説明

FC融合体

本発明はin vivoでの使用に適した抗体を基礎とする構造を生成する単純な方法に関する。特に、本発明は、工程:(a)エピトープ結合特異性を有する抗体単一可変ドメインを選択すること;および(b)工程(a)の単一ドメインをエフェクター基と連結することを含む、in vivoでの使用に適した抗体を基礎とする構造を生成するための方法に関する。また本発明の方法を使用することにより生成される分子の使用も記載される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はin vivoでの使用に適した抗体分子を生成する単純な方法に関する。特に、本発明は抗体の単一可変ドメインを基礎とするin vivoでの使用に適した抗体分子の生成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体の抗原結合ドメインは2種類の別個の領域:重鎖可変ドメイン(V)および軽鎖可変ドメイン(V:VκもしくはVλのいずれかであり得る)を含む。抗原結合部位それ自体は6種のポリペプチドループ:Vドメインから3種(H1、H2およびH3)およびVドメインから3種(L1、L2およびL3)によって形成されている。VおよびVドメインをコードするV遺伝子の多様な一次レパートリーは、遺伝子セグメントの組合せによる再編成によって生じる。V遺伝子は3種の遺伝子セグメント、V、DおよびJの組換えによって生じる。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約51種の機能的Vセグメント(CookおよびTomlinson(1995)Immunol Today,16:237)、25種の機能的Dセグメント(Corbettら(1997)J.Mol.Biol.,268:69)および6種の機能的JHセグメント(Ravetchら(1981)Cell,27:583)が存在する。VHセグメントがVHドメインの第1および第2抗原結合ループ(H1およびH2)を形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方、VH、DおよびJHセグメントは組合せてVHドメインの第3抗原結合ループ(H3)を形成する。VL遺伝子はわずか2種類の遺伝子セグメント、VLおよびJLの組換えによって生じる。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約40種の機能的Vκセグメント(SchableおよびZachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler,374:1001)、31種の機能的Vλセグメント(Williamsら(1996)J.Mol.Biol.,264:220;Kawasakiら(1997)Genome Res.,7:250)、5種の機能的Jκセグメント(Hieterら(1982)J.Biol.Chem.,257:1516)および4種の機能的Jλセグメント(VasicekおよびLeder(1990)J.Exp.Med.,172:609)が存在する。VLセグメントがVLドメインの第1および第2抗原結合ループ(L1およびL2)を形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方、VLおよびJLセグメントは組合わせてVLドメインの第3抗原結合ループ(L3)を形成する。この一次レパートリーから選択される抗体は、少なくとも適度な親和性を有するほとんど全ての抗原と結合するのに十分多様であると考えられる。高親和性抗体は、再編成した遺伝子の「親和性成熟」(その際、点突然変異が生成され、改善した結合に基づく免疫系によって選択される)により生じる。
【0003】
抗体の構造および配列の分析は、6種の抗原結合ループの内の5種(H1、H2、L1、L2、L3)は、限られた数の主鎖コンホメーションもしくは標準構造を有することを示している(ChothiaおよびLesk(1987)J.Mol.Biol.,196:901;Chothiaら(1989)Nature,342:877)。主鎖コンホメーションは、(i)抗原結合ループの長さ、ならびに(ii)抗原結合ループおよび抗体フレームワーク中の特定の鍵となる位置における特定の残基、もしくは残基のタイプによって決定される。ループ長および鍵となる残基の分析は、本発明者らが大部分のヒト抗体配列によってコードされるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションを予測することを可能にしてきた(Chothiaら(1992) J.Mol.Biol.,227:799;Tomlinsonら(1995)EMBO J.,14:4628; Williamsら(1996) J.Mol.Biol.,264:220)。H3領域は、配列、長さおよび構造に関して(Dセグメントの使用に起因して)遥かに多様であるが、ループおよび抗体フレームワーク中の鍵となる位置における長さ、および特定の残基もしくは残基のタイプの存在に応じて、短いループ長の限定数の主鎖コンホメーションを形成する(Martinら(1996)J.Mol.Biol.,263:800; Shiraiら(1996)FEBS Letters,399:1)。
【0004】
歴史的に、抗体は、例えばウサギおよび他の動物等の免疫処置による自然発生源から取得されてきた。あるいは分子生物学的技術を使用することもでき、抗体を例えばハイブリッドハイブリドーマの使用を含む技術等を用いて生成することもできる。
【0005】
このようにして選択的なもしくは所望の抗原結合特異性の抗体を生成することができる。このような抗体は、例えばこれらが疾患抗原に対して設計することができるので大きな治療的価値がある。しかし、これらの抗体の製造方法は労力を要し、かつ失敗しやすいだけでなく、ドナーの免疫処置経歴がもたらした多様性に制限されている。例えば合成ライブラリーを用いて、多様性の増加を生じさせることは有利であろう。したがって、当業界において、依然として所望のもしくは予め決定した抗原結合特異性を有する機能的活性抗体分子を生成する単純な方法についてのニーズがある。
【0006】
一般的に軽鎖を含む天然の抗体、モノクローナル抗体もしくはドメインのレパートリーに由来する単一の重鎖可変ドメインが記載されている(EP−A−0368684)。これらの重鎖可変ドメインは1以上の抗原と特異的に相互作用することが示されている(Wardら)。しかし、これらの単一ドメインはin vivoで非常に短い半減期を有することが示されている。したがってこのようなドメインは治療的価値が制限されている。
【0007】
さらに、EP 0 656 946A1は、抗原に特異的に結合する二重鎖免疫グロブリンを記載しており、ここでは重鎖ポリペプチド鎖はCH1重鎖ドメインを欠き、免疫グロブリンも軽鎖ポリペプチド鎖を欠いている。このような抗体はラクダ科の動物(Camelids)で天然に生じるため、このような抗体の抗原特異性はラクダ科の動物によって生成されるものに制限される。
【0008】
H鎖病について実施される研究も注目に値する。この疾患において、重鎖可変ドメイン、CH2およびCH3ドメインを含むが、CH1ドメインおよび軽鎖を欠く免疫グロブリン分子が生成される。このような分子はH鎖病において蓄積することが見出されている(Blockら,Am J.Med,55,61-70(1973), Ellmanら、New Engl.J.Med, 278:95-1201(1968))。したがって、H鎖病の先行技術は、単一の抗原相互作用ドメインタイプ(この場合、重鎖可変ドメイン)のみを含む抗体が疾患に関与していることを教示する。すなわち、先行技術は、ヒト重鎖可変ドメインのみを基礎とする抗体の予防および/または治療のための使用に反する内容を教示する。
【0009】
国際特許出願WO88/09344(Creative Biomolecules)はドメインと連結するためのリンカーを含む抗体構築物を記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、当業界において、依然として予防および/または治療のための使用に適した抗原へのドナーの前暴露によって必ずしも制限されない、所望のもしくは予め決定した抗原結合特異性を有する抗体ベースの分子を生成する単純かつ労力を要しない方法についてのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
発明の概要
本発明者らは、in vivoにおける予防および/または治療のための使用に適する、選択されたエピトープ結合特異性を有する抗体ベースの分子の合成のための単純かつ労力を要しない方法を案出した。重要なことは、この発明の方法が所望のもしくは予め決定したエピトープ結合特異性を有する単一鎖抗体ベースの分子の合成を可能にすることである。この単純な方法の使用は、重鎖のみの抗体の治療的使用に反する内容を教示するH鎖病の先行技術に照らせば驚くべきことである。
【0012】
構造的に、本発明の分子は、定義されたもしくは予め決定したエピトープ結合特異性を有する抗体単一可変ドメインと、1以上の抗体定常領域および/またはヒンジ領域(全体として「エフェクター基」と称する)とを含む。このような分子は単一ドメイン−エフェクター基免疫グロブリン(dAb−エフェクター基)として称され、本発明者らはこのような分子が重要な治療的価値があるものとして考慮する。
【0013】
したがって、第一態様では、本発明は、以下の工程:
(a)エピトープ結合特異性を有する抗体単一可変ドメインを選択すること;および
(b)工程(a)の単一ドメインを免疫グロブリンエフェクター基と連結すること、
を含むin vivoでの使用に適した単一ドメイン−エフェクター基免疫グロブリン(dAb−エフェクター基)を合成する方法を提供する。
【0014】
本発明によれば、抗体単一ドメインがラクダ科の動物以外の抗体単一ドメインであることが好ましい。ヒト起源の単一可変ドメインであるのが有利である。また本明細書中に記載される発明は、CDR(ラクダ科の動物以外(例えばヒト)のCDR)をラクダ科の動物のフレームワーク領域に融合する(grafting)CDRも意図する。ラクダ科の動物のフレームワーク領域へのヒトCDRのCDR融合のための技術は当業界で公知である。このような方法は欧州特許出願0 239 400(Winter)に記載されており、かつフレームワーク改変を含み得る(EP 0 239 400; Riechmann,L.ら,Nature,332, 323-327,1988; Verhoeyen M.ら,Science,239, 1534-1536,1988; Kettleborough,C.A.ら, Protein Engng.,4, 773-783,1991; Maeda,H.ら,Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Gorman S.D.ら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,88, 4181-4185, 1991; Tempest P. R.ら,Bio/Technology,9, 266-271, 1991; Co,M.S.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA,88, 2869-2873, 1991; Carter,P.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA,89, 4285-4289, 1992; Co,M.S.ら, J.Immunol., 148, 1149-1154, 1992; およびSato, K.ら,Cancer Res.,53, 851-856, 1993)。別の実施形態では、単一可変ドメインはラクダ科の動物以外(例えばヒト)のフレームワーク領域(例えば1、2、3もしくは4つのヒトフレームワーク領域)を含む。1以上のヒトフレームワーク領域(カバット(Kabat)により定義される)がヒト生殖細胞系列抗体遺伝子によってコードされるものとアミノ酸レベルで同一であるのが有利である。
【0015】
例えば、免疫学的に興味のある配列のカバットデータベース、または当業者に公知もしくは特定可能な他の抗体配列中の可変領域配列を、本明細書に記載されるdAb-エフェクター基を生成するのに用いることができる。カバットデータベースもしくは他のこういったデータベースには膨大な数の種由来の抗体配列が含まれる。
【0016】
CDRおよびフレームワーク領域は免疫学的に興味のあるタンパク質配列のカバットデータベース中に規定される免疫グロブリン可変ドメインの領域である。好適なヒトフレームワーク領域は、生殖細胞系列遺伝子セグメントであるDP47およびDPK9によってコードされるものである。VまたはVドメインのFW1、FW2およびFW3がDP47またはDPK9由来のFW1、FW2またはFW3の配列を有するのが有利である。ヒトフレームワークは場合により突然変異を含んでもよく、例えば本発明のリガンドに使用されるヒトフレームワーク中に全体として最大約5アミノ酸の変化もしくは最大約10アミノ酸の変化を含む。
【0017】
本発明の方法に従って使用される抗体単一可変ドメインが、少なくとも部分的にヒトの免疫処置により単離されるのが有利である。これらが動物の免疫処置により単離されないのが有利である。
【0018】
1つの実施形態では、単一可変ドメインはWO99/20749に定義されるような一般的なリガンドの結合部位を含む。例えば、一般的なリガンドはプロテインAもしくはプロテインLである。
【0019】
本明細書に定義されるように、「単一ドメイン−エフェクター基免疫グロブリン分子」(dAb−エフェクター基)という用語は、1以上のエピトープと特異的に結合することが可能な単一可変ドメインを含み、1以上の定常領域ドメインおよび/またはヒンジ(全体として「エフェクター基」と称される)と連結される、操作した免疫グロブリン分子をいう。各可変ドメインは重鎖ドメイン(V)もしくは軽鎖ドメイン(V)であってもよい。各軽鎖ドメインはκもしくはλサブグループのいずれかであってもよい。本明細書に記載されるエフェクター基が抗体のFc領域を含むのが有利である。
【0020】
dAb−エフェクター基を結合して多価性構造を形成してもよく、これには以下:ホモダイマー、ヘテロダイマーおよび多量体よりなる群から選択されるもののいずれかが含まれる。このような多量体構造は、複数のエピトープが同一抗原上にある場合に、2以上のエピトープ結合部位を有する多量体構造の長所によって抗原相互作用の結合力(avidity)を改善している。複数のエピトープが異なる抗原上にある(例えば同一細胞の表面上にともに近接している)場合、これらのエピトープはdAb−エフェクター基によって架橋されてもよい。
【0021】
疑いを除くため、本発明によるdAb−エフェクター基はEP−A−0656946に記載されるような二重鎖抗体を含まないだけでなく、これらに開示されるVHH−ヒンジフラグメントといったラクダ科の動物の免疫グロブリンを基礎とする単一鎖フラグメントも含まない。さらに、「dAb−エフェクター基」という用語は、その範囲内にラクダ科の動物内で生成された天然の二重鎖抗体を含まない。また、「dAb−エフェクター基」という用語は、その範囲内に2つの軽鎖および2つの重鎖またはこれらに由来する単一の重鎖もしくは軽鎖を含むIgG抗体分子の四鎖構造も含まない。
【0022】
上述されているように、「in vivoでの使用に適した」という用語は、本発明による「dAb−エフェクター基」が、前記分子が所望の生物学的効果の1以上を産生するのに十分な時間で体内に存在するように、十分な半減期を有することを意味する。この点について、本発明者らはエフェクター基の大きさおよび性質が本発明によるdAb−エフェクター基のin vivo半減期に影響することを見出した。
【0023】
本発明による好適なエフェクター基は、抗体分子のFc領域であるかもしくはこれを含む。このようなエフェクター基は、Fc受容体結合性(例えばFc受容体のCD64およびCD32の1つもしくは両方との)およびClqとの相互作用を介した補体活性化を可能にし、同時に独立した単一可変重鎖ドメインよりも長い半減期を有する分子を提供する。
【0024】
本明細書で使用されるように、「エピトープ」という用語は、1以上の可変ドメイン(例えば免疫グロブリンV/V対)により提供される抗原結合部位によって一般的に結合される構造の単位である。エピトープは抗体の最小結合部位を規定し、したがって抗体の特異性の標的を表わす。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは他の可変ドメインと独立した可変ドメインによって結合される構造の単位を表す。
【0025】
本明細書で使用されるように、(抗体可変ドメインを)「選択する」という用語は、その範囲内に多くの異なる選択肢からの(抗体可変ドメインの)選択を含む。抗体可変ドメインの「選択」のための技術は当業者によく知られているだろう。(抗体可変ドメインの)「選択」という用語は、その範囲内に1以上の可変ドメインのライブラリースクリーニングによる「選択」を含む。選択がファージディスプレイライブラリー(McCaffertyら, (1990) Nature 340, 662-654)もしくはエマルジョンベースのin vitro系(Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6)内のバクテリオファージ表面に呈示される抗体可変ドメインのレパートリーのスクリーニングを含むことが有利である。
【0026】
本明細書で用いられる(本明細書に記載されるように単一ドメインをエフェクター基に)「連結する」という用語は、その範囲内に本明細書に記載される単一ドメインの本明細書に記載される1以上の定常領域への直接的な連結を含む。また、例えば別の基および/またはリンカー領域を介した単一ドメインのエフェクター基への間接的な連結も含まれる。さらに、「連結する」という用語は、dAb−エフェクター基が半減期(すなわち、可変ドメインの血清滞留時間)の増大およびin vivoで利用されるべき定常領域(例えばFc領域など)の機能的な属性を与えるといった生物学的効果を生じることが可能であるようにin vivoで会合が維持されるそれぞれの基の会合をその範囲内に含む。
【0027】
好適な実施形態では、可変ドメインおよびエフェクター基はリンカーを用いることなく直接連結される。
【0028】
リンカーが可変ドメインを1以上の定常領域ドメインと連結することに使用される場合、このリンカーがポリペプチドリンカーであるのが有利である。当業者はリンカーの長さおよび組成がdAb−エフェクター基の物理的特性に影響し得ることを理解するであろう。したがって、より短いリンカーにより互いに関連する各基によって提示される運動の自由度を最小にしてもよいし、より長いリンカーにより運動の自由度をより高めてもよい。同様に、大きなもしくは荷電したアミノ酸により他のドメインに対して1つのドメインの運動を制限してもよい。適切なリンカーの議論はBirdら Science 242, 423-426. Hudsonら,Journal Immunol Methods 231(1999)177-189; Hudsonら, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883で提供される。一例は(Gly Ser)リンカーである(ここでnは1〜8、例えば2、3もしくは4である)。
【0029】
単一可変ドメインのエフェクター基への連結は、本明細書に定義されるようにポリペプチドレベル、すなわちそれぞれのドメインおよび基をコードする核酸の発現後に達成してもよい。あるいは、連結工程を核酸レベルで実行してもよい。連結の方法として、当業者によく知られかつ本明細書に記載されるタンパク質化学および/または分子生物学技術の使用がある。
【0030】
本明細書に定義される「ラクダ科の動物以外の抗体単一可変ドメイン」という用語は、ラクダ科の動物以外の起源の抗体単一可変ドメインを指す。ラクダ科の動物以外の抗体単一可変ドメインは、単一ドメインのレパートリー、例えばファージディスプレイライブラリー中に表されるものから選択してもよい。あるいは、これらは天然の抗体分子に由来してもよい。当業者はラクダ科の動物以外の起源の抗体単一可変ドメインの更なる供与源に気付くであろう。
【0031】
抗体単一可変ドメインは軽鎖可変ドメイン(V)もしくは重鎖可変ドメイン(V)であってもよい。各V鎖可変ドメインはVkappa(Vκ)もしくはVlambda(Vλ)サブグループのものである。選択されるこれらのドメインが軽鎖可変ドメインであるのが有利である。
【0032】
構造的に、単一ドメインエフェクター基は上述されるようにVもしくはVドメインを含んでもよい。
【0033】
本発明の一実施形態によれば、抗体可変ドメイン(VもしくはV)は1以上の抗体重鎖定常領域ドメインに連結される。このような1以上の定常重鎖ドメインは本発明による「エフェクター基」を構成する。
【0034】
一実施形態では、各VもしくはVドメインは抗体のFc領域(エフェクター基)に連結される。本発明によるdAb−エフェクター基がV−Fcであるのが有利である。エフェクター基が抗体のFc領域である場合は、CH3ドメインがdAb−エフェクター基とFc受容体の相互作用を促進する一方でCH2ドメインがdAb−エフェクター基とC1qとの相互作用を可能にして、その結果補体系の活性化を促進する。さらに、本発明者らは、抗体のFc部分がdAb-エフェクター基を安定させ、かつin vivoでの治療および/予防のための使用に適した半減期を有する分子が提供されることを見出した。
【0035】
他の適切なエフェクター基は、以下:少なくとも1つの抗体軽鎖定常領域(CL)を含むエフェクター基、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメイン、もしくはそのあらゆる組合せよりなる群から選択されるもののいずれかを含む。1以上の定常領域ドメインに加えて、エフェクター基はまた抗体のヒンジ領域(IgG分子のCH1とCH2との間で通常みられる領域など)を含んでもよい。本発明の上述の態様における別の実施形態では、エフェクター基はヒンジ領域のみであり、したがってdAb-エフェクター基は抗体分子のヒンジ領域と連結された単一可変ドメインを含む。
【0036】
本発明によれば、本明細書中に記載されるエフェクター基は定常領域ドメインのCH2および/またはCH3であるか、もしくはこれを含む。エフェクター基がCH2および/またはCH3を含み、好ましくは本明細書に記載されるエフェクター基がCH2およびCH3ドメインからなり、場合により本明細書に記載される抗体分子のヒンジ領域と連結されることが有利である。
【0037】
別の態様では、本発明は本発明の方法を用いて取得可能な「dAb−エフェクター基」を提供する。疑いを避けるため、本発明による「dAb−エフェクター基」は、これらの範囲内にIgG分子の四鎖構造も天然のラクダ科の動物の抗体もしくはEP 0 656 946 A1に記載される二重鎖構造のいずれも含まない。
【0038】
抗体単一可変ドメインは軽鎖可変ドメイン(V)もしくは重鎖可変ドメイン(V)であってもよい。各V鎖可変ドメインはVkappa(Vk)もしくはVlambda(Vλ)サブグループのものである。選択されるこれらのドメインが軽鎖可変ドメインであるのが有利である。Vドメインの使用は、これらのドメインは、重鎖可変ドメイン(V)とは違って、単独のVドメインの場合に「粘着性」であり、かつ可溶性の問題を引き起こし得る疎水性界面を有しないという利点を有する。
【0039】
構造的に、本発明による単一ドメイン−エフェクター基免疫グロブリン分子は上述されるようにVもしくはVドメインのいずれかを含む。
【0040】
本発明の上記態様によれば、本発明の方法により取得されるdAb−エフェクター基がV−FcもしくはV−Fcであるのが有利である。dAb−エフェクター基がV−Fcであるのがさらに有利である。この本発明の態様の別の実施形態では、dAb−エフェクター基はV−ヒンジである。さらに別の実施形態では、dAb−エフェクター基はVk−Fcである。本発明者らは、抗体のFc部分が適切な半減期を有する分子を提供するdAb−エフェクター基を安定させることを見出した。
【0041】
この本発明の態様の別の実施形態では、エフェクター基はFab抗体フラグメントを基礎とする。すなわち、Fabフラグメントを構成する1以上の定常領域ドメインと連結されたVドメインもしくはVドメインを含む抗体フラグメントを含む。当業者はこのようなフラグメントが1つの可変ドメインのみを含むことを理解するであろう。このようなFabエフェクター基は図1hに図示されている。
【0042】
本発明の方法によって調製される様々な好ましい「dAb−エフェクター基」が図1に図示されている。
【0043】
本発明のdAb−エフェクター基は、非免疫グロブリンマルチリガンド構造上で結合し、これらが2以上の抗原結合部位を含む多価性構造を形成してもよい。このような構造は抗原結合の結合力を増加させる。このような多量体の一例において、V領域は優れた結合力を与える同一抗原上の異なるエピトープに結合する。別の実施形態では、WO0069907(Medical Research Council)に記載されるように、多価性複合体は、例えば細菌性GroELの環構造もしくは他のシャペロンポリペプチドを基礎とする足場(scaffold)タンパク質上で構築されてもよい。
【0044】
あるいは、本発明によるdAb−エフェクター基は非免疫グロブリン足場タンパク質の不在下で結合されて、もっぱら免疫グロブリンドメインを基礎とする多価性構造を形成してもよい。このような多価性構造は、複数のエピトープ結合部位を含むこれらの効果により、標的分子に対する結合力を増加し得る。このような多価性構造は、ホモダイマー、ヘテロダイマーもしくは多量体であり得る。
【0045】
本発明者らは、本発明のdAb−エフェクター基(および多価性構造など)の予防および/または治療における使用のための特定の使用を考慮する。
【0046】
抗原はポリペプチド、タンパク質もしくは核酸、またはその一部であってもよく、天然または合成のものであってもよい。当業者は、この選択が豊富かつ様々であることを理解するであろう。これらは、例えばヒトもしくは動物タンパク質、サイトカイン、サイトカインレセプター、酵素もしくはDNA結合性タンパク質の酵素補因子であり得る。適切なサイトカインおよび成長因子として、これに限定されるものではないがApoE、Apo−SAA、BDNF、カーディオトロフィン-1、EGF、EGFレセプター、ENA−78、エオタキシン、エオタキシン−2、エクソダス−2、EpoR、酸性FGF、塩基性FGF、繊維芽細胞成長因子−10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G−CSF、GM−CSF、GF−β1、インシュリン、IL1R1、IFN−γ、IGF−I、IGF−II、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8(72 a.a.)、IL−8(77 a.a.)、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP−10、ケラチノサイト成長因子−2(KGF−2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質(同30)、M−CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP−1(MCAF)、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MIG、MIP−1α、MIP−1β、MIP−3α、MIP−3β、MIP−4、ミエロイド前駆体阻害因子−1(myeloid progenitor inhibitor factor−1;MPIF−1)、NAP−2、ニュールツリン(Neurturin)、神経成長因子、β−NGF、NT−3、NT−4、オンコスタチン M、p55、TNFα認識部位、プロ−TNF−α−ストーク(pro−TNF−α−stalk)、PDGF−AA、PDGF−AB、PDGF−BB、PF−4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TACE酵素認識部位、TGF−α、TGF−β、TGFβ1、TGF−β2、TGF−β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF−α、TNF−β、TNFレセプターI、TNFレセプターII、TNIL−1、TPO、VEGF、VEGFレセプター1、VEGFレセプター2、VEGFレセプター3、GCP−2、GRO/MGSA、GRO−β、GRO−γ、HCC1、1−309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4がある。サイトカインレセプターには前述のサイトカインについてのレセプターが含まれる。この列挙が網羅的であることを意図するものでないことは理解されるであろう。
【0047】
本発明の一実施形態では、可変ドメインは1以上の抗原もしくはエピトープに対して指向される抗体に由来する。この点で、本発明のdAb−エフェクター基はエピトープもしくは抗原に結合し、かつアンタゴニストもしくはアゴニストとして作用し得る(例えばEPOレセプターアゴニスト)。
【0048】
好適な実施形態では、可変ドメインは単一抗体可変ドメインのレパートリーに由来する。一例において、このレパートリーは動物もしくは合成レパートリー中で作製されていないレパートリーである。別の例において、単一可変ドメインは動物の免疫処理によって(少なくとも部分的に)単離されていない。したがって、単一ドメインはナイーブ(naive)なライブラリーから単離することができる。
【0049】
一態様では、ライブラリー構成メンバーの集団がエフェクター基(例えばFc領域)をコードする共通の構成物をそれぞれ含むようにライブラリー(例えばファージもしくはファジミドライブラリーまたはWO 99/02671に記載されるエマルジョン技術を用いたライブラリー)が作製される。続いて、単一可変ドメインをコードする多様な配列をスプライシングして、同一のエフェクター基との関連で多様な単一可変ドメインを呈示する構成メンバーのライブラリーを作製する。その後、抗原もしくはエピトープに対するdAb−エフェクター基の選択が共通のエフェクター基との関連で達成され、これは例えば半減期に対するエフェクター基の所望の効果に基づいて選択し得る。
【0050】
別の態様では、本発明は本明細書に規定されるdAb−エフェクター基の少なくとも1つをコードする1以上の核酸分子を提供する。
【0051】
dAb−エフェクター基は単一の核酸分子上にコードされてもよい。あるいは、この分子の異なる部分が別個の核酸分子によってコートされてもよい。「dAb−エフェクター基」が単一の核酸分子によってコードされる場合、前記ドメインを融合ポリペプチドとして発現してもよいし、または別々に発現した後に例えば化学結合剤を用いてともに連結してもよい。別個の核酸から発現されたdAb−エフェクター基を適切な手段でともに連結してもよい。
【0052】
この核酸が発現の際に宿主細胞からポリペプチドを搬出するためのシグナル配列をさらにコードし、発現の際に糸状バクテリオファージ粒子(もしくは選択ディスプレイシステムの他の成分)の表面成分(例えば、pIIIコートタンパク質の少なくとも一部)と融合してもよい。
【0053】
別の態様では、本発明は本発明による核酸を含むベクターを提供する。
【0054】
さらに別の態様では、本発明は本発明によるベクターでトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【0055】
このようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上で選択用のdAb−エフェクター基を産生するよう設計し得る。
【0056】
本発明は、本発明のよるdAb−エフェクター基を少なくとも1つ含む、疾患の予防および/または治療に適切なキットをさらに提供する。
【0057】
またさらに別の態様では、本発明は本発明の方法によって取得可能なdAb−エフェクター基と製薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含む組成物を提供する。
【0058】
既に議論したように、本発明者らはエフェクター基の大きさおよび性質が本発明によるdAb−エフェクター基の半減期を増大することを見出した。薬物動態学的分析のための方法は当業者によく知られているであろう。詳細はKenneth,Aら:Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Petersら, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach(1996)に見出すこともできる。tαおよびtβ半減期などの薬物動態学的パラメーターならびに濃度曲線下面積(AUC)を記載している「Pharmacokinetics」,M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekkerによる発表, 第2Rev.ex版(1982)も参照されたい。
【0059】
半減期(t1/2αおよびt1/2β)およびAUCは、時間に対するdAb−エフェクター基の血清濃度の曲線から決定することができる(例えば図6を参照のこと)。WinNonlin分析パッケージ(Pharsight Corp.,Mountain View, CA94040, USAから入手可能)を、例えば曲線をモデル化するのに用いることができる。第1段階(α段階)では、一部の消失を伴いながら、dAb−エフェクター基が患者における主要な分布を経ている。このdAb−エフェクター基が分布し、dAb−エフェクター基が患者から除かれながら血清濃度が減少しているとき、第2段階(β段階)は終末段階である。tα半減期は第1段階の半減期であり、tβ半減期は第2段階の半減期である。
【0060】
したがって、本発明は有利には、15分以上の範囲でtα半減期を有する本発明によるdAb−エフェクター基を含むdAb−エフェクター基もしくは組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下端は30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間もしくは12時間である。これに加えて、あるいは代替的に、本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物は最大で12時間(12時間を含む)の範囲でtα半減期を有するだろう。一実施形態では、この範囲の上端は11、10、9、8、7、6もしくは5時間である。適切な範囲の例は1〜6時間、2〜5時間もしくは3〜4時間である。
【0061】
本発明が2.5時間以上の範囲でtβ半減期を有する本発明によるdAb−エフェクター基を含むdAb−エフェクター基もしくは組成物を提供することが有利である。一実施形態では、この範囲の下端は3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、もしくは12時間である。これに加えて、あるいは代替的に、本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物は最大21日(21日を含む)の範囲でtβ半減期を有する。一実施形態では、本発明によるdAb−エフェクター基は以下:12時間以上、24時間以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上もしくは20日以上よりなる群から選択されるtβ半減期のいずれかのtβ半減期を有する。本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物が12〜60時間の範囲でtβ半減期を有することが有利であろう。別の実施形態では1日以上のtβ半減期を有するだろう。さらに別の実施形態では、12〜26時間の範囲であろう。
【0062】
本発明によるdAb−エフェクター基が、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上もしくは7日以上のtβ半減期を有するV−Fcを含むか、このようなV−Fcからなることが有利である。本発明によるdAb−エフェクター基が1日以上のtβ半減期を有するV−Fcを含むか、またはこのようなV−Fcからなることが最も有利である。
【0063】
本発明によれば、dAb−エフェクター基が、本明細書に記載されるヒンジ領域を伴う、あるいは伴わない定常領域ドメインCH2および/またはCH3、このましくはCH2およびCH3からなるエフェクター基を含み、その際dAb−エフェクター基が1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上もしくは7日以上のtβ半減期を有することが最も有利である。本発明によるdAb−エフェクター基が定常領域ドメインCH2および/またはCH3からなるエフェクター基を含み、その際dAb−エフェクター基が1日以上のtβ半減期を有することが最も有利である。
【0064】
上述の特徴に加えて、あるいは代替的に、本発明は1mg.min/ml以上の範囲でAUC値(濃度曲線下面積)を有する本発明によるdAb−エフェクター基もしくはdAb−エフェクター基を含む組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下端は5、10、15、20、30、100、200もしくは300mg.min/mlである。これに加えて、あるいは代替的に、本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物は最大600mg.min/mlの範囲でAUCを有する。一実施形態では、この範囲の上端は500、400、300、200、150、100、75もしくは50mg.min/mlである。本発明によるdAb−エフェクター基が以下:15〜150mg.min/ml、15〜100mg.min/ml、15〜75mg.min/ml、および15〜50mg.min/mlからなる群から選択される範囲でAUCを有することが有利であろう。
【0065】
別の態様では、本発明は本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物を用いた疾患の予防および/または治療のための方法を提供する。
【0066】
別の態様では、本発明は、疾患の治療における本発明によるdAb−エフェクター基もしくはその組成物を提供する。
【0067】
さらに、本発明者らは、標的ヒトTNFαに特異的で、TAR1−5−19Fcと呼ばれるdAb−Fcが関節炎のモデルにおいて非常に効率的な治療であることが示されることを見出した。したがって、本発明者らは、TAR1−5−19−エフェクター基が1以上の炎症性疾患の予防および/または治療における特定の使用であり得ることを考慮する。
【0068】
したがって別の態様では、本発明は、1以上の炎症性疾患の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に本発明によるdAb−エフェクター基の治療上有効量を投与する工程を含む上記方法を提供する。
【0069】
別の態様では、本発明は、1以上の炎症性疾患の予防および/または治療のための医薬調製における本発明のdAb−エフェクター基の使用を提供する。
【0070】
本発明の上述の態様によれば、dAb−エフェクター基がTNFαに特異的に結合することが有利である。dAb−エフェクター基がヒトTNFαに特異的に結合することがより有利である。dAb−エフェクター基がdAb−Fcであり、かつTNFα、好ましくはヒトTNFαに特異的に結合することがより一層有利である。dAb−エフェクター基がエフェクター基としてTAR1−5−19を含むことがより一層有利である。本発明の上述の態様による使用のためのdAb−エフェクター基がTAR1−5−19−Fcであることが最も有利である。
【0071】
本発明の上述の態様によれば、1以上の炎症性疾患がTNF−αによって介在されることが有利である。1以上の炎症性疾患がTNFαによって介在され、かつ以下:慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、多発性硬化症、敗血症性ショック、アルツハイマー、冠状動脈血栓症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および糸状体腎炎よりなる群から選択されることが有利である。
【0072】
別の態様では、本発明は、患者におけるTNFαによって介在される悪液質を減少および/または予防および/または抑制する方法であって、そのような治療を必要とする患者に本発明によるdAb−エフェクター基の治療上有効量を投与する工程を含む上記方法を提供する。
【0073】
さらに別の態様では、本発明は患者における悪液質を減少および/または予防および/または抑制するための医薬調製における、本発明のdAb−エフェクター基の使用を提供する。
【0074】
上述の本発明の態様における好適な実施形態では、悪液質は炎症性疾患と関連する。炎症性疾患が以下:慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、多発性硬化症、敗血症性ショック、アルツハイマー、冠状動脈血栓症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および糸状体腎炎よりなる群から選択されることが有利である。
【0075】
上述の本発明の態様によれば、この方法もしくは使用は、ヒトもしくはヒト以外の患者の治療に用いることができる。本発明の上述の態様によれば、患者がヒトであり、かつTNFαがヒトTNFαであることが好ましい。
【0076】
被験者へ投与する本発明によるdAb−エフェクター基の適切な用量は当業者によく知られているだろう。この投与量は0.5〜20mg/Kgの範囲のdAb−エフェクター基であるのが有利である。dAb−エフェクター基の投与量が1〜10mg/Kgの範囲であるのがより有利である。好適な投与量の範囲は1〜5mg/Kgである。1mg/Kgもしくは5mg/Kgの投与量のdAb−エフェクター基が投与されることが最も有利である。適切な服用量のレジメンは、年齢、疾患の重篤度など、特定の被験者の特徴に依存し得る。特に被験者がヒトである場合に、dAb−エフェクター基を、例えば毎日、1週間に1回、2週間に1回もしくは毎月投与してもよい。当業者はこの列挙が網羅的であることを意図するものでないことを理解するであろう。
【0077】
図面の簡単な説明
図1は本発明による種々の好適なdAb−エフェクター基を示している。
(a)は抗体分子のヒンジ領域と連結したVもしくはVを示す。
(b)はCH1、CH2もしくはCH3と連結したVもしくはVを示す。
(c)はCHおよびCH2またはCH3と連結したVもしくはVを示す。
(d)はVもしくはVと連結した(b)によるdAb−エフェクター基を示す。
(e)はCH1/CH2およびCH3ドメインの組合せのいずれかと連結したVもしくはVの二量体であって、ここで可変ドメインが本明細書に記載されるリンカーの使用を伴いながら、または伴わずに互いに連結されている、上記二量体を示す。
(f)は、ステップ(e)と同一の成分を有するが、二量体を構成する2つの成分間での連結ポイントがエフェクター基である二量体を示す。
(g)は抗体分子のFc領域と連結されたVもしくはVを示す。
(h)は抗体のFab領域を含む様々な定常領域ドメインと連結されたVもしくはVを示す。
【0078】
図2は、E5−FcとVH2−Fc融合体を作製するのに使用されるsignal pIgplusベクターを示す。詳細は実施例1で説明する。
【0079】
図3aは、本発明による免疫グロブリンエフェクター基の精製を表すSDSページゲルを示す;レーン1−MWマーカー(kDa)、レーン2−プロテインA精製前の培養培地、レーン3−プロテインA精製後の培養培地、レーン4−精製したE5−Fcタンパク質、レーン5−精製したE5−Fcタンパク質。図3bは本発明による免疫グロブリン−エフェクター基のグリコシル化を示す。レーンは図面上に標識されている。図3cは、Cos−1細胞、Cos−7細胞およびCHO細胞が、正しい特異性で、かつ無関係な抗原との交差反応なくdAb−Fc融合タンパク質の発現を可能にすることを立証するELISA結果を示す。
【0080】
図4は、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示している。精製したE5−Fcタンパク質をフルオレセインで3.3/1のフルオレセイン/タンパク質の比率で標識した。続いて標識したタンパク質(491μg/ml濃度)をFACS分析に使用した。2種類のタイプのヒトFcRs(CD64とCD32)を発現するヒト単球様U937細胞を使用してこれらのレセプターに結合するE5−Fc融合タンパク質の能力を評価した。FACS結果はE5−Fc融合タンパク質がU937細胞系に結合することを示している(5x10個のU−937細胞を80mlの標識したタンパク質(1:50希釈)とともにインキュベートしてライブで調査した)。
a. 図4a:U−937細胞(対照)
b. 図4b:抗CD64抗体(陽性対照)とともにインキュベートしたU−937細胞
c. 図4c:抗CD32抗体(陽性対照)とともにインキュベートしたU−937細胞
d. 図4d:抗CD16抗体(陰性対照)とともにインキュベートしたU−937細胞
e. 図4e:E5−Fc融合タンパク質とともにインキュベートしたU−937細胞
【0081】
図5:Raj 1細胞(CD32レセプターのみを発現する)をFACS分析に用いた。FACS結果はE5−Fc鎖がRaj 1細胞に結合することを立証する。
1.Raj 1細胞(対照)
2.抗CD64抗体(陰性対照)とともにインキュベートしたRaj 1細胞
3.抗CD32抗体(陽性対照)とともにインキュベートしたRaj 1細胞
4.抗CD16抗体(陰性対照)とともにインキュベートしたRaj 1細胞
5.E5−Fc融合タンパク質とともにインキュベートしたRaj 1細胞
【0082】
図6は薬物動態学的分析の結果を示す。図は本発明によるHEL−4もしくはE5−Fcの50μgボーラスIV服用後のマウスにおける血清レベルを示している。
【0083】
図7はTg197マウスの関節炎スコアに与える週に2回のTAR1−5−19注射の効果を示している。
【0084】
図8は異なる処置群由来の足関節の組織病理学的スコアを示している。
【0085】
図9はTg197マウスの群平均重量に与える週に2回のTAR1−5−19注射の効果を示している。
【0086】
図10:α因子dAb Fc融合タンパク質のヌクレオチド配列(α因子リーダー配列の始めからEcoRIクローニング部位まで)。
【0087】
図11:図10に示される配列によってコードされるα因子dAb Fc融合タンパク質のアミノ酸配列。
【0088】
図12:抗原結合活性:抗原結合活性をTNFレセプター結合アッセイを用いて決定した。96ウェルNunc Maxisorpプレートをマウス抗ヒトFc抗体でコーティングし、1%BSAでブロッキングした後、TNFレセプター1−Fc融合体を添加する。異なる濃度のdAb−Fc融合タンパク質を10ng/mlのTNFタンパク質と混合し、室温で1時間以上インキュベートする。この混合物をTNFレセプター1−Fc融合タンパク質でコーティングしたプレートに加えて、室温で1時間インキュベートする。続いてプレートを洗浄して未結合の遊離dAb−Fc融合体、TNFおよびdAb−Fc/TNF複合体を除く。その後、プレートを順にビオチン化抗TNF抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼとともにインキュベートした。そしてプレートを発色性西洋ワサビペルオキシダーゼ基質TMBとともにインキュベートした。発色を1M 塩酸の添加により停止し、吸光度を450nmで読み取った。吸光度の読み取りはTNF結合量に比例し、したがってTAR1−5−19Fc融合タンパク質はTNFの結合についてTNFレセプターと競合し、アッセイにおけるシグナルを低下し得る。ピキア・パストリス(P.pastoris)が産生したタンパク質は上述のin vitro TNFレセプターアッセイにおいて、哺乳動物タンパク質と同等の活性を有していた。
【0089】
図13は、哺乳動物細胞(レーン1と2)およびピキア・パストリス(レーン3)で産生されたTAR1−5−19Fc融合タンパク質(プロテインA親和性により精製)間の比較を表示する、非還元の15%SDS−PAGEゲルを示している。3種全てのレーンに存在する主要なバンドは約80kDaのジスルフィド結合したホモダイマーと、約40kDaのジスルフィド結合していないモノマー単位であることが認められうる。哺乳動物およびピキア・パストリスの双方で産生されたタンパク質のゲル濾過は、非SDS−PAGE条件下でいずれの種もホモダイマーとして泳動することを示した。80kDaマーカーより下の副次的なバンドは、dAbと連結することなく、dAbとFcドメインとを結合するポリペプチドのタンパク質分解作用を介して産生された遊離Fcタンパク質を表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【0090】
発明の詳細な説明
定義
免疫グロブリン これは抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折りたたみを保持するポリペプチドのファミリーを指し、2つのβシート、および通常保存されたジスルフィド結合を含む。免疫グロブリンスーパーファミリーの構成メンバーはin vivoで細胞および非細胞相互作用の多くの局面に関与し、これには免疫系における広範囲にわたる役割(例えば、抗体、T細胞レセプター分子など)、細胞接着(例えばICAM分子)および細胞内シグナル伝達(例えば、PDGFレセプターなどのレセプター分子)における関与が含まれる。
【0091】
ドメイン ドメインはタンパク質の残りとは無関係にその三次構造を保持する折り畳みタンパク質構造である。一般的に、ドメインはタンパク質の個別的な性状に関与し、多くの場合で機能を損なうことなく付加、除去もしくは他のタンパク質に転換し得る。単一抗体可変ドメインによって、本発明者らは抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳みポリペプチドドメインを意図している。したがって、単一抗体可変ドメインには、例えば1以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換されているか、あるいはN−もしくはC−末端伸長部(extention)を末端切断した抗体可変ドメインまたはN−もしくはC−末端伸長部を含む抗体可変ドメインなどの抗体可変ドメインが含まれる。
【0092】
レパートリー 多様な変異体、例えばこれらの主要な配列において異なるポリペプチド変異体の集合。本発明に用いられるライブラリーは少なくとも1000の構成メンバーを含むポリペプチドのレパートリーを含むだろう。
【0093】
ライブラリー ライブラリーという用語は、異種ポリペプチドもしくは異種核酸の混合物を指す。ライブラリーは単一のポリペプチドもしくは核酸配列を有する構成メンバーから成る。この範囲でライブラリーはレパートリーと同義である。ライブラリー構成メンバー間での配列の相違は、ライブラリー中に存在する多様性の原因となる。ライブラリーはポリペプチドもしくは核酸の単なる混合物の形態を採ってもよく、あるいは、例えば核酸のライブラリーで形質転換した細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの、生物または細胞の形態であってもよい。個々の生物もしくは細胞は各々唯一のまたは限定数のライブラリー構成メンバーを含むことが好ましい。核酸を発現ベクター中に組込み、この核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にすることが有利である。したがって、好適な態様では、ライブラリーは宿主生物の集団の形態を採ることもでき、各生物は核酸形態中に、発現してその対応するポリペプチド構成メンバーを産生することが可能なライブラリーの単一構成メンバーを含む発現ベクターの1以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、膨大な遺伝学的に多様なポリペプチド変異体のレパートリーをコードする可能性を有する。
【0094】
本明細書に定義される単一ドメイン−エフェクター基(dAb−エフェクター基)は、1以上の定常領域ドメインおよび/またはヒンジ(全体として「エフェクター基」と称する)と連結された、1以上のエピトープと特異的に結合することが可能な単一可変ドメインを含む人工合成構造をいう。各可変ドメインは重鎖ドメイン(V)もしくは軽鎖ドメイン(V)であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載されるエフェクター基は抗体のFc領域を含む。dAb−エフェクター基を組合せて多価性構造を形成することにより、抗原相互作用の結合力を改善してもよい。疑いを避けるため、本発明によるdAb−エフェクター基免疫グロブリン分子は単一鎖分子であり、これらは(例えばEP 0 656 946A1に記載されるような)二重鎖抗体ではない。さらに、「dAb−エフェクター基」という用語は、その範囲内にラクダ科の動物内で生成される天然の二重鎖抗体またはIgG分子の四鎖構造のいずれも含まない。本発明による「dAb−エフェクター基」は、in vivoにおける生物学的効果を産生することが可能であるように、十分な長さの半減期を有する。本発明者らは、本明細書に定義されるdAb−エフェクター基のエフェクター機能およびこの分子のin vivo半減期を決定するのはエフェクター基の大きさと性質であることを見出した。
【0095】
抗体 あらゆる種が本来産生する抗体に由来するか、または組換えDNA技術によって作製される(血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞(transfectomas)、酵母もしくは細菌から単離される)抗体(例えばIgG1、2、3および4;IgM;IgA;IgD;もしくはIgE)あるいはフラグメント(Fab、Dab、F(ab’)、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、ジアボディ(diabody)など)。
【0096】
TAR1−5−19は標的ヒトTNFα(TAR1)に特異的に結合するDabである。
【0097】
抗原 本発明によるdAb−エフェクター基によって結合されるリガンド。単一ドメインは、本発明における使用のためにこれらの抗原結合特異性によって選択し得る。抗原はポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは他の分子であってもよい。抗体およびそのフラグメントの場合、可変ループ(L1、L2、L3およびH1、H2、H3)によって定義される抗体結合部位は抗原と結合することが可能である。
【0098】
本明細書で言及されるエピトープは、1以上の免疫グロブリン可変ドメイン、例えば免疫グロブリンV/V対によって一般的に結合される構造単位である。エピトープは抗体の最小結合部位を定義し、したがって抗体の特異的な標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、1のエピトープは別の可変ドメインと独立した可変ドメインによって結合される構造単位を表す。
【0099】
選択という用語は、多くの異なる選択肢からの選択を意味する。当業者は1以上の抗体単一可変ドメインを選択する方法に気付くであろう。この方法がライブラリーからの選択を含むことが有利である。このライブラリーがファージディスプレイライブラリーであるのが有利である。
【0100】
普遍的なフレームワーク Kabatにより定義される配列中(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、US Department of Health and Human Services)もしくはChothiaおよびLesk(1987)(J.Mol.Biol. 196:910-917)によって定義される構造中に保存されている抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列。本発明は、超可変領域中の変異のみであるにも関わらず実質的に全ての結合特異性の誘導を可能にすることが見出された単一フレームワークもしくは一組のそのようなフレームワークの使用を提供する。
【0101】
特定の一般的リガンド レパートリーの全ての構成メンバーと結合するリガンド。一般的に、抗原結合部位を介して結合しない。例としてプロテインAとプロテインLがある。
【0102】
本明細書で使用されるように、「ヒト起源」という用語は、問題の配列の派生における一部の点で、核酸配列の供給源としてヒト配列が用いられたことを意味する。類似の意味は「ラクダ科の動物起源」という用語にも適用する。
【0103】
本明細書で使用されるように、「増大した半減期」という言い回しは、特定のdAb−エフェクター基が、エフェクターのない同一のdAbに比べて少なくとも25%より長い血清半減期を有することを意味する。増大した半減期は、少なくとも30%より長い、40%より長い、50%より長い、75%より長い、100%より長い、3Xより長い、5Xより長い、10Xより長い、20Xより長い、50X以上長いことが好ましい。
【0104】
本明細書で使用されるように、「選択」という用語は、技術もしくは選択圧の適用を要求し、これにより集団の他の構成メンバーに保持されていない選択項目によって保持される1以上の特性に基づいて集団間から1以上の項目の単離を可能にすることと理解すべきである。
【0105】
発明の詳細な説明
一般的技術
他に定義されていない限り、本明細書で使用される(例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における)全ての技術および科学用語は当業者に共通して理解されるものと同一の意味を有する。標準技術は分子法、遺伝子法および生化学法(一般的にSambrookらMolecular Cloning:A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelらShort Protocols in Molecular Biology(1999)第4版,John Wiley & Sons,Inc.を参照し、これらは参照により本明細書に組み入れる)ならびに化学法について用いられる。
【0106】
本発明によるdAb−エフェクター基の調製
dAb−エフェクター基は既に確立された技術に従って調製でき、このような技術は抗体工学の分野で、scFv、「ファージ抗体」および他の人工抗体分子の調製のために使用される。抗体、および特に二重特異性抗体を調製するための技術は、例えば以下の総説およびこれらの中に記載される参考文献中に記載されている:Winter & Milstein(1991) Nature 349:293-299; Plueckthun(1992)Immunological Reviews 130:151-188;Wrightら(1992) Crti.Rev.Immunol.12:125-168;Holliger,P. & Winter,G. (1993) Curr. Op.Biotechn.4, 446-449; Carterら(1995)J.Hematother. 4, 463-470; Chester,K.A. & Hawkins,R.E.(1995)Trends Biotechn.13, 294-300; Hoogenboom,H.R.(1997) Nature Biotechnol.15, 125-126; Fearon,D.(1997)Nature Biotechnol.15, 618-619; Pluckthun,A. & Pack,P.(1997)Immunotechnology 3, 83-105; Carter,P. & Merchant,A.M. (1997) Curr.Opin.Biotechnol.8, 449-454; Holliger,P. & Winter,G.(1997) Cancer Immunol. Immunother. 45, 128-130。
【0107】
可変ドメインの選択に使用される技術は当業界で公知のライブラリーおよび選択手順を使用する。ヒトB細胞から回収した再編成したV遺伝子を使用する天然ライブラリー(Marksら(1991) J.Mol.Biol., 222:581; Vaughanら(1996) Nature Biotech., 14:309)が当業者に周知である。合成ライブラリー(Hoogenboom & Winter(1992) J.Mol.Biol., 227:381; Barbasら.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4457; Nissimら.(1994) EMBO J.,13:692; Griffithsら.(1994) EMBO J.,13:3245;De Kruifら.(1995) J.Mol.Biol.,248: 97)は、一般的にはPCRを用いて、免疫グロブリンV遺伝子をクローニングすることにより調製される。PCR工程における誤りは高度な無作為化を生じさせることができる。Vおよび/またはVライブラリーは別個の標的抗原もしくはエピトープに対して選択されてもよく、単一ドメイン結合の場合、結合は直接的に選択されるか、または一緒に選択される。
【0108】
本発明による「dAb−エフェクター基」を合成する好適な方法は、可変ドメインのレパートリーが抗原もしくはエピトープへの結合について選択される選択システムを使用することを含む。その後、選択される単一ドメインはエフェクター基に連結される。
【0109】
適当なエフェクター基として、以下:少なくとも1つの抗体軽鎖定常領域(CL)を含むエフェクター基、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメインまたはそのあらゆる組合せよりなる群から選択されるもののいずれかを含む。1以上の定常領域ドメインに加えて、エフェクター基は抗体のヒンジ領域(IgG分子のCH1ドメインとCH2ドメインとの間で通常みられる領域など)を含んでもよい。本発明の別の実施形態によれば、「dAb−エフェクター基」は抗体分子に由来するヒンジ領域と連結した単一可変ドメインである。
【0110】
本発明のこの態様における別の実施形態では、エフェクター基はFab抗体フラグメントを基礎とする。すなわち、エフェクター基は、Fabフラグメントを構成する1以上の定常領域ドメインと連結したVドメインもしくはVドメインを含む抗体フラグメントを含む。当業者は、そのようなフラグメントが1つの可変ドメインのみを含むことを理解するであろう。このようなFabエフェクター基は図1gに図示されている。図1gに示される2鎖の実施形態(すなわち2鎖実施形態)では、単一可変ドメインは各々それぞれのエピトープもしくは抗原結合部位を形成する。したがって、単一可変ドメインは単一の結合部位を一緒に形成しない。可変ドメインのエピトープもしくは抗原特異性は同一であっても異なってもよい。
【0111】
本発明のこの態様における別の好適な実施形態では、本発明によるエフェクター基はIgG分子のFc領域である。
【0112】
A.ライブラリーベクター系
多様な選択システムが当業界で公知であり、これらは本発明における使用に適している。そのようなシステムの例を以下に記載する。
【0113】
バクテリオファージλ発現系を、バクテリオファージのプラークもしくは溶原ファージのコロニーとして直接スクリーニングしてもよく(いずれもすでにHuseら(1989) Science, 246:1275; CatonおよびKoprowski(1990) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら(1990) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 87:8095; Perssonら(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 88:2432に記載されている)、本発明に使用される。このような発現系は最大10の異なるライブラリーの構成メンバーをスクリーニングするのに使用することができるが、これらは本来より膨大な数(10構成メンバー以上)のスクリーニングには適していない。
【0114】
ライブラリー構築物において特に有用な使用は選択ディスプレイシステム(selection display system)であり、これはポリペプチドに連結すべき核酸の発現を可能にする。本明細書で使用されるように、選択ディスプレイシステムは、一般的なリガンドおよび/または標的リガンドを結合して、適切なディスプレイ手段によりライブラリーの個々の構成メンバーの選択を可能にするシステムである。
【0115】
大きなライブラリーにおいて所望の構成メンバーを単離するための選択プロトコルはファージディスプレイ技術に代表されるように当業界で公知である。多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面に呈示されるこのようなシステム(ScottおよびSmith(1990) Science, 249:386)は、in vitro選択のための抗体フラグメント(およびこれらをコードするヌクレオチド配列)ライブラリーの作製、および標的抗原に結合する特定の抗体フラグメントの増幅(McCaffertyら, WO 92/01047)に有用であることを証明している。VおよびV領域をコードするヌクレオチド配列がこれらを大腸菌の細胞周辺腔へ導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片と連結され、その結果生じる抗体フラグメントが、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質(例えばpIIIもしくはpVIII)との融合体としてバクテリオファージの表面に呈示される。あるいは、抗体フラグメントがλファージキャプシド外部に提示される(ファージ抗体)。ファージを基礎とするディスプレイシステムの利点は、これらが生物系であるため、選択されるライブラリー構成メンバーを、細菌細胞中で選択したライブラリー構成メンバーを含むファージを生育することによって簡単に増幅することができる点である。さらに、ポリペプチドライブラリー構成メンバーをコードするヌクレオチド配列がファージもしくはファジミドベクターに含まれるため、配列決定、発現およびこれに続く遺伝子操作が比較的簡単である。
【0116】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は当業界で周知である(McCaffertyら(1990) Nature, 348:552; Kangら(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 88:4363; Clacksonら(1991) Nature, 352: 624; Lowmanら(1991) Biochemistry, 30:10832; Burtonら(1991) Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,88:10134; Hoogenboomら(1991) Nucleic Acids Res.,19:4133; Changら(1991) J.Immunol.,147:3610; Breitlingら(1991) Gene,104:147; Marksら(1991)前掲; Barbasら(1992)前掲; HawkinsおよびWinter(1992) J.Immunol.,22:867; Marksら,1992, J.Biol.Chem., 267:16007; Lernerら(1992) Science,258:1313,参照により本明細書に組み入れる)。
【0117】
1つの特に有利な手法はscFvファージライブラリー(Hustonら, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883; Chaudharyら(1990) Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070; McCaffertyら(1990)前掲; Clacksonら(1991) Nature,352:624; Marksら(1991) J.Mol.Biol.,222:581; Chiswellら(1992) Trends Biotech., 10:80; Marksら(1992) J.Biol.Chem.,267)の使用である。バクテリオファージコートタンパク質に呈示されるscFvライブラリーの様々な実施形態が記載されている。また、ファージディスプレイ法の改善は、例えばWO96/06213およびWO92/01047(Medical Research Councilら)ならびにWO97/08320(Morphosys)に記載されているように公知であり、これらは参照により本明細書に組み入れる。
【0118】
ポリペプチドライブラリーを作製する別のシステムは、ライブラリー構成メンバーのin vitro合成のための無細胞酵素機構(cell−free enzymatic machinery)の使用に関する。ある方法では、RNA分子は標的リガンドに対する選択とPCR増幅の交互ラウンドにより選択される(TuerkおよびGold(1990) Science, 249:505; EllingtonおよびSzostak(1990) Nature, 346:818)。同様の技術を使用して予め決定したヒト転写因子と結合するDNA配列を同定することもできる(ThiesenおよびBach(1990) Nucleic Acids Res.,18:3203; BeaudryおよびJoyce(1992) Science,257:635; WO92/05258およびWO92/14843)。同様の方法において、in vitro翻訳を大きなライブラリーを作製する方法として使用してポリペプチドを合成することができる。一般的に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、さらにWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058、およびWO92/02536に記載されている。WO95/22625およびWO95/11922(Affymax)に開示されるようなファージを基礎としない代替的なディスプレイシステムはポリソームを使用して選択用のポリペプチドを呈示させる。
【0119】
さらに別のカテゴリーの技術は、ある遺伝子とその遺伝子産物との関連性を可能にする人工区画中のレパートリーの選択に関する。例えば、所望の遺伝子産物をコードする核酸を油中水型エマルジョンにより形成されるマイクロカプセル中で選択することができる選択システムがWO99/02671、WO00/40712およびTawfik & Griffiths(1998) Nature Biotechnol 16(7),652−6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝的要素がマイクロカプセル中に区画化され、続いてマイクロカプセル内で転写および/または翻訳されて、これらのそれぞれの遺伝子産物(RNAもしくはタンパク質)を産生する。所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝的要素が順に分類される。この方法は、多様な手段で所望の活性を検出することにより、目的の遺伝子産物を選択する。
【0120】
B.ライブラリー構築
選択に使用することが意図されるライブラリーは、例えば上記のような当業界で公知の技術を用いることにより構築してもよく、もしくは商業的に購入してもよい。本発明に有用なライブラリーは、例えばWO99/20749に記載されている。いったんベクター系が選択され、かつ目的のポリペプチドをコードする1以上の核酸配列がライブラリーベクター中にクローニングされれば、発現前に突然変異誘発を行うことによってクローン分子内で多様性を生じさせることもでき、あるいは、突然変異誘発と選択の追加ラウンドを実施する前に、コードされるタンパク質を上述されるように発現および選択してもよい。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発は標準的な分子法によって実施される。特に有用な方法はポリメラーゼ連鎖反応、もしくはPCRである(MullisおよびFaloona(1987) Methods Enzymol.,155:335、参照により本明細書に組み入れる)。耐熱性DNA依存性DNAポリメラーゼにより触媒される複数サイクルのDNA複製を使用して、目的の標的配列を増幅するPCRは当業界で周知である。様々な抗体ライブラリーの構築がWinterら(1994) Ann.Rev.Immunology 12, 433−55およびその中に記載される参考文献中で議論されている。
【0121】
PCRは鋳型DNA(少なくとも1fg;より有効には、1〜1000ng)および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施する;プライマープールが非常に不均質である場合、各配列はこのプール中の分子の小さな分画のみによって表され、かつ量は後半の増幅サイクルにおいて制限的になるため、より大量のプライマーを用いることが有利であり得る。典型的な反応混合液は2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10X PCRバッファー1(Perkin−Elmer、Foster City、CA)、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl(もしくは2.5ユニット)のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer、Foster City、CA)および脱イオン水を含み、25μlの全量とする。鉱油が重層され、PCRはプログラム式のサーマルサイクラーを用いて実施される。PCRサイクルの各工程の長さと温度、およびサイクル数は実質的にストリンジェントな必要条件に従って調整される。アニーリングの温度とタイミングは、プライマーが鋳型にアニールすることが予想される効率と、許容されるべきミスマッチの程度の両方から決定される;明らかではあるが、核酸分子が同時に増幅および突然変異される場合は、少なくとも合成の第1ラウンドでミスマッチが要求される。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、通常の当業者の知識の範囲内である。30℃〜72℃のアニーリング温度が用いられる。鋳型分子の最初の変性は、通常は92℃〜99℃、4分間で生じ、変性(94〜99℃、15秒〜1分)、アニーリング(先に述べた通りに温度は決定される;1〜2分)、伸長(72℃、増幅産物の長さに応じて1〜5分)から構成される20〜40サイクルが続く。最後の伸長は一般的に4分間、72℃であり、4℃での不定の(0〜24時間)工程が続いてもよい。
【0122】
C.本発明によるエフェクター基への単一可変ドメインの連結
いったん選択された本発明によるドメインは、当業界で公知の多様な方法(共有結合および非共有結合的方法)で本明細書に記載されるエフェクター基と連結することができる。
【0123】
好適な方法として、例えばscFv分子との関連で記載されているように、ポリペプチドリンカーの使用が含まれる(Birdら(1988) Science 242:423-426)。リンカーは2つの単一ドメインが相互作用することができるようフレキシブル(flexible)であってもよい。ジアボディに使用されるフレキシブルの少ないリンカーも採用し得る(Holligerら(1993) PNAS (USA) 90:6444-6448)。
【0124】
リンカー以外の方法を用いて可変ドメインがエフェクター基に連結されてもよい。例えば、天然のもしくは操作されたシステイン残基を介して提供されるジスルフィド架橋の使用が利用されてもよい。
【0125】
必要に応じて、免疫グロブリンの可変ドメインを本発明のエフェクター基へ連結する別の技術が使用されてもよい。
【0126】
リンカーの長さおよび性質はdAb−エフェクター分子の物理的特性に影響し得る。例えばリンカーは、適当な位置における小さなアミノ酸残基の組込みにより、ドメインの会合を促進することもできる。あるいは、適当な剛構造を設計することもでき、これによりエフェクター基と可変ドメインとを互いに極めて物理的に近接に維持するだろう。
【0127】
本発明による「dAb−エフェクター基」
本発明によれば、単一のVおよび単一のV可変ドメインは本明細書に記載される手段を介してエフェクター基と連結される。
【0128】
(a) 本発明のdAb−エフェクター基の調製
本発明によるdAb−エフェクター基は本来抗体を産生するあらゆる種に由来するか、または組換えDNA技術によって作製し得る(血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞(transfectomas)、酵母もしくは細菌のいずれかから単離される)。
【0129】
本発明による単一可変ドメインおよびエフェクター基は同一のポリペプチド鎖上に存在してもよい。あるいは、これらが別個のポリペプチド鎖上に存在してもよい。これらが同一のポリペプチド鎖上に存在する場合、これらはリンカーにより連結し得る。リンカーは上述されるようにペプチド配列であるのが好ましい。
【0130】
単一可変ドメインおよびエフェクター基は共有的もしくは非共有的に結合されてもよい。これらが共有的に結合される場合、共有結合はジスルフィド結合であり得る。
【0131】
可変ドメインが例えば本明細書に記載されるファージディスプレイ技術を用いて選択されたV遺伝子レパートリーから選択される場合、これらの可変ドメインは普遍のフレームワーク領域、すなわち本明細書に規定される特定の一般的リガンドによって認識し得るフレームワーク領域を含む。普遍のフレームワーク、一般的リガンド等の使用はWO99/20749に記載されている。本発明によるdAB−エフェクター基の調製のための好適な生殖細胞系列遺伝子セグメントの例として以下:DP38、DP45、DP47およびDPK9よりなる群から選択されるもののいずれかを含む。
【0132】
V遺伝子レパートリーが使用される場合、ポリペプチド配列中の変異が可変ドメインの構造ループ中に位置することが好ましい。任意の可変ドメインのポリペプチド配列をDNAシャッフリング(shuffling)もしくは突然変異のいずれかにより改変して、各可変ドメインとその相補的エピトープとの相互作用を増進することもできる。
【0133】
別の態様では、本発明は本明細書に定義される少なくとも1つの単一ドメイン−エフェクター基抗体をコードする核酸を提供する。
【0134】
可変領域は標的抗原もしくはエピトープに対して指向される抗体から誘導し得る。あるいは、これらは糸状バクテリオファージ表面に発現されるような、単一抗体ドメインのレパートリーから誘導し得る。選択は下記に記載されるように行うこともできる。
【0135】
一般的に、本発明の遂行に要求される核酸分子およびベクター構築物は、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、USAなどの標準的な実験室マニュアルに記載されるように構築および操作することもできる。
【0136】
本発明における核酸の操作は典型的には組換えベクター中で実施する。
【0137】
したがって別の態様では、本発明は本明細書で定義される単一ドメイン−エフェクター基の少なくとも1つをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【0138】
本明細書で使用されるように、ベクターは異種DNAの発現および/または複製のために異種DNAを細胞に導入することに使用される独立的要素をいう。このようなベクターを選択する方法、構築する方法および、それに続く使用方法は当業者によく知られている。多数のベクターが公然利用可能であり、細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソーマルベクターが含まれる。このようなベクターは単純なクローニングおよび突然変異誘発に使用することもでき、代替的に遺伝子発現ベクターが使用される。本発明に使用されるベクターは所望の大きさ、典型的には0.25キロベース(kb)〜40kb以上の長さのポリペプチドコード配列に適合するよう選択し得る。適当な宿主細胞はin vitroクローニング操作の後、このベクターで形質転換される。各ベクターは様々な機能的構成要素を含み、一般的にはクローニング(もしくは「ポリリンカー」)部位、複製起点および少なくとも1種の選択可能なマーカー遺伝子を含む。当該ベクターが発現ベクターである場合、さらに以下:エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列の1以上を、それぞれがクローニング部位に近接した位置で、これらが本発明によるポリペプチドレパートリー構成メンバーをコードする遺伝子と機能的に連結されるように所持する。
【0139】
クローニングベクターおよび発現ベクターのいずれも一般的に、1以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。典型的にクローニングベクターにおいて、この配列はベクターが宿主染色体DNAとは独立して複製することを可能とし、かつ複製起点もしくは自立複製配列を含む配列である。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、2ミクロンプラスミドの起点は酵母に適切であり、様々なウイルスの起点(例えばSV40、アデノウイルス)が哺乳動物細胞中でのベクターのクローニングに有用である。一般的に複製起点は、これらがCOS細胞などの哺乳動物細胞中で高レベルのDNA複製を可能にすることに用いられる場合を除いて哺乳動物発現ベクターには必要ではない。
【0140】
クローニングベクターもしくは発現ベクターが選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得ることが有利である。この遺伝子は選択培養培地中で生育する形質転換宿主細胞の生存もしくは生育に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞はこの培養培地中で生存しないだろう。典型的な選択遺伝子は抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を与え、栄養要求性欠損を補足し、または生育培地中で利用可能でない重大な栄養源を供給するタンパク質をコードする。
【0141】
本発明によるベクターの複製は大腸菌で最も都合よくなされるため、大腸菌選択可能マーカー、例えば抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらはpBR322などの大腸菌プラスミド、またはpUC18、pUC19もしくはpUC119などのpUCプラスミドから取得することができる。
【0142】
発現ベクターは通常、宿主生物によって認識され、かつ目的のコード配列と機能的に連結されているプロモーターを含む。このようなプロモーターは誘導性もしくは構成性であってもよい。「機能的に連結される」という用語は、記載される成分がこれらの意図される仕方で機能することを可能にする関係で存在する並列状態をいう。コード配列と「機能的に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【0143】
原核宿主と使用するのに適したプロモーターとして、例えばβ−ラクタマーゼとラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターがある。細菌系で使用するためのプロモーターも一般的にコード配列と機能的に連結されたShine−Delgarno配列を含むだろう。
【0144】
好適なベクターは、ポリペプチドライブラリー構成メンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、第1および/または第2抗原またはエピトープを用いた選択は、別々の伝播およびポリペプチドライブラリー構成メンバーを発現する単一クローンの発現あるいはあらゆる選択ディスプレイシステムの使用によって行うことができる。上述されるように、好適な選択ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイである。したがって、ファージもしくはファジミドベクターを用いてもよい。好適なベクターは、大腸菌の(二重鎖複製のための)複製起点およびファージの(一本鎖DNA産生のための)複製起点も有するファジミドベクターである。このようなベクターの操作および発現は当業界でよく知られている(HoogenboomおよびWinter(1992)前掲; Nissimら(1994)前掲)。簡潔に言うと、ベクターはファジミドに選択作用を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子と、(N末端からC末端に)(発現したポリペプチドを細胞周辺腔へ導く)pelBリーダー配列、(ヌクレオチド版のライブラリー構成メンバーをクローニングするための)多重クローニング部位、場合により(検出用の)1以上のペプチドタグ、場合により1以上のTAG終止コドンおよびファージタンパク質pIIIからなる発現カセット上流のlacプロモーターとを含む。したがって、大腸菌の様々なサプレッサー株および非サプレッサー株を使用し、かつグルコース、イソ−プロピル チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)もしくはヘルパーファージ(VCS M13など)を加えることで、ベクターは発現することなくプラスミドとして複製し、ポリペプチドライブラリー構成メンバーのみを大量に産生し、または少なくとも一部はそれらの表面にポリペプチド−pIII融合体のコピーを少なくとも1つ含むファージを産生することができる。
【0145】
本発明によるベクターの構築は慣用の連結技術を使用する。単離されたベクターもしくはDNA断片を切断し、調整し、かつ所望の形態で再連結して必要なベクターを生成する。必要に応じて、正しい配列が構築したベクター中に存在していることを確認するための分析を公知の様式で行うことができる。発現ベクターを構築するための、in vitroで転写産物を調製するための、DNAを宿主細胞に導入するための、および発現および機能を評価する分析を行うための方法は当業者に周知である。サザンもしくはノーザン分析、ウエスタンブロッティング、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析といった慣用方法でサンプル中の遺伝子配列の存在は検出され、あるいはその増幅および/または発現が定量される。当業者は必要に応じてこれらの方法をいかに改変し得るかを容易に予見するだろう。
【0146】
(b) 本発明によるdAb−エフェクター基の構造
本明細書で定義される単一ドメイン抗体−エフェクター基(dAb-エフェクター基)とは、1以上の定常領域ドメイン(エフェクター基)と連結した、1以上のエピトープと特異的に結合可能な単一可変ドメインを含む設計された抗体分子をいう。各可変ドメインは重鎖ドメイン(V)もしくは軽鎖ドメイン(V)であってもよい。
【0147】
適当なエフェクター基として、以下:抗体軽鎖定常領域(CL)の少なくとも1つを含むエフェクター基、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメイン、もしくはこれらのあらゆる組合せよりなる群から選択されるもののいずれかを含む。1以上の定常領域ドメインに加えて、エフェクター基はまた抗体のヒンジ領域(IgG分子のCH1ドメインおよびCH2ドメイン間で通常みられる領域等)を含んでもよい。本明細書に記載されるエフェクター基は抗体のFc領域を含むのが有利である。本発明によるdAb−エフェクター基がV−Fcであるのがより有利である。
【0148】
この本発明の態様の別の実施形態では、エフェクター基はFab抗体フラグメントを基礎とする。すなわち、エフェクター基は、Fabフラグメントを構成する定常領域ドメインに連結したVドメインもしくはVドメインを含む抗体フラグメントを含む。当業者はこのようなフラグメントが1つの可変ドメインのみを含むことを理解するであろう。
【0149】
一実施形態では、本発明によるdAb−エフェクター基は以下:12時間以上、24時間以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上または20日以上よりなる群から選択されるtβ半減期のいずれかのtβ半減期を有する。本発明によるdAb−エフェクター基もしくは組成物が12〜60時間の範囲でtβ半減期を有することが有利であろう。更なる実施形態において、本発明によるdAb−エフェクター基または組成物は、1日以上のtβ半減期を有するだろう。さらに別の実施形態では、12〜26時間の範囲であろう。
【0150】
本発明によるdAb−エフェクター基が1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上もしくは7日以上のtβ半減期を有するV−Fcを含むか、またはこのようなV−Fcからなるのが有利である。本発明によるdAb−エフェクター基が1日以上のtβ半減期を有するV−Fcを含むか、またはこのようなV−Fcからなるのが最も有利である。
【0151】
本発明によれば、dAbエフェクター基が本明細書に記載されるヒンジ領域を含むもしくは含まない定常領域ドメインCH2および/またはCH3、このましくはCH2およびCH3からなるエフェクター基を含み、その際、このdAb−エフェクター基が1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上もしくは7日以上のtβ半減期を有することが有利である。本発明によるdAb−エフェクター基が定常領域ドメインCH2および/またはCH3からなるエフェクター基を含み、その際このdAb−エフェクター基が1日以上のtβ半減期を有することがより有利である。
【0152】
免疫グロブリン足場(scaffold)
各単一可変ドメインは、免疫グロブリン足場およびドメインと1以上のエピトープとの特異的相互作用に関与する1以上のCDRを含む。
【0153】
i.主鎖コンホメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの構成メンバーは全てこれらのポリペプチド鎖について類似した折り畳み(fold)を共有する。例えば、抗体はこれらの一次配列については高多様性であるが、配列および結晶構造の比較は予想に反して抗体の6種の抗原結合ループのうち5種(H1、H2、L1、L2、L3)が限られた数の主鎖コンホメーションもしくは標準構造をとることを明らかにしている(ChothiaおよびLesk(1987) J.Mol.Biol.,196:901; Chothiaら(1989) Nature、342:877)。したがって、ループ長および鍵となる残基の分析は、大部分のヒト抗体でみられるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションの予測を可能にしている(Chothiaら(1992) J.Mol.Biol.,227:799; Tomlinsonら(1995) EMBO J.,14:4628; Williamsら(1996) J.Mol.Biol.,264:220)。H3領域は(Dセグメントの使用に起因して)配列、長さおよび構造に関して遥かに多様であるが、また短いループ長について限られた数の主鎖コンホメーションを形成し、これは長さおよびループと抗体フレームワーク中の鍵となる位置に存在する特定の残基もしくは残基のタイプに依存する(Martinら(1996) J.Mol.Biol.,263:800; Shiraiら(1996) FEBS Letters, 399:1)。
【0154】
有利には、本発明のdAb−エフェクター基はVドメインのライブラリーおよびVドメインのライブラリーなどのドメインのライブラリーから組み立てられる。本発明における使用のため、抗体ポリペプチドのライブラリーは、特定のループ長および鍵となる残基を選択して構成メンバーの主鎖コンホメーションが既知であることを保障されるよう設計される。これらが天然にみられる免疫グロブリンスーパーファミリー分子の現実のコンホメーションであり、これらが非機能的である可能性を最小にすることが有利である。生殖細胞系列V遺伝子セグメントは、抗体もしくはT細胞レセプターライブラリーを構築するのに適切な1つの基本的フレームワークとして役立つ(他の配列も使用される)。変異は、機能的構成メンバーの少数がその機能に影響しない改変型の主鎖コンホメーションを所持し得るよう低頻度で生じ得る。
【0155】
標準構造理論も、本発明において、抗体によりコードされる多くの異なる主鎖コンホメーション数を評価し、抗体配列に基づいて主鎖コンホメーションを予測し、多様化のために標準構造に影響しない残基を選択することに使用される。ヒトVドメインにおいて、L1ループは4種の標準構造のうちの1種を採ることができ、L2ループは単一の標準構造を有し、かつL3ループについては90%のヒトVドメインが4種または5種の標準構造のうちの1種を採ることが知られている(Tomlinsonら(1995)前掲)。したがってVドメイン単独の場合、異なる標準構造を組合せて異なる主鎖コンホメーションの領域を作製することができる。VλドメインがL1、L2およびL3ループについて異なる標準構造の範囲をコードし、かつVおよびVλがH1およびH2ループについて数種の標準構造をコードすることができるVドメインのいずれかと一対にすることができることを考えれば、これらの5種類のループについて観察される標準構造の組合せ数は非常に豊富である。これは主鎖コンホメーションにおける多様性の発生が広範囲の結合特異性の生産に不可欠であり得ることを意味する。しかし、予想に反して、既知の単一主鎖コンホメーションに基づく抗体ライブラリーの構築によって、主鎖コンホメーションにおける多様性が実質的に全ての標的抗原に対する十分な多様性を生じるために必要ないことが見出された。さらに驚くべきことは、単一主鎖コンホメーションはコンセンサス構造を必要とせず、天然単一コンホメーションは全体ライブラリーを基準として使用することができる。したがって、好ましい態様では、本発明のdAb−エフェクター基は既知の単一主鎖コンホメーションを所持する。
【0156】
選択される単一主鎖コンホメーションは、問題とする免疫グロブリンスーパーファミリー型の分子間で一般的であるのが好ましい。あるコンホメーションを採る有意数の天然分子が観察される場合、このコンホメーションが一般的である。したがって、本発明の好適な態様では、免疫グロブリンスーパーファミリー分子の各結合ループで異なる天然の主鎖コンホメーションが個々に考慮され、その後、異なるループで所望の主鎖コンホメーションの組合せを所持する天然の免疫グロブリンスーパーファミリー分子が選択される。取得可能なものがない場合、最も近い同等物を選択してもよい。異なるループにおける所望の主鎖コンホメーションの組合せが所望の主鎖コンホメーションをコードする生殖細胞系列遺伝子セグメントを選択することによって作製されることが好ましい。選択された生殖細胞系列遺伝子セグメントが現実に頻繁に発現されていることがより好ましく、これらが全ての天然生殖細胞系列遺伝子セグメントを最高頻度で発現していることが最も好ましい。
【0157】
単一可変ドメインもしくはそのライブラリーを設計する際、6種の抗原結合ループのそれぞれにおいて異なる主鎖コンホメーションの発生率を個別に考慮してもよい。H1、H2、L1、L2およびL3については、採用される特定のコンホメーションは天然分子の抗原結合ループの20%〜100%で選択される。典型的には、その観察される発生率が35%を超え(すなわち35%〜100%)、50%もしくはさらに60%を超えるのが理想的である。圧倒的多数のH3ループは標準構造を有さないので、標準構造を示すループ間で一般的な主鎖コンホメーションを選択することが好ましい。したがって、このループのそれぞれについては、天然レパートリー中で最も頻繁に観察されるコンホメーションが選択される。ヒト抗体では、各ループについて最も一般的な標準構造(CS)は下記の通りである:H1−CS1(発現したレパートリーの79%)、H2−CS3(46%)、VのL1−CS2(39%)、L2−CS1(100%)、VのL3−CS1(36%)(計算は70:30の:λ比と仮定する、Hoodら(1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,48:133)。標準構造を有するH3ループについては、残基94〜残基101由来の塩橋を有する7残基長のCDR3(Kabatら(1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)が最も共通しているようである。EMBLデータライブリーにこのコンホメーションを形成するのに必要なH3の長さおよび鍵となる残基と共に少なくとも16種のヒト抗体配列が存在し、タンパク質データーバンクに抗体モデリングの基準として使用することができる少なくとも2種類の結晶構造(2cgrおよび1tet)が存在する。最高頻度で発現される生殖細胞系列遺伝子セグメントにおいて、この標準構造の組合せはVセグメント3〜23(DP−47)、JセグメントJH4b、VセグメントO2/O12(DPK9)およびJセグメントJ1である。したがって、これらのセグメントを基礎として組合せで用いて、所望の単一主鎖コンホメーションを含むライブラリーを構築することができる。
【0158】
あるいは、個々の各結合ループで異なる主鎖コンホメーションの自然発生に基づく単一主鎖コンホメーションを選択する代わりに、主鎖コンホメーションの組合せの自然発生が単一主鎖コンホメーションを選択する基準として用いられる。抗体の場合、例えば抗原結合ループの2、3、4、5もしくは6種全てにおける標準構造の組合せの自然発生を決定することができる。ここで、選択されるコンホメーションが天然の抗体において一般的であるのが好ましく、これが天然のレパートリーにおいて最高頻度で観察されるのが最も好ましい。したがってヒト抗体では、例えば5種類の抗原結合ループであるH1、H2、L1、L2およびL3の天然の組合せが考慮される際、単一主鎖コンホメーション選択の基礎として、標準構造の最高頻度の組合せが決定され、その後H3ループについて最も一般的なコンホメーションと組合される。
【0159】
b.標準配列の多様化
所望の多様性は典型的には1以上の位置で選択される分子を改変することによって生成される。変化されるべき位置は無作為に選択することができ、または選択されることが好ましい。次いで、変異は、常在アミノ酸が任意のアミノ酸または天然もしくは合成のその類似体と交換される間の無作為化によって非常に多数の変化を産生することにより、または常住アミノ酸を規定のアミノ酸の部分集合の1以上で置換して、より限定数の変異体を産生することにより達成することができる。
【0160】
このような多様性を導入するための様々な方法が報告されている。変異性(Error−prone)PCR(Hawkinsら(1992) J. Mol. Biol.,226:889)、化学的突然変異誘発(Dengら(1994) J. Biol. Chem.,269:9533)もしくは細菌性突然変異誘発株(Lowら(1996) J. Mol. Biol.,260:359)を用いてこの分子をコードする遺伝子に無作為な突然変異を導入することができる。選択された位置で突然変異させる方法も当業界でよく知られており、これにはPCRを使用しながらもしくは使用せずに、不一致のオリゴヌクレオチドもしくは 縮重したオリゴヌクレオチドを使用することが含まれる。例えば、いくつかの合成抗体ライブラリーは抗原結合ループに対する突然変異を標的とすることにより作製される。ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域を無作為化することにより新規な結合特異性の範囲が作製されている(Barbasら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:4457)。無作為なもしくは半無作為なH3およびL3領域を生殖細胞系列V遺伝子セグメントに加えて、非突然変異フレームワーク領域を有する大きなライブラリーが作製されている(Hoogenboom & Winter(1992) J. Mol. Biol.、227:381; Barbasら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:4457; Nissimら(1994) EMBO J.、13:692; Griffithsら(1994) EMBO J.、13:3245;De Kruifら(1995) J. Mol. Biol.、248:97)。このような多様化は別の抗原結合ループの一部もしくは全てを含むよう拡大されている(Crameriら(1996) Nature Med.、2:100; Riechmannら(1995) Bio/Technology、13:475;Morphosys、WO97/08320、前掲)。
【0161】
ループの無作為化はH3のみについて約1015以上の構造を作製する可能性を有し、かつ他の5種のループについても同程度大数の変異体を作成する可能性を有するので、現在の形質転換技術を用いること、もしくはさらに無細胞システムを用いて見込まれる全ての組合せを表すライブラリーを作製することは適当でない。例えば、現在までに構築された最も巨大なライブラリーの1つにおいて、6x1010種の異なる抗体(これはこの設計のライブラリーについて見込まれる多様性のわずか一部である)が生成された(Griffithsら(1994) 前掲)。
【0162】
非機能的構成メンバーの除去および既知の単一主鎖コンホメーションの使用に加えて、これらの制限はこの分子の所望の機能を作製もしくは改変することに直接的に関わる残基のみを多様化することにより対処される。多くの分子については、この機能は標的と結合することであり、したがって多様性は標的結合部位に集中すべきであるが、この分子全体のパッキング(packing)もしくは選択した主鎖コンホメーションを維持することに極めて重要な残基の変化は避けるべきである。
【0163】
本発明によるdAb−エフェクター基の特徴付け
本発明による単一ドメイン抗体−エフェクター基(dAb−エフェクター基)のその特異的抗原もしくはエピトープへの結合は、ELISAを含む当業者によく知られた方法で試験することができる。好適な実施形態では、結合はモノクローナルファージELISAを用いて試験される。
【0164】
ファージELISAは任意の適切な手段により実施してもよく、例示のプロトコルを以下に述べる。
【0165】
各ラウンドの選択で作製されるファージの集団は、ELISAにより、選択された抗原もしくはエピトープに対する結合についてスクリーニングし、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定することができる。これらの集団からの単一の感染型細菌コロニーに由来するファージはその後、ELISAによりスクリーニングして「モノクローナル」ファージ抗体を同定することができる。抗原もしくはエピトープに結合するために可溶性抗体フラグメントをスクリーニングすることも望ましく、これは例えばC−もしくはN−末端タグに対する試薬を用いたELISAによって着手することができる(例えばWinterら(1994) Ann. Rev. Immunology 12、433-55およびその中に記載の参考文献を参照のこと)。
【0166】
選択されるファージモノクローナル抗体の多様性は、PCR産物のゲル電気泳動(Marksら1991、前掲; Nissimら 1994 前掲)、プロービング(Tomlinsonら1992 J. Mol. Biol. 227、776)もしくはベクターDNAの配列決定によって評価してもよい。
【0167】
F.本発明による核酸構築物
一般的に、本発明の実行に要求される核酸分子およびベクター構築物は、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、USAなどの標準的な実験室マニュアルに示されるように構築および操作することもできる。
【0168】
本発明における核酸の操作は典型的には組換えベクター中で実施される。
【0169】
本明細書で用いられるように、ベクターは異種DNAの発現および/または複製のためにそのDNAを細胞内に導入することに用いられる独立した要素をいう。このようなベクターを選択もしくは構築する方法、およびそれに続く使用方法は通常の当業者によく知られている。膨大なベクターが公然利用可能であり、細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソーマルベクターが含まれる。このようなベクターを単にクローニングおよび突然変異誘発に使用してもよい。あるいは遺伝子発現ベクターが使用される。本発明に使用されるベクターは所望のサイズ、典型的には0.25キロベース(kb)〜40kb以上の長さのポリペプチドコード配列に適合するよう選択し得る。適当な宿主細胞はin vitroクローニング操作の後、このベクターで形質転換される。各ベクターは様々な機能的構成要素を含み、一般的にはクローニング(もしくは「ポリリンカー」)部位、複製起点および少なくとも1種の選択可能なマーカー遺伝子を含む。当該ベクターが発現ベクターである場合、さらに以下:エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列の1以上を、それぞれがクローニング部位に近接した位置で、これらがポリペプチドをコードする遺伝子と機能的に連結されるように所持する。
【0170】
クローニングベクターおよび発現ベクターのいずれも一般的に、1以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。典型的にクローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体DNAとは独立してベクターが複製することを可能とし、かつ複製起点もしくは自立複製配列を含む配列である。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、2ミクロンプラスミドの起点は酵母に適切であり、様々なウイルスの起点(例えばSV40、アデノウイルス)が哺乳動物細胞中でのベクターのクローニングに有用である。一般的に複製起点は、これらがCOS細胞などの哺乳動物細胞中で高レベルのDNA複製を可能にすることに用いられる場合を除いて哺乳動物発現ベクターには必要ではない。
【0171】
クローニングベクターもしくは発現ベクターが選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得ることが有利である。この遺伝子は選択培養培地中で生育する形質転換宿主細胞の生存もしくは生育に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞はこの培養培地中で生存しないだろう。典型的な選択遺伝子は抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を与え、栄養要求性欠損を補足し、または生育培地中で利用可能でない重大な栄養源を供給するタンパク質をコードする。
【0172】
ベクターの複製は大腸菌中で最も都合よく行われ、選択可能なマーカー、例えば抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらはpBR322などの大腸菌プラスミド、pUC18、pUC19もしくはpUC119などのpUCプラスミドから取得することができる。
【0173】
発現ベクターは通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含み、このプロモーターは目的のコード配列と機能的に連結されている。そのようなプロモーターは誘導性もしくは構成性であってもよい。「機能的に連結される」という用語は、記載される成分がこれらの意図される仕方で機能することを可能にする関係で存在する並列状態をいう。コード配列と「機能的に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【0174】
原核宿主と使用するのに適したプロモーターとして、例えばβ−ラクタマーゼとラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターがある。細菌系で使用するためのプロモーターも一般的にコード配列と機能的に連結されたShine−Delgarno配列を含むだろう。
【0175】
好適なベクターは、ポリペプチドに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、抗原を用いた選択は別々の伝播およびポリペプチドを発現する単一クローンの発現あるいはあらゆる選択ディスプレイシステムの使用によって行うことができる。上述されるように、好適な選択ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイである。したがって、ファージもしくはファジミドベクターを用いてもよい。好適なベクターは、大腸菌の(二重鎖複製のための)複製起点およびファージの(一本鎖DNA産生のための)複製起点も有するファジミドベクターである。このようなベクターの操作および発現は当業界でよく知られている(HoogenboomおよびWinter(1992)前掲; Nissimら(1994)前掲)。簡潔に言うと、ベクターはファジミドに選択性を与えるβ−ラクタマーゼと、(N末端からC末端に)(発現したポリペプチドを細胞周辺腔へ導く)pelBリーダー配列、(ポリペプチドのヌクレオチドバージョンをクローニングするための)多重クローニング部位、場合により(検出用の)1以上のペプチドタグ、場合により1以上のTAG終止コドンおよびファージタンパク質pIIIからなる発現カセット上流のlacプロモーターとを含む。したがって、大腸菌の様々なサプレッサー株および非サプレッサー株を使用し、かつグルコース、イソ−プロピル チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)もしくはヘルパーファージ(VCS M13など)を加えることで、ベクターは発現することなくプラスミドとして複製し、ポリペプチドのみを大量に産生し、または一部はそれらの表面にポリペプチド−pIII融合体のコピーを少なくとも1つ含むファージを産生することができる。
【0176】
本発明によるベクターの構築は慣用の連結技術を使用する。単離されたベクターもしくはDNA断片を切断し、調整し、かつ所望の形態で再連結して必要なベクターを生成する。必要に応じて、正しい配列が構築したベクター中に存在していることを確認するための分析を公知の様式で行うことができる。発現ベクターを構築するための、in vitroで転写産物を調製するための、DNAを宿主細胞に導入するための、および発現および機能を評価する分析を行うための方法は当業者に公知である。サザンもしくはノーザン分析、ウエスタンブロッティング、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析といった慣用方法でサンプル中の遺伝子配列の存在は検出され、あるいはその増幅および/または発現が定量される。当業者は必要に応じてこれらの方法をいかに改変し得るかを容易に予見するだろう。
【0177】
G:本発明によるdAb−エフェクター基の使用
本発明の方法に従って選択されるdAb−エフェクター基はin vitro治療および予防用途、in vitroおよびin vivo診断用途、in vitroアッセイおよび試薬用途などに使用してもよい。例えばdAb−エフェクター基をELISA技術など当業者に公知の方法に従って抗体に基づくアッセイ技術において使用してもよい。
【0178】
当業者は本発明のdAb−エフェクター基が所望のもしくは予め決定した抗原結合特異性に従って調製することができることを理解するであろう。さらに、本発明の方法は所望のエフェクター基を有するdAb−エフェクター基の合成が可能である。このようにエフェクター機能をdAb−エフェクター基内に設計することができる。さらに、本発明者らはこのエフェクター基の存在がこの分子のin vivo半減期を増大させることを見出した。
【0179】
上で示唆したように、本発明によるdAb−エフェクター基は診断、予防および治療方法に使用される。本発明に従って選択される単一ドメイン−エフェクター基抗体(dAb−エフェクター基)は、標準的な免疫組織化学的方法によるウエスタン分析およびin situタンパク質検出において診断的に使用される(これらの用途における使用のために選択されたレパートリーの抗体を当業界で公知の技術に基づいて標識し得る)。さらに、樹脂などのクロマトグラフ支持体に複合体化される場合、このような抗体ポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィー法において準備的に使用することもできる。このような技術は全て当業者に周知である。
【0180】
実質的に少なくとも90〜95%の均一性である本発明によるdAb−エフェクター基が哺乳動物への投与に好適であり、特に哺乳動物がヒトである場合に、98〜99%以上の均一性が医薬の使用に最も好適である。いったん要望通りに部分的にもしくは均一に精製されれば、選択されたdAb−エフェクター基は診断および/または治療(体外を含む)に使用してもよく、あるいはアッセイ方法、免疫蛍光染色などの開発および実行に用いてもよい(LefkoviteおよびPernis(1979および1981) Immunological Methods、IおよびII巻、Academic Press、NY)。
【0181】
本発明のdAb-エフェクター基は典型的には炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌もしくはウイルス感染、および自己免疫疾患(これに限定されるものではないがI型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症を含む)の予防、抑制もしくは治療における使用を見出し得る。
【0182】
即時的用途において、「予防」という用語は疾患の誘導前の防御組成物の投与に関する。「抑制」とは誘導事象後であるが、疾患の臨床的出現前の組成物の投与をいう。「治療」とは疾患の症状が明らかになった後の防御組成物の投与に関する。
【0183】
疾患に対して防御するもしくは疾患を治療する際に、dAb−エフェクター基のスクリーニングに使用することができる動物モデルシステムが利用可能である。感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス(SLE)を試験するための方法が当業界で公知である(Knightら(1978) J. Exp. Med.、147:1653; Reinerstenら(1978) New Eng. J. Med.、299:515)。雌のSJL/Jマウスにおいて重症筋無力症(MG)が別種由来の可溶性AchRタンパク質によって疾患を誘導することにより試験される(Lindstromら(1988) Adv. Immunol.、42: 233)。マウスの感受性系統において、II型コラーゲンの注射により関節炎が誘導される(Stuartら(1984) Ann. Rev. Immunol.、42:233)。感受性ラットにおいて、関節炎がミコバクテリウムの熱ショックタンパク質の注入により誘導されるアジュバントによるモデルが記載されている(Van Edenら(1988) Nature、331:171)。Maronら(1980)J.Exp.Med.、152:1115に記載されるようにマウスにおいてチログロブリンの投与により甲状腺炎が誘導される。Kanasawaら(1984)Diabetologia、27:113に記載されるようなマウスの特定の系統において、インシュリン依存性糖尿病(IDDM)は自然に生じるかもしくは誘導することができる。マウスおよびラットのEAEはヒトにおけるMSのモデルとして役立つ。このモデルにおいて、脱髄疾患はミエリン塩基性タンパク質の投与によって誘導される(Paterson (1986) Textbook of Immunopathology、Mischerら編、GruneおよびStratton、New York、pp.179-213; McFarlinら(1973) Science、179:478:ならびにSatohら(1987) J. Immunol.、138:179を参照)。
【0184】
一般的に、dAb−エフェクター基は薬理学的に適切な担体と一緒に精製された形態で利用されるだろう。典型的にこれらの担体として、生理食塩水および/または緩衝化媒体をいくらか含む水性もしくはアルコール性/水性の溶液、乳液もしくは懸濁液がある。非経口ビヒクルには塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲルが含まれる。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持することが必要な場合、適切な生理学的に許容されるアジュバントをカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギナートなどの増粘剤から選択し得る。
【0185】
静脈内ビヒクルには、例えばリンゲルデキストロースを主成分とする液体および栄養補液ならびに電解質補液が含まれる。抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物が存在してもよい(Mack(1982) Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版)。
【0186】
本発明のdAb−エフェクター基は別々に投与される組成物として使用してもよく、もしくは他の薬剤と共に使用してもよい。これらはシクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンもしくはシスプラチナムなどの様々な免疫療法薬および免疫毒素を含むことができる。医薬組成物は本発明のdAb−エフェクター基と共に様々な細胞毒性薬剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、または異なる標的リガンドを用いて選択される可変ドメインを有するdAb−エフェクター基といった異なる特異性を有する本発明のdAb−エフェクター基の組合せを、これらが投与前にプールされるかどうかに関わらずに含むことができる。
【0187】
本発明による医薬組成物の投与経路は当業者に共通して知られる経路のいずれかであってもよい。治療(限定されるものではないが、免疫療法を含む)のために、本発明のdAb−エフェクター基および組成物は標準的な技術に従ってあらゆる患者に投与することができる。投与は非経口的経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮的経路、肺経路を介することを含むいかなる適切な様式によることもでき、または適切にはカーテルを用いた直接的な注入も可能である。投与の用量および頻度は患者の年齢、性別および状況、別の薬剤の同時投与、誘導刺激および臨床医によって考慮されるべき他のパラメーターに依存するであろう。
【0188】
この発明のdAb−エフェクター基は貯蔵のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で再構成することができる。この技術は通常の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当業界で公知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成が、抗体活性の欠失の度合いを(例えば通常の免疫グロブリンでは、IgM抗体はIgG抗体よりも大きな活性の欠失を有する傾向にある)変化させることに導き得ること、および使用レベルを調節して上向きに補正する必要があり得ることは当業者に理解されるであろう。
【0189】
dAb−エフェクター基もしくはそのカクテルを含む組成物は予防および/または治療処置として投与することができる。特定の治療用途では、選択された細胞集団の少なくとも一部の阻害、抑制、調節、死滅もしくはまた別の測定可能なパラメーターを達成するのに十分な量を「治療上有効量」と定義する。この用量を達成するのに必要な量は疾患の重篤度および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存するが、一般的に選択された抗体、レセプター(例えばT細胞レセプター)もしくはその結合性タンパク質は体重1キログラム当たり0.005〜5.0mgの範囲であり、0.05〜2.0mg/kg/用量の用量がより一般的に用いられる。予防の用途については、dAb−エフェクター基もしくはそのカクテルを含む組成物は同様のもしくはわずかに低い投与量で投与することもできる。
【0190】
本発明によるdAb−エフェクター基もしくはそのカクテルを含む組成物は、哺乳動物における選択標的細胞集団の改変、不活性化、死滅もしくは除去に役立つ予防および治療設定に利用することもできる。さらに、本明細書に記載されるdAb−エフェクター基は体外もしくはin vitroで選択的に使用して、異種の細胞集合に由来する標的細胞集団を死滅、枯渇またその他には効率的に除去することもできる。哺乳動物由来の血液を選択した抗体、細胞表面レセプターもしくはその結合性タンパク質と体外で組合せて、標準技術に従って哺乳動物に戻す目的で望まれていない細胞を死滅させるか、もしくはその他、血液から除去することもできる。
【0191】
本発明を、以下の実施例において実例のみを目的としてさらに説明する。
【実施例1】
【0192】
実施例1.dAb−Fc融合構築物の作製
この実施例はVκ−FcおよびV−Fc融合体(いずれの融合体についてもFcはIgG1に由来し、Fcはヒンジ−CH2−CH3である)を作製する方法を説明する。β−ガラクトシダーゼ結合性VκdAb E5をVκ−Fc融合体を作製するために用い、アルカリホスファターゼ(APS)結合性VdAb VH2をV−Fc融合体を作製するために用いた(VκdAb E5およびVdAb VH2の配列は表1aに示される)。
【0193】
HindIIIおよびNotI制限部位をオリゴヌクレオチドVK5Hind、VH5HindおよびVH3Notを用いてE5 dAbおよびVH2 dAbの5’および3’末端それぞれに導入した(表1a、既に存在しているためE5 dAbの3’末端にNotI部位を導入する必要がなかったことに注意されたい)。
【0194】
E5−FcおよびVH2−Fc融合体を作製するため、次いでE5Vκ dAbおよびVH2V dAbを含むHindIII/NotI消化フラグメントをHindIII/NotI消化Signal pIgplusベクター(R&D Systems Europe Ltd、図2)中に連結した。連結混合物をコンピテント大腸菌TG1細胞中に形質転換し、組換えクローンをコロニーPCRスクリーニングによって確認し、PIG5SEQおよびPIG3SEQオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した(表1b)。
【表1a】

【0195】
【表1b】

【実施例2】
【0196】
実施例2.哺乳動物細胞におけるdAb−Fc融合タンパク質の発現
この実施例はE5−FcおよびVH2−Fc融合体(実施例1)を哺乳動物細胞中で発現させることができ、かつ産生したタンパク質が親dAbの抗原特異性を維持していることを説明する。
【0197】
3種の哺乳動物細胞系(COS1、COS7およびCHO)をFuGENE 6 Transfection Reagent(Roche)を用いてE5 dAbを含むpIgplusでトランスフェクトし、VH2 dAbを含むpIgplusプラスミドDNA(実施例1)でトランスフェクトした。安定した形質転換細胞系をG418(COS1およびCOS7細胞については1mg/ml、CHO細胞については0.5mg/ml)を含む選択培地を用いて生成した。
【0198】
dAb−Fc融合タンパク質の発現を調べるため、25mlのトランスフェクトした細胞由来の消耗した組織培養培地を収集し、0.45μフィルターを用いてろ過し、その後プロテインAセファロースカラムを通過させた。dAb−Fc融合体を0.4ml 1M Tris、pH0.9内へ入れた1.6ml 0.1Mグリシン pH2.0を用いて溶出した。生じる2mlサンプルの50μlを、PBS中10μl/ml濃度で100μlのAPSおよびβ−ガラクドシダーゼを用いて、4℃一晩でコートしたELISA(標準的なELISAプロトコルに従った)96ウェルプレート中で試験した。検出は抗ヒトIgG(Fc特異的)−HRPコンジュゲート(Sigma)を用いて実施した。ELISAの結果は全ての細胞系が正確な特異性のdAb−Fc融合体を発現することを立証する(図3c)。無関係な抗原との交差反応性(E5−FcについてはAPS、VH2−Fcについてはβ−ガラクトシダーゼ)は観察されなかった(図3c)。
【0199】
SDS(非還元性)ゲルにおけるdAb−Fc鎖の分析は、これらが約80kDaのMWを有する(ヒンジでジスルフィド結合された)二量体として主に産生されることを示している(図3a)。40kDaのバンドもゲル上で可視化し(図3a)、これはこのタンパク質の一部は単量体形態として存在していることも示している。
【0200】
グリコシル化の染色はE5−Fcタンパク質がグリコシル化されることを明らかにした(図3b)。
【0201】
発現および精製手順の最適化に従えば、COS1細胞からのE5−Fc融合タンパク質の産出は20mg/lである。VH2−Fc融合体の発現レベルはより低い。
【実施例3】
【0202】
実施例3.ヒトFcレセプターを発現する細胞系へのE5−Fc融合タンパク質の結合
この実施例はE5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを説明する。精製したE5−Fcタンパク質をフルオレセイン(3.3/1のフルオレセイン/タンパク質比率で)で標識した。その後、標識したタンパク質(491μg/ml濃度)をFACS分析に用いた。二種類のタイプのヒトFcRs(CD64およびCD32)を発現するヒト単球様U937細胞を用いてE5−Fc融合タンパク質がこれらのレセプターに結合する能力を評価した。FACS結果はE5−Fc融合タンパク質がU937細胞系(5x10個のU−937細胞を80μlの標識タンパク質(1:50希釈)と共にインキュベートし、ライブで調査した)に結合することを示している(図4)。U−937細胞におけるレセプターブロッキング調査は、E5−Fc鎖が主にCD32レセプターに結合することを示した(データは示されない)。この結果を確認するため、Raj 1細胞(CD32レセプターのみを発現する)をFACS分析に用いた。FACS結果はE5−Fc鎖がRaj 1細胞に結合することを立証する(図5)。
【実施例4】
【0203】
実施例4.dAb−Fc融合体の薬物動態学的分析
薬物動態学的分析のために、6群のオスCD1マウス3個体(年齢は約6〜7週間;体重は約25〜30g)を50μgのdAb−Fc(実施例1に記載されるE5−Fc)を用いて尾静脈に静脈内(i.v.)注射した。E5−Fcタンパク質を実施例2に記載される哺乳動物細胞系から精製し、500容量のリン酸緩衝生理食塩水に対して2時間以上2回透析した。6群のオスCD1マウス3個体(年齢は約6〜7週間;体重は約25〜30g)を50μgのdAb(C末端HAエピトープタグを有するHEL−4と称する抗メンドリ卵リゾチームdAb、アミノ酸配列については下記を参照のこと)を用いて尾静脈に静脈内注射した。HEL−4は大腸菌株HB2151中で発現され、プロテインAおよび陰イオン交換を用いた標準的なクロマトグラフィーによってペリプラズム画分から精製した。このタンパク質を500容量のリン酸緩衝生理食塩水に対して2時間以上2回透析した。
【0204】
HEL−4のアミノ酸配列

【0205】
選択した時点で、各群からの3個体の動物を人道的に屠殺し、最終的な血液サンプルを収集した。この血液を凝固させ(約30分)、続いて遠心分離して血清を調製した。この血清をデカントして分析まで凍結保存した。dAbもしくはdAb−Fcタンパク質の濃度を測定するため、血清サンプルを2%(v/v)のTween−20を含むリン酸緩衝生理食塩水中で希釈し、抗原捕捉ELISAによってアッセイした。HEL−4については、抗原はメンドリ卵リゾチームであり、これを1.59g/l NaCO、2.93g/l NaHCO pH9.6を含む緩衝液中3mg/ml、4℃でMaxisorpプレート(Nunc)上に一晩コートした。E5−Fcについては、抗原はリン酸緩衝生理食塩水中10μg/ml、4℃でMaxisorpプレート(Nunc)上に一晩コートしたβ−ガラクトシダーゼであった。HEL−4およびE5−Fcのこれらそれぞれの抗原への結合を、それぞれHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)標識化ラットモノクローナル抗HAエピトープ抗体(Roche)もしくはHRP標識化ヤギポリクローナル抗ヒトFc抗体(Sigma)を用いて検出した。既知の濃度のHEL−4およびE5−Fcを用いてこれらの読み取りを較正した。マウス薬物動態学的実験(図6および表2)は、dAbと比較してFc領域と融合したdAbについて、血清中での半減期がかなり増加したことを証明する。
【表2】

【実施例5】
【0206】
実施例5.関節炎のヒトTNFトランスジェニックモデルにおけるTAR1−5−19の有効性調査
本明細書で言及されるように、TAR1−5−19は標的ヒトTNFα(TAR1)に特異的に結合するDabである。
【0207】
Tg197マウスはヒトTNF−グロビンハイブリッド遺伝子のトランスジェニックであり、ヘテロ接合体は4〜7週間の年齢で慢性関節リウマチと共通の組織的特徴を有する慢性的、進行性の多発関節炎を生じる(Keffer,J.、Probert,L.、Cazlaris,H.、Georgopoulos,S.、Kaslaris,E.、Kioussis,D.、Kollias,G.(1991). Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J.、Vol.10、pp.4025-4031.)。
【0208】
Tg197モデルにおいて、関節炎の予防におけるVκ dAb Fc融合体(IgG1のCH2−CH3領域へ融合したdAb、dAbはTAR1−5−19である)の有効性を試験するため、ヘテロ接合性トランスジェニックマウスを同数のオスとメスを含む10個体の動物の5つの群に分けた。処置は3週齢で、週に2回試験項目の腹腔内注射により開始した。処置群を表1に列挙している。対照のdAb−FcはヒトIgG1のFc領域と抗β−ガラクトシダーゼdAb(E5と称する)との間での融合体であり、安定的にトランスフェクトしたCOS−7細胞系の上清中で発現した。TAR1−5−19−Fc融合体はCOS−7の一過的なトランスフェクションによって発現した。いずれのFc融合タンパク質もプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。TAR1−5−19単量体は大腸菌中で発現し、プロテインLクロマトグラフィーとIEXによって精製した。全てのタンパク質調製物は、リン酸緩衝生理食塩水中に存在し、許容され得るレベルの内毒素について試験した。
【表3】

【0209】
この調査はブラインド(blind)で実施した。毎週、動物の体重を量り、関節炎のマクロ表現兆候(macrophenotypic sign)を以下のシステムに従ってスコアを付けた:0=関節炎なし(標準的な外観および屈曲)、1=軽い関節炎(関節の歪曲)、2=適度な関節炎(腫脹、関節の変形)、3=重度の関節炎(重度の運動障害)。10週目に、動物の足首/脚と膝関節を固定し、包埋し、以下のシステムを用いて組織病理学的分析を脚関節において行った:0=検出可能な病状なし、1=滑膜の過形成および多形核浸潤の存在、2=パンヌスおよび繊維組織形成ならびに局所的な亜軟骨侵食(subchondral bone erosion)、3=関節軟骨破壊および骨侵食、4=広範な関節軟骨破壊および骨侵食。組織構造はブラインドでスコアを付けた。
【0210】
関節炎スコアの結果は、10mg/KgのTAR1−5−19−Fc融合体が関節炎の発症を阻害することを明確に立証した(図7を参照)。10週目におけるTAR1−5−19−Fcの関節炎スコア中央値と、対照dAb−Fc、TAR1−5−19単量体もしくは生理食塩水対照のいずれかとの比較は、統計学的に有意な効果を与えた(P<0.1%)。TAR1−5−19−Fcの低用量は対照dAb−Fcよりも低い関節炎スコア中央値を生じさせるが、その違いは統計学的に有意ではなかった。生理食塩水群においては、1mg/KgのTAR1−5−19−Fc群と比較して関節炎がより早期に生じるいくつかの証拠が存在した(P<5%)。
【0211】
関節における関節炎のマクロ表現スコアからの結果を組織病理学的スコアに反映した(図8を参照)。高用量のTAR1−5−19−Fcを用いた予防処置は、対照群と比較した際、より低い組織病理学的スコアを生じた。
【0212】
トランスジェニック動物においてTNFを循環するレベルを増加させる影響を有する悪液質は、TAR1−5−19−Fc(高用量)によって強力に阻害された(図9を参照)。
【0213】
結論として、TAR1−5−19−Fcが関節炎のTg197モデルにおいて非常に効果的な治療となることが示された。
【実施例6】
【0214】
実施例6.ピキア・パストリス(Pichia pastoris)におけるdAb−Fc融合タンパク質の発現
ベクター構築
ピキアにおけるdAb Fc融合タンパク質のメタノール誘導性、分泌性発現のためのベクターを、発現ベクターpPICZalpha(Invitrogen)に基づいて構築した。このベクターをXbaIとKpnIによる消化によって改変して、1247位のヌクレオチドでXhoI部位を除去し、Pfuポリメラーゼで平滑末端化して再連結した。ヌクレオチド1315位のSalI部位をSalIにより消化することにより除去し、Pfuポリメラーゼで平滑末端化して再連結した。続いてVK dAb−Fc融合体を、下記のプライマーおよびPfuTurbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて上述される哺乳動物発現構築物からPCR増幅した。
【0215】

【0216】
PCR産物をXhoIとEcoRIで消化した後、EcoRI/XhoI消化発現ベクター中にクローニングした。これにより抗TNF Fc融合タンパク質を産生し得る構築物pPICZalpha−TAR1−5−19Fcを生じさせた。
【0217】
VHもしくはVKdAbのFc融合体を作製するための一般的なベクターを構築するため、XhoI−NotI dAbフラグメントをpPICZalpha−TAR1−5−19Fcから切り取り、フレーム中にSaI部位(制限部位:5’−CTCGAGAAAAGAGCGTCGACATCTAGATCAGCGGCCGC−3’を含むフラグメントの配列)を含んだXhoI−NotIリンカーで置換した。
【0218】
続いて、別のdAbを以下のプライマー対を用いたPCR増幅後に、XhoIとNotIを用いて消化したこのベクター中にクローニングし、XhoI NotIフラグメントとしてクローニングすることができた。
【0219】
VH dAb用:

VK dAb用:

配列を以下のプライマーを用いた配列決定により確認した。

【0220】
全てのクローニングは大腸菌TOP10F’細胞中で行った。このベクターはピキアの形質転換前にPmeIで線状化した。
【0221】
このベクターはピキア・パストリスのゲノム中に組み込まれた際にメタノールによる誘導によって抗TNF組換えdAb−Fc融合タンパク質TAR1−5−19Fcを発現するだろう。このタンパク質は培養培地への分泌を指令するアミノ末端酵母α接合因子分泌シグナルと共に産生され、その間にKex2プロテアーゼによって切断されて、培養上清から精製することができる均質のdAb−Fc融合タンパク質を残す。
【0222】
ここで産生されるタンパク質はdAbとFc領域との間に第Xa因子プロテアーゼ切断部位を有する。これはこのタンパク質の機能的分析に役立つが、柔軟なポリペプチドリンカー、柔軟性のないポリペプチドリンカー、もしくはその他特異的プロテアーゼで切断可能な配列のいずれかによって置換することができる。
【0223】
特異的プロテアーゼ切断部位の使用は、標的組織が発現していない場合に、選択されたプロテアーゼも発現している非標的組織において抗原と非特異的に結合するタンパク質の量を減らす際に利益を与える。これは標的化免疫毒素、薬物コンジュゲートもしくはプロドラッグ活性化酵素に有用であり得る。
【0224】
α因子リーダー配列から始まりEcoRIクローニング部位までのα因子dAb Fc融合タンパク質のヌクレオチド配列が下記および図10に示される。
【0225】

【0226】
上記のヌクレオチド配列によってコードされるα因子dAb Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示し、また図11にも示される。
【0227】

【0228】
下線は酵母α接合因子リーダーの配列である。イタリック表記はdAbの配列である。Fc部分は太字である。第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むこの場合、dAbおよびFc領域はポリペプチドスペーサーによって分離されている。
【0229】
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株KM71Hの形質転換
ピキアをエレクトロポレーションのために、0.51YPD(1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、2%(w/v)グルコース)培地中30℃で1.0のOD600nmまでピキア・パストリスを生育することによりコンピテント化した。その後、この細胞を氷冷水で2回、20mlの氷冷1Mソルビトールで1回洗浄し、1mlのソルビトール中に再懸濁した。生じた懸濁液の80マイクロリットルを上述されるように作製した10μgのPmeI線状化ベクターを含む水の10マイクロリットルと共に氷上で5分間インキュベートし、続いて0.2cmの電極ギャップエレクトロポレーションキュベット中で(0.54kV、25ミクロファラド)、キャパシタンス拡張装置を備えたBiorad gene pulserII(Biorad)における無限大の抵抗設定でエレクトロポレートした。細胞を1mlの1Mソルビトール中に回収し、続いて100、500、1000もしくは2000μg/mlのゼオシンで補足したYPDSプレート(1.5%(w/v)寒天中、1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、2%(w/v)グルコース、1Mソルビトール)上にプレーティングした。プレートを2〜3日間30℃で生育し、続いてコロニーを再塗布して(re−streaked)クローン集団を単離した。その後クローンを下記に記載されるように発現レベルについて特徴付けた。
【0230】
このような結果はX33などの他のピキア・パストリス株、もしくは発現の間dAb−Fc融合タンパク質のタンパク質分解切断を減少するのに有利なプロテアーゼ欠損株smd1163、smd1165もしくはsmd1168においても取得することができる。あるいは、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)などの別のピキア種、またはハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジタ・ボイジニイ(Candida boidinii)、もしくはアスペルギルス・アワモリイ(Aspergillus awamorii)などの他の酵母および真菌種もdAb Fc融合タンパク質の発現に適切であろう。
【0231】
発現
発現は、バッフル振とうフラスコにおいて、炭素源としてグリセロールを含む合成BMGY培地(1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、1%(v/v)グリセロール、1.34% (w/v)酵母窒素塩基、4x10−5%(w/v)ビオチン、100mM KPOバッファー pH6.0)中で実施した。培養物を250rpmで振とうしながら30℃で10のOD600nmまで生育し、続いてペレットを遠心分離により回収し、発現を誘導すべくBMMY(1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、0.5%(v/v)メタノール、1.34%(w/v)酵母窒素塩基、4x10−5%(w/v)ビオチン、100mM KPOバッファー pH6.0)中に再懸濁した。30℃での誘導後24〜48時間で30mg/mlのピーク発現レベルが観察された。
【0232】
生育および発現は、最小培地もしくはケミカリー・ディファインド(chemically defined)培地を含む別の培地中、並びに合成培地中で実施することもでき、同様の結果をもたらす。発酵槽中での、供給バッチ(fed batch)もしくは連続工程を用いた炭素源供給の制御、メタノール誘導レベルの制御、酸素レベルの制御がなされた条件下におけるより高細胞密度への生育は、より高発現レベルをもたらし得る。
【0233】
グリコシル化パターンがヒトにおいて見られるものに近似していることが必要な場合、哺乳動物様グリコシル化はHamilton SR、Bobrowicz P、Bobrowicz B、Davidson RC、Li H、Mitchell T、Nett JH、Rausch S、Stadheim TA、Wischnewski H、Wildt S、Gerngross TU(2003).Production of complex human glycoproteins in yeast. Science. 29;301(5637):1171に記載されているように、ピキア中のグリコシル化酵素(glycosylation enzyme)の改変により取得することができる。これにより均一のグリコシル化産物を産出し得る。
【0234】
精製
精製を20分間、4℃で2000xgでの遠心分離により浄化した上清において行った。上清を20cmの深さのベッドの流線型プロテインAマトリックス(Amersham Biotech)上に300cm/時間で装填した。装填の後、結合していない物質を0.35M NaClで補足されたPBSを用いて洗浄することで除去した。融合タンパク質を0.1M グリシン、0.15M NaCl、pH 3.0により溶出した。分画を0.2容量の1M Tris−HCl、pH 8.0で中和した。純粋なdAb−Fc融合体を、5mlのResource Qカラム(Amersham Biotech)上で(20mM Tris−HClバッファー、pH8.5、0〜0.5MのNaCl勾配を用いた)イオン交換クロマトグラフィーによってこの物質からさらに精製した。
【0235】
分析
結果は図13に示される。
アミノ末端の配列決定は、このタンパク質が5サイクルのエドマン分解後にピキア・パストリスのKex2プロテアーゼによって予測されるように処理されて、NH−EDQIMのアミノ末端配列を生じていたことを示した。
【0236】
非還元性および還元性SDS−PAGE分析(図13)は、このタンパク質が哺乳動物発現ベクター中の同じTAR1−5−19−Fc融合タンパク質構築物を用いて哺乳動物細胞中で産生されたものと同じ大きさであったことを示した。
【0237】
75%以上のFcホモダイマーは鎖間ジスルフィド結合によって連結したが、25%以上はジスルフィド結合しなかった。これは哺乳動物細胞で見られる状況に類似しており、その際Fc融合タンパク質の一部は非ジスルフィドリンカーホモダイマーとして存在する。
【0238】
Superdex 75カラム(Amersham Biotech)におけるゲル濾過分析はグリコシル化ホモダイマーについて予測される102.4kDaの予測分子量を与えた。
【0239】
抗原結合活性
結果は図12に示される。
【0240】
抗原結合活性をTNFレセプター結合アッセイを用いて判定した(図12)。96ウェルNunc Maxisorpプレートをマウス抗ヒトFc抗体でコーティングし、1% BSAでブロッキングした後、TNFレセプター1−Fc融合体を添加する。様々な濃度のdAb−Fc融合タンパク質を10ng/mlのTNFタンパク質と混合し、室温で1時間以上インキュベートする。この混合液をTNFレセプター1−Fc融合タンパク質をコーティングしたプレートに添加して、室温で1時間インキュベートする。続いてこのプレートを洗浄して未結合の遊離dAb−Fc融合体、TNFおよびdAb−Fc/TNF複合体を除去する。その後、このプレートを順にビオチン化抗TNF抗体およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベートした。次にこのプレートを発色性西洋ワサビペルオキシダーゼ基質TMBと共にインキュベートした。発色を1M 塩酸の付加により停止し、吸光度を450nmで読み取った。吸光度の読み取りはTNF結合の量に比例し、したがってTAR1−5−19Fc融合タンパク質はTNFの結合についてTNFレセプターと競合し、アッセイにおけるこのシグナルを減少し得る。
【0241】
ピキア・パストリスが産生したタンパク質は上述したin vitroTNFレセプターアッセイにおける哺乳動物タンパク質と同等の活性を有した。
【0242】
補体活性化活性
産生されたこのタンパク質は、以下のアッセイによって測定されるように、抗原の結合後にヒトの補体の活性化に有効であった。
【0243】
96ウェルMaxisopプレート(Nunc)をヒトTNF(1μg/ml)でコーティングした。dAb−Fc融合体もしくは対照抗体をTNFをコーティングしたプレートと結合させ、これをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより未結合の抗体を除去し、続いてヒト補体C1(1μg/ml)(Merck Biosciences、化学量論的に(C1r) (C1s) C1qの複合体から構成される)とともに補体固定希釈バッファー(Oxoid、0.575g/l バルビタール、8.5g/l NaCl、0.168g/l MgCl、0.028g/l CaCl、0.185g/l バルビタール可溶性物質、pH 7.2)中で30分間プレインキュベートし、その後、基質メトキシカルボニル−Lys(z)−Gly−Arg−pNA(Bachem)を加えて2.5mMの最終濃度とした。これを活性化C1で切断してpNAを放出させて、続いて、アッセイはpNAの放出に起因する405nmにおける発色が続く。
【0244】
180分後、82.5μg/mlでは、dAb−Fc融合体はバックグラウンドを超える0.09AUの405nmで吸光度を与えた。
【0245】
補体活性化がdAb−Fc融合体の機能性(標的腫瘍細胞の補体溶解など)に重要である状況では、この活性が有利である。Fc融合体が他の理由で、補体活性化が要求されないかもしくは機能に有害である場合、グリコシル化アスパラギン残基の除去によりグリコシル化部位が除去され、相同なアグリコシル(aglycosyl)タンパク質が産生し得る。
【0246】
上記の明細書中で言及される全ての刊行物、および該刊行物中に記載される参考文献は、参照により本明細書に組み入れる。記載される本発明の方法およびシステムの様々な改変ならびに変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好適な実施形態との関連で記載されているが、特許請求の範囲に記載の発明をそのような特定の実施形態に不当に制限すべきでないことを理解すべきである。実際、分子生物学もしくは関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するために記載される様式の様々な改変は添付の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【0247】
【図1】図1は、本発明による種々の好適なdAb−エフェクター基を示す。
【図2】図2は、E5−FcとVH2−Fc融合体を作製するのに使用されるsignal pIgplusベクターを示す。
【図3a】図3aは、本発明による免疫グロブリンエフェクター基の精製を表すSDSページゲルを示す。
【図3b】図3bは、本発明による免疫グロブリン−エフェクター基のグリコシル化を示す。
【図3c】図3cは、Cos−1細胞、Cos−7細胞およびCHO細胞が、正しい特異性で、かつ無関係な抗原との交差反応なくdAb−Fc融合タンパク質の発現を可能にすることを立証するELISA結果を示す。
【図4a】図4aは、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示す。図4aはU−937細胞(対照)の結果を示す。
【図4b】図4bは、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示す。図4bは抗CD64抗体(陽性対照)と共にインキュベートしたU−937細胞の結果を示す。
【図4c】図4cは、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示す。図4cは抗CD32抗体(陽性対照)と共にインキュベートしたU−937細胞の結果を示す。
【図4d】図4dは、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示す。図4dは抗CD16抗体(陰性対照)と共にインキュベートしたU−937細胞の結果を示す。
【図4e】図4eは、E5−Fc融合タンパク質がヒトFcレセプターを発現する細胞系に結合することができることを示す。図4eはE5−Fc融合タンパク質と共にインキュベートしたU−937細胞の結果を示す。
【図5】図5は、FACSの結果より、E5−Fc鎖がRaj 1細胞に結合することが示されたことを示す。
【図6】図6は、薬物動態学的分析の結果を示す。
【図7】図7は、Tg197マウスの関節炎スコアに与える週に2回のTAR1−5−19注射の効果を示す。
【図8】図8は、異なる処置群由来の足関節の組織病理学的スコアを示す。
【図9】図9は、Tg197マウスの群平均重量に与える週に2回のTAR1−5−19注射の効果を示す。
【図10】図10は、α因子リーダー配列の始めからEcoRIクローニング部位までのα因子dAb Fc融合タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
【図11】図11は、図10に示される配列によってコードされるα因子dAb Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図12】図12は、抗原結合活性をTNFレセプター結合アッセイを用いて決定した結果を示す。
【図13】図13は、哺乳動物細胞(レーン1と2)およびピキア・パストリス(レーン3)で産生されたTAR1−5−19Fc融合タンパク質(プロテインA親和性により精製)間の比較を表示する、非還元の15%SDS−PAGEゲルを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程:
(a) エピトープ結合特異性を有する抗体単一可変ドメインを選択すること;および
(b) 工程(a)の単一ドメインをエフェクター基と連結すること、
を含むin vivoでの使用に適した単一ドメイン−エフェクター基(dAb−エフェクター基)を合成する方法。
【請求項2】
前記抗体単一可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記抗体単一可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
前記軽鎖可変ドメインが、ドメインのVサブグループの構成メンバーである、請求項3に記載の方法。
【請求項5】
前記軽鎖可変ドメインが、ドメインのVλサブグループの構成メンバーである、請求項3に記載の方法。
【請求項6】
前記エフェクター基が、抗体軽鎖定常領域(C)、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメイン、抗体のFc領域および抗体分子のヒンジ領域よりなる群から選択されるいずれか1以上の基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記エフェクター基が抗体のFc領域を構成する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記エフェクター基がCH2およびCH3ドメインからなる、請求項6に記載の方法。
【請求項9】
前記エフェクター基がCH2ドメイン、CH3ドメインおよび抗体分子のヒンジ領域からなる、請求項6に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体単一可変ドメインがラクダ科の動物以外(non−Camelid)の可変ドメインである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体単一可変ドメインがヒト可変ドメインである、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記抗体単一可変ドメインが1以上のヒトフレームワーク領域を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体単一可変ドメインがカバット(Kabat)により定義されるヒト由来の4つのフレームワーク領域を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項14】
カバット(Kabat)により定義される1以上のヒトフレームワーク領域が、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子によってコードされるものとアミノ酸レベルで同一である、請求項12または13に記載の方法。
【請求項15】
前記抗体単一可変ドメインを、部分的に、ヒトの免疫処置により単離する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗体単一可変ドメインを動物の免疫処置により単離しない、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項17】
前記抗体単一可変ドメインがスーパー抗原のプロテインAもしくはプロテインLに結合する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項18】
前記エフェクター基がラクダ科の動物(Camelid)もしくはヒト起源である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項19】
前記単一可変ドメインが1以上のヒトフレームワーク領域を含み、かつ免疫グロブリンエフェクター基がヒト起源である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項20】
単一可変ドメインが4つのヒトフレームワーク領域を含み、かつ免疫グロブリンエフェクター基がヒト起源である、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
工程(b)における単一可変ドメインのエフェクター基への連結が、融合ポリペプチドとして単一ドメイン−エフェクター基を発現することにより生じる、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】
請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて取得することが可能なdAb−エフェクター基。
【請求項23】
医薬として使用するためのdAb−エフェクター基。
【請求項24】
前記抗体単一可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項22または23に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項25】
前記抗体単一可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項22または23に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項26】
前記軽鎖可変ドメインがドメインのVκサブグループの構成メンバーである、請求項25に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項27】
前記軽鎖可変ドメインがドメインのVλサブグループの構成メンバーである、請求項25に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項28】
前記エフェクター基が、抗体軽鎖定常領域(C)、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメイン、抗体のFc領域および抗体分子のヒンジ領域よりなる群から選択されるいずれか1以上の基を含む、請求項22〜27のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項29】
前記エフェクター基がCH2およびCH3ドメインからなる、請求項28に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項30】
前記エフェクター基がCH2ドメイン、CH3ドメインおよび抗体分子のヒンジ領域からなる、請求項28に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項31】
前記エフェクター基が抗体のFc領域を構成する、請求項28に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項32】
前記抗体単一可変ドメインがヒト起源である、請求項22〜31のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項33】
前記抗体単一可変ドメインがヒトフレームワーク領域を含む、請求項22〜31のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項34】
前記エフェクター基がラクダ科の動物(Camelid)もしくはヒト起源である、請求項22〜33のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項35】
単一可変ドメインが1以上のヒトフレームワーク領域を含み、かつ免疫グロブリンエフェクター基がヒト起源である、請求項16〜23のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基。
【請求項36】
以下:二量体、三量体および多量体よりなる群から選択される高次構造として提供される、請求項22〜35のいずれか1項に記載の2以上のdAb−エフェクター基。
【請求項37】
ヘテロダイマーもしくはホモダイマーとして提供される、請求項36に記載の2つのdAb−エフェクター基。
【請求項38】
ホモダイマーとして提供される、請求項37に記載の2つのdAb−エフェクター基。
【請求項39】
請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基を少なくともコードしている核酸分子。
【請求項40】
発現の際に宿主細胞の細胞質からdAbとエフェクター基とを排出するためのシグナル配列をさらにコードする、請求項39に記載の核酸分子。
【請求項41】
請求項39または請求項40に記載の核酸を含むベクター。
【請求項42】
請求項41に記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項43】
請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基と、製薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含む組成物。
【請求項44】
15分以上のt1/2αを有する請求項43に記載の組成物。
【請求項45】
1〜6時間のt1/2αを有する請求項43に記載の組成物。
【請求項46】
2.5時間以上のt1/2βを有する、請求項43、44もしくは45に記載の組成物。
【請求項47】
1日以上のt1/2βを有する請求項43に記載の組成物。
【請求項48】
2日以上のt1/2βを有する請求項47に記載の組成物。
【請求項49】
3日以上のt1/2βを有する請求項48に記載の組成物。
【請求項50】
1mg.min/ml以上のAUCを有する請求項43〜47のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項51】
15〜150mg.min/mlのAUCを有する請求項50に記載の組成物。
【請求項52】
患者における疾患を治療および/または予防する方法であって、請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基、または請求項43〜51のいずれか1項に記載の組成物を患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項53】
疾患の治療および/または予防のための医薬調製における、請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基、または請求項43〜51のいずれか1項に記載の組成物の使用。
【請求項54】
炎症性疾患の治療および/または予防方法であって、そのような治療および/または予防を必要とする患者に、請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基の治療上有効量を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項55】
患者における炎症性疾患の予防および/または治療のための医薬調製における請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基の使用。
【請求項56】
前記炎症性疾患がTNFαによって介在され、かつ以下:慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、多発性硬化症、敗血症性ショック、アルツハイマー、冠状動脈血栓症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および糸状体腎炎よりなる群から選択される、請求項54に記載の方法または請求項55に記載の使用。
【請求項57】
患者におけるTNFαによって介在される悪液質を減少および/または予防および/または抑制する方法であって、そのような治療を必要とする患者に請求項22〜38のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基の治療上有効量を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項58】
患者における悪液質を減少および/または予防および/または抑制するための医薬調製における、請求項22〜28のいずれか1項に記載のdAb−エフェクター基の使用。
【請求項59】
前記TNFαがヒトTNFαであり、かつ前記患者がヒトである、請求項54〜58のいずれか1項に記載の方法または使用。
【請求項60】
前記dAb−エフェクター基がTAR1−5−19−エフェクター基である、請求項54〜59のいずれか1項に記載の方法または使用。
【請求項61】
前記エフェクター基がFcである、請求項60に記載の方法または使用。
【請求項62】
前記dAb−エフェクター基を0.5〜20mg/Kgの範囲の投与量で投与する、請求項54〜61のいずれか1項に記載の方法または使用。
【請求項63】
前記dAb−エフェクター基を1〜10mg/Kgの範囲の投与量で投与する、請求項62に記載の方法または使用。

【図1】
image rotate

【図2】
image rotate

【図3a】
image rotate

【図3b】
image rotate

【図3c】
image rotate

【図4a】
image rotate

【図4b】
image rotate

【図4c】
image rotate

【図4d】
image rotate

【図4e】
image rotate

【図5】
image rotate

【図6】
image rotate

【図7】
image rotate

【図8】
image rotate

【図9】
image rotate

【図10】
image rotate

【図11】
image rotate

【図12】
image rotate

【図13】
image rotate


【公表番号】特表2006−524986(P2006−524986A)
【公表日】平成18年11月9日(2006.11.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2004−563348(P2004−563348)
【出願日】平成15年12月24日(2003.12.24)
【国際出願番号】PCT/GB2003/005597
【国際公開番号】WO2004/058820
【国際公開日】平成16年7月15日(2004.7.15)
【出願人】(502197046)ドマンティス リミテッド (47)
【Fターム(参考)】