ＨＩＶ−１交差中和モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’−エピトープ複合体
【課題】複合体形成していない、ならびに、結合したエピトープを有する双方の、Ｍａｂ ２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの三次元構造の提供。
【解決手段】実験室株およびＨＩＶ−１のはなはだ多くの同源系統群の初代臨床的分離株の双方に有効な中和剤であるＭａｂ ２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの、ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ４１の広範に保存されるペプチド配列ＥＬＤＫＷＡＳとの複合体を形成した、および非複合の両結晶構造が解明され、ペプチド−タンパク質相互作用の特性が決定された。かかる決定に関連して、ペプチド模倣体を、そのエピトープ配列対する増大した抗原性を付与するような三次元構造へと制御がなされる。
【解決手段】実験室株およびＨＩＶ−１のはなはだ多くの同源系統群の初代臨床的分離株の双方に有効な中和剤であるＭａｂ ２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの、ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ４１の広範に保存されるペプチド配列ＥＬＤＫＷＡＳとの複合体を形成した、および非複合の両結晶構造が解明され、ペプチド−タンパク質相互作用の特性が決定された。かかる決定に関連して、ペプチド模倣体を、そのエピトープ配列対する増大した抗原性を付与するような三次元構造へと制御がなされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、結晶学ならびに免疫学、特には、モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの三次元構造の初めての解明に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）２Ｆ５は、ＨＩＶ−１のはなはだ多くの同源系統群の初代臨床的分離株ならびに実験室株の双方に有効な中和剤であり、時にはＫａｔｉｎｇｅｒエピトープとも称される、ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ４１の、広範に保存されているペプチド配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と反応する（参照文献１〜７:非特許文献１〜７。本出願を通じて、本発明が属する技術分野の現状をより完全に説明するために、様々な文献が括弧中に参照される。各々の引用の完全な文献情報は、明細書の最後にある。これらの参照文献の開示は、参照によって、本開示に組み込む。）このため、Ｍａｂ ２Ｆ５は、ＨＩＶ−１ワクチンの開発において、より多くの興味がある。抗原性提示（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の研究に基づいて、このエピトープ配列の抗原性は、分子的構造に依存するものであると結論された（参照文献８:非特許文献８）。
【非特許文献１】Muster, T., et al., A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J. Virology, 67, 6642-6647 (1993)
【非特許文献２】Muster, T., et al., Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS. J. Virology, 68, 4031-4034 (1994)
【非特許文献３】Purtcher, M., et al., A broadly neutralizing human monoclonal antibody against gp41 of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). AIDS Res. And Human Retroviruses, 10, 1651-1658 (1994)
【非特許文献４】Conley, A.J., et al., Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5, an anti-gp41 human monoclonal antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3348-3352 (1994)
【非特許文献５】Trkola, A., et al., Cross0clade neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IGG. J. Virology, 69, 6609-6617 (1995)
【非特許文献６】Burton D.R., A vaccine for HIV type 1: The antibody perspective. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10018-10023 (1997)
【非特許文献７】Mascola, J.R., et al., Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary isolates by hyperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12, J. Virology, 71, 7198-7206 (1997)
【非特許文献８】Eckhart, L., et al., Immunogenic presentation of a conserved gp41 epitope of human immunodeficiency virus type 1 on recombinant surface antigens of hepatitis B virus. J. of General Virology, 77, 2001-2008 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の概要）
本発明によれば、複合体形成していない、ならびに、結合したエピトープを有する双方の、Ｍａｂ ２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの三次元構造が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
複合体形成した結晶構造において、以下に説明されるように、７個のアミノ酸配列（ＥＬＤＫＷＡＳ）はわずかに歪んだβターンを形成し、タンパク質／ペプチド相互作用の主要部の原因となっている中央のＤＫＷコアを持つ。
【０００５】
本明細書中に与えられる詳細な分析から理解されるように、わずかに歪んだβターンは、それぞれ、アスパラギン酸の骨格および側鎖からアラニンおよびトリプトファンのアミドへの水素結合によって安定化されている。三次元構造において、該エピトープのトリプトファンおよびリシンの側鎖は、重なり合い平行となっている。
【０００６】
これらの三次元構造の解明は、本明細書に記載されるように、複合体の結晶構造に見られるものと同じβターン様立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に制御されたペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を構築することを可能にし、それはエピトープ配列の抗原性を増大させると期待される。
【０００７】
従って、本発明の１つの態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶が提供される。結晶形態のＦａｂ’２Ｆ５フラグメントの単離は、かかる形態のフラグメントの三次元構造を決定することを可能にし、その構造は、以下に記載の図１に示される。以下の表２に記載されるように、結その晶構造に対する、いくらかの特性パラメータが決定された。
【０００８】
結晶はそれ自身の独自の格子定数を有する、別の空間群に成長することもできるが、単離される結晶は、格子定数ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Å、ｃ＝９３．４Åの単位格子を持つ、空間群Ｐ２1２1２1に成長することができる。結晶形態のＦａｂ’２Ｆ５は、通常、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２Ｆ５Ａとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに１９９９年４月９日に登録された原子座標を有する。
【０００９】
本明細書に与えられる、単離結晶を構成しているＦａｂ’２Ｆ５分子は、以下の表１に見られるように、Ｈ鎖９８番目〜H鎖１２０番目のアミノ酸残基を含む重鎖の第３超可変（Ｖ３）ループをもち、それは以下に記載される図４に示される三次元構造、および以下の表３に示される原子座標をもつ。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）をもつペプチドまたはその機能的類似体（ａｎａｌｏｇ）と複合体形成したモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶が提供される。複合体の結晶形態の解明は、この形態の複合体の三次元構造を決定することを可能にし、Ｆａｂ’フラグメントへのペプチドの結合部位の詳細は以下に記載の図３に示される。以下の表２に記載されるように、複合体の結晶構造に対しても、いくつかの特性パラメータが決定された。
【００１１】
結晶は、それ自身の独自の格子定数を持つ別の空間群に成長することもできるが、単離される複合体結晶は、格子定数ａ＝５８．０Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１７５．６Åをもつ空間群Ｐ２1２1２1に成長してもよい。Ｆａｂ’ ２Ｆ５の複合体形成した形態の結晶構造は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２Ｆ５Ｂとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに１９９９年４月９日に登録された原子座標をもつことができる。
【００１２】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳの機能的類似体は、リシンがアルギニンで置換されたもの、および／またはトリプトファンがチロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されたものでありうる。このような機能性類似体の一例は、ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）である。
【００１３】
ペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と結合している際の、Ｆａｂ’２Ｆ５フラグメントの結晶構造の解明は、かかる抗体へ結合している際の、ペプチド エピトープの現実のコンホメーションの詳細を提供し、それは、解析される結晶の種類に依らず、同じでありえる。
【００１４】
ペプチド エピトープのコンホメーションに関して与えられる情報は、抗ＨＩＶワクチンの成分として有用であるかもしれない類似ペプチド、ペプチド模倣体および他の抗原の供給の基礎を提供する。
【００１５】
従って、本発明の別の態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、また図３に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の三次元構造に相当する三次元構造をとるように束縛された合成ペプチドが提供される。
【００１６】
この合成ペプチドは通常、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を含み、図３に見られまた以下に記載されるように、重なり合い平行であるトリプトファンおよびリシン残基鎖をもつ三次元構造のわずかに歪んだβターン立体配置に束縛されている。
【００１７】
エピトープの立体コンホメーション解析は、少なくとも１個のトリプトファンおよびリシンの側鎖が図３に示されるペプチド−タンパク質相互作用を保持し、またＭａｂに結合するアミノ酸によって置換することができるということを示している。例えば、アルギニン（Ｒ）はリシン（Ｋ）の替りに用いることができ、またチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）および荷電していないヒスチジン（Ｈ）はトリプトファン（Ｗ）の替りに用いることができる。１つまたは複数のこのようなアミノ酸置換が行われたペプチドは、そのペプチドはやはりモノクローナル抗体２Ｆ５に結合するという点において、その用語が本明細書において理解されるように、アミノ酸配列ＤＫＷの「機能的類似体」を含むペプチドである。
【００１８】
本明細書において与えられる合成ペプチドは、どのような便宜的手段によって必要とされるコンホメーションに束縛されてもよい。例えば、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその類似体を、図３に示される２個のアミノ酸残基の各々の配向に保持するためにジスルフィド架橋を用いてもよい。このようなジスルフィド架橋は合成ペプチドＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）のシステイン残基の間に形成することができる。
【００１９】
あるいは、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するためにラクタム結合を用いてもよい。このようなラクタム結合は、合成ペプチドＥDapＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）またはＥＥＤＫＷＤａｐＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）のジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）とグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成することができる。
【００２０】
ペプチドの抗原性は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜タンパク質を含むタンパク質などの担体分子と複合化することで増大することがよく知られている。このような担体タンパク質をペプチドに結合させてもよい。
【００２１】
本発明の付加的な態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５に結合するペプチドの製造方法も提供され、この方法はモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）をもつペプチドまたはその機能的類似体とを共結晶化し複合体結晶を形成すること、複合体結晶を解析しＦａｂ’フラグメントとの関係において結合ペプチドの立体配向を決定すること、および決定された立体配向に束縛され少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能性類似体を含むペプチドを合成することを含む。
【００２２】
少なくともアミノ酸ＤＫＷを含むペプチドの機能性類似体は、やはりモノクローナル抗体２Ｆ５に結合するものである。機能性類似体はまた、式Ｘ1ＬＤＫＷＸ2Ｓ（Ｘ1はＥ、Ａ、ＧまたはＱであり、Ｘ2はＡまたはＴ）で表される類似体を含むＥＬＤＫＷＡＳモチーフの既知の類似体にわたる。
【００２３】
本発明の出願ファイルはカラーで製作された図面、すなわち、図１〜４を含む。カラー図面をもつ本特許のコピーは、請求および必要料金の支払により、原出願のＰａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅによって提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の全般的説明）
Ｍａｂ ２Ｆ５（ＩｇＧ）のＦａｂ’フラグメントの結晶構造は、分子置換によって２．０５Åの分解能で解かれ、標準的免疫グロブリンフォールドを採用する。構造の特徴は、伸びた（２２アミノ酸）Ｈ鎖の超可変ループ３（Ｖ−Ｈ３、参照文献９）であり、これはアミノ酸残基Ｈ９８〜１２０を含み、図１のリボン表示図から分かるようにタンパク質表面から離れて延びる。Ｖ−Ｈ３ループは図４に詳細に示されている。Ｖ−Ｈ３ループの原子座標は表３に与えられている。
【００２５】
２．０Åで精密化された結合エピトープをもつＦａｂ’２Ｆ５複合体の構造において、このループは明瞭な電子密度によってよく限定されたものであった。複合化していない形態においては、Ｖ−Ｈ３領域はより不明瞭であるが、両方の鎖のＣ末端を含む、Ｈ鎖定常ドメインのＣ末端領域でのループは、解像度がよりよかった。よりよく限定された電子密度からのコンホメーションは他のモデルを構築するためのテンプレートとして用いた。精密化したモデルは、Ｌ鎖の残基Ｌ１〜Ｌ２１４およびＨ鎖のＨ１〜Ｈ１４６とＨ１５１〜Ｈ２３５プラス定序水分子を含む。Ｆａｂ’２Ｆ５のＬ鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）およびＨ鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）のアミノ酸配列が以下の表１に示されている。複合体の構造に対して、Ｐ１〜Ｐ７はペプチドの残基である。Ｈ鎖の定常ドメインのＨ１４７〜Ｈ１５０のループはいずれの構造においても明かでなかった。（残基には本明細書において、Ｈ鎖に対してＨ１〜Ｈ２３５またＬ鎖に対してＬ１〜Ｌ２１４さらにペプチドに対してＰ１〜Ｐ７と番号をつける。）
前記のループの可動性における差異とともに、複合形態における折曲がり角（ｅｌｂｏｗ ａｎｇｌｅ）は複合していないＦａｂ’２Ｆ５と異なる（１４２°対１４６°）。単位格子が異なっている、すなわち非複合体Ｆａｂ’２Ｆ５は３０％小さい単位格子をもっているので、これらの観察のいずれも結晶充填の人工産物の可能性がある。すべてのＣα原子のオーバーレイは０．７Åのｒｍｓｄを与えが、これらのシフトは抗原結合部位のいかなる変更よりもむしろドメインの一斉運動（すなわち折曲がり角の変化）の結果のように見える。可変領域だけの重ね合わせは０．４Åのｒｍｓｄを与える。構造解析の結果は見出されたＶ−Ｈ３の長いループの挿入に対するいかなる明白な説明ももたらさないが、表面残基のその異常な疎水性は、それが抗体メカニズムにおいてある役割を演じていることを示唆する。それは、結合を強めＦａｂの特異性を強化し、ｇｐ４１のＣ末端の部分のエピトープ配列に対する相互作用に関与している可能性がある。それは、おそらくｇｐ４１のコイルドコイル３量体のコンホメーションを壊して、中和メカニズムの不可欠な部分を形成している可能性さえある。
【００２６】
複合体の構造において、ＥＬＤＫＷＡＳペプチドは、Ｐ６−Ａｌａのアミド窒素からＰ３−Ａｓｐのカルボニル酸素への３．１Åの水素結合をもち、Ｐ４−ＬｙｓとＰ５−Ｔｒｐの間に中心のある僅かに歪んだタイプＩβターンを形成する（図２および３に見られる）。この配列は、ターン中の位置２も３もグリシンではなく（参照文献１０）、むしろ嵩高い残基リシンおよびトリプトファンであるという点で非典型的である。Ｐ５−Ｔｒｐに対する２面角はラマチャンドラン・プロットの「好ましくない」領域にある（φ＝１０１．７°、ψ＝８．７°）。
【００２７】
複合体構造の別の興味ある特徴は、約３．８Åの距離でのＰ４−Ｌｙｓの伸び切ったアルキル鎖およびＰ５−Ｔｒｐの芳香族環の間の疎水性相互作用による、隣接するＰ５−ＴｒｐとＰ４−Ｌｙｓの側鎖の重なり合う配置である。疎水性メチレングループがＰ５−ＴｒｐとＨ５４−Ｔｒｐの間にサンドイッチされているリシンの側鎖は、末端のアミノ基で鋭く曲がり、Ｈ５６−ＡｓｐおよびＨ５８−Ａｓｐと相互作用している。Ｐ５−Ｔｒｐの主たる疎水性相互作用はＰ４−Ｌｙｓのメチレングループであるが、その芳香族環系から４Å以内の他の疎水性残基にはＨ１０３−ＰｒｏおよびＨ３２−ＰｈｅおよびＨ１１３−Ａｒｇの側鎖のメチレングループが含まれる。ペプチド立体配置の安定性にとっての鍵となる要素はＰ３−Ａｓｐの側鎖の配向であり、これはすべて約２．８Åの距離でＬ９６−Ｈｉｓ−ＮεおよびＨ１００−Ａｒｇ−ＮＨ１だけでなくＰ５−Ｔｒｐの主鎖アミドと強い水素結合を形成する。３．０Åの距離でＰ５−Ｔｒｐ−Ｎε１と会合する水分子もまた、各々２．７Åおよび２．８Åの距離でＨ３３−ＧｌｙおよびＨ１０１−Ａｒｇの主鎖カルボニルと強い水素結合を形成する。この解析から、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ（ＤＫＷ）トリオがタンパク質／ペプチド相互作用の本質的要素であると結論することができる。
【００２８】
この結論は、ＤＫＷコア以外の変化は結合に劇的な効果を及ぼさず、一方トリオ内の重大な変更は通常中和を妨げるという変異体の研究によって支持される（参照文献５）。ＬＤＫＷモチーフは、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質配列の間で８３％保存されていると見積もられた（参照文献４）。エピトープの重要部分、ＤＫＷに対して、１９９７ ｔｏ １９９８ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（参照文献１１）中のすべての同源系統群の配列決定されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質２０６種の間では保存率は８６％である。Ｂ同源系統群のなかでは、保存率は９２％である（９１／９９配列）。Ｍａｂ ２Ｆ５でのファージライブラリスクリーニングはまた、ＤＲＷコアをもつ配列を選択した（参照文献４）。アルギニンでＰ４−Ｌｙｓを置換した（すなわち、ペプチドＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）複合体の構造は、同一のペプチドコンホーメーションを示し、コンセンサスエピトープをもつここで報告する複合体のように相互作用する。複合体の形成により埋もれた全接触可能面積は１０２５Å2である（半径１．４Åのプローブを用いて決定された、完全な複合体とペプチドおよび非複合Ｆａｂ’の表面積の合計との接触可能面積の差として計算される（参照文献１２））。複合体Ｆａｂ’２Ｆ５＋ＥＬＤＫＷＡＳのペプチド座標は表４に示され、複合体Ｆａｂ’２Ｆ５＋ＥＬＤＲＷＡＳのペプチド座標は表５に示される。
【００２９】
Ｆａｂ’２Ｆ５との複合体に見出され図３に詳細に見られるｇｐ４１エピトープのコンホメーションは予想されなかった。らせんコンホメーションが提案され（参照文献１３）、それはｇｐ４１のエクトドメインに認められたコイルドコイルの伸長と矛盾がなかった（参照文献１４〜１９）。２つの報告（参照文献１４，１９）は部分的配列を含んでいるが、ＨＩＶ−１（参照文献１４〜１６）またはＳＩＶ（参照文献１７〜１９）ｇｐ４１のほとんどの構造解析はエピトープ配列を組込まない。一方では（参照文献１４）、結晶化部分のＣ末端のＥＬＤにαらせん構造、長い（３７ａａ）らせんの延長を採用した。他方では、Ｃ末端は構造のないコイルである（参照文献１９）。
【００３０】
全エピトープのコンホメーションは、エピトープを９個のアミノ酸リンカーによってグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端に結合させた融合タンパク質の一部分として決定された（参照文献２０）。この環境では、エピトープは一連の窮屈なターンの一部分を形成するが、本明細書に記載される結果に見られるβターンではなかった。ＧＳＴ−融合構造においては、エピトープペプチドは結晶中の隣接する分子と相互作用し、結晶の充填力が観測されるコンホメーションに導いたということがほぼ確実である。この構造のｇｐ４１ペプチド部分はまた屈曲性を示す大きな熱パラメータをもっていた。
【００３１】
予備的なＮＭＲ測定は、ＥＬＤＫＷＡＳ配列はほとんどまたは全く安定な２次構造をとらないということを示唆していた。本明細書で明らかにされるＦａｂ’２Ｆ５の結晶構造は、このエピトープが赤血球凝集素（参照文献２、２１）または組換え体の抗体（参照文献２２）のループに導入された場合に観察されるより強い免疫応答を説明し、これらの場合βターンコンホメーションが誘起される可能性があり、エピトープの移植が２Ｆ５に似る結合特異性のあるすぐれた体液性応答を示すが生きているウイルスを中和できない肝炎Ｂウイルスの表面抗原（参照文献８）と対照をなし、正しいエピトープコンホメーションの重要性を際立たせている。
【００３２】
本明細書で記載されるｇｐ４１エピトープのコンホメーションは、ウイルスエンベロープでの成熟したｇｐ４１／ｇｐ１２０の３量体の形成の後、あるいは可能性として融合過程の間に一時的に形成されるかもしれない。中間の「嵌め込まれてない」また融合しない形態だけでなく、本明細書でなされた構造決定において認められた安定な融合する（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）形態を含むｇｐ４１に対するコンホメーションの範囲は、何人かの研究者によって提案されてきた（参照文献１４、２３）。抗原の短命さは、その低い抗原性およびほとんどの感染患者の抗血清にＭａｂ ２Ｆ５が結果的に欠如していることと合致している。そのうえ、チンパンジにおけるＭａｂ ２Ｆ５での受動免疫ではＨＩＶ−１を中和できず、感染を遅らせウイルスの数を減少させたが防護にはならなかった（参照文献６）。この結果は、抗体が低濃度であることまたは抗原のコンホメーションの短命さのいずれかのために、おそらく抗体結合の機会が十分でないことによる。ｇｐ４１に対する唯一の確認された交差中和抗体として、Ｍａｂ ２Ｆ５はＨＩＶ−１ワクチンの探求において重要な焦点である。それは今日までに確認された３種の広範に中和するモノクローナル抗体の内の１つであり、短い連続するエピトープをもつ唯一のものである。交差中和Ｍａｂとして知られている他の２つは、各々ＣＤ４結合部位およびｇｐ１２０のＶ３／Ｖ４ループのエピトープを定めるｂ１２および２Ｇ１２であるが（参照文献６）、これらの場合、エピトープは不連続でペプチドと炭水化物相互作用の両方を含む（参照文献５、６）。
【００３３】
Ｆａｂ’２Ｆ５の構造中に見出されたｇｐ４１配列のコンホメーションをとるように束縛されたペプチド模倣体の開発は、エピトープの低い抗原性を克服し、この化合物を将来のＨＩＶ−１ワクチンの有用な成分とするであろう。
【実施例】
【００３４】
（実施例）
前記の開示は一般的に本発明を記載する。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られる。これらの実施例は例示のためにのみ記載され本発明の範囲を限定しようとするものではない。形態の変更および同等物の置換は状況が便法を示唆するかまたはそうなる場合に予想されている。特定の用語が本実施例で使われているが、このような用語は説明のためであり、限定するためではない。
【００３５】
用いられるがこの開示および実施例では明示的に記載されていない分子遺伝学、ペプチド模倣体の化学、タンパク質生化学、結晶学および免疫学の方法は、科学的文献に多く報告されており、十分に当分野の技術者の能力の範囲内にある。
【００３６】
実施例１
この実施例は、Ｆａｂ’２Ｆ５およびそのエピトープ複合体の調製、精製および結晶化を示す。
【００３７】
未処理のヒトＩＡＭ ２Ｆ５ ＩｇＧ抗体を、標準的なペプシンプロトコルを用いてＦ（ａｂ’）2に変換した。Ｆ（ａｂ’）2を次に、安定のために溶液に加えられた１％（ｗ／ｖ）臨床用ヒトアルブミンとともに保存した。アルブミンからタンパク質を分離するために、ＤＥ５２セルロースを２０ｍＭトリスｐＨ８．０中で膨潤させ、幅３ｃｍで高さ５ｃｍのカラムに充填し、約３０ｍＬのベッドボリュームとした。コラムを２Ｌの２０ｍＭトリスｐＨ８．０で一夜洗浄した。
【００３８】
濃度１．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質５５ｍＬを２回４〜５Ｌの２０ｍＭトリスｐＨ８．０で透析し、伝導度および緩衝液のｐＨ、流出およびタンパク質濃度を調べ、タンパク質がカラムに結合したことを確認した。タンパク質を１〜５ｍＬ／分でポンプで送ることによってカラムに装填した。アルブミンはカラムに結合し一方Ｆ（ａｂ’）２は結合しない。緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスｐＨ８．０）を、ＯＤ280がベースラインに下降するまでカラムに流し、ほぼ７ｍＬのフラクションを得た。
【００３９】
アルブミンを、２０ｍＭトリスｐＨ８、２０ｍＭトリスｐＨ８．０＋０．２ＭＮａＣｌの塩勾配で溶出させ、他のタンパク質が存在しないことを確認した。流出タンパク質を濃縮し、２３ｍｇ／ｍｌで５×５００μＬのＦ（ａｂ’）2を得た。ｋ−鎖を標的にするポジティッブ抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ、それに続くヒト抗体分子のＦｃ部分を標的とするネガティッブアッセイによってだけでなく、還元および非還元ｎａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって、試料がＦ（ａｂ’）2であることを確認した。
【００４０】
２３ｍｇ／ｍＬの２００μＬのＦａｂ’を０．１ＭトリスｐＨ８．０で４ｍＬに希釈した。０．１ＭトリスｐＨ８．０中の４００μＬ １００ｍＭ ＤＴＴをその４ｍＬに加え、ＤＴＴ中１０ｍＭの最終濃度を得た。この溶液を１時間室温でインキュベートし、０．１ＭトリスｐＨ８．０中３０μＬの５００ｍＭのヨードアセトアミド溶液を加えその溶液をさらに３０分放置した。Ｆａｂ’を２０ｍＭトリスｐＨ８．０で一夜透析し、結晶化のセットアップに用いるために１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【００４１】
複合していないＦａｂ’の結晶は、ｐＨ５．８の１．０Ｍ硫酸アンモニウムを沈殿剤として、５ｍｇ／ｍＬタンパク質のハンギングドロップから成長し、針状に成長した。複合体は、３：１の比でペプチドＥＬＤＫＷＡＳをタンパク質に加え、一夜インキュベートし、その後ｐＨ７．０の１．６Ｍ硫酸アンモニウムを沈殿剤として用い、ｐＨ５．８の５ｍｇ／ｍＬ複合体のハンギングドロップを設置することによって、共結晶化した。結晶は大きな正方両錐体として２日で成長した。
【００４２】
Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメインの配列は最近公表され（参照文献１０）、アミノ酸Ｈ１１０、それは当初言われたようなプロリンでなくセリンである、の唯一の訂正以外は本研究で用いられたものと一致する。Ｆａｂ’フラグメントの可変および定常ドメインの完全なアミノ酸配列は以下の表１に示される（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６および７）。
【００４３】
フリーＦａｂ’結晶は空間群Ｐ２1２1２1（単位格子：ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Å、ｃ＝９４．７Å）に属し、針状結晶に成長する。複合体の結晶も空間群Ｐ２1２1２1（単位格子：ａ＝５９．０Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１７５．６Å）であり、正方両錐体に成長する。結晶をデータ収集のため瞬間凍結した。データを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｒｐのｍｉｒｒｏｒ ｏｐｔｉｃｓとＭａｒ３４５ ｉｍａｇｅ ｐｌａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒとを備えるＲｉｇａｋｕＦＲ−Ｃ（Ｆａｂ’２Ｆ５）、およびＭａｒ３０ ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてブルックヘブンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで（複合体）収集した。データをＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて処理した。
【００４４】
実施例２
この実施例はＦａｂ’２Ｆ５複合および非複合体の構造の解を記載する。
【００４５】
Ｆａｂ’２Ｆ５複合体の構造を、ＰＤＢエントリ１ＣＬＺ（参照文献２５）マイナス側鎖および超可変ループをモデルとして用いて分子置換（参照文献２４）により解いた。定常および可変領域を独立の探査モデルとして用いた。補正された解は３．３Åまでのデータを用いて相関係数は３５．３（Ｒ＝４７．３％）であった。ＣＮＳパッケージ（参照文献２６）を精密化に用いた。ポリアラニンモデルの剛体の精密化の後生成する２Ｆo−Ｆcマップはほとんどの側鎖の位置決定を可能にした。シミュレートされたアニーリングサイクルの後、超可変ループを含めた。ペプチドの密度はこの時点で明かで曖昧さなく当て嵌めることができた。別のアニーリングサイクル、位置およびＢ−ファクタの精密化の後、水を含め、＞３．５のピークを供与または受容原子から適当な距離に差マップに見出した。
【００４６】
複合していないＦａｂ’２Ｆ５の構造を、精密化されたＦａｂ’２Ｆ５複合体マイナスペプチドを探査モデルとして分子置換によって解いた。相関係数は５３．７、Ｒ＝３９．０％であった。精密化は複合体に対するものと同じ手順で行った。データ収集、処理および構造の精密化の統計は以下の表２に与えられる。結晶構造の座標は、非複合構造に対して２Ｆ５Ａ、Ｆａｂ’２Ｆ５−エピトープ複合体に対して２Ｆ５ＢのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒでブルックヘブンのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録された。
【００４７】
実施例３
この実施例は、束縛されたペプチドベースのワクチンの合理的なデザインにおけるＫａｔｉｎｇｅｒエピトープ（実施例１および２）の三次元構造の情報の有用性を例示する。
【００４８】
１．ＥＣＤＫＷＣＳ ＣＬＰ−６３４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
構造の情報に基づいて、ＫａｔｉｎｇｅｒエピトープをペプチドＥＣＤＫＷＣＳ（ＣＬＰ−６３４）の位置２および６の間のジスルフィド架橋によって束縛することが可能である。
【００４９】
線状ペプチドＥＣＤＫＷＣＳは自動的でなく、ｔ−Ｂｏｃ化法とともに標準的な固相ペプチド合成法を用いることによってＰＡＭ支持体上で合成される。粗ペプチドを高−ＨＦ法によって樹脂から切り離した。粗材料（５４ｍｇ）をメタノール（５００ｍＬ）で溶解した。メタノール中５０ｍＭヨウ素を、溶液が薄い黄色になるまで、攪拌しながら滴下した。１分間攪拌後、Ｄｏｗｅｘ ＩＸ２−２００（アセテート）樹脂（約９ｇ）を加えた。溶液が無色になるまで攪拌を続けた。樹脂をフィルタで除去し、５０ｍＬの水を加え、混合物を減圧濃縮し、凍結乾燥した。粗環状ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００５０】
２．ＥｄａｐＤＫＷＥＳ ＣＬＰ−１３０９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）
構造の情報に基づいて、ＫａｔｉｎｇｅｒエピトープをペプチドＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＣＬＰ−１３０９）の位置２および６の間のラクタム結合によって束縛することも可能である。
【００５１】
ペプチド、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｃｂｚ）−Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂をＰＡＭ支持固体上で集積した。続いてＤａｐ（２）およびＧｌｕ（６）の側鎖の保護基を２５％ピペラジン処理ではずした。側鎖の環化を４当量のＨＢＴＵおよび８当量のＤＩＥＡを加え、一夜混合物を振り動かすことによって樹脂上で行った。環状ペプチドを標準のＨＦ法によって切り離し、粗ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。この実施例で用いられた省略形は、
Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸
ＨＢＴＵ＝Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＥＡ＝ジ−イソプロピルエチルアミン
ＰＡＭ＝４−ヒドロキシメチル−フェニルアセトアミドメチル樹脂
Ｂｚｌ＝ベンジル
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ＝２・クロロベンジルオキシカルボニル
Ｆｏｒ＝ホルミル
ｔ−Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル
Ｆｍ＝フルオレニルメチル
である。
【００５２】
両ペプチドＣＬＰ−６３４とＣＬＰ−１３０９は、モノクローナル抗体２Ｆ５と免疫複合体を形成できることが見出され、次いでＦａｂ’フラグメントと共結晶化された。これらの結果は、束縛されたペプチドはＫａｔｉｎｇｅｒエピトープを模倣でき、ペプチドベースのワクチンとして有用でありうるということを示している。
【００５３】
実施例４
この実施例は、抗ＨＩＶワクチンとして使用するための、束縛されたペプチド−担体複合体の形成を例示する。
【００５４】
束縛されたペプチドＣＬＰ−１３０９（実施例３）と担体タンパク質を複合化するために、４量体ペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｙをＣＬＳ−１３０９にＮ末端で結合し、得られるペプチドをＣＬＰ−１４９１と呼ぶ。同様に、４量体ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＣｙｓをＣＬＰ−１３０９にＣ末端で結合し、得られるペプチドをＣＬＰ−１４９２と呼ぶ。
【００５５】
５０マイクロリットルのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ、Ｐｉｅｒｃｅ、２ｍｇ；１ｍＬのテトラヒドロフランまたはメタノール中６．３ｍｍｏｌ）をタンパク質溶液（２ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５中ほぼ１０ｍｇのＨｉｎ４７または破傷風トキソイド）に加えた。反応混合物をアルゴン中室温で３０分間攪拌した。反応混合物を、２０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２で平衡に達したＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２０×３００ｍｍ）に通し、同じ緩衝液で溶出させた。溶出は２３０ｎｍの吸光度によってモニタし、ピークの溶出タンパク質を溜めた。担体に組込まれたマレイミド基の数を、過剰の２−メルカプトエタノールを活性化された担体−ＭＢＳに加え、改良されたエルマン法を用いて過剰分を逆滴定することによって測定した（参照文献３１）。
【００５６】
ペプチド−担体複合体に対する一般的なプロトコルは記載されてきた（参照文献３２）。簡単に記載すると、脱ガスされたＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中の合成ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）と担体−ＭＢＳ（１ｍｇ／ｍＬ）とを混合した。反応混合物をアルゴン雰囲気下室温で一夜攪拌した。過剰のＮ−エチル−マレイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて反応を終息させ、攪拌をさらに１時間続けた。不溶性の沈殿物を濾別し、濾液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィにかけた。ペプチド−担体複合体を集めた。担体とペプチドのモル比はアミノ酸分析で測定された。
【００５７】
（開示の概要）
この開示の概要として、非複合形態の、およびエピトープＥＬＤＬＷＡＳと複合体形成したＦａｂ’２Ｆ５フラグメントの結晶構造が解明され、そして、ペプチドは、そのペプチド−タンパク質相互作用による束縛された構造に対応するように合成された。改良は本発明の範囲内で可能である。
表１
【００５８】
【表１】
【００５９】
表２
【００６０】
【表２】
【００６１】
表３
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
表４
【００６９】
【表９】
【００７０】
【表１０】
【００７１】
表５
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
参照文献
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（参照文献２７）およびＲａｓｔｅｒ ３Ｄ（参照文献２８）により作成された、紫色のＨ鎖、青色のＬ鎖およびタンパク質表面から延びる伸びたＶＨ３ループ（金色）を示す、結晶化Ｆａｂ’２Ｆ５のカラーリボン表示図である。
【図２】プログラムＯ（参照文献２９）により作成された、ＥＬＤＫＷＡＳペプチドの密度モデルの着色立体プロット図であり、このＦｏ−Ｆｃマップは、ペプチドに限定して計算され、３σで輪郭を示してあり、輪郭のレベルでのＰ７−Ｓｅｒの密度のわずかな破れが、結合したエピトープの末端での自由度がわずかに増大していることを示している。
【図３】プログラムＳＥＴＯＲ（参照文献３０）を用いて作成された、タンパク質−ペプチド相互作用を示す、Ｆａｂ’２Ｆ５の抗原結合部位のカラー表示図である。残基は、原子の種類別に着色され、酸素は赤色、窒素は青色、炭素は灰色およびイオウは黄色であり、明確性のためにエピトープと相互作用する疎水性側鎖のいくつかは省略されており、全ての結合の長さはÅで示される。
【図４】プログラムＳＥＴＯＲ（参照文献３０）を用いて作成した、アミノ酸残基Ｈ９８〜Ｈ１２０を含むＦａｂ’２Ｆ５複合体のＨ鎖の第３超可変ループのカラー表示図であり、残基は原子の種類別に着色されている。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、結晶学ならびに免疫学、特には、モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの三次元構造の初めての解明に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）２Ｆ５は、ＨＩＶ−１のはなはだ多くの同源系統群の初代臨床的分離株ならびに実験室株の双方に有効な中和剤であり、時にはＫａｔｉｎｇｅｒエピトープとも称される、ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ４１の、広範に保存されているペプチド配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と反応する（参照文献１〜７:非特許文献１〜７。本出願を通じて、本発明が属する技術分野の現状をより完全に説明するために、様々な文献が括弧中に参照される。各々の引用の完全な文献情報は、明細書の最後にある。これらの参照文献の開示は、参照によって、本開示に組み込む。）このため、Ｍａｂ ２Ｆ５は、ＨＩＶ−１ワクチンの開発において、より多くの興味がある。抗原性提示（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の研究に基づいて、このエピトープ配列の抗原性は、分子的構造に依存するものであると結論された（参照文献８:非特許文献８）。
【非特許文献１】Muster, T., et al., A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J. Virology, 67, 6642-6647 (1993)
【非特許文献２】Muster, T., et al., Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS. J. Virology, 68, 4031-4034 (1994)
【非特許文献３】Purtcher, M., et al., A broadly neutralizing human monoclonal antibody against gp41 of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). AIDS Res. And Human Retroviruses, 10, 1651-1658 (1994)
【非特許文献４】Conley, A.J., et al., Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5, an anti-gp41 human monoclonal antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3348-3352 (1994)
【非特許文献５】Trkola, A., et al., Cross0clade neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IGG. J. Virology, 69, 6609-6617 (1995)
【非特許文献６】Burton D.R., A vaccine for HIV type 1: The antibody perspective. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10018-10023 (1997)
【非特許文献７】Mascola, J.R., et al., Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary isolates by hyperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12, J. Virology, 71, 7198-7206 (1997)
【非特許文献８】Eckhart, L., et al., Immunogenic presentation of a conserved gp41 epitope of human immunodeficiency virus type 1 on recombinant surface antigens of hepatitis B virus. J. of General Virology, 77, 2001-2008 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の概要）
本発明によれば、複合体形成していない、ならびに、結合したエピトープを有する双方の、Ｍａｂ ２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの三次元構造が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
複合体形成した結晶構造において、以下に説明されるように、７個のアミノ酸配列（ＥＬＤＫＷＡＳ）はわずかに歪んだβターンを形成し、タンパク質／ペプチド相互作用の主要部の原因となっている中央のＤＫＷコアを持つ。
【０００５】
本明細書中に与えられる詳細な分析から理解されるように、わずかに歪んだβターンは、それぞれ、アスパラギン酸の骨格および側鎖からアラニンおよびトリプトファンのアミドへの水素結合によって安定化されている。三次元構造において、該エピトープのトリプトファンおよびリシンの側鎖は、重なり合い平行となっている。
【０００６】
これらの三次元構造の解明は、本明細書に記載されるように、複合体の結晶構造に見られるものと同じβターン様立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に制御されたペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を構築することを可能にし、それはエピトープ配列の抗原性を増大させると期待される。
【０００７】
従って、本発明の１つの態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶が提供される。結晶形態のＦａｂ’２Ｆ５フラグメントの単離は、かかる形態のフラグメントの三次元構造を決定することを可能にし、その構造は、以下に記載の図１に示される。以下の表２に記載されるように、結その晶構造に対する、いくらかの特性パラメータが決定された。
【０００８】
結晶はそれ自身の独自の格子定数を有する、別の空間群に成長することもできるが、単離される結晶は、格子定数ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Å、ｃ＝９３．４Åの単位格子を持つ、空間群Ｐ２1２1２1に成長することができる。結晶形態のＦａｂ’２Ｆ５は、通常、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２Ｆ５Ａとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに１９９９年４月９日に登録された原子座標を有する。
【０００９】
本明細書に与えられる、単離結晶を構成しているＦａｂ’２Ｆ５分子は、以下の表１に見られるように、Ｈ鎖９８番目〜H鎖１２０番目のアミノ酸残基を含む重鎖の第３超可変（Ｖ３）ループをもち、それは以下に記載される図４に示される三次元構造、および以下の表３に示される原子座標をもつ。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）をもつペプチドまたはその機能的類似体（ａｎａｌｏｇ）と複合体形成したモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶が提供される。複合体の結晶形態の解明は、この形態の複合体の三次元構造を決定することを可能にし、Ｆａｂ’フラグメントへのペプチドの結合部位の詳細は以下に記載の図３に示される。以下の表２に記載されるように、複合体の結晶構造に対しても、いくつかの特性パラメータが決定された。
【００１１】
結晶は、それ自身の独自の格子定数を持つ別の空間群に成長することもできるが、単離される複合体結晶は、格子定数ａ＝５８．０Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１７５．６Åをもつ空間群Ｐ２1２1２1に成長してもよい。Ｆａｂ’ ２Ｆ５の複合体形成した形態の結晶構造は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２Ｆ５Ｂとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに１９９９年４月９日に登録された原子座標をもつことができる。
【００１２】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳの機能的類似体は、リシンがアルギニンで置換されたもの、および／またはトリプトファンがチロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されたものでありうる。このような機能性類似体の一例は、ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）である。
【００１３】
ペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と結合している際の、Ｆａｂ’２Ｆ５フラグメントの結晶構造の解明は、かかる抗体へ結合している際の、ペプチド エピトープの現実のコンホメーションの詳細を提供し、それは、解析される結晶の種類に依らず、同じでありえる。
【００１４】
ペプチド エピトープのコンホメーションに関して与えられる情報は、抗ＨＩＶワクチンの成分として有用であるかもしれない類似ペプチド、ペプチド模倣体および他の抗原の供給の基礎を提供する。
【００１５】
従って、本発明の別の態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、また図３に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の三次元構造に相当する三次元構造をとるように束縛された合成ペプチドが提供される。
【００１６】
この合成ペプチドは通常、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を含み、図３に見られまた以下に記載されるように、重なり合い平行であるトリプトファンおよびリシン残基鎖をもつ三次元構造のわずかに歪んだβターン立体配置に束縛されている。
【００１７】
エピトープの立体コンホメーション解析は、少なくとも１個のトリプトファンおよびリシンの側鎖が図３に示されるペプチド−タンパク質相互作用を保持し、またＭａｂに結合するアミノ酸によって置換することができるということを示している。例えば、アルギニン（Ｒ）はリシン（Ｋ）の替りに用いることができ、またチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）および荷電していないヒスチジン（Ｈ）はトリプトファン（Ｗ）の替りに用いることができる。１つまたは複数のこのようなアミノ酸置換が行われたペプチドは、そのペプチドはやはりモノクローナル抗体２Ｆ５に結合するという点において、その用語が本明細書において理解されるように、アミノ酸配列ＤＫＷの「機能的類似体」を含むペプチドである。
【００１８】
本明細書において与えられる合成ペプチドは、どのような便宜的手段によって必要とされるコンホメーションに束縛されてもよい。例えば、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその類似体を、図３に示される２個のアミノ酸残基の各々の配向に保持するためにジスルフィド架橋を用いてもよい。このようなジスルフィド架橋は合成ペプチドＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）のシステイン残基の間に形成することができる。
【００１９】
あるいは、アミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するためにラクタム結合を用いてもよい。このようなラクタム結合は、合成ペプチドＥDapＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）またはＥＥＤＫＷＤａｐＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）のジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）とグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成することができる。
【００２０】
ペプチドの抗原性は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの外膜タンパク質を含むタンパク質などの担体分子と複合化することで増大することがよく知られている。このような担体タンパク質をペプチドに結合させてもよい。
【００２１】
本発明の付加的な態様において、モノクローナル抗体２Ｆ５に結合するペプチドの製造方法も提供され、この方法はモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）をもつペプチドまたはその機能的類似体とを共結晶化し複合体結晶を形成すること、複合体結晶を解析しＦａｂ’フラグメントとの関係において結合ペプチドの立体配向を決定すること、および決定された立体配向に束縛され少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能性類似体を含むペプチドを合成することを含む。
【００２２】
少なくともアミノ酸ＤＫＷを含むペプチドの機能性類似体は、やはりモノクローナル抗体２Ｆ５に結合するものである。機能性類似体はまた、式Ｘ1ＬＤＫＷＸ2Ｓ（Ｘ1はＥ、Ａ、ＧまたはＱであり、Ｘ2はＡまたはＴ）で表される類似体を含むＥＬＤＫＷＡＳモチーフの既知の類似体にわたる。
【００２３】
本発明の出願ファイルはカラーで製作された図面、すなわち、図１〜４を含む。カラー図面をもつ本特許のコピーは、請求および必要料金の支払により、原出願のＰａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅによって提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の全般的説明）
Ｍａｂ ２Ｆ５（ＩｇＧ）のＦａｂ’フラグメントの結晶構造は、分子置換によって２．０５Åの分解能で解かれ、標準的免疫グロブリンフォールドを採用する。構造の特徴は、伸びた（２２アミノ酸）Ｈ鎖の超可変ループ３（Ｖ−Ｈ３、参照文献９）であり、これはアミノ酸残基Ｈ９８〜１２０を含み、図１のリボン表示図から分かるようにタンパク質表面から離れて延びる。Ｖ−Ｈ３ループは図４に詳細に示されている。Ｖ−Ｈ３ループの原子座標は表３に与えられている。
【００２５】
２．０Åで精密化された結合エピトープをもつＦａｂ’２Ｆ５複合体の構造において、このループは明瞭な電子密度によってよく限定されたものであった。複合化していない形態においては、Ｖ−Ｈ３領域はより不明瞭であるが、両方の鎖のＣ末端を含む、Ｈ鎖定常ドメインのＣ末端領域でのループは、解像度がよりよかった。よりよく限定された電子密度からのコンホメーションは他のモデルを構築するためのテンプレートとして用いた。精密化したモデルは、Ｌ鎖の残基Ｌ１〜Ｌ２１４およびＨ鎖のＨ１〜Ｈ１４６とＨ１５１〜Ｈ２３５プラス定序水分子を含む。Ｆａｂ’２Ｆ５のＬ鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）およびＨ鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）のアミノ酸配列が以下の表１に示されている。複合体の構造に対して、Ｐ１〜Ｐ７はペプチドの残基である。Ｈ鎖の定常ドメインのＨ１４７〜Ｈ１５０のループはいずれの構造においても明かでなかった。（残基には本明細書において、Ｈ鎖に対してＨ１〜Ｈ２３５またＬ鎖に対してＬ１〜Ｌ２１４さらにペプチドに対してＰ１〜Ｐ７と番号をつける。）
前記のループの可動性における差異とともに、複合形態における折曲がり角（ｅｌｂｏｗ ａｎｇｌｅ）は複合していないＦａｂ’２Ｆ５と異なる（１４２°対１４６°）。単位格子が異なっている、すなわち非複合体Ｆａｂ’２Ｆ５は３０％小さい単位格子をもっているので、これらの観察のいずれも結晶充填の人工産物の可能性がある。すべてのＣα原子のオーバーレイは０．７Åのｒｍｓｄを与えが、これらのシフトは抗原結合部位のいかなる変更よりもむしろドメインの一斉運動（すなわち折曲がり角の変化）の結果のように見える。可変領域だけの重ね合わせは０．４Åのｒｍｓｄを与える。構造解析の結果は見出されたＶ−Ｈ３の長いループの挿入に対するいかなる明白な説明ももたらさないが、表面残基のその異常な疎水性は、それが抗体メカニズムにおいてある役割を演じていることを示唆する。それは、結合を強めＦａｂの特異性を強化し、ｇｐ４１のＣ末端の部分のエピトープ配列に対する相互作用に関与している可能性がある。それは、おそらくｇｐ４１のコイルドコイル３量体のコンホメーションを壊して、中和メカニズムの不可欠な部分を形成している可能性さえある。
【００２６】
複合体の構造において、ＥＬＤＫＷＡＳペプチドは、Ｐ６−Ａｌａのアミド窒素からＰ３−Ａｓｐのカルボニル酸素への３．１Åの水素結合をもち、Ｐ４−ＬｙｓとＰ５−Ｔｒｐの間に中心のある僅かに歪んだタイプＩβターンを形成する（図２および３に見られる）。この配列は、ターン中の位置２も３もグリシンではなく（参照文献１０）、むしろ嵩高い残基リシンおよびトリプトファンであるという点で非典型的である。Ｐ５−Ｔｒｐに対する２面角はラマチャンドラン・プロットの「好ましくない」領域にある（φ＝１０１．７°、ψ＝８．７°）。
【００２７】
複合体構造の別の興味ある特徴は、約３．８Åの距離でのＰ４−Ｌｙｓの伸び切ったアルキル鎖およびＰ５−Ｔｒｐの芳香族環の間の疎水性相互作用による、隣接するＰ５−ＴｒｐとＰ４−Ｌｙｓの側鎖の重なり合う配置である。疎水性メチレングループがＰ５−ＴｒｐとＨ５４−Ｔｒｐの間にサンドイッチされているリシンの側鎖は、末端のアミノ基で鋭く曲がり、Ｈ５６−ＡｓｐおよびＨ５８−Ａｓｐと相互作用している。Ｐ５−Ｔｒｐの主たる疎水性相互作用はＰ４−Ｌｙｓのメチレングループであるが、その芳香族環系から４Å以内の他の疎水性残基にはＨ１０３−ＰｒｏおよびＨ３２−ＰｈｅおよびＨ１１３−Ａｒｇの側鎖のメチレングループが含まれる。ペプチド立体配置の安定性にとっての鍵となる要素はＰ３−Ａｓｐの側鎖の配向であり、これはすべて約２．８Åの距離でＬ９６−Ｈｉｓ−ＮεおよびＨ１００−Ａｒｇ−ＮＨ１だけでなくＰ５−Ｔｒｐの主鎖アミドと強い水素結合を形成する。３．０Åの距離でＰ５−Ｔｒｐ−Ｎε１と会合する水分子もまた、各々２．７Åおよび２．８Åの距離でＨ３３−ＧｌｙおよびＨ１０１−Ａｒｇの主鎖カルボニルと強い水素結合を形成する。この解析から、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ（ＤＫＷ）トリオがタンパク質／ペプチド相互作用の本質的要素であると結論することができる。
【００２８】
この結論は、ＤＫＷコア以外の変化は結合に劇的な効果を及ぼさず、一方トリオ内の重大な変更は通常中和を妨げるという変異体の研究によって支持される（参照文献５）。ＬＤＫＷモチーフは、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質配列の間で８３％保存されていると見積もられた（参照文献４）。エピトープの重要部分、ＤＫＷに対して、１９９７ ｔｏ １９９８ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（参照文献１１）中のすべての同源系統群の配列決定されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質２０６種の間では保存率は８６％である。Ｂ同源系統群のなかでは、保存率は９２％である（９１／９９配列）。Ｍａｂ ２Ｆ５でのファージライブラリスクリーニングはまた、ＤＲＷコアをもつ配列を選択した（参照文献４）。アルギニンでＰ４−Ｌｙｓを置換した（すなわち、ペプチドＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）複合体の構造は、同一のペプチドコンホーメーションを示し、コンセンサスエピトープをもつここで報告する複合体のように相互作用する。複合体の形成により埋もれた全接触可能面積は１０２５Å2である（半径１．４Åのプローブを用いて決定された、完全な複合体とペプチドおよび非複合Ｆａｂ’の表面積の合計との接触可能面積の差として計算される（参照文献１２））。複合体Ｆａｂ’２Ｆ５＋ＥＬＤＫＷＡＳのペプチド座標は表４に示され、複合体Ｆａｂ’２Ｆ５＋ＥＬＤＲＷＡＳのペプチド座標は表５に示される。
【００２９】
Ｆａｂ’２Ｆ５との複合体に見出され図３に詳細に見られるｇｐ４１エピトープのコンホメーションは予想されなかった。らせんコンホメーションが提案され（参照文献１３）、それはｇｐ４１のエクトドメインに認められたコイルドコイルの伸長と矛盾がなかった（参照文献１４〜１９）。２つの報告（参照文献１４，１９）は部分的配列を含んでいるが、ＨＩＶ−１（参照文献１４〜１６）またはＳＩＶ（参照文献１７〜１９）ｇｐ４１のほとんどの構造解析はエピトープ配列を組込まない。一方では（参照文献１４）、結晶化部分のＣ末端のＥＬＤにαらせん構造、長い（３７ａａ）らせんの延長を採用した。他方では、Ｃ末端は構造のないコイルである（参照文献１９）。
【００３０】
全エピトープのコンホメーションは、エピトープを９個のアミノ酸リンカーによってグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端に結合させた融合タンパク質の一部分として決定された（参照文献２０）。この環境では、エピトープは一連の窮屈なターンの一部分を形成するが、本明細書に記載される結果に見られるβターンではなかった。ＧＳＴ−融合構造においては、エピトープペプチドは結晶中の隣接する分子と相互作用し、結晶の充填力が観測されるコンホメーションに導いたということがほぼ確実である。この構造のｇｐ４１ペプチド部分はまた屈曲性を示す大きな熱パラメータをもっていた。
【００３１】
予備的なＮＭＲ測定は、ＥＬＤＫＷＡＳ配列はほとんどまたは全く安定な２次構造をとらないということを示唆していた。本明細書で明らかにされるＦａｂ’２Ｆ５の結晶構造は、このエピトープが赤血球凝集素（参照文献２、２１）または組換え体の抗体（参照文献２２）のループに導入された場合に観察されるより強い免疫応答を説明し、これらの場合βターンコンホメーションが誘起される可能性があり、エピトープの移植が２Ｆ５に似る結合特異性のあるすぐれた体液性応答を示すが生きているウイルスを中和できない肝炎Ｂウイルスの表面抗原（参照文献８）と対照をなし、正しいエピトープコンホメーションの重要性を際立たせている。
【００３２】
本明細書で記載されるｇｐ４１エピトープのコンホメーションは、ウイルスエンベロープでの成熟したｇｐ４１／ｇｐ１２０の３量体の形成の後、あるいは可能性として融合過程の間に一時的に形成されるかもしれない。中間の「嵌め込まれてない」また融合しない形態だけでなく、本明細書でなされた構造決定において認められた安定な融合する（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）形態を含むｇｐ４１に対するコンホメーションの範囲は、何人かの研究者によって提案されてきた（参照文献１４、２３）。抗原の短命さは、その低い抗原性およびほとんどの感染患者の抗血清にＭａｂ ２Ｆ５が結果的に欠如していることと合致している。そのうえ、チンパンジにおけるＭａｂ ２Ｆ５での受動免疫ではＨＩＶ−１を中和できず、感染を遅らせウイルスの数を減少させたが防護にはならなかった（参照文献６）。この結果は、抗体が低濃度であることまたは抗原のコンホメーションの短命さのいずれかのために、おそらく抗体結合の機会が十分でないことによる。ｇｐ４１に対する唯一の確認された交差中和抗体として、Ｍａｂ ２Ｆ５はＨＩＶ−１ワクチンの探求において重要な焦点である。それは今日までに確認された３種の広範に中和するモノクローナル抗体の内の１つであり、短い連続するエピトープをもつ唯一のものである。交差中和Ｍａｂとして知られている他の２つは、各々ＣＤ４結合部位およびｇｐ１２０のＶ３／Ｖ４ループのエピトープを定めるｂ１２および２Ｇ１２であるが（参照文献６）、これらの場合、エピトープは不連続でペプチドと炭水化物相互作用の両方を含む（参照文献５、６）。
【００３３】
Ｆａｂ’２Ｆ５の構造中に見出されたｇｐ４１配列のコンホメーションをとるように束縛されたペプチド模倣体の開発は、エピトープの低い抗原性を克服し、この化合物を将来のＨＩＶ−１ワクチンの有用な成分とするであろう。
【実施例】
【００３４】
（実施例）
前記の開示は一般的に本発明を記載する。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られる。これらの実施例は例示のためにのみ記載され本発明の範囲を限定しようとするものではない。形態の変更および同等物の置換は状況が便法を示唆するかまたはそうなる場合に予想されている。特定の用語が本実施例で使われているが、このような用語は説明のためであり、限定するためではない。
【００３５】
用いられるがこの開示および実施例では明示的に記載されていない分子遺伝学、ペプチド模倣体の化学、タンパク質生化学、結晶学および免疫学の方法は、科学的文献に多く報告されており、十分に当分野の技術者の能力の範囲内にある。
【００３６】
実施例１
この実施例は、Ｆａｂ’２Ｆ５およびそのエピトープ複合体の調製、精製および結晶化を示す。
【００３７】
未処理のヒトＩＡＭ ２Ｆ５ ＩｇＧ抗体を、標準的なペプシンプロトコルを用いてＦ（ａｂ’）2に変換した。Ｆ（ａｂ’）2を次に、安定のために溶液に加えられた１％（ｗ／ｖ）臨床用ヒトアルブミンとともに保存した。アルブミンからタンパク質を分離するために、ＤＥ５２セルロースを２０ｍＭトリスｐＨ８．０中で膨潤させ、幅３ｃｍで高さ５ｃｍのカラムに充填し、約３０ｍＬのベッドボリュームとした。コラムを２Ｌの２０ｍＭトリスｐＨ８．０で一夜洗浄した。
【００３８】
濃度１．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質５５ｍＬを２回４〜５Ｌの２０ｍＭトリスｐＨ８．０で透析し、伝導度および緩衝液のｐＨ、流出およびタンパク質濃度を調べ、タンパク質がカラムに結合したことを確認した。タンパク質を１〜５ｍＬ／分でポンプで送ることによってカラムに装填した。アルブミンはカラムに結合し一方Ｆ（ａｂ’）２は結合しない。緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスｐＨ８．０）を、ＯＤ280がベースラインに下降するまでカラムに流し、ほぼ７ｍＬのフラクションを得た。
【００３９】
アルブミンを、２０ｍＭトリスｐＨ８、２０ｍＭトリスｐＨ８．０＋０．２ＭＮａＣｌの塩勾配で溶出させ、他のタンパク質が存在しないことを確認した。流出タンパク質を濃縮し、２３ｍｇ／ｍｌで５×５００μＬのＦ（ａｂ’）2を得た。ｋ−鎖を標的にするポジティッブ抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ、それに続くヒト抗体分子のＦｃ部分を標的とするネガティッブアッセイによってだけでなく、還元および非還元ｎａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって、試料がＦ（ａｂ’）2であることを確認した。
【００４０】
２３ｍｇ／ｍＬの２００μＬのＦａｂ’を０．１ＭトリスｐＨ８．０で４ｍＬに希釈した。０．１ＭトリスｐＨ８．０中の４００μＬ １００ｍＭ ＤＴＴをその４ｍＬに加え、ＤＴＴ中１０ｍＭの最終濃度を得た。この溶液を１時間室温でインキュベートし、０．１ＭトリスｐＨ８．０中３０μＬの５００ｍＭのヨードアセトアミド溶液を加えその溶液をさらに３０分放置した。Ｆａｂ’を２０ｍＭトリスｐＨ８．０で一夜透析し、結晶化のセットアップに用いるために１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【００４１】
複合していないＦａｂ’の結晶は、ｐＨ５．８の１．０Ｍ硫酸アンモニウムを沈殿剤として、５ｍｇ／ｍＬタンパク質のハンギングドロップから成長し、針状に成長した。複合体は、３：１の比でペプチドＥＬＤＫＷＡＳをタンパク質に加え、一夜インキュベートし、その後ｐＨ７．０の１．６Ｍ硫酸アンモニウムを沈殿剤として用い、ｐＨ５．８の５ｍｇ／ｍＬ複合体のハンギングドロップを設置することによって、共結晶化した。結晶は大きな正方両錐体として２日で成長した。
【００４２】
Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメインの配列は最近公表され（参照文献１０）、アミノ酸Ｈ１１０、それは当初言われたようなプロリンでなくセリンである、の唯一の訂正以外は本研究で用いられたものと一致する。Ｆａｂ’フラグメントの可変および定常ドメインの完全なアミノ酸配列は以下の表１に示される（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６および７）。
【００４３】
フリーＦａｂ’結晶は空間群Ｐ２1２1２1（単位格子：ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Å、ｃ＝９４．７Å）に属し、針状結晶に成長する。複合体の結晶も空間群Ｐ２1２1２1（単位格子：ａ＝５９．０Å、ｂ＝６５．０Å、ｃ＝１７５．６Å）であり、正方両錐体に成長する。結晶をデータ収集のため瞬間凍結した。データを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｒｐのｍｉｒｒｏｒ ｏｐｔｉｃｓとＭａｒ３４５ ｉｍａｇｅ ｐｌａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒとを備えるＲｉｇａｋｕＦＲ−Ｃ（Ｆａｂ’２Ｆ５）、およびＭａｒ３０ ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてブルックヘブンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで（複合体）収集した。データをＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて処理した。
【００４４】
実施例２
この実施例はＦａｂ’２Ｆ５複合および非複合体の構造の解を記載する。
【００４５】
Ｆａｂ’２Ｆ５複合体の構造を、ＰＤＢエントリ１ＣＬＺ（参照文献２５）マイナス側鎖および超可変ループをモデルとして用いて分子置換（参照文献２４）により解いた。定常および可変領域を独立の探査モデルとして用いた。補正された解は３．３Åまでのデータを用いて相関係数は３５．３（Ｒ＝４７．３％）であった。ＣＮＳパッケージ（参照文献２６）を精密化に用いた。ポリアラニンモデルの剛体の精密化の後生成する２Ｆo−Ｆcマップはほとんどの側鎖の位置決定を可能にした。シミュレートされたアニーリングサイクルの後、超可変ループを含めた。ペプチドの密度はこの時点で明かで曖昧さなく当て嵌めることができた。別のアニーリングサイクル、位置およびＢ−ファクタの精密化の後、水を含め、＞３．５のピークを供与または受容原子から適当な距離に差マップに見出した。
【００４６】
複合していないＦａｂ’２Ｆ５の構造を、精密化されたＦａｂ’２Ｆ５複合体マイナスペプチドを探査モデルとして分子置換によって解いた。相関係数は５３．７、Ｒ＝３９．０％であった。精密化は複合体に対するものと同じ手順で行った。データ収集、処理および構造の精密化の統計は以下の表２に与えられる。結晶構造の座標は、非複合構造に対して２Ｆ５Ａ、Ｆａｂ’２Ｆ５−エピトープ複合体に対して２Ｆ５ＢのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒでブルックヘブンのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録された。
【００４７】
実施例３
この実施例は、束縛されたペプチドベースのワクチンの合理的なデザインにおけるＫａｔｉｎｇｅｒエピトープ（実施例１および２）の三次元構造の情報の有用性を例示する。
【００４８】
１．ＥＣＤＫＷＣＳ ＣＬＰ−６３４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
構造の情報に基づいて、ＫａｔｉｎｇｅｒエピトープをペプチドＥＣＤＫＷＣＳ（ＣＬＰ−６３４）の位置２および６の間のジスルフィド架橋によって束縛することが可能である。
【００４９】
線状ペプチドＥＣＤＫＷＣＳは自動的でなく、ｔ−Ｂｏｃ化法とともに標準的な固相ペプチド合成法を用いることによってＰＡＭ支持体上で合成される。粗ペプチドを高−ＨＦ法によって樹脂から切り離した。粗材料（５４ｍｇ）をメタノール（５００ｍＬ）で溶解した。メタノール中５０ｍＭヨウ素を、溶液が薄い黄色になるまで、攪拌しながら滴下した。１分間攪拌後、Ｄｏｗｅｘ ＩＸ２−２００（アセテート）樹脂（約９ｇ）を加えた。溶液が無色になるまで攪拌を続けた。樹脂をフィルタで除去し、５０ｍＬの水を加え、混合物を減圧濃縮し、凍結乾燥した。粗環状ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００５０】
２．ＥｄａｐＤＫＷＥＳ ＣＬＰ−１３０９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）
構造の情報に基づいて、ＫａｔｉｎｇｅｒエピトープをペプチドＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＣＬＰ−１３０９）の位置２および６の間のラクタム結合によって束縛することも可能である。
【００５１】
ペプチド、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｃｂｚ）−Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂をＰＡＭ支持固体上で集積した。続いてＤａｐ（２）およびＧｌｕ（６）の側鎖の保護基を２５％ピペラジン処理ではずした。側鎖の環化を４当量のＨＢＴＵおよび８当量のＤＩＥＡを加え、一夜混合物を振り動かすことによって樹脂上で行った。環状ペプチドを標準のＨＦ法によって切り離し、粗ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。この実施例で用いられた省略形は、
Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸
ＨＢＴＵ＝Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＥＡ＝ジ−イソプロピルエチルアミン
ＰＡＭ＝４−ヒドロキシメチル−フェニルアセトアミドメチル樹脂
Ｂｚｌ＝ベンジル
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ＝２・クロロベンジルオキシカルボニル
Ｆｏｒ＝ホルミル
ｔ−Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル
Ｆｍ＝フルオレニルメチル
である。
【００５２】
両ペプチドＣＬＰ−６３４とＣＬＰ−１３０９は、モノクローナル抗体２Ｆ５と免疫複合体を形成できることが見出され、次いでＦａｂ’フラグメントと共結晶化された。これらの結果は、束縛されたペプチドはＫａｔｉｎｇｅｒエピトープを模倣でき、ペプチドベースのワクチンとして有用でありうるということを示している。
【００５３】
実施例４
この実施例は、抗ＨＩＶワクチンとして使用するための、束縛されたペプチド−担体複合体の形成を例示する。
【００５４】
束縛されたペプチドＣＬＰ−１３０９（実施例３）と担体タンパク質を複合化するために、４量体ペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｙをＣＬＳ−１３０９にＮ末端で結合し、得られるペプチドをＣＬＰ−１４９１と呼ぶ。同様に、４量体ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＣｙｓをＣＬＰ−１３０９にＣ末端で結合し、得られるペプチドをＣＬＰ−１４９２と呼ぶ。
【００５５】
５０マイクロリットルのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ、Ｐｉｅｒｃｅ、２ｍｇ；１ｍＬのテトラヒドロフランまたはメタノール中６．３ｍｍｏｌ）をタンパク質溶液（２ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５中ほぼ１０ｍｇのＨｉｎ４７または破傷風トキソイド）に加えた。反応混合物をアルゴン中室温で３０分間攪拌した。反応混合物を、２０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２で平衡に達したＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２０×３００ｍｍ）に通し、同じ緩衝液で溶出させた。溶出は２３０ｎｍの吸光度によってモニタし、ピークの溶出タンパク質を溜めた。担体に組込まれたマレイミド基の数を、過剰の２−メルカプトエタノールを活性化された担体−ＭＢＳに加え、改良されたエルマン法を用いて過剰分を逆滴定することによって測定した（参照文献３１）。
【００５６】
ペプチド−担体複合体に対する一般的なプロトコルは記載されてきた（参照文献３２）。簡単に記載すると、脱ガスされたＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中の合成ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）と担体−ＭＢＳ（１ｍｇ／ｍＬ）とを混合した。反応混合物をアルゴン雰囲気下室温で一夜攪拌した。過剰のＮ−エチル−マレイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて反応を終息させ、攪拌をさらに１時間続けた。不溶性の沈殿物を濾別し、濾液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィにかけた。ペプチド−担体複合体を集めた。担体とペプチドのモル比はアミノ酸分析で測定された。
【００５７】
（開示の概要）
この開示の概要として、非複合形態の、およびエピトープＥＬＤＬＷＡＳと複合体形成したＦａｂ’２Ｆ５フラグメントの結晶構造が解明され、そして、ペプチドは、そのペプチド−タンパク質相互作用による束縛された構造に対応するように合成された。改良は本発明の範囲内で可能である。
表１
【００５８】
【表１】
【００５９】
表２
【００６０】
【表２】
【００６１】
表３
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
表４
【００６９】
【表９】
【００７０】
【表１０】
【００７１】
表５
【００７２】
【表１１】
【００７３】
【表１２】
【００７４】
参照文献
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（参照文献２７）およびＲａｓｔｅｒ ３Ｄ（参照文献２８）により作成された、紫色のＨ鎖、青色のＬ鎖およびタンパク質表面から延びる伸びたＶＨ３ループ（金色）を示す、結晶化Ｆａｂ’２Ｆ５のカラーリボン表示図である。
【図２】プログラムＯ（参照文献２９）により作成された、ＥＬＤＫＷＡＳペプチドの密度モデルの着色立体プロット図であり、このＦｏ−Ｆｃマップは、ペプチドに限定して計算され、３σで輪郭を示してあり、輪郭のレベルでのＰ７−Ｓｅｒの密度のわずかな破れが、結合したエピトープの末端での自由度がわずかに増大していることを示している。
【図３】プログラムＳＥＴＯＲ（参照文献３０）を用いて作成された、タンパク質−ペプチド相互作用を示す、Ｆａｂ’２Ｆ５の抗原結合部位のカラー表示図である。残基は、原子の種類別に着色され、酸素は赤色、窒素は青色、炭素は灰色およびイオウは黄色であり、明確性のためにエピトープと相互作用する疎水性側鎖のいくつかは省略されており、全ての結合の長さはÅで示される。
【図４】プログラムＳＥＴＯＲ（参照文献３０）を用いて作成した、アミノ酸残基Ｈ９８〜Ｈ１２０を含むＦａｂ’２Ｆ５複合体のＨ鎖の第３超可変ループのカラー表示図であり、残基は原子の種類別に着色されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶。
【請求項２】
図１によって表される三次元構造を有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項３】
表２中に定められるパラメータを有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項４】
格子定数ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Åおよびｃ＝９３．４Åの単位格子をとり、空間群Ｐ２1２1２1を有する分子からなる請求項３の単離結晶。
【請求項５】
図４に示される三次元構造を有し、表１に示す、H鎖９８番目〜H鎖１２０番目のアミノ酸残基を含む、重鎖の第３超可変（Ｖ３）ループを有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項６】
前記のＶ３ループが、表３中に示される原子座標を有する分子からなる請求項５の単離結晶。
【請求項７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ２Ｆ５Ａとして登録されている原子座標を有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項８】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を有するペプチドまたはその機能的類似体と複合体形成したモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶。
【請求項９】
図３に示されるような、Ｆａｂ’フラグメントに対する該ペプチドの結合部位における構造を有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１０】
表２に定められるパラメータを有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１１】
格子定数ａ＝５８．０Å、ｂ＝６５．０Åおよびｃ＝１７５．６Åの単位格子をとり、空間群Ｐ２1２1２1を有する分子からなる請求項１０の単離結晶。
【請求項１２】
前記のアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳの前記の機能性類似体は、リシンがアルギニンによって置換されたもの、ならびに、トリプトファンがチロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されたものからなる群から選択される請求項８の単離結晶。
【請求項１３】
前記のペプチドがＥＬＤＫＷＡＳである請求項８の単離結晶。
【請求項１４】
Ｆａｂ’２Ｆ５：ＥＬＤＫＷＡＳ複合体が表４の原子座標を有する請求項１３の単離結晶。
【請求項１５】
前記のペプチドがＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）である請求項８の単離結晶。
【請求項１６】
前記のＦａｂ’２Ｆ５：ＥＬＤＲＷＡＳ複合体が表５の原子座標を有する請求項１５の単離結晶。
【請求項１７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ２Ｆ５Ｂとして登録されている原子座標を有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１８】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、図３に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に対するものに、相当する三次元構造をもたらすように制御されている合成ペプチド。
【請求項１９】
トリプトファンおよびリシンの側鎖が重なり合い、平行となる、前記の三次元構造の僅かに歪んだβターン配置に束縛される、アミノ酸配列ＤＫＷあるいはその機能的類似体を含む請求項１８の合成ペプチド。
【請求項２０】
前記のトリプトファンとリシンの、少なくとも一方のアミノ酸が、図３に示されるペプチド−タンパク質相互作用を維持するアミノ酸によって置換されている請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２１】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２２】
前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２３】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換され、かつ、前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２４】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するジスルフィド架橋を含む請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２５】
前記のペプチドは、アミノ酸配列ＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を有し、またジスルフィド架橋が前記のシステイン（Ｃ）残基の間で設けられる請求項２４の合成ペプチド。
【請求項２６】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するラクタム結合を含む請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２７】
前記のペプチドが、式ＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）を有し、かつ、前記のラクタム結合は、Ｄａｐとグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成されている請求項２６の合成ペプチド。
【請求項２８】
担体タンパク質と連結されている請求項１８の合成ペプチド。
【請求項２９】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合するペプチドの製造方法であって、
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはその機能性類似体とを共結晶化して、結晶性複合体を形成すること、
結晶性複合体を解析し、Ｆａｂ’フラグメントに対して相対的に、結合ペプチドの三次元的配向を決定すること、および
決定された立体配向に束縛される、少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能的類似体を含むペプチドを合成すること
を含む方法。
【請求項３０】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳを有するペプチドの前記の機能性類似体は、アミノ酸配列ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有する請求項２９の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、図３に示される、下記の表示：
【化４】
に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に対するものに、相当する三次元構造をもたらすように制御されている
ことを特徴とする合成ペプチド。
【請求項２】
トリプトファンおよびリシンの側鎖が重なり合い、平行となる、前記の三次元構造の僅かに歪んだβターン配置に束縛される、アミノ酸配列ＤＫＷあるいはその機能的類似体を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
前記のトリプトファンとリシンの、少なくとも一方のアミノ酸が、図３に示される、下記の表示：
【化５】
に示されるペプチド−タンパク質相互作用を維持するアミノ酸によって置換されている
ことを特徴とする請求項２に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換されている
ことを特徴とする請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている
ことを特徴とする請求項３または４に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示される、下記の表示：
【化６】
に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するジスルフィド架橋を含む
ことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
前記のペプチドは、アミノ酸配列ＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を有し、またジスルフィド架橋が前記のシステイン（Ｃ）残基の間で設けられる
ことを特徴とする請求項６に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示される、下記の表示：
【化７】
に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するラクタム結合を含む
ことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項９】
前記のペプチドが、式ＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）を有し、かつ、前記のラクタム結合は、Ｄａｐとグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成されている
ことを特徴とする請求項８に記載の合成ペプチド。
【請求項１０】
担体タンパク質と連結されている
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項１１】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合する合成ペプチドの製造方法であって、
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはその機能性類似体とを共結晶化して、Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶性複合体を形成する工程、
結晶性複合体を解析し、Ｆａｂ’フラグメントに対して相対的に、結合ペプチドの三次元的配向を決定する工程、および
決定された立体配向に束縛される、少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能的類似体を含むペプチドを合成する工程
を含む
ことを特徴とする合成ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳを有するペプチドの前記の機能性類似体は、アミノ酸配列ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有する
ことを特徴とする請求項１１に記載の合成ペプチドの製造方法。
【請求項１】
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶。
【請求項２】
図１によって表される三次元構造を有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項３】
表２中に定められるパラメータを有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項４】
格子定数ａ＝６３．６Å、ｂ＝７６．４Åおよびｃ＝９３．４Åの単位格子をとり、空間群Ｐ２1２1２1を有する分子からなる請求項３の単離結晶。
【請求項５】
図４に示される三次元構造を有し、表１に示す、H鎖９８番目〜H鎖１２０番目のアミノ酸残基を含む、重鎖の第３超可変（Ｖ３）ループを有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項６】
前記のＶ３ループが、表３中に示される原子座標を有する分子からなる請求項５の単離結晶。
【請求項７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ２Ｆ５Ａとして登録されている原子座標を有する分子からなる請求項１の単離結晶。
【請求項８】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を有するペプチドまたはその機能的類似体と複合体形成したモノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントの単離結晶。
【請求項９】
図３に示されるような、Ｆａｂ’フラグメントに対する該ペプチドの結合部位における構造を有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１０】
表２に定められるパラメータを有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１１】
格子定数ａ＝５８．０Å、ｂ＝６５．０Åおよびｃ＝１７５．６Åの単位格子をとり、空間群Ｐ２1２1２1を有する分子からなる請求項１０の単離結晶。
【請求項１２】
前記のアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳの前記の機能性類似体は、リシンがアルギニンによって置換されたもの、ならびに、トリプトファンがチロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されたものからなる群から選択される請求項８の単離結晶。
【請求項１３】
前記のペプチドがＥＬＤＫＷＡＳである請求項８の単離結晶。
【請求項１４】
Ｆａｂ’２Ｆ５：ＥＬＤＫＷＡＳ複合体が表４の原子座標を有する請求項１３の単離結晶。
【請求項１５】
前記のペプチドがＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）である請求項８の単離結晶。
【請求項１６】
前記のＦａｂ’２Ｆ５：ＥＬＤＲＷＡＳ複合体が表５の原子座標を有する請求項１５の単離結晶。
【請求項１７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ２Ｆ５Ｂとして登録されている原子座標を有する分子からなる請求項８の単離結晶。
【請求項１８】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、図３に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に対するものに、相当する三次元構造をもたらすように制御されている合成ペプチド。
【請求項１９】
トリプトファンおよびリシンの側鎖が重なり合い、平行となる、前記の三次元構造の僅かに歪んだβターン配置に束縛される、アミノ酸配列ＤＫＷあるいはその機能的類似体を含む請求項１８の合成ペプチド。
【請求項２０】
前記のトリプトファンとリシンの、少なくとも一方のアミノ酸が、図３に示されるペプチド−タンパク質相互作用を維持するアミノ酸によって置換されている請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２１】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２２】
前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２３】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換され、かつ、前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている請求項２０の合成ペプチド。
【請求項２４】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するジスルフィド架橋を含む請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２５】
前記のペプチドは、アミノ酸配列ＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を有し、またジスルフィド架橋が前記のシステイン（Ｃ）残基の間で設けられる請求項２４の合成ペプチド。
【請求項２６】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するラクタム結合を含む請求項１９の合成ペプチド。
【請求項２７】
前記のペプチドが、式ＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）を有し、かつ、前記のラクタム結合は、Ｄａｐとグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成されている請求項２６の合成ペプチド。
【請求項２８】
担体タンパク質と連結されている請求項１８の合成ペプチド。
【請求項２９】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合するペプチドの製造方法であって、
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはその機能性類似体とを共結晶化して、結晶性複合体を形成すること、
結晶性複合体を解析し、Ｆａｂ’フラグメントに対して相対的に、結合ペプチドの三次元的配向を決定すること、および
決定された立体配向に束縛される、少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能的類似体を含むペプチドを合成すること
を含む方法。
【請求項３０】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳを有するペプチドの前記の機能性類似体は、アミノ酸配列ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有する請求項２９の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合し、図３に示される、下記の表示：
【化４】
に示されるペプチドＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に対するものに、相当する三次元構造をもたらすように制御されている
ことを特徴とする合成ペプチド。
【請求項２】
トリプトファンおよびリシンの側鎖が重なり合い、平行となる、前記の三次元構造の僅かに歪んだβターン配置に束縛される、アミノ酸配列ＤＫＷあるいはその機能的類似体を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
前記のトリプトファンとリシンの、少なくとも一方のアミノ酸が、図３に示される、下記の表示：
【化５】
に示されるペプチド−タンパク質相互作用を維持するアミノ酸によって置換されている
ことを特徴とする請求項２に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
前記のリシン残基がアルギニンによって置換されている
ことを特徴とする請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記のトリプトファンが、チロシン、フェニルアラニンまたは荷電していないヒスチジンによって置換されている
ことを特徴とする請求項３または４に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示される、下記の表示：
【化６】
に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するジスルフィド架橋を含む
ことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
前記のペプチドは、アミノ酸配列ＥＣＤＫＷＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を有し、またジスルフィド架橋が前記のシステイン（Ｃ）残基の間で設けられる
ことを特徴とする請求項６に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
前記のペプチドが、前記のアミノ酸配列ＤＫＷまたはその機能的類似体を、図３に示される、下記の表示：
【化７】
に示されるアミノ酸残基の各々の配向に保持するラクタム結合を含む
ことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項９】
前記のペプチドが、式ＥＤａｐＤＫＷＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）を有し、かつ、前記のラクタム結合は、Ｄａｐとグルタミン酸（Ｅ）残基の間に形成されている
ことを特徴とする請求項８に記載の合成ペプチド。
【請求項１０】
担体タンパク質と連結されている
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項１１】
モノクローナル抗体２Ｆ５に結合する合成ペプチドの製造方法であって、
モノクローナル抗体２Ｆ５のＦａｂ’フラグメントとアミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはその機能性類似体とを共結晶化して、Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶性複合体を形成する工程、
結晶性複合体を解析し、Ｆａｂ’フラグメントに対して相対的に、結合ペプチドの三次元的配向を決定する工程、および
決定された立体配向に束縛される、少なくともアミノ酸ＤＫＷまたはその機能的類似体を含むペプチドを合成する工程
を含む
ことを特徴とする合成ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳを有するペプチドの前記の機能性類似体は、アミノ酸配列ＥＬＤＲＷＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有する
ことを特徴とする請求項１１に記載の合成ペプチドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−３２８０４７（Ｐ２００６−３２８０４７Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０４２８７（Ｐ２００６−１０４２８７）
【出願日】平成１８年４月５日（２００６．４．５）
【分割の表示】特願２０００−６１１５５９（Ｐ２０００−６１１５５９）の分割
【原出願日】平成１２年４月５日（２０００．４．５）
【出願人】（５０１４０１５０４）ユニバーシティー オブ トロント (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＯＲＯＮＴＯ
【出願人】（５０００９６９９４）サノフィ パスツ−ル リミテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月５日（２００６．４．５）
【分割の表示】特願２０００−６１１５５９（Ｐ２０００−６１１５５９）の分割
【原出願日】平成１２年４月５日（２０００．４．５）
【出願人】（５０１４０１５０４）ユニバーシティー オブ トロント (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＯＲＯＮＴＯ
【出願人】（５０００９６９９４）サノフィ パスツ−ル リミテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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