Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の調節剤を同定する方法
本発明は、高親和性および特異性で、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介するシグナル伝達を遮断するかまたは増進し、そして／またはＧタンパク質共役型受容体の特定の配座異性体を安定化する、ペプチドおよび他の化合物を同定する方法に関する。これらの方法と組み合わせて発展したアッセイ、治療法、および他の方法もまた、開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドを同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する、前記ペプチドライブラリーのメンバーを選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片がＧαサブユニットである、請求項４の方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項４の方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項４の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項２２】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドを提供し；
（ｃ）前記高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｄ）工程（ｂ）のペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｂ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項２５の方法。
【請求項３３】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項２５の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求２２の方法。
【請求項３５】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項２２の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｂ）のペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーがコンビナトリアル・ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３８】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが薬剤様分子を含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが集中的小分子ライブラリーである、請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記集中的小分子ライブラリーのメンバーが、工程（ｂ）のペプチドの化学的構造に基づく、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチド。
【請求項４２】
請求項２２の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物。
【請求項４３】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項２２の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を阻害する方法であって、前記Ｇタンパク質共役型受容体が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質に結合するのに干渉する化合物と、前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）請求項１の方法にしたがって同定されたペプチドを提供し、ここで前記ペプチドは検出可能なペプチドシグナルを提供するように標識されている；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）前記ペプチドと前記Ｇタンパク質共役型受容体を、前記ペプチドが前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する条件下で接触させ；
（ｄ）未結合ペプチドを前記Ｇタンパク質共役型受容体から取り除き；
（ｅ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｆ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物の前記ライブラリーのメンバーと、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させ；
（ｇ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｈ）前記Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達活性が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているか、そしてＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているかを決定し；そして
（ｉ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合増加、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達増加の両方を生じる化合物を同定し、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合減少、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達減少の両方を生じる化合物を同定し、そしてペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、工程（ａ）のペプチドの結合親和性増加を生じる化合物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４７】
ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体の前記シグナル伝達活性を測定する方法が：
（ａ）イノシトールリン酸集積測定；
（ｂ）細胞内Ｃａ２＋レベル測定；
（ｃ）アデニルシクラーゼ活性測定；
（ｄ）経内皮電気抵抗測定；
（ｅ）ストレスファイバー形成測定；
（ｆ）リガンド結合測定；
（ｇ）受容体発現測定；
（ｈ）受容体脱感作測定；
（ｉ）キナーゼ活性測定；
（ｊ）ホスファターゼ活性測定；
（ｋ）核転写因子測定；
（ｌ）遊走（走化性）すべての測定；
（ｍ）スーパーオキシド形成測定；
（ｎ）一酸化窒素形成測定；
（ｏ）細胞脱顆粒測定；
（ｐ）ＧＩＲＫ活性測定；
（ｑ）アクチン重合測定；
（ｒ）血管狭窄測定；
（ｓ）細胞浸透性測定；
（ｔ）アポトーシス測定；
（ｕ）細胞分化測定；
（ｖ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；
（ｗ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；および
（ｘ）Ｒａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定
からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物。
【請求項４９】
療法Ｇタンパク質共役型シグナル伝達修飾ペプチドを哺乳動物に提供する方法であって、前記哺乳動物に、請求項４８の化合物を発現する発現構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
過剰なＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達増進剤を同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する前記ペプチドライブラリーメンバーを選択し；
（ｄ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｅ）工程（ｃ）で選択した前記ペプチドライブラリーのメンバーと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｆ）工程（ｃ）で選択したペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｃ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項６０】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項５４の方法。
【請求項６１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項５４の方法。
【請求項６２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項５４の方法。
【請求項６３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項５１の方法。
【請求項６４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項５１の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項５１の方法。
【請求項６７】
請求項６６の方法であって、前記酵素連結免疫吸着アッセイが：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；
（ｃ）前記Ｇタンパク質共役型受容体に対して、少なくとも前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合する条件下で、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体を、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの存在下でインキュベーションし；
（ｄ）前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを取り除き；
（ｅ）前記の結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体を、前記抗体が前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合する条件下で、インキュベーションし；
（ｆ）未結合抗体を取り除き；そして
（ｇ）前記の結合した抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６８】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、そして前記抗体が抗マルトース結合タンパク質抗体である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と前記シグナル伝達増進剤の相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項５１の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７１】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７４】
工程（ｄ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｃ）で選択された化合物の構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７５】
候補化合物の前記ライブラリーがペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７６】
候補化合物の前記ライブラリーが小分子ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７７】
請求項５１記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７８】
請求項６７記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７９】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８０】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項７８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８１】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）Ｇタンパク質共役型受容体−化合物結合対を共結晶させ；
（ｃ）前記共結晶結合対をＸ線結晶学に供し；そして
（ｄ）前記共結晶結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８２】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）前記結合対を核磁気共鳴研究に供し；そして
（ｃ）前記結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８３】
Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナーを単離する方法であって：
（ａ）請求項７８の結合化合物を含む固体支持体を提供し；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナー化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）候補化合物の前記ライブラリーと、前記固体支持体を、前記化合物への前記候補化合物の結合が生じる条件下で接触させ；
（ｄ）未結合候補化合物および非特異的に結合した候補化合物を前記固体支持体から溶出し；そして
（ｅ）前記固体支持体から、結合した候補化合物を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項８４】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８１の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８５】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８２の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８６】
請求項７７のペプチドをコードするＤＮＡを含む核酸であって、前記ＤＮＡが異種転写制御配列に機能可能であるように連結されている、前記核酸。
【請求項８７】
請求項８６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項８９】
請求項４８のペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項９０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項８９の抗体。
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドを同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する、前記ペプチドライブラリーのメンバーを選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片がＧαサブユニットである、請求項４の方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項４の方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項４の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項２２】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドを提供し；
（ｃ）前記高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｄ）工程（ｂ）のペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｂ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項２５の方法。
【請求項３３】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項２５の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求２２の方法。
【請求項３５】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項２２の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｂ）のペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーがコンビナトリアル・ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３８】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが薬剤様分子を含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが集中的小分子ライブラリーである、請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記集中的小分子ライブラリーのメンバーが、工程（ｂ）のペプチドの化学的構造に基づく、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチド。
【請求項４２】
請求項２２の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物。
【請求項４３】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項２２の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を阻害する方法であって、前記Ｇタンパク質共役型受容体が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質に結合するのに干渉する化合物と、前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）請求項１の方法にしたがって同定されたペプチドを提供し、ここで前記ペプチドは検出可能なペプチドシグナルを提供するように標識されている；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）前記ペプチドと前記Ｇタンパク質共役型受容体を、前記ペプチドが前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する条件下で接触させ；
（ｄ）未結合ペプチドを前記Ｇタンパク質共役型受容体から取り除き；
（ｅ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｆ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物の前記ライブラリーのメンバーと、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させ；
（ｇ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｈ）前記Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達活性が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているか、そしてＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているかを決定し；そして
（ｉ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合増加、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達増加の両方を生じる化合物を同定し、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合減少、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達減少の両方を生じる化合物を同定し、そしてペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、工程（ａ）のペプチドの結合親和性増加を生じる化合物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４７】
ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体の前記シグナル伝達活性を測定する方法が：
（ａ）イノシトールリン酸集積測定；
（ｂ）細胞内Ｃａ２＋レベル測定；
（ｃ）アデニルシクラーゼ活性測定；
（ｄ）経内皮電気抵抗測定；
（ｅ）ストレスファイバー形成測定；
（ｆ）リガンド結合測定；
（ｇ）受容体発現測定；
（ｈ）受容体脱感作測定；
（ｉ）キナーゼ活性測定；
（ｊ）ホスファターゼ活性測定；
（ｋ）核転写因子測定；
（ｌ）遊走（走化性）すべての測定；
（ｍ）スーパーオキシド形成測定；
（ｎ）一酸化窒素形成測定；
（ｏ）細胞脱顆粒測定；
（ｐ）ＧＩＲＫ活性測定；
（ｑ）アクチン重合測定；
（ｒ）血管狭窄測定；
（ｓ）細胞浸透性測定；
（ｔ）アポトーシス測定；
（ｕ）細胞分化測定；
（ｖ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；
（ｗ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；および
（ｘ）Ｒａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定
からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物。
【請求項４９】
療法Ｇタンパク質共役型シグナル伝達修飾ペプチドを哺乳動物に提供する方法であって、前記哺乳動物に、請求項４８の化合物を発現する発現構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
過剰なＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達増進剤を同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する前記ペプチドライブラリーメンバーを選択し；
（ｄ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｅ）工程（ｃ）で選択した前記ペプチドライブラリーのメンバーと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｆ）工程（ｃ）で選択したペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｃ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項６０】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項５４の方法。
【請求項６１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項５４の方法。
【請求項６２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項５４の方法。
【請求項６３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項５１の方法。
【請求項６４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項５１の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項５１の方法。
【請求項６７】
請求項６６の方法であって、前記酵素連結免疫吸着アッセイが：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；
（ｃ）前記Ｇタンパク質共役型受容体に対して、少なくとも前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合する条件下で、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体を、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの存在下でインキュベーションし；
（ｄ）前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを取り除き；
（ｅ）前記の結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体を、前記抗体が前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合する条件下で、インキュベーションし；
（ｆ）未結合抗体を取り除き；そして
（ｇ）前記の結合した抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６８】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、そして前記抗体が抗マルトース結合タンパク質抗体である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と前記シグナル伝達増進剤の相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項５１の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７１】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７４】
工程（ｄ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｃ）で選択された化合物の構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７５】
候補化合物の前記ライブラリーがペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７６】
候補化合物の前記ライブラリーが小分子ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７７】
請求項５１記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７８】
請求項６７記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７９】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８０】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項７８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８１】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）Ｇタンパク質共役型受容体−化合物結合対を共結晶させ；
（ｃ）前記共結晶結合対をＸ線結晶学に供し；そして
（ｄ）前記共結晶結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８２】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）前記結合対を核磁気共鳴研究に供し；そして
（ｃ）前記結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８３】
Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナーを単離する方法であって：
（ａ）請求項７８の結合化合物を含む固体支持体を提供し；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナー化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）候補化合物の前記ライブラリーと、前記固体支持体を、前記化合物への前記候補化合物の結合が生じる条件下で接触させ；
（ｄ）未結合候補化合物および非特異的に結合した候補化合物を前記固体支持体から溶出し；そして
（ｅ）前記固体支持体から、結合した候補化合物を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項８４】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８１の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８５】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８２の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８６】
請求項７７のペプチドをコードするＤＮＡを含む核酸であって、前記ＤＮＡが異種転写制御配列に機能可能であるように連結されている、前記核酸。
【請求項８７】
請求項８６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項８９】
請求項４８のペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項９０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項８９の抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２００７−５２５１７０（Ｐ２００７−５２５１７０Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９９１３（Ｐ２００６−５０９９１３）
【出願日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１１６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２１９９
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０５３７９４８９）キュー・バイオテック・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１１６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２１９９
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０５３７９４８９）キュー・バイオテック・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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