリバリーシステムの運搬体としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドとしては、配列番号７に示されるアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ；以下、「Ｅｐ３０１（ＷＴ）」ということもある）からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドや、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド（以下、「Ｅｐ３０１（ＶＴ）」ということもある）であれば特に制限されるものではないが、Ｅｐ３０１（ＶＴ）において「ＥｐＣＡＭに結合能を有する」とは、Ｅｐ３０１（ＷＴ）のＥｐＣＡＭに対する結合能の少なくとも８０％以上の結合能を有することを意味し、Ｅｐ３０１（ＶＴ）としては、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｘａａ（配列番号８；Ｘａａは任意のアミノ酸残基）等の配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されているペプチドを例示することができ、中でも、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｘａａ（配列番号９）等の配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されているペプチドを好適に例示することができ、具体的には、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１０），Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１１），Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号１２），Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ（配列番号１３）など、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されているペプチドを、ＥｐＣＡＭへの優れた結合能を有するペプチドとして好適に挙げることができる。
【００１５】
上記本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含され、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とが包含される。本発明のペプチドを合成するには、そのいずれの方法をも採用することができる。上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができ、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００１６】
さらに、上記本発明のペプチドは、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１７】
上記本発明のペプチドは、検出可能なマーカーで標識されていてもよく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られているペプチド標識用のマーカーであれば特に制限されるものではないが、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造や、生物発光化合物や、化学発光化合物や、金属キレート等を具体的に挙げることができる。
【００１８】
また、本発明のペプチドは、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグに結合した融合ペプチドであってもよい。本発明の融合ペプチドとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、上記マーカータンパク質やペプチドタグは従来知られているものであれば特に制限されるものではないが、上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また、上記ペプチドタグとしては、例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチン化ペプチド 、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを具体的に例示することができる。なかでも、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド（Ｅｐ３０１（ＷＴ））とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とを結合させたＭＢＰ−Ｅｐ３０１（ＷＴ）は、後述の実施例でも示されているように、ＥｐＣＡＭへの優れた結合能を有する融合ペプチドであり、特に好例として挙げることができる。以上のような、本発明の標識されたペプチドや融合ペプチドは、常法により作製することができ、本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出の際に有用であるだけでなく、後述するように被検試料中のＥｐＣＡＭを検出・定量やＥｐＣＡＭを発現する細胞の検出・分離等を行う際にも非常に有用である。
【００１９】
さらに、本発明には、上記本発明のペプチドや融合ペプチドを、ＥｐＣＡＭタンパク質と結合させたＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体も含まれる。本発明のＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体としては、本発明のペプチドや融合ペプチドとＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体であれば特に制限されるものではなく、ＥｐＣＡＭと他の分子（タンパク等）との相互作用の検討など、ＥｐＣＡＭの分子レベルでの機能解析に有効に用いることができる。
【００２０】
本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するファージとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるＥｐＣＡＭに結合能を有するファージは、ファージライブラリスクリーニングの過程で、ＥｐＣＡＭに強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより得られる他、本発明のＥｐＣＡＭに結合有するペプチドをコードするＤＮＡを、常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。
【００２１】
本発明のペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、なかでもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかる本発明のペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のペプチド又はその断片を免疫することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。以下に、本発明のペプチドのひとつであるＥｐ３０１（ＷＴ）に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００２２】
上記抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体は、抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、Ｅｐ３０１（ＷＴ）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００２３】
また、上記Ｅｐ３０１（ＷＴ）に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのＥｐ３０１（ＷＴ）を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。さらに、上記抗Ｅｐ３０１（ＷＴ）モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記Ｅｐ３０１（ＷＴ）を検出・定量等を行うことができる。上記抗体を用いた免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切に挿入することにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが転写できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２５】
上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、シアン蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Red Fluorescence Protein（ＲＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。
【００２６】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつ本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されるものではなく、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）等を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。
【００２７】
本発明のペプチド又は融合ペプチドは、ＥｐＣＡＭの検出・定量に利用することができる。本発明のＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いるものであれば、どのような方法でもよく、検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いる場合は、使用したマーカー等の標識物質の種類に応じて適切な検出・定量手法を選択することができる。また、上記ＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチドと本発明の抗体を組み合わせて行うこともでき、この場合には、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光方法法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法、ウエスタンブロット法等の公知の免疫学的測定方法を選択することができる。
【００２８】
さらに、上記本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いることにより、ＥｐＣＡＭを発現する細胞を検出・分離することができる。ＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離するには、本発明のペプチドと標識された本発明の抗体を組み合わせて用いることができるほか、検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いることもでき、使用したマーカー等の標識物質の種類に応じて適切な分離手法を選択することができる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、効率的かつ高精度のＥｐＣＡＭ発現細胞の分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用してＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離することができる。また、マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いて良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターやマイクロメッシュフィルターを用いてＥｐＣＡＭを発現する細胞を分離することもできる。
【００２９】
本発明の癌の治療及び／又は診断用組成物としては、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを含むものであれば特に制限されるものではないが、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドに、診断及び／又は治療用作用物質を結合されたものが好ましく、上記用作用物質としては、例えば、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素、リシン毒素等の毒素、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)等のサイトカイン、免疫刺激物質、放射性標識物質、画像処理剤等を挙げることができる。また、本発明には、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを癌の治療用組成物や診断用組成物として使用する方法や、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを癌の治療用組成物や診断用組成物の製造における使用方法も含まれる。
【００３０】
また、上記本発明のペプチド又は融合ペプチドは、ドラッグデリバリーシステムに用いることもできる。ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）とは、癌細胞や標的組織等を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システムを意味するものであり、その中でも特にターゲティング（標的指向）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。ターゲティングＤＤＳの代表的な運搬体として微粒子性キャリアーであるリポソームが挙げられるが、この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法があり、さらに高機能の能動的ターゲティング法として、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法が開発されている。本発明のペプチド又は融合ペプチドをリポソーム膜面上に結合させたＤＤＳ運搬体は、細胞表面上にＥｐＣＡＭを発現する癌細胞をターゲットとしたＤＤＳに用いることができる。また、本発明には、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドをドラッグデリバリーシステムの運搬体として使用する方法や、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドをドラッグデリバリーシステムの運搬体の製造における使用方法も含まれる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチドのスクリーニング］
１．ＥｐＣＡＭコートプレートの作製
ＥｐＣＡＭ細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域の融合タンパク質であるＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質（以下、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃと記載することもある）を用いて、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートを作製した。ＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質（cat# 960-EP、R&D systems社製）は、Phosphate buffered saline （ＰＢＳ：ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇを超純水１０００ｍＬに溶解したもの）を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈した。このＥｐＣＡＭ／Ｆｃ溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（IMMURON 4HBX、Thermo Fisher Scientific社製）に１００μＬ／ウェルとなるように加え、４℃で１晩静置し吸着させた。翌日、溶液を取り除き、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、岩井化学薬品社製）を含むTris Buffered Saline(ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を３００μＬ／ウェルとなるよう加え、３７℃で１時間静置することにより、ブロッキングを行った。その後、０．１％のPolyoxyethylenesorbitan monolaurate（Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ社製）を含むＴＢＳにより１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。また、同様の方法により、ＢＭＰＲII／Ｆｃキメラタンパク質（cat# 811-BR、R&D systems社製）を用いてＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレートを作製した。
【００３３】
２．ファージライブラリを用いたスクリーニング
スクリーニングには、Ph.D 12 peptide phage display kit（Ｄ−１２；New England Biolabs社製）を使用した。このライブラリは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するファージライブラリであり、２．７ｘ１０９種類の多様性を有する。
【００３４】
まず、ヒトＩｇＧ１Ｆｃに結合するファージクローンを取り除く目的で、ＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレートにファージライブラリを結合させた。ファージライブラリを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで希釈し、１．０ｘ１０１１plaque formation unit（ｐｆｕ）／ウェルとなるように、ＢＭＰＲII／Ｆｃコートプレート加えた後、マイルドミキサー（ＰＡ−１２、タイテック社製）上で穏やかに攪拌しながら室温で１時間反応させた。
【００３５】
次に、反応後の溶液（上清）を採取し、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートに移し、室温で１時間穏やかに攪拌し、ＥｐＣＡＭにファージクローンを結合させた。その後、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートから溶液を取り除き、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で１０回洗浄を行った。ＥｐＣＡＭ／Ｆｃとファージとの結合を解離させるために、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を１００μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温で１０分間穏やかに攪拌した。反応後の溶液をエッペンドルフチューブ（１．５ｍＬ）に回収し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加し中和した。中和後の溶液の一部を用いて解離したファージの力価測定を行い、残りを大腸菌に感染させることにより増幅した。力価測定及びファージの増幅は常法（Phage Display-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い行った。
【００３６】
ファージの増幅の増幅は、次のように行った。対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌｑ△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）］に、得られたファージ溶出液を感染させ、２０ｍＬのＬＢ中で振とう培養を行った。培養は、振とう培養機（ＢＲ−４０ＬＦ、タイテック社製）を用い、３７℃で激しく撹拌しながら４時間３０分行った。ファージ感染菌を含む培養液を遠心チューブ（５０ｍｌクリスタル遠心管、グライナー社製）に移し、ユニバーサル冷却遠心機５９２２（久保田商事、中容量アングルローター）を用いて、４℃、８９００ ｘ ｇで５分間遠心した。遠心後、ＥＲ２７３８菌を取り除き、上清のファージ液を別のチューブに移した。このファージ液に、４ｍＬ（１／５量）の２０％Polyethylene glycol 6000（以下ＰＥＧ６０００、Fluka社製）・ＮａＣｌ（２．５Ｍ）溶液を加え、ミキサー（Ｓ−１００、タイテック社製）により良く撹拌した後に氷上で１時間インキュベートし、ファージを沈殿させた。
【００３７】
インキュベート後のファージ溶液を、ユニバーサル冷却遠心機を用いて、４℃、８９００ ｘ ｇで、１５分間遠心することにより上清を取り除き、さらに、８９００ ｘ ｇで、１分間遠心した。上清を完全に取り除いた後、得られたファージ沈殿に１ｍｌのＴＢＳを加え、氷上で冷却し、穏やかに懸濁した。このファージ懸濁液を、１．５ｍＬ微量遠心管（トレフ社製）に移し、冷却遠心機（５４１５Ｒ及びアングルローターF-45-24-11、エッペンドルフ社製）を用い１３２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を別のチューブに移し、懸濁されない残渣を取り除いた。ファージ懸濁液に再度、２５０μＬの２０％ＰＥＧ６０００・２．５Ｍ ＮａＣｌを加え、ミキサーで良く撹拌した後、氷上で５分間インキュベートしてファージを沈殿させた。次に、冷却遠心機により１３２００ｒｐｍで５分間遠心することによりファージ沈殿を回収した。このようにして得られたファージ沈殿に、２００μｌの０．０２％ＮａＮ３（和光純薬社製）を含むＴＢＳを加え、完全に懸濁させた。懸濁できない残渣は、冷却遠心機により１３２００ｒｐｍで５分間遠心することにより取り除き、得られた濃縮ファージ液の力価を求めた。
【００３８】
３．バイオパニング
以上のような、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに結合するファージの選別実験を複数回繰り返すことにより、結合特異性の高いペプチドを提示しているファージの濃縮を行った。選別作業において、結合・洗浄に用いる緩衝液（ＴＢＳ）中のＴｗｅｅｎ２０の濃度を、２回目の選別作業では０．３％に、３及び４回目では０．５％にした。このように選別条件順次厳しくすることで、より特異性の高いファージを選別した。これらの作業により、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに対して結合するファージが濃縮されているかどうかを確認するため、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートに添加したファージの力価と、最終的に溶出したファージの力価との比を求め選別回数ごとにプロットした。その結果、図１に示すように、３回の選別作業で十分特異性の高いファージが得られていることが確認できた。
【００３９】
４．ファージクローンの配列決定
３回目の選別作業で得られた溶出ファージのクローンの配列を常法（Phage Display A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い決定した。塩基配列の決定は、提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー(−９６ｇIII シーケンシングプライマー：配列番号１）を用いたダイデオキシターミネイト法により行った（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社製）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマン社製）を用いた。３回目の選別作業で得られた溶出ファージ１２クローンについて、ＤＮＡの配列を確認したところ５種類のクローン（ファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７、Ｅｐ３０８）が確認された。それぞれのファージクローンの塩基配列を配列番号２〜６に、予想される提示ペプチドのアミノ酸配列を配列番号７、１４〜１７に示す。また、得られた１２クローンには、ファージクローンＥｐ３０１（配列番号２）と同じＤＮＡ配列のものが７クローン、ファージクローンＥｐ３０８（配列番号６）と同じＤＮＡ配列のものが２クローン含まれていた。また、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列を、ＥｐＣＡＭのアミノ酸配列と比較したところ、図２に示すように、ＥｐＣＡＭの１０６−１１９番目のアミノ酸残基と部分的な相同性を有することが明らかとなった。
【実施例２】
【００４０】
［ＥｐＣＡＭ結合ペプチドの特徴の決定］
１．結合能
実施例１で得られたファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７及びＥｐ３０８をクローン化し、クローン化状態でのＥｐＣＡＭ／Ｆｃに対する結合能力を評価した。実施例１と同様の方法で、９６ウェルプレートに０．１μｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質を、１００μＬ／ウェルで結合させた、結合能検出用ＥｐＣＡＭ／Ｆｃコートプレートを新たに作製した。結合能検出に用いたファージの力価は１ウェル当たり１．０ｘ１０１０ｐｆｕ、反応及び洗浄には０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを使用した。この実験の結果、ファージクローンＥｐ３０１および、Ｅｐ３０８が強い結合能を示すことが明らかとなった（図３）。
【００４１】
２．特異性
続いて、ファージクローンＥｐ３０１及びＥｐ３０８の結合特異性を確認するため、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃ又はＢＭＰＲ２／Ｆｃによりコートしたプレートと、タンパク質を吸着させていないブロッキングのみを行ったプレート対する、それぞれのファージの結合を調べた。その結果、図４に示すとおり、ファージクローンＥｐ３０１はＥｐＣＡＭ／Ｆｃのみに特異的に結合することが判明した。一方、ファージクローンＥｐ３０８はＥｐＣＡＭ／ＦｃだけでなくＢＭＰＲ２／Ｆｃにも結合したため、ＥｐＣＡＭに対する結合特異性が低いことが確認された。以上の実験により、ファージクローンＥｐ３０１の提示するペプチド（配列番号７）がＥｐＣＡＭに対して特異的に強い結合能を有することが明らかとなった。
【００４２】
３．アラニンスキャン実験
Ｅｐ３０１配列に類似の配列は、他のファージに認められなかったことから、Ｅｐ３０１のＥｐＣＡＭへの結合能に重要なアミノ酸残基を同定することを目的としてアラニンスキャン実験を行った。すなわち、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列（ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ：Ｅｐ３０１（ＷＴ））を１アミノ酸ごとにアラニンへと置換した１２種類のＥｐ３０１変異体（Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｌ３Ａ、Ｑ４Ａ、Ｃ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｎ７Ａ、Ｎ８Ａ、Ｌ９Ａ、Ｃ１０Ａ、Ｗ１１Ａ、Ｐ１２Ａ）を作製し、これらの変異体クローンのＥｐＣＡＭ／Ｆｃへの結合量を検討した。
【００４３】
１２種類の点変異体は、配列番号１８〜２９に示す合成ＤＮＡを用いてＫｕｎｋｅｌ法（Molecular Cloning Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）により作製した。点変異導入の確認は、実施例１と同様の方法でファージＤＮＡの塩基配列を決定することにより行った。また、これらの１２種類の点変異体のＥｐＣＡＭ/Ｆｃへの結合能の測定は、実施例２に示す方法と同様に、結合能検出用ＥｐＣＡＭ/Ｆｃコートプレートを用いて行った。
【００４４】
各点変異体のＥｐＣＡＭ/Ｆｃに対する結合実験の結果を図５に示す。Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｎ７Ａ、Ｐ１２Ａの４種の変異体では、天然型のＥｐ３０１（ＷＴ）と比較して結合能の低下は認められなかったが、それ以外の８種の変異体では結合能が顕著に低下した。これらの結果は、Ｅｐ３０１のＥｐＣＡＭへの結合に、３、４、５、６、８、９、１０、１１番目のアミノ酸が関与している可能性を示唆している。また、前述のように、Ｅｐ３０１のアミノ酸配列はＥｐＣＡＭの配列の１０６−１１９番目のアミノ酸残基と部分的な相同性を有しているが（図２）、ＥｐＣＡＭと相同性を示した部分のうち、１番目のアミノ酸残基以外、すなわち４、５、１０、１１番目のアミノ酸残基がＥｐＣＡＭへの結合に重要な役割を果たしていることが、この実験で明らかとなった。
【実施例３】
【００４５】
［ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１タンパク質の作製］
本実験で取得したペプチド配列の応用を考慮すると、ファージ上に提示された状態の他に、他のタンパク質の末端などにペプチドを融合して用いる用途が想定される。また、ファージに提示した状態で十分な結合能を有しているペプチドを、合成ペプチドや他のタンパク質の末端などに融合した場合に結合能がしばしば大きく低下することが起こりうる。ファージ上に提示している状態では、たとえばｇＩＩＩｐに提示している場合、ペプチドはファージ粒子当たり約５本提示されており、この多価での提示による、ターゲットへの結合の際におけるエントロピーの寄与、いわゆるAvidity effectが無視できない場合も多く存在する。そこで、今回取得したペプチド提示ファージを元にしてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＮ末端側にペプチドを融合したタンパク質を作製し、ＥｐＣＡＭへの結合能を確認した。
【００４６】
１．発現ベクターの作製
ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１（ＷＴ）及びＭＢＰ融合Ｅｐ３０１（Ｗ１１Ａ）ペプチドの作製用の発現ベクターは、次のように作製した。まず、Ｅｐ３０１（ＷＴ）及びＥｐ３０１（Ｗ１１Ａ）ペプチド提示ファージを作製し、それぞれのファージを大腸菌に感染させ増幅させた後、２本鎖ファージゲノムＤＮＡ抽出した。このファージゲノムＤＮＡを制限酵素Ａｓｐ７１８とＥａｇＩで切断し、ＤＮＡ断片をＭＢＰ融合タンパク作製用ベクターであるｐＭａｌ−ｐＩＩＩベクタープラスミド（ＮＥＢ社製）に、常法（例えば、Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載の方法）に従って挿入した。次に、これらのプラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｃＩで切断し、ＭＢＰ融合Ｅｐ３０１をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ７系発現系であるｐＥＴ−２０ｂ（＋）ベクター（Ｍｅｒｃｋ社）へ挿入した。このプラスミドによりコードされるタンパク質は、ｇ３ｐシグナル配列-Ｅｐ３０１（ＷＴ）又は（Ｗ１１Ａ）−リンカー配列（ＧＧＧＳ）−ＭＢＰ−Ｈｉｓｘ６タグ配列という形になり、大腸菌において発現を誘導すると、シグナル配列の働きにより細胞質内からペリプラズムへと分泌される。また、その際に、ファージのｇ３ｐシグナル配列が切断され、ＭＢＰのＮ末端にＥｐ３０１（ＷＴ）又は（Ｗ１１Ａ）融合したタンパク質が発現する（配列番号３０及び３１）。また、この２種類のタンパク質と同時に、以降の実験での比較対象用にｐＭａｌ−ｐ２ｘの天然ＭＢＰ遺伝子に相当部分をｐＥＴ−２０ｂ（＋）に組み込んだプラスミドも作製した。
【００４７】
２．形質転換
作製したＴ７発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)（Merck社製）を形質転換させた。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養することによりコロニーを形成させた。このコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むオートインダクション培地（１Ｌあたり、１０ｇのトリプトン（Becton Dickinson社製）、５ｇの酵母エキス（Becton Dickinson社製）、２５ｍＭ (ＮＨ４)２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４, ５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｇのグリセロール、０．５ｇのグルコース、２ｇのα-ラクトースを含：Studier F. W.ら、Protein Expr. Purif.,2005, 41:207-34.を参考にした）２００ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間、振盪培養した。
【００４８】
３．タンパクの精製
培養した形質転換体（菌体）を含む培養液を５０ｍＬチューブ２本に移し、４０００ｘｇで１０分間遠心した。残りの培養液を再度同じ５０ｍＬチューブで遠心し、菌体を全て回収した。回収した菌体に２０％スクロース（ナカライテスク社製）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（３０ｍＭ、ｐＨ８．０）を４０ｍL加え、菌体を再度懸濁させた後、終濃度が１ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えた。これをマイルドミキサー上において室温で穏やかに１０分間攪拌し、４０００ ｘ ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ４を加えて、再度菌体を懸濁し、氷上で１０分間穏やかに攪拌した。その後、８０００ ｘ ｇで１０分間遠心し、ペリプラズム画分と残りの菌体を分離した。その後、分画したタンパク質の安定化のため、ペリプラズム画分溶液に終濃度で１０ｍＭになるように１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。
【００４９】
ＴＡＬＯＮレジン（クロンテック社製）を用いて、採取した分画からＭＢＰ融合ペプチドを精製した。精製は、ＴＡＬＯＮレジンのマニュアル記載の方法に従い、非変性条件、イミダゾール添加による溶出で行った。得られた精製タンパク質はCENTRIPREP-10（ミリポア社製）で限外濾過濃縮を行うと同時に、バッファーをＴＢＳに置換した。得られたタンパク質溶液は使用時まで−８０℃で保存した。また、タンパク質溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、ProtParamプログラム（Gasteiger E. et al. The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005).pp. 571-607）を用いて配列から算出した吸光係数を元に、その濃度を決定した。
【００５０】
４．ＥＬＩＳＡ
以上のようにして得られたＥｐ３０１−ＭＢＰを、ＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質の特異的結合について検討した。
まず、作製した３種類のＭＢＰ融合ペプチドを、ＴＢＳで１０μｇ/ｍＬになるようにそれぞれ希釈した。これらの溶液を、１００μＬ／ウェルとなるようにＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（IMMURON 4HBX）に加え、４℃で一晩静置し吸着させた。１種類のＭＢＰ融合ペプチドにつき３ウェル分を用意した。
【００５１】
反応後のプレートからＭＢＰ溶液を除去し、０．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを、３００μＬ／ウェルとなるように加え、３７℃で１時間静置することによりブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液を除き、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１μｇ／ｍＬになるように希釈したＥｐＣＡＭ／Ｆｃキメラタンパク質を、１００μＬ／ウェルとなるように加え、マイルドミキサーを用いて室温で穏やかに１時間攪拌した。反応終了後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、二次抗体として、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０００倍希釈した抗ヒトIgG-Fc Horseradish peroxidase conjugate（シグマ社）を１００μＬ／ウェルとなるように加え、マイルドミキサーを用いて室温で穏やかに１時間攪拌した。
【００５２】
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１５０μＬ／ウェル）で、再度３回の洗浄を行った後に、発色基質溶液［０．２２ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid：シグマ社製)含有５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）２１ｍＬに、３０％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を３６μＬ加え混合した溶液］を２００ｕＬ／ウェルとなるように添加し、室温で穏やかに攪拌しながら発色させた。１時間後にＭｏｄｅｌ６８０ マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
測定の結果を図６に示す。Ｅｐ３０１（ＷＴ）−ＭＢＰは、ＭＢＰのみ、又はＥｐ３０１（Ｗ１１Ａ）−ＭＢＰよりも顕著に高い吸光度を示したことから、Ｅｐ３０１（ＷＴ）−ＭＢＰは、ＥｐＣＡＭ／Ｆｃに特異的に結合することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｄ−１２ファージライブラリを用いた、ＥｐＣＡＭへのバイオパニングの結果を示す図である。
【図２】本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドＥｐ３０１（ＷＴ）のアミノ酸配列と、ＥｐＣＡＭの１０６−１１９番目のアミノ酸残基とが部分的に相同性を有することを示す図である。
【図３】本発明のファージクローンＥｐ３０１、Ｅｐ３０５、Ｅｐ３０６、Ｅｐ３０７及びＥｐ３０８の、ＥｐＣＡＭへの結合の強さを比較した結果を示す図である。
【図４】本発明のファージクローンＥｐ３０１及びＥｐ３０８の結合特異性を、ＥｐＣＡＭ又はＢＭＰＲ２をコートしたプレートを用いて検討した結果を示す図である。
【図５】本発明のＥｐ３０１（ＷＴ）と、その点変異体（Ｋ１Ａ、Ｓ２Ａ、Ｌ３Ａ、Ｑ４Ａ、Ｃ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｎ７Ａ、Ｎ８Ａ、Ｌ９Ａ、Ｃ１０Ａ、Ｗ１１Ａ、Ｐ１２Ａ）のＥｐＣＡＭへの結合能を比較した結果を示す図である。
【図６】本発明のＥｐ３０１（ＷＴ）とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合ペプチドであるＥｐ３０１−ＭＢＰが、ＥｐＣＡＭへの結合能を有することを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項３】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項２又は３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のペプチド。
【請求項６】
検出可能なマーカーで標識された請求項１〜５のいずれか記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項８】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ペプチドであることを特徴とする請求項７記載の融合ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージ。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドを認識する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２記載のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項１４】
組換えプラスミドベクターである請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭの検出・定量方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、癌の治療又は診断用組成物。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムの運搬体。
【請求項１】
配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項３】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、４、５、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、３、４、５、６、８、９、１０及び１１番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項２又は３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１番目のリジン、２番目のセリン、７番目のアスパラギン及び１２番目のプロリンのうち、少なくとも１以上のアミノ酸がアラニンに置換されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載のペプチド。
【請求項６】
検出可能なマーカーで標識された請求項１〜５のいずれか記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項８】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ペプチドであることを特徴とする請求項７記載の融合ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージ。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドを認識する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２記載のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項１４】
組換えプラスミドベクターである請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭの検出・定量方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の分離方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、癌の治療又は診断用組成物。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド、若しくは請求項７又は８記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムの運搬体。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１９３７２８（Ｐ２０１１−１９３７２８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８５８１９（Ｐ２００８−１８５８１９）
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（０００００６２３１）株式会社村田製作所 (3,635)
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（０００００６２３１）株式会社村田製作所 (3,635)
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
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