説明

Gタンパク質共役型レセプターの作動剤および医薬

【課題】Gタンパク質共役型レセプターの作動剤、及び該作動剤を有効成分として含有する各種医薬を提供する。
【解決手段】本発明のGタンパク質共役型レセプターの作動剤は、
一般式(I):


(式中、Rは置換されていても良い低級アルキル基を示す。)
で表されるチアゾリジン系化合物を有効成分として含有する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤およびこれを利用した各種医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
脂肪酸をリガンドとするGタンパク質共役型レセプター(GPCR)として、GPR120及びGPR40とその類縁分子が知られている。
【0003】
GPR40の類縁分子としてはGPR41、GPR42などが知られている。
【0004】
GPR120は腸管、肺、脳などに存在することが知られている。腸管に存在するGPR120を保有する細胞は、GPR120を作動させるリガンドとしての脂肪酸を作用させると、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)、コレシストキニン(CCK)などの腸管ホルモンペプチドを放出することが知られている。
【0005】
これらペプチドは摂餌行動に関係する生理的機能を制御しており、例えば、すい臓β細胞からのインスリン分泌、すい臓からの膵液分泌、胆嚢からの胆汁分泌、中枢への食欲抑制作用などを制御している。しかるにGPR120の機能を作動させる物質を生体に投与することにより、インスリン分泌亢進による糖尿病の予防及び治療、消化液分泌促進による消化活動不全の治療、食欲抑制作用による肥満の予防及び治療が考えられる。
【0006】
ところで、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)等のチアゾリジン系化合物は、脂肪細胞の核内受容体型転写因子であるペルオキシゾーム増殖促進受容体ガンマ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma:PPARγ)に結合し、種々の分子の転写を促進することが知られている。これより脂肪細胞の分化を促進し、結果的にインスリン抵抗性の改善、ひいては糖尿病の治療に用いられてきた。
【0007】
これまでチアゾリジン系化合物の主たる薬効は、(1)脂肪細胞を標的としてその活性化を抑制し(非特許文献1)、インスリン抵抗性を誘導する物質産生を抑制し、インスリン抵抗性を改善する(非特許文献2)ことによる糖尿病の治療、(2)インスリン分泌を司る膵臓β細胞に関しても、同様にβ細胞のインスリン分泌を抑制したり、細胞死を誘導したりする外的因子からβ細胞を保護することによりβ細胞の機能維持をする(非特許文献3)ことによる糖尿病の治療、(3)肝臓の脂質捕獲能を亢進して(非特許文献4)、高脂血症治療とそれにともなう、循環器疾患治療、糖尿病治療、(4)肝臓の星細胞の活性化を抑制して肝線維化を抑える(非特許文献5)、肝線維化治療及び非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis: NASH)治療、(5)マクロファージや単球などの炎症を惹起する細胞の活性化(非特許文献6)やサイトカイン産生を抑制(非特許文献7)して炎症性疾患やリウマチ性関節炎の治療、(6)ある種の癌増殖を抑制することによる癌治療(非特許文献8)などが挙げられる。
【非特許文献1】J. Biol Chem. 272, 5637, 1907
【非特許文献2】Hauner H., Diabetes Metab. Res. Rev., 2002 Mar-Apr;18 Suppl 2:S10-5)(Tan MH, Int. J. Clin. Pract. Suppl., 2000 Oct;(113):54-62
【非特許文献3】Ishida H et al., Metabolism, 2004 Apr;53(4):488-94.
【非特許文献4】Sato O. et al., J. Biol. Chem., 2002 May 3;277(18):15703-11
【非特許文献5】GuoYT et al., World J. Gastroenterol, 2005 Aug 14;11(30):4735-9.
【非特許文献6】Nature, 391, 79-82,1998
【非特許文献7】Nature, 391, 82-86,1998
【非特許文献8】Valentiner U et al., Toxicology, 2005 Sep 15;213(1-2):157-68.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤、および該作動剤を有効成分として含有する医薬、たとえば膵臓ベータ分化再生増殖促進剤、消化器疾患治療薬、神経障害治療薬、肺疾患治療薬、及びメタボリックシンドローム治療薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意研究を行った結果、次のような知見を得た。
【0010】
従来、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)等のチアゾリジン系化合物は、脂肪細胞の核内受容体型転写因子であるペルオキシゾーム増殖促進受容体ガンマ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma:PPARγ)に結合し、種々の分子の転写を促進することが知られている。これより脂肪細胞の分化を促進し、結果的にインスリン抵抗性の改善、ひいては糖尿病の治療に用いられてきた。
【0011】
本発明者らは、かかるチアゾリジン系化合物が、GPR120(配列表1〜3)、GPR40(配列表4,5)等のGタンパク質共役型レセプター(GPCR)を作動(亢進)できることを見出した。
【0012】
上述したように、GPR120は、腸管、肺、脳などに存在し、腸管に存在するGPR120を保有する細胞は、チアゾリジン系化合物によりGPR120を作動させて、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)、コレシストキニン(CCK)などの腸管ホルモンペプチドが放出されることを見出した。
【0013】
かかる知見に基づき、本発明者らは更に研究を重ねることにより、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、特定のチアゾリジン系化合物を有効成分として含有するGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤、及び該作動剤を含む食欲調節剤、膵臓ベータ細胞分化再生増殖促進剤、消化器疾患治療薬、神経障害治療薬、及び肺疾患治療薬を提供する。具体的には、以下に掲げる態様の発明を提供する。
【0014】
本発明のGタンパク質共役型レセプターの作動剤は、下記一般式(I)
【化1】

(式中、Rは置換されていても良い低級アルキル基を示す。)
で表される化合物を有効成分として含有するものである。
【0015】
一般式(I)で表される化合物が、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、及びロジグリタゾン(rosiglitazone)からなる群より選ばれる少なくとも1種であることが好ましい。
【0016】
Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)が、GPR120またはGPR40であることが好ましい。
【0017】
以上のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する医薬品として、食欲調節剤、膵臓ベータ細胞分化再生増殖促進剤、消化器疾患治療薬、神経障害治療薬、精神障害治療薬、肺疾患治療薬、メタボリックシンドローム治療薬がある。
【0018】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0019】
本発明のGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤は、下記一般式(I)で示される化合物(以下、チアゾリジン系化合物と表記する)を有効成分として含有する。
【0020】
【化2】

(式中、Rは置換されていても良い低級アルキル基を示す。)
【0021】
Rで示される置換されていても良い低級アルキル基の低級アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖のC1〜6のアルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、n−プロピル基等である。
【0022】
Rにおける低級アルキル基上の置換基としては、置換されていても良いピリジル基、置換されていても良いアミノ基、置換されていても良いシクロアルキル基、置換されていても良いクロマニル基などが挙げられる。
【0023】
置換されたピリジル基のピリジル基上の置換基としては、C1〜3のアルキル基、C1〜3のアルコキシ基、水酸基等が挙げられる。
【0024】
置換されたアミノ基のアミノ基上の置換基としては、C1〜3のアルキル基、ピリジル基等が挙げられる。
【0025】
置換されたシクロアルキル基のシクロアルキル基上の置換基としては、C1〜3のアルキル基等が挙げられる。
【0026】
置換されたクロマニル基上の置換基としては、C1〜3のアルキル基、水酸基等が挙げられる。
【0027】
好ましいRとしては、以下に示される基である。
【0028】
【化3】

【0029】
即ち、好ましいチアゾリジン系化合物としては、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ロジグリタゾン(rosiglitazone)等が挙げられる。
【0030】
本発明のGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤は、上記したチアゾリジン系化合物を有効成分として含有する。従来、チアゾリジン系化合物は、細胞内受容体であるPPARγに結合し、種々の分子の転写を促進し、これより脂肪細胞の分化を促進し、結果的にインスリン抵抗性の改善、ひいては糖尿病の治療に用いられてきた。
【0031】
しかしながら、本研究によりチアゾリジン系化合物の一部がGPR120又はGPR40の機能を作動(亢進)させることが明らかとなった。具体的には、本発明のGPCRの作動剤は、チアゾリジン系化合物が腸管ホルモン分泌細胞に働いて、腸管ホルモンを放出し、このホルモン(具体的にはCCKおよびGLP-1)が標的細胞の受容体(CCK受容体またはGLP-1受容体)に作用して種々の薬効を示すという新しいメカニズムに基づくものである。つまり、チアゾリジン系化合物は、従来の糖尿病治療等のメカニズムと異なる、新規なメカニズムに基づき、従来知られていなかった薬効を発揮するのである。また、メカニズムが異なるため、チアゾリジン系化合物の標的臓器も異なるわけであるから、異なる薬効が発揮される。
【0032】
本発明の対象疾患と効能は血中または対象臓器内のCCK濃度の増加、および血中又は対象臓器内のGLP-1濃度の増加に基づいている。本発明はチアゾリジン系化合物によりGPCRを作動させて、血中又は対象臓器内のCCKまたはGLP-1濃度の亢進にともなう広範な治療が可能となる。
【0033】
CCKの濃度増加にともなう対象疾患として、例えば、(i)消化活動を促進する。膵液分泌促進、胃液分泌促進、胆汁分泌促進、胃における食物滞留の保持、腸管運動の促進、食道下部括約筋収縮による逆流防止などである。CCKを増加させ消化活動の不全な疾患を治療する。(ii)満腹感を与え食欲を抑制する。CCKを増加させることにより食欲に関する疾患、たとえば肥満を抑制したり、神経性過食症を治療したりする。(iii)胃粘膜中の細胞の分化増殖を促進する。胃壁障害の治療。(iv)神経の修復、維持作用があり、神経障害治療。この記載に限定されるものでなく、CCKの濃度亢進ともなう治療全体が対象となる。
【0034】
一方、GLP-1の濃度増加にともなう対象疾患として、例えば、(1)膵臓β細胞の分化再生増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。またはβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上;(2)胃酸分泌抑制による胃酸過多治療;(3)腸管運動抑制による下痢治療(4)神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療;及び(5)食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。この記載に限定されるものでなく、GLP-1の濃度亢進にともなう治療全体が対象となる。
【0035】
チアゾリジン系化合物は、CCKとGLP-1放出を同時に行なう為、両者が同様な薬効を表すケースが多いが、消化活動では互いに拮抗するように見える。実際は両者が協調して消化活動を円滑に行なっており、CCKとGLP-1が同時に放出されることはより生理的に合理的治療法となる。
【0036】
チアゾリジン系化合物が直接標的臓器に作用する場合と、GPR120(配列表1〜3)を介してCCKやGLP-1を放出してこれらが標的臓器に作用する場合とは、当然薬効は異なるが、特に従来の直接作用と異なる薬効について記載すると、適用拡大は次の通りとなる。(i)消化活動の協調的促進、消化活動障害の治療、(ii)食欲抑制による肥満予防治療、過食症の治療、(iii)膵臓β細胞の分化増殖促進による糖尿病予防治療。特にβ細胞あるいはその前駆細胞移植治療時の治療効果促進剤、(iv)神経細胞可塑性、生存維持作用による神経移植、神経接合時の治療促進剤あるいはアルツハイマー症等、神経細胞障害が原因の疾患治療、(v)腸管運動の正常化作用による腸炎時の腸管運動異常の治療、(vi) 腸管細胞の障害抑制あるいは腸管に存在する神経細胞の障害抑制、(vii)肺における肺機能向上例えばサーファクタント分泌促進によるCOPD(慢性閉塞性肺疾患)などの肺疾患治療、(viii) GPR120作動薬はCCKとGLP−1の両作用を同時に促すことから、肥満、インスリン抵抗性、高血糖などを総合的に治療することによる、メタボリックシンドローム治療などがあげられる。
【0037】
一方、GPR40(配列表4,5)を作動させるチアゾリジン系化合物は、測定薬のいずれもGPR40を作動させたが、その効果の強さは物質により異なった(図1)。GPR40は膵臓β細胞に存在し、GPR40の作動によりインスリン分泌が促進される。GPR40作動性チアゾリジン化合物は、PPARγを作動させ脂肪細胞活性化を抑制する従来の作用と同時に直接β細胞に作用して、膵臓β細胞の分化増殖を促進する。この視点からチアゾリジン化合物の新たな薬効拡大として膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬、或いはβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上が考えられる。
【0038】
本発明のチアゾリジン系化合物を有効成分として含有するGPCRの作動剤は、上記したような薬効を有しており、例えば、次のようにして製剤化できる。
【0039】
本発明のGPCRの作動剤は、静脈内、経口への投与を含む、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。静脈内への投与に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
【0040】
pHは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【0041】
注射に適する製剤とするには、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒であって、使用時に調製するための滅菌水溶液(水溶性の)又は分散媒及び滅菌されたパウダー(凍結乾燥されたタンパク質、核酸などを含む)が含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が含まれる。注射剤として使用する場合、GPCR作動剤は滅菌されており、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを防ぐために使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
【0042】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【0043】
経口用の製剤とする場合には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口用製剤は、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口用製剤は、流動性担体を用いて調製することも可能である。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び/又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
【0044】
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤及びその類似物は、以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る。微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤;スターチ又はラクトース、アルギン酸、PRIMOGEL、又はコーンスターチなどの膨化剤;ステアリン酸マグネシウム又はSTRROTESなどの潤滑剤;コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤;スクロース又はサッカリンなどの甘味剤;又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【0045】
全身投与用の製剤とする場合には、経粘膜的又は経皮的に行うことができる。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアーを透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中に製剤化される。
【0046】
また、チアゾリジン系化合物は、直腸への送達に対して、坐薬(例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に)又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
【0047】
制御放出製剤とする場合には、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ALZA Corporation(Mountain View, CA)及びNOVA Pharmaceuticals, Inc.(Lake Elsinore, CA)から入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG誘導ホスファチジルエタノール(PEG−PE)を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のFab’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい(Martin及びPapahadjopoulos, 1982)。詳細な調製方法は、例えば、Eppstein等, 1985;Hwang等, 1980中の記載を参照。
【0048】
本発明のGPCR作動剤の投与量は、特定の疾患の治療又は予防において、投与される患者(人)又は動物の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば容易に最適化することが可能である。
【0049】
例えば、注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約0.1μg/kgから500mg/kgを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約0.1μg/kgから約250mg/kgであり、より好ましくは一日に約0.5〜約100mg/kgである。
【0050】
経口投与の場合は、好ましくは1.0から1000mgの活性成分を含む錠剤の形態で提供される。好ましくは治療されるべき患者(人)又は動物に対する有効活性成分の投与量は、0.01〜100mg/kgである。化合物は一日に1〜4回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【0051】
また、チアゾリジン化合物のスクリーニング手段として、GPR120およびGPR40への作動性を測定することにより、ここで述べた適用拡大の対象疾患に対するより優れた医薬品をスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【0052】
本発明のGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤は、食欲調節剤、膵臓ベータ分化細胞増促進殖剤、消化器疾患治療薬、神経障害治療薬、及び肺疾患治療薬として有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0053】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0054】
−実施例1(細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK) AssayによるGPR40およびGPR120のLigand Screening)−
本実施例に用いた材料及び方法は以下の通りである。
1.蛋白質回収
(1)本実験には細胞株TXGPR40およびTXGPR120を用い、35 mm dishに細胞数5×105 / dishになるよう播種した。Dishへの定着を確認した後Doxycyclin処理(10μg Doxycyclinを細胞溶液に加える)し、その28時間前にStarvation(FBS(-)Mediumに置き換え、Dox入)を行い、更にその20時間後にAssayした。
なお、TXGR40、TXGR120はそれぞれ、ヒトGPR40(hGPT40)又はヒトGPR120(hGPR120)遺伝子をDoxycycline処理で発現する発現ベクターに組み込んだプラスミドを遺伝子導入し、安定的にGPR40又はGPR120蛋白質を発現する細胞株を意味する。
(2)Ligandは、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ロジグリタゾン(rosiglitazone)の4種類を用いた。これらをDMSOに溶解して調製し、Mediumで10倍に希釈して、全量100μlとした。また、ネガティブコントロールとしてDMSOを、ポジティブコントロールとしてPMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)を用いた。
(3)細胞のdishからMediumを除き、全液量を0.9 mlとした。
(4)Ligand溶液を細胞の溶液の上からポタポタと垂らすように加え、軽くdishを揺すって拡散させ、室温で反応させた。
(5)5分間の反応の後、Mediumを捨て、dishに残ったMediumは氷上にてアスピレータで除去した。
(6)150μl Lysis buffer(50mM HEPES(pH7.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1% NonidetP-40, 2mM MgCl2, 1mM EDTA, 100mM NaF, 10mM Sodiumphosphate, 1mM Na3VO4, 20mM β-glycerophosphate, Proteinase Inhibitor)を入れ、Cell Scraperで細胞を回収した。
(7)回収した液は150μl(等量)の1×SDS Sample Buffer(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% SDS, 12% Mercaptoethanol, 20% glycerol, BPB)と混合し、以下のWestern Blottingに使用、または-20℃で保存した。
【0055】
2.SDS-PAGE
(1)SDS Sample Bufferに混合した粗酵素液は、sonifierを用いて超音波破砕した後、90℃で5minインキュベートした。
(2)ボルテックスにかけて遠心(15,000 rpm 5min 4℃)した。
(3)泳動槽に1×SDS-PAGE Running Buffer(25mM Tris, 0.2M Glycine, 1% SDS)を満たし、2枚の7.5%アクリルアミドゲルをセットし、サンプル遠心後の上清をアプライした。泳動は40mAの定電流で行った。(約80?90min)
【0056】
3.Blotting(Semi-Dry法)
(1)PVDF membraneはゲルの大きさにあわせて切り、methanolに約15sec浸した後、Transfer Buffer C solution(25mM Tris, 0.02% SDS, 2% methanol, 40mM 6-aminohexanoic acid)中で15min振盪(室温)して膨潤させた。Blottingに使用する濾紙は10cm×10cmの大きさに切った。
(2)Blotting装置にA solution(0.3M Tris, 0.02% SDS, 2% methanol)に浸した濾紙2枚、B solution(25mM Tris, 0.02% SDS, 2% methanol)に浸した濾紙2枚の順に重ね、その上にmembraneを乗せた。更にその上に泳動終了後のゲルを乗せ、最後にC solutionに浸らせた濾紙2枚を重ねてふたをした。
(3)15 Vで30分間Transferを行った。
【0057】
4.ブロッキング(Blocking)
(1)以下の作業はすべて室温。Transfer終了後のmembraneを1×TTBS(0.2M Tris, 1.5M NaCl, 0.2& Tween20)を入れたケースに移し、15分間washした。
(2)TTBSを除き、Block Ace約10 mlを加えて1時間振盪してBlockingした。
【0058】
5.一次抗体
(1)一次抗体(p44/42 MAP Kinase AntibodyおよびPhospho-p44/42 MAP Kinase Antibody)は、それぞれTTBSで1000倍希釈。
(2)Blocking終了後、Block Ace溶液を除き、一次抗体溶液を入れて2時間振盪して反応させた。
【0059】
6.二次抗体
(1)二次抗体(Anti-rabbit Ig, Horseradish Peroxidase linkednF (ab’)2 fragment)はTTBSで5000倍希釈。
(2)一次抗体溶液を除き、TTBS中で5?10分間振盪しwashした。washは3回。
(3)TTBSを除き、二次抗体溶液を入れて1時間振盪した。
【0060】
7.検出
(1)氷上にてECL kit中のDetection Reagent 1とDetection Reagent 2それぞれ2 mlずつを混合した。
(2)二次抗体反応終了後のmembraneから、二次抗体溶液を除き、TTBS中で5分間振盪しwashした。washは3回。
(3)membraneを、しっかり水を切ってパック内へ入れ、1枚のmembraneにつき2 mlのDetection Reagent混合液をかけた。
(4)カセット内でmembraneとフィルムとを1分?5分間接触させ、自動現像機で現像した。
【0061】
8.解析
(1)フィルムをスキャンしてパソコンに取り込み、「Image J」のアプリケーション(Image J 1.345: National Institutes of Healthから公開されているフリーソフト)を用いてバンドを数値化した。
(2)DMSOおよびPMAによりnormalizeし、薬物間の値を比較した。
【0062】
TXGPR40およびTXGPR120に対し、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン及びロジグリタゾンを10μM、100μMの濃度で反応させた。シグナルは数値化し、DMSOおよびPMAによりnormalizeした。
【0063】
TXGPR40およびTXGPR120の結果を、それぞれ図1及び図2に示す。図1および図2に示す各物質のデータにおいて、A(Doxt)は、Doxycycline処理によりGPR蛋白質を発現させた細胞の反応を示し、B(Dox-)はDoxycycline処理を行わずGPR蛋白質を発現させていない細胞の反応を示し、C(TXCONT)はGPR遺伝子を含まないベクターのみを導入した細胞の反応を示す。図1および図2のデータから、以下の知見が得られた。
【0064】
GPRの組み込まれていないTXCONTおよびDoxycycline処理を行っていない細胞(Dox(-))をネガティブコントロールとして並べ、Doxycycline処理を行ったもの(Dox(+))について4種類のLigandに対するERK活性を比較した。hGPR40についてはいずれのLigandに対しても反応が見られた。一方hGPR120については、トログリタゾン及びシグリタゾンに対してのみ反応がみられ、その他のLigandではほとんどERKの活性化は起こらなかった。
【0065】
これにより、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン及びロジグリタゾンは、GPR40(配列表4,5)を誘導発現した細胞に対して、特異的に反応していることが理解できる。従って、上記の4化合物は、GPR40作動剤として好適に用いられることを示唆している。
【0066】
また、トログリタゾン及びシグリタゾンはGPR120(配列表1〜3)を誘導発現した細胞に対して、特異的に反応していることが理解できる。従って、上記の2化合物はGPR120作動剤(アゴニスト)として好適に用いられることを示唆している。
【0067】
−実施例2−
C57BL/6 CrSlc (8週令、♂、約25g) にネンブタール溶液(原液を生理食塩水で1/10に希釈)を投与して麻酔した。開腹後、投与物質を100nmol/g 体重 ポリエチレングリコール(Polyehylene glycol(PEG):平均分子量400、SIGMA)100μlに懸濁して、腸管(結腸)へ投与した。投与後15分静置し、門脈より採血した。採血した血液サンプルを遠心分離し、血漿を凍結保存した。血漿のGLP−1濃度をELISA(ラットGLP-1ELISAキットワコー:和光純薬工業株式会社)を用いて測定した。使用マウスは各群5匹を用いた。αリノレン酸(SIGMA)及びトログリタゾン(SIGMA)を用いた。
【0068】
図3は、実施例2における投与物質として、PEGのみ、αリノレン酸(α―LA)PEG懸濁液、トログリタゾンPEG懸濁液をそれぞれ用いた場合のGLP−1平均濃度(ng/ml)を表にして示す図である。この結果から、トログリタゾンは、GPR120リガンドであるα−LAと同程度のGLP−1を腸管から放出しており、細胞のGPR120の活性化に有効であることがわかる。
【0069】
GPR120アゴニストあるいはアンタゴニストは論文および特許(Nature Medicine、11(1),90-94,2005 および特開2005−15358)に示すようにGPR120保有細胞からGLP-1あるいはCCKの放出を促進し、論文に示すように
(I)消化活動の協調的促進、消化活動障害の治療薬。Nutrition 2001; 17(3):230-5、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2004 ;18(4):569-86、Dig Dis Sci.2004;49(3):361-9、Endocrinology 2004;145(6):2653-9、Pharmacol Toxicol 2002;91(6):375-81、Gastroenterology 2004;127(3):957-69、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2004 ;18(4):569-86、Med Res Rev.2003;23(5):559-605、Med Res Rev.2003;23(5):559-605、Horm Metab Res 2004;36(11-12):842-5、Horm Metab Res 2004;36(11-12):842-5、Am J Phyusiol Endcrinol Metab 2004;287(6):E1209-15、Dig Dis Sci 1998;43(4):799-805、(II)食欲抑制による肥満予防治療薬、過食症の治療薬。Physiol Behav. 2004;83(4): 617-21,Best Pract Res Cli Endocrinol Metab. 2004;18(4):569-86、Trends Endcrinol Metab.2004;15(6):259-63, Cuur Drug Target CNS Neurol disord 2004;3(5):379-88
(III)膵臓β細胞の分化増殖促進による糖尿病予防治療薬。特にβ細胞あるいはその前駆細胞移植治療時の治療効果促進剤Diobetology, 2005;48(9):1700-13、Diabetes 2004;53suppl 3:S225-32、Hormone Metab Res.2004(11-12):766-70、Hormone Metab Res.2004、36(11-12):846-51
(IV)神経細胞可塑性、生存維持作用による神経移植、神経接合時の治療促進剤あるいはアルツハイマー症等、神経細胞障害が原因の疾患治療薬。Curr Drug Target CNS Neurol Disord 2002; 1(5): 495-510、Curr Drug Targets.2004;5(69:565-71、Curr Alzheimer Res 2005,2(3):377-85
(V)腸管運動の正常化作用による腸炎時の腸管運動異常の治療薬Drug 2003;63(12):1785-97、Br J Pharmacol. 2004;141(8):1275-84,
(VI)肺におけるサーファクタント分泌促進によるCOPD(慢性閉塞性肺疾患)などの肺疾患治療薬Endocrinology. 1998;139(5):2363-8. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163(4):840-6.
(VII)メタボリックシンドローム治療薬。前述のNature Medicine、11(1), 90-94,2005 および特開2005−15358および(II)の文献を総合
となる。
【図面の簡単な説明】
【0070】
【図1】実施例1におけるERKアッセイによるGPR40のリガンドスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図2】実施例1におけるERKアッセイによるGPR120のリガンドスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図3】実施例2における各種投与物質に対するGLP−1平均濃度を表にして示す図である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式(I):
【化1】

(式中、Rは置換されていても良い低級アルキル基を示す。)
で表される化合物を有効成分として含有するGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の作動剤。
【請求項2】
一般式(I)で表される化合物が、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、及びロジグリタゾン(rosiglitazone)からなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
【請求項3】
前記Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)が、GPR120である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
【請求項4】
前記Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)が、GPR40である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
【請求項5】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する食欲調節剤。
【請求項6】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する膵臓ベータ細胞分化再生増殖促進剤。
【請求項7】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する消化器疾患治療薬。
【請求項8】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する神経障害治療薬。
【請求項9】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する精神障害治療薬。
【請求項10】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する肺疾患治療薬。
【請求項11】
請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有するメタボリックシンドローム治療薬。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2008−1690(P2008−1690A)
【公開日】平成20年1月10日(2008.1.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−138654(P2007−138654)
【出願日】平成19年5月25日(2007.5.25)
【出願人】(506180040)ファルマフロンティア株式会社 (9)
【出願人】(504080607)
【Fターム(参考)】