ＨＣＶ複製阻害の標的
ＨＣＶ複製に関与する肝臓発現タンパク質は、ＨＣＶレプリコン活性に対する宿主細胞タンパク質発現阻害の影響を測定する方法を使用して同定された。同定されたタンパク質およびコードしている核酸は、それぞれが、ＨＣＶ複製を阻害するため、およびＨＣＶ複製を阻害する化合物の能力を評価するための標的となる。ＨＣＶ複製を阻害する化合物には、同定されたタンパク質を標的化する化合物および同定されたタンパク質をコードしている核酸を標的化する化合物が含まれる。ＨＣＶ複製を阻害するための標的として同定された宿主遺伝子のいくつかはまた、ＨＩＶ複製を阻害するための標的であることが発見された。ＨＩＶおよびＨＣＶ複製の両方を阻害するための標的となる能力は、このような同定遺伝子およびコード化タンパク質が様々なウイルスの複製を阻害するための標的となることができ、特定ウイルスの複製の阻害に限定されないことを示している。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、それぞれ参照により本明細書に組み込んだ２００５年６月２２日出願の米国特許仮出願第６９２８２１号および２００５年８月１９日出願の米国特許仮出願第７１０００６号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願で引用した参考文献は、特許請求した本発明の先行技術であると自認しない。
【０００３】
ＨＣＶに曝露すると、わずかな症例で顕性急性疾患が生じるが、ほとんどの場合、ウイルスは慢性感染を確立して肝臓の炎症を引き起こし、ゆっくりと肝不全および肝硬変に進行する（Ｉｗａｒｓｏｎ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１４：２０１〜２０４、１９９４）。疫学的調査によって、ＨＣＶは肝細胞癌病理発生に重要な役割を果たすことが示されている（Ｋｅｗ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１４：２１１〜２２０、１９９４、Ａｌｔｅｒ、Ｂｌｏｏｄ、８５：１６８１〜１６９５、１９９５）。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、アミノ酸約３００個の前駆体ポリタンパク質をコードする長さ約９．５ｋｂの１本鎖ＲＮＡから構成される（Ｃｈｏｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：３６２〜３６４、１９８９、Ｃｈｏｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：３５９〜３６２、１９８９、Ｔａｋａｍｉｚａｗａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５〜１１１３、１９９１）。ＨＣＶポリタンパク質は、ウイルスタンパク質をＣ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順番で含有する。
【０００５】
個々のウイルスタンパク質は、ＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解により生成される。宿主細胞プロテアーゼは、推定構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７を放出し、アミノ酸８１０でＮＳ２のＮ末端を形成する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：２７３１〜２７３４（１９９４）；Ｈｉｊｉｋａｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０７７３〜１０７７７、１９９３）。
【０００６】
非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂはおそらく、ウイルス複製機構を形成し、ポリタンパク質から放出される。ＮＳ２およびＮＳ３のＮ末端に関連する亜鉛依存性プロテアーゼは、ＮＳ２とＮＳ３との間の開裂に関与する（Ｇｒａｋｏｕｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：１３８５〜１３９５、１９９３、Ｈｉｊｉｋａｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０７７３〜１０７７７、１９９３）。
【０００７】
ＮＳ３のＮ末端ドメイン中に位置する別のセリンプロテアーゼは、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部でのタンパク質分解開裂に関与している（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：３８３５〜３８４４、１９９３、Ｇｒａｋｏｕｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０５８３〜１０５８７、１９９３、Ｔｏｍｅｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４０１７〜４０２６、１９９３）。ＲＮＡ誘発ＮＴＰアーゼおよびヘリカーゼ活性は、ＮＳ３のＣ末端に位置する。
【０００８】
ＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼ活性のコファクターとなる（Ｆａｉｌｌａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：３７５３〜３７６０（１９９４）；ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ他、米国特許第５７３９００２号明細書）。
【０００９】
ＮＳ５Ａはインターフェロン耐性を与える高リン酸化タンパク質である（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ．Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．Ｓｕｐｐｌ．、１：４７〜４８、１９９９）。
【００１０】
ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとなる（ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ他、１９９６年１１月２８日公開ＷＯ９６／３７６１９、Ｂｅｈｒｅｎｓ他、ＥＭＢＯ １５：１２〜２２、１９９６；Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９：１０８〜１１８（１９９８））。
【発明の開示】
【００１１】
ＨＣＶ複製に関与する肝臓発現タンパク質は、ＨＣＶレプリコン活性に対する宿主細胞タンパク質発現阻害の影響を測定する方法を使用して同定された。同定されたタンパク質およびコードしている核酸は、それぞれが、ＨＣＶ複製を阻害するための、および化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力を評価するための標的となる。ＨＣＶ複製を阻害する化合物には、同定タンパク質を標的とする化合物および同定タンパク質をコードする核酸を標的とする化合物が含まれる。ＨＣＶ複製を阻害する標的として同定された宿主遺伝子のいくつかはまた、ＨＩＶ複製を阻害するための標的であることが発見された。ＨＩＶおよびＨＣＶ複製の両方を阻害する標的となる能力は、このような同定遺伝子およびコードされたタンパク質が様々な種類のウイルスの複製を阻害するための有用な標的となることができ、特定のウイルス複製の阻害に限定されないことを示している。
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ライブラリーを使用して、ウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製に関与する宿主細胞因子を同定する方法を説明する。この方法は、異なる細胞因子を標的化してウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製を阻害するｓｉＲＮＡライブラリーの能力を測定するステップを含み、このｓｉＲＮＡライブラリーには、従来はウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製に関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１０個の異なるｓｉＲＮＡが標的化することが含まれる。
【００１３】
「ライブラリー」は、実験の一部としてスクリーニングされる異なるｓｉＲＮＡの集合を含有する。実験結果は、ほぼ同一の時点または限定された期間にわたって得られる。様々な実施形態では、限定された期間は、約１週間または約１日の範囲内である。好ましくは、このライブラリーの構成要素は、同時に試験される。
【００１４】
異なる宿主細胞因子を標的とするｓｉＲＮＡの一定数を含むライブラリーについて記載することで、異なるｓｉＲＮＡの少なくとも一定数が使用されることを表す。様々な実施形態では、このライブラリーは１００、５００または１０００個の構成要素を含み、かつ／または異なる構成要素のそれぞれは、キナーゼまたはホスファターゼである。他の実施形態では、このライブラリーは５０００、１００００または２００００個の構成要素を含み、ゲノム規模のライブラリーであると考えられる。
【００１５】
本発明の他の態様は、化合物がウイルスの複製を阻害する能力を評価する方法を記載する。この方法は、
（ａ）ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質またはこの標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、この標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質に結合する、または、このようなタンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物を同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定した化合物がウイルス複製を阻害する能力を測定するステップと
を含む。
【００１６】
標的タンパク質に結合する、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物の最初の同定は、実験的に実験することができるか、あるいは化合物が同定された標的の１つに結合するか、または同定された標的の１つを阻害する能力に関する公知の情報に基づくことができる。様々な標的に関する情報は、科学文献から入手できる。この化合物は活性阻害を最初に同定されることが好ましい。
【００１７】
好ましい実施形態では、ウイルスはＨＩＶまたはＨＣＶである。化合物のウイルス複製阻害能力の測定には、（１）化合物が結合するか、またはウイルス複製を阻害することができることを最初に同定すること、あるいは（２）化合物がウイルス複製を阻害する範囲を測定することのいずれか、または両方が含まれる。ウイルス複製の阻害は、定量的または定性的測定法で測定することができる。例えば、化合物のＨＣＶ複製阻害能力の測定には、（１）化合物が結合するか、またはＨＣＶ複製を阻害することができることを最初に同定すること、あるいは（２）化合物がＨＣＶ複製を阻害する範囲を測定することのいずれか、または両方が含まれる。
【００１８】
参照タンパク質配列との配列同一性は、タンパク質配列と参照配列とを整列させ、対応する領域内の同一アミノ酸の数を測定することによって決定される。この数を参照配列（例えば、配列番号１）内のアミノ酸の総数で除し、次に１００を乗し、最も近い整数に四捨五入する。
【００１９】
本発明の他の態様は、ＨＣＶ複製を阻害する方法を記載する。この方法は、ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号第７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質、またはこの標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、この標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物の有効量を使用する。
【００２０】
本発明の他の態様は、宿主におけるウイルス複製を阻害する方法を記載する。宿主は、ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号第２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質、または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害できる化合物の有効量を与えられる。
【００２１】
「宿主」とは、ウイルスに感染した、または感染することができる細胞、動物、またはヒトを示す。この化合物は、ウイルス感染前またはウイルスに感染した宿主に投与することができる。
【００２２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」などの制限のない用語では、追加的要素またはステップが許可される。「１個または複数」などの補助的用語は、追加的要素またはステップの可能性を強調するために制限のない用語を伴って、または伴わずに使用される。
【００２３】
明白に記載していなければ、「ａ」または「ａｎ」などの用語は、１つを限定して指していない。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、「細胞（複数）（ｃｅｌｌｓ）」を除外しない。１個または複数などの補助的用語は、複数の存在の可能性を強調するために使用される。
【００２４】
本発明のその他の特性および利点は、様々な実施例を含む本明細書で提供された追加的記載から明らかである。提供された実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分および方法を例示する。この実施例は、特許請求された本発明を制限しない。本開示に基づいて、当業者は本発明の実施に有用なその他の成分および方法を同定し、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ＨＣＶ複製を阻害するための異なる宿主細胞タンパク質標的は、ＨＣＶレプリコン活性に対する宿主細胞タンパク質発現阻害の影響を測定する方法を使用し、標的タンパク質の肝臓発現を考慮して同定された。ＨＣＶ複製に関与することが同定されたタンパク質およびコードしている核酸は、それぞれが、ＨＣＶ複製を阻害し、ＨＣＶ複製を阻害する化合物の能力を評価するための標的となる。
【００２６】
ＨＣＶ複製を阻害する標的として同定された宿主遺伝子のいくつかはまた、ＨＩＶ複製を阻害することが発見された。ＨＩＶおよびＨＣＶ両方の標的となる能力は、このような標的が様々な種類のウイルスの複製を阻害するための有用な標的となることができ、特定ウイルスの複製の阻害に限定されないことを示している。
【００２７】
ＨＩＶおよびＨＣＶなどのウイルス複製の阻害は、研究上および治療上意味がある。研究への適用例には、ウイルスの複製および発現、例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶの複製および発現を研究するための手段の提供が含まれる。治療への適用例には、患者におけるウイルス感染（例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染）を治療するか、または発症を阻害するために効果的であり、かつ許容できない毒性を有さないなどの適切な薬理学的特性を備えた化合物を使用することが含まれる。
【００２８】
標的の同定
本明細書で同定されたＨＣＶ複製などのウイルス複製を阻害するための標的は、宿主細胞因子である。同定された宿主細胞因子をコードしている核酸配列、宿主因子および実質的に類似の核酸またはタンパク質は、それぞれが、ＨＣＶ複製などのウイルス複製を阻害するための標的として使用することができる。表１に、ＨＣＶ複製、場合によってはＨＩＶ複製を阻害するために同定された宿主細胞因子に関する情報を挙げる。
【００２９】
表１に挙げた標的はまた、ＨＣＶ以外のウイルスの複製を阻害するために有用であり得る。ＨＣＶ標的のサブセットについて、ＨＣＶ複製阻害を試験した。実施例１３に記載したように、以下のＰＩＫ４ＡＣ、ＳＹＮＰＲ、ＤＹＲＫ４、ＰＦＫＬ、ＧＡＫ、ＤＵＳＰ１９およびＤＵＴの阻害は、ＨＩＶ複製も阻害する。ＨＣＶおよびＨＩＶ複製の両方を阻害する能力は、様々なウイルス種の複製におけるこのような標的としての役割を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
特定の同定された配列に実質的に類似の核酸およびタンパク質は、特定の同定された配列に対して少数の変化を有する配列である。実質的に類似の配列には、１種または複数の天然に生じる多形化または人工的変化を含有する配列が含まれる。
【００３２】
実質的に類似のタンパク質配列は、参照配列と少なくとも９５％同一である。実質的に類似のタンパク質配列はまた、参照配列より活性が著しく低くてはならない。著しく低い活性とは、同定されたタンパク質の活性の約８０％未満である。
【００３３】
様々な実施形態では、実質的に類似のタンパク質配列は、参照配列とは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸変化によって異なる。アミノ酸変化はそれぞれ独立して、付加、欠失および置換である。実質的に類似の配列は、天然に生じる変種であることが好ましい。
【００３４】
実質的に類似の核酸は、参照配列と少なくとも９５％同一である。実質的に類似の核酸配列は、参照配列によってコードされるタンパク質よりも活性が著しく低いタンパク質をコードしてはならない。著しく低い活性とは、同定されたタンパク質の活性の約８０％未満である。
【００３５】
参照核酸配列との配列同一性は、核酸配列と参照配列とを整列させ、対応する領域内の同一ヌクレオチドの数を測定することによって決定する。この数を参照配列（例えば、配列番号２）内のヌクレオチドの総数で除し、次に１００を乗し、最も近い整数に四捨五入する。
【００３６】
様々な実施形態では、実質的に類似の核酸配列は、参照配列とは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチド変化によって異なる。ヌクレオチド変化はそれぞれ独立して、付加、欠失および置換である。実質的に類似の配列は、天然に生じる変種であることが好ましい。
【００３７】
タンパク質生成
タンパク質は、化学合成の技術およびそのタンパク質を生成する細胞からの精製に関する技術を含む当業界で周知の技術を使用して産生することができる。タンパク質の化学合成技術は、当業界で周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｄｅｃｋｅｒ、１９９０参照。）。組換えタンパク質産生および精製技術はまた、当業界で周知である(例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２参照。）。
【００３８】
細胞からのタンパク質の獲得は、そのタンパク質を産生するための組換え核酸技術を使用すると容易である。タンパク質産生のための組換え核酸技術には、そのタンパク質をコードしている組換え遺伝子を細胞内に導入するか、または細胞内で産生させ、そのタンパク質を発現させることが含まれる。
【００３９】
組換え遺伝子は、タンパク質発現のための調節因子と共にタンパク質をコードする核酸を含有する。組換え遺伝子は、細胞ゲノムに存在するか、または発現ベクターの一部であることができる。
【００４０】
組換え遺伝子の一部として存在することができる調節因子には、タンパク質をコードしている配列に天然に関連した因子およびタンパク質をコードしている配列に天然では関連してない外来調節因子が含まれる。外来プロモーターなどの外来調節因子は、特定の宿主で組換え遺伝子を発現させるか、または発現レベルを増加させるのに有用であり得る。一般的に、組換え遺伝子に存在する調節因子には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞においてプロセシングされるために好ましい因子は、ポリアデニル化シグナルである。
【００４１】
細胞における組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用すると容易である。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞での自発的複製のための複製起点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、および高コピー数能力も含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドおよびウイルスである。
【００４２】
遺伝子コードの縮重のため、多数の様々なコード核酸配列を特定のタンパク質のコードに使用することができる。遺伝子コードの縮重は、ほとんどのアミノ酸がヌクレオチドトリプレットまたは「コドン」の様々な組み合わせによってコードされるゆえに生じる。アミノ酸は以下のようなコドンによってコードされる。
【００４３】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｄｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドン ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ、ＵＡＵ
組換え遺伝子産生、細胞への導入および組換え遺伝子発現の技術は、当業界では周知である。このような技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋ他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９などの参考文献に挙げられている。
【００４４】
所望するならば、特定の宿主での発現は、コドン最適化によって促進することができる。コドン最適化には、より好ましいコドンの使用が含まれる。異なる宿主でのコドン最適化の技術は、当業界で周知である。
【００４５】
標的タンパク質への結合、または標的タンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物の同定
標的タンパク質に結合する、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物の最初の同定は、実験的に決定することができるか、あるいは標的に関する利用可能な情報に基づくことができる。タンパク質に結合するタンパク質、またはタンパク質活性を阻害する化合物は、タンパク質を対象とする。タンパク質発現を阻害する化合物は、タンパク質をコードしているか、または調節機能を有する核酸を対象とする。
【００４６】
化合物がタンパク質に結合する能力は、競合および非競合結合アッセイなどの技術を使用して測定することができる。このようなアッセイは、例えば、結合を直接測定する標識化合物を使用して、または化合物に結合する検出可能な試薬を使用して結合を測定して、実施することができる。
【００４７】
キナーゼおよびホスファターゼ活性をアッセイする技術は、当業界では周知である。例えば、ＮＭＥ４、ＰＣＫ１、ＳＴＫ１６、ＤＵＳＰ６、ＰＩＫ４ＣＡ、ＰＫＷＮＫ３、ＡＫＡＰ８、ＧＣＫ、ＳＲＰＫ１、ＤＧＫＤ、ＤＵＴ、ＧＡＫ、ＰＦＫＬ、ＰＳＫＨ１、ＳＯＣＳ５、ＴＮＫ１、ＤＵＳＰ１９およびＥＰＨＡ２の活性を測定するために使用できる技術を記載した文献には、Ｋｏｗｌｕｒｕ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３９８（２）：１６０〜１６９、２００２（ＮＭＥ４）、Ｍａｈｏｕｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１３３６：５４９〜５５６、１９９７（ＰＣＫ１）、Ｏｈｔａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３５０（Ｐｔ２）：３９５〜４０４、２０００（ＳＴＫ１６）、Ｋｉｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（５１）：１５１９７〜２０７、２００３（ＤＵＳＰ６）、Ｖａｒｓａｎｙｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７９：４７３〜４７９、１９８９（ＰＩＫ４ＣＡ）、Ｘｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６７９５〜１６８０１、２０００、（ＰＲＫＷＮＫ３）、Ａｋｉｌｅｓｗａｒａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８：２７６（２０）：１７４４８〜５４、２００１（ＡＫＡＰ８）、Ｖａｎ Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９：１１９〜１８４、１９８９（ＧＣＫ）、Ａｕｂｏｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．、１００（２２）：１２６０１〜６、２００３（ＳＲＰＫ１）、Ｉｍａｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３８）：３５３２３〜３２、２００２（ＤＧＫＤ）；Ｃｌｉｍｉｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ．５（３）：２５２〜２５Ｓ（１９９３）（ＤＵＴ）、Ｇｒｅｅｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２）：１３６５〜１３７０、２０００およびＫｉｍｕｒａ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４：１７９〜１８７（１９９７）（ＧＡＫ）、ＦｕｒｕｙａおよびＵｙｅｄａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１４）：７１０９〜７１１２、１９８１、Ｈｉｒａｄａ他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（７０）：２０４７〜２０５２、２０００（ＰＦＫＬ）、Ｂｒｅｄｅ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７０（１）：８２〜９２、２０００、Ｂｒｅｄｅ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０（２３）：５３０１〜５３０９、２００２（ＰＳＫＨ１）；Ｋａｒｉｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８０（８）：７０３８〜７０４８、２００５（ＳＯＣＳ５）；Ｆｅｌｓｃｈｏｗ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７３：２９４〜３０１、２０００（ＴＮＫ１）；Ｚａｍａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２６）：２３９０９〜２３９１８、２００２；およびＰｒａｔｔ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（５０）：７６９０〜９、２００２（ＥＰＨＡ２）が含まれる。
【００４８】
異なるキナーゼおよびホスファターゼの阻害剤は、当業界で周知である。このような阻害剤の例には、ＡＴＭを阻害する２−モルホリン−４−イル−６−チアントレン−１−イル−ピラン−４−オン（ＫＵ−５５９３３）（Ｈｉｃｋｓｏｎ他、、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４（２４）：９１５２〜９、２００４）、ＰＩＫ４ＣＡを阻害する（５Ｒ，６Ｓ）−５−アジド−６−ベンゾイルオキシ−２−シクロヘキセン−１−オン（Ｐｅｌｙｖａｓ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４４：６２７〜６３２、２００１)、ＰＣＫ１を阻害する１−アリル−３−ブチル−８−メチルキサンチン（Fｏｌｅｙ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ、１３（２０）：３６０７〜１０、２００３）、ＤＵＴを阻害する５−マーキュリ−ｄＵＴＰおよびその他のＵＴＰ類縁体（Ｃｌｉｍｉｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ ５（３）：２５２〜２５８、１９９３、Ｂｅｃｋ他、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ、１９５ ＰｔＢ （９７〜１０４）、１９８６およびＰＦＫＬを阻害するＮ−ブロモアセチルエタノールアミンホスファート（Ｈｉｒａｄａ他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（１０）：２０４７〜２０５２、２０００）が含まれる。
【００４９】
酵素活性をアッセイするために使用できる技術および／または表１に記載した非キナーゼ標的タンパク質に結合する化合物も公知である。ＴＲＰＭ５、ＰＨＥＸ、ＭＤＭ４、ＰＤＩＡ３、ＡＰＰＬ３およびＰＡＲＶＢを測定するために使用できる活性測定技術を記載した参考文献の例には、Ｐｒａｗｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７００：１５１６６〜１５１７１、２００３（ＴＲＰＭ５）、Ｂｏｉｌｅａｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３５５：７０７〜７１３、２００１（ＰＨＥＸ）、Ｂａｄｃｉｏｎｇ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：４９６６８〜４９７７５、２００２（ＭＤＭ４）；Ｆｒｉｃｋｅｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９：１８２７７〜１８２８７、２００４、（ＰＤＩＡ３）、Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：４９８０８〜４９８１４、１９９２（ＡＬＰＰＬ２）、Ｏｌｓｋｉ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：５２５〜５３８（２０００）（ＰＡＲＶＢ）が含まれる。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１は血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの触媒的に不活性なサブユニットであるが、完全なアセチルヒルドロラーゼ酵素複合体の測定条件は、Ｈａｔｔｏｒｉ ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８７４８〜１８７５３、１９９３（ＰＡＦＡＨ１Ｂ１）に見いだすことができる。
【００５０】
同定されたタンパク質をコードしている核酸配列は、その核酸にハイブリダイズすることができる化合物の標的となる。核酸配列にハイブリダイズできる化合物の例には、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸が含まれる。阻害機構は、化合物の種類に応じて変化する。ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸の生成および使用技術は当業界で周知である（例えば、Ｐｒｏｂｓｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２：２７１〜２８１、２０００、Ｚｈａｎｇ他、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．１０６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第２版、ｐ．１１〜３４、Ｉ．Ｐｈｉｌｉｐｓ著、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００５）。さらに、以下に挙げた実施例は、ｓｉＲＮＡの使用を例示する。
【００５１】
核酸をベースにした化合物を輸送するためのベクターには、プラスミドおよびウイルスをベースにしたベクターが含まれる。治療的応用に好ましいベクターはレトロウイルスおよびアデノウイルスをベースにしたベクターである(Ｄｅｖｒｏｅ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（３）３１９〜３２７、２００４、Ｚｈａｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２０：１３５〜１４３、２００４）。
【００５２】
ＨＣＶ阻害活性の測定
化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または動物モデルを使用して測定することができる（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．７（１）：２３〜４３、２００３）。化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、ＨＣＶまたはＨＣＶレプリコンの使用が関与する。ＨＣＶは培養で増殖させることが困難なので、好ましいｉｎ ｖｉｔｒｏ技術ではＨＣＶレプリコンを使用する。
【００５３】
ＨＣＶレプリコンとは、Ｈｕｈ７のように培養細胞中で自発的に複製できるＲＮＡ分子である。ＨＣＶレプリコンは、複製機構のＨＣＶ由来成分を発現し、培養細胞中での複製に必要なシス因子を含有する。
【００５４】
ＨＣＶレプリコンの生成および使用は、様々な文献に記載されている（例えば、Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５：１１０〜１１３、１９９９、Ｂｌｉｇｈｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：１９７２〜１９７４、２０００、Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５：１４３７〜１４４９、２００１、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５：１２５２〜１２６４、２００１、Ｇｒｏｂｌｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：１６７４１〜１６７４６、２００３、Ｍｕｒｒａｙ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７７（５）：２９２８〜２９３５、２００３、Ｚｕｃｋ他、Ａｎａｌ Ｂｒｉｏｃｈｅｍ．３３４（２）：３４４〜３５５、２００４、Ｌｕｄｍｅｒｅｒ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４９（５）：２０５９〜６９、２００５、Ｒｉｃｅ他、２００１年１１月２９日公開の国際公開第０１／８９３６４号、Ｂｉｃｈｋｏ、２００２年５月１６日公開の国際公開第０２／２３８７９３号、Ｋｕｋｏｌｊ他、２００２年７月４日公開の国際公開第０２／０５２０１５号、２００２年８月１日公開のＤｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ他、国際公開第０２／０５９３２１号、Ｇｌｏｂｅｒ他、２００４年９月２日公開の国際公開第０４／０７４５０７号およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、米国特許第６６３０３４３号を参照）。
【００５５】
化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力は、ＨＣＶ感染の疑われる天然由来の、または人工的な動物モデルを使用して測定することができる。ヒトおよびチンパンジーなどの数種の動物のみがＨＣＶ感染に感受性である。チンパンジーは、ＨＣＶ感染に対する化合物の効果を測定するための動物モデルとして使用されてきた。
【００５６】
ＨＣＶ感染に感受性のある人工的動物モデルは、マウスにヒト肝臓を移植することによって作製された（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．７（１）：２３〜４３、２００３）。キメラマウス−ヒト肝臓を有するトランスジェニックマウスが小動物モデルのために使用される。
【００５７】
ＨＩＶ阻害活性の測定
化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または動物モデルを使用して測定することができる。化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、例えば、ウイルス生活環の初期段階（組み込みによる侵入）を測定する技術が含まれるか、またはウイルス感染拡大が続くＴ細胞系または末梢血単核細胞のＨＩＶ感染の使用が関与する（例えば、Ｊｏｙｃｅ他、、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４８）：４５８１１〜２０、２００２、Ｎｕｎｂｅｒｇ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５（９）：４８８７〜４８９２、１９９１、Ｇｏｌｄｍａｎ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６（５）：１０１９〜１０２３、１９９２）。
【００５８】
化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力は、ＨＩＶまたはＳＨＩＶ（サル−ヒト免疫不全ウイルス）と称されるＨＩＶおよびＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）ゲノムの断片を一緒にすることによって創出されたキメラウイルスのいずれかによる感染に感受性のある非ヒト霊長類モデルで測定することができる。ヒトおよびチンパンジーなどの数種の動物のみがＨＩＶ感染に感受性がある。チンパンジーは、ＨＩＶ感染に対する化合物の効果を測定するための動物モデルとして使用されてきた。（Ｇｒｏｂ他、Ｎａｔ Ｍｅｄ．３（６）：６６５〜６７０、１９９７）。非ヒト霊長類におけるＨＩＶ感染に対する化合物の効果の測定は、ＳＨＩＶに感染したアカゲザルで実施されることが極めて多い（Ｈａｚｕｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８３）：５２８〜３２、２００４）。
【００５９】
投与
一般的な治療用化合物の医薬品投与の指針は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ著、２０００年出版および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」第２版、Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ著、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、１９９０に記されている。
【００６０】
適切な官能基を有する治療的標的に活性のある化合物は、酸塩または塩基塩として調製することができる。薬学的に許容される塩（水溶性または油溶性または分散可能な生成物の形態）には、例えば、無機または有機の酸または塩基から形成される従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。このような塩の例には、酸付加塩、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンホスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩ならびに塩基付加塩、例えば、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの有機塩基による塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、およびアルギニンおよびリシンなどのアミノ酸による塩が含まれる。
【００６１】
化合物は、経口、経鼻、注射、経皮および経粘膜を含む様々な経路を使用して投与することができる。懸濁液として経口的に投与される活性成分は、製薬業界で周知の技術に従って調製することができ、増量のために微結晶性セルロース、懸濁剤としてアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロースおよび甘味剤／矯臭剤を含有することができる。即放性錠剤として、これらの組成物は、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウムおよび乳糖および／またはその他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および光沢剤を含有することができる。
【００６２】
経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与するとき、組成物は製薬業界で周知の技術に従って調製することができ、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存剤、生物学的利用率を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または溶解剤または分散剤を使用して、生理食塩水に溶かした溶液として調製することができる。
【００６３】
この化合物はまた、静脈内（ボーラスおよび注入）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うか、または伴わない局所型、あるいは筋肉内型で投与することができ、いずれも製薬業界の当業者に周知の形態を使用する。注射によって投与するとき、注射溶液または懸濁液は、適切な非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液または等張塩化ナトリウム溶液、あるいは適切な分散剤または湿潤剤または懸濁剤、例えば、滅菌の無刺激性鉱油、例えば、合成モノまたはジグリセリド、および脂肪酸、例えば、オレイン酸を使用して製剤化することができる。
【００６４】
座薬の形態で直腸から投与するとき、組成物は、薬剤を適切な非刺激性の賦形剤、例えば、カカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールと混合することによって調製することができ、通常の温度では固形であるが、直腸腔内で液化および／または溶解して薬剤を放出する。
【００６５】
本発明の治療上の適用に適切な投与計画は、患者の年齢、体重、性別および健康状態、治療する病状の重症度、投与経路、患者の腎機能および肝機能、使用した特定の化合物を含む当業界で周知の要素を考慮して選択される。医薬品投与および医薬組成物の指針は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第２０版、前述、および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」第２版、前述に記載されている。
【００６６】
毒性を伴わず効果を発揮する範囲内の薬剤濃度を最適な精度で実現するには、標的部位に対する薬剤の利用性の反応速度論に基づいた計画が必要である。これには、薬剤の分布、平衡および排泄を考慮することが必要である。患者の１日用量は、成人患者１日当たり０．０１ｍｇと１０００ｍｇとの間であると予測される。
【００６７】
実施例
実施例を以下に挙げ、本発明の様々な特性をさらに例示する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。この実施例は、特許請求された本発明を制限しない。
【実施例１】
【００６８】
タンパク質キナーゼおよびホスファターゼｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
ＨＣＶレプリコン複製を阻害するための潜在的宿主細胞因子標的は、Ｈｕｈ−７細胞で発現したＨＣＶＣｏｎ１−１ｂβ−ラクタマーゼ発現レプリコンおよび宿主ｓｉＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡライブラリーを使用して同定された。その方法は以下の通り実施した。
【００６９】
１日目：組織培養適合ＨＣＶＣｏｎ１−１ｂβ−ラクタマーゼ発現レプリコン（Ｚｕｃｋ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３４（２）：３４４〜３５５、２００４）を発現するＨｕｈ−７細胞を黒色、透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０３）に２０００個細胞／ウェルで播種する。ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１０６３−０２９）１００μＬ、牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６１４０−０７１）１０％、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０−０５０）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０−０６１）に細胞を播種する。細胞を接着させ、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させる。
【００７０】
２日目：播種したＨｕＨ−７／レプリコン細胞を以下の通りにトランスフェクトする。
【００７１】
１．１×緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）２００μｌを各ウェルに添加することによってｓｉＲＮＡを再懸濁し、ｓｉＲＮＡの最終濃度１０μＭを作製する。
【００７２】
【化１】
【００７３】
対照も１０μＭで使用する。細胞に添加したｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭである。
【００７４】
２．Ｏｐｔｉｍｅｎを３３μＬ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに分配し、１２番目の列は空にしておく。
【００７５】
３．親プレートのＡ３ウェルからｓｉＲＮＡを娘プレートのＡ２ウェルに移すように、ｓｉＲＮＡストックプレートの各ウェルからｓｉＲＮＡ１μＬをＯｐｔｉｍｅｎ含有プレートに移す（各ウェルからｓｉＲＮＡ１μＬを対応するプレートの同位置の行のＮ−１列の位置に移す。）。
【００７６】
４．上下にピペッティングすることによって混合する。
【００７７】
５．試験管に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２２５２−０１１）１００μＬ、Ｏｐｔｉｍｅｎ減少血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０５８−０２１）１２１０μＬを添加する。室温で５分間インキュベートする。
【００７８】
６．各ウェルにＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ６μＬを分配し、上下にピペッティングすることによって混合する。プレートを室温で１５分間インキュベートする。
【００７９】
７．細胞から培地を除去し、（ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ）８０μＬと交換する。各対応ウェルにｓｉＲＮＡ／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物２０μＬを添加する。
【００８０】
８．プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。
【００８１】
９．ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）＋牛胎児血清３０％、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、５０μＬを添加する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【００８２】
１０．細胞から培地を除去し、ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、ＦＢＳ１０％、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘおよびクラブラン酸０．５μＭ、１００μＬ／ウェルと交換する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【００８３】
１１．細胞から培地を除去し、以下の溶液、ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）１２ｍＬ、ＣＣＦ４（ＤＭＳＯに溶かした１ｍＭ溶液）２４μＬ、溶液Ｃ（Ａｕｒｏｒａ）２ｍＬ、溶液Ｂ（プルロニック酸、Ａｕｒｏｒａ）１２０μＬの５０μＬと交換する。
【００８４】
１２．細胞を暗所で室温で１．５時間インキュベートする。
【００８５】
１３．蛍光強度を読み取ることができるプレートリーダーを使用して、４６０ｎｍおよび５３０ｎｍでプレートを読み取る。
【００８６】
１４．データ分析：Ａ４６０およびＡ５３８の両方の平均バックグラウンド（カラム１２の値の平均）を決定する。各ウェルからバックグラウンドを差し引く。バックグラウンドを差し引いた後、Ａ４６０をＡ５３８で除し、各細胞の青／緑比を決定する。形質移入毎の平均および標準偏差を計算する。
【００８７】
ＤｈａｒｍａｃｏｎキナーゼびホスファターゼｓｉＲＮＡライブラリーの各プレートについて、２連でこの分析を実施した。ヒットは、β−ラクタマーゼ活性によって測定すると（ＮＳ１ｓｉＲＮＡで形質移入した対照と比較したＡ４６０／Ａ５３０比）レプリコンの複製を４０％以上抑制し、ＮＳ１ｓｉＲＮＡ形質移入対照と比較したＡ５３０の読み取りによって測定すると細胞生存率阻害は２０％を上回らないｓｉＲＮＡと考えられた。
【００８８】
結果
第１のスクリーニングで８９個のヒットを同定した。ＡＫＡＰ８、ＡＬＫ、ＡＳＰ、ＡＴＭ、Ｃ１４ＯＲＦ２４、ＣＳＮＫ１Ｅ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＤＤＲ１、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＺ、ＤＬＧ２、ＤＵＳＰ１８、ＤＵＳＰ１９、ＤＵＳＰ２２、ＤＵＳＰ５、ＤＵＳＰ６、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ２、ＤＹＲＫ４、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ５、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＢＰ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＦＨＩＴ、ＦＬＪ２０４４２、ＦＬＪ３５１０７、ＦＮ３Ｋ、ＦＲＫ、ＧＡＫ、ＧＣＫ、ＨＩＰＫ３、ＨＫ３、Ｉ−４、ＩＧＢＰ１、ＩＭＰＫ、ＬＯＣ３３９２２１、ＬＰＰＲ４、ＭＡＰ２Ｋ３、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＧＣ１１３６、ＭＴＭＲ１、ＭＴＭＲ７、ＮＭＥ４、ＰＡＮＫ１、ＰＣＫ１、ＰＣＫ２、ＰＣＴＫ１、ＰＦＫＬ、ＰＫ４ＣＡ、ＰＨＫＡ２、ＰＨＫＧ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＰＰＰ１Ｒ２、ＰＲＫＣＬ２、ＰＲＫＤ２、ＰＲＫＷＮＫ３、ＰＲＫＹ、ＰＲＰＳ１、ＰＲＰＳ１Ｌ１、ＰＲＰＳＡＰ１、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＫ９Ｌ、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＰＮ２、ＲＩＰＫ２、ＳＯＣＳ５、ＳＲＰＫ１、ＳＴＫ１６、ＳＴＫ３、ＳＴＫ３３、ＳＴＫ３５、ＳＴＫ３８、ＴＡＦ１、ＴＢＫ１、ＴＪＰ２、ＴＮＫ１、ＴＰＫ１、ＴＲＰＭ７、ＴＸＫ、ＵＬＫ２およびＶＲＫ１。
【実施例２】
【００８９】
Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓを使用した肝発現のヒットのカウンタースクリーニング
ＨＣＶは肝臓で複製するので、宿主ＨＣＶ標的の１必要条件は、遺伝子が肝臓で発現することである。実施例１で記載した遺伝子８９個の様々な組織における遺伝子発現は、既に作製されたＢｏｄｙ Ａｔｌａｓを使用して評価した。このＢｏｄｙ Ａｔｌａｓは、多数の組織のｍＲＮＡプールの発現と比較した様々な組織における様々な遺伝子の相対的遺伝子発現を示す。
【００９０】
相対的発現レベルが１．５相対強度を上回る場合、遺伝子は肝臓において高発現であると考えられ、遺伝子の相対強度が０．５と１．５の間であれば中程度の発現であり、遺伝子の相対強度が０．０５と０．５の間であれば低発現であると考えられた。相対発現０．０５未満の遺伝子は、肝臓では発現しないと考えられた。
【００９１】
標的としてさらに考慮から排除される遺伝子には、肝臓で発現しない遺伝子および２種類の複製スクリーニングのうち１つでのみヒットとして同定された肝臓での発現レベルが低い遺伝子が含まれる。肝臓で発現しない遺伝子には、ＡＳＰ、ＦＢＰ２、Ｉ−４、ＬＰＰＲ４、ＭＴＭＲ７、ＰＲＰ４Ａ３およびＳＴＫ３３が含まれる。これらの遺伝子は、擬陽性、または培養細胞においてのみレプリコンを維持するために必須である遺伝子と考えられた。
【００９２】
肝臓内での発現レベルが中程度から高程度である遺伝子をさらに分析するために選択した。肝臓での発現レベルが低い遺伝子は、ライブラリーを２回スクリーニングしていずれにおいてもＨＣＶ複製を阻害した場合のみ、さらに分析するために選択した。さらに分析するために選択されなかった肝臓での発現レベルが低い遺伝子には、ＣＳＮＫ１Ｅ、ＤＧＫＧ、ＤＬＧ２、ＤＵＳＰ５、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ７Ｐ１、ＰＣＴＫ１、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＰＫ２およびＳＴＫ３８が含まれた。
【００９３】
表２は、さらに分析するために選択された標的遺伝子のリストで、肝臓での発現の相対的レベルを示す。
【００９４】
【表２】
【実施例３】
【００９５】
ｓｉＲＮＡヒットの確認
キナーゼおよびホスファターゼライブラリーの１次スクリーニングから、ＨＣＶレプリコンを抑制し、肝臓でも発現する８０個のｓｉＲＮＡプールを選択した。ｓｉＲＮＡプールは、プールプレートの各ウェルの同一遺伝子を対象とする４個のｓｉＲＮＡを有するように設計された。ヒットを確認するために、このプールの４個のｓｉＲＮＡそれぞれを８回２倍希釈して個々に試験した。確認されたヒットは、（２個の異なるｓｉＲＮＡ配列が同じ標的外効果を有するとはほとんど考えられないので）プール中に存在する個々のｓｉＲＮＡの少なくとも２個で力価測定可能な阻害を示すと予測された。
【００９６】
１日目
試薬および消耗品
ＣＭ．１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０％、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
９６ウェル細胞用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
方法
１．ＣＭ．１０細胞のフラスコをトリプシン処理する。
【００９７】
２．ＤＭＥＭ接種培地をフラスコに添加することによってトリプシンを不活性化する。
【００９８】
３．細胞懸濁液の一部１０μｌを取り出し、生細胞染色のためにトリパンブルーで１：２に希釈する。
【００９９】
４．血球計数器を使用して細胞を計数する。
【０１００】
５．ＤＭＥＭ接種培地で細胞を最終濃度２００００細胞／ｍｌまで希釈する。
【０１０１】
６．細胞懸濁液（２００００細胞／ｍｌ）１００μｌを９６ウェル細胞用プレートの１〜１１列に添加することによって、細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種する。
【０１０２】
７．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で１８〜２０時間インキュベートする。
【０１０３】
２日目
試薬および消耗品
ｓｉＲＮＡマスタープレート
Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
９６ウェル細胞用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
方法
１．Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉを９６ウェル力価測定プレート（２連で８回）に添加する。この力価測定プレートは、１〜１２に番号付けされた列およびＡ〜Ｈの行の格子を設定することができる。１列のＡ〜Ｈ行には３３μｌ、２〜１１列のＡ行には６６μｌ、２〜１１列のＢ〜Ｈ行には３４μｌを入れ、列１２は空のままにする。
【０１０４】
２．９６ウェルマスタープレートは、１〜１２に番号付けされた列およびＡ〜Ｈの行の格子を設定することができる。１列のＡ〜Ｈ行には対照、２〜１１列のＡ行には試料を入れ、列１２は空にする。
【０１０５】
３．マスタープレートのＡ行の２〜１１列のウェルから９６ウェル力価測定プレートのＡ行の２〜１１列のウェルにｓｉＲＮＡ（１０μＭ）（試料）２μｌを移す。
【０１０６】
４．マスタープレートの１列のウェルから９６ウェル力価測定プレートの１列のウェルにｓｉＲＮＡ（１０μＭ）（対照）１μｌを移す。
【０１０７】
５．上下にゆっくりピペッティングすることによって試料を混合する。
【０１０８】
６．Ａ行の２〜１１列のウェルからＢ行の２〜１１列のウェルに試料３４μｌを移し、混合することによって、ｓｉＲＮＡ（試料）の２倍希釈を８回実施する。Ｃ行からＤ行、Ｄ行からＥ行、Ｅ行からＦ行など試料３４μＬを移し、混合することによって力価測定を継続する。各力価測定点のｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭおよび０．３９０６２５ｎＭである。プレートの設定および力価測定設定を８回繰り返し、マスタープレートの試料の８行全てを占める。
【０１０９】
７．コニカル試験管１５ｍＬ内に、Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉ ５．５０ｍＬおよびＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ０．５０ｍＬを添加する。ゆっくり混合する。
【０１１０】
８．この混合物を室温で５分間インキュベートする。
【０１１１】
９．ｓｉＲＮＡを含有する９６ウェル力価測定プレートの各ウェルにこのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物６μＬを添加する。ゆっくり混合する。
【０１１２】
１０．形質移入複合体を形成するために、このｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を室温で１５分間インキュベートする。
【０１１３】
１１．ｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのインキュベーション中、９６ウェル細胞用プレートの細胞から培地をマルチチャンネルピペッターで取り除く。
【０１１４】
１２．培地をＤＭＥＭ形質移入培地５０μＬと交換する。
【０１１５】
１３．ｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体形成に必要な１５分経った後、９６ウェル力価測定プレートから複合体２０μＬを９６ウェル細胞用プレートの一致するウェルに移す。各力価測定点のｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭおよび０．３９０６２５ｎＭである。
【０１１６】
１４．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で４時間インキュベートする。
【０１１７】
１５．４時間のインキュベーション時間が経った後、９６ウェル細胞用プレートの細胞および形質移入混合物を含有するウェルそれぞれにＤＭＥＭ ＦＢＳ培地３０μｌを添加する。
【０１１８】
１６．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間インキュベートする。
【０１１９】
４日目
試薬および消耗品：
クラブラン酸
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０％、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
方法
１．９６ウェル細胞用プレートのウェルから培地を除去する。
【０１２０】
２．ＤＭＥＭ接種培地１００μｌ、クラブラン酸０．５μＭを添加する。
【０１２１】
３．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間インキュベートする。
【０１２２】
５日目
試薬および消耗品：
ＤＭＥＭ染色培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＨＥＰＥＳ １Ｍ
ＣＣＦ４
溶液Ｂ（Ａｕｒｏｒａ、ＣＥＴ３３８Ｐ４１）
溶液Ｃ（Ａｕｒｏｒａ、ＣＥＴ３３８Ｐ３９）
方法
１．以下の通り（プレート８枚に十分な量の）染色溶液を調製する。
【０１２３】
ａ．ＤＭＥＭ染色培地７２ｍＬ、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ
ｂ．ＣＣＦ４（１ｍＭ）０．１４４ｍＬ
ｃ．溶液Ｂ ０．７２０ｍＬ
ｄ．溶液Ｃ １２ｍＬ
２．９６ウェル細胞用プレートのウェルから培地を除去する。
【０１２４】
３．列１２のウェルを含む９６ウェル細胞用プレートのウェル全てに染色溶液５０μＬを添加する。
【０１２５】
４．プレートを暗所で室温で１．５時間インキュベートする。
【０１２６】
５．Ａ４６０およびＡ５３０の蛍光強度を読み取る。
【０１２７】
データ分析
各試料の読み取りからバックグラウンド（細胞を含まないウェル）を差し引く。Ａ４６０／Ａ５３０比を計算する。非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡの割合として正規化する。各ｓｉＲＮＡのデータを対照Ａ４６０／Ａ５３０対形質移入したｓｉＲＮＡの濃度の％として図にする。
【０１２８】
有効と考えられるｓｉＲＮＡでは、試験した４種のｓｉＲＮＡのうち少なくとも２種がＨＣＶ複製を対照レベルの少なくとも４０％から６０％阻害し、その阻害は、少量の形質移入ｓｉＲＮＡで力価測定すべきである。
【０１２９】
前記基準を使用してＨＣＶレプリコンの維持に不可欠であると確認された遺伝子を次に４種類の群に分類し、ＨＣＶ標的に最も望ましい基準を有するものを優先順位１とした。遺伝子分類は以下の通りに決定した。 優先順位１：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を≧７０％阻害した。肝臓で中程度から高程度に発現する。これらの遺伝子およびコードされたタンパク質は、ＨＣＶ感染を阻害するのに好ましい標的である。
【０１３０】
優先順位２：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を≧６０％阻害した。肝臓で任意のレベルで発現する。
【０１３１】
優先順位３：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を６０％と５０％の間で阻害した。
【０１３２】
優先順位４：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を５０％と４０％の間で阻害した。
【０１３３】
ＨＣＶレプリコン複製に不可欠な遺伝子および指示された分類を表３に示す。
【０１３４】
【表３】
【実施例４】
【０１３５】
ゲノム規模のｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
２２０００個を上回るｓｉＲＮＡプールのライブラリーのスクリーニングは、実施例１で記載した方法を本質的に使用して実施した。簡単に説明すると、ベータ−ラクタマーゼ（ＣＭ．１０）を発現するＨＣＶＣｏｎ１−１ｂレプリコンを含有するＨｕＨ−７細胞を３８４ウェルプレートに接種した。翌日Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用し製造者の指示に従って、細胞に対照ｓｉＲＮＡを含む一連のｓｉＲＮＡプールを形質移入した。形質移入７２時間後に、ＣＣＦ４を使用し製造者の指示に従って、細胞のベータ−ラクタマーゼ発現を染色した。実施例１とは異なり、クラブラン酸を細胞に添加しなかった。
【０１３６】
ベータ−ラクタマーゼ発現に影響を与える６４０個のｓｉＲＮＡプールをその後さらに３回アッセイして、ＨＣＶ複製に対するそれらの影響を確認した。
【０１３７】
次に、さらに確認するために３９個のｓｉＲＮＡプールを選択した。３９個のｓｉＲＮＡプールによって標的化される遺伝子それぞれを標的とする６個のｓｉＲＮＡそれぞれを別々にＣＭ．１０細胞に形質移入して、前記のようにアッセイした。試験した遺伝子の１つを標的とする最小限２個のｓｉＲＮＡによってＨＣＶ複製が効果的に阻害されたことにより、ＨＣＶｃｏｎ１ １ｂ複製のために宿主因子が重要であることが確認されたと考えられた。
【０１３８】
結果
このスクリーニングで、ＡＬＰＰＬ２、ＡＰ４Ｍ１、ＣＡＰＺＡ１、ＤＮＡＨ５、ＤＯＭ３Ｚ、ＦＴＣＤ、ＰＤＩＡ３、ＭＤＭ４、ＷＤＲ６６、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８、ＮＳＵＮ６、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＲＶＢ、ＰＨＥＸ、ＰＫＮ、ＰＯＬＲ２Ｊ２、ＲＡＢ２０、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５を含む１９個の遺伝子が確認された。確認されたｓｉＲＮＡプールは全て、肝臓での発現が少なくとも低レベルである遺伝子を標的とした。
【実施例５】
【０１３９】
キメラＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンを使用したヒットのスクリーニング
実験は、キメラＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンがＣｏｎ１ １ｂレプリコンと同様の遺伝子のノックダウンに感受性であるかどうかを決定するために実施した。使用した方法は、遺伝子型２ｂ ＮＳ５ｂ配列を含有するＢＫレプリコンを使用すること以外は、実施例１および４で記載されている。ＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンは、Ｇｒｏｂｌｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：１６７４１〜１６７４６、２００３に記載されている。
【０１４０】
データ分析は、確認されたｓｉＲＮＡヒットそれぞれについて実施した。ＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンに対するｓｉＲＮＡ形質移入の効果を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【実施例６】
【０１４２】
ＨＣＶ遺伝子型１ａ、Ｃｏｎ−１ｂおよび２ａレプリコンに対する活性
定量的マルチプレックスＴａｑＭａｎアッセイは、３種のＨＣＶレプリコン細胞系、Ｃｏｎ−１ｂ、１ａおよび２ａにおけるＨＣＶレプリコンＲＮＡの相対量を測定するために確立された。簡単に説明すると、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ９６ウェルキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１８２）を使用してｓｉＲＮＡで形質移入したレプリコン細胞から単離した。ＴａｑＭａｎ反応は、ＴａｑＭａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４０３０２８）、ＴａｑＭａｎ ＰＤＡＲ対照試薬ヒトシクロフィリンＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３１０８８３Ｅ）ならびにＨＣＶレプリコンゲノムのネオマイシン耐性遺伝子を標的化するプローブおよびプライマーセット（Ｎｅｏ ｆｗｄ：配列番号９８、Ｎｅｏ ｒｅｖ：配列番号９９およびＮｅｏ ｐｒｏｂｅ ５’ＦＡＭ−配列番号１００−ＴＡＭＲＡ３’）を使用した。反応混合物中の各成分の最終濃度は以下の通りである。１×ＴａｑＭａｎ ＥＺ緩衝液、Ｍｎ（Ｏａｃ）２ ３ｍＭ、ｄＡＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＣＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＧＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＵＴＰ ０．６ｍＭ、フォワードプライマー０．２ｍＭ、リバースプライマー０．２ｍＭ、プローブ０．１ｍＭ、１×ＰＤＡＲシクロフィリンＡミックス、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ０．１ユニット／μｌ、ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ ０．０１ユニット／μｌ、全ＲＮＡ１０μｌおよびＨ２Ｏで５０μｌにする。９６管光学プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｎ８０１−０５６０）を光学粘着性カバー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｎ４３１１９７１）で覆い、数回反転することによって混合した。この試料をマルチプレックスＴａｑＭａｎ分析のためにＡＢＩ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に入れ、プレート全体を「未知」（ＨＣＶ）ではＦＡＭ色素層に、内部対照、シクロフィリンＡではＶＩＣ色素層に設定した。サイクリング変数は、スペクトル補正および曝露時間１０ミリ秒を使用して、５０℃２分、６０℃３０分、９５℃５分（９４℃２０秒、５５℃１分）４０回に設定した。
【０１４３】
試料中における各標的ＲＮＡの相対量を計算するために、３種のＨＣＶレプリコン細胞株のそれぞれにおいて、ＨＣＶ Ｎｅｏプライマーおよびプローブセットならびに内部対照、シクロフィリンＡ予備開発アッセイ試薬（ＰＤＡＲ）について標準曲線を作製した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を使用し、製造者のプロトコルに従って、レプリコンから全ＲＮＡを単離した。ＴａｑＭａｎサイクル閾値（Ｃｔ）は、全ＲＮＡを７回５倍希釈して測定した。全ＲＮＡの質量（ｎｇ）の自然対数を測定し、Ｃｔ値に対してプロットした。ＨＣＶレプリコン細胞株のそれぞれにおいて、各プローブおよびプライマーセットで方程式を計算して、それぞれのＣｔ値からＨＣＶ ＲＮＡおよび内部対照シクロフィリンＡ ｍＲＮＡの相対量を得た。ＨＣＶ ＲＮＡレベルは、内部対照、シクロフィリンＡ、ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
【０１４４】
結果
第１優先標的：ＨＣＶ遺伝子型１ａ、Ｃｏｎ−１ｂおよび２ａレプリコンの複製を３０％超阻害するｓｉＲＮＡ：ＤＵＳＰ１９、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ４、ＧＡＫ、ＰＡＲＶＢ、ＰＦＫＬ、ＰＫ４ＣＡ、ＰＳＫＨ１、ＳＯＣＳ５、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５。
【０１４５】
第２優先標的：２種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも５０％超阻害するｓｉＲＮＡ：ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＳＴＫ１６およびＴＮＫ１。
【０１４６】
第３優先標的：２種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも３０％超阻害するｓｉＲＮＡ:ＡＫＡＰ８、ＡＬＫ、ＡＰ４Ｍ１、ＣＡＰＺＡ１、ＤＧＫＤ、ＤＮＡＨ５、ＤＹＲＫ２、ＥＰＨＡ２、ＦＧＦＲ２、ＦＲＫ、ＦＴＣＤ、ＧＣＫ、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８、ＰＤＩＡ３、ＰＨＥＸ、ＰＯＬＲ２Ｊ２、ＰＲＫＷＮＫ３、ＲＡＢ２０、ＳＴＫ３５、ＴＪＰ２、ＴＰＫ１、ＴＲＥＢ３およびＴＲＰＭ７。
【０１４７】
第４優先標的：１種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも３０％超阻害するｓｉＲＮＡ:ＡＬＰＰＬ２、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＤＲ１、ＤＧＫＺ、Ｄ０Ｍ３Ｚ、ＤＵＳＰ２２、ＤＵＳＰ６、ＭＡＰ２Ｋ６、ＮＭＥ４、ＰＣＫ１、ＰＲＰＳ１Ｌ１、ＰＴＫ９Ｌ、ＳＲＰＫ１、ＴＡＦ１、ＴＢＫ１、ＶＲＫ１およびＷＤＲ６６。
【実施例７】
【０１４８】
ＨｅＬａ細胞におけるＨＣＶ１ｂサブゲノム複製の阻害
ＨｅＬａ細胞において複製するように操作されたレプリコンクローンにおいて第１優先標的がＨＣＶ１ｂサブゲノム複製を阻害する能力を試験した。ＨｅＬａ細胞においてサブゲノム複製が阻害されることは、標的遺伝子の必要性がＨｕＨ−７細胞株の人為的結果ではないことの証拠となる。ＨＣＶのＨｅＬａ細胞複製系は、Ｚｈｕ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７７（１７）：９２０４〜９２１０、２００３に記載された通りであった。ｓｉＲＮＡ形質移入およびサブゲノム複製の定量は、実施例６に説明したように実施した。
【０１４９】
結果：
第１優先標的、ＤＵＴ、ＧＡＫ、ＰＦＫＬ、ＰＩＫＡＣＡ、ＰＳＫＨ１およびＳＹＮＰＲは、ＨｅＬａ細胞においてＨＣＶｃｏｎ１ｂサブゲノム複製を少なくとも３０％阻害した。ＰＡＲＶＢ、ＳＯＣＳ５およびＴＲＰＭ５ｓｉＲＮＡは、これらの細胞では毒性であり、ＨＣＶ複製に対する効果は評価できなかった。ＤＵＳＰ１９およびＤＹＲＫ４ｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞におけるＨＣＶサブゲノム複製に対して効果がなかった。
【実施例８】
【０１５０】
ワートマニンによるＨＣＶ複製の阻害
ＰＩＫ４ＣＡは、２個のアイソフォームが報告されている。アイソフォーム１（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００２６５０、タンパク質：ＮＰ＿００２６４）は短く、アイソフォーム２（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０５８００４、タンパク質：ＮＰ＿４７７３５２）のＮ末端部分のほとんどが欠如している。ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム１は、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩ型として特徴づけられており、アデノシンには感受性で、ワートマニンには非感受性であるが（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｌｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２８８７８〜２８８８４、１９９４）、ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム２はホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型として特徴づけられており、ワートマニンには感受性で、アデノシンには非感受性である（Ｇｅｈｒｍａｎｎ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４３７：３４１〜３５６、１９９９）。
【０１５１】
アイソフォーム２がＨＣＶ複製に関連したアイソフォームであるかどうかを確かめるために、細胞においてマイクロモルレベルでホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型を阻害するキナーゼ阻害剤、ワートマニンのＨＣＶ複製に対する効果を試験した。簡単に説明すると、ベータラクタマーゼを発現するＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞株を９６ウェルＢｌａｃｋ組織培養処理プレート上で細胞完全培地（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、１×ＮＥＡＡ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、（−）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）５０μｌに７５００細胞／ウェルで接種した。ワートマニンの１０ｍＭ ＤＭＳＯ保存液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｗ１６２８）を完全培地２００μｌで１００μＭに希釈し、２．５倍で７回系列希釈して力価測定した。希釈点それぞれから５０μｌを、ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞を含有するアッセイプレートに移し、以下の濃度（μＭ）のワートマニン：５０、２０、８、３．２、１．２８、０．５１２および０．２０４８を作製した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１５２】
ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞系において内在性β−ラクタマーゼ活性を阻害するために、クラブラン酸の１ｍＭ ＤＭＳＯ保存液（ＵＳ ＰＨａｒｍｏｃｏｐｅｉａ、＃１１３４４２６）を完全培地で５．５μＭに希釈し、その１０μｌを細胞に添加して、最終濃度０．５μＭを作製した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１５３】
ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞系においてβ−ラクタマーゼ活性を測定するために、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ β−ラクタマーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｋ１０８５）染色混合物を製造者のプロトコルに基づいて調製した。細胞培養／化合物培地を細胞から除去して、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ β−ラクタマーゼ染色混合物と置換した。細胞を暗所で室温で１．５〜２．０時間インキュベートした。Ａ４６０およびＡ５３０の蛍光強度をＬＪＬ分析で測定した。
【０１５４】
結果
ワートマニンはＨＣＶ複製をＩＣ５０７．１μＭで阻害した。このデータは、ＰＩＫ４ＣＡ機能を必要とするＨＣＶ複製と一致した。
【実施例９】
【０１５５】
ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム２を特異的に標的化するｓｉＲＮＡはＨＣＶ複製を中断する
ＨＣＶ複製におけるＰＩＫ４ＣＡ２アイソフォーム２の必要性を示すために、アイソフォーム２ｍＲＮＡのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＮＭ＿０５８００４）のＨＣＶ複製の阻害を試験した。以下のｓｉＲＮＡをＣＭ．１０細胞に形質移入して、実施例１に記載した通りにＨＣＶサブゲノム複製の阻害を試験した。
【０１５６】
【化２】
【０１５７】
結果
ＰＩＫ４ＣＡを標的化する６種のｓｉＲＮＡは全てＨＣＶサブゲノム複製を阻害し、ＰＩＫ４ＣＡのアイソフォーム２はＨＣＶ複製に関連したアイソフォームであることが確認された。
【実施例１０】
【０１５８】
ＰＩＫ４ＣＡ２を標的化するｓｉＲＮＡは、ＨＣＶ複製中断の前にＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡレベルをノックダウンする
ＨＣＶ複製がＰＩＫ４ＣＡ発現または活性に左右されるならば、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡを形質移入した後で生じるＨＣＶ複製の減少は、ＰＩＫ４ＡＣ発現欠如に続いて生じるはずである。これを確かめるために、ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂレプリコンを含有するＨｕＨ−７細胞を、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡで形質移入した。形質移入後、０，１２、２４、３６、４８および７２ｈの時点で、細胞から全ＲＮＡを単離し、ＰＩＫ４ＣＡおよびＨＣＶ ＲＮＡレベルを実施例６に記載したように測定した。
【０１５９】
結果
図１に示したように、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡは、形質移入後１２ｈと２４ｈとの間でＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡレベルの最大阻害を引き起こした。対照的に、ＨＣＶ ＲＮＡレベルは形質移入後３６ｈと４８ｈとの間で減少し始め、７２ｈ時点まで減少し続けた。
【実施例１１】
【０１６０】
ポリクローナルＰＩＫ４ＣＡ抗体を使用したＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルのノックダウンの確認
抗原ＩＰ１２４０配列番号１１３（ａａ８９３〜９０４）およびＩＰ１２４１配列番号１１４（ａａ６９６〜７０７）に対して抗体を作製した。ウサギ２匹（Ｄ３７９２およびＤ３７９３）の抗血清は、ウェスタンブロットによってアッセイしたとき、ＰＩＫ４ＣＡの内部レベルを検出するのに十分敏感であった。Ｖ５タグを付けたＰＩＫ４ＣＡまたは空のｐＣＤＮＡ３．１ベクターは、ＨＣＶ ＨＶ１ Ｃｏｎ１ｂ細胞で過剰発現した。細胞溶解物をＲＩＰＡ緩衝液中に収集して、４％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。カスタム抗体（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用したウェスタンブロット分析用に１：１０００に希釈した。ＰＩＫ４ＣＡのゲル移動特性を測定するために、Ｖ５およびＤ３９７２抗体を使用して２重プローブウェスタンブロットを実施した。２色ウェスタンブロットによって、Ｄ３９７２ブロットで見られた強度の弱い低いバンドは、Ｖ５でタグ付けしたタンパク質と同じ大きさで移動することが示された（図２Ａ）。
【０１６１】
ＰＩＫ４ＣＡタンパク質がＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡの存在下で減少するかどうかを測定するために、ＨＣＶ ＨＢ１ Ｃｏｎ１ｂ細胞を対照ｓｉＲＮＡおよびＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡのＯＲＦまたは３’ＵＴＰを標的化するＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡで形質移入した。その結果は、ＨＣＶ ＲＮＡレベルがＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡおよび陽性対照、ＨＣＶ ｓｉＲＮＡによって減少することを示している（図２Ｂ）。さらに、ＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡのＯＲＦおよび３’ＵＴＰ両方を標的とするＰＩＫ４ＣＡ ｓｉＲＮＡは、ウェスタンブロットによるとＰＩＫ４ＣＡタンパク質を検出不可能なレベルまで減少させる（前述のように、低い、強度の弱いバンドはＰＩＫ４ＣＡを表す、図２Ｃ）。これらのデータによって、使用したｓｉＲＮＡによるＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルのノックダウンが実証され、Ｄ３７９２抗体によって認識されたＰＩＫ４ＣＡバンドの同一性が確認される。
【実施例１２】
【０１６２】
いくつかの標的に関する追加情報
標的のいくつかに対する追加情報を以下に挙げる。
【０１６３】
ＤＵＳＰ１９（２特異性ホスファターゼ１９）
ＤＵＳＰ１９は、２特異性分裂促進剤活性化プロテインキナーゼホスファターゼファミリーの１つである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４９および５０によって表される。ＤＵＳＰ１９多形を表５に示す。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
ＤＵＴ（ｄＵＴＰポリホスファターゼ）
ＤＵＴは、複製中にＤＮＡに誤取り込みされるのを防ぐためにｄＵＴＰを低レベルに維持し、５−フルオロウラシルに対する耐性を媒介し、ペルオキシソーム増殖を調節することができる。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５１および５２によって表される。ＤＵＴ多形を表６に示す。
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
ＤＹＲＫ４（２特異性チロシン調節キナーゼ４）
ＤＹＲＫ４は、タンパク質チロシンキナーゼのＤＹＲＫファミリーの１つである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５３および５４によって表される。ＤＹＲＫ４多形を表７に示す。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
ＧＡＫ（サイクリンＧ関連キナーゼ）
ＧＡＫは、テンシンおよびオーキシリンと相同性を有する推定セリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞周期調節において役割を果たすことができる。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５５および５６によって表される。ＧＡＫヌクレオチド多形を表８に示す。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
ＰＡＲＶＢ（パルビンベータ）アイソフォームＡ
ＰＡＲＶＢは、インテグリン結合キナーゼに結合する２個のカルポニン相同性ドメインを含有する接着斑タンパク質であり、細胞−基質接着を確立するためにインテグリン−ＩＬＫシグナリングが関与するようである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号３７および３８によって表される。ＰＡＲＶＢヌクレオチド多形を表９に示す。
【０１７２】
【表９】
【０１７３】
ＰＦＫＬ（ホスホフルクトキナーゼ、肝臓）
肝臓ホスホフルクトキナーゼは、解糖作用においてフルクトース−６−リン酸のフルクトース−１，６−２リン酸へのリン酸化を触媒する。欠乏すると糖原病ＶＩＩ型と関連し、過剰発現するとダウン症の認識障害と関連し得る。ＰＦＫＬのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号６３および６４によって表される。
【０１７４】
ＰＩＫ４ＣＡ
ＰＩＫ４ＣＡは、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型である。ホスファチジルイノシトール４，５−２リン酸の形成の第１段階を触媒し、その活性は高濃度のワートマニンによって阻害される。ＰＩＫ４ＣＡのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号２１および２２によって表される。ＰＩＫ４ＣＡヌクレオチド多形を表１０に示す。
【０１７５】
【表１０】
【０１７６】
ＰＳＫＨ１（タンパク質セリンキナーゼＨ１）
ＰＳＫＨ１は、カルシウム依存性自己リン酸化を受けるタンパク質セリンキナーゼである。ＰＳＫＨ１の過剰発現は、スプライシング因子ＳＦＲＳ１およびＳＦＲＳ２の核再構築を導き、ＲＮＡスプライシングを刺激する。ＰＳＫＨ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５７および５８によって表される。
【０１７７】
ＳＯＣＳ５（サイトカインシグナリング５の抑制因子）
ＳＯＣＳ５は、ＳＨ２ドメインおよびＳＯＣＳボックスを含有するサイトカイン誘導性タンパク質である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路によってサイトカインシグナリングを負に調節する。ＳＯＣＳ５のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５９および６０によって表される。ＳＯＣＳ５について同定されたヌクレオチド多形を表１１に示す。
【０１７８】
【表１１】
【０１７９】
ＳＹＮＰＲ（シナプトポリン）
シナプトポリンは、シナプス小胞の標的化に関与するシナプス小胞内在性膜タンパク質、ラットシナプトフィジンと高い相同性を有するタンパク質である。膜関連ドメインを含有し、脂質関連タンパク質で発見されることが多い。ＳＹＮＰＲのタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４５および４６によって表される。
【０１８０】
ＴＲＰＭ５（一過性受容器電位カチオンチャンネル、サブファミリーＭ、構成要素５）
ＴＲＰＭ５は、カチオンチャンネルの一過性受容器電位ファミリーと関連している。６個の予測膜貫通ドメインを有する。ＴＲＰＭ５のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４７および４８によって表される。ＴＲＰＭ５について同定されたヌクレオチド多形を表１２に示す。
【０１８１】
【表１２】
【０１８２】
ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（アイソフォーム１ｂ）アルファサブユニット（４５ｋＤ）
ＰＡＦＡＨ１Ｂ１は、血小板活性化因子を不活性化するヘテロ３量体酵素の非触媒性サブユニットである。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号３５および３６によって表される。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１のヌクレオチド多形を表１３に示す。
【０１８３】
【表１３】
【０１８４】
ＳＴＫ１６（セリン／トレオニンキナーゼ１６）
セリン／トレオニンキナーゼ１６は、トランスフォーミング成長因子ベータによる情報伝達に応答して転写を調節することができるミリストイル化およびパルミトイル化されたタンパク質キナーゼである。ＳＴＫ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号７および８によって表される。
【０１８５】
ＴＮＫ１（チロシンキナーゼ、非受容体１）
ＴＮＫ１は、ホスホリパーゼＣガンマ１（ＰＬＣＧ１）と相互作用するキナーゼである。胎児発生中およびリンパ球造血系の成人細胞におけるリン脂質シグナリング経路を調節することができる。ＴＮＫ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号６１および６２によって表される。
【実施例１３】
【０１８６】
ＨＩＶ感染も遮断するｓｉＲＮＡヒット
優先順位の高いｓｉＲＮＡプールがＨｅＬａ細胞においてＨＩＶ感染を中断させる能力について試験した。その方法は以下の通りに実施した。
１日目：ＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞を４×９６ウェルプレートにウェル当たり２０００個で接種する。
２日目：ｓｉＲＮＡプールによるＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞の形質移入は以下の通りである。
【０１８７】
１．ｓｉＲＮＡを最終濃度０．５％のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して最終濃度１００ｎＭで形質移入した。陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡを以下の通りに含めた。
【０１８８】
サイクリンＴ１（陽性対照）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号ｓｃ−３５１４４）から購入。
【０１８９】
ルシフェラーゼ（陰性対照）：ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ（配列番号１１５）
２連で試験したｓｉＲＮＡには、ＤＵＳＰ１９、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ４、ＧＡＫ、ＰＡＲＶＢ、ＰＦＫＬ、ＰＩＫ４ＣＡ、ＰＳＫＨ１，ＳＯＣＳ５、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５を標的とする３種のｓｉＲＮＡのプールが含まれた。
【０１９０】
２．ＯｐｔｉＭＥＭを６６μＬ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに分配し、１２番目の列は空にしておく。
【０１９１】
３．各ｓｉＲＮＡ（１０μＭで再懸濁）２μＬをＯｐｔｉＭＥＭ含有プレートに移した。
【０１９２】
４．上下にピペッティングすることによって混合した。
【０１９３】
５．試験管に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２４０μＬ、ＯｐｔｉＭＥＭ１２１０μＬを添加した。室温で５分間インキュベートした。
【０１９４】
６．各ウェルにＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ１２μＬを分配し、上下にピペッティングすることによって混合した。プレートを室温で１５分間インキュベートした。
【０１９５】
７．ＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞の各ウェルにｓｉＲＮＡ−Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体２０μＬを添加した。
３日目：形質移入したＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞に以下の通りにＨＸＢ２ ＨＩＶを感染させた。
【０１９６】
１．培地を細胞から除去した。
【０１９７】
２．新鮮な培地８０μＬを各ウェルに添加した。
【０１９８】
３．ＨＸＢ２ ＨＩＶを培地で希釈した。希釈したＨＸＢ４０μＬを各ウェルに添加した。
【０１９９】
４．ウイルス感染を９６時間継続させた。
５日目
ベータガラクトシダーゼ活性、ウイルス感染の指標を以下の通りに測定した。
【０２００】
１．培地を細胞から除去した。
【０２０１】
２．細胞をウェル当たり２００μＬのＰＢＳで洗浄した。
【０２０２】
３．ＤＴＴを含有する溶解緩衝液（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ、Ｔｒｏｐｉｘ、カタログ番号ＢＬ１００Ｐ）２０μＬを各ウェルに添加し、プレートを１０分間振盪した。
【０２０３】
４．次に、基質８０μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で暗所で１時間インキュベートした。
【０２０４】
５．増強溶液１００μＬを各ウェルに添加して、プレートをＤｙｎｅｘ照度計で読み取った。
【０２０５】
データは、以下の方法で分析した。各プレートの読み取り値は、ルシフェラーゼ陰性対照の読み取り値に正規化して、「ルシフェラーゼ対照のパーセント」として表した。好ましい標的は、平均４０％以上でベータ−ガラクトシダーゼ活性を抑制するｓｉＲＮＡプールと考えられた。
【０２０６】
結果
ＰＩＫ４ＣＡ、ＳＹＮＰＲ、ＤＹＲＫ４およびＰＦＫＬを標的とするｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ複製を４０％超阻害した（図３参照）。したがって、これらの遺伝子は、ヒト細胞系においてＨＩＶおよびＨＣＶ両方の複製に不可欠である。ＨＩＶ複製の３０％と４０％との間の阻害が、ＧＡＫ、ＤＵＳＰ１９およびＤＵＴを標的とするｓｉＲＮＡで認められ、これらの遺伝子はまた、ＨＩＶおよびＨＣＶ感染を標的化できることを示唆する。
【０２０７】
実施例７に示したように、ＨｅＬａ細胞におけるＳＯＣＳ５、ＰＡＲＶＢおよびＴＲＰＭ５ｓｉＲＮＡに関連した毒性は、これらの細胞におけるウイルス感染においてこれらの遺伝子が果たす役割のいかなる理解も妨害する。ＰＳＫＨ１ｓｉＲＮＡでは、ＨＩＶ複製に対して影響は認められなかった。
【０２０８】
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態を示し説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】ＰＩＫ４ＣＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入した後のＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡレベルおよびＨＣＶＲＮＡレベルのノックダウンの経時変化を示す結果を表した図である。
【図２Ａ】ＰＩＫ４ＣＡタンパク質を認識するウサギポリクローナル抗血清の産生を示す結果を表した図である。
【図２Ｂ】ＰＩＫ４ＣＡを標的とする２個の別個のｓｉＲＮＡまたはＨＣＶを直接標的とするｓｉＲＮＡを形質移入した後ではＨＣＶ複製の阻害を示すが、非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳＩ）の形質移入の後では示さない結果を表した図である。
【図２Ｃ】図２Ｂで使用したＰＩＫ４ＣＡを標的とするｓｉＲＮＡはＰＩＫ４ＡＣタンパク質レベルもノックダウンするが、ＨＣＶを標的とするｓｉＲＮＡおよび非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ１）はＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルに影響を及ぼさないことを示す結果を表した図である。
【図３】異なる宿主遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡがＨＩＶ複製を阻害する能力を示す結果を表した図である。以下の遺伝子、１−ＣｙｃＴ１；２−ＰＦＫＬ；３−ＰＩＫ４ＣＡ；４−ＤＹＲＫ４；５−ＳＹＮＰＲ；６−ＧＡＫ；７−ＤＵＳＰ１９；８−ＤＵＴ；９−ＰＳＫＨ１；１０−ＬＵＣ；１１−Ｓ０ＣＳ５；１２−ＰＡＲＶＢ；および１３−ＴＲＰＭ５のｓｉＲＮＡの結果を図１に挙げる。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、それぞれ参照により本明細書に組み込んだ２００５年６月２２日出願の米国特許仮出願第６９２８２１号および２００５年８月１９日出願の米国特許仮出願第７１０００６号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願で引用した参考文献は、特許請求した本発明の先行技術であると自認しない。
【０００３】
ＨＣＶに曝露すると、わずかな症例で顕性急性疾患が生じるが、ほとんどの場合、ウイルスは慢性感染を確立して肝臓の炎症を引き起こし、ゆっくりと肝不全および肝硬変に進行する（Ｉｗａｒｓｏｎ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１４：２０１〜２０４、１９９４）。疫学的調査によって、ＨＣＶは肝細胞癌病理発生に重要な役割を果たすことが示されている（Ｋｅｗ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１４：２１１〜２２０、１９９４、Ａｌｔｅｒ、Ｂｌｏｏｄ、８５：１６８１〜１６９５、１９９５）。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、アミノ酸約３００個の前駆体ポリタンパク質をコードする長さ約９．５ｋｂの１本鎖ＲＮＡから構成される（Ｃｈｏｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：３６２〜３６４、１９８９、Ｃｈｏｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：３５９〜３６２、１９８９、Ｔａｋａｍｉｚａｗａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６５：１１０５〜１１１３、１９９１）。ＨＣＶポリタンパク質は、ウイルスタンパク質をＣ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順番で含有する。
【０００５】
個々のウイルスタンパク質は、ＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解により生成される。宿主細胞プロテアーゼは、推定構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７を放出し、アミノ酸８１０でＮＳ２のＮ末端を形成する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：２７３１〜２７３４（１９９４）；Ｈｉｊｉｋａｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０７７３〜１０７７７、１９９３）。
【０００６】
非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂはおそらく、ウイルス複製機構を形成し、ポリタンパク質から放出される。ＮＳ２およびＮＳ３のＮ末端に関連する亜鉛依存性プロテアーゼは、ＮＳ２とＮＳ３との間の開裂に関与する（Ｇｒａｋｏｕｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：１３８５〜１３９５、１９９３、Ｈｉｊｉｋａｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０７７３〜１０７７７、１９９３）。
【０００７】
ＮＳ３のＮ末端ドメイン中に位置する別のセリンプロテアーゼは、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部でのタンパク質分解開裂に関与している（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：３８３５〜３８４４、１９９３、Ｇｒａｋｏｕｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０５８３〜１０５８７、１９９３、Ｔｏｍｅｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４０１７〜４０２６、１９９３）。ＲＮＡ誘発ＮＴＰアーゼおよびヘリカーゼ活性は、ＮＳ３のＣ末端に位置する。
【０００８】
ＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼ活性のコファクターとなる（Ｆａｉｌｌａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：３７５３〜３７６０（１９９４）；ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ他、米国特許第５７３９００２号明細書）。
【０００９】
ＮＳ５Ａはインターフェロン耐性を与える高リン酸化タンパク質である（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ．Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．Ｓｕｐｐｌ．、１：４７〜４８、１９９９）。
【００１０】
ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとなる（ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ他、１９９６年１１月２８日公開ＷＯ９６／３７６１９、Ｂｅｈｒｅｎｓ他、ＥＭＢＯ １５：１２〜２２、１９９６；Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４９：１０８〜１１８（１９９８））。
【発明の開示】
【００１１】
ＨＣＶ複製に関与する肝臓発現タンパク質は、ＨＣＶレプリコン活性に対する宿主細胞タンパク質発現阻害の影響を測定する方法を使用して同定された。同定されたタンパク質およびコードしている核酸は、それぞれが、ＨＣＶ複製を阻害するための、および化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力を評価するための標的となる。ＨＣＶ複製を阻害する化合物には、同定タンパク質を標的とする化合物および同定タンパク質をコードする核酸を標的とする化合物が含まれる。ＨＣＶ複製を阻害する標的として同定された宿主遺伝子のいくつかはまた、ＨＩＶ複製を阻害するための標的であることが発見された。ＨＩＶおよびＨＣＶ複製の両方を阻害する標的となる能力は、このような同定遺伝子およびコードされたタンパク質が様々な種類のウイルスの複製を阻害するための有用な標的となることができ、特定のウイルス複製の阻害に限定されないことを示している。
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ライブラリーを使用して、ウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製に関与する宿主細胞因子を同定する方法を説明する。この方法は、異なる細胞因子を標的化してウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製を阻害するｓｉＲＮＡライブラリーの能力を測定するステップを含み、このｓｉＲＮＡライブラリーには、従来はウイルス（例えば、ＨＣＶ）複製に関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１０個の異なるｓｉＲＮＡが標的化することが含まれる。
【００１３】
「ライブラリー」は、実験の一部としてスクリーニングされる異なるｓｉＲＮＡの集合を含有する。実験結果は、ほぼ同一の時点または限定された期間にわたって得られる。様々な実施形態では、限定された期間は、約１週間または約１日の範囲内である。好ましくは、このライブラリーの構成要素は、同時に試験される。
【００１４】
異なる宿主細胞因子を標的とするｓｉＲＮＡの一定数を含むライブラリーについて記載することで、異なるｓｉＲＮＡの少なくとも一定数が使用されることを表す。様々な実施形態では、このライブラリーは１００、５００または１０００個の構成要素を含み、かつ／または異なる構成要素のそれぞれは、キナーゼまたはホスファターゼである。他の実施形態では、このライブラリーは５０００、１００００または２００００個の構成要素を含み、ゲノム規模のライブラリーであると考えられる。
【００１５】
本発明の他の態様は、化合物がウイルスの複製を阻害する能力を評価する方法を記載する。この方法は、
（ａ）ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質またはこの標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、この標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質に結合する、または、このようなタンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物を同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定した化合物がウイルス複製を阻害する能力を測定するステップと
を含む。
【００１６】
標的タンパク質に結合する、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物の最初の同定は、実験的に実験することができるか、あるいは化合物が同定された標的の１つに結合するか、または同定された標的の１つを阻害する能力に関する公知の情報に基づくことができる。様々な標的に関する情報は、科学文献から入手できる。この化合物は活性阻害を最初に同定されることが好ましい。
【００１７】
好ましい実施形態では、ウイルスはＨＩＶまたはＨＣＶである。化合物のウイルス複製阻害能力の測定には、（１）化合物が結合するか、またはウイルス複製を阻害することができることを最初に同定すること、あるいは（２）化合物がウイルス複製を阻害する範囲を測定することのいずれか、または両方が含まれる。ウイルス複製の阻害は、定量的または定性的測定法で測定することができる。例えば、化合物のＨＣＶ複製阻害能力の測定には、（１）化合物が結合するか、またはＨＣＶ複製を阻害することができることを最初に同定すること、あるいは（２）化合物がＨＣＶ複製を阻害する範囲を測定することのいずれか、または両方が含まれる。
【００１８】
参照タンパク質配列との配列同一性は、タンパク質配列と参照配列とを整列させ、対応する領域内の同一アミノ酸の数を測定することによって決定される。この数を参照配列（例えば、配列番号１）内のアミノ酸の総数で除し、次に１００を乗し、最も近い整数に四捨五入する。
【００１９】
本発明の他の態様は、ＨＣＶ複製を阻害する方法を記載する。この方法は、ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号第７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質、またはこの標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、この標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物の有効量を使用する。
【００２０】
本発明の他の態様は、宿主におけるウイルス複製を阻害する方法を記載する。宿主は、ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号第２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質、または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害できる化合物の有効量を与えられる。
【００２１】
「宿主」とは、ウイルスに感染した、または感染することができる細胞、動物、またはヒトを示す。この化合物は、ウイルス感染前またはウイルスに感染した宿主に投与することができる。
【００２２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」などの制限のない用語では、追加的要素またはステップが許可される。「１個または複数」などの補助的用語は、追加的要素またはステップの可能性を強調するために制限のない用語を伴って、または伴わずに使用される。
【００２３】
明白に記載していなければ、「ａ」または「ａｎ」などの用語は、１つを限定して指していない。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、「細胞（複数）（ｃｅｌｌｓ）」を除外しない。１個または複数などの補助的用語は、複数の存在の可能性を強調するために使用される。
【００２４】
本発明のその他の特性および利点は、様々な実施例を含む本明細書で提供された追加的記載から明らかである。提供された実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分および方法を例示する。この実施例は、特許請求された本発明を制限しない。本開示に基づいて、当業者は本発明の実施に有用なその他の成分および方法を同定し、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ＨＣＶ複製を阻害するための異なる宿主細胞タンパク質標的は、ＨＣＶレプリコン活性に対する宿主細胞タンパク質発現阻害の影響を測定する方法を使用し、標的タンパク質の肝臓発現を考慮して同定された。ＨＣＶ複製に関与することが同定されたタンパク質およびコードしている核酸は、それぞれが、ＨＣＶ複製を阻害し、ＨＣＶ複製を阻害する化合物の能力を評価するための標的となる。
【００２６】
ＨＣＶ複製を阻害する標的として同定された宿主遺伝子のいくつかはまた、ＨＩＶ複製を阻害することが発見された。ＨＩＶおよびＨＣＶ両方の標的となる能力は、このような標的が様々な種類のウイルスの複製を阻害するための有用な標的となることができ、特定ウイルスの複製の阻害に限定されないことを示している。
【００２７】
ＨＩＶおよびＨＣＶなどのウイルス複製の阻害は、研究上および治療上意味がある。研究への適用例には、ウイルスの複製および発現、例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶの複製および発現を研究するための手段の提供が含まれる。治療への適用例には、患者におけるウイルス感染（例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染）を治療するか、または発症を阻害するために効果的であり、かつ許容できない毒性を有さないなどの適切な薬理学的特性を備えた化合物を使用することが含まれる。
【００２８】
標的の同定
本明細書で同定されたＨＣＶ複製などのウイルス複製を阻害するための標的は、宿主細胞因子である。同定された宿主細胞因子をコードしている核酸配列、宿主因子および実質的に類似の核酸またはタンパク質は、それぞれが、ＨＣＶ複製などのウイルス複製を阻害するための標的として使用することができる。表１に、ＨＣＶ複製、場合によってはＨＩＶ複製を阻害するために同定された宿主細胞因子に関する情報を挙げる。
【００２９】
表１に挙げた標的はまた、ＨＣＶ以外のウイルスの複製を阻害するために有用であり得る。ＨＣＶ標的のサブセットについて、ＨＣＶ複製阻害を試験した。実施例１３に記載したように、以下のＰＩＫ４ＡＣ、ＳＹＮＰＲ、ＤＹＲＫ４、ＰＦＫＬ、ＧＡＫ、ＤＵＳＰ１９およびＤＵＴの阻害は、ＨＩＶ複製も阻害する。ＨＣＶおよびＨＩＶ複製の両方を阻害する能力は、様々なウイルス種の複製におけるこのような標的としての役割を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
特定の同定された配列に実質的に類似の核酸およびタンパク質は、特定の同定された配列に対して少数の変化を有する配列である。実質的に類似の配列には、１種または複数の天然に生じる多形化または人工的変化を含有する配列が含まれる。
【００３２】
実質的に類似のタンパク質配列は、参照配列と少なくとも９５％同一である。実質的に類似のタンパク質配列はまた、参照配列より活性が著しく低くてはならない。著しく低い活性とは、同定されたタンパク質の活性の約８０％未満である。
【００３３】
様々な実施形態では、実質的に類似のタンパク質配列は、参照配列とは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸変化によって異なる。アミノ酸変化はそれぞれ独立して、付加、欠失および置換である。実質的に類似の配列は、天然に生じる変種であることが好ましい。
【００３４】
実質的に類似の核酸は、参照配列と少なくとも９５％同一である。実質的に類似の核酸配列は、参照配列によってコードされるタンパク質よりも活性が著しく低いタンパク質をコードしてはならない。著しく低い活性とは、同定されたタンパク質の活性の約８０％未満である。
【００３５】
参照核酸配列との配列同一性は、核酸配列と参照配列とを整列させ、対応する領域内の同一ヌクレオチドの数を測定することによって決定する。この数を参照配列（例えば、配列番号２）内のヌクレオチドの総数で除し、次に１００を乗し、最も近い整数に四捨五入する。
【００３６】
様々な実施形態では、実質的に類似の核酸配列は、参照配列とは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチド変化によって異なる。ヌクレオチド変化はそれぞれ独立して、付加、欠失および置換である。実質的に類似の配列は、天然に生じる変種であることが好ましい。
【００３７】
タンパク質生成
タンパク質は、化学合成の技術およびそのタンパク質を生成する細胞からの精製に関する技術を含む当業界で周知の技術を使用して産生することができる。タンパク質の化学合成技術は、当業界で周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｄｅｃｋｅｒ、１９９０参照。）。組換えタンパク質産生および精製技術はまた、当業界で周知である(例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２参照。）。
【００３８】
細胞からのタンパク質の獲得は、そのタンパク質を産生するための組換え核酸技術を使用すると容易である。タンパク質産生のための組換え核酸技術には、そのタンパク質をコードしている組換え遺伝子を細胞内に導入するか、または細胞内で産生させ、そのタンパク質を発現させることが含まれる。
【００３９】
組換え遺伝子は、タンパク質発現のための調節因子と共にタンパク質をコードする核酸を含有する。組換え遺伝子は、細胞ゲノムに存在するか、または発現ベクターの一部であることができる。
【００４０】
組換え遺伝子の一部として存在することができる調節因子には、タンパク質をコードしている配列に天然に関連した因子およびタンパク質をコードしている配列に天然では関連してない外来調節因子が含まれる。外来プロモーターなどの外来調節因子は、特定の宿主で組換え遺伝子を発現させるか、または発現レベルを増加させるのに有用であり得る。一般的に、組換え遺伝子に存在する調節因子には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞においてプロセシングされるために好ましい因子は、ポリアデニル化シグナルである。
【００４１】
細胞における組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用すると容易である。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞での自発的複製のための複製起点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、および高コピー数能力も含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドおよびウイルスである。
【００４２】
遺伝子コードの縮重のため、多数の様々なコード核酸配列を特定のタンパク質のコードに使用することができる。遺伝子コードの縮重は、ほとんどのアミノ酸がヌクレオチドトリプレットまたは「コドン」の様々な組み合わせによってコードされるゆえに生じる。アミノ酸は以下のようなコドンによってコードされる。
【００４３】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｄｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドン ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ、ＵＡＵ
組換え遺伝子産生、細胞への導入および組換え遺伝子発現の技術は、当業界では周知である。このような技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７〜２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋ他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９などの参考文献に挙げられている。
【００４４】
所望するならば、特定の宿主での発現は、コドン最適化によって促進することができる。コドン最適化には、より好ましいコドンの使用が含まれる。異なる宿主でのコドン最適化の技術は、当業界で周知である。
【００４５】
標的タンパク質への結合、または標的タンパク質の活性もしくは発現を阻害する化合物の同定
標的タンパク質に結合する、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物の最初の同定は、実験的に決定することができるか、あるいは標的に関する利用可能な情報に基づくことができる。タンパク質に結合するタンパク質、またはタンパク質活性を阻害する化合物は、タンパク質を対象とする。タンパク質発現を阻害する化合物は、タンパク質をコードしているか、または調節機能を有する核酸を対象とする。
【００４６】
化合物がタンパク質に結合する能力は、競合および非競合結合アッセイなどの技術を使用して測定することができる。このようなアッセイは、例えば、結合を直接測定する標識化合物を使用して、または化合物に結合する検出可能な試薬を使用して結合を測定して、実施することができる。
【００４７】
キナーゼおよびホスファターゼ活性をアッセイする技術は、当業界では周知である。例えば、ＮＭＥ４、ＰＣＫ１、ＳＴＫ１６、ＤＵＳＰ６、ＰＩＫ４ＣＡ、ＰＫＷＮＫ３、ＡＫＡＰ８、ＧＣＫ、ＳＲＰＫ１、ＤＧＫＤ、ＤＵＴ、ＧＡＫ、ＰＦＫＬ、ＰＳＫＨ１、ＳＯＣＳ５、ＴＮＫ１、ＤＵＳＰ１９およびＥＰＨＡ２の活性を測定するために使用できる技術を記載した文献には、Ｋｏｗｌｕｒｕ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３９８（２）：１６０〜１６９、２００２（ＮＭＥ４）、Ｍａｈｏｕｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１３３６：５４９〜５５６、１９９７（ＰＣＫ１）、Ｏｈｔａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３５０（Ｐｔ２）：３９５〜４０４、２０００（ＳＴＫ１６）、Ｋｉｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（５１）：１５１９７〜２０７、２００３（ＤＵＳＰ６）、Ｖａｒｓａｎｙｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７９：４７３〜４７９、１９８９（ＰＩＫ４ＣＡ）、Ｘｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６７９５〜１６８０１、２０００、（ＰＲＫＷＮＫ３）、Ａｋｉｌｅｓｗａｒａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８：２７６（２０）：１７４４８〜５４、２００１（ＡＫＡＰ８）、Ｖａｎ Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９：１１９〜１８４、１９８９（ＧＣＫ）、Ａｕｂｏｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．、１００（２２）：１２６０１〜６、２００３（ＳＲＰＫ１）、Ｉｍａｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３８）：３５３２３〜３２、２００２（ＤＧＫＤ）；Ｃｌｉｍｉｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ．５（３）：２５２〜２５Ｓ（１９９３）（ＤＵＴ）、Ｇｒｅｅｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２）：１３６５〜１３７０、２０００およびＫｉｍｕｒａ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４：１７９〜１８７（１９９７）（ＧＡＫ）、ＦｕｒｕｙａおよびＵｙｅｄａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１４）：７１０９〜７１１２、１９８１、Ｈｉｒａｄａ他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（７０）：２０４７〜２０５２、２０００（ＰＦＫＬ）、Ｂｒｅｄｅ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７０（１）：８２〜９２、２０００、Ｂｒｅｄｅ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０（２３）：５３０１〜５３０９、２００２（ＰＳＫＨ１）；Ｋａｒｉｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８０（８）：７０３８〜７０４８、２００５（ＳＯＣＳ５）；Ｆｅｌｓｃｈｏｗ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７３：２９４〜３０１、２０００（ＴＮＫ１）；Ｚａｍａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２６）：２３９０９〜２３９１８、２００２；およびＰｒａｔｔ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（５０）：７６９０〜９、２００２（ＥＰＨＡ２）が含まれる。
【００４８】
異なるキナーゼおよびホスファターゼの阻害剤は、当業界で周知である。このような阻害剤の例には、ＡＴＭを阻害する２−モルホリン−４−イル−６−チアントレン−１−イル−ピラン−４−オン（ＫＵ−５５９３３）（Ｈｉｃｋｓｏｎ他、、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４（２４）：９１５２〜９、２００４）、ＰＩＫ４ＣＡを阻害する（５Ｒ，６Ｓ）−５−アジド−６−ベンゾイルオキシ−２−シクロヘキセン−１−オン（Ｐｅｌｙｖａｓ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４４：６２７〜６３２、２００１)、ＰＣＫ１を阻害する１−アリル−３−ブチル−８−メチルキサンチン（Fｏｌｅｙ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ、１３（２０）：３６０７〜１０、２００３）、ＤＵＴを阻害する５−マーキュリ−ｄＵＴＰおよびその他のＵＴＰ類縁体（Ｃｌｉｍｉｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ ５（３）：２５２〜２５８、１９９３、Ｂｅｃｋ他、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ、１９５ ＰｔＢ （９７〜１０４）、１９８６およびＰＦＫＬを阻害するＮ−ブロモアセチルエタノールアミンホスファート（Ｈｉｒａｄａ他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（１０）：２０４７〜２０５２、２０００）が含まれる。
【００４９】
酵素活性をアッセイするために使用できる技術および／または表１に記載した非キナーゼ標的タンパク質に結合する化合物も公知である。ＴＲＰＭ５、ＰＨＥＸ、ＭＤＭ４、ＰＤＩＡ３、ＡＰＰＬ３およびＰＡＲＶＢを測定するために使用できる活性測定技術を記載した参考文献の例には、Ｐｒａｗｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７００：１５１６６〜１５１７１、２００３（ＴＲＰＭ５）、Ｂｏｉｌｅａｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３５５：７０７〜７１３、２００１（ＰＨＥＸ）、Ｂａｄｃｉｏｎｇ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：４９６６８〜４９７７５、２００２（ＭＤＭ４）；Ｆｒｉｃｋｅｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９：１８２７７〜１８２８７、２００４、（ＰＤＩＡ３）、Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７：４９８０８〜４９８１４、１９９２（ＡＬＰＰＬ２）、Ｏｌｓｋｉ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：５２５〜５３８（２０００）（ＰＡＲＶＢ）が含まれる。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１は血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの触媒的に不活性なサブユニットであるが、完全なアセチルヒルドロラーゼ酵素複合体の測定条件は、Ｈａｔｔｏｒｉ ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８７４８〜１８７５３、１９９３（ＰＡＦＡＨ１Ｂ１）に見いだすことができる。
【００５０】
同定されたタンパク質をコードしている核酸配列は、その核酸にハイブリダイズすることができる化合物の標的となる。核酸配列にハイブリダイズできる化合物の例には、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸が含まれる。阻害機構は、化合物の種類に応じて変化する。ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸の生成および使用技術は当業界で周知である（例えば、Ｐｒｏｂｓｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２：２７１〜２８１、２０００、Ｚｈａｎｇ他、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．１０６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第２版、ｐ．１１〜３４、Ｉ．Ｐｈｉｌｉｐｓ著、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００５）。さらに、以下に挙げた実施例は、ｓｉＲＮＡの使用を例示する。
【００５１】
核酸をベースにした化合物を輸送するためのベクターには、プラスミドおよびウイルスをベースにしたベクターが含まれる。治療的応用に好ましいベクターはレトロウイルスおよびアデノウイルスをベースにしたベクターである(Ｄｅｖｒｏｅ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（３）３１９〜３２７、２００４、Ｚｈａｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２０：１３５〜１４３、２００４）。
【００５２】
ＨＣＶ阻害活性の測定
化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または動物モデルを使用して測定することができる（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．７（１）：２３〜４３、２００３）。化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、ＨＣＶまたはＨＣＶレプリコンの使用が関与する。ＨＣＶは培養で増殖させることが困難なので、好ましいｉｎ ｖｉｔｒｏ技術ではＨＣＶレプリコンを使用する。
【００５３】
ＨＣＶレプリコンとは、Ｈｕｈ７のように培養細胞中で自発的に複製できるＲＮＡ分子である。ＨＣＶレプリコンは、複製機構のＨＣＶ由来成分を発現し、培養細胞中での複製に必要なシス因子を含有する。
【００５４】
ＨＣＶレプリコンの生成および使用は、様々な文献に記載されている（例えば、Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５：１１０〜１１３、１９９９、Ｂｌｉｇｈｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：１９７２〜１９７４、２０００、Ｌｏｈｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５：１４３７〜１４４９、２００１、Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５：１２５２〜１２６４、２００１、Ｇｒｏｂｌｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：１６７４１〜１６７４６、２００３、Ｍｕｒｒａｙ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７７（５）：２９２８〜２９３５、２００３、Ｚｕｃｋ他、Ａｎａｌ Ｂｒｉｏｃｈｅｍ．３３４（２）：３４４〜３５５、２００４、Ｌｕｄｍｅｒｅｒ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４９（５）：２０５９〜６９、２００５、Ｒｉｃｅ他、２００１年１１月２９日公開の国際公開第０１／８９３６４号、Ｂｉｃｈｋｏ、２００２年５月１６日公開の国際公開第０２／２３８７９３号、Ｋｕｋｏｌｊ他、２００２年７月４日公開の国際公開第０２／０５２０１５号、２００２年８月１日公開のＤｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ他、国際公開第０２／０５９３２１号、Ｇｌｏｂｅｒ他、２００４年９月２日公開の国際公開第０４／０７４５０７号およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、米国特許第６６３０３４３号を参照）。
【００５５】
化合物がＨＣＶ複製を阻害する能力は、ＨＣＶ感染の疑われる天然由来の、または人工的な動物モデルを使用して測定することができる。ヒトおよびチンパンジーなどの数種の動物のみがＨＣＶ感染に感受性である。チンパンジーは、ＨＣＶ感染に対する化合物の効果を測定するための動物モデルとして使用されてきた。
【００５６】
ＨＣＶ感染に感受性のある人工的動物モデルは、マウスにヒト肝臓を移植することによって作製された（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ他、Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．７（１）：２３〜４３、２００３）。キメラマウス−ヒト肝臓を有するトランスジェニックマウスが小動物モデルのために使用される。
【００５７】
ＨＩＶ阻害活性の測定
化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または動物モデルを使用して測定することができる。化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、例えば、ウイルス生活環の初期段階（組み込みによる侵入）を測定する技術が含まれるか、またはウイルス感染拡大が続くＴ細胞系または末梢血単核細胞のＨＩＶ感染の使用が関与する（例えば、Ｊｏｙｃｅ他、、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４８）：４５８１１〜２０、２００２、Ｎｕｎｂｅｒｇ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５（９）：４８８７〜４８９２、１９９１、Ｇｏｌｄｍａｎ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６（５）：１０１９〜１０２３、１９９２）。
【００５８】
化合物がＨＩＶ複製を阻害する能力は、ＨＩＶまたはＳＨＩＶ（サル−ヒト免疫不全ウイルス）と称されるＨＩＶおよびＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）ゲノムの断片を一緒にすることによって創出されたキメラウイルスのいずれかによる感染に感受性のある非ヒト霊長類モデルで測定することができる。ヒトおよびチンパンジーなどの数種の動物のみがＨＩＶ感染に感受性がある。チンパンジーは、ＨＩＶ感染に対する化合物の効果を測定するための動物モデルとして使用されてきた。（Ｇｒｏｂ他、Ｎａｔ Ｍｅｄ．３（６）：６６５〜６７０、１９９７）。非ヒト霊長類におけるＨＩＶ感染に対する化合物の効果の測定は、ＳＨＩＶに感染したアカゲザルで実施されることが極めて多い（Ｈａｚｕｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８３）：５２８〜３２、２００４）。
【００５９】
投与
一般的な治療用化合物の医薬品投与の指針は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ著、２０００年出版および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」第２版、Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ著、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、１９９０に記されている。
【００６０】
適切な官能基を有する治療的標的に活性のある化合物は、酸塩または塩基塩として調製することができる。薬学的に許容される塩（水溶性または油溶性または分散可能な生成物の形態）には、例えば、無機または有機の酸または塩基から形成される従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。このような塩の例には、酸付加塩、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンホスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩ならびに塩基付加塩、例えば、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの有機塩基による塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、およびアルギニンおよびリシンなどのアミノ酸による塩が含まれる。
【００６１】
化合物は、経口、経鼻、注射、経皮および経粘膜を含む様々な経路を使用して投与することができる。懸濁液として経口的に投与される活性成分は、製薬業界で周知の技術に従って調製することができ、増量のために微結晶性セルロース、懸濁剤としてアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロースおよび甘味剤／矯臭剤を含有することができる。即放性錠剤として、これらの組成物は、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウムおよび乳糖および／またはその他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および光沢剤を含有することができる。
【００６２】
経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与するとき、組成物は製薬業界で周知の技術に従って調製することができ、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存剤、生物学的利用率を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または溶解剤または分散剤を使用して、生理食塩水に溶かした溶液として調製することができる。
【００６３】
この化合物はまた、静脈内（ボーラスおよび注入）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うか、または伴わない局所型、あるいは筋肉内型で投与することができ、いずれも製薬業界の当業者に周知の形態を使用する。注射によって投与するとき、注射溶液または懸濁液は、適切な非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液または等張塩化ナトリウム溶液、あるいは適切な分散剤または湿潤剤または懸濁剤、例えば、滅菌の無刺激性鉱油、例えば、合成モノまたはジグリセリド、および脂肪酸、例えば、オレイン酸を使用して製剤化することができる。
【００６４】
座薬の形態で直腸から投与するとき、組成物は、薬剤を適切な非刺激性の賦形剤、例えば、カカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールと混合することによって調製することができ、通常の温度では固形であるが、直腸腔内で液化および／または溶解して薬剤を放出する。
【００６５】
本発明の治療上の適用に適切な投与計画は、患者の年齢、体重、性別および健康状態、治療する病状の重症度、投与経路、患者の腎機能および肝機能、使用した特定の化合物を含む当業界で周知の要素を考慮して選択される。医薬品投与および医薬組成物の指針は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第２０版、前述、および「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」第２版、前述に記載されている。
【００６６】
毒性を伴わず効果を発揮する範囲内の薬剤濃度を最適な精度で実現するには、標的部位に対する薬剤の利用性の反応速度論に基づいた計画が必要である。これには、薬剤の分布、平衡および排泄を考慮することが必要である。患者の１日用量は、成人患者１日当たり０．０１ｍｇと１０００ｍｇとの間であると予測される。
【００６７】
実施例
実施例を以下に挙げ、本発明の様々な特性をさらに例示する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。この実施例は、特許請求された本発明を制限しない。
【実施例１】
【００６８】
タンパク質キナーゼおよびホスファターゼｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
ＨＣＶレプリコン複製を阻害するための潜在的宿主細胞因子標的は、Ｈｕｈ−７細胞で発現したＨＣＶＣｏｎ１−１ｂβ−ラクタマーゼ発現レプリコンおよび宿主ｓｉＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡライブラリーを使用して同定された。その方法は以下の通り実施した。
【００６９】
１日目：組織培養適合ＨＣＶＣｏｎ１−１ｂβ−ラクタマーゼ発現レプリコン（Ｚｕｃｋ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３４（２）：３４４〜３５５、２００４）を発現するＨｕｈ−７細胞を黒色、透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０３）に２０００個細胞／ウェルで播種する。ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１０６３−０２９）１００μＬ、牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６１４０−０７１）１０％、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０−０５０）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０−０６１）に細胞を播種する。細胞を接着させ、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させる。
【００７０】
２日目：播種したＨｕＨ−７／レプリコン細胞を以下の通りにトランスフェクトする。
【００７１】
１．１×緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）２００μｌを各ウェルに添加することによってｓｉＲＮＡを再懸濁し、ｓｉＲＮＡの最終濃度１０μＭを作製する。
【００７２】
【化１】
【００７３】
対照も１０μＭで使用する。細胞に添加したｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭである。
【００７４】
２．Ｏｐｔｉｍｅｎを３３μＬ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに分配し、１２番目の列は空にしておく。
【００７５】
３．親プレートのＡ３ウェルからｓｉＲＮＡを娘プレートのＡ２ウェルに移すように、ｓｉＲＮＡストックプレートの各ウェルからｓｉＲＮＡ１μＬをＯｐｔｉｍｅｎ含有プレートに移す（各ウェルからｓｉＲＮＡ１μＬを対応するプレートの同位置の行のＮ−１列の位置に移す。）。
【００７６】
４．上下にピペッティングすることによって混合する。
【００７７】
５．試験管に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２２５２−０１１）１００μＬ、Ｏｐｔｉｍｅｎ減少血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０５８−０２１）１２１０μＬを添加する。室温で５分間インキュベートする。
【００７８】
６．各ウェルにＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ６μＬを分配し、上下にピペッティングすることによって混合する。プレートを室温で１５分間インキュベートする。
【００７９】
７．細胞から培地を除去し、（ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ）８０μＬと交換する。各対応ウェルにｓｉＲＮＡ／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物２０μＬを添加する。
【００８０】
８．プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。
【００８１】
９．ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）＋牛胎児血清３０％、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、５０μＬを添加する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【００８２】
１０．細胞から培地を除去し、ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、ＦＢＳ１０％、１×非必須アミノ酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘおよびクラブラン酸０．５μＭ、１００μＬ／ウェルと交換する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【００８３】
１１．細胞から培地を除去し、以下の溶液、ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）１２ｍＬ、ＣＣＦ４（ＤＭＳＯに溶かした１ｍＭ溶液）２４μＬ、溶液Ｃ（Ａｕｒｏｒａ）２ｍＬ、溶液Ｂ（プルロニック酸、Ａｕｒｏｒａ）１２０μＬの５０μＬと交換する。
【００８４】
１２．細胞を暗所で室温で１．５時間インキュベートする。
【００８５】
１３．蛍光強度を読み取ることができるプレートリーダーを使用して、４６０ｎｍおよび５３０ｎｍでプレートを読み取る。
【００８６】
１４．データ分析：Ａ４６０およびＡ５３８の両方の平均バックグラウンド（カラム１２の値の平均）を決定する。各ウェルからバックグラウンドを差し引く。バックグラウンドを差し引いた後、Ａ４６０をＡ５３８で除し、各細胞の青／緑比を決定する。形質移入毎の平均および標準偏差を計算する。
【００８７】
ＤｈａｒｍａｃｏｎキナーゼびホスファターゼｓｉＲＮＡライブラリーの各プレートについて、２連でこの分析を実施した。ヒットは、β−ラクタマーゼ活性によって測定すると（ＮＳ１ｓｉＲＮＡで形質移入した対照と比較したＡ４６０／Ａ５３０比）レプリコンの複製を４０％以上抑制し、ＮＳ１ｓｉＲＮＡ形質移入対照と比較したＡ５３０の読み取りによって測定すると細胞生存率阻害は２０％を上回らないｓｉＲＮＡと考えられた。
【００８８】
結果
第１のスクリーニングで８９個のヒットを同定した。ＡＫＡＰ８、ＡＬＫ、ＡＳＰ、ＡＴＭ、Ｃ１４ＯＲＦ２４、ＣＳＮＫ１Ｅ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＤＤＲ１、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＺ、ＤＬＧ２、ＤＵＳＰ１８、ＤＵＳＰ１９、ＤＵＳＰ２２、ＤＵＳＰ５、ＤＵＳＰ６、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ２、ＤＹＲＫ４、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ５、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＢＰ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＦＨＩＴ、ＦＬＪ２０４４２、ＦＬＪ３５１０７、ＦＮ３Ｋ、ＦＲＫ、ＧＡＫ、ＧＣＫ、ＨＩＰＫ３、ＨＫ３、Ｉ−４、ＩＧＢＰ１、ＩＭＰＫ、ＬＯＣ３３９２２１、ＬＰＰＲ４、ＭＡＰ２Ｋ３、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１、ＭＧＣ１１３６、ＭＴＭＲ１、ＭＴＭＲ７、ＮＭＥ４、ＰＡＮＫ１、ＰＣＫ１、ＰＣＫ２、ＰＣＴＫ１、ＰＦＫＬ、ＰＫ４ＣＡ、ＰＨＫＡ２、ＰＨＫＧ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＰＰＰ１Ｒ２、ＰＲＫＣＬ２、ＰＲＫＤ２、ＰＲＫＷＮＫ３、ＰＲＫＹ、ＰＲＰＳ１、ＰＲＰＳ１Ｌ１、ＰＲＰＳＡＰ１、ＰＳＫＨ１、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＫ９Ｌ、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＰＮ２、ＲＩＰＫ２、ＳＯＣＳ５、ＳＲＰＫ１、ＳＴＫ１６、ＳＴＫ３、ＳＴＫ３３、ＳＴＫ３５、ＳＴＫ３８、ＴＡＦ１、ＴＢＫ１、ＴＪＰ２、ＴＮＫ１、ＴＰＫ１、ＴＲＰＭ７、ＴＸＫ、ＵＬＫ２およびＶＲＫ１。
【実施例２】
【００８９】
Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓを使用した肝発現のヒットのカウンタースクリーニング
ＨＣＶは肝臓で複製するので、宿主ＨＣＶ標的の１必要条件は、遺伝子が肝臓で発現することである。実施例１で記載した遺伝子８９個の様々な組織における遺伝子発現は、既に作製されたＢｏｄｙ Ａｔｌａｓを使用して評価した。このＢｏｄｙ Ａｔｌａｓは、多数の組織のｍＲＮＡプールの発現と比較した様々な組織における様々な遺伝子の相対的遺伝子発現を示す。
【００９０】
相対的発現レベルが１．５相対強度を上回る場合、遺伝子は肝臓において高発現であると考えられ、遺伝子の相対強度が０．５と１．５の間であれば中程度の発現であり、遺伝子の相対強度が０．０５と０．５の間であれば低発現であると考えられた。相対発現０．０５未満の遺伝子は、肝臓では発現しないと考えられた。
【００９１】
標的としてさらに考慮から排除される遺伝子には、肝臓で発現しない遺伝子および２種類の複製スクリーニングのうち１つでのみヒットとして同定された肝臓での発現レベルが低い遺伝子が含まれる。肝臓で発現しない遺伝子には、ＡＳＰ、ＦＢＰ２、Ｉ−４、ＬＰＰＲ４、ＭＴＭＲ７、ＰＲＰ４Ａ３およびＳＴＫ３３が含まれる。これらの遺伝子は、擬陽性、または培養細胞においてのみレプリコンを維持するために必須である遺伝子と考えられた。
【００９２】
肝臓内での発現レベルが中程度から高程度である遺伝子をさらに分析するために選択した。肝臓での発現レベルが低い遺伝子は、ライブラリーを２回スクリーニングしていずれにおいてもＨＣＶ複製を阻害した場合のみ、さらに分析するために選択した。さらに分析するために選択されなかった肝臓での発現レベルが低い遺伝子には、ＣＳＮＫ１Ｅ、ＤＧＫＧ、ＤＬＧ２、ＤＵＳＰ５、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ７Ｐ１、ＰＣＴＫ１、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＩＰＫ２およびＳＴＫ３８が含まれた。
【００９３】
表２は、さらに分析するために選択された標的遺伝子のリストで、肝臓での発現の相対的レベルを示す。
【００９４】
【表２】
【実施例３】
【００９５】
ｓｉＲＮＡヒットの確認
キナーゼおよびホスファターゼライブラリーの１次スクリーニングから、ＨＣＶレプリコンを抑制し、肝臓でも発現する８０個のｓｉＲＮＡプールを選択した。ｓｉＲＮＡプールは、プールプレートの各ウェルの同一遺伝子を対象とする４個のｓｉＲＮＡを有するように設計された。ヒットを確認するために、このプールの４個のｓｉＲＮＡそれぞれを８回２倍希釈して個々に試験した。確認されたヒットは、（２個の異なるｓｉＲＮＡ配列が同じ標的外効果を有するとはほとんど考えられないので）プール中に存在する個々のｓｉＲＮＡの少なくとも２個で力価測定可能な阻害を示すと予測された。
【００９６】
１日目
試薬および消耗品
ＣＭ．１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０％、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
９６ウェル細胞用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
方法
１．ＣＭ．１０細胞のフラスコをトリプシン処理する。
【００９７】
２．ＤＭＥＭ接種培地をフラスコに添加することによってトリプシンを不活性化する。
【００９８】
３．細胞懸濁液の一部１０μｌを取り出し、生細胞染色のためにトリパンブルーで１：２に希釈する。
【００９９】
４．血球計数器を使用して細胞を計数する。
【０１００】
５．ＤＭＥＭ接種培地で細胞を最終濃度２００００細胞／ｍｌまで希釈する。
【０１０１】
６．細胞懸濁液（２００００細胞／ｍｌ）１００μｌを９６ウェル細胞用プレートの１〜１１列に添加することによって、細胞を２０００細胞／ウェルの密度で播種する。
【０１０２】
７．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で１８〜２０時間インキュベートする。
【０１０３】
２日目
試薬および消耗品
ｓｉＲＮＡマスタープレート
Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
９６ウェル細胞用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
方法
１．Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉを９６ウェル力価測定プレート（２連で８回）に添加する。この力価測定プレートは、１〜１２に番号付けされた列およびＡ〜Ｈの行の格子を設定することができる。１列のＡ〜Ｈ行には３３μｌ、２〜１１列のＡ行には６６μｌ、２〜１１列のＢ〜Ｈ行には３４μｌを入れ、列１２は空のままにする。
【０１０４】
２．９６ウェルマスタープレートは、１〜１２に番号付けされた列およびＡ〜Ｈの行の格子を設定することができる。１列のＡ〜Ｈ行には対照、２〜１１列のＡ行には試料を入れ、列１２は空にする。
【０１０５】
３．マスタープレートのＡ行の２〜１１列のウェルから９６ウェル力価測定プレートのＡ行の２〜１１列のウェルにｓｉＲＮＡ（１０μＭ）（試料）２μｌを移す。
【０１０６】
４．マスタープレートの１列のウェルから９６ウェル力価測定プレートの１列のウェルにｓｉＲＮＡ（１０μＭ）（対照）１μｌを移す。
【０１０７】
５．上下にゆっくりピペッティングすることによって試料を混合する。
【０１０８】
６．Ａ行の２〜１１列のウェルからＢ行の２〜１１列のウェルに試料３４μｌを移し、混合することによって、ｓｉＲＮＡ（試料）の２倍希釈を８回実施する。Ｃ行からＤ行、Ｄ行からＥ行、Ｅ行からＦ行など試料３４μＬを移し、混合することによって力価測定を継続する。各力価測定点のｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭおよび０．３９０６２５ｎＭである。プレートの設定および力価測定設定を８回繰り返し、マスタープレートの試料の８行全てを占める。
【０１０９】
７．コニカル試験管１５ｍＬ内に、Ｏｐｔｉｍｅｎ−Ｉ ５．５０ｍＬおよびＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ０．５０ｍＬを添加する。ゆっくり混合する。
【０１１０】
８．この混合物を室温で５分間インキュベートする。
【０１１１】
９．ｓｉＲＮＡを含有する９６ウェル力価測定プレートの各ウェルにこのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物６μＬを添加する。ゆっくり混合する。
【０１１２】
１０．形質移入複合体を形成するために、このｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を室温で１５分間インキュベートする。
【０１１３】
１１．ｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのインキュベーション中、９６ウェル細胞用プレートの細胞から培地をマルチチャンネルピペッターで取り除く。
【０１１４】
１２．培地をＤＭＥＭ形質移入培地５０μＬと交換する。
【０１１５】
１３．ｓｉＲＮＡ：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体形成に必要な１５分経った後、９６ウェル力価測定プレートから複合体２０μＬを９６ウェル細胞用プレートの一致するウェルに移す。各力価測定点のｓｉＲＮＡの最終濃度は、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭおよび０．３９０６２５ｎＭである。
【０１１６】
１４．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で４時間インキュベートする。
【０１１７】
１５．４時間のインキュベーション時間が経った後、９６ウェル細胞用プレートの細胞および形質移入混合物を含有するウェルそれぞれにＤＭＥＭ ＦＢＳ培地３０μｌを添加する。
【０１１８】
１６．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間インキュベートする。
【０１１９】
４日目
試薬および消耗品：
クラブラン酸
ＤＭＥＭ接種培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０％、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
方法
１．９６ウェル細胞用プレートのウェルから培地を除去する。
【０１２０】
２．ＤＭＥＭ接種培地１００μｌ、クラブラン酸０．５μＭを添加する。
【０１２１】
３．９６ウェル細胞用プレートを通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間インキュベートする。
【０１２２】
５日目
試薬および消耗品：
ＤＭＥＭ染色培地：ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＨＥＰＥＳ １Ｍ
ＣＣＦ４
溶液Ｂ（Ａｕｒｏｒａ、ＣＥＴ３３８Ｐ４１）
溶液Ｃ（Ａｕｒｏｒａ、ＣＥＴ３３８Ｐ３９）
方法
１．以下の通り（プレート８枚に十分な量の）染色溶液を調製する。
【０１２３】
ａ．ＤＭＥＭ染色培地７２ｍＬ、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ
ｂ．ＣＣＦ４（１ｍＭ）０．１４４ｍＬ
ｃ．溶液Ｂ ０．７２０ｍＬ
ｄ．溶液Ｃ １２ｍＬ
２．９６ウェル細胞用プレートのウェルから培地を除去する。
【０１２４】
３．列１２のウェルを含む９６ウェル細胞用プレートのウェル全てに染色溶液５０μＬを添加する。
【０１２５】
４．プレートを暗所で室温で１．５時間インキュベートする。
【０１２６】
５．Ａ４６０およびＡ５３０の蛍光強度を読み取る。
【０１２７】
データ分析
各試料の読み取りからバックグラウンド（細胞を含まないウェル）を差し引く。Ａ４６０／Ａ５３０比を計算する。非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡの割合として正規化する。各ｓｉＲＮＡのデータを対照Ａ４６０／Ａ５３０対形質移入したｓｉＲＮＡの濃度の％として図にする。
【０１２８】
有効と考えられるｓｉＲＮＡでは、試験した４種のｓｉＲＮＡのうち少なくとも２種がＨＣＶ複製を対照レベルの少なくとも４０％から６０％阻害し、その阻害は、少量の形質移入ｓｉＲＮＡで力価測定すべきである。
【０１２９】
前記基準を使用してＨＣＶレプリコンの維持に不可欠であると確認された遺伝子を次に４種類の群に分類し、ＨＣＶ標的に最も望ましい基準を有するものを優先順位１とした。遺伝子分類は以下の通りに決定した。 優先順位１：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を≧７０％阻害した。肝臓で中程度から高程度に発現する。これらの遺伝子およびコードされたタンパク質は、ＨＣＶ感染を阻害するのに好ましい標的である。
【０１３０】
優先順位２：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を≧６０％阻害した。肝臓で任意のレベルで発現する。
【０１３１】
優先順位３：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を６０％と５０％の間で阻害した。
【０１３２】
優先順位４：最も潜在能力のあるｓｉＲＮＡは、ＨＣＶレプリコン複製を５０％と４０％の間で阻害した。
【０１３３】
ＨＣＶレプリコン複製に不可欠な遺伝子および指示された分類を表３に示す。
【０１３４】
【表３】
【実施例４】
【０１３５】
ゲノム規模のｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニング
２２０００個を上回るｓｉＲＮＡプールのライブラリーのスクリーニングは、実施例１で記載した方法を本質的に使用して実施した。簡単に説明すると、ベータ−ラクタマーゼ（ＣＭ．１０）を発現するＨＣＶＣｏｎ１−１ｂレプリコンを含有するＨｕＨ−７細胞を３８４ウェルプレートに接種した。翌日Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用し製造者の指示に従って、細胞に対照ｓｉＲＮＡを含む一連のｓｉＲＮＡプールを形質移入した。形質移入７２時間後に、ＣＣＦ４を使用し製造者の指示に従って、細胞のベータ−ラクタマーゼ発現を染色した。実施例１とは異なり、クラブラン酸を細胞に添加しなかった。
【０１３６】
ベータ−ラクタマーゼ発現に影響を与える６４０個のｓｉＲＮＡプールをその後さらに３回アッセイして、ＨＣＶ複製に対するそれらの影響を確認した。
【０１３７】
次に、さらに確認するために３９個のｓｉＲＮＡプールを選択した。３９個のｓｉＲＮＡプールによって標的化される遺伝子それぞれを標的とする６個のｓｉＲＮＡそれぞれを別々にＣＭ．１０細胞に形質移入して、前記のようにアッセイした。試験した遺伝子の１つを標的とする最小限２個のｓｉＲＮＡによってＨＣＶ複製が効果的に阻害されたことにより、ＨＣＶｃｏｎ１ １ｂ複製のために宿主因子が重要であることが確認されたと考えられた。
【０１３８】
結果
このスクリーニングで、ＡＬＰＰＬ２、ＡＰ４Ｍ１、ＣＡＰＺＡ１、ＤＮＡＨ５、ＤＯＭ３Ｚ、ＦＴＣＤ、ＰＤＩＡ３、ＭＤＭ４、ＷＤＲ６６、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８、ＮＳＵＮ６、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＲＶＢ、ＰＨＥＸ、ＰＫＮ、ＰＯＬＲ２Ｊ２、ＲＡＢ２０、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５を含む１９個の遺伝子が確認された。確認されたｓｉＲＮＡプールは全て、肝臓での発現が少なくとも低レベルである遺伝子を標的とした。
【実施例５】
【０１３９】
キメラＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンを使用したヒットのスクリーニング
実験は、キメラＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンがＣｏｎ１ １ｂレプリコンと同様の遺伝子のノックダウンに感受性であるかどうかを決定するために実施した。使用した方法は、遺伝子型２ｂ ＮＳ５ｂ配列を含有するＢＫレプリコンを使用すること以外は、実施例１および４で記載されている。ＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンは、Ｇｒｏｂｌｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：１６７４１〜１６７４６、２００３に記載されている。
【０１４０】
データ分析は、確認されたｓｉＲＮＡヒットそれぞれについて実施した。ＢＫ：２ｂ（ＮＳ５ｂ）レプリコンに対するｓｉＲＮＡ形質移入の効果を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【実施例６】
【０１４２】
ＨＣＶ遺伝子型１ａ、Ｃｏｎ−１ｂおよび２ａレプリコンに対する活性
定量的マルチプレックスＴａｑＭａｎアッセイは、３種のＨＣＶレプリコン細胞系、Ｃｏｎ−１ｂ、１ａおよび２ａにおけるＨＣＶレプリコンＲＮＡの相対量を測定するために確立された。簡単に説明すると、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ９６ウェルキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１８２）を使用してｓｉＲＮＡで形質移入したレプリコン細胞から単離した。ＴａｑＭａｎ反応は、ＴａｑＭａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４０３０２８）、ＴａｑＭａｎ ＰＤＡＲ対照試薬ヒトシクロフィリンＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３１０８８３Ｅ）ならびにＨＣＶレプリコンゲノムのネオマイシン耐性遺伝子を標的化するプローブおよびプライマーセット（Ｎｅｏ ｆｗｄ：配列番号９８、Ｎｅｏ ｒｅｖ：配列番号９９およびＮｅｏ ｐｒｏｂｅ ５’ＦＡＭ−配列番号１００−ＴＡＭＲＡ３’）を使用した。反応混合物中の各成分の最終濃度は以下の通りである。１×ＴａｑＭａｎ ＥＺ緩衝液、Ｍｎ（Ｏａｃ）２ ３ｍＭ、ｄＡＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＣＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＧＴＰ ０．３ｍＭ、ｄＵＴＰ ０．６ｍＭ、フォワードプライマー０．２ｍＭ、リバースプライマー０．２ｍＭ、プローブ０．１ｍＭ、１×ＰＤＡＲシクロフィリンＡミックス、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ０．１ユニット／μｌ、ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ ０．０１ユニット／μｌ、全ＲＮＡ１０μｌおよびＨ２Ｏで５０μｌにする。９６管光学プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｎ８０１−０５６０）を光学粘着性カバー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｎ４３１１９７１）で覆い、数回反転することによって混合した。この試料をマルチプレックスＴａｑＭａｎ分析のためにＡＢＩ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に入れ、プレート全体を「未知」（ＨＣＶ）ではＦＡＭ色素層に、内部対照、シクロフィリンＡではＶＩＣ色素層に設定した。サイクリング変数は、スペクトル補正および曝露時間１０ミリ秒を使用して、５０℃２分、６０℃３０分、９５℃５分（９４℃２０秒、５５℃１分）４０回に設定した。
【０１４３】
試料中における各標的ＲＮＡの相対量を計算するために、３種のＨＣＶレプリコン細胞株のそれぞれにおいて、ＨＣＶ Ｎｅｏプライマーおよびプローブセットならびに内部対照、シクロフィリンＡ予備開発アッセイ試薬（ＰＤＡＲ）について標準曲線を作製した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を使用し、製造者のプロトコルに従って、レプリコンから全ＲＮＡを単離した。ＴａｑＭａｎサイクル閾値（Ｃｔ）は、全ＲＮＡを７回５倍希釈して測定した。全ＲＮＡの質量（ｎｇ）の自然対数を測定し、Ｃｔ値に対してプロットした。ＨＣＶレプリコン細胞株のそれぞれにおいて、各プローブおよびプライマーセットで方程式を計算して、それぞれのＣｔ値からＨＣＶ ＲＮＡおよび内部対照シクロフィリンＡ ｍＲＮＡの相対量を得た。ＨＣＶ ＲＮＡレベルは、内部対照、シクロフィリンＡ、ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
【０１４４】
結果
第１優先標的：ＨＣＶ遺伝子型１ａ、Ｃｏｎ−１ｂおよび２ａレプリコンの複製を３０％超阻害するｓｉＲＮＡ：ＤＵＳＰ１９、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ４、ＧＡＫ、ＰＡＲＶＢ、ＰＦＫＬ、ＰＫ４ＣＡ、ＰＳＫＨ１、ＳＯＣＳ５、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５。
【０１４５】
第２優先標的：２種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも５０％超阻害するｓｉＲＮＡ：ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＳＴＫ１６およびＴＮＫ１。
【０１４６】
第３優先標的：２種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも３０％超阻害するｓｉＲＮＡ:ＡＫＡＰ８、ＡＬＫ、ＡＰ４Ｍ１、ＣＡＰＺＡ１、ＤＧＫＤ、ＤＮＡＨ５、ＤＹＲＫ２、ＥＰＨＡ２、ＦＧＦＲ２、ＦＲＫ、ＦＴＣＤ、ＧＣＫ、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８、ＰＤＩＡ３、ＰＨＥＸ、ＰＯＬＲ２Ｊ２、ＰＲＫＷＮＫ３、ＲＡＢ２０、ＳＴＫ３５、ＴＪＰ２、ＴＰＫ１、ＴＲＥＢ３およびＴＲＰＭ７。
【０１４７】
第４優先標的：１種のＨＣＶ遺伝子型の複製を少なくとも３０％超阻害するｓｉＲＮＡ:ＡＬＰＰＬ２、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＤＤＲ１、ＤＧＫＺ、Ｄ０Ｍ３Ｚ、ＤＵＳＰ２２、ＤＵＳＰ６、ＭＡＰ２Ｋ６、ＮＭＥ４、ＰＣＫ１、ＰＲＰＳ１Ｌ１、ＰＴＫ９Ｌ、ＳＲＰＫ１、ＴＡＦ１、ＴＢＫ１、ＶＲＫ１およびＷＤＲ６６。
【実施例７】
【０１４８】
ＨｅＬａ細胞におけるＨＣＶ１ｂサブゲノム複製の阻害
ＨｅＬａ細胞において複製するように操作されたレプリコンクローンにおいて第１優先標的がＨＣＶ１ｂサブゲノム複製を阻害する能力を試験した。ＨｅＬａ細胞においてサブゲノム複製が阻害されることは、標的遺伝子の必要性がＨｕＨ−７細胞株の人為的結果ではないことの証拠となる。ＨＣＶのＨｅＬａ細胞複製系は、Ｚｈｕ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７７（１７）：９２０４〜９２１０、２００３に記載された通りであった。ｓｉＲＮＡ形質移入およびサブゲノム複製の定量は、実施例６に説明したように実施した。
【０１４９】
結果：
第１優先標的、ＤＵＴ、ＧＡＫ、ＰＦＫＬ、ＰＩＫＡＣＡ、ＰＳＫＨ１およびＳＹＮＰＲは、ＨｅＬａ細胞においてＨＣＶｃｏｎ１ｂサブゲノム複製を少なくとも３０％阻害した。ＰＡＲＶＢ、ＳＯＣＳ５およびＴＲＰＭ５ｓｉＲＮＡは、これらの細胞では毒性であり、ＨＣＶ複製に対する効果は評価できなかった。ＤＵＳＰ１９およびＤＹＲＫ４ｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞におけるＨＣＶサブゲノム複製に対して効果がなかった。
【実施例８】
【０１５０】
ワートマニンによるＨＣＶ複製の阻害
ＰＩＫ４ＣＡは、２個のアイソフォームが報告されている。アイソフォーム１（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００２６５０、タンパク質：ＮＰ＿００２６４）は短く、アイソフォーム２（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０５８００４、タンパク質：ＮＰ＿４７７３５２）のＮ末端部分のほとんどが欠如している。ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム１は、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩ型として特徴づけられており、アデノシンには感受性で、ワートマニンには非感受性であるが（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｌｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２８８７８〜２８８８４、１９９４）、ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム２はホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型として特徴づけられており、ワートマニンには感受性で、アデノシンには非感受性である（Ｇｅｈｒｍａｎｎ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４３７：３４１〜３５６、１９９９）。
【０１５１】
アイソフォーム２がＨＣＶ複製に関連したアイソフォームであるかどうかを確かめるために、細胞においてマイクロモルレベルでホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型を阻害するキナーゼ阻害剤、ワートマニンのＨＣＶ複製に対する効果を試験した。簡単に説明すると、ベータラクタマーゼを発現するＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞株を９６ウェルＢｌａｃｋ組織培養処理プレート上で細胞完全培地（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、１×ＮＥＡＡ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、（−）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）５０μｌに７５００細胞／ウェルで接種した。ワートマニンの１０ｍＭ ＤＭＳＯ保存液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｗ１６２８）を完全培地２００μｌで１００μＭに希釈し、２．５倍で７回系列希釈して力価測定した。希釈点それぞれから５０μｌを、ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞を含有するアッセイプレートに移し、以下の濃度（μＭ）のワートマニン：５０、２０、８、３．２、１．２８、０．５１２および０．２０４８を作製した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１５２】
ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞系において内在性β−ラクタマーゼ活性を阻害するために、クラブラン酸の１ｍＭ ＤＭＳＯ保存液（ＵＳ ＰＨａｒｍｏｃｏｐｅｉａ、＃１１３４４２６）を完全培地で５．５μＭに希釈し、その１０μｌを細胞に添加して、最終濃度０．５μＭを作製した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１５３】
ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂ ＣＭ１０細胞系においてβ−ラクタマーゼ活性を測定するために、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ β−ラクタマーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｋ１０８５）染色混合物を製造者のプロトコルに基づいて調製した。細胞培養／化合物培地を細胞から除去して、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ β−ラクタマーゼ染色混合物と置換した。細胞を暗所で室温で１．５〜２．０時間インキュベートした。Ａ４６０およびＡ５３０の蛍光強度をＬＪＬ分析で測定した。
【０１５４】
結果
ワートマニンはＨＣＶ複製をＩＣ５０７．１μＭで阻害した。このデータは、ＰＩＫ４ＣＡ機能を必要とするＨＣＶ複製と一致した。
【実施例９】
【０１５５】
ＰＩＫ４ＣＡアイソフォーム２を特異的に標的化するｓｉＲＮＡはＨＣＶ複製を中断する
ＨＣＶ複製におけるＰＩＫ４ＣＡ２アイソフォーム２の必要性を示すために、アイソフォーム２ｍＲＮＡのみを標的化するｓｉＲＮＡ（ＮＭ＿０５８００４）のＨＣＶ複製の阻害を試験した。以下のｓｉＲＮＡをＣＭ．１０細胞に形質移入して、実施例１に記載した通りにＨＣＶサブゲノム複製の阻害を試験した。
【０１５６】
【化２】
【０１５７】
結果
ＰＩＫ４ＣＡを標的化する６種のｓｉＲＮＡは全てＨＣＶサブゲノム複製を阻害し、ＰＩＫ４ＣＡのアイソフォーム２はＨＣＶ複製に関連したアイソフォームであることが確認された。
【実施例１０】
【０１５８】
ＰＩＫ４ＣＡ２を標的化するｓｉＲＮＡは、ＨＣＶ複製中断の前にＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡレベルをノックダウンする
ＨＣＶ複製がＰＩＫ４ＣＡ発現または活性に左右されるならば、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡを形質移入した後で生じるＨＣＶ複製の減少は、ＰＩＫ４ＡＣ発現欠如に続いて生じるはずである。これを確かめるために、ＨＣＶ Ｃｏｎ１−ｂレプリコンを含有するＨｕＨ−７細胞を、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡで形質移入した。形質移入後、０，１２、２４、３６、４８および７２ｈの時点で、細胞から全ＲＮＡを単離し、ＰＩＫ４ＣＡおよびＨＣＶ ＲＮＡレベルを実施例６に記載したように測定した。
【０１５９】
結果
図１に示したように、ＰＩＫ４ＣＡを標的化するｓｉＲＮＡは、形質移入後１２ｈと２４ｈとの間でＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡレベルの最大阻害を引き起こした。対照的に、ＨＣＶ ＲＮＡレベルは形質移入後３６ｈと４８ｈとの間で減少し始め、７２ｈ時点まで減少し続けた。
【実施例１１】
【０１６０】
ポリクローナルＰＩＫ４ＣＡ抗体を使用したＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルのノックダウンの確認
抗原ＩＰ１２４０配列番号１１３（ａａ８９３〜９０４）およびＩＰ１２４１配列番号１１４（ａａ６９６〜７０７）に対して抗体を作製した。ウサギ２匹（Ｄ３７９２およびＤ３７９３）の抗血清は、ウェスタンブロットによってアッセイしたとき、ＰＩＫ４ＣＡの内部レベルを検出するのに十分敏感であった。Ｖ５タグを付けたＰＩＫ４ＣＡまたは空のｐＣＤＮＡ３．１ベクターは、ＨＣＶ ＨＶ１ Ｃｏｎ１ｂ細胞で過剰発現した。細胞溶解物をＲＩＰＡ緩衝液中に収集して、４％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。カスタム抗体（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用したウェスタンブロット分析用に１：１０００に希釈した。ＰＩＫ４ＣＡのゲル移動特性を測定するために、Ｖ５およびＤ３９７２抗体を使用して２重プローブウェスタンブロットを実施した。２色ウェスタンブロットによって、Ｄ３９７２ブロットで見られた強度の弱い低いバンドは、Ｖ５でタグ付けしたタンパク質と同じ大きさで移動することが示された（図２Ａ）。
【０１６１】
ＰＩＫ４ＣＡタンパク質がＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡの存在下で減少するかどうかを測定するために、ＨＣＶ ＨＢ１ Ｃｏｎ１ｂ細胞を対照ｓｉＲＮＡおよびＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡのＯＲＦまたは３’ＵＴＰを標的化するＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡで形質移入した。その結果は、ＨＣＶ ＲＮＡレベルがＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡおよび陽性対照、ＨＣＶ ｓｉＲＮＡによって減少することを示している（図２Ｂ）。さらに、ＰＩＫ４ＣＡ ｍＲＮＡのＯＲＦおよび３’ＵＴＰ両方を標的とするＰＩＫ４ＣＡ ｓｉＲＮＡは、ウェスタンブロットによるとＰＩＫ４ＣＡタンパク質を検出不可能なレベルまで減少させる（前述のように、低い、強度の弱いバンドはＰＩＫ４ＣＡを表す、図２Ｃ）。これらのデータによって、使用したｓｉＲＮＡによるＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルのノックダウンが実証され、Ｄ３７９２抗体によって認識されたＰＩＫ４ＣＡバンドの同一性が確認される。
【実施例１２】
【０１６２】
いくつかの標的に関する追加情報
標的のいくつかに対する追加情報を以下に挙げる。
【０１６３】
ＤＵＳＰ１９（２特異性ホスファターゼ１９）
ＤＵＳＰ１９は、２特異性分裂促進剤活性化プロテインキナーゼホスファターゼファミリーの１つである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４９および５０によって表される。ＤＵＳＰ１９多形を表５に示す。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
ＤＵＴ（ｄＵＴＰポリホスファターゼ）
ＤＵＴは、複製中にＤＮＡに誤取り込みされるのを防ぐためにｄＵＴＰを低レベルに維持し、５−フルオロウラシルに対する耐性を媒介し、ペルオキシソーム増殖を調節することができる。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５１および５２によって表される。ＤＵＴ多形を表６に示す。
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
ＤＹＲＫ４（２特異性チロシン調節キナーゼ４）
ＤＹＲＫ４は、タンパク質チロシンキナーゼのＤＹＲＫファミリーの１つである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５３および５４によって表される。ＤＹＲＫ４多形を表７に示す。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
ＧＡＫ（サイクリンＧ関連キナーゼ）
ＧＡＫは、テンシンおよびオーキシリンと相同性を有する推定セリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞周期調節において役割を果たすことができる。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５５および５６によって表される。ＧＡＫヌクレオチド多形を表８に示す。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
ＰＡＲＶＢ（パルビンベータ）アイソフォームＡ
ＰＡＲＶＢは、インテグリン結合キナーゼに結合する２個のカルポニン相同性ドメインを含有する接着斑タンパク質であり、細胞−基質接着を確立するためにインテグリン−ＩＬＫシグナリングが関与するようである。そのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号３７および３８によって表される。ＰＡＲＶＢヌクレオチド多形を表９に示す。
【０１７２】
【表９】
【０１７３】
ＰＦＫＬ（ホスホフルクトキナーゼ、肝臓）
肝臓ホスホフルクトキナーゼは、解糖作用においてフルクトース−６−リン酸のフルクトース−１，６−２リン酸へのリン酸化を触媒する。欠乏すると糖原病ＶＩＩ型と関連し、過剰発現するとダウン症の認識障害と関連し得る。ＰＦＫＬのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号６３および６４によって表される。
【０１７４】
ＰＩＫ４ＣＡ
ＰＩＫ４ＣＡは、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩ型である。ホスファチジルイノシトール４，５−２リン酸の形成の第１段階を触媒し、その活性は高濃度のワートマニンによって阻害される。ＰＩＫ４ＣＡのタンパク質配列およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号２１および２２によって表される。ＰＩＫ４ＣＡヌクレオチド多形を表１０に示す。
【０１７５】
【表１０】
【０１７６】
ＰＳＫＨ１（タンパク質セリンキナーゼＨ１）
ＰＳＫＨ１は、カルシウム依存性自己リン酸化を受けるタンパク質セリンキナーゼである。ＰＳＫＨ１の過剰発現は、スプライシング因子ＳＦＲＳ１およびＳＦＲＳ２の核再構築を導き、ＲＮＡスプライシングを刺激する。ＰＳＫＨ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５７および５８によって表される。
【０１７７】
ＳＯＣＳ５（サイトカインシグナリング５の抑制因子）
ＳＯＣＳ５は、ＳＨ２ドメインおよびＳＯＣＳボックスを含有するサイトカイン誘導性タンパク質である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路によってサイトカインシグナリングを負に調節する。ＳＯＣＳ５のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号５９および６０によって表される。ＳＯＣＳ５について同定されたヌクレオチド多形を表１１に示す。
【０１７８】
【表１１】
【０１７９】
ＳＹＮＰＲ（シナプトポリン）
シナプトポリンは、シナプス小胞の標的化に関与するシナプス小胞内在性膜タンパク質、ラットシナプトフィジンと高い相同性を有するタンパク質である。膜関連ドメインを含有し、脂質関連タンパク質で発見されることが多い。ＳＹＮＰＲのタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４５および４６によって表される。
【０１８０】
ＴＲＰＭ５（一過性受容器電位カチオンチャンネル、サブファミリーＭ、構成要素５）
ＴＲＰＭ５は、カチオンチャンネルの一過性受容器電位ファミリーと関連している。６個の予測膜貫通ドメインを有する。ＴＲＰＭ５のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号４７および４８によって表される。ＴＲＰＭ５について同定されたヌクレオチド多形を表１２に示す。
【０１８１】
【表１２】
【０１８２】
ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（アイソフォーム１ｂ）アルファサブユニット（４５ｋＤ）
ＰＡＦＡＨ１Ｂ１は、血小板活性化因子を不活性化するヘテロ３量体酵素の非触媒性サブユニットである。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号３５および３６によって表される。ＰＡＦＡＨ１Ｂ１のヌクレオチド多形を表１３に示す。
【０１８３】
【表１３】
【０１８４】
ＳＴＫ１６（セリン／トレオニンキナーゼ１６）
セリン／トレオニンキナーゼ１６は、トランスフォーミング成長因子ベータによる情報伝達に応答して転写を調節することができるミリストイル化およびパルミトイル化されたタンパク質キナーゼである。ＳＴＫ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号７および８によって表される。
【０１８５】
ＴＮＫ１（チロシンキナーゼ、非受容体１）
ＴＮＫ１は、ホスホリパーゼＣガンマ１（ＰＬＣＧ１）と相互作用するキナーゼである。胎児発生中およびリンパ球造血系の成人細胞におけるリン脂質シグナリング経路を調節することができる。ＴＮＫ１のタンパク質およびコードしているｃＤＮＡ配列は、配列番号６１および６２によって表される。
【実施例１３】
【０１８６】
ＨＩＶ感染も遮断するｓｉＲＮＡヒット
優先順位の高いｓｉＲＮＡプールがＨｅＬａ細胞においてＨＩＶ感染を中断させる能力について試験した。その方法は以下の通りに実施した。
１日目：ＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞を４×９６ウェルプレートにウェル当たり２０００個で接種する。
２日目：ｓｉＲＮＡプールによるＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞の形質移入は以下の通りである。
【０１８７】
１．ｓｉＲＮＡを最終濃度０．５％のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して最終濃度１００ｎＭで形質移入した。陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡを以下の通りに含めた。
【０１８８】
サイクリンＴ１（陽性対照）：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号ｓｃ−３５１４４）から購入。
【０１８９】
ルシフェラーゼ（陰性対照）：ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ（配列番号１１５）
２連で試験したｓｉＲＮＡには、ＤＵＳＰ１９、ＤＵＴ、ＤＹＲＫ４、ＧＡＫ、ＰＡＲＶＢ、ＰＦＫＬ、ＰＩＫ４ＣＡ、ＰＳＫＨ１，ＳＯＣＳ５、ＳＹＮＰＲおよびＴＲＰＭ５を標的とする３種のｓｉＲＮＡのプールが含まれた。
【０１９０】
２．ＯｐｔｉＭＥＭを６６μＬ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに分配し、１２番目の列は空にしておく。
【０１９１】
３．各ｓｉＲＮＡ（１０μＭで再懸濁）２μＬをＯｐｔｉＭＥＭ含有プレートに移した。
【０１９２】
４．上下にピペッティングすることによって混合した。
【０１９３】
５．試験管に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２４０μＬ、ＯｐｔｉＭＥＭ１２１０μＬを添加した。室温で５分間インキュベートした。
【０１９４】
６．各ウェルにＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ１２μＬを分配し、上下にピペッティングすることによって混合した。プレートを室温で１５分間インキュベートした。
【０１９５】
７．ＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞の各ウェルにｓｉＲＮＡ−Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体２０μＬを添加した。
３日目：形質移入したＨｅＬａ（Ｐ４／Ｒ５）細胞に以下の通りにＨＸＢ２ ＨＩＶを感染させた。
【０１９６】
１．培地を細胞から除去した。
【０１９７】
２．新鮮な培地８０μＬを各ウェルに添加した。
【０１９８】
３．ＨＸＢ２ ＨＩＶを培地で希釈した。希釈したＨＸＢ４０μＬを各ウェルに添加した。
【０１９９】
４．ウイルス感染を９６時間継続させた。
５日目
ベータガラクトシダーゼ活性、ウイルス感染の指標を以下の通りに測定した。
【０２００】
１．培地を細胞から除去した。
【０２０１】
２．細胞をウェル当たり２００μＬのＰＢＳで洗浄した。
【０２０２】
３．ＤＴＴを含有する溶解緩衝液（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ、Ｔｒｏｐｉｘ、カタログ番号ＢＬ１００Ｐ）２０μＬを各ウェルに添加し、プレートを１０分間振盪した。
【０２０３】
４．次に、基質８０μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で暗所で１時間インキュベートした。
【０２０４】
５．増強溶液１００μＬを各ウェルに添加して、プレートをＤｙｎｅｘ照度計で読み取った。
【０２０５】
データは、以下の方法で分析した。各プレートの読み取り値は、ルシフェラーゼ陰性対照の読み取り値に正規化して、「ルシフェラーゼ対照のパーセント」として表した。好ましい標的は、平均４０％以上でベータ−ガラクトシダーゼ活性を抑制するｓｉＲＮＡプールと考えられた。
【０２０６】
結果
ＰＩＫ４ＣＡ、ＳＹＮＰＲ、ＤＹＲＫ４およびＰＦＫＬを標的とするｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ複製を４０％超阻害した（図３参照）。したがって、これらの遺伝子は、ヒト細胞系においてＨＩＶおよびＨＣＶ両方の複製に不可欠である。ＨＩＶ複製の３０％と４０％との間の阻害が、ＧＡＫ、ＤＵＳＰ１９およびＤＵＴを標的とするｓｉＲＮＡで認められ、これらの遺伝子はまた、ＨＩＶおよびＨＣＶ感染を標的化できることを示唆する。
【０２０７】
実施例７に示したように、ＨｅＬａ細胞におけるＳＯＣＳ５、ＰＡＲＶＢおよびＴＲＰＭ５ｓｉＲＮＡに関連した毒性は、これらの細胞におけるウイルス感染においてこれらの遺伝子が果たす役割のいかなる理解も妨害する。ＰＳＫＨ１ｓｉＲＮＡでは、ＨＩＶ複製に対して影響は認められなかった。
【０２０８】
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態を示し説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】ＰＩＫ４ＣＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入した後のＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡレベルおよびＨＣＶＲＮＡレベルのノックダウンの経時変化を示す結果を表した図である。
【図２Ａ】ＰＩＫ４ＣＡタンパク質を認識するウサギポリクローナル抗血清の産生を示す結果を表した図である。
【図２Ｂ】ＰＩＫ４ＣＡを標的とする２個の別個のｓｉＲＮＡまたはＨＣＶを直接標的とするｓｉＲＮＡを形質移入した後ではＨＣＶ複製の阻害を示すが、非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳＩ）の形質移入の後では示さない結果を表した図である。
【図２Ｃ】図２Ｂで使用したＰＩＫ４ＣＡを標的とするｓｉＲＮＡはＰＩＫ４ＡＣタンパク質レベルもノックダウンするが、ＨＣＶを標的とするｓｉＲＮＡおよび非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ１）はＰＩＫ４ＣＡタンパク質レベルに影響を及ぼさないことを示す結果を表した図である。
【図３】異なる宿主遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡがＨＩＶ複製を阻害する能力を示す結果を表した図である。以下の遺伝子、１−ＣｙｃＴ１；２−ＰＦＫＬ；３−ＰＩＫ４ＣＡ；４−ＤＹＲＫ４；５−ＳＹＮＰＲ；６−ＧＡＫ；７−ＤＵＳＰ１９；８−ＤＵＴ；９−ＰＳＫＨ１；１０−ＬＵＣ；１１−Ｓ０ＣＳ５；１２−ＰＡＲＶＢ；および１３−ＴＲＰＭ５のｓｉＲＮＡの結果を図１に挙げる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる細胞因子を標的化するｓｉＲＮＡライブラリーがウイルスの複製を阻害する能力を測定するステップを含み、前記ｓｉＲＮＡライブラリーは、前記ウイルスの複製に従来は関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１０個の異なるｓｉＲＮＡが標的化すること、を含む、前記ウイルスの複製に関与した宿主細胞因子の同定方法。
【請求項２】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、ｓｉＲＮＡライブラリーは、ＨＣＶ複製に従来は関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１００個の異なるｓｉＲＮＡが標的化すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１００個の異なるｓｉＲＮＡの各々がキナーゼまたはホスファターゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質との配列同一性が少なくとも９５％である前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質に結合するか、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物を同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記化合物がウイルスの複製を阻害する能力を測定するステップと
を含むウイルス阻害化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、４９、５１、５３、５５または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のいずれかである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）で同定された化合物が標的タンパク質の活性を阻害する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがＨＣＶであり、標的タンパク質が配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的タンパク質が、配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）がＨＣＶレプリコンを含有する培養細胞を使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスがＨＩＶであり、標的タンパク質が配列番号２１、４５、４７、４９、５１、５３、５５または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号）４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害することができる化合物の有効量を細胞に提供するステップを含む、ＨＣＶレプリコンを含有するか、ＨＣＶに感染した前記細胞におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製の阻害方法。
【請求項１５】
標的タンパク質が配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＣＶレプリコンに感染した培養細胞においてＨＣＶ複製を阻害するために使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する前記標的タンパク質に実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害することができる化合物の有効量を宿主細胞に提供するステップを含む、宿主におけるウイルス複製の阻害方法。
【請求項１８】
標的タンパク質が、配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のいずれかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
異なる細胞因子を標的化するｓｉＲＮＡライブラリーがウイルスの複製を阻害する能力を測定するステップを含み、前記ｓｉＲＮＡライブラリーは、前記ウイルスの複製に従来は関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１０個の異なるｓｉＲＮＡが標的化すること、を含む、前記ウイルスの複製に関与した宿主細胞因子の同定方法。
【請求項２】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり、ｓｉＲＮＡライブラリーは、ＨＣＶ複製に従来は関与しなかった異なる宿主因子を少なくとも１００個の異なるｓｉＲＮＡが標的化すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１００個の異なるｓｉＲＮＡの各々がキナーゼまたはホスファターゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質との配列同一性が少なくとも９５％である前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質に結合するか、またはその活性もしくは発現を阻害する化合物を同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記化合物がウイルスの複製を阻害する能力を測定するステップと
を含むウイルス阻害化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、４９、５１、５３、５５または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のいずれかである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）で同定された化合物が標的タンパク質の活性を阻害する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがＨＣＶであり、標的タンパク質が配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的タンパク質が、配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）がＨＣＶレプリコンを含有する培養細胞を使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスがＨＩＶであり、標的タンパク質が配列番号２１、４５、４７、４９、５１、５３、５５または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号）４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する前記標的タンパク質と実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害することができる化合物の有効量を細胞に提供するステップを含む、ＨＣＶレプリコンを含有するか、ＨＣＶに感染した前記細胞におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製の阻害方法。
【請求項１５】
標的タンパク質が配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれか、あるいは前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＣＶレプリコンに感染した培養細胞においてＨＣＶ複製を阻害するために使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＫＡＰ８（配列番号１１）、ＡＬＫ（配列番号６７）、ＡＴＭ（配列番号６８）、Ｃ１４ＯＲＦ２４（配列番号６９）、ＤＧＫＤ（配列番号１５）、ＤＧＫＺ（配列番号７０）、ＤＵＳＰ１９（配列番号４９）、ＤＵＳＰ２２（配列番号７１）、ＤＵＳＰ６（配列番号９）、ＤＵＴ（配列番号５１）、ＤＹＲＫ２（配列番号７２）、ＤＹＲＫ４（配列番号５３）、ＥＮＰＰ５（配列番号７３）、ＥＰＨＡ２（配列番号１３）、ＦＧＦＲ２（配列番号７４）、ＦＨＩＴ（配列番号７５）、ＦＲＫ（配列番号７６）、ＧＡＫ（配列番号５５）、ＧＣＫ（配列番号１９）、ＭＡＰ２Ｋ３（配列番号７７）、ＮＭＥ４（配列番号１）、ＰＡＮＫ１（配列番号７８）、ＰＣＫ１（配列番号３）、ＰＦＫＬ（配列番号６３）、ＰＩＫ４ＣＡ（配列番号２１）、ＰＲＫＷＮＫ３（配列番号５）、ＰＲＰＳ１Ｌ１（配列番号７９）、ＰＳＫＨ１（配列番号５７）、ＰＴＫ９Ｌ（配列番号８０）、ＳＯＣＳ５（配列番号５９）、ＳＲＰＫ１（配列番号１７）、ＳＴＫ１６（配列番号７）、ＳＴＫ３５（配列番号８１）、ＴＡＦ１（配列番号８２）、ＴＢＫ１（配列番号８３）、ＴＪＰ２（配列番号８４）、ＴＮＫ１（配列番号６１）、ＴＰＫ１（配列番号８５）、ＴＲＩＢ３（配列番号８６）、ＴＲＰＭ７（配列番号８７）、ＶＲＫ（配列番号８８）、ＡＬＰＰＬ２（配列番号８９）、ＡＰ４Ｍ１（配列番号２３）、ＣＡＰＺＡ１（配列番号２５）、ＤＮＡＨ５（配列番号２７）、ＤＯＭ３Ｚ（配列番号９０）、ＦＴＣＤ（配列番号２９）、ＰＤＩＡ３（配列番号３１）、ＭＤＭ４（配列番号９１）、ＷＤＲ６６（配列番号９２）、ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（配列番号３３）、ＮＳＵＮ６（配列番号９３）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１（配列番号３５）、ＰＡＲＶＢ（配列番号３７）、ＰＨＥＸ（配列番号３９）、ＰＫＮ１（配列番号４４）、ＰＯＬＲ２Ｊ２（配列番号４１または６５）、ＲＡＢ２０（配列番号４３）、ＳＹＮＰＲ（配列番号４５）およびＴＲＰＭ５（配列番号４７）からなる群から選択された標的タンパク質または前記標的タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する前記標的タンパク質に実質的に類似のタンパク質の活性もしくは発現を阻害することができる化合物の有効量を宿主細胞に提供するステップを含む、宿主におけるウイルス複製の阻害方法。
【請求項１８】
標的タンパク質が、配列番号７、２１、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１または６３のいずれかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のいずれかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的タンパク質が、配列番号２１、４５、４７、５３または６３のいずれかである、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５０１５１３（Ｐ２００９−５０１５１３Ａ）
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８２６０（Ｐ２００８−５１８２６０）
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００１９２８
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【出願人】（５０５４４１９０４）ロゼッタ インファーマティックス エルエルシー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００１９２８
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【出願人】（５０５４４１９０４）ロゼッタ インファーマティックス エルエルシー (9)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]