ＨＩＶの治療
プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）及びコルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチド並びにそれらの産物を使用するＨＩＶの治療方法、並びに医薬の製造におけるそれらのペプチドの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶの治療方法、並びにＨＩＶの治療のための医薬の調製におけるＰＯＭＣ及び／又はＣＲＦペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス／後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）の流行は、世界中で２千万を超える人を死に至らしめており、現在では約４千万人が感染している。これは、発展途上国に対して特に深刻な社会経済的影響を有する。現在まで、ＨＩＶ及びＡＩＤＳに対して効果的な唯一の武器は、治療であって、特に非常に活性の高い抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）である。しかしながら、これは世界中で利用可能なわけではなく、毒性の副作用がある可能性があり、多くの場合に多数の困っている人から治療が奪われる。したがって、効果的な治療ＨＩＶワクチン又は予防が、次第に非常に緊急に必要になっている。
【０００３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８は、患者の各種疾患の治療における、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）及び／又はプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ペプチドの使用を開示している。治療され得る疾患の一覧は、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８を参照のこと。ヤギ血清製品の調製は、国際特許出願ＷＯ ０３／００４０４９及びＷＯ０３／０６４４７２に開示されており、本出願人は、この血清製品が、本発明において使用してよいＣＲＦ及びＰＯＭＣペプチドの有用な供給源であってよいと解している。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８
【特許文献２】ＷＯ ０３／００４０４９
【特許文献３】ＷＯ０３／０６４４７２
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願人は、ここで、ＣＲＦ及び／又はＰＯＭＣペプチドがＨＩＶの治療において有用であり、特に患者におけるウイルス量の減少及び／又はＣＤ４＋およびＣＤ８細胞数の増加において有用であることを発見した。
【０００５】
ＣＲＦは、視床下部において生産されるペプチドであり、ストレス応答に関与すると解されている。ヒトＣＲＦは、ＯＭＩＭ（ｏｎｌｉｎｅ ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からアクセス可能である）の登録１２２５６０に詳細に開示されている。ヒトＣＲＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も既知であり、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＢＣ０１１０３１を有する。ヒトＣＲＦの配列及びサイズのデータに関する知識が、ヤギＣＲＦを含む非ヒトＣＲＦについての同等の情報を当業者が見出すことを可能にするであろう。ＣＲＦは、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）としても知られている。
【０００６】
「ＣＲＦペプチド」は、対応する配列、構造、又は機能を有する任意のペプチドを意味する。上述のＧＥＮＢＡＮＫの登録においてヒトＣＲＦについて与えられた標準的なヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が、ペプチドの構造又は機能に影響を与えること無く、ある程度まで変化してよいことが、当業者には明らかである。特に対立遺伝子多型及び機能変異体が、この定義に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換、並びにＣＲＦの断片及び誘導体を含んでよい。
【０００７】
患者に対するＣＲＦの投与は、内因性のＣＲＦの生産を刺激し、次いで、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）及びその関連する構成ペプチドの生産を刺激すると解されている。
【０００８】
ＰＯＭＣは、下垂体（並びに多数の他の器官、ある種の腫瘍、例えば黒色腫、並びに正常な皮膚細胞）において生産されるペプチド（プロホルモン）であり、宿主に対して多数の効果を奏する一連の副腎皮質刺激ホルモンの前駆体である。ＰＯＭＣは、α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの前駆体である。これらのホルモンの全てが、単独の大きな前駆体であるＰＯＭＣから切断されており、本明細書では「ＰＯＭＣ産物」と称する。
【０００９】
ヒトＰＯＭＣは、ＯＭＩＭ（ｏｎｌｉｎｅ ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からアクセス可能である）の登録１７６８３０に詳細に開示されている。ヒトＰＯＭＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も知られており、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＢＣ０６５８３２を有する。ヒトＰＯＭＣは、３１ｋＤａの分子量を有する糖鎖付加したタンパク質前駆体を生じさせる。
【００１０】
「ＰＯＭＣペプチド」は、対応する配列、構造、又は機能を有する任意のペプチドを意味する。上述のＧＥＮＢＡＮＫ登録においてヒトＰＯＭＣについて与えられる標準的なヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が、ペプチドの構造又は機能に影響を与えずに、ある程度まで変化してよいことが、当業者には明らかであろう。特に、対立遺伝子多型及び機能変異体が、この定義に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換を含んでよい。本明細書で使用する「ＰＯＭＣペプチド」は、ＭＳＨ、ＡＣＴＨ、ＬＰＨの少なくとも１つの形態、βエンドルフィン、メチオニン−エンケファリン、及びロイシン−エンケファリンであり；好ましくは、α、β、及びγＭＳＨのすべて；ＡＣＴＨ；β及びγＬＰＨ；並びにβエンドルフィン、メチオニン−エンケファリン、及びロイシン−エンケファリンである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様によれば、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチドを患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法を提供する。
【００１２】
前記治療は、以下の効果：ウイルス量の減少；ＣＤ４細胞の増加；又はＣＤ８細胞の増加の１つ又は複数を得るために使用してよい。
【００１３】
本出願人は、前記方法は、ヒトの患者におけるＨＩＶ及びＡＩＤＳに対して成功裡に使用し得ると解している。理論に繋げることを望まないが、本出願人は、前記治療が、ウイルス複製及び拡散に必要な高活性免疫反応のレベルを低減することによって、体内におけるウイルスの拡散を制限及び調節すると解している。加えて、ウイルス複製及び拡散を支え及び刺激する、日和見感染及び結果として生じる炎症性サイトカインの生産によって生じる炎症も調節する可能性がある。その様に、前記治療は、ＨＩＶ患者のウイルス量を減少し、血中のＣＤ４及びＣＤ８数を増加し、性欲を改善し、食欲を刺激し、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の生活の質を改善する。
【００１４】
ＣＲＦは、非ヒトＣＲＦであって良く、好都合には有蹄動物のＣＲＦであり、最も好ましくはヤギＣＲＦである。驚くべきことに、ヤギが出血または免疫などの生理的ストレスによって刺激を受ける際に、ヤギ血清がＣＲＦを含有していることを同定した。これによって、本発明の医薬組成物のためのＣＲＦの簡便な供給源が提供される。ＣＲＦは患者において自律的な効果を有してよく、ＣＲＦの初期量の投与が患者においてＣＲＦの体内生産を生じさせ、かくして、低レベルのＣＲＦの初期投与が、患者に対して顕著な効果を有してよく、ＰＯＭＣペプチドのレベルにおける増加を含むと解されている。言うまでも無く、ヤギ以外の動物から得られるペプチドを使用してよく、組換え又は他の供給源のペプチドであってよい。
【００１５】
本発明で使用するペプチドの投与は、経口又は非経口で実施してよい。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内、又は鼻内投与を含む。活性成分に加えて、投与する組成物は、賦形剤及び医薬投与に適切な製剤に活性化合物を処理することを容易にする他の成分を含む、適切な製薬学的に許容される担体を含んでよい。
【００１６】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適切な用量において、当該技術分野において既知の製薬学的に許容される担体を使用して製剤化してよい。その様な担体は、対象による摂取に適切な錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤などに組成物を製剤化することを可能にする。
【００１７】
経口用途のための製剤は、活性化合物を固体の賦形剤と混合し、結果として得られる混合物を任意にすりつぶし、錠剤又は糖衣錠剤の核を得るために望ましい場合には適切な追加の化合物を添加した後に、顆粒の混合物を処理することによって得られてよい。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖；トウモロコシ、小麦、コメ、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムなどのゴム；並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含む。望ましい場合には、崩壊剤又は可溶化剤を添加してよく、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はそれらの塩を添加してよい。
【００１８】
糖衣錠剤は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい濃縮した糖溶液などの適切なコーティングを用いて提供してよい。染料及び顔料は、製品認識又は活性化合物の量を特徴付けるための錠剤又は糖衣錠剤コーティングを添加してもよい。
【００１９】
経口で使用してよい製剤は、押し込み型のゼラチン製カプセル剤、並びに密閉型のゼラチン製軟カプセル剤及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングを含む。押し込み型のカプセル剤は、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意に安定剤と混合して活性成分を含有してよい。軟カプセル剤では、活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに、安定剤と共に又は安定剤無しで、溶解又は懸濁してよい。
【００２０】
非経口投与のための製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射については、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、又は生理緩衝食塩水中で製剤化してよい。水性懸濁注射剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁剤の粘度を増大する物質を含有してよい。加えて、活性化合物の懸濁物が、適当な油性注射用懸濁剤として調製されてよい。適切な脂溶性溶媒又は媒体は、ゴマ油などの脂肪油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリド、あるいはリポソームを含む。任意に、前記懸濁剤は、化合物の可溶性を増大させて高度に濃縮した溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含有してよい。
【００２１】
局所又は鼻内投与については、浸透すべき特定の障壁に適当な浸透剤を、製剤において使用してよい。
【００２２】
本発明で使用するための医薬組成物は、当該技術分野において既知の標準的な製造手法に実質的にしたがって製造してよい。
【００２３】
本発明に使用するためのペプチド又は組成物は親油性化してよい。これによって、製品の保存寿命及び安定性を改善し、輸送可能性を改善する。これは、温暖な気候であって、冷凍設備が容易に利用可能でない場合において使用するために特に有益である。親油性化した製品を投与前に再構成してよい。
【００２４】
前記方法は、患者における各種の細胞による更なるペプチドの放出のカスケードを誘導する可能性がある１つ又は複数のペプチド調節因子又は放出因子を投与する工程を更に含んでよい。その様な追加の因子は、好ましくはＣＲＦと同じ供給源、特にヤギ血清由来である。適切な因子は、とりわけα−ＨＬＡ、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−１０を含む。
【００２５】
好ましい実施態様では、前記方法は、バソプレッシン、βエンドルフィン、及びエンケファリンの１つ又は複数を投与する工程を含んでよい。ある実施態様では、前記方法は、ＣＲＦ結合タンパク質であるＣＲＦ−ＢＰを含んでよい。これはＣＲＦに結合し、患者に対するＣＲＦの後続の放出のためのリザーバーとして働いてよい。
【００２６】
前記方法は、ＰＯＭＣペプチド又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を更に含んでよく、あるＰＯＭＣ産物は、患者に投与して、更なる生産を刺激するか又は内因性のＰＯＭＣが生産され得る前に所望の応答を得るために有用であってよい。
【００２７】
本発明の更なる態様は、患者にＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、ＰＯＭＣは非ヒトＰＯＭＣであり、好都合には有蹄動物ＰＯＭＣであり、最も好ましくはヤギＰＯＭＣである。ＰＯＭＣは下垂体において生産され、そのため、血清に少なくとも有意なレベルで存在することは予期されなかったが、驚くべきことに、ヤギが出血又は免疫などの生理ストレスによって刺激を受ける際に特に、ヤギ血清がＰＯＭＣ、ＰＯＭＣ関連ペプチド、及びＰＯＭＣカスケード関連分子を含有することを同定した。これによって、本発明の医薬組成物のためのＰＯＭＣの簡便な供給源が提供される。ＰＯＭＣは患者において自律的な効果を有する可能性があると解されており、ＰＯＭＣの初期量の投与が患者においてＰＯＭＣの体内生産を生じさせ、かくして、低レベルのＰＯＭＣの初期投与が患者に対して顕著な効果を有する可能性があると解されている。ＣＲＦペプチドのように、言うまでも無く、組換えＰＯＭＣを含むヤギ以外のＰＯＭＣペプチドの供給源が使用されてよい。
【００２９】
ＰＯＭＣ及びその関連分子の対象に対する投与において、ペプチドをタンパク質分解して、対象が容易に利用可能な形態においてＰＯＭＣ産物の１つ又は複数を提供し、視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ）を刺激する分子カスケードの誘導も存在すると解される。
【００３０】
本発明の更なる態様によれば、α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの２つ以上を投与する工程を含むＨＩＶの治療方法を提供する。おそらく投与によるＰＯＭＣのタンパク質分解が与えられて、ＰＯＭＣ由来の個々のホルモンの２つ以上の投与によって類似の効果を達成することができる可能性がある。記載したホルモンは、個々のペプチド又は１つ又は複数の前駆体分子（例えば、ＰＯＭＣの部分分解物）として提供されてよい。好ましくは、３、４、５、６、又は７のホルモンが、その様な分子の持続的な生産のためのカスケードを（任意にＣＲＦと共に）誘導する医薬組成物中に含まれる。各種の成分が、該成分の１つ又は複数に結合する１つ又は複数の担体分子と組み合わせて提供されてよく、該成分放出のためのリザーバー又はデポーとして働いてよい。担体分子は、ＰＯＭＣ及びその関連ペプチドと組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドの最適な用量は未だ決定していないが、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは０．０１から５ｍｇ／ｋｇの間、０．０２５から２ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは０．０５から１ｍｇ／ｋｇの間の用量のペプチドを対象に投与することが適当であってよい。
【００３２】
正確な投与用量は、患者の年齢、性別、及び体重、投与方法及び製剤、並びに治療しようとする疾患の性質及び重度などの因子によって変化してよい。食事、投与時間、患者の状態、併用薬、及び反応感度などの他の因子が考慮に入れられてよい。効果的な治療計画は、治療する医療従事者によって決定されてよい。一回又は複数回の投与が与えられて、典型的には、少なくとも３、５、又はそれ以上の一連の投与の後に利益が認められる。組成物の有益な効果を維持するために、反復投与が望ましい可能性がある。
【００３３】
治療は、任意の効果的な経路によって、好ましくは、皮下注射によって投与してよいが、使用してよい代替的な経路は、筋肉内又は病巣内注射、経口、エアロゾル、非経口、又は局所を含む。
【００３４】
治療は、好ましくは、液体製剤として投与されるが、他の製剤が使用されてよい。液体製剤は、凍結乾燥製剤から再構成されてよい。例えば、治療は、適切な製薬学的に許容される担体と混合して良く、経口、局所、又は非経口投与用の適切な組成物における固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）として製剤化されてよい。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶの治療用の医薬の製造におけるＣＲＦの使用も提供する。ＨＩＶの治療用の医薬の調製におけるＰＯＭＣの使用も提供する。ＣＲＦ又はＰＯＭＣは、単離された精製ＣＲＦ又はＰＯＭＣであってよいが、上述の各種の他の成分と組み合わせて投与することが好ましい。特に、生物活性担体タンパク質及びバソプレッシンを使用してよい。
【実施例】
【００３６】
国際特許出願公開ＷＯ ０３／００４０４９及びＷＯ ０３／０６４４７２は、ヤギ血清組成物の製造を開示している。その製造方法の概要を以下に示す。
【００３７】
血清組成物の製造
ヤギは、１ｍｌあたり１０９のウイルス粒子の濃度でＨＩＶ−３ｂの筋肉内注射を用いて、標準的な市販の上清に懸濁した可溶化ＨＩＶ−３ｂウイルスを筋肉内注射して接種する。前記ウイルスは、３０分間６０℃で事前に熱で殺滅させる。最適な手法では、ヤギは、４週間に亘って毎週注射し、次いで、６週目にヤギを出血させて試薬を得る。
【００３８】
約４００ｃｃの血液を滅菌技術のもとでヤギから得る。前記動物は、典型的には１０から１４日で再出血させてよく、血液の量を補充する。出血前の養生は、血清の活性成分生産を刺激するために有用である可能性がある。全ての後続の処理工程は、他に特定していない限り、好ましくは４℃で実施する。次いで、血液を遠心分離して、血清を分離し、血清を濾過して大きな凝塊及び粒子状物質を除く。次いで、過飽和硫酸アンモニウム（４℃で４７％溶液）で血清を処理して、抗体及び他の物質を沈殿させる。結果として得られた溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ６Ｍ／Ｅ遠心分離機で４５分間に亘って３５００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清の流動体を除去する。沈殿したイムノグロブリン及び他の固体物質は、沈殿物を再溶解するのに十分なＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁する。
【００３９】
次いで、溶液は、４℃で１０，０００ダルトンの分子量カットオフでＰＢＳに対して透析濾過に供する。透析濾過後に、製品を０．２ミクロンフィルターで滅菌容器に濾過して、タンパク質濃度を４から５ｍｇ／ｍｌに調節する。溶液は、１ｍｌの単回投与を与える容器に入れて、使用するまで−２２℃で保存した。
【００４０】
血清組成物の分析
ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８は、この方法で調製した血清組成物が、ＰＯＭＣ及びＣＲＦペプチドを含有することを報告しており、血清の効果におけるこれらのペプチドの積極的役割を示唆している。血清の分析の概要を以下に示す。
【００４１】
前記組成物のサンプルはゲルでサイズ分画し、βエンドルフィンに対する抗体を用いてウエスタンブロットを実施した。強力なシグナルが検出され、βエンドルフィンの存在が示されたが、見掛けの分子量は約３１ｋＤａであり、βエンドルフィンの推定サイズよりもはるかに大きかった。このことは、βエンドルフィンが大きなペプチドの一部としてサンプル中に存在することを示しており、前記サイズはＰＯＭＣのものと一致した。
【００４２】
本出願人は、その組成物に対してマススペクトロメトリーも実施して、少なくとも２つのＰＯＭＣ由来ペプチド、つまりβエンドルフィン及びコルチコトロピン関連分子を検出した。ＣＲＨ−ＢＰ（コルチコトロピン放出ホルモン結合タンパク質）も同定した。
【００４３】
図１から４
ＰＯＭＣペプチド及びＣＲＦ−ＢＰは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｅｇａｎ ＬＣＱマススペクトロメトリーによって、前記製品中において同定した。ＣＲＦは、下垂体前葉におけるＡＣＴＨの合成及び分泌を主に調節している。ＣＲＦ及びＣＲＦ−ＢＰに加えて、ＰＯＭＣ及び／又はその構成ペプチドの投与は、ＰＯＭＣペプチドの合成及び持続的な濃度の上昇の発生の促進に作用するカスケードを開始すると解される。ＣＥＦ−ＢＰは、ＣＲＦのリザーバーとして働く機能を有する。
【００４４】
図１から４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の汚染から分離した前記製品に由来するトリプシン消化物のマススペクトロメトリー分析から得られたヒットを示す。上述のように、これらの分子の幾つかは、ＰＯＭＣカスケードの誘導因子及び調節因子である。より詳細な分析（例えば、ペプチド分画、免疫沈降、及び濃縮）を用いた更なる調査は、より多くのペプチドが存在することを明らかにするであろう。図１は、ＰＯＭＣ由来コルチコトロピンの存在を示す。図２は、ＣＲＦ−ＢＰの存在を示す。図３は、プロエンケファリンＡの存在を示す。図４は、プロエンケファリンＢの存在を示す。ＣＲＦ−ＢＰの存在は、製品が幾つかのＣＲＦを含有するが、ＰＯＭＣ及び関連ペプチドも明らかに存在することを示唆する。
【００４５】
本出願人は、また、患者自身の血清の血清組成物を用いて治療効果を調査した。これらの効果を以下に記載する。
【００４６】
治療した患者における、炎症性ＴＨ−１プロフィールから抗炎症性ＴＨ−２サイトカインプロフィールへの転換の証拠
図５は、上述のように調製したヤギ血清製品で処理する前及び後に、２つの群の患者（健康なボランティア）の血清におけるＴＧＦ−βのレベルを示す。２つの群の患者（各群ｎ＝３）が、生産されるＴＧＦ−βの濃度に対して異なる反応を示すが、全ての患者が、処理に対して血清レベルの増加を示した（ｐｒｅ ｓｅｒａ＝処理前の患者の血清レベル；ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ＝２回目及び５回目の投与後）。データは、治療によって、抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βの濃度の増大が誘導されていることを示す。
【００４７】
図６は、治療前（ｐｒｅ−ｓｅｒａ）及び後における、１つの群の患者のＩＬ−４の血清レベルを示す。治療後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ）において、ＩＬ−４のレベルは患者の血清において有意に増加することが認められる（ｎ＝５）。しかしながら、５回目の投与の後に、ＩＬ−４のレベルは全ての患者において低下しているが、治療前よりも高いままであった。ＩＬ−４は、ＴＨ−１細胞からの炎症性サイトカインＩＬ−４の生産を下方調節することが知られている。全ての患者において認められる濃度の一貫性のある変化は、ＴＨ−１からＴＨ−２への転換におけるＩＬ−４の役割と一致している。
【００４８】
図７は、治療前及び後における、１つの群の患者のＩＬ−６の血清レベルを示す。治療後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ）に、ＩＬ−６のレベルが患者の血清において減少していることが認められる（ｎ＝４）。
【００４９】
図８は、治療前及び後における、１つの群の患者のＩＦＮ−γの血清レベルを示す。処理後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ）に、ＩＦＮ−γのレベルが患者の血清において減少していることが認められる。
【００５０】
図９は、ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）が、単球亜集団における抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の生産を誘導することを示す。Ｔリンパ球及びＢリンパ球並びに単球は、ヒトボランティアから得られたＰＢＭＣから分離した。全ての細胞種は、等量の製品で１６時間に亘って処理し、それらの上清を、ＩＬ−１０含有量についてＥＬＩＳＡでアッセイした。Ｔ細胞集団によって生産されたＩＬ−１０レベルは処理によって影響を受けず、ＩＬ−１０の小さな増加のみがＢ細胞において誘導されたことが認められる。しかしながら、ＩＬ−１０濃度の顕著な増加が、処理によって単球集団において誘導された。全ての測定は、三回重複＋／−標準偏差で実施した。これらのデータは、少なくとも３回の別々の試験の典型である。
【００５１】
要点及び結論
本出願人は、上述のヤギ血清製品がＰＯＭＣペプチド及びその産物並びにＣＲＦペプチドを含有することを、本明細書及びＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８において示している。本出願人は、患者の炎症プロフィールにおける転換を誘導する血清製品の投与も示す。
【００５２】
ＷＯ ０３／００４０４９は、ＨＩＶ患者の治療のための上述のように調製したヤギ血清製品の使用を開示する。該文献では、ＨＩＶに対する前記血清の有益な効果が、抗−ＦＡＳ及び抗−ＨＬＡ分子の存在によるものであると示唆されており、ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドが存在することは示唆されていない。該文献は、血清を与えられた患者が、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数の増加、ウイルス量の減少、及びＰ２４値の減少を示すことを観察している。
【００５３】
ＷＯ ０２／０７７６０も、ＨＩＶ患者を治療するための同一のヤギ血清製品の調製及び使用を開示している。該文献は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＩＶの中和を示すという実験データを報告している。該文献の実施例３は、上述と同様のヤギ血清製品の調製を開示している。前記血清の投与は、ＨＩＶウイルス量（血清１ｍｌあたりのＨＩＶ−１ ＲＮＡのコピー数として定義される）の減少を生じさせ、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数の増加を生じさせる。ここでも、これらの特性が、ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドの存在によるものである可能性があるという示唆はされていない。
【００５４】
ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８における発見及び本明細書において提示したデータを考慮すると、ヤギ血清製品がＰＯＭＣペプチド及びその産物並びにＣＲＦペプチドを含有し、これらのペプチド及び産物が活性を有する生物学的作用物質であり、これらのペプチド及び産物が、ヒトの患者におけるＨＩＶ及び／又はＡＩＤＳの治療において、とりわけウイルス量の減少、ＣＤ４細胞数の増加、及びＣＤ８細胞数の増加の１つ又は複数を得るために有用であり得ると解される。
【００５５】
ＨＩＶは、神経変性及び広範な神経病を生じさせる中枢神経系（ＣＮＳ）の各種の病変を誘導することも知られている。これらは、ＨＩＶ脳炎、ＨＩＶ白質脳症、軸索損傷、各種の重度の神経細胞脱落と関連する散在するポリオジストロフィーを含む。後者は、アポトーシスの過程によるものであると解される。これらの疾患は、認知機能の損失及び認知症を生じさせる。神経変性疾患に対するＰＯＭＣ／ＣＲＦペプチドの開示されている効果を考慮すると（ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８参照）、その様なペプチドは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのこれらの症状並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ自体を緩和するために使用してもよいようである。
【００５６】
ＨＩＶウイルスに感染した人々における視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）が機能不全を起こすことも報告されている。サイトカインネットワークの操作が、ＨＩＶ感染の調節における有益な効果をもたらすであろう。炎症細胞におけるメラノコルチン受容体の刺激が、ＨＩＶ感染の経過を変化させる効果的な治療法である可能性がある。本明細書に記載した血清製品に存在するプロオピオメラノコルチン由来ペプチドは、副腎皮質刺激ホルモン［ＡＣＴＨ（１−３９）］、α−メラニン細胞刺激ホルモン［α−ＭＳＨ（１−１３）］、及び関連するアミノ酸配列を含む。メラノコルチンペプチドは、強力な抗炎症／抗サイトカイン活性を有する。
【００５７】
インターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインは、ＨＩＶ感染患者において有害なものである可能性がある。ＨＩＶ患者の血中におけるＩＬ−１及びＴＮＦ−αの生産に対するメラノコルチンの効果が調べられている。α−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）、ＡＣＴＨ（１−２４）、又はＡＣＴＨ（１−３９）の存在下又は非存在下においてＬＰＳで刺激した全血サンプルにおいて、サイトカイン生産を測定した際に、メラノコルチンが濃度依存的な様式で双方のサイトカインの生産を低減させることが認められた。正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における別の実験では、α−ＭＳＨ（１−１３）が、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０によって誘導されるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの生産を阻害することが認められた。これらの結果は、炎症細胞におけるメラノコルチン受容体の刺激が、ＨＩＶ複製を促進するサイトカインの生産を低減させる新規な方法である可能性を示唆する。
【００５８】
ＰＯＭＣ及びＣＲＦペプチド及びその産物は、各々又は組み合わせのいずれかにおいて、ＨＰＡを調節する能力を有する新規製剤を提供し、メラノコルチンの供給源及びメラノコルチン生産の調節因子として役立つ。特に、高活性炎症性ＴＨ−１サイトカインから抗炎症性ＴＨ２プロフィールへと転換させるようである。かくして、炎症性サイトカインの生産及び放出が調節される。
【００５９】
ＨＩＶ感染が、多数の経路によって単球−マクロファージの感染により促進するという考えを支持する証拠が存在する。ＡＩＤＳにおける日和見感染によるＮＦ−κＢの活性化は、ＣＣＲ５受容体の発現及びＴＮＦ−αの発現を増加し、それらの双方がＨＩＶ感染を支持するための許容状態である。加えて、ウイルス負荷の低減は、感染した組織及び／又は炎症を起こした組織の治療に付随し、これが、免疫活性化とウイルス複製との間の関係を更に後押しする。かくして、ＰＯＭＣ／ＣＲＦペプチド及び／又はその産物を用いる患者の治療は、炎症性サイトカイン及びマクロファージ活性化のレベル並びに組織の炎症を低減し、患者における細胞感染を低減し、おそらく脳などの体内器官に対する感染の拡散を低減するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図２】図２は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図３】図３は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図４】図４は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図５】図５は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図６】図６は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図７】図７は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図８】図８は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図９】図９は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶの治療方法、並びにＨＩＶの治療のための医薬の調製におけるＰＯＭＣ及び／又はＣＲＦペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス／後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）の流行は、世界中で２千万を超える人を死に至らしめており、現在では約４千万人が感染している。これは、発展途上国に対して特に深刻な社会経済的影響を有する。現在まで、ＨＩＶ及びＡＩＤＳに対して効果的な唯一の武器は、治療であって、特に非常に活性の高い抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）である。しかしながら、これは世界中で利用可能なわけではなく、毒性の副作用がある可能性があり、多くの場合に多数の困っている人から治療が奪われる。したがって、効果的な治療ＨＩＶワクチン又は予防が、次第に非常に緊急に必要になっている。
【０００３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８は、患者の各種疾患の治療における、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）及び／又はプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ペプチドの使用を開示している。治療され得る疾患の一覧は、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８を参照のこと。ヤギ血清製品の調製は、国際特許出願ＷＯ ０３／００４０４９及びＷＯ０３／０６４４７２に開示されており、本出願人は、この血清製品が、本発明において使用してよいＣＲＦ及びＰＯＭＣペプチドの有用な供給源であってよいと解している。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８
【特許文献２】ＷＯ ０３／００４０４９
【特許文献３】ＷＯ０３／０６４４７２
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願人は、ここで、ＣＲＦ及び／又はＰＯＭＣペプチドがＨＩＶの治療において有用であり、特に患者におけるウイルス量の減少及び／又はＣＤ４＋およびＣＤ８細胞数の増加において有用であることを発見した。
【０００５】
ＣＲＦは、視床下部において生産されるペプチドであり、ストレス応答に関与すると解されている。ヒトＣＲＦは、ＯＭＩＭ（ｏｎｌｉｎｅ ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からアクセス可能である）の登録１２２５６０に詳細に開示されている。ヒトＣＲＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も既知であり、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＢＣ０１１０３１を有する。ヒトＣＲＦの配列及びサイズのデータに関する知識が、ヤギＣＲＦを含む非ヒトＣＲＦについての同等の情報を当業者が見出すことを可能にするであろう。ＣＲＦは、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）としても知られている。
【０００６】
「ＣＲＦペプチド」は、対応する配列、構造、又は機能を有する任意のペプチドを意味する。上述のＧＥＮＢＡＮＫの登録においてヒトＣＲＦについて与えられた標準的なヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が、ペプチドの構造又は機能に影響を与えること無く、ある程度まで変化してよいことが、当業者には明らかである。特に対立遺伝子多型及び機能変異体が、この定義に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換、並びにＣＲＦの断片及び誘導体を含んでよい。
【０００７】
患者に対するＣＲＦの投与は、内因性のＣＲＦの生産を刺激し、次いで、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）及びその関連する構成ペプチドの生産を刺激すると解されている。
【０００８】
ＰＯＭＣは、下垂体（並びに多数の他の器官、ある種の腫瘍、例えば黒色腫、並びに正常な皮膚細胞）において生産されるペプチド（プロホルモン）であり、宿主に対して多数の効果を奏する一連の副腎皮質刺激ホルモンの前駆体である。ＰＯＭＣは、α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの前駆体である。これらのホルモンの全てが、単独の大きな前駆体であるＰＯＭＣから切断されており、本明細書では「ＰＯＭＣ産物」と称する。
【０００９】
ヒトＰＯＭＣは、ＯＭＩＭ（ｏｎｌｉｎｅ ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からアクセス可能である）の登録１７６８３０に詳細に開示されている。ヒトＰＯＭＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も知られており、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＢＣ０６５８３２を有する。ヒトＰＯＭＣは、３１ｋＤａの分子量を有する糖鎖付加したタンパク質前駆体を生じさせる。
【００１０】
「ＰＯＭＣペプチド」は、対応する配列、構造、又は機能を有する任意のペプチドを意味する。上述のＧＥＮＢＡＮＫ登録においてヒトＰＯＭＣについて与えられる標準的なヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が、ペプチドの構造又は機能に影響を与えずに、ある程度まで変化してよいことが、当業者には明らかであろう。特に、対立遺伝子多型及び機能変異体が、この定義に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換を含んでよい。本明細書で使用する「ＰＯＭＣペプチド」は、ＭＳＨ、ＡＣＴＨ、ＬＰＨの少なくとも１つの形態、βエンドルフィン、メチオニン−エンケファリン、及びロイシン−エンケファリンであり；好ましくは、α、β、及びγＭＳＨのすべて；ＡＣＴＨ；β及びγＬＰＨ；並びにβエンドルフィン、メチオニン−エンケファリン、及びロイシン−エンケファリンである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様によれば、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチドを患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法を提供する。
【００１２】
前記治療は、以下の効果：ウイルス量の減少；ＣＤ４細胞の増加；又はＣＤ８細胞の増加の１つ又は複数を得るために使用してよい。
【００１３】
本出願人は、前記方法は、ヒトの患者におけるＨＩＶ及びＡＩＤＳに対して成功裡に使用し得ると解している。理論に繋げることを望まないが、本出願人は、前記治療が、ウイルス複製及び拡散に必要な高活性免疫反応のレベルを低減することによって、体内におけるウイルスの拡散を制限及び調節すると解している。加えて、ウイルス複製及び拡散を支え及び刺激する、日和見感染及び結果として生じる炎症性サイトカインの生産によって生じる炎症も調節する可能性がある。その様に、前記治療は、ＨＩＶ患者のウイルス量を減少し、血中のＣＤ４及びＣＤ８数を増加し、性欲を改善し、食欲を刺激し、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の生活の質を改善する。
【００１４】
ＣＲＦは、非ヒトＣＲＦであって良く、好都合には有蹄動物のＣＲＦであり、最も好ましくはヤギＣＲＦである。驚くべきことに、ヤギが出血または免疫などの生理的ストレスによって刺激を受ける際に、ヤギ血清がＣＲＦを含有していることを同定した。これによって、本発明の医薬組成物のためのＣＲＦの簡便な供給源が提供される。ＣＲＦは患者において自律的な効果を有してよく、ＣＲＦの初期量の投与が患者においてＣＲＦの体内生産を生じさせ、かくして、低レベルのＣＲＦの初期投与が、患者に対して顕著な効果を有してよく、ＰＯＭＣペプチドのレベルにおける増加を含むと解されている。言うまでも無く、ヤギ以外の動物から得られるペプチドを使用してよく、組換え又は他の供給源のペプチドであってよい。
【００１５】
本発明で使用するペプチドの投与は、経口又は非経口で実施してよい。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内、又は鼻内投与を含む。活性成分に加えて、投与する組成物は、賦形剤及び医薬投与に適切な製剤に活性化合物を処理することを容易にする他の成分を含む、適切な製薬学的に許容される担体を含んでよい。
【００１６】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適切な用量において、当該技術分野において既知の製薬学的に許容される担体を使用して製剤化してよい。その様な担体は、対象による摂取に適切な錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤などに組成物を製剤化することを可能にする。
【００１７】
経口用途のための製剤は、活性化合物を固体の賦形剤と混合し、結果として得られる混合物を任意にすりつぶし、錠剤又は糖衣錠剤の核を得るために望ましい場合には適切な追加の化合物を添加した後に、顆粒の混合物を処理することによって得られてよい。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖；トウモロコシ、小麦、コメ、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムなどのゴム；並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含む。望ましい場合には、崩壊剤又は可溶化剤を添加してよく、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はそれらの塩を添加してよい。
【００１８】
糖衣錠剤は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい濃縮した糖溶液などの適切なコーティングを用いて提供してよい。染料及び顔料は、製品認識又は活性化合物の量を特徴付けるための錠剤又は糖衣錠剤コーティングを添加してもよい。
【００１９】
経口で使用してよい製剤は、押し込み型のゼラチン製カプセル剤、並びに密閉型のゼラチン製軟カプセル剤及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングを含む。押し込み型のカプセル剤は、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意に安定剤と混合して活性成分を含有してよい。軟カプセル剤では、活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに、安定剤と共に又は安定剤無しで、溶解又は懸濁してよい。
【００２０】
非経口投与のための製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射については、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、又は生理緩衝食塩水中で製剤化してよい。水性懸濁注射剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁剤の粘度を増大する物質を含有してよい。加えて、活性化合物の懸濁物が、適当な油性注射用懸濁剤として調製されてよい。適切な脂溶性溶媒又は媒体は、ゴマ油などの脂肪油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリド、あるいはリポソームを含む。任意に、前記懸濁剤は、化合物の可溶性を増大させて高度に濃縮した溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含有してよい。
【００２１】
局所又は鼻内投与については、浸透すべき特定の障壁に適当な浸透剤を、製剤において使用してよい。
【００２２】
本発明で使用するための医薬組成物は、当該技術分野において既知の標準的な製造手法に実質的にしたがって製造してよい。
【００２３】
本発明に使用するためのペプチド又は組成物は親油性化してよい。これによって、製品の保存寿命及び安定性を改善し、輸送可能性を改善する。これは、温暖な気候であって、冷凍設備が容易に利用可能でない場合において使用するために特に有益である。親油性化した製品を投与前に再構成してよい。
【００２４】
前記方法は、患者における各種の細胞による更なるペプチドの放出のカスケードを誘導する可能性がある１つ又は複数のペプチド調節因子又は放出因子を投与する工程を更に含んでよい。その様な追加の因子は、好ましくはＣＲＦと同じ供給源、特にヤギ血清由来である。適切な因子は、とりわけα−ＨＬＡ、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−１０を含む。
【００２５】
好ましい実施態様では、前記方法は、バソプレッシン、βエンドルフィン、及びエンケファリンの１つ又は複数を投与する工程を含んでよい。ある実施態様では、前記方法は、ＣＲＦ結合タンパク質であるＣＲＦ−ＢＰを含んでよい。これはＣＲＦに結合し、患者に対するＣＲＦの後続の放出のためのリザーバーとして働いてよい。
【００２６】
前記方法は、ＰＯＭＣペプチド又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を更に含んでよく、あるＰＯＭＣ産物は、患者に投与して、更なる生産を刺激するか又は内因性のＰＯＭＣが生産され得る前に所望の応答を得るために有用であってよい。
【００２７】
本発明の更なる態様は、患者にＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、ＰＯＭＣは非ヒトＰＯＭＣであり、好都合には有蹄動物ＰＯＭＣであり、最も好ましくはヤギＰＯＭＣである。ＰＯＭＣは下垂体において生産され、そのため、血清に少なくとも有意なレベルで存在することは予期されなかったが、驚くべきことに、ヤギが出血又は免疫などの生理ストレスによって刺激を受ける際に特に、ヤギ血清がＰＯＭＣ、ＰＯＭＣ関連ペプチド、及びＰＯＭＣカスケード関連分子を含有することを同定した。これによって、本発明の医薬組成物のためのＰＯＭＣの簡便な供給源が提供される。ＰＯＭＣは患者において自律的な効果を有する可能性があると解されており、ＰＯＭＣの初期量の投与が患者においてＰＯＭＣの体内生産を生じさせ、かくして、低レベルのＰＯＭＣの初期投与が患者に対して顕著な効果を有する可能性があると解されている。ＣＲＦペプチドのように、言うまでも無く、組換えＰＯＭＣを含むヤギ以外のＰＯＭＣペプチドの供給源が使用されてよい。
【００２９】
ＰＯＭＣ及びその関連分子の対象に対する投与において、ペプチドをタンパク質分解して、対象が容易に利用可能な形態においてＰＯＭＣ産物の１つ又は複数を提供し、視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ）を刺激する分子カスケードの誘導も存在すると解される。
【００３０】
本発明の更なる態様によれば、α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの２つ以上を投与する工程を含むＨＩＶの治療方法を提供する。おそらく投与によるＰＯＭＣのタンパク質分解が与えられて、ＰＯＭＣ由来の個々のホルモンの２つ以上の投与によって類似の効果を達成することができる可能性がある。記載したホルモンは、個々のペプチド又は１つ又は複数の前駆体分子（例えば、ＰＯＭＣの部分分解物）として提供されてよい。好ましくは、３、４、５、６、又は７のホルモンが、その様な分子の持続的な生産のためのカスケードを（任意にＣＲＦと共に）誘導する医薬組成物中に含まれる。各種の成分が、該成分の１つ又は複数に結合する１つ又は複数の担体分子と組み合わせて提供されてよく、該成分放出のためのリザーバー又はデポーとして働いてよい。担体分子は、ＰＯＭＣ及びその関連ペプチドと組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドの最適な用量は未だ決定していないが、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは０．０１から５ｍｇ／ｋｇの間、０．０２５から２ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは０．０５から１ｍｇ／ｋｇの間の用量のペプチドを対象に投与することが適当であってよい。
【００３２】
正確な投与用量は、患者の年齢、性別、及び体重、投与方法及び製剤、並びに治療しようとする疾患の性質及び重度などの因子によって変化してよい。食事、投与時間、患者の状態、併用薬、及び反応感度などの他の因子が考慮に入れられてよい。効果的な治療計画は、治療する医療従事者によって決定されてよい。一回又は複数回の投与が与えられて、典型的には、少なくとも３、５、又はそれ以上の一連の投与の後に利益が認められる。組成物の有益な効果を維持するために、反復投与が望ましい可能性がある。
【００３３】
治療は、任意の効果的な経路によって、好ましくは、皮下注射によって投与してよいが、使用してよい代替的な経路は、筋肉内又は病巣内注射、経口、エアロゾル、非経口、又は局所を含む。
【００３４】
治療は、好ましくは、液体製剤として投与されるが、他の製剤が使用されてよい。液体製剤は、凍結乾燥製剤から再構成されてよい。例えば、治療は、適切な製薬学的に許容される担体と混合して良く、経口、局所、又は非経口投与用の適切な組成物における固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）として製剤化されてよい。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶの治療用の医薬の製造におけるＣＲＦの使用も提供する。ＨＩＶの治療用の医薬の調製におけるＰＯＭＣの使用も提供する。ＣＲＦ又はＰＯＭＣは、単離された精製ＣＲＦ又はＰＯＭＣであってよいが、上述の各種の他の成分と組み合わせて投与することが好ましい。特に、生物活性担体タンパク質及びバソプレッシンを使用してよい。
【実施例】
【００３６】
国際特許出願公開ＷＯ ０３／００４０４９及びＷＯ ０３／０６４４７２は、ヤギ血清組成物の製造を開示している。その製造方法の概要を以下に示す。
【００３７】
血清組成物の製造
ヤギは、１ｍｌあたり１０９のウイルス粒子の濃度でＨＩＶ−３ｂの筋肉内注射を用いて、標準的な市販の上清に懸濁した可溶化ＨＩＶ−３ｂウイルスを筋肉内注射して接種する。前記ウイルスは、３０分間６０℃で事前に熱で殺滅させる。最適な手法では、ヤギは、４週間に亘って毎週注射し、次いで、６週目にヤギを出血させて試薬を得る。
【００３８】
約４００ｃｃの血液を滅菌技術のもとでヤギから得る。前記動物は、典型的には１０から１４日で再出血させてよく、血液の量を補充する。出血前の養生は、血清の活性成分生産を刺激するために有用である可能性がある。全ての後続の処理工程は、他に特定していない限り、好ましくは４℃で実施する。次いで、血液を遠心分離して、血清を分離し、血清を濾過して大きな凝塊及び粒子状物質を除く。次いで、過飽和硫酸アンモニウム（４℃で４７％溶液）で血清を処理して、抗体及び他の物質を沈殿させる。結果として得られた溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ６Ｍ／Ｅ遠心分離機で４５分間に亘って３５００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清の流動体を除去する。沈殿したイムノグロブリン及び他の固体物質は、沈殿物を再溶解するのに十分なＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁する。
【００３９】
次いで、溶液は、４℃で１０，０００ダルトンの分子量カットオフでＰＢＳに対して透析濾過に供する。透析濾過後に、製品を０．２ミクロンフィルターで滅菌容器に濾過して、タンパク質濃度を４から５ｍｇ／ｍｌに調節する。溶液は、１ｍｌの単回投与を与える容器に入れて、使用するまで−２２℃で保存した。
【００４０】
血清組成物の分析
ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８は、この方法で調製した血清組成物が、ＰＯＭＣ及びＣＲＦペプチドを含有することを報告しており、血清の効果におけるこれらのペプチドの積極的役割を示唆している。血清の分析の概要を以下に示す。
【００４１】
前記組成物のサンプルはゲルでサイズ分画し、βエンドルフィンに対する抗体を用いてウエスタンブロットを実施した。強力なシグナルが検出され、βエンドルフィンの存在が示されたが、見掛けの分子量は約３１ｋＤａであり、βエンドルフィンの推定サイズよりもはるかに大きかった。このことは、βエンドルフィンが大きなペプチドの一部としてサンプル中に存在することを示しており、前記サイズはＰＯＭＣのものと一致した。
【００４２】
本出願人は、その組成物に対してマススペクトロメトリーも実施して、少なくとも２つのＰＯＭＣ由来ペプチド、つまりβエンドルフィン及びコルチコトロピン関連分子を検出した。ＣＲＨ−ＢＰ（コルチコトロピン放出ホルモン結合タンパク質）も同定した。
【００４３】
図１から４
ＰＯＭＣペプチド及びＣＲＦ−ＢＰは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｅｇａｎ ＬＣＱマススペクトロメトリーによって、前記製品中において同定した。ＣＲＦは、下垂体前葉におけるＡＣＴＨの合成及び分泌を主に調節している。ＣＲＦ及びＣＲＦ−ＢＰに加えて、ＰＯＭＣ及び／又はその構成ペプチドの投与は、ＰＯＭＣペプチドの合成及び持続的な濃度の上昇の発生の促進に作用するカスケードを開始すると解される。ＣＥＦ−ＢＰは、ＣＲＦのリザーバーとして働く機能を有する。
【００４４】
図１から４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の汚染から分離した前記製品に由来するトリプシン消化物のマススペクトロメトリー分析から得られたヒットを示す。上述のように、これらの分子の幾つかは、ＰＯＭＣカスケードの誘導因子及び調節因子である。より詳細な分析（例えば、ペプチド分画、免疫沈降、及び濃縮）を用いた更なる調査は、より多くのペプチドが存在することを明らかにするであろう。図１は、ＰＯＭＣ由来コルチコトロピンの存在を示す。図２は、ＣＲＦ−ＢＰの存在を示す。図３は、プロエンケファリンＡの存在を示す。図４は、プロエンケファリンＢの存在を示す。ＣＲＦ−ＢＰの存在は、製品が幾つかのＣＲＦを含有するが、ＰＯＭＣ及び関連ペプチドも明らかに存在することを示唆する。
【００４５】
本出願人は、また、患者自身の血清の血清組成物を用いて治療効果を調査した。これらの効果を以下に記載する。
【００４６】
治療した患者における、炎症性ＴＨ−１プロフィールから抗炎症性ＴＨ−２サイトカインプロフィールへの転換の証拠
図５は、上述のように調製したヤギ血清製品で処理する前及び後に、２つの群の患者（健康なボランティア）の血清におけるＴＧＦ−βのレベルを示す。２つの群の患者（各群ｎ＝３）が、生産されるＴＧＦ−βの濃度に対して異なる反応を示すが、全ての患者が、処理に対して血清レベルの増加を示した（ｐｒｅ ｓｅｒａ＝処理前の患者の血清レベル；ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ＝２回目及び５回目の投与後）。データは、治療によって、抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βの濃度の増大が誘導されていることを示す。
【００４７】
図６は、治療前（ｐｒｅ−ｓｅｒａ）及び後における、１つの群の患者のＩＬ−４の血清レベルを示す。治療後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ）において、ＩＬ−４のレベルは患者の血清において有意に増加することが認められる（ｎ＝５）。しかしながら、５回目の投与の後に、ＩＬ−４のレベルは全ての患者において低下しているが、治療前よりも高いままであった。ＩＬ−４は、ＴＨ−１細胞からの炎症性サイトカインＩＬ−４の生産を下方調節することが知られている。全ての患者において認められる濃度の一貫性のある変化は、ＴＨ−１からＴＨ−２への転換におけるＩＬ−４の役割と一致している。
【００４８】
図７は、治療前及び後における、１つの群の患者のＩＬ−６の血清レベルを示す。治療後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ）に、ＩＬ−６のレベルが患者の血清において減少していることが認められる（ｎ＝４）。
【００４９】
図８は、治療前及び後における、１つの群の患者のＩＦＮ−γの血清レベルを示す。処理後（ｐｏｓｔ ２ｎｄ及びｐｏｓｔ ５ｔｈ）に、ＩＦＮ−γのレベルが患者の血清において減少していることが認められる。
【００５０】
図９は、ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）が、単球亜集団における抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の生産を誘導することを示す。Ｔリンパ球及びＢリンパ球並びに単球は、ヒトボランティアから得られたＰＢＭＣから分離した。全ての細胞種は、等量の製品で１６時間に亘って処理し、それらの上清を、ＩＬ−１０含有量についてＥＬＩＳＡでアッセイした。Ｔ細胞集団によって生産されたＩＬ−１０レベルは処理によって影響を受けず、ＩＬ−１０の小さな増加のみがＢ細胞において誘導されたことが認められる。しかしながら、ＩＬ−１０濃度の顕著な増加が、処理によって単球集団において誘導された。全ての測定は、三回重複＋／−標準偏差で実施した。これらのデータは、少なくとも３回の別々の試験の典型である。
【００５１】
要点及び結論
本出願人は、上述のヤギ血清製品がＰＯＭＣペプチド及びその産物並びにＣＲＦペプチドを含有することを、本明細書及びＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８において示している。本出願人は、患者の炎症プロフィールにおける転換を誘導する血清製品の投与も示す。
【００５２】
ＷＯ ０３／００４０４９は、ＨＩＶ患者の治療のための上述のように調製したヤギ血清製品の使用を開示する。該文献では、ＨＩＶに対する前記血清の有益な効果が、抗−ＦＡＳ及び抗−ＨＬＡ分子の存在によるものであると示唆されており、ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドが存在することは示唆されていない。該文献は、血清を与えられた患者が、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数の増加、ウイルス量の減少、及びＰ２４値の減少を示すことを観察している。
【００５３】
ＷＯ ０２／０７７６０も、ＨＩＶ患者を治療するための同一のヤギ血清製品の調製及び使用を開示している。該文献は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＩＶの中和を示すという実験データを報告している。該文献の実施例３は、上述と同様のヤギ血清製品の調製を開示している。前記血清の投与は、ＨＩＶウイルス量（血清１ｍｌあたりのＨＩＶ−１ ＲＮＡのコピー数として定義される）の減少を生じさせ、ＣＤ４及びＣＤ８細胞数の増加を生じさせる。ここでも、これらの特性が、ＰＯＭＣ又はＣＲＦペプチドの存在によるものである可能性があるという示唆はされていない。
【００５４】
ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８における発見及び本明細書において提示したデータを考慮すると、ヤギ血清製品がＰＯＭＣペプチド及びその産物並びにＣＲＦペプチドを含有し、これらのペプチド及び産物が活性を有する生物学的作用物質であり、これらのペプチド及び産物が、ヒトの患者におけるＨＩＶ及び／又はＡＩＤＳの治療において、とりわけウイルス量の減少、ＣＤ４細胞数の増加、及びＣＤ８細胞数の増加の１つ又は複数を得るために有用であり得ると解される。
【００５５】
ＨＩＶは、神経変性及び広範な神経病を生じさせる中枢神経系（ＣＮＳ）の各種の病変を誘導することも知られている。これらは、ＨＩＶ脳炎、ＨＩＶ白質脳症、軸索損傷、各種の重度の神経細胞脱落と関連する散在するポリオジストロフィーを含む。後者は、アポトーシスの過程によるものであると解される。これらの疾患は、認知機能の損失及び認知症を生じさせる。神経変性疾患に対するＰＯＭＣ／ＣＲＦペプチドの開示されている効果を考慮すると（ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５０１０８参照）、その様なペプチドは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのこれらの症状並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ自体を緩和するために使用してもよいようである。
【００５６】
ＨＩＶウイルスに感染した人々における視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）が機能不全を起こすことも報告されている。サイトカインネットワークの操作が、ＨＩＶ感染の調節における有益な効果をもたらすであろう。炎症細胞におけるメラノコルチン受容体の刺激が、ＨＩＶ感染の経過を変化させる効果的な治療法である可能性がある。本明細書に記載した血清製品に存在するプロオピオメラノコルチン由来ペプチドは、副腎皮質刺激ホルモン［ＡＣＴＨ（１−３９）］、α−メラニン細胞刺激ホルモン［α−ＭＳＨ（１−１３）］、及び関連するアミノ酸配列を含む。メラノコルチンペプチドは、強力な抗炎症／抗サイトカイン活性を有する。
【００５７】
インターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインは、ＨＩＶ感染患者において有害なものである可能性がある。ＨＩＶ患者の血中におけるＩＬ−１及びＴＮＦ−αの生産に対するメラノコルチンの効果が調べられている。α−ＭＳＨ（１−１３）、α−ＭＳＨ（１１−１３）、ＡＣＴＨ（１−２４）、又はＡＣＴＨ（１−３９）の存在下又は非存在下においてＬＰＳで刺激した全血サンプルにおいて、サイトカイン生産を測定した際に、メラノコルチンが濃度依存的な様式で双方のサイトカインの生産を低減させることが認められた。正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における別の実験では、α−ＭＳＨ（１−１３）が、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０によって誘導されるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの生産を阻害することが認められた。これらの結果は、炎症細胞におけるメラノコルチン受容体の刺激が、ＨＩＶ複製を促進するサイトカインの生産を低減させる新規な方法である可能性を示唆する。
【００５８】
ＰＯＭＣ及びＣＲＦペプチド及びその産物は、各々又は組み合わせのいずれかにおいて、ＨＰＡを調節する能力を有する新規製剤を提供し、メラノコルチンの供給源及びメラノコルチン生産の調節因子として役立つ。特に、高活性炎症性ＴＨ−１サイトカインから抗炎症性ＴＨ２プロフィールへと転換させるようである。かくして、炎症性サイトカインの生産及び放出が調節される。
【００５９】
ＨＩＶ感染が、多数の経路によって単球−マクロファージの感染により促進するという考えを支持する証拠が存在する。ＡＩＤＳにおける日和見感染によるＮＦ−κＢの活性化は、ＣＣＲ５受容体の発現及びＴＮＦ−αの発現を増加し、それらの双方がＨＩＶ感染を支持するための許容状態である。加えて、ウイルス負荷の低減は、感染した組織及び／又は炎症を起こした組織の治療に付随し、これが、免疫活性化とウイルス複製との間の関係を更に後押しする。かくして、ＰＯＭＣ／ＣＲＦペプチド及び／又はその産物を用いる患者の治療は、炎症性サイトカイン及びマクロファージ活性化のレベル並びに組織の炎症を低減し、患者における細胞感染を低減し、おそらく脳などの体内器官に対する感染の拡散を低減するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図２】図２は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図３】図３は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図４】図４は、血清成分のトリプシン消化のマススペクトル分析を示す。
【図５】図５は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図６】図６は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図７】図７は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図８】図８は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【図９】図９は、組成物を用いた治療による患者の炎症プロフィールにおける転換についての証拠を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチドを患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項２】
以下の効果：ウイルス量の減少；ＣＤ４細胞の増加；又はＣＤ８細胞の増加の１つ又は複数を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＦが非ヒトＣＲＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＦがヤギＣＲＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つ又は複数のペプチド調節因子又は放出因子を投与する工程を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記因子が、α−ＨＬＡ、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−１０を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バソプレッシン、βエンドルフィン、及びエンケファリンの１つ又は複数を投与する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＲＦ結合タンパク質であるＣＲＦ−ＢＰを投与する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＯＭＣペプチド又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物を患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項１１】
α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの２つ以上を投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項１２】
ＨＩＶの治療のための医薬の調製における、ＣＲＦペプチドの使用。
【請求項１３】
ＨＩＶの治療のための医薬の調製における、ＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物の使用。
【請求項１】
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチドを患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項２】
以下の効果：ウイルス量の減少；ＣＤ４細胞の増加；又はＣＤ８細胞の増加の１つ又は複数を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＦが非ヒトＣＲＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＦがヤギＣＲＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つ又は複数のペプチド調節因子又は放出因子を投与する工程を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記因子が、α−ＨＬＡ、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−１０を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バソプレッシン、βエンドルフィン、及びエンケファリンの１つ又は複数を投与する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＲＦ結合タンパク質であるＣＲＦ−ＢＰを投与する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＯＭＣペプチド又はＰＯＭＣ産物を投与する工程を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物を患者に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項１１】
α、β、及びγメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）；副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；β及びγリポトロピン（ＬＰＨ）；並びにβエンドルフィンの２つ以上を投与する工程を含む、ＨＩＶの治療方法。
【請求項１２】
ＨＩＶの治療のための医薬の調製における、ＣＲＦペプチドの使用。
【請求項１３】
ＨＩＶの治療のための医薬の調製における、ＰＯＭＣペプチド及び／又はＰＯＭＣ産物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５２２３４５（Ｐ２００９−５２２３４５Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９０６５（Ｐ２００８−５４９０６５）
【出願日】平成１９年１月５日（２００７．１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０５０００６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７７４６５
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０４０００９３７）エイムスコ・リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月５日（２００７．１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０５０００６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７７４６５
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０４０００９３７）エイムスコ・リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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