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FABMS測定の前処理方法
説明

FABMS測定の前処理方法

【課題】FABMS測定を行う際の分子イオンピークの分裂を防ぐことで、分子イオンピークのS/N比の低下を防止し、分子イオンピークの強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができるFABMS測定の前処理方法を提供する。
【解決手段】試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うFABMS測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む試料と、軽水素を含むマトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合した状態で質量分析を行う。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、FABMS測定の前処理方法に関し、詳しくは、分子内の交換性の水素原子が、高純度にHにて標識されたアミノ酸等の難揮発性物質を試料としてFABMS測定を行う際の前処理方法に関する。
【背景技術】
【0002】
熱分解性・難揮発性物質を質量分析する際のイオン化にFAB法を使用する方法、すなわちFABMS法が知られている。FAB法では、試料をグリセロール等の粘性のある有機化合物(マトリックス)と混合し、その混合液にキセノンやアルゴン等の原子を衝突させイオン化を行う。マトリックスとしては、グリセロール、チオグリセリン、3−ニトロベンジルアルコール等が実用的なマトリックスとして知られており、試料の性質に合わせてマトリックスを選定することが質の高いマススペクトルを得る上で、非常に重要な要因であると言える(例えば、非特許文献1参照。)。
【0003】
しかし、いずれのマトリックスも非常に粘性の高い物質であり、試料が固体試料の場合には、それをマトリックスと直接混合しても、均一な試料溶液を得ることが困難であるため、通常は、試料とマトリックスとの混合は、両者が溶解する溶媒を介して行われることが多い。すなわち、試料及びマトリックスが共に溶解する溶媒とマトリックスとをあらかじめ混合してマトリックス溶液とし、このマトリックス溶液に試料を混合するようにしている。
【0004】
また、FAB法は、最も一般的なイオン化方法であるEI(Electron Ionization)法に比較するとイオン化の機構がソフトであり、分子イオン(正確にはプロトン化分子:[M+H]や脱プロトン化分子:[M−H]。以下同様)が出現しやすいといった特徴がある。イオン化により生成するイオンの内、フラグメントイオンは、分子内の特定の部位に関する情報のみを与える。一方、分子イオンは、分子の分子量等の分子全体にわたる情報を与えてくれる。このためFAB法は、化合物全体にわたる情報を得るためのイオン化法として汎用性があり、優れた方法であるといえる。
【非特許文献1】YOKUDEL−FAB−Matrix[FAB測定用マトリックス]〜FAB測定のノウハウ、日本電子データム株式会社、2004年7月1日(第2版)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
分子全体の情報を得るため、すなわち、分子イオンを得るためのイオン化手段として、FAB法は優れた方法であるものの、試料が交換性重水素を含む場合には、試料とマトリックス溶液とを混合することで、マトリックス溶液中の交換性の軽水素(多くの場合、マトリックス溶液は交換性の軽水素を含んでいる。)と試料中の交換性重水素との同位体交換反応によって試料の質量数が変化することが生じていた。
【0006】
この質量の変化(低質量数側へのシフト)は、試料中のすべての試料分子のすべての交換性重水素に対して確実に起こるものであれば、質量シフトにより分子イオンがマトリックス由来ピーク等と重ならない限り特段の問題はない。しかし、マトリックス溶液の種類や混合方法によっては、この交換反応が部分的にしか進行しないといったことも起こりえる。この場合、試料の分子イオンピークは、複数の質量数に分散して検出される(分子イオンピークの分裂)こととなるため、ピークのS/N比が低下してしまうなどの不都合が生じていた。
【0007】
そこで、本発明は、FABMS測定を行う際の分子イオンピークの分裂を防ぐことで、分子イオンピークのS/N比の低下を防止し、分子イオンピークの強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができるFABMS測定の前処理方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記目的を達成するため、本発明のFABMS測定の前処理方法は、試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うFABMS測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む試料と、軽水素を含むマトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合することを特徴としている。
【0009】
また、本発明のFABMS測定の前処理方法における前記試料中の交換性重水素の軽水素への置き換えは、交換性軽水素を含む溶媒に前記試料を溶解した後、乾燥させて前記溶媒を除去することにより行うことができる。
【発明の効果】
【0010】
本発明のFABMS測定の前処理方法によれば、分子内の交換性の水素原子が高純度にHにて標識されたアミノ酸等の難揮発性物質を試料としてFABMS測定を実施する際に、あらかじめ交換性重水素をすべて軽水素に置き換える前処理を行うことで、試料分子イオンのピークの分裂を効果的に抑制することが可能となり、分子イオンピークのS/N比を低下させることがなく、強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
本発明は、分子内のすべての水素原子が高純度に重水素(H)にて標識されたアミノ酸等の試料をマトリックス溶液に混合してFABMS測定を実施する前に、分子内の交換性の重水素をすべて軽水素に(H)に置き換える操作を行う。この交換性重水素の軽水素への置き換えは、試料中の交換性重水素の量に比べて十分に多量の交換性軽水素を含み、かつ、試料が溶解する溶媒を用いて行うことができる。
【0012】
例えば、試料中の交換性重水素の数に対して10倍程度の交換性軽水素を含む溶媒に試料を混合、溶解させて所定時間、例えば1時間以上放置することにより、試料中の交換性重水素のすべてを軽水素に置換する。なお、放置時間は、試料の種類や交換性重水素の量、溶媒の種類や交換性軽水素の含有量、その他の条件に応じて適宜設定すればよい。
【0013】
試料中の交換性重水素を軽水素に完全に置き換えた後、溶媒を蒸発させて試料を乾燥させ、試料から溶媒を除去する。溶媒の蒸発は、加熱等の任意の方法で行うことができるが、熱分解性を有する試料の場合は、分解温度を下回る温度で加熱し、ゆっくり蒸発させる必要がある。
【0014】
このようにして分子内の交換性重水素を軽水素に置き換えた試料を、通常の試料と同様にしてマトリックス溶液と混合してFABMS測定を実施することにより、分子イオンピークの分裂がなく、強度が強くて質の高いマススペクトルを取得することができる。
【0015】
なお、軽水素への置き換えに使用する溶媒は、特に限定されるものではなく、試料中の交換性重水素の置き換えに充分な量の交換性軽水素を含み、かつ、試料が溶解するものであればよく、任意の物質を使用することが可能である。代表的な溶媒としては純水(軽純水)が挙げられるが、その他、メタノール、エタノール等のアルコール類、エタノールアミン等のアミン類、酢酸等のカルボン酸類、メチルメルカプタン等のメルカプタン類も使用可能であり、これらを単独で用いてもよく、複数種を混合して用いてもよい。
【実施例】
【0016】
実施例1
試料として、分子内のすべての水素及び窒素を高純度にH及び15Nに標識化したH,15N標識システイン(SH−CH−CH(NH)−COOH)を用いた。また、マトリックス溶液には、10%グリセロール水溶液(水素の殆どが軽水素)を用いた。まず、前記試料1mgを純水(軽水)200μLに溶解し、常温にて1時間放置した。その後、システインが溶解した水溶液を60℃に加熱して溶媒(水)をゆっくり蒸発させて除去した。乾燥後の試料を前記マトリックス溶液に溶解し、通常の操作にて質量分析を行ってFABMSスペクトルを取得した。その結果を図1に示す。
【0017】
ここで、水素、窒素の殆どすべてがH及び15Nであって、それ以外の元素が天然存在比だと考えられるシステインにおいて、最も存在比の大きな分子は、
32H−1212H(15)−121616
であるから、その分子量は129となる。したがって、この分子にプロトン(軽プロトン)が付加したイオンは、M/Z=130に検出される。
【0018】
一方、この試料分子には、SH基、N基、COOH基等の交換性重水素基が存在するので、この試料と前記マトリックス溶液とを単に混合すると、マトリックス溶液中の交換性軽水素と試料中の交換性重水素との同位体交換反応により、試料中の交換性重水素が部分的にマトリックス中の交換性軽水素に置き換わった分子、
32H−1212H(15)−121616H(分子量:128)、
32H−1212H(15)−121616H(分子量:127)、
32H−1212H(15H)−121616H(分子量:126)
等が生じるため、質量数(M/Z):129、128及び127(分子量+1の質量数)にピークが検出されることになる。
【0019】
なお、システインは、分子内に硫黄原子を1つ含むアミノ酸であり、硫黄には安定同位体として32S以外に天然存在比で0.75atom%の33S、4.215atom%の34S及び0.107atom%の36S(残りの95.018atom%が32S)が存在する。したがって、本実施例におけるH,15N標識システインの内で最も存在比の大きな分子の硫黄原子を順に33S、34S及び36Sに置き換えた分子であって、かつ、その分子内の交換性重水素を完全に軽水素へ置き換えた分子の分子量は、順に126、127及び129となり、これらの分子にプロトン(軽プロトン)が付加したイオンは、M/Z=127、128及び130に検出される。つまり、127、128及び130の3つの質量数のピーク強度には、これらのイオンに由来する強度も含まれていることとなる。このため、硫黄が32Sである最も存在比の大きい分子であって、軽水素への置き換えが不完全なものに由来する強度は、実際に観測されたこれらのピーク強度より低いものである。
【0020】
これに対し、前記手順によってすべての交換性重水素を軽水素に置き換えた場合は、
32H−1212H(15N)−121616H(分子量:125)
となっているから、M/Z=126にピークが検出されることになる。
【0021】
図1を見ると、M/Z=120〜130付近では、M/Z=126のところに強いピークが出現し、その他の質量数(M/Z)では、僅かな強度のピークしか出現していないことが分かる。すなわち、交換性重水素を軽水素に置き換える前処理を実施することにより、部分的な同位体交換を起こした分子の分子イオンピークの出現が非常に低く抑えられ、交換性の重水素が完全に軽水素に置き換わった分子イオンピークであるM/Z=126のピークのみを強く出現されることが可能となったことが分かる。つまり、分子イオンピークが複数の質量数に分散することなく、その殆どがM/Z=126のピークとして検出されているため、分子イオンピークのS/N比が低下することなく、質の高いマススペクトルが得られていることが分かる。
【0022】
実施例2
試料として、分子内のすべての水素、炭素及び窒素を高純度にH、13C及び15Nで標識化したセリン(HO−CH−CH(NH)COOH)を用いた。マトリックス溶液及び溶媒には実施例1と同じものを使用し、同じ手順で前処理を行った後、FABMS測定を実施した。得られたマススペクトルを図2に示す。
【0023】
この標識セリンで最も存在比が高い分子は、
16O‐1313H(15131616
であり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はM/Z=117(分子量+1)である。
【0024】
一方、上記標識セリンには、4個の交換性重水素(16O−、−15及び−121616H)が存在するので、部分的にこれらが軽水素に交換すると、交換後の分子に由来するピークがM/Z=116〜114に出現し、完全に軽水素に置き換わった場合には、M/Z=113にピークが出現することになる。
【0025】
図2を見ると、M/Z=113〜117の範囲においては、M/Z=113のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。
【0026】
実施例3
試料として、分子内のすべての水素、炭素及び窒素を高純度にH、13C及び15Nで標識化したシステイン(SH−CH−CH(NH)−COOH)を用いた。マトリックス溶液及び溶媒には実施例1と同じものを使用し、同じ手順で前処理を行った後、FABMS測定を実施した。得られたマススペクトルを図3に示す。
【0027】
この標識システインで最も存在比が高い分子は、
32H−1313H(15)−131616
であり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はM/Z=133(分子量+1)である。
【0028】
一方、上記標識システインには、4個の交換性重水素(32H−、−15及び−C1616H)が存在するので、部分的にこれらが軽水素に交換すると、交換後の分子に由来するピークがM/Z=132〜130の範囲に出現し、完全に軽水素に置き換わった場合には、M/Z=129にピークが出現することになる。
【0029】
図3を見ると、M/Z=129〜133の範囲においては、M/Z=129のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。
【0030】
実施例4
実施例3の操作を5回繰り返して、5回分のマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルからM/Z=129〜133のピークを抽出し、M/Z=129のピーク強度を100とした場合の各ピークの相対強度を算出した。その結果を表1に示す。
【表1】

【0031】
実施例5
試料として分子内のすべての水素及び窒素を高純度にH及び15Nに標識したH,15N標識システインを使用し、軽水素への置き換えの有無によるマススペクトルの差を確認する実験を行った。
【0032】
(1)軽水素への置き換えを行わずに試料1mgをそのまま10%グリセロール水溶液(実施例1と同じ)と混合して溶解させたものに対して通常の操作で質量分析を行い、FABMSスペクトルを取得した。その結果を図4に示す。
【0033】
(2)試料1mgを純水(軽水)200μLに溶解して1時間放置した後、60℃に加熱して溶媒(水)をゆっくり蒸発させて除去することにより軽水素への置き換えを行った。この試料を(1)と同じ10%グリセロール水溶液と混合して溶解させ、(1)と同様にして質量分析を行い、FABMSスペクトルを取得した。その結果を図5に示す。
【0034】
(3)試料1mgをエタノール(交換性水素の殆どすべてが軽水素)200μLに溶解して1時間放置した後、40℃に加熱して溶媒(エタノール)をゆっくり除去することにより軽水素への置き換えを行った。この試料を、(1)と同じ10%グリセロール水溶液と混合して溶解させ、(1)と同様にして質量分析を行い、FABMSスペクトルを取得した。その結果を図6に示す。
【0035】
軽水素への置き換えを行わなかった図4のマススペクトルを見ると、M/Z=120〜130付近に分子イオンピークの分裂に由来する複数のピークが観測され、かつ、S/N比が低下していることが分かる。
【0036】
一方、溶媒として純水やエタノールを用いて軽水素への置き換えを行った図5及び図6のマススペクトルを見ると、M/Z=120〜130付近では、M/Z=126のところに強いピークが出現し、その他の質量数(M/Z)では、僅かな強度のピークしか出現していないことが分かる。
【0037】
このことから、軽水素への置き換えを行うことにより、分子イオンピークが複数の質量数に分散することがなく、その殆どがM/Z=126のピークとして検出されているため、分子イオンピークのS/N比が低下することなく、したがってマススペクトルの質が高く保たれたままであることが分かる。また、軽水素への置き換えを行う際に使用する溶媒の種類によらず、同様の効果が得られることも分かる。
【0038】
実施例6
試料として分子内のすべての水素及び窒素を高純度にH及び15Nに標識したH,15N標識グリシン(CH(NH)−COOH)を使用した以外は、実施例5と同じ手順でマススペクトル(FABMSスペクトル)をそれぞれ取得した。その結果を図7〜図9に示す。
【0039】
H,15N標識グリシンの場合、最も存在比が高い分子は1215121616Hであり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はM/Z=82である。一方、上記標識グリシンには3個の交換性重水素(−15及び−121616H)が存在するので、部分的にこれらが軽水素と交換するとM/Z=81〜80に交換後の分子に由来するピークが出現し、完全に置き換わったものは、M/Z=79にピークが出現することになる。
【0040】
軽水素への置き換えを行わなかった図7のマススペクトルを見ると、M/Z=79〜82において複数のピークが検出され、かつ、S/N比が低下していることが分かる。一方、純水を溶媒として軽水素への置き換えを行った図8、エタノールを溶媒として軽水素への置き換えを行った図9のマススペクトルを見ると、M/Z=79のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。
【0041】
このことから、本実施例においても、溶媒の種類によらず、軽水素への置き換えを行うことによってS/N比に優れ、強度が強い質の高いマススペクトルを取得できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】実施例1で取得したマススペクトルである。
【図2】実施例2で取得したマススペクトルである。
【図3】実施例3で取得したマススペクトルである。
【図4】実施例5において、軽水素への置き換えを行わなかったときのマススペクトルである。
【図5】実施例5において、純水で軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。
【図6】実施例5において、エタノールで軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。
【図7】実施例6において、軽水素への置き換えを行わなかったときのマススペクトルである。
【図8】実施例6において、純水で軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。
【図9】実施例6において、エタノールで軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うFABMS測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む前記試料と、軽水素を含む前記マトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合することを特徴とするFABMS測定の前処理方法。
【請求項2】
前記試料中の交換性重水素の軽水素への置き換えは、交換性軽水素を含む溶媒に前記試料を溶解した後、乾燥させて前記溶媒を除去することにより行うことを特徴とする請求項1記載のFABMS測定の前処理方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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