Ｈ−１パルボウイルスに結合する抗体
完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントについて記載する。当該抗体は、様々な診断および治療方法、例えば妊娠中のＨ−１パルボウイルス感染症の検出／療法に有用であるが、それはパルボウイルスが妊婦約４００例中１例を罹患させ、胎児消失または胎児水腫を誘発する可能性があるためである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。当該抗体は、様々な診断法および治療法、例えばＨ−１パルボウイルス感染症の検出／治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは、ウイルスファミリーのパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の１つの属名である。パルボウイルス属は、ヘルパーウイルスの非存在下で複製可能な多数の小さな正２０面体ウイルスを含んでいる。パルボウイルスは長さ約５，０００ｂｐの一本鎖ＤＮＡを含有している。ＤＮＡの３’および５’末端には、各々１本のパリンドローム（回文）配列が存在する。このＤＮＡは、２つのキャプシドタンパク質であるＶＰ１およびＶＰ２（図１）ならびに２つの調節非構造タンパク質であるＮＳ−１およびＮＳ−２をコードする。後者のタンパク質はリン酸化されており、核または細胞質および核両方の局在をそれぞれ示す。第３のより小さなキャプシドタンパク質であるＶＰ３は、タンパク質分解的開裂によりＶＰ２から引き出される。これら２つのキャプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２は、ＶＰ２コーディング領域がＶＰ１コーディング領域内に完全に含まれるように、重複するオープンリーディングフレームによってコードされる。自然感染では、キャプシドタンパク質は、選択的スプライシングに起因して１：１０のＶＰ１：ＶＰ２比で発現する。近年、ＶＰ１に対して特異的なキャプシドタンパク質の領域（Ｎ末端領域）は、細胞ホスホリパーゼＡと共通するモチーフを含有しており、実際にｉｎ ｖｉｔｒｏでこの活性を発揮することが証明されている。パルボウイルスＶＰ１が類似性を共有するカルシウム依存性の分泌型ＰＬＡ２は、膜の透過による細胞溶解を包含するシグナリング経路に関与する。他方、ＮＳ１は、順にホスホリパーゼを経由して調節される、プロテインキナーゼＣファミリーのメンバーによって調節されることが証明されている。
【０００３】
パルボウイルスは、通常はそれらの自然宿主の集団によって良好に耐容され、その中で明白な病理学的徴候を示すことなく存続する。これは、先天性免疫による胎児および新生児の保護、ならびに成体動物においてはパルボウイルス複製が狭い範囲の標的増殖組織へ顕著に制限されることの両方に起因する。この宿主耐性は、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）ならびにそれらの各天然宿主、つまりマウスおよびラット内のＨ−１ウイルスに関する。
【０００４】
さらに、ヒトは、パルボウイルス、例えばＨ−１パルボウイルスに感染する可能性がある。実際、パルボウイルスは、一般的感染症であり、通常は小児における伝染性紅斑として現れる。この感染症は、通常は軽症であり、健常者においては自己限定性である。しかしパルボウイルスは、成人における反応性関節炎、および血液学的状態もしくは免疫抑制状態の成人における重症貧血もまた誘発することがある。さらに、パルボウイルスは、妊婦約４００例中１例で発症し、胎児消失または胎児水腫を誘発することがある。そこで、特に妊婦におけるパルボウイルス感染症の同定は、モニタリングおよび考え得る治療のために重要である。残念なことに、パルボウイルス感染症の診断／療法のための現行法は改良を必要としており、例えば現時点では、集合Ｈ−１パルボウイルスに対する特異的抗体は入手することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の基礎にある技術的課題は、パルボウイルス感染症またはそれに関連する疾患を診断および治療するための改良された手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記技術的課題の解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施形態を提供することによって達成される。Ｈ−１パルボウイルスを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した後、本発明者らは、抗体産生Ｂ細胞を脾臓から単離し、Ａｇ８骨髄腫細胞と融合させることができた。淘汰圧を用いた３ラウンドの選択後、Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１を単離することができた。
【０００７】
そこで、本発明は、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０００８】
本明細書で使用する用語「抗体」は、完全抗体、または特異的結合に対して完全抗体と競合するその結合フラグメントを意味する。（抗原）結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または完全抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生成される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体ならびに「ディアボディ（二重特異性抗体）」が含まれる。「二重特異性」もしくは「二機能性」以外の抗体は、その各々が同一である結合部位を有すると理解されている。
【０００９】
本明細書で使用する用語「キャプシド」は、「キャプソマー」と呼ばれる、異なる、または同一のタンパク質サブユニットから形成されるウイルス核酸を取り囲むタンパク質の保護膜である。キャプシドは、ウイルスゲノムによってコードされるタンパク質から生成され、その形状は形態学的識別の根拠として役立つ。ウイルスによりコードされたタンパク質サブユニットは、自己集合してキャプシドを形成し、一般にウイルスゲノムの存在を必要とする。パルボウイルスキャプシドは、完全粒子の成熟の一部としてタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。
【００１０】
本明細書で使用する用語「完全キャプシド」は、ウイルス核酸、好ましくは生存ウイルスを含有するパルボウイルスキャプシドを意味する。用語「中空キャプシド」は、包埋された核酸を含まないキャプシドを意味する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、天然Ｈ−１パルボウイルスキャプシドには結合するが、変性キャプシド、例えば界面活性剤もしくは熱を使用することによって変性したキャプシドには結合しない抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。
【００１２】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、中和抗体である。本明細書で使用する用語「中和抗体」は、パルボウイルスの生物学的活性、例えば複製および／または感染性を低減させる、または無効にする抗体を意味する。
【００１３】
いっそうより好ましい実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。Ｈ−１パルボウイルスに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９８５）， ４９５−７）。全キャプシド、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはそれらのフラグメントを使用して哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたはヒトを免疫し、ポリクローナル抗体を産生することができる。所望であれば、免疫原は、担体タンパク質、例えばウシ血清アルブミン、サイログロブリンおよびキーホール リンペット ヘモシアニンへ抱合させることができる。宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用すると、免疫学的応答を増加させることができる。当該アジュバントには、フロイントアジュバント、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、登録商標）ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油乳濁剤、キーホール リンペット ヘモシアニンおよびジニトロフェノール）が含まれる。特にヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００１４】
一本鎖抗体を生成するために記載された技術は、Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する一本鎖抗体を産生するために当該技術分野において公知の方法を使用して適合させることができる。関連する特異性を備えるが別個のイディオタイプ組成の抗体は、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからのチェイン シャフリングによって生成することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８ （１９９１）， １１１２０−３）。一本鎖抗体は、さらにまたＤＮＡ増幅法、例えばＰＣＲを使用して、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いて構築することもできる（Ｔｈｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５ （１９９６）, ５０７−１１）。一本鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であってよく、および二価または四価であってよい。四価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５ （１９９７）, １５９−６３に教示されている。二価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｘ ｎｏ９ （１９９４）， １９９−２０６に教示されている。
【００１５】
最も好ましい実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、ブダペスト条約を遵守して、２００９年１１月２５日に番号ＤＳＭ ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって生成される。
【００１６】
本発明はさらに、ブダペスト条約を遵守して、２００９年１１月２５日に番号ＤＳＭ ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって生成される抗体と同一エピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１７】
本明細書で使用する用語「エピトープ」には、抗体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常は分子の化学的活性表面基、例えばアミノ酸もしくは糖側鎖からなり、通常は特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。本発明の抗体は、解離定数が≦１μＭである、好ましくは≦μＭ １００ｎＭである、および最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われている。典型的には、１つのエピトープを形成するために、少なくとも６、８、１０または１２連続アミノ酸が必要とされる。しかし、非連続アミノ酸を包含するエピトープは、より多くの、例えば少なくとも１５、２５または５０アミノ酸を必要とすることがある。
【００１８】
本発明はさらに、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドへの結合について上記で特徴付けた本発明の抗体と競合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１９】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を持っている。抗体／フラグメントは、直接的または間接的に検出可能に、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素を用いて標識することができる。当業者であれば、抗体に結合させるための他の適切な標識を認識でき、またはルーチンの実験を使用して当該の標識を確認することができる。
【００２０】
本発明はさらに、細胞系、すなわち本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞系に関する。好ましくは、この細胞系は、哺乳動物細胞系である。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当該技術分野において周知であり、ＤＳＭＺまたはアメリカン培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が含まれ、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｐ細胞および多数の他の細胞系が含まれる。細菌、酵母、昆虫および植物を含む非哺乳動物細胞もまた組換え抗体を発現させるために使用できる。発現方法は、どの系が最高発現レベルを生成するのか、および所望の結合特性を備える抗体を産生するのかを決定することによって選択される。
【００２１】
当該細胞系によって産生された抗体は、当該技術分野において周知の方法によって精製することができる。例えば、抗体は、パルボウイルスキャプシドまたはパルボウイルスエンベロープタンパク質が結合しているカラムを通過させることによって親和性精製することができる。結合した抗体は、次に塩濃度の高い緩衝液を用いてカラムから溶出させることができる。
【００２２】
最も好ましい細胞系は、ブダペスト条約を遵守して２００９年１１月２５日に番号ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１である。
【００２３】
本発明は、さらに本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸も提供する。本発明の抗体、例えば一本鎖抗体をコードする核酸を、手動もしくは自動ヌクレオチド合成を使用して構築し、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローン化し、および細胞内へ導入して該コード配列を発現させることができる。または、抗体は、例えば繊維状ファージ テクノロジー（Ｖｅｒｈａａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１ （１９９５）, ４９７−５０１）を使用して直接的に産生することができる。
【００２４】
本発明は、さらに本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断用組成物も提供する。当該組成物は、パルボウイルス感染症の診断に有用である可能性がある。さらに、当該組成物は、
（ａ）Ｈ−１パルボウイルス標本およびさらに感染した動物および患者（薬物動態学的ウイルス血症）における、例えばＥＬＩＳＡによるＨ−１パルボウイルスの定量、
（ｂ）細胞内でのＨ−１パルボウイルス集合および輸送の検出、
（ｃ）実験動物、特にラットにおけるＨ−１パルボウイルスによる汚染の検出のために使用することができる。
【００２５】
診断には、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体を、免疫化学的測定法、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法、免疫組織化学的測定法、免疫沈降法、または当該技術分野において公知の他の免疫化学的測定法において使用できる。競合的結合または免疫放射線測定法のための多数のプロトコールは、当該技術分野において周知である。当該免疫測定法は、典型的には免疫源と該免疫源に特異的に結合する抗体との間の錯体形成の測定を含んでいる。
【００２６】
診断は、特定の免疫測定法には限定されず、同種および異種方法の両方を含むことが意図されている。実施可能な代表的な免疫測定法には、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、比濁阻害免疫測定法（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ）が含まれる。指標成分、もしくは標識基は、対象抗体に付着させることができ、測定装置の利用可能性および適合する免疫測定法によって指示されることが多い方法の様々な使用のニーズを満たすよう選択される。上記に記載した様々な免疫測定法を実施する際に使用可能な一般的技術は、当業者には公知である。
【００２７】
本発明は、さらに本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えばＨ−１パルボウイルス感染症またはそれに関連する疾患を治療するための、該抗体がウイルスを中和する能力（ａｎｔｉｄｏｔ）を使用する方法において使用することができる。
【００２８】
療法には、抗体またはその抗原結合フラグメントは、有効量で、薬学的に許容される担体と組み合わされて存在する。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって毒性ではない任意の担体を含むことが意図されている。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液、例えば水中油型乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。当該担体は、従来の方法によって調製することができる。
【００２９】
本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを、被験者に有効量で投与することができる。「有効量」は、感染症／疾患の経過および重症度に影響を及ぼし、当該病状の低減または緩解をもたらすために十分な抗体またはその抗原結合フラグメントの量を意味する。これらの感染症、疾患または障害を治療および／または予防するために有用な「有効量」は、当業者には公知の方法を使用して決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， ｅｄｓ． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．１−４６（１９７５）を参照されたい）。
【００３０】
最後に、本発明は、さらにＨ−１パルボウイルス感染症または当該感染症と関連する疾患の診断または療法に有用な本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。好ましくは、本キットは、１つ以上の容器、例えばバイアル、試験管などを、その中にきっちりと密封して収容するために区分化されている輸送手段を含み、該容器手段の各々は該分析において使用される個別要素の１つを含んでいる。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識される、または検出可能に標識することができる本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。本キットは、さらに緩衝液を含有する容器および／またはレポーター分子（例えば、酵素もしくは蛍光標識）に結合したレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質、例えばアビジンもしくはストレプトアビジン）を含む容器も有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｈ−１パルボウイルスの免疫沈降反応を示す。 レーン１：ＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させられたＨ−１パルボウイルス。レーン２：ＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を伴わない、免疫沈降反応が生じないＨ−１パルボウイルスを意味する陰性コントロール。レーン３：陽性コントロール：免疫沈降反応方法を用いないＳＤＳ−ゲルおよびウェスタンブロット上のＨ−１パルボウイルス単独。レーン４：タンパク質マーカー。 ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水。ｍＡｂ：ＢＬ−Ｈ１。ａＶＰ：変性Ｈ−１パルボウイルスのウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体。
【図２】図２は、ウェスタンドットブロットを示す。 ウェスタンドットブロットは、天然および変性Ｈ−１パルボウイルスを用いて生成された。ＢＬ−Ｈ１：Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体。ａＶＰ：変性ウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドおよびジチオトレイトールを用いる）。天然：未処理Ｈ−１パルボウイルス。陰性コントロール：Ｈ−１パルボウイルスを含まない。
【図３】図３は、野生型Ｈ−１の分布およびＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を用いた検出を示す。 モノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１がキャプシド、モノ／オリゴマーキャプシドタンパク質または変性キャプシドタンパク質と反応するか決定するため、細胞抽出物は、ｐＵＣ １９ΔＨｉｎｄＩＩＩでのトランスフェクションの２４時間後に、２９３Ｔ ＨＥＫ細胞から調製した。細胞抽出物は、直線スクロース勾配上で分画させる。 ＢＬ−Ｈ１：Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体。ａＶＰ：変性Ｈ−１パルボウイルスのウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体。プラスミドｐＵＣ１９ΔＨｉｎｄＩＩＩは、完全Ｈ−１パルボウイルスゲノムを含有する。Ｖｇ：リアルタイムＰＣＲによって分析されたウイルスゲノム含有粒子。ＩＵ：感染単位。ＨＡ：完全または中空Ｈ−１パルボウイルスの赤血球凝集反応。
【図４】図４は、ｍａｂ ＢＬ−Ｈ１の免疫蛍光試験（精製７および２１日後のＢＬ−Ｈ１活性の安定性）を示す。 精製後、ＢＬ−Ｈ１抗体を、各々室温、４℃および−２０℃で保存する。活性は、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞上でＩＦ（免疫蛍光）によって２１日後に試験する。陽性コントロールは、ポリクローナル抗体Ｃ８Ｂ１０である。分析は、顕微鏡Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓおよびカメラＡｘｉｏＣａｍＭＲｃ（倍率：４０倍）によって実施する。
【図５】図５は、Ｈ−１パルボウイルスに感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞の中和を示す。 Ｈ−１パルボウイルスの中和は、野生型および組換えＨ−１パルボウイルスの何れかでの１のＭＯＩで、５５０ｎｍ（吸光度５５０ｎｍ）で測定するＭＴＴ測定法によって示されている。０ｎｇ〜５０００ｎｇのＢ１−Ｈ１濃度を試験すると、３Ｅ５〜３Ｅ７のＨ−１パルボウイルス／μｇ（ＢＬ−Ｈ１）に対応した。
【図６】図６は、ｍａｂ ＢＬ−Ｈ１を用いた野生型Ｈ−１ ＰＶの中和を示す。 Ｈ−１パルボウイルスの中和は、１および１０のＭＯＩでのＮＢ−３２４Ｋ細胞上でのプラークアッセイによって示されている。３Ｅ４または１Ｅ５のＨ−１パルボウイルスはいずれも１μｇのＢＬ−Ｈ１で中和された。 ＮＣ＝陰性コントロール。ＰＣ＝陽性コントロール。
【図７】図７は、組換えＨ−１ ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を示す。 １および１０のＭＯＩで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有する組換えＨ−１パルボウイルスは、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞である０ｎｇ〜５０００ｎｇのＢ１−Ｈ１濃度で中和された。ＧＦＰは、４０倍の倍率で分析する。 ＮＢ−３２４Ｋ細胞上でのＢＬ−Ｈ１を用いた感染阻害作用は、一晩（ｏ／ｎ）のＢ１−Ｈ１プレインキュベーションおよびその後のＨ−１パルボウイルスによる感染によって所見されない。
【図８】図８は、Ｈ−１ ＰＶ検出のためのＥＬＩＳＡの開発を示す。 Ｈ−１パルボウイルスキャプシドは、標準曲線を評価するために分光光度計において４５０ｎｍで測定する。現在もなお、３種の異なる濃度（０．７５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌの二次抗体）を使用する。
【００３２】
以下、実施例により本発明を具体的に例示する。
【実施例１】
【００３３】
一般的方法
（Ａ）Ｈ−１パルボウイルスによるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫
マウスを以下のスケジュールに従って免疫した。
（１）注射１週間前
麻酔後、眼窩後穿刺により１５μｌの血液を採取した（陰性コントロール）。
【００３４】
（２）免疫
麻酔：ＰＢＳ中の１００μｌの０．２％塩酸キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ社）およびＰＢＳ中の体重１０ｇ当たり各１０μｇの塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｖａｌｔ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ社）の腹腔内［ｉ．ｐ．］注射。
【００３５】
（３）１．Ｈ−１パルボウイルスの注射
４０％のビジパーク（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ、登録商標）−リンガー液中の１００μｌウイルス（＝７×１０１０ウイルスゲノム含有粒子［Ｖｇ］＝１．２×１０８ＰＦＵ（プラーク形成単位））、
＋５０μｌのＰＢＳ、
＋１５０μｌの不完全アジュバント、
を混合し、４つの相違する位置に各６０μｌを皮下［ｓ．ｃ．］注射。
【００３６】
（４）２．初回注射の１カ月後のＨ−１パルボウイルスの注射
１．注射と同様の手順。
【００３７】
（５）３． 初回注射の２カ月後のＨ−１パルボウイルスの注射
追加免疫：脾臓を摘出する１週間前
１００μｌのウイルス（７×１０１０Ｖｇ＝１．２×１０８ＰＦＵ）
＋２００μｌのＰＢＳの腹腔内［ｉ．ｐ．］注射。
【００３８】
（Ｂ）ハイブリドーマの生成
ハイブリドーマは、以下のスケジュールに従って生成した。
【００３９】
培地：
作業培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社番号Ｒ８７５８）。
ハイブリドーマ培地：５００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社番号Ｒ８７５８）
＋５ｍｌ Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ社）。
＋５ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン１００００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ社））
＋１０ｍｌの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）（Ｓｉｇｍａ社）
＋５０ｍｌのＦＣＳ（融合試験済み、３０分間５６℃で熱不活性化）。
選択培地：ハイブリドーマ培地＋１０ｍｌのＨＡＴ５０倍濃縮液（Ｇｉｂｃｏ社）。
ＢＭ Ｃｏｎｄｉ−Ｍｅｄ（選択用）１０％。
【００４０】
融合試薬：
ＰＥＧ １５００（Ｒｏｃｈｅ社番号７８３６４１）。
【００４１】
細胞：
Ａｇ８／Ｘ６３（Ｂ細胞腫瘍細胞）。
細胞は、融合の少なくとも１週間前に解凍し、ハイブリドーマ培地中で培養し、融合１日前に分割させた。細胞は、増殖期にあるはずである。
【００４２】
融合：
調製：融合の１〜２日前
融合の１日前：Ａｇ８細胞を分割させる（計１８、増殖期にあるはずである）。
【００４３】
融合日：
全培地および溶液を３７℃に加温する。
【００４４】
Ａｇ８細胞の調製：
Ａｇ８細胞を貯留し、７分間２６４×ｇで遠心し、３０〜４０ｍｌの作業培地中に入れ、細胞を計数する（約１〜２×１０８細胞）。
【００４５】
脾臓の調製：
麻酔後、マウスを致死させ、殺菌するために７０％エタノール中に入れ、無菌ベースにピンで固定し、無菌ピンセットおよび剪刀を用いて脾臓を取り出し、それをシャーレ内の作業培地中へ入れ、心臓を穿刺して血液を採取し、１．５ｍｌ試験管中に収集する。リンパ節に注意を払う。
【００４６】
脾臓細胞：
脾臓は剪刀を用いて数回切断し、無菌対物スライドを用いて脾臓を破砕し（粉砕）、脾嚢を取り出して作業培地を用いて洗浄し、脾嚢を廃棄し、脾細胞をパスツールピペットを用いてホモジナイズし、細胞懸濁液を５０ｍｌ試験管内に収集し、嚢組織をセットし、上清を新しい５０ｍｌ試験管内へ入れ、細胞を２６４×ｇで７分間遠心し、細胞を作業培地で１回洗浄し、細胞を２６４×ｇで７分間遠心し、ペレットを２〜５ｍｌの作業培地中へ取り出し、細胞を計数する（５×１０７〜３×１０８細胞でなければならない）。
【００４７】
脾細胞とＡｇ８細胞との融合：
脾細胞：Ａｇ８細胞＝３：１を５０ｍｌ試験管中で混合し、混合した細胞を２６４×ｇで７分間遠心する。各細胞ペレットは総計１×１０８細胞以下でなければならない。上清を廃棄し、試験管の底部を静かにタッピングすることによってペレットを崩壊させ、連続的に揺らしながら１分間にわたり１ｍｌのピペットを使用して１ｍｌのＰＥＧ １５００をペレットに加える。さらに２分間揺らし続け、３分間連続的に揺らすことによって慎重に１０ｍｌの選択培地を加える。さらに１０ｍｌの選択培地を加え、混合した細胞を１２０×ｇで７分間遠心し、上清を廃棄し、ペレットは試験管の底部を静かにタッピングすることによって崩壊させ、再び洗浄し（さらに１０ｍｌの選択培地を加え、混合した細胞を１２０×ｇで７分間遠心し、ペレットは試験管の底部を静かにタッピングすることによって崩壊させる）、１００μｌの選択培地を備える９６ウエルプレートを調製する（各ウエルは細胞数２×１０５個／ウエル（＝２×１０６個／ｍｌ、２×１０７個／１０ｍｌ））。
【００４８】
Ａｇ８コントロール：
選択培地中に１Ｅ４細胞／ウエルを播種する（およそ２４ウエル以下）。
【００４９】
血液：
３０分後（赤血球凝集反応）、遠心し（５０００×ｇ、１０分間）、新しい試験管中に血清を採取する（陽性コントロール）。
【００５０】
観察：
２〜７日後：ＨＡＴ選択培地中のコントロールＡｇ８細胞（死滅していなければならない）。
１週間後：融合した細胞を供給し、１ウエル当たり１００μｌを取り出し、廃棄し、１００μｌの新鮮ＨＡＴ選択培地を供給する。
２週間後：スクリーニング（１０％のＢＭ ＣｏｎｄｉＭｅｄを備える培地）、免疫蛍光法、ウェスタンドットブロットを開始しなければならない。
【００５１】
選択：
陽性スクリーニングのウエルを選択しなければならない。
１．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
２．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
３．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
【００５２】
（Ｃ）Ｈ−１野生型キャプシドに対するモノクローナル抗体の産生
材料：
７５ｃｍ２または１５０ｃｍ２の無菌フィルターを備えるＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ Ｔ−フラスコ。１０％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン（２．５ｍＭ）、１％のＰ／Ｓ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを備えるＲＰＭＩ培地。ＢＬ−Ｈ１−ハイブリドーマ細胞。ピペット（５、１０、２０ｍｌ）。試験管（１５本、５０ｍｌ）。１ｌのボトル。水浴。そして遠心機。
【００５３】
情報：
ＢＬ−Ｈ１の生成時間：約２７時間。
懸濁細胞。
培地の交換：細胞を含む培地を遠心する：３００×ｇ、１０分間。
Ｂ１−Ｈ１の採取：遠心：５０００×ｇ、５分間。
ＢＬ−Ｈ１細胞増殖は、グルコース濃度が高いほど良好である。
ＲＰＭＩは２ｇ／ｌのグルコースを含有し、３または４ｇ／ｌへの増加は抗体産生を改良することができよう。
２×１０６個／ｍｌまでの細胞密度が可能である。
【００５４】
産生：
７５ｃｍ２のフラスコには１０ｍｌ、１５０ｃｍ２のフラスコには２０ｍｌの細胞懸濁液を入れる。
ＲＰＭＩ培地中でのＢＬ−Ｈ１細胞の培養。開始時の細胞密度：２×１０５個／ｍｌが理想的である。
細胞数１×１０５個／ｍｌも可能であるが、細胞増殖は開始時にはより緩徐である。細胞数３×１０５個／ｍｌも可能であるが、その場合、細胞を２または３日後に分割しなければならず、さもなければ生命力が低下する。
細胞を３日後（任意で４日後）に分割させる。
新鮮培地を備える１５〜２０％の馴化培地は、培地交換後、細胞生存性を増加させる。
【００５５】
（Ｄ）親和性クロマトグラフィーを用いたモノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１の精製
材料：
ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ社、フライブルク）。７０％エタノール（Ｈ２Ｏ中）。２０％エタノール（Ｈ２Ｏ中）。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（平衡バッファー＝バッファーＡ）。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（中和バッファー）。５０ｍｌ試験管。ポリスチレン製丸底試験管。０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．０）（溶出バッファー＝バッファーＢ）。ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ ５ｍｌカラム。
【００５６】
全緩衝液は、ボトルトップ フィルターを用いて濾過しなければならず、室温で１０分間超音波を用いて１００％脱気しなければならない（４８０Ｗ）。
【００５７】
手順：
ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅシステムの使用：最初に本システムを２０％エタノールで洗浄する。試験管Ａおよび試験管Ｂを２０％エタノール中に入れ、「Ｒｕｎ ｓｔｏｒｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ（保存されているメソッドを実行する）」を押し、プログラム１を選択する。その後、試験管にＨ２Ｏを入れ、再びプログラム１を選択する。ここで各試験管に平衡バッファーを満たし、全試験管を接続する。カラムを２０％エタノール中に保管し、平衡バッファーを用いて直ちに洗浄しなければならない。プレッシャーリミットは、０．３ＭＰａである。プロテインＡカラムについての１００％バッファーＡ（＝０％バッファーＢ）の流速は、５ｍｌ／分である。代替のプロテインＧ：１ｍｌ／分（直列カラムの量とは無関係）。
【００５８】
クロマトグラフィーは、メインメニューの「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアルで操作する）」で実行しなければならない。洗浄および装填のために、以下の条件を使用する。
メソッド ベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（０％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００５９】
クロマトグラフィーは、メインメニューの「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアル操作で作動する）」で実行しなければならない。カラムは、ＵＶベースライン値が持続する限り、緩衝液を用いて洗浄しなければならない。カラムに充填する前に、マニュアル操作での作動で「ａｕｔｏ ｚｅｒｏ（オートゼロ）」に入るが、これはＵＶベースライン値をゼロにリセットする。試験管Ａを通して「抗体培地」を負荷する。このため、試験管Ａを「抗体培地」内に入れ「ｂｒｅａｋ（中断する）」で保持する。さもないとシステム内に気泡が流入する。その後「ｃｏｎｔｉｎｕｅ（再開する）」を押す。最後に「ｂｒｅａｋ（中断する）」を押し、試験管Ａに戻し、洗浄のために「ｃｏｎｔｉｎｕｅ（再開する）」を押す。ＵＶベースライン値がほぼゼロである限り洗浄する。装填および洗浄中の素通り画分は追加ボトル内に収集しなければならない（カラムが過負荷になっている場合：これはＵＶシグナルの追加の増加を通して見ることができよう）。そこで、素通り画分は、二度目に使用することができよう。
【００６０】
１００％バッファーＢへ目を向けると、他の全てのパラメーターは同一である。
メソッドベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（１００％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００６１】
バッファーＢがカラムに達すると、抗体の溶出が直ちに始まる。ＵＶシグナルが強度に増加する。画分は、フラクションコレクターチューブを通して収集できよう。異なる抗体濃度のために、少なくとも２つの画分を収集することが推奨されている。
【００６２】
画分を手作業で収集するため、「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアル操作で作動する）」の「ｓｅｔ ｅｖｅｎｔ ｍａｒｋ（イベントマークを設定する）」を設定して開始時および終了時を見ることができよう。溶出された画分は、中和バッファーを用いて直ちにｐＨ１にしなければならない。第１画分は今も少量のバッファーＡを含有している可能性があるので、前もって中和バッファーの量を知ることは容易でない。不安定性を回避するために極めて迅速にｐＨ紙を用いてチェックしなければならない。１００％Ｐｕｆｆｅｒ Ｂについての推奨値。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ピークがベースライン値になった後、バッファーＡへ切換える。
メソッド ベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（０％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００６５】
カラムおよびシステムの保管は２０％エタノール中で行わなければならない。システム全体を洗浄しなければならない［プロトコールＰ−１９−２Ａを参照されたい］。
【００６６】
（Ｅ）Ｈ１−キャプシド−ＥＬＩＳＡ
材料：
・フレキシブルプレート、９６ウエル、Ｕ−ボトム、蓋なし、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社。マイクロプレート用蓋、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ社。ウシ乳汁由来カゼイン、Ｓｉｇｍａ社。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）。ＰＢＳ（Ｈ２Ｏ中）。コーティング用：ＢＬ−Ｈ１画分Ｅ１、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した０．１Ｍグリシン緩衝液中の２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ２Ａ ＢＬ−Ｈ１（１０ｍｇ／ｍｌの全タンパク質、ＩｇＧ２Ａ＋異種（ｆｏｒｅｉｇｈｎ）タンパク質）、４℃で保管。検出用：リン酸ナトリウム緩衝液中のＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰ、およそ１ｍｇ／ｍｌ、−２０℃で冷凍、試験管１本当たり１０μｌ。標準物質：４０％のビジパーク（商標）中のＨＶ Ｐｏｏｌ ｇｒｅｅｎ １−２／１−３／３−３／４−２／４−３／５−２／６−２／７−２ １．５×１０１１Ｖｇ／ｍｌ、７．５×１０１１キャプシド／ｍｌ、４℃で保管。陽性コントロール：４０％のビジパーク（商標）中のＰ＃３０／０７β、９．１×１０１１Ｖｇ／ｍｌ（推定〜１×１０１３キャプシド／ｍｌ）、４℃で保管。光学接着カバー（Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。ＴＭＢ、ＥＬＩＳＡのための超緩徐、液体物質システム、Ｓｉｇｍａ社、４℃で保管。停止液：室温で保管した１Ｎ Ｈ２ＳＯ４。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸマイクロタイタープレート光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社。
【００６７】
緩衝液：
洗浄バッファー：ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を加える（ウェスタン（ドット）ブロット用のストック液を参照されたい）。
コーティング液：使用直前に調製する。Ｅ１をＰＢＳ（Ｈ２Ｏ中）中で２．５μｇ／ｍｌへ希釈する、これは１：８００を意味する。１プレート当たり１０ｍｌの希釈液。
ブロッキングバッファー（ＢＢ）：ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌカゼイン＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）。常に新しく調製する。
４００ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を〜５０℃に（マイクロウェーブで４０〜５０秒間）加熱し、それをビーカー内へ注入し、必要量のカゼインを加える。３０分間加熱しながら、全てが溶解するまでおよそ５０℃で１時間まで攪拌する。使用のためには、水浴中で３７℃へ冷却する。１プレート当たり１００ｍｌで十分である。
検出：使用直前に調製する。ＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰ（二次抗体）をブロッキングバッファー中で０．１ｇ／ｍｌへ希釈する、これは１：１０，０００を意味する。１プレート当たり１０ｍｌの希釈液。
標準物質：ＨＶ ｐｏｏｌ ｇｒｅｅｎを２．５×１０９〜３．９１×１０７キャプシド／ウエルの標準物質へ希釈する。２つの標準物質列については、６００μｌの２．５０×１０９（ｄｏｕｐｌｅｘ）キャプシド／ウエル標準物質をストック標準物質からブロッキングバッファー中での１：３０（２．５×１０１０キャプシド／ｍｌ）希釈によって調製する。３００μｌのブロッキングバッファーを６本の１．５ｍｌ試験管へ加え、１．２５Ｅ＋０９、６．２５Ｅ＋０８、３．１３Ｅ０＋８、１．５６Ｅ＋０８、７．８１Ｅ＋０７、３．９１Ｅ＋０７キャプシド／ウエルと表示する。３００μｌの各標準物質を次の試験管に加え、各移行間にボルテックスミキサーにかけて連続希釈を実施する。ＰＢＳは、ブランクとして機能する（ブロッキングバッファーも使用することができる）。
陽性コントロール：ＢＢ中１：７００に希釈すると、およそ４．２×１０９キャプシド／ウエル、各々最初は２．９×１０１２キャプシド／ウエル。１プレートに付きコントロールを含む少なくとも４ウエルを実施する。Ｐ＃３０／０７βについての陰性コントロールは、４０％のビジパーク（商標）をＢＢ中１：７００に希釈する。
【００６８】
実行：
第０日
午後：フレキシブルプレートを１００μｌ／ウエルのコーティング液で一晩４℃にてコーティングする。マイクロプレート用の蓋を用いてプレートを閉じる。この作業は、ウエルの液体を蓋に押し出さないように慎重に実施する。
【００６９】
第１日
または、プレートを午前中、室温で２時間インキュベートすることでコーティングすることができる。
１．ブロッキングバッファーを上述したように調製する。コーティング液は、残っているコーティング液を全て除去するために吸収紙上で反転させて吸い取ることによってプレートから除去する。２００μｌ／ウエルのブロッキングバッファーを加え、プレートを蓋で閉じ、３７℃で１時間インキュベートする。
２．プレートのブロッキング中、上述したように標準物質および陽性コントロールを調製する。サンプル希釈のためにＶｇ／ｍｌ力価によってキャプシド数／ｍｌを推定する。より広い範囲をカバーするためにほぼ推定値の数種の希釈液を作製する。バッファーを用いてサンプルマトリックスの陰性コントロールを調製する（サンプルの希釈に注意を払う！）。
３．ウエルを吸引し、２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて２回洗浄する。最終洗浄後、プレートを反転させて、残っている緩衝液を全て取り除くために吸水性のペーパータオルで吸い取る。
４．ここから、プレートを用いる全ての工程は無菌フード下で行う。１００μｌの標準物質、陽性コントロール、各陰性コントロールまたはサンプルを各ウエルに加える。プレートを蓋で閉じる。３７℃で１時間インキュベートする。
５．陽性コントロール、各陰性コントロールまたはサンプルを、異なるサンプル毎にチップを交換しながらピペットで取り除く。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄する。最終洗浄後、プレートの表面をペーパータオルで乾燥させる。廃棄物をビーカー内に収集する。
６．１００μｌ／ウエルの希釈ＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰを各ウエルに加える。プレートを蓋で閉じ、３７℃で１時間インキュベートする。
７．検出抗体を１２チャンネルピペットを用いて取り出す。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて４回洗浄する。最終洗浄後、プレートの表面をペーパータオルで乾燥させる。できる限り多くの液体を取り除く努力をする。廃棄物を無菌フード下でビーカー内に収集する（１２チャンネルピペットを使用することができる）。
８．依然として無菌フード下で、１００μｌ／ウエルのＴＭＢ溶液を各ウエルに加え、室温の暗所でおよそ１５分間インキュベートする。およそ１０分後に反応強度が申し分ないかチェックする。
９．１００μｌ／ウエルの停止液を各ウエルに加えることによって反応を停止させる。プレートを光学接着カバーで密封する。
１０．反応を停止させるため３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を読み取る。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸマイクロタイタープレート光度計を使用する。結果の選択的補正のために、プレートを５５０ｎｍおよび５９５ｎｍで追加して読み取る。
【００７０】
追加の勧告：
ブロッキングは、一晩より長い時間実施してはならない。インキュベーション時間が長くなると凝集体の形成などが生じる。ウイルスおよび抗体の全希釈液は、使用直前に調製しなければならない。ウエルは、結合した抗体の消失を回避するため慎重に洗浄しなければならない。さらに、各列には同一時間工程でＴＭＢを加えることが重要である。反応を停止させるため、２つの列間の変動を最小限に抑えるため、同一時間工程を使用しなければならない。残っている液体をピペットで取り除く場合は、結合した反応物質の消失を回避するために、ウエルの底部に極めて軽く触れるだけでこすってはならない。３７℃でのプレートのインキュベーションは、ポリスチレンが弱熱導体であるため、周辺効果を誘発することがある。このため、分析の実施中にはブロッキングバッファーを３７℃に維持することが重要である。これにより、周辺効果を下方レベルへ抑えることができる。標識された二次抗体は、使用後に再冷凍してはならない。再冷凍は、シグナルの低強度を引き起こすことがある。カゼインを含有するブロッキングバッファーは、−２０℃で冷凍すれば少なくとも４週間保管することができる。この希釈手順は、間違えると結果が不正確になるので、慎重に実施しなければならない。多数回の希釈を次々に実施しなければ、極めて正確に実施することができる。
【実施例２】
【００７１】
Ｈ−１キャプシドに対するＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体の特性付け
ＢＬ−Ｈ１抗体がＨ−１パルボウイルスを免疫沈降させる能力を評価するため、抗体およびパルボウイルスを一緒に３７℃で一晩インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡセファロースによって沈降させ、ウェスタンブロッティングによって変性ウイルスタンパク質に対する抗体を使用して分析した。これは、ＢＬ−Ｈ１抗体が集合Ｈ−１パルボウイルスキャプシドを認識することを証明している（図１）。
【００７２】
この同定を特性付けるために、天然または変性Ｈ−１パルボウイルス何れかをニトロセルロース膜へ移した（図２）。ＢＬ−Ｈ１抗体は天然粒子しか認識しないが、ポリクローナル抗体は変性キャプシドを認識する。
【００７３】
ＢＬ−Ｈ１抗体がキャプシドと、または天然ウイルスタンパク質とも反応するか決定するために、キャプシドタンパク質発現プラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出物を調製し、直線スクロース勾配上で分画させた（図３）。ＢＬ−Ｈ１は、中空および完全Ｈ−１パルボウイルス粒子に対応する画分８〜１８の間でピークを示す。完全または中空キャプシドは、赤血球凝集を介して実証される（画分８〜１７）。完全キャプシドは、ウイルスゲノム含有粒子（画分１０〜１７）および感染単位を介した活性粒子（画分１２〜１８）によって決定される。これとは対照的に、非集合ウイルスタンパク質は、ウイルスタンパク質に対する抗体での画分３〜１４において検出された。最後に、ＢＬ−Ｈ１と非変性ならびに変性キャプシドタンパク質との間に反応性は見られない。ＢＬ−Ｈ１は、集合Ｈ−１パルボウイルスキャプシド上に存在する立体構造エピトープを特異的に認識する。全てまとめると、これは、ＢＬ−Ｈ１が集合粒子によってのみ表示される構造的エピトープを認識することを証明している。
【００７４】
図４は、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞におけるＨ−１産生の免疫蛍光法によるＢＬ−Ｈ１を用いた検出を示している。ＢＬ−Ｈ１抗体は、室温、４℃および−２０℃で保管した場合、少なくとも３週間安定性である。
【００７５】
図５、６および７では、Ｈ−１パルボウイルスのＢＬ−Ｈ１中和能力が証明されている。
【００７６】
ＭＴＴ測定法は、Ｈ−１パルボウイルスとＢＬ−Ｈ１抗体との正しい比率を見つけるために実施した。１Ｅ５までのＨ−１パルボウイルスを中和するには、ＢＬ−Ｈ１は１μｇで十分である（図５）。
【００７７】
プラークアッセイによって決定すると、１Ｅ５ Ｈ−１パルボウイルス当たり１μｇのＢＬ−Ｈ１を用いて９５％の中和を達成することができた（図６）。この中和能力は、さらに緑色蛍光タンパク質を発現する組み換えＨ−１パルボウイルスを用いても証明されている（図７、上方パネル）。ＢＬ−Ｈ１自体が細胞レポーターと相互作用することによって間接的に作用するのではないことを証明するため、ＮＢ−３２４Ｋ細胞をＢＬ−Ｈ１抗体とともに一晩プレインキュベートし、その後Ｈ−１パルボウイルスにより感染させた（図７、下方パネル）。
【実施例３】
【００７８】
Ｈ−１−キャプシドのＥＬＩＳＡ
ＢＬ−Ｈ１を用いたＨ−１パルボウイルスの定量をＥＬＩＳＡによって評価した。最初の結果は、キャプシドとウイルスゲノム含有粒子との比率が約５であることを示している（図８、下方部分）。使用した二次抗体の３種の濃度（０．１μｇ／ｍｌ〜０．７５μｇ／ｍｌ）は、回収率における有意差を示さなかった（図８、上方部分）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。当該抗体は、様々な診断法および治療法、例えばＨ−１パルボウイルス感染症の検出／治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは、ウイルスファミリーのパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の１つの属名である。パルボウイルス属は、ヘルパーウイルスの非存在下で複製可能な多数の小さな正２０面体ウイルスを含んでいる。パルボウイルスは長さ約５，０００ｂｐの一本鎖ＤＮＡを含有している。ＤＮＡの３’および５’末端には、各々１本のパリンドローム（回文）配列が存在する。このＤＮＡは、２つのキャプシドタンパク質であるＶＰ１およびＶＰ２（図１）ならびに２つの調節非構造タンパク質であるＮＳ−１およびＮＳ−２をコードする。後者のタンパク質はリン酸化されており、核または細胞質および核両方の局在をそれぞれ示す。第３のより小さなキャプシドタンパク質であるＶＰ３は、タンパク質分解的開裂によりＶＰ２から引き出される。これら２つのキャプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２は、ＶＰ２コーディング領域がＶＰ１コーディング領域内に完全に含まれるように、重複するオープンリーディングフレームによってコードされる。自然感染では、キャプシドタンパク質は、選択的スプライシングに起因して１：１０のＶＰ１：ＶＰ２比で発現する。近年、ＶＰ１に対して特異的なキャプシドタンパク質の領域（Ｎ末端領域）は、細胞ホスホリパーゼＡと共通するモチーフを含有しており、実際にｉｎ ｖｉｔｒｏでこの活性を発揮することが証明されている。パルボウイルスＶＰ１が類似性を共有するカルシウム依存性の分泌型ＰＬＡ２は、膜の透過による細胞溶解を包含するシグナリング経路に関与する。他方、ＮＳ１は、順にホスホリパーゼを経由して調節される、プロテインキナーゼＣファミリーのメンバーによって調節されることが証明されている。
【０００３】
パルボウイルスは、通常はそれらの自然宿主の集団によって良好に耐容され、その中で明白な病理学的徴候を示すことなく存続する。これは、先天性免疫による胎児および新生児の保護、ならびに成体動物においてはパルボウイルス複製が狭い範囲の標的増殖組織へ顕著に制限されることの両方に起因する。この宿主耐性は、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）ならびにそれらの各天然宿主、つまりマウスおよびラット内のＨ−１ウイルスに関する。
【０００４】
さらに、ヒトは、パルボウイルス、例えばＨ−１パルボウイルスに感染する可能性がある。実際、パルボウイルスは、一般的感染症であり、通常は小児における伝染性紅斑として現れる。この感染症は、通常は軽症であり、健常者においては自己限定性である。しかしパルボウイルスは、成人における反応性関節炎、および血液学的状態もしくは免疫抑制状態の成人における重症貧血もまた誘発することがある。さらに、パルボウイルスは、妊婦約４００例中１例で発症し、胎児消失または胎児水腫を誘発することがある。そこで、特に妊婦におけるパルボウイルス感染症の同定は、モニタリングおよび考え得る治療のために重要である。残念なことに、パルボウイルス感染症の診断／療法のための現行法は改良を必要としており、例えば現時点では、集合Ｈ−１パルボウイルスに対する特異的抗体は入手することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の基礎にある技術的課題は、パルボウイルス感染症またはそれに関連する疾患を診断および治療するための改良された手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記技術的課題の解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施形態を提供することによって達成される。Ｈ−１パルボウイルスを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した後、本発明者らは、抗体産生Ｂ細胞を脾臓から単離し、Ａｇ８骨髄腫細胞と融合させることができた。淘汰圧を用いた３ラウンドの選択後、Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１を単離することができた。
【０００７】
そこで、本発明は、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０００８】
本明細書で使用する用語「抗体」は、完全抗体、または特異的結合に対して完全抗体と競合するその結合フラグメントを意味する。（抗原）結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または完全抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生成される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体ならびに「ディアボディ（二重特異性抗体）」が含まれる。「二重特異性」もしくは「二機能性」以外の抗体は、その各々が同一である結合部位を有すると理解されている。
【０００９】
本明細書で使用する用語「キャプシド」は、「キャプソマー」と呼ばれる、異なる、または同一のタンパク質サブユニットから形成されるウイルス核酸を取り囲むタンパク質の保護膜である。キャプシドは、ウイルスゲノムによってコードされるタンパク質から生成され、その形状は形態学的識別の根拠として役立つ。ウイルスによりコードされたタンパク質サブユニットは、自己集合してキャプシドを形成し、一般にウイルスゲノムの存在を必要とする。パルボウイルスキャプシドは、完全粒子の成熟の一部としてタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。
【００１０】
本明細書で使用する用語「完全キャプシド」は、ウイルス核酸、好ましくは生存ウイルスを含有するパルボウイルスキャプシドを意味する。用語「中空キャプシド」は、包埋された核酸を含まないキャプシドを意味する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、天然Ｈ−１パルボウイルスキャプシドには結合するが、変性キャプシド、例えば界面活性剤もしくは熱を使用することによって変性したキャプシドには結合しない抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。
【００１２】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、中和抗体である。本明細書で使用する用語「中和抗体」は、パルボウイルスの生物学的活性、例えば複製および／または感染性を低減させる、または無効にする抗体を意味する。
【００１３】
いっそうより好ましい実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。Ｈ−１パルボウイルスに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９８５）， ４９５−７）。全キャプシド、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはそれらのフラグメントを使用して哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたはヒトを免疫し、ポリクローナル抗体を産生することができる。所望であれば、免疫原は、担体タンパク質、例えばウシ血清アルブミン、サイログロブリンおよびキーホール リンペット ヘモシアニンへ抱合させることができる。宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用すると、免疫学的応答を増加させることができる。当該アジュバントには、フロイントアジュバント、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、登録商標）ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油乳濁剤、キーホール リンペット ヘモシアニンおよびジニトロフェノール）が含まれる。特にヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００１４】
一本鎖抗体を生成するために記載された技術は、Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する一本鎖抗体を産生するために当該技術分野において公知の方法を使用して適合させることができる。関連する特異性を備えるが別個のイディオタイプ組成の抗体は、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからのチェイン シャフリングによって生成することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８ （１９９１）， １１１２０−３）。一本鎖抗体は、さらにまたＤＮＡ増幅法、例えばＰＣＲを使用して、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いて構築することもできる（Ｔｈｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５ （１９９６）, ５０７−１１）。一本鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であってよく、および二価または四価であってよい。四価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５ （１９９７）, １５９−６３に教示されている。二価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｘ ｎｏ９ （１９９４）， １９９−２０６に教示されている。
【００１５】
最も好ましい実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、ブダペスト条約を遵守して、２００９年１１月２５日に番号ＤＳＭ ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって生成される。
【００１６】
本発明はさらに、ブダペスト条約を遵守して、２００９年１１月２５日に番号ＤＳＭ ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって生成される抗体と同一エピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１７】
本明細書で使用する用語「エピトープ」には、抗体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常は分子の化学的活性表面基、例えばアミノ酸もしくは糖側鎖からなり、通常は特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。本発明の抗体は、解離定数が≦１μＭである、好ましくは≦μＭ １００ｎＭである、および最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われている。典型的には、１つのエピトープを形成するために、少なくとも６、８、１０または１２連続アミノ酸が必要とされる。しかし、非連続アミノ酸を包含するエピトープは、より多くの、例えば少なくとも１５、２５または５０アミノ酸を必要とすることがある。
【００１８】
本発明はさらに、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドへの結合について上記で特徴付けた本発明の抗体と競合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１９】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を持っている。抗体／フラグメントは、直接的または間接的に検出可能に、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素を用いて標識することができる。当業者であれば、抗体に結合させるための他の適切な標識を認識でき、またはルーチンの実験を使用して当該の標識を確認することができる。
【００２０】
本発明はさらに、細胞系、すなわち本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞系に関する。好ましくは、この細胞系は、哺乳動物細胞系である。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当該技術分野において周知であり、ＤＳＭＺまたはアメリカン培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が含まれ、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｐ細胞および多数の他の細胞系が含まれる。細菌、酵母、昆虫および植物を含む非哺乳動物細胞もまた組換え抗体を発現させるために使用できる。発現方法は、どの系が最高発現レベルを生成するのか、および所望の結合特性を備える抗体を産生するのかを決定することによって選択される。
【００２１】
当該細胞系によって産生された抗体は、当該技術分野において周知の方法によって精製することができる。例えば、抗体は、パルボウイルスキャプシドまたはパルボウイルスエンベロープタンパク質が結合しているカラムを通過させることによって親和性精製することができる。結合した抗体は、次に塩濃度の高い緩衝液を用いてカラムから溶出させることができる。
【００２２】
最も好ましい細胞系は、ブダペスト条約を遵守して２００９年１１月２５日に番号ＡＣＣ３０３０を付してＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１である。
【００２３】
本発明は、さらに本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸も提供する。本発明の抗体、例えば一本鎖抗体をコードする核酸を、手動もしくは自動ヌクレオチド合成を使用して構築し、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローン化し、および細胞内へ導入して該コード配列を発現させることができる。または、抗体は、例えば繊維状ファージ テクノロジー（Ｖｅｒｈａａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１ （１９９５）, ４９７−５０１）を使用して直接的に産生することができる。
【００２４】
本発明は、さらに本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断用組成物も提供する。当該組成物は、パルボウイルス感染症の診断に有用である可能性がある。さらに、当該組成物は、
（ａ）Ｈ−１パルボウイルス標本およびさらに感染した動物および患者（薬物動態学的ウイルス血症）における、例えばＥＬＩＳＡによるＨ−１パルボウイルスの定量、
（ｂ）細胞内でのＨ−１パルボウイルス集合および輸送の検出、
（ｃ）実験動物、特にラットにおけるＨ−１パルボウイルスによる汚染の検出のために使用することができる。
【００２５】
診断には、完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体を、免疫化学的測定法、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法、免疫組織化学的測定法、免疫沈降法、または当該技術分野において公知の他の免疫化学的測定法において使用できる。競合的結合または免疫放射線測定法のための多数のプロトコールは、当該技術分野において周知である。当該免疫測定法は、典型的には免疫源と該免疫源に特異的に結合する抗体との間の錯体形成の測定を含んでいる。
【００２６】
診断は、特定の免疫測定法には限定されず、同種および異種方法の両方を含むことが意図されている。実施可能な代表的な免疫測定法には、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、比濁阻害免疫測定法（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ）が含まれる。指標成分、もしくは標識基は、対象抗体に付着させることができ、測定装置の利用可能性および適合する免疫測定法によって指示されることが多い方法の様々な使用のニーズを満たすよう選択される。上記に記載した様々な免疫測定法を実施する際に使用可能な一般的技術は、当業者には公知である。
【００２７】
本発明は、さらに本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えばＨ−１パルボウイルス感染症またはそれに関連する疾患を治療するための、該抗体がウイルスを中和する能力（ａｎｔｉｄｏｔ）を使用する方法において使用することができる。
【００２８】
療法には、抗体またはその抗原結合フラグメントは、有効量で、薬学的に許容される担体と組み合わされて存在する。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって毒性ではない任意の担体を含むことが意図されている。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液、例えば水中油型乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。当該担体は、従来の方法によって調製することができる。
【００２９】
本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを、被験者に有効量で投与することができる。「有効量」は、感染症／疾患の経過および重症度に影響を及ぼし、当該病状の低減または緩解をもたらすために十分な抗体またはその抗原結合フラグメントの量を意味する。これらの感染症、疾患または障害を治療および／または予防するために有用な「有効量」は、当業者には公知の方法を使用して決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， ｅｄｓ． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．１−４６（１９７５）を参照されたい）。
【００３０】
最後に、本発明は、さらにＨ−１パルボウイルス感染症または当該感染症と関連する疾患の診断または療法に有用な本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。好ましくは、本キットは、１つ以上の容器、例えばバイアル、試験管などを、その中にきっちりと密封して収容するために区分化されている輸送手段を含み、該容器手段の各々は該分析において使用される個別要素の１つを含んでいる。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識される、または検出可能に標識することができる本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。本キットは、さらに緩衝液を含有する容器および／またはレポーター分子（例えば、酵素もしくは蛍光標識）に結合したレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質、例えばアビジンもしくはストレプトアビジン）を含む容器も有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｈ−１パルボウイルスの免疫沈降反応を示す。 レーン１：ＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させられたＨ−１パルボウイルス。レーン２：ＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を伴わない、免疫沈降反応が生じないＨ−１パルボウイルスを意味する陰性コントロール。レーン３：陽性コントロール：免疫沈降反応方法を用いないＳＤＳ−ゲルおよびウェスタンブロット上のＨ−１パルボウイルス単独。レーン４：タンパク質マーカー。 ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水。ｍＡｂ：ＢＬ−Ｈ１。ａＶＰ：変性Ｈ−１パルボウイルスのウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体。
【図２】図２は、ウェスタンドットブロットを示す。 ウェスタンドットブロットは、天然および変性Ｈ−１パルボウイルスを用いて生成された。ＢＬ−Ｈ１：Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体。ａＶＰ：変性ウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドおよびジチオトレイトールを用いる）。天然：未処理Ｈ−１パルボウイルス。陰性コントロール：Ｈ−１パルボウイルスを含まない。
【図３】図３は、野生型Ｈ−１の分布およびＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体を用いた検出を示す。 モノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１がキャプシド、モノ／オリゴマーキャプシドタンパク質または変性キャプシドタンパク質と反応するか決定するため、細胞抽出物は、ｐＵＣ １９ΔＨｉｎｄＩＩＩでのトランスフェクションの２４時間後に、２９３Ｔ ＨＥＫ細胞から調製した。細胞抽出物は、直線スクロース勾配上で分画させる。 ＢＬ−Ｈ１：Ｈ−１パルボウイルスに対するモノクローナル抗体。ａＶＰ：変性Ｈ−１パルボウイルスのウイルスタンパク質を認識するポリクローナル抗体。プラスミドｐＵＣ１９ΔＨｉｎｄＩＩＩは、完全Ｈ−１パルボウイルスゲノムを含有する。Ｖｇ：リアルタイムＰＣＲによって分析されたウイルスゲノム含有粒子。ＩＵ：感染単位。ＨＡ：完全または中空Ｈ−１パルボウイルスの赤血球凝集反応。
【図４】図４は、ｍａｂ ＢＬ−Ｈ１の免疫蛍光試験（精製７および２１日後のＢＬ−Ｈ１活性の安定性）を示す。 精製後、ＢＬ−Ｈ１抗体を、各々室温、４℃および−２０℃で保存する。活性は、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞上でＩＦ（免疫蛍光）によって２１日後に試験する。陽性コントロールは、ポリクローナル抗体Ｃ８Ｂ１０である。分析は、顕微鏡Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓおよびカメラＡｘｉｏＣａｍＭＲｃ（倍率：４０倍）によって実施する。
【図５】図５は、Ｈ−１パルボウイルスに感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞の中和を示す。 Ｈ−１パルボウイルスの中和は、野生型および組換えＨ−１パルボウイルスの何れかでの１のＭＯＩで、５５０ｎｍ（吸光度５５０ｎｍ）で測定するＭＴＴ測定法によって示されている。０ｎｇ〜５０００ｎｇのＢ１−Ｈ１濃度を試験すると、３Ｅ５〜３Ｅ７のＨ−１パルボウイルス／μｇ（ＢＬ−Ｈ１）に対応した。
【図６】図６は、ｍａｂ ＢＬ−Ｈ１を用いた野生型Ｈ−１ ＰＶの中和を示す。 Ｈ−１パルボウイルスの中和は、１および１０のＭＯＩでのＮＢ−３２４Ｋ細胞上でのプラークアッセイによって示されている。３Ｅ４または１Ｅ５のＨ−１パルボウイルスはいずれも１μｇのＢＬ−Ｈ１で中和された。 ＮＣ＝陰性コントロール。ＰＣ＝陽性コントロール。
【図７】図７は、組換えＨ−１ ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を示す。 １および１０のＭＯＩで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有する組換えＨ−１パルボウイルスは、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞である０ｎｇ〜５０００ｎｇのＢ１−Ｈ１濃度で中和された。ＧＦＰは、４０倍の倍率で分析する。 ＮＢ−３２４Ｋ細胞上でのＢＬ−Ｈ１を用いた感染阻害作用は、一晩（ｏ／ｎ）のＢ１−Ｈ１プレインキュベーションおよびその後のＨ−１パルボウイルスによる感染によって所見されない。
【図８】図８は、Ｈ−１ ＰＶ検出のためのＥＬＩＳＡの開発を示す。 Ｈ−１パルボウイルスキャプシドは、標準曲線を評価するために分光光度計において４５０ｎｍで測定する。現在もなお、３種の異なる濃度（０．７５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌの二次抗体）を使用する。
【００３２】
以下、実施例により本発明を具体的に例示する。
【実施例１】
【００３３】
一般的方法
（Ａ）Ｈ−１パルボウイルスによるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫
マウスを以下のスケジュールに従って免疫した。
（１）注射１週間前
麻酔後、眼窩後穿刺により１５μｌの血液を採取した（陰性コントロール）。
【００３４】
（２）免疫
麻酔：ＰＢＳ中の１００μｌの０．２％塩酸キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ社）およびＰＢＳ中の体重１０ｇ当たり各１０μｇの塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｖａｌｔ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ社）の腹腔内［ｉ．ｐ．］注射。
【００３５】
（３）１．Ｈ−１パルボウイルスの注射
４０％のビジパーク（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ、登録商標）−リンガー液中の１００μｌウイルス（＝７×１０１０ウイルスゲノム含有粒子［Ｖｇ］＝１．２×１０８ＰＦＵ（プラーク形成単位））、
＋５０μｌのＰＢＳ、
＋１５０μｌの不完全アジュバント、
を混合し、４つの相違する位置に各６０μｌを皮下［ｓ．ｃ．］注射。
【００３６】
（４）２．初回注射の１カ月後のＨ−１パルボウイルスの注射
１．注射と同様の手順。
【００３７】
（５）３． 初回注射の２カ月後のＨ−１パルボウイルスの注射
追加免疫：脾臓を摘出する１週間前
１００μｌのウイルス（７×１０１０Ｖｇ＝１．２×１０８ＰＦＵ）
＋２００μｌのＰＢＳの腹腔内［ｉ．ｐ．］注射。
【００３８】
（Ｂ）ハイブリドーマの生成
ハイブリドーマは、以下のスケジュールに従って生成した。
【００３９】
培地：
作業培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社番号Ｒ８７５８）。
ハイブリドーマ培地：５００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ社番号Ｒ８７５８）
＋５ｍｌ Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ社）。
＋５ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン１００００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ社））
＋１０ｍｌの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）（Ｓｉｇｍａ社）
＋５０ｍｌのＦＣＳ（融合試験済み、３０分間５６℃で熱不活性化）。
選択培地：ハイブリドーマ培地＋１０ｍｌのＨＡＴ５０倍濃縮液（Ｇｉｂｃｏ社）。
ＢＭ Ｃｏｎｄｉ−Ｍｅｄ（選択用）１０％。
【００４０】
融合試薬：
ＰＥＧ １５００（Ｒｏｃｈｅ社番号７８３６４１）。
【００４１】
細胞：
Ａｇ８／Ｘ６３（Ｂ細胞腫瘍細胞）。
細胞は、融合の少なくとも１週間前に解凍し、ハイブリドーマ培地中で培養し、融合１日前に分割させた。細胞は、増殖期にあるはずである。
【００４２】
融合：
調製：融合の１〜２日前
融合の１日前：Ａｇ８細胞を分割させる（計１８、増殖期にあるはずである）。
【００４３】
融合日：
全培地および溶液を３７℃に加温する。
【００４４】
Ａｇ８細胞の調製：
Ａｇ８細胞を貯留し、７分間２６４×ｇで遠心し、３０〜４０ｍｌの作業培地中に入れ、細胞を計数する（約１〜２×１０８細胞）。
【００４５】
脾臓の調製：
麻酔後、マウスを致死させ、殺菌するために７０％エタノール中に入れ、無菌ベースにピンで固定し、無菌ピンセットおよび剪刀を用いて脾臓を取り出し、それをシャーレ内の作業培地中へ入れ、心臓を穿刺して血液を採取し、１．５ｍｌ試験管中に収集する。リンパ節に注意を払う。
【００４６】
脾臓細胞：
脾臓は剪刀を用いて数回切断し、無菌対物スライドを用いて脾臓を破砕し（粉砕）、脾嚢を取り出して作業培地を用いて洗浄し、脾嚢を廃棄し、脾細胞をパスツールピペットを用いてホモジナイズし、細胞懸濁液を５０ｍｌ試験管内に収集し、嚢組織をセットし、上清を新しい５０ｍｌ試験管内へ入れ、細胞を２６４×ｇで７分間遠心し、細胞を作業培地で１回洗浄し、細胞を２６４×ｇで７分間遠心し、ペレットを２〜５ｍｌの作業培地中へ取り出し、細胞を計数する（５×１０７〜３×１０８細胞でなければならない）。
【００４７】
脾細胞とＡｇ８細胞との融合：
脾細胞：Ａｇ８細胞＝３：１を５０ｍｌ試験管中で混合し、混合した細胞を２６４×ｇで７分間遠心する。各細胞ペレットは総計１×１０８細胞以下でなければならない。上清を廃棄し、試験管の底部を静かにタッピングすることによってペレットを崩壊させ、連続的に揺らしながら１分間にわたり１ｍｌのピペットを使用して１ｍｌのＰＥＧ １５００をペレットに加える。さらに２分間揺らし続け、３分間連続的に揺らすことによって慎重に１０ｍｌの選択培地を加える。さらに１０ｍｌの選択培地を加え、混合した細胞を１２０×ｇで７分間遠心し、上清を廃棄し、ペレットは試験管の底部を静かにタッピングすることによって崩壊させ、再び洗浄し（さらに１０ｍｌの選択培地を加え、混合した細胞を１２０×ｇで７分間遠心し、ペレットは試験管の底部を静かにタッピングすることによって崩壊させる）、１００μｌの選択培地を備える９６ウエルプレートを調製する（各ウエルは細胞数２×１０５個／ウエル（＝２×１０６個／ｍｌ、２×１０７個／１０ｍｌ））。
【００４８】
Ａｇ８コントロール：
選択培地中に１Ｅ４細胞／ウエルを播種する（およそ２４ウエル以下）。
【００４９】
血液：
３０分後（赤血球凝集反応）、遠心し（５０００×ｇ、１０分間）、新しい試験管中に血清を採取する（陽性コントロール）。
【００５０】
観察：
２〜７日後：ＨＡＴ選択培地中のコントロールＡｇ８細胞（死滅していなければならない）。
１週間後：融合した細胞を供給し、１ウエル当たり１００μｌを取り出し、廃棄し、１００μｌの新鮮ＨＡＴ選択培地を供給する。
２週間後：スクリーニング（１０％のＢＭ ＣｏｎｄｉＭｅｄを備える培地）、免疫蛍光法、ウェスタンドットブロットを開始しなければならない。
【００５１】
選択：
陽性スクリーニングのウエルを選択しなければならない。
１．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
２．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
３．選択：ＰＯＳウエルを平板培養しなければならない。各９６ウエルプレート、５細胞／ウエル、１細胞／ウエル。
【００５２】
（Ｃ）Ｈ−１野生型キャプシドに対するモノクローナル抗体の産生
材料：
７５ｃｍ２または１５０ｃｍ２の無菌フィルターを備えるＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ Ｔ−フラスコ。１０％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン（２．５ｍＭ）、１％のＰ／Ｓ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを備えるＲＰＭＩ培地。ＢＬ−Ｈ１−ハイブリドーマ細胞。ピペット（５、１０、２０ｍｌ）。試験管（１５本、５０ｍｌ）。１ｌのボトル。水浴。そして遠心機。
【００５３】
情報：
ＢＬ−Ｈ１の生成時間：約２７時間。
懸濁細胞。
培地の交換：細胞を含む培地を遠心する：３００×ｇ、１０分間。
Ｂ１−Ｈ１の採取：遠心：５０００×ｇ、５分間。
ＢＬ−Ｈ１細胞増殖は、グルコース濃度が高いほど良好である。
ＲＰＭＩは２ｇ／ｌのグルコースを含有し、３または４ｇ／ｌへの増加は抗体産生を改良することができよう。
２×１０６個／ｍｌまでの細胞密度が可能である。
【００５４】
産生：
７５ｃｍ２のフラスコには１０ｍｌ、１５０ｃｍ２のフラスコには２０ｍｌの細胞懸濁液を入れる。
ＲＰＭＩ培地中でのＢＬ−Ｈ１細胞の培養。開始時の細胞密度：２×１０５個／ｍｌが理想的である。
細胞数１×１０５個／ｍｌも可能であるが、細胞増殖は開始時にはより緩徐である。細胞数３×１０５個／ｍｌも可能であるが、その場合、細胞を２または３日後に分割しなければならず、さもなければ生命力が低下する。
細胞を３日後（任意で４日後）に分割させる。
新鮮培地を備える１５〜２０％の馴化培地は、培地交換後、細胞生存性を増加させる。
【００５５】
（Ｄ）親和性クロマトグラフィーを用いたモノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１の精製
材料：
ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ社、フライブルク）。７０％エタノール（Ｈ２Ｏ中）。２０％エタノール（Ｈ２Ｏ中）。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（平衡バッファー＝バッファーＡ）。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（中和バッファー）。５０ｍｌ試験管。ポリスチレン製丸底試験管。０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．０）（溶出バッファー＝バッファーＢ）。ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ ５ｍｌカラム。
【００５６】
全緩衝液は、ボトルトップ フィルターを用いて濾過しなければならず、室温で１０分間超音波を用いて１００％脱気しなければならない（４８０Ｗ）。
【００５７】
手順：
ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅシステムの使用：最初に本システムを２０％エタノールで洗浄する。試験管Ａおよび試験管Ｂを２０％エタノール中に入れ、「Ｒｕｎ ｓｔｏｒｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ（保存されているメソッドを実行する）」を押し、プログラム１を選択する。その後、試験管にＨ２Ｏを入れ、再びプログラム１を選択する。ここで各試験管に平衡バッファーを満たし、全試験管を接続する。カラムを２０％エタノール中に保管し、平衡バッファーを用いて直ちに洗浄しなければならない。プレッシャーリミットは、０．３ＭＰａである。プロテインＡカラムについての１００％バッファーＡ（＝０％バッファーＢ）の流速は、５ｍｌ／分である。代替のプロテインＧ：１ｍｌ／分（直列カラムの量とは無関係）。
【００５８】
クロマトグラフィーは、メインメニューの「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアルで操作する）」で実行しなければならない。洗浄および装填のために、以下の条件を使用する。
メソッド ベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（０％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００５９】
クロマトグラフィーは、メインメニューの「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアル操作で作動する）」で実行しなければならない。カラムは、ＵＶベースライン値が持続する限り、緩衝液を用いて洗浄しなければならない。カラムに充填する前に、マニュアル操作での作動で「ａｕｔｏ ｚｅｒｏ（オートゼロ）」に入るが、これはＵＶベースライン値をゼロにリセットする。試験管Ａを通して「抗体培地」を負荷する。このため、試験管Ａを「抗体培地」内に入れ「ｂｒｅａｋ（中断する）」で保持する。さもないとシステム内に気泡が流入する。その後「ｃｏｎｔｉｎｕｅ（再開する）」を押す。最後に「ｂｒｅａｋ（中断する）」を押し、試験管Ａに戻し、洗浄のために「ｃｏｎｔｉｎｕｅ（再開する）」を押す。ＵＶベースライン値がほぼゼロである限り洗浄する。装填および洗浄中の素通り画分は追加ボトル内に収集しなければならない（カラムが過負荷になっている場合：これはＵＶシグナルの追加の増加を通して見ることができよう）。そこで、素通り画分は、二度目に使用することができよう。
【００６０】
１００％バッファーＢへ目を向けると、他の全てのパラメーターは同一である。
メソッドベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（１００％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００６１】
バッファーＢがカラムに達すると、抗体の溶出が直ちに始まる。ＵＶシグナルが強度に増加する。画分は、フラクションコレクターチューブを通して収集できよう。異なる抗体濃度のために、少なくとも２つの画分を収集することが推奨されている。
【００６２】
画分を手作業で収集するため、「Ｍａｎｕａｌ Ｒｕｎ（マニュアル操作で作動する）」の「ｓｅｔ ｅｖｅｎｔ ｍａｒｋ（イベントマークを設定する）」を設定して開始時および終了時を見ることができよう。溶出された画分は、中和バッファーを用いて直ちにｐＨ１にしなければならない。第１画分は今も少量のバッファーＡを含有している可能性があるので、前もって中和バッファーの量を知ることは容易でない。不安定性を回避するために極めて迅速にｐＨ紙を用いてチェックしなければならない。１００％Ｐｕｆｆｅｒ Ｂについての推奨値。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ピークがベースライン値になった後、バッファーＡへ切換える。
メソッド ベースを設定する（ｍｌ）。
濃度％Ｂを設定する（０％）。
グラジエントを設定する（オフ）。
流速を設定する（Ａ：１ｍｌ／分、Ｂ：５ｍｌ／分）。
フラクション ベースを設定する（ｍｌ）。
フラクション サイズを設定する（０）。
プレッシャーリミットを設定する（０．３ＭＰａ）。
バッファーバルブ ポジションを設定する（Ｐｏｓ １）。
インジェクションバルブ ポジションを設定する（ｌｏａｄ）。
実行を開始する。
【００６５】
カラムおよびシステムの保管は２０％エタノール中で行わなければならない。システム全体を洗浄しなければならない［プロトコールＰ−１９−２Ａを参照されたい］。
【００６６】
（Ｅ）Ｈ１−キャプシド−ＥＬＩＳＡ
材料：
・フレキシブルプレート、９６ウエル、Ｕ−ボトム、蓋なし、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社。マイクロプレート用蓋、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ社。ウシ乳汁由来カゼイン、Ｓｉｇｍａ社。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）。ＰＢＳ（Ｈ２Ｏ中）。コーティング用：ＢＬ−Ｈ１画分Ｅ１、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した０．１Ｍグリシン緩衝液中の２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ２Ａ ＢＬ−Ｈ１（１０ｍｇ／ｍｌの全タンパク質、ＩｇＧ２Ａ＋異種（ｆｏｒｅｉｇｈｎ）タンパク質）、４℃で保管。検出用：リン酸ナトリウム緩衝液中のＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰ、およそ１ｍｇ／ｍｌ、−２０℃で冷凍、試験管１本当たり１０μｌ。標準物質：４０％のビジパーク（商標）中のＨＶ Ｐｏｏｌ ｇｒｅｅｎ １−２／１−３／３−３／４−２／４−３／５−２／６−２／７−２ １．５×１０１１Ｖｇ／ｍｌ、７．５×１０１１キャプシド／ｍｌ、４℃で保管。陽性コントロール：４０％のビジパーク（商標）中のＰ＃３０／０７β、９．１×１０１１Ｖｇ／ｍｌ（推定〜１×１０１３キャプシド／ｍｌ）、４℃で保管。光学接着カバー（Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。ＴＭＢ、ＥＬＩＳＡのための超緩徐、液体物質システム、Ｓｉｇｍａ社、４℃で保管。停止液：室温で保管した１Ｎ Ｈ２ＳＯ４。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸマイクロタイタープレート光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社。
【００６７】
緩衝液：
洗浄バッファー：ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を加える（ウェスタン（ドット）ブロット用のストック液を参照されたい）。
コーティング液：使用直前に調製する。Ｅ１をＰＢＳ（Ｈ２Ｏ中）中で２．５μｇ／ｍｌへ希釈する、これは１：８００を意味する。１プレート当たり１０ｍｌの希釈液。
ブロッキングバッファー（ＢＢ）：ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌカゼイン＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）。常に新しく調製する。
４００ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を〜５０℃に（マイクロウェーブで４０〜５０秒間）加熱し、それをビーカー内へ注入し、必要量のカゼインを加える。３０分間加熱しながら、全てが溶解するまでおよそ５０℃で１時間まで攪拌する。使用のためには、水浴中で３７℃へ冷却する。１プレート当たり１００ｍｌで十分である。
検出：使用直前に調製する。ＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰ（二次抗体）をブロッキングバッファー中で０．１ｇ／ｍｌへ希釈する、これは１：１０，０００を意味する。１プレート当たり１０ｍｌの希釈液。
標準物質：ＨＶ ｐｏｏｌ ｇｒｅｅｎを２．５×１０９〜３．９１×１０７キャプシド／ウエルの標準物質へ希釈する。２つの標準物質列については、６００μｌの２．５０×１０９（ｄｏｕｐｌｅｘ）キャプシド／ウエル標準物質をストック標準物質からブロッキングバッファー中での１：３０（２．５×１０１０キャプシド／ｍｌ）希釈によって調製する。３００μｌのブロッキングバッファーを６本の１．５ｍｌ試験管へ加え、１．２５Ｅ＋０９、６．２５Ｅ＋０８、３．１３Ｅ０＋８、１．５６Ｅ＋０８、７．８１Ｅ＋０７、３．９１Ｅ＋０７キャプシド／ウエルと表示する。３００μｌの各標準物質を次の試験管に加え、各移行間にボルテックスミキサーにかけて連続希釈を実施する。ＰＢＳは、ブランクとして機能する（ブロッキングバッファーも使用することができる）。
陽性コントロール：ＢＢ中１：７００に希釈すると、およそ４．２×１０９キャプシド／ウエル、各々最初は２．９×１０１２キャプシド／ウエル。１プレートに付きコントロールを含む少なくとも４ウエルを実施する。Ｐ＃３０／０７βについての陰性コントロールは、４０％のビジパーク（商標）をＢＢ中１：７００に希釈する。
【００６８】
実行：
第０日
午後：フレキシブルプレートを１００μｌ／ウエルのコーティング液で一晩４℃にてコーティングする。マイクロプレート用の蓋を用いてプレートを閉じる。この作業は、ウエルの液体を蓋に押し出さないように慎重に実施する。
【００６９】
第１日
または、プレートを午前中、室温で２時間インキュベートすることでコーティングすることができる。
１．ブロッキングバッファーを上述したように調製する。コーティング液は、残っているコーティング液を全て除去するために吸収紙上で反転させて吸い取ることによってプレートから除去する。２００μｌ／ウエルのブロッキングバッファーを加え、プレートを蓋で閉じ、３７℃で１時間インキュベートする。
２．プレートのブロッキング中、上述したように標準物質および陽性コントロールを調製する。サンプル希釈のためにＶｇ／ｍｌ力価によってキャプシド数／ｍｌを推定する。より広い範囲をカバーするためにほぼ推定値の数種の希釈液を作製する。バッファーを用いてサンプルマトリックスの陰性コントロールを調製する（サンプルの希釈に注意を払う！）。
３．ウエルを吸引し、２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて２回洗浄する。最終洗浄後、プレートを反転させて、残っている緩衝液を全て取り除くために吸水性のペーパータオルで吸い取る。
４．ここから、プレートを用いる全ての工程は無菌フード下で行う。１００μｌの標準物質、陽性コントロール、各陰性コントロールまたはサンプルを各ウエルに加える。プレートを蓋で閉じる。３７℃で１時間インキュベートする。
５．陽性コントロール、各陰性コントロールまたはサンプルを、異なるサンプル毎にチップを交換しながらピペットで取り除く。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄する。最終洗浄後、プレートの表面をペーパータオルで乾燥させる。廃棄物をビーカー内に収集する。
６．１００μｌ／ウエルの希釈ＢＬ−Ｈ１−ＨＲＰを各ウエルに加える。プレートを蓋で閉じ、３７℃で１時間インキュベートする。
７．検出抗体を１２チャンネルピペットを用いて取り出す。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーを用いて４回洗浄する。最終洗浄後、プレートの表面をペーパータオルで乾燥させる。できる限り多くの液体を取り除く努力をする。廃棄物を無菌フード下でビーカー内に収集する（１２チャンネルピペットを使用することができる）。
８．依然として無菌フード下で、１００μｌ／ウエルのＴＭＢ溶液を各ウエルに加え、室温の暗所でおよそ１５分間インキュベートする。およそ１０分後に反応強度が申し分ないかチェックする。
９．１００μｌ／ウエルの停止液を各ウエルに加えることによって反応を停止させる。プレートを光学接着カバーで密封する。
１０．反応を停止させるため３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を読み取る。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸマイクロタイタープレート光度計を使用する。結果の選択的補正のために、プレートを５５０ｎｍおよび５９５ｎｍで追加して読み取る。
【００７０】
追加の勧告：
ブロッキングは、一晩より長い時間実施してはならない。インキュベーション時間が長くなると凝集体の形成などが生じる。ウイルスおよび抗体の全希釈液は、使用直前に調製しなければならない。ウエルは、結合した抗体の消失を回避するため慎重に洗浄しなければならない。さらに、各列には同一時間工程でＴＭＢを加えることが重要である。反応を停止させるため、２つの列間の変動を最小限に抑えるため、同一時間工程を使用しなければならない。残っている液体をピペットで取り除く場合は、結合した反応物質の消失を回避するために、ウエルの底部に極めて軽く触れるだけでこすってはならない。３７℃でのプレートのインキュベーションは、ポリスチレンが弱熱導体であるため、周辺効果を誘発することがある。このため、分析の実施中にはブロッキングバッファーを３７℃に維持することが重要である。これにより、周辺効果を下方レベルへ抑えることができる。標識された二次抗体は、使用後に再冷凍してはならない。再冷凍は、シグナルの低強度を引き起こすことがある。カゼインを含有するブロッキングバッファーは、−２０℃で冷凍すれば少なくとも４週間保管することができる。この希釈手順は、間違えると結果が不正確になるので、慎重に実施しなければならない。多数回の希釈を次々に実施しなければ、極めて正確に実施することができる。
【実施例２】
【００７１】
Ｈ−１キャプシドに対するＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体の特性付け
ＢＬ−Ｈ１抗体がＨ−１パルボウイルスを免疫沈降させる能力を評価するため、抗体およびパルボウイルスを一緒に３７℃で一晩インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡセファロースによって沈降させ、ウェスタンブロッティングによって変性ウイルスタンパク質に対する抗体を使用して分析した。これは、ＢＬ−Ｈ１抗体が集合Ｈ−１パルボウイルスキャプシドを認識することを証明している（図１）。
【００７２】
この同定を特性付けるために、天然または変性Ｈ−１パルボウイルス何れかをニトロセルロース膜へ移した（図２）。ＢＬ−Ｈ１抗体は天然粒子しか認識しないが、ポリクローナル抗体は変性キャプシドを認識する。
【００７３】
ＢＬ−Ｈ１抗体がキャプシドと、または天然ウイルスタンパク質とも反応するか決定するために、キャプシドタンパク質発現プラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出物を調製し、直線スクロース勾配上で分画させた（図３）。ＢＬ−Ｈ１は、中空および完全Ｈ−１パルボウイルス粒子に対応する画分８〜１８の間でピークを示す。完全または中空キャプシドは、赤血球凝集を介して実証される（画分８〜１７）。完全キャプシドは、ウイルスゲノム含有粒子（画分１０〜１７）および感染単位を介した活性粒子（画分１２〜１８）によって決定される。これとは対照的に、非集合ウイルスタンパク質は、ウイルスタンパク質に対する抗体での画分３〜１４において検出された。最後に、ＢＬ−Ｈ１と非変性ならびに変性キャプシドタンパク質との間に反応性は見られない。ＢＬ−Ｈ１は、集合Ｈ−１パルボウイルスキャプシド上に存在する立体構造エピトープを特異的に認識する。全てまとめると、これは、ＢＬ−Ｈ１が集合粒子によってのみ表示される構造的エピトープを認識することを証明している。
【００７４】
図４は、感染したＮＢ−３２４Ｋ細胞におけるＨ−１産生の免疫蛍光法によるＢＬ−Ｈ１を用いた検出を示している。ＢＬ−Ｈ１抗体は、室温、４℃および−２０℃で保管した場合、少なくとも３週間安定性である。
【００７５】
図５、６および７では、Ｈ−１パルボウイルスのＢＬ−Ｈ１中和能力が証明されている。
【００７６】
ＭＴＴ測定法は、Ｈ−１パルボウイルスとＢＬ−Ｈ１抗体との正しい比率を見つけるために実施した。１Ｅ５までのＨ−１パルボウイルスを中和するには、ＢＬ−Ｈ１は１μｇで十分である（図５）。
【００７７】
プラークアッセイによって決定すると、１Ｅ５ Ｈ−１パルボウイルス当たり１μｇのＢＬ−Ｈ１を用いて９５％の中和を達成することができた（図６）。この中和能力は、さらに緑色蛍光タンパク質を発現する組み換えＨ−１パルボウイルスを用いても証明されている（図７、上方パネル）。ＢＬ−Ｈ１自体が細胞レポーターと相互作用することによって間接的に作用するのではないことを証明するため、ＮＢ−３２４Ｋ細胞をＢＬ−Ｈ１抗体とともに一晩プレインキュベートし、その後Ｈ−１パルボウイルスにより感染させた（図７、下方パネル）。
【実施例３】
【００７８】
Ｈ−１−キャプシドのＥＬＩＳＡ
ＢＬ−Ｈ１を用いたＨ−１パルボウイルスの定量をＥＬＩＳＡによって評価した。最初の結果は、キャプシドとウイルスゲノム含有粒子との比率が約５であることを示している（図８、下方部分）。使用した二次抗体の３種の濃度（０．１μｇ／ｍｌ〜０．７５μｇ／ｍｌ）は、回収率における有意差を示さなかった（図８、上方部分）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、天然Ｈ−１パルボウイルスキャプシドにのみ結合して単離キャプシドタンパク質には結合しない抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
中和抗体である請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＤＳＭＺにおいて番号ＡＣＣ３０３０で寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって産生される請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の前記抗体と同一エピトープに結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドへの結合について請求項１〜４の何れか一項に記載の前記抗体と競合する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
検出可能な標識を有する請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞系。
【請求項９】
ＤＳＭＺにおいて番号ＡＣＣ３０３０で寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１である請求項８に記載の細胞系。
【請求項１０】
請求項３〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断用組成物。
【請求項１２】
パルボウイルス感染症を診断するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
Ｈ−１パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患を治療するための方法において使用するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患を治療するための医薬組成物を調製するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＨ−１パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患の診断または治療のために有用なキット。
【請求項１７】
少なくとも１つの緩衝液をさらに含む請求項１６に記載のキット。
【請求項１】
完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、天然Ｈ−１パルボウイルスキャプシドにのみ結合して単離キャプシドタンパク質には結合しない抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
中和抗体である請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＤＳＭＺにおいて番号ＡＣＣ３０３０で寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１によって産生される請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の前記抗体と同一エピトープに結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
完全または中空Ｈ−１パルボウイルスキャプシドへの結合について請求項１〜４の何れか一項に記載の前記抗体と競合する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
検出可能な標識を有する請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞系。
【請求項９】
ＤＳＭＺにおいて番号ＡＣＣ３０３０で寄託されたハイブリドーマ細胞系ＢＬ−Ｈ１である請求項８に記載の細胞系。
【請求項１０】
請求項３〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断用組成物。
【請求項１２】
パルボウイルス感染症を診断するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
Ｈ−１パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患を治療するための方法において使用するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患を治療するための医薬組成物を調製するための請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むＨ−１パルボウイルス感染症または前記感染症によって誘発される疾患の診断または治療のために有用なキット。
【請求項１７】
少なくとも１つの緩衝液をさらに含む請求項１６に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５１３３５８（Ｐ２０１３−５１３３５８Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２３８６（Ｐ２０１２−５４２３８６）
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００７３０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９６１４
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５１２１５１４０３）
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００７３０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９６１４
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５１２１５１４０３）
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ
【Ｆターム（参考）】
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