ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤
【課題】 線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進して、皮膚の老化に伴う変化（シワ・くすみ・キメの消失・弾力性の低下等）を改善し、あるいは防止することを可能とする。
【解決手段】 ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、又はヒアルロン酸産生促進剤とする。また、これを配合してなる皮膚外用剤、又は抗老化剤とする。
【解決手段】 ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、又はヒアルロン酸産生促進剤とする。また、これを配合してなる皮膚外用剤、又は抗老化剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進する技術に関し、特に植物の抽出物を有効成分とするＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、動物のあらゆる結合組織に存在するグリコサミノグリカンであり、その分子量は数万から数百万といわれている。このヒアルロン酸やその塩類は、人の肌を滑らかにしたり、肌のシワを延ばしたりするなどの効果があることから、従来から化粧品や医薬品の成分として使用されている。
【０００３】
生体内のヒアルロン酸、特に皮膚内のヒアルロン酸は水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つとして知られており、表皮角化細胞に加え真皮線維芽細胞からも合成されることが知られている。また、真皮のヒアルロン酸の機能として、水分保持、弾力性維持、線維芽細胞の増殖、創傷治癒にも関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
生体内のヒアルロン酸合成は、低分子の原料物質からヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳとする）により合成される。生体内のヒアルロン酸合成に関与している酵素は、３つのアイソフォームからなるＨＡＳのみであり、それぞれのＨＡＳをコードする遺伝子として、ＨＡＳ１ｍＲＮＡ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ、ＨＡＳ３ｍＲＮＡが知られている。これらのＨＡＳ遺伝子は、ヒト皮膚線維芽細胞とヒト表皮角化細胞で発現パターンが異なり、線維芽細胞では主にＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっており（非特許文献１）、また表皮角化細胞ではＨＡＳ３ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっている（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、ヒアルロン酸は加齢や皮膚の生理的老化に伴い減少することが知られており、真皮内のヒアルロン酸量の減少が、弾力性の低下、シワ形成等の老化現象に関与している可能性が示唆されている（非特許文献３）。そこで、このような線維芽細胞によるヒアルロン酸等の産生を促進させるために、従来から様々な研究がなされている。
例えば、特許文献１には、吹雲草からの抽出物を用いることで、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進できることが記載されている。また、特許文献２には、ザゼンソウの地上部位から得られた抽出物を用いることで、ヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進した実験結果が示されている。さらに、特許文献３には、マイタケから得られた抽出物を用いることで、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加を介してヒアルロン酸産生を促進した結果が示されている。
【０００６】
【非特許文献１】Yoshinori Sugiyama，Akemi Shimada，Tetsuya Sayo，Shingo Sakai，Shintaro Inoue．Putative hyaluronan synthase mRNA are expressed in mouse skin and TGF-β upregulates their expression in cultured human skin cells．J. Invest. Dermatol. 110：116-121，1998．
【非特許文献２】Tetsuya Sayo，Yoshinori Sugiyama，Yoshito Takahashi, Naoko Ozawa, Shingo Sakai, Osamu Ishikawa, Masaaki Tamura, Shintaro Inoue. Hyaluronan synthase 3 regulates hyaluronan synthesis in cultured human keratinocytes．J. Invest. Dermatol. 118：43-48，2002．
【非特許文献３】佐用哲也．ヒアルロン酸代謝に着目したシワ改善剤へのアプローチ．Fragrance Journal．34(5)：65−71，2004．
【特許文献１】特許第３９３５３６０号公報
【特許文献２】特許第４２０１０９１号公報
【特許文献３】特許第４５８３５０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、植物から得られる抽出物には、線維芽細胞においてＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進し、これによって線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進する効果を奏する有効成分を含有するものが存在している。このため、このような植物を見いだしてその有効成分を抽出し、これを用いることにより皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進して肌の滑らかさの向上やシワの防止に利用することができれば大変有用である。また、このような植物抽出物を、皮膚の老化等に伴う変化（シワ・くすみ・キメの消失・弾力性の低下等）を改善し、あるいは防止するために用いれば、老化防止用の皮膚外用剤、及び抗老化剤として有用なものとなる。
【０００８】
そこで、本発明者らはこのような植物を見いだすべく、鋭意研究した結果、植物生薬であるソウジュツ（蒼朮）（学名：Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物に、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進させる作用があり、またこれによって線維芽細胞のヒアルロン酸の産生を促進させる作用があることを発見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ソウジュツからの溶媒抽出物を有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソウジュツの溶媒抽出物を有効成分として含有するものとしてある。
また、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、ソウジュツの溶媒抽出物を有効成分として含有するものとしてある。
【００１０】
また、本発明の皮膚外用剤は、上記ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は上記ヒアルロン酸産生促進剤を配合してなるものとしてある。
また、本発明の抗老化剤は、上記ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は上記ヒアルロン酸産生促進剤を配合してなるものとしてある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進させることができるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びこのような線維芽細胞におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現促進を介して、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させることにより、肌の老化を改善又は抑制することが可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供することが可能となる。
また、このようなＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる皮膚外用剤、及び抗老化剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態及び実施例の内容に限定されるものではない。
【００１３】
［ソウジュツ］
ソウジュツ（蒼朮）（学名：Atractylodis Lanceae Rhizoma）は、キク科のホソバオケラ（Atractylodes lancea De Candolle又はAtractylodes chinensis Koidzumi（Compositae））、オケラ（Atractylodes japonica）、オオバナオケラ（Atractylodes ovate De Candolle）等の根茎を加熱又は天日乾燥した生薬である。
本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤を製造するにあたっては、特にホソバオケラから得られたソウジュツを用いることが好ましい。
【００１４】
［ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤，ヒアルロン酸産生促進剤］
本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤は、ソウジュツから溶媒抽出法によってＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質を抽出することにより得ることができる。このＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質によって、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現量が増加することで、線維芽細胞のヒアルロン酸産生が促進される。したがって、このＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加物質は、ＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸の産生を促進するヒアルロン酸産生促進物質でもある。
この溶媒抽出処理は、一般的な方法により行うことができる。例えば、ソウジュツを抽出溶媒に浸漬し、これを静置又は撹拌することにより行うことができる。
【００１５】
抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒（メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール）、又はこれらの混合液を用いることができる。好ましい抽出溶媒は、水もしくは低級アルコールの単独の溶液、又は水と低級アルコールの混合液であり、水と低級アルコールの混合液が特に好ましい。
【００１６】
抽出溶媒として混合液を使用する場合、その混合比は、適宣調整することができる。
例えば、水と親水性有機溶媒の混合比を、容量比で１０：９０〜９０：１０とすることにより抽出処理を好適に行うことが可能である。
【００１７】
また、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤における原料のソウジュツの抽出溶媒に対する混合比（重量ｇ/容量ｍｌ）は、１／５００〜１／２とすることが好ましい。１／５００未満にすると、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進効果を十分に得ることができず、したがってヒアルロン酸産生促進効果も十分に得られず、また１／２より大きい場合には、原料の高い濃度の影響により返ってＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現及びヒアルロン酸の産生が阻害されることがあるためである。このような観点から抽出溶媒に対するソウジュツの混合比は、１／１００〜１／５とすることがより好ましく、１／２０〜１／５とすることがさらに好ましい。
【００１８】
なお、以下の実施例では、抽出溶媒に対するソウジュツの混合比が１／２０〜１／５の場合、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を、線維芽細胞を播種したディッシュに添加した場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は、添加しない場合に比較して３．５〜４倍程度向上することが示されている。
また、同様に、抽出溶媒に対するソウジュツの混合比が１／２０〜１／５の場合、本実施形態のヒアルロン酸産生促進剤を、線維芽細胞を播種したディッシュに添加した場合のヒアルロン酸産生促進率は、添加しない場合に比較して２．５〜３．５倍程度向上することが示されている。
【００１９】
抽出温度は、通常は抽出溶媒の沸点以下の温度にする必要があり、特に５〜５０℃とすることが好ましい。
抽出時間は、抽出温度が室温付近の場合、１〜１０日間とすることができ、２〜５日間とすることが好ましい。
【００２０】
以上のようにしてソウジュツから得られた抽出物は、そのままでもＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤として用いることができる。また、得られた抽出物を濃縮、乾固したものを、水や極性溶媒に再度溶解したり、あるいはＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用又はヒアルロン酸産生促進作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や分画処理を行った後に、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤として用いることも可能である。
【００２１】
［皮膚外用剤，抗老化剤］
本実施形態の皮膚外用剤及び抗老化剤は、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を増加させることで、ヒアルロン酸産生を促進し、これによってヒアルロン酸の減少により生じる皮膚の老化に伴う変化（シワ・くすみ・キメの消失・弾力性の低下等）を改善し、あるいは防止する作用を奏するものとなっている。また、皮膚に適用した場合の使用感と安全性にも優れている。
また、本実施形態の皮膚外用剤と抗老化剤の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、口紅、入浴剤等に用いることが可能である。また、皮膚外用剤と抗老化剤におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤の配合量は、皮膚外用剤と抗老化剤の種類や、抽出したＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質又はヒアルロン酸産生促進物質の生理活性等によって適宣調整することができる。例えば、当該抽出物の配合量を皮膚外用剤又は抗老化剤全量中に、１０重量％程度以下となるように配合することが好ましい。
【００２２】
さらに、本実施形態の皮膚外用剤及び抗老化剤には、ヒアルロン酸産生促進作用の妨げにならない限り、皮膚外用剤や抗老化剤の製造に通常使用される油性成分、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、増粘剤、アルコール類、顔料、香料、酸化防止剤、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧品原料や、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、活性酸素消去剤、皮膚細胞賦活剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等の生理活性成分も含有させることができる。
【００２３】
以上説明したように、本実施形態によれば、皮膚の老化に伴う変化を改善あるいは防止する作用を有し、皮膚に適用した場合の使用感と安全性、及び老化防止効果に優れたＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤を提供することが可能となっている。
【実施例】
【００２４】
以下、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の効果を評価するための実施例及び試験例と、皮膚外用剤及び抗老化剤の配合例について説明する。
【００２５】
（製造例１）
ソウジュツ（株式会社紀伊国屋漢薬局製）３０ｇを、５０容量％エタノール水溶液３００ｍＬに浸漬し、室温で２日間静置した。その後、不溶物をろ別除去し、４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥して、抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤）８．８ｇを得た。
この抽出物をＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）とＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の混合液（容量比５０：５０）に溶解して濃度を調整し、これを試料として用いて以下の試験を行った。
【００２６】
（試験例１）ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られたソウジュツ抽出物について、以下のようにしてＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００２７】
（１）細胞培養と試料の添加
０．５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、GIBCO社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、３５ｍｍディッシュ５枚に、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ２×１０５個となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で一晩培養した。
また、上記抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤）を、各１，５，１０，２０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含有する、ＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、各混合液を培地量の１／１００量になるように溶解したサンプルを準備し、それぞれ実施例１−４の試料とした。
さらに、比較例１として、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、試料を溶解していないＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、培地量の１／１００量になるように添加したサンプルを準備した。
【００２８】
２４時間後、実施例１−４及び比較例１ごとに、各サンプルを、上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したディッシュに２ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の下でさらに２４時間培養した。
培養終了後、常法により総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、ディッシュから培地を吸引除去した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、当該キットの操作方法に従い行った。
【００２９】
（２）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ライフテクノロジーズ社製）及びマスターサイクラー（ｅｐ ｒｅａｌｐｌｅｘ，エッペンドルフ社製）を使用して行った。
具体的には、上記抽出により得られた総ＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）を、実施例１−４及び比較例１ごとにそれぞれ１０μＬ用いて、ｃＤＮＡ合成キットの使用方法に従い反応液を調製し、マスターサイクラーにより２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間反応させ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用するｃＤＮＡを合成した。
【００３０】
（３）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ２遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）を使用した。
センスプライマー：５’−ＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＴ−３’
アンチセンスプライマー：５’−ＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡ−３’
【００３１】
また、内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を使用した。
センスプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴ−３’
アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡ−３’
【００３２】
実施例１−４及び比較例１ごとに、培養した細胞から調製したｃＤＮＡについて、上記プライマーセットを使用して、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム，ライフテクノロジーズ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉ，ライフテクノロジーズ社製）によりリアルタイムＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃で２０秒間保温の後、９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間の反応を４０サイクル繰り返し、１サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００３３】
（４）解析
各サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量にもとづいて、ＨＡＳ２及びＧＡＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成し、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子として、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて上記発光量を相対的に定量した（Applied Biosystems User Bulletin #2．11−15，2001参照）。
【００３４】
以上の試験を、実施例１−４及び比較例１について、それぞれ３回行った。そして、比較例１（試料を含有しない対照）のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の平均値を基準とし、各実施例におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の換算値にもとづいて、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率を算出した。その結果を表１に示す。同表において、各実施例のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示されるように、試料添加濃度が０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率を１００．０％とすると、試料添加濃度が１０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は１１８．３％、試料添加濃度が５０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は３９０．２％、試料添加濃度が１００μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は４１８．８％、試料添加濃度が２００μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は３５４．６％であった。
すなわち、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、５０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で有意にＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現を促進しており、特に１００μｇ／ｍＬの濃度においてその効果は最大となっていた。
【００３７】
（試験例２）ヒアルロン酸産生促進作用試験
製造例１にて得られたソウジュツ抽出物について、以下のようにしてヒアルロン酸産生促進作用を試験した。
【００３８】
（１）細胞培養と試料の添加
０．５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、GIBCO社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、２４ウェルプレートに、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ１ウェルあたり８×１０４個となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で一晩培養した。
また、上記抽出物（ヒアルロン酸産生促進剤）を、各１，５，１０，２０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含有する、ＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、各混合液を培地量の１／１００量になるように溶解したサンプルを準備し、それぞれ実施例５−８の試料とした。
さらに、比較例２として、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、試料を溶解していないＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、培地量の１／１００量になるように添加したサンプルを準備した。
【００３９】
２４時間後、実施例５−８及び比較例２ごとに、各サンプルを、上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したウェルに５００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の下でさらに４８時間培養した。
【００４０】
（２）ヒアルロン酸の測定
培養終了後、実施例５−８及び比較例２ごとに、培養上清を回収してプロナーゼ処理を行った後、ヒアルロン酸結合タンパクを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、培養上清中のヒアルロン酸量を測定した。同時に細胞数を計測し、細胞当たり（１×１０４個当たり）のヒアルロン酸産生量を算出した。プロナーゼ処理、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、及び細胞数の計測は、一般的な手法により行った。
【００４１】
以上の試験を、実施例５−８及び比較例２について、それぞれ３回行った。そして、比較例２（試料を含有しない対照）のヒアルロン酸産生量の平均値を基準とし、各実施例におけるヒアルロン酸産生量の換算値にもとづいて、ヒアルロン酸産生促進率を算出した。その結果を表２に示す。同表において、各実施例のヒアルロン酸産生促進率は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２に示されるように、試料添加濃度が０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率を１００．０％とすると、試料添加濃度が１０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は８６．５％、試料添加濃度が５０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は３０６．１％、試料添加濃度が１００μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は３３８．４％、試料添加濃度が２００μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は２５０．１％であった。
すなわち、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、５０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で有意にヒアルロン酸産生量を促進しており、特に１００μｇ／ｍＬの濃度においてその効果は最大となっていた。なお、試験した濃度範囲内において細胞毒性は認められなかった。
【００４４】
以上の通り、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤によれば、線維芽細胞におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進することができ、また線維芽細胞にヒアルロン酸産生を大きく促進できることが明らかとなった。したがって、これらのＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる皮膚外用剤及び抗老化剤によれば、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進することにより、皮膚の老化に伴う変化を改善できることがわかる。
【００４５】
（配合例）ソウジュツを用いた皮膚外用剤、及び抗老化剤の配合例
以下に、種々の剤型の皮膚外用剤、及び抗老化剤についてのソウジュツの溶媒抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤）の配合例を示す。
［化粧水］
下記組成の化粧水を常法により製造した。
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.2g
グリセリン 5g
1,3-ブチレングリコール 3g
エタノール 3%
イソステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 0.1g
パラオキシ安息香酸メチル 0.12g
クエン酸ナトリウム 0.05g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４６】
［乳液］
下記組成の乳液を常法により製造した。
スクワラン 2g
流動パラフィン 4g
モノステアリン酸グリセリル 2g
ポリオキシエチレンステアリルエーテル(20E.O.) 2.5g
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 2g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
グリセリン 2g
1,3-ブチレングリコール 3g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
パラオキシ安息香酸プロピル 0.1g
カルボキシビニルポリマー 0.05g
水酸化ナトリウム 0.01g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４７】
［クリーム］
下記組成のクリームを常法により製造した。
スクワラン 7g
ホホバ油 3g
ベヘニルアルコール 1g
セタノール 1.5g
メチルフェニルポリシロキサン 1.5g
N-ステアロイル-L-グルタミン酸ナトリウム 0.3g
ポリオキシエチレンステアリルエーテル(20E.O.) 2g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
1,3-ブチレングリコール 5g
グリセリン 2g
ソルビトール 3g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
パラオキシ安息香酸ブチル 0.1g
カルボキシビニルポリマー 0.3g
水酸化ナトリウム 0.05g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４８】
［美容液］
下記組成の美容液を常法により製造した。
デカオレイン酸ポリグリセリル 0.2g
モノオレイン酸ポリグリセリル 1.5g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
グリセリン 4g
1,3-ブチレングリコール 3g
カルボキシビニルポリマー 0.25g
キサンタンガム 0.08g
マルチトール 0.8g
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 0.1g
酢酸dl-α-トコフェロール 0.1g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 3g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記の実施例では、正常ヒト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させる例を示したが、家畜などの動物の皮膚における線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させることもできる。また、ソウジュツ抽出物の有効成分を精製し、これを含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、又はヒアルロン酸産生促進剤とするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、老化防止用の皮膚化粧料等を製造する場合などにおいて、好適に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進する技術に関し、特に植物の抽出物を有効成分とするＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、動物のあらゆる結合組織に存在するグリコサミノグリカンであり、その分子量は数万から数百万といわれている。このヒアルロン酸やその塩類は、人の肌を滑らかにしたり、肌のシワを延ばしたりするなどの効果があることから、従来から化粧品や医薬品の成分として使用されている。
【０００３】
生体内のヒアルロン酸、特に皮膚内のヒアルロン酸は水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つとして知られており、表皮角化細胞に加え真皮線維芽細胞からも合成されることが知られている。また、真皮のヒアルロン酸の機能として、水分保持、弾力性維持、線維芽細胞の増殖、創傷治癒にも関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
生体内のヒアルロン酸合成は、低分子の原料物質からヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳとする）により合成される。生体内のヒアルロン酸合成に関与している酵素は、３つのアイソフォームからなるＨＡＳのみであり、それぞれのＨＡＳをコードする遺伝子として、ＨＡＳ１ｍＲＮＡ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ、ＨＡＳ３ｍＲＮＡが知られている。これらのＨＡＳ遺伝子は、ヒト皮膚線維芽細胞とヒト表皮角化細胞で発現パターンが異なり、線維芽細胞では主にＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっており（非特許文献１）、また表皮角化細胞ではＨＡＳ３ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっている（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、ヒアルロン酸は加齢や皮膚の生理的老化に伴い減少することが知られており、真皮内のヒアルロン酸量の減少が、弾力性の低下、シワ形成等の老化現象に関与している可能性が示唆されている（非特許文献３）。そこで、このような線維芽細胞によるヒアルロン酸等の産生を促進させるために、従来から様々な研究がなされている。
例えば、特許文献１には、吹雲草からの抽出物を用いることで、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進できることが記載されている。また、特許文献２には、ザゼンソウの地上部位から得られた抽出物を用いることで、ヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進した実験結果が示されている。さらに、特許文献３には、マイタケから得られた抽出物を用いることで、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加を介してヒアルロン酸産生を促進した結果が示されている。
【０００６】
【非特許文献１】Yoshinori Sugiyama，Akemi Shimada，Tetsuya Sayo，Shingo Sakai，Shintaro Inoue．Putative hyaluronan synthase mRNA are expressed in mouse skin and TGF-β upregulates their expression in cultured human skin cells．J. Invest. Dermatol. 110：116-121，1998．
【非特許文献２】Tetsuya Sayo，Yoshinori Sugiyama，Yoshito Takahashi, Naoko Ozawa, Shingo Sakai, Osamu Ishikawa, Masaaki Tamura, Shintaro Inoue. Hyaluronan synthase 3 regulates hyaluronan synthesis in cultured human keratinocytes．J. Invest. Dermatol. 118：43-48，2002．
【非特許文献３】佐用哲也．ヒアルロン酸代謝に着目したシワ改善剤へのアプローチ．Fragrance Journal．34(5)：65−71，2004．
【特許文献１】特許第３９３５３６０号公報
【特許文献２】特許第４２０１０９１号公報
【特許文献３】特許第４５８３５０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、植物から得られる抽出物には、線維芽細胞においてＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進し、これによって線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進する効果を奏する有効成分を含有するものが存在している。このため、このような植物を見いだしてその有効成分を抽出し、これを用いることにより皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進して肌の滑らかさの向上やシワの防止に利用することができれば大変有用である。また、このような植物抽出物を、皮膚の老化等に伴う変化（シワ・くすみ・キメの消失・弾力性の低下等）を改善し、あるいは防止するために用いれば、老化防止用の皮膚外用剤、及び抗老化剤として有用なものとなる。
【０００８】
そこで、本発明者らはこのような植物を見いだすべく、鋭意研究した結果、植物生薬であるソウジュツ（蒼朮）（学名：Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物に、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進させる作用があり、またこれによって線維芽細胞のヒアルロン酸の産生を促進させる作用があることを発見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ソウジュツからの溶媒抽出物を有効成分として含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、ソウジュツの溶媒抽出物を有効成分として含有するものとしてある。
また、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、ソウジュツの溶媒抽出物を有効成分として含有するものとしてある。
【００１０】
また、本発明の皮膚外用剤は、上記ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は上記ヒアルロン酸産生促進剤を配合してなるものとしてある。
また、本発明の抗老化剤は、上記ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は上記ヒアルロン酸産生促進剤を配合してなるものとしてある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進させることができるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びこのような線維芽細胞におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現促進を介して、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させることにより、肌の老化を改善又は抑制することが可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供することが可能となる。
また、このようなＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる皮膚外用剤、及び抗老化剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態及び実施例の内容に限定されるものではない。
【００１３】
［ソウジュツ］
ソウジュツ（蒼朮）（学名：Atractylodis Lanceae Rhizoma）は、キク科のホソバオケラ（Atractylodes lancea De Candolle又はAtractylodes chinensis Koidzumi（Compositae））、オケラ（Atractylodes japonica）、オオバナオケラ（Atractylodes ovate De Candolle）等の根茎を加熱又は天日乾燥した生薬である。
本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤を製造するにあたっては、特にホソバオケラから得られたソウジュツを用いることが好ましい。
【００１４】
［ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤，ヒアルロン酸産生促進剤］
本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤は、ソウジュツから溶媒抽出法によってＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質を抽出することにより得ることができる。このＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質によって、線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現量が増加することで、線維芽細胞のヒアルロン酸産生が促進される。したがって、このＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加物質は、ＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸の産生を促進するヒアルロン酸産生促進物質でもある。
この溶媒抽出処理は、一般的な方法により行うことができる。例えば、ソウジュツを抽出溶媒に浸漬し、これを静置又は撹拌することにより行うことができる。
【００１５】
抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒（メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール）、又はこれらの混合液を用いることができる。好ましい抽出溶媒は、水もしくは低級アルコールの単独の溶液、又は水と低級アルコールの混合液であり、水と低級アルコールの混合液が特に好ましい。
【００１６】
抽出溶媒として混合液を使用する場合、その混合比は、適宣調整することができる。
例えば、水と親水性有機溶媒の混合比を、容量比で１０：９０〜９０：１０とすることにより抽出処理を好適に行うことが可能である。
【００１７】
また、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤における原料のソウジュツの抽出溶媒に対する混合比（重量ｇ/容量ｍｌ）は、１／５００〜１／２とすることが好ましい。１／５００未満にすると、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進効果を十分に得ることができず、したがってヒアルロン酸産生促進効果も十分に得られず、また１／２より大きい場合には、原料の高い濃度の影響により返ってＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現及びヒアルロン酸の産生が阻害されることがあるためである。このような観点から抽出溶媒に対するソウジュツの混合比は、１／１００〜１／５とすることがより好ましく、１／２０〜１／５とすることがさらに好ましい。
【００１８】
なお、以下の実施例では、抽出溶媒に対するソウジュツの混合比が１／２０〜１／５の場合、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤を、線維芽細胞を播種したディッシュに添加した場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は、添加しない場合に比較して３．５〜４倍程度向上することが示されている。
また、同様に、抽出溶媒に対するソウジュツの混合比が１／２０〜１／５の場合、本実施形態のヒアルロン酸産生促進剤を、線維芽細胞を播種したディッシュに添加した場合のヒアルロン酸産生促進率は、添加しない場合に比較して２．５〜３．５倍程度向上することが示されている。
【００１９】
抽出温度は、通常は抽出溶媒の沸点以下の温度にする必要があり、特に５〜５０℃とすることが好ましい。
抽出時間は、抽出温度が室温付近の場合、１〜１０日間とすることができ、２〜５日間とすることが好ましい。
【００２０】
以上のようにしてソウジュツから得られた抽出物は、そのままでもＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤として用いることができる。また、得られた抽出物を濃縮、乾固したものを、水や極性溶媒に再度溶解したり、あるいはＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用又はヒアルロン酸産生促進作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や分画処理を行った後に、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤として用いることも可能である。
【００２１】
［皮膚外用剤，抗老化剤］
本実施形態の皮膚外用剤及び抗老化剤は、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を増加させることで、ヒアルロン酸産生を促進し、これによってヒアルロン酸の減少により生じる皮膚の老化に伴う変化（シワ・くすみ・キメの消失・弾力性の低下等）を改善し、あるいは防止する作用を奏するものとなっている。また、皮膚に適用した場合の使用感と安全性にも優れている。
また、本実施形態の皮膚外用剤と抗老化剤の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、口紅、入浴剤等に用いることが可能である。また、皮膚外用剤と抗老化剤におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤の配合量は、皮膚外用剤と抗老化剤の種類や、抽出したＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現増加物質又はヒアルロン酸産生促進物質の生理活性等によって適宣調整することができる。例えば、当該抽出物の配合量を皮膚外用剤又は抗老化剤全量中に、１０重量％程度以下となるように配合することが好ましい。
【００２２】
さらに、本実施形態の皮膚外用剤及び抗老化剤には、ヒアルロン酸産生促進作用の妨げにならない限り、皮膚外用剤や抗老化剤の製造に通常使用される油性成分、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、増粘剤、アルコール類、顔料、香料、酸化防止剤、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧品原料や、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、活性酸素消去剤、皮膚細胞賦活剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等の生理活性成分も含有させることができる。
【００２３】
以上説明したように、本実施形態によれば、皮膚の老化に伴う変化を改善あるいは防止する作用を有し、皮膚に適用した場合の使用感と安全性、及び老化防止効果に優れたＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤を提供することが可能となっている。
【実施例】
【００２４】
以下、本実施形態のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚外用剤、及び抗老化剤の効果を評価するための実施例及び試験例と、皮膚外用剤及び抗老化剤の配合例について説明する。
【００２５】
（製造例１）
ソウジュツ（株式会社紀伊国屋漢薬局製）３０ｇを、５０容量％エタノール水溶液３００ｍＬに浸漬し、室温で２日間静置した。その後、不溶物をろ別除去し、４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥して、抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤）８．８ｇを得た。
この抽出物をＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）とＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の混合液（容量比５０：５０）に溶解して濃度を調整し、これを試料として用いて以下の試験を行った。
【００２６】
（試験例１）ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用試験
製造例１にて得られたソウジュツ抽出物について、以下のようにしてＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００２７】
（１）細胞培養と試料の添加
０．５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、GIBCO社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、３５ｍｍディッシュ５枚に、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ２×１０５個となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で一晩培養した。
また、上記抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤）を、各１，５，１０，２０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含有する、ＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、各混合液を培地量の１／１００量になるように溶解したサンプルを準備し、それぞれ実施例１−４の試料とした。
さらに、比較例１として、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、試料を溶解していないＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、培地量の１／１００量になるように添加したサンプルを準備した。
【００２８】
２４時間後、実施例１−４及び比較例１ごとに、各サンプルを、上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したディッシュに２ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の下でさらに２４時間培養した。
培養終了後、常法により総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、ディッシュから培地を吸引除去した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、当該キットの操作方法に従い行った。
【００２９】
（２）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ライフテクノロジーズ社製）及びマスターサイクラー（ｅｐ ｒｅａｌｐｌｅｘ，エッペンドルフ社製）を使用して行った。
具体的には、上記抽出により得られた総ＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）を、実施例１−４及び比較例１ごとにそれぞれ１０μＬ用いて、ｃＤＮＡ合成キットの使用方法に従い反応液を調製し、マスターサイクラーにより２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間反応させ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用するｃＤＮＡを合成した。
【００３０】
（３）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ２遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）を使用した。
センスプライマー：５’−ＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＴ−３’
アンチセンスプライマー：５’−ＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡ−３’
【００３１】
また、内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を使用した。
センスプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴ−３’
アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡ−３’
【００３２】
実施例１−４及び比較例１ごとに、培養した細胞から調製したｃＤＮＡについて、上記プライマーセットを使用して、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム，ライフテクノロジーズ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉ，ライフテクノロジーズ社製）によりリアルタイムＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃で２０秒間保温の後、９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間の反応を４０サイクル繰り返し、１サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【００３３】
（４）解析
各サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量にもとづいて、ＨＡＳ２及びＧＡＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成し、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子として、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて上記発光量を相対的に定量した（Applied Biosystems User Bulletin #2．11−15，2001参照）。
【００３４】
以上の試験を、実施例１−４及び比較例１について、それぞれ３回行った。そして、比較例１（試料を含有しない対照）のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の平均値を基準とし、各実施例におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の換算値にもとづいて、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率を算出した。その結果を表１に示す。同表において、各実施例のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示されるように、試料添加濃度が０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率を１００．０％とすると、試料添加濃度が１０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は１１８．３％、試料添加濃度が５０μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は３９０．２％、試料添加濃度が１００μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は４１８．８％、試料添加濃度が２００μｇ／ｍＬの場合のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率は３５４．６％であった。
すなわち、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤は、５０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で有意にＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現を促進しており、特に１００μｇ／ｍＬの濃度においてその効果は最大となっていた。
【００３７】
（試験例２）ヒアルロン酸産生促進作用試験
製造例１にて得られたソウジュツ抽出物について、以下のようにしてヒアルロン酸産生促進作用を試験した。
【００３８】
（１）細胞培養と試料の添加
０．５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、GIBCO社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、２４ウェルプレートに、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ１ウェルあたり８×１０４個となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で一晩培養した。
また、上記抽出物（ヒアルロン酸産生促進剤）を、各１，５，１０，２０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含有する、ＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、各混合液を培地量の１／１００量になるように溶解したサンプルを準備し、それぞれ実施例５−８の試料とした。
さらに、比較例２として、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、試料を溶解していないＤＭＳＯとＰＢＳの混合液（容量比５０：５０）を、培地量の１／１００量になるように添加したサンプルを準備した。
【００３９】
２４時間後、実施例５−８及び比較例２ごとに、各サンプルを、上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したウェルに５００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の下でさらに４８時間培養した。
【００４０】
（２）ヒアルロン酸の測定
培養終了後、実施例５−８及び比較例２ごとに、培養上清を回収してプロナーゼ処理を行った後、ヒアルロン酸結合タンパクを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、培養上清中のヒアルロン酸量を測定した。同時に細胞数を計測し、細胞当たり（１×１０４個当たり）のヒアルロン酸産生量を算出した。プロナーゼ処理、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、及び細胞数の計測は、一般的な手法により行った。
【００４１】
以上の試験を、実施例５−８及び比較例２について、それぞれ３回行った。そして、比較例２（試料を含有しない対照）のヒアルロン酸産生量の平均値を基準とし、各実施例におけるヒアルロン酸産生量の換算値にもとづいて、ヒアルロン酸産生促進率を算出した。その結果を表２に示す。同表において、各実施例のヒアルロン酸産生促進率は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２に示されるように、試料添加濃度が０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率を１００．０％とすると、試料添加濃度が１０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は８６．５％、試料添加濃度が５０μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は３０６．１％、試料添加濃度が１００μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は３３８．４％、試料添加濃度が２００μｇ／ｍＬの場合のヒアルロン酸産生促進率は２５０．１％であった。
すなわち、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、５０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で有意にヒアルロン酸産生量を促進しており、特に１００μｇ／ｍＬの濃度においてその効果は最大となっていた。なお、試験した濃度範囲内において細胞毒性は認められなかった。
【００４４】
以上の通り、本発明のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤によれば、線維芽細胞におけるＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進することができ、また線維芽細胞にヒアルロン酸産生を大きく促進できることが明らかとなった。したがって、これらのＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる皮膚外用剤及び抗老化剤によれば、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進することにより、皮膚の老化に伴う変化を改善できることがわかる。
【００４５】
（配合例）ソウジュツを用いた皮膚外用剤、及び抗老化剤の配合例
以下に、種々の剤型の皮膚外用剤、及び抗老化剤についてのソウジュツの溶媒抽出物（ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤）の配合例を示す。
［化粧水］
下記組成の化粧水を常法により製造した。
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.2g
グリセリン 5g
1,3-ブチレングリコール 3g
エタノール 3%
イソステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 0.1g
パラオキシ安息香酸メチル 0.12g
クエン酸ナトリウム 0.05g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４６】
［乳液］
下記組成の乳液を常法により製造した。
スクワラン 2g
流動パラフィン 4g
モノステアリン酸グリセリル 2g
ポリオキシエチレンステアリルエーテル(20E.O.) 2.5g
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.) 2g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
グリセリン 2g
1,3-ブチレングリコール 3g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
パラオキシ安息香酸プロピル 0.1g
カルボキシビニルポリマー 0.05g
水酸化ナトリウム 0.01g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４７】
［クリーム］
下記組成のクリームを常法により製造した。
スクワラン 7g
ホホバ油 3g
ベヘニルアルコール 1g
セタノール 1.5g
メチルフェニルポリシロキサン 1.5g
N-ステアロイル-L-グルタミン酸ナトリウム 0.3g
ポリオキシエチレンステアリルエーテル(20E.O.) 2g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
1,3-ブチレングリコール 5g
グリセリン 2g
ソルビトール 3g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 1g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
パラオキシ安息香酸ブチル 0.1g
カルボキシビニルポリマー 0.3g
水酸化ナトリウム 0.05g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４８】
［美容液］
下記組成の美容液を常法により製造した。
デカオレイン酸ポリグリセリル 0.2g
モノオレイン酸ポリグリセリル 1.5g
ソウジュツ50%エタノール抽出物 0.5g
グリセリン 4g
1,3-ブチレングリコール 3g
カルボキシビニルポリマー 0.25g
キサンタンガム 0.08g
マルチトール 0.8g
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 0.1g
酢酸dl-α-トコフェロール 0.1g
ヒアルロン酸ナトリウム1%水溶液 3g
パラオキシ安息香酸メチル 0.2g
精製水 残部（全量を100gとする）
【００４９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記の実施例では、正常ヒト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させる例を示したが、家畜などの動物の皮膚における線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させることもできる。また、ソウジュツ抽出物の有効成分を精製し、これを含有するＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤、又はヒアルロン酸産生促進剤とするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、老化防止用の皮膚化粧料等を製造する場合などにおいて、好適に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項２】
ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
請求項１記載のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は請求項２記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合してなることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項１記載のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は請求項２記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合してなることを特徴とする抗老化剤。
【請求項１】
ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項２】
ソウジュツ（Atractylodis Lanceae Rhizoma）の溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
請求項１記載のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は請求項２記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合してなることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項１記載のＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進剤又は請求項２記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合してなることを特徴とする抗老化剤。
【公開番号】特開２０１２−１５８５２９（Ｐ２０１２−１５８５２９Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７７１３（Ｐ２０１１−１７７１３）
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（３９７０１８５７８）ジュジュ化粧品株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（３９７０１８５７８）ジュジュ化粧品株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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