ＨＥＲ３結合ポリペプチド
本発明は、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドを提供し、該モチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対して又はＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対して結合親和性を有し、かつ本明細書で定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチド又はＥＧＦＲ結合ポリペプチドとを含む、二重特異性リガンドも提供される。
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対して又はＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対して結合親和性を有し、かつ本明細書で定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチド又はＥＧＦＲ結合ポリペプチドとを含む、二重特異性リガンドも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（本明細書ではＨＥＲ３と呼ぶ）に結合するポリペプチド並びに画像化及び治療における上記ポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２、又はＨＥＲ３及びＥＧＦＲの両方に対する結合親和性を有する二重特異性リガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＥＲＢＢ３又はＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）を含む膜貫通チロシンキナーゼ受容体の上皮増殖因子ファミリーは、細胞内シグナル伝達経路の複雑なネットワークを通した重要な細胞機能（例えば細胞増殖、生存、分化及び遊走）の調節に関与する。今日では、これらの受容体の異常な発現及びシグナル伝達がいくつかの型のがんの発生及び進行に関連するということが十分に確立されており、それによりこれらの受容体は新規ながん治療の開発のための重要な標的となっている。これまでに、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体が最も広く研究されており、いくつかの標的の薬剤はヒトがんの診断又は処置について行政当局により認可されている。ＨＥＲ３はチロシンキナーゼ活性を欠いており、従ってそのシグナル伝達機能を発揮するために他のＥｒｂＢ受容体と（例えばＨＥＲ２と）ヘテロ二量体を形成しなければならない（非特許文献１）。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体は潜在的に発がん性の単位であると考えられており（非特許文献２）、そしてＨＥＲ３はＨＥＲ２の好ましいヘテロ二量化パートナーとして近年注目が高まっている。ＨＥＲ２との二量化はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化並びに腫瘍細胞生存及び増殖の促進をもたらす（非特許文献３）。ＨＥＲ３は、乳がん（非特許文献４）、卵巣がん及び膀胱がん（非特許文献５）を含む多数のヒトのがんにおいて発現され、そしていくつかの肺がん（非特許文献６）及び前立腺がん（非特許文献７）を含む他のがん（非特許文献８）におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。さらに、高レベルの受容体発現は、ＨＥＲ２を過剰発現する患者と比較して有意に短い生存期間と関連するので、ＨＥＲ３発現は予後的な価値を有する（非特許文献９、非特許文献１０）。実際ＨＥＲ３は、ＥｒｂＢ受容体−ＰＩ３Ｋシグナル伝達軸のリガンド誘導活性化における主要なノードであると提案されてきた（非特許文献１１）。
【０００３】
より最近に認可された治療の比較的大部分はＥＧＦＲに向けられたものであり、そしてＨＥＲ２受容体はモノクローナル抗体に基づく。この新しいクラスの生物学的薬剤のがん治療における成功の背後にある理由の１つは、低分子化学薬を使用して以前には達成できなかった新しく独特な作用機構を抗体が提供するということである。より伝統的なアゴニスト（例えば細胞表面受容体の刺激）及びアンタゴニスト（例えば天然のタンパク質−タンパク質相互作用のブロック）の治療効果に加えて、抗体はまた、様々な範囲の免疫学的防御機構を特異的にがん性細胞に向けるために、さらには種々の画像化又は治療用抱合体（例えば化学療法薬、放射性核種及び毒素）の特異的送達を達成するための標的化剤として使用され得る。ＥｒｂＢファミリーの十分に研究されたＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体メンバーと対照的に、抗ＨＥＲ３抗体の使用に関しては比較的少ない報告しかない。
【０００４】
しかしＵｌｌｒｉｃｈ及び共同研究者らは、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体が乳がんの細胞モデルにおいてＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害するということを報告しており（非特許文献１２）、そして現在では２つのモノクローナル抗ＨＥＲ３抗体が第１相臨床試験にある（ＡＭＧ ８８８、非特許文献１３、及びＭＭ−１２１、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌら、上記）。
【０００５】
しかし、全長モノクローナル抗体を使用するいくつかの成功したがん治療研究が報告されているが、このクラスの薬剤は固形腫瘍を標的とするために（診断的なペイロードの目的でも治療的なペイロードの目的でもなく）常に最適というわけではない。治療効果は、腫瘍全体の薬物の有効な分布に依存し、そして分子画像化は、腫瘍取り込みと周囲の正常組織との間の高い比率に依存する。腫瘍浸透率（血管外漏出を含む）は分子の大きさと逆の関係があるので、比較的大きなＩｇＧ分子は本質的に乏しい組織分布及び浸透能を有する。さらに、分子画像化については、抗体の非常に長いインビボでの半減期が比較的高い血液シグナルを生じ、それにより比較的少ない腫瘍対血液コントラストを生じる。
【０００６】
ＨＥＲ３はＥＧＦファミリーの他のメンバーと同じ腫瘍細胞で発現され得るので、ＨＥＲ３及びＥＧＦファミリーの別のメンバーを標的にする二重特異性分子の製造は、近年いくらかの興味を集めている。このような二重特異性分子は、例えば分子画像化適用における標的化及びＨＥＲ３と腫瘍上に発現される別の抗原との同時標的化のための標的化ビヒクルとして利用され得る。
【０００７】
しかし、２つの別々の標的に結合する二重特異性モノクローナル抗体を製造することは複雑である。４つの必要なポリペプチド鎖をコードする遺伝子が細胞において産生される場合、１０もの異なる組み合わせが可能であり、そして１つの組み合わせのみが望まれる二重特異性抗体を示す。従って、二重特異的結合という構想は、抗体を使用して十分に探査されていない。代わりに、抗体フラグメント及び他の結合分子が二重特異性分子（二重特異性Ｚ変異体を含む）を作製するためにより広く利用されてきた（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｉｔｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２８４（１）：５４−６５（２００３）
【非特許文献２】Ｈｏｌｂｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １００（１５）：８９３３−８（２００３）
【非特許文献３】Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５（５）：３４１−５４（２００５）
【非特許文献４】Ｂｏｂｒｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３３（１１）：１８４６−５０（１９９７）
【非特許文献５】Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ４９（４）（１９９６）
【非特許文献６】Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２（１０）：３７８８−９３（２００５）
【非特許文献７】Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１（５）：１７０４−１２（２００５）
【非特許文献８】Ｓｔｏｖｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２１（８）：６６５−８４（２００４）
【非特許文献９】Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（２６）：４３１７−２３（２００６）
【非特許文献１０】Ｒｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４（１６）：５１８８−９７（２００８）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２（７７）：ｒａ ３１（２００９）
【非特許文献１２】ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１５（４）：５１９−２７（２００５）
【非特許文献１３】Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ９（７）：４６３−７５（２００９）
【非特許文献１４】Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：１２１−３１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の説明
例えばＨＥＲ３を発現する細胞の標的化、このようなＨＥＲ３を発現する細胞の分子画像化及びＨＥＲ３関連状態の処置において使用され得る新規なＨＥＲ３結合剤を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の両方を発現する病変に対する高い特異性を有する標的化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一局面によれば、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供され、該モチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｗ及びＶから選択され；
Ｘ3はＲ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＶから選択され；
Ｘ6はＡ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、Ｔ及びＹから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ11はＡ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ及びＴから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｆ、Ｄ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ20はＡ、Ｒ及びＫから選択され；
Ｘ21はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここでポリペプチドはＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＨＥＲ３−ＥＣＤ）に結合する。
【００１２】
本明細書において記載されるポリペプチドは、ＨＥＲ３によく結合するという点でＨＥＲ３に対する良好な結合親和性を示す。配列に関連したＨＥＲ３結合ポリペプチドのクラスの上記の定義は、選択実験においてＨＥＲ３とのそれらの相互作用について選択された親骨格の多数の無作為なポリペプチド変異体の分析に基づく。同定されたＨＥＲ３結合モチーフ又は「ＢＭ」は、親骨格の結合領域に相当し、この領域は３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ）内の２つのアルファヘリックスを構成する。親骨格において、２つのＢＭヘリックスの変更されたアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。結合表面の無作為な変更及びその後の変異体の選択により、結合表面のＦｃ相互作用能がＨＥＲ３との相互作用の能力で置き換えられた。
【００１３】
当業者に理解されるように、本明細書に定義されるポリペプチドのＨＥＲ３結合能のように、ポリペプチドの機能はポリペプチドの三次構造に依存する。従って、その三次構造及び機能に大きな影響を与えずにポリペプチドのアミノ酸配列に小さな変化を生成することが可能である。従って一実施態様において、本ポリペプチドは、結果として生じた配列がｉ）により定義されるクラスに属する配列に対して少なくとも９０％同一である、例えばｉ）により定義されるクラスに属する配列に対して少なくとも９３％同一、例えば少なくとも９７％同一であるように改変された、ｉ）ＢＭの変異体を含む。いくつかの実施態様において、小さな変化は本明細書において開示されるＨＥＲ３結合ポリペプチドの配列の全ての位置において作製され得る。他の実施態様において、小さな変化は、骨格アミノ酸残基とも示される不変位置においてのみ作製され得る。このような場合において、変化は可変位置、すなわち「Ｘ」で示される位置（例えば上記の定義されたＢＭのＸ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ11、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ25、Ｘ26及びＸ28）において許容されていない。例えば、アミノ酸残基の特定の機能による分類（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ機能グループからの別のアミノ酸残基と交換され得るということが可能である。
【００１４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用される用語「％の同一性（同一性％）」は以下のようにして算出される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２： ４６７３−４６８０（１９９４））を使用して問い合わせ配列を対象配列と整列させる。整列された配列の最短のものに対応する範囲にわたって比較を行う。整列された配列の最短のものは、いくつかの場合には標的配列であるかもしれない（例えば２９アミノ酸残基のＨＥＲ３結合モチーフ）。他の場合、問い合わせ配列が整列された配列の最短のものを構成するかもしれない。問い合わせ配列は、例えば少なくとも１０アミノ酸残基、例えば少なくとも２０アミノ酸残基からなるものであり得る。各位置におけるアミノ酸残基を比較し、そして標的配列において同一の対応を有する問い合わせ配列中の位置のパーセントを同一性％として報告する。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用される用語「％の類似性（類似性％）」は以下のやり方で計算される。配列アラインメント及び比較を基本的に同一性％の計算に関して記載したように行う。しかし「類似性」は以下のように解釈されるべきである。２つのアミノ酸残基は、それらがアミノ酸残基の同じグループに属する場合に類似と見なされる。アミノ酸残基のグループの非限定的な例は、アミノ酸残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓを含む疎水性グループ；アミノ酸残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む塩基性グループ；アミノ酸残基Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む酸性グループ；非荷電アミノ酸残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒを含む親水性グループ；並びにアミノ酸残基Ｇｌｙを含む天然グループである。従って、各位置におけるアミノ酸残基を比較し、そして標的配列中に類似した対応を有する問い合わせ配列中の位置のパーセントを類似性％として報告する。
【００１６】
この説明全体を通して、本発明に従う代替の実施態様は、特定の同一性パーセントの代わりに、対応する類似性パーセントを満たす。他の代替の実施態様は、特定の同一性パーセントに加えて、各配列についての好ましい同一性パーセントの群から選択される別のより高い類似性パーセント満たす。例えば、配列は別の配列に対して７０％の類似性であってもよく；又はそれは別の配列に対して７０％の同一性であってもよく；又は別の配列に対して７０％の同一性及び９０％の類似性であってもよい。
【００１７】
上に開示されるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ2はＲ、Ｋ及びＷから選択される。
【００１８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ3はＲ、Ｋ、Ｓ及びＹから選択される。
【００１９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される。
【００２０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ6はＡ、Ｓ、Ｔ及びＹから選択される。
【００２１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択される。
【００２２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ11はＱ及びＥから選択される。
【００２３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17はＲ、Ｑ、Ｔ及びＶから選択される。
【００２４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ18はＲ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択される。
【００２５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ20はＲ及びＫから選択される。
【００２６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ21はＡ及びＧから選択される。
【００２７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｒ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される。
【００２８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ28はＡ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択される。
【００２９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2はＲ及びＫから選択される。
【００３０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ3はＫ及びＹから選択される。
【００３１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される。
【００３２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ6はＴ及びＹから選択される。
【００３３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｙ及びＶから選択される。
【００３４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17はＲ、Ｑ及びＶから選択される。
【００３５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ18はＲ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｙ及びＶから選択される。
【００３６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される。
【００３７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ28はＡ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｓ及びＷから選択される。
【００３８】
上で開示されるＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、該ポリペプチドはＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含み、このモチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ ＹＸ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＫ、Ｒ及びＷから選択され；
Ｘ3はＫ、Ｒ、及びＹから選択され；
Ｘ4はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11はＥ及びＱから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ20はＫ及びＲから選択され；
Ｘ21はＡ及びＧから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する。
【００３９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2Ｘ3はＫＹ、ＲＹ、ＷＫ及びＷＲから選択される。
【００４０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ11はＱである。
【００４１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ、ＶＲ及びＲＲから選択される。
【００４２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ20はＫである。
【００４３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ21はＡである。
【００４４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される。
【００４５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＫ、Ｌ、Ｓ及びＴから選択される。
【００４６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＦ、Ｇ及びＹから選択される。
【００４７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ及びＶＲから選択される。
【００４８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｇ及びＳから選択される。
【００４９】
上で開示されるポリペプチドのなおさらなる実施態様において、アミノ酸配列ｉ）は、以下の条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：
Ｉ） Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される；
ＩＩ） Ｘ11はＱである；
ＩＩＩ） Ｘ20はＫである；
ＩＶ） Ｘ21はＡである、
の少なくとも１つを満たす。
【００５０】
アミノ酸配列ｉ）は、例えば４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、又は全てを満たし得る。
【００５１】
以下の実験項に詳細に記載されるように、ＨＥＲ３結合変異体の選択は、個々のＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定をもたらした。これらの配列は、この局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドの個々の実施態様を構成する。個々のＨＥＲ３結合モチーフの配列を図１に、そして配列番号１〜３３４として示す。この局面のいくつかの実施態様において、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号１〜配列番号６６のいずれか１つから選択され、例えば配列番号２２〜６６のいずれか１つから、例えば配列番号２３〜２５、配列番号２７〜２８、配列番号３２、配列番号３５〜３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４〜４５、配列番号５３〜５４及び配列番号５６から選択される。
【００５２】
特定の実施態様において、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）はこのようにして３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは該３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で相互接続ループを有する２つのアルファヘリックスを本質的に構成し得る。これらの実施態様において、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは：
ｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
［ここで
［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり；
ＸaはＡ及びＳから選択され；
ＸbはＮ及びＥから選択され；
ＸcはＡ、Ｓ及びＣから選択され；
ＸdはＡ及びＳから選択される］；
及び
ｉｉ） 上で定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含み得る。上記アミノ酸配列は、上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも８２％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の同一性を有し得る。
【００５３】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、そしてＸdはＡである。
【００５４】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＡである。
【００５５】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、そしてＸdはＳである。
【００５６】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＳである。
【００５７】
なおさらなる実施態様において、上で定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３３５〜６６８から選択され、特に配列番号３３５〜４００から、例えば配列番号３５６〜４００から、例えば配列番号３５７〜３５９、配列番号３６１〜３６２、配列番号３６６、配列番号３６９〜３７０、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８〜３７９、配列番号３８７〜３８８及び配列番号３９０から選択される。
【００５８】
特定の実施態様において、上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、例えばドメインＢ、及びその誘導体である。いくつかの実施態様において、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインはプロテインＺの変異体であり、これはブドウ球菌プロテインＡの上記ドメインＢから誘導される。
【００５９】
従って、さらなる実施態様において：
ｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そして
ＸcはＳ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【００６０】
あるいは：
ｉ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そして
ＸcはＡ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上記ｉ）において定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【００６１】
上で考察したように、上記のアミノ酸配列と比較して小さな変化を含むポリペプチドもまた本出願の範囲内である。従って、いくつかの実施態様において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載される配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％又は少なくとも９８％同一である配列を有し得る。
【００６２】
いくつかの実施態様において及び以下の実験項において開示されるように、ＨＥＲ３結合モチーフは５８アミノ酸のポリペプチドの一部を形成し得る。このようなポリペプチドは、例えば配列番号６６９〜１００２のいずれか１つから選択される配列、特に配列番号６６９〜７３４から選択される配列、例えば配列番号６９０〜７３４から、例えば配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択される配列を含み得る。
【００６３】
本明細書に記載されるいずれかの局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、又は例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ３に結合し得る。本明細書において使用される用語「ＨＥＲ３結合」及び「ＨＥＲ３に対する結合親和性」は、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるような表面プラズモン共鳴技術の使用により試験され得るポリペプチドの特性を指す。ＨＥＲ３結合親和性は、例えばＨＥＲ３をＢｉａｃｏｒｅ機器のセンサーチップに固定し、そして試験しようとするポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通す実験において試験され得る。あるいは以下の実施例に記載されるように、ＨＥＲ３結合親和性は細胞上（ｏｎ−ｃｅｌｌ）実験で試験され得る。細胞上実験は、例えば様々な濃度の標識されたＨＥＲ３を試験しようとするポリペプチドを提示している細胞とともにインキュベートすることにより行われ得る。その後、細胞集団を蛍光細胞分析分離システム（ＦＡＣＳ）におけるようなフローサイトメーターで分析し得、そして平均蛍光強度データを決定し得る。続いて平均蛍光をＨＥＲ３濃度に対してプロットし、そして見かけの平衡解離定数ＫDを決定するために１部位結合モデルにフィッティングし得る。ＫD測定において使用されるＨＥＲ３又はそのフラグメントは、例えば配列番号１００７で表されるアミノ酸配列（ＨＥＲ３−ＥＣＤ）を含み得る。
【００６４】
以下の実施例において説明されるように、ＨＥＲ３結合変異体の選択は、例えばタンパク質骨格の未処理の変異体の選択のためのファージディスプレイ、続いて場合により親和性成熟ＨＥＲ３結合変異体の選択のための親和性成熟及び細胞ディスプレイにより達成され得る。しかし、ファージベースでも、細胞ベースでもその他でも、いずれの選択システムもＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択に使用され得ることが理解される。以下の実施例において、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）での組み換えタンパク質の細胞表面ディスプレイのための発現系を使用した（Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：９３−１０３（２００９））。しかし、ファージ粒子の大きさを比較して、より大きなサイズの細胞は一般的にハイスループットスクリーニング及び細胞提示タンパク質ライブラリーからの選択のための蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）の使用を可能にする。
【００６５】
ＩｇＧ分子と比較して、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは比較的小さく、これにより、ＨＥＲ３結合ポリペプチドを広範囲の適用において有用にするだけでなく、固相ペプチド合成を使用した製造が可能になり得る。固相合成経路は、例えば分子画像化における放射標識に使用されるキレート剤のような非生物学的基の部位特異的結合を容易にする。
【００６６】
従って、当業者には当然のことながら、様々な修飾及び／又は付加が、本発明の範囲から逸脱することなくポリペプチドを特定の適用に合わせるために、本明細書に開示されるいずれかの局面にしたがってなされ得る。例えば、いずれかの局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸を含み得る。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖におけるかなり最初の方及び／又は最後の方の位置に、すなわちＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解されるべきである。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、いずれかの適切な数のさらなるアミノ酸残基、例えば少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基を含み得る。付加的アミノ酸残基はそれぞれ、例えばポリペプチドの製造、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング、又は検出を改善するために、独立して又は集合的に付加され得る。このような付加的アミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例はシステイン残基の付加である。このような付加的アミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えばタグに対して特異的な抗体との相互作用のため、又はＨｉｓ6タグの場合には固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための、Ｈｉｓ6タグ又は「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ又は「ＦＬＡＧ」タグを生じ得る。
【００６７】
上で考察されたさらなるアミノ酸を、化学的連結を用いて（公知の有機化学方法を使用して）、又は融合タンパク質としてのＨＥＲ３結合ポリペプチドの発現のような他の手段を用いてＨＥＲ３結合ポリペプチドにカップリングさせ得る。
【００６８】
上で考察されたさらなるアミノ酸は、例えば１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを含み得る。さらなるポリペプチドドメインは、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに別の機能、例えば別の結合機能、又は酵素的機能、又は毒素機能（例えばイムノトキシン）、又は蛍光シグナル機能、又はその組み合わせを与え得る。
【００６９】
いくつかの実施態様において、さらなるポリペプチドドメインは、インビボでＨＥＲ３結合ポリペプチドの半減期を増加させる半減期延長部分を含み得る。当業者に理解されるように、増加した、又は延長された半減期は、特定の分子の血液からの遅延されたクリアランスを意味する。半減期延長部分は、例えば血清アルブミンへのインビボでの結合を可能にするペプチド又はタンパク質を含み得る。特に、半減期延長部分はアルブミン結合部分であり得る。アルブミン結合部分は、例えば天然に存在するポリペプチド、又はそのアルブミン結合フラグメント、又は改変ポリペプチドからなるものであってもよい。改変ポリペプチドは、新しいか又は増強された特性、例えばアルブミンのような分子に対する結合親和性を付与する目的で、それをタンパク質工学技術、例えば部位特異的又は無作為化されたアプローチでの変異及び変更を受けさせることにより、天然に存在する出発ポリペプチドから誘導され得る。
【００７０】
このような改変アルブミン結合ポリペプチドは、例えばアルブミンに対するその特異的結合親和性について選択された、タンパク質骨格の変異体であってもよい。特定の実施態様において、タンパク質骨格は、連鎖球菌プロテインＧのドメイン又はその誘導体、例えば連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのドメインＧＡ１、ドメインＧＡ２及びドメインＧＡ３、特にドメインＧＡ３から選択され得る。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、さらなるアミノ酸は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、又はその誘導体を含む。本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドにおけるさらなるポリペプチドドメインとして含まれ得るアルブミン結合ドメインの一例は、配列番号１００５で示される。適切なアルブミン結合ドメインの他の例はＷＯ２００９／０１６０４３に開示される。このようなＡＢＤ延長ポリペプチドはインビボで血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から利益を得、これによりポリペプチド自体の正味の半減期が増加する（例えばＷＯ９１／０１７４３を参照のこと）。
【００７１】
本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドが上で定義されるアルブミン結合部分を含む場合、ＨＥＲ３結合（ｂｉｎｄｎｉｇ）ポリペプチドの全体の大きさは比較的小さい。例えばヒト対象のような哺乳動物対象に投与された場合、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのアルブミン結合部分は、血清アルブミンと非共有結合で結合し、そしてそれによりポリペプチドは減少した腎クリアランス及び上皮細胞での増加した再循環から利益が得られ得る。しかし組織浸透は、血清アルブミンの血管外漏出特性に起因して速いままである。さらに、半減期延長部分を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドは、対応する半減期延長部分の無いポリペプチドと比較して、インビボで延長された半減期を示すだけでなく、インビボで減少した免疫応答を示す（例えばＷＯ２００５／０９７２０２を参照のこと）。
【００７２】
さらなるポリペプチドドメインは、同じ結合機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを生じ得る。従って、さらなる実施態様において、そのアミノ酸配列は同じであっても異なっていてもよい少なくとも２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド単量体単位を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。ポリペプチドの多量体形態は、それぞれがＨＥＲ３結合モチーフを有し、かつそれぞれが多量体内の「単量体」を形成する、適切な数のドメインを含み得る。これらのドメインは全て同じアミノ酸配列を有していてもよいが、あるいはそれらが異なるアミノ酸配列を有していてもよい。特に、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し得る。
【００７３】
上記のさらなるポリペプチドドメイン（単数又は複数）は、公知の有機化学方法を使用して共有結合カップリングによりＨＥＲ３結合ポリペプチドに結合され得る。あるいは、さらなるポリペプチドドメイン（単数又は複数）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドを１つ又はそれ以上の融合ポリペプチドとして、例えばポリペプチドのの組み換え発現のための系において発現させてもよいし、直接的又はリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を介して、いずれかの他のやり方で結合させてもよい。
【００７４】
ＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、本ポリペプチドは天然に存在するＨＥＲ３リガンドと同じエピトープに結合するか、又はそれに十分に接近して天然に存在するＨＥＲ３リガンド（例えばニューレグリン−１及び２）のＨＥＲ３への結合をブロックする。従ってＨＥＲ３結合ポリペプチドは、ＨＥＲ３遮断薬として、かつ／又はインビボでのＨＥＲ３媒介細胞シグナル伝達を阻害するために使用され得る。
【００７５】
さらなる局面において、上記のＨＥＲ３結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、例えば宿主細胞における発現によりＨＥＲ３結合ポリペプチドの生産を可能にし得る。
【００７６】
ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、様々な医療、獣医学及び診断適用における従来の抗体又は低分子量物質に対する代替として使用され得る。当業者は、本発明のポリペプチドが、試薬のＨＥＲ３に対する親和性を必要とするいずれかの方法において有用であり得るということを理解するだろう。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、このような方法における検出試薬、捕捉試薬又は分離試薬として使用され得る。さらに、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば哺乳動物対象における細胞表面でのＨＥＲ３発現を特徴とする疾患の存在を明らかにし、診断し、そして試験するために診断法において使用され得る。従って、ＨＥＲ３発現は、診断上、本発明のポリペプチドの使用によりインビボでモニタリングされ得る。診断モニタリングは、例えば分子画像化によるＨＥＲ３発現の判断のための診断用核種の送達により達成され得る。本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドはまた、それ自身だけで治療剤若しくは診断剤として、又はＨＥＲ３タンパク質に対する直接的（例えば、イットリウム−９０、ルテチウム−１７７及びトリウム−２２７のような放射性核種、マイタンシノイドのような毒素を含む毒性分子）若しくは間接的（例えばがんワクチン、免疫賦活性分子）な効果を有する他の治療剤若しくは診断剤を標的とするための手段として有用であり得る。治療効果は、受容体相互作用をブロックすることにより、あるいは腫瘍細胞へ有効なペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を送達するための標的としてＨＥＲ３結合ポリペプチドを使用することにより、潜在的に媒介され得る。
【００７７】
さらなる局面において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＨＥＲ２結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する結合親和性を有するリガンドが提供される。このようなリガンドは、２つの異なる結合機能を含む二重特異性ヘテロ二量体の例として解釈されるべきであり：１つは上で開示されるポリペプチドによりもたらされるＨＥＲ３に対する結合機能であり、そして１つはＨＥＲ２結合ポリペプチドによりもたらされるＨＥＲ２に対する結合機能である。当然のことながら、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、リガンド中に含まれ得る。２つの結合機能は、２つの別々の単量体単位としてリガンドに含まれる。
【００７８】
このような本発明に従う二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の両方が関与するがんの検出、特徴付け及び／又は診断において有用であり得る。検出、特徴付け及び／又は診断は、例えばガンマ線若しくは陽電子放出核種を使用する分子画像により、又は近赤外蛍光プローブを使用することにより達成され得る。上記のように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２についての好ましいヘテロ二量化パートナーであり、そしてＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする腫瘍の増殖を促進するために重要である。ＨＥＲ２は公知のリガンドがなく、リガンド誘導シグナル伝達に関してＨＥＲファミリーの他の受容体に依存すると現在では考えられている。しかし本発明に従う二重特異性リガンドは、診断のためだけでなく、標的化治療ペイロード適用にも使用され得る。ペイロード適用において使用される化合物としては、とりわけ、放射性核種、プロドラッグ酵素、サイトカイン、化学毒性分子、毒素及び光増感剤が挙げられる。標的化ペイロード適用については、正常組織と疾患組織との間の高度な識別が非常に重要である。
【００７９】
２つの異なる受容体に結合する二重特異性リガンドに含まれる両方の結合ポリペプチドの親和性を微調整することにより、リガンドは両方の受容体を同時に発現している病変にのみ優先的に位置し、そして蓄積し得る。従って、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３結合機能は、それらの個々の標的に対して２つの同等に強力な結合機能を有するリガンドをもたらし得る。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのＨＥＲ３に対する結合親和性は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合親和性とほぼ同位であり得る。一実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ２に結合し得る。別の実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合は、対応するＨＥＲ３結合ポリペプチドのＨＥＲ３に対する結合と同程度に強力であるかより強力であり得る。従って、ＨＥＲ２結合ポリペプチドとＨＥＲ２との間の相互作用のＫD値は、多くてＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ３との間の相互作用のＫD値である。ＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ３との間の相互作用のＫD値は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドとＨＥＲ２との間の相互作用のＫD値の例えば５倍、１０倍又は１００倍であり得る。
【００８０】
一実施態様において、二重特異性リガンドのＨＥＲ２結合ポリペプチドは改変ポリペプチドである。ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２に対するその特異的結合親和性について選択された、タンパク質骨格の変異体である改変ポリペプチドであり得る。タンパク質骨格の非限定的な例は、ブドウ球菌プロテインＡ、並びにそのドメイン及び誘導体からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのドメインＢから誘導された改変タンパク質である。この改変タンパク質は、特にプロテインＺ誘導体を含んでいてもよく、これは上記プロテインＡのドメインＢから誘導されたプロテインＺの変異体である。
【００８１】
リガンドのいくつかの実施態様において、改変ＨＥＲ２結合タンパク質は、
ｉ） 配列番号１００３に対応する、
ＹＡＫＥＭ ＲＮＡＹＷ ＥＩＡＬＬ ＰＮＬＴＮ ＱＱＫＲＡ ＦＩＲＫＬ ＹＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
例えば１から４５個までのアミノ酸を含むペプチドリンカーによりＨＥＲ３結合ポリペプチド及びＨＥＲ２結合ポリペプチドが連結され得る。連結部分は特にＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端のカップリングのために配置され得る。このようにして生じる連結は、Ｃ末端とＣ末端との連結、Ｃ末端とＮ末端との連結又はＮ末端とＣ末端の連結から選択され得る。連結部分のＨＥＲ３結合ポリペプチド及びＨＥＲ２結合ポリペプチドへのカップリングは、例えば化学的結合（公知の有機化学方法を使用する）を用いて、又は融合タンパク質としてのリガンドの発現のようないずれかの他の手段により達成され得る。
【００８３】
リガンドは、上記のように、インビボでのリガンドの半減期を延長するための半減期延長部分をさらに含み得る。半減期の延長は、多数の種々の半減期延長部分により達成され得、そしてこのような部分の非限定的な例は、アルブミン、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに関連して上で定義されたようなアルブミン結合部分、ＩｇＧからのＦｃ部分、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー化合物から選択される。哺乳動物血清において最も豊富なタンパク質である血清アルブミンへのリガンドのカップリングは、インビボでのリガンドの半減期の延長をもたらし得る。
【００８４】
特に、アルブミン結合部分は、
ｉ） 配列番号１００５で示される、
ＬＡＥＡＫ ＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹ ＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩ ＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥ ＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬ Ｐ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン結合部分のような、連鎖球菌プロテインＧのドメインＧＡ３から誘導された改変タンパク質であり得る。
【００８５】
半減期延長部分は、例えば公知の有機化学方法を使用して共有結合カップリングによりリガンドの残部に接続されても、他のやり方で直接、又は多数のアミノ酸を含むリンカーを介して結合されてもよい。半減期延長部分がアルブミン又はアルブミン結合部分により表される場合、リガンドはそれ自体１つ又はそれ以上の融合ポリペプチドとしてポリペプチドの組み換え発現のための系において発現されてもよい。一実施態様において、半減期延長部分は、リガンドに存在するシステイン残基を介してリガンドの残部に結合する。特に、半減期延長部分は、結合モチーフから離れた部位に導入された、ＨＥＲ３又はＨＥＲ２結合ポリペプチドのシステイン残基に結合され得る。別の実施態様において、半減期延長部分は連結部分を介してリガンドの残部に結合する。
【００８６】
特定の実施態様において、連結部分は上で定義された半減期延長部分を含む。従って、アルブミン、アルブミン結合部分又はＰＥＧは例えばＨＥＲ３結合ポリペプチドをＨＥＲ２結合ポリペプチドに接続するために使用され得る。
【００８７】
いくつかの実施態様において、本発明に従うリガンドは、さらなるＣ末端又はＮ末端アミノ酸を含み得る。このようなさらなるアミノ酸は、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに関して上で記載したように、例えばポリペプチドの生産、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善するために、個別に、又は集合的に付加され得る。特定の実施態様において、さらなるアミノ酸は１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを構成し得る。このようなさらなるポリペプチドドメインの機能は、既にリガンドに含まれている機能と同じであっても異なっていてもよい。さらなるポリペプチドドメインは、例えば別のＨＥＲ３結合機能及び／又は別のＨＥＲ２結合機能を有するリガンドを生じ得る。従って、本発明に従う二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３結合機能の多量体及び／又はＨＥＲ２結合機能の多量体を含み得る。多量体結合機能を含む二重特異性リガンドの一例は、２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド及び２つのＨＥＲ２結合ポリペプチドを含むリガンドである。
【００８８】
上で定義されたリガンドは、一実施態様において、インビボでのＨＥＲ２及びＨＥＲ３の二量化を防止し得る。より詳細には、リガンドは、例えば哺乳動物対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３に結合することにより、対象におけるＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害し得る。リガンドの二重特異性に起因して、これは、それらがもはやシグナル伝達を行うことができないような位置において２つの受容体に結合してブロックし得る。当業者には当然のことながら、従って本発明のリガンドは、細胞表面上のＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３の発現、特に過剰発現に関連する状態の処置のために利用され得る。
【００８９】
しかしＨＥＲ３はＥＧＦＲともヘテロ二量体を形成し得、それ故ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化する活性シグナル伝達単位を形成する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２（１０）：３７８８−９３（２００５））。実際、ＨＥＲ３は、明らかにＥｒｂＢリガンドの上方調節のために非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において過剰発現されるが（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（２４）：１１４７８−８５（２００５））、一方でＨＥＲ３は正常肺上皮で発現されない。従って、関連する局面において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＥＧＦＲ結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＥＧＦＲ結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する結合親和性を有するリガンドが提供される。当然のことながら、本発明の上記の局面において記載される特徴は、本発明のこの局面にも適用可能である。特に、このような二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲを標的にし得、そしてＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する二重特異性リガンド結合に関して上で記載した作用様式と類似しているか又は同じ作用様式で作用する。ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性リガンド結合の例は、
ｉ） 配列番号１００４に相当する、
ＹＡＫＥＭ ＷＩＡＷＥ ＥＩＲＮＬ ＰＮＬＮＧ ＷＱＭＴＡ ＦＩＡＫＬ ＬＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるＥＧＦＲ結合ポリペプチドを含み得る。
【００９０】
ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ結合リガンドにおいて使用され得るＥＧＦＲ結合ポリペプチドの他の例はＷＯ２００７／０６５６３５に開示される。
【００９１】
他の実施態様において、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド又は二重特異性リガンドは、治療剤又は診断剤に、インビボ及びインビトロの両方で、ＨＥＲ３を発現する細胞、特にＨＥＲ３を過剰発現する細胞を標的にさせる際に使用される。上で考察したように、本発明のリガンドは、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ２、又はＨＥＲ３及び／若しくはＥＧＦＲを発現するか又は過剰発現する細胞を標的にする際に利用され得る。従って関連する局面において、本明細書において定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチド、又は上で定義されるリガンド、及び治療剤の組み合わせが提供される。治療剤の非限定的な例は、細胞傷害性ペイロード、例えば放射性核種、低分子量薬物又は毒素から選択される。このような治療剤は、化学的に結合されるか、そうでなければＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドに結合される。
【００９２】
本発明に従う組み合わせ、ＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドはさらに、治療における、例えばＨＥＲ３関連状態、例えばがん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される、哺乳動物（例えばヒト対象）におけるＨＥＲ３関連状態の処置のための、医薬として使用され得る。従って、ＨＥＲ３関連状態、例えば上述のＨＥＲ３関連状態の処置のための医薬の製造のための本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドの使用もまた、本発明の範囲内である。
【００９３】
関連する局面において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、又は上記のリガンド若しくは組み合わせを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ＨＥＲ３関連状態の処置方法が提供される。結果として、本処置方法において、対象は、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせで処置される。この方法のより特定の実施態様において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせの、対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ３に対する結合は、受容体活性化を阻害する。この結合は、例えばＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害し得る。本処置方法の一実施態様において、上記ＨＥＲ３関連状態は、がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される。
【００９４】
別の実施態様において、本発明のリガンドを、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２関連状態の処置方法が提供される。
【００９５】
当業者に理解されるように、そして上で考察したように、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドは、ＨＥＲ３又はＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ２関連状態の診断のような診断において使用され得る。本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、診断剤と別々に使用されても組み合わせて使用されてもよい。このような組み合わせは、ＨＥＲ３関連状態の診断において、例えばＨＥＲ３を過剰発現する細胞の分子画像化において使用され得る。
【００９６】
本発明はここで以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１−１】本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドに含まれるＨＥＲ３結合モチーフの例（配列番号１〜３３４）、本発明に従う４９量体ＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号３３５〜６６８）及び本発明に従う５８量体ＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号６６９〜１００２）、本発明に従うリガンドに含まれるＨＥＲ２結合ポリペプチドの例（配列番号１００３）、本発明のリガンドの一実施態様において含まれ得るようなアルブミン結合部分の例（配列番号１００５）、本発明に従うリガンドの一実施態様において含まれ得るＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１００４）のアミノ酸配列表、さらにはプロテインＺの配列（配列番号１００６）、並びにＨＥＲ３の細胞外ドメイン（配列番号１００７）、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（配列番号１００８）及びＨＥＲ４の細胞外ドメイン（配列番号１００９）の配列の表である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図１−５】図１−４の続きである。
【図１−６】図１−５の続きである。
【図１−７】図１−６の続きである。
【図１−８】図１−７の続きである。
【図１−９】図１−８の続きである。
【図１−１０】図１−９の続きである。
【図１−１１】図１−１０の続きである。
【図１−１２】図１−１１の続きである。
【図１−１３】図１−１２の続きである。
【図１−１４】図１−１３の続きである。
【図１−１５】図１−１４の続きである。
【図１−１６】図１−１５の続きである。
【図１−１７】図１−１６の続きである。
【図１−１８】図１−１７の続きである。
【図１−１９】図１−１８の続きである。
【図１−２０】図１−１９の続きである。
【図１−２１】図１−２０の続きである。
【図１−２２】図１−２１の続きである。
【図１−２３】図１−２２の続きである。
【図１−２４】図１−２３の続きである。
【図１−２５】図１−２４の続きである。
【図１−２６】図１−２５の続きである。
【図１−２７】図１−２６の続きである。
【図１−２８】図１−２７の続きである。
【図１−２９】図１−２８の続きである。
【図１−３０】図１−２９の続きである。
【図１−３１】図１−３０の続きである。
【図１−３２】図１−３１の続きである。
【図１−３３】図１−３２の続きである。
【図１−３４】図１−３３の続きである。
【図１−３５】図１−３５の続きである。
【図１−３６】図１−３５の続きである。
【図１−３７】図１−３６の続きである。
【図１−３８】図１−３７の続きである。
【図１−３９】図１−３８の続きである。
【図１−４０】図１−３９の続きである。
【図１−４１】図１−４０の続きである。
【図１−４２】図１−４１の続きである。
【図２】ＨＳＡ結合ドメインＡＢＤへの融合として発現された個々のＨＥＲ３結合Ｚ変異体からの周辺質フラクションを使用して行われたドットブロットアッセイの結果を示す。２１のコントロールタンパク質に対する潜在的バックグラウンド結合、さらにはＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃへの結合を分析した。タンパク質をメンブレン上に３列で以下の順序にてドットを打った； 列１： ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、アルファ−２マクログロブリン、フィブリノゲン、ホロ−トランスフェリン、アルファ−１−抗トリプシン、 列２：Ｃ３、ハプトグロブリン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、アルファ−１酸性糖タンパク質、アルファ−１抗キモトリプシン、Ｃ４、マウスＩｇＥカッパ、ヘモペキシン、トランスサイレチン、 列３：ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ３−Ｆｃ、ＨＥＲ４−Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−ＥＣＤ。 画像は、Ａ） Ｚ０１７４８、Ｂ） Ｚ０１８１３、Ｃ） Ｚ０１８１４、Ｄ） Ｚ０１８１５、Ｅ） Ｚ０２００９、Ｆ） Ｚ０１８２１、Ｇ） Ｚ０２０１０、Ｈ） Ｚ０１８２４、Ｉ） Ｚ０１８２５、Ｊ） Ｚ０１８１７、Ｋ） Ｚ０１８１８、Ｌ） Ｚ０１８２０、Ｍ） Ｚ０１８２６、Ｎ） Ｚ０１８２８、Ｏ） Ｚ０２０１１、Ｐ） Ｚ０１８３０、及びＱ）ネガティブコントロールとしての、ＡＢＤのみを発現するｐＡＹ０１２４７からの生成物を示す。
【図３】実施例２に記載される免疫蛍光実験からの画像を示す。ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６６細胞（Ａ〜Ｄ）並びにＨＥＲ２ポジティブ及びＨＥＲ３ネガティブのＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ〜Ｆ）をＨＥＲ３特異的Ｚ変異体又は以下に従うコントロールで染色した：Ａ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−ｃｙｓ、Ｂ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−ｃｙｓ、Ｃ） 抗ＨＥＲ３抗体（ポジティブコントロール）、Ｄ）（Ｚ０１１５４）2（ネガティブコントロールＺ変異体）、Ｅ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−ｃｙｓ、Ｆ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−ｃｙｓ。
【図４】Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）（Ｂ）の表面での本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドの細胞ディスプレイのために使用したブドウ球菌ディスプレイベクターの略図である。ベクターｐＳＣＺ１（Ａ）は：ｉ）リパーゼ遺伝子（関連するスタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）の表面で発現される）からのプロモーター及び分泌シグナル（Ｓ）、ｉｉ） 同じリパーゼ遺伝子からのプロペプチド（ＰＰ）をコードする遺伝子フラグメント、（組み換えタンパク質の効率的な転座に重要であることが実証されている）、ｉｉｉ）細胞壁固定領域（ＸＭ）、（ブドウ球菌プロテインＡ由来）、ｉｖ）標的結合シグナルの表面発現レベル正規化をもたらすために導入されるブドウ球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ、Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７（６）：１４７０−１４７６、（１９９５））、ｖ） ブドウ球菌における安定した複製及び発現のためのブドウ球菌複製起点及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｃｍｌr）、並びにｖｉ）Ｅ．ｃｏｌｉでのサブクローニング作業を容易にする、Ｅ．ｃｏｌｉのための複製起点（ＯｒｉＥ）さらにはβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｂｌａ）を含む。
【図５】Ｓｃ：ＺHER3LIBのフローサイトメトリー分離からの結果として密度プロットを示す。これらのプロットは、ｘ軸に表面発現レベルに対応するＦＬ−４チャネル蛍光強度（ＨＳＡ結合によりモニタリング）、及びｙ軸にＨＥＲ３結合に対応するＦＬ−１チャネル蛍光を示す。密度プロットは、各プロットにおいて四角で輪郭を描いたゲーティングにおいて使用された領域と共に、それぞれ１、２、３及び４回目のフローサイトメトリー分離前のブドウ球菌ライブラリーを示す。
【図６−１】細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイのヒストグラム図を示し、ここではアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）への融合でＺ変異体を提示するＦＡＣＳで単離した細胞を、蛍光標識したＨＥＲ３−Ｆｃ及び蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。ＨＥＲ３結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−１）とＨＳＡ結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−４）との比率がｙ軸にある。全てのＦＬ−１／ＦＬ−４比は；Ａ） Ｚ０５４０５のＦＬ−１／ＦＬ−４比、及びＢ〜Ｄ） 第一世代バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）（Ｚ０１７５３）のＦＬ−１／ＦＬ−４比を用いて正規化される。４５の個々のクローンを４つの別々のアッセイ（Ａ〜Ｄ）において分析し、ここでＺ０５４０５及びＺ０５４０９を比較のために全てのアッセイに含めた。Ａ）はＺ０５４０３〜Ｚ０５４１５の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｂ）はＺ０５４１６〜Ｚ０５４２６細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｃ）はＺ０５４２７〜Ｚ０５４３４の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、そしてＤ）はＺ０５４３５〜Ｚ０５４４７の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示す。
【図６−２】細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイのヒストグラム図を示し、ここではアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）への融合でＺ変異体を提示するＦＡＣＳで単離した細胞を、蛍光標識したＨＥＲ３−Ｆｃ及び蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。ＨＥＲ３結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−１）とＨＳＡ結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−４）との比率がｙ軸にある。全てのＦＬ−１／ＦＬ−４比は；Ａ） Ｚ０５４０５のＦＬ−１／ＦＬ−４比、及びＢ〜Ｄ） 第一世代バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）（Ｚ０１７５３）のＦＬ−１／ＦＬ−４比を用いて正規化される。４５の個々のクローンを４つの別々のアッセイ（Ａ〜Ｄ）において分析し、ここでＺ０５４０５及びＺ０５４０９を比較のために全てのアッセイに含めた。Ａ）はＺ０５４０３〜Ｚ０５４１５の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｂ）はＺ０５４１６〜Ｚ０５４２６細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｃ）はＺ０５４２７〜Ｚ０５４３４の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、そしてＤ）はＺ０５４３５〜Ｚ０５４４７の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示す。
【図７Ａ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｂ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｃ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｄ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図８Ａ】Ｚ０５４１７のヘレグリンとのＳＰＲ競合分析からのセンサーグラムを示す。Ａ）はヒトヘレグリンを固定した表面上での、単独及び４０倍モル濃度過剰のＺ０５４１７と共にプレインキュベートした、ＨＥＲ３−Ｆｃの注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｂ）は、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定化した表面上でのヘレグリンとのＺ０５４１７の同時注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｚ０５４１７を、５つの異なる濃度、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ及び０ｎＭで二回注入した。一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ０５４１７に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は三番目に高い濃度に対応するなどである。
【図８Ｂ】Ｚ０５４１７のヘレグリンとのＳＰＲ競合分析からのセンサーグラムを示す。Ａ）はヒトヘレグリンを固定した表面上での、単独及び４０倍モル濃度過剰のＺ０５４１７と共にプレインキュベートした、ＨＥＲ３−Ｆｃの注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｂ）は、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定化した表面上でのヘレグリンとのＺ０５４１７の同時注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｚ０５４１７を、５つの異なる濃度、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ及び０ｎＭで二回注入した。一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ０５４１７に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は三番目に高い濃度に対応するなどである。
【図９】ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の存在しない場合及び存在下でのＨＥＲ３リン酸化のパーセントに関する図表を示す。ＭＣＦ−７細胞を、Ｚ変異体の存在しない場合（１００％リン酸化、塗りつぶしたバー）、並びにＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の存在下で、並びにネガティブコントロールＺ０１１５５の存在下で（ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体、縞模様のバー）又は培地のみを用いて（白いバー）、５ｎＭヘレグリンで刺激した。この図表は、ヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化（１００％）と比較した、Ｚ変異体又は培地の存在下でのＨＥＲ３リン酸化のパーセントを示す。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択及びスクリーニング
材料及び方法
ＨＥＲ３及びＨＳＡの標識： 組み換えヒトＨＥＲ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３４８−ＲＢ−０５０）（本明細書ではＨＥＲ３−Ｆｃと示される）のビオチン化を、Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸマイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｂ３００１０）を使用して供給業者の推奨にしたがって行った。ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（配列番号１００７）（本明細書ではＨＥＲ３−ＥＣＤと示される）を、ＥＺ−ＬｉｎｋTM−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３８）を使用して供給業者の推奨にしたがってビオチン化した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ； Ｓｉｇｍａ、＃Ａ−３７８２）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R) ６４７スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ２０００６）を使用して供給業者の推奨にしたがって蛍光標識した。タンパク質緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）又は過剰のビオチン若しくはフルオロフォアを除去するために０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)Ｆ１０８ ＮＦ界面活性剤（ＰＢＳＰ； ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃３００８５２３１）を補充したＰＢＳに変更した。
ＨＥＲ３結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択： Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２８：１６２−１８３（２００７）に記載されるように、ファージミドｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５において構築されたバクテリオファージで提示されるＺ分子のランダム変異体のライブラリー（Ｚｌｉｂ２００２と示される）を、ＨＥＲ３−ＥＣＤ−結合ポリペプチドの選択のために使用した。ファージミドライブラリーから、さらには選択ラウンドの間に、ファージストックの製造を以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：７７２−７７７（１９９７）； Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：２３７−２５２（１９９９））にしたがってヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃ＮＯ３１５Ｓ）を使用して行った。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アンバー抑圧遺伝子系統ＲＲ１ΔＭ１５（Ｒｕｅｔｈｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：５７６５−５７７２、１９８２）を全てのクローニング手順のために、そしてファージ産生のための宿主として使用した。
【００９９】
ファージ選択を、溶液でビオチン化ＨＥＲ３タンパク質及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R) Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ ＃１１２．０６）を、結合したファージの捕捉のために使用して行った。さらに、ファージ選択を、固相においてＭａｘｉＳｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）に固定化されたＨＥＲ３−ＥＣＤを使用して行った。ファージ粒子の非特異的結合を、全てのチューブ及びビーズをＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１％ゼラチンを補充したＰＢＳ）で予備処理することにより最少にした。選択を４サイクルで行った。全ての選択をＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン中でかつ体積１ｍｌで行った。
【０１００】
溶液で行われた選択については、４サイクルの選択を室温（ＲＴ）にて異なる濃度のビオチン化組み換えＨＥＲ３−ＥＣＤを標的タンパク質として使用して行った。サイクル１及び２で使用したファージストックを、ストレプトアビジン結合ファージを除去するために０．１ｍｇストレプトアビジン被覆ビーズとともに１時間プレインキュベートした。サイクル１において、Ｚｌｉｂ２００２ライブラリーからのファージ粒子を、１００ｎＭのビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤと共にＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン中で２時間インキュベートした。それに続く選択サイクルを２つの選択トラックに分割し、そのために標的濃度をサイクル２について５０（トラック１）又は２０ｎＭ（トラック２）まで、サイクル３について２０（トラック１）又は１０ｎＭ（トラック２）まで、そしてサイクル４について２０（トラック１）又は５ｎＭ（トラック２）まで下げた。結合したファージをストレプトアビジン被覆Ｍ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)を用いて捕捉し、ビーズ１ミリグラムあたりＨＥＲ３−ＥＣＤ４μｇを固定化させた。
【０１０１】
固相での選択については、ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅに１ｍｌ ＨＥＲ３−ＥＣＤ（５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔ）緩衝液中１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ ９．６）を１．５時間室温にて固定化させ、その後３ｍｌ ＰＢＳＴ ０．１−ゼラチンを用いて１時間室温にてブロックした。ファージストックをこのチューブに加え、そして２時間インキュベートした。
【０１０２】
両方の選択ストラテジーのために、ＰＢＳＴ ０．１−ゼラチンでの洗浄回数を、選択ストリンジェンシーを高めるためにラウンド間で増やした。従って、洗浄をサイクル１において２回、サイクル２において３回、サイクル３において６回、そしてサイクル４において１２回行った。結合したファージ粒子を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出し、続いてすぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。ファージ含有溶出液を対数期ＲＲ１ΔＭ１５細胞に感染させるために使用し、そしてファージミド粒子を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を使用して感染した細胞からレスキューした。選択過程を、各選択ラウンドの前及び標的タンパク質からの溶出後にファージストックの滴定によりモニタリングした。ファージ溶液の段階希釈を、対数期ＲＲ１ΔＭ１５細胞の感染のために使用した。
【０１０３】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング： Ｚ変異体分子が実際にＨＥＲ３と相互作用するかどうかを試験するために、２つの異なるＥＬＩＳＡを行い、一方は標的タンパク質としてビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを使用し、そして２つ目はＨＥＲ３−Ｆｃを使用した。上で記載したように製造された単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充した１ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地（３０ｇ／ｌ ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母抽出物）中でディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＃２７８７５２）において播種することによりＺ変異体を生成した。ネガティブコントロールとして、インスリン結合Ｚ変異体（Ｚ００８０１）を播種し、そして各プレートにおいて増殖させた。これらのプレートを１８〜２４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に、−２０℃での貯蔵のために１５％グリセロールを含む９６ウェルプレートに各培養物を少量移すことにより複製のプレートを作製した。残りの細胞を遠心分離によりペレット化し、３００μｌ ＰＢＳＴ ０．０５（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したＰＢＳ）中に再懸濁し、そして細胞の周辺質部分を放出させるために−８０℃で凍結した。凍結したサンプルを水浴で解凍し、そして細胞を遠心分離によりペレット化した。周辺質上清は、連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのＧＡ３からのアルブミン結合ドメインへの融合物としてのＺ変異体（ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧとして表される）を含有していた（Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ、前出）。Ｚ＃＃＃＃＃は個々のＺ変異体を指す。
【０１０４】
ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、６μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３７８２）を含有する５０μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で被覆し、そして終夜（ＯＮ）インキュベートした。ＨＳＡ溶液を捨てて、２％脱脂粉乳溶液（Ｓｅｍｐｅｒ ＡＢ）を補充したＰＢＳＴ ０．１ １００μｌを用いてウェルを１時間室温にてブロックした。ブロッキング溶液を廃棄し、そして周辺質溶液５０μｌを各ウェルに加え、そして１．５時間室温でゆっくりと震盪しながらインキュベートした。上清を捨てて、ウェルをＰＢＳＴ ０．０５で４回洗浄した。ＰＢＳＴ ０．０５中０．５μｇ／ｍｌの濃度のＨＥＲ３−Ｆｃ ５０μｌ又はＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを各ウェルに加えた。プレートを１．５時間室温でインキュベートし、続いてＰＢＳＴ ０．０５で４回洗浄した。ＨＥＲ３−Ｆｃプレートにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されＰＢＳＴ０．０５で１：４０００に希釈されたヒトＦｃに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、＃Ｐ０２１４）をウェルに加え、そして１時間室温でインキュベートした。ビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを含むプレートにおいて、ＨＲＰと結合したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ、＃Ｐ０３９７）を各ウェルに加えてＰＢＳＴ ０．０５で１：５０００に希釈した。上で記載したように洗浄した後、５０μｌ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０２１）をウェルに加え、そしてプレートを製造者の推奨に従って処理した。ブロッキングから読み取りまでの全ての工程を、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｆｒｅｅｄｏｍ ２００ロボット（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＬＴＤ）で行った。ウェルの吸光度を４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ ３８４（Ｔｅｃａｎ）で読み取り、そしてＭａｇｅｌｌａｎ ｖ．５．０ソフトウェア（Ｔｅｃａｎ）を用いて評価した。
【０１０５】
配列決定： ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、陽性と考えられる全てのクローンの一部を配列決定のために選別した。ＰＣＲフラグメントを、標準的なＰＣＲプログラム並びにプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ）及びＡＦＦＩ−２２（５'−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ）を使用して単一コロニーから増幅した。増幅されたフラグメントの配列決定を、製造者のプロトコルに従って使用されるビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５'−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ）及びＢｉｇＤｙｅ(R)ターミネーターｖ３．１サイクルシークエンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。配列決定反応混合物を、磁気ストレプトアビジン被覆ビーズへの結合により、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して精製し、そしてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(R)３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。配列決定結果をインポートし、そしてＡＬＤ ＬＩＭＳ ＮａｕｔｉｌｕｓTM ２００３ Ｒ２ Ｂ３ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて分析した。
【０１０６】
ドットブロット分析： 生成されたＨＥＲ３結合Ｚ変異体を、特異性についてドットブロット分析によりアルファ−２マクログロブリン（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ／Ｃａｐｐｅｌ、＃５５８３３）、アルファ−１酸性糖タンパク質（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５３−１）、アルファ−１抗キモトリプシン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５９−０）、アルファ−１−抗トリプシン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１６５−５）、補体Ｃ３（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５０−０）、補体Ｃ４（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５１−０）、フィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃０３１０１５Ｅ）、ハプトグロブリン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１１９−１）、ヘモペキシン（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ホロ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ０６６５）、ヒトＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ、＃Ｐ８０−１０２）、マウスＩｇＥカッパ（ＢＤ、＃５５０７９）、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ４３８６）、ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｉ８２６０）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ、＃Ａ３７８２）、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３１０００）、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１１２２）、トランスサイレチン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ１７４２）、ＨＥＲ２−ＥＣＤ（配列番号１００８）、ＨＥＲ３−ＥＣＤ（配列番号１００７）、ＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＥＲ４−ＥＣＤ（配列番号１００９）、ＨＥＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して試験した。
【０１０７】
可溶性タンパク質を含有する周辺質上清を得るために、Ｚ変異体をＥＬＩＳＡスクリーニングで記載された方法と本質的に同じ方法で製造した。上清を０．４５μｍメンブレンを使用してろ過した。
【０１０８】
ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各タンパク質１μｌを、それぞれ０．２９ｍｇ／ｍｌ及び０．１４ｍｇ／ｍｌの濃度を有していたＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−ＥＣＤを除いて０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いてドットを打った。これらのメンブレンを０．５％カゼイン（ブロッキング液）を補充したＰＢＳＴ０．１中で終夜４℃でブロックした。溶液を除去した後、これらのメンブレンを１時間、０．５％カゼインを補充した周辺質上清と共にインキュベートした。これらのメンブレンをＰＢＳＴ ０．１中で非常に短く３回、そして４×５分洗浄した。Ｚ変異体を、ＰＢＳＴブロッキング液中で１：５０００に希釈された全てのＺ変異体（社内で製造）に共通のエピトープに対するＡＢＤ融合超免疫ポリクローナルウサギＩｇを用いて１時間室温でインキュベートすることにより検出した。上記のように洗浄した後、ブロッキング溶液で１：５０００希釈された、ＨＲＰと複合体化されたウサギＩｇＧに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、＃Ｐ０４４８）をメンブレンに加え、続いてこれらのメンブレンを１時間室温でインキュベートした。メンブレンを洗浄し、ＰＢＳですすぎ、そしてＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０７５）と共に浸漬した。発光をＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ ５５００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いて撮影した。
【０１０９】
Ｚ変異体のサブクローニング： 二量体Ｚ変異体をｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５ベクターから増幅した。異なるプライマー対を使用してＰＣＲを行い、そして得られた遺伝子フラグメントを精製し、そしてリガーゼ緩衝液中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした遺伝子フラグメントをｐＡＹ００４３０ベクターでサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓ6タグ及びＣ末端システインを生じた（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓ）。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体をダイマーとしてサブクローニングし、そして発現ベクターによりコードされる構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＣであった。３つの部分のライゲーションを、両方の挿入フラグメントをベクター中に同じ工程で挿入するために使用した。ハイブリダイズした遺伝子フラグメント及びＡｃｃＩ−消化して脱リン酸化した発現ベクターをリガーゼ緩衝液中で連結し、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞中にエレクトロポレーション処理した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）血液寒天基礎培地）上に広げ、続いて３７℃で終夜インキュベートした。コロニーをＰＣＲを使用してスクリーニングし、そしてＰＣＲフラグメントの長さをアガロースゲルで確認した。配列を確認するために、上記のように配列決定を行った。プラスミドＤＮＡストックを配列決定したクローンから調製し、そして−８０℃に置いた。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をエレクトロポレーションによりプラスミドを用いて形質転換した。
【０１１０】
結果
ＨＥＲ３結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択： ４ラウンドのファージディスプレイ選択を、ビオチン化又は非ビオチン化ヒトＨＥＲ３−ＥＣＤに対して行った。４回の選択サイクルを、２つの異なる標的濃度でビオチン化標的を含む溶液で、又は非ビオチン化標的を含む固相で行った。溶液では、ファージ粒子標的複合体がストレプトアビジン被覆ビーズに捕捉された。各選択サイクルについて、洗浄回数を増やした。ファージ粒子力価及び収率を、各選択サイクル後に計算した。ファージ粒子収率（選択された（ｏｕｔ）ファージ粒子／導入した（ｉｎ）ファージ粒子）は、３回目又は最後のサイクルで増加し、標的結合クローンの濃縮を示していた。
【０１１１】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング： ４サイクルの選択後に得られたクローンを９６ウェルプレートで作製し、そしてＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃ−結合活性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。各選択トラックから合計で９３のクローンをスクリーニングした。吸光度測定は、選択方法と無関係に、約９０％のクローンがＨＥＲ３に対して陽性（ネガティブコントロールのシグナルの２倍の応答として定義される）であることを示した。インスリンに結合するＺ変異体分子を、ネガティブ及びポジティブコントロール実験において使用した。ポジティブコントロールをビオチン化インスリンを用いて検出し、そしてネガティブコントロールについては標的タンパク質を除いた。
【０１１２】
配列決定： ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてＨＥＲ３−Ｆｃに対して様々な（ｖａｒｉｙｉｎｇ）シグナル吸光度値を有することに基づいて選択されたクローンについて配列決定を行い、従って配列決定のための多くの異なる代表的なバインダーを得た。合計で１３５のＨＥＲ３ポジティブクローンを配列決定した。クローンの半分は合計２３の新しいクローンを生じるいくつかのコピーにおいて見出され、それらのうち２つはバックグラウンドバインダーと同一であった。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を付与し、そして個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８量体Ｚ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号６６９〜６８９として載せる。これらのＺ変異体の推定ＨＥＲ３結合モチーフを図１及び配列表に配列番号１〜２１として載せる。これらの各Ｚ変異体内で完全３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９量体ポリペプチドのアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号３３５〜３５５として載せる。
【０１１３】
ドットブロット分析： 配列決定された独特なＨＥＲ３結合ポリペプチド（ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧの形態）のうち１６の特異性をドットブロット分析を使用して試験した。２３の異なるタンパク質をニトロセルロースメンブレン上にブロットした。これらの２３のタンパク質には、１６の高度に豊富なヒト血清タンパク質、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃ並びにＨＥＲ４−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−Ｆｃが含まれていた。Ｚ０１８２４以外の全てのＺ変異体融合タンパク質はＨＳＡと同様にＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃに特異的に結合した。従って、試験したＺ変異体の特異性は十分なものであった（図２）。
【０１１４】
Ｚ変異体のサブクローニング： １６の独特なクローンを二量体として発現ベクターｐＡＹ００４３０８でサブクローニングするために選択した。クローニングは、１５の二量体のＨＥＲ３結合Ｚ変異体を生じた（Ｚ０１７４８、Ｚ０１７４９、Ｚ０１７５１、Ｚ０１７５３、Ｚ０１８１４、Ｚ０１８１５、Ｚ０１８１７、Ｚ０１８２０、Ｚ０１８２１、Ｚ０１８２６、Ｚ０１８２８、Ｚ０１８３０、Ｚ０２００９、Ｚ０２０１０及びＺ０２０１１の二量体）。
【０１１５】
実施例２： Ｚ変異体の産生及び特徴付け
材料及び方法
タンパク質発現及び精製：実施例１においてサブクローニングした形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物を、ＴＳＢ−ＹＥで約１の光学密度まで増殖させた。次いで１Ｍ ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えることによりタンパク質発現を誘導した。培養物を誘導の５時間後に遠心分離により採取した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを集めて−２０℃で貯蔵した。
【０１１６】
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体を、１．５ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で変性条件下で細胞ペレットから精製し、そしてバッファーをＰＢＳに交換してＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。精製したＺ変異体をアリコートに分けて−８０℃で貯蔵した。
【０１１７】
タンパク質特徴付け： 精製されたＺ変異体（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓ形態）の濃度を２８０ｎｍにおける吸光度測定により決定した。純度を１０ウェル４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥTMゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でクマシーブルー染色を使用して見積もった。精製したＺ変異体のアイデンティティを確認し、分子量を決定するために、ＬＣ／ＭＳ分析をＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ／ＭＳＤシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。
【０１１８】
ＣＤ分析： 精製したＺ変異体を解凍し、そしてＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。それぞれの希釈したＺ変異体について、２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを２０℃で得た。さらに、温度可変測定（ＶＴＭ）を、融点（Ｔｍ）を決定するために行った。ＶＴＭにおいて、５℃／分の温度勾配で温度を２０から９０℃に上げながら吸光度を２２０ｎｍで測定した。ＣＤ測定を、光路長１ｍｍを有するセルを使用してＪａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ）で行った。
【０１１９】
蛍光免疫染色： ＨＥＲ３ポジティブヒト乳腺細胞株ＡＵ５６５（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−２３５１）及びＨＥＲ３ネガティブヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３（Ｅｃａｃｃ、＃９１０９１００４）を供給業者に推奨されるように培養した。アッセイ前日に、２５０００個の細胞をマルチウェルスライド（スライドあたり８ウェル、Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＃ＥＲ−２０１−１Ｂ）の各ウェルに加え、そして終夜ＣＯ2インキュベーターで板状形態を呈するように増殖させた。パスツールピペットを用いてスライド上に液滴を加えることによりこれらのスライドをＰＢＳで穏やかに洗浄した。
【０１２０】
２つの実験を行った。１つ目の実験では、ＡＵ５６５細胞を１１の異なるＨＥＲ３特異的Ｚ変異体で染色した；Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７４８）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７４９）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７５１）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７５３）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１５）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１７）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２８）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８３０）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０２０１１）2−Ｃｙｓ。２つ目の実験は、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓを用いて、そして（Ｚ０１１５４）2をネガティブコントロールＺ変異体として用いて行った。染色を、ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５及びＨＥＲ３ネガティブＳＫＯＶ−３細胞を用いてスライド上で行った。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ＨＥＲ３抗体（＃ＡＦ２３４）をポジティブコントロールとして両方の実験に
含めた。
【０１２１】
両方の実験において、Ｚ変異体をＰＢＳ中１５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、そして試薬の全ての希釈はＰＢＳ中で行い、全ての洗浄も同様にした。１時間室温でのインキュベーション後、マルチウェルスライドを上記のように穏やかに洗浄し、そしてヤギ抗Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子Ｉｇ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ、＃２０．１０００．０１．０００５）を各ウェルに５μｇ／ｍｌの濃度で加えた。４５分室温でのインキュベーション後、スライドを上記のように穏やかに洗浄し、そして５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ２１４６７）を各ウェルに加えた。さらに４５分のインキュベーション後、スライドを穏やかに洗浄した。ポジティブコントロール、ヤギ抗ＨＥＲ３抗体を１５μｇ／ｍｌの濃度で、続いて５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用した。染色が完了した後、ＰＢＳ中３％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、＃１３６５）中で１０分間室温で固定した。次いでスライドを２回すすぎ、乾燥し、そしてＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジン−２−フェニルインドール、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃Ｈ１２００）を含有する退色防止液を用いて封入した。生体画像化用のビデオカメラを備えたＬＥＩＣＡ ＤＭＬＡ顕微鏡を使用して染色を記録した。
【０１２２】
フローサイトメトリーを使用した細胞上親和性順位付け： Ｚ変異体Ｚ０１７５１、Ｚ０１７５３、Ｚ０１８１４及びＺ０１８２０をコードする全長遺伝子配列を、それらの対応するｐＡＹ００４３０ベクター構築物からＰＣＲ増幅し、そして制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で予め消化したブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２１：２４７−２５５（２００８））に結合させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１ΔＭ１５をプラスミド構築及び製造のための宿主として使用し、そして以前に記載されたプロトコル（Ｌｏｅｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０２：７３６−７４７（２００７））に従ってこれらの構築物をエレクトロコンピテントなスタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００（Ｇｏｅｔｚ、Ｓｏｃ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．１９：４９−５３（１９９０））に形質転換した。独立して４つの異なるＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＴＳＢ−ＹＥ １０ｍｌに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。培養物から、１０6個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。これらの細胞を遠心分離（３５００ｘｇ、４℃、６分）によりペレット化し、そして異なる濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃ（５、２０、５０及び１００ｎＭ；ビオチン化については実施例１を参照のこと）を含有するＰＢＳＰ１００μｌ中に再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベーションすることにより平衡結合に達した。細胞を氷冷ＰＢＳＰ １ｍｌで１回洗浄し、続いて氷上で１．２５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８複合体化ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｓ３２３５４）及び２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７複合体化ＨＳＡ（実施例１を参照のこと）を含有する氷冷ＰＢＳＰ １００μｌ中で４０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで１回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析の前に氷冷ＰＢＳＰ３００μｌに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１２３】
結果
タンパク質発現及び精製： １５の二量体Ｚ変異体分子（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓの形態）は許容しうる産生レベルの可溶性タンパク質を生じ、そして産生されたバッチの純度は、基準を満たさなかった２つのＺ変異体（Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２６）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０２００９）2−Ｃｙｓ）を除いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９０％を超えると見積もられた。ＬＣ／ＭＳ分析により、全ての純粋なＺ変異体分子について正確な分子量が確認された。
ＣＤ分析： ＣＤスペクトルは、Ｚ変異体分子がα−ヘリックス構造を２０℃で有していることを示した。この結果は融点（Ｔｍ）を決定した温度可変測定（表１）でも確認された。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
蛍光免疫染色： 蛍光免疫顕微鏡検査法を、ヒトがん細胞において発現される天然ＨＥＲ３に対する特異性及び結合活性の特徴付けのために使用した。実施例１のＥＬＩＳＡにおいてポジティブシグナルを示す１１のクローンを、Ｎ末端Ｈｉｓ6−タグ及びＣ末端システインに融合された二量体として製造した。各Ｚ変異体をＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５細胞（ヒト乳房乳腺細胞株）でインキュベートした。抗ＨＥＲ３抗体をポジティブコントロールとして使用した。染色手順の後に細胞を固定した。１１のバインダーのうち、６つは膜結合染色パターンを生じた。バックグラウンドはいくつかのＺ変異体について高く、そしていくつかの場合にはそれらが特異的であるか否かを判別することが困難であった。２つのＨＥＲ３特異的分子、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓを、ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５細胞並びにＨＥＲ２ポジティブ及びＨＥＲ３ネガティブＳＫＯＶ−３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）の両方に対するさらなる分析のために選択した。明確な細胞膜染色がＡＵ５６５で得られたがＳＫＯＶ−３細胞では得られず、ＨＥＲ２よりもＨＥＲ３に対するＺ変異体の選択性を示した（図３）。
【０１２６】
フローサイトメトリーを使用した細胞上親和性順位付け： ＨＥＲ３結合分子をさらに特徴付けし、そして細菌細胞での機能発現を確認するために、蛍光免疫染色においてＨＥＲ３に対する特異性を示す４つのＨＥＲ３結合分子を、ブドウ球菌細胞ディスプレイ及びフローサイトメトリーを使用する細胞上親和性順位付け実験のために使用した。４つの変異体の単量体構築物を、その後のブドウ球菌宿主への形質転換のためにブドウ球菌ディスプレイベクターにサブクローニングした。４つのＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞をそれぞれ、５〜１００ｎＭの範囲に及ぶ４つの濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃとともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して細胞を分析し、４つ全ての変異体についてクローン間での相対的親和性において有意な差異はなく、細胞表面上での効果的な発現及びＨＥＲ３への特異的結合が明らかとなった（データは示されていない）。ビオチン化ＨＥＲ２を実験においてネガティブコントロールとして使用して交差特異性は観察されず、実施例１における周辺質上清を用いて行われたドットブロット及びこの実施例における蛍光免疫染色の結果を裏付けた。
【０１２７】
実施例３： ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の成熟ライブラリーの設計及び構築
この実施例において、成熟ライブラリーを構築した。このライブラリーをＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択のために使用した。成熟ライブラリーからの選択は通常、増加した親和性を有するバインダーを生じると期待される（Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（８）：４３３９−４８（２００６）。しかしモノヌクレオチド及び縮重コドンを使用する伝統的なオリゴヌクレオチド合成技術は、ブドウ球菌系統がアンバー停止コドンを抑制することができないために設計を制限し得る。この研究において、無作為化二本鎖リンカーをＳｌｏｎｏｍｉｃｓ(R)技術により代わりに生成し、これはその後に構成される二本鎖ＤＮＡのライゲーション及び制限を使用したトリヌクレオチドビルディングブロックの無作為化セットの組み込みを可能にする。
【０１２８】
材料及び方法
ライブラリー設計： ライブラリーは、実施例１及び２に記載されるＨＥＲ３結合Ｚ変異体の配列に基づくものであった。新しいライブラリーにおいて、Ｚ分子骨格における１３の可変位置は、配列番号１〜２１において定義されるＺ変異体配列の結合モチーフに基づいたストラテジーにしたがって、特定のアミノ酸残基に偏っていた。制限部位ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩが隣接した、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのヘリックス１及び２において部分的に無作為化された位置をコードする１３１ｂｐの二本鎖リンカー、例えば５’−ＧＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＧＧ ＮＮＮ ＴＴＡ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＮＮＮ ＡＧＴ ＴＴＡ ＮＮＮ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＴ−３’（無作為化コドンはＮＮＮと示される）の混合物を含有するＳｌｏｎｏＭａｘ(R)ライブラリーをＳｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨに発注した。１３の可変Ｚ位置についての新しいライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論的分布を表３に示す：
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
ライブラリー構築及びクローニング： Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、＃Ｆ５３０Ｌ）を使用して８サイクルのＰＣＲの間にライブラリーを増幅し、そしてプールした生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて供給業者の推奨にしたがって精製した。無作為化ライブラリーフラグメントの精製したプールを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、そして２％アガロースゲルでの分取ゲル電気泳動を使用して精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ系統ＲＲ１ΔＭ１５を、Ｊｅｔｓｔａｒ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ、＃２２００２０）を用いたブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１（図４Ａ）のプラスミド産生のための宿主系統として使用した。
【０１３１】
このベクターを同じ酵素ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩで消化し、そして１％アガロースゲルでの分取ゲル電気泳動を使用して精製した。ｐＳＣＺ１と無作為化ライブラリーフラグメントとのライゲーションを、１：４のベクター対フラグメントのモル比のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０２０２Ｔ）を使用して行った。ライゲーション混合物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して供給業者の推奨に従って、エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８２６３−０１２）への形質転換前に精製した。形質転換後、さらには終夜の増殖後に直接プレーティングした個々のクローンを、配列確認のためにＢｉｇＤｙｅサーモサイクルシークエンシング（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００機器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲ増幅した。プラスミドをＪｅｔｓｔａｒ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用したＥ．ｃｏｌｉの終夜培養から製造し、そしてエレクトロコンピテントなＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）に以前に記載されたように（Ｌｏｅｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ、前出）形質転換した。ブドウ球菌提示ライブラリーを本明細書以下ではＳｃ：ＺHER3LIBと示す。
【０１３２】
ライブラリー品質分析： Ｓｃ：ＺHER3LIBのアリコート（少なくともライブラリーサイズの１０倍、すなわち１．３×１０8より多い）を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１００ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。１６時間後、１０7個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで１回洗浄した。細胞を遠心分離（３５００ｘｇ、４℃、６分）でペレット化し、そして２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有するＰＢＳＰに再懸濁し、そして１時間室温にて暗所でインキュベートした。１ｍｌ氷冷ＰＢＳＰで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析の前に細胞を３００μｌ氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１３３】
結果
ライブラリー構築及びクローニング： 新しいライブラリーを、確認された結合特性（実施例１及び２）を有する一組のＨＥＲ３結合Ｚ変異体（配列番号６６９〜６８９）に基づいて設計した。設計されたライブラリーの理論的なサイズは７．４×１０8のＺ変異体であった。ＤＮＡフラグメントのライブラリーをブドウ球菌発現ベクター中にクローニングし、そしてＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）に形質転換して約１．３×１０7の個々のクローンを含有する細胞提示ライブラリーを生成した。個々のライブラリーメンバーの配列分析により、理論的設計に従ったコドンの分布、並びに予期しないコドン、多重挿入及びフレームシフトの低い比率が示された。
ライブラリー品質分析： Ｚ変異体成熟ライブラリーが細菌表面に機能的に提示されたことを確認するために、ライブラリーからのブドウ球菌細胞を蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートし、そしてフローサイトメトリーを使用して分析した。結果は、ライブラリーの約７２％が細胞表面で機能的ＡＢＰ融合を有する全長タンパク質を発現したことを示した（データは示されていない）。従ってＨＥＲ３結合ポリペプチドの成熟ライブラリーは首尾よく構築された。
【０１３４】
実施例４： ブドウ球菌表面ディスプレイライブラリーからのＺ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
材料及び方法
細胞標識及びＦＡＣＳを使用したブドウ球菌細胞選別： Ｓｃ：ＺHER3LIBのアリコート（ライブラリーサイズの少なくとも１０倍、すなわち１．３×１０8より多い）を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＴＳＢ−ＹＥ １００ｍｌに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。１６時間後、細胞（その後のサンプリング数の少なくとも４倍）を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）でペレット化し、そしてビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃを含有するＰＢＳＰ中に再懸濁し、そして室温で穏やかに混合しながら２時間インキュベートして平衡結合に到達させた。その後細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、続いて１．２５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８結合体化ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有する１ｍｌ ＰＢＳＰ中で１時間氷上で暗所にてインキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌでの最終洗浄工程の後、細胞を選別前に氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して選別した。ソートゲートは 最も高いＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７蛍光強度比を示すＺ変異体提示細胞の上部（ｔｏｐ）フラクション（典型的に０．１％）を選別するように設定した。細胞を直接０．５ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地中に選別し、そしてその後１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＴＳＢに播種し、そして３７℃で１６時間、標識及びＦＡＣＳの次のラウンドのため、増殖により単離された細胞を増幅するためにインキュベートした。この手順を４回繰り返した。
【０１３５】
配列決定： 個々のブドウ球菌クローンの配列決定を、実施例３のライブラリー構築において記載した細胞選別サイクル３及び４の後に行った。
【０１３６】
細胞上親和性順位付け及びＫD決定： ＨＥＲ３−Ｆｃをビオチン化し、そして実施例１において記載されるようにＨＳＡをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７と結合体化した。異なるＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞をそれぞれ１０ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。培養物から、１０6個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）でペレット化し、そして推定ＫDに及ぶ異なる濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７について１３５、９０、２７、９、２．７、０．９、０．４５、０．２２、０．１１及び０．０５４ｎＭ；Ｚ０１８２０について６７０、３３７、１１０、４５、１８、６．７、２．２、１．１、０．３７及び０．２７ｎＭ）を含有するＰＢＳＰに再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベーションすることにより平衡結合に達した。細胞を氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで洗浄し、続いて１．２５μｇ／ｍｌＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８結合体化ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そして順位付け実験では２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有する氷冷ＰＢＳＰ１００μｌ中で氷上で４０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで洗浄した後、フローサイトメトリー分析前に細胞を氷冷ＰＢＳＰ３００μｌに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１３７】
結果
改善されたＺ変異体の単離のためのフローサイトメトリー選別： 成熟ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の単離のために、ブドウ球菌ライブラリーを、細胞増殖による増幅の交互のラウンドを含むラウンドの蛍光細胞分析分離にかけた。
【０１３８】
手短には、細胞をビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃと共に実施例１及び２からのＺ変異体の推定ＫDと比較して約１０倍低い濃度でインキュベートした。その後細胞を洗浄し、そしてその後の細胞に結合したＨＥＲ３の蛍光媒介検出のための蛍光標識したストレプトアビジン、さらには表面発現レベルのモニタリングのための蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。結合したＨＥＲ３の解離速度を小さくするために、二次的試薬及びＨＳＡのインキュベーションを氷上で行った。さらに洗浄した後、標識された細胞ライブラリーをフローサイトメーターでスクリーニング及び選別した。標的濃度、選別パラメーター及びソートゲートに関する選択ストリンジェンシーは、各選別ラウンドとともに増加し、そして典型的には、最も高い標的結合対表面発現比を示すライブラリーの上位０．１％を、増幅及びその後の選別ラウンドのためにゲーティングして単離した。フローサイトメーターでのライブラリーの標的結合特性の可視化により、各選別ラウンドでのＨＥＲ３ポジティブクローンの濃縮そして最終ラウンドでは本質的にＨＥＲ３ポジティブクローンのみであることが明らかとなった（図５）。ＦＡＣＳの４ラウンドまでの後、単離された細胞を個々の候補の配列決定及び特徴付けのために半固形培地に広げた。
配列決定： ５７６の個々のクローンを配列決定し、結果として４４３の配列が可読であり、そのうち４５のクローンは同じ選別ラウンドにおいて１回以上出現した（配列番号６９０〜７３４）。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を付与し、そして個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８量体Ｚ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号６９０〜１００２として載せる。これらのＺ変異体の推定ＨＥＲ３結合モチーフを図１及び配列表に配列番号２２〜３３４として載せる。これらの各Ｚ変異体内で完全３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９量体ポリペプチドのアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号３５６〜６６８として載せる。
【０１３９】
細胞上親和性順位付け： 配列決定結果に基づいて１回より多く出現した４５のクローンを、ＦＥＲ３に対する親和性に関して変異体を順位付けするために全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにかけた。ブドウ球菌細胞集団をフローサイトメトリーを使用して分析し、そしてブドウ球菌細胞において表面提示された実施例１及び２からの１つのＺ変異体（Ｚ０１７５３）を比較のために分析に含めた。全ての４５の候補がアッセイにおいてＨＥＲ３結合に関してポジティブであり、さらに、４３は実施例１及び２からのＺ変異体と比較してより高いシグナルを示した（図６Ａ〜Ｄ）。アッセイにおいて最も高いシグナルは配列決定後に最も頻繁に出現した４つのクローンで見られ、フローサイトメトリー選別におけるＺ変異体の定量的な単離が示された。
【０１４０】
ＫD決定： 見掛けの平衡解離定数（ＫD）を、４つのＺ変異（図４Ｂ）並びに実施例１及び２からの１つのＨＥＲ３結合Ｚ変異体（Ｚ０１８２０）について細胞で決定した。４つの変異体及びＺ０１８２０を提示しているブドウ球菌細胞を、推定ＫDに及ぶ様々な濃度の標識ＨＥＲ３−Ｆｃでインキュベートした。細胞集団をフローサイトメーターで分析し、続いて平均蛍光強度データをＨＥＲ３−Ｆｃ濃度に対してプロットし、そしてＫDを決定するために１部位結合モデルにフィッティングした。全ての４つの成熟Ｚ変異体は低いナノモルの見掛けのＫDを示した。最も強いバインダーは、実施例１及び２からのＺ変異体と比較してＨＥＲ３−Ｆｃに対する親和性において１５倍の改善を示した（表３）。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
実施例５：Ｚ変異体の表面プラズモン共鳴ＫD決定
材料及び方法
表面プラズモン共鳴分析： 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析をＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７についてＢＩＡｃｏｒｅTM ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びマウスＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＭ−５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＮＨＳ／ＥＣＤアミンカップリング化学により固定化した。固定化は１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中で３０μｌ／分の流量で、そして１０μｇ／ｍｌの濃度で行い、４０００ＲＵの固定化レベルを目標とした。ランニングバッファーとしてＰＢＳＰを２０μｌ／分（別の記載がなければ）の流量で、そして再生のために５ｍＭ ＮａＯＨを使用した。
【０１４３】
動力学の決定のために、４つの異なる濃度（１．５〜６７ｎＭ、ＰＢＳＰ中で希釈）の４つのＨＥＲ３結合Ｚ変異体２５０μｌを、ＣＭ−５チップ表面上に固定化したＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入した。５ｍＭ ＮａＯＨ １５μｌの４回の注入及びランニングバッファを用いた徹底的な洗浄により表面を再生した。各サンプルを二つ組で測定し、そしてブランク表面からの応答を各濃度での各Ｚ変異体の応答から差し引いた。平均会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）に基づいてＫD値を決定するために、得られたセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）を１部位結合モデルにフィッティングした。
【０１４４】
対照実験： ＨＥＲ３−ＦｃのＦｃ部分に対する親和性について選択されたのではないことを確認するために、各Ｚ変異体（５０ｎＭ）を、各サンプル１００μｌ（上記の濃度で）をバイオセンサーチップ表面に固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入する前に、１０倍モル濃度過剰のヒトポリクローナルＩｇＧ（５００ｎＭ）と共に１時間室温でインキュベートした。さらなる対照実験において、センサーチップ表面に固定化されたＨＥＲ３−ＥＣＤ上にＺ変異体を注入した。
【０１４５】
結果
表面プラズモン共鳴分析： ４つのＺ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の解離平衡定数（ＫD）をＳＰＲ技術により決定した。１部位結合モデルに対する非線形回帰を使用してＺ変異体の会合速度及び解離速度から親和性を決定し、Ｚ０５４０５について１．６１ｎＭ、Ｚ０５４１３について０．７８ｎＭ、Ｚ０５４１６について０．７８ｎＭ、そしてＺ０５４１７について０．６９ｎＭの解離定数を得た（図７、表４）。表４において、全ての値は同日に行われた各濃度の二つ組の平均である。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
対照実験： ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の分析はヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に融合されたＨＥＲ３を用いて行ったので、Ｚ変異体がＨＥＲ３−ＦｃのＦｃ部分に対する親和性について選択されたのではないことを確認するために２つの対照実験を行った。ＩｇＧと共にプレインキュベートしたＺ変異体とＺ変異体のみを含有するサンプルとの間に応答の差異は見られなかった（データは示していない）。さらに、ＨＥＲ３−ＥＣＤを有する表面上に注入されたＺ変異体は、全ての４つの変異体に対して特異的結合を示した（データは示していない）。総合すると、これら２つの実験は、ＦｃがＨＥＲ３−Ｆｃ上のＺ変異体の結合部位の一部ではないということを明確に示す。
【０１４８】
実施例６： ヘレグリン及びＨＥＲ３結合Ｚ変異体についての競合アッセイ
この実施例において、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体がリガンドヘレグリンのＨＥＲ３に対する結合をブロックする能力を競合アッセイにおいてＳＰＲにより調べた。
【０１４９】
材料及び方法
天然リガンドヘレグリン（ＨＲＧ１−β１、ＥＧＦ様ドメイン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と４つのＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７との間の競合を、ＳＰＲを使用して２つの異なるアッセイで分析した。
【０１５０】
第一のアッセイにおいて、２．５ｎＭ ＨＥＲ３−Ｆｃを、１００ｎＭの４つのＨＥＲ３特異的Ｚ変異体の各々（４０倍モル濃度過剰）とともに１時間室温でプレインキュベートした。その後、ＨＥＲ３−Ｆｃ及びＺ変異体の各混合物７５μｌを、ヘレグリンが固定化されたセンサーチップ表面上に注入した。さらに、Ｚ変異体とプレインキュベートしていないＨＥＲ３−Ｆｃを、ヘレグリンが固定化されたチップ表面上に注入した。
【０１５１】
第二のアッセイにおいて、５つの異なる濃度（０〜１０ｎＭ）の各Ｚ変異体１００μｌを、ＨＥＲ３が固定されたセンサーチップ表面上に注入し、続いてすぐに２５０ｎＭヘレグリン１００μｌを注入した（ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＯＩＮＪＥＣＴコマンドを使用）。全てのサンプルを二つ組で注入し、そしてＨＥＲ２特異的Ｚ変異体を、同じ設定を使用してネガティブコントロールとして注入した。５ｍＭ ＮａＯＨの２回の注入及びランニングバッファでの徹底的な洗浄で表面を再生させた。
【０１５２】
結果
ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の天然ＨＥＲ３リガンドヘレグリンとのＨＥＲ３に対する競合をＳＰＲ技術により調べた。
【０１５３】
チップ表面上に固定化されたヘレグリンを使用した第一のアッセイの結果は、Ｚ変異体とプレインキュベートしていないＨＥＲ３−Ｆｃを注入した場合と比較してＺ変異体とともにプレインキュベートしたＨＥＲ３−Ｆｃを注入した場合に、応答レベルのほとんど完全な減少を示した（図８Ａ）。
【０１５４】
チップ表面上に固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃを使用した第二のアッセイの結果は、ＨＥＲ３受容体とその天然リガンドとの間の相互作用と濃度依存的に競合することを示した（図８Ｂ）。同じパターンがマウスＨＥＲ３−Ｆｃについて観察された（データは示していない）。ネガティブコントロールとヘレグリンとの間の競合はヒト又はマウスＨＥＲ３のいずれについても観察することができなかった（データは示していない）。
【０１５５】
これらの結果は、ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体が天然リガンドヘレグリンと同じＨＥＲ３上の結合部位と相互作用し、それ故リガンドと受容体との間の結合とインビトロで競合し得るということを示した。この効果は、今後の治療的なインビボ適用において利用されるかもしれない。
【０１５６】
実施例７： インビトロでのヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化の阻害
この実施例では、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体のヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化を妨害する能力を細胞アッセイで調べた。
【０１５７】
材料及び方法
刺激： ＭＣＦ−７（ＡＣＣ１１５、ＤＳＭＺ）乳がん細胞を、Ｌ−グルタミン（ＢＥ１７−６０５Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、非必須アミノ酸（ＢＥ１３−１１４Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、ピルビン酸ナトリウム（ＢＥ１３−１１５Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０１０８−１６５、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（ＢＥ１２−１６７Ｆ、Ｌｏｎｚａ）で培養した。刺激の前日に、１×１０6の細胞を６ｍｍペトリ皿（４３０１６８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に上記の培地５ｍｌ中で播種した。
【０１５８】
刺激の１時間前に、培地をＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン＋２％透析ＦＢＳ（２６４００−０３６、Ｇｉｂｃｏ）からなる培地に変更した。ＨＥＲ３のリン酸化を５ｎＭヘレグリン（ＨＲＧ１−β、３９６−ＨＢ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて誘導した。それぞれＮ末端ｈｉｓタグ及びＣ末端システインを含むＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７（Ｈｉｓ6−Ｚ０５４１６−ｃｙｓ及びＨｉｓ6−Ｚ０５４１７−ｃｙｓ）を、１０又は１００倍モル濃度過剰のヘレグリンと同時に加えた。ｔａｑポリメラーゼ特異的Ｚ変異体（Ｈｉｓ6−Ｚ０１１５５−ｃｙｓ）をネガティブコントロールとして使用して、そして上記と同じ手順に従って加えた。
【０１５９】
１０分間３７℃でインキュベーションした後、ペトリ皿を氷上に置き、続いて氷冷ＰＢＳで洗浄することにより細胞プロセスを停止させた。洗浄後、１ｍＭ活性化オルトバナデート（４５０２４３、Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ ２ｍｌを各皿に加え、そして細胞を細胞スクレーパーを使用して剥離した。細胞溶液を１０ｍｌのチューブに移し、そして細胞を１０００ｒｐｍでの３分間の予冷遠心分離で回転させることによりペレット化した。乾燥ペレットを氷冷溶解緩衝液１００μｌ（１％ ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ Ｉ３０２１）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化ナトリウムオルトバナデート）に溶解して細胞を溶解させた。溶解物を回転させて４℃にて３０分間インキュベートし、そして１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を集めてさらなる分析まで−８０℃で保存した。
【０１６０】
ｐＨＥＲ３−ＥＬＩＳＡ： リン酸化ＨＥＲ３タンパク質（ｐＨＥＲ３）の細胞溶解物中の存在を、Ｄｕｏ−Ｓｅｔ ＩＣ ｐｈｏｓｐｏ ＥｒｂＢ３サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＤＹＣ−１７６９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
【０１６１】
９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を終夜５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中に希釈された２μｇ／ｍｌの捕捉抗体で被覆した。次の日、プレートを自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機でＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）で２時間室温にてウェルをブロックし、そして以前に記載したように洗浄した。
【０１６２】
ＩＣ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＃１２（１％ ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ活性化ナトリウムオルトバナデート）で２回又は４回希釈した５０μｌ／ウェルの細胞溶解物を加えた。製造者により提供されたポジティブコントロールもウェルに加えた。続いてプレートを２時間インキュベートした。
【０１６３】
洗浄後、製造者のプロトコルにしたがってＩＣ ｄｉｌｕｅｎｔ ＃１４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．２−７．４）で希釈した５０μｌ／ウェルの検出抗体を加え、そしてプレートをさらに２時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ、Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。２０分後に５０μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍでＶｉｃｔｏｒ3 ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。
【０１６４】
結果
ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７を、ネガティブコントロール（ｔａｑポリメラーゼ特異的Ｚ０１１５５）と一緒に、ＨＥＲ３のヘレグリン誘導リン酸化をブロックするそれらの能力について評価した。ｐＨＥＲ３の相対含有量（％）を、ヘレグリン刺激培養物（ヘレグリン刺激培養物から得られたＯＤ値）に対するブロックされた培養物（Ｚ変異体を含有する培養物から得られたＯＤ値）の関係として決定した。図９は、ＨＥＲ３結合変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７が用量依存的様式でヘレグリン誘導リン酸化を阻害し、一方でｔａｑポリメラーゼ結合変異体Ｚ０１１５５はいずれの効果も有していなかったことを示す。
【０１６５】
実施例８： ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に結合する二重特異性Ｚ変異体
背景の項に記載したように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２にとって好ましいヘテロ二量体化パートナーであり、そしてＨＥＲ２はリガンド誘導シグナル伝達に関してＨＥＲファミリーの他の受容体に依存している。二重特異性ＨＥＲ３及びＨＥＲ２標的化リガンド（例えばＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体）は、両方の受容体を発現している腫瘍において受容体シグナル促進腫瘍成長をブロックするかもしれない。
【０１６６】
場合により様々なリンカー長を含む二重特異性分子のための種々の分子構築物を考慮した。構築物の例は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドに対してＨＥＲ３結合ポリペプチドをＮ末端又はＣ末端に位置づけることである。リンカーが２つの結合ポリペプチドの間に導入される場合、それは１〜６０アミノ酸残基、例えば１〜４５アミノ酸を含み得る。さらに、二重特異性構築物は、半減期延長部分、例えばアルブミン融合、アルブミン結合部分又はＰＥＧのような分子へのカップリングを分子のＮ末端若しくはＣ末端部分又はリンカー領域内に備えていてもよい。あるいは、半減期延長部分はそれ自体で結合ポリペプチド間のリンカー、又はスペーサーとして利用され得る。
【０１６７】
材料及び方法
二量体二重特異性Ｚ変異体分子を、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、５４（２）：１２１−３１（２００９）に以前に報告されたように操作した。ＦｒｉｅｄｍａｎらはＨＥＲファミリーの２つのメンバーに対して特異的な四量体Ｚ変異体の製造について記載しているが、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２二重特異性Ｚ変異体の構築は、原理上は同じプロトコルに従う。当業者は、Ｆｒｉｅｄｍａｎらに基づく手順を適用する方法を用意に理解するだろう。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に結合するヘテロ二量体Ｚ変異体の構築については、Ｊｏｎｓｓｏｎらにより記載される手順（前出）に従うことにより、２つの結合ポリペプチドの間に４０アミノ酸のペプチドリンカーを使用してＨＥＲ３結合変異体をコードする遺伝子フラグメントを、ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントとインフレームで遺伝子融合した。
【０１６８】
二重特異性タンパク質をコードする遺伝子を、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードするベクターのクローニングにより構築した。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体は、配列番号６６９〜１００２から選択され、特に配列番号６６９〜７３４から選択される配列、例えば配列番号６９０〜７３４から、例えば配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択され、そしてＨＥＲ２結合Ｚ変異体は配列番号１００３から選択される。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３結合Ｚ変異体は、異なる受容体に対して異なる親和性を有し得る。構築物は同じ受容体に対する様々な親和性を有するＺ変異体をコードするベクターから作製されてもよい。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードするベクターを、適切なエンドヌクレアーゼ（例えばＳｆｉＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して切断し、そしてＨＥＲ３−ＨＥＲ２特異的Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントを回収し、そしてライゲーションして二重特異性分子をコードする遺伝子を形成した。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２結合ポリペプチドは遺伝子フラグメント内で個々に単量体単位を形成しても多量体単位、例えば二量体、三量体又は四量体を形成してもよい。
【０１６９】
ペプチドリンカーの導入のために、リンカー領域をコードする遺伝子フラグメント（例えばＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＬＶＧＬＧＳＧＧＧＧＳ）の倍数を異なるリンカー長を有する構築物を作製するために導入する。リンカー領域はアルブミン遺伝子又はアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）のための遺伝子も含有し得る。ここでは、ＡＢＤ遺伝子をＰＣＲを使用して増幅し、そしてリンカーコード単位を導入する。この後、ＢａｍＨＩ制限消化し、そしてＨＥＲ結合ポリペプチド間で二量体ＨＥＲ３−ＨＥＲ２二重特異性遺伝子中にライゲーションする。これは本質的に、Ｊｏｎｓｓｏｎら（前出）により三量体ＴＮＦ構築物の作製について記載されたように行われるが、Ｊｏｎｓｓｏｎにおいて記載される中心ＴＮＦ分子をＡＢＤに置き換える。あるいは、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントを、種々の形式で二重特異性分子をクローニングするるための所望のリンカー領域及び制限部位も導入する適切なＰＣＲプライマーを使用して増幅する。二重特異性分子の種々の形式は、例えばＮ末端若しくはＣ末端の位置づけ、結合Ｚ変異体間の様々な長さのリンカー及び／又は中間のＡＢＤ遺伝子である。所望の二重特異性分子をコードする遺伝子の構築についての別の可能性は、単に完全合成遺伝子をそのようなサービスを提供している企業（例えばＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ）から購入することである。
【０１７０】
結果として得られた、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体、ＨＥＲ２結合Ｚ変異体、ペプチドリンカー及び場合によりＡＢＤをコードする遺伝子フラグメントを、発現ベクターにライゲーションし、発現細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。タンパク質を例えば実施例２に記載されるように発現させる。さらなるｈｉｓ−ｔａｇ及び／又は標識目的のための独特のシステインをコードする発現ベクターを使用し、そして発現されたタンパク質を例えば実施例２に記載されるように精製する。タンパク質発現及び精製に使用される方法は、当業者に公知の標準的な方法である。
【０１７１】
次いで得られた二重特異性タンパク質を、Ｆｒｉｅｄｍａｎら（前出）に記載されるように、バイオセンサー分析（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによりインビトロでの同時結合について試験する。ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（ｈＨＥＲ３−Ｆｃ）及びヒトＨＥＲ２−Ｆｃ（ｈＨＥＲ２−Ｆｃ、両方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）を、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストラン層上に製造者の指示に従って固定化した。別のフローセル表面を活性化し、そして参照表面として不活性化した。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子をランニングバッファ、ＨＢＳ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で希釈し、その後結合分析を２５℃で行った。第一の実験において、二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を１２５ｎＭから２μＭの範囲に及ぶ濃度で全ての表面に３０μｌ／分の流量で注入した。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体及びＨＥＲ２結合Ｚ変異体もまたコントロールとして注入した。各注入後に、１０ｍＭ ＨＣｌ １０ｍｌを注入することによりフローセルを再生した。
【０１７２】
第二の実験において、５μＭ ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を、ｈＨＥＲ３−Ｆｃ又はｈＨＥＲ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）がアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップのカルボキシル化デキストラン層上に固定化されたフローセル表面上に注入した。１分の短い解離時間の後、１１５ｎＭ ｈＨＥＲ３−Ｆｃ及びｈＨＥＲ２−Ｆｃ（ランニングバッファで希釈）を注入し、そして二重特異性分子のそれらの標的両方に同時に結合する能力をモニタリングした。
【０１７３】
蛍光標識した二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を、ＨＥＲ３を発現しＨＥＲ２を発現していない細胞、又はＨＥＲ２を発現しＨＥＲ３を発現していない細胞のいずれかとインキュベートすることにより、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子の生存細胞での結合能力を、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析を使用してＦｒｉｅｄｍａｎら（前出）に記載されるようにモニタリングした。それぞれの受容体に対する異なる親和性を有する異なる構築物が、細胞での異なる受容体発現レベルを区別するかどうかを調べるために特異性の差異を同時に調べた。
【０１７４】
細胞に対する結合二重特異性Ｚ変異体の生物学的効果を、細胞培養物を０．０５ｎＭから５０００ｎＭまでの範囲にわたる様々な量の二重特異性Ｚ変異体に曝露し、そして細胞増殖速度及び生存を分析し、そして重要な細胞シグナル伝達経路のリン酸化パターンをウェスタンブロット分析を使用して、ＨＥＲ２特異的Ｚ変異体についてＥｋｅｒｌｊｕｎｇらにより（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ２７（４）：２０１−１０（２００６）及びＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３７７（２）：４８９−９４（２００８）において）記載されるように分析することにより試験した。試験することができる細胞株としては、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＣＡＬＵ−３及びＳＫＯＶ−３が挙げられる。またＨＥＲ３形質導入ＢＴ−４７４及びＺＲ７５細胞を使用することもできる。
【０１７５】
インビボでのＨＥＲ３−ＨＥＲ２ Ｚ変異体の効果を試験するために、二重特異性構築物を腫瘍標的化及び腫瘍における生物学的効果について評価した。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を以前に記載されたように（Ａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９（１）：２３５−４３（２００８））放射標識し、そしてインビトロでの細胞取り込み、保持及び内部移行について、記載された方法（Ｓｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２０（３）：２３９−４８（２００５））を使用して特徴付けした。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２受容体を発現している異種移植された腫瘍（例えばＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＣＡＬＵ−３及びＳＫＯＶ−３）を有する動物を、体内分布研究において放射標識したＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を注射し、そして腫瘍取り込み及び他の器官との対比についてモニタリングした。半減期延長部分を有していない構築物については、異種移植されたマウスにおける放射能の分布を、典型的には放射標識二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体の注射後１、２、４、８、２４、４８及び７２時間の時点で評価した。半減期延長部分を有する構築物については、放射能の分布を典型的には放射標識された二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体の注射後１、４、１２、２４、４８、７２、１６８及び３３２時間の時点で、本質的にＴｏｌｍａｃｈｅｖらにより記載されるように（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７（６）：２７７３−８２（２００７））評価した。放射標識二重特異性Ｚ変異体の取り込みを、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３結合Ｚ変異体単独の取り込みと比較した。二重特異性Ｚ変異体が、単一特異性の相当するものと比較した場合にインビボで腫瘍において優れた取り込み及び保持及び／又は特異性を有する場合、それらの二重特異性変異体は標的化ペイロード治療に適切であり得る。このような治療は、二重特異性分子に融合又は結合体化された潜在的なエフェクター機能、例えば放射性核種、毒性化学分子、毒素、サイトカイン又は光増感剤を利用するだろう。
【０１７６】
二重特異性Ｚ変異体を、インビボでの内因性の効果についてさらに特徴付けした。マウスに、両方の受容体を発現している腫瘍細胞、又はコントロールとして、受容体の一方のみを発現しているか受容体をどちらも発現していない腫瘍細胞を移植し、そして二重特異性Ｚ変異体の単回又は複数回の注射を行う。腫瘍成長を経時的に、そして注射緩衝液のみで活性化合物（すなわち二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合分子）を注射されていないビヒクル群を含むコントロール群に対してモニタリングした、
【０１７７】
実施例９：ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性を有するＺ変異体
導入部に記載したように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２にについての好ましいヘテロ二量化パートナーである。しかし、特定の条件では、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ１）に対する重要な二量化パートナーでもある。二重特異性ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ標的化リガンドを使用することにより、両方の受容体を発現している腫瘍が標的にされ、そして腫瘍促進受容体シグナル伝達がブロックされ得る。
【０１７８】
二重特異性ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ結合Ｚ変異体は、本質的に上記実施例８に記載されるように操作される。得られた構築物を、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ受容体を発現する細胞株（例えばＡ４３１細胞）において、実施例８で二重特異性ＨＥＲ３及びＨＥＲ２結合Ｚ変異体について記載される方法と類似の方法で試験することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（本明細書ではＨＥＲ３と呼ぶ）に結合するポリペプチド並びに画像化及び治療における上記ポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２、又はＨＥＲ３及びＥＧＦＲの両方に対する結合親和性を有する二重特異性リガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＥＲＢＢ３又はＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）を含む膜貫通チロシンキナーゼ受容体の上皮増殖因子ファミリーは、細胞内シグナル伝達経路の複雑なネットワークを通した重要な細胞機能（例えば細胞増殖、生存、分化及び遊走）の調節に関与する。今日では、これらの受容体の異常な発現及びシグナル伝達がいくつかの型のがんの発生及び進行に関連するということが十分に確立されており、それによりこれらの受容体は新規ながん治療の開発のための重要な標的となっている。これまでに、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体が最も広く研究されており、いくつかの標的の薬剤はヒトがんの診断又は処置について行政当局により認可されている。ＨＥＲ３はチロシンキナーゼ活性を欠いており、従ってそのシグナル伝達機能を発揮するために他のＥｒｂＢ受容体と（例えばＨＥＲ２と）ヘテロ二量体を形成しなければならない（非特許文献１）。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体は潜在的に発がん性の単位であると考えられており（非特許文献２）、そしてＨＥＲ３はＨＥＲ２の好ましいヘテロ二量化パートナーとして近年注目が高まっている。ＨＥＲ２との二量化はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化並びに腫瘍細胞生存及び増殖の促進をもたらす（非特許文献３）。ＨＥＲ３は、乳がん（非特許文献４）、卵巣がん及び膀胱がん（非特許文献５）を含む多数のヒトのがんにおいて発現され、そしていくつかの肺がん（非特許文献６）及び前立腺がん（非特許文献７）を含む他のがん（非特許文献８）におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。さらに、高レベルの受容体発現は、ＨＥＲ２を過剰発現する患者と比較して有意に短い生存期間と関連するので、ＨＥＲ３発現は予後的な価値を有する（非特許文献９、非特許文献１０）。実際ＨＥＲ３は、ＥｒｂＢ受容体−ＰＩ３Ｋシグナル伝達軸のリガンド誘導活性化における主要なノードであると提案されてきた（非特許文献１１）。
【０００３】
より最近に認可された治療の比較的大部分はＥＧＦＲに向けられたものであり、そしてＨＥＲ２受容体はモノクローナル抗体に基づく。この新しいクラスの生物学的薬剤のがん治療における成功の背後にある理由の１つは、低分子化学薬を使用して以前には達成できなかった新しく独特な作用機構を抗体が提供するということである。より伝統的なアゴニスト（例えば細胞表面受容体の刺激）及びアンタゴニスト（例えば天然のタンパク質−タンパク質相互作用のブロック）の治療効果に加えて、抗体はまた、様々な範囲の免疫学的防御機構を特異的にがん性細胞に向けるために、さらには種々の画像化又は治療用抱合体（例えば化学療法薬、放射性核種及び毒素）の特異的送達を達成するための標的化剤として使用され得る。ＥｒｂＢファミリーの十分に研究されたＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体メンバーと対照的に、抗ＨＥＲ３抗体の使用に関しては比較的少ない報告しかない。
【０００４】
しかしＵｌｌｒｉｃｈ及び共同研究者らは、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体が乳がんの細胞モデルにおいてＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害するということを報告しており（非特許文献１２）、そして現在では２つのモノクローナル抗ＨＥＲ３抗体が第１相臨床試験にある（ＡＭＧ ８８８、非特許文献１３、及びＭＭ−１２１、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌら、上記）。
【０００５】
しかし、全長モノクローナル抗体を使用するいくつかの成功したがん治療研究が報告されているが、このクラスの薬剤は固形腫瘍を標的とするために（診断的なペイロードの目的でも治療的なペイロードの目的でもなく）常に最適というわけではない。治療効果は、腫瘍全体の薬物の有効な分布に依存し、そして分子画像化は、腫瘍取り込みと周囲の正常組織との間の高い比率に依存する。腫瘍浸透率（血管外漏出を含む）は分子の大きさと逆の関係があるので、比較的大きなＩｇＧ分子は本質的に乏しい組織分布及び浸透能を有する。さらに、分子画像化については、抗体の非常に長いインビボでの半減期が比較的高い血液シグナルを生じ、それにより比較的少ない腫瘍対血液コントラストを生じる。
【０００６】
ＨＥＲ３はＥＧＦファミリーの他のメンバーと同じ腫瘍細胞で発現され得るので、ＨＥＲ３及びＥＧＦファミリーの別のメンバーを標的にする二重特異性分子の製造は、近年いくらかの興味を集めている。このような二重特異性分子は、例えば分子画像化適用における標的化及びＨＥＲ３と腫瘍上に発現される別の抗原との同時標的化のための標的化ビヒクルとして利用され得る。
【０００７】
しかし、２つの別々の標的に結合する二重特異性モノクローナル抗体を製造することは複雑である。４つの必要なポリペプチド鎖をコードする遺伝子が細胞において産生される場合、１０もの異なる組み合わせが可能であり、そして１つの組み合わせのみが望まれる二重特異性抗体を示す。従って、二重特異的結合という構想は、抗体を使用して十分に探査されていない。代わりに、抗体フラグメント及び他の結合分子が二重特異性分子（二重特異性Ｚ変異体を含む）を作製するためにより広く利用されてきた（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｉｔｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２８４（１）：５４−６５（２００３）
【非特許文献２】Ｈｏｌｂｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １００（１５）：８９３３−８（２００３）
【非特許文献３】Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５（５）：３４１−５４（２００５）
【非特許文献４】Ｂｏｂｒｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３３（１１）：１８４６−５０（１９９７）
【非特許文献５】Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ４９（４）（１９９６）
【非特許文献６】Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２（１０）：３７８８−９３（２００５）
【非特許文献７】Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１（５）：１７０４−１２（２００５）
【非特許文献８】Ｓｔｏｖｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２１（８）：６６５−８４（２００４）
【非特許文献９】Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（２６）：４３１７−２３（２００６）
【非特許文献１０】Ｒｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４（１６）：５１８８−９７（２００８）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２（７７）：ｒａ ３１（２００９）
【非特許文献１２】ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１５（４）：５１９−２７（２００５）
【非特許文献１３】Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ９（７）：４６３−７５（２００９）
【非特許文献１４】Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：１２１−３１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の説明
例えばＨＥＲ３を発現する細胞の標的化、このようなＨＥＲ３を発現する細胞の分子画像化及びＨＥＲ３関連状態の処置において使用され得る新規なＨＥＲ３結合剤を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の両方を発現する病変に対する高い特異性を有する標的化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一局面によれば、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供され、該モチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｗ及びＶから選択され；
Ｘ3はＲ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＶから選択され；
Ｘ6はＡ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、Ｔ及びＹから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ11はＡ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ及びＴから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｆ、Ｄ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択され；
Ｘ20はＡ、Ｒ及びＫから選択され；
Ｘ21はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここでポリペプチドはＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＨＥＲ３−ＥＣＤ）に結合する。
【００１２】
本明細書において記載されるポリペプチドは、ＨＥＲ３によく結合するという点でＨＥＲ３に対する良好な結合親和性を示す。配列に関連したＨＥＲ３結合ポリペプチドのクラスの上記の定義は、選択実験においてＨＥＲ３とのそれらの相互作用について選択された親骨格の多数の無作為なポリペプチド変異体の分析に基づく。同定されたＨＥＲ３結合モチーフ又は「ＢＭ」は、親骨格の結合領域に相当し、この領域は３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ）内の２つのアルファヘリックスを構成する。親骨格において、２つのＢＭヘリックスの変更されたアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。結合表面の無作為な変更及びその後の変異体の選択により、結合表面のＦｃ相互作用能がＨＥＲ３との相互作用の能力で置き換えられた。
【００１３】
当業者に理解されるように、本明細書に定義されるポリペプチドのＨＥＲ３結合能のように、ポリペプチドの機能はポリペプチドの三次構造に依存する。従って、その三次構造及び機能に大きな影響を与えずにポリペプチドのアミノ酸配列に小さな変化を生成することが可能である。従って一実施態様において、本ポリペプチドは、結果として生じた配列がｉ）により定義されるクラスに属する配列に対して少なくとも９０％同一である、例えばｉ）により定義されるクラスに属する配列に対して少なくとも９３％同一、例えば少なくとも９７％同一であるように改変された、ｉ）ＢＭの変異体を含む。いくつかの実施態様において、小さな変化は本明細書において開示されるＨＥＲ３結合ポリペプチドの配列の全ての位置において作製され得る。他の実施態様において、小さな変化は、骨格アミノ酸残基とも示される不変位置においてのみ作製され得る。このような場合において、変化は可変位置、すなわち「Ｘ」で示される位置（例えば上記の定義されたＢＭのＸ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ11、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ25、Ｘ26及びＸ28）において許容されていない。例えば、アミノ酸残基の特定の機能による分類（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ機能グループからの別のアミノ酸残基と交換され得るということが可能である。
【００１４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用される用語「％の同一性（同一性％）」は以下のようにして算出される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２： ４６７３−４６８０（１９９４））を使用して問い合わせ配列を対象配列と整列させる。整列された配列の最短のものに対応する範囲にわたって比較を行う。整列された配列の最短のものは、いくつかの場合には標的配列であるかもしれない（例えば２９アミノ酸残基のＨＥＲ３結合モチーフ）。他の場合、問い合わせ配列が整列された配列の最短のものを構成するかもしれない。問い合わせ配列は、例えば少なくとも１０アミノ酸残基、例えば少なくとも２０アミノ酸残基からなるものであり得る。各位置におけるアミノ酸残基を比較し、そして標的配列において同一の対応を有する問い合わせ配列中の位置のパーセントを同一性％として報告する。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用される用語「％の類似性（類似性％）」は以下のやり方で計算される。配列アラインメント及び比較を基本的に同一性％の計算に関して記載したように行う。しかし「類似性」は以下のように解釈されるべきである。２つのアミノ酸残基は、それらがアミノ酸残基の同じグループに属する場合に類似と見なされる。アミノ酸残基のグループの非限定的な例は、アミノ酸残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓを含む疎水性グループ；アミノ酸残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む塩基性グループ；アミノ酸残基Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む酸性グループ；非荷電アミノ酸残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒを含む親水性グループ；並びにアミノ酸残基Ｇｌｙを含む天然グループである。従って、各位置におけるアミノ酸残基を比較し、そして標的配列中に類似した対応を有する問い合わせ配列中の位置のパーセントを類似性％として報告する。
【００１６】
この説明全体を通して、本発明に従う代替の実施態様は、特定の同一性パーセントの代わりに、対応する類似性パーセントを満たす。他の代替の実施態様は、特定の同一性パーセントに加えて、各配列についての好ましい同一性パーセントの群から選択される別のより高い類似性パーセント満たす。例えば、配列は別の配列に対して７０％の類似性であってもよく；又はそれは別の配列に対して７０％の同一性であってもよく；又は別の配列に対して７０％の同一性及び９０％の類似性であってもよい。
【００１７】
上に開示されるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ2はＲ、Ｋ及びＷから選択される。
【００１８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ3はＲ、Ｋ、Ｓ及びＹから選択される。
【００１９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される。
【００２０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ6はＡ、Ｓ、Ｔ及びＹから選択される。
【００２１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択される。
【００２２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ11はＱ及びＥから選択される。
【００２３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17はＲ、Ｑ、Ｔ及びＶから選択される。
【００２４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ18はＲ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶから選択される。
【００２５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ20はＲ及びＫから選択される。
【００２６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ21はＡ及びＧから選択される。
【００２７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｒ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される。
【００２８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ28はＡ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択される。
【００２９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2はＲ及びＫから選択される。
【００３０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ3はＫ及びＹから選択される。
【００３１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される。
【００３２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ6はＴ及びＹから選択される。
【００３３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＡ、Ｇ、Ｆ、Ｙ及びＶから選択される。
【００３４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17はＲ、Ｑ及びＶから選択される。
【００３５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ18はＲ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｙ及びＶから選択される。
【００３６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される。
【００３７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ28はＡ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｓ及びＷから選択される。
【００３８】
上で開示されるＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、該ポリペプチドはＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含み、このモチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ ＹＸ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＫ、Ｒ及びＷから選択され；
Ｘ3はＫ、Ｒ、及びＹから選択され；
Ｘ4はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11はＥ及びＱから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ20はＫ及びＲから選択され；
Ｘ21はＡ及びＧから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する。
【００３９】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2Ｘ3はＫＹ、ＲＹ、ＷＫ及びＷＲから選択される。
【００４０】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ11はＱである。
【００４１】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ、ＶＲ及びＲＲから選択される。
【００４２】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ20はＫである。
【００４３】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ21はＡである。
【００４４】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される。
【００４５】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ4はＫ、Ｌ、Ｓ及びＴから選択される。
【００４６】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ7はＦ、Ｇ及びＹから選択される。
【００４７】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ及びＶＲから選択される。
【００４８】
上に開示されるポリペプチドのさらなる実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｇ及びＳから選択される。
【００４９】
上で開示されるポリペプチドのなおさらなる実施態様において、アミノ酸配列ｉ）は、以下の条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：
Ｉ） Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される；
ＩＩ） Ｘ11はＱである；
ＩＩＩ） Ｘ20はＫである；
ＩＶ） Ｘ21はＡである、
の少なくとも１つを満たす。
【００５０】
アミノ酸配列ｉ）は、例えば４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、又は全てを満たし得る。
【００５１】
以下の実験項に詳細に記載されるように、ＨＥＲ３結合変異体の選択は、個々のＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定をもたらした。これらの配列は、この局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドの個々の実施態様を構成する。個々のＨＥＲ３結合モチーフの配列を図１に、そして配列番号１〜３３４として示す。この局面のいくつかの実施態様において、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号１〜配列番号６６のいずれか１つから選択され、例えば配列番号２２〜６６のいずれか１つから、例えば配列番号２３〜２５、配列番号２７〜２８、配列番号３２、配列番号３５〜３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４〜４５、配列番号５３〜５４及び配列番号５６から選択される。
【００５２】
特定の実施態様において、ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）はこのようにして３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは該３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で相互接続ループを有する２つのアルファヘリックスを本質的に構成し得る。これらの実施態様において、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは：
ｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
［ここで
［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり；
ＸaはＡ及びＳから選択され；
ＸbはＮ及びＥから選択され；
ＸcはＡ、Ｓ及びＣから選択され；
ＸdはＡ及びＳから選択される］；
及び
ｉｉ） 上で定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含み得る。上記アミノ酸配列は、上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも８２％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の同一性を有し得る。
【００５３】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、そしてＸdはＡである。
【００５４】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＡである。
【００５５】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、そしてＸdはＳである。
【００５６】
上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＳである。
【００５７】
なおさらなる実施態様において、上で定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３３５〜６６８から選択され、特に配列番号３３５〜４００から、例えば配列番号３５６〜４００から、例えば配列番号３５７〜３５９、配列番号３６１〜３６２、配列番号３６６、配列番号３６９〜３７０、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８〜３７９、配列番号３８７〜３８８及び配列番号３９０から選択される。
【００５８】
特定の実施態様において、上記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、例えばドメインＢ、及びその誘導体である。いくつかの実施態様において、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインはプロテインＺの変異体であり、これはブドウ球菌プロテインＡの上記ドメインＢから誘導される。
【００５９】
従って、さらなる実施態様において：
ｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そして
ＸcはＳ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【００６０】
あるいは：
ｉ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は上で定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そして
ＸcはＡ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上記ｉ）において定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。
【００６１】
上で考察したように、上記のアミノ酸配列と比較して小さな変化を含むポリペプチドもまた本出願の範囲内である。従って、いくつかの実施態様において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載される配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％又は少なくとも９８％同一である配列を有し得る。
【００６２】
いくつかの実施態様において及び以下の実験項において開示されるように、ＨＥＲ３結合モチーフは５８アミノ酸のポリペプチドの一部を形成し得る。このようなポリペプチドは、例えば配列番号６６９〜１００２のいずれか１つから選択される配列、特に配列番号６６９〜７３４から選択される配列、例えば配列番号６９０〜７３４から、例えば配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択される配列を含み得る。
【００６３】
本明細書に記載されるいずれかの局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、又は例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ３に結合し得る。本明細書において使用される用語「ＨＥＲ３結合」及び「ＨＥＲ３に対する結合親和性」は、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるような表面プラズモン共鳴技術の使用により試験され得るポリペプチドの特性を指す。ＨＥＲ３結合親和性は、例えばＨＥＲ３をＢｉａｃｏｒｅ機器のセンサーチップに固定し、そして試験しようとするポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通す実験において試験され得る。あるいは以下の実施例に記載されるように、ＨＥＲ３結合親和性は細胞上（ｏｎ−ｃｅｌｌ）実験で試験され得る。細胞上実験は、例えば様々な濃度の標識されたＨＥＲ３を試験しようとするポリペプチドを提示している細胞とともにインキュベートすることにより行われ得る。その後、細胞集団を蛍光細胞分析分離システム（ＦＡＣＳ）におけるようなフローサイトメーターで分析し得、そして平均蛍光強度データを決定し得る。続いて平均蛍光をＨＥＲ３濃度に対してプロットし、そして見かけの平衡解離定数ＫDを決定するために１部位結合モデルにフィッティングし得る。ＫD測定において使用されるＨＥＲ３又はそのフラグメントは、例えば配列番号１００７で表されるアミノ酸配列（ＨＥＲ３−ＥＣＤ）を含み得る。
【００６４】
以下の実施例において説明されるように、ＨＥＲ３結合変異体の選択は、例えばタンパク質骨格の未処理の変異体の選択のためのファージディスプレイ、続いて場合により親和性成熟ＨＥＲ３結合変異体の選択のための親和性成熟及び細胞ディスプレイにより達成され得る。しかし、ファージベースでも、細胞ベースでもその他でも、いずれの選択システムもＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択に使用され得ることが理解される。以下の実施例において、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）での組み換えタンパク質の細胞表面ディスプレイのための発現系を使用した（Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：９３−１０３（２００９））。しかし、ファージ粒子の大きさを比較して、より大きなサイズの細胞は一般的にハイスループットスクリーニング及び細胞提示タンパク質ライブラリーからの選択のための蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）の使用を可能にする。
【００６５】
ＩｇＧ分子と比較して、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは比較的小さく、これにより、ＨＥＲ３結合ポリペプチドを広範囲の適用において有用にするだけでなく、固相ペプチド合成を使用した製造が可能になり得る。固相合成経路は、例えば分子画像化における放射標識に使用されるキレート剤のような非生物学的基の部位特異的結合を容易にする。
【００６６】
従って、当業者には当然のことながら、様々な修飾及び／又は付加が、本発明の範囲から逸脱することなくポリペプチドを特定の適用に合わせるために、本明細書に開示されるいずれかの局面にしたがってなされ得る。例えば、いずれかの局面に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸を含み得る。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖におけるかなり最初の方及び／又は最後の方の位置に、すなわちＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解されるべきである。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、いずれかの適切な数のさらなるアミノ酸残基、例えば少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基を含み得る。付加的アミノ酸残基はそれぞれ、例えばポリペプチドの製造、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング、又は検出を改善するために、独立して又は集合的に付加され得る。このような付加的アミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例はシステイン残基の付加である。このような付加的アミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えばタグに対して特異的な抗体との相互作用のため、又はＨｉｓ6タグの場合には固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための、Ｈｉｓ6タグ又は「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ又は「ＦＬＡＧ」タグを生じ得る。
【００６７】
上で考察されたさらなるアミノ酸を、化学的連結を用いて（公知の有機化学方法を使用して）、又は融合タンパク質としてのＨＥＲ３結合ポリペプチドの発現のような他の手段を用いてＨＥＲ３結合ポリペプチドにカップリングさせ得る。
【００６８】
上で考察されたさらなるアミノ酸は、例えば１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを含み得る。さらなるポリペプチドドメインは、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに別の機能、例えば別の結合機能、又は酵素的機能、又は毒素機能（例えばイムノトキシン）、又は蛍光シグナル機能、又はその組み合わせを与え得る。
【００６９】
いくつかの実施態様において、さらなるポリペプチドドメインは、インビボでＨＥＲ３結合ポリペプチドの半減期を増加させる半減期延長部分を含み得る。当業者に理解されるように、増加した、又は延長された半減期は、特定の分子の血液からの遅延されたクリアランスを意味する。半減期延長部分は、例えば血清アルブミンへのインビボでの結合を可能にするペプチド又はタンパク質を含み得る。特に、半減期延長部分はアルブミン結合部分であり得る。アルブミン結合部分は、例えば天然に存在するポリペプチド、又はそのアルブミン結合フラグメント、又は改変ポリペプチドからなるものであってもよい。改変ポリペプチドは、新しいか又は増強された特性、例えばアルブミンのような分子に対する結合親和性を付与する目的で、それをタンパク質工学技術、例えば部位特異的又は無作為化されたアプローチでの変異及び変更を受けさせることにより、天然に存在する出発ポリペプチドから誘導され得る。
【００７０】
このような改変アルブミン結合ポリペプチドは、例えばアルブミンに対するその特異的結合親和性について選択された、タンパク質骨格の変異体であってもよい。特定の実施態様において、タンパク質骨格は、連鎖球菌プロテインＧのドメイン又はその誘導体、例えば連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのドメインＧＡ１、ドメインＧＡ２及びドメインＧＡ３、特にドメインＧＡ３から選択され得る。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、さらなるアミノ酸は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、又はその誘導体を含む。本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドにおけるさらなるポリペプチドドメインとして含まれ得るアルブミン結合ドメインの一例は、配列番号１００５で示される。適切なアルブミン結合ドメインの他の例はＷＯ２００９／０１６０４３に開示される。このようなＡＢＤ延長ポリペプチドはインビボで血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から利益を得、これによりポリペプチド自体の正味の半減期が増加する（例えばＷＯ９１／０１７４３を参照のこと）。
【００７１】
本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドが上で定義されるアルブミン結合部分を含む場合、ＨＥＲ３結合（ｂｉｎｄｎｉｇ）ポリペプチドの全体の大きさは比較的小さい。例えばヒト対象のような哺乳動物対象に投与された場合、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのアルブミン結合部分は、血清アルブミンと非共有結合で結合し、そしてそれによりポリペプチドは減少した腎クリアランス及び上皮細胞での増加した再循環から利益が得られ得る。しかし組織浸透は、血清アルブミンの血管外漏出特性に起因して速いままである。さらに、半減期延長部分を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドは、対応する半減期延長部分の無いポリペプチドと比較して、インビボで延長された半減期を示すだけでなく、インビボで減少した免疫応答を示す（例えばＷＯ２００５／０９７２０２を参照のこと）。
【００７２】
さらなるポリペプチドドメインは、同じ結合機能を有するＨＥＲ３結合ポリペプチドを生じ得る。従って、さらなる実施態様において、そのアミノ酸配列は同じであっても異なっていてもよい少なくとも２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド単量体単位を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドが提供される。ポリペプチドの多量体形態は、それぞれがＨＥＲ３結合モチーフを有し、かつそれぞれが多量体内の「単量体」を形成する、適切な数のドメインを含み得る。これらのドメインは全て同じアミノ酸配列を有していてもよいが、あるいはそれらが異なるアミノ酸配列を有していてもよい。特に、本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドは、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し得る。
【００７３】
上記のさらなるポリペプチドドメイン（単数又は複数）は、公知の有機化学方法を使用して共有結合カップリングによりＨＥＲ３結合ポリペプチドに結合され得る。あるいは、さらなるポリペプチドドメイン（単数又は複数）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドを１つ又はそれ以上の融合ポリペプチドとして、例えばポリペプチドのの組み換え発現のための系において発現させてもよいし、直接的又はリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を介して、いずれかの他のやり方で結合させてもよい。
【００７４】
ＨＥＲ３結合ポリペプチドの一実施態様において、本ポリペプチドは天然に存在するＨＥＲ３リガンドと同じエピトープに結合するか、又はそれに十分に接近して天然に存在するＨＥＲ３リガンド（例えばニューレグリン−１及び２）のＨＥＲ３への結合をブロックする。従ってＨＥＲ３結合ポリペプチドは、ＨＥＲ３遮断薬として、かつ／又はインビボでのＨＥＲ３媒介細胞シグナル伝達を阻害するために使用され得る。
【００７５】
さらなる局面において、上記のＨＥＲ３結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、例えば宿主細胞における発現によりＨＥＲ３結合ポリペプチドの生産を可能にし得る。
【００７６】
ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、様々な医療、獣医学及び診断適用における従来の抗体又は低分子量物質に対する代替として使用され得る。当業者は、本発明のポリペプチドが、試薬のＨＥＲ３に対する親和性を必要とするいずれかの方法において有用であり得るということを理解するだろう。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、このような方法における検出試薬、捕捉試薬又は分離試薬として使用され得る。さらに、ＨＥＲ３結合ポリペプチドは、例えば哺乳動物対象における細胞表面でのＨＥＲ３発現を特徴とする疾患の存在を明らかにし、診断し、そして試験するために診断法において使用され得る。従って、ＨＥＲ３発現は、診断上、本発明のポリペプチドの使用によりインビボでモニタリングされ得る。診断モニタリングは、例えば分子画像化によるＨＥＲ３発現の判断のための診断用核種の送達により達成され得る。本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドはまた、それ自身だけで治療剤若しくは診断剤として、又はＨＥＲ３タンパク質に対する直接的（例えば、イットリウム−９０、ルテチウム−１７７及びトリウム−２２７のような放射性核種、マイタンシノイドのような毒素を含む毒性分子）若しくは間接的（例えばがんワクチン、免疫賦活性分子）な効果を有する他の治療剤若しくは診断剤を標的とするための手段として有用であり得る。治療効果は、受容体相互作用をブロックすることにより、あるいは腫瘍細胞へ有効なペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を送達するための標的としてＨＥＲ３結合ポリペプチドを使用することにより、潜在的に媒介され得る。
【００７７】
さらなる局面において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＨＥＲ２結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する結合親和性を有するリガンドが提供される。このようなリガンドは、２つの異なる結合機能を含む二重特異性ヘテロ二量体の例として解釈されるべきであり：１つは上で開示されるポリペプチドによりもたらされるＨＥＲ３に対する結合機能であり、そして１つはＨＥＲ２結合ポリペプチドによりもたらされるＨＥＲ２に対する結合機能である。当然のことながら、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、リガンド中に含まれ得る。２つの結合機能は、２つの別々の単量体単位としてリガンドに含まれる。
【００７８】
このような本発明に従う二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の両方が関与するがんの検出、特徴付け及び／又は診断において有用であり得る。検出、特徴付け及び／又は診断は、例えばガンマ線若しくは陽電子放出核種を使用する分子画像により、又は近赤外蛍光プローブを使用することにより達成され得る。上記のように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２についての好ましいヘテロ二量化パートナーであり、そしてＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする腫瘍の増殖を促進するために重要である。ＨＥＲ２は公知のリガンドがなく、リガンド誘導シグナル伝達に関してＨＥＲファミリーの他の受容体に依存すると現在では考えられている。しかし本発明に従う二重特異性リガンドは、診断のためだけでなく、標的化治療ペイロード適用にも使用され得る。ペイロード適用において使用される化合物としては、とりわけ、放射性核種、プロドラッグ酵素、サイトカイン、化学毒性分子、毒素及び光増感剤が挙げられる。標的化ペイロード適用については、正常組織と疾患組織との間の高度な識別が非常に重要である。
【００７９】
２つの異なる受容体に結合する二重特異性リガンドに含まれる両方の結合ポリペプチドの親和性を微調整することにより、リガンドは両方の受容体を同時に発現している病変にのみ優先的に位置し、そして蓄積し得る。従って、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３結合機能は、それらの個々の標的に対して２つの同等に強力な結合機能を有するリガンドをもたらし得る。従って、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのＨＥＲ３に対する結合親和性は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合親和性とほぼ同位であり得る。一実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ２に結合し得る。別の実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合は、対応するＨＥＲ３結合ポリペプチドのＨＥＲ３に対する結合と同程度に強力であるかより強力であり得る。従って、ＨＥＲ２結合ポリペプチドとＨＥＲ２との間の相互作用のＫD値は、多くてＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ３との間の相互作用のＫD値である。ＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ３との間の相互作用のＫD値は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドとＨＥＲ２との間の相互作用のＫD値の例えば５倍、１０倍又は１００倍であり得る。
【００８０】
一実施態様において、二重特異性リガンドのＨＥＲ２結合ポリペプチドは改変ポリペプチドである。ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２に対するその特異的結合親和性について選択された、タンパク質骨格の変異体である改変ポリペプチドであり得る。タンパク質骨格の非限定的な例は、ブドウ球菌プロテインＡ、並びにそのドメイン及び誘導体からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのドメインＢから誘導された改変タンパク質である。この改変タンパク質は、特にプロテインＺ誘導体を含んでいてもよく、これは上記プロテインＡのドメインＢから誘導されたプロテインＺの変異体である。
【００８１】
リガンドのいくつかの実施態様において、改変ＨＥＲ２結合タンパク質は、
ｉ） 配列番号１００３に対応する、
ＹＡＫＥＭ ＲＮＡＹＷ ＥＩＡＬＬ ＰＮＬＴＮ ＱＱＫＲＡ ＦＩＲＫＬ ＹＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
例えば１から４５個までのアミノ酸を含むペプチドリンカーによりＨＥＲ３結合ポリペプチド及びＨＥＲ２結合ポリペプチドが連結され得る。連結部分は特にＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端のカップリングのために配置され得る。このようにして生じる連結は、Ｃ末端とＣ末端との連結、Ｃ末端とＮ末端との連結又はＮ末端とＣ末端の連結から選択され得る。連結部分のＨＥＲ３結合ポリペプチド及びＨＥＲ２結合ポリペプチドへのカップリングは、例えば化学的結合（公知の有機化学方法を使用する）を用いて、又は融合タンパク質としてのリガンドの発現のようないずれかの他の手段により達成され得る。
【００８３】
リガンドは、上記のように、インビボでのリガンドの半減期を延長するための半減期延長部分をさらに含み得る。半減期の延長は、多数の種々の半減期延長部分により達成され得、そしてこのような部分の非限定的な例は、アルブミン、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに関連して上で定義されたようなアルブミン結合部分、ＩｇＧからのＦｃ部分、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー化合物から選択される。哺乳動物血清において最も豊富なタンパク質である血清アルブミンへのリガンドのカップリングは、インビボでのリガンドの半減期の延長をもたらし得る。
【００８４】
特に、アルブミン結合部分は、
ｉ） 配列番号１００５で示される、
ＬＡＥＡＫ ＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹ ＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩ ＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥ ＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬ Ｐ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン結合部分のような、連鎖球菌プロテインＧのドメインＧＡ３から誘導された改変タンパク質であり得る。
【００８５】
半減期延長部分は、例えば公知の有機化学方法を使用して共有結合カップリングによりリガンドの残部に接続されても、他のやり方で直接、又は多数のアミノ酸を含むリンカーを介して結合されてもよい。半減期延長部分がアルブミン又はアルブミン結合部分により表される場合、リガンドはそれ自体１つ又はそれ以上の融合ポリペプチドとしてポリペプチドの組み換え発現のための系において発現されてもよい。一実施態様において、半減期延長部分は、リガンドに存在するシステイン残基を介してリガンドの残部に結合する。特に、半減期延長部分は、結合モチーフから離れた部位に導入された、ＨＥＲ３又はＨＥＲ２結合ポリペプチドのシステイン残基に結合され得る。別の実施態様において、半減期延長部分は連結部分を介してリガンドの残部に結合する。
【００８６】
特定の実施態様において、連結部分は上で定義された半減期延長部分を含む。従って、アルブミン、アルブミン結合部分又はＰＥＧは例えばＨＥＲ３結合ポリペプチドをＨＥＲ２結合ポリペプチドに接続するために使用され得る。
【００８７】
いくつかの実施態様において、本発明に従うリガンドは、さらなるＣ末端又はＮ末端アミノ酸を含み得る。このようなさらなるアミノ酸は、ＨＥＲ３結合ポリペプチドに関して上で記載したように、例えばポリペプチドの生産、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善するために、個別に、又は集合的に付加され得る。特定の実施態様において、さらなるアミノ酸は１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを構成し得る。このようなさらなるポリペプチドドメインの機能は、既にリガンドに含まれている機能と同じであっても異なっていてもよい。さらなるポリペプチドドメインは、例えば別のＨＥＲ３結合機能及び／又は別のＨＥＲ２結合機能を有するリガンドを生じ得る。従って、本発明に従う二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３結合機能の多量体及び／又はＨＥＲ２結合機能の多量体を含み得る。多量体結合機能を含む二重特異性リガンドの一例は、２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド及び２つのＨＥＲ２結合ポリペプチドを含むリガンドである。
【００８８】
上で定義されたリガンドは、一実施態様において、インビボでのＨＥＲ２及びＨＥＲ３の二量化を防止し得る。より詳細には、リガンドは、例えば哺乳動物対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３に結合することにより、対象におけるＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害し得る。リガンドの二重特異性に起因して、これは、それらがもはやシグナル伝達を行うことができないような位置において２つの受容体に結合してブロックし得る。当業者には当然のことながら、従って本発明のリガンドは、細胞表面上のＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３の発現、特に過剰発現に関連する状態の処置のために利用され得る。
【００８９】
しかしＨＥＲ３はＥＧＦＲともヘテロ二量体を形成し得、それ故ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化する活性シグナル伝達単位を形成する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０２（１０）：３７８８−９３（２００５））。実際、ＨＥＲ３は、明らかにＥｒｂＢリガンドの上方調節のために非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において過剰発現されるが（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（２４）：１１４７８−８５（２００５））、一方でＨＥＲ３は正常肺上皮で発現されない。従って、関連する局面において、上で定義されたＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＥＧＦＲ結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＥＧＦＲ結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する結合親和性を有するリガンドが提供される。当然のことながら、本発明の上記の局面において記載される特徴は、本発明のこの局面にも適用可能である。特に、このような二重特異性リガンドは、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲを標的にし得、そしてＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する二重特異性リガンド結合に関して上で記載した作用様式と類似しているか又は同じ作用様式で作用する。ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性リガンド結合の例は、
ｉ） 配列番号１００４に相当する、
ＹＡＫＥＭ ＷＩＡＷＥ ＥＩＲＮＬ ＰＮＬＮＧ ＷＱＭＴＡ ＦＩＡＫＬ ＬＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるＥＧＦＲ結合ポリペプチドを含み得る。
【００９０】
ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ結合リガンドにおいて使用され得るＥＧＦＲ結合ポリペプチドの他の例はＷＯ２００７／０６５６３５に開示される。
【００９１】
他の実施態様において、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド又は二重特異性リガンドは、治療剤又は診断剤に、インビボ及びインビトロの両方で、ＨＥＲ３を発現する細胞、特にＨＥＲ３を過剰発現する細胞を標的にさせる際に使用される。上で考察したように、本発明のリガンドは、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ２、又はＨＥＲ３及び／若しくはＥＧＦＲを発現するか又は過剰発現する細胞を標的にする際に利用され得る。従って関連する局面において、本明細書において定義されるＨＥＲ３結合ポリペプチド、又は上で定義されるリガンド、及び治療剤の組み合わせが提供される。治療剤の非限定的な例は、細胞傷害性ペイロード、例えば放射性核種、低分子量薬物又は毒素から選択される。このような治療剤は、化学的に結合されるか、そうでなければＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドに結合される。
【００９２】
本発明に従う組み合わせ、ＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドはさらに、治療における、例えばＨＥＲ３関連状態、例えばがん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される、哺乳動物（例えばヒト対象）におけるＨＥＲ３関連状態の処置のための、医薬として使用され得る。従って、ＨＥＲ３関連状態、例えば上述のＨＥＲ３関連状態の処置のための医薬の製造のための本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドの使用もまた、本発明の範囲内である。
【００９３】
関連する局面において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、又は上記のリガンド若しくは組み合わせを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ＨＥＲ３関連状態の処置方法が提供される。結果として、本処置方法において、対象は、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせで処置される。この方法のより特定の実施態様において、ＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせの、対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ３に対する結合は、受容体活性化を阻害する。この結合は、例えばＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害し得る。本処置方法の一実施態様において、上記ＨＥＲ３関連状態は、がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される。
【００９４】
別の実施態様において、本発明のリガンドを、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２関連状態の処置方法が提供される。
【００９５】
当業者に理解されるように、そして上で考察したように、本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチド又はリガンドは、ＨＥＲ３又はＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ２関連状態の診断のような診断において使用され得る。本発明に従うＨＥＲ３結合ポリペプチドは、診断剤と別々に使用されても組み合わせて使用されてもよい。このような組み合わせは、ＨＥＲ３関連状態の診断において、例えばＨＥＲ３を過剰発現する細胞の分子画像化において使用され得る。
【００９６】
本発明はここで以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１−１】本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドに含まれるＨＥＲ３結合モチーフの例（配列番号１〜３３４）、本発明に従う４９量体ＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号３３５〜６６８）及び本発明に従う５８量体ＨＥＲ３結合ポリペプチドの例（配列番号６６９〜１００２）、本発明に従うリガンドに含まれるＨＥＲ２結合ポリペプチドの例（配列番号１００３）、本発明のリガンドの一実施態様において含まれ得るようなアルブミン結合部分の例（配列番号１００５）、本発明に従うリガンドの一実施態様において含まれ得るＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１００４）のアミノ酸配列表、さらにはプロテインＺの配列（配列番号１００６）、並びにＨＥＲ３の細胞外ドメイン（配列番号１００７）、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（配列番号１００８）及びＨＥＲ４の細胞外ドメイン（配列番号１００９）の配列の表である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図１−５】図１−４の続きである。
【図１−６】図１−５の続きである。
【図１−７】図１−６の続きである。
【図１−８】図１−７の続きである。
【図１−９】図１−８の続きである。
【図１−１０】図１−９の続きである。
【図１−１１】図１−１０の続きである。
【図１−１２】図１−１１の続きである。
【図１−１３】図１−１２の続きである。
【図１−１４】図１−１３の続きである。
【図１−１５】図１−１４の続きである。
【図１−１６】図１−１５の続きである。
【図１−１７】図１−１６の続きである。
【図１−１８】図１−１７の続きである。
【図１−１９】図１−１８の続きである。
【図１−２０】図１−１９の続きである。
【図１−２１】図１−２０の続きである。
【図１−２２】図１−２１の続きである。
【図１−２３】図１−２２の続きである。
【図１−２４】図１−２３の続きである。
【図１−２５】図１−２４の続きである。
【図１−２６】図１−２５の続きである。
【図１−２７】図１−２６の続きである。
【図１−２８】図１−２７の続きである。
【図１−２９】図１−２８の続きである。
【図１−３０】図１−２９の続きである。
【図１−３１】図１−３０の続きである。
【図１−３２】図１−３１の続きである。
【図１−３３】図１−３２の続きである。
【図１−３４】図１−３３の続きである。
【図１−３５】図１−３５の続きである。
【図１−３６】図１−３５の続きである。
【図１−３７】図１−３６の続きである。
【図１−３８】図１−３７の続きである。
【図１−３９】図１−３８の続きである。
【図１−４０】図１−３９の続きである。
【図１−４１】図１−４０の続きである。
【図１−４２】図１−４１の続きである。
【図２】ＨＳＡ結合ドメインＡＢＤへの融合として発現された個々のＨＥＲ３結合Ｚ変異体からの周辺質フラクションを使用して行われたドットブロットアッセイの結果を示す。２１のコントロールタンパク質に対する潜在的バックグラウンド結合、さらにはＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃへの結合を分析した。タンパク質をメンブレン上に３列で以下の順序にてドットを打った； 列１： ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、アルファ−２マクログロブリン、フィブリノゲン、ホロ−トランスフェリン、アルファ−１−抗トリプシン、 列２：Ｃ３、ハプトグロブリン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、アルファ−１酸性糖タンパク質、アルファ−１抗キモトリプシン、Ｃ４、マウスＩｇＥカッパ、ヘモペキシン、トランスサイレチン、 列３：ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ３−Ｆｃ、ＨＥＲ４−Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−ＥＣＤ。 画像は、Ａ） Ｚ０１７４８、Ｂ） Ｚ０１８１３、Ｃ） Ｚ０１８１４、Ｄ） Ｚ０１８１５、Ｅ） Ｚ０２００９、Ｆ） Ｚ０１８２１、Ｇ） Ｚ０２０１０、Ｈ） Ｚ０１８２４、Ｉ） Ｚ０１８２５、Ｊ） Ｚ０１８１７、Ｋ） Ｚ０１８１８、Ｌ） Ｚ０１８２０、Ｍ） Ｚ０１８２６、Ｎ） Ｚ０１８２８、Ｏ） Ｚ０２０１１、Ｐ） Ｚ０１８３０、及びＱ）ネガティブコントロールとしての、ＡＢＤのみを発現するｐＡＹ０１２４７からの生成物を示す。
【図３】実施例２に記載される免疫蛍光実験からの画像を示す。ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６６細胞（Ａ〜Ｄ）並びにＨＥＲ２ポジティブ及びＨＥＲ３ネガティブのＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ〜Ｆ）をＨＥＲ３特異的Ｚ変異体又は以下に従うコントロールで染色した：Ａ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−ｃｙｓ、Ｂ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−ｃｙｓ、Ｃ） 抗ＨＥＲ３抗体（ポジティブコントロール）、Ｄ）（Ｚ０１１５４）2（ネガティブコントロールＺ変異体）、Ｅ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−ｃｙｓ、Ｆ） Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−ｃｙｓ。
【図４】Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）（Ｂ）の表面での本発明のＨＥＲ３結合ポリペプチドの細胞ディスプレイのために使用したブドウ球菌ディスプレイベクターの略図である。ベクターｐＳＣＺ１（Ａ）は：ｉ）リパーゼ遺伝子（関連するスタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）の表面で発現される）からのプロモーター及び分泌シグナル（Ｓ）、ｉｉ） 同じリパーゼ遺伝子からのプロペプチド（ＰＰ）をコードする遺伝子フラグメント、（組み換えタンパク質の効率的な転座に重要であることが実証されている）、ｉｉｉ）細胞壁固定領域（ＸＭ）、（ブドウ球菌プロテインＡ由来）、ｉｖ）標的結合シグナルの表面発現レベル正規化をもたらすために導入されるブドウ球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ、Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７（６）：１４７０−１４７６、（１９９５））、ｖ） ブドウ球菌における安定した複製及び発現のためのブドウ球菌複製起点及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｃｍｌr）、並びにｖｉ）Ｅ．ｃｏｌｉでのサブクローニング作業を容易にする、Ｅ．ｃｏｌｉのための複製起点（ＯｒｉＥ）さらにはβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｂｌａ）を含む。
【図５】Ｓｃ：ＺHER3LIBのフローサイトメトリー分離からの結果として密度プロットを示す。これらのプロットは、ｘ軸に表面発現レベルに対応するＦＬ−４チャネル蛍光強度（ＨＳＡ結合によりモニタリング）、及びｙ軸にＨＥＲ３結合に対応するＦＬ−１チャネル蛍光を示す。密度プロットは、各プロットにおいて四角で輪郭を描いたゲーティングにおいて使用された領域と共に、それぞれ１、２、３及び４回目のフローサイトメトリー分離前のブドウ球菌ライブラリーを示す。
【図６−１】細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイのヒストグラム図を示し、ここではアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）への融合でＺ変異体を提示するＦＡＣＳで単離した細胞を、蛍光標識したＨＥＲ３−Ｆｃ及び蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。ＨＥＲ３結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−１）とＨＳＡ結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−４）との比率がｙ軸にある。全てのＦＬ−１／ＦＬ−４比は；Ａ） Ｚ０５４０５のＦＬ−１／ＦＬ−４比、及びＢ〜Ｄ） 第一世代バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）（Ｚ０１７５３）のＦＬ−１／ＦＬ−４比を用いて正規化される。４５の個々のクローンを４つの別々のアッセイ（Ａ〜Ｄ）において分析し、ここでＺ０５４０５及びＺ０５４０９を比較のために全てのアッセイに含めた。Ａ）はＺ０５４０３〜Ｚ０５４１５の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｂ）はＺ０５４１６〜Ｚ０５４２６細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｃ）はＺ０５４２７〜Ｚ０５４３４の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、そしてＤ）はＺ０５４３５〜Ｚ０５４４７の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示す。
【図６−２】細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイのヒストグラム図を示し、ここではアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）への融合でＺ変異体を提示するＦＡＣＳで単離した細胞を、蛍光標識したＨＥＲ３−Ｆｃ及び蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。ＨＥＲ３結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−１）とＨＳＡ結合シグナル（ＭＦＩ、ＦＬ−４）との比率がｙ軸にある。全てのＦＬ−１／ＦＬ−４比は；Ａ） Ｚ０５４０５のＦＬ−１／ＦＬ−４比、及びＢ〜Ｄ） 第一世代バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）（Ｚ０１７５３）のＦＬ−１／ＦＬ−４比を用いて正規化される。４５の個々のクローンを４つの別々のアッセイ（Ａ〜Ｄ）において分析し、ここでＺ０５４０５及びＺ０５４０９を比較のために全てのアッセイに含めた。Ａ）はＺ０５４０３〜Ｚ０５４１５の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｂ）はＺ０５４１６〜Ｚ０５４２６細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、Ｃ）はＺ０５４２７〜Ｚ０５４３４の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示し、そしてＤ）はＺ０５４３５〜Ｚ０５４４７の細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ結果を示す。
【図７Ａ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｂ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｃ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図７Ｄ】４つの異なる濃度での４つの異なるＺ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動力学的分析からのセンサーグラムを示す。各センサーグラムにおける一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ変異体に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は３番目に高い濃度に対応するなどである。４６、１５、１．５及び１．５ｎＭの濃度のＺ変異体Ｚ０５４０５（Ａ）、５７、１９、６．３及び１．９ｎＭの濃度のＺ０５４１３（Ｂ）、６７、２２、７．５及び２．２ｎＭの濃度のＺ０５４１６（Ｃ）、並びに５９、２０、６．５及び２ｎＭの濃度のＺ０５４１７（Ｄ）を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定した表面上に注入し、そしてｋon及びｋoffに基づいて解離定数を決定した。
【図８Ａ】Ｚ０５４１７のヘレグリンとのＳＰＲ競合分析からのセンサーグラムを示す。Ａ）はヒトヘレグリンを固定した表面上での、単独及び４０倍モル濃度過剰のＺ０５４１７と共にプレインキュベートした、ＨＥＲ３−Ｆｃの注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｂ）は、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定化した表面上でのヘレグリンとのＺ０５４１７の同時注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｚ０５４１７を、５つの異なる濃度、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ及び０ｎＭで二回注入した。一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ０５４１７に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は三番目に高い濃度に対応するなどである。
【図８Ｂ】Ｚ０５４１７のヘレグリンとのＳＰＲ競合分析からのセンサーグラムを示す。Ａ）はヒトヘレグリンを固定した表面上での、単独及び４０倍モル濃度過剰のＺ０５４１７と共にプレインキュベートした、ＨＥＲ３−Ｆｃの注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｂ）は、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃを固定化した表面上でのヘレグリンとのＺ０５４１７の同時注入から得られたセンサーグラムを示す。Ｚ０５４１７を、５つの異なる濃度、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ及び０ｎＭで二回注入した。一番上の曲線は最も高い濃度の注入されたＺ０５４１７に対応し、上から二番目の曲線は二番目に高い濃度に対応し、上から三番目の曲線は三番目に高い濃度に対応するなどである。
【図９】ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の存在しない場合及び存在下でのＨＥＲ３リン酸化のパーセントに関する図表を示す。ＭＣＦ−７細胞を、Ｚ変異体の存在しない場合（１００％リン酸化、塗りつぶしたバー）、並びにＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の存在下で、並びにネガティブコントロールＺ０１１５５の存在下で（ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体、縞模様のバー）又は培地のみを用いて（白いバー）、５ｎＭヘレグリンで刺激した。この図表は、ヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化（１００％）と比較した、Ｚ変異体又は培地の存在下でのＨＥＲ３リン酸化のパーセントを示す。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択及びスクリーニング
材料及び方法
ＨＥＲ３及びＨＳＡの標識： 組み換えヒトＨＥＲ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３４８−ＲＢ−０５０）（本明細書ではＨＥＲ３−Ｆｃと示される）のビオチン化を、Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸマイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｂ３００１０）を使用して供給業者の推奨にしたがって行った。ＨＥＲ３の細胞外ドメイン（配列番号１００７）（本明細書ではＨＥＲ３−ＥＣＤと示される）を、ＥＺ−ＬｉｎｋTM−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３８）を使用して供給業者の推奨にしたがってビオチン化した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ； Ｓｉｇｍａ、＃Ａ−３７８２）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R) ６４７スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ２０００６）を使用して供給業者の推奨にしたがって蛍光標識した。タンパク質緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）又は過剰のビオチン若しくはフルオロフォアを除去するために０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)Ｆ１０８ ＮＦ界面活性剤（ＰＢＳＰ； ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃３００８５２３１）を補充したＰＢＳに変更した。
ＨＥＲ３結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択： Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２８：１６２−１８３（２００７）に記載されるように、ファージミドｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５において構築されたバクテリオファージで提示されるＺ分子のランダム変異体のライブラリー（Ｚｌｉｂ２００２と示される）を、ＨＥＲ３−ＥＣＤ−結合ポリペプチドの選択のために使用した。ファージミドライブラリーから、さらには選択ラウンドの間に、ファージストックの製造を以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：７７２−７７７（１９９７）； Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：２３７−２５２（１９９９））にしたがってヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃ＮＯ３１５Ｓ）を使用して行った。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アンバー抑圧遺伝子系統ＲＲ１ΔＭ１５（Ｒｕｅｔｈｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：５７６５−５７７２、１９８２）を全てのクローニング手順のために、そしてファージ産生のための宿主として使用した。
【００９９】
ファージ選択を、溶液でビオチン化ＨＥＲ３タンパク質及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R) Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ ＃１１２．０６）を、結合したファージの捕捉のために使用して行った。さらに、ファージ選択を、固相においてＭａｘｉＳｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）に固定化されたＨＥＲ３−ＥＣＤを使用して行った。ファージ粒子の非特異的結合を、全てのチューブ及びビーズをＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１％ゼラチンを補充したＰＢＳ）で予備処理することにより最少にした。選択を４サイクルで行った。全ての選択をＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン中でかつ体積１ｍｌで行った。
【０１００】
溶液で行われた選択については、４サイクルの選択を室温（ＲＴ）にて異なる濃度のビオチン化組み換えＨＥＲ３−ＥＣＤを標的タンパク質として使用して行った。サイクル１及び２で使用したファージストックを、ストレプトアビジン結合ファージを除去するために０．１ｍｇストレプトアビジン被覆ビーズとともに１時間プレインキュベートした。サイクル１において、Ｚｌｉｂ２００２ライブラリーからのファージ粒子を、１００ｎＭのビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤと共にＰＢＳＴ ０．１−ゼラチン中で２時間インキュベートした。それに続く選択サイクルを２つの選択トラックに分割し、そのために標的濃度をサイクル２について５０（トラック１）又は２０ｎＭ（トラック２）まで、サイクル３について２０（トラック１）又は１０ｎＭ（トラック２）まで、そしてサイクル４について２０（トラック１）又は５ｎＭ（トラック２）まで下げた。結合したファージをストレプトアビジン被覆Ｍ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)を用いて捕捉し、ビーズ１ミリグラムあたりＨＥＲ３−ＥＣＤ４μｇを固定化させた。
【０１０１】
固相での選択については、ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅに１ｍｌ ＨＥＲ３−ＥＣＤ（５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔ）緩衝液中１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ ９．６）を１．５時間室温にて固定化させ、その後３ｍｌ ＰＢＳＴ ０．１−ゼラチンを用いて１時間室温にてブロックした。ファージストックをこのチューブに加え、そして２時間インキュベートした。
【０１０２】
両方の選択ストラテジーのために、ＰＢＳＴ ０．１−ゼラチンでの洗浄回数を、選択ストリンジェンシーを高めるためにラウンド間で増やした。従って、洗浄をサイクル１において２回、サイクル２において３回、サイクル３において６回、そしてサイクル４において１２回行った。結合したファージ粒子を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出し、続いてすぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。ファージ含有溶出液を対数期ＲＲ１ΔＭ１５細胞に感染させるために使用し、そしてファージミド粒子を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を使用して感染した細胞からレスキューした。選択過程を、各選択ラウンドの前及び標的タンパク質からの溶出後にファージストックの滴定によりモニタリングした。ファージ溶液の段階希釈を、対数期ＲＲ１ΔＭ１５細胞の感染のために使用した。
【０１０３】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング： Ｚ変異体分子が実際にＨＥＲ３と相互作用するかどうかを試験するために、２つの異なるＥＬＩＳＡを行い、一方は標的タンパク質としてビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを使用し、そして２つ目はＨＥＲ３−Ｆｃを使用した。上で記載したように製造された単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充した１ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地（３０ｇ／ｌ ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母抽出物）中でディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＃２７８７５２）において播種することによりＺ変異体を生成した。ネガティブコントロールとして、インスリン結合Ｚ変異体（Ｚ００８０１）を播種し、そして各プレートにおいて増殖させた。これらのプレートを１８〜２４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に、−２０℃での貯蔵のために１５％グリセロールを含む９６ウェルプレートに各培養物を少量移すことにより複製のプレートを作製した。残りの細胞を遠心分離によりペレット化し、３００μｌ ＰＢＳＴ ０．０５（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したＰＢＳ）中に再懸濁し、そして細胞の周辺質部分を放出させるために−８０℃で凍結した。凍結したサンプルを水浴で解凍し、そして細胞を遠心分離によりペレット化した。周辺質上清は、連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのＧＡ３からのアルブミン結合ドメインへの融合物としてのＺ変異体（ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧとして表される）を含有していた（Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ、前出）。Ｚ＃＃＃＃＃は個々のＺ変異体を指す。
【０１０４】
ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、６μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３７８２）を含有する５０μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で被覆し、そして終夜（ＯＮ）インキュベートした。ＨＳＡ溶液を捨てて、２％脱脂粉乳溶液（Ｓｅｍｐｅｒ ＡＢ）を補充したＰＢＳＴ ０．１ １００μｌを用いてウェルを１時間室温にてブロックした。ブロッキング溶液を廃棄し、そして周辺質溶液５０μｌを各ウェルに加え、そして１．５時間室温でゆっくりと震盪しながらインキュベートした。上清を捨てて、ウェルをＰＢＳＴ ０．０５で４回洗浄した。ＰＢＳＴ ０．０５中０．５μｇ／ｍｌの濃度のＨＥＲ３−Ｆｃ ５０μｌ又はＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを各ウェルに加えた。プレートを１．５時間室温でインキュベートし、続いてＰＢＳＴ ０．０５で４回洗浄した。ＨＥＲ３−Ｆｃプレートにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されＰＢＳＴ０．０５で１：４０００に希釈されたヒトＦｃに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、＃Ｐ０２１４）をウェルに加え、そして１時間室温でインキュベートした。ビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤを含むプレートにおいて、ＨＲＰと結合したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ、＃Ｐ０３９７）を各ウェルに加えてＰＢＳＴ ０．０５で１：５０００に希釈した。上で記載したように洗浄した後、５０μｌ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０２１）をウェルに加え、そしてプレートを製造者の推奨に従って処理した。ブロッキングから読み取りまでの全ての工程を、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｆｒｅｅｄｏｍ ２００ロボット（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＬＴＤ）で行った。ウェルの吸光度を４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ ３８４（Ｔｅｃａｎ）で読み取り、そしてＭａｇｅｌｌａｎ ｖ．５．０ソフトウェア（Ｔｅｃａｎ）を用いて評価した。
【０１０５】
配列決定： ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、陽性と考えられる全てのクローンの一部を配列決定のために選別した。ＰＣＲフラグメントを、標準的なＰＣＲプログラム並びにプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ）及びＡＦＦＩ−２２（５'−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ）を使用して単一コロニーから増幅した。増幅されたフラグメントの配列決定を、製造者のプロトコルに従って使用されるビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５'−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ）及びＢｉｇＤｙｅ(R)ターミネーターｖ３．１サイクルシークエンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。配列決定反応混合物を、磁気ストレプトアビジン被覆ビーズへの結合により、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して精製し、そしてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(R)３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。配列決定結果をインポートし、そしてＡＬＤ ＬＩＭＳ ＮａｕｔｉｌｕｓTM ２００３ Ｒ２ Ｂ３ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて分析した。
【０１０６】
ドットブロット分析： 生成されたＨＥＲ３結合Ｚ変異体を、特異性についてドットブロット分析によりアルファ−２マクログロブリン（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ／Ｃａｐｐｅｌ、＃５５８３３）、アルファ−１酸性糖タンパク質（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５３−１）、アルファ−１抗キモトリプシン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５９−０）、アルファ−１−抗トリプシン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１６５−５）、補体Ｃ３（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５０−０）、補体Ｃ４（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１５１−０）、フィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃０３１０１５Ｅ）、ハプトグロブリン（ＲＤＩ、＃ＲＤＩ−ＳＣＰ−１１９−１）、ヘモペキシン（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ホロ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ０６６５）、ヒトＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ、＃Ｐ８０−１０２）、マウスＩｇＥカッパ（ＢＤ、＃５５０７９）、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ４３８６）、ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｉ８２６０）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ、＃Ａ３７８２）、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３１０００）、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１１２２）、トランスサイレチン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ１７４２）、ＨＥＲ２−ＥＣＤ（配列番号１００８）、ＨＥＲ３−ＥＣＤ（配列番号１００７）、ＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＥＲ４−ＥＣＤ（配列番号１００９）、ＨＥＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して試験した。
【０１０７】
可溶性タンパク質を含有する周辺質上清を得るために、Ｚ変異体をＥＬＩＳＡスクリーニングで記載された方法と本質的に同じ方法で製造した。上清を０．４５μｍメンブレンを使用してろ過した。
【０１０８】
ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各タンパク質１μｌを、それぞれ０．２９ｍｇ／ｍｌ及び０．１４ｍｇ／ｍｌの濃度を有していたＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−ＥＣＤを除いて０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いてドットを打った。これらのメンブレンを０．５％カゼイン（ブロッキング液）を補充したＰＢＳＴ０．１中で終夜４℃でブロックした。溶液を除去した後、これらのメンブレンを１時間、０．５％カゼインを補充した周辺質上清と共にインキュベートした。これらのメンブレンをＰＢＳＴ ０．１中で非常に短く３回、そして４×５分洗浄した。Ｚ変異体を、ＰＢＳＴブロッキング液中で１：５０００に希釈された全てのＺ変異体（社内で製造）に共通のエピトープに対するＡＢＤ融合超免疫ポリクローナルウサギＩｇを用いて１時間室温でインキュベートすることにより検出した。上記のように洗浄した後、ブロッキング溶液で１：５０００希釈された、ＨＲＰと複合体化されたウサギＩｇＧに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、＃Ｐ０４４８）をメンブレンに加え、続いてこれらのメンブレンを１時間室温でインキュベートした。メンブレンを洗浄し、ＰＢＳですすぎ、そしてＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０７５）と共に浸漬した。発光をＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ ５５００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いて撮影した。
【０１０９】
Ｚ変異体のサブクローニング： 二量体Ｚ変異体をｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５ベクターから増幅した。異なるプライマー対を使用してＰＣＲを行い、そして得られた遺伝子フラグメントを精製し、そしてリガーゼ緩衝液中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした遺伝子フラグメントをｐＡＹ００４３０ベクターでサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓ6タグ及びＣ末端システインを生じた（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓ）。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体をダイマーとしてサブクローニングし、そして発現ベクターによりコードされる構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＣであった。３つの部分のライゲーションを、両方の挿入フラグメントをベクター中に同じ工程で挿入するために使用した。ハイブリダイズした遺伝子フラグメント及びＡｃｃＩ−消化して脱リン酸化した発現ベクターをリガーゼ緩衝液中で連結し、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞中にエレクトロポレーション処理した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）血液寒天基礎培地）上に広げ、続いて３７℃で終夜インキュベートした。コロニーをＰＣＲを使用してスクリーニングし、そしてＰＣＲフラグメントの長さをアガロースゲルで確認した。配列を確認するために、上記のように配列決定を行った。プラスミドＤＮＡストックを配列決定したクローンから調製し、そして−８０℃に置いた。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をエレクトロポレーションによりプラスミドを用いて形質転換した。
【０１１０】
結果
ＨＥＲ３結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択： ４ラウンドのファージディスプレイ選択を、ビオチン化又は非ビオチン化ヒトＨＥＲ３−ＥＣＤに対して行った。４回の選択サイクルを、２つの異なる標的濃度でビオチン化標的を含む溶液で、又は非ビオチン化標的を含む固相で行った。溶液では、ファージ粒子標的複合体がストレプトアビジン被覆ビーズに捕捉された。各選択サイクルについて、洗浄回数を増やした。ファージ粒子力価及び収率を、各選択サイクル後に計算した。ファージ粒子収率（選択された（ｏｕｔ）ファージ粒子／導入した（ｉｎ）ファージ粒子）は、３回目又は最後のサイクルで増加し、標的結合クローンの濃縮を示していた。
【０１１１】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング： ４サイクルの選択後に得られたクローンを９６ウェルプレートで作製し、そしてＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃ−結合活性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。各選択トラックから合計で９３のクローンをスクリーニングした。吸光度測定は、選択方法と無関係に、約９０％のクローンがＨＥＲ３に対して陽性（ネガティブコントロールのシグナルの２倍の応答として定義される）であることを示した。インスリンに結合するＺ変異体分子を、ネガティブ及びポジティブコントロール実験において使用した。ポジティブコントロールをビオチン化インスリンを用いて検出し、そしてネガティブコントロールについては標的タンパク質を除いた。
【０１１２】
配列決定： ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてＨＥＲ３−Ｆｃに対して様々な（ｖａｒｉｙｉｎｇ）シグナル吸光度値を有することに基づいて選択されたクローンについて配列決定を行い、従って配列決定のための多くの異なる代表的なバインダーを得た。合計で１３５のＨＥＲ３ポジティブクローンを配列決定した。クローンの半分は合計２３の新しいクローンを生じるいくつかのコピーにおいて見出され、それらのうち２つはバックグラウンドバインダーと同一であった。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を付与し、そして個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８量体Ｚ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号６６９〜６８９として載せる。これらのＺ変異体の推定ＨＥＲ３結合モチーフを図１及び配列表に配列番号１〜２１として載せる。これらの各Ｚ変異体内で完全３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９量体ポリペプチドのアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号３３５〜３５５として載せる。
【０１１３】
ドットブロット分析： 配列決定された独特なＨＥＲ３結合ポリペプチド（ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧの形態）のうち１６の特異性をドットブロット分析を使用して試験した。２３の異なるタンパク質をニトロセルロースメンブレン上にブロットした。これらの２３のタンパク質には、１６の高度に豊富なヒト血清タンパク質、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃ並びにＨＥＲ４−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−Ｆｃが含まれていた。Ｚ０１８２４以外の全てのＺ変異体融合タンパク質はＨＳＡと同様にＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−Ｆｃに特異的に結合した。従って、試験したＺ変異体の特異性は十分なものであった（図２）。
【０１１４】
Ｚ変異体のサブクローニング： １６の独特なクローンを二量体として発現ベクターｐＡＹ００４３０８でサブクローニングするために選択した。クローニングは、１５の二量体のＨＥＲ３結合Ｚ変異体を生じた（Ｚ０１７４８、Ｚ０１７４９、Ｚ０１７５１、Ｚ０１７５３、Ｚ０１８１４、Ｚ０１８１５、Ｚ０１８１７、Ｚ０１８２０、Ｚ０１８２１、Ｚ０１８２６、Ｚ０１８２８、Ｚ０１８３０、Ｚ０２００９、Ｚ０２０１０及びＺ０２０１１の二量体）。
【０１１５】
実施例２： Ｚ変異体の産生及び特徴付け
材料及び方法
タンパク質発現及び精製：実施例１においてサブクローニングした形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物を、ＴＳＢ−ＹＥで約１の光学密度まで増殖させた。次いで１Ｍ ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えることによりタンパク質発現を誘導した。培養物を誘導の５時間後に遠心分離により採取した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを集めて−２０℃で貯蔵した。
【０１１６】
ＨＥＲ３結合Ｚ変異体を、１．５ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で変性条件下で細胞ペレットから精製し、そしてバッファーをＰＢＳに交換してＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。精製したＺ変異体をアリコートに分けて−８０℃で貯蔵した。
【０１１７】
タンパク質特徴付け： 精製されたＺ変異体（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓ形態）の濃度を２８０ｎｍにおける吸光度測定により決定した。純度を１０ウェル４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥTMゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でクマシーブルー染色を使用して見積もった。精製したＺ変異体のアイデンティティを確認し、分子量を決定するために、ＬＣ／ＭＳ分析をＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ／ＭＳＤシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。
【０１１８】
ＣＤ分析： 精製したＺ変異体を解凍し、そしてＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。それぞれの希釈したＺ変異体について、２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを２０℃で得た。さらに、温度可変測定（ＶＴＭ）を、融点（Ｔｍ）を決定するために行った。ＶＴＭにおいて、５℃／分の温度勾配で温度を２０から９０℃に上げながら吸光度を２２０ｎｍで測定した。ＣＤ測定を、光路長１ｍｍを有するセルを使用してＪａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ）で行った。
【０１１９】
蛍光免疫染色： ＨＥＲ３ポジティブヒト乳腺細胞株ＡＵ５６５（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−２３５１）及びＨＥＲ３ネガティブヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３（Ｅｃａｃｃ、＃９１０９１００４）を供給業者に推奨されるように培養した。アッセイ前日に、２５０００個の細胞をマルチウェルスライド（スライドあたり８ウェル、Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＃ＥＲ−２０１−１Ｂ）の各ウェルに加え、そして終夜ＣＯ2インキュベーターで板状形態を呈するように増殖させた。パスツールピペットを用いてスライド上に液滴を加えることによりこれらのスライドをＰＢＳで穏やかに洗浄した。
【０１２０】
２つの実験を行った。１つ目の実験では、ＡＵ５６５細胞を１１の異なるＨＥＲ３特異的Ｚ変異体で染色した；Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７４８）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７４９）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７５１）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１７５３）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１５）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１７）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２８）2−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８３０）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０２０１１）2−Ｃｙｓ。２つ目の実験は、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓを用いて、そして（Ｚ０１１５４）2をネガティブコントロールＺ変異体として用いて行った。染色を、ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５及びＨＥＲ３ネガティブＳＫＯＶ−３細胞を用いてスライド上で行った。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ＨＥＲ３抗体（＃ＡＦ２３４）をポジティブコントロールとして両方の実験に
含めた。
【０１２１】
両方の実験において、Ｚ変異体をＰＢＳ中１５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、そして試薬の全ての希釈はＰＢＳ中で行い、全ての洗浄も同様にした。１時間室温でのインキュベーション後、マルチウェルスライドを上記のように穏やかに洗浄し、そしてヤギ抗Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子Ｉｇ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ、＃２０．１０００．０１．０００５）を各ウェルに５μｇ／ｍｌの濃度で加えた。４５分室温でのインキュベーション後、スライドを上記のように穏やかに洗浄し、そして５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ２１４６７）を各ウェルに加えた。さらに４５分のインキュベーション後、スライドを穏やかに洗浄した。ポジティブコントロール、ヤギ抗ＨＥＲ３抗体を１５μｇ／ｍｌの濃度で、続いて５μｇ／ｍｌのニワトリ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用した。染色が完了した後、ＰＢＳ中３％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、＃１３６５）中で１０分間室温で固定した。次いでスライドを２回すすぎ、乾燥し、そしてＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジン−２−フェニルインドール、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃Ｈ１２００）を含有する退色防止液を用いて封入した。生体画像化用のビデオカメラを備えたＬＥＩＣＡ ＤＭＬＡ顕微鏡を使用して染色を記録した。
【０１２２】
フローサイトメトリーを使用した細胞上親和性順位付け： Ｚ変異体Ｚ０１７５１、Ｚ０１７５３、Ｚ０１８１４及びＺ０１８２０をコードする全長遺伝子配列を、それらの対応するｐＡＹ００４３０ベクター構築物からＰＣＲ増幅し、そして制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で予め消化したブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１（Ｋｒｏｎｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２１：２４７−２５５（２００８））に結合させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１ΔＭ１５をプラスミド構築及び製造のための宿主として使用し、そして以前に記載されたプロトコル（Ｌｏｅｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０２：７３６−７４７（２００７））に従ってこれらの構築物をエレクトロコンピテントなスタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００（Ｇｏｅｔｚ、Ｓｏｃ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．１９：４９−５３（１９９０））に形質転換した。独立して４つの異なるＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＴＳＢ−ＹＥ １０ｍｌに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。培養物から、１０6個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。これらの細胞を遠心分離（３５００ｘｇ、４℃、６分）によりペレット化し、そして異なる濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃ（５、２０、５０及び１００ｎＭ；ビオチン化については実施例１を参照のこと）を含有するＰＢＳＰ１００μｌ中に再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベーションすることにより平衡結合に達した。細胞を氷冷ＰＢＳＰ １ｍｌで１回洗浄し、続いて氷上で１．２５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８複合体化ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｓ３２３５４）及び２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７複合体化ＨＳＡ（実施例１を参照のこと）を含有する氷冷ＰＢＳＰ １００μｌ中で４０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで１回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析の前に氷冷ＰＢＳＰ３００μｌに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１２３】
結果
タンパク質発現及び精製： １５の二量体Ｚ変異体分子（Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）2−Ｃｙｓの形態）は許容しうる産生レベルの可溶性タンパク質を生じ、そして産生されたバッチの純度は、基準を満たさなかった２つのＺ変異体（Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８２６）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０２００９）2−Ｃｙｓ）を除いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９０％を超えると見積もられた。ＬＣ／ＭＳ分析により、全ての純粋なＺ変異体分子について正確な分子量が確認された。
ＣＤ分析： ＣＤスペクトルは、Ｚ変異体分子がα−ヘリックス構造を２０℃で有していることを示した。この結果は融点（Ｔｍ）を決定した温度可変測定（表１）でも確認された。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
蛍光免疫染色： 蛍光免疫顕微鏡検査法を、ヒトがん細胞において発現される天然ＨＥＲ３に対する特異性及び結合活性の特徴付けのために使用した。実施例１のＥＬＩＳＡにおいてポジティブシグナルを示す１１のクローンを、Ｎ末端Ｈｉｓ6−タグ及びＣ末端システインに融合された二量体として製造した。各Ｚ変異体をＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５細胞（ヒト乳房乳腺細胞株）でインキュベートした。抗ＨＥＲ３抗体をポジティブコントロールとして使用した。染色手順の後に細胞を固定した。１１のバインダーのうち、６つは膜結合染色パターンを生じた。バックグラウンドはいくつかのＺ変異体について高く、そしていくつかの場合にはそれらが特異的であるか否かを判別することが困難であった。２つのＨＥＲ３特異的分子、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８１４）2−Ｃｙｓ及びＨｉｓ6−（Ｚ０１８２０）2−Ｃｙｓを、ＨＥＲ３ポジティブＡＵ５６５細胞並びにＨＥＲ２ポジティブ及びＨＥＲ３ネガティブＳＫＯＶ−３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）の両方に対するさらなる分析のために選択した。明確な細胞膜染色がＡＵ５６５で得られたがＳＫＯＶ−３細胞では得られず、ＨＥＲ２よりもＨＥＲ３に対するＺ変異体の選択性を示した（図３）。
【０１２６】
フローサイトメトリーを使用した細胞上親和性順位付け： ＨＥＲ３結合分子をさらに特徴付けし、そして細菌細胞での機能発現を確認するために、蛍光免疫染色においてＨＥＲ３に対する特異性を示す４つのＨＥＲ３結合分子を、ブドウ球菌細胞ディスプレイ及びフローサイトメトリーを使用する細胞上親和性順位付け実験のために使用した。４つの変異体の単量体構築物を、その後のブドウ球菌宿主への形質転換のためにブドウ球菌ディスプレイベクターにサブクローニングした。４つのＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞をそれぞれ、５〜１００ｎＭの範囲に及ぶ４つの濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃとともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して細胞を分析し、４つ全ての変異体についてクローン間での相対的親和性において有意な差異はなく、細胞表面上での効果的な発現及びＨＥＲ３への特異的結合が明らかとなった（データは示されていない）。ビオチン化ＨＥＲ２を実験においてネガティブコントロールとして使用して交差特異性は観察されず、実施例１における周辺質上清を用いて行われたドットブロット及びこの実施例における蛍光免疫染色の結果を裏付けた。
【０１２７】
実施例３： ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の成熟ライブラリーの設計及び構築
この実施例において、成熟ライブラリーを構築した。このライブラリーをＨＥＲ３結合ポリペプチドの選択のために使用した。成熟ライブラリーからの選択は通常、増加した親和性を有するバインダーを生じると期待される（Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（８）：４３３９−４８（２００６）。しかしモノヌクレオチド及び縮重コドンを使用する伝統的なオリゴヌクレオチド合成技術は、ブドウ球菌系統がアンバー停止コドンを抑制することができないために設計を制限し得る。この研究において、無作為化二本鎖リンカーをＳｌｏｎｏｍｉｃｓ(R)技術により代わりに生成し、これはその後に構成される二本鎖ＤＮＡのライゲーション及び制限を使用したトリヌクレオチドビルディングブロックの無作為化セットの組み込みを可能にする。
【０１２８】
材料及び方法
ライブラリー設計： ライブラリーは、実施例１及び２に記載されるＨＥＲ３結合Ｚ変異体の配列に基づくものであった。新しいライブラリーにおいて、Ｚ分子骨格における１３の可変位置は、配列番号１〜２１において定義されるＺ変異体配列の結合モチーフに基づいたストラテジーにしたがって、特定のアミノ酸残基に偏っていた。制限部位ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩが隣接した、ＨＥＲ３結合ポリペプチドのヘリックス１及び２において部分的に無作為化された位置をコードする１３１ｂｐの二本鎖リンカー、例えば５’−ＧＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＧＧ ＮＮＮ ＴＴＡ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＮＮＮ ＡＧＴ ＴＴＡ ＮＮＮ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＴ−３’（無作為化コドンはＮＮＮと示される）の混合物を含有するＳｌｏｎｏＭａｘ(R)ライブラリーをＳｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨに発注した。１３の可変Ｚ位置についての新しいライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論的分布を表３に示す：
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
ライブラリー構築及びクローニング： Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、＃Ｆ５３０Ｌ）を使用して８サイクルのＰＣＲの間にライブラリーを増幅し、そしてプールした生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて供給業者の推奨にしたがって精製した。無作為化ライブラリーフラグメントの精製したプールを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、そして２％アガロースゲルでの分取ゲル電気泳動を使用して精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ系統ＲＲ１ΔＭ１５を、Ｊｅｔｓｔａｒ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ、＃２２００２０）を用いたブドウ球菌ディスプレイベクターｐＳＣＺ１（図４Ａ）のプラスミド産生のための宿主系統として使用した。
【０１３１】
このベクターを同じ酵素ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩで消化し、そして１％アガロースゲルでの分取ゲル電気泳動を使用して精製した。ｐＳＣＺ１と無作為化ライブラリーフラグメントとのライゲーションを、１：４のベクター対フラグメントのモル比のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０２０２Ｔ）を使用して行った。ライゲーション混合物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して供給業者の推奨に従って、エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８２６３−０１２）への形質転換前に精製した。形質転換後、さらには終夜の増殖後に直接プレーティングした個々のクローンを、配列確認のためにＢｉｇＤｙｅサーモサイクルシークエンシング（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００機器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲ増幅した。プラスミドをＪｅｔｓｔａｒ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用したＥ．ｃｏｌｉの終夜培養から製造し、そしてエレクトロコンピテントなＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）に以前に記載されたように（Ｌｏｅｆｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ、前出）形質転換した。ブドウ球菌提示ライブラリーを本明細書以下ではＳｃ：ＺHER3LIBと示す。
【０１３２】
ライブラリー品質分析： Ｓｃ：ＺHER3LIBのアリコート（少なくともライブラリーサイズの１０倍、すなわち１．３×１０8より多い）を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１００ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。１６時間後、１０7個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで１回洗浄した。細胞を遠心分離（３５００ｘｇ、４℃、６分）でペレット化し、そして２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有するＰＢＳＰに再懸濁し、そして１時間室温にて暗所でインキュベートした。１ｍｌ氷冷ＰＢＳＰで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析の前に細胞を３００μｌ氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１３３】
結果
ライブラリー構築及びクローニング： 新しいライブラリーを、確認された結合特性（実施例１及び２）を有する一組のＨＥＲ３結合Ｚ変異体（配列番号６６９〜６８９）に基づいて設計した。設計されたライブラリーの理論的なサイズは７．４×１０8のＺ変異体であった。ＤＮＡフラグメントのライブラリーをブドウ球菌発現ベクター中にクローニングし、そしてＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）に形質転換して約１．３×１０7の個々のクローンを含有する細胞提示ライブラリーを生成した。個々のライブラリーメンバーの配列分析により、理論的設計に従ったコドンの分布、並びに予期しないコドン、多重挿入及びフレームシフトの低い比率が示された。
ライブラリー品質分析： Ｚ変異体成熟ライブラリーが細菌表面に機能的に提示されたことを確認するために、ライブラリーからのブドウ球菌細胞を蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートし、そしてフローサイトメトリーを使用して分析した。結果は、ライブラリーの約７２％が細胞表面で機能的ＡＢＰ融合を有する全長タンパク質を発現したことを示した（データは示されていない）。従ってＨＥＲ３結合ポリペプチドの成熟ライブラリーは首尾よく構築された。
【０１３４】
実施例４： ブドウ球菌表面ディスプレイライブラリーからのＺ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
材料及び方法
細胞標識及びＦＡＣＳを使用したブドウ球菌細胞選別： Ｓｃ：ＺHER3LIBのアリコート（ライブラリーサイズの少なくとも１０倍、すなわち１．３×１０8より多い）を、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＴＳＢ−ＹＥ １００ｍｌに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。１６時間後、細胞（その後のサンプリング数の少なくとも４倍）を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）でペレット化し、そしてビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃを含有するＰＢＳＰ中に再懸濁し、そして室温で穏やかに混合しながら２時間インキュベートして平衡結合に到達させた。その後細胞を氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、続いて１．２５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８結合体化ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有する１ｍｌ ＰＢＳＰ中で１時間氷上で暗所にてインキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌでの最終洗浄工程の後、細胞を選別前に氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して選別した。ソートゲートは 最も高いＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７蛍光強度比を示すＺ変異体提示細胞の上部（ｔｏｐ）フラクション（典型的に０．１％）を選別するように設定した。細胞を直接０．５ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地中に選別し、そしてその後１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＴＳＢに播種し、そして３７℃で１６時間、標識及びＦＡＣＳの次のラウンドのため、増殖により単離された細胞を増幅するためにインキュベートした。この手順を４回繰り返した。
【０１３５】
配列決定： 個々のブドウ球菌クローンの配列決定を、実施例３のライブラリー構築において記載した細胞選別サイクル３及び４の後に行った。
【０１３６】
細胞上親和性順位付け及びＫD決定： ＨＥＲ３−Ｆｃをビオチン化し、そして実施例１において記載されるようにＨＳＡをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７と結合体化した。異なるＺ変異体を提示しているブドウ球菌細胞をそれぞれ１０ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールに播種し、そして終夜３７℃及び１５０ｒｐｍで増殖させた。培養物から、１０6個の細胞を１ｍｌ ＰＢＳＰで洗浄した。細胞を遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分）でペレット化し、そして推定ＫDに及ぶ異なる濃度のビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７について１３５、９０、２７、９、２．７、０．９、０．４５、０．２２、０．１１及び０．０５４ｎＭ；Ｚ０１８２０について６７０、３３７、１１０、４５、１８、６．７、２．２、１．１、０．３７及び０．２７ｎＭ）を含有するＰＢＳＰに再懸濁した。穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベーションすることにより平衡結合に達した。細胞を氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで洗浄し、続いて１．２５μｇ／ｍｌＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８結合体化ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そして順位付け実験では２２５ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)６４７結合体化ＨＳＡを含有する氷冷ＰＢＳＰ１００μｌ中で氷上で４０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳＰ１ｍｌで洗浄した後、フローサイトメトリー分析前に細胞を氷冷ＰＢＳＰ３００μｌに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０１３７】
結果
改善されたＺ変異体の単離のためのフローサイトメトリー選別： 成熟ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の単離のために、ブドウ球菌ライブラリーを、細胞増殖による増幅の交互のラウンドを含むラウンドの蛍光細胞分析分離にかけた。
【０１３８】
手短には、細胞をビオチン化ＨＥＲ３−Ｆｃと共に実施例１及び２からのＺ変異体の推定ＫDと比較して約１０倍低い濃度でインキュベートした。その後細胞を洗浄し、そしてその後の細胞に結合したＨＥＲ３の蛍光媒介検出のための蛍光標識したストレプトアビジン、さらには表面発現レベルのモニタリングのための蛍光標識したＨＳＡと共にインキュベートした。結合したＨＥＲ３の解離速度を小さくするために、二次的試薬及びＨＳＡのインキュベーションを氷上で行った。さらに洗浄した後、標識された細胞ライブラリーをフローサイトメーターでスクリーニング及び選別した。標的濃度、選別パラメーター及びソートゲートに関する選択ストリンジェンシーは、各選別ラウンドとともに増加し、そして典型的には、最も高い標的結合対表面発現比を示すライブラリーの上位０．１％を、増幅及びその後の選別ラウンドのためにゲーティングして単離した。フローサイトメーターでのライブラリーの標的結合特性の可視化により、各選別ラウンドでのＨＥＲ３ポジティブクローンの濃縮そして最終ラウンドでは本質的にＨＥＲ３ポジティブクローンのみであることが明らかとなった（図５）。ＦＡＣＳの４ラウンドまでの後、単離された細胞を個々の候補の配列決定及び特徴付けのために半固形培地に広げた。
配列決定： ５７６の個々のクローンを配列決定し、結果として４４３の配列が可読であり、そのうち４５のクローンは同じ選別ラウンドにおいて１回以上出現した（配列番号６９０〜７３４）。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を付与し、そして個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と呼ぶ。５８量体Ｚ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号６９０〜１００２として載せる。これらのＺ変異体の推定ＨＥＲ３結合モチーフを図１及び配列表に配列番号２２〜３３４として載せる。これらの各Ｚ変異体内で完全３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９量体ポリペプチドのアミノ酸配列を図１及び配列表に配列番号３５６〜６６８として載せる。
【０１３９】
細胞上親和性順位付け： 配列決定結果に基づいて１回より多く出現した４５のクローンを、ＦＥＲ３に対する親和性に関して変異体を順位付けするために全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにかけた。ブドウ球菌細胞集団をフローサイトメトリーを使用して分析し、そしてブドウ球菌細胞において表面提示された実施例１及び２からの１つのＺ変異体（Ｚ０１７５３）を比較のために分析に含めた。全ての４５の候補がアッセイにおいてＨＥＲ３結合に関してポジティブであり、さらに、４３は実施例１及び２からのＺ変異体と比較してより高いシグナルを示した（図６Ａ〜Ｄ）。アッセイにおいて最も高いシグナルは配列決定後に最も頻繁に出現した４つのクローンで見られ、フローサイトメトリー選別におけるＺ変異体の定量的な単離が示された。
【０１４０】
ＫD決定： 見掛けの平衡解離定数（ＫD）を、４つのＺ変異（図４Ｂ）並びに実施例１及び２からの１つのＨＥＲ３結合Ｚ変異体（Ｚ０１８２０）について細胞で決定した。４つの変異体及びＺ０１８２０を提示しているブドウ球菌細胞を、推定ＫDに及ぶ様々な濃度の標識ＨＥＲ３−Ｆｃでインキュベートした。細胞集団をフローサイトメーターで分析し、続いて平均蛍光強度データをＨＥＲ３−Ｆｃ濃度に対してプロットし、そしてＫDを決定するために１部位結合モデルにフィッティングした。全ての４つの成熟Ｚ変異体は低いナノモルの見掛けのＫDを示した。最も強いバインダーは、実施例１及び２からのＺ変異体と比較してＨＥＲ３−Ｆｃに対する親和性において１５倍の改善を示した（表３）。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
実施例５：Ｚ変異体の表面プラズモン共鳴ＫD決定
材料及び方法
表面プラズモン共鳴分析： 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析をＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７についてＢＩＡｃｏｒｅTM ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びマウスＨＥＲ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＭ−５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＮＨＳ／ＥＣＤアミンカップリング化学により固定化した。固定化は１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中で３０μｌ／分の流量で、そして１０μｇ／ｍｌの濃度で行い、４０００ＲＵの固定化レベルを目標とした。ランニングバッファーとしてＰＢＳＰを２０μｌ／分（別の記載がなければ）の流量で、そして再生のために５ｍＭ ＮａＯＨを使用した。
【０１４３】
動力学の決定のために、４つの異なる濃度（１．５〜６７ｎＭ、ＰＢＳＰ中で希釈）の４つのＨＥＲ３結合Ｚ変異体２５０μｌを、ＣＭ−５チップ表面上に固定化したＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入した。５ｍＭ ＮａＯＨ １５μｌの４回の注入及びランニングバッファを用いた徹底的な洗浄により表面を再生した。各サンプルを二つ組で測定し、そしてブランク表面からの応答を各濃度での各Ｚ変異体の応答から差し引いた。平均会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）に基づいてＫD値を決定するために、得られたセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）を１部位結合モデルにフィッティングした。
【０１４４】
対照実験： ＨＥＲ３−ＦｃのＦｃ部分に対する親和性について選択されたのではないことを確認するために、各Ｚ変異体（５０ｎＭ）を、各サンプル１００μｌ（上記の濃度で）をバイオセンサーチップ表面に固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ上に注入する前に、１０倍モル濃度過剰のヒトポリクローナルＩｇＧ（５００ｎＭ）と共に１時間室温でインキュベートした。さらなる対照実験において、センサーチップ表面に固定化されたＨＥＲ３−ＥＣＤ上にＺ変異体を注入した。
【０１４５】
結果
表面プラズモン共鳴分析： ４つのＺ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の解離平衡定数（ＫD）をＳＰＲ技術により決定した。１部位結合モデルに対する非線形回帰を使用してＺ変異体の会合速度及び解離速度から親和性を決定し、Ｚ０５４０５について１．６１ｎＭ、Ｚ０５４１３について０．７８ｎＭ、Ｚ０５４１６について０．７８ｎＭ、そしてＺ０５４１７について０．６９ｎＭの解離定数を得た（図７、表４）。表４において、全ての値は同日に行われた各濃度の二つ組の平均である。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
対照実験： ＨＥＲ３結合Ｚ変異体の分析はヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に融合されたＨＥＲ３を用いて行ったので、Ｚ変異体がＨＥＲ３−ＦｃのＦｃ部分に対する親和性について選択されたのではないことを確認するために２つの対照実験を行った。ＩｇＧと共にプレインキュベートしたＺ変異体とＺ変異体のみを含有するサンプルとの間に応答の差異は見られなかった（データは示していない）。さらに、ＨＥＲ３−ＥＣＤを有する表面上に注入されたＺ変異体は、全ての４つの変異体に対して特異的結合を示した（データは示していない）。総合すると、これら２つの実験は、ＦｃがＨＥＲ３−Ｆｃ上のＺ変異体の結合部位の一部ではないということを明確に示す。
【０１４８】
実施例６： ヘレグリン及びＨＥＲ３結合Ｚ変異体についての競合アッセイ
この実施例において、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体がリガンドヘレグリンのＨＥＲ３に対する結合をブロックする能力を競合アッセイにおいてＳＰＲにより調べた。
【０１４９】
材料及び方法
天然リガンドヘレグリン（ＨＲＧ１−β１、ＥＧＦ様ドメイン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と４つのＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７との間の競合を、ＳＰＲを使用して２つの異なるアッセイで分析した。
【０１５０】
第一のアッセイにおいて、２．５ｎＭ ＨＥＲ３−Ｆｃを、１００ｎＭの４つのＨＥＲ３特異的Ｚ変異体の各々（４０倍モル濃度過剰）とともに１時間室温でプレインキュベートした。その後、ＨＥＲ３−Ｆｃ及びＺ変異体の各混合物７５μｌを、ヘレグリンが固定化されたセンサーチップ表面上に注入した。さらに、Ｚ変異体とプレインキュベートしていないＨＥＲ３−Ｆｃを、ヘレグリンが固定化されたチップ表面上に注入した。
【０１５１】
第二のアッセイにおいて、５つの異なる濃度（０〜１０ｎＭ）の各Ｚ変異体１００μｌを、ＨＥＲ３が固定されたセンサーチップ表面上に注入し、続いてすぐに２５０ｎＭヘレグリン１００μｌを注入した（ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＯＩＮＪＥＣＴコマンドを使用）。全てのサンプルを二つ組で注入し、そしてＨＥＲ２特異的Ｚ変異体を、同じ設定を使用してネガティブコントロールとして注入した。５ｍＭ ＮａＯＨの２回の注入及びランニングバッファでの徹底的な洗浄で表面を再生させた。
【０１５２】
結果
ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４０５、Ｚ０５４１３、Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７の天然ＨＥＲ３リガンドヘレグリンとのＨＥＲ３に対する競合をＳＰＲ技術により調べた。
【０１５３】
チップ表面上に固定化されたヘレグリンを使用した第一のアッセイの結果は、Ｚ変異体とプレインキュベートしていないＨＥＲ３−Ｆｃを注入した場合と比較してＺ変異体とともにプレインキュベートしたＨＥＲ３−Ｆｃを注入した場合に、応答レベルのほとんど完全な減少を示した（図８Ａ）。
【０１５４】
チップ表面上に固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃを使用した第二のアッセイの結果は、ＨＥＲ３受容体とその天然リガンドとの間の相互作用と濃度依存的に競合することを示した（図８Ｂ）。同じパターンがマウスＨＥＲ３−Ｆｃについて観察された（データは示していない）。ネガティブコントロールとヘレグリンとの間の競合はヒト又はマウスＨＥＲ３のいずれについても観察することができなかった（データは示していない）。
【０１５５】
これらの結果は、ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体が天然リガンドヘレグリンと同じＨＥＲ３上の結合部位と相互作用し、それ故リガンドと受容体との間の結合とインビトロで競合し得るということを示した。この効果は、今後の治療的なインビボ適用において利用されるかもしれない。
【０１５６】
実施例７： インビトロでのヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化の阻害
この実施例では、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体のヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化を妨害する能力を細胞アッセイで調べた。
【０１５７】
材料及び方法
刺激： ＭＣＦ−７（ＡＣＣ１１５、ＤＳＭＺ）乳がん細胞を、Ｌ−グルタミン（ＢＥ１７−６０５Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、非必須アミノ酸（ＢＥ１３−１１４Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、ピルビン酸ナトリウム（ＢＥ１３−１１５Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０１０８−１６５、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（ＢＥ１２−１６７Ｆ、Ｌｏｎｚａ）で培養した。刺激の前日に、１×１０6の細胞を６ｍｍペトリ皿（４３０１６８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に上記の培地５ｍｌ中で播種した。
【０１５８】
刺激の１時間前に、培地をＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン＋２％透析ＦＢＳ（２６４００−０３６、Ｇｉｂｃｏ）からなる培地に変更した。ＨＥＲ３のリン酸化を５ｎＭヘレグリン（ＨＲＧ１−β、３９６−ＨＢ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて誘導した。それぞれＮ末端ｈｉｓタグ及びＣ末端システインを含むＨＥＲ３結合Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７（Ｈｉｓ6−Ｚ０５４１６−ｃｙｓ及びＨｉｓ6−Ｚ０５４１７−ｃｙｓ）を、１０又は１００倍モル濃度過剰のヘレグリンと同時に加えた。ｔａｑポリメラーゼ特異的Ｚ変異体（Ｈｉｓ6−Ｚ０１１５５−ｃｙｓ）をネガティブコントロールとして使用して、そして上記と同じ手順に従って加えた。
【０１５９】
１０分間３７℃でインキュベーションした後、ペトリ皿を氷上に置き、続いて氷冷ＰＢＳで洗浄することにより細胞プロセスを停止させた。洗浄後、１ｍＭ活性化オルトバナデート（４５０２４３、Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ ２ｍｌを各皿に加え、そして細胞を細胞スクレーパーを使用して剥離した。細胞溶液を１０ｍｌのチューブに移し、そして細胞を１０００ｒｐｍでの３分間の予冷遠心分離で回転させることによりペレット化した。乾燥ペレットを氷冷溶解緩衝液１００μｌ（１％ ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ Ｉ３０２１）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化ナトリウムオルトバナデート）に溶解して細胞を溶解させた。溶解物を回転させて４℃にて３０分間インキュベートし、そして１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を集めてさらなる分析まで−８０℃で保存した。
【０１６０】
ｐＨＥＲ３−ＥＬＩＳＡ： リン酸化ＨＥＲ３タンパク質（ｐＨＥＲ３）の細胞溶解物中の存在を、Ｄｕｏ−Ｓｅｔ ＩＣ ｐｈｏｓｐｏ ＥｒｂＢ３サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＤＹＣ−１７６９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
【０１６１】
９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を終夜５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中に希釈された２μｇ／ｍｌの捕捉抗体で被覆した。次の日、プレートを自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機でＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）で２時間室温にてウェルをブロックし、そして以前に記載したように洗浄した。
【０１６２】
ＩＣ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＃１２（１％ ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ活性化ナトリウムオルトバナデート）で２回又は４回希釈した５０μｌ／ウェルの細胞溶解物を加えた。製造者により提供されたポジティブコントロールもウェルに加えた。続いてプレートを２時間インキュベートした。
【０１６３】
洗浄後、製造者のプロトコルにしたがってＩＣ ｄｉｌｕｅｎｔ ＃１４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．２−７．４）で希釈した５０μｌ／ウェルの検出抗体を加え、そしてプレートをさらに２時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ、Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。２０分後に５０μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍでＶｉｃｔｏｒ3 ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。
【０１６４】
結果
ＨＥＲ３特異的Ｚ変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７を、ネガティブコントロール（ｔａｑポリメラーゼ特異的Ｚ０１１５５）と一緒に、ＨＥＲ３のヘレグリン誘導リン酸化をブロックするそれらの能力について評価した。ｐＨＥＲ３の相対含有量（％）を、ヘレグリン刺激培養物（ヘレグリン刺激培養物から得られたＯＤ値）に対するブロックされた培養物（Ｚ変異体を含有する培養物から得られたＯＤ値）の関係として決定した。図９は、ＨＥＲ３結合変異体Ｚ０５４１６及びＺ０５４１７が用量依存的様式でヘレグリン誘導リン酸化を阻害し、一方でｔａｑポリメラーゼ結合変異体Ｚ０１１５５はいずれの効果も有していなかったことを示す。
【０１６５】
実施例８： ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に結合する二重特異性Ｚ変異体
背景の項に記載したように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２にとって好ましいヘテロ二量体化パートナーであり、そしてＨＥＲ２はリガンド誘導シグナル伝達に関してＨＥＲファミリーの他の受容体に依存している。二重特異性ＨＥＲ３及びＨＥＲ２標的化リガンド（例えばＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体）は、両方の受容体を発現している腫瘍において受容体シグナル促進腫瘍成長をブロックするかもしれない。
【０１６６】
場合により様々なリンカー長を含む二重特異性分子のための種々の分子構築物を考慮した。構築物の例は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドに対してＨＥＲ３結合ポリペプチドをＮ末端又はＣ末端に位置づけることである。リンカーが２つの結合ポリペプチドの間に導入される場合、それは１〜６０アミノ酸残基、例えば１〜４５アミノ酸を含み得る。さらに、二重特異性構築物は、半減期延長部分、例えばアルブミン融合、アルブミン結合部分又はＰＥＧのような分子へのカップリングを分子のＮ末端若しくはＣ末端部分又はリンカー領域内に備えていてもよい。あるいは、半減期延長部分はそれ自体で結合ポリペプチド間のリンカー、又はスペーサーとして利用され得る。
【０１６７】
材料及び方法
二量体二重特異性Ｚ変異体分子を、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、５４（２）：１２１−３１（２００９）に以前に報告されたように操作した。ＦｒｉｅｄｍａｎらはＨＥＲファミリーの２つのメンバーに対して特異的な四量体Ｚ変異体の製造について記載しているが、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２二重特異性Ｚ変異体の構築は、原理上は同じプロトコルに従う。当業者は、Ｆｒｉｅｄｍａｎらに基づく手順を適用する方法を用意に理解するだろう。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に結合するヘテロ二量体Ｚ変異体の構築については、Ｊｏｎｓｓｏｎらにより記載される手順（前出）に従うことにより、２つの結合ポリペプチドの間に４０アミノ酸のペプチドリンカーを使用してＨＥＲ３結合変異体をコードする遺伝子フラグメントを、ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントとインフレームで遺伝子融合した。
【０１６８】
二重特異性タンパク質をコードする遺伝子を、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードするベクターのクローニングにより構築した。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体は、配列番号６６９〜１００２から選択され、特に配列番号６６９〜７３４から選択される配列、例えば配列番号６９０〜７３４から、例えば配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択され、そしてＨＥＲ２結合Ｚ変異体は配列番号１００３から選択される。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３結合Ｚ変異体は、異なる受容体に対して異なる親和性を有し得る。構築物は同じ受容体に対する様々な親和性を有するＺ変異体をコードするベクターから作製されてもよい。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードするベクターを、適切なエンドヌクレアーゼ（例えばＳｆｉＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して切断し、そしてＨＥＲ３−ＨＥＲ２特異的Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントを回収し、そしてライゲーションして二重特異性分子をコードする遺伝子を形成した。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２結合ポリペプチドは遺伝子フラグメント内で個々に単量体単位を形成しても多量体単位、例えば二量体、三量体又は四量体を形成してもよい。
【０１６９】
ペプチドリンカーの導入のために、リンカー領域をコードする遺伝子フラグメント（例えばＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＬＶＧＬＧＳＧＧＧＧＳ）の倍数を異なるリンカー長を有する構築物を作製するために導入する。リンカー領域はアルブミン遺伝子又はアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）のための遺伝子も含有し得る。ここでは、ＡＢＤ遺伝子をＰＣＲを使用して増幅し、そしてリンカーコード単位を導入する。この後、ＢａｍＨＩ制限消化し、そしてＨＥＲ結合ポリペプチド間で二量体ＨＥＲ３−ＨＥＲ２二重特異性遺伝子中にライゲーションする。これは本質的に、Ｊｏｎｓｓｏｎら（前出）により三量体ＴＮＦ構築物の作製について記載されたように行われるが、Ｊｏｎｓｓｏｎにおいて記載される中心ＴＮＦ分子をＡＢＤに置き換える。あるいは、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体をコードする遺伝子フラグメントを、種々の形式で二重特異性分子をクローニングするるための所望のリンカー領域及び制限部位も導入する適切なＰＣＲプライマーを使用して増幅する。二重特異性分子の種々の形式は、例えばＮ末端若しくはＣ末端の位置づけ、結合Ｚ変異体間の様々な長さのリンカー及び／又は中間のＡＢＤ遺伝子である。所望の二重特異性分子をコードする遺伝子の構築についての別の可能性は、単に完全合成遺伝子をそのようなサービスを提供している企業（例えばＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ）から購入することである。
【０１７０】
結果として得られた、ＨＥＲ３結合Ｚ変異体、ＨＥＲ２結合Ｚ変異体、ペプチドリンカー及び場合によりＡＢＤをコードする遺伝子フラグメントを、発現ベクターにライゲーションし、発現細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。タンパク質を例えば実施例２に記載されるように発現させる。さらなるｈｉｓ−ｔａｇ及び／又は標識目的のための独特のシステインをコードする発現ベクターを使用し、そして発現されたタンパク質を例えば実施例２に記載されるように精製する。タンパク質発現及び精製に使用される方法は、当業者に公知の標準的な方法である。
【０１７１】
次いで得られた二重特異性タンパク質を、Ｆｒｉｅｄｍａｎら（前出）に記載されるように、バイオセンサー分析（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによりインビトロでの同時結合について試験する。ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（ｈＨＥＲ３−Ｆｃ）及びヒトＨＥＲ２−Ｆｃ（ｈＨＥＲ２−Ｆｃ、両方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）を、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストラン層上に製造者の指示に従って固定化した。別のフローセル表面を活性化し、そして参照表面として不活性化した。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子をランニングバッファ、ＨＢＳ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で希釈し、その後結合分析を２５℃で行った。第一の実験において、二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を１２５ｎＭから２μＭの範囲に及ぶ濃度で全ての表面に３０μｌ／分の流量で注入した。ＨＥＲ３結合Ｚ変異体及びＨＥＲ２結合Ｚ変異体もまたコントロールとして注入した。各注入後に、１０ｍＭ ＨＣｌ １０ｍｌを注入することによりフローセルを再生した。
【０１７２】
第二の実験において、５μＭ ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を、ｈＨＥＲ３−Ｆｃ又はｈＨＥＲ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）がアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップのカルボキシル化デキストラン層上に固定化されたフローセル表面上に注入した。１分の短い解離時間の後、１１５ｎＭ ｈＨＥＲ３−Ｆｃ及びｈＨＥＲ２−Ｆｃ（ランニングバッファで希釈）を注入し、そして二重特異性分子のそれらの標的両方に同時に結合する能力をモニタリングした。
【０１７３】
蛍光標識した二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子を、ＨＥＲ３を発現しＨＥＲ２を発現していない細胞、又はＨＥＲ２を発現しＨＥＲ３を発現していない細胞のいずれかとインキュベートすることにより、ＨＥＲ３−ＨＥＲ２分子の生存細胞での結合能力を、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析を使用してＦｒｉｅｄｍａｎら（前出）に記載されるようにモニタリングした。それぞれの受容体に対する異なる親和性を有する異なる構築物が、細胞での異なる受容体発現レベルを区別するかどうかを調べるために特異性の差異を同時に調べた。
【０１７４】
細胞に対する結合二重特異性Ｚ変異体の生物学的効果を、細胞培養物を０．０５ｎＭから５０００ｎＭまでの範囲にわたる様々な量の二重特異性Ｚ変異体に曝露し、そして細胞増殖速度及び生存を分析し、そして重要な細胞シグナル伝達経路のリン酸化パターンをウェスタンブロット分析を使用して、ＨＥＲ２特異的Ｚ変異体についてＥｋｅｒｌｊｕｎｇらにより（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ２７（４）：２０１−１０（２００６）及びＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３７７（２）：４８９−９４（２００８）において）記載されるように分析することにより試験した。試験することができる細胞株としては、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＣＡＬＵ−３及びＳＫＯＶ−３が挙げられる。またＨＥＲ３形質導入ＢＴ−４７４及びＺＲ７５細胞を使用することもできる。
【０１７５】
インビボでのＨＥＲ３−ＨＥＲ２ Ｚ変異体の効果を試験するために、二重特異性構築物を腫瘍標的化及び腫瘍における生物学的効果について評価した。二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を以前に記載されたように（Ａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９（１）：２３５−４３（２００８））放射標識し、そしてインビトロでの細胞取り込み、保持及び内部移行について、記載された方法（Ｓｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２０（３）：２３９−４８（２００５））を使用して特徴付けした。ＨＥＲ３及びＨＥＲ２受容体を発現している異種移植された腫瘍（例えばＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＣＡＬＵ−３及びＳＫＯＶ−３）を有する動物を、体内分布研究において放射標識したＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を注射し、そして腫瘍取り込み及び他の器官との対比についてモニタリングした。半減期延長部分を有していない構築物については、異種移植されたマウスにおける放射能の分布を、典型的には放射標識二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体の注射後１、２、４、８、２４、４８及び７２時間の時点で評価した。半減期延長部分を有する構築物については、放射能の分布を典型的には放射標識された二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合Ｚ変異体の注射後１、４、１２、２４、４８、７２、１６８及び３３２時間の時点で、本質的にＴｏｌｍａｃｈｅｖらにより記載されるように（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７（６）：２７７３−８２（２００７））評価した。放射標識二重特異性Ｚ変異体の取り込みを、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３結合Ｚ変異体単独の取り込みと比較した。二重特異性Ｚ変異体が、単一特異性の相当するものと比較した場合にインビボで腫瘍において優れた取り込み及び保持及び／又は特異性を有する場合、それらの二重特異性変異体は標的化ペイロード治療に適切であり得る。このような治療は、二重特異性分子に融合又は結合体化された潜在的なエフェクター機能、例えば放射性核種、毒性化学分子、毒素、サイトカイン又は光増感剤を利用するだろう。
【０１７６】
二重特異性Ｚ変異体を、インビボでの内因性の効果についてさらに特徴付けした。マウスに、両方の受容体を発現している腫瘍細胞、又はコントロールとして、受容体の一方のみを発現しているか受容体をどちらも発現していない腫瘍細胞を移植し、そして二重特異性Ｚ変異体の単回又は複数回の注射を行う。腫瘍成長を経時的に、そして注射緩衝液のみで活性化合物（すなわち二重特異性ＨＥＲ３−ＨＥＲ２結合分子）を注射されていないビヒクル群を含むコントロール群に対してモニタリングした、
【０１７７】
実施例９：ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性を有するＺ変異体
導入部に記載したように、ＨＥＲ３はＨＥＲ２にについての好ましいヘテロ二量化パートナーである。しかし、特定の条件では、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ１）に対する重要な二量化パートナーでもある。二重特異性ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ標的化リガンドを使用することにより、両方の受容体を発現している腫瘍が標的にされ、そして腫瘍促進受容体シグナル伝達がブロックされ得る。
【０１７８】
二重特異性ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ結合Ｚ変異体は、本質的に上記実施例８に記載されるように操作される。得られた構築物を、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ受容体を発現する細胞株（例えばＡ４３１細胞）において、実施例８で二重特異性ＨＥＲ３及びＨＥＲ２結合Ｚ変異体について記載される方法と類似の方法で試験することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドであって、該モチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ ＹＸ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＫ、Ｒ及びＷから選択され；
Ｘ3はＫ、Ｒ、及びＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11はＥ及びＱから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ20はＫ及びＲから選択され；
Ｘ21はＡ及びＧから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列［ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する］、
から選択されるアミノ酸配列からなる、上記ＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ2Ｘ3はＫＹ、ＲＹ、ＷＫ及びＷＲから選択される、請求項１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ4はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される、請求項１又は２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ7はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ11はＱである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ、ＶＲ及びＲＲから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ20はＫである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ21はＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ28はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される、請求項２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ4はＫ、Ｌ、Ｓ及びＴから選択される、請求項３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘ7はＦ、Ｇ及びＹから選択される、請求項４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ及びＶＲから選択される、請求項６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ25はＡ、Ｇ及びＳから選択される、請求項９に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ28はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｓ及びＷから選択される、請求項１０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列ｉ）が、以下の４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：
Ｉ） Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される；
ＩＩ） Ｘ11はＱである；
ＩＩＩ） Ｘ20はＫである；
ＩＶ） Ｘ21はＡである、
のうち少なくとも１つを満たす、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１８】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも２つを満たす、請求項１７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１９】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも３つを満たす、請求項１８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２０】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの全てを満たす、請求項１９に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列が配列番号１〜３３４のいずれか１つから選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列が配列番号１〜６６のいずれか１つから選択される、請求項２１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド
【請求項２３】
アミノ酸配列が、配列番号２３〜２５、配列番号２７〜２８、配列番号３２、配列番号３５〜３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４〜４５、配列番号５３〜５４及び配列番号５６のいずれか１つから選択される、請求項２２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ３結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＨＥＲ３結合モチーフが、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループを有する２つのアルファヘリックスの一部を本質的に形成する、請求項２４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメイン及びその誘導体から選択される、請求項２４又は２５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２７】
ｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
［ここで、
［ＢＭ］は、請求項１〜２３のいずれか１項において定義されるＨＥＲ３結合モチーフであり；
ＸaはＡ及びＳから選択され；
ＸbはＮ及びＥから選択され；
ＸcはＡ、Ｓ及びＣから選択され；
ＸdはＡ及びＳから選択される］
及び
ｉｉ） 上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２８】
ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、そしてＸdはＡである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＡである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、そしてＸdはＳである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３１】
ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＳである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３２】
アミノ酸配列が配列番号３３５〜６６８のいずれか１つから選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸配列が、配列番号３３５〜４００のいずれか１つから選択される、請求項３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３４】
アミノ酸配列が、配列番号３５７〜３５９、配列番号３６１〜３６２、配列番号３６６、配列番号３６９〜３７０、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８〜３７９、配列番号３８７〜３８８及び配列番号３９０のいずか１つから選択される、請求項３３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３５】
ｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は請求項１〜２３のいずれか１項において定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そしてＸcはＳ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上で定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３６】
ｉ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は請求項１〜２３のいずれか１項において定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そしてＸcはＡ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列が配列番号６６９〜１００２から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸配列が配列番号６６９〜７３４から選択される、請求項３７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸配列が、配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択される、請求項３８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４０】
相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ３結合ポリペプチドがＨＥＲ３に結合する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４１】
さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４２】
さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸の各々が、ポリペプチドの生産、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善する、請求項４１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４３】
アミノ酸配列が同じであっても異なっていてもよい、少なくとも２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形態である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４４】
二量体形態である、請求項４３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４５】
天然に存在するＨＥＲ３リガンドのＨＥＲ３への結合をブロックする、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４６】
インビボでＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項４５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＨＥＲ２結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する結合親和性を有するリガンド。
【請求項５１】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドが、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ２に結合する、請求項５０に記載のリガンド。
【請求項５２】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインＢから誘導された改変タンパク質である、請求項５０又は５１に記載のリガンド。
【請求項５３】
改変タンパク質がプロテインＺ誘導体を含む、請求項５２に記載のリガンド。
【請求項５４】
改変タンパク質が、
ｉ） ＹＡＫＥＭ ＲＮＡＹＷ ＥＩＡＬＬ ＰＮＬＴＮ ＱＱＫＲＡ ＦＩＲＫＬ ＹＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載のリガンド。
【請求項５５】
連結部分が１から最大で４５個までのアミノ酸を含むペプチドである、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項５６】
インビボでリガンド半減期を延長させるための半減期延長部分をさらに含む、請求項５０〜５５のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項５７】
半減期延長部分がアルブミンである、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５８】
半減期延長部分がアルブミン結合部分である、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５９】
アルブミン結合部分が、連鎖球菌プロテインＧのドメインＧＡ３から誘導された改変タンパク質である、請求項５８に記載のリガンド。
【請求項６０】
アルブミン結合部分が、
ｉ） ＬＡＥＡＫ ＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹ ＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩ ＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥ ＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬ Ｐ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載のリガンド。
【請求項６１】
半減期延長部分がポリエチレングリコールである、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項６２】
半減期延長部分が、リガンド中に存在する少なくとも１つのシステイン残基を介してリガンドの残部に結合する、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６３】
半減期延長部分が連結部分を介してリガンドの残部に結合する、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６４】
連結部分が、請求項５６〜６０のいずれか１項において定義される半減期延長部分を含む、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６５】
融合ポリペプチドである、請求項５０〜６０又は６４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６６】
インビボでＨＥＲ２及びＨＥＲ３の二量化を防止する、請求項５０〜６５のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６７】
インビボでＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項６６に記載のリガンド。
【請求項６８】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＥＧＦＲ結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドをＥＧＦＲ結合ポリペプチドと連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する結合親和性を有するリガンド。
【請求項６９】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド又は請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンドと治療剤との組み合わせ。
【請求項７０】
治療における使用のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７１】
ＨＥＲ３関連状態の処置のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７２】
がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択されるＨＥＲ３関連状態の処置のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７３】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせを、それを必要とする哺乳動物対象に投与する工程を含む、ＨＥＲ３関連状態の処置方法。
【請求項７４】
ＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせの、対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ３への結合が、ＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項７３に記載の処置方法。
【請求項７５】
ＨＥＲ３関連状態が、がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項１】
ＨＥＲ３結合モチーフ（ＢＭ）を含むＨＥＲ３結合ポリペプチドであって、該モチーフは、
ｉ） ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ ＹＸ7ＥＩＷ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
［ここで、互いに独立して、
Ｘ2はＫ、Ｒ及びＷから選択され；
Ｘ3はＫ、Ｒ、及びＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ7はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11はＥ及びＱから選択され；
Ｘ16はＮ及びＴから選択され；
Ｘ17はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18はＲ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ20はＫ及びＲから選択され；
Ｘ21はＡ及びＧから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｒ及びＳから選択され；
Ｘ26はＳ及びＫから選択され；
Ｘ28はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ及びＹから選択される］；
及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列［ここで該ポリペプチドは、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する］、
から選択されるアミノ酸配列からなる、上記ＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ2Ｘ3はＫＹ、ＲＹ、ＷＫ及びＷＲから選択される、請求項１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ4はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択される、請求項１又は２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ7はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ11はＱである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ、ＶＲ及びＲＲから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ20はＫである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ21はＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ25はＡ、Ｇ、Ｋ及びＳから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ28はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される、請求項２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ4はＫ、Ｌ、Ｓ及びＴから選択される、請求項３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘ7はＦ、Ｇ及びＹから選択される、請求項４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ17Ｘ18はＲＶ、ＲＴ及びＶＲから選択される、請求項６に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ25はＡ、Ｇ及びＳから選択される、請求項９に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ28はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｓ及びＷから選択される、請求項１０に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列ｉ）が、以下の４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：
Ｉ） Ｘ2Ｘ3はＫＹ及びＲＹから選択される；
ＩＩ） Ｘ11はＱである；
ＩＩＩ） Ｘ20はＫである；
ＩＶ） Ｘ21はＡである、
のうち少なくとも１つを満たす、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１８】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも２つを満たす、請求項１７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項１９】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのうち少なくとも３つを満たす、請求項１８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２０】
４つの条件Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの全てを満たす、請求項１９に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列が配列番号１〜３３４のいずれか１つから選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列が配列番号１〜６６のいずれか１つから選択される、請求項２１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド
【請求項２３】
アミノ酸配列が、配列番号２３〜２５、配列番号２７〜２８、配列番号３２、配列番号３５〜３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４〜４５、配列番号５３〜５４及び配列番号５６のいずれか１つから選択される、請求項２２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ３結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＨＥＲ３結合モチーフが、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループを有する２つのアルファヘリックスの一部を本質的に形成する、請求項２４に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメイン及びその誘導体から選択される、請求項２４又は２５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２７】
ｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
［ここで、
［ＢＭ］は、請求項１〜２３のいずれか１項において定義されるＨＥＲ３結合モチーフであり；
ＸaはＡ及びＳから選択され；
ＸbはＮ及びＥから選択され；
ＸcはＡ、Ｓ及びＣから選択され；
ＸdはＡ及びＳから選択される］
及び
ｉｉ） 上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２８】
ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、そしてＸdはＡである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＡである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、そしてＸdはＳである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３１】
ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、そしてＸdはＳである、請求項２７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３２】
アミノ酸配列が配列番号３３５〜６６８のいずれか１つから選択される、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸配列が、配列番号３３５〜４００のいずれか１つから選択される、請求項３２に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３４】
アミノ酸配列が、配列番号３５７〜３５９、配列番号３６１〜３６２、配列番号３６６、配列番号３６９〜３７０、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８〜３７９、配列番号３８７〜３８８及び配列番号３９０のいずか１つから選択される、請求項３３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３５】
ｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は請求項１〜２３のいずれか１項において定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そしてＸcはＳ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上で定義される配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３６】
ｉ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
［ここで［ＢＭ］は請求項１〜２３のいずれか１項において定義されたＨＥＲ３結合モチーフであり、そしてＸcはＡ及びＣから選択される］；及び
ｉｉ） 上で定義された配列のいずれか１つに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列が配列番号６６９〜１００２から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸配列が配列番号６６９〜７３４から選択される、請求項３７に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸配列が、配列番号６９１〜６９３、配列番号６９５〜６９６、配列番号７００、配列番号７０３〜７０４、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２〜７１３、配列番号７２１、配列番号７２２及び配列番号７２４から選択される、請求項３８に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４０】
相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ３結合ポリペプチドがＨＥＲ３に結合する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４１】
さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４２】
さらなるＣ末端アミノ酸及び／又はＮ末端アミノ酸の各々が、ポリペプチドの生産、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善する、請求項４１に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４３】
アミノ酸配列が同じであっても異なっていてもよい、少なくとも２つのＨＥＲ３結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形態である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４４】
二量体形態である、請求項４３に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４５】
天然に存在するＨＥＲ３リガンドのＨＥＲ３への結合をブロックする、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４６】
インビボでＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項４５に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＨＥＲ２結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドとＨＥＲ２結合ポリペプチドとを連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２に対する結合親和性を有するリガンド。
【請求項５１】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドが、相互作用のＫD値が多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、例えば多くとも１×１０-8ＭであるようにＨＥＲ２に結合する、請求項５０に記載のリガンド。
【請求項５２】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインＢから誘導された改変タンパク質である、請求項５０又は５１に記載のリガンド。
【請求項５３】
改変タンパク質がプロテインＺ誘導体を含む、請求項５２に記載のリガンド。
【請求項５４】
改変タンパク質が、
ｉ） ＹＡＫＥＭ ＲＮＡＹＷ ＥＩＡＬＬ ＰＮＬＴＮ ＱＱＫＲＡ ＦＩＲＫＬ ＹＤＤＰＳ ＱＳＳＥＬ ＬＳＥＡＫ ＫＬＮＤＳ Ｑ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載のリガンド。
【請求項５５】
連結部分が１から最大で４５個までのアミノ酸を含むペプチドである、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項５６】
インビボでリガンド半減期を延長させるための半減期延長部分をさらに含む、請求項５０〜５５のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項５７】
半減期延長部分がアルブミンである、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５８】
半減期延長部分がアルブミン結合部分である、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５９】
アルブミン結合部分が、連鎖球菌プロテインＧのドメインＧＡ３から誘導された改変タンパク質である、請求項５８に記載のリガンド。
【請求項６０】
アルブミン結合部分が、
ｉ） ＬＡＥＡＫ ＶＬＡＮＲ ＥＬＤＫＹ ＧＶＳＤＦ ＹＫＲＬＩ ＮＫＡＫＴ ＶＥＧＶＥ ＡＬＫＬＨ ＩＬＡＡＬ Ｐ；及び
ｉｉ） ｉ）において定義された配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載のリガンド。
【請求項６１】
半減期延長部分がポリエチレングリコールである、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項６２】
半減期延長部分が、リガンド中に存在する少なくとも１つのシステイン残基を介してリガンドの残部に結合する、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６３】
半減期延長部分が連結部分を介してリガンドの残部に結合する、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６４】
連結部分が、請求項５６〜６０のいずれか１項において定義される半減期延長部分を含む、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６５】
融合ポリペプチドである、請求項５０〜６０又は６４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６６】
インビボでＨＥＲ２及びＨＥＲ３の二量化を防止する、請求項５０〜６５のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６７】
インビボでＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項６６に記載のリガンド。
【請求項６８】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド；ＥＧＦＲ結合ポリペプチド；及びＨＥＲ３結合ポリペプチドをＥＧＦＲ結合ポリペプチドと連結するための連結部分を含む、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに対する結合親和性を有するリガンド。
【請求項６９】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド又は請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンドと治療剤との組み合わせ。
【請求項７０】
治療における使用のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７１】
ＨＥＲ３関連状態の処置のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７２】
がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択されるＨＥＲ３関連状態の処置のための、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせ。
【請求項７３】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＨＥＲ３結合ポリペプチド、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載のリガンド又は請求項６９に記載の組み合わせを、それを必要とする哺乳動物対象に投与する工程を含む、ＨＥＲ３関連状態の処置方法。
【請求項７４】
ＨＥＲ３結合ポリペプチド、リガンド又は組み合わせの、対象の細胞表面で発現されたＨＥＲ３への結合が、ＨＥＲ３仲介シグナル伝達を阻害する、請求項７３に記載の処置方法。
【請求項７５】
ＨＥＲ３関連状態が、がん疾患、例えば結腸がん、子宮内膜がん、胃がん、神経膠腫、乳がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がん、黒色種、髄芽腫、神経上皮腫、卵巣がん、パジェット病、乳頭様甲状腺がん、前立腺がん、皮膚扁平上皮がん、移行上皮がん及び前庭神経鞘腫から選択される、請求項７３又は７４に記載の方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図１−８】
【図１−９】
【図１−１０】
【図１−１１】
【図１−１２】
【図１−１３】
【図１−１４】
【図１−１５】
【図１−１６】
【図１−１７】
【図１−１８】
【図１−１９】
【図１−２０】
【図１−２１】
【図１−２２】
【図１−２３】
【図１−２４】
【図１−２５】
【図１−２６】
【図１−２７】
【図１−２８】
【図１−２９】
【図１−３０】
【図１−３１】
【図１−３２】
【図１−３３】
【図１−３４】
【図１−３５】
【図１−３６】
【図１−３７】
【図１−３８】
【図１−３９】
【図１−４０】
【図１−４１】
【図１−４２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図１−８】
【図１−９】
【図１−１０】
【図１−１１】
【図１−１２】
【図１−１３】
【図１−１４】
【図１−１５】
【図１−１６】
【図１−１７】
【図１−１８】
【図１−１９】
【図１−２０】
【図１−２１】
【図１−２２】
【図１−２３】
【図１−２４】
【図１−２５】
【図１−２６】
【図１−２７】
【図１−２８】
【図１−２９】
【図１−３０】
【図１−３１】
【図１−３２】
【図１−３３】
【図１−３４】
【図１−３５】
【図１−３６】
【図１−３７】
【図１−３８】
【図１−３９】
【図１−４０】
【図１−４１】
【図１−４２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５０９８６１（Ｐ２０１３−５０９８６１Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６７５７（Ｐ２０１２−５３６７５７）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５１１６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６１２４
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５１１６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６１２４
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
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