ＦＩＳＨ法を用いた循環腫瘍細胞中のＩＧＦ１Ｒ／Ｃｈｒ１５を検出するための方法
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子を発現している循環腫瘍細胞を含む血液試料の自動ＦＩＳＨアッセイのための方法及びプローブ組成物を開示する。このアッセイは、免疫磁気選択及び蛍光標識後に同定された疑わしい循環腫瘍細胞の遺伝子分析を可能とする。ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座に対する固有の無反復配列プローブと、１５番染色体参照プローブとを使用することにより、低レベルのＩＧＦ−１Ｒ増幅を示した１つの細胞株を含む、異常な数のＩＧＦ−１Ｒ及びＣｈｒシグナルを発現している細胞株が検出された。循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの遺伝子プロファイルを直接調べることが可能であることによって、疾患及び治療に対する患者の反応を評価するための自動化された手段が与えられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｂｒａｄ Ｆｏｕｌｋ ａｎｄ Ｌｅｏｎ Ｗ．Ｍ．Ｍ．Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００５年９月２０日出願の米国仮特許出願第６０／７１８，６７６号、及び２００８年３月２５日出願の同第６１／０３９，１６２号に基づく優先権を主張する非仮出願である。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に腫瘍学及び診断イメージングの分野に関する。より詳細には、本発明は、癌の検出に用いられる方法であって、患者の治療レジメンを評価するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
癌患者の治療及び管理を向上させるための努力にも関わらず、癌患者の生存率は多くの癌のタイプで過去２０年間、改善されていない。したがって、多くの癌患者は原発腫瘍によって死亡するのではなく、転移によって命を落とすのである。転移とはすなわち、原発腫瘍から分離して身体を通じて時に遠隔部位へと移動する悪性細胞によって多発性の広範囲にわたる腫瘍コロニーが確立されることである。癌における最も成功を収めた治療法は、早期の発見と腫瘍が臓器に留まっている間に外科的に除去することである。癌の早期発見は、特に、子宮頸癌におけるパップスメア、乳癌におけるマンモグラフィー、及び前立腺癌における血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの適切な診断テストが存在する場合、一部の癌においては実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期段階で発見される多くの癌は、外科的切除の前に既に微小転移している。したがって、癌の悪性潜在性の早期かつ正確な判定は、適切な治療法を選択するうえで重要である。
【０００５】
最適な治療法は、診断及び予後の情報の組み合わせに基づいたものとなる。正確かつ再現性のある診断テストによって、特定の癌の転移性に関する詳細な情報を得ることが、生存率に関する詳細な情報を与える予後評価とともに求められている。
【０００６】
適切に設計された予後テストは、医師にリスク及び生存の可能性についての情報を与えるものであり、ひいては患者に不必要な治療に耐える必要をなくす利点を与えるものである。選択された治療法が予後テストに基づいて効果的であることが分かれば、患者の士気も高まることになる。こうしたテストにともなうコストの削減は、医師に効果のない治療法を変更するための根拠を与えることから重要でありうる。患者の生存に主眼を置いた転移性癌の治療及び検出用の適切に開発された診断及び予後データバンクが、医療に多大な利益をもたらすことは明白である（米国特許第６，０６３，５８６号）。
【０００７】
原発腫瘍が十分早期に発見されれば、外科手術、放射線若しくは化学療法、又はこれらの治療法の幾つかの組み合わせによってしばしば除去することが可能である。残念ながら、転移性コロニーは検出及び除去が困難であり、すべてのコロニーを完全に治療することはしばしば不可能である。したがって臨床的な観点から言えば、転移とは癌の自然な進行の最終的な事象と考えることができる。更に、転移する能力は、悪性腫瘍を特徴付ける固有の性質である。
【０００８】
血液中の完全な腫瘍細胞の検出は、原発腫瘍の切除を行った癌患者において再発する転移性疾患との直接的関連を与えるものである。残念なことに、悪性腫瘍の同じ広がりは、従来の腫瘍の段階判別手順では引き続き見逃されている。最近の研究によって、癌患者の骨髄中の１個の癌細胞の存在は、転移性再発の独立した予後因子であることが示されている（Ｄｉｅｌ ＩＪ，Ｋａｕｆｍａｎ Ｍ，Ｇｏｅｒｎｅｒ Ｒ，Ｃｏｓｔａ ＳＤ，Ｋａｕｌ Ｓ，Ｂａｓｔｅｒｔ Ｇ．「原発性乳癌を有する患者の骨髄中の腫瘍細胞の検出：遠隔転移の予後因子」（Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１０：１５３４〜１５３９，１９９２）。しかしながら、これらの侵襲的手法は、血液中の播種性上皮腫瘍細胞の検出と比較して、日常の又は多数回の臨床検査法としては、望ましくない又は許容されないものと考えられている。
【０００９】
腫瘍細胞ばかりではなく、希少細胞又は生体試料からの他の生物学的物質を特徴付けるための方法がこれまでに述べられている（米国特許第６，３６５，３６２号）。この２段階の方法は、分析に先立って大量の破片及び他の干渉物質を除去しつつ、標的細胞を確実に取得するための効率的な濃縮化を必要とし、これによりイメージング技術による細胞検査を可能とするものである。この方法は、多パラメーターフローサイトメトリーによる免疫磁気濃縮、顕微鏡法、及び免疫細胞化学分析の要素を独自の自動的な方法で組み合わせたものである。この組み合わせによる方法を使用して血液試料中の上皮細胞を濃縮して計数することで、癌を測定するための手段を与える。
【００１０】
こうした２段階の方法は、転移性癌の患者における癌の予後及び生存率の予測に応用される（国際特許出願公開第０４０７６６４３号）。この方法は、血液中に循環している形態的に完全な癌細胞の存在に基づいて、転移性乳癌患者の循環癌細胞の存在を疾患の進行及び生存率と相関させることが可能である。より詳細には、７．５ミリリットル当たり５個以上の循環腫瘍細胞が存在する場合に、最初の経過観察時の予測値が与えられ、これにより患者の生存率の初期の予後指標を与えるものである。
【００１１】
上記に述べた検査の特異性は、検出される細胞数とともに高くなるものであり、検出される細胞数が少ない場合（一般的に５個未満の循環腫瘍細胞）には十分ではない。この問題に対する解決策の１つは、疑わしい癌細胞についての詳細な遺伝子情報を与えることである。したがって、個々の疑わしい癌細胞の多パラメトリック画像サイトメトリー及び多パラメトリック遺伝子解析に血液試料の濃縮化を取り入れた方法であれば、患者のスクリーニング、疾患の再発又は全生存率の評価のための現在の方法を大幅に改善する完全なプロファイル及び確認機構を与えるものと思われる。
【００１２】
国際特許出願公開第００／６０１１９号、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０１（２５）：９３９３〜９３９８（２００４）、Ｆｅｈｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ ８：２０７３〜２０８４（２００２）に述べられ、本明細書に援用する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、濃縮後の希少細胞検出における単一モードの分析法として述べられている。上皮細胞の濃縮後、捕捉された細胞を公知のハイブリダイゼーション法によってスクリーニングし、顕微鏡スライド上で画像化する。内在的な技術的変化及び遺伝子情報の十分な確認の不足により、ハイブリダイゼーションパターン単独では、５個未満の標的細胞を含む試料を評価する場合のように、高感度の分析に必要とされるレベルの臨床的信頼度を与えるものではない。更に、ＦＩＳＨ分析のこの方法は自動化が困難である。
【００１３】
ハイブリダイゼーションに基づいた方法を個々の細胞の分析において免疫細胞化学と組み合わせることについては、これまでに述べられている（米国特許第６，５２４，７９８号）。個々の細胞の表現型及び遺伝子型を同時に評価するためには、表現型の特徴がｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの準備段階後に安定に維持され、検出可能な標識の選択において限定されたものである必要がある。一般的に、従来のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは以下の工程を必要とする。すなわち、（１）熱又はアルカリによる変性、（２）非特異的結合を低減する任意の工程、（３）標的核酸配列への１以上の核酸プローブのハイブリダイゼーション、（４）結合しなかった核酸フラグメントの除去、及び（５）ハイブリダイズしたプローブの検出、である。これらの工程の１以上を行うために使用される試薬（すなわち、メタノール洗浄）によって、後の免疫細胞化学における抗原認識が変化し、標的細胞の位置がわずかに変化するか、標的細胞が完全に除去され、疑わしい細胞の誤った特徴付けがなされる可能性が生ずる。
【００１４】
個々に単離された標的細胞の表現型及び遺伝子型の多パラメトリック分析を組み合わせることによって希少な循環細胞を分析することが可能であれば、取得されたあらゆる定量的情報の確認が臨床医に与えられるものと考えられる。これは、極めて少数（１、２、３又は４個）の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を用いて病態を評価する場合に特に関連があり、早期の疾患発見の確認を与えるものである。
【００１５】
多パラメトリックＦＩＳＨ分析のためのプローブのセット及び方法は、肺癌において述べられている（米国特許出願公開第２００３００８７２４８号）。患者の膀胱癌を検出するための９５％の感度が得られる３つのプローブの組み合わせについても述べられている（米国特許第６，３７６，１８８号、及び同第６，１７４，６８１号を参照）。これらの方法は、少ない数の標的細胞を評価するための特異性及び感度を欠いており、ひいては病態の早期発見の確証的評価を欠いている。これらの方法はまた、利便のよい自動化の手段を与えるものでもない。
【００１６】
最近になって述べられているプローブは、ＤＮＡから反復配列を除去することによって無反復配列を与えるものである。この無反復配列プローブは、ブロッキングＤＮＡを使用せず、また望ましくないＤＮＡ配列をブロックする必要なくハイブリダイゼーションプローブとして機能する（国際特許出願公開第０７／０５３２４５号）。
【００１７】
高レベルのＩＧＦ−１の発現は、ＩＧＦ−１のレベルが低い患者と比較して、肺癌、乳癌、前立腺癌及び結腸直腸癌のリスクの増大との関連が示されている。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の維持におけるＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−１Ｒの役割を示す相当な証拠がある。ＩＧＦ−１Ｒのレベルは肺（Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５〜６６８，１９９３；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５２：１１６１〜１１７３，１９９３；Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：２５１１〜２５１７，１９９０）、乳房（Ｐｏｌｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３８：２２３〜２３０，１９８７；Ｆｏｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：７００２〜７００９，１９８９；Ａｒｔｅａｑａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８〜１４２３，１９８９）、前立腺及び結腸（Ｒｅｍａｏｌｅ−Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５：６０９〜６１６，１９９２；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０２：１１０１〜１１０８，１９９２）の腫瘍において上昇している。前立腺上皮におけるＩＧＦ−１の脱調節された発現は、形質転換マウスにおいて腫瘍形成を生ずる（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３４５５〜３４６０，２０００）。更に、ＩＧＦ−１はヒトグリオーマの自己分泌刺激因子と考えられる（Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３（１１）：２４７５〜７８，１９９３）一方で、ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する線維肉腫の増殖を刺激することが示されている（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３０２１〜３０２７，１９９８）。各種のヒト腫瘍の増殖においてＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒの相互作用が果たす役割の概説については、Ｍａｃａｕｌａｙ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６５：３１１〜２０，１９９２を参照されたい。
【００１８】
ＩＧＦ−１Ｒ ＲＮＡに対するアンチセンス発現ベクター又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒとの干渉がＩＧＦ−１によって媒介される細胞増殖を阻害することが示されている（例えば、Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：５２１〜５２６，２０００を参照）。ＩＧＦ−１のペプチドアナログ（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆ．３：１９９〜２０５，１９９２；Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３８８３〜３８８９，１９９２）、又はＩＧＦ−１ ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するベクター（Ｔｒｏｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４〜９７，１９９２）を用いることによっても増殖を阻害することができる。更に、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍ．２２：１０１〜１０６，１９９２；ａｎｄ Ｋａｌｅｂｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５５３１〜３４，１９９４）、及びＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ変異体（Ｐｒａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１８１〜８５，１９９４；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２５５８〜２５６４，１９９４；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：６０７１〜６０７７，１９９９）によって癌化した表現型を元に戻し、腫瘍形成を阻害し、転移性の表現型の消失を誘導することができる。
【００１９】
ＩＧＦ−１は、アポトーシスの調節においても重要である。アポトーシスはプログラミングされた細胞死であり、免疫及び神経系の成熟などの広範な発生過程に関与している。発生における役割以外にも、アポトーシスは腫瘍形成に対する重要な細胞保護手段であることが示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｅｌｌ ６５：１０９７〜１０９８，１９９１；Ｌａｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７８６〜７８７，１９９３）。アポトーシスプログラムの抑制は、悪性腫瘍の発生及び進行に寄与する場合がある。
【００２０】
幾つかの研究は、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルは臨床転帰と相関があることを示唆している。腫瘍モデルにおいて、ＩＧＦ−１Ｒは細胞増殖、生存及び転移を調節し、標的とした治療法への耐性を誘導した。ＩＧＦ−１Ｒの阻害によって細胞毒性物質の活性は大幅に高まる（Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１（５）：２０６３〜７３）。したがってＩＧＦ−１Ｒによるシグナル伝達の阻害は、新たな癌の治療法を開発するための有望な方針であると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＣＴＣの表面上のＩＧＦ−ＩＲ発現の検出は、癌患者におけるＩＧＦ−１Ｒ拮抗薬療法の効果の予測と関連付けられている（国際特許出願公開第０７／１４１６２６号）。しかしながら、この方法では個々の腫瘍細胞の染色体の配列を直接調べることはできない。ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の分析によって、ＩＧＦ−１Ｒを発現する個々の腫瘍細胞のアポトーシス又は増殖状態に関する情報が与えられることにより、腫瘍形成のより詳細な評価につながるものと考えられる。
【００２２】
更に、ＩＧＦ−１Ｒ及びあらゆる染色体異常の存在の両方を評価可能な方法を、ＩＧＦ−１Ｒの表面上での発現を検出することと組み合わせることによって、ＩＧＦ−１Ｒを発現している循環腫瘍細胞における異数性のより直接的な指標が与えられるものと考えられる。これにより疾患の進行のより詳細かつ高感度の診断及び評価が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ循環腫瘍細胞における染色体配列を評価するための直接的な方法を提供する。より直接的な分析法は、癌患者におけるＩＧＦ−１Ｒ療法の効果を予測し、こうした患者におけるより詳細な診断を与えるうえで臨床医を支援するものである。本方法は、ａ）循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、ｂ）免疫磁気濃縮により上皮細胞の亜集団を単離することと、ｃ）ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の異常を有する循環腫瘍細胞を同定することと、ｅ）循環腫瘍細胞を関連付け、被験者に関する診断、予後又は治療情報を与えることと、を含む。
【００２４】
本発明は更に、ＩＧＦ−１Ｒを発現している循環腫瘍細胞の存在について患者試料をスクリーニングするためのキットであって、ａ）磁性コア物質、タンパク質ベースコーティング物質、及び上皮細胞由来の腫瘍細胞に特異的に結合する抗体を有するコーティングされた磁性ナノ粒子であって、その抗体が前記ベースコーティング物質と直接的又は間接的に結合されている磁性ナノ粒子と、ｂ）腫瘍細胞以外の試料成分を排除して分析を行うための細胞色素と、ｃ）染色体の計数及び異数性の検出のためのサテライト計数（satellite enumeration）プローブと、ｄ）ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の遺伝子座を規定することが可能な無反復配列プローブと、を含むキットを更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＢＡＣ開始ＤＮＡからの反復配列除去ＤＮＡプローブの生成を示す概略図。断片化された全ゲノム増幅ライブラリーを変性し、過剰量のＣｏｔ ＤＮＡの存在下で再アニーリングした。二本鎖ＤＮＡのＤＳＮによる消化によって一本鎖の固有配列の混合物が得られ、これをプローブ製造の鋳型として使用した。
【図２】ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の同定に使用した２つのクローンの位置を示した図。ＩＧＦ−１Ｒプローブは、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の配列を含むＢＡＣクローンを選択することによって設計した。
【図３】無反復配列ＩＧＦ−１Ｒ ＤＮＡクローンのマッピングを示す図。ＩＧＦ−１Ｒクローンを、１７番染色体のαサテライトコントロールプローブ（緑）とともに正常なヒト中期染色体（赤）とハイブリダイズさせた。
【図４】１５番染色体に対するαサテライトプローブ（ＳＥ−１５）の画像をＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座において示した図。無反復配列ＩＧＦ−１Ｒクローン（赤）はＳＥ−１５プローブ（緑）とともにプールされ、正常な中期展開染色体にハイブリダイズした。
【図５】ＬＮＣＡＰ細胞（右）及びＢＴ４７４細胞（左）でのＩＧＦ−１Ｒプローブの構成のハイブリダイゼーションを示す図。
【図６】組み合わせで使用されるプローブの相対位置を示す図。２つのクローンは、参照としてＩＧＦ−１Ｒプローブ（青）を使用してマッピングされた無反復配列の蛍光標識された（赤）プローブである。
【図７】アッセイで使用した蛍光色素のスペクトルを示す図。ＩＧＦ−１Ｒに対してはＵＬＳ ＤＹ４１５を用いた。
【図８】ＩＧＦ−１Ｒプローブにより評価した７つの細胞株の画像であり、プローブが染色体異常を検出可能であることを示している。
【図９】ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置から取得された画像のスコア判定が可能であることを示す図。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置からの画像を標準的な蛍光顕微鏡と比較したもの。
【図１０】ＦＩＳＨの結果のスコア判定に使用したＦＩＳＨソフトウェアからのスクリーンショットの画像。上列はＣＴＣの走査、ＣＫ＋；ＤＡＰＩ＋／ＣＤ４５−及びＣＴＣからの画像を示す。下列は、異常な数のＩＧＦ−１Ｒ及び１５番染色体のプローブを示すＣＴＣを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、異常な遺伝子プロファイルを有する腫瘍細胞においてＩＧＦ−１Ｒを検出するために、免疫磁気濃縮及び画像分析を蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と組み合わせて用いて循環腫瘍細胞の単離及び同定を行うものである。
【００２７】
このため、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムでは、全血液試料中に存在するあらゆる上皮細胞を高度に濃縮及び凝縮するための免疫磁気選択及び分離を用いている。捕捉された細胞は、白血球特異的マーカー及び１以上の腫瘍細胞特異的蛍光モノクローナル抗体によって検出可能に標識することによって、捕捉されたＣＴＣの同定及び計数、並びに混在する非標的細胞からの機器又は視認による明確な区別を可能とする。このアッセイは、低腫瘍量の早期段階においても７．５〜３０ｍＬの血液当たり１又は２個の上皮細胞という非常に高い感度で腫瘍細胞の検出を可能とするものである。本発明の実施形態は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムに限定されるものではなく、同等の感度及び特異性を有するすべての単離及び画像化プロトコールを含むものである。
【００２８】
ＤＮＡは固有の配列と反復配列とを含んでいる。反復配列は染色体の全体にわたって存在し、これらの反復配列の外側の特異的領域又は固有配列を標的としたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション反応と干渉する可能性がある。染色体、遺伝子又はＤＮＡ配列上の特異的配列の存在、量、及び位置を特定するには、ハイブリダイゼーションプローブが対象とする位置にのみハイブリダイズすることが重要である。ハイブリダイゼーションプローブ混合物中の反復配列の存在は結合の特異性を低下させるものであり、反復配列をプローブから除去するか、プローブが標的上の反復配列とハイブリダイズすることを防止するための方法が必要となる。例えば、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、反復配列へのプローブの結合を防止するために、ハイブリダイゼーションの際にしばしば加えられる（米国特許第５，４４７，８４１号及び同第６，５９６，４７９号）。
【００２９】
反復配列除去ＤＮＡプローブの生成の一般的な図を図１に示す。デオキシリボ核酸分子を選択的に切断する二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）（本明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／０１６４２１６号及び米国特許第６，５４１，２０４号）は、一本鎖ＤＮＡと比較して核酸の二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に切断し、試料混合物から非標的二本鎖ＤＮＡを除去する手段を与えるものである。ポリヌクレオチドの二本鎖形態を選択的に消化するこれらのヌクレアーゼの能力は、固有の標的特異的プローブを作製するうえで使用できる可能性があり、ブロッキングＤＮＡの干渉作用を防止し、速やかで効率的かつ費用効率の高い製造を可能とする手段を与えるものである。
【００３０】
開始ＤＮＡは通常、複数のＤＮＡセグメントを含む１以上のＤＮＡ配列の形態のものである。プローブ組成物の製造における個々の開始物質の最初の供給源については、直接標識したプローブの製造において述べられている（米国特許第６，５６９，６２６号）。開始ポリヌクレオチドの供給源は、組織から精製され、酵素処理（制限酵素）、ポリメラーゼ、限定的ＤＮアーゼＩ消化、限定的マングビーンヌクレアーゼ消化、超音波処理、ＤＮＡの剪断などの任意の公知の方法を用いて１５０ｋｂ〜２００ｋｂのセグメントに断片化することが最適である。これらのセグメント化されたフラグメントの一部は、特定の固有な標的配列の１以上のＤＮＡセグメントの少なくとも一部分と相補的なものとなる。
【００３１】
個々のＤＮＡは、プラスミド構築体へのクローニングなどの一般的に知られる方法によって増殖させた後、細菌にトランスフェクトされる。
【００３２】
クローニングされたフラグメントを増殖させた後、単離されたフラグメントを表わす個々のコロニーを、対象とする配列の少なくとも一部を含むものとして同定する。同定は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、又は市販のライブラリーの確立されたデータベースを検索するなどの公知の方法によって行われる。選択されたコロニーをそれぞれ増殖させることによって、染色体上の標的配列のセグメントと少なくとも部分的に相補的な固有のフラグメントを有する単離されたプラスミド構築体を得る（すなわち、ＢＡＣクローン）。
【００３３】
クローニングされた対象フラグメントを増殖及び単離した後、フラグメントから反復ポリヌクレオチド配列を除去する。全遺伝子増幅法（ＷＧＡ）を用いて、単離されたプラスミド構築体からフラグメントを２００〜５００ｂｐのセグメントとして増幅する。増幅後、最初に９５℃に加熱して二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖の状態に変性し、次いで６５℃に冷却して反復配列を選択的に再びアニーリングさせることによって、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡをＷＧＡライブラリープールと合わせる。次いで最適な二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）条件下で二本鎖特異的ヌクレアーゼを加えることによって、残りの一本鎖セグメントには影響を与えずに、完全に一致した核酸二本鎖を有するデオキシリボ核酸分子を選択的に切断する。二本鎖核酸の選択的な切断は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を酵素で消化することによって行われる。カムチャッカガニ（米国特許出願第１０／８４５，３６６号）及びエビ（米国特許第６，５４１，２０４号）から単離されたＤＳＮは、二本鎖構造を除去するものである。エンドヌクレアーゼ特異的なヌクレアーゼの使用により、二本鎖ＤＮＡの主鎖のホスホジエステル結合が加水分解されることで、ヌクレオチド配列に特異的でなく、したがって対象とするほとんどの標的に適用が可能であるという利点が得られる。ＤＳＮによる消化によって、残りの一本鎖ポリヌクレオチドの続く増幅を行うために核酸二本鎖の相当量を除去することができる。得られた消化産物は、染色体上の固有の標的配列の部分に相当する一本鎖ＤＮＡ、一定量の未消化の二本鎖ＤＮＡ、及び消化された塩基対を含んでいる。未消化のＤＮＡは、消化されたＤＮＡ及びＤＳＮから遠心分離によって分離される（すなわち、スピンカラムクロマトグラフィー）。この混合物を直ちに使用するか、あるいは標識及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションといった後の使用のために精製した組成物の増幅の前又は後に８０℃で保存する。増幅後、得られた標的プローブ配列をＰＣＲによって増幅し、純度９０％〜９９％の標的プローブ配列及び指定された反復配列除去ＤＮＡを得る。
【００３４】
得られたプローブを本発明で実施される方法で使用する。本発明で述べる反復配列除去ＤＮＡは、疑わしいＣＴＣのＩＧＦ−１Ｒ遺伝子に適用されるＦＩＳＨのようなｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに有用である。本発明で述べる反復配列除去プローブを使用することにより競合的結合の必要性がなくなり、反応の特異性が高くなると同時に結合に必要とされるプローブの量が低減される。
【００３５】
免疫磁気標識した細胞の再分析
染色体の異数性は、遺伝子疾患、特に癌と関連している。特にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の使用によって、これらの染色体異常を検出する診断方法が知られている。組織又は細胞試料に対するＩＳＨ及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）の適用は確立されているが、単一細胞に対してＩＳＨ及びＩＣＣによる同時分析を行うための診断的に効果的な方法を確立することが大きく望まれている。個々の細胞におけるこれらの染色体異常が癌細胞のＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座に関連していることから、本発明は、費用効果が高くかつ特異性の高い手段を用いてこれらの染色体異常の検出を可能とするものである。
【００３６】
本発明の一態様では、濃縮及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析の後に希少細胞を更に処理する。例えば、上皮細胞などの循環希少細胞を疑わしい癌細胞として同定する（米国特許第６，３６５，３６２号、同第６，６４５，７３１号、及び米国特許出願第１１／２０２，８７５号を援用する）。疑わしい細胞を、特異的な細胞抗原及び核酸標識によって特定する。これらの疑わしい細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの確認を、特定された疑わしい細胞内の染色体の変化（すなわち、異数性）を評価するために用いられる染色体及び／又は遺伝子を規定する特異的な固有の標的配列の発現によって判定する。したがって、本発明の一実施形態は、ＩＣＣ染色と、これに続く、遺伝子又は遺伝子群に結合可能なサテライト計数プローブ（satellite enumeration probe）（ＳＥ）及び固有配列プローブを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による確認との組み合わせを含む。
【００３７】
本方法は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）、及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステム（ベリデックス社（Veridex, LLC））によって与えられ、米国特許第６，３６５，３６２号に更に述べられるような、循環腫瘍細胞の免疫磁気濃縮及び蛍光イメージング後の高い特異性を提供するものである。一方法は、疾患の段階とは無関係に１個又はそれよりも多いＣＴＣをＩＧＦ−ＩＲ陽性癌細胞として指定することによって、ある試料をＣＴＣ陽性と呼ぶための閾値を下げることを可能にする。本発明の一実施形態は、治療標的としてのＩＧＦ−１Ｒの有無を検出することによって、正しい治療法の選択を行うための手段を与える。
【００３８】
そのため、血液試料処理のための自動化かつ標準化された一方法は、ＩＣＣによる循環上皮細胞の同定を可能とする。分画化された血液試料から吸引された血漿を、標的細胞集団（すなわち、ＥｐＣＡＭ陽性）に特異的な抗体と結合させた磁性流体試薬と合わせる。これらの細胞を外部から印加した磁場によって免疫磁気的に回収することで、非標識細胞の分離及び除去が可能である。
【００３９】
標的細胞を分離した後、これを使い捨てカートリッジに注入して画像表示装置（米国特許第６，７９０，３６６号及び同第６，８９０，４２６号）を用いた画像分析を行う。この装置は、後のＩＣＣイメージングのために標識された細胞を、チャンバの光学的に透明な表面に沿って配向させるような磁場を作用させるように設計されている。
【００４０】
ＩＣＣイメージングの後、疑わしい細胞を適当なアルゴリズムを用いて同定する。疑わしい細胞の画像は、提示された疑わしい細胞の性状について最終的な判断を下す使用者に対して提示される。疑わしい細胞の画像、及びチャンバの光学的に透明な観測表面に沿った細胞の相対的位置を記録して、後の使用のためにアーカイブ化しておく。
【００４１】
ＩＣＣイメージング単独では、５個未満のＣＴＣを含む血液試料の臨床的重要性を評価するための、あるいは疑わしい癌細胞についての詳細な遺伝子情報を与えるための特異性を欠いていることから、個々の疑わしい細胞について後に分析を行って完全なプロファイルを得て、選択された疑わしい腫瘍細胞がスクリーニング、疾患の再発率及び全生存率を評価するといった診断分析に使用可能であることを確認する必要がある。
【００４２】
ＦＩＳＨは、ＤＮＡの融解温度よりも高い温度と、ＩＣＣ標識と適合性のない試薬を必要とする。ＩＣＣ及びＤＮＡ標識の多くは、何らかのシグナルが処理の際に失われてしまい、ＦＩＳＨ法を通じて使用することはできない。したがって、ＦＩＳＨ分析の対象となる細胞として特定された細胞をその位置で追跡することができない。したがって、ＩＣＣ画像が得られた後、光学的に透明な観測表面に沿った細胞の位置が、後の遺伝子分析（ＦＩＳＨ）及びＩＣＣ標識が失われる他の種類の分析を行うために維持されるような検出方法が求められている。これは、ＩＣＣ画像が得られた後に、細胞が失われないようにして、又は表面に沿って大きく動かないようにして細胞を光学的に透明な表面上に固定することによってある程度実現される。
【００４３】
そのため、ＦＩＳＨ試薬の添加後、カートリッジを、固定された細胞を有する表面がホットプレートと接触するようにしてホットプレート上に置く。アッセイの種類に応じて、２〜４８時間で行われる異なる温度サイクルでホットプレートをプログラミングする。温度サイクルの終了後、余分なＦＩＳＨ試薬をカートリッジから取り除く。カートリッジにＤＮＡ標識を含んだ緩衝溶液を充填して、固定された細胞の核を可視化する。使用されるＤＮＡ標識に応じて、標識はカートリッジ内に残るか、あるいは染色後にカートリッジから洗い流される。
【００４４】
次に、カートリッジをＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステムに戻して２度目の走査を行う。最初のＩＣＣイメージ分析の際に上面に存在した細胞は固定されているため、同じ細胞がカートリッジ内部の同じ相対位置に依然存在している。イメージングシステム（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステム）に対するカートリッジの移動量を評価するため、２回目の走査の画像内の核の位置を最初のＩＣＣ走査の画像内の核の位置と比較する。これらの画像の互いに対する移動量をたたみ込みアルゴリズムを用いて求める。この移動量が求められた後、対象とする特定の細胞をそのＩＣＣ画像に基づいてリストから選択し、２回目の走査のＦＩＳＨ後にカートリッジの表面上で再度位置決定することができる。次いで選択されたＦＩＳＨプローブの蛍光画像が取得される。
【実施例】
【００４５】
実施例１−ＩＧＦ−１Ｒ／Ｃｈｒ １５ ＦＩＳＨアッセイ用のプローブセットの開発
このアッセイでは２つのタイプのプローブが必要とされる。１つ目のタイプはサテライト計数（satellite enumeration）（ＳＥ）プローブである。このプローブは、染色体の動原体付近のサテライト（反復）配列に結合し、染色体の計数及び異数性の検出に用いられる。２つ目のタイプは、固有配列プローブである。その名前が示す通り、このプローブは遺伝子などの固有配列に結合する。バイオインフォーマティックスを用いることで、固有配列プローブをゲノムの任意の位置に対して設計することができる。固有配列プローブは、通常、プローブの非特異的結合を生じうるＡｌｕ又はＫｐｎ反復配列のような反復要素を含んでいる。非特異的結合の抑制は、ハイブリダイゼーションにおいて非標識のブロッキングＤＮＡを組み込むことによって通常行われる。ブロッキングＤＮＡは、固有配列とサテライトプローブとのハイブリダイゼーションと干渉することが示されている。本発明の方法は、プローブのより速やかかつより明確なハイブリダイゼーションを可能とする無反復配列プローブの使用によってこの工程を省略するものであり、ブロッキングＤＮＡを使用するという短所を克服したものである。
【００４６】
バイオインフォーマティックスを用いることで、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを選択することにより、ＩＧＦ−１Ｒプローブを設計することができる。図２の図は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子に対する２つのクローンの位置を示している。ＢＡＣ ＤＮＡを増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔキットを使用して単離した。クローンを特異性についてＦＩＳＨマッピングした後、述べられたプロトコールに従って反復配列を取り除いた。図２において、赤で示した「Ａ」及び「Ｂ」は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の２つのクローンを表わしている。緑の領域は１５番染色体上のサテライト計数プローブ（ＳＥ−１５）を表わしている。
【００４７】
各ＩＧＦ−１Ｒクローンをマッピングしてその機能を確認した。両方のクローンについて増幅した無反復配列ＤＮＡを超音波処理し、ＵＬＳ−ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ ５５０（クレアテック・ダイアグノスティクス社（Kreatech Diagnostics））によって標識した。図３に示されるように、ＩＧＦ−１Ｒクローン（赤）を１７番染色体のαサテライトコントロールプローブ（緑）とともに正常なヒト中期染色体とハイブリダイズした。いずれのクローンも適当なサイズの末端動原体染色体（areocentric chromosome）のｑ末端上に明るいシグナルを与えた。他の染色体上で無反復配列クローンのクロスハイブリダイゼーションは認められなかった。
【００４８】
１５番染色体に対するαサテライトプローブ（ＳＥ−１５）を、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座に対する参照プローブとしての使用について評価した。図４に示されるように、無反復配列ＩＧＦ−１ＲクローンＡ及びＢ（赤）は、ＳＥ−１５動原体プローブ（緑）とともにプールされ、正常な中期展開染色体とハイブリダイズした。以下の画像は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＳＥ１５プローブが正しい染色体にマッピングされ、強いシグナルを与えたことを明らかに示すものである。
【００４９】
実施例２−ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブの構成の細胞株評価
１５番染色体に対するαサテライトプローブとＩＧＦ−１ＲクローンＡ及びＢ（ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５）との組み合わせを、遺伝子異常の評価について試験した。ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブの構成を複数の細胞株に使用して、プローブが異数性又は遺伝子増幅／欠失を検出できるかどうかを調べた。Ａ５４９（肺）、ＢＴ４７４（乳房）、ＰＣ３（前立腺）、ＬＮＣＡＰ（前立腺）、Ｈ１２９９（肺）、及びＭＣＦ７（乳房）細胞株をこの構成で試験した。図５の画像は、ＬＮＣＡＰが４個のＳＥ−１５のコピーと４個のＩＧＦ−１Ｒのコピーを有していることを示しており、遺伝子増幅のない異数性を示している。試験を行った残りの５つの細胞株では、他の染色体に対するＳＥ−１５プローブのクロスハイブリダイゼーションが認められた。ＢＴ ４７４細胞は２〜３個のＩＧＦ−１Ｒのコピーと多数のＳＥ−１５のシグナルを含み、クロスハイブリダイゼーションを示した。他の細胞株では、異なる量のＳＥ−１５プローブのクロスハイブリダイゼーションが認められた。クロスハイブリダイゼーションの程度は細胞株及び試験した正常なドナー間で異なったため、このクロスハイブリダイゼーションはドナーごとの変動によるものと考えられる。
【００５０】
ＳＥ−１５のクロスハイブリダイゼーションの問題を解決するため、ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブを、１５番染色体上の他の位置の遺伝子座に対する固有配列プローブによって再構成した。これは固有配列プローブであることから、ＳＥ−１５のようなαサテライトプローブを使用した場合に生じうるクロスハイブリダイゼーションの問題を生ずることなく、１５番染色体の特異的領域に結合するはずである。１５番染色体のＩＧＦ−１Ｒと同じ腕上の動原体の付近に位置する２つの隣接したクローンを１５番染色体のｑ１領域内で選択した。図６の図は、この構成で用いたプローブの相対位置を示している。これら２つのクローンは無反復配列のプロトコールに従って作製し、蛍光標識（赤）した。ＩＧＦ−１Ｒプローブ（青）をマッピングの参照用として用いた。画像に示されるように、クローンＣｈｒ １５ Ａは誤った染色体にマッピングされた。クローンＣｈｒ １５ Ｂは１５番染色体に正しくマッピングされたため、ＩＧＦ−１Ｒに対する参照プローブとして更に評価を行った。
【００５１】
図７は、これらのプローブに対する標識として使用した蛍光色素のスペクトルを示している。ＵＬＳ−５５０色素（クレアテック・ダイアグノスティクス社（Kreatech Diagnostics））をＣｈｒ １５プローブに対して選択し、ＵＬＳ ＤＹ４１５をＩＧＦ−１Ｒに対して使用した。
【００５２】
各プローブ構成の最適濃度は、最良のシグナル／ノイズ測定値を与える最も明るいシグナルに基づいたものである。ハイブリダイゼーションミックスは、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、１０％Ｋｒｅａｂｏｏｓｔ、及び異なる濃度のプローブからなる。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓカートリッジ内に固定された白血球に一晩ＦＩＳＨを行い、２４％ホルムアミド及び０．１×ＳＳＣを用いてストリンジェンシー洗浄を行った。シグナル及びバックグラウンド強度は、１０個の細胞の蛍光画像を取得し、最も明るいピクセルの強度（シグナル）を細胞核内の複数のランダムなピクセルの平均強度（ノイズ）で割ることによって測定した。試験した濃度及びその濃度におけるシグナル／ノイズ比（ＳＮＲ）を表Ｉに示した。最適濃度はＩＧＦ１Ｒ及びＣｈｒ １５の両者について４ｎｇ／μＬであった。
【表１】
【００５３】
実施例３−ドナー試料からのプローブの構成の評価
反応に４ｎｇ／μＬの各プローブの使用を含むアッセイの最適条件を得た後、プローブの構成を、３人の異なるドナーから得た全部で３５０個のＳＤ４５＋／ＣＫ−細胞（白血球）で評価し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムを使用して分析した。各標的のコピー数のスコアを求め、結果を以下の表に示した。ＦＩＳＨシグナルは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムによって再位置決定した細胞の９５％よりも多くの細胞においてスコアを判定することができた。
【００５４】
表ＩＩは３人のドナーからの結果を示す。予想されたＩＧＦ１Ｒの２個のコピーは、３人のドナーで調べた白血球の８７％、８１％、及び９３％で認められた。ＩＧＦ１Ｒについては、白血球の７５％以上が白血球１個当たり２個のドットという予想された結果を示し、評価を行った白血球の８５％よりも多くのものがスコア判定可能であることが予想された。３人のドナーで、調べた白血球の９１％、９７％、及び９３％において予想どおりＣｈｒ １５の２個のコピーが認められた。そのため、我々は、白血球の８０％以上が予想された２個のドットを示し、評価を行った白血球の８５％よりも多くのものがスコア判定可能でなければならないという品質管理仕様を設定した。データは、選択された他のプローブを用いて同様に得たデータと符合していた。
【表２】
【００５５】
実施例４−染色体異常の検出
７つの細胞株を最適化されたＩＧＦ−１Ｒプローブによってアッセイすることによって、プローブが染色体異常を検出可能であることを実証した。図８に示されるように、各顕微鏡画像は、多数の細胞を観察した場合に見られるＩＧＦ−１Ｒシグナル（青）及びＣｈｒ １５シグナル（赤）を通常のカウントとともに示している。調べたすべての細胞株が、ＩＧＦ−１Ｒ及びＣｈｒ １５プローブの双方の余分なコピーを有していた。コピー数の増加の多くは、両方のプローブについて同様の増加であり、遺伝子増幅ではなく異数性によるものであることを示すものである。この例外は、Ｃｈｒ １５プローブに対して１〜２個の余分なＩＧＦ−１Ｒのコピーが一貫して認められたＭＣＦ７細胞株であり、低レベルの遺伝子増幅を示すものである。試験した細胞株で高いレベルのＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の増幅を示したものはなかった。
【００５６】
実施例５−自動化ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置と標準的な蛍光顕微鏡との比較
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置が自動分析において有用な画像を取得することが可能であることを実証するため、同じカートリッジからの細胞の画像をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨ装置及び標準的な蛍光顕微鏡の両方を用いて取得した。図９は、典型的なＰＣ３−９細胞及びコントロールとしての白血球の画像を示す。図は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置からの画像が、顕微鏡からの画像と少なくとも同程度に良好であることを示している。顕微鏡で撮影したＰＣ３−９細胞のＣｈｒ１５画像は、やや焦点がぼやけた２個のドットを示している（白い矢印）。これに対して、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置は複数の焦点面内で画像を撮影し、すべてのドットの焦点が合った合成画像を形成するため、容易な解釈が可能である。典型的なＰＣ３−９細胞では、４〜６個のＣｈｒ １５のコピー及び３〜５個のＩＧＦ−１Ｒのコピーが認められた。
【００５７】
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムは液体試料の自動ＩＧＦ−１Ｒ分析に理想的なプラットフォームである。図１０は、カートリッジ内における濃縮及び固定後の選択された細胞の典型的なスクリーンショット画像を示している。画像の上列はＣＴＣ走査による元の画像を示し、この細胞がＣＫ＋／ＤＡＰＩ＋／ＣＤ４５−であり、したがって疑わしいＣＴＣであることを示している。画像の下列はＦＩＳＨ装置によって取得したものであり、このＣＴＣが異常な数のＩＧＦ−１Ｒ及びＣｈｒ １５プローブを有していることを示している。ＦＩＳＨソフトウェアは結果のスコア判定を行い、診断解釈のための情報を与えるものである。これにより、患者試料からのＣＴＣを血液から濃縮し、カートリッジ内に固定し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムでＦＩＳＨ法を用いて分析することが可能であることが示された。
【００５８】
幾つかの学術論文、米国特許及び米国特許出願を上記に引用した。上記の各引用文献の主題を、その全体が本明細書に記載されているものとまったく同様に本明細書に援用するものである。
【００５９】
以上、本発明の特定の好ましい実施形態について述べ、具体的に例示したが、本発明はこうした実施形態に限定されるものではない。本発明には本発明の趣旨を逸脱することなく様々な改変を行うことが可能であり、本発明の完全な範囲は以下の特許請求の範囲において定義されるものである。
【００６０】
〔実施の態様〕
（１） 患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を評価するための方法であって、
ａ．循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、
ｂ．免疫磁気濃縮により、上皮細胞の亜集団を単離することと、
ｃ．疑わしい循環腫瘍細胞を同定することと、
ｄ．前記疑わしい循環腫瘍細胞を、染色体異常を検出可能なＩＧＦ−１Ｒ無反復配列プローブの構成とハイブリダイズさせることと、を含む、方法。
（２） 前記免疫磁気濃縮が、
ａ．他の集団を実質的に排除して、前記試料を、疑わしい循環腫瘍細胞と特異的に結合するリガンドに結合されたコロイド状免疫磁性粒子と混合することと、
ｂ．前記試料−免疫磁性粒子の混合物を高勾配の磁場にさらすことによって、免疫磁性粒子が結合した腫瘍細胞が濃縮された分離された細胞画分を生成することと、を含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記表現型プロファイルが、多パラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベースの画像分析法、毛管容量測定法、スペクトル画像分析法、手動細胞分析、自動細胞分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって求められる、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記表現型プロファイルが、自動免疫蛍光細胞分析法によって求められる、実施態様３に記載の方法。
（５） 前記プローブの構成が、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のクローン配列と、クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブとからなる、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記クローン配列が、細菌人工染色体クローンから選択される、実施態様４に記載の方法。
（７） 前記αサテライトプローブが、ＳＥ−１７、ＳＥ−１５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様５に記載の方法。
（８） 前記αサテライトプローブが、１５番染色体のｑ１領域に対する特異性を有する、実施態様５に記載の方法。
（９） 前記疑わしい標的細胞をハイブリダイズすることが、前記患者の診断、予後、又は治療情報を与える、実施態様１に記載の方法。
（１０） 患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を判定するためのキットであって、
ａ．反復配列を除去した、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のポリヌクレオチドプローブ配列と、
ｂ．クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブと、
ｃ．前記（ａ）及び（ｂ）に結合された標識部分と、を含む、キット。
【００６１】
（１１） 二本鎖特異的ヌクレアーゼで消化することによって、前記ポリヌクレオチドプローブ配列から前記反復配列を除去する、実施態様１０に記載のキット。
（１２） 前記標識部分が、白金ベースの配位結合によって結合された蛍光色素分子である、実施態様１０に記載のキット。
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｂｒａｄ Ｆｏｕｌｋ ａｎｄ Ｌｅｏｎ Ｗ．Ｍ．Ｍ．Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００５年９月２０日出願の米国仮特許出願第６０／７１８，６７６号、及び２００８年３月２５日出願の同第６１／０３９，１６２号に基づく優先権を主張する非仮出願である。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に腫瘍学及び診断イメージングの分野に関する。より詳細には、本発明は、癌の検出に用いられる方法であって、患者の治療レジメンを評価するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
癌患者の治療及び管理を向上させるための努力にも関わらず、癌患者の生存率は多くの癌のタイプで過去２０年間、改善されていない。したがって、多くの癌患者は原発腫瘍によって死亡するのではなく、転移によって命を落とすのである。転移とはすなわち、原発腫瘍から分離して身体を通じて時に遠隔部位へと移動する悪性細胞によって多発性の広範囲にわたる腫瘍コロニーが確立されることである。癌における最も成功を収めた治療法は、早期の発見と腫瘍が臓器に留まっている間に外科的に除去することである。癌の早期発見は、特に、子宮頸癌におけるパップスメア、乳癌におけるマンモグラフィー、及び前立腺癌における血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの適切な診断テストが存在する場合、一部の癌においては実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期段階で発見される多くの癌は、外科的切除の前に既に微小転移している。したがって、癌の悪性潜在性の早期かつ正確な判定は、適切な治療法を選択するうえで重要である。
【０００５】
最適な治療法は、診断及び予後の情報の組み合わせに基づいたものとなる。正確かつ再現性のある診断テストによって、特定の癌の転移性に関する詳細な情報を得ることが、生存率に関する詳細な情報を与える予後評価とともに求められている。
【０００６】
適切に設計された予後テストは、医師にリスク及び生存の可能性についての情報を与えるものであり、ひいては患者に不必要な治療に耐える必要をなくす利点を与えるものである。選択された治療法が予後テストに基づいて効果的であることが分かれば、患者の士気も高まることになる。こうしたテストにともなうコストの削減は、医師に効果のない治療法を変更するための根拠を与えることから重要でありうる。患者の生存に主眼を置いた転移性癌の治療及び検出用の適切に開発された診断及び予後データバンクが、医療に多大な利益をもたらすことは明白である（米国特許第６，０６３，５８６号）。
【０００７】
原発腫瘍が十分早期に発見されれば、外科手術、放射線若しくは化学療法、又はこれらの治療法の幾つかの組み合わせによってしばしば除去することが可能である。残念ながら、転移性コロニーは検出及び除去が困難であり、すべてのコロニーを完全に治療することはしばしば不可能である。したがって臨床的な観点から言えば、転移とは癌の自然な進行の最終的な事象と考えることができる。更に、転移する能力は、悪性腫瘍を特徴付ける固有の性質である。
【０００８】
血液中の完全な腫瘍細胞の検出は、原発腫瘍の切除を行った癌患者において再発する転移性疾患との直接的関連を与えるものである。残念なことに、悪性腫瘍の同じ広がりは、従来の腫瘍の段階判別手順では引き続き見逃されている。最近の研究によって、癌患者の骨髄中の１個の癌細胞の存在は、転移性再発の独立した予後因子であることが示されている（Ｄｉｅｌ ＩＪ，Ｋａｕｆｍａｎ Ｍ，Ｇｏｅｒｎｅｒ Ｒ，Ｃｏｓｔａ ＳＤ，Ｋａｕｌ Ｓ，Ｂａｓｔｅｒｔ Ｇ．「原発性乳癌を有する患者の骨髄中の腫瘍細胞の検出：遠隔転移の予後因子」（Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１０：１５３４〜１５３９，１９９２）。しかしながら、これらの侵襲的手法は、血液中の播種性上皮腫瘍細胞の検出と比較して、日常の又は多数回の臨床検査法としては、望ましくない又は許容されないものと考えられている。
【０００９】
腫瘍細胞ばかりではなく、希少細胞又は生体試料からの他の生物学的物質を特徴付けるための方法がこれまでに述べられている（米国特許第６，３６５，３６２号）。この２段階の方法は、分析に先立って大量の破片及び他の干渉物質を除去しつつ、標的細胞を確実に取得するための効率的な濃縮化を必要とし、これによりイメージング技術による細胞検査を可能とするものである。この方法は、多パラメーターフローサイトメトリーによる免疫磁気濃縮、顕微鏡法、及び免疫細胞化学分析の要素を独自の自動的な方法で組み合わせたものである。この組み合わせによる方法を使用して血液試料中の上皮細胞を濃縮して計数することで、癌を測定するための手段を与える。
【００１０】
こうした２段階の方法は、転移性癌の患者における癌の予後及び生存率の予測に応用される（国際特許出願公開第０４０７６６４３号）。この方法は、血液中に循環している形態的に完全な癌細胞の存在に基づいて、転移性乳癌患者の循環癌細胞の存在を疾患の進行及び生存率と相関させることが可能である。より詳細には、７．５ミリリットル当たり５個以上の循環腫瘍細胞が存在する場合に、最初の経過観察時の予測値が与えられ、これにより患者の生存率の初期の予後指標を与えるものである。
【００１１】
上記に述べた検査の特異性は、検出される細胞数とともに高くなるものであり、検出される細胞数が少ない場合（一般的に５個未満の循環腫瘍細胞）には十分ではない。この問題に対する解決策の１つは、疑わしい癌細胞についての詳細な遺伝子情報を与えることである。したがって、個々の疑わしい癌細胞の多パラメトリック画像サイトメトリー及び多パラメトリック遺伝子解析に血液試料の濃縮化を取り入れた方法であれば、患者のスクリーニング、疾患の再発又は全生存率の評価のための現在の方法を大幅に改善する完全なプロファイル及び確認機構を与えるものと思われる。
【００１２】
国際特許出願公開第００／６０１１９号、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０１（２５）：９３９３〜９３９８（２００４）、Ｆｅｈｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ ８：２０７３〜２０８４（２００２）に述べられ、本明細書に援用する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、濃縮後の希少細胞検出における単一モードの分析法として述べられている。上皮細胞の濃縮後、捕捉された細胞を公知のハイブリダイゼーション法によってスクリーニングし、顕微鏡スライド上で画像化する。内在的な技術的変化及び遺伝子情報の十分な確認の不足により、ハイブリダイゼーションパターン単独では、５個未満の標的細胞を含む試料を評価する場合のように、高感度の分析に必要とされるレベルの臨床的信頼度を与えるものではない。更に、ＦＩＳＨ分析のこの方法は自動化が困難である。
【００１３】
ハイブリダイゼーションに基づいた方法を個々の細胞の分析において免疫細胞化学と組み合わせることについては、これまでに述べられている（米国特許第６，５２４，７９８号）。個々の細胞の表現型及び遺伝子型を同時に評価するためには、表現型の特徴がｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの準備段階後に安定に維持され、検出可能な標識の選択において限定されたものである必要がある。一般的に、従来のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは以下の工程を必要とする。すなわち、（１）熱又はアルカリによる変性、（２）非特異的結合を低減する任意の工程、（３）標的核酸配列への１以上の核酸プローブのハイブリダイゼーション、（４）結合しなかった核酸フラグメントの除去、及び（５）ハイブリダイズしたプローブの検出、である。これらの工程の１以上を行うために使用される試薬（すなわち、メタノール洗浄）によって、後の免疫細胞化学における抗原認識が変化し、標的細胞の位置がわずかに変化するか、標的細胞が完全に除去され、疑わしい細胞の誤った特徴付けがなされる可能性が生ずる。
【００１４】
個々に単離された標的細胞の表現型及び遺伝子型の多パラメトリック分析を組み合わせることによって希少な循環細胞を分析することが可能であれば、取得されたあらゆる定量的情報の確認が臨床医に与えられるものと考えられる。これは、極めて少数（１、２、３又は４個）の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を用いて病態を評価する場合に特に関連があり、早期の疾患発見の確認を与えるものである。
【００１５】
多パラメトリックＦＩＳＨ分析のためのプローブのセット及び方法は、肺癌において述べられている（米国特許出願公開第２００３００８７２４８号）。患者の膀胱癌を検出するための９５％の感度が得られる３つのプローブの組み合わせについても述べられている（米国特許第６，３７６，１８８号、及び同第６，１７４，６８１号を参照）。これらの方法は、少ない数の標的細胞を評価するための特異性及び感度を欠いており、ひいては病態の早期発見の確証的評価を欠いている。これらの方法はまた、利便のよい自動化の手段を与えるものでもない。
【００１６】
最近になって述べられているプローブは、ＤＮＡから反復配列を除去することによって無反復配列を与えるものである。この無反復配列プローブは、ブロッキングＤＮＡを使用せず、また望ましくないＤＮＡ配列をブロックする必要なくハイブリダイゼーションプローブとして機能する（国際特許出願公開第０７／０５３２４５号）。
【００１７】
高レベルのＩＧＦ−１の発現は、ＩＧＦ−１のレベルが低い患者と比較して、肺癌、乳癌、前立腺癌及び結腸直腸癌のリスクの増大との関連が示されている。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の維持におけるＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−１Ｒの役割を示す相当な証拠がある。ＩＧＦ−１Ｒのレベルは肺（Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５〜６６８，１９９３；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５２：１１６１〜１１７３，１９９３；Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：２５１１〜２５１７，１９９０）、乳房（Ｐｏｌｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３８：２２３〜２３０，１９８７；Ｆｏｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：７００２〜７００９，１９８９；Ａｒｔｅａｑａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８〜１４２３，１９８９）、前立腺及び結腸（Ｒｅｍａｏｌｅ−Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５：６０９〜６１６，１９９２；Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０２：１１０１〜１１０８，１９９２）の腫瘍において上昇している。前立腺上皮におけるＩＧＦ−１の脱調節された発現は、形質転換マウスにおいて腫瘍形成を生ずる（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３４５５〜３４６０，２０００）。更に、ＩＧＦ−１はヒトグリオーマの自己分泌刺激因子と考えられる（Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３（１１）：２４７５〜７８，１９９３）一方で、ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する線維肉腫の増殖を刺激することが示されている（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３０２１〜３０２７，１９９８）。各種のヒト腫瘍の増殖においてＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒの相互作用が果たす役割の概説については、Ｍａｃａｕｌａｙ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６５：３１１〜２０，１９９２を参照されたい。
【００１８】
ＩＧＦ−１Ｒ ＲＮＡに対するアンチセンス発現ベクター又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒとの干渉がＩＧＦ−１によって媒介される細胞増殖を阻害することが示されている（例えば、Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：５２１〜５２６，２０００を参照）。ＩＧＦ−１のペプチドアナログ（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆ．３：１９９〜２０５，１９９２；Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３８８３〜３８８９，１９９２）、又はＩＧＦ−１ ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するベクター（Ｔｒｏｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４〜９７，１９９２）を用いることによっても増殖を阻害することができる。更に、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍ．２２：１０１〜１０６，１９９２；ａｎｄ Ｋａｌｅｂｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５５３１〜３４，１９９４）、及びＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ変異体（Ｐｒａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１８１〜８５，１９９４；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２５５８〜２５６４，１９９４；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：６０７１〜６０７７，１９９９）によって癌化した表現型を元に戻し、腫瘍形成を阻害し、転移性の表現型の消失を誘導することができる。
【００１９】
ＩＧＦ−１は、アポトーシスの調節においても重要である。アポトーシスはプログラミングされた細胞死であり、免疫及び神経系の成熟などの広範な発生過程に関与している。発生における役割以外にも、アポトーシスは腫瘍形成に対する重要な細胞保護手段であることが示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｅｌｌ ６５：１０９７〜１０９８，１９９１；Ｌａｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７８６〜７８７，１９９３）。アポトーシスプログラムの抑制は、悪性腫瘍の発生及び進行に寄与する場合がある。
【００２０】
幾つかの研究は、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルは臨床転帰と相関があることを示唆している。腫瘍モデルにおいて、ＩＧＦ−１Ｒは細胞増殖、生存及び転移を調節し、標的とした治療法への耐性を誘導した。ＩＧＦ−１Ｒの阻害によって細胞毒性物質の活性は大幅に高まる（Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１（５）：２０６３〜７３）。したがってＩＧＦ−１Ｒによるシグナル伝達の阻害は、新たな癌の治療法を開発するための有望な方針であると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＣＴＣの表面上のＩＧＦ−ＩＲ発現の検出は、癌患者におけるＩＧＦ−１Ｒ拮抗薬療法の効果の予測と関連付けられている（国際特許出願公開第０７／１４１６２６号）。しかしながら、この方法では個々の腫瘍細胞の染色体の配列を直接調べることはできない。ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の分析によって、ＩＧＦ−１Ｒを発現する個々の腫瘍細胞のアポトーシス又は増殖状態に関する情報が与えられることにより、腫瘍形成のより詳細な評価につながるものと考えられる。
【００２２】
更に、ＩＧＦ−１Ｒ及びあらゆる染色体異常の存在の両方を評価可能な方法を、ＩＧＦ−１Ｒの表面上での発現を検出することと組み合わせることによって、ＩＧＦ−１Ｒを発現している循環腫瘍細胞における異数性のより直接的な指標が与えられるものと考えられる。これにより疾患の進行のより詳細かつ高感度の診断及び評価が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ循環腫瘍細胞における染色体配列を評価するための直接的な方法を提供する。より直接的な分析法は、癌患者におけるＩＧＦ−１Ｒ療法の効果を予測し、こうした患者におけるより詳細な診断を与えるうえで臨床医を支援するものである。本方法は、ａ）循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、ｂ）免疫磁気濃縮により上皮細胞の亜集団を単離することと、ｃ）ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の異常を有する循環腫瘍細胞を同定することと、ｅ）循環腫瘍細胞を関連付け、被験者に関する診断、予後又は治療情報を与えることと、を含む。
【００２４】
本発明は更に、ＩＧＦ−１Ｒを発現している循環腫瘍細胞の存在について患者試料をスクリーニングするためのキットであって、ａ）磁性コア物質、タンパク質ベースコーティング物質、及び上皮細胞由来の腫瘍細胞に特異的に結合する抗体を有するコーティングされた磁性ナノ粒子であって、その抗体が前記ベースコーティング物質と直接的又は間接的に結合されている磁性ナノ粒子と、ｂ）腫瘍細胞以外の試料成分を排除して分析を行うための細胞色素と、ｃ）染色体の計数及び異数性の検出のためのサテライト計数（satellite enumeration）プローブと、ｄ）ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の遺伝子座を規定することが可能な無反復配列プローブと、を含むキットを更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＢＡＣ開始ＤＮＡからの反復配列除去ＤＮＡプローブの生成を示す概略図。断片化された全ゲノム増幅ライブラリーを変性し、過剰量のＣｏｔ ＤＮＡの存在下で再アニーリングした。二本鎖ＤＮＡのＤＳＮによる消化によって一本鎖の固有配列の混合物が得られ、これをプローブ製造の鋳型として使用した。
【図２】ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の同定に使用した２つのクローンの位置を示した図。ＩＧＦ−１Ｒプローブは、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の配列を含むＢＡＣクローンを選択することによって設計した。
【図３】無反復配列ＩＧＦ−１Ｒ ＤＮＡクローンのマッピングを示す図。ＩＧＦ−１Ｒクローンを、１７番染色体のαサテライトコントロールプローブ（緑）とともに正常なヒト中期染色体（赤）とハイブリダイズさせた。
【図４】１５番染色体に対するαサテライトプローブ（ＳＥ−１５）の画像をＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座において示した図。無反復配列ＩＧＦ−１Ｒクローン（赤）はＳＥ−１５プローブ（緑）とともにプールされ、正常な中期展開染色体にハイブリダイズした。
【図５】ＬＮＣＡＰ細胞（右）及びＢＴ４７４細胞（左）でのＩＧＦ−１Ｒプローブの構成のハイブリダイゼーションを示す図。
【図６】組み合わせで使用されるプローブの相対位置を示す図。２つのクローンは、参照としてＩＧＦ−１Ｒプローブ（青）を使用してマッピングされた無反復配列の蛍光標識された（赤）プローブである。
【図７】アッセイで使用した蛍光色素のスペクトルを示す図。ＩＧＦ−１Ｒに対してはＵＬＳ ＤＹ４１５を用いた。
【図８】ＩＧＦ−１Ｒプローブにより評価した７つの細胞株の画像であり、プローブが染色体異常を検出可能であることを示している。
【図９】ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置から取得された画像のスコア判定が可能であることを示す図。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置からの画像を標準的な蛍光顕微鏡と比較したもの。
【図１０】ＦＩＳＨの結果のスコア判定に使用したＦＩＳＨソフトウェアからのスクリーンショットの画像。上列はＣＴＣの走査、ＣＫ＋；ＤＡＰＩ＋／ＣＤ４５−及びＣＴＣからの画像を示す。下列は、異常な数のＩＧＦ−１Ｒ及び１５番染色体のプローブを示すＣＴＣを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、異常な遺伝子プロファイルを有する腫瘍細胞においてＩＧＦ−１Ｒを検出するために、免疫磁気濃縮及び画像分析を蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と組み合わせて用いて循環腫瘍細胞の単離及び同定を行うものである。
【００２７】
このため、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムでは、全血液試料中に存在するあらゆる上皮細胞を高度に濃縮及び凝縮するための免疫磁気選択及び分離を用いている。捕捉された細胞は、白血球特異的マーカー及び１以上の腫瘍細胞特異的蛍光モノクローナル抗体によって検出可能に標識することによって、捕捉されたＣＴＣの同定及び計数、並びに混在する非標的細胞からの機器又は視認による明確な区別を可能とする。このアッセイは、低腫瘍量の早期段階においても７．５〜３０ｍＬの血液当たり１又は２個の上皮細胞という非常に高い感度で腫瘍細胞の検出を可能とするものである。本発明の実施形態は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムに限定されるものではなく、同等の感度及び特異性を有するすべての単離及び画像化プロトコールを含むものである。
【００２８】
ＤＮＡは固有の配列と反復配列とを含んでいる。反復配列は染色体の全体にわたって存在し、これらの反復配列の外側の特異的領域又は固有配列を標的としたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション反応と干渉する可能性がある。染色体、遺伝子又はＤＮＡ配列上の特異的配列の存在、量、及び位置を特定するには、ハイブリダイゼーションプローブが対象とする位置にのみハイブリダイズすることが重要である。ハイブリダイゼーションプローブ混合物中の反復配列の存在は結合の特異性を低下させるものであり、反復配列をプローブから除去するか、プローブが標的上の反復配列とハイブリダイズすることを防止するための方法が必要となる。例えば、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、反復配列へのプローブの結合を防止するために、ハイブリダイゼーションの際にしばしば加えられる（米国特許第５，４４７，８４１号及び同第６，５９６，４７９号）。
【００２９】
反復配列除去ＤＮＡプローブの生成の一般的な図を図１に示す。デオキシリボ核酸分子を選択的に切断する二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）（本明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／０１６４２１６号及び米国特許第６，５４１，２０４号）は、一本鎖ＤＮＡと比較して核酸の二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に切断し、試料混合物から非標的二本鎖ＤＮＡを除去する手段を与えるものである。ポリヌクレオチドの二本鎖形態を選択的に消化するこれらのヌクレアーゼの能力は、固有の標的特異的プローブを作製するうえで使用できる可能性があり、ブロッキングＤＮＡの干渉作用を防止し、速やかで効率的かつ費用効率の高い製造を可能とする手段を与えるものである。
【００３０】
開始ＤＮＡは通常、複数のＤＮＡセグメントを含む１以上のＤＮＡ配列の形態のものである。プローブ組成物の製造における個々の開始物質の最初の供給源については、直接標識したプローブの製造において述べられている（米国特許第６，５６９，６２６号）。開始ポリヌクレオチドの供給源は、組織から精製され、酵素処理（制限酵素）、ポリメラーゼ、限定的ＤＮアーゼＩ消化、限定的マングビーンヌクレアーゼ消化、超音波処理、ＤＮＡの剪断などの任意の公知の方法を用いて１５０ｋｂ〜２００ｋｂのセグメントに断片化することが最適である。これらのセグメント化されたフラグメントの一部は、特定の固有な標的配列の１以上のＤＮＡセグメントの少なくとも一部分と相補的なものとなる。
【００３１】
個々のＤＮＡは、プラスミド構築体へのクローニングなどの一般的に知られる方法によって増殖させた後、細菌にトランスフェクトされる。
【００３２】
クローニングされたフラグメントを増殖させた後、単離されたフラグメントを表わす個々のコロニーを、対象とする配列の少なくとも一部を含むものとして同定する。同定は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、又は市販のライブラリーの確立されたデータベースを検索するなどの公知の方法によって行われる。選択されたコロニーをそれぞれ増殖させることによって、染色体上の標的配列のセグメントと少なくとも部分的に相補的な固有のフラグメントを有する単離されたプラスミド構築体を得る（すなわち、ＢＡＣクローン）。
【００３３】
クローニングされた対象フラグメントを増殖及び単離した後、フラグメントから反復ポリヌクレオチド配列を除去する。全遺伝子増幅法（ＷＧＡ）を用いて、単離されたプラスミド構築体からフラグメントを２００〜５００ｂｐのセグメントとして増幅する。増幅後、最初に９５℃に加熱して二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖の状態に変性し、次いで６５℃に冷却して反復配列を選択的に再びアニーリングさせることによって、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡをＷＧＡライブラリープールと合わせる。次いで最適な二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）条件下で二本鎖特異的ヌクレアーゼを加えることによって、残りの一本鎖セグメントには影響を与えずに、完全に一致した核酸二本鎖を有するデオキシリボ核酸分子を選択的に切断する。二本鎖核酸の選択的な切断は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を酵素で消化することによって行われる。カムチャッカガニ（米国特許出願第１０／８４５，３６６号）及びエビ（米国特許第６，５４１，２０４号）から単離されたＤＳＮは、二本鎖構造を除去するものである。エンドヌクレアーゼ特異的なヌクレアーゼの使用により、二本鎖ＤＮＡの主鎖のホスホジエステル結合が加水分解されることで、ヌクレオチド配列に特異的でなく、したがって対象とするほとんどの標的に適用が可能であるという利点が得られる。ＤＳＮによる消化によって、残りの一本鎖ポリヌクレオチドの続く増幅を行うために核酸二本鎖の相当量を除去することができる。得られた消化産物は、染色体上の固有の標的配列の部分に相当する一本鎖ＤＮＡ、一定量の未消化の二本鎖ＤＮＡ、及び消化された塩基対を含んでいる。未消化のＤＮＡは、消化されたＤＮＡ及びＤＳＮから遠心分離によって分離される（すなわち、スピンカラムクロマトグラフィー）。この混合物を直ちに使用するか、あるいは標識及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションといった後の使用のために精製した組成物の増幅の前又は後に８０℃で保存する。増幅後、得られた標的プローブ配列をＰＣＲによって増幅し、純度９０％〜９９％の標的プローブ配列及び指定された反復配列除去ＤＮＡを得る。
【００３４】
得られたプローブを本発明で実施される方法で使用する。本発明で述べる反復配列除去ＤＮＡは、疑わしいＣＴＣのＩＧＦ−１Ｒ遺伝子に適用されるＦＩＳＨのようなｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに有用である。本発明で述べる反復配列除去プローブを使用することにより競合的結合の必要性がなくなり、反応の特異性が高くなると同時に結合に必要とされるプローブの量が低減される。
【００３５】
免疫磁気標識した細胞の再分析
染色体の異数性は、遺伝子疾患、特に癌と関連している。特にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の使用によって、これらの染色体異常を検出する診断方法が知られている。組織又は細胞試料に対するＩＳＨ及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）の適用は確立されているが、単一細胞に対してＩＳＨ及びＩＣＣによる同時分析を行うための診断的に効果的な方法を確立することが大きく望まれている。個々の細胞におけるこれらの染色体異常が癌細胞のＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座に関連していることから、本発明は、費用効果が高くかつ特異性の高い手段を用いてこれらの染色体異常の検出を可能とするものである。
【００３６】
本発明の一態様では、濃縮及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析の後に希少細胞を更に処理する。例えば、上皮細胞などの循環希少細胞を疑わしい癌細胞として同定する（米国特許第６，３６５，３６２号、同第６，６４５，７３１号、及び米国特許出願第１１／２０２，８７５号を援用する）。疑わしい細胞を、特異的な細胞抗原及び核酸標識によって特定する。これらの疑わしい細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの確認を、特定された疑わしい細胞内の染色体の変化（すなわち、異数性）を評価するために用いられる染色体及び／又は遺伝子を規定する特異的な固有の標的配列の発現によって判定する。したがって、本発明の一実施形態は、ＩＣＣ染色と、これに続く、遺伝子又は遺伝子群に結合可能なサテライト計数プローブ（satellite enumeration probe）（ＳＥ）及び固有配列プローブを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による確認との組み合わせを含む。
【００３７】
本方法は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）ＡｕｔｏＰｒｅｐ（登録商標）、及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステム（ベリデックス社（Veridex, LLC））によって与えられ、米国特許第６，３６５，３６２号に更に述べられるような、循環腫瘍細胞の免疫磁気濃縮及び蛍光イメージング後の高い特異性を提供するものである。一方法は、疾患の段階とは無関係に１個又はそれよりも多いＣＴＣをＩＧＦ−ＩＲ陽性癌細胞として指定することによって、ある試料をＣＴＣ陽性と呼ぶための閾値を下げることを可能にする。本発明の一実施形態は、治療標的としてのＩＧＦ−１Ｒの有無を検出することによって、正しい治療法の選択を行うための手段を与える。
【００３８】
そのため、血液試料処理のための自動化かつ標準化された一方法は、ＩＣＣによる循環上皮細胞の同定を可能とする。分画化された血液試料から吸引された血漿を、標的細胞集団（すなわち、ＥｐＣＡＭ陽性）に特異的な抗体と結合させた磁性流体試薬と合わせる。これらの細胞を外部から印加した磁場によって免疫磁気的に回収することで、非標識細胞の分離及び除去が可能である。
【００３９】
標的細胞を分離した後、これを使い捨てカートリッジに注入して画像表示装置（米国特許第６，７９０，３６６号及び同第６，８９０，４２６号）を用いた画像分析を行う。この装置は、後のＩＣＣイメージングのために標識された細胞を、チャンバの光学的に透明な表面に沿って配向させるような磁場を作用させるように設計されている。
【００４０】
ＩＣＣイメージングの後、疑わしい細胞を適当なアルゴリズムを用いて同定する。疑わしい細胞の画像は、提示された疑わしい細胞の性状について最終的な判断を下す使用者に対して提示される。疑わしい細胞の画像、及びチャンバの光学的に透明な観測表面に沿った細胞の相対的位置を記録して、後の使用のためにアーカイブ化しておく。
【００４１】
ＩＣＣイメージング単独では、５個未満のＣＴＣを含む血液試料の臨床的重要性を評価するための、あるいは疑わしい癌細胞についての詳細な遺伝子情報を与えるための特異性を欠いていることから、個々の疑わしい細胞について後に分析を行って完全なプロファイルを得て、選択された疑わしい腫瘍細胞がスクリーニング、疾患の再発率及び全生存率を評価するといった診断分析に使用可能であることを確認する必要がある。
【００４２】
ＦＩＳＨは、ＤＮＡの融解温度よりも高い温度と、ＩＣＣ標識と適合性のない試薬を必要とする。ＩＣＣ及びＤＮＡ標識の多くは、何らかのシグナルが処理の際に失われてしまい、ＦＩＳＨ法を通じて使用することはできない。したがって、ＦＩＳＨ分析の対象となる細胞として特定された細胞をその位置で追跡することができない。したがって、ＩＣＣ画像が得られた後、光学的に透明な観測表面に沿った細胞の位置が、後の遺伝子分析（ＦＩＳＨ）及びＩＣＣ標識が失われる他の種類の分析を行うために維持されるような検出方法が求められている。これは、ＩＣＣ画像が得られた後に、細胞が失われないようにして、又は表面に沿って大きく動かないようにして細胞を光学的に透明な表面上に固定することによってある程度実現される。
【００４３】
そのため、ＦＩＳＨ試薬の添加後、カートリッジを、固定された細胞を有する表面がホットプレートと接触するようにしてホットプレート上に置く。アッセイの種類に応じて、２〜４８時間で行われる異なる温度サイクルでホットプレートをプログラミングする。温度サイクルの終了後、余分なＦＩＳＨ試薬をカートリッジから取り除く。カートリッジにＤＮＡ標識を含んだ緩衝溶液を充填して、固定された細胞の核を可視化する。使用されるＤＮＡ標識に応じて、標識はカートリッジ内に残るか、あるいは染色後にカートリッジから洗い流される。
【００４４】
次に、カートリッジをＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステムに戻して２度目の走査を行う。最初のＩＣＣイメージ分析の際に上面に存在した細胞は固定されているため、同じ細胞がカートリッジ内部の同じ相対位置に依然存在している。イメージングシステム（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩシステム）に対するカートリッジの移動量を評価するため、２回目の走査の画像内の核の位置を最初のＩＣＣ走査の画像内の核の位置と比較する。これらの画像の互いに対する移動量をたたみ込みアルゴリズムを用いて求める。この移動量が求められた後、対象とする特定の細胞をそのＩＣＣ画像に基づいてリストから選択し、２回目の走査のＦＩＳＨ後にカートリッジの表面上で再度位置決定することができる。次いで選択されたＦＩＳＨプローブの蛍光画像が取得される。
【実施例】
【００４５】
実施例１−ＩＧＦ−１Ｒ／Ｃｈｒ １５ ＦＩＳＨアッセイ用のプローブセットの開発
このアッセイでは２つのタイプのプローブが必要とされる。１つ目のタイプはサテライト計数（satellite enumeration）（ＳＥ）プローブである。このプローブは、染色体の動原体付近のサテライト（反復）配列に結合し、染色体の計数及び異数性の検出に用いられる。２つ目のタイプは、固有配列プローブである。その名前が示す通り、このプローブは遺伝子などの固有配列に結合する。バイオインフォーマティックスを用いることで、固有配列プローブをゲノムの任意の位置に対して設計することができる。固有配列プローブは、通常、プローブの非特異的結合を生じうるＡｌｕ又はＫｐｎ反復配列のような反復要素を含んでいる。非特異的結合の抑制は、ハイブリダイゼーションにおいて非標識のブロッキングＤＮＡを組み込むことによって通常行われる。ブロッキングＤＮＡは、固有配列とサテライトプローブとのハイブリダイゼーションと干渉することが示されている。本発明の方法は、プローブのより速やかかつより明確なハイブリダイゼーションを可能とする無反復配列プローブの使用によってこの工程を省略するものであり、ブロッキングＤＮＡを使用するという短所を克服したものである。
【００４６】
バイオインフォーマティックスを用いることで、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを選択することにより、ＩＧＦ−１Ｒプローブを設計することができる。図２の図は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子に対する２つのクローンの位置を示している。ＢＡＣ ＤＮＡを増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔキットを使用して単離した。クローンを特異性についてＦＩＳＨマッピングした後、述べられたプロトコールに従って反復配列を取り除いた。図２において、赤で示した「Ａ」及び「Ｂ」は、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲の２つのクローンを表わしている。緑の領域は１５番染色体上のサテライト計数プローブ（ＳＥ−１５）を表わしている。
【００４７】
各ＩＧＦ−１Ｒクローンをマッピングしてその機能を確認した。両方のクローンについて増幅した無反復配列ＤＮＡを超音波処理し、ＵＬＳ−ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ ５５０（クレアテック・ダイアグノスティクス社（Kreatech Diagnostics））によって標識した。図３に示されるように、ＩＧＦ−１Ｒクローン（赤）を１７番染色体のαサテライトコントロールプローブ（緑）とともに正常なヒト中期染色体とハイブリダイズした。いずれのクローンも適当なサイズの末端動原体染色体（areocentric chromosome）のｑ末端上に明るいシグナルを与えた。他の染色体上で無反復配列クローンのクロスハイブリダイゼーションは認められなかった。
【００４８】
１５番染色体に対するαサテライトプローブ（ＳＥ−１５）を、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座に対する参照プローブとしての使用について評価した。図４に示されるように、無反復配列ＩＧＦ−１ＲクローンＡ及びＢ（赤）は、ＳＥ−１５動原体プローブ（緑）とともにプールされ、正常な中期展開染色体とハイブリダイズした。以下の画像は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＳＥ１５プローブが正しい染色体にマッピングされ、強いシグナルを与えたことを明らかに示すものである。
【００４９】
実施例２−ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブの構成の細胞株評価
１５番染色体に対するαサテライトプローブとＩＧＦ−１ＲクローンＡ及びＢ（ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５）との組み合わせを、遺伝子異常の評価について試験した。ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブの構成を複数の細胞株に使用して、プローブが異数性又は遺伝子増幅／欠失を検出できるかどうかを調べた。Ａ５４９（肺）、ＢＴ４７４（乳房）、ＰＣ３（前立腺）、ＬＮＣＡＰ（前立腺）、Ｈ１２９９（肺）、及びＭＣＦ７（乳房）細胞株をこの構成で試験した。図５の画像は、ＬＮＣＡＰが４個のＳＥ−１５のコピーと４個のＩＧＦ−１Ｒのコピーを有していることを示しており、遺伝子増幅のない異数性を示している。試験を行った残りの５つの細胞株では、他の染色体に対するＳＥ−１５プローブのクロスハイブリダイゼーションが認められた。ＢＴ ４７４細胞は２〜３個のＩＧＦ−１Ｒのコピーと多数のＳＥ−１５のシグナルを含み、クロスハイブリダイゼーションを示した。他の細胞株では、異なる量のＳＥ−１５プローブのクロスハイブリダイゼーションが認められた。クロスハイブリダイゼーションの程度は細胞株及び試験した正常なドナー間で異なったため、このクロスハイブリダイゼーションはドナーごとの変動によるものと考えられる。
【００５０】
ＳＥ−１５のクロスハイブリダイゼーションの問題を解決するため、ＩＧＦ−１Ｒ／ＳＥ−１５プローブを、１５番染色体上の他の位置の遺伝子座に対する固有配列プローブによって再構成した。これは固有配列プローブであることから、ＳＥ−１５のようなαサテライトプローブを使用した場合に生じうるクロスハイブリダイゼーションの問題を生ずることなく、１５番染色体の特異的領域に結合するはずである。１５番染色体のＩＧＦ−１Ｒと同じ腕上の動原体の付近に位置する２つの隣接したクローンを１５番染色体のｑ１領域内で選択した。図６の図は、この構成で用いたプローブの相対位置を示している。これら２つのクローンは無反復配列のプロトコールに従って作製し、蛍光標識（赤）した。ＩＧＦ−１Ｒプローブ（青）をマッピングの参照用として用いた。画像に示されるように、クローンＣｈｒ １５ Ａは誤った染色体にマッピングされた。クローンＣｈｒ １５ Ｂは１５番染色体に正しくマッピングされたため、ＩＧＦ−１Ｒに対する参照プローブとして更に評価を行った。
【００５１】
図７は、これらのプローブに対する標識として使用した蛍光色素のスペクトルを示している。ＵＬＳ−５５０色素（クレアテック・ダイアグノスティクス社（Kreatech Diagnostics））をＣｈｒ １５プローブに対して選択し、ＵＬＳ ＤＹ４１５をＩＧＦ−１Ｒに対して使用した。
【００５２】
各プローブ構成の最適濃度は、最良のシグナル／ノイズ測定値を与える最も明るいシグナルに基づいたものである。ハイブリダイゼーションミックスは、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、１０％Ｋｒｅａｂｏｏｓｔ、及び異なる濃度のプローブからなる。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓカートリッジ内に固定された白血球に一晩ＦＩＳＨを行い、２４％ホルムアミド及び０．１×ＳＳＣを用いてストリンジェンシー洗浄を行った。シグナル及びバックグラウンド強度は、１０個の細胞の蛍光画像を取得し、最も明るいピクセルの強度（シグナル）を細胞核内の複数のランダムなピクセルの平均強度（ノイズ）で割ることによって測定した。試験した濃度及びその濃度におけるシグナル／ノイズ比（ＳＮＲ）を表Ｉに示した。最適濃度はＩＧＦ１Ｒ及びＣｈｒ １５の両者について４ｎｇ／μＬであった。
【表１】
【００５３】
実施例３−ドナー試料からのプローブの構成の評価
反応に４ｎｇ／μＬの各プローブの使用を含むアッセイの最適条件を得た後、プローブの構成を、３人の異なるドナーから得た全部で３５０個のＳＤ４５＋／ＣＫ−細胞（白血球）で評価し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムを使用して分析した。各標的のコピー数のスコアを求め、結果を以下の表に示した。ＦＩＳＨシグナルは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムによって再位置決定した細胞の９５％よりも多くの細胞においてスコアを判定することができた。
【００５４】
表ＩＩは３人のドナーからの結果を示す。予想されたＩＧＦ１Ｒの２個のコピーは、３人のドナーで調べた白血球の８７％、８１％、及び９３％で認められた。ＩＧＦ１Ｒについては、白血球の７５％以上が白血球１個当たり２個のドットという予想された結果を示し、評価を行った白血球の８５％よりも多くのものがスコア判定可能であることが予想された。３人のドナーで、調べた白血球の９１％、９７％、及び９３％において予想どおりＣｈｒ １５の２個のコピーが認められた。そのため、我々は、白血球の８０％以上が予想された２個のドットを示し、評価を行った白血球の８５％よりも多くのものがスコア判定可能でなければならないという品質管理仕様を設定した。データは、選択された他のプローブを用いて同様に得たデータと符合していた。
【表２】
【００５５】
実施例４−染色体異常の検出
７つの細胞株を最適化されたＩＧＦ−１Ｒプローブによってアッセイすることによって、プローブが染色体異常を検出可能であることを実証した。図８に示されるように、各顕微鏡画像は、多数の細胞を観察した場合に見られるＩＧＦ−１Ｒシグナル（青）及びＣｈｒ １５シグナル（赤）を通常のカウントとともに示している。調べたすべての細胞株が、ＩＧＦ−１Ｒ及びＣｈｒ １５プローブの双方の余分なコピーを有していた。コピー数の増加の多くは、両方のプローブについて同様の増加であり、遺伝子増幅ではなく異数性によるものであることを示すものである。この例外は、Ｃｈｒ １５プローブに対して１〜２個の余分なＩＧＦ−１Ｒのコピーが一貫して認められたＭＣＦ７細胞株であり、低レベルの遺伝子増幅を示すものである。試験した細胞株で高いレベルのＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の増幅を示したものはなかった。
【００５６】
実施例５−自動化ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置と標準的な蛍光顕微鏡との比較
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置が自動分析において有用な画像を取得することが可能であることを実証するため、同じカートリッジからの細胞の画像をＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨ装置及び標準的な蛍光顕微鏡の両方を用いて取得した。図９は、典型的なＰＣ３−９細胞及びコントロールとしての白血球の画像を示す。図は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置からの画像が、顕微鏡からの画像と少なくとも同程度に良好であることを示している。顕微鏡で撮影したＰＣ３−９細胞のＣｈｒ１５画像は、やや焦点がぼやけた２個のドットを示している（白い矢印）。これに対して、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ装置は複数の焦点面内で画像を撮影し、すべてのドットの焦点が合った合成画像を形成するため、容易な解釈が可能である。典型的なＰＣ３−９細胞では、４〜６個のＣｈｒ １５のコピー及び３〜５個のＩＧＦ−１Ｒのコピーが認められた。
【００５７】
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ−ＦＩＳＨシステムは液体試料の自動ＩＧＦ−１Ｒ分析に理想的なプラットフォームである。図１０は、カートリッジ内における濃縮及び固定後の選択された細胞の典型的なスクリーンショット画像を示している。画像の上列はＣＴＣ走査による元の画像を示し、この細胞がＣＫ＋／ＤＡＰＩ＋／ＣＤ４５−であり、したがって疑わしいＣＴＣであることを示している。画像の下列はＦＩＳＨ装置によって取得したものであり、このＣＴＣが異常な数のＩＧＦ−１Ｒ及びＣｈｒ １５プローブを有していることを示している。ＦＩＳＨソフトウェアは結果のスコア判定を行い、診断解釈のための情報を与えるものである。これにより、患者試料からのＣＴＣを血液から濃縮し、カートリッジ内に固定し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓシステムでＦＩＳＨ法を用いて分析することが可能であることが示された。
【００５８】
幾つかの学術論文、米国特許及び米国特許出願を上記に引用した。上記の各引用文献の主題を、その全体が本明細書に記載されているものとまったく同様に本明細書に援用するものである。
【００５９】
以上、本発明の特定の好ましい実施形態について述べ、具体的に例示したが、本発明はこうした実施形態に限定されるものではない。本発明には本発明の趣旨を逸脱することなく様々な改変を行うことが可能であり、本発明の完全な範囲は以下の特許請求の範囲において定義されるものである。
【００６０】
〔実施の態様〕
（１） 患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を評価するための方法であって、
ａ．循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、
ｂ．免疫磁気濃縮により、上皮細胞の亜集団を単離することと、
ｃ．疑わしい循環腫瘍細胞を同定することと、
ｄ．前記疑わしい循環腫瘍細胞を、染色体異常を検出可能なＩＧＦ−１Ｒ無反復配列プローブの構成とハイブリダイズさせることと、を含む、方法。
（２） 前記免疫磁気濃縮が、
ａ．他の集団を実質的に排除して、前記試料を、疑わしい循環腫瘍細胞と特異的に結合するリガンドに結合されたコロイド状免疫磁性粒子と混合することと、
ｂ．前記試料−免疫磁性粒子の混合物を高勾配の磁場にさらすことによって、免疫磁性粒子が結合した腫瘍細胞が濃縮された分離された細胞画分を生成することと、を含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記表現型プロファイルが、多パラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベースの画像分析法、毛管容量測定法、スペクトル画像分析法、手動細胞分析、自動細胞分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって求められる、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記表現型プロファイルが、自動免疫蛍光細胞分析法によって求められる、実施態様３に記載の方法。
（５） 前記プローブの構成が、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のクローン配列と、クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブとからなる、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記クローン配列が、細菌人工染色体クローンから選択される、実施態様４に記載の方法。
（７） 前記αサテライトプローブが、ＳＥ−１７、ＳＥ−１５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様５に記載の方法。
（８） 前記αサテライトプローブが、１５番染色体のｑ１領域に対する特異性を有する、実施態様５に記載の方法。
（９） 前記疑わしい標的細胞をハイブリダイズすることが、前記患者の診断、予後、又は治療情報を与える、実施態様１に記載の方法。
（１０） 患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を判定するためのキットであって、
ａ．反復配列を除去した、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のポリヌクレオチドプローブ配列と、
ｂ．クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブと、
ｃ．前記（ａ）及び（ｂ）に結合された標識部分と、を含む、キット。
【００６１】
（１１） 二本鎖特異的ヌクレアーゼで消化することによって、前記ポリヌクレオチドプローブ配列から前記反復配列を除去する、実施態様１０に記載のキット。
（１２） 前記標識部分が、白金ベースの配位結合によって結合された蛍光色素分子である、実施態様１０に記載のキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を評価するための方法であって、
ａ．循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、
ｂ．免疫磁気濃縮により、上皮細胞の亜集団を単離することと、
ｃ．疑わしい循環腫瘍細胞を同定することと、
ｄ．前記疑わしい循環腫瘍細胞を、染色体異常を検出可能なＩＧＦ−１Ｒ無反復配列プローブの構成とハイブリダイズさせることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫磁気濃縮が、
ａ．他の集団を実質的に排除して、前記試料を、疑わしい循環腫瘍細胞と特異的に結合するリガンドに結合されたコロイド状免疫磁性粒子と混合することと、
ｂ．前記試料−免疫磁性粒子の混合物を高勾配の磁場にさらすことによって、免疫磁性粒子が結合した腫瘍細胞が濃縮された分離された細胞画分を生成することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表現型プロファイルが、多パラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベースの画像分析法、毛管容量測定法、スペクトル画像分析法、手動細胞分析、自動細胞分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって求められる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表現型プロファイルが、自動免疫蛍光細胞分析法によって求められる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブの構成が、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のクローン配列と、クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブとからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クローン配列が、細菌人工染色体クローンから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記αサテライトプローブが、ＳＥ−１７、ＳＥ−１５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記αサテライトプローブが、１５番染色体のｑ１領域に対する特異性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記疑わしい標的細胞をハイブリダイズすることが、前記患者の診断、予後、又は治療情報を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を判定するためのキットであって、
ａ．反復配列を除去した、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のポリヌクレオチドプローブ配列と、
ｂ．クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブと、
ｃ．前記（ａ）及び（ｂ）に結合された標識部分と、を含む、キット。
【請求項１】
患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を評価するための方法であって、
ａ．循環腫瘍細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含む血液試料を患者から得ることと、
ｂ．免疫磁気濃縮により、上皮細胞の亜集団を単離することと、
ｃ．疑わしい循環腫瘍細胞を同定することと、
ｄ．前記疑わしい循環腫瘍細胞を、染色体異常を検出可能なＩＧＦ−１Ｒ無反復配列プローブの構成とハイブリダイズさせることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫磁気濃縮が、
ａ．他の集団を実質的に排除して、前記試料を、疑わしい循環腫瘍細胞と特異的に結合するリガンドに結合されたコロイド状免疫磁性粒子と混合することと、
ｂ．前記試料−免疫磁性粒子の混合物を高勾配の磁場にさらすことによって、免疫磁性粒子が結合した腫瘍細胞が濃縮された分離された細胞画分を生成することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表現型プロファイルが、多パラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベースの画像分析法、毛管容量測定法、スペクトル画像分析法、手動細胞分析、自動細胞分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって求められる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表現型プロファイルが、自動免疫蛍光細胞分析法によって求められる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブの構成が、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のクローン配列と、クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブとからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クローン配列が、細菌人工染色体クローンから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記αサテライトプローブが、ＳＥ−１７、ＳＥ−１５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記αサテライトプローブが、１５番染色体のｑ１領域に対する特異性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記疑わしい標的細胞をハイブリダイズすることが、前記患者の診断、予後、又は治療情報を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者試料からの循環腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ遺伝子異常を判定するためのキットであって、
ａ．反復配列を除去した、前記ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子座の周囲のポリヌクレオチドプローブ配列と、
ｂ．クロスハイブリダイゼーションを生じないαサテライトプローブと、
ｃ．前記（ａ）及び（ｂ）に結合された標識部分と、を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５１５１０９（Ｐ２０１１−５１５１０９Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２０１５（Ｐ２０１１−５０２０１５）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７６７
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７６７
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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