ＧＣＰＩＩ突然変異体を含有するアルツハイマーの予防及び治療用薬学的組成物
【課題】グルタメート生成阻害及びβアミロイド分解活性を有するＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）及び前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を有効成分として含有する下記の疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【解決手段】ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）が野生型ＧＣＰIIに比べてＡβ分解活性が優れているのみならず、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成を阻害する活性を同時に保有しているので、野生型ＧＣＰIIよりその効果が顕著に優れていて安定性も優秀であることを確認することによって、ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができることが分かる。
【解決手段】ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）が野生型ＧＣＰIIに比べてＡβ分解活性が優れているのみならず、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成を阻害する活性を同時に保有しているので、野生型ＧＣＰIIよりその効果が顕著に優れていて安定性も優秀であることを確認することによって、ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができることが分かる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタメート生成阻害及びβアミロイド（β-amyloid）分解活性を有するＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）、及び前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック（Pick）病及びクロイツフェルト・ヤコブ（Creutzfeid-Jakob）病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＧＣＰIIは、脳に存在し９４〜１００ｋＤａの見かけの分子量を有したタイプII内在性膜タンパク質で、主にグリア内に存在し、ＮＡＡＧ（Ｎ−アセチルアスパルチルグルタメートをＮＡＡ（Ｎ−アセチルアスパルテート）及びグルタメートに加水分解することによって、興奮性神経伝達に影響を及ぼす。ＮＡＡＧ加水分解によって生成されたグルタメートは、中枢神経系で主要な興奮性神経伝達物質として神経系に必須な要素として作用するが、脳内での過多な蓄積は脳細胞の死滅と変性をもたらし、アルツハイマー、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病のような退行性脳疾患を惹起することが知られている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
ＧＣＰIIは、酵素活性及び発現部位によって多様な名前が存在する。前立腺でのＧＣＰIIの強い発現（ＧＣＰIIの機能場所は知られていない）からＰＳＭＡと命名され、中枢神経系では脳神経伝達物質ＮＡＡＧを代謝させるので、ＧＣＰIIをＮＡＡＬＡＤａｓｅと命名し、小腸前半部ではポリ−ｇ−グルタメート葉酸（poly-g-glutamated folate）、葉酸加水分解酵素（folate hydrolase）ＦＯＬＨ１及びカルボキシペプチダーゼとしてグルタメート・カルボキシペプチダーゼII（ＧＣＰII）からガンマ連結されたグルタメート（gamma-linked glutamate）を除去する役割をする。
【０００４】
また、ＧＣＰIIの構造は、ＧＣＰIIの触媒機序及び基質特異性に対する洞察を提供する。ＧＣＰIIは活性部位に二核性Ｚｎ２＋中心があって、この活性部位で二つの亜鉛原子は結合カルボン酸塩リガンド（bridging carboxylate ligand）を共有する。α−ＮＡＡＧは、ＧＣＰIIのアルギニン部分と相互作用するグルタメートサイドチェーン（glutamate side chain）の種類と結合して、カルボニルが攻撃されることから酸素、及びＣ−末端は亜鉛イオンと結合する。基質（例えば、α−ＮＡＡＧでのＮＡＡ）の残りは、Ａｒｇ−２１０と特異的相互作用する基質−結合空間から収容される。もう少し大きな基質（例えば、最大四つの、γ連結されたグルタメートを伴うポリ−γ−グルタメート葉酸（poly-γ-glutamated folates with up to four γ-linked glutamates））は、ポケットとの立体衝突を避けるために少しの構造的再配列を要し、交差して結合し得る。また、ＧＣＰIIは二つの活性部位であるＳ１'ポケット及びＳ１ポケットを有する（非特許文献４）。前記Ｓ１ポケットはＧＣＰII基質特異性の「微細調整（fine-tuning）」として作用し、前記Ｓ１'ポケットはＮＡＡＧ及びＧＣＰII抑制剤の主な高い親和性結合に寄与する。
【０００５】
今までに、ＧＣＰIIの主要機能としては、ＮＡＡＧ加水分解作用があることが報告された。したがって、強力で選択的なＧＣＰII抑制剤、すなわち２−ＰＭＰＡ（２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸）は、脳卒中、ルー・ゲーリック病及び神経因性疼痛の臨床前のモデルで脳グルタメートを減少させて神経保護効果を提供すると報告されたことがある。
【０００６】
以前の研究で、ＧＣＰIIがＡβ（アミロイドβ）の分解効果を通じて、Ａβが脳内に蓄積されることを防止または除くことで、アルツハイマー疾患及びダウン症候群などの疾病治療に用いることができると報告されたことがある（特許文献１）。しかし、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ加水分解によって生成されるグルタメートは、神経毒性を誘発するだけでなく、脳内の過多な蓄積は脳細胞の死滅と変性をもたらして、アルツハイマー、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病のような退行性脳疾患を惹起することが知られているので、ＧＣＰII使用時の安全性を保障することが難しかった。したがって、これを補うことができる方法が要求された。
【０００７】
そこで本発明者等は、これを補うことができる方法を研究した結果、ＧＣＰIIの多様な突然変異体を製造してその活性を分析し、ＧＣＰII突然変異体であるＫ６９９Ｓが野生型ＧＣＰIIよりＡβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成阻害効果も有するため、野生型ＧＣＰIIより優れた効果があって安定性も優れて、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができることを明らかにすることによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許公開番号：10-2007-0023832
【特許文献２】US 7,846,910
【特許文献３】US 2004/0185487
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Choi,W. H.,Oh,Y. S.,Ahn,J. Y.,Kim,S. R. and Ha,T. Y.(2005年)Antioxidative and protective effects of Ulmus davidiana var. japonica extracts on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells. Korean J. Food Sci. Technol.第37巻,p.479-483
【非特許文献２】Jeon,H. J.,Park,S. W. and Mun,B. S.(2004年)Effects of Gwibitang on glutamate-induced death in rat neonatal astrocytes. J Korean Oriental Med.第25巻,p.184-193
【非特許文献３】Lee,J.,Kim,M. S.,Lee,C.,Kim,H. Y.,Choi,D. H.,Kim,T. Y.,Son,Y. and Park,R.(2003年)Role of morphine in the glutamate-induced oxidative damage of C6 glial cells. Korean J Anesthesiol.第45巻,p.271-277
【非特許文献４】Mlcochova P.,Plechanovova A.,Barinka C.,Mahadevan D.,Saldanha J. W.,Rjlisek L.,Konvalinka J.(2007年)Mapping of the active site of glutamate carboxypeptidase II by site-directed mutagenesis. FEBS J.第274(18)巻,p.4731-41
【非特許文献５】Cyril Barinka et al., Amino acids at the N- and C-termini of human glutamate carboxypeptidase II are required for enzymatic activity and proper folding. Eur. J. Biochem. 271, 2782-2790(2008)
【非特許文献６】HENRY S. SPENO et al., Site-Directed Mutagenesis of Predicted Active Site Residues in Glutamate Carboxypeptidase II. MOLECULAR PHARMACOLOGY, 55:179-185 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、グルタメート生成阻害及びβアミロイド分解活性を有するＧＣＰII（glutamate carboxypeptidaseII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を用いた、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を用いた、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明はＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Lysine,Ｋ）をセリン（Serine,Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤のスクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、
（１）前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞においてＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
同時に、本発明は、
（１）前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
本発明１は、ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）の全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明２は、ＧＣＰII突然変異体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明３は、ＧＣＰII突然変異体が、グルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有することを特徴とする、本発明１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明４は、前記βアミロイドが、溶解性または不溶性βアミロイドであることを特徴とする、本発明３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明５は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤である。
本発明６は、発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであることを特徴とする、本発明５のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤である。
本発明７は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明８は、ＧＣＰII突然変異体の遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、本発明７のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明９は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明１０は、ＧＣＰII突然変異タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明９のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明１１は、
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞でＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１２は、工程（２）のタンパク質の発現水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、本発明１１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１３は、
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程と、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１４は、工程（２）のタンパク質の活性水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、本発明１３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）が、野生型ＧＣＰIIに比べてＡβ分解活性が優れているだけでなく、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成阻害活性を同時に保有しており、野生型ＧＣＰIIよりその効果が顕著に優れていて、安定性も優秀であるので、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】２−ＰＭＰＡが、Ａβに及ぼす影響を示した図である。ｒｈＧＣＰIIを２−ＰＭＰＡまたはＥＤＴＡがあるかまたはない条件で、Ａβ４０とともに培養した。Ａβ４０をＥＬＩＳＡまたはＮＡＡＧ分解分析（cleavage assay）で検出した。
【図２】２−ＰＭＰＡが、ＮＡＡＧ分解に及ぼす影響を示した図である。ｒｈＧＣＰIIを２−ＰＭＰＡまたはＥＤＴＡがあるかまたはない条件で、ＮＡＡＧとともに培養した。ＮＡＡＧ水準をＥＬＩＳＡまたはＮＡＡＧ分解分析（cleavage assay）で検出した。
【図３】レンチウイルスＧＣＰII（lentiviral ＧＣＰII）をマウス初代星状細胞に感染させた後、単量体のＡβ４０で細胞を処理した。そして、２−ＰＭＰＡを多様な投与量で処理した。細胞成長培地で前記Ａβ４０の濃度をＥＬＩＳＡ分析で測定した。
【図４】８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Ｅ９形質転換マウスの腹腔内に、１ヶ月間２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを注入した（９回）。膜断片をＮＡＡＧで分析した。
【図５】８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Ｅ９形質転換マウスの腹腔内に、１ヶ月間２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを注入した（９回）。膜断片をＥＬＩＳＡ分析で分析した。
【図６】ＧＣＰIIの位置選択的突然変異を示した図で、プライマーの配列を位置選択的突然変異実験に用いた。
【図７】ＧＣＰIIの位置選択的突然変異を示した図で、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞で多様な突然変異タンパク質の発現を示した。
【図８】ＧＣＰIIのＳ１'ポケット突然変異体のＮＡＡＧ分解活性を示した図である。Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）に置換がある突然変異タンパク質は、ＮＡＡＧを分解しなかった。しかし、Ｓ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｒ５４８Ｐ）に突然変異がある他のタンパク質は、約４０％程度ＮＡＡＧ分解活性を有する。
【図９】ＧＣＰIIのＳ１'ポケット突然変異体のＮＡＡＧ分解活性を示した図である。ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかった。
【図１０】ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を示した図である。Ｈ４細胞で、過剰発現されたＳ１'突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）はアミロイド−β４０を分解したが、Ｓ１突然変異体（Ｇ５４８Ｐ）は分解しなかった。
【図１１】ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を示した図である。Ｈ４細胞で、過剰発現されたＳ１'突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）はアミロイド−β４０を分解したが、Ｓ１突然変異体（Ｇ５４８Ｐ）は分解しなかった。
【図１２】残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐを除いて、Ｋ６９９Ｓによって減少した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を提供する。
【００２４】
前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、具体的にＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたもので、より詳細には配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであるが、これに限定されない。
【００２５】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的にグルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有するものであるが、これに限定されない。
【００２６】
また、本発明は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２７】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであるが、これに限定されない。
【００２８】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的にグルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有するものであるが、これに限定されない。
【００２９】
前記βアミロイドは、具体的に溶解性または不溶性ベータアミロイドであるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明者等は、ＧＣＰIIの特異的抑制剤である２−ＰＭＰＡのＡβペプチドに対する効果を確認するために、組換えヒトＧＣＰII（ｒｈＧＣＰII）をＡβ１−４０と一緒にインキュベートして多様な投与量で２−ＰＭＰＡを添加し、ＥＬＩＳＡで分析した。その結果、ｒｈＧＣＰIIは、対照群と比べて８０％程度Ａβ１−４０ペプチドを分解させたが、２−ＰＭＰＡはＧＣＰIIのＡβ１−４０分解に何らの効果がなかったことを確認した（図１参照）。２−ＰＭＰＡは、初代マウス星状細胞でレンチウイルスＧＣＰIIのＡβ１−４０分解を遮断しなかったことを確認した（図３参照）。ＧＣＰIIによるＮＡＡＧの加水分解は、２−ＰＭＰＡによって完全に遮断されたことを確認した（図２参照）。また、マウスの脳で２−ＰＭＰＡの効果を調べるために、２−ＰＭＰＡで形質転換ＡＤモデルマウスを処理した。本発明者等は、２−ＰＭＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に、１ヶ月間 ２Ｘ／ｗｋ）を、８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Δ９形質転換マウスに対し処理した。皮質膜断片（cortical membrane fraction）におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準をＥＬＩＳＡで分析し、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性をＮＡＡＧ分析で測定した。その結果、ＮＡＡＧ分解は、ＰＢＳ対照群と比べ、２−ＰＭＰＡで処理したマウスにおいて約９０％減少したが（図４参照）、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の総水準は２−ＰＭＰＡの処理によって変化しなかったことを確認した（図５参照）。したがって、ＧＣＰIIでＮＡＡＧまたはＡβ分解部位が異なることを確認した。
【００３１】
本発明者等は、ＧＣＰIIがＳ１及びＳ１'ポケットと命名された二つの活性部位で構成されているということを基に、ＧＣＰII［ｒｅｆ］の多様な突然変異体である、ＧＣＰIIの７個の突然変異体（Ｒ２１０Ａ、Ｄ３８７Ｎ、Ｐ３８８Ａ、Ｒ５３６Ｌ、Ｇ５４８Ｐ、Ｙ５５２Ｉ、Ｋ６９９Ｓ）を製作した（図６参照）。各突然変異がある、二つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、アミノ酸を位置選択的突然変異で変化させた。突然変異がある多様なＧＣＰIIの発現を確認するために、突然変異プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に形質導入させた後、ウエスタンブロットでタンパク質の発現変化を確認した。その結果、バンドのパターンは、ｒｈＧＣＰIIと類似し、バンドの一つはＧＣＰIIの予測された大きさである９８ｋＤａで顕著に見られることを確認した（図７参照）。
【００３２】
本発明者等は、ＧＣＰII突然変異体の酵素活性の変化を観察した。多様な突然変異体の酵素活性を分析するために、Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）及びＳ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）に置換がある突然変異タンパク質を、Ｈ４細胞に形質導入させた。ＮＡＡＧの加水分解を測定するために、細胞溶解物を［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＧＣＰIIの特異的基質とともに培養した。その結果、前記Ｓ１'ポケット突然変異体（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）は、ＮＡＡＧを加水分解する活性をまったくなくしてしまったが、前記Ｓ１ポケット突然変異体（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）は、野生型ＧＣＰIIと比べて４０％程度活性を維持するということを確認した（図８参照）。さらに、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解とＡβ分解間の競争的阻害効果を調べるために、ｒｈＧＣＰIIを［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＡβペプチドを濃度別で培養した。その結果、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかったことを確認した（図９参照）。したがって、Ｓ１'ポケットでのＮＡＡＧ加水分解は、Ａβによって影響されないことを確認し、ＧＣＰIIでのＮＡＡＧ分解とＡβ分解機序が異なることを確認した。
【００３３】
本発明者等は、突然変異ＧＣＰIIのＡβクリアランス活性を同定するために、内因性のＧＣＰIIを発現しないことが知られているＰＣ３細胞に、多様な突然変異プラスミドを形質導入した。４８時間後、前記細胞溶解物をＡβ（２μＭ）と混合して一晩中培養した。残ったＡβペプチドは、６Ｅ１０抗体を用いてドットブロット及びウエスタンブロットで確認した。その結果、Ｋ６９９Ｓ突然変異体は野生型よりもＡβをもう少し分解したが、Ｇ５４８Ｐ突然変異体はＡβ分解活性を失ったことを確認した（図１０、１１参照）。また、培養培地で外因的に処理されたＡβペプチドでＧＣＰIIの分解活性を確認するために、形質導入の翌日、培地内にＡβを１ｎｇ／ｍｌで処理して３７℃で８時間培養しＥＬＩＳＡ分析を行なった。その結果、ウエスタンブロットと類似し、残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐは除外して、Ｋ６９９Ｓによって減少したことを確認した（図１２参照）。したがって、Ｓ１ポケットがＡβの分解においてＳ１'ポケットよりもう少し重要であるということを通じて、ＮＡＡＧ加水分解活性及びＡβ分解活性の作用は、ＧＣＰII酵素によって異なって調節されるということを確認した。
【００３４】
ゆえに、本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIに比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患に有用に用いることができる。
【００３５】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物は、前記有効成分以外に薬剤学的に相応しく、生理学的に許容される補助剤を用いて製造することができ、前記補助剤では、賦形剤、崩解剤、甘味料、結合剤、被剤剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味料などの可溶化剤を用いることができる。
【００３６】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬学的組成物として好ましく製剤化することができる。
【００３７】
液状溶液で製剤化される組成物において薬学的に許容される担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該技術分野の適切な方法としてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３８】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の薬剤の製剤形態としては、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐薬、シロップ、溶液、懸濁剤、乳済、点滴液または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤等を挙げることができる。
【００３９】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の投与方法は、特別にこれに制限されるのではないが、目的とする方法によって非経口投与、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔内、吸入、局所、直腸または経口投与を通じて一般的な方式で投与することができる。
【００４０】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に用いる薬物を含めた多様な因子にしたがって調節することができる。成人の場合、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質を１日に１回ないし数回投与時、０．１μｇ／ｋｇ〜０．１ｇ／ｋｇの用量で投与することが好ましい。
【００４１】
本発明の治療用組成物は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の治療のために、単独で、またはホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して用いることができる。
【００４２】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤を提供する。
【００４３】
前記発現ベクターは、詳細にはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであるが、これに限定されない。
【００４４】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤に有用に用いることができる。
【００４５】
また、本発明は薬学的に有効な量のＧＣＰII突然変異体を、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患に罹患した個体に投与する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の治療方法を提供する。
【００４６】
また、本発明は薬学的に有効な量のＧＣＰII突然変異体を個体に投与する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防方法を提供する。
【００４７】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００４８】
前記ＧＣＰII突然変異体の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とするがこれに限定されない。
【００４９】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物として有用に用いることができる。
【００５０】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００５１】
前記ＧＣＰII突然変異タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするがこれに限定されない。
【００５２】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物として有用に用いることができる。
【００５３】
また、本発明は、
（１）本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞においてＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００５４】
前記方法において、工程（２）のタンパク質の発現水準は、具体的には免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定するが、これに限定されない。
【００５５】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質の発現変化は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニングに有用に用いることができる。
【００５６】
また、本発明は、
（１）本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００５７】
前記方法において、工程（２）のタンパク質の活性水準は、具体的には免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定するが、これに限定されない。
【００５８】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIに比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質の活性変化は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニングに有用に用いることができる。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子を含有する組成物と試験対象物質間の反応確認は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質及びＤＮＡ−化合物間の反応有無を確認するのに用いる一般的な方法を用いることができる。
【００６０】
例えば、試験管内（インビトロ）で前記遺伝子と試験対象物質間の結合有無を確認するためのハイブリダイズ試験、哺乳類細胞と試験対象物質を反応させた後のノーザンブロット分析、定量的ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲなどを通じた前記遺伝子の発現率測定方法、または前記遺伝子にレポーター遺伝子を連結させて細胞内に導入した後、試験対象物質と反応させてレポータータンパク質の発現率を測定する方法などを用いることができる。
【００６１】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子の他にも核酸の構造を安定に維持させる蒸留水または緩衝液を含有することができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質を含有する組成物と試験対象物質間の反応確認は、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−化合物間の反応有無を確認するのに用いる一般的な方法を用いることができる。
【００６３】
例えば、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子またはＧＣＰ−II突然変異タンパク質と試験対象物質を反応させた後に活性を測定する方法、酵母ツーハイブリッド法、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質に結合するファージディスプレイペプチドクローンの検索、天然物及び化学物質ライブラリなどを用いたＨＴＳ（ハイスループット・スクリーニング）、ドラッグヒットＨＴＳ（drug hit HTS）、細胞ベースのスクリーニング（cell-based screeing）またはＤＮＡマイクロアレイを使用したスクリーニング方法等を用いることができる。
【００６４】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−II突然変異体で発現されたタンパク質の他にも、タンパク質の構造または生理活性を安定に維持させる緩衝液または反応液を含むことができる。また、本発明の組成物は、生体内（インビボ）実験のために、前記タンパク質を発現する細胞または転写率を調節することができるプロモーター下で前記タンパク質を発現するプラスミドを含有する細胞等を含むことができる。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法において試験対象物質は、一般的な選定方式にしたがって、Ａβの脳内蓄積またはグルタメートの生成予防及び治療剤としての可能性を有していると推定されるか、または無作為的に選定された個別的な核酸、タンパク質、その他の抽出物または天然物などを挙げることができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただ、下記の実施例は、本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が実施例によって限定されるのではない。
【００６７】
＜実施例１＞２−ＰＭＰＡが、Ａβ及びＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
＜１−１＞細胞培養及び形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨ４細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇ，ＶＡ，米国）を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ培地）（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）中、ＰＣ３細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が添加されたＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ）中、５％ＣＯ２を含む湿式培養器で３７℃で培養した。製造社の指針書にしたがってリポフェクタミン２０００試薬またはリポフェクタミンプラス試薬（インビトロジェン）を用いて、一時的な形質導入を行なった。
【００６８】
＜１−２＞Ａβペプチドの準備
Ａβ１−４０またはＡβ１−４２（インビトロジェン）ペプチドを最終的に１ｍＭ濃度で冷たいヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ；Ｓｉｇｍａ）とともに準備した。室温で４０分間振って４℃で２０分間放置した後、ＨＦＩＰを真空状態で除去した。ペプチドペレットを−７０℃で保存した。前記ペレットを最終５ｍＭ濃度になるようにＤＭＳＯで溶解させて、最終１ｍＭ濃度になるように蒸留水を添加した。
【００６９】
＜１−３＞ＥＬＩＳＡ分析を通じた２−ＰＭＰＡがＡβ分解に及ぼす影響の確認
ｈＧＣＰII及び多様な突然変異体のｈＧＣＰII遺伝子をコードするベクターを１２ウェルプレートでＰＣ３細胞内に形質導入した。培養培地を約３０時間後に２−ＰＭＰＡ（（２−（ホスホメチル）ペンタン二酸）があるかまたはない条件で、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２ペプチドが処理された培地に変えて、細胞を再び８時間培養した。前記培地を回収し、製造社のプロトコールにしたがってＥＬＩＳＡキット（インビトロジェン）を用い、残りはＡβ１−４０またはＡβ１−４２を分析した。空ｐｃＤＮＡ３空ベクターで形質導入された細胞を陰性対照群として用いた。
【００７０】
その結果、図１に示されたようにｒｈＧＣＰIIは、対照群と比べて約８０％Ａβ１−４０を分解したが、２−ＰＭＰＡはＧＣＰIIのＡβ１−４０分解に効果がないことを確認した（図１）
【００７１】
＜１−４＞ＮＡＡＧ分解分析を通じた２−ＰＭＰＡがＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
内因性または過剰発現されたグルタメート・カルボキシペプチダーゼII（ＧＣＰII）タンパク質の活性を下記のような方法で測定した。細胞溶解物（５０μｇ）を３７℃で一時間５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む総１００μｌの体積でＧＣＰII特異的抑制剤である２−ＰＭＰＡの２０ｎＭまたはＥＤＴＡが一緒にあるかまたはない条件で、ＮＡＡＧ（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−［３，４−３Ｈ］グルタメート；ＮＥＮコーポレーション）の２０μＭとともに培養した。反応後に、試料混合物を９６ウェルカラム（Ｈａｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に用意したＡＧ １−Ｘ８陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏｒａｄ）に用い、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。試料混合物と結合した樹脂を０．５ｍＭホルマート（１００ｍｌ）で溶離し、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。溶離したすべての試料を１ｍｌのシンチレーション溶液（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ；Ｗａｌｌａｃ）と一緒に混合し、放射能をシンチレーション計数器（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．）で測定した。
【００７２】
その結果、図２に示されたように２−ＰＭＰＡがＧＣＰIIによるＮＡＡＧ加水分解を完全に遮断したことを確認した（図２）。
【００７３】
＜１−５＞ＧＣＰIIプラスミド及びレンチウイルス製作を通じた２−ＰＭＰＡがレンチウイルスＧＣＰIIのＡβ分解に及ぼす影響の確認
ｈＧＣＰIIプラスミドを下記の記載のように準備した。ヒトのアストロサイトに該当するＵ８７−ＭＧ細胞からＲＮＡを分離した後、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡで ｈＧＣＰIIの増幅のために下記のプライマーを用いてＰＣＲ方法を用いた。プラスミド生成のためにＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３ベクター内にクローニングした：
正方向：５'−ＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣ−３'（配列番号３）、及び
逆方向：５'−ＡＴＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ−３'（配列番号４）。
【００７４】
レンチウイルスｈＧＣＰIIをＭａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（韓国ソウル）で準備した。ｈＧＣＰIIｃＤＮＡをヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び蛍光タンパク質（ＧＦＰ）があるＩＲＥＳ配列を含むレンチウイルスコンストラクト（ＬｅｎｔｉＭ１．４−ｈＧＣＰＩＩ）内にクローニングした。ウイルス製作のために、ｈＧＣＰII、ＶＳＶ−Ｇ及びｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを、リポフェクタミンプラス（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）を用いて２９３Ｔ細胞内に一緒に形質導入した後、細胞を単量体のＡβおよび２−ＰＭＰＡで処理した。細胞成長培地でのＡβ１−４０の濃度を前記実施例＜１−３＞の方法で分析した。
【００７５】
その結果、図３に示されたように２−ＰＭＰＡは、レンチウイルスＧＣＰIIのＡβ１−４０分解を遮断しなかったことを確認した（図３）。
【００７６】
＜１−６＞形質転換動物
二重形質導入ＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１ΔＥ９マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，米国）から購入し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド系統で野生型マウスと交配することによって、ヘミ接合体（hemizygotes）を維持した。すべての動物を標準動物管理プロトコールによって飼育し、韓国食品医薬品安全庁（the Korean Food and Drug Administration）の無菌飼育施設（pathogen-free facility）で維持した。マウス遺伝子型を下記のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてＰＣＲ方法で確認した：
ＰｒＰ（ｍｏｕｓｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）：
正方向５'−ＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧ−３'（配列番号５）、
逆方向５'−ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣ−３'（配列番号６）、
ヒト（ｈｕｍａｎ）ＡＰＰ：
正方向５'−ＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧ−３'（配列番号７）、及び
逆方向５'−ＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＣＧ−３'（配列番号８）。
【００７７】
Ａβｓの脳での水準でＧＣＰII抑制剤の効果を測定するために、処理した群は腹腔内注射で一ヶ月間、ＰＢＳ ２Ｘ／ｗｋで、溶解した２−ＰＭＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を注入した。処理しない群は対照群として同じ量のＰＢＳを注入した。マウスが８ヶ月になった時に処理を始めた。
【００７８】
＜１−７＞２−ＰＭＰＡのマウス脳での効果確認
２−ＰＭＰＡの効果をマウスの脳で調べるために、前記実施例＜１−６＞の方法で形質転換された８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Δ９マウスの腹腔内に、１ヶ月間、２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを９回処理した。皮質膜断片でＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準を前記実施例＜１−３＞の方法で分析し、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性を前記実施例＜１−４＞の方法で測定した。
【００７９】
その結果、図４に示されたように２−ＰＭＰＡで処理したマウスでのＮＡＡＧ分解は、ＰＢＳ対照群と比べて約９０％減少したことを確認し（図４）、図５に示されたように２−ＰＭＰＡの処理によってＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準は変化しなかったということを確認した（図５）。
【００８０】
＜実施例２＞ＧＣＰIIの位置選択的突然変異体の発現の確認
＜２−１＞ＧＣＰIIの位置選択的突然変異（Site-directed mutagenesis）
ｐｃＤＮＡ−ｈＧＣＰIIプラスミド（５０ｎｇ）を鋳型に用いて、所望する突然変異を産生する二つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーで、各突然変異を導入した。Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の２．５Ｕを用いて延長させ、ニックの入った円形鎖（nicked circular strand）（９５℃、５分→（９５℃、５０秒→５５℃、１分→８０℃、８分２０秒→７２℃、１分）２２回循環→４℃、無限大（∞））で、結果としてもたらされた突然変異プライマー（１２５ｎｇ）を作った。メチル化されて、突然変異のない母型ＤＮＡ（nonmutated parental ＤＮＡ）鋳型を３７℃で一時間Ｄｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）の２０Ｕで消化させた。その後、円形（circular）ｄｓＤＮＡでＤＨ５ａコンピテント細胞内を形質転換させた。それぞれの突然変異をシークエンシング（Ｃｏｓｍｏ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で確認した。
【００８１】
その結果、図６に示されたようにＧＣＰIIの７個の突然変異体（Ｒ２１０Ａ、Ｄ３８７Ｎ、Ｐ３８８Ａ、Ｒ５３６Ｌ、Ｇ５４８Ｐ、Ｙ５５２Ｉ、Ｋ６９９Ｓ）を製作した（図６）。
【００８２】
＜２−２＞ウエスタンブロットを通じたＧＣＰII突然変異体の発現の確認
ＧＣＰII突然変異体の発現を確認するために、前記実施例＜１−１＞の方法にしたがって突然変異体のプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に形質導入した後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）入りのＲＩＰＡ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ａｔ ｐＨ８．０）で溶解させた。ブラッドフォード分析で溶解物のタンパク質の濃度を測定した。同じ濃度のタンパク質にβ−メルカブトエタノールを添加して１０分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で電気泳動させ、一時間室温で５％脱脂粉乳を入れたＴＢＳ−Ｔでブロックした。その後、前記膜を４℃で一晩、５％脱脂粉乳に ａｎｔｉ−ＰＳＭＡ（ａｂｃａｍ；ａｂ４１０３４，１：１０００）、Ｙ−ＰＳＭＡ（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１：１０００）または抗−α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６１９９，１：５００００）とともに培養した。ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、ブロットを室温で２時間ＨＲＰ−ヤギ抗マウスコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０７１，１：１００００）または、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０４６，１：１００００）とともに培養した。三回洗浄した後、タンパク質を化学発光の基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
【００８３】
その結果、図７に示されたようにバンドのパターンは、ｒｈＧＣＰIIと類似し、一つのバンドはＧＣＰIIの予測された大きさである９８ｋＤａで明確に見えることを確認した（図７）。
【００８４】
＜実施例３＞ＧＣＰII突然変異体のＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
ＧＣＰII突然変異体のＮＡＡＧ分解に及ぼす影響を確認するために、前記実施例＜１−１＞の方法によって、Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）及びＳ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）に置換がある突然変異タンパク質を、Ｈ４細胞に形質導入した。ＮＡＡＧの加水分解を測定するために、前記実施例＜１−４＞の方法によって、細胞溶解物を［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＧＣＰIIの特異的基質とともに培養し、前記実施例＜２−２＞の方法によってタンパク質発現の変化を確認した。
【００８５】
その結果、図８に示されたようにＳ１'ポケット突然変異体（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）はＮＡＡＧを加水分解する活性を完全になくしてしまったが、Ｓ１ポケット突然変異体（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）は野生型ＧＣＰIIと比べて４０％程度活性を維持していることを確認した（図８）。
【００８６】
ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解でＡβの効果を調べるために、前記実施例＜１−４＞の方法によってｒｈＧＣＰIIを［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＡβペプチドとともに同時に培養した。
【００８７】
その結果、図９に示されたようにＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかったことを確認した（図９）。
【００８８】
＜実施例４＞ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響の確認
＜４−１＞ＧＣＰII／Ａβ複合体のモデリング
Ａβ−Ｓ１及びＳ１'ポケットの結合のＭＯＤＥをプログラムＯ（http://xray.bmc.uu.se/alw yn/A-Z_frameset.html)(PDB file:1z0q(Ab),2oot(GCPII))を用いて制作した。計算的ドッキング（computational docking）をマニュアルドッキング（manual docking）方法を用いて行なった。
【００８９】
ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を確認するために、前記実施例＜１−５＞の方法及び前記実施例＜４−１＞の方法によって、多様な突然変異体のプラスミドを、内因性のＧＣＰIIを発現しないことが知られているＰＣ３細胞に形質導入した。４８時間後、前記細胞溶解物をＡβ（２μＭ）と混合して一晩培養した。
【００９０】
＜４−２＞ドットブロットを通じたＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響の確認
発現したＧＣＰＩＩによって切られないで残ったＡβペプチドの量を確認するために、細胞溶解物とＡβ（２μＭ）との混合物を下記のドットブロット方法及び前記実施例＜２−２＞の方法で確認した。細胞溶解物とＡβ（２μＭ）の混合物１μｌをニトロセルロース膜に落とした後、完全に乾燥させた。乾燥した膜を一時間室温で５％脱脂粉乳を入れたＴＢＳ−Ｔでブロックした。その後、前記膜を４℃で一晩、５％脱脂粉乳に抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０（ＳＩＧＮＥＴ；ＳＩＧ−３９３００，１：２０００）とともに培養した。ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、膜を室温で１時間ＨＲＰ−ヤギ抗マウスコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０７１，１：１００００）とともに培養した。三回洗浄した後、タンパク質を化学発光基質を用いて検出した。
【００９１】
その結果、図１０、図１１に示されたように、Ｋ６９９Ｓ突然変異体は野生型よりＡβをもう少し分解したが、Ｇ５４８Ｐ突然変異体はＡβ分解活性を失ったことを確認した（図１０、１１）。
【００９２】
ＡβペプチドでＧＣＰIIの分解活性を確認するために、前記実施例＜１−３＞及び前記実施例＜４−１＞の方法によって、形質導入後の翌日、培地内にＡβを１ｎｇ／ｍｌで処理し、３７℃で８時間培養した。
【００９３】
その結果、図１２に示されたように残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐを除いて、Ｋ６９９Ｓによって減少したことを確認した（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
前記で示されたように、本発明は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療のための薬剤の開発と、それを用いた予防または治療方法の開発、すなわちタンパク質治療剤、発現及び活性調節物質、遺伝子治療剤または細胞治療剤などに有用に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタメート生成阻害及びβアミロイド（β-amyloid）分解活性を有するＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）、及び前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック（Pick）病及びクロイツフェルト・ヤコブ（Creutzfeid-Jakob）病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＧＣＰIIは、脳に存在し９４〜１００ｋＤａの見かけの分子量を有したタイプII内在性膜タンパク質で、主にグリア内に存在し、ＮＡＡＧ（Ｎ−アセチルアスパルチルグルタメートをＮＡＡ（Ｎ−アセチルアスパルテート）及びグルタメートに加水分解することによって、興奮性神経伝達に影響を及ぼす。ＮＡＡＧ加水分解によって生成されたグルタメートは、中枢神経系で主要な興奮性神経伝達物質として神経系に必須な要素として作用するが、脳内での過多な蓄積は脳細胞の死滅と変性をもたらし、アルツハイマー、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病のような退行性脳疾患を惹起することが知られている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
ＧＣＰIIは、酵素活性及び発現部位によって多様な名前が存在する。前立腺でのＧＣＰIIの強い発現（ＧＣＰIIの機能場所は知られていない）からＰＳＭＡと命名され、中枢神経系では脳神経伝達物質ＮＡＡＧを代謝させるので、ＧＣＰIIをＮＡＡＬＡＤａｓｅと命名し、小腸前半部ではポリ−ｇ−グルタメート葉酸（poly-g-glutamated folate）、葉酸加水分解酵素（folate hydrolase）ＦＯＬＨ１及びカルボキシペプチダーゼとしてグルタメート・カルボキシペプチダーゼII（ＧＣＰII）からガンマ連結されたグルタメート（gamma-linked glutamate）を除去する役割をする。
【０００４】
また、ＧＣＰIIの構造は、ＧＣＰIIの触媒機序及び基質特異性に対する洞察を提供する。ＧＣＰIIは活性部位に二核性Ｚｎ２＋中心があって、この活性部位で二つの亜鉛原子は結合カルボン酸塩リガンド（bridging carboxylate ligand）を共有する。α−ＮＡＡＧは、ＧＣＰIIのアルギニン部分と相互作用するグルタメートサイドチェーン（glutamate side chain）の種類と結合して、カルボニルが攻撃されることから酸素、及びＣ−末端は亜鉛イオンと結合する。基質（例えば、α−ＮＡＡＧでのＮＡＡ）の残りは、Ａｒｇ−２１０と特異的相互作用する基質−結合空間から収容される。もう少し大きな基質（例えば、最大四つの、γ連結されたグルタメートを伴うポリ−γ−グルタメート葉酸（poly-γ-glutamated folates with up to four γ-linked glutamates））は、ポケットとの立体衝突を避けるために少しの構造的再配列を要し、交差して結合し得る。また、ＧＣＰIIは二つの活性部位であるＳ１'ポケット及びＳ１ポケットを有する（非特許文献４）。前記Ｓ１ポケットはＧＣＰII基質特異性の「微細調整（fine-tuning）」として作用し、前記Ｓ１'ポケットはＮＡＡＧ及びＧＣＰII抑制剤の主な高い親和性結合に寄与する。
【０００５】
今までに、ＧＣＰIIの主要機能としては、ＮＡＡＧ加水分解作用があることが報告された。したがって、強力で選択的なＧＣＰII抑制剤、すなわち２−ＰＭＰＡ（２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸）は、脳卒中、ルー・ゲーリック病及び神経因性疼痛の臨床前のモデルで脳グルタメートを減少させて神経保護効果を提供すると報告されたことがある。
【０００６】
以前の研究で、ＧＣＰIIがＡβ（アミロイドβ）の分解効果を通じて、Ａβが脳内に蓄積されることを防止または除くことで、アルツハイマー疾患及びダウン症候群などの疾病治療に用いることができると報告されたことがある（特許文献１）。しかし、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ加水分解によって生成されるグルタメートは、神経毒性を誘発するだけでなく、脳内の過多な蓄積は脳細胞の死滅と変性をもたらして、アルツハイマー、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病のような退行性脳疾患を惹起することが知られているので、ＧＣＰII使用時の安全性を保障することが難しかった。したがって、これを補うことができる方法が要求された。
【０００７】
そこで本発明者等は、これを補うことができる方法を研究した結果、ＧＣＰIIの多様な突然変異体を製造してその活性を分析し、ＧＣＰII突然変異体であるＫ６９９Ｓが野生型ＧＣＰIIよりＡβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成阻害効果も有するため、野生型ＧＣＰIIより優れた効果があって安定性も優れて、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができることを明らかにすることによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許公開番号：10-2007-0023832
【特許文献２】US 7,846,910
【特許文献３】US 2004/0185487
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Choi,W. H.,Oh,Y. S.,Ahn,J. Y.,Kim,S. R. and Ha,T. Y.(2005年)Antioxidative and protective effects of Ulmus davidiana var. japonica extracts on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells. Korean J. Food Sci. Technol.第37巻,p.479-483
【非特許文献２】Jeon,H. J.,Park,S. W. and Mun,B. S.(2004年)Effects of Gwibitang on glutamate-induced death in rat neonatal astrocytes. J Korean Oriental Med.第25巻,p.184-193
【非特許文献３】Lee,J.,Kim,M. S.,Lee,C.,Kim,H. Y.,Choi,D. H.,Kim,T. Y.,Son,Y. and Park,R.(2003年)Role of morphine in the glutamate-induced oxidative damage of C6 glial cells. Korean J Anesthesiol.第45巻,p.271-277
【非特許文献４】Mlcochova P.,Plechanovova A.,Barinka C.,Mahadevan D.,Saldanha J. W.,Rjlisek L.,Konvalinka J.(2007年)Mapping of the active site of glutamate carboxypeptidase II by site-directed mutagenesis. FEBS J.第274(18)巻,p.4731-41
【非特許文献５】Cyril Barinka et al., Amino acids at the N- and C-termini of human glutamate carboxypeptidase II are required for enzymatic activity and proper folding. Eur. J. Biochem. 271, 2782-2790(2008)
【非特許文献６】HENRY S. SPENO et al., Site-Directed Mutagenesis of Predicted Active Site Residues in Glutamate Carboxypeptidase II. MOLECULAR PHARMACOLOGY, 55:179-185 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、グルタメート生成阻害及びβアミロイド分解活性を有するＧＣＰII（glutamate carboxypeptidaseII）突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を用いた、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を用いた、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明はＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Lysine,Ｋ）をセリン（Serine,Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤のスクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、
（１）前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞においてＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
同時に、本発明は、
（１）前記ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
本発明１は、ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）の全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明２は、ＧＣＰII突然変異体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明３は、ＧＣＰII突然変異体が、グルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有することを特徴とする、本発明１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明４は、前記βアミロイドが、溶解性または不溶性βアミロイドであることを特徴とする、本発明３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物である。
本発明５は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤である。
本発明６は、発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであることを特徴とする、本発明５のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤である。
本発明７は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明８は、ＧＣＰII突然変異体の遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、本発明７のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明９は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明１０は、ＧＣＰII突然変異タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明９のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物である。
本発明１１は、
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞でＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１２は、工程（２）のタンパク質の発現水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、本発明１１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１３は、
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程と、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明１４は、工程（２）のタンパク質の活性水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、本発明１３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）が、野生型ＧＣＰIIに比べてＡβ分解活性が優れているだけでなく、野生型ＧＣＰIIが有していないグルタメート生成阻害活性を同時に保有しており、野生型ＧＣＰIIよりその効果が顕著に優れていて、安定性も優秀であるので、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防または治療剤に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】２−ＰＭＰＡが、Ａβに及ぼす影響を示した図である。ｒｈＧＣＰIIを２−ＰＭＰＡまたはＥＤＴＡがあるかまたはない条件で、Ａβ４０とともに培養した。Ａβ４０をＥＬＩＳＡまたはＮＡＡＧ分解分析（cleavage assay）で検出した。
【図２】２−ＰＭＰＡが、ＮＡＡＧ分解に及ぼす影響を示した図である。ｒｈＧＣＰIIを２−ＰＭＰＡまたはＥＤＴＡがあるかまたはない条件で、ＮＡＡＧとともに培養した。ＮＡＡＧ水準をＥＬＩＳＡまたはＮＡＡＧ分解分析（cleavage assay）で検出した。
【図３】レンチウイルスＧＣＰII（lentiviral ＧＣＰII）をマウス初代星状細胞に感染させた後、単量体のＡβ４０で細胞を処理した。そして、２−ＰＭＰＡを多様な投与量で処理した。細胞成長培地で前記Ａβ４０の濃度をＥＬＩＳＡ分析で測定した。
【図４】８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Ｅ９形質転換マウスの腹腔内に、１ヶ月間２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを注入した（９回）。膜断片をＮＡＡＧで分析した。
【図５】８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Ｅ９形質転換マウスの腹腔内に、１ヶ月間２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを注入した（９回）。膜断片をＥＬＩＳＡ分析で分析した。
【図６】ＧＣＰIIの位置選択的突然変異を示した図で、プライマーの配列を位置選択的突然変異実験に用いた。
【図７】ＧＣＰIIの位置選択的突然変異を示した図で、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞で多様な突然変異タンパク質の発現を示した。
【図８】ＧＣＰIIのＳ１'ポケット突然変異体のＮＡＡＧ分解活性を示した図である。Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）に置換がある突然変異タンパク質は、ＮＡＡＧを分解しなかった。しかし、Ｓ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｒ５４８Ｐ）に突然変異がある他のタンパク質は、約４０％程度ＮＡＡＧ分解活性を有する。
【図９】ＧＣＰIIのＳ１'ポケット突然変異体のＮＡＡＧ分解活性を示した図である。ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかった。
【図１０】ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を示した図である。Ｈ４細胞で、過剰発現されたＳ１'突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）はアミロイド−β４０を分解したが、Ｓ１突然変異体（Ｇ５４８Ｐ）は分解しなかった。
【図１１】ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を示した図である。Ｈ４細胞で、過剰発現されたＳ１'突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）はアミロイド−β４０を分解したが、Ｓ１突然変異体（Ｇ５４８Ｐ）は分解しなかった。
【図１２】残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐを除いて、Ｋ６９９Ｓによって減少した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）を提供する。
【００２４】
前記ＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、具体的にＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたもので、より詳細には配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであるが、これに限定されない。
【００２５】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的にグルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有するものであるが、これに限定されない。
【００２６】
また、本発明は、ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２７】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであるが、これに限定されない。
【００２８】
前記ＧＣＰII突然変異体は、具体的にグルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有するものであるが、これに限定されない。
【００２９】
前記βアミロイドは、具体的に溶解性または不溶性ベータアミロイドであるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明者等は、ＧＣＰIIの特異的抑制剤である２−ＰＭＰＡのＡβペプチドに対する効果を確認するために、組換えヒトＧＣＰII（ｒｈＧＣＰII）をＡβ１−４０と一緒にインキュベートして多様な投与量で２−ＰＭＰＡを添加し、ＥＬＩＳＡで分析した。その結果、ｒｈＧＣＰIIは、対照群と比べて８０％程度Ａβ１−４０ペプチドを分解させたが、２−ＰＭＰＡはＧＣＰIIのＡβ１−４０分解に何らの効果がなかったことを確認した（図１参照）。２−ＰＭＰＡは、初代マウス星状細胞でレンチウイルスＧＣＰIIのＡβ１−４０分解を遮断しなかったことを確認した（図３参照）。ＧＣＰIIによるＮＡＡＧの加水分解は、２−ＰＭＰＡによって完全に遮断されたことを確認した（図２参照）。また、マウスの脳で２−ＰＭＰＡの効果を調べるために、２−ＰＭＰＡで形質転換ＡＤモデルマウスを処理した。本発明者等は、２−ＰＭＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に、１ヶ月間 ２Ｘ／ｗｋ）を、８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Δ９形質転換マウスに対し処理した。皮質膜断片（cortical membrane fraction）におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準をＥＬＩＳＡで分析し、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性をＮＡＡＧ分析で測定した。その結果、ＮＡＡＧ分解は、ＰＢＳ対照群と比べ、２−ＰＭＰＡで処理したマウスにおいて約９０％減少したが（図４参照）、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の総水準は２−ＰＭＰＡの処理によって変化しなかったことを確認した（図５参照）。したがって、ＧＣＰIIでＮＡＡＧまたはＡβ分解部位が異なることを確認した。
【００３１】
本発明者等は、ＧＣＰIIがＳ１及びＳ１'ポケットと命名された二つの活性部位で構成されているということを基に、ＧＣＰII［ｒｅｆ］の多様な突然変異体である、ＧＣＰIIの７個の突然変異体（Ｒ２１０Ａ、Ｄ３８７Ｎ、Ｐ３８８Ａ、Ｒ５３６Ｌ、Ｇ５４８Ｐ、Ｙ５５２Ｉ、Ｋ６９９Ｓ）を製作した（図６参照）。各突然変異がある、二つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、アミノ酸を位置選択的突然変異で変化させた。突然変異がある多様なＧＣＰIIの発現を確認するために、突然変異プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に形質導入させた後、ウエスタンブロットでタンパク質の発現変化を確認した。その結果、バンドのパターンは、ｒｈＧＣＰIIと類似し、バンドの一つはＧＣＰIIの予測された大きさである９８ｋＤａで顕著に見られることを確認した（図７参照）。
【００３２】
本発明者等は、ＧＣＰII突然変異体の酵素活性の変化を観察した。多様な突然変異体の酵素活性を分析するために、Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）及びＳ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）に置換がある突然変異タンパク質を、Ｈ４細胞に形質導入させた。ＮＡＡＧの加水分解を測定するために、細胞溶解物を［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＧＣＰIIの特異的基質とともに培養した。その結果、前記Ｓ１'ポケット突然変異体（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）は、ＮＡＡＧを加水分解する活性をまったくなくしてしまったが、前記Ｓ１ポケット突然変異体（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）は、野生型ＧＣＰIIと比べて４０％程度活性を維持するということを確認した（図８参照）。さらに、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解とＡβ分解間の競争的阻害効果を調べるために、ｒｈＧＣＰIIを［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＡβペプチドを濃度別で培養した。その結果、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかったことを確認した（図９参照）。したがって、Ｓ１'ポケットでのＮＡＡＧ加水分解は、Ａβによって影響されないことを確認し、ＧＣＰIIでのＮＡＡＧ分解とＡβ分解機序が異なることを確認した。
【００３３】
本発明者等は、突然変異ＧＣＰIIのＡβクリアランス活性を同定するために、内因性のＧＣＰIIを発現しないことが知られているＰＣ３細胞に、多様な突然変異プラスミドを形質導入した。４８時間後、前記細胞溶解物をＡβ（２μＭ）と混合して一晩中培養した。残ったＡβペプチドは、６Ｅ１０抗体を用いてドットブロット及びウエスタンブロットで確認した。その結果、Ｋ６９９Ｓ突然変異体は野生型よりもＡβをもう少し分解したが、Ｇ５４８Ｐ突然変異体はＡβ分解活性を失ったことを確認した（図１０、１１参照）。また、培養培地で外因的に処理されたＡβペプチドでＧＣＰIIの分解活性を確認するために、形質導入の翌日、培地内にＡβを１ｎｇ／ｍｌで処理して３７℃で８時間培養しＥＬＩＳＡ分析を行なった。その結果、ウエスタンブロットと類似し、残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐは除外して、Ｋ６９９Ｓによって減少したことを確認した（図１２参照）。したがって、Ｓ１ポケットがＡβの分解においてＳ１'ポケットよりもう少し重要であるということを通じて、ＮＡＡＧ加水分解活性及びＡβ分解活性の作用は、ＧＣＰII酵素によって異なって調節されるということを確認した。
【００３４】
ゆえに、本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIに比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患に有用に用いることができる。
【００３５】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物は、前記有効成分以外に薬剤学的に相応しく、生理学的に許容される補助剤を用いて製造することができ、前記補助剤では、賦形剤、崩解剤、甘味料、結合剤、被剤剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味料などの可溶化剤を用いることができる。
【００３６】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬学的組成物として好ましく製剤化することができる。
【００３７】
液状溶液で製剤化される組成物において薬学的に許容される担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該技術分野の適切な方法としてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３８】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の薬剤の製剤形態としては、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐薬、シロップ、溶液、懸濁剤、乳済、点滴液または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤等を挙げることができる。
【００３９】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の投与方法は、特別にこれに制限されるのではないが、目的とする方法によって非経口投与、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔内、吸入、局所、直腸または経口投与を通じて一般的な方式で投与することができる。
【００４０】
本発明のＧＣＰ−II突然変異タンパク質を有効成分として含有する組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に用いる薬物を含めた多様な因子にしたがって調節することができる。成人の場合、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質を１日に１回ないし数回投与時、０．１μｇ／ｋｇ〜０．１ｇ／ｋｇの用量で投与することが好ましい。
【００４１】
本発明の治療用組成物は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の治療のために、単独で、またはホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して用いることができる。
【００４２】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤を提供する。
【００４３】
前記発現ベクターは、詳細にはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであるが、これに限定されない。
【００４４】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤に有用に用いることができる。
【００４５】
また、本発明は薬学的に有効な量のＧＣＰII突然変異体を、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患に罹患した個体に投与する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の治療方法を提供する。
【００４６】
また、本発明は薬学的に有効な量のＧＣＰII突然変異体を個体に投与する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防方法を提供する。
【００４７】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００４８】
前記ＧＣＰII突然変異体の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とするがこれに限定されない。
【００４９】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物として有用に用いることができる。
【００５０】
また、本発明は本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物を提供する。
【００５１】
前記ＧＣＰII突然変異タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするがこれに限定されない。
【００５２】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物として有用に用いることができる。
【００５３】
また、本発明は、
（１）本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞においてＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００５４】
前記方法において、工程（２）のタンパク質の発現水準は、具体的には免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定するが、これに限定されない。
【００５５】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIと比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質の発現変化は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニングに有用に用いることができる。
【００５６】
また、本発明は、
（１）本発明によるＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べ、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００５７】
前記方法において、工程（２）のタンパク質の活性水準は、具体的には免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定するが、これに限定されない。
【００５８】
本発明によるＧＣＰII突然変異体（Ｋ６９９Ｓ）は、既知の野生型ＧＣＰIIに比べて、Ａβ分解に優れた効果があるのみならず、野生型ＧＣＰIIが有している安定性保障の難しさを克服する、ＮＡＡＧ加水分解によって生成されて神経毒性を誘発するグルタメートの生成も同時に阻害する効果まであるので、ＧＣＰII突然変異タンパク質の活性変化は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニングに有用に用いることができる。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子を含有する組成物と試験対象物質間の反応確認は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質及びＤＮＡ−化合物間の反応有無を確認するのに用いる一般的な方法を用いることができる。
【００６０】
例えば、試験管内（インビトロ）で前記遺伝子と試験対象物質間の結合有無を確認するためのハイブリダイズ試験、哺乳類細胞と試験対象物質を反応させた後のノーザンブロット分析、定量的ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲなどを通じた前記遺伝子の発現率測定方法、または前記遺伝子にレポーター遺伝子を連結させて細胞内に導入した後、試験対象物質と反応させてレポータータンパク質の発現率を測定する方法などを用いることができる。
【００６１】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子の他にも核酸の構造を安定に維持させる蒸留水または緩衝液を含有することができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質を含有する組成物と試験対象物質間の反応確認は、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−化合物間の反応有無を確認するのに用いる一般的な方法を用いることができる。
【００６３】
例えば、ＧＣＰ−II突然変異体の遺伝子またはＧＣＰ−II突然変異タンパク質と試験対象物質を反応させた後に活性を測定する方法、酵母ツーハイブリッド法、ＧＣＰ−II突然変異タンパク質に結合するファージディスプレイペプチドクローンの検索、天然物及び化学物質ライブラリなどを用いたＨＴＳ（ハイスループット・スクリーニング）、ドラッグヒットＨＴＳ（drug hit HTS）、細胞ベースのスクリーニング（cell-based screeing）またはＤＮＡマイクロアレイを使用したスクリーニング方法等を用いることができる。
【００６４】
このような場合、本発明の組成物は、ＧＣＰ−II突然変異体で発現されたタンパク質の他にも、タンパク質の構造または生理活性を安定に維持させる緩衝液または反応液を含むことができる。また、本発明の組成物は、生体内（インビボ）実験のために、前記タンパク質を発現する細胞または転写率を調節することができるプロモーター下で前記タンパク質を発現するプラスミドを含有する細胞等を含むことができる。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法において試験対象物質は、一般的な選定方式にしたがって、Ａβの脳内蓄積またはグルタメートの生成予防及び治療剤としての可能性を有していると推定されるか、または無作為的に選定された個別的な核酸、タンパク質、その他の抽出物または天然物などを挙げることができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただ、下記の実施例は、本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が実施例によって限定されるのではない。
【００６７】
＜実施例１＞２−ＰＭＰＡが、Ａβ及びＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
＜１−１＞細胞培養及び形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨ４細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇ，ＶＡ，米国）を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ培地）（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）中、ＰＣ３細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が添加されたＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ）中、５％ＣＯ２を含む湿式培養器で３７℃で培養した。製造社の指針書にしたがってリポフェクタミン２０００試薬またはリポフェクタミンプラス試薬（インビトロジェン）を用いて、一時的な形質導入を行なった。
【００６８】
＜１−２＞Ａβペプチドの準備
Ａβ１−４０またはＡβ１−４２（インビトロジェン）ペプチドを最終的に１ｍＭ濃度で冷たいヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ；Ｓｉｇｍａ）とともに準備した。室温で４０分間振って４℃で２０分間放置した後、ＨＦＩＰを真空状態で除去した。ペプチドペレットを−７０℃で保存した。前記ペレットを最終５ｍＭ濃度になるようにＤＭＳＯで溶解させて、最終１ｍＭ濃度になるように蒸留水を添加した。
【００６９】
＜１−３＞ＥＬＩＳＡ分析を通じた２−ＰＭＰＡがＡβ分解に及ぼす影響の確認
ｈＧＣＰII及び多様な突然変異体のｈＧＣＰII遺伝子をコードするベクターを１２ウェルプレートでＰＣ３細胞内に形質導入した。培養培地を約３０時間後に２−ＰＭＰＡ（（２−（ホスホメチル）ペンタン二酸）があるかまたはない条件で、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２ペプチドが処理された培地に変えて、細胞を再び８時間培養した。前記培地を回収し、製造社のプロトコールにしたがってＥＬＩＳＡキット（インビトロジェン）を用い、残りはＡβ１−４０またはＡβ１−４２を分析した。空ｐｃＤＮＡ３空ベクターで形質導入された細胞を陰性対照群として用いた。
【００７０】
その結果、図１に示されたようにｒｈＧＣＰIIは、対照群と比べて約８０％Ａβ１−４０を分解したが、２−ＰＭＰＡはＧＣＰIIのＡβ１−４０分解に効果がないことを確認した（図１）
【００７１】
＜１−４＞ＮＡＡＧ分解分析を通じた２−ＰＭＰＡがＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
内因性または過剰発現されたグルタメート・カルボキシペプチダーゼII（ＧＣＰII）タンパク質の活性を下記のような方法で測定した。細胞溶解物（５０μｇ）を３７℃で一時間５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む総１００μｌの体積でＧＣＰII特異的抑制剤である２−ＰＭＰＡの２０ｎＭまたはＥＤＴＡが一緒にあるかまたはない条件で、ＮＡＡＧ（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−［３，４−３Ｈ］グルタメート；ＮＥＮコーポレーション）の２０μＭとともに培養した。反応後に、試料混合物を９６ウェルカラム（Ｈａｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に用意したＡＧ １−Ｘ８陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏｒａｄ）に用い、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。試料混合物と結合した樹脂を０．５ｍＭホルマート（１００ｍｌ）で溶離し、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。溶離したすべての試料を１ｍｌのシンチレーション溶液（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ；Ｗａｌｌａｃ）と一緒に混合し、放射能をシンチレーション計数器（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．）で測定した。
【００７２】
その結果、図２に示されたように２−ＰＭＰＡがＧＣＰIIによるＮＡＡＧ加水分解を完全に遮断したことを確認した（図２）。
【００７３】
＜１−５＞ＧＣＰIIプラスミド及びレンチウイルス製作を通じた２−ＰＭＰＡがレンチウイルスＧＣＰIIのＡβ分解に及ぼす影響の確認
ｈＧＣＰIIプラスミドを下記の記載のように準備した。ヒトのアストロサイトに該当するＵ８７−ＭＧ細胞からＲＮＡを分離した後、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡで ｈＧＣＰIIの増幅のために下記のプライマーを用いてＰＣＲ方法を用いた。プラスミド生成のためにＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３ベクター内にクローニングした：
正方向：５'−ＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣ−３'（配列番号３）、及び
逆方向：５'−ＡＴＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ−３'（配列番号４）。
【００７４】
レンチウイルスｈＧＣＰIIをＭａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（韓国ソウル）で準備した。ｈＧＣＰIIｃＤＮＡをヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び蛍光タンパク質（ＧＦＰ）があるＩＲＥＳ配列を含むレンチウイルスコンストラクト（ＬｅｎｔｉＭ１．４−ｈＧＣＰＩＩ）内にクローニングした。ウイルス製作のために、ｈＧＣＰII、ＶＳＶ−Ｇ及びｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを、リポフェクタミンプラス（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）を用いて２９３Ｔ細胞内に一緒に形質導入した後、細胞を単量体のＡβおよび２−ＰＭＰＡで処理した。細胞成長培地でのＡβ１−４０の濃度を前記実施例＜１−３＞の方法で分析した。
【００７５】
その結果、図３に示されたように２−ＰＭＰＡは、レンチウイルスＧＣＰIIのＡβ１−４０分解を遮断しなかったことを確認した（図３）。
【００７６】
＜１−６＞形質転換動物
二重形質導入ＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１ΔＥ９マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，米国）から購入し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド系統で野生型マウスと交配することによって、ヘミ接合体（hemizygotes）を維持した。すべての動物を標準動物管理プロトコールによって飼育し、韓国食品医薬品安全庁（the Korean Food and Drug Administration）の無菌飼育施設（pathogen-free facility）で維持した。マウス遺伝子型を下記のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてＰＣＲ方法で確認した：
ＰｒＰ（ｍｏｕｓｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）：
正方向５'−ＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧ−３'（配列番号５）、
逆方向５'−ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣ−３'（配列番号６）、
ヒト（ｈｕｍａｎ）ＡＰＰ：
正方向５'−ＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧ−３'（配列番号７）、及び
逆方向５'−ＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＣＧ−３'（配列番号８）。
【００７７】
Ａβｓの脳での水準でＧＣＰII抑制剤の効果を測定するために、処理した群は腹腔内注射で一ヶ月間、ＰＢＳ ２Ｘ／ｗｋで、溶解した２−ＰＭＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を注入した。処理しない群は対照群として同じ量のＰＢＳを注入した。マウスが８ヶ月になった時に処理を始めた。
【００７８】
＜１−７＞２−ＰＭＰＡのマウス脳での効果確認
２−ＰＭＰＡの効果をマウスの脳で調べるために、前記実施例＜１−６＞の方法で形質転換された８ヶ月になったＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ／ＰＳ１Δ９マウスの腹腔内に、１ヶ月間、２−ＰＭＰＡの１０ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳ ２／ｗｋを９回処理した。皮質膜断片でＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準を前記実施例＜１−３＞の方法で分析し、ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性を前記実施例＜１−４＞の方法で測定した。
【００７９】
その結果、図４に示されたように２−ＰＭＰＡで処理したマウスでのＮＡＡＧ分解は、ＰＢＳ対照群と比べて約９０％減少したことを確認し（図４）、図５に示されたように２−ＰＭＰＡの処理によってＡβ１−４０及びＡβ１−４２の水準は変化しなかったということを確認した（図５）。
【００８０】
＜実施例２＞ＧＣＰIIの位置選択的突然変異体の発現の確認
＜２−１＞ＧＣＰIIの位置選択的突然変異（Site-directed mutagenesis）
ｐｃＤＮＡ−ｈＧＣＰIIプラスミド（５０ｎｇ）を鋳型に用いて、所望する突然変異を産生する二つの相補的オリゴヌクレオチドプライマーで、各突然変異を導入した。Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の２．５Ｕを用いて延長させ、ニックの入った円形鎖（nicked circular strand）（９５℃、５分→（９５℃、５０秒→５５℃、１分→８０℃、８分２０秒→７２℃、１分）２２回循環→４℃、無限大（∞））で、結果としてもたらされた突然変異プライマー（１２５ｎｇ）を作った。メチル化されて、突然変異のない母型ＤＮＡ（nonmutated parental ＤＮＡ）鋳型を３７℃で一時間Ｄｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）の２０Ｕで消化させた。その後、円形（circular）ｄｓＤＮＡでＤＨ５ａコンピテント細胞内を形質転換させた。それぞれの突然変異をシークエンシング（Ｃｏｓｍｏ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で確認した。
【００８１】
その結果、図６に示されたようにＧＣＰIIの７個の突然変異体（Ｒ２１０Ａ、Ｄ３８７Ｎ、Ｐ３８８Ａ、Ｒ５３６Ｌ、Ｇ５４８Ｐ、Ｙ５５２Ｉ、Ｋ６９９Ｓ）を製作した（図６）。
【００８２】
＜２−２＞ウエスタンブロットを通じたＧＣＰII突然変異体の発現の確認
ＧＣＰII突然変異体の発現を確認するために、前記実施例＜１−１＞の方法にしたがって突然変異体のプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に形質導入した後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）入りのＲＩＰＡ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ａｔ ｐＨ８．０）で溶解させた。ブラッドフォード分析で溶解物のタンパク質の濃度を測定した。同じ濃度のタンパク質にβ−メルカブトエタノールを添加して１０分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で電気泳動させ、一時間室温で５％脱脂粉乳を入れたＴＢＳ−Ｔでブロックした。その後、前記膜を４℃で一晩、５％脱脂粉乳に ａｎｔｉ−ＰＳＭＡ（ａｂｃａｍ；ａｂ４１０３４，１：１０００）、Ｙ−ＰＳＭＡ（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１：１０００）または抗−α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６１９９，１：５００００）とともに培養した。ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、ブロットを室温で２時間ＨＲＰ−ヤギ抗マウスコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０７１，１：１００００）または、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０４６，１：１００００）とともに培養した。三回洗浄した後、タンパク質を化学発光の基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
【００８３】
その結果、図７に示されたようにバンドのパターンは、ｒｈＧＣＰIIと類似し、一つのバンドはＧＣＰIIの予測された大きさである９８ｋＤａで明確に見えることを確認した（図７）。
【００８４】
＜実施例３＞ＧＣＰII突然変異体のＮＡＡＧ分解に及ぼす影響の確認
ＧＣＰII突然変異体のＮＡＡＧ分解に及ぼす影響を確認するために、前記実施例＜１−１＞の方法によって、Ｓ１'ポケット（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）及びＳ１ポケット（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）に置換がある突然変異タンパク質を、Ｈ４細胞に形質導入した。ＮＡＡＧの加水分解を測定するために、前記実施例＜１−４＞の方法によって、細胞溶解物を［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＧＣＰIIの特異的基質とともに培養し、前記実施例＜２−２＞の方法によってタンパク質発現の変化を確認した。
【００８５】
その結果、図８に示されたようにＳ１'ポケット突然変異体（Ｒ２１０Ａ，Ｋ６９９Ｓ）はＮＡＡＧを加水分解する活性を完全になくしてしまったが、Ｓ１ポケット突然変異体（Ｒ５３６Ｌ，Ｇ５４８Ｐ）は野生型ＧＣＰIIと比べて４０％程度活性を維持していることを確認した（図８）。
【００８６】
ＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解でＡβの効果を調べるために、前記実施例＜１−４＞の方法によってｒｈＧＣＰIIを［Ｈ］３がラベルされたＮＡＡＧ（２０μＭ）及びＡβペプチドとともに同時に培養した。
【００８７】
その結果、図９に示されたようにＧＣＰIIのＮＡＡＧ分解活性は、Ａβペプチドに影響を受けなかったことを確認した（図９）。
【００８８】
＜実施例４＞ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響の確認
＜４−１＞ＧＣＰII／Ａβ複合体のモデリング
Ａβ−Ｓ１及びＳ１'ポケットの結合のＭＯＤＥをプログラムＯ（http://xray.bmc.uu.se/alw yn/A-Z_frameset.html)(PDB file:1z0q(Ab),2oot(GCPII))を用いて制作した。計算的ドッキング（computational docking）をマニュアルドッキング（manual docking）方法を用いて行なった。
【００８９】
ＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響を確認するために、前記実施例＜１−５＞の方法及び前記実施例＜４−１＞の方法によって、多様な突然変異体のプラスミドを、内因性のＧＣＰIIを発現しないことが知られているＰＣ３細胞に形質導入した。４８時間後、前記細胞溶解物をＡβ（２μＭ）と混合して一晩培養した。
【００９０】
＜４−２＞ドットブロットを通じたＧＣＰII突然変異体のＡβ分解に及ぼす影響の確認
発現したＧＣＰＩＩによって切られないで残ったＡβペプチドの量を確認するために、細胞溶解物とＡβ（２μＭ）との混合物を下記のドットブロット方法及び前記実施例＜２−２＞の方法で確認した。細胞溶解物とＡβ（２μＭ）の混合物１μｌをニトロセルロース膜に落とした後、完全に乾燥させた。乾燥した膜を一時間室温で５％脱脂粉乳を入れたＴＢＳ−Ｔでブロックした。その後、前記膜を４℃で一晩、５％脱脂粉乳に抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０（ＳＩＧＮＥＴ；ＳＩＧ−３９３００，１：２０００）とともに培養した。ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、膜を室温で１時間ＨＲＰ−ヤギ抗マウスコンジュゲートＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ；１１５−０３５−０７１，１：１００００）とともに培養した。三回洗浄した後、タンパク質を化学発光基質を用いて検出した。
【００９１】
その結果、図１０、図１１に示されたように、Ｋ６９９Ｓ突然変異体は野生型よりＡβをもう少し分解したが、Ｇ５４８Ｐ突然変異体はＡβ分解活性を失ったことを確認した（図１０、１１）。
【００９２】
ＡβペプチドでＧＣＰIIの分解活性を確認するために、前記実施例＜１−３＞及び前記実施例＜４−１＞の方法によって、形質導入後の翌日、培地内にＡβを１ｎｇ／ｍｌで処理し、３７℃で８時間培養した。
【００９３】
その結果、図１２に示されたように残ったＡβは、Ｇ５４８Ｐを除いて、Ｋ６９９Ｓによって減少したことを確認した（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
前記で示されたように、本発明は、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療のための薬剤の開発と、それを用いた予防または治療方法の開発、すなわちタンパク質治療剤、発現及び活性調節物質、遺伝子治療剤または細胞治療剤などに有用に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）の全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
ＧＣＰII突然変異体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
ＧＣＰII突然変異体が、グルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有することを特徴とする、請求項１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記βアミロイドが、溶解性または不溶性βアミロイドであることを特徴とする、請求項３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤。
【請求項６】
発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであることを特徴とする、請求項５のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤。
【請求項７】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項８】
ＧＣＰII突然変異体の遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項７のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項９】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項１０】
ＧＣＰII突然変異タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項９のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項１１】
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞でＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
工程（２）のタンパク質の発現水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、請求項１１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程と、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
工程（２）のタンパク質の活性水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、請求項１３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＧＣＰII（グルタメート・カルボキシペプチダーゼII）の全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
ＧＣＰII突然変異体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
ＧＣＰII突然変異体が、グルタメート生成阻害活性及びβアミロイド分解活性を同時に有することを特徴とする、請求項１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記βアミロイドが、溶解性または不溶性βアミロイドであることを特徴とする、請求項３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体を発現する発現ベクターを有効成分として含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤。
【請求項６】
発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス性の発現ベクターであることを特徴とする、請求項５のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤。
【請求項７】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の遺伝子を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項８】
ＧＣＰII突然変異体の遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項７のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項９】
ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を含有する、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項１０】
ＧＣＰII突然変異タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項９のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤スクリーニング用薬学的組成物。
【請求項１１】
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異体の発現細胞を被検物質で処理する工程、
（２）工程（１）の細胞でＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の発現水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
工程（２）のタンパク質の発現水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、請求項１１のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（１）ＧＣＰIIの全体アミノ酸配列のＮ末端から６９９番目アミノ酸であるリジン（Ｋ）をセリン（Ｓ）に変異させたＧＣＰII突然変異タンパク質を被検物質で処理する工程と、
（２）工程（１）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を測定する工程、及び
（３）被検物質で処理しない対照群に比べて、工程（２）のＧＣＰII突然変異タンパク質の活性水準を減少させた被検物質を選別する工程
を含む、アミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
工程（２）のタンパク質の活性水準が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする、請求項１３のアミロイド症、アルツハイマー疾患、アルツハイマー疾患を伴うダウン症候群、脳卒中、中風、痴ほう、ハンチントン病、ピック病及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択された疾患の予防及び治療剤候補物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１３−８２７１０（Ｐ２０１３−８２７１０Ａ）
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２２６５４（Ｐ２０１２−２２２６５４）
【出願日】平成２４年１０月５日（２０１２．１０．５）
【出願人】（５１２２５８９７５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月５日（２０１２．１０．５）
【出願人】（５１２２５８９７５）
【Ｆターム（参考）】
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