本発明は、ＨＣＶポリタンパク質の別の領域に由来する少なくとも１つの他のＨＣＶエピトープに融合した、切断された、または全長のＨＣＶ ＮＳ５ポリペプチドおよびＨＣＶ ＮＳ２ポリペプチドの一部を含むＨＣＶ融合ポリペプチドを提供する。融合物は、ＨＣＶに対する免疫応答、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）特異的Ｔ細胞を活性化すること等のＨＣＶに対する細胞性免疫応答を刺激する方法において、使用することができる。方法は、ＨＣＶ特異的免疫原性組成物を開発するためならびにＨＣＶに対して免疫化するためのモデル系において、使用することができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年８月２５日に出願された米国特許出願第６０／８４０，１６２号の利益を主張し、米国特許出願第６０／８４０，１６２号は、その全体が参照として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、核酸がＥ２、ＮＳ２のカルボキシ末端の一部、変異ＮＳ３、ＮＳ４、切断されたＮＳ５および場合によりＨＣＶ由来のコアポリペプチドを含む切断されたＨＣＶ融合タンパク質をコードする、核酸およびタンパク質に関する。タンパク質は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を準備刺激および／または活性化するためならびに診断試薬のために、細胞媒介性免疫応答等の免疫応答を刺激するのに有用である。本発明はまた、ＨＣＶ融合ポリペプチドの生成を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、重要な健康問題であり、世界の人口のおよそ１％がウイルスに感染している。急性感染した個体の７５％より多くが、最終的には、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌を生じる場合がある慢性保菌者状態に進行する。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献３を参照のこと。
【０００４】
ＨＣＶは、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらによって、ＮＡＮＢＨの原因として、最初に同定および特徴付けされた。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、配列を得るための方法のように公知である。例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂのプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ウイルスのフラビウイルス科のメンバーである。系統学的分析基づいて、少なくとも６つの、異なるが関連する遺伝子型のＨＣＶが同定されている（非特許文献５）。ウイルスは、３０００個を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ポリタンパク質は、同時および翻訳後に、構造および非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００５】
具体的には、図１に示されるように、いくつかのタンパク質がＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断生成物の順序および命名は以下の通りである。
ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質、Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と名付けられる）ならびに２つのエンベロープ糖タンパク質、「Ｅ１」（Ｅとしても公知）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知）、ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離させる宿主プロテアーゼによって、触媒される。ＮＳ領域はＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と名付けられる。ＮＳ２はタンパク質分解活性を有する膜内在性タンパク質であり、ＮＳ３と組み合わせて、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を切断し、次に、ＮＳ３ Ｎ末端を生成し、セリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングする役目を果たす。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒されるＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部での自己触媒的切断によって開始される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第８９／０４６６９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／１１０８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１４４３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｌｔｅｒら（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１８９９−１９０５
【非特許文献２】ＲｅｎｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ．（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｍ．Ｍｅｄ．１５３：１６７２−１６７７
【非特許文献３】Ｓｅｅｆｆ（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．６：２０−２７
【非特許文献４】Ｔｏｎｇら（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１４６３−１４６６
【非特許文献５】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９
【非特許文献６】Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２
【非特許文献７】Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５
【非特許文献８】Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１−１７１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＨＩＶのような特定のウイルスに対する医薬品の開発における広範な進歩にもかかわらず、急性ＨＣＶ感染および慢性ＨＣＶ感染の制御における成功は限られている（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅおよびｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：３４７−３５６）。具体的には、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答等の細胞性免疫応答の発生は、ＨＣＶ感染の制御および根絶のために重要であると考えられている。
【０００９】
細胞性免疫応答を発生させることができる免疫原性ＨＣＶ融合タンパク質は、国際公開第２００４／００５４７３号パンフレットならびに米国特許第６，５６２，３４６号明細書；同第６，５１４，７３１号明細書および同第６，４２８，７９２号明細書に記載されている。それにもかかわらず、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答等の免疫応答を刺激するさらなる有効な方法について、当該分野における必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を準備刺激することおよび／または活性化すること等のＨＣＶに対する細胞性免疫応答等の免疫応答を刺激するための試薬および方法を提供することが、本発明の目的である。ＨＣＶ感染の予防および／または治療のための組成物を提供することもまた、本発明の目的である。生物学的試料中のＨＣＶの存在を検出するための診断アッセイにおける使用のための試薬および方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１１】
したがって、一実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でメチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンはアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９はリシンであり、コア配列のアミノ酸１１はアスパラギンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でメチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でメチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でメチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである、単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫原性組成物を対象とする。
【００１９】
別個の実施形態において、本発明は、本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００２０】
全てのＨＣＶタンパク質領域（例えば、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、コア）は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸配列に関して番号付けされる。
【００２１】
さらなる実施形態において、融合ポリペプチド中に存在するＨＣＶポリペプチドは、同じＨＣＶ分離株に由来する。他の実施形態において、融合物中に存在するＨＣＶポリペプチドの少なくとも１つは、融合物中に存在する他のペプチドの少なくとも１つと異なる分離株に由来する。
【００２２】
ある実施形態において、ＨＣＶ融合ポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｊのアミノ酸１７７２〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列からなるコアポリペプチドである、Ｃ末端の切断を含むＨＣＶコアポリペプチドを含む。
【００２３】
さらにさらなる実施形態において、本発明は、上述の実施形態のいずれかによるＨＣＶ融合ポリペプチドを薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含む組成物を対象とする。ある実施形態において、組成物は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体等の免疫原性ＨＣＶポリペプチドを含む。Ｅ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質と別々に提供してもよい。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、被験体に治療有効量の上述のような組成物を投与することを含む、脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を刺激する方法を対象とする。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、
（ａ）上述のようなＨＣＶ融合ポリペプチドの１つ以上をコードするポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それによって宿主細胞中でコード配列が転写および翻訳されることができる、少なくとも１つの調節因子
を含む、組換えベクターを対象とする。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、上述のような組換えベクターを含む宿主細胞の集団を対象とする。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣＶ融合ポリペプチドを生成するための方法を対象とし、方法は、タンパク質を生成するための条件下で上述のような宿主細胞を培養することを含む。本発明はまた、ＨＣＶ Ｅ２アミノ酸配列を融合ポリペプチドのＮ末端に配置することによってＨＣＶ融合ポリペプチドの組換え発現を促進するための方法を含む。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に思い当たるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域を示す、ＨＣＶゲノムの図表示である。
【図２】図２（配列番号３および４）は、代表的な天然の非修飾ＮＳ３プロテアーゼドメインのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊ（配列番号５および６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインが欠失しており、Ｃ末端にコアのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的な修飾された融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＤ３におけるＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１（ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアの１〜１２１）およびＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１（全長ＮＳ５、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアの１〜１２１）の発現レベルの比較を示す。図４Ａは２５℃での発現レベルを示し、図４Ｂは３０℃での発現レベルを示す。レーン１、標準；レーン２、プラスミド対照；レーン３、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン６）；レーン４、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン７）；レーン５、ＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン８）；レーン６、ＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン９）；レーン７、標準。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５ポリペプチドのＣ末端がコアポリペプチドに融合している、代表的な融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むコアポリペプチドに融合している、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５ポリペプチドのＣ末端がコアポリペプチドに融合している、代表的な融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むコアポリペプチドに融合している、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５ポリペプチドのＣ末端がコアポリペプチドに融合している、代表的な融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むコアポリペプチドに融合している、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５ポリペプチドのＣ末端がコアポリペプチドに融合している、代表的な融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むコアポリペプチドに融合している、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５ポリペプチドのＣ末端がコアポリペプチドに融合している、代表的な融合タンパク質の領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むコアポリペプチドに融合している、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、本発明の融合ポリペプチドを生じるために使用される例示的なクローニング戦略を示す。
【図７】図７は、本発明の例示的な融合ポリペプチドの遺伝子構成を示す。
【図８】図８は、本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドでの免疫化に応答してマウス中で生じたＴ細胞のグラフ表示である。
【図９】図９は、本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドでの免疫化に応答してマウス中で生じたＴ細胞のグラフ表示である。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｄは、酵母細胞における本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドの発現の結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｄは、酵母細胞における本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドの発現の結果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｄは、酵母細胞における本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドの発現の結果を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、酵母細胞における本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドの発現の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の例示的なＨＣＶ融合ポリペプチドの遺伝子構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実行は、他に示されない限りは、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を採用する。かかる技術は文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示さない限り、複数の参照を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「ポリペプチド」に対する参照は、２つ以上のポリペプチドの混合物を含む、等。
【００３２】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される。
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、以下に示されるように定義されることが意図される。
【００３３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、最小長の生成物に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマー等が、定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片の両方が、定義によって包含される。用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然の配列に対する、欠失、付加および置換（性質は一般に保存的）等の修飾を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介するように意図的であってもよく、または例えば、タンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーを介するように偶発的なものであってもよい。
【００３４】
「ＨＣＶポリペプチド」は、上記で定義されたように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリペプチドである。ポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はないが、合成的にまたは組換え的に生成してもよい。さらに、ポリペプチドは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９に記載されているＨＣＶの６つの遺伝型のいずれかを有する分離株を含む種々のＨＣＶ株および分離株（例えば、株１、２、３、４等）ならびに新しく同定された分離株およびＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂ等のようなこれらの分離株のサブタイプのいずれかに由来してもよい。多数の保存領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、一般に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列がアラインメントされた場合に、高い程度の配列相同性、例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きいアミノ酸配列相同性を有する。したがって、例えば、用語「ＮＳ５」ポリペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれか由来の天然のＮＳ５、ならびに以下にさらに定義されるようなＮＳ５アナログ、ムテインおよび免疫原性断片をいう。用語「ＨＣＶポリペプチド」は、一般に、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂを含む）、ＮＳ５（ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂを含む）である、ＨＣＶポリタンパク質中に存在する、種々の、個々の同定され、公知のＨＣＶタンパク質をいうために使用される。用語「ＨＣＶ融合ポリペプチド」は、単一の組換えポリペプチド分子中に２つ以上のＨＣＶポリペプチドが存在する、組換えポリペプチドをいうために使用される。
【００３５】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照分子の生物学的に活性のある誘導体またはかかる誘導体の断片をいい、これらは、以下に定義されるように、細胞媒介性免疫応答を刺激する能力等の所望の活性を維持する。修飾されたＮＳ３の場合において、「アナログ」または「ムテイン」は、その天然のタンパク質分解活性を欠いたＮＳ３分子をいう。一般に、用語「アナログ」は、修飾が免疫原性活性を破壊しない限り、天然の分子に対して、１つ以上のアミノ酸付加、置換（一般に、性質は保存的、または修飾されたＮＳ３の場合において、活性タンパク質分解部位で性質は非保存的）および／または欠失を有する天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくとも天然の分子と同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、以下にさらに記載される。
【００３６】
上に説明されるように、アナログは、一般に、性質は保存的である置換、すなわち、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。具体的には、アミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）無電荷で極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単独の置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での類似の保存的な置換は、生物学的活性に対して主要な効果は有さないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または約さらには１５〜２５個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜２５個の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含んでもよい。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定することができる。
【００３７】
「Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチド」によって、全長ＮＳ５ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂ領域全体でなくＮＳ５ｂポリペプチドＮ末端部分を含む、ＮＳ５ポリペプチドが意味される。Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドの具体的な例を下記に提供する。
【００３８】
「修飾されたＮＳ３」によって、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性が破壊される、すなわちプロテアーゼ活性が減少するか、阻害されるか、またはない（非修飾または野生型ＮＳ３と比較して）ような修飾を有するＮＳ３ポリペプチドが意味される。修飾は、天然の分子に対して１つ以上のアミノ酸付加、置換（性質は一般に非保存的）および／または欠失を含み得、ここでＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は破壊されている。プロテアーゼ活性を測定する方法は、以下にさらに議論される。
【００３９】
「断片」によって、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドが意図される。断片は、天然のポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性断片」は、本明細書中に記載されるアッセイによって測定される場合に問題の断片が免疫原性活性を保持する限りは、一般に、エピトープを定義する、全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個以上の連続するアミノ酸残基を含むか、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続するアミノ酸残基を含む。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５個、好ましくは約５〜１０個または１５個、および約１０００個以下のアミノ酸（またはこの間の任意の整数のアミノ酸）の配列をいい、これは、それ自体、またはより大きな配列の一部として、かかる配列に応答して生じる抗体に結合する配列を定義する。断片の長さに臨界的な上限はなく、これは、ほぼ全長のタンパク質配列、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、それが由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際に、ウイルスゲノムは、一定流量の状態にあり、分離株間で比較的高い程度の可変性を示すいくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然の配列に同一な配列、ならびに天然の配列に対する欠失、付加および置換等の修飾（一般に、性質は保存的）を包含する。
【００４１】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して、同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直線状エピトープは、例えば、タンパク質分子の一部に対応する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、ペプチドを固体支持体に依然として付着させながら、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。かかる技術は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載されている。同様に、コンホメーションエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴等によって、アミノ酸の空間的立体配座を決定することによって容易に決定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたもの等の、標準的な抗原性および疎水性親水性指標プロットを使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法、Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８、および疎水性親水性指標プロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２を使用する。
【００４２】
種々のＨＣＶエピトープの説明については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ペプチド構造または関連するハプテンに対するＴ細胞免疫を誘導することができるペプチド構造の特性をいう。Ｔ細胞エピトープは、一般に、ＭＨＣ分子のペプチド結合間隔内の拡大した立体配座を想定する直鎖ペプチド決定因子を含む（Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：５５１−５５７）。ポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩ関連直鎖ペプチド決定因子（一般に５〜１４個の間のアミノ酸長）への変換は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって行われる「抗原プロセシング」と呼ばれる。より具体的には、Ｔ細胞エピトープは、電荷および疎水性親水性を含む一次アミノ酸配列特性ならびにヘリシティー等のある種の二次構造等の短ペプチド構造の局所的な特性によって定義され、これらはポリペプチド全体の折り畳みに依存しない。さらに、ヘルパーＴ細胞によって認識することができる短ペプチドは、一般に疎水性側（ＭＨＣ分子との相互作用について）および親水性側（Ｔ細胞受容体との相互作用について）を含む両親媒性構造であり（Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，編Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら、（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６）、さらに、両親媒性構造はα螺旋立体配置を有する（例えば、Ｓｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３８：２０４−２１２；Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６：２４９８−２５０３を参照のこと）と考えられている。
【００４４】
したがって、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質のセグメントは、多数のコンピュータプログラムを使用して容易に予測することができる（例えば、Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，編、Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら、（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６を参照のこと）。かかるプログラムは、一般に、Ｔ細胞応答を誘導することが公知の配列に対してペプチドのアミノ酸配列を比較し、Ｔ細胞エピトープに必要であると考えられているアミノ酸のパターンについて検索する。
【００４５】
ＨＣＶ抗原（ポリペプチドおよびインビボで発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含む）または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する分子に応答した被験体における体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、「細胞性免疫応答」はＴリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を伴う。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と関連して提示され、細胞の表面上に発現されるペプチド抗原に対する、特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはかかる微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進するのを助ける。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方は、ＨＣＶ感染細胞を殺傷することができる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、表面上にＭＨＣ分子と関連したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、活性に焦点を当てることを助けるように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含むがこれらに限定されない、抗ウイルス性サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって生成される他のかかる分子の生成をいう。
【００４６】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と関連した抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように働くことができる。細胞媒介性免疫応答は、それらの表面に抗原を提示する細胞、またはその付近を対象とする。また、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫化された宿主の将来的な保護を可能にするように生じさせることができる。
【００４７】
特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによる、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによる等の多数のアッセイによって判定してもよい。かかるアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６；および下記の実施例を参照のこと。
【００４８】
したがって、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの生成、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであってもよい。目的の抗原もまた、抗体媒介性免疫応答を誘発する場合がある。したがって、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を含んでもよい：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／また目的の組成物またはワクチンに存在する抗原または抗原（複数）に対して特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、かつ／または抗体−補体、もしくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主に対する保護（すなわち、予防）または症状の軽減（すなわち、治療）を提供するように働き得る。かかる応答は、当該分野において周知である、標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して判定することができる。
【００４９】
「等価な抗原決定基」によって、ＨＣＶの株１、２、３等のＨＣＶの異なる亜種または株由来の抗原決定基が意味され、これらの抗原決定基は、配列の変動に起因して必ずしも同一でないが、問題のＨＣＶ配列における等価な位置に存在する。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列がアラインメントされた場合、高い程度の配列相同性、例えば、６０％より大きい、さらに８０〜９０％より高い相同性等の、３０％より大きい、通常４０％より大きいアミノ酸配列相同性を有する。
【００５０】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下に配置された場合、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによって、および３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって、判定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’に配置され得る。
【００５１】
「核酸」分子または「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含んでもよく、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物もしくは真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）由来のゲノムＤＮＡ配列または原核生物ＤＮＡ、および特に合成ＤＮＡ配列をいうが、これらに限定されない。用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列も捕捉する。
【００５２】
「作動可能に連結される」は、そのように記載される成分が、それらの所望の機能を実行するように構成される要素の配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結される所与のプロモーターは、適切な転写因子等が存在する場合、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。したがって、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、イントロンが転写されるように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００５３】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、その起源または操作により、天然に関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、下記にさらに記載されるように、クローニングされ、次いで、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来遺伝子を発現して、タンパク質を生成する。
【００５４】
「制御因子」は、それが連結しているコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。用語は、プロモーター、転写終結配列、上流の調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域、ならびに適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーを含み、これらは、集合的に、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、それに作動可能に連結される下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５６】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指示し」、次いで、これは、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００５７】
「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を指向することができる集合体をいう。発現カセットは、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）（の転写を指向するように）に作動可能に連結されたプロモーター等の上記のような制御因子を含み、しばしば、同様に、ポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれていてもよい。発現カセットの構成成分に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製開始点）、少なくとも１つの多重クローニング部位、および「哺乳動物」の複製開始点（例えば、複製のＳＶ４０複製開始点またはアデノウイルス複製開始点）を含んでもよい。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」は、挿入のために使用される方法：例えば、直接的な取り込みによる形質転換、トランスフェクション、感染等にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入をいう。トランスフェクションの具体的な方法については、下記をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えば、エピソームとして維持してもよく、または宿主ゲノムに組み込んでもよい。
【００５９】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換された細胞、または形質転換することができる細胞である。
【００６０】
「単離された」は、ポリペプチドに言及する場合、示された分子が、分子が天然に見出される生物全体から分離し、別々であるか、または同じ種類の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然でそれと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然で存在するが、それに関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、より好ましくは、さらに少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％の、同じ種類の生物学的高分子が存在することを意味する。
【００６２】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％またはそれ以上の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００６３】
一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの対応またはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。同一性のパーセントは、それらの配列をアラインメントさせ、２つのアラインメントされた配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって割り、結果に１００を掛けることによる、２つの分子の間の配列情報の直接的な比較によって判定することができる。ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる、ＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ等の、容易に入手可能なコンピュータプログラムを、分析を助けるために使用することができる。ヌクレオチド配列同一性を判定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）、例えば、同様にＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムにおいて入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上記で参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターで容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性のパーセントは、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーで、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して判定することができる。
【００６４】
本発明の状況において同一性のパーセントを確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができ、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または相同性のパーセントを計算するための他の適したプログラムは、当該分野において一般に公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いることができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＮＣＢＩインターネットサイトで容易に見出すことができる。
【００６５】
あるいは、相同性は、相同な領域の間に安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）での消化、および消化された断片のサイズ決定によって、判定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００６６】
「核酸免疫化」によって、インビボにおける免疫原（単数または複数）の発現のために、宿主細胞中に１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子を導入することが意味される。核酸分子は、例えば、注入投与、吸入投与、経口投与、鼻腔内投与および粘膜投与等によってレシピエント被験体中に直接的に導入してもよく、または、エキソビボで、宿主から取り出された細胞中に導入してもよい。後者の場合、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、ここで、核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答を開始することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な除去または完全な除去、のいずれかをいう。処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）に達成してもよい。
【００６８】
「脊椎動物被験体」によって、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種等の非ヒト霊長類を含む、ヒトおよび他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ等の飼育場用家畜；イヌおよびネコ等の家畜哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモット等の齧歯類を含む実験用動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、アヒル、ガチョウ等のような家庭用、野生および狩猟用のトリを含むトリを含むがこれらに限定されない、コルダータ（ｃｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバーが意味される。用語は、特定の年齢を示さない。したがって、成体の個体および新生仔の個体の両方を網羅することが意図される。これらの脊椎動物の全ての免疫系が同様に作動するので、本明細書中に記載される発明は、上記脊椎動物種のいずれにおける使用のためにも意図される。
【００６９】
（ＩＩ．発明を実施するための形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の製剤も処理パラメーターも変動し得るので、特定の製剤にも処理パラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００７０】
本明細書中に記載されたものと類似するかまたは同等な多数の組成物および方法を、本発明の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書中に記載される。
【００７１】
本発明は、ＨＣＶ ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、全長ＨＣＶ ＮＳ５ａポリペプチドおよびＣ末端の切断されたＨＣＶ ＮＳ５ｂポリペプチドの一部を含む、ＨＣＶ融合ポリペプチドに関する。本発明はまた、それをコードするポリヌクレオチドに関する。具体的には、本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、ＨＣＶ ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＨＣＶ ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＨＣＶ ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１を含む。ＨＣＶ融合ポリペプチドは、ＮＳ２配列に先行するアミノ末端にＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５を、および／またはＮＳ５ ２９９０アミノ酸の直後にＨＣＶ ＮＳ５のアミノ酸２９９１〜３０１１を、さらに含んでもよい。本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドを用いて、体液性および／または細胞性免疫応答等の免疫学的応答を刺激して、例えばＨＣＶ特異的Ｔ細胞、すなわちこれらのポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性化する、および／またはヘルパーＴ細胞の産生を誘発する、および／または抗ウイルス性サイトカイン、ケモカイン等の生成を刺激することができる。かかる融合タンパク質によるＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、特に応答と関連するＨＣＶポリペプチドエピトープを同定するための、ＨＣＶワクチンの開発のためのインビトロモデル系およびインビボモデル系の両方を提供する。ＨＣＶ融合ポリペプチドはまた、哺乳動物におけるＨＣＶに対する免疫応答、例えばＣＴＬ応答を発生させるため、ならびに／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を準備刺激して、治療目的または予防目的のいずれかのための抗ウイルス剤を生成するために使用することができる。
【００７２】
したがって、ＨＣＶ融合ポリペプチドは、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するために有用である。ＨＣＶ融合ポリペプチドは、単独で、または１つ以上の細菌性もしくはウイルス性免疫原と組み合わせて使用してもよい。組み合わせは、同じ病原体由来の複数の免疫原、異なる病原体由来の複数の免疫原または同じおよび異なる病原体由来の複数の免疫原を含んでもよい。したがって、細菌性、ウイルス性および／もしくは他の免疫原が、ＨＣＶ融合ポリペプチドとして同じ組成物中に含まれてもよく、または、同じ被験体に別々に投与されてもよい。
【００７３】
さらに、本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドはまた、診断試薬として使用して、生物学的試料中のＨＣＶ感染を検出することができる。
【００７４】
本発明をさらに理解するために、本組成物における使用のためのＨＣＶ融合ポリペプチド、ならびにＨＣＶ融合ポリペプチドの生成、それを含む組成物およびＨＣＶ融合ポリペプチドを使用する方法に関して、以下により詳細な考察を提供する。
【００７５】
（ＨＣＶ融合ポリペプチド）
ＨＣＶ株のゲノムは、およそ９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質に転写される。図１および表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質は、切断の際に、
ＮＨ_２−Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０個の異なる産物を生成する。コアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、１〜１９１位に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムについては、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドは、さらにプロセシングされて、およそアミノ酸１〜１７３のＨＣＶポリペプチドを生成する。エンベロープポリペプチド、Ｅ１およびＥ２は、それぞれ、約１９２〜３８３位および約３８４〜７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、約７４７〜８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質の約８１０〜１０２６位に見出される。ＮＳ２は、ＮＳ３（約１０２７〜１６５７位に見出される）と組み合わせて、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を切断し、次に、ＮＳ３ Ｎ末端を生成し、セリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を遊離させる。約１０２７〜１２０７位に見出されるＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングする働きをする。ヘリカーゼ活性は、約１１９３〜１６５７位に見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（約１６５８〜１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２個のタンパク質（約１７１２〜１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、および約１９７３〜２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１〜３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ連結部での自己触媒による切断よって開始される。
【００７６】
【表１】

本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドは、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチド（本明細書中で「ＮＳ５ｔ」または「ＮＳ５ｔｒ」とも呼ばれる）を含む。具体的には、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、全長ＮＳ５ａポリペプチド、およびＮＳ５ｂポリペプチドのＮ末端部分を含む。Ｃ末端の切断されたポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１配列に関して番号付けされた、アミノ酸２５０５．．．２５５０．．．２６００．．．２６５０．．．２７００．．．２７５０．．．２８００．．．２８５０．．．２９００．．．２９５０．．．２９６０．．．２９７０．．．２９７５．．．２９８０．．．２９８５．．．２９９０．．．２９９５．．．３０００等の後等の、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸２５００とＣ末端との間の任意の位置で切断することができる。分子が、全長ＨＣＶ−１配列に関して番号付けされた、２５００と３０１０との間の任意のアミノ酸で切断されてもよいことは、容易に明らかである。ある特に好ましいＮＳ５ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸２９９０の直後のアミノ酸に対応するアミノ酸で切断され、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列を含む。かかる構築物についての配列は、配列番号８のアミノ酸１〜１０１８位で示される（図５Ａ〜５Ｅ中でアミノ酸１９７３〜２９９０として標識されている）。本発明の融合物は、場合により、発現のためのＮ末端のメチオニンを有する。
【００７７】
Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、単独で、下記の組成物中で、またはＨＣＶポリタンパク質の種々のドメインのいずれか由来の１つ以上の他のＨＣＶ免疫原性ポリペプチドと組み合わせて、使用することができる。さらなるＨＣＶポリペプチドが、別々に、または融合物において提供される。実際に、融合物は、ＨＣＶポリタンパク質の全ての領域を含んでもよい。これらのポリペプチドは、ＮＳ５ポリペプチドと同じＨＣＶ分離株に由来してもよく、または、種々のＨＣＶ遺伝子型のいずれかを有する分離株を含む異なる株および分離株に由来して、広範なＨＣＶ遺伝子型に対して増大した防御を提供してもよい。また、ポリペプチドは、融合物を含むワクチン組成物が使用される特定の地理的領域に固有の特定のウイルスクレードに基づいて選択してもよい。本融合物が、広範な状況においてＨＣＶ感染を治療する効果的な手段を提供することは、容易に明らかである。
【００７８】
したがって、ＮＳ５ｔは、ＮＳ５ｔの、ＨＣＶポリタンパク質中での他のドメイン由来の１つ以上の免疫原性ＨＣＶポリペプチドとの任意の組み合わせ、すなわちＥ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、および／またはコアポリペプチドと組み合わせられたＮＳ５ｔを含む、融合ポリペプチド中に含まれてもよい。好ましくは、ＮＳ５ｔは、ＨＣＶ融合ポリペプチド中で、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびコアポリペプチドの部分、ならびに場合によりＥ２と組み合わせられる。これらの領域は、それらが天然に存在する順序である必要はない。さらに、これらの領域のそれぞれは、同じまたは異なるＨＣＶ分離株に由来してもよい。本明細書中に記載されている種々の融合物中に存在する種々のＨＣＶポリペプチドは、全長ポリペプチドまたはその一部のいずれであってもよい。
【００７９】
融合ポリペプチドを構成しているＨＣＶポリペプチドの部分は、それぞれ一般に、少なくとも１つのエピトープを含み、これは２１５２−ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０（配列番号１）および／または２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８（配列番号２）等の、活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識される。エピトープは、いくつかの方法によって同定することができる。例えば、上記の任意の組み合わせを含む個々のポリペプチドまたは融合タンパク質を、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用する免疫親和性精製によって、単離することができる。次いで、単離されたタンパク質配列は、タンパク質配列全体にわたる、精製されたタンパク質のタンパク質分解性切断によって一連の短いペプチドを調製することによって、スクリーニングすることができる。例えば、１００マーポリペプチドで開始することによって、各ポリペプチドは、ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープの存在について試験することができ、次いで、次第により小さく、重複する断片を、同定された１００マーから試験して、目的のエピトープをマッピングすることができる。
【００８０】
ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープは、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイによって、またはリンパ増殖アッセイによって、同定することができる（実施例を参照のこと）。^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、エピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローニングすることおよび発現ベクターを標的細胞中に形質転換することによって、目的のエピトープを表示する標的細胞を、構築することができる。ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、例えば、融合物中で見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域由来の１つ以上のエピトープを提示する標的細胞を溶解し、かかるエピトープを提示しない細胞は溶解しない。リンパ増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、例えば、融合物中に見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域由来の１つ以上のエピトープとともに培養される場合、増殖するが、ＨＣＶエピトープ性ペプチドの非存在下では、増殖しない。
【００８１】
種々のＨＣＶポリペプチドは、融合タンパク質中に任意の順序で存在してもよい。所望される場合、１つ以上のＨＣＶポリペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上が、ＨＣＶ融合タンパク質中に存在してもよい。複数のＨＣＶのウイルス株が存在してもよく、これらの株のいずれかのＨＣＶポリペプチドを、融合タンパク質中で使用してもよい。
【００８２】
Ｃｏｒｅ、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ遺伝子およびポリペプチドを含む、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域の核酸配列およびアミノ酸配列を含む、多数のＨＣＶ株および分離株の核酸配列およびアミノ酸配列が、決定されている。例えば、分離株ＨＣＶ Ｊ１．１が、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０７２−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載されている。２つの独立した分離株、ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの全コード配列が、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３にそれぞれ記載されている。
【００８３】
ＨＣＶ−１分離株を記載している刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ分離株ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ分離株ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０が、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載されている。ＨＣＶ分離株Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２が、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載されている。ＨＣＶ分離株Ａ、Ｃ、ＤおよびＥが、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ５：２４３−２５４に記載されている。
【００８４】
上記で説明されているように、ＨＣＶ融合ポリペプチドの成分のそれぞれは、同じＨＣＶ株もしくは分離株または異なるＨＣＶ株もしくは分離株から得ることができる。例えば、ＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶの第１の株に由来してもよく、存在している他のＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来してもよい。あるいは、１つ以上の他のＨＣＶポリペプチド、例えば、存在する場合、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、Ｃｏｒｅ、ｐ７、Ｅ１および／またはＥ２は、ＨＣＶの第１の株に由来してもよく、残りのＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来してもよい。さらに、存在するＨＣＶポリペプチドのそれぞれは、異なるＨＣＶ株に由来してもよい。
【００８５】
本融合物における使用のためのＨＣＶ領域由来の種々のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．；国際公開第９４／０１７７８号；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００８６】
例えば、融合物は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチド、およびＮＳ３ポリペプチドを含んでもよい。ＮＳ３ポリペプチドを修飾して、融合物のさらなる切断が阻害されるように、プロテアーゼ活性を阻害または減少させることができる（本明細書中で「ＮＳ３^＊」とも呼ばれる）。ＮＳ３ポリペプチドは、ＮＳ３プロテアーゼドメインの全てまたは一部の欠失によって修飾してもよい。あるいは、プロテアーゼ活性は、プロテアーゼドメインの活性領域内のアミノ酸の置換によって阻害してもよい。最後に、触媒部位が修飾されるような、ドメインの活性領域へのアミノ酸の付加もまた、タンパク質分解活性を阻害する働きをする。
【００８７】
上記で説明されるように、プロテアーゼ活性は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸約１０２７〜１２０７位（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照のこと）、図２の２〜１８２位で見出される。ＮＳ３プロテアーゼの構造、および活性部位は、公知である。例えば、Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。したがって、天然の配列に対する欠失および修飾は、典型的には、分子の活性部位で、またはこの近くで生じる。具体的には、図２の１〜１８２位もしくは２〜１８２位、好ましくは１〜１７０位もしくは２〜１７０位または１〜１５５位もしくは２〜１５５位に存在する１つ以上のアミノ酸に対して、修飾するかまたは欠失を作製することが、望ましい。好ましい修飾は、プロテアーゼを不活性化するために、プロテアーゼの活性部位の触媒的三連構造、すなわち、Ｈ、Ｄおよび／またはＳ残基に対してである。これらの残基は、全長ＨＣＶポリタンパク質に対して番号づけられた、それぞれ１０８３位、１１０７位および１１６５位に存在する（それぞれ図２の５８位、８０位および１４０位）。かかる修飾は、Ｔ細胞エピトープを維持しながら、タンパク質分解性切断を抑制する。ある特に好ましい修飾は、Ｓｅｒ−１１６５の、Ａｌａでの置換である。当業者は、活性を崩壊させるために欠失すべきＮＳ３プロテアーゼの部分を、容易に決定することができる。活性の存在または非存在は、当業者に公知の方法を使用して判定することができる。
【００８８】
例えば、プロテアーゼ活性またはその喪失は、下記で実施例に記載される手順を使用して、ならびに当該分野で周知のアッセイを使用して、判定することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９８８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３−１５８；およびＫｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照のこと。
【００８９】
図３Ａ〜３Ｊは、修飾されたＮＳ３ポリペプチドを含み、ＮＳ３プロテアーゼドメインがＮ末端から欠失しており、Ｃ末端上にＣｏｒｅのアミノ酸１〜１２１を含む、代表的なＨＣＶ融合ポリペプチドを示す。
【００９０】
上記に説明するように、本発明の融合物中のＨＣＶポリタンパク質のコア領域由来のポリペプチドを含むことが、望ましい場合がある。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号づけられる、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１９１位に存在する。全長タンパク質、アミノ酸１〜１６０、例えば、アミノ酸１〜１５０、１〜１４０、１〜１３０、１〜１２０、例えば、アミノ酸１〜１２１、１〜１２２、１〜１２３．．．１〜１５１等のようなその断片、またはアミノ酸１０〜５３、アミノ酸１０〜４５、アミノ酸６７〜８８、アミノ酸１２０〜１３０、または例えばＨｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および第６，１５０，０８７号で同定されているコアエピトープのいずれか間で見出されるエピトープ等の、全長タンパク質のエピトープを含むより小さな断片のいずれかを、本発明の融合物に使用することができる。さらに、国際公開第９９／６３９４１号に記載されるような、ポリタンパク質のコア領域のフレームシフトから生じるタンパク質を使用することができる。本融合物との使用のための、ある特に好ましいコアポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｊのアミノ酸１７７２〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列を含む。このコアポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸Ａｒｇ−９およびＴｈｒ−１１（それぞれ、図３Ａ〜３Ｊの１７８０位および１７８２位）を含むＨＣＶポリタンパク質アミノ酸１〜１２１を含む。図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および８）は、Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドを含み、ＮＳ５のＣ末端がこのコアポリペプチドに融合した、代表的な融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。Ｃ末端の切断されたＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１（配列番号８のアミノ酸１０１９〜１１３９）を含む上述のコアポリペプチドに融合した、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０を含む（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）（配列番号８のアミノ酸１〜１０１８）。
【００９１】
コアポリペプチドが存在する場合、これは、融合物のＮ末端、Ｃ末端および／または内部に存在し得る。特に好ましいのは、以下にさらに記載される、ＩＳＣＯＭ等の特定のアジュバンドとの複合体の形成を可能にするので、Ｃ末端上のコアポリペプチドである。
【００９２】
ＨＣＶ融合物中の他の有用なポリペプチドとしては、ポリタンパク質の任意の種々の領域由来のＴ細胞エピトープが挙げられる。この点において、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７およびＮＳ２は、ヒトＴ細胞エピトープ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）を含み、ワクチン効力を増大させ、複数のＨＣＶ遺伝子型に対する保護レベルを増大させるよう働くこれらのエピトープの１つ以上を含むことが公知である。さらに、異なる遺伝子型由来のエピトープの混合物等の、特異的な、保存されたＴ細胞エピトープの複数のコピーもまた、融合物中で使用することができる。
【００９３】
例えば、ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２領域由来のポリペプチドを、本発明の融合物において使用することができる。Ｅ２は、複数の種として存在し（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）、クリッピングおよびタンパク質分解が、Ｅ２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端で起こり得る。したがって、本明細書中の使用のためのＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号づけられる、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸４０５〜６６１、例えば、４００、４０１、４０２．．．〜６６１、ならびに３８３もしくは３８４〜６６１、３８３もしくは３８４〜７１５、３８３もしくは３８４〜７４６、３８３もしくは３８４〜７４９または３８３もしくは３８４〜８０９、または３８３もしくは３８４から６６１〜８０９の間の任意のＣ末端等のポリペプチドを含んでもよい。好ましくは、アミノ酸３８４〜７１５を含むＥ２ポリペプチドの一部が、ＨＣＶ融合ポリペプチド中に含まれる。好ましくは、Ｅ２ポリペプチド配列は、ＨＣＶ融合ポリペプチドのＮ末端に存在する。
【００９４】
同様に、本明細書中の使用のためのＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、１９２〜３３０、１９２〜３３３、１９２〜３６０、１９２〜３６３、１９２〜３８３、または１９２から３２６〜３８３の間の任意のＣ末端を含み得る。
【００９５】
エピトープを含むＥ１および／またはＥ２の免疫原性断片を、本融合物において使用してもよい。例えば、Ｅ１ポリペプチドの断片は、６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１８５もしくはそれ以上等の約５〜分子のほぼ全長のＥ１ポリペプチドのアミノ酸、または述べられた数の間の任意の整数を含んでもよい。同様に、Ｅ２ポリペプチドの断片は、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００もしくは３５０アミノ酸または述べられた数の間の任意の整数を含んでもよい。
【００９６】
例えば、例えばアミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０にわたる領域等の、Ｅ２の超可変領域由来のエピトープが、融合物中に含まれてもよい。Ｅ２ポリペプチド配列中に組み入れられる特に有効なＥ２エピトープは、ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列を表すコンセンサス配列（配列番号９）
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ等の、この領域由来のコンセンサス配列を含むものである。Ｅ１およびＥ２のさらなるエピトープは、公知であり、例えば、Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号に記載されている。
【００９７】
さらに、Ｅ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失していてもよい。Ｅ１について、一般に、アミノ酸約３７０位以上（ＨＣＶ−１ポリタンパク質の番号づけに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって保持され、したがって増殖媒地中に分泌されない。Ｅ２について、アミノ酸７３１位以上（これもまた、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の番号づけに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって保持され、分泌されない。（例えば、１９９６年２月１５日に公開された、国際公開第９６／０４３０１号を参照のこと）。これらのアミノ酸位置が絶対的ではなく、ある程度変動してもよいことが留意されるべきである。したがって、本発明は、膜貫通結合ドメインを保持するＥ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドならびにアミノ酸約３６９位以下で終結するＥ１ポリペプチドおよびアミノ酸７３０位以下で終結するＥ２ポリペプチドを含む膜貫通結合ドメインの全てまたは一部を欠くポリペプチドの使用を企図する。さらに、Ｃ末端の切断は、Ｎ末端に向かう膜貫通ドメインを超えて延長してもよい。したがって、例えば、例えば３６０位より下に存在するＥ１切断および例えば７１５位より下に存在するＥ２切断もまた、本発明に包含される。必要な全ては、切断されたＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドが、それらの意図された目的のために機能的であり続けることである。しかしながら、特に好ましい切断されたＥ１構築物は、アミノ酸約３００を超えて延長しないものである。最も好ましいのは、３６０位で終結しているものである。好ましい切断されたＥ２構築物は、アミノ酸約７１５位を超えて延長しないＣ末端の切断を有するものである。特に好ましいＥ２切断は、７２５等の、アミノ酸７１５〜７３０のいずれかの後で切断されている分子である。
【００９８】
ある好ましい実施形態において、融合タンパク質は、修飾されたＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、Ｃ末端の切断されたＮＳ５、および場合により、ＨＣＶのコアポリペプチドを含む（ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔまたはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ融合タンパク質、本明細書中で「ＮＳ３^＊４５ｔ」および「ＮＳ３^＊４５ｔＣｏｒｅ」とも名付けられる）。これらの融合ポリペプチドはまた、ＨＣＶ ＮＳ２ポリペプチドの一部、好ましくはアミノ酸１０１８〜１０２６（ＨＣＶ−１ポリタンパク質中のように番号付けされる）由来のＮＳ２部分を含んでもよい。これらの領域は、必ずしもそれらが天然のＨＣＶポリタンパク質中で天然に存在する順序でなくてもよい。したがって、例えば、コアポリペプチドは、融合物のＮ末端および／またはＣ末端にあってもよい。特に好ましい実施形態において、ＮＳ５ｔは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸１９７３〜２９９０を含み、ＮＳ３^＊分子は、通常１１６５位で見出されるＳｅｒのＡｌａでの置換を含み、領域は、以下のＮ末端からＣ末端の順序：ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔまたはＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔで存在する。これらの融合物は、分子のＣ末端にコアポリペプチドを含んでもよい。存在する場合、コアポリペプチドは、好ましくは、図３Ａ〜３Ｊのアミノ酸１７７２〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列を含む。このコアポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸Ａｒｇ−９およびＴｈｒ−１１（それぞれ図３Ａ〜３Ｊの１７８０位および１７８２位）を含む、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含む。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、直前に記載されているＨＣＶ融合ポリペプチドは、ＮＳ３^＊またはＮＳ２に先行して、Ｎ末端にＥ２ポリペプチドを含む。好ましくは、Ｅ２ポリペプチドは、Ｃ末端の切断されたポリペプチドであり、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされた、アミノ酸３８４〜７１５を含む。この融合物は、場合により、上述のようなコアポリペプチドを含んでもよい。
【０１００】
所望される場合、融合タンパク質、またはこれらのタンパク質の個々の成分はまた、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列等の、他のアミノ酸配列、ならびにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびスタフィロコッカスプロテインＡ等の、タンパク質精製において有用なリガンドを含んでもよい。
【０１０１】
（ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
ポリヌクレオチドは、全体より少ないＨＣＶゲノムを含むか、または、上述のようにＣ末端の切断されたＮＳ５を有するポリタンパク質全体の配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡであってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、タンパク質および脂質等の他の成分を含まずに単離される。ポリヌクレオチドは、上述の融合タンパク質をコードし、したがって、ＮＳ５ｔ、およびＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、コア等に由来するポリペプチド等のＨＣＶポリタンパク質の異なる領域由来の少なくとも１つの他のＨＣＶポリペプチドのコード配列を含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは、Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅ、Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ、ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅまたはＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅを含むか、またはこれらからなる、ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、リンカーの配列、シグナル配列等の他のヌクレオチド配列、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびスタフィロコッカスプロテインＡ等のタンパク質精製において有用なリガンドを含んでもよい。
【０１０２】
発現収率を助けるために、ポリタンパク質を発現のための断片に分割することが望ましい場合がある。これらの断片は、本明細書中で記載されるような組成物において組み合わせて使用することができる。あるいは、これらの断片は、発現の後に結合させてもよい。したがって、例えば、ＮＳ３^＊ＮＳ４は、１つの構築物として発現させてもよく、ＮＳ５ｔＣｏｒｅは、第２の構築物として発現させてもよく、２つのタンパク質は、その後組成物に融合または別々に添加してもよい。同様に、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４は、１つの構築物として発現させてもよく、ＮＳ５ｔＣｏｒｅを、第２の構築物として発現させてもよい。上記の組み合わせは、単に代表例であって、任意の組み合わせの融合物が別々に発現され得ることが、理解されるべきである。
【０１０３】
ＨＣＶ融合ポリペプチド中に切断されたＮＳ５（例えば、アミノ酸２９９０で切断されたＮＳ５）を含むことは、しばしば、全長ＮＳ５が含まれたものと比較してより高いレベルの融合ポリペプチドの発現を生じることが、これまでに示されている。ＨＣＶ融合ポリペプチドのカルボキシ末端でのＨＣＶコア配列（例えばコアアミノ酸１〜１２１）の付加が、カルボキシ末端にコア配列のないＨＣＶ融合ポリペプチドの発現レベルより高いレベルの発現を生じることもまた、これまでに示唆されている。本発明者らは、今や、ＨＣＶ融合ポリペプチドのＮ末端での特定のＨＣＶ Ｅ２配列（例えば、アミノ酸３８４〜７１５）の付加によって、Ｎ末端にＥ２配列を含まないものと比較して、融合ポリペプチドの組換え発現レベルが促進されることを見出した。したがって、本発明はまた、ＨＣＶ Ｅ２配列を、融合ポリペプチドのＮ末端で、好ましくはアミノ酸３８４〜７１５（ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされる）に配置することによって、ＨＣＶ融合ポリペプチドの組換え発現を促進する方法を提供する。Ｎ末端でのＥ２アミノ酸配列のかかる配置は、Ｅ２コード配列を融合ポリペプチドの５’末端に融合させることによって、達成することができることが、明らかであろう。
【０１０４】
種々のＨＣＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、ＨＣＶに感染した個体の血漿、血清、もしくは肝臓ホモジネートに存在する核酸配列に由来するゲノムライブラリーから単離してもよく、または例えば自動合成機を使用して、実験室において合成してもよい。ＰＣＲ等の増幅方法を使用して、ＨＣＶゲノムＤＮＡまたはそれをコードするｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅してもよい。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、天然に存在するこれらのポリペプチドについてのコード配列を含むが、または天然に存在しない人工配列であってもよい。これらのポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学技術を用いてライゲートさせて、融合タンパク質のコード配列を形成させてもよい。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適した発現系において発現することができる発現ベクターに導入してもよい。種々の細菌、酵母、哺乳動物および昆虫発現系が当該分野で入手可能であり、任意のかかる発現系を使用してもよい。場合により、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを無細胞発現系において翻訳してもよい。かかる方法は当該分野で公知である。タンパク質はまた、固相タンパク質合成によって構築してもよい。
【０１０６】
所望の融合物を含む本発明の発現構築物、またはこれらの融合物の個々の成分を含む個々の発現構築物を、核酸免疫化のために使用して、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて細胞性免疫応答を刺激してもよい。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、直接脊椎動物被験体に送達してもよく、または、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達して、細胞を被験体に再移植してもよい。例えば、構築物は、例えば、プラスミドＤＮＡ、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＣｏｌＥ１等の、プラスミド内に含まれるプラスミドＤＮＡとして送達してもよい。
【０１０７】
さらに、発現構築物は、細胞への送達の前に、リポソーム内に封入してもよい。脂質カプセル化は、一般に、核酸を安定的に結合するかまたは捕捉および維持することができるリポソームを使用して達成される。凝集したＤＮＡ対脂質調製物の比率は変化してもよいが、一般におよそ１：１である（ＤＮＡのｍｇ：脂質のミクロモル）か、脂質よりも多い。核酸の送達のための担体としてのリポソームの使用の総説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチドとの使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電）調製物、アニオン性（負に荷電）調製物、および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの登録商標で、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ．から入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照のこと）。他の市販の脂質としては、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な物質から調製することができる。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ出願公開第９０／１１０９２号を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、第１０１巻、ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を、参照のこと。
【０１０９】
ＤＮＡはまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載されているものと類似の渦巻形の脂質組成物中で送達してもよい。米国特許第４，６６３，１６１号および第４，８７１，４８８号もまた、参照のこと。
【０１１０】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞内への遺伝子導入のために開発されている。例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクター内に挿入し、レトロウイルス粒子内に封入することができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が、記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９。簡潔には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルスを含む様々なレトロウイルス、ならびにＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ等のスプーマウイルスおよびレンチウイルスから容易に構築してもよい（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。かかるレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９）等の寄託機関もしくは収集機関から容易に得ることができ、または一般に利用可能な技術を用いて、公知の供給源から単離してもよい。
【０１１１】
アデノウイルス２型ベクターおよび５型ベクター等の多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム内に組み込むレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体外に留まり、したがって、挿入変異に関連する危険性を最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【０１１２】
Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されているアデノウイルスキメラベクター等の分子結合体ベクターもまた、遺伝子送達のために使用してもよい。
【０１１３】
限定されないが、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス、ＶＥＥに由来するベクター等の、アルファウイルス属のメンバーもまた、目的の遺伝子の送達のためのウイルスベクターとしての使用を提供する。本方法の実践のために有用なシンドビスウイルス由来ベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；ならびに国際公開第９５／０７９９５号および第９６／１７０７２号を参照のこと。
【０１１４】
限定されないが、アデノ随伴ウイルスベクター、サルウイルス４０およびサイトメガロウイルスを含む、他のベクターを使用してもよい。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＢＣＧ株、およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等の細菌ベクターを使用してもよい。ＭＣおよびＭＣ１等のミニ染色体、バクテリオファージ、コスミド（λファージｃｏｓ部位が挿入されているプラスミド）およびレプリコン（細胞中で、それら自体の制御の下で複製することができる遺伝因子）もまた、使用してもよい。
【０１１５】
発現構築物はまた、微粒子状担体にカプセル化し、吸着させ、または関連させてもよい。かかる担体は、免疫系に対し、選択された分子の複数のコピーを提示し、局部リンパ節における分子の捕捉および維持を促進する。粒子はマクロファージによって補食され得、サイトカイン放出を通して抗原提示を促進し得る。微粒子状担体の例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、ならびにポリ（ラクチド）由来の微粒子およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−コグリコリド）由来の微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
【０１１６】
発現構築物を細胞に送達するために、様々な他の方法を使用してもよい。かかる方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリシン媒介性トランスフェクションもしくはポリオルニチン媒介性トランスフェクション、またはリン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石等のような他の不溶性無機塩を使用した沈殿が挙げられる。他の有用なトランスフェクションの方法としては、エレクトロポレーション、ソノボレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞を形質転換するための技術の考察については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を；遺伝子導入に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポレーションを使用してＤＮＡを送達する、ある特に効果的な方法が、国際公開第／００４５８２３号に記載されている。
【０１１７】
さらに、金およびタングステン等の微粒子状担体を使用する微粒子銃送達系は、本発明の発現構築物を送達するために特に有用である。粒子は、送達されるべき構築物で被膜され、「遺伝子銃」から発射される銃粉末を用いて、一般に減圧の雰囲気下で、高速まで加速される。かかる技術、およびこれらに有用な装置の記載については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第５，１７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および第５，４７８，７４４号を参照のこと。
【０１１８】
（融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含む組成物）
本発明はまた、融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。上記で定義されたように、組成物を使用して、免疫学的応答を刺激することができる。組成物は、融合物の１つが本明細書中に記載されているようなＣ末端の切断されたＮＳ５ドメインを含む限りは、１つ以上の融合物を含んでもよい。好ましくは、組成物は、ＮＳ２、ＮＳ３（特に、修飾されたＮＳ３）、ＮＳ４、ＮＳ５ｔおよびコアの部分を含む、またはこれらからなる、ＨＣＶ融合ポリペプチドを含む。より好ましくは、組成物は、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３（特に、修飾されたＮＳ３）、ＮＳ４、ＮＳ５ｔおよびコアの部分を含む、またはこれらからなる、ＨＣＶ融合ポリペプチドを含む。本発明の組成物はまた、薬学的に許容され得る担体を含んでもよい。担体は、それ自体が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導するべきではない。薬学的に許容され得る担体は、当業者に周知である。かかる担体としては、タンパク質、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ等のような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン等のような多量体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性型ウイルス粒子等の、大型のゆっくりと代謝される高分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
薬学的に許容され得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩等の無機塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩等の有機酸の塩もまた、本発明の組成物中で使用してもよい。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素、および当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、単独または組み合わせで、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノール等のような液体または賦形剤、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤等の物質を含んでもよい。本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドはまた、リポソームおよびＰＬＧ等の微粒子状担体に吸着させてもよく、これに捕捉させてもよく、またはそうでなければこれに関連させてもよい。リポソームおよび他の微粒子状担体は、上述されている。
【０１２０】
所望される場合、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５からｓｅｒ１２５へ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、ＦＬＰ−３、リバビリンおよびＲＡＮＴＥＳ等のサイトカインを含むがこれらに限定されない、Ｂ７−１もしくはＢ７−２、またはサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン等の、リンパ球に対する免疫原提示を改善する共刺激分子が、組成物中に含まれてもよい。場合により、アジュバントもまた、組成物中に含まれてもよい。使用され得るアジュバントとしては：
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）例えば（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）等のマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される、（場合により種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）５％スクアレン、０．５％ＴＷＥＥＮ ８０、および０．５％ＳＰＡＮ ８５を含むＭＦ５９（ＰＣＴ国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるか、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンが作製されるかのいずれかの、１０％スクアレン、０．４％ＴＷＥＥＮ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照のこと）を含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレンと、０．２％ＴＷＥＥＮ ８０と、モノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）とを含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）等の、水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記を参照のこと）または細菌細胞壁成分等の他の特定の免疫刺激剤ありまたはなし）；（３）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）等のサポニンアジュバントを使用してもよく、またはこれから作製されるＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）等の粒子であって、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を有さなくてもよい（例えば、国際公開第００／０７６２１号を参照のこと）；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等のようなインターロイキン等のサイトカイン（例えば、国際公開第９９／４４６３６号を参照のこと）、γインターフェロン等のインターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）等の細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、６３位の野生型アミノ酸がリシンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、７２位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここで、１０９位の野生型アミノ酸がセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここで、９位の野生型アミノ酸がリシンで、１２９位の野生型アミノ酸がグリシンで置換されている）（例えば、国際公開第９３／１３２０２号および第９２／１９２６５号を参照のこと）；（７）場合によりミョウバンの実質的非存在下にあるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２２１；ＥＰＡ０６８９４５４を参照のこと）、（例えば、国際公開第００／５６３５８号を参照のこと）；（８）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エミュレーションとの組み合わせ（例えば、ＥＰＡ ０８３５３１８；ＥＰＡ ０７３５８９８；ＥＰＡ ０７６１２３１を参照のこと）；（９）ポリエキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開第９９／５２５４９号を参照のこと）；（１０）ＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはサポニンおよびＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、国際公開第００／６２８００号を参照のこと）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、国際公開第００／２３１０５号を参照のこと）；（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン（例えば、国際公開第９９／１１２４１号を参照のこと；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）（例えば、国際公開第９８／５７６５９号を参照のこと）；（１４）ＭＰＬ誘導体ＲＣ５２９；ならびに（１５）免疫刺激剤として作用し、組成物の有効性を促進する他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９が、好ましい。
【０１２１】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
さらに、融合タンパク質は、ＩＳＣＯＭに吸着させてもよく、またはＩＳＣＯＭ内に捕捉してもよい。古典的ＩＳＣＯＭは、コレステロール、サポニン、ホスホリピド、および免疫原の組み合わせによって形成される。一般に、免疫原（通常は、疎水性領域を有する）は、界面活性剤中にて可溶化され、反応混合物に添加され、それによって、ＩＳＣＯＭが、免疫原が中に組み込まれて形成される。ＩＳＣＯＭマトリックス組成物は、同様に形成されるが、ウイルスタンパク質を含まない。高い正電荷を有するタンパク質は、ＩＳＣＯＭ粒子中に、疎水性の力を介してではなく、静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭ、ならびにＩＳＣＯＭを製剤化するための方法のより詳細な一般的考察について、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：２４７−２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１２３】
本発明との使用のためのＩＳＣＯＭは、当該分野で周知の標準的な技術を使用して生成され、例えば、米国特許第４，９８１，６８４号、第５，１７８，８６０号、第５，６７９，３５４号および第６，０２７，７３２号；欧州特許出願公開第ＥＰＡ１０９，９４２号；第１８０，５６４号および第２３１，０３９号；Ｃｏｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３に記載されている。典型的には、用語「ＩＳＣＯＭ」は、トリテルペノイドサポニン（特にＱｕｉｌ Ａ）等のグリコシドと、疎水性領域を含む抗原との間に形成される、免疫原性複合体をいう。例えば、欧州特許出願公開第ＥＰＡ １０９，９４２号および第１８０，５６４号を参照のこと。この実施形態において、ＨＣＶ融合物（通常は、疎水性領域を有する）は、界面活性剤中で可溶化され、反応混合物に添加され、それによって、ＩＳＣＯＭが、融合物が中に組み込まれて形成される。ＨＣＶポリペプチドＩＳＣＯＭは、両親媒性特性を示すＨＣＶポリペプチドを用いて容易に生成される。しかしながら、望ましい疎水性特性を欠くタンパク質およびペプチドが、疎水性アミノ酸、脂肪酸ラジカル、アルキルラジカル等を有するペプチドと結合した後に、免疫原性複合体中に組み込まれてもよい。
【０１２４】
欧州特許出願公開第ＥＰＡ ２３１，０３９号に説明されているように、抗原の存在は、基本的ＩＳＣＯＭ構造（マトリックスまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと呼ばれる）を形成するためには必要ではなく、これは、コレステロール等のステロール、ホスファチジルエタノールアミン等のホスホリピド、およびＱｕｉｌ Ａ等のグリコシドから形成され得る。したがって、目的のＨＣＶ融合物は、マトリックス中に組み込まれるのではなく、マトリックスの外側に存在し、例えば、静電的相互作用を介してマトリックスに吸着される。例えば、高い正電荷を有するＨＣＶ融合物は、疎水性の力を介するのではなく、ＩＳＣＯＭ粒子に静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭ、およびＩＳＣＯＭを製剤化する方法の、より詳細な一般的考察については、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：２４７−２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１２５】
ＩＳＣＯＭマトリックスは、例えば、可溶化ステロールと、グリコシドと、（場合により）ホスホリピドとを、一緒に混合することによって、調製してもよい。ホスホリピドが使用されない場合、２次元構造が形成される。例えば、欧州特許出願公開第ＥＰＡ ２３１，０３９号を参照のこと。用語「ＩＳＣＯＭマトリックス」は、３次元構造および２次元構造の両方をいうよう使用される。使用されるべきグリコシドは、一般に、両親媒性特性を示し、分子中に疎水性領域および親水性領域を含む、グリコシドである。好ましくは、キラヤ・サポニア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からのサポニン抽出物およびＱｕｉｌ Ａ等のサポニンが、使用される。他の好ましいサポニンは、アエスクルス・ヒポカスタナム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）由来のエスキン（Ｐａｔｔら（１９６０）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ １０：２７３−２７５）、およびジプソフィラ・ストルチウム（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ）由来のサポアルビン（Ｖｏｃｈｔｅｎら（１９６８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４２：２１３−２２６）である。
【０１２６】
ＩＳＣＯＭを調製するために、グリコシドが、少なくとも臨界ミセル形成濃度において使用される。Ｑｕｉｌ Ａの場合、この濃度は、約０．０３重量％である。ＩＳＣＯＭを生成するために使用されるステロールは、コレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スティグマステロール、およびシトステロール等の、動物起源または植物起源の公知のステロールであってもよい。適したホスホリピドとしては、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。一般に、グリコシド（特に、Ｑｕｉｌ Ａである場合）対ステロール（特に、コレステロールである場合）対ホスホリピドのモル比は、１：１：０〜１であり、各数字について±２０％（好ましくは±１０％以下）である。これは、Ｑｕｉｌ Ａ：コレステロールについての重量比約５：１に等しい。
【０１２７】
可溶化剤もまた、存在してもよく、例えば、界面活性剤であっても、尿素であっても、グアニジンであってもよい。一般に、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、もしくは双性イオン性界面活性剤、またはデゾキシコール酸ナトリウム、コール酸塩、およびＣＴＡＢ（セチルトリアンモニウムブロミド）等のコール酸ベースの界面活性剤が、この目的のために使用され得る。適した界面活性剤の例としては、オクチルグルコシド、ノニルＮ−メチルグルカミド、またはデカノイルＮ−メチルグルカミド、９〜１０個のオキシエチレン基を有するポリエチレングリコールｐ−イソオクチル−フェニルエーテル（商標名ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００Ｒ^ＴＭの下で販売されている）等のアルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商標名ＴＷＥＥＮ ２０^ＴＭ、ＴＷＥＥＮ ８０^ＴＭ等の下で販売されている）等のアシルポリオキシエチレンエステルが挙げられるが、これらに限定されない。可溶化剤は、一般に、限外濾過、透析、超遠心分離またはクロマトグラフィー等によって、ＩＳＣＯＭの形成のために除去されるが、特定の方法においては、この工程は不要である（例えば、米国特許第４，９８１，６８４号を参照のこと）。
【０１２８】
一般に、Ｑｕｉｌ Ａ等のグリコシド対ＨＣＶ融合物の重量比は、５：１〜０．５：１の範囲にある。好ましくは、重量比は、およそ３：１〜１：１であり、より好ましくは、比は２：１である。
【０１２９】
一旦ＩＳＣＯＭが形成されると、それらは、本明細書中に記載されるように、組成物へと製剤化され、動物に投与され得る。望ましい場合、得られる免疫原性複合体の溶液は、凍結乾燥され得、次いで、使用前に再構成され得る。
【０１３０】
上述の、ＨＣＶ融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドまたはＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、他のＨＣＶ免疫原性タンパク質、および／またはそれを含む組成物と組み合わせて、使用してもよい。例えば、ＨＣＶ融合ポリペプチドは、表１に記載されているＨＣＶポリタンパク質の領域の１つ以上に由来する種々のＨＣＶ免疫原性タンパク質のいずれかと組み合わせて使用することができる。本融合ポリペプチドおよび／または融合ポリペプチドを含む組成物との使用のための、ある特定のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原である。ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原は公知であり、ＨＣＶ Ｅ１とＨＣＶ Ｅ２との複合体を含み、場合により、ＰＣＴ国際公開第０３／００２０６５号に記載されているようなＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体等の、ｐ７領域の一部または全てを含む。さらなるＨＣＶ免疫原性タンパク質は、上述のような、賦形剤、アジュバント、免疫刺激分子等とともに組成物中で提供してもよい。例えば、Ｅ１Ｅ２複合体は、ＭＦ５９等のサブミクロン水中油型エマルジョンならびに／またはＣｐＹ、ＣｐＲおよび非メチル化ＣｐＧモチーフ（グアノシンが続き、リン酸結合によって連結されたシトシン）等の免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物中で提供してもよい。かかる組成物は、ＰＣＴ国際公開第０３／００２０６５号中に詳細に記載されている。
【０１３１】
したがって、本発明の組成物が、多数の免疫調節剤と併用して投与することができ、通常アジュバントを含むことが、容易に明らかである。組成物との使用のためのかかる薬剤およびアジュバントとしては、上述の物質のいずれか、ならびに以下に示されるものの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
（Ａ．無機物含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適した無機物含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩等の無機物塩が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等のような無機物塩（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９５）ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編の第８章および第９章、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍを参照のこと）、または異なる無機化合物の混合物（例えば、場合によりリン酸塩が過剰な、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物）を含み、化合物は任意の適した形態をとり（例えば、ゲル、結晶、不定形等）、塩（複数可）への吸着が好ましい。無機物含有組成物はまた、金属塩の粒子として製剤化してもよい（ＰＣＴ国際公開第００／２３１０５号）。
【０１３３】
Ａｌ^３＋の用量が１用量あたり０．２〜１．０ｍｇの間であるように、アルミニウム塩が本発明の組成物中に含まれてもよい。一実施形態において、本組成物中での使用のためのアルミニウムベースのアジュバントは、リン酸バッファー中で抗原をミョウバンと混合し、次いで水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウム等の塩基で滴定および沈殿することによってインサイチューで形成されるもの等の、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡＩＫ（ＳＯ_４）_２）、またはミョウバン誘導体である。
【０１３４】
本発明のワクチン製剤中での使用のための別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）_３）または結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）であり、これは、およそ５００ｍ^２／ｇの表面積を有する優れた吸着剤である。あるいは、水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基の一部または全ての代わりにリン酸基を含む、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ_４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムが提供される。本明細書中で提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性、塩基性および中性媒質中で、不定形で可溶性である。
【０１３５】
別の実施形態において、本組成物との使用のためのアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。より具体的なその実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの重量比で、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または９：１より大きい比等、水酸化アルミニウムよりも大量のリン酸アルミニウムを有する。より具体的には、アルミニウム塩は、ワクチン１用量あたり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン１用量あたり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン１用量あたり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン１用量あたり約０．６ｍｇで存在してもよい。
【０１３６】
一般に、好ましいアルミニウムベースのアジュバント（複数可）、またはリン酸アルミニウム対水酸化アルミニウム等の複数のアルミニウムベースのアジュバントの比は、抗原が所望のｐＨでアジュバントと反対の電荷を保持するように、分子の間の静電気引力の最適化によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）はリゾチームを吸着するが、ｐＨ７．４でアルブミンを吸着しない。アルブミンが標的である場合、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ １１．４）。あるいは、リン酸塩での水酸化アルミニウムの前処理によって、その等電点が低下し、より塩基性の抗原に好ましいアジュバントになる。
【０１３７】
（Ｂ．油エマルジョン）
組成物でのアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョンが挙げられる。特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。本明細書中での使用のための好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％ Ｓｐａｎ ８５^ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、ならびに、場合により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホホリルオキ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン水中油型エマルジョン等の、場合により種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水エマルジョン、例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油型エマルジョンである（国際公開第９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号、ならびにＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）中のＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．２７７−２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、および０．５％ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５^ＴＭを含み、場合により、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化された、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量、最も好ましくは０〜１００μｇ／用量の量で存在させることができる。本明細書中で使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く、上記のサブミクロン水中油型エマルジョンをいうが、用語ＭＦ５９−ＭＴＰは、ＭＴＰ−ＰＥを含む製剤を意味する。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、１用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む、等である。本明細書での使用のための別のサブミクロン水中油型エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、および０．７５％ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５^ＴＭ、ならびに場合によりＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油型エマルジョンは、ＳＡＦとしても公知のＭＦ７５であり、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％プルロニックブロック多量体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、また、マイクロ流動化されてサブミクロンエマルジョンになる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、１用量あたり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥ等のＭＴＰを含むＭＦ７５製剤を意味する。
【０１３８】
サブミクロン油中水型エマルジョン、それを製造する方法、および、組成物中での使用のためのムラミルペプチド等の免疫刺激剤が、国際公開第９０／１４８３７号ならびに米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号に詳細に記載されている。
【０１３９】
フロイト完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もまた、本組成物中でのアジュバントとして使用され得る。
【０１４０】
（Ｃ．サポニン製剤）
サポニン製剤もまた、組成物中でのアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花にも見られるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均質なグループである。キラヤ・サポニア・モリナの木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、スライマックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、ジプソフィラ・パニキュラータ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライズベール）、およびサポナリア・オフィチナーリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート）からも商業的に得られ得る。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１等の精製された製剤、ならびにＩＳＣＯＭ等の脂質製剤が挙げられる。
【０１４１】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されてきた。これらの技術を用いて、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、特定の精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成の方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン製剤は、コレステロール等のステロールを含んでもよい（ＰＣＴ公開第９６／３３７３９号を参照のこと）。
【０１４２】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭはまた、一般的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン等のリン脂質を含む。任意の公知のサポニンもＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、さらに、ＥＰ０１０９９４２、国際公開第９６／１１７１１号および国際公開第９６／３３７３９号に記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭはさらなる界面活性剤（複数可）を含まなくてもよい。国際公開第００／０７６２１号を参照のこと。
【０１４３】
サポニンベースのアジュバントの開発の総説は、Ｂａｒｒら、「ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見出され得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、「Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照のこと。
【０１４４】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明でアジュバントとして使用され得る。これらの構造体は一般に、場合によりリン脂質と混合または製剤化されている、ウイルスに由来する１つ以上のタンパク質を含む。これらは一般に、非病原性、非複製性であり、一般に、天然のウイルスゲノムのいずれも含まない。ウイルスタンパク質は組み換え生成され得るか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適した、これらウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ等）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質等）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質等）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１等）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、さらに国際公開第０３／０２４４８０号、国際公開第０３／０２４４８１号、およびＮｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６Ｌ１ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ−１６Ｌ１ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０で考察されている。ビロソームは、さらに、例えば、Ｇｌｕｃｋら、「Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６で考察されている。免疫増強性再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内の３価のＩＮＦＬＥＸＡＬ^ＴＭ生成物｛ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０、補遺５：Ｂ１７−２３｝およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳ^ＴＭ生成物においてサブユニット抗原送達系として使用されている。
【０１４５】
（Ｅ．細菌性または微生物性の誘導体）
本組成物における使用に適したアジュバントとしては、以下のような細菌性または微生物性の誘導体が挙げられる。
【０１４６】
（１）腸内細菌性リポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
かかる誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６個のアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい「小粒子」形態の３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡは、ＥＰ０６８９４５４に開示されている。かかる３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２ミクロン膜で濾過して滅菌できるほど小さい（ＥＰ０６８９４５４を参照のこと）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体等の、モノホスホリルリピドＡの模倣物、例えばＲＣ−５２９が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：２２７３−２２７８を参照のこと。
【０１４７】
（２）リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４等の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、「ＯＭ−１７４，ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２−３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋら、「Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１４８】
（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド
アジュバントとしての使用に適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンとそれに続くグアノシンを含み、リン酸結合によって連結された配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む、細菌の２本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１４９】
ＣｐＧのものは、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／アナログを含んでもよく、２本鎖でも１本鎖でもよい。場合により、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン等のアナログで置換されていてもよい。可能なアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；国際公開第０２／２６７５７号および国際公開第９９／６２９２３号を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、Ｋｒｉｅｇ、「ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ」、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；国際公開第９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；第６，２３９，１１６号および米国特許第６，４２９，１９９号で考察されている。
【０１５０】
ＣｐＧ配列は、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ等の、ＴＬＲ９に対し指向することが可能である。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（第３部）：６５４−６５８を参照のこと。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ等の、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であり得るか、または、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ等の、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、「ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ、「Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５および国際公開第０１／９５９３５号で考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１５１】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識しやすいように構築されている。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、それらの３’末端で結合して、「イムノマー」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（第３部）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら、「ＣｐＧ ｐｅｎｔａ−ａｎｄ ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１および国際公開第０３／０３５８３６号を参照のこと。
【０１５２】
（４）ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化された誘導体は、組成物中でアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（すなわち、大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、国際公開第９５／１７２１１号に記載されており、非経口アジュバントとしては国際公開第９８／４２３７５号に記載されている。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇ等の無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、以下の参考文献に見出され得る。Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２，ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴＫ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）」Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換の数的な参照は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７に示されているＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１５３】
（Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本組成物中でアジュバントとして使用することができる。適した生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフィア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）、またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体等の粘膜接着剤が挙げられる。キトサン、およびその誘導体もまた、本組成物中でアジュバントして使用できる。例えば、国際公開第９９／２７９６０号を参照のこと。
【０１５４】
（Ｇ．微粒子）
微粒子もまた、組成物中のアジュバントとして使用され得る。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を用いて、生分解性で無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）から形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、場合により、（例えば、ＳＤＳによって）負に帯電した表面、または（例えば、ＣＴＡＢ等の陽イオン性界面活性剤によって）正に帯電した表面を有するように処理される。
【０１５５】
（Ｈ．リポソーム）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号、およびＥＰ０６２６１６９に記載されている。
【０１５６】
（Ｉ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤）
組成物中での使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。例えば、国際公開第９９／５２５４９号を参照のこと。かかる製剤はさらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１６５７号）、ならびに、例えば、オクトキシノール等の少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１１５２号）を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１５７】
（Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１−３）：１０９−１１５およびＰａｙｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０１５８】
（Ｋ．ムラミルペプチド）
アジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１５９】
（Ｌ．イミダゾキノリン化合物）
組成物中でのアジュバントとしての使用に適したイミダゾキノリン化合物の例としては、イミキモド、およびそのアナログが挙げられ、Ｓｔａｎｌｅｙ、「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号、第５，３８９，６４０号、第５，２６８，３７６号、第４，９２９，６２４号、第５，２６６，５７５号、第５，３５２，７８４号、第５，４９４，９１６号、第５，４８２，９３６号、第５，３４６，９０５号、第５，３９５，９３７号、第５，２３８，９４４号、および第５，５２５，６１２号にさらに記載されている。
【０１６０】
（Ｍ．チオセミカルバゾン化合物）
チオセミカルバゾン化合物の例、ならびに、すべて組成物中でのアジュバントとしての使用に適した化合物を製剤化、製造、およびスクリーニングする方法としては、国際公開第０４／６０３０８号に記載されているものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１６１】
（Ｎ．トリプタントリン化合物）
トリプタントリン化合物の例、ならびに、すべて組成物中でのアジュバントとしての使用に適した化合物を製剤化、製造、およびスクリーニングする方法としては、国際公開第０４／６４７５９号に記載されているものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−α等のサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１６２】
（Ｏ．ヒト免疫調節因子）
組成物中でのアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子等のサイトカインが挙げられる。
【０１６３】
組成物はまた、上記に特定されたアジュバントの１つ以上の態様の組み合わせを含むことができる。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において使用することができる。
（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン（国際公開第９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（国際公開第９４／００１５３号を参照のこと）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）（国際公開第９８／５７６５９号）
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、第０７３５８９８号および第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦであって、マイクロ流動化されてサブミクロンエマルジョンになっているか、またはボルテックスされて粒子サイズのより大きいエマルジョンになったもの。
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに
（８）１つ以上の無機物塩（アルミニウム塩等）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＰＭＬ等）。
（９）１つ以上の無機物塩（アルミニウム塩等）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列等）。
【０１６４】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射可能なワクチンとの使用に好ましいアジュバントである。細菌性毒素および生体接着剤は、経鼻ワクチン等の粘膜送達ワクチンとの使用のための好ましいアジュバントである。
【０１６５】
（ＨＣＶ特異的抗体を生成する方法）
ＨＣＶ融合ポリペプチドを、ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体を生成するために使用してもよい。ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体は、ＨＣＶ抗原に特異的に結合する。ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマ等の哺乳動物に融合タンパク質を投与することによって、生成され得る。免疫化された動物由来の血清が収集され、抗体は、例えば、硫酸アンモニウムを用いる沈殿、その後のクロマトグラフィー、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーによって、血漿から精製される。ポリクローナル抗血清を生成および処理するための技術は、当該分野で公知である。
【０１６６】
融合ポリペプチド中に存在するＨＣＶ特異的エピトープに対するモノクローナル抗体もまた、容易に生成され得る。ＨＣＶ融合ポリペプチドで免疫化された、マウス等の哺乳動物由来の正常Ｂ細胞を、例えば、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成し得る。ＨＣＶ特異的抗体を生成するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを使用して同定され得、半固体寒天におけるクローニングによって、または限界希釈によって、単離され得る。ＨＣＶ特異的抗体を生成するクローンは、もう１回のスクリーニングによって、単離される。
【０１６７】
モノクローナルおよびポリクローナルのいずれかの、ＨＣＶエピトープに対する抗体は、ＨＣＶに感染したヒト由来の血清試料等の試料中のＨＣＶまたはＨＣＶ抗原の存在を検出するために、特に有用である。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、１つの抗体またはいくつかの抗体を利用し得る。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、例えば、ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのＨＣＶポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、種々のＨＣＶポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体、同じＨＣＶ抗原に対するポリクローナル抗体、種々のＨＣＶ抗原に対するポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用し得る。イムノアッセイプロトコールは、例えば、標識抗体を使用する、例えば、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。標識は、例えば、蛍光、化学発光、または放射活性であり得る。
【０１６８】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫アフィニティーカラムによって、ＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原を単離するためにさらに使用され得る。抗体は、抗体がその免疫選択的活性を保持するように、例えば、吸着によって、または共有結合によって、固体支持体に固定され得る。場合により、抗体の抗原結合部位が接近可能なままであるように、スペーサー基が含まれ得る。次いで、固定された抗体が、血液または血漿等の生物学的試料由来のＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原に結合するために使用され得る。結合したＨＣＶ粒子または結合したＨＣＶ抗原は、例えば、ｐＨの変化によって、カラムマトリックスから回収される。
【０１６９】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞）
インビボまたはインビトロで発現される、コアポリペプチドを含むかまたは含まないＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質、ならびに本明細書中に記載されている他の種々の融合物のいずれかを含む、上述の融合物によって活性化されるＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、好ましくは、これらのペプチドのうちの１つ以上と、コアポリペプチドを含むかまたは含まないＮＳ５ｔとの融合物のエピトープを含む、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂポリペプチド等のＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識する。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋であり得る。他の実施形態において、ＮＳ５部分は切断されていなくてもよい。
【０１７０】
本発明は、少なくともＮＳ３４５タンパク質配列に融合したアミノ酸１０１８位に見られる、天然に存在するＮＳ２タンパク質のメチオニンを含む、新規なＨＣＶ融合ポリペプチドを提供し、ここで、ＮＳ３配列は、ＮＳ３の固有のプロテアーゼ機能が除去されるよう変異している。これらの組成物は、Ｅ２およびコアをさらに含んでもよい。
【０１７１】
Ｅ２および／またはコアを融合タンパク質に付加することによって、免疫系が認識する、さらなるＴ細胞エピトープが提供される。Ｅ１、Ｐ７およびＮＳ２の大部分を含まないことによって、疎水性領域の喪失のために、発現が最適化される。
【０１７２】
ＮＳ５ｂの末端なしのＨＣＶタンパク質を発現することもまた、タンパク質発現を促進する。（ＵＳ２００６００８８８１９−Ａ１を参照のこと）
ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得、これは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体形成したこれらのエピトープのうちのいずれかを提示するＨＣＶ感染細胞を死滅させ得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイ（実施例を参照のこと）によって検出され得る。^５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、これらのエピトープのうちの１つ以上を提示している標的細胞を溶解する能力を測定する。ＩＦＮ−γ等の抗ウイルス物質を発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞もまた、本明細書中で企図され、これはまた、免疫学的方法によって、好ましくは、限定されないがＥ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂポリペプチド等のＨＣＶポリペプチドのうちの１つ以上でのインビトロ刺激の後、ＩＦＮ−γまたは同様のサイトカインについての細胞内染色によって、検出され得る（実施例を参照のこと）。
【０１７３】
インビボまたはインビトロで発現される、限定されないが、コアポリペプチドを含むかまたは含まない、ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合ポリペプチドまたはＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合ポリペプチド等の上述の融合物によって活性化されるＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋細胞は、好ましくは、ＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合され、例えば、コアポリペプチドありまたはなしで、ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔまたはＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合ポリペプチドを刺激することに応じて増殖する、その融合物のエピトープを含む、限定されないがＮＳ２、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、またはＮＳ５ｂまたはコアポリペプチド等の、ＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識する。
【０１７４】
ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、リンパ増殖アッセイによって検出され得る（実施例を参照のこと）。リンパ増殖アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、例えば、ＮＳ２、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂまたはコアエピトープに応じて増殖する能力を測定する。
【０１７５】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する方法）
ＨＣＶ融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボのいずれかでＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するために使用され得る。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、特に、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答を最適化するモデル系を提供するため、およびＨＣＶ感染に対する予防処置または治療処置を提供するために、使用され得る。インビトロ活性化について、タンパク質は、上述のように、アデノウイルスベクター等の、プラスミドまたはウイルスベクターを介して、好ましくはＴ細胞に供給される。
【０１７６】
Ｔ細胞のポリクローナル集団は、ＨＣＶに感染している哺乳動物の、血液に由来してもよく、好ましくは、リンパ節等の末梢リンパ器官、脾臓、または胸腺に由来してもよい。好ましい哺乳動物としては、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが挙げられる。ＨＣＶは、哺乳動物中の活性化したＨＣＶ特異的Ｔ細胞の数を拡大するように作用する。次いで、哺乳動物由来のＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、限定されないが、コアポリペプチドを含むかまたは含まない、ＨＣＶ ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質等の、本明細書中に記載されているようなＨＣＶ融合ポリペプチドを、Ｔ細胞に添加することによって、インビトロで再刺激され得る。次いで、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、特に、増殖、ＩＦＮ−γの生成、およびインビトロでＨＣＶエピトープを提示する標的細胞を溶解する能力について、試験され得る。
【０１７７】
リンパ増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、限定されないがＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５、Ｅ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５、またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５、またはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｔ、またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｔ、またはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅ、またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅ、またはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ、またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅエピトープペプチド等のＨＣＶポリペプチドとともに培養された場合に増殖するが、エピトープペプチドの非存在下では増殖しない。したがって、限定されないがＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５およびＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープ等の、ＮＳ２、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、またはコアおよびこれらのエピトープの融合物等の、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識される特定のＨＣＶエピトープは、リンパ増殖アッセイを使用して同定され得る。
【０１７８】
同様に、上述の融合タンパク質を用いるインビトロ刺激の後にＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γを検出することは、例えば、ＩＦＮ−γを生成するようにＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激する際に特に有効である、限定されないがＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５、およびＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープ等の、限定されないがＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂのエピトープ、およびこれらのエピトープの融合物等の融合タンパク質エピトープを同定するために使用され得る（実施例２を参照のこと）。
【０１７９】
さらに、^５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答のレベルを判定するために有用である。Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９〜４４９を参照のこと。例えば、ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＣＶに感染した哺乳動物の肝臓に由来してもよい。これらのＴ細胞は、例えば、Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープまたはＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープを提示する標的細胞に対する^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、試験され得る。異なるＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープまたはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープを発現するいくつかの標的細胞集団は、各標的細胞集団がＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５の異なるエピトープを提示するように、構築され得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋細胞は、これらの標的細胞集団のそれぞれに対してアッセイされ得る。^５１Ｃｒ放出アッセイの結果は、ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５のエピトープのうちのどちらがＨＣＶに対する最も強力なＣＴＬ応答を担うかを判定するために使用され得る。次いで、最も強力なＣＴＬ応答を担うエピトープを含む、コアポリペプチドを含むかまたは含まない、ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質が、^５１Ｃｒ放出アッセイに由来する情報を使用して、構築され得る。
【０１８０】
上述のようなＨＣＶ融合ポリペプチド、またはかかる融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞をインビボで活性化する等、体液性および／または細胞性免疫応答を刺激するために、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト等の哺乳動物に投与され得る。投与は、上述のように、非経口投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、または生物学的微粒子銃（「遺伝子銃」）を使用する注射を含む皮下注射を含む、当該分野で公知の任意の手段によってであり得る。
【０１８１】
好ましくは、ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの注射は、Ｔ細胞を活性化するために使用される。構築および改変を簡単にするという実用的利点に加えて、ポリヌクレオチドの注射は、宿主における融合タンパク質の合成を生じる。したがって、これらの免疫原は、天然の翻訳後修飾、構造、および立体構造で宿主免疫系に提示される。ポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒト等の大きな哺乳動物に、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で、筋肉内注射される。
【０１８２】
ＨＣＶ融合ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ、とりわけ、^５１Ｃｒ放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって測定されるかまたはＩＦＮ−γについての細胞内染色によって測定される場合に、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するのに有効な量で、投与される。タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳動物またはＨＣＶ感染哺乳動物のいずれかに投与され得る。組成物中のポリヌクレオチドまたは融合タンパク質の特定の投与量は、組成物が投与される哺乳動物の種、年齢、および全体的な状態、ならびに組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない、多くの要因に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験のみを用いて容易に判定され得る。上述のインビトロおよびインビボモデルが、適切な用量を同定するのに用いられ得る。以下に記載の実施例において使用されるポリヌクレオチドの量は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいてＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するのに使用され得る全般的な手引きを提供する。一般に、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５、または１０ｍｇのＨＣＶ融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト等の大きな動物に投与される。所望される場合、共刺激分子またはアジュバントがまた、組成物の前、後、または同時に提供され得る。
【０１８３】
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を含む、本発明の組成物の送達によりって発生する哺乳動物の免疫応答は、投与量、投与経路、または追加免疫計画を変化させることによって促進され得る。本発明の組成物は、単回用量スケジュールで、または、好ましくは、初回ワクチン接種が１〜１０の別々の用量を含み、その後他の用量が免疫応答を維持および／もしくは強化するのに必要とされるその後の時間間隔、例えば、第２用量については１〜４ヶ月で与えられ、必要な場合、数ヶ月後にその後の用量（複数可）が与えられる複数回用量スケジュールで、与えられ得る。
【０１８４】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を行うための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示的な目的のためだけに提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、本開示の教示が与えられれば、発明が種々の方法で実施され得ることを容易に理解するであろう。
【０１８５】
使用される数値（例えば、量、温度等）に関して、正確さを確保する努力をしているが、ある程度の実験誤差および偏差は、当然、許容されるべきである。
【実施例】
【０１８６】
（実施例１）
（ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニング）
アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、アミノ酸１０１８〜１０２６由来のＮＳ２のカルボキシ末端、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０または３０１１、および場合によりコアのアミノ酸１〜１２１をコードし、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、存在する場合、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンであり、場合によりアミノ酸３８４〜アミノ酸７１５由来のＥ２配列を含む、合成核酸配列を、一般的な方法および下記に概説されるものに従って構築した。ＨＣＶ−１配列に関するアミノ酸番号付けで、種々の構築物を図１１に図式的に表す。標準的な組換えクローニング技術ならびに特にこれまでにＵＳ２００６−００８８８１９−Ａ１、国際公開第０１／３８３６０号および国際公開第２００４／００５４７３号に記載されている方法を利用することによって、核酸配列をプラスミドベクターにクローニングし、融合ポリペプチドをコードするコードするＤＮＡ挿入を含むプラスミドベクターで形質転換した宿主細胞から、融合ポリペプチドを発現させた。
【０１８７】
一実施形態の構築について、詳細な実施例を以下に提供する。同様の手法を使用して、上述の他の核酸配列を含むプラスミドベクターを構築した。
【０１８８】
（ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１をコードするポリヌクレオチドのクローニング）
アミノ末端からカルボキシ末端の方向でメチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１からなり、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである、ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするように、合成ＨＣＶ１ａ核酸を構築した。この核酸配列によってコードされる融合タンパク質を、ＨＣＶ−１配列に関するアミノ酸番号付けで、図７で図式的に表し、これは本明細書中で「ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１」、「ｅ２．ｎｓ３_ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１」、または「Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１」もしくは「Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１」と呼ばれる。
【０１８９】
ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１融合ポリペプチドは、一般に、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のために操作した（米国特許第６，４５８，５２７号第４．２．４．２部および米国特許第５，６３５，３７４号、図６ａに示す）。このベクターは、酵母における自律複製のための２μ配列ならびに選択マーカーとしての酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよびＵＲＡ３を含む。細菌におけるプラスミド複製に必要な、α因子ターミネーター、βラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点もまた、この発現ベクター中に存在する。
【０１９０】
以下の工程をとって、ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１ポリタンパク質のための発現カセットを構築した（図６ａ〜６ｆに示す）。
【０１９１】
最初に、Ｎ末端領域を組み立てるために、８１９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｃｌＩ断片を、ｐＧＥＭ７．ｄ．Ｅ２（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）サブクローン＃３からゲル単離した。５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の後に、ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ配列、イニシエーターＡＴＧ、およびａａ３８４で始まってａａ６５０のＡｃｌＩ制限酵素認識部位まで続く、ＨＣＶ−１ Ｅ２エクトドメインのコドンが続く。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｃｌＩ断片、およびＥ２エクトドメインのａａ６５１〜ａａ６６２に対応する３４ｂｐのＡｃｌＩ／ＣｅｌＩＩキナーゼ合成断片を、ＨＣＶ−１ Ｅ２エクトドメイン配列のａａ６６２〜ａａ７１５をコードする２２８ｂｐのＣｅｌＩＩ／ＢｌｎＩ断片と、それに続くＨＣＶ−１ ＮＳ２およびＮＳ３のａａ１０１８〜ａａ１０３９のコドンを含むｐＴ７Ｂｌｕｅ２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｅｌＩＩベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をＨＢ１０１コンピテント細胞に形質転換し、Ｌｕｒｉａ−アンピシリンアガープレート上に播種した（１００μｇ／ｍｌ）。ミニプレップＤＮＡ分析、所望のクローンの同定および配列確認の後に、ｐＴ７Ｂｌｕｅ２．Ｅ２／ｎｓ２．３＃２３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化して、Ｅ２／ＮＳ２／ＮＳ３をコードする１０８１ｂｐの断片を単離した。
【０１９２】
第二に、ＮＳ３ドメイン中にＳｅｒ_１１６５−Ａｌａ変異を導入するために、７０３ｂｐのＢｌｎＩ／ＣｌａＩ断片を、ｐＳＰ７２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ．ｎｓ３ｍｕｔ １１６５＃１５からゲル単離した。この７０３ｂｐの断片は、部位特異的突然変異誘発によってＳｅｒ_１１６５がＡｌａに変異している、ＨＣＶ−１ゲノムのａａ１０４０〜ａａ１２７４をコードする。
【０１９３】
第三に、ｅ２．ｎｓ３_ｍ−ｎｓ５ｃｏｒｅ１２１発現カセットのクローニングを容易にするために、１０８１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｌｎＩ断片（Ｅ２／ＮＳ２／ＮＳ３をコードする）および７０３ｂｐのＢｌｎ／ＣｌａＩ断片（ＮＳ３ｍＳｅｒ１１６５−Ａｌａをコードする）を、ｐＳＰ７２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩベクターにライゲートした。ライゲーション混合物を上述のように形質転換し、ＤＮＡ分析の後に、得られたクローンをｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ ｅ２．ｎｓ３_ｍ＃１と名付けた。
【０１９４】
第四に、Ｅ２／ＮＳ２／ＮＳ３ｍをコードする１７８４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片を、上述のｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ ｅ２．３_ｍ＃１からゲル精製した。ＨＣＶ−１のＮＳ３−ＮＳ５ａ由来のａａ１２７４〜ａａ２２０２をコードするＣｌａＩ／ＮｈｅＩ ２７８７ｂｐ断片を、全長ＨＣＶ−１クローンであるｐＵＣ．ＨＣＶ３から単離した。２７３２ｂｐのＮｈｅ／ＳａｌＩ断片を、ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ．ｎｓ５ａｂ．２９９０．ｃｏｒｅ１２１＃２７サブクローンからゲル単離した。Ｎｈｅ／Ｓａｌ断片は、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂのａａ２２０３〜２９９０に対応し、コアドメインのａａ１〜１２１がそれに続く。ＨＣＶ−１コア配列内で、コンセンサスａａを、９位（ＨＣＶ−１コア配列のＬｙｓの代わりにＡｒｇ）および１１位（ＨＣＶ−１のＡｓｎの代わりにＴｈｒ）で組み込んだ。
【０１９５】
最後に、米国特許第６，１８３，９８５号に記載されている１３６６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター断片を、１７８４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片、２７８７ｂｐのＣｌａ／ＮｈｅＩ断片、および２７３２ｂｐのＮｈｅ／ＳａｌＩ断片とともに、ｐＢＳ２４．１ ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクターにライゲートし、それによって、プラスミドｐｄ．ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１を作製した（図６ｆを参照のこと）。
【０１９６】
同様の手法を用いて、図１１に示されるような、他の融合ポリペプチドをコードするように、他のポリヌクレオチドを構築し、発現ベクターｐＢＳ２４．１に挿入した。これらの他の融合タンパク質は、
Δｎｓ３ｎｓ５ｃｏｒｅ１２１またはΔＮＳ３−ＮＳ５．ｃｏｒｅ１２１（ＮＳ３のａａ１２４２〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２、ＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ２９９０およびコアのａａ１〜ａａ１２１）；
ｎｓ３ｍ．ｎｓ５−ｃｏｒｅまたはＮＳ３ｍ−ＮＳ５（ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２およびＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ３０１１）；
ｎｓ３ｍ．ｎｓ５ｔｒ−ｃｏｒｅまたはＮＳ３ｍ−ＮＳ５ｔｒ（ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２およびＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ２９９０）；
ｎｓ３ｍ．ｎｓ５＋ｃｏｒｅ１２１またはＮＳ３ｍ−ＮＳ５．ｃｏｒｅ１２１（ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２、ＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ３０１１およびコアのａａ１〜ａａ１２１）；
ｎｓ３ｍ．ｎｓ５ｔｒ＋ｃｏｒｅまたはＮＳ３ｍ−ＮＳ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２、ＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ２９９０およびコアのａａ１〜ａａ１２１）；
ｅ２．ｎｓ３ｍ．ｎｓ５−ｃｏｒｅまたはＥ２．ＮＳ３ｍ−ＮＳ５（メチオニン、Ｅ２のａａ３８４〜ａａ７１５、ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２およびＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ３０１１）；
ｅ２．ｎｓ３ｍ．ｎｓ５ｔｒ−ｃｏｒｅまたはＥ２．ＮＳ３ｍ−ＮＳ５ｔｒ（メチオニン、Ｅ２のａａ３８４〜ａａ７１５、ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２およびＮＳ５の１９７３〜ａａ２９９０）；ならびに
ｅ２．ｎｓ３ｍ．ｎｓ５＋ｃｏｒｅまたはＥ２．ＮＳ３ｍ−ＮＳ５．ｃｏｒｅ１２１（メチオニン、Ｅ２のａａ３８４〜ａａ７１５、ＮＳ２のａａ１０１８〜ａａ１０２６、ＮＳ３のａａ１０２７〜ａａ１６５７、ＮＳ４のａａ１６５８〜ａａ１９７２、ＮＳ５のａａ１９７３〜ａａ３０１１およびコアのａａ１〜ａａ１２１）である。
【０１９７】
これらの融合タンパク質の全ては、コア配列のアミノ酸９としてＡｒｇを有し、コア配列のアミノ酸１１としてＴｈｒを有した。Δｎｓ３ｎｓ５ｃｏｒｅ１２１以外の全ては、ＮＳ３中にＳｅｒ１１６５−Ａｌａ変異を有した。
【０１９８】
（ＨＣＶ融合タンパク質の発現および検出）
図１０ａ〜１０ｄに示されるように、上述の種々の構築物を有する発現プラスミドを酵母に形質転換し、発現させた。
【０１９９】
ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターを用いて、酵母発現プラスミドから融合タンパク質を発現させた。例えば、Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１融合タンパク質を、プラスミドｐｄ．ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１から発現させた。
【０２００】
Ｓ．セレビシエＡＤ３^＊株（遺伝子型ｍａｔα、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃ１−４０７、ｃｉｒ^○、ｔｒｐ＋、：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］、元々は米国特許第６，４５８，５２７号第４．２．４．４部に記載されているようなＢＪ２１６８株に由来する）を、ｐｄ．ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１酵母発現プラスミドまたは他のプラスミドで、上述のように形質転換した。酢酸リチウムプロトコールを用いて、酵母細胞を発現プラスミドで形質転換した。Ｕｒａ−形質転換体を、単一コロニーについて筋状にし、ｌｅｕ⁻／８％グルコースプレート上に斑点をつけて、プラスミドコピー数を増大させた。Ｌｅｕ⁻スターター培養物を３０℃で２４〜４８時間増殖させ、次いでＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトン２％グルコース）培地中で１：２０に希釈した。細胞を２５℃または３０℃のいずれかで４８時間増殖させ、培地中のグルコースの枯渇の後、採取した。
【０２０１】
図１０ａ〜１０ｄに結果が示されている実験について、プラスミドｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１によってコードされるＨＣＶ融合ポリペプチドならびに上述の他の融合ポリペプチドの発現について試験するために、酵母形質転換体を、新しく増殖させた単一コロニー、凍結グリセロールストックまたは数日後の液体培養物のいずれか由来の３ｍｌのｌｅｕ⁻／８％グルコース培地中に接種した。これらの培養物は、「スターター培養物」と呼ばれ、３０℃で３６〜４８時間増殖させた。次いで、各スターター培養物の１．５ｍｌを、２８．５ｍｌのＹＥＰＤに接種し、２５℃で４８〜５０時間増殖させた。等しいアリコートの細胞（同じ体積の、ひとまとまりの細胞）を、溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で、ガラスビーズで溶解させた。溶解した酵母細胞試料を１４Ｋｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を廃棄し、不溶性酵母ペレット（ＩＰ）を５００μｌのｐＨ１２ ＳＤＳ試料バッファー＋５０ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、傾斜した振とう器上に１時間置いた。再懸濁させたＩＰ試料を８〜１０秒間超音波分解し（Ｖｉｒｓｏｎｉｃ ６０、１７に設定）、さらなる５００μｌのｐＨ１２ ＳＤＳ試料バッファー＋５０ｍＭ ＤＴＴを、超音波分解した試料に添加した。ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で試料を１分間遠心分離して、残渣をペレット化した。各試料の５μｌを、煮沸なしで、ＳＤＳ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（４〜２０％）上に負荷した。
【０２０２】
電気泳動の後に、ゲルをクマシーブルーで染色するか（図１０ａ〜１０ｄのそれぞれの左側に示す）、またはニトロセルロースろ紙にブロットし、ウエスタンブロッティング技術を用いてウサギ抗ＨＣＶヘリカーゼ抗体とともにインキュベートするか（図１０ａ〜１０ｄのそれぞれの右側に示す）のいずれかをした。一次抗体であるウサギ抗ヘリカーゼ＃１抗体（ＢＡｂＣＯ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、１：１０，０００の希釈で使用した。次いで、ブロットを、１：１０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ−結合体で検出し、ＨＲＰ発色試薬で展開した。
【０２０３】
図１０Ａは、アミノ末端にａａ３８４〜ａａ７１５のＥ２エクトドメインを有さないＨＣＶ融合ポリペプチドの発現レベルの比較である。図中の全ての試料についてのスターター培養物を、新しく増殖させた単一コロニーから接種した。全ての試料は、不溶性ペレット（ＩＰ）を示し、１ｍｌのｐＨ１２ ＳＢ＋ＤＴＴ中に１時間再懸濁させ、約８秒間超音波分解した。図１０Ａに示される試料は、
レーンＳＴ、分子量標準
レーンＣ、ｐＡＢ２４プラスミドベクター対照；
レーン１、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン２、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン３、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ（２１７．０ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン４、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ（２１７．０ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン５、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２３３．６ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン６、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２３３．６ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン７、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン８、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン９、Δｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２０８．０ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン１０、Δｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２０８．０ｋＤ）、コロニーＢ
である。
【０２０４】
図１０Ｂは、互いにアミノ末端にａａ３８４〜ａａ７１５のＥ２エクトドメインを有する融合ポリペプチドと、対照として働くΔｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１ポリペプチドとの発現レベルの比較である。図中に示される全ての試料についてのスターター培養物を、新しく増殖させた単一コロニーから接種した。全ての試料は、不溶性ペレット（ＩＰ）を示し、１ｍｌのｐＨ１２ ＳＢ＋ＤＴＴ中に１時間再懸濁させ、約８秒間超音波分解した。図１０Ｂに示される試料は、
レーンＣ、ｐＡＢ２４プラスミドベクター対照；
レーンＳＴ、分子量標準；
レーン１、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン２、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン３、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ（２５３．６ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン４、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ（２５３．６ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン５、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２６９．２ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン６、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２６９．２ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン７、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン８、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、コロニーＢ；
レーン９、Δｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２０８．０ｋＤ）、コロニーＡ；
レーン１０、Δｎｓ３ｍ−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２０８．０ｋＤ）、コロニーＢ
である。
【０２０５】
図１０Ｃは、種々の融合ポリペプチドの発現および検出の、新しく増殖させたコロニーから接種されたｐＡＢ２４以外の凍結グリセロールストック由来の接種材料との比較である。図１０Ｄは、同じ融合タンパク質の、凍結ストックまたは単一コロニーの代わりの数日後の液体培養物由来の接種材料との比較である。これらを行って、所望の融合ポリペプチドの将来の発現および検出レベルが、凍結ストック、予め調製された液体培養物および新しい単一コロニーの両方由来の複数世代の増殖の間中維持され得ることを確認した。
【０２０６】
図１０Ｃに示される試料は、
レーンＳＴ、分子量標準；
レーンＣ、ｐＡＢ２４プラスミドベクター対照；
レーン１、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、凍結ストックＡ；
レーン２、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、凍結ストックＢ；
レーン３、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、凍結ストックＡ；
レーン４、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、凍結ストックＢ；
レーン５、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、凍結ストックＡ；
レーン６、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、凍結ストックＢ；
レーン７、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、凍結ストックＡ；
レーン８、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、凍結ストックＢ；
レーン９、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、凍結ストックＣ；
レーン１０、Δｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１（２０８．０ｋＤ）、コロニー
である。
【０２０７】
図１０Ｄに示される試料は、
レーンＳＴ、分子量標準；
レーンＣ、ｐＡＢ２４プラスミドベクター対照；
レーン１、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、液体培養物Ａ；
レーン２、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２１９．３ｋＤ）、液体培養物Ｂ；
レーン３、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、液体培養物Ａ；
レーン４、ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２３０．３ｋＤ）、液体培養物Ｂ；
レーン５、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、液体培養物Ａ；
レーン６、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５（２５６．０ｋＤ）、液体培養物Ｂ；
レーン７、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、液体培養物Ａ；
レーン８、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１（２６６．３ｋＤ）、液体培養物Ｂ
である。
【０２０８】
ウエスタン解析によって検出される発現レベルの量の対照としてΔｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１を用いて、図１０ａおよび１０ｂ中で検出された融合ポリペプチドの量を目視検査によって評価し、相対量を下記の表２中に要約する。
【０２０９】
表２．Δｎｓ３−ｎｓ５．ｃｏｒｅ１２１融合ポリタンパク質対照と比較した、ウエスタン解析によって検出されたＨＣＶ融合ポリペプチド発現レベルの要約。
【０２１０】
【表２Ａ】

【０２１１】
【表２Ｂ】

図１０Ａ、１０Ｂおよび表２に示される結果から、特にアミノ末端にａａ３８４〜ａａ７１５のＥ２エクトドメインを有さないｎｓ３ｍ−ｎｓ５およびｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ ｃｏｒｅ１２１と比較した場合に、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５およびｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ ｃｏｒｅ１２１が特に高いレベルで発現されることが示される。
【０２１２】
（ＨＣＶ融合ポリペプチド−ＩＳＣＯＭ製剤の生成）
上述のように生成された、Ｅ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅ１２１融合タンパク質、またはｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｔｒ．ｃｏｒｅ１２１を用いて、ＨＣＶ融合−ＩＳＣＯＭを次のように生成した。融合タンパク質を、イオン相互作用を利用して融合タンパク質とアジュバントとの間の関連を最大化して、予め形成されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＩＳＣＯＭを使用する）と混合することによって、融合−ＩＳＣＯＭ製剤を調製した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは、本質的に、Ｃｏｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３に記載されているように調製される。ＨＣＶ融合ポリペプチド＋ＩＳＣＯＭの生成のためのさらなる方法は、本明細書中に記載されている。融合−ＩＳＣＯＭ製剤はまた、本明細書中で、「ＩＭＸ／ポリ」または「ＩＭＸ−ポリ」と呼ばれる。一実施形態において、ＣｐＧを製剤に添加し、完全な製剤を「ＩＭＸ／ポリ／ＣｐＧ」と名付けた。
【０２１３】
（実施例２）
（融合ポリペプチドワクチン製剤がＴ細胞応答を準備刺激する能力）
（免疫化）
以下の研究を行って、ＣｐＧありまたはなしで、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｃｏｒｅ１２１／ＩＳＣＯＭ、またはＩＭＸ／ポリがＨＣＶ特異的免疫応答、特にＴ細胞応答を準備刺激する能力を判定した。また、ＩＭＸ／ポリでの一次免疫と、それに続く、野生型ＮＳ３４５をコードするアルファウイルスレプリコン（「α−ＮＳ３４５」）での追加免疫またはその逆（α−ＮＳ３４５で準備刺激して、融合−ＩＳＣＯＭ製剤で追加免疫する）を、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答に対するそれらの効果について試験した。結果を図８（ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答）および図９（ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答）に示す。
【０２１４】
１つの群あたり１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌの総体積で（すなわち、大腿１つあたり５０μｌ）、示されたワクチン製剤（図８および９）を０、３、および６週間目に前脛骨筋に筋肉内（ＩＭ）注射し、血清を２、５、および８週間目に収集した。準備刺激−追加免疫試験のために、マウスを０および３週間目に準備刺激し、６週間目に追加免疫した。非構造タンパク質（ＮＳ３４５）については、ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＮＳ３４５の５Ｅ６複製粒子および５０μｇのポリタンパク質を５μｇのＩＭＸ（Ｐｅａｒｓｅ，Ｍ．Ｊ．およびＤ．Ｄｒａｎｅ、２００５、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５７：４６５−７４；Ｐｅａｒｓｅ，Ｍ．Ｊ．およびＤ．Ｄｒａｎｅ、２００４、Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：２３９１−５；Ｐｏｌａｋｏｓら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：３５８９−９８）とともに、１０μｇのＣｐＧありまたはなしで、注射のために混合した。脾臓におけるＴ細胞応答および血清中の抗体応答を検出するために、マウスを８週間目に屠殺した。
【０２１５】
（細胞内染色（ＩＣＳ））
脾臓細胞（１Ｅ６）を、表３に示される１０μｇ／ｍｌのペプチドまたはタンパク質で、抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびブレフェルジンＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の存在下で、３７℃で６時間刺激し、次いで、ＣＤ４（抗ＣＤ４アロフィコシアニン結合体、クローンＳＫ３、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣＤ８（抗ＣＤ８α ＰｅｒＣＰ結合体、クローンＳＫ１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に対する抗体で染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびＩＦＮ−γ（クローン４Ｓ．Ｂ３、フィコエリトリン結合体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で透過処理した。染色された細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。サイトカイン陽性細胞の平均頻度を、２つ組の各対について計算した。刺激されていない平均頻度（ペプチドなし）を刺激された平均頻度（ＨＣＶペプチドで、表３）と比較することによって、抗原特異的頻度を判定し、ｔ検定によって、ｐ＜０．０５を、統計的に有意であると見なす。
【０２１６】
【表３】

図８に示される結果から、ＣｐＧなしのＩＭＸ−ポリが、陰性対照と比較して、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を誘導することができることが示される。ＩＭＸ−ポリへのＣｐＧの添加によって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答がさらに増大した。ＣｐＧありまたはなしでの、種々の順序でのＩＭＸ−ポリおよびα−ＮＳ３４５での準備刺激および追加免疫もまた、有意なＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を誘導した。
【０２１７】
（実施例３）
（対応するＮＳエピトープを発現するアルファウイルス）
アルファウイルスレプリコン粒子、例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩＮＣＲ（ＬＰ）を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載されているように調製した。アルファウイルスレプリコンは、本明細書中に記載されている免疫原性ＨＣＶ融合ポリペプチド組成物のアミノ酸と比較して、さらなるＨＣＶエピトープの全てもしくは一部分を含む。実施例２において使用されたα−ＮＳ３４５レプリコンは、ＮＳ３、４および５の完全な配列（ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１）を含んでおり、ＮＳ３に変異はなかった。実施例２に示されるように、準備刺激追加免疫化戦略の一部として、かかるアルファウイルス粒子を、本発明のＨＣＶ融合ポリペプチドと組み合わせて使用してもよい。
【０２１８】
（実施例４）
（修飾されたＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔおよびＥ２ＮＳ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成）
以下の実施例におけるＥ２は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５を含む、Ｃ末端の切断されたＥ２分子を表す。一実施形態におけるＥ２核酸を、ＮＳ２タンパク質のアミノ酸１０１８〜１０２６をコードする核酸に融合させたが、これは、ポリタンパク質のコア１２１アミノ酸をコードする核酸に融合した、ポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜３０１１または２９９０をコードする核酸に融合している。
【０２１９】
これらの２つのベクターのＨＣＶ融合ポリペプチドは、図１１中で「ｅ２．ｎｓ３ｍ．ｎｓ５−／−ｃｏｒｅ１２１」（ＮＳ５ｂの全長バージョン）および「ｅ２．ｎｓ３ｍ．ｎｓ５ｔ−／−ｃｏｒｅ１２１」（切断されたＮＳ５ｂ）修飾ＮＳ３ポリペプチドとして見出される。示されるＥ２アミノ酸配列を含む構築物は、本明細書中に記載されているコア１〜１２１を含む。
【０２２０】
ポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜２９９０をコードする核酸の部分は、修飾されたＮＳ３タンパク質（１０２７〜１６５７）、ＮＳ４ａＮＳ４ｂ（１６５８〜１９７２）およびＮＳ５ａＮＳ５ｂ（１９７３〜２０９０）をコードし、ここでＮＳ５ｂタンパク質は切断されている。
【０２２１】
ポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜３０１１をコードする核酸は、修飾されたＮＳ３タンパク質（１０２７〜１６５７）、ＮＳ４ａＮＳ４ｂ（１６５８〜１９７２）およびＮＳ５ａＮＳ５ｂ（１９７３〜３０１１）」をコードし、ここでＮＳ５ｂは全長である。
【０２２２】
ＨＣＶ融合ポリペプチドの、修飾されたＮＳ３部分は、プロテアーゼ活性の喪失を生じる、Ｓｅｒ１１６５からアラニンの変異を含む。
【０２２３】
図１１に示される、さらなる融合タンパク質は、（１）ポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜３０１１をコードする核酸は、修飾されたＮＳ３タンパク質（１０２７〜１６５７）、ＮＳ４ａＮＳ４ｂ（１６５８〜１９７２）およびＮＳ５ａＮＳ５ｂ（１９７３〜３０１１）をコードし、ここでＮＳ５ｂは全長である（「ｎｓ３ｍ．ｎｓ５＋／−ｃｏｒｅ１２１」）、または（２）ポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜２９９０をコードする核酸は、修飾されたＮＳ３タンパク質（１０２７〜１６５７）、ＮＳ４ａＮＳ４ｂ（１６５８〜１９７２）およびＮＳ５ａＮＳ５ｂ（１９７３〜２０９０）をコードし、ここでＮＳ５ｂタンパク質は切断されている（「ｎｓ３ｍ．ｎｓ５ｔｒ＋／−ｃｏｒｅ１２１」）に融合した、ＮＳ２の最後の９個のアミノ酸を含む。
【０２２４】
本明細書中に記載されている融合タンパク質への、ＮＳ２の最後の９個のアミノ酸の付加によって、ＮＳ３遺伝子部分の上流およびポリタンパク質のＥ２部分の下流の、天然に存在するメチオニンが提供され、したがって、天然に存在するＨＣＶポリタンパク質からのエピトープの変化が最小限にされる。
【０２２５】
一実施形態において、本発明は、酵母における向上したタンパク質発現を可能にする、修飾されたＨＣＶ融合ポリペプチドを提供する。
【０２２６】
ＨＣＶ−１ ＮＳ３ドメイン（ａａ１０２７〜ａａ１６５７）のＮ末端はトリプシン様セリンプロテアーゼをコードするので、プロテアーゼの触媒的三連構造の天然のＳｅｒ_１１６５をＡｌａに変異させて、ＨＣＶ ｅ２ｎｓ３_ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１融合ポリペプチドの自己タンパク質分解を予防する。
【０２２７】
したがって、ＨＣＶ融合ポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが開示される。本発明の好ましい実施形態を多少詳しく説明してきたが、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく明らかな変化を行うことができることが、理解される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
（２）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
（３）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；ならびに
（４）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
からなるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドからなる単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫学的組成物。
【請求項２】
（１）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
（２）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
（３）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；ならびに
（４）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
からなるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドからなる単離されたＨＣＶ融合ポリペプチドを含む、免疫学的組成物。
【請求項３】
さらなるＨＣＶ免疫原性ポリペプチドをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらなるＨＣＶ免疫原性ポリペプチドがＥ１Ｅ２複合体を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
免疫刺激分子をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫刺激分子がＣｐＧである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
被験体に治療有効量の請求項１〜７のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を刺激する方法。
【請求項９】
脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を刺激する方法における、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１０】
被験体において細胞性免疫応答を刺激するための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物を薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせることを含む、組成物を生成するための方法。
【請求項１２】
（１）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
（２）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
（３）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；ならびに
（４）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がリシンであり、コア配列のアミノ酸１１がアスパラギンである；
からなるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドからなるＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
（１）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
（２）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４〜７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
（３）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；ならびに
（４）アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、ＮＳ２のアミノ酸１０１８〜１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８〜１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびコアのアミノ酸１〜１２１、ここでＮＳ３配列の１１６５位のセリンがアラニンで置換されており、コア配列のアミノ酸９がアルギニンであり、コア配列のアミノ酸１１がスレオニンである；
からなるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドからなるＨＣＶ融合ポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
（ａ）請求項１２または請求項１３に記載のポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それによって宿主細胞中でコード配列が転写および翻訳される、少なくとも１つの制御因子
をコードする、単離された核酸
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸で形質転換された、宿主細胞。
【請求項１６】
ＨＣＶ融合ポリペプチドを生成するための方法であって、前記ポリペプチドを生成するための条件下で請求項１５に記載の宿主細胞の集団を培養することを含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図３Ｈ】

【図３Ｉ】

【図３Ｊ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１】

【公表番号】特表２０１０−５０１５８０（Ｐ２０１０−５０１５８０Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５６６２（Ｐ２００９−５２５６６２）
【出願日】平成１９年８月２７日（２００７．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８９４０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２４５１８
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス　アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】