ＨＩＶワクチン処方物
本発明において提供されるのは、ＰＬＧおよび／あるいはＨＩＶタンパク質を吸収するＨＩＶポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、ＨＩＶワクチンである。被験体において免疫応答を生じさせるための、これらのワクチンの使用方法もまた、提供される。１つの側面において、本発明は少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇコード配列またはＥｎｖコード配列を含む核酸発現ベクター（例えば、プラスミド、ウィルス性ベクターなど）およびＰＬＧを含むＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物を包含する。好ましくは、この核酸発現ベクターが、ＰＬＧに吸収される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、広く免疫原性のＨＩＶ組成物、特にＨＩＶワクチンならびにこれらワクチンの処方および投与の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医学が直面している最も大きな健康の脅威の１つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存在しない。
【０００３】
１９８３年〜１９８４年においては、３つのグループが、ＡＩＤＳの推測される病因学的な因子を別々に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，ＥｓｓｅｘおよびＧｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２。これらの単離物は、リンパ節腫脹症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と、さまざまに呼ばれた。これらの単離物の全てが、同じウイルスの株であり、そして後にまとめて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれた。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離物を用いて、最初にＨＩＶと呼ばれた株が、現在ＨＩＶ−１と呼ばれており、そして関連するウイルスが、ＨＩＶ−２と呼ばれている。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６９５を参照のこと。
【０００４】
１９９６年、合衆国において高活性抗レトロウィルス治療（ＨＡＡＲＴ）の実行により、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と診断された人の数、およびＡＩＤＳで死亡した人の数は、実質的に下落し（Ｋａｒｏｎら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９１（７）：１０６０−１０６８）、その結果としてＡＩＤＳと共に生きる人（ｐｅｒｓｏｎｓ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ）の数は増加してきた。疾病管理センター（Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＤＣ）は、２０００年１２月３１日時点で、合衆国においておよそ３４０，０００の人がＡＩＤＳと共に生きていたと予測する（ＭＭＷＲ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｓｕｒｖｅｉｌｌｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ、１３（Ｎｏ．１）２００１）。
【０００５】
合衆国における臨床的な試みは、限定された被験体数に対して実施され、そしてさらなるＨＩＶワクチンの開発は、ＨＩＶの血清罹患が十分に高く、プラセボコントロールと、免疫性を与えられた集団における防護との区別が可能である、適切な集団の同定を必要とし得る（Ｓｅａｇｅ ＩＩＩら（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１５３（７）：６１９−６２７；Ｈａｌｐｅｒｎら（２００１）Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ ２７（３）：２８１−８）。
【０００６】
ＨＩＶの主な伝播様式は、性交渉を通じての伝播様式、および感染した体液（血液、精液、膣液、母乳および血液を含む他の体液）との接触によっての伝播様式である。先進国において、人々への危険性が知られている報告された事例の大部分は、男性と性交渉をもつ男性の事例である。ＨＩＶ抗体に対する血液スクリーニングが始められる以前は、輸血関連ＨＩＶは合衆国において懸案であった（ＣＤＣ．Ｕｐｄａｔｅ：ＨＩＶ−２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｏｎｏｒｓ−−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、１９９２年６月〜１９９５年６月、ＭＭＷＲ、１９９５ ４４：６０３−６０６頁）。他の伝播の様式には、注射薬物常用者による注射針の共有、病院勤務者における感染血液との不注意の接触、および汚染された医療機器の再利用を通じてのまれな医原性の伝播が挙げられる。より高い率の性的伝播感染は、危険な性交渉実践の増加の前兆である。Ｃｈｅｎら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９２（９）：１３８７−１３８８。異性間のＨＩＶ−１伝播は、特に女性、若者および経済的弱者の間で増加し続けており、そして現実に、異性間の伝播は発展途上の社会において優勢な伝播様式である。これらの傾向は、予防的ワクチンおよび／または治療に役立つワクチンの開発の必要性を強調する。Ｃａｔａｎｉａら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９１（６）：９０７−９１４。
【０００７】
ＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子産物およびＧａｇ遺伝子産物を含むワクチン開発のためのいくつかの標的が、試験されている。Ｇａｇ遺伝子産物としては、Ｇａｇポリメラーゼ（ｐｏｌ）およびＧａｇプロテアーゼ（ｐｒｏｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物としては、モノマーｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーｇｐ１４０ポリペプチド（ｏ−ｇｐ１４０）およびｇｐ１６０ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
最近、免疫原性の組成物中でのＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの使用が記載されている。（異なるＨＩＶ ｅｎｖ改変体をそれぞれ発現する少なくとも４つの異なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性の組成物を記載している、１９９８年１２月８日に発行されたＨｕｒｗｉｔｚらの米国特許第５，８４６，５４６号；および、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドを記載している、１９９８年１１月２４日に発行された、Ｖａｈｌｎｅらの米国特許第５，８４０，３１３号を参照のこと）。さらに、１９９９年３月２日に発行された、Ｓｉａらの米国特許第５，８７６，７３１号は、配列ＧＰＧＲを含有しているＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して直接連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含有しているＨＩＶに対する候補のワクチンを記載している。しかしながら、これらのグループは有効なＨＩＶワクチンを同定しなかった。
【０００９】
米国特許第６，６０２，７０５号および国際特許公報ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ／０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４は、様々なサブタイプ由来の免疫原性ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する。
【００１０】
従って、免疫原性ＨＩＶ組成物の、特にＨＩＶワクチン処方物の必要性が、なお存在している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
１つの側面において、本発明は少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇコード配列またはＥｎｖコード配列を含む核酸発現ベクター（例えば、プラスミド、ウィルス性ベクターなど）およびＰＬＧを含むＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物を包含する。好ましくは、この核酸発現ベクターが、ＰＬＧに吸収される。特定の実施形態において、ＰＬＧの濃度は、核酸発現ベクターの濃度より約５倍と１００倍の間で高い。例えば、核酸の濃度は、約１０μｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間であり得、そしてＰＬＧの濃度は約１００μｇ／ｍＬと１００ｍｇ／ｍＬの間であり得、そして／あるいは１用量あたりの核酸発現ベクターの濃度は約１μｇ／用量と５ｍｇ／用量の間であり得、そして１用量あたりのＰＬＧの濃度は、約１０μｇ／用量と１００ｍｇ／用量の間であり得る。特定の処方物は、本明細書中に、例えば表１、表２、または表９のカラム２において記載される。
【００１２】
別の側面において、本発明はＨＩＶエンベロープタンパク質（例えばオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０））；および薬学的に受容可能な賦形剤を含むＨＩＶワクチン組成物を包含する。特定の実施形態において、ｏ−ｇｐ１４０の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの間である。さらに、特定の実施形態において、このｏ−ｇｐ１４０の１用量あたりの濃度は、約１００μｇ／用量である。ＨＩＶタンパク質ワクチンの特定の処方物はまた、本明細書中に、例えば表３および表１１において記載される。
【００１３】
別の側面において、本発明は、１つ以上の本明細書に記載されるＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、本明細書に記載されるＨＩＶ Ｇａｇ ＤＮＡワクチンおよび本明細書に記載されるようなＨＩＶ Ｅｎｖ ＤＮＡワクチン）および１つ以上の本明細書に記載されるＨＩＶワクチン（例えば、ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０調製物）を含むＨＩＶワクチンを包含する。
【００１４】
本明細書に記載される任意のＨＩＶワクチン組成物は、さらに１つ以上のアジュバント（例えば、ＭＦ５９またはＣｐＧ）を含み得る。ＭＦ５０についての特定の処方物は、表４に記載される。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は被験体において免疫応答を起こさせる方法を包含し、この方法は、（ａ）被験体に、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、および（ｂ）工程（ａ）の投与の後で、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程を包含する。特定の実施形態において、工程（ａ）において投与される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物は、本明細書に記載されるようなＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび／または少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチン）を含み、そして工程（ｂ）において投与されるＨＩＶワクチン組成物は、本明細書に記載されるＨＩＶタンパク質ワクチンを含む。さらに、工程（ａ）は、本明細書に記載される１つ以上のＨＩＶ ＤＮＡワクチンの複数回投与（例えば、１ヶ月間隔で２回または３回の投与）を包含し得、そして工程（ｂ）は、本明細書に記載される１つ以上のＨＩＶタンパク質ワクチンの、少なくとも１回の投与（１、２または３ヶ月間隔で２回または３回の投与）を包含し得る。あるいは、工程（ｂ）は、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび／またはＨＩＶ Ｅｎｖワクチン）および本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶタンパク質ワクチンを同時投与する工程を包含し得る。工程（ａ）の投与と工程（ｂ）の投与との間の時間は変動し得、例えば１ヶ月と６ヶ月の間またはそれ以上である。本明細書に記載される任意の方法において、１回以上の投与は筋内および／または皮内であり得る。
【００１６】
さらなる側面において、本発明はオリゴマーＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０タンパク質を作製する方法を包含し、この方法は、ｇｐ１４０をコードする核酸を宿主細胞に導入する工程；ｇｐ１４０が細胞内において発現される条件下で宿主細胞を培養する工程；およびオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）タンパク質を宿主細胞から単離する工程を包含する。特定の実施形態において、このｏ−ｇｐ１４０は、この細胞から分泌され、そしてこの細胞上清から単離される。
【００１７】
なおさらなる側面において、本明細書に記載される任意のＨＩＶ ＤＮＡワクチンを作製する方法が提供される。この方法は、１つ以上のＨＩＶポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、無菌のＰＬＧ微粒子とを結合させる工程を包含し、その結果核酸発現ベクターがＰＬＧ微粒子に結合して、ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを形成する。特定の実施形態において、この方法は、さらにこのＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを凍結乾燥する工程を包含する。
【００１８】
別の側面において、本発明は本明細書に記載されるようなＨＩＶタンパク質ワクチンを作製する方法を包含し、この方法は、ｏ−ｇｐ１４０とアジュバントを結合させる工程を包含する。
【００１９】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示を照らして当業者に容易に見出されるであろう。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に特に示されない限りは、当業者の範囲内である、化学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬理学的な従来の方法を使用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと。
【００２１】
本明細書において引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、前出または後掲に関わらずその全体が参考として援用される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に特に明確に示されない限りは、複数形の対象物を含む。従って、例えば、「抗原」に関しては、２つ以上のこのような抗原の混合物を含む。
【００２３】
本発明を記載する前に、本明細書にこれ以降で使用される特定の用語の定義を最初に記載することは、それらの用語を理解する助けとなり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＨＩＶポリペプチド」は任意のＨＩＶ株またはサブタイプ由来の任意のＨＩＶペプチドをいい、これらとしては、Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ，ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはｖｐｕ；それらの機能的（例えば、免疫原性）フラグメント、それらの改変ポリペプチドおよびこれらのフラグメントおよび／または改変ポリペプチドの組み合せが挙げられるが、これに限定されない。さらに、本明細書中に定義される「ＨＩＶポリペプチド」は、公知のＨＩＶポリペプチドの正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。むしろＨＩＶゲノムは、絶えず流動的な状態であり、そして単体間に相対的に高い度合いの改変性を示すいくつかの領域を含む。本明細書中に明らかにされるように、ポリペプチドが免疫原性の特徴を有するということが重要である。この用語が任意の様々なＨＩＶ株およびサブタイプに由来するポリペプチドを包含することは、容易に明らかである。この用語はさらに、生成の方法に関わらず任意のこのようなＨＩＶタンパク質を包含する（例えば、組換え的に生成されたポリペプチド、および合成的に生成されたポリペプチドが挙げられる）。
【００２５】
さらに、用語「ＨＩＶポリペプチド」は、天然の配列に対するさらなる改変、例えばさらなる内部欠失、付加および置換（一般に天然に保存される）、を含むタンパク質を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように故意であってもよく、または天然に存在する変異事象によるように偶然であってもよい。これら改変の全ては、本発明が意図する目的のための改変ＨＩＶポリペプチド機能である限りは、本発明において包含される。従って、例えばワクチン組成物において、改変は免疫学的な活性が失われないものであるべきである。同様に、ポリペプチドが診断的な目的のために使用される場合、このような能力は保持されなければならない。従って、この用語はまた、天然に存在するペプチドとは異なる、例えば１つ以上の欠失（例えば、Ｅｎｖから欠失した様々な領域）、置換および／または挿入を含むペプチドであるＨＩＶポリペプチドを含む。非保存的な変化は、一般には上記アミノ酸の１つと異なる群からのアミノ酸との置換（例えば、ＡｓｎをＧｌｕに置換すること）、あるいは上記アミノ酸いずれかをＣｙｓ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＰｒｏに置換することである。共通のアミノ酸を含む置換は、都合の良いことには所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発、次いで変更された形態の発現によって実施される。アミノ酸は、合成的または半合成的な方法によってもまた、変更され得る。例えば、システイン残基またはセリン残基は、単離したタンパク質の適切な化学的処理によってセレンシステインに転化され得る。あるいは、共通でないアミノ酸は、インビトロタンパク質合成方法において標準的に組み込まれ得る。代表的に、変異体において天然の配列に対し変更、欠失または付加された残基の総数は、約２０以下であり得、好ましくは約１０以下であり得、もっとも好ましくは約５以下である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合には、「合成」ポリヌクレオチド配列は、ＨＩＶをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｇａｇコード配列および／またはＥｎｖコード配列）をいい、その発現は、例えば阻害配列のコドンの置換および不活性化によって最適化されてきた。例えば、米国特許第６，６０２、７０５号および国際公報ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４の合成ＨＩＶをコードするポリヌクレオチドの例を参照のこと。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「野生型」配列または「天然の」配列は、それらが天然において見出される本質的なポリペプチドのコード配列をいう。例えば、Ｃ型の単離物（例えば、ボツワナ単離物、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８またはＡＦ１１０９７５、あるいはサウスアフリカン単離物）のような他の単離物において発見されたＧａｇコード配列および／またはＥｎｖコード配列。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、以下にさらに議論される任意のいくつかのウイルスに由来する、複製性ではないウイルスの殻をいう。ＶＬＰは、一般的には、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるこれらのタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドのような、１つ以上のウイルスタンパク質から構成されるが、これらに限定されない。ＶＬＰは、適切な発現系においてタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成し得る。粒子状のＶＬＰを産生するための方法は当該分野で公知であり、そして以下により完全に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当該分野で公知の従来技術（例えば、電子顕微鏡分析、Ｘ線結晶解析など）を使用して検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離され得、そして／または特徴的な密度のバンド形成によって同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡分析が、対象のＶＬＰ調製物のガラス化された水溶性のサンプル対して行われ得、そして適切な露出条件下で画像が記録され得る。
【００２９】
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」によって、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、または内部欠失を有するウイルスタンパク質が意味される。これらは、ＶＬＰ形成に好ましい条件下でＶＬＰを形成する能力を有する。従って、ポリペプチドは、全長の配列、フラグメント、短縮された配列および部分的な配列、ならびに参照分子のアナログおよび前駆体の形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を維持している限り、配列に対する欠失、付加，および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然のバリエーションを含む。なぜなら、コートタンパク質におけるバリエーションはしばしば、ウイルスの単体間で生じるからである。この用語はまた、タンパク質がＶＬＰを形成する能力を維持している限り、参照のタンパク質において天然には生じない欠失、付加、および置換を含む。好ましい置換は、天然に保存されている置換（すなわち、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、一般的に、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。
【００３０】
「抗原」とは、体液性および／または細胞性抗原特異的応答を生じる宿主免疫系を刺激する１つ以上のエピトープを含む分子（線状、配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）のいずれか、またはその両方）をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。代表的に、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４個の程度の少なさのアミノ酸であり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。代表的に、エピトープは、約７と１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、抗原が天然に関連している生物全体から分離され、そして別個である抗原）、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生体、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープ（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中で使用される場合、抗原の定義の下にとらえられる。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
【００３１】
本発明の目的のために、抗原は好ましくは任意のＨＩＶのサブタイプに由来する。抗原はまた、任意のいくつかの公知のウィルス、細菌、寄生体および真菌、または腫瘍抗原に由来され得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」はタンパク質が本明細書中に定義される場合、免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、例えば、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般に天然に保存される）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように故意であってもよく、または抗原を産生する宿主の変異によるように偶然であってもよい。
【００３２】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する抗原に対する被験体の体液性および／または細胞性免疫応答における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して存在し、そして細胞表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する機能を刺激し、そしてこの細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により産生される他のこのような分子の産生をいう。
【００３３】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近で指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的な保護を可能にするように生成され得る。
【００３４】
細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くのアッセイによって（例えば、リンホ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによって）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、Ｔ細胞集団による細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定を含む（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５、１９９７）により総説される）。
【００３５】
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。ＨＩＶ抗原もまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する保護を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００３６】
「免疫学的組成物」は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する被験体の体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じさせる抗原性分子を含む組物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜（例えば、直腸内または膣内）投与によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
【００３７】
「サブユニット」ワクチンとは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌、寄生体または真菌由来）の抗原に由来するか、またはそれに相同である、１以上の選択された抗原（しかし、全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原性細胞または病原性粒子、あるいはこのような細胞または粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそれらのアナログから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。
【００３８】
「実質的に精製される（た）」とは、一般に、基質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、存在するサンプルの主要な割合を含むように、基質を単離することをいう。代表的には、サンプル中に、実質的に精製された成分は、このサンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０％〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度に従う沈降が挙げられる。
【００３９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、インビボで転写される（ＤＮＡの場合）核酸分子、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによって、そして３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。
【００４０】
代表的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止配列に対して３’に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に位置する）、および翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「核酸」分子には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえも挙げられ得るが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログを含む配列を捕捉する。
【００４２】
「作動可能に連結した」は、エレメントの整列をいい、ここで、そのように記載された成分は、それらの機能を行うように構成されている。従って、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。このプロモーターは、自身の発現を指向するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結」していると考えられ得る。
【００４３】
本明細書において核酸分子を記載するために使用される場合、「組換え」は、その起源または操作により、（１）天然に関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない；および／または（２）天然に関連している以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されたポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞部分として培養された原核生物微生物細胞株または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得る、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされている始原細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または起源の親に相補的なゲノムもしくは全ＤＮＡにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００４４】
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する適切な部位での２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。次いで、いわゆる「パーセント同一性」は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する（代表的に、ｃＤＮＡ中間体を介して）こと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。
【００４５】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸配列またはペプチド配列が一般に記載されているか否か）は、一般に、より短い配列の長さによって除算され、そして１００を積算された２つの整列された配列間の正確な整合の数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって規格化された、スコア付けマトリックスを使用して、ペプチド配列を用いる使用にまで拡張し得る。核酸配列およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、から入手可能）に記載される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。
【００４６】
例えば、特定のヌクレオチド配列の、参照配列に対するパーセント同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコア付け表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーとともに使用して決定され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって頒布されているＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権の帰属するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、スコア付表（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）について使用されるデフォルトパラメータが使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラム（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ（これはデフォルトパラメータでも使用され得る））は、一般に、当該分野で公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータでも使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非縮重、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４７】
当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを容易に決定し得る。例えば、検索パラメータは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の配列に由来するＹ個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有し；（ｉｉ）ＸとＹは等しく、かつ（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチドよりも大きいか、それに等しく、そして５０００ヌクレオチドまでであり、好ましくは、８ヌクレオチドより大きいか、またはそれに等しく、そして５０００ヌクレオチドまでであり、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチドであり、そして５０００ヌクレオチドまでであり、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０ヌクレオチドであり、本明細書に記載される全長配列（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照）に存在するヌクレオチドの数までであり、上記の範囲内の全ての整数値が含まれる。
【００４８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドには、本明細書に開示される配列に対して（例えば、本発明の特許請求された配列またはその他の配列）、本発明の配列が問い合わせ配列として使用された場合に、約８０％〜１００％の、８０〜８５％より大きい、好ましくは、９０〜９２％より大きい、より好ましくは、９５％より大きい、そして最も好ましくは、９８％より大きい配列同一性（これらの記載の範囲内に入る全ての整数値を含む）有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００４９】
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、「選択的にハイブリダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、など、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な結合事象の不在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性を欠損する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％よりも少ない配列同一性を有するプローブ）を使用することによって評価され得る。
【００５０】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、そのプローブおよび標的配列が、互いに、「選択的にハイブリダイズする」か、結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きな配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知なように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００５１】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多数の等価な条件が、例えば、以下のファクターを変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために利用され得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに種々の洗浄条件。特定の組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野での標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００５２】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、その相補物と、同一の塩基対配列を有するか、または実質的に同一の塩基対配列を有する場合、あるいは第１のポリヌクレオチドが上記のように配列同一性を示す場合、その第１のポリヌクレオチドは、その第２のポリヌクレオチドに「由来する」。
【００５３】
第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）上記のように第２のポリペプチドと配列同一性を示す場合、その第１のポリペプチドは、その第２のポリペプチドに「由来する」。
【００５４】
ウイルスポリペプチドが、（ｉ）そのウイルスのポリヌクレオチド（ウイルスポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、または（ｉｉ）上記のようにそのウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示す場合、一般に、そのウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（ウイルスポリペプチド）に「由来する」。
【００５５】
「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、ここで、ポリペプチド配列またはその部分は、核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。その配列によってコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同定され得るポリペプチド配列もまた、含まれる。
【００５６】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然に関連するタンパク質を実質的に含まない（例えば、約５０％未満を含む、好ましくは約７０％未満を含む、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野において周知であり、そして、例えば、カオトロピック剤を用いるポリヌクレオチドを含有する細胞の破壊、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離が挙げられる。
【００５７】
「核酸免疫」によって、インビボにおける抗原（単数および複数）あるいはエピトープ（単数および複数）の発現のために、宿主細胞中に１つ以上の選択した抗原をコードする核酸分子を導入することを意味する。核酸分子は、例えば、注入投与、吸入投与、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエント被験体中に直接的に導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り出された細胞中に導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、被験体中で、核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答を開始し得る。
【００５８】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞中に目的のＤＮＡを確実に挿入するための方法または系をいう。そのような方法は、非組み込み型移入ＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入された遺伝子物質の挿入を生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫のために使用される場合、そのような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。
【００５９】
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞媒介性攻撃の部分を構成する非抗体産生リンパ球である。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺（胸腺でＴリンパ球は、胸腺ホルモンの指令のもと、成熟化プロセスを受ける）に移動する未成熟のリンパ球から生じる。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分裂し、非常に大多数に増加する。成熟するＴ細胞は、特定の抗原を認識しそして結合するその能力に基づいて、免疫適格となる。免疫適格Ｔ細胞の活性化は、抗原がリンパ球表面レセプターに結合する場合に、誘発される。
【００６０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入される場合、その細胞は、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。そのような技術を使用して、適切な宿主細胞中に１つ以上の外来ＤＮＡ部分を導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方をいい、そしてペプチド結合ＤＮＡおよび抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
【００６１】
標的細胞への「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の移入は、代表的にの細胞に対して比較的非毒性の化合物または組成物に対して細胞を感受性にする。Ｍｏｏｌｔｅｎ、Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（５）：５６７−５７３）および細菌酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７１３−７２０）である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロドラッグであるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌シトシンデアミナーゼ）の効果に対して、感受性となる。Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１５５０−１５５２、Ｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８３０２−８３０６。
【００６２】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、治療的活性を有さないが、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、操作、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれる、遺伝子移入ベクター中に含まれるヌクレオチド配列をいう。
【００６３】
「特異的結合剤」とは、分子の特異的結合対のメンバーをいい、ここでこの分子の１つは、化学的および／または物理的手段を通じて、第２の分子に特異的に結合する。特異的結合剤の１つの例は、選択された抗原に対する抗体である。
【００６４】
「被験体」とは、限定ではなく、ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の尾なしザル種およびサル種を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのようなペット；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験室動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどのようなペット、野生のトリおよび競技用のトリを含むトリ、を含む脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟個体および新生個体の両方を含むことが意味される。これら全ての脊椎動物の免疫系は、同様に作動するので、上記の系は、上記の任意の脊椎動物種における使用が意図される。
【００６５】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的ではなく、またそれ以外においても望まれないことのない物質、すなわち、望まれない生物学的効果を全く生じることもなく、その物質が含まれる組成物のいずれの成分とも有害な様式において相互作用することもなく、処方物または組成物中で個体に投与され得る物質を意味する。
【００６６】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ８．０を含む）、より典型的には約７．２〜７．６の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ７．６を含む）を、意味する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または排除、および／または（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的（感染前）であっても、治療的（感染後）であってもよい。
【００６８】
「核酸発現ベクター」とは、目的の配列または目的の遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または目的の遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含み得る。他の制御エレメントもまた、存在し得る。核酸発現ベクターとしては、プラスミド、ウィルス性ベクター、アルファウィルスベクター（例えば、シンドビス）、真核細胞層状ベクター開始系（例えば、米国特許第６，３４２，３７２号参照のこと）、レトロウィルス性ベクター、アデノウィルス性ベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。種々の核酸ベクターの説明については、米国特許第６，６０２，７０５号もまた参照のこと。発現カセットは、核酸発現ベクター内に含まれ得る。このベクターはまた、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、構築物を１本鎖ＤＮＡとして生成させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、多重クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００６９】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウィルスベクターにおいてでは欠失しているが、感染性組換えレトロウィルスの産生に必須なエレメントを含む細胞をいう。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、Ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る１つ以上の発現カセットを含む。
【００７０】
「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウィルスベクター粒子の産生のために必須なエレメントの全てを含む細胞をいう。
【００７１】
さらに、以下は本明細書で使用される略語の部分的なリストである：
μｇ マイクログラム
ＡＩＤＳ 後天性免疫不全症候群
ＡＰＣ 抗原呈示細胞
ＣＣＲ５ ケモカインレセプター５
ＣＤ４＋ ＣＤ４レセプター
ＣＤ８＋ ＣＤ８レセプター
ＣＤＣ 疾病管理センター
ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＣＭＶ サイトメガロウィルス
ＣｏｎＡ コンカナバリンＡ
ＣＲＦ 事例様式
ＣＲＦ’ｓ 循環組換え様式
ＣＴＡＢ セチルトリメチルアンモニウムブロミド
ＣＴＬ 細胞障害性Ｔリンパ球
Ｃｖ クロミウム（ｃｒｏｍｉｕｍ）
ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチル
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＴＨ 遅延型過敏症
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＥＬＩＳＰＯＴ 酵素結合免疫スポット測定法
ＥＮＶ エンベロープ
ＦＩＧＥ 領域反転ゲル電気泳動
ＧＡＧ 群特異的抗原
ＧＬＰ 良好な実験実践
ｇｐ 糖タンパク質
ＨＡＡＲＴ 高活性抗レトロウィルス治療
ＨＡＰ ハイドロジアパティック（ｈｙｄｒｏｚｉａｐａｔｉｃ）
ＨＢｓＡｇ Ｂ型肝炎皮相抗原
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウィルス
ＨＩＶ／ＨＩＶ−１ ヒト免疫不全ウィルス／１型
ｈｒ 時間
ＨＳＶ 単純疱疹ウイルス
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＦＮγ インターフェロンγ
ＩＭ 筋内
ＩＮＤ 研究新薬
ＩＶ 静脈内
Ｋｂ キロベース
ｋＤ キロダルトン
Ｋｇ キログラム
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ＭＦ５９ 水中油型乳剤アジュバント
ＮａＣｌ 塩化ナトリウム
ＮＩＡＩＤ 国立アレルギーおよび感染症研究所
ＮＩＨ 国立衛生研究所
ｏ−またはＯ− オリゴマー
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＬＧ カチオンポリラクチド−コ−グリコリド
ｐＳＩＮ シンドビスウィルスベクター
ＰＶＡ ポリ（ビニルアルコール）
ＲＥＶ ウィルス性タンパク質−ウィルス性発現の制御に関する
ＳＡＥ 重篤な有害事象
ＳＨＩＶ シミアンヒト免疫不全ウィルス
ＳＰ ｒｅｓｉｎ 改変ポリエステル−カーボネート樹脂
（全体的な概観）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の処方物もプロセスのパラメーターも変動し得るので、特定の処方物にもプロセスのパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００７２】
本明細書中に記載された方法および材料と類似するかまたは等価な多数の方法および材料が、本発明の実施で用いられ得るが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載される。
【００７３】
本発明は、ＨＩＶに対する免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の開発のための方法および組成物に関する。例えば、本明細書に記載されるＨＩＶワクチンは、３つ以上の成分を含み得る。本明細書に記載されるワクチンは筋内注射が意図され得る。特定の実施形態において、２つの核酸成分がカチオンポリラクチド−コ−グリコリド（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧ）微粒子上に処方され（吸収され）、そして初回刺激免疫として投与される。ＤＮＡ成分に加えて、タンパク質成分がまた、１回以上の追加刺激免疫に投与される。このタンパク質成分は、典型的には、ＭＦ−５９アジュバントと混合された少なくとも１つのＨＩＶポリペプチド（例えば、ＣＨＯ細胞によって生成されるＶ２領域に欠失がある組換えオリゴマーエンベロープタンパク質）を含む。
【００７４】
（薬学的組成物）
好ましい実施形態において、本明細書に記載されるＨＩＶワクチンは、６〜９ヶ月またはさらに長い期間において（例えば、筋内投与）が意図される複数回（例えば、３以上）投与の成分を含む。この成分は同時にまたは異なる時点で与えられ得る。例えば、２つの核酸「初回刺激」免疫が与えられ得、ここで各初回刺激免疫が、Ｇａｇタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ＳＦ２由来のｐ５５ Ｇａｇ）および／またはＥｎｖタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２由来の、オリゴマーで、Ｖ２が欠失しているｇｐ１４０エンベロープタンパク質）をコードするＤＮＡの２つの別個の調製物を含み、両方の調製物がＰＬＧ微粒子上に処方される。これらの核酸は、１μｇと１０ｍｇの間のＤＮＡおよび１０μｇと１００ｍｇの間のＰＬＧ（例えば、１ｍｇのＤＮＡおよび２５ｍｇのＰＬＧ微粒子）を含む単位用量バイアルにおいて、代表的に別個に提供される。このＤＮＡ含有用量は、代表的に凍結乾燥された形態において保存され、そしてバイアルは一般に使用時に元に戻される。各単位用量バイアルは、典型的には、実際に患者に投与されるより多いＤＮＡ（またはタンパク質）を含むことに注意するべきである。最終的な投薬量は、代表的に、Ｇａｇ ＤＮＡおよびＥｎｖ ＤＮＡそれぞれ０．５ｍＬ中１ｍｇからなる。このワクチンのＤＮＡ成分は、初回刺激抗体、ＨＩＶ抗原（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖ）に応答するＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞が意図される。
【００７５】
上に言及されるように、本明細書に記載される免疫原性系（ワクチン）はまた、少なくとも１つのタンパク質成分、代表的に任意のＨＩＶ単離物またはＨＩＶ株由来のＨＩＶポリペプチドを含む。例えば、特定の実施形態において、このタンパク質成分は、ＨＩＶ−１のＳＦ１６２株由来の組換えオリゴマーエンベロープタンパク質を含む。ＨＩＶ Ｅｎｖのタンパク質モノマーは、（例えば、可溶性を向上させるために）約１４０ｋＤの分子サイズに切断され得、そしてＶ２ループは少なくとも部分的に取り除かれ得る。得られたオリゴマー分子は、ＨＩＶのエンベロープ構造に非常に似ている。このＶ２可変ループの除去は、レセプター結合および／または共レセプター結合に関する保存されたエピトープを露出する。サブタイプＢ（ＣＣＲ５）一次単離物ＳＦ１６２由来のオリゴマーＶ２欠失ｇｐ１４０をコードする裸のＤＮＡワクチンで初回刺激され、対応する組換えタンパク質で追加刺激されたマカークザルは、異なるサブタイプＢ一次単離物の範囲を中和することが可能な抗体を産生しする。Ｂａｒｎｅｔｔら（２００１）Ｊ Ｖｉｏｌ．７５（１２）：５５２６−４０；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（２００２）Ｊ Ｖｉｏｌ．（６）：２８３５−４７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）Ｊ．Ｖｉｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９。
【００７６】
マカークザル研究においてみられる、マカークザルを保護するために必要とされる受動的に投与される量ならびに中和力価の大きさと幅に基づき、本明細書に記載されるワクチンにより誘発される抗体は、動物の大部分において感染からの保護を提供するであろうことが示唆される。Ｍａｓｃｏｌａら（１９９９）Ｊ Ｖｉｏｌ．７３（５）：４００９−１８。１用量あたりのタンパク質の量は、マイクログラム量からミリグラム量まで変動し得る。特定の実施形態において、このタンパク質は、投与された用量が、防腐剤無しでｐＨ６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液において、エンベロープタンパク質を含んでいる単位用量バイアルにおいて約１００μｇであるように提供される。
【００７７】
本明細書に記載されるタンパク質組成物および／または核酸組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このキャリアは、宿主に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導すべきでない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。適切なキャリアは、代表的に、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウィルス粒子）である。粒子キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来の粒子状キャリアならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして知られているポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら（１９９７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０；Ｏ’Ｈａｇａｎら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４参照のこと。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイドのような細菌性のトキソイド、ならびにＥ．ｃｏｌｉ．に由来する毒素に結合され得る。
【００７８】
薬学的に受容可能な塩もまた、本発明の組成物において使用され得る（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような無機塩類、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩のような有機塩類）。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミン、破傷風トキサイドおよび当業者に周知な他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキスロトース、エタノールなど）を、単独もしくは組み合せて、ならびに湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームはまた、本発明の組成物のためのキャリアとして使用され得、このようなリポソームは上に記載されている。
【００７９】
簡単に、ウィルス性粒子に関しては、複製欠陥ベクター（上で粒子とも称される）は、天然のままの形態または精製形態のいずれかで保存され得る。保存方法および条件は、米国特許第６，０１５，６９４号に記載される。
【００８０】
さらに、本明細書に記載される組成物は、様々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。好ましくは、この組成物は免疫学的応答を開始させるのに十分な量の抗原を含む。適切な有効量は、当業者により決定され得る。このような量は、慣用的試験によって決定され得る比較的広い範囲に入り、そして一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ（例えば、抗原および／または粒子）、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇの粒子／抗原の程度の量である。
【００８１】
すでに示されたように、１つ以上の組成物は、さらに１つ以上のアジュバントを含み得る。有効性を増強し得る好ましいアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない組成物を含む：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を有するかまたは有さない）（例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、マイクロフルイダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９ＴＭ（国際公報ＷＯ ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ第１０章：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、（ｂ）１ミクロン未満のエマルジョンへとマイクロフルイダイズされたかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを作製するためにボルテックスされたかのいずれかの、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ））；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が用いられ得る）またはそれから作製された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体））このＩＳＣＯＭＳは、付加的な洗浄剤を欠き得る（例えば、ＷＯ ００／０７６２１を参照のこと））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ ９９／４４６３６）、ＩＬ１６など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−βＲａｎｔｅｓなど）など）；（６）必要に応じて、肺炎双球菌の糖と共に使用される場合、実質的にミョウバンの非存在下で、モノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−ジアシレートＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）（ＷＯ ００／５６３５８）；（７）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンと３ｄＭＰＬとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（８）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４：１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０：８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６：１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７：２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６：１２１６−１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４２：５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３：２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６：４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７：７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ． Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９：８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７：１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０：４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０５：５８９８−５９０６；国際特許出願ＷＯ ９６／０２５５５、ＷＯ ９８／１６２４７、ＷＯ ９８／１８８１０、ＷＯ ９８／４０１００５、ＷＯ ９８／５５４９５、ＷＯ ９８／３７９１９およびＷＯ ９８／５２５８１）すなわち、必要に応じてシトシンの代わりに使用される５メチルシトシンと共に少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド含む；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチロン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｏｎｅ）エステル、例えばＷＯ ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組み合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ ０１／２１２０７）もしくは少なくとも１つのさらなる非イオン性の界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合せた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ ０１／２１１５２）；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ ００／６２８００）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ ００／２３１０５）；（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン（例えば、ＷＯ ９９／１１２４１）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＝ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、ＷＯ ９９／５７６５９）（１４）組成物の有効性を増強する免疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバン（特にリン酸アルミニウムおよび／または水酸化物アルミニウム）およびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【００８２】
ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【００８３】
本明細書に記載される薬学的組成物の投与は、任意の適切な経路により行われ得る（例えば、セクションＣを参照のこと）。特に、筋内投与または粘膜（例えば、直腸および／または膣）投与が好ましい。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回の用量スケジュールは、最初のコース（ｃｏｕｒｓｅ）のワクチン接種が、１〜１０回の別々の用量であり得、次いで他の用量が、免疫応答を維持および／または増強するように選択された時間間隔の後（例えば、第２の用量について１〜６ヶ月間）で与えられ、そして必要な場合、続いての用量が数ヵ月後に与えられるスケジュールである。この投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、モダリティーの有効性、送達が行われるワクチン、被験体の必要性によって決定され、そして開業医の判断に依存する。
【００８４】
特定の実施形態において、このタンパク質成分は、水中油型エマルジョンアジュバントである独立のＭＦ５９Ｃ．１（以後ＭＦ５９と称される）と投与前に混合される（例えば、国際公報ＷＯ番号 ９０／１４８３７参照のこと）。様々なサブユニット抗原（例えば、ＨＣＶ Ｅ２、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＢｓＡｇ、ＣＭＶ ｇＢおよびＨＳＶ ２ｇＤ）が、ＭＦ５９アジュバントと組み合わせられ、そして優れた安全性および許容できるプロフィールで現在までに、１８，０００人以上のヒト被験体に投与されてきた。タンパク質ブースターは、初回刺激抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を幅と継続時間において増幅することが意図され、免疫系の体液性区画および細胞性区画の両方において平衡のとれた応答を提供し、ＨＩＶ−１感染の予防を達成することを可能にする。
【００８５】
すでに示されたように、ＭＦ５９アジュバントは、インフルエンザ、単純疱疹ウィルス２（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）およびＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）由来のサブユニット抗原を含む、多数の異なるサブユニット抗原を用いて臨床試験において徹底的に評価されており、そしてこれは、一般的に一過性でかつ軽度から中等度の重篤度である、最小の局所的有害反応および全体的有害反応に十分許容される。３０を超える臨床研究において、１２，０００人を超える被験体が、ＭＦ５９アジュバントエマルジョンと組み合わせてインフルエンザウィルスワクチンを受けた。わずか２人の患者が、深刻な副作用を受けた。さらに、副作用の発生率は、使用される抗原に依存する。
【００８６】
（初回刺激−追加刺激レジメン）
特定の実施形態において、複数回投与（例えば、初回刺激−追加刺激型投与）は有利に行われ得る。例えば、１つ以上の目的のＨＩＶ抗原を発現する核酸構築物が投与される。次いで、例えば、ポリペプチド抗原および適切なアジュバントを含む組成物において、同一のおよび／または異なるＨＩＶ抗原が投与される。あるいは、抗原はＤＮＡより前に投与される。複数回ポリペプチド投与および複数回核酸投与（任意のオーダーで）がまた、行われ得る。
【００８７】
本明細書に記載のように、本明細書に記載されるある典型的な初回刺激−追加刺激のレジメンは、一つ以上のＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡの二回以上の投与、続いてＨＩＶポリペプチド抗原そのものの一回以上の投与を含む。例えば、ＨＩＶ ＧａｇおよびＨＩＶ ＥｎｖのＤＮＡ／ＰＬＧ組成物（例えば、別個のＧａｇおよびＥｎｖ）の二回以上の投与後、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の一回以上の投与がなされ得る。ＨＩＶ−１ ＤＮＡ構築物は、免疫系の細胞性部門（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｒｍ）および体液性部門（ｈｕｍｏｒａｌ ａｒｍ）を刺激し得、チンパンジーにおけるＨＩＶ感染予防可能な免疫応答を惹起し得る。Ｂｏｙｅｒら（１９９７），Ｎａｔ Ｍｅｄ３：５２６−５３２。ＰＬＧ微粒子の表面上へのＤＮＡの吸着は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＤＮＡの取り込みを改善し、細胞性免疫応答および液性免疫応答を高める。Ｏ’Ｈａｇａｎら、（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：９０３７−４３。ＰＬＧは、ＤＮＡを送達するのに特に好まれる。なぜなら、このポリマーは、生物分解性であり、生体適合性であり、いくつかの薬物送達系を開発するのに使われてきたからである。Ｏｋａｄａら（１９９７）、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ２８（１）：４３−７０。ある実施形態では、ＤＮＡ：ＰＬＧの比率は、約１ｗ／ｗ％と１６ｗ／ｗ％との間（またはその間の任意の値）である。
【００８８】
「ブースター」構成成分は、任意のＨＩＶ株またはサブタイプ由来のＨＩＶタンパク質（例えば、サブタイプＢ株（例えば、ＳＦ２、ＳＦ１６２など）および／またはサブタイプＣ株（ボツワナ株および／またはＴＶ１のような南アフリカ株）由来の、組換えオリゴマー化エンベロープタンパク質）を含む。例えば、Ｓｃｒｉｂａら（２００１），ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １７（８）：７７５−８１；Ｓｃｒｉｂａら（２００２）、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １８（２）１４９−５９；Ｔｒｅｕｒｎｉｃｈｔら（２００２），Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．６８（２）：１４１−６を参照のこと。Ｅｎｖタンパク質のタンパク質単量体は、トランケートになり得、そしてＶ２ループは、交差反応性中和抗体を惹起するためにより効率的である保存されたエピトープの露出を増やすために、部分的に除去され得る。一つの理論に縛り付けられることなく、上記タンパク質ブースターは、一次抗体およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の応答を幅および期間において増幅するように意図されている。Ｂａｒｎｅｔｔら（２００１），Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（１２）：５５２６−４０；Ｃｈｅｒｐｅｌｉｓら（２００１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（３）：１５４７−５０。各々の用量におけるタンパク質濃度は、約１μｇから１０００μｇを超えるまで（またはその間の任意の値）、好ましくは約１０μｇと５００μｇとの間で、そしてなお好ましくは約３０μｇと３００μｇの間で変化し得る。
【００８９】
今日まで、本明細書に記載されるような、ＨＩＶワクチンは、前臨床研究および臨床試験において安全性についての強力な記録を示してきた。以下の実施例４もまた参照のこと。ワクチン関連の免疫不全の証拠は、報告されていない。ＨＩＶワクチンを用いてマウスおよびラビットで実施された毒物学研究は、このワクチンが非常によく寛容されることを示した。発見は、他のウイルスサブユニットワクチンまたはＭＦ５９アジュバントを用いて実施された研究と一致していた。可逆的局部（筋肉内）炎症は、そのようなワクチンで観察される唯一の顕著な変化である（実施例４参照）。
【００９０】
ＨＩＶワクチンの開発計画の目的は、広い体液応答および細胞性応答の組み合わせを惹起し得、かつＨＩＶの感染または進行したＨＩＶ疾患／ＡＩＤＳの発症を予防し得る、新規なＤＮＡプライムプラス組換えタンパク質−追加刺激ＨＩＶワクチンの安全性および効力を証明することである。
【００９１】
（ＨＩＶ抗原の供給源）
ポリヌクレオチド配列（例えば、核酸発現構築物における使用のための）は、例えば、その遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすること、またはその遺伝子を含むことが公知のベクターからその遺伝子を取得することによって、組換え技術を用いて、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、その遺伝子を含む細胞および組織から、標準的な技術、例えば、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲを用いて、直接単離され得る。ＤＮＡを取得および単離するために用いられる技術の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら上記参照。目的とする遺伝子は、クローン化されるよりもむしろ、化学合成によってもまた生産され得る。そのヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について適切なコドンを用いて設計され得る。一般的に、そのアミノ酸配列が発現される意図される宿主にとって好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全なコード配列１へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．，（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３を参照のこと。
【００９２】
次に、所望される抗原をコードする遺伝子配列は、例えば、米国特許第６，６０２，７０５号および国際特許出願公開ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４に記載のベクターに挿入され得る。これらの特許は、適切な例示的な核酸発現ベクターおよび本明細書に記載の組成物および方法において有用な、さらなるベクターを取得する方法を記載している。
【００９３】
発現構築物（例えば、プラスミド）は、代表的には、上記コード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み、この制御エレメントは、対象種中におけるインビボでのその遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的な発現プロモーターとしては、とりわけＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターのようなＣＭＶプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような、他の非ウイルス性プロモーターもまた、哺乳動物発現のために用途が見出される。代表的には、翻訳終止コドンに対して３’側に存在する転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた、存在する。好ましくは、上記コード配列に対して５’側に位置する、翻訳開始の最適化のための配列もまた、存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されるような、ＳＶ４０由来のものおよびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
【００９４】
エンハンサーエレメントはまた、上記哺乳動物構築物の発現レベルを上げるために本明細書で使われ得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるような、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるような、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるような、ヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【００９５】
さらに、キメラ抗原をコードする遺伝子配列（例えば、目的とする複数の抗原／エピトープ（例えば、一つ以上のウイルス単離株由来のもの）をコードする）を含むＨＩＶポリペプチドをコードする核酸が、構築され得る。あるいは、マルチシストロン性カセット（例えば、２−シストロン性カセット）が構築され得、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどを用いた単一ｍＲＮＡからの複数の抗原の発現を可能にする。
【００９６】
さらに、本願処方物に用いられる上記ＨＩＶ抗原（およびこれらの抗原をコードするポリヌクレオチド）は、ＨＩＶの一つ以上のサブタイプから得られ得る。ＨＩＶ−１の配列の系統発生樹には、３本の別個の枝があり、これらの間で、Ｍ（主要）ウイルスは、世界中のヒトの感染のほとんど全てを占める。上記Ｍ群のウイルスは、９個の別個の遺伝子サブタイプまたは（ＡからＫまでの）クレードに分類されてきた。世界中で、上記サブタイプＡおよびＣは、上記感染のほとんどを占め、これらのサブタイプは、南アフリカおよびインドにおいて最も一般的である。上記サブタイプＢは、アメリカ大陸、オーストラリアおよびヨーロッパで支配的である。Ｍａｌｉｍら，（２００１）Ｃｅｌｌ １０４（４）：４６９−７２。これらのサブタイプの後に頻繁に、より新しい循環組換え形態（ＣＲＦ）が生じる。ＨＩＶ−１は、サブタイプの内部で、および単一の個体の内部でさえ、新規の遺伝的多様性を示す。Ｋｗｏｎｇら，（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７４（４）：１９６１−７２。有効なワクチンが開発されたウイルスにおいて見出される多様性と比べた場合、この多様性は非常に莫大である。Ｍｏｏｒｅら，（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：５７２１−９。従って、ＨＩＶに関して、本明細書に記載されるワクチンは、代表的には、支配的な遺伝子サブタイプに基づいて開発されるが、特定のサブタイプに対して有効なワクチンは、本明細書に記載の教示を用いて容易に生産され得る。
【００９７】
（産業上の利用可能性）
ＨＩＶがＡＩＤＳの病因物質であるという１９８３年から１９８４年における発見は、ワクチンの迅速な開発に希望をわかせた。４０種類より多くのＨＩＶのワクチンの候補が、すでにフェーズＩおよびフェーズＩＩの臨床試験で試験されており、最初のフェーズＩＩ試験は、米国およびタイで現在進行中である。Ｅｓｐａｒｚａ，Ｊ．（２００１）Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．７９（１２）：１１３３−７。しかし、そのワクチンの開発の主な障害は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳに対する防御の免疫学的相関に関する科学的証拠が欠如していることであった。Ｃｌｅｒｉｃｉら（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５１（１−２）：６９−７３。ＨＩＶに感染したほとんどの個体は、広汎な免疫学的応答を上記ウイルスに対して発生するけれども、これらの応答は、上記感染も除去し得ないし、疾患の進行も防止し得ない。この問題は、ＨＩＶ株は世界の様々な地域で著しく変わるという事実により、さらに複雑となる。ＨＩＶは、特にウイルスエンベロープタンパク質をコードしている遺伝子において、広範囲にわたる遺伝子配列不均一性を示す。種々のサブタイプのウイルスは、それら自体の間で結合し得、付加的循環組換え形態（ＣＲＦ）を産生する。ＭｃＣｕｔｃｈａｎら（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（６）：３３３１−３３３８。
【００９８】
ＨＩＶ−１感染に対する天然の応答よりも効果的である特異的抗ＨＩＶ−１免疫応答を誘導するためのワクチン接種の使用は遂行し難いことが、証明されてきた。ワクチンが有効な感染の大部分において、ウイルス血症または菌血症は、病原体が標的器官に到達する前に免疫系がその病原体を含むことを可能にする重大な段階である。Ａｄａら（２００１）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３４５：１０４２−１０５３。従って、想定されてきた。ＨＩＶ−１の十分な免疫制御の欠損が、そのウイルス血症の初期段階の間の主要な標的であるＣＤ４＋細胞にＨＩＶ−１が感染して瀉出する能力（Ｇｒｅｅｎｅら（２００２），Ｎａｔ Ｍｅｄ．８（７）：６７３−８０）；表面抗原の配列を変異させるＨＩＶ−１の能力；ＨＩＶ−１は、マスクしなければ中和抗体に認識される表面エピトープをマスクする能力を有する、弱い抗原であるという事実；および／またはＨＩＶ−１は、細胞性免疫応答を回避し得、免疫系に接近不能な部位での潜在性感染を確立し得るという事実（Ｇｏｔｃｈら，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １３（１）：１３−１７）を含む、いくつかの要因に起因する可能性があるいうことが想定されてきた。
【００９９】
さらに、ほとんどの認可されたワクチンは、細胞性応答および抗体応答の両方を惹起するが、これらの公知のワクチンが感染に対して実際にどのように防御するかについてはほとんど知られていない。機能的抗体応答は、細菌を殺すこと、ウイルスを不活化することまたは毒素を中和することのいずれかにより、その接種物を排除し得る。Ｐｌｏｔｋｉｎら（２００１），Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ．２０（１）：６３−７５。しかし、以前に、試験されたそのＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ−１の多様な一次単離株に対する、広汎なＨＩＶ−１特異的中和抗体の十分な力価を惹起し得なかった。
【０１００】
科学界には、成功するために、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのワクチンは、ｉ）広範囲の一次単離物を中和し得る抗体を誘導し、ｉｉ）種々の株に対する持続性のＣＤ８＋培介性細胞傷害性応答を誘導し、そしてｉｉｉ）ＣＴＬ活性を維持する強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するべきである、という全体的な合意がある。例えば、Ｍａｓｃｏｌａら（１９９９），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３（５）：４００９−１８を参照のこと。受動的に投与された抗体だけで、病原性ＳＨＩＶを用いた粘膜性およびＩＶの両方のチャレンジに対して、マカクを防御し得る。例えば、Ｍａｓｃｏｌａら，（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（４）：４８９−９５を参照のこと。しかし、広汎に交差反応性の中和抗体が免疫化によりヒトにおいて惹起され得るという疑いが存在する。これは、何人かの研究者に、ワクチンにエンベローブを含ませる努力をあきらめさせ、防御のために細胞性免疫に専ら頼るワクチンを奨励させた。また、Ｋａｕｌら（２００１），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０７（３）：３４１−９参照のこと。しかし、そのようなワクチンは、感染から防御する見込みがなく、疾患の進行を制限することが期待され得る。
【０１０１】
従って、本明細書に記載される組成物および方法は、好ましくは体液性応答（中和抗体）ならびに細胞性応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）の組み合わせを惹起する。（体液性応答または細胞性応答それぞれで十分であり得るのだが。）その初回刺激レジメンは、好ましくはＧａｇ ＨＩＶ遺伝子および／またはＥｎｖ ＨＩＶ遺伝子をそれぞれ含む核酸ベクター（例えば、ｐＣＭＶもしくはｐＳＩＮ）に基づく。ＤＮＡを基にしたワクチンは魅力的である。なぜなら、そのワクチンは融通がきき、比較的生産しやすいからである。そのワクチンの配布は、簡単にされ得る。なぜなら、ＤＮＡそれ自体は、適切に保存された場合、非常に耐久性だからである。抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを用いた免疫化は、抗体媒介性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を惹起する。ＤＮＡ免疫化は、様々な動物モデルにおいて防御性免疫を提供した。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７），Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０（３）：１６３−７２を参照のこと。マラリア抗原をコードするＤＮＡワクチンは、２０人の志願者により、比較的十分に寛容され、ほんのわずかな穏やかな局部的反応原生および全身性症状しか伴わなかった。Ｗａｎｇら（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３８８）：４７６−８０。ＨＩＶ−１のＥｎｖ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む、ＤＮＡを基にしたワクチンは、抗ウイルス薬を用いていない１５人の無症候のＨＩＶ感染患者に投与された。そのワクチンは、局部反応も全身反応も誘導せず、実験の異常は何も検出されなかった。特に、自己免疫抗体を生じた患者はいなかった。ＭａｃＧｒｅｇｏｒら（１９９８），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１７８（１）：９２−１００。進行中のフェーズ１の臨床試験は、治療ワクチンは、ヒトにおいて抗ＨＩＶ−１免疫応答を実際に追加刺激するということを示す。Ｕｇｅｎら（１９９８），Ｖａｃｃｉｎｅ １６（１９）：１８１８−２１。
【０１０２】
本明細書に記載される組成物および方法の追加刺激構成成分は、代表的にはＨＩＶタンパク質（例えば、Ｖ２ループの欠損を有し、それゆえに保存されたエピトープを露出しているＨＩＶエンベロープｇｐ１４０タンパク質）を含む。本明細書に記載されるＨＩＶタンパク質ワクチンは、一般的に、サブユニット組換え抗原を含み、そして、非組換えＨＩＶタンパク質ワクチンを用いて得られる安全日および有効日を考慮して、十分に寛容され、かつ（体液性および細胞性）免疫原性であることの両方が予測される。
【０１０３】
（処方物および投与）
上記に言及されている通り、上記組成物は、好ましくは「初回刺激−追加刺激」アプローチを使用して投与される。例えば、２回の初回刺激注射物（例えば、各々が、ＨＩＶ−１のＳＦ２由来のｐ５５ ＧａｇをコードするＤＮＡ調製物およびＨＩＶ−１のＳＦ１６２由来の、Ｖ２ループを欠損したオリゴマーｇｐ１４０エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡの調製物という２種の別個の調製物を含み、その両方が、ＰＬＧ微粒子（Ｅｎｖ ＰＬＧ／ＤＮＡまたはＧａｇ ＰＬＧ／ＤＮＡ）上に処方されている）が投与される。追加刺激組成物は、タンパク質を含み、例えば抗原は、ＭＦ５９アジュバントと組み合わせた、組換えオリゴマーの、Ｖ２ループの欠失したｇｐ１４０エンベロープタンパク質（ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０）から構成されている。そのタンパク質は、代表的には、注射の直前に上記アジュバントと混合される。
【０１０４】
上記ＤＮＡワクチンは、バイアル１本当たり１．４ｍｇのＤＮＡおよび３５ｍｇのＰＬＧ微粒子を凍結乾燥形態で５．０ｍＬのＩ型のガラスバイアルにて提供され得る。ＨＩＶ
ｏ−ｇｐ１４０抗原は、バイアル１本当たり０．３５ｍＬ中に１４０μｇを含む、３ｍＬのＩ型ガラスバイアルに入った液体として供給される。ＭＦ５９アジュバントは、バイアル１本当たり０．７ｍＬを含む３ｍＬのＩ型ガラスバイアルに入れて供給される。一般的に、実際に被験体に投与されるＤＮＡおよびタンパク質の用量は、そのバイアルに含まれる用量未満である。例えば、そのバイアルが１．４ｍｇを含む場合、約１．０ｍｇのＤＮＡが、代表的に被験体に投与される。同様に、各々の単位容量バイアルが、１４０μｇのタンパク質を含む場合、約１００μｇのタンパク質が、代表的に被験体に投与される。
【０１０５】
核酸およびポリペプチドに関しては、任意の適切な送達様式が使用され得る。リポソームもまた、これらの分子の送達のために用いられ得る。核酸の送達用のキャリアとしてのリポソームの使用の概観として、Ｈｕｇ ａｎｄ Ｓｌｅｉｇｈｔ， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）のＶｏｌ．１０１のｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電している）調製物、アニオン性（負に荷電している）調製物および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態でのプラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されてきた。カチオン性リポソームは、容易に入手できる。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で入手可能である．（また、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照のこと。）市販されている他の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０１０６】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を用いて容易に作られる。そのような物質には、とりわけ、フォスファチジルコリン、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルフォスファチジルエタノーコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、適当な比率でＤＯＴＭＡ開始剤およびＤＯＴＡＰ開始剤と混合され得る。これらの物質を用いてリポソームを作る方法は、当業者に十分に公知である。
【０１０７】
前記ＤＮＡ抗原および／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４；４８３−４９１に記載されるものに類似した蝸牛殻状（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）脂質組成物の状態で送達され得る。また、米国特許第４，６６３，１６１号および第４，８７１，４８８号を参照のこと。
【０１０８】
上記ワクチンの構成成分はまた、粒子カプセル状キャリアにカプセル化されるか、粒子状キャリアに吸着されるか、または結合され得る。そのようなキャリアは、複数のコピー数の選択された抗原を免疫系に提示し、局部リンパ節中での抗原の捕捉および保持を促進する。その粒子は、マクロファージにより貪食され得、そしてサイトカインの放出により抗原提示を増強し得る。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のものならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−コ−グリコチド）由来の微粒子−が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）１４９−５４，１９９３を参照のこと。適切な微粒子はまた、例えばアニオン性洗剤またはカチオン性洗剤のような、電荷を帯びた洗剤の存在下で生産され得、正味負の電荷または正味正の電荷を持つ表面を有する微粒子を生産する。例えば、アニオン性洗剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））を用いて生産される微粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、負に荷電している高分子（例えば、ＤＮＡを吸着する。）（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと。）核酸を送達するためのＰＬＧ粒子の製造方法および使用方法が、国際特許出願公開ＷＯ ９８／３３４８７；ＷＯ００／０６１２３；ＷＯ０２／２６２１２；およびＷＯ ０２／０２６２０９に記載されている。
【０１０９】
ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマーおよびこれらの分子の結合体もまた、目的とする核酸を移入するために用いられ得る。
【０１１０】
さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを用いたバイオリスティック送達ステムは、本発明の核酸ベクターを送達するのに特に有用である。上記粒子は、送達されるべき核酸で覆われ、「遺伝子銃」からの火薬発射を使って一般的には減圧雰囲気下で、高速に加速される。そのような技術およびそれゆえ有用な装置の説明に関しては、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、第５，１００，７９２号、第５，１７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および第５，４７８，７４４号を参照のこと。無針注射システムもまた使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０１１１】
本明細書に記載された組成物は、予防薬（感染を予防するため）であるか、または治療法（感染後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。上記組成物は、「治療上有効な量」の目的の遺伝子を、その組成物が投与される個体において免疫応答が生成されるような量の抗原がインビボで産生され得るように、含む。正確な必要量は、治療される被験体に依存して変化する；とりわけ、処置される被験体の年齢および全身的状態；その被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原およびその投与様式に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療上の有効量」は、慣用的試行を通して決定され得る比較的広い範囲にある。
【０１１２】
その組成物は、一つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を一般的に含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）はそのようなビヒクルに存在し得る。核酸取り込みおよび／または核酸発現の特定の促進物質もまた、上記組成物に含まれ得るか、または、たとえばブピバカイン、心臓毒性およびスクロース（これらに限定されない）と共に投与され得る。
【０１１３】
一旦処方されれば、本発明の組成物は、（例えば、上に記載されたように）被験体に直接投与され得るか、あるいは、上記の方法のような方法を用いてエキソビボで上記被験体由来の細胞に送達され得る。例えば、被験体への形質転換細胞のエキソビボでの送達のための方法および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして、この方法としては、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミンおよびＬＴ−１媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へ（対応する抗原を含むかまたは含まない）ポリヌクレオチドのカプセル化、ならびに核への上記ＤＮＡの直接微量注入が挙げられ得る。
【０１１４】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのインビボでの直接送達は、一般的には本明細書に記載のように、従来の注射器またはＡｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような遺伝子銃のどちらかを用いた注入により遂行される。上記構築物は、皮下注射、表皮注射、皮内注射、および粘膜内注射（例えば鼻内注射、直腸内注射、および膣内注射、腹腔内注射、静脈注射、口腔注射もしくは好ましくは、筋肉内注射）のいずれかにより注入され得る。投与処理は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と組み合わされ得る。
【０１１５】
下記は、本発明を実行するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示の目的のためにだけ提供され、これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされてきたが、いくらかの実験的誤差および偏差は、当然計上されるべきである。
【実施例】
【０１１６】
（実験）
（実施例１：ワクチン製造プロセスおよび放出）
（Ａ．ＰＬＧ／ＤＮＡ ＨＩＶワクチン）
核酸を用いたＰＬＧ／ＤＮＡ初回刺激免疫化に関して、プラスミドＤＮＡ（ＥｎｖまたはＧａｇ）を、本質的には以下の通りに生分解性ポリマー微粒子（ＰＬＧ）上に吸着させた。そのＤＮＡワクチンを製造するために、大腸菌（ＤＨ５株）を、上記ＨＩＶ Ｅｎｖ遺伝子およびＧａｇ遺伝子をコードするプラスミドを用いて形質転換した。改変型アルカリ溶解方法を使用して、プラスミドＤＮＡを、染色体ＤＮＡ、タンパク質および他の細胞断片から単離した。プラスミドＤＮＡを、ＰＥＧ８０００を用いた沈殿により濃縮した。その後、上記プラスミドは、二回のクロマトグラフィー工程により精製し、限外濾過により処方物緩衝液中に移した。
【０１１７】
ＰＬＧ微粒子を、無菌製造プロセスによって生産した。例えば、米国特許第５，６０３，９６０号；第６，５３４，０６４号および６，５７３，２３８号；Ｇｕｐｔａら（１９９８），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．３２（３）：２２５−２４６；Ｏ’Ｈａｇａｎ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０（１）：１−１０を参照のこと。特に、（塩化メチレンに溶解した）ＰＬＧを、高速および高せん断の混合条件下で処方物緩衝液およびＣＴＡＢ（カチオン性界面活性剤）溶液を用いてホモジネートし、安定なエマルジョンを形成した。窒素パージによる塩化メチレンの除去は、そのカチオン性界面活性剤がＰＬＧの界面にとどまる傾向に起因して、ＰＬＧに微粒子を形成させる。これらの正に帯電した微粒子は、負に帯電したＤＮＡと結合し、上記ＰＬＧ／ＤＮＡ免疫原を形成する。
【０１１８】
（Ｂ．ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原）
上記組換えオリゴマー性ＨＩＶ ｇｐ−１４０（ｏ−ｇｐ１４０）を、本質的にはＳｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９に記載のように調製した。宿主細胞の発酵に続き、細胞培養液の上清を得、濾過し、濃縮し、そして精製した。
【０１１９】
その精製ｏ−ｇｐ１４０タンパク質画分を、外来性ウイルスを除去するためにさらに処理した。これらの工程の第１の工程は、ｐＨ３．５で１時間のウイルスの不活性化であった。その後、サンプルを濃縮し、ＳＰ樹脂を用いたカチオンの捕獲のためにｐＨ４で緩衝液にディアフィルトレーションした。ＳＰ樹脂は、ｏ−ｇｐ１４０レジンを捕捉し、多くのウイルスを通り抜けさせる。そのｏ−ｇｐ１４０を溶出し、濃縮して処方物緩衝液中にディアフィルトレーションした。この処方された大量生産物を、次にＵｌｔｉｐｏｒ（登録商標） ＶＦ グレード ＤＶ５０ウイルス除去膜を通して濾過した後、０．２μｍ膜を通して濾過した。
【０１２０】
（Ｃ．ＭＦ５９ アジュバント）
ＭＦ５９アジュバント（ＭＦ５９Ｃ．１）は、スクアレン内部油相およびクエン酸塩緩衝液外部水相を持つ、水中油滴型エマルジョンである。例えば、米国特許第６，２９９，８８４号および６，０８６，９０１号；Ｏｔｔら，「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７７−２９６（１９９５）。二つの非イオン性界面活性剤、トリオレイン酸ソルビタンおよびポリソルベート８０は、上記エマルジョンを安定化させるのに役立つ。上記ＭＦ５９アジュバンドの安定性は、動物およびヒトにおいて、多くの抗体と組み合わせて示されている。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら，「ＭＦ５９ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｂｏｔｈ Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｏｌｄ Ｍｉｃｅ」Ｖａｃｃｉｎｅ １４（６）：４７８−４８４（１９９６）を参照のこと。
【０１２１】
（実施例２ ワクチン組成物）
上記ＰＬＧ／ＤＮＡ初回刺激ワクチン、ｏ−ｇｐ１４０追加刺激抗原、およびＭＦ５９アジュバンドの要素を、以下の表において規定する。
【０１２２】
（表１ ＰＬＧ ＤＮＡ（Ｅｎｖ）ワクチン組成物）
【０１２３】
【表１】
＊再構成の後。
【０１２４】
（表２ ＰＬＧ ＤＮＡ（Ｇａｇ）ワクチン組成物）
【０１２５】
【表２】
＊再構成の後。
【０１２６】
（表３ ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原組成物）
【０１２７】
【表３】
（表４ ＭＦ５９Ｃ．１アジュバント組成物）
【０１２８】
【表４】
ワクチン注射のスケジュールは、複数の時点で（例えば、５つの異なる時点または６つの異なる時点で）注射することであり、０月目、１月目、２月目、６月目、９月目および可能ならば１２月目に投与される。いくつかの免疫化スケジュールは、免疫応答を最大化するように評価される。これらのスケジュールは、例えば、以下に記載されるような任意のスケジュールに従う、４つの時点または５つの時点でのワクチン接種を含み得る。すべてのワクチン接種は、外来患者の設定で筋肉内注射により投与される。表５は、例示的な免疫化プロトコールを示す。
【０１２９】
（表５ 免疫化のプロトコール）
【０１３０】
【表５】
＃スケジュール
＊免疫応答を維持する必要がある場合
（実施例３：取り扱いおよび保存）
投与用に上記ＤＮＡ／ＰＬＧワクチンを調製するため、一本のバイアルの各々のＤＮＡ／ＰＬＧ（ＥｎｖまたはＧａｇ）を、０．７ｍＬの注射用水を注射器に引き出すことおよびそれをその二本のバイアルに添加することにより、再構成する。そのバイアルを、二分間まで激しく攪拌する。上記懸濁物が均一であり、乳白色であり、十分に分散した場合、その混合物は完成している。その再構成された溶液を、最大のＤＮＡ／ＰＬＧ用量（１０００μｇ）を送達するために、更なる調製なしに投与する。５００μｇ用量および２５０μｇ用量を調製するために、新しい注射器を使って０．７ｍＬまたは２．１ｍＬのさらなる０．９％のＮａＣｌ溶液（生理食塩水）それぞれを、準備され、再構成されたすべてのバイアルに加え、かき混ぜて混合する。新しい注射器を用いて、０．５ｍＬの上記Ｅｎｖ ＰＬＧ／ＤＮＡ混合物を、その後０．５ｍＬの上記Ｇａｇ ＤＮＡ／ＰＬＧ混合物を同一の注射器に引き出す。その後、合わせた容積１ｍＬ中の、全ＤＮＡ用量を、三角筋に筋肉内注射（ＩＭ）し得る。
【０１３１】
ＨＩＶのｏ−ｇｐ１４０抗原を、投与前にＭＦ５９アジュバンドと混合する。ワクチンの投与用量を調製するため、上記ＭＦ５９バイアルの中身を繰り返し施回させること、および（激しい振盪ではなく）反転させることにより混合し、次に０．３５ｍＬを１ｍＬの無菌注射器に引き出す。このアジュバントを、解凍したＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原を含む上記３ｍＬバイアルに注入し、そして緩やかに施回することにより混合する。新たな注射器を用いて上記混合物の０．５ｍＬを引き出し、その後、その混合物を三角筋に筋肉内注射（ＩＭ）し得る。最終ワクチンは、乳白色の不透明性を有する。上記注射は、上記アジュバントの添加の直後に投与するべきである。
【０１３２】
上記解凍したＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原は、２℃〜８℃で８時間安定である。８時間より長時間解凍された抗原は、（冷蔵されていても）好ましくない。なぜなら、それは減少した効力を有し得るからである。
【０１３３】
偽薬を受ける個体は、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まない、リン酸緩衝化生理食塩水を０．５ｍＬ受ける。１ｍＬ用量を送達するための一定容積を含むバイアルに入れて、無色透明な溶液として供給する。上記バイアルは、２℃〜８℃にて冷蔵庫中で保存しなければならない。
【０１３４】
（Ａ．ワクチン保存条件）
前記凍結乾燥したＤＮＡ／ＰＬＧワクチンを、２℃〜８℃にて保存する。ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０を、−６０℃未満で凍結して保存し、そして上記ＭＦ５９アジュバントを、冷蔵庫中に２℃〜８℃にて保存する。ＭＦ５９は、凍結するべきではない。
【０１３５】
（実施例４：動物研究）
非臨床安全評価計画を、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の３筋肉内（ＩＭ）用量、次いで上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物の３ＩＭ用量の臨床投与を援助するために設計した。上記ＤＮＡワクチン処方物の１臨床用量（１．０ｍＬ）は、１ｍｇのＥｎｖ−ＤＮＡ、１ｍｇのＧａｇ−ＤＮＡおよび５０ｍｇのＰＬＧを含み、一方、上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの１臨床用量（０．５ｍＬ）は、０．１ｍｇ／０．２５ｍＬのＥｎｖタンパク質および０．２５ｍＬのＭＦ５９を含む。
【０１３６】
以下のＧＬＰ研究を、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を単回のＩＭ注射として、ニュージーランドシロウサギに投与した場合、宿主のゲノムＤＮＡ中への組込みが生じるかを評価するため、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合は上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の組織局在および持続性を特徴付けるためにそれぞれ行った。これらの研究を、以下の「ニュージーランドシロウサギに対する単回筋肉内注射後のＤＮＡ−ＰＬＧ処方物を用いた組み込み研究」と題したセクションＡおよび「ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の単回用量生体分布研究」と題したセクションＢにおいてさらに記述する。
【０１３７】
以下にさらに詳細に記述するように、これらの研究では、生存度、臨床的知見、体重および肉眼的剖検に基づいて毒性を評価した。注射部位の理学的検査および皮膚評点付けもまた、マウス生体分布研究においても遂行した。これらの研究の結果は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡワクチン処方物の単回用量の投与により、上記ウサギのゲノムＤＮＡへの組込みが生じず、そしてニュージーランドシロウサギおよびＢＡＬＢ／ｃマウスに十分な耐性が生じることを証明した。上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の分布に関するマウス組織の分析もまた行った。
【０１３８】
さらに、以下のＧＬＰ毒物学研究を実行して、ニュージーランドシロウサギにＩＭ注射により投与した場合の、上記ＨＩＶワクチン処方物の全身的寛容および局部的寛容を評価した。（「ニュージーランドシロウサギにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を用いた複数回用量の筋肉内注射毒性研究」と題した以下のセクションＣを参照のこと。）本研究では、動物に、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の４用量を二週間間隔で与え、続いて上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物の４用量を二週間間隔で与えた。最初のＨＩＶタンパク質ワクチン用量は、最終ＨＩＶ ＤＮＡワクチン用量と同じ日に投与した。二週間の回復期間を、その研究計画は含んだ。ウサギに、上記予定の臨床用量（１ｍＬ ＨＩＶ ＤＮＡワクチン／用量；０．５ｍＬ ＨＩＶタンパク質ワクチン／用量）を臨床的投与経路（ＩＭ）で与えた。しかし、ウサギに、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンの各々の４用量および上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの４用量を与えた。これは、意図した臨床的レジメン（各３用量）よりも１用量だけ多かった。ウサギ投与レジメンは、（月１回の）臨床的レジメンに比較して濃密であるが、ウサギ免疫原性研究は、２週ごとのレジメンが免疫学的観点から適当であるということを示した。
【０１３９】
本研究では、毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、体温、食物消費、検眼鏡検査、臨床病理学（血液学、血清化学およびフィブリノーゲンを含む凝固）、器官の重さ、ならびに肉眼的剖検および組織病理学的検査に基づいて評価した。抗体（抗核抗体ならびに抗Ｅｎｖ抗体および抗Ｇａｇ抗体）に関する血清の分析もまた実行した。本研究の条件のもとでかつ利用可能な予備データ（末期の器官の重さ、肉眼検査評価および未解決の組織学）に基づいて、上記ＨＩＶワクチン処方物の投与に関連するいかなる全身的効果も局部的効果も確認されなかった。
【０１４０】
上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の注射部位における安全性および存続性を、以下の非ＧＬＰ研究においてさらに評価した。そしてその非ＧＬＰ研究には、さらに詳細に、以下の「雄のニュージーランドシロウサギにおける、予備的ＤＮＡ／ＰＬＧ局部刺激寛容研究」と題したセクションＤおよび「ＰＣＲ注入部位評価を用いた、単回用量筋肉内マウス免疫原性研究および複数（２）用量筋肉内マウス免疫原性研究」と題したセクションＥに記述した。
【０１４１】
上記単回用量研究を行い、単回のＩＭ注射により投与した場合の、雄のニュージーランドシロウサギにおける、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧの潜在的局部刺激効果を評価した。潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、総合肉眼検診および注射部位の顕微鏡検査に基づいて評価した。本研究の条件下では、単回ＩＭ注射として雄のニュージーランドシロウサギに投与した場合、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧは、十分に寛容された。
【０１４２】
上記複数回用量免疫原性研究は、Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ処方物の２回投与（０日目および２８日目）を受けた雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、最終投与の４週間後および８週間後の、上記ＩＭ注射部位でのＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧの存在を評価した。結果は、上記ＰＬＧ処方物は、裸のＤＮＡコントロールと、持続性という観点で匹敵するということ、および最終投与の４週間後および８週間後での注射部位に残存する量は、不十分（上記感染量の約１０−７％）であるということを示した。
【０１４３】
（Ａ ニュージーランドシロウサギに対する、単回筋肉内注射後のＤＮＡ−ＰＬＧ処方物を用いた組み込み研究）
ニュージーランドシロウサギに対する単回ＩＭ注射によって上記ＨＩＶ ＤＮＡ−ＰＬＧワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の宿主ゲノムＤＮＡへの組込みを評価するため、以下の研究を行った。その研究は、３群から成り立っており、その１群あたり雌雄二匹ずつのウサギを含んでいた。０日目に、処理したウサギの各々の後脚に上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたは上記Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのどちらか一方の単回ＩＭ注射（０．５ｍＬ／脚）をした（表６参照）。コントロールのウサギには、いかなる注射もしなかった。全ての動物を、２９日目に剖検した。
（表６ 実験的研究設計）
【０１４４】
【表６】
ａ動物一匹あたりの全用量２ｍｇのＤＮＡ、５０ｍｇのＰＬＧ与えるために、群２および群３の動物に、各々の後脚に、脚一本あたり１ｍｇ／０．５ｍＬのＤＮＡ、２５ｍｇ／０．５ｍＬのＰＬＧの１用量を与えた。本研究の０日目に投与を行った。
ｂ動物一匹あたり総容積１ｍＬを与えるために、群２および群３の動物に、脚一本あたり容積０．５ｍＬの量を与えた。
ｃ剖検を、投与３０日後（２９日目）に行った。
【０１４５】
潜在的毒性を、死亡率に関する生存度の知見および全身的状態に関する生存度の知見、体重ならびに総合的剖検肉眼検査に基づいて評価した。さらに、剖検の際にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析のために注射部位を集め、上記ウサギのゲノムＤＮＡ中への上記ＤＮＡワクチンの組み込みを評価した。上記注射部位で陽性組み込み結果の事象がある場合にあり得るＰＣＲ分析のために、さらなる組織（表７参照）もまた集めた。上記ＰＣＲ分析のために、ＤＮＡを上記ウサギ組織から抽出し、定量し、フィールド逆転ゲル電気泳動に供して、上記ウサギゲノムＤＮＡを染色体外プラスミドＤＮＡから分離した。１７ｋｂより大きいサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、精製した。上記の抽出したＤＮＡおよびＦＩＧＥ精製ＤＮＡ（１μｇ）の両方を、定量的ＰＣＲアッセイを用いて分析し、各々の調製物における標的配列（プラスミドベクターＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の組み込みを評価した。コントロール動物の組織から抽出したＤＮＡを、性別に従ってプールした；処理した動物由来のＤＮＡをプールしなかったが、別々に分析した。
【０１４６】
（表７ ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１４７】
【表７】
死亡は一つもなく、臨床的徴候および体重に対する処理関連の副作用も一つもなかった。肉眼的検査における、処理関連の変化も注目されなかった。上記ＰＣＲ組み込み分析の結果は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧの上記宿主ゲノムＤＮＡ中への組み込みがないことを示した（表８参照）。上記注射部位で組み込みが一つも生じなかったので、さらなる組織は評価しなかった。
【０１４８】
（表８ 注射部位の定量的ＰＣＲアッセイ結果）
【０１４９】
【表８】
ｑフィールド逆転ゲル電気泳動（染色体外プラスミドＤＮＡ＋ゲノムＤＮＡ）の前のゲノムＤＮＡ中の上記標的配列の定量
ｑフィールド逆転ゲル電気泳動（ゲノムＤＮＡのみ）により精製したゲノムＤＮＡ中の上記標的配列の定量
ＬＬＤ＝上記アッセイの低い方の検出限界（５コピー数／μｇ ＤＮＡ）よりも低い。
【０１５０】
結論として、合計２ｍｇのＤＮＡおよび５０ｍｇのＰＬＧを含む、Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかの単回ＩＭ用量は、ニュージーランドシロウサギにおいて十分に寛容された。処理関連の副作用は全く注目されず、そしてプラスミドベクターＥｎｖ−ＤＮＡの、上記注射部位から得たウサギゲノムＤＮＡ中への組み込みは検出されなかった。
【０１５１】
（Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の単回用量生体分布研究）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する筋肉内（ＩＭ）注射による単回投与後の、上記ＨＩＶ ＤＮＡ ＰＬＧワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の組織局在および持続性を評価するため、以下の研究を行った。その研究は、１群あたり雄雌１５匹ずつの動物からなる群を５つ含んでいた。１日目に、処理したマウスの右大腿二頭筋領域に、高用量のＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧもしくはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ、または低用量のＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧもしくはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかを単回筋肉内（ＩＭ）注射した。コントロールのマウスには、いかなる注射もしなかった。一群あたり雄雌５匹ずつの動物を、投与１週間後（８日目）、投与２ヶ月後（６１日目）または投与３ヶ月後（９１日目）に剖検した。（表９）。
【０１５２】
潜在的毒性を、死亡率および全身的状態に関する生存度の知見、理学的検査、体重、注射部位の皮膚のＤｒａｚｉｅ評点付け、ならびに総合的剖検肉眼検査に基づいて評価した。さらに、選択した組織（表１０参照）を、各々の剖検の際に、ＰＣＲ分析のために収集し、マウス組織中への上記ＤＮＡワクチンの生体分布および持続性を評価した。上記ＰＣＲ分析のために、各々のマウス組織からＤＮＡを抽出し、定量し、蛍光プローブを用いるＰＣＲ増幅に供し、その後、蛍光検出を行った。収集した組織の内、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧで処理したウサギ由来の組織のみを分析した。
【０１５３】
（表９ 実験的研究設計）
【０１５４】
【表９】
ａ本研究の１日目に投与を行った。
【０１５５】
（表１０ ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１５６】
【表１０】
上記試験物質の投与に関連し得る死亡は一つもなく、臨床的徴候および体重に対する処理関連の副作用も一つもなかった。注射部位において、紅斑も浮腫も見られなかった。肉眼検査において注目された処理関連の変化はなかった。
【０１５７】
結論として、１００μｇまでのＤＮＡおよび２．５ｍｇまでのＰＬＧを含む、Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかの単回筋肉内（ＩＭ）用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて十分に寛容された。処理関連の副作用は、何も気付かれなかった。
【０１５８】
（Ｃ．ニュージーランドシロウサギにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を用いた複数回用量筋肉内注射毒性研究）
上記ＨＩＶワクチン処方物の、反復投与後のニュージーランドシロウサギにおける局所的毒性および全身的毒性を評価するため、ならびに知見の可逆性を決定するため、以下の研究を行った。一群あたり雌雄８匹ずつの動物の群を二つ用いた。処理したウサギに、隔週与える上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）を４回投与した。その後、上記処理したウサギに、同様に隔週与える上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物を４回投与した。最後のＨＩＶ ＤＮＡワクチン用量および最初のＨＩＶタンパク質ワクチン用量を、同じ日（４３日目）に投与した。用量は、筋肉内（ＩＭ）注射により大腿四頭筋に投与し、両足に注射した４３日目を除いて、脚を交互に選んだ。コントロール動物に、生理食塩水溶液の筋肉内（ＩＭ）注射を４回し、その後、ＭＦ５９の筋肉内（ＩＭ）注射を４回した。一群あたり雄雌４匹ずつを、投与の３日後（８８日目、主要剖検）または投与の２週間後（９９日目、回復剖検）に剖検した。表１１は、実験的研究設計を示す。
【０１５９】
潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体温、体重、食物消費、眼の検査、臨床的病状（血液学、凝固、および血清化学パラメーター）、器官の重さ、総合肉眼検査試験、および選択した組織の顕微鏡的な評価に基づいて評価した。
【０１６０】
（表１１ 実験的研究設計）
【０１６１】
【表１１】
ａ１６匹の動物（８匹の雄＋８匹の雌）
ｃ０．２５ｍＬのＭＦ５９＋０．２５ｍＬの生理食塩水からなる。
ｃ０．５ｍＬのＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧ（２ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ，５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧ）＋０．５ｍＬのＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ（２ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ，５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧ）からなる。
ｄ０．２５ｍＬのＥｎｖタンパク質（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋０．２５ｍＬのＭＦ５９からなる。
ｅ一群あたり雄雌４匹ずつの動物。
【０１６２】
上記動物を、死亡率および罹患率に関して１日に２回観察し、そして毒性の徴候に関して１日に１回観察した。さらに、詳細な観察を、投与前、各々の投与日の４時間後、毎週１回および各剖検の際に行った。注射部位を刺激の徴候に関して評価し、投与前、ならびに各注射の２４時間後および４８時間後に、改変Ｄｒａｉｚｅスコアに基づいて等級付けした。体温を、処理前、各投与前および各投与の２４時間後に測定した。体重を、処理前、その後毎週１回、および剖検の際に記録した。食物消費を毎週１回評価した。眼科学的評価を、処理前および各剖検の前に行った。血液学、血清化学および（フィブリノーゲンを含む）凝固分析についてのさらなる血液サンプルを、処理前、２９日目および５７日目の投与前、ならびに８７日目および９９日目に収集した。各々抗体（抗核抗体ならびに抗Ｅｎｖ抗体および抗Ｇａｇ抗体）分析のために、血液サンプルを、処理前、１５日目、４３日目および７１日目の投与前、ならびに８７日目および９９日目にさらに採取した。各剖検の際、完全な肉眼検査および選択した組織の顕微鏡的評価（表１２参照）を行った。選択した器官（表１３）に関する器官の重量のデータをまた収集した。さらに、ＰＣＲ分析による上記ＤＮＡワクチンの宿主組織中への分布の可能な評価（表１４）のために、選択した組織を収集した。
【０１６３】
（表１２ 組織病理学組織一覧表）
【０１６４】
【表１２】
（表１３ 器官重量一覧表）
【０１６５】
【表１３】
（表１４ 潜在的ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１６６】
【表１４】
（８４日目までの）予備的データは、上記試験物質の投与に関連し得る死はなく、臨床的徴候、体重、食物消費および体温に対する処理関連の副作用はないということを示した。注射部位の皮膚評点付けは、コントロール群および処理群の両方からの、少数の動物における浮腫または紅斑が時折生じる事例を示した。これらの皮膚刺激反応の発生率は、（ＨＩＶワクチン処理した）群２の動物においてわずかに高かったが、上記所見は重篤度が軽かった（非常にわずか〜わずか）。そして上記所見は、次の観察期間までに完全に消散した。臨床病理学に関する（５７日目までの）入手可能な予備データは、血液学、凝固または臨床化学パラメーターに対する処理関連の影響はないということを示した。
【０１６７】
結論として、本研究の条件下でしかも入手可能な予備データに基づき、上記ＨＩＶワクチン処方物の投与に関連する全身的な効果は、何も同定されなかった。局部的効果は、非常にわずかからわずかの紅斑または浮腫の予備例から成り、それは次の観察期間までに完全に消散したようだった。隔週与える上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンの４回の筋肉内（ＩＭ）注射、次いでまた隔週与える上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの４回の筋肉内（ＩＭ）注射は、ニュージーランドシロウサギにより十分に寛容された。
【０１６８】
（Ｄ．雄のニュージーランドシロウサギにおける、予備的ＤＮＡ／ＰＬＧ局部刺激寛容研究−筋肉内単回用量）
単回筋肉内（ＩＭ）注射により投与した場合の、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧの潜在的局部刺激効果を、雄のニュージーランドシロウサギにおいて評価するため、以下の研究を２群の雄のウサギ９匹をそれぞれ用いて行った。１日目に、各々のウサギに、上記試験物およびコントロール物質の０．５ｍＬの筋肉内（ＩＭ）注射を与えた。１群あたり３羽のウサギを投与の１日後（２日目）、投与の１週間後（８日目）、または投与の２週間後（１５日目）に剖検した。実験設計を、表１５に示す。
【０１６９】
潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、総合的肉眼検査、および注射部位の顕微鏡評価に基づいて評価した。
【０１７０】
（表１５ 実験設計）
【０１７１】
【表１５】
ａ注射容積＝０．５ｍＬ
ＤＦ＝開発処方物
ＲＦ＝研究処方物
死亡は一つもなく、また体重に対するいかなる処理関連の影響もなかった。注射部位の明確な挫傷を、１日目から４日目の間に、群１のウサギ９匹中４匹および群２のウサギ９匹中５匹においてそれぞれ散発的に観察した。損傷は、注射部位番号２を除くすべての注射部位において注目された。注射部位におけるわずかの損傷のこの所見は、筋肉内（ＩＭ）注射に一致している。注射部位における皮膚のＤｒａｉｚｅ評点付けの結果を、表１６に提示する。１３日目から１５日目にかけて、群１の２羽のウサギ（ＩＭ部位３および４）に、そして１３日目から１４日目にかけて群２の１羽のウサギ（ＩＭ部位４）に、非常にわずかな浮腫があるのが注目された。剖検肉眼的所見を、注射部位に限定した。剖検肉眼所見は、赤く堅い領域、黄褐色領域、筋肉を覆う筋膜での出血、皮下出血領域からなった。これらの所見は、２日目の方がより有勢であった。注射部位の組織病理学的検査は、生理食塩水処理部位において針外傷に対する特徴的応答（筋線維変性および出血）を示した。試験物質処理部位の評価は、２日目に、全ての処方物に関して同様の、最小限の処理関連の炎症〜軽度の処理関連の炎症を示した。８日目に、肉芽腫性変化は、顕著な所見であり、処方物の間に違いはなかった。これらの肉芽腫性変化は、ＰＬＧ微粒子に対する公知の応答および／または再生プロセスと一致している。１５日目までに、上記組織病理的変化は、部分的［１％ＤＮＡ＋１００ｍｇＰＬＧ（開発（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）処方物および研究（ｒｅｓｅａｒｃｈ）処方物），２％ＤＮＡ＋５０ｍｇＰＬＧ，４％ＤＮＡ＋２５ｍｇＰＬＧ］にまたは完全［１００ｍｇ ＰＬＧ／ＰＶＡ］に消散した。また、表１６を参照のこと。
【０１７２】
（表１６ 皮膚刺激の結果）
【０１７３】
【表１６】
ＤＦ＝開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）処方物
ＲＦ＝研究（Ｒｅｓｅａｒｃｈ）処方物。
【０１７４】
結論として、単回筋肉内（ＩＭ）注射として雄ニュージーランドシロウサギに投与した場合、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧは、十分に寛容された。注射部位所見は、２日目に最も頻繁で最も強く（軽度〜最小限）、そして注射部位の所見は、回復期間の終期までに部分的にまたは完全に消散した。
【０１７５】
（Ｅ．ＰＣＲ注射部位評価を用いた複数（２）用量マウス免疫原性研究）
Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ処方物の筋肉内（ＩＭ）注射部位での免疫原性および持続性を評価するため、１群あたり１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表１７で概説するように処理した。０日目および２８日目に動物に投与し、筋肉内（ＩＭ）注射部位を最終投与後４週目および８週目に取得した。本研究で試験した上記処方物は、上記毒性研究で用いた処方物と類似していた。
【０１７６】
（表１７ 実験設計）
【０１７７】
【表１７】
ａ筋肉内（ＩＭ）注射により、０日目および２８日目に投与した。
ｂ投与の４週間後
ｃ投与の８週間後
注射部位の上記ＰＣＲ分析の結果を、表１８に提示する。結果は、上記ＤＮＡ−ＰＬＧ処方物は、持続性という点で上記裸のＤＮＡのコントロールに匹敵するということを示した。上記Ｇａｇ−ＤＮＡは、最終投与後の４週間および８週間で、注射部位でまだ検出可能であるが、その残存する量は、不十分（上記注射されたＤＮＡの約１０−７％）であるということを示した。
【０１７８】
（表１８ 注射部位のＰＣＲ分析）
【０１７９】
【表１８】
ａ最終投与の４週間後
ｂ最終投与の８週間後
ｃ時間０での平均ＤＮＡコピー数を、コピー数／注射したＤＮＡのμｇに基づいて推定した。
【０１８０】
（結論）
これらの研究の条件下で、上記ＨＩＶワクチン処方物の単回投与および／または複数回投与は、動物モデル（ニュージーランドシロウサギおよびＢＡＬＢ／ｃマウス）において十分に寛容され、そしてさらに、上記処方物は、強力な免疫応答を惹起した。上記複数回用量ウサギ研究では、上記ＨＩＶワクチン処方物は、臨床的知見、体重、体温、食物消費、ならびに臨床病理学（血液学、凝固および臨床化学）に対して、処理関連の副作用を全く生じなかった。注射部位の皮膚評点付けは、非常にわずか〜わずかの紅斑または浮腫が時折生じる事例を示した。そしてその事例は、可逆的であるようだった。上記注射部位でのこれらの所見は、単回用量局所寛容ウサギ研究において観察される所見と一致している。後者において、組織病理学的評価は、上記注射部位において、処理に関連する最小限〜軽度の炎症を示し、上記回復期間の終期までに部分的にまたは完全に消散した。さらなる研究では、上記注射部位のＰＣＲ分析は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧは上記宿主ゲノムＤＮＡに組み込まないということ、および上記Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧは４週間後にも８週間後にも上記注射部位で持続しないということを示した。
【０１８１】
上記複数回用量ウサギ研究では、上記計画臨床用量（１ｍＬ ＨＩＶ ＤＮＡワクチン／用量、０．５ｍＬ ＨＩＶタンパク質ワクチン／用量）を、臨床的投与経路（ＩＭ）により動物に与えた。しかし、ウサギに、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンおよび上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの各々の４用量を与えた。これは、上記意図される臨床的レジメン（各々３用量）より１用量だけ多かった。さらに、体重をもとにすると、ウサギ（約２．５Ｋｇ）での上記用量は、ヒト（約６０Ｋｇ）における同じ量より約２４倍高かった。それゆえ、上記臨床用量の投与および正常ヒト被験体に対するレジメンは、十分に寛容されることが予想される。
【０１８２】
さらに、Ｇａｇ抗体およびＥｎｖ抗体の高い力価を観測したので、上記処方物は免疫原性であることが示された。
【０１８３】
（実施例５：組換えタンパク質で初回刺激−追加刺激するレジメンを用いた、アカゲザルマカクにおけるプラスミドＤＮＡ／ＰＬＧ微粒子ＨＩＶワクチンの増大した効力）
以下の研究を実行し、免疫原性に対するＰＬＧ媒介性送達の効果を決定した。
【０１８４】
（Ａ．ベクター、タンパク質、ＰＬＧの調製）
本明細書に記載されるＨＩＶワクチンを、赤毛ザルマカクにおいて次のように評価した。プラスミドｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２およびプラスミドｐＣＭＶＫｍ２．ｏ−ｇｐ１４０．ＳＦ１６２を、本質的には米国特許第６，６０２，７０５号に記載のように調製した。ｇａｇ挿入部分およびｅｎｖ挿入部分をｐＣＭＶＫｍ２構築物から切除し、ｐＳＩＮＣＰ（ｐＳＩＮ１．５の改変版であって、本質的にはＨａｒｉｈａｒａｎら（１９９８）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（２）：９５０−８に記載されている）に連結することにより、シンドビス構築物を調製した。
【０１８５】
組換えＥｎｖタンパク質ｏ−ｇｐ１４０ＳＦ１６２ΔＶ２を、本質的にはＳｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９に記載のように、ＣＨＯ細胞において産生し、精製した。
【０１８６】
カチオン性ＰＬＧ微粒子を、以下のように調製した。上記微粒子を、ＩＫＡホモジェナイザーを高速で用いて、１０ｍｌの５％ｗ／ｖのポリマー溶液を１ｍｌのＰＢＳと一緒に塩化メチレン中で乳化した。その後、その最初のエマルジョンを、ＣＴＡＢ（０．５％ ｗ／ｖ）を含む５０ｍｌの蒸留水に加えた。これにより、水中油中水エマルジョンの形成が生じ、これを、室温で１２時間６０００ｒｐｍで攪拌される、塩化メチレンを気化させた。生じた微粒子を、１０，０００ｇでの遠心分離により蒸留水中で４回洗浄し、凍結乾燥した。上記ＤＮＡを、１ｍｇのＤＮＡを１ｍｌの１Ｘ ＴＥ緩衝液に１００ｍｇの微粒子と一緒に、穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートすることにより、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子に吸着させた。その後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、上記微粒子をペレットにし、１Ｘ ＴＥ緩衝液で洗浄し、再度遠心分離し、そして５ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして凍結乾燥した。微粒子のサイズ分布を、粒子径分析器（Ｍａｓｔｅｒ ｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて決定した。
【０１８７】
ＤＮＡ構築物を、上記のようにＰＬＧ粒子上に吸着させた。同様に、ＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質を、以下のようにアニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着させた。１０ｍｌの６％ ｗ／ｖポリマー溶液を、ＳＤＳ（１％ ｗ／ｖ）を含む４０ｍｌの蒸留水と一緒に塩化メチレン中で、１０ｍｍのプローブを使って高速でホモジェナイズすることにより、微粒子を調製した。これにより、水中油エマルジョンが生じ、そのエマルジョンを室温で１２時間１，０００ｒｐｍで攪拌し、上記塩化メチレンを気化させた。その生じた微粒子を、３８μｍのメッシュを通して濾過し、３回蒸留水で洗浄し、そして凍結乾燥した。上記微粒子のサイズの分布を粒子径分析器（Ｍａｓｔｅｒ ｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて決定した。
【０１８８】
５０ｍｇの凍結乾燥したＳＤＳブランク微粒子を、０．５ｍｇのｐ５５ ｇａｇタンパク質と一緒に、ｐＨ９の６Ｍ尿素を含む２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液１０ｍｌ中でインキュベートした。５０ｍｇの凍結乾燥したＤＳＳブランク微粒子を、０．５ｍｇのｇｐ１２０タンパク質とともに１０ｍＬのＰＢＳ中でインキュベートした。粒子を、室温で５時間、研究室の振盪機（Ａｌｉｑｕｏｔ ｍｉｘｅｒ，Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に放置した。上記微粒子を、遠心分離によりインキュベーション媒体から分離し、上記ＳＤＳペレットを一回、６Ｍの尿素を含むホウ酸塩緩衝液で洗浄し、その後、蒸留水で３回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０１８９】
微粒子に吸着するタンパク質の負荷レベルを、１０ｍｇの上記微粒子を５％ ＳＤＳ−０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液２ｍｌ中に室温で溶解することにより決定した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により測定した。ブランク微粒子および吸着微粒子の両方についてのゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ分析器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。
【０１９０】
（Ｂ．ワクチン接種）
アカゲザル免疫化研究を行って、組換えタンパク質を用いた初回刺激−追加刺激レジメンにおける、２つのＤＮＡワクチンベクターおよびカチオン性ＰＬＧ微粒子ＤＮＡ送達系を評価した。５匹のアカゲザルマカクの群を、筋肉内注射により免疫化した。ＰＬＧ微粒子に吸着しているか吸着していない、ＨＩＶ ＳＦ２ Ｇａｇ（０．５ｍｇ）およびＨＩＶ ＳＦ１６２ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（１．０ｍｇ）をコードするＤＮＡワクチンで、０週目、４週目、１４週目に注射した。上記動物を、２９週目に、アニオン性ＰＬＧ微粒子上に吸着した酵母由来のｐ５５ Ｇａｇタンパク質（Ｇａｇ／ＰＬＧ）で追加刺激した。最後に、上記動物を、３８週目および７５週目に、水中油ＭＦ５９アジュバントと共に投与した、ＣＨＯ細胞由来のＶ２領域欠失オリゴマーｇｐ１４０Ｅｎｖタンパク質（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）を用いて追加刺激した。
【０１９１】
上記ワクチン組成物の免疫原性を、抗体（ＥＬＩＳＡ，中和）の定量測定および定性測定ならびにＴ細胞の応答（リンパ球増殖，細胞内サイトカイン染色，ＣＴＬ）により、各々の免疫化後の様々な時点で評価した。
【０１９２】
（Ｃ．抗体アッセイ）
Ｅｎｖタンパク質およびＧａｇタンパク質に対する抗体応答を、酵素結合免疫反応吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。両方のＥＬＩＳＡに関し、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中５μｇ／ｍｌのＥｎｖタンパク質５０μｌまたはＰＢＳ（ｐＨ７．０）中５μｇ／ｍｌのＧａｇタンパク質５０μｌで、一晩４℃で被覆した。上記被覆ウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１５０μｌで、３７℃にて１時間ブロッキングした。血清のサンプルをまず、ブロッキング緩衝液中に１：２５または１：１００で希釈し、次いで３倍ずつの段階希釈を行った。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗サルＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈した）を用いて検出し、３７℃で１時間インキュベートした。発色のため、３，３’，５，５’テトラメチルベンズジジン（ＴＭＢ）を、製造者の指示に従って１５分間インキュベートし、そしてその反応を、２ＮのＨＣｌを加えることにより停止させた。その後、上記アッセイプレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４５０ｎｍの吸収波長にて読み取った。血清標準を、各々のマイクロタイタープレート上に含んだ。上記標準の参照値を、上記サンプルＥＬＩＳＡ力価の正規化のために用いた。上記力価は、上記血清希釈の逆数を表し、光学密度０．５を与える。ウイルス中和抗体を、標準的技術を用いて、同族のＨＩＶ−１ ＳＦ１６２ウイルスに対して評価した。
【０１９３】
（Ｄ．アカゲザルＰＢＭＣの精製およびＢリンパ芽球様様細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）の誘導）
アカゲザルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ハイパーク勾配にヘパリン化した全血から分離した。アカゲザルＢリンパ芽球様細胞株を誘導するために、ＰＭＢＣを、０．５μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、上記５９４Ｓ細胞株からヘルペスウイルスのパピオ含有培養上清に曝露した。アカゲザルＰＢＭＣを、２４ウェルプレート中の、１０％の熱非働体化ウシ胎仔血清（ＡＲ１０）を補充したＡＩＭ−Ｖ：ＲＰＭＩ１６４０（５０：５０）培養培地（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌ中で、１ウェル当たり２×１０６〜３×１０６個の細胞にて８日間、培養した。抗原特異的細胞を、ｇａｇペプチドまたはｅｎｖペプチド（１０．７μｇ／ｍｌの総ペプチド）のいずれかのプールの添加により刺激した。組換えヒトＩＬ−７（１５ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、培養の開始時に添加した。ヒトｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，２０ ＩＵ／ｍｌ，Ｃｈｉｒｏｎ）を、１日目、３日目および６日目に添加した。
【０１９４】
（Ｅ．ＣＴＬ活性に関する５１Ｃｒ放出アッセイ）
自己のＢ−ＬＣＬを、ｇａｇ（ｒＶＶ ｇａｇ−ｐｏｌＳＦ２）またはｅｎｖ（ｒＶＶ ｇｐ１６０ ｅｎｖＳＦ１６２）を発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）を用いて感染させ、その後、一晩Ｎａ２［５１Ｃｒ］Ｏ４（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；２．５×１０５のＢ−ＬＣＬあたり１０μＣｉ）で標識し、そして洗浄した。組換えＶＶ（組換えワクチニアウイルス）に感染した５１Ｃｒ標識Ｂ−ＬＣＬ（１丸底ウェル当たり２５００個）を、培養ＰＢＭＣの３回の段階希釈を含む複製ウェルに添加した。非標識Ｂ−ＬＣＬ（１ウェル当たり１×１０５個）を、非特異的細胞溶解を防止するために添加した。４時間後、５０μｌの培養の上清を取得し、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）に添加し、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて計測した。溶解した標的から放出された５１Ｃｒを、以下の式：
（特異的５１Ｃｒ放出パーセント）＝１００％×（平均実験放出−自然発生放出）／（最大放出−自然発生放出）
で正規化した。ここで、
自然発生放出＝ＰＢＭＣの不在下で標的細胞から放出された毎分平均カウント（ｃｐｍ）であり、そして
最大放出＝０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在下で標的細胞から放出された平均ｃｐｍ
である。ＰＢＭＣの二回の段階希釈（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）の際、正味の特異的溶解（抗原特異的溶解−非特異的溶解）が１０％以上の場合、応答を陽性として評点付けた。
【０１９５】
（Ｆ．リンパ球増殖アッセイ）
ｐ５５ Ｇａｇタンパク質（３μｇ／ｍｌ）またはＥｎｖペプチド（１６μｇ／ｍｌ）のプールの不在下または存在下で、２×１０５個のＰＢＭＣを、平底マイクロタイターウェル中で、０．２ｍｌの容積のＡＲ１０中でインキュベートした。 ６つのレプリカ培養を確率した。４日間のインキュベーションの後、［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えた（１μＣｉ／ウェル）。一晩のインキュベーションに続き、培養物をガラス微小繊維フィルタ上に得た。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、細胞の［３Ｈ］ＴｄＲ取り込みを測定した。
【０１９６】
（Ｇ．細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）
抗原ｇａｇペプチドプール３０μｇ／ｍｌまたはｅｎｖペプチドプール３０μｇ／ｍｌ）の不在下または存在下で、アカゲザルＰＢＭＣを３７℃にて１晩培養した。抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を同時刺激の供給源として添加し、ブレフェルジンＡ（１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、サイトカインの分泌を防止するために加えた。１晩のインキュベーションの後、ＰＢＭＣを、細胞表面のＣＤ４（抗ＣＤ４アロフィコシアニン結合体、クローンＳＫ３、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＣＤ８（抗ＣＤ８α ＰｅｒＣＰ結合体、クローンＳＫ１、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）について染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて透過性処理し、そしてその後、細胞内ＩＦＮ−γ（モノクローナル抗体４Ｓ．Ｂ３、フィコエリトリン結合体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および細胞内ＴＮＦ−α（ＭＡｂ１１、ＦＩＴＣ結合体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）について染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）を用いて分析した。
【０１９７】
（Ｈ．ＤＮＡワクチンベクターの比較）
ＰＬＧを伴わないＤＮＡベクターの免疫原性を評価した。抗Ｇａｇ抗体について、最初の免疫原性レジメンとして生理食塩水中にて加えた場合、（ｐＣＭＶもｐＳＩＮＣＰも）いずれのベクターも有効ではなかった。しかし、Ｇａｇ／ＰＬＧタンパク質抗原を用いて、裸のｇａｇ ＤＮＡで初回刺激した動物の追加刺激は、著しい抗体応答を迅速に惹起した。同様に、Ｅｎｖ／ＭＦ５９タンパク質は、抗Ｅｎｖ抗体の量を迅速にブーストした。いかなる時にも、ｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰにより誘導される抗体の力価に有意差はなかった。
【０１９８】
ヘルパーＴ細胞の応答を、リンパ球増殖（ＬＰＡ）および細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）の両方により測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、組換えｐ５５ ｇａｇタンパク質で刺激するか、または合成ｅｎｖペプチドのプールで刺激した。抗体応答と同様に、上記裸のｐＣＭＶ ＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡワクチンは、ＬＰＡ応答もＩＣＳ応答も誘導するのにそれほど有効ではなかった。しかし、Ｇａｇ ＬＰＡ応答に関して、ｐＳＩＮＣＰは、一般的に、より効力があるようだった。上記ｐＳＩＮＣＰ群とｐＣＭＶ群との間の統計的有意性は、２０週目および２７週目（それぞれ、ｐ＝０．０１８，０．０２３）に達せられた。
【０１９９】
同様に、ｐＳＩＮＣＰは、Ｅｎｖ ＬＰＡ応答を惹起するのに、より効果的であるようだった。群間で有意に高いＬＰＡ応答を、２０週目、２４週目および２７週目のＤＮＡ初回刺激の間（それぞれｐ＝０．０２８，０．０２２および０．０４４）ならびに４４週目の上記Ｅｎｖタンパク質の追加刺激の後（ｐ＝０．０１６）に観察した。
【０２００】
さらにＴ細胞応答を定量するために、ＰＢＭＣを抗原で１晩刺激し、そしてその後、上記ＰＢＭＣを、ＰＥ結合体化抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合体化抗ＴＮＦ−α ｍＡｂ（細胞内）で染色した。ＰＢＭＣをＡＰＣ結合体化抗ＣＤ４およびＰｅｒＣＰ結合体化抗ＣＤ８で対比染色し、サイトカイン陽性細胞、特に最も有勢な抗原提示細胞であったＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α二重陽性細胞について、フローサイトメトリーで分析した。ｐＳＩＮＣＰを受ける動物群とｐＣＭＶを受ける動物群との間で、抗原特異的Ｔ細胞の頻度の有意差は見られなかった。
【０２０１】
ＣＴＬの測定のために、ｇａｇペプチドのプールまたはｅｎｖペプチドのプール、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で、ＰＢＭＣを培養した。８日目に、ＰＢＭＣ培養を取得し、段階希釈し、そしてｇａｇ（ｒＶＶ ｇａｇｐｏｌＳＦ２）またはｅｎｖ（ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖＳＦ１６２）を発現する組換えワクチニアベクターを用いて前日に感染させた５１Ｃｒ標識自己Ｂ−ＬＣＬを含むマイクロタイターウェルに添加した。ｐＣＭＶは、Ｇａｇ ＣＴＬ応答を惹起する点で、ｐＳＩＮＣＰより有効であるようで、上記研究の過程の間ずっと、非常に沢山の応答を伴った。
【０２０２】
要約すれば、ｐＣＭＶの裸のＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰの裸のＤＮＡワクチンの両方は、ＨＩＶ ＧａｇおよびＨＩＶ Ｅｎｖに対して抗体応答およびＴ細胞応答を誘導した。
【０２０３】
（Ｉ．ＤＮＡワクチンのＰＬＧ微粒子送達）
動物をまた、ＤＮＡ／ＰＬＧ組成物を用いて上記のように免疫化し、ＰＬＧ微粒子に吸着したＤＮＡワクチンの免疫原性を評価した。上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンのカチオン性ＰＬＧ微粒子上への吸着は、（特に抗体応答に関する）免疫応答を増強するのに有効であった。ＰＬＧ送達は、ｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰのいずれかを受けるマカクにおける抗体力価を、有意に増加した。ＤＮＡ初回刺激フェーズの間ずっと、ＰＬＧ群の抗ｇａｇ力価は、測定した全ての時点において、裸のＤＮＡに比べて有意に高く（ｐ＝０．０００３〜０．０４）、力価のピーク値は約１０００倍高かった（図１）。タンパク質追加刺激の後、これらの差は維持され、ｐＣＭＶ／ＰＬＧおよびｐＳＩＮＣＰ／ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較して、約１０倍〜２５倍高かった（ｐ＝０．０２〜０．０４）。抗Ｅｎｖ抗体の応答はまた、上記ＰＬＧ群において有意に高かったが、ＤＮＡ初回刺激後（第２のＤＮＡの投与の２週から６週後）のピークの応答においてのみであった（Ｐ＝０．００３〜０．０１５）。タンパク質追加刺激の後およびタンパク質追加刺激の間、上記抗ｅｎｖ力価は、全ての群において類似していた。上記ＰＬＧ／ＤＮＡワクチン群については、抗体応答のピークを、２回目のＤＮＡ免疫化の後に取得したが、一方、裸のＤＮＡによる応答のピークには、３回の免疫化が必要だった。
【０２０４】
上記ＰＬＧ／ＤＮＡワクチンは、ＬＰＡおよびＩＣＳにより測定した場合、ＧａｇおよびＥｎｖに対するヘルパーＴ細胞応答を誘導した。裸のＤＮＡ群およびＰＬＧ／ＤＮＡ群における応答の規模は一般的に同様であったが、まとめられた場合（ｐＣＭＶ＋ｐＳＩＮＣＰ）、ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較して、Ｇａｇについては６週間目に、そしてＥｎｖについては１６週間目に、有意に高い応答を起こした（ｐ＝０．０５）。ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカイン産生の頻度は、ＩＣＳにより測定した場合、第２のＤＮＡの投与の二週間後に、裸のＤＮＡと比較して、上記Ｇａｇ／ＰＬＧ群（ｐＣＭＶ＋ｐＳＩＮＣＰ群の結合体）においては応答の強化を示した（ｐ＜０．０５）。上記Ｅｎｖ ＤＮＡワクチンに関しては、違いが全く観察されなかった。ＣＤ８ Ｔ細胞応答を、ＩＣＳおよび５１Ｃｒ放出により測定した。ＩＣＳによって、その応答は一般的に低く、群間に違いは見られなかった。培養ＰＢＭＣの５１Ｃｒ放出により、良好なＣＴＬ応答がＧａｇに対して検出されたが、Ｅｎｖに対しては検出されなかった。本研究の過程にわたるＧａｇ ＣＴＬ応答の総数は、ＰＬＧ群においては２４、そして裸のＤＮＡ群においては１８であり、上記ｐＣＭＶ／ＰＬＧ群における抗Ｇａｇ−ＣＴＬの明らかに早期の開始を伴った（５匹の動物のうち、３匹の動物が最初のＤＮＡの二週間後）。
【０２０５】
結論として、ＨＩＶ ＤＮＡワクチンのＰＬＧ送達は、抗体免疫応答および細胞性免疫応答を誘導するのに有効であった。さらに、ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較すると免疫応答を有意に強化した。抗体応答の特に強力な強化が、上記ｐＣＭＶ ＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡワクチンの両方に関して観察された。Ｇａｇに関しては、本研究の上記ＤＮＡ初回刺激フェーズおよびタンパク質追加刺激フェーズの両方の間に、これが当てはまる。応答の早期の開始、応答の規模の増大、および応答の頻度の増加により見られるように、いくつかの場合では、細胞性免疫応答はまた、ＤＮＡ初回刺激の間にＰＬＧにより強化される。
【０２０６】
（Ｊ．タンパク質追加刺激）
上記動物を、２９週目にアニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着した組換えＧａｇタンパク質を用い、その後３８週目および７５週目にＭＦ５９アジュバント中の組換えＥｎｖを用いて、追加刺激した（それぞれ最終ＤＮＡ免疫化の１５週間後、２４週間後、５１週間後）。抗体の力価が全ての群において増加した（図１、図２）。ｇａｇタンパク質を用いて追加刺激した後、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ−ＤＮＡで初回刺激された動物における上記抗ｇａｇ抗体の力価は、裸のＤＮＡで初回刺激された動物より約１０倍高かった。上記抗ｇａｇ力価は、ＤＮＡ初回刺激により達成されるピークの力価に等しい（ＤＮＡ／ＰＬＧ）か、またはＤＮＡ初回刺激により達成されるピークの力価を超えていた（ＤＮＡ／生理食塩水）。Ｅｎｖに関しては、ＤＮＡ初回刺激の後、全ての群の力価が、ピークの力価を超えて著しく増加された（ｐ＝０．０００２〜０．０２）（図２）。第２のＥｎｖタンパク質追加刺激は、抗体の力価を、第１のＥｎｖタンパク質追加刺激の後に見られるレベルにまで回復した。ＤＮＡワクチン初回刺激の後、ウイルス中和抗体応答は、どの動物においても検出されなかった。しかし、１回および２回のタンパク質追加刺激免疫化の後、増加する力価が観察され、全幾何平均力価（それぞれ８または６４）（ｐ＝０．０００７１）であった。（図３）。これらの時点の両方において、上記力価は、種々のワクチン群の間で統計的に異なっていた。
【０２０７】
タンパク質免疫化の後、Ｔ細胞の応答もまた、増加されるようであった。Ｇａｇに関しては、タンパク質追加刺激の後、平均ＳＩが、基準線の４倍〜７倍に増加し、応答細胞の数が２０のうち、７から１４に増加した。しかし、上記応答の規模は、ＤＮＡ初回刺激の後のピーク時に見られる規模ほど大きくはなかった。
【０２０８】
Ｅｎｖタンパク質追加免疫化の後、平均ＳＩが、基準線を越えて１１倍〜２５倍増加し、そしてこれらの応答は、ＤＮＡ初回刺激の後測定した応答よりも大きかった。ＩＣＳにより、Ｇａｇタンパク質の追加刺激の後、観察された増加は、ほとんどまたは全くなかったが、各々のＥｎｖタンパク質の追加刺激の後、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌する細胞の比率の実質的増加が、見られた。さらに、第２のタンパク質追加刺激後の上記ＩＣＳ応答の全体規模は、第１のタンパク質追加刺激後のＩＣＳ応答の全体規模に比べて大きく（ｐ＝０．０００８）（図４）、何匹かの動物中では、応答がＣＤ４ Ｔ細胞の４％に接近していた。
【０２０９】
要約すれば、ＤＮＡ初回刺激したマカクを組換えＧａｇタンパク質および組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激すると、抗体応答およびＴ細胞応答の迅速かつ有意な強化を生じた。いくつかの場合、これらの応答の規模は、ＤＮＡ初回刺激後に得られる応答の規模よりも著しく大きかった。
【０２１０】
従って、本明細書に記載のＤＮＡ／ＰＬＧワクチンは、アカゲザルマカクにおいて強力な免疫応答を誘導し、特に抗体応答ならびにヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞に対する効力を強化した。ＤＮＡ／ＰＬＧで初回刺激されたマカクを、組換えタンパク質で追加刺激する有効性（Ｅｎｖタンパク質追加刺激後の、Ｔ細胞からのＴｈ−１型サイトカインの強力な産生を含む）は、また確立された。
【０２１１】
（実施例６：ヒト研究）
上記ＨＩＶワクチン試験（および他の成果）からのデータに基づけば、偽薬コントロールにおける深刻で有害な経験の割合は、約３．５％であった。他の組換え糖タンパク質抗原をＭＦ５９と一緒に使用した広範な安全性データは、そのようなワクチン抗原は、ＭＦ５９と一緒に投与された場合、非常に安全で一般的に十分に寛容されるということを示す。さらに、これらのワクチンは、特定の抗原に対して、強力な抗体応答を惹起した。ＤＮＡ／ＰＬＧで初回刺激されたマカクを、組換えタンパク質で追加刺激する有効性（Ｅｎｖタンパク質追加刺激の後、Ｔ細胞からのＴｈ−１型サイトカインの強力な産生を含む）は、また証明された。
【０２１２】
ヒト研究のための例示的なプロトコールを、以下の表１９に示す。サブタイプＢに関して例示されているが、上記プロトコールはまた、ＨＩＶの他の株または他のサブタイプに関して、そのままでか、または改変されて使われ得ることが容易に明らかである。
【０２１３】
（表１９ ヒトプロトコール）
【０２１４】
【表１９】
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｇａｇ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図１Ａは、０週、４週、および１４週にプラスミドＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｇａｇ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）についての相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｇａｇ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図１Ｂは、０週、４週、および１４週にｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｇａｇ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）についての相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｅｎｖ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図２Ａは、０週、４週、および１４週にプラスミドＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｅｎｖ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）に対する相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｅｎｖ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図２Ｂは、０週、４週、および１４週にｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激された動物の、相乗平均力価を示す。抗Ｅｎｖ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）に対する相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図３】図３は、ＤＮＡ投与後の相乗平均中和力価を示すグラフである。
【図４】図４は、ＤＮＡワクチンによって初回刺激されたＴ細胞応答に対する、Ｅｎｖタンパク質追加刺激の効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、広く免疫原性のＨＩＶ組成物、特にＨＩＶワクチンならびにこれらワクチンの処方および投与の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医学が直面している最も大きな健康の脅威の１つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存在しない。
【０００３】
１９８３年〜１９８４年においては、３つのグループが、ＡＩＤＳの推測される病因学的な因子を別々に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，ＥｓｓｅｘおよびＧｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２。これらの単離物は、リンパ節腫脹症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と、さまざまに呼ばれた。これらの単離物の全てが、同じウイルスの株であり、そして後にまとめて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれた。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離物を用いて、最初にＨＩＶと呼ばれた株が、現在ＨＩＶ−１と呼ばれており、そして関連するウイルスが、ＨＩＶ−２と呼ばれている。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：６９１−６９５を参照のこと。
【０００４】
１９９６年、合衆国において高活性抗レトロウィルス治療（ＨＡＡＲＴ）の実行により、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と診断された人の数、およびＡＩＤＳで死亡した人の数は、実質的に下落し（Ｋａｒｏｎら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９１（７）：１０６０−１０６８）、その結果としてＡＩＤＳと共に生きる人（ｐｅｒｓｏｎｓ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ）の数は増加してきた。疾病管理センター（Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＤＣ）は、２０００年１２月３１日時点で、合衆国においておよそ３４０，０００の人がＡＩＤＳと共に生きていたと予測する（ＭＭＷＲ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｓｕｒｖｅｉｌｌｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ、１３（Ｎｏ．１）２００１）。
【０００５】
合衆国における臨床的な試みは、限定された被験体数に対して実施され、そしてさらなるＨＩＶワクチンの開発は、ＨＩＶの血清罹患が十分に高く、プラセボコントロールと、免疫性を与えられた集団における防護との区別が可能である、適切な集団の同定を必要とし得る（Ｓｅａｇｅ ＩＩＩら（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１５３（７）：６１９−６２７；Ｈａｌｐｅｒｎら（２００１）Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ ２７（３）：２８１−８）。
【０００６】
ＨＩＶの主な伝播様式は、性交渉を通じての伝播様式、および感染した体液（血液、精液、膣液、母乳および血液を含む他の体液）との接触によっての伝播様式である。先進国において、人々への危険性が知られている報告された事例の大部分は、男性と性交渉をもつ男性の事例である。ＨＩＶ抗体に対する血液スクリーニングが始められる以前は、輸血関連ＨＩＶは合衆国において懸案であった（ＣＤＣ．Ｕｐｄａｔｅ：ＨＩＶ−２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｏｎｏｒｓ−−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、１９９２年６月〜１９９５年６月、ＭＭＷＲ、１９９５ ４４：６０３−６０６頁）。他の伝播の様式には、注射薬物常用者による注射針の共有、病院勤務者における感染血液との不注意の接触、および汚染された医療機器の再利用を通じてのまれな医原性の伝播が挙げられる。より高い率の性的伝播感染は、危険な性交渉実践の増加の前兆である。Ｃｈｅｎら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９２（９）：１３８７−１３８８。異性間のＨＩＶ−１伝播は、特に女性、若者および経済的弱者の間で増加し続けており、そして現実に、異性間の伝播は発展途上の社会において優勢な伝播様式である。これらの傾向は、予防的ワクチンおよび／または治療に役立つワクチンの開発の必要性を強調する。Ｃａｔａｎｉａら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９１（６）：９０７−９１４。
【０００７】
ＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子産物およびＧａｇ遺伝子産物を含むワクチン開発のためのいくつかの標的が、試験されている。Ｇａｇ遺伝子産物としては、Ｇａｇポリメラーゼ（ｐｏｌ）およびＧａｇプロテアーゼ（ｐｒｏｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物としては、モノマーｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーｇｐ１４０ポリペプチド（ｏ−ｇｐ１４０）およびｇｐ１６０ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
最近、免疫原性の組成物中でのＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの使用が記載されている。（異なるＨＩＶ ｅｎｖ改変体をそれぞれ発現する少なくとも４つの異なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性の組成物を記載している、１９９８年１２月８日に発行されたＨｕｒｗｉｔｚらの米国特許第５，８４６，５４６号；および、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドを記載している、１９９８年１１月２４日に発行された、Ｖａｈｌｎｅらの米国特許第５，８４０，３１３号を参照のこと）。さらに、１９９９年３月２日に発行された、Ｓｉａらの米国特許第５，８７６，７３１号は、配列ＧＰＧＲを含有しているＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して直接連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含有しているＨＩＶに対する候補のワクチンを記載している。しかしながら、これらのグループは有効なＨＩＶワクチンを同定しなかった。
【０００９】
米国特許第６，６０２，７０５号および国際特許公報ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ／０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４は、様々なサブタイプ由来の免疫原性ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する。
【００１０】
従って、免疫原性ＨＩＶ組成物の、特にＨＩＶワクチン処方物の必要性が、なお存在している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
１つの側面において、本発明は少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇコード配列またはＥｎｖコード配列を含む核酸発現ベクター（例えば、プラスミド、ウィルス性ベクターなど）およびＰＬＧを含むＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物を包含する。好ましくは、この核酸発現ベクターが、ＰＬＧに吸収される。特定の実施形態において、ＰＬＧの濃度は、核酸発現ベクターの濃度より約５倍と１００倍の間で高い。例えば、核酸の濃度は、約１０μｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間であり得、そしてＰＬＧの濃度は約１００μｇ／ｍＬと１００ｍｇ／ｍＬの間であり得、そして／あるいは１用量あたりの核酸発現ベクターの濃度は約１μｇ／用量と５ｍｇ／用量の間であり得、そして１用量あたりのＰＬＧの濃度は、約１０μｇ／用量と１００ｍｇ／用量の間であり得る。特定の処方物は、本明細書中に、例えば表１、表２、または表９のカラム２において記載される。
【００１２】
別の側面において、本発明はＨＩＶエンベロープタンパク質（例えばオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０））；および薬学的に受容可能な賦形剤を含むＨＩＶワクチン組成物を包含する。特定の実施形態において、ｏ−ｇｐ１４０の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの間である。さらに、特定の実施形態において、このｏ−ｇｐ１４０の１用量あたりの濃度は、約１００μｇ／用量である。ＨＩＶタンパク質ワクチンの特定の処方物はまた、本明細書中に、例えば表３および表１１において記載される。
【００１３】
別の側面において、本発明は、１つ以上の本明細書に記載されるＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、本明細書に記載されるＨＩＶ Ｇａｇ ＤＮＡワクチンおよび本明細書に記載されるようなＨＩＶ Ｅｎｖ ＤＮＡワクチン）および１つ以上の本明細書に記載されるＨＩＶワクチン（例えば、ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０調製物）を含むＨＩＶワクチンを包含する。
【００１４】
本明細書に記載される任意のＨＩＶワクチン組成物は、さらに１つ以上のアジュバント（例えば、ＭＦ５９またはＣｐＧ）を含み得る。ＭＦ５０についての特定の処方物は、表４に記載される。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は被験体において免疫応答を起こさせる方法を包含し、この方法は、（ａ）被験体に、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、および（ｂ）工程（ａ）の投与の後で、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程を包含する。特定の実施形態において、工程（ａ）において投与される少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物は、本明細書に記載されるようなＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび／または少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチン）を含み、そして工程（ｂ）において投与されるＨＩＶワクチン組成物は、本明細書に記載されるＨＩＶタンパク質ワクチンを含む。さらに、工程（ａ）は、本明細書に記載される１つ以上のＨＩＶ ＤＮＡワクチンの複数回投与（例えば、１ヶ月間隔で２回または３回の投与）を包含し得、そして工程（ｂ）は、本明細書に記載される１つ以上のＨＩＶタンパク質ワクチンの、少なくとも１回の投与（１、２または３ヶ月間隔で２回または３回の投与）を包含し得る。あるいは、工程（ｂ）は、本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶ ＤＮＡワクチン（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび／またはＨＩＶ Ｅｎｖワクチン）および本明細書に記載される少なくとも１つのＨＩＶタンパク質ワクチンを同時投与する工程を包含し得る。工程（ａ）の投与と工程（ｂ）の投与との間の時間は変動し得、例えば１ヶ月と６ヶ月の間またはそれ以上である。本明細書に記載される任意の方法において、１回以上の投与は筋内および／または皮内であり得る。
【００１６】
さらなる側面において、本発明はオリゴマーＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０タンパク質を作製する方法を包含し、この方法は、ｇｐ１４０をコードする核酸を宿主細胞に導入する工程；ｇｐ１４０が細胞内において発現される条件下で宿主細胞を培養する工程；およびオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）タンパク質を宿主細胞から単離する工程を包含する。特定の実施形態において、このｏ−ｇｐ１４０は、この細胞から分泌され、そしてこの細胞上清から単離される。
【００１７】
なおさらなる側面において、本明細書に記載される任意のＨＩＶ ＤＮＡワクチンを作製する方法が提供される。この方法は、１つ以上のＨＩＶポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、無菌のＰＬＧ微粒子とを結合させる工程を包含し、その結果核酸発現ベクターがＰＬＧ微粒子に結合して、ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを形成する。特定の実施形態において、この方法は、さらにこのＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを凍結乾燥する工程を包含する。
【００１８】
別の側面において、本発明は本明細書に記載されるようなＨＩＶタンパク質ワクチンを作製する方法を包含し、この方法は、ｏ−ｇｐ１４０とアジュバントを結合させる工程を包含する。
【００１９】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示を照らして当業者に容易に見出されるであろう。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に特に示されない限りは、当業者の範囲内である、化学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬理学的な従来の方法を使用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと。
【００２１】
本明細書において引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、前出または後掲に関わらずその全体が参考として援用される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に特に明確に示されない限りは、複数形の対象物を含む。従って、例えば、「抗原」に関しては、２つ以上のこのような抗原の混合物を含む。
【００２３】
本発明を記載する前に、本明細書にこれ以降で使用される特定の用語の定義を最初に記載することは、それらの用語を理解する助けとなり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＨＩＶポリペプチド」は任意のＨＩＶ株またはサブタイプ由来の任意のＨＩＶペプチドをいい、これらとしては、Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ，ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはｖｐｕ；それらの機能的（例えば、免疫原性）フラグメント、それらの改変ポリペプチドおよびこれらのフラグメントおよび／または改変ポリペプチドの組み合せが挙げられるが、これに限定されない。さらに、本明細書中に定義される「ＨＩＶポリペプチド」は、公知のＨＩＶポリペプチドの正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。むしろＨＩＶゲノムは、絶えず流動的な状態であり、そして単体間に相対的に高い度合いの改変性を示すいくつかの領域を含む。本明細書中に明らかにされるように、ポリペプチドが免疫原性の特徴を有するということが重要である。この用語が任意の様々なＨＩＶ株およびサブタイプに由来するポリペプチドを包含することは、容易に明らかである。この用語はさらに、生成の方法に関わらず任意のこのようなＨＩＶタンパク質を包含する（例えば、組換え的に生成されたポリペプチド、および合成的に生成されたポリペプチドが挙げられる）。
【００２５】
さらに、用語「ＨＩＶポリペプチド」は、天然の配列に対するさらなる改変、例えばさらなる内部欠失、付加および置換（一般に天然に保存される）、を含むタンパク質を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように故意であってもよく、または天然に存在する変異事象によるように偶然であってもよい。これら改変の全ては、本発明が意図する目的のための改変ＨＩＶポリペプチド機能である限りは、本発明において包含される。従って、例えばワクチン組成物において、改変は免疫学的な活性が失われないものであるべきである。同様に、ポリペプチドが診断的な目的のために使用される場合、このような能力は保持されなければならない。従って、この用語はまた、天然に存在するペプチドとは異なる、例えば１つ以上の欠失（例えば、Ｅｎｖから欠失した様々な領域）、置換および／または挿入を含むペプチドであるＨＩＶポリペプチドを含む。非保存的な変化は、一般には上記アミノ酸の１つと異なる群からのアミノ酸との置換（例えば、ＡｓｎをＧｌｕに置換すること）、あるいは上記アミノ酸いずれかをＣｙｓ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＰｒｏに置換することである。共通のアミノ酸を含む置換は、都合の良いことには所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発、次いで変更された形態の発現によって実施される。アミノ酸は、合成的または半合成的な方法によってもまた、変更され得る。例えば、システイン残基またはセリン残基は、単離したタンパク質の適切な化学的処理によってセレンシステインに転化され得る。あるいは、共通でないアミノ酸は、インビトロタンパク質合成方法において標準的に組み込まれ得る。代表的に、変異体において天然の配列に対し変更、欠失または付加された残基の総数は、約２０以下であり得、好ましくは約１０以下であり得、もっとも好ましくは約５以下である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合には、「合成」ポリヌクレオチド配列は、ＨＩＶをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｇａｇコード配列および／またはＥｎｖコード配列）をいい、その発現は、例えば阻害配列のコドンの置換および不活性化によって最適化されてきた。例えば、米国特許第６，６０２、７０５号および国際公報ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４の合成ＨＩＶをコードするポリヌクレオチドの例を参照のこと。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「野生型」配列または「天然の」配列は、それらが天然において見出される本質的なポリペプチドのコード配列をいう。例えば、Ｃ型の単離物（例えば、ボツワナ単離物、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８またはＡＦ１１０９７５、あるいはサウスアフリカン単離物）のような他の単離物において発見されたＧａｇコード配列および／またはＥｎｖコード配列。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、以下にさらに議論される任意のいくつかのウイルスに由来する、複製性ではないウイルスの殻をいう。ＶＬＰは、一般的には、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるこれらのタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドのような、１つ以上のウイルスタンパク質から構成されるが、これらに限定されない。ＶＬＰは、適切な発現系においてタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成し得る。粒子状のＶＬＰを産生するための方法は当該分野で公知であり、そして以下により完全に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当該分野で公知の従来技術（例えば、電子顕微鏡分析、Ｘ線結晶解析など）を使用して検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離され得、そして／または特徴的な密度のバンド形成によって同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡分析が、対象のＶＬＰ調製物のガラス化された水溶性のサンプル対して行われ得、そして適切な露出条件下で画像が記録され得る。
【００２９】
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」によって、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、または内部欠失を有するウイルスタンパク質が意味される。これらは、ＶＬＰ形成に好ましい条件下でＶＬＰを形成する能力を有する。従って、ポリペプチドは、全長の配列、フラグメント、短縮された配列および部分的な配列、ならびに参照分子のアナログおよび前駆体の形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を維持している限り、配列に対する欠失、付加，および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然のバリエーションを含む。なぜなら、コートタンパク質におけるバリエーションはしばしば、ウイルスの単体間で生じるからである。この用語はまた、タンパク質がＶＬＰを形成する能力を維持している限り、参照のタンパク質において天然には生じない欠失、付加、および置換を含む。好ましい置換は、天然に保存されている置換（すなわち、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、一般的に、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。
【００３０】
「抗原」とは、体液性および／または細胞性抗原特異的応答を生じる宿主免疫系を刺激する１つ以上のエピトープを含む分子（線状、配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）のいずれか、またはその両方）をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。代表的に、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４個の程度の少なさのアミノ酸であり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。代表的に、エピトープは、約７と１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、抗原が天然に関連している生物全体から分離され、そして別個である抗原）、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生体、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープ（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中で使用される場合、抗原の定義の下にとらえられる。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
【００３１】
本発明の目的のために、抗原は好ましくは任意のＨＩＶのサブタイプに由来する。抗原はまた、任意のいくつかの公知のウィルス、細菌、寄生体および真菌、または腫瘍抗原に由来され得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」はタンパク質が本明細書中に定義される場合、免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、例えば、ネイティブな配列に対する欠失、付加および置換（一般に天然に保存される）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように故意であってもよく、または抗原を産生する宿主の変異によるように偶然であってもよい。
【００３２】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する抗原に対する被験体の体液性および／または細胞性免疫応答における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して存在し、そして細胞表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する機能を刺激し、そしてこの細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により産生される他のこのような分子の産生をいう。
【００３３】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近で指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的な保護を可能にするように生成され得る。
【００３４】
細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くのアッセイによって（例えば、リンホ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによって）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、Ｔ細胞集団による細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定を含む（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５、１９９７）により総説される）。
【００３５】
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。ＨＩＶ抗原もまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する保護を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００３６】
「免疫学的組成物」は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する被験体の体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じさせる抗原性分子を含む組物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜（例えば、直腸内または膣内）投与によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
【００３７】
「サブユニット」ワクチンとは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌、寄生体または真菌由来）の抗原に由来するか、またはそれに相同である、１以上の選択された抗原（しかし、全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原性細胞または病原性粒子、あるいはこのような細胞または粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそれらのアナログから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。
【００３８】
「実質的に精製される（た）」とは、一般に、基質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、存在するサンプルの主要な割合を含むように、基質を単離することをいう。代表的には、サンプル中に、実質的に精製された成分は、このサンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０％〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度に従う沈降が挙げられる。
【００３９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、インビボで転写される（ＤＮＡの場合）核酸分子、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによって、そして３’（カルボキシ）末端で翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。
【００４０】
代表的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止配列に対して３’に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に位置する）、および翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「核酸」分子には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえも挙げられ得るが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログを含む配列を捕捉する。
【００４２】
「作動可能に連結した」は、エレメントの整列をいい、ここで、そのように記載された成分は、それらの機能を行うように構成されている。従って、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。このプロモーターは、自身の発現を指向するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結」していると考えられ得る。
【００４３】
本明細書において核酸分子を記載するために使用される場合、「組換え」は、その起源または操作により、（１）天然に関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない；および／または（２）天然に関連している以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されたポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞部分として培養された原核生物微生物細胞株または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得る、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされている始原細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または起源の親に相補的なゲノムもしくは全ＤＮＡにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００４４】
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する適切な部位での２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。次いで、いわゆる「パーセント同一性」は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する（代表的に、ｃＤＮＡ中間体を介して）こと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。
【００４５】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸配列またはペプチド配列が一般に記載されているか否か）は、一般に、より短い配列の長さによって除算され、そして１００を積算された２つの整列された配列間の正確な整合の数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって規格化された、スコア付けマトリックスを使用して、ペプチド配列を用いる使用にまで拡張し得る。核酸配列およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、から入手可能）に記載される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。
【００４６】
例えば、特定のヌクレオチド配列の、参照配列に対するパーセント同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコア付け表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーとともに使用して決定され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって頒布されているＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権の帰属するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、スコア付表（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）について使用されるデフォルトパラメータが使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラム（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ（これはデフォルトパラメータでも使用され得る））は、一般に、当該分野で公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータでも使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非縮重、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４７】
当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを容易に決定し得る。例えば、検索パラメータは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の配列に由来するＹ個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有し；（ｉｉ）ＸとＹは等しく、かつ（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチドよりも大きいか、それに等しく、そして５０００ヌクレオチドまでであり、好ましくは、８ヌクレオチドより大きいか、またはそれに等しく、そして５０００ヌクレオチドまでであり、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチドであり、そして５０００ヌクレオチドまでであり、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０ヌクレオチドであり、本明細書に記載される全長配列（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照）に存在するヌクレオチドの数までであり、上記の範囲内の全ての整数値が含まれる。
【００４８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドには、本明細書に開示される配列に対して（例えば、本発明の特許請求された配列またはその他の配列）、本発明の配列が問い合わせ配列として使用された場合に、約８０％〜１００％の、８０〜８５％より大きい、好ましくは、９０〜９２％より大きい、より好ましくは、９５％より大きい、そして最も好ましくは、９８％より大きい配列同一性（これらの記載の範囲内に入る全ての整数値を含む）有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００４９】
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、「選択的にハイブリダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、など、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な結合事象の不在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性を欠損する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％よりも少ない配列同一性を有するプローブ）を使用することによって評価され得る。
【００５０】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、そのプローブおよび標的配列が、互いに、「選択的にハイブリダイズする」か、結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きな配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知なように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００５１】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多数の等価な条件が、例えば、以下のファクターを変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために利用され得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに種々の洗浄条件。特定の組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野での標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００５２】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、その相補物と、同一の塩基対配列を有するか、または実質的に同一の塩基対配列を有する場合、あるいは第１のポリヌクレオチドが上記のように配列同一性を示す場合、その第１のポリヌクレオチドは、その第２のポリヌクレオチドに「由来する」。
【００５３】
第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）上記のように第２のポリペプチドと配列同一性を示す場合、その第１のポリペプチドは、その第２のポリペプチドに「由来する」。
【００５４】
ウイルスポリペプチドが、（ｉ）そのウイルスのポリヌクレオチド（ウイルスポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、または（ｉｉ）上記のようにそのウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示す場合、一般に、そのウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（ウイルスポリペプチド）に「由来する」。
【００５５】
「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、ここで、ポリペプチド配列またはその部分は、核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。その配列によってコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同定され得るポリペプチド配列もまた、含まれる。
【００５６】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然に関連するタンパク質を実質的に含まない（例えば、約５０％未満を含む、好ましくは約７０％未満を含む、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野において周知であり、そして、例えば、カオトロピック剤を用いるポリヌクレオチドを含有する細胞の破壊、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離が挙げられる。
【００５７】
「核酸免疫」によって、インビボにおける抗原（単数および複数）あるいはエピトープ（単数および複数）の発現のために、宿主細胞中に１つ以上の選択した抗原をコードする核酸分子を導入することを意味する。核酸分子は、例えば、注入投与、吸入投与、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエント被験体中に直接的に導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り出された細胞中に導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、被験体中で、核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答を開始し得る。
【００５８】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞中に目的のＤＮＡを確実に挿入するための方法または系をいう。そのような方法は、非組み込み型移入ＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入された遺伝子物質の挿入を生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫のために使用される場合、そのような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。
【００５９】
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞媒介性攻撃の部分を構成する非抗体産生リンパ球である。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺（胸腺でＴリンパ球は、胸腺ホルモンの指令のもと、成熟化プロセスを受ける）に移動する未成熟のリンパ球から生じる。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分裂し、非常に大多数に増加する。成熟するＴ細胞は、特定の抗原を認識しそして結合するその能力に基づいて、免疫適格となる。免疫適格Ｔ細胞の活性化は、抗原がリンパ球表面レセプターに結合する場合に、誘発される。
【００６０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入される場合、その細胞は、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。そのような技術を使用して、適切な宿主細胞中に１つ以上の外来ＤＮＡ部分を導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方をいい、そしてペプチド結合ＤＮＡおよび抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
【００６１】
標的細胞への「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の移入は、代表的にの細胞に対して比較的非毒性の化合物または組成物に対して細胞を感受性にする。Ｍｏｏｌｔｅｎ、Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（５）：５６７−５７３）および細菌酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７１３−７２０）である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロドラッグであるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌シトシンデアミナーゼ）の効果に対して、感受性となる。Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１５５０−１５５２、Ｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８３０２−８３０６。
【００６２】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、治療的活性を有さないが、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、操作、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれる、遺伝子移入ベクター中に含まれるヌクレオチド配列をいう。
【００６３】
「特異的結合剤」とは、分子の特異的結合対のメンバーをいい、ここでこの分子の１つは、化学的および／または物理的手段を通じて、第２の分子に特異的に結合する。特異的結合剤の１つの例は、選択された抗原に対する抗体である。
【００６４】
「被験体」とは、限定ではなく、ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の尾なしザル種およびサル種を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのようなペット；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験室動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどのようなペット、野生のトリおよび競技用のトリを含むトリ、を含む脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成熟個体および新生個体の両方を含むことが意味される。これら全ての脊椎動物の免疫系は、同様に作動するので、上記の系は、上記の任意の脊椎動物種における使用が意図される。
【００６５】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的ではなく、またそれ以外においても望まれないことのない物質、すなわち、望まれない生物学的効果を全く生じることもなく、その物質が含まれる組成物のいずれの成分とも有害な様式において相互作用することもなく、処方物または組成物中で個体に投与され得る物質を意味する。
【００６６】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ８．０を含む）、より典型的には約７．２〜７．６の範囲内のｐＨ（ｐＨ７．２およびｐＨ７．６を含む）を、意味する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または排除、および／または（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的（感染前）であっても、治療的（感染後）であってもよい。
【００６８】
「核酸発現ベクター」とは、目的の配列または目的の遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または目的の遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含み得る。他の制御エレメントもまた、存在し得る。核酸発現ベクターとしては、プラスミド、ウィルス性ベクター、アルファウィルスベクター（例えば、シンドビス）、真核細胞層状ベクター開始系（例えば、米国特許第６，３４２，３７２号参照のこと）、レトロウィルス性ベクター、アデノウィルス性ベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。種々の核酸ベクターの説明については、米国特許第６，６０２，７０５号もまた参照のこと。発現カセットは、核酸発現ベクター内に含まれ得る。このベクターはまた、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、構築物を１本鎖ＤＮＡとして生成させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、多重クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００６９】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウィルスベクターにおいてでは欠失しているが、感染性組換えレトロウィルスの産生に必須なエレメントを含む細胞をいう。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、Ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る１つ以上の発現カセットを含む。
【００７０】
「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウィルスベクター粒子の産生のために必須なエレメントの全てを含む細胞をいう。
【００７１】
さらに、以下は本明細書で使用される略語の部分的なリストである：
μｇ マイクログラム
ＡＩＤＳ 後天性免疫不全症候群
ＡＰＣ 抗原呈示細胞
ＣＣＲ５ ケモカインレセプター５
ＣＤ４＋ ＣＤ４レセプター
ＣＤ８＋ ＣＤ８レセプター
ＣＤＣ 疾病管理センター
ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＣＭＶ サイトメガロウィルス
ＣｏｎＡ コンカナバリンＡ
ＣＲＦ 事例様式
ＣＲＦ’ｓ 循環組換え様式
ＣＴＡＢ セチルトリメチルアンモニウムブロミド
ＣＴＬ 細胞障害性Ｔリンパ球
Ｃｖ クロミウム（ｃｒｏｍｉｕｍ）
ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチル
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＴＨ 遅延型過敏症
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＥＬＩＳＰＯＴ 酵素結合免疫スポット測定法
ＥＮＶ エンベロープ
ＦＩＧＥ 領域反転ゲル電気泳動
ＧＡＧ 群特異的抗原
ＧＬＰ 良好な実験実践
ｇｐ 糖タンパク質
ＨＡＡＲＴ 高活性抗レトロウィルス治療
ＨＡＰ ハイドロジアパティック（ｈｙｄｒｏｚｉａｐａｔｉｃ）
ＨＢｓＡｇ Ｂ型肝炎皮相抗原
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウィルス
ＨＩＶ／ＨＩＶ−１ ヒト免疫不全ウィルス／１型
ｈｒ 時間
ＨＳＶ 単純疱疹ウイルス
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＦＮγ インターフェロンγ
ＩＭ 筋内
ＩＮＤ 研究新薬
ＩＶ 静脈内
Ｋｂ キロベース
ｋＤ キロダルトン
Ｋｇ キログラム
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ＭＦ５９ 水中油型乳剤アジュバント
ＮａＣｌ 塩化ナトリウム
ＮＩＡＩＤ 国立アレルギーおよび感染症研究所
ＮＩＨ 国立衛生研究所
ｏ−またはＯ− オリゴマー
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＬＧ カチオンポリラクチド−コ−グリコリド
ｐＳＩＮ シンドビスウィルスベクター
ＰＶＡ ポリ（ビニルアルコール）
ＲＥＶ ウィルス性タンパク質−ウィルス性発現の制御に関する
ＳＡＥ 重篤な有害事象
ＳＨＩＶ シミアンヒト免疫不全ウィルス
ＳＰ ｒｅｓｉｎ 改変ポリエステル−カーボネート樹脂
（全体的な概観）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の処方物もプロセスのパラメーターも変動し得るので、特定の処方物にもプロセスのパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００７２】
本明細書中に記載された方法および材料と類似するかまたは等価な多数の方法および材料が、本発明の実施で用いられ得るが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載される。
【００７３】
本発明は、ＨＩＶに対する免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の開発のための方法および組成物に関する。例えば、本明細書に記載されるＨＩＶワクチンは、３つ以上の成分を含み得る。本明細書に記載されるワクチンは筋内注射が意図され得る。特定の実施形態において、２つの核酸成分がカチオンポリラクチド−コ−グリコリド（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧ）微粒子上に処方され（吸収され）、そして初回刺激免疫として投与される。ＤＮＡ成分に加えて、タンパク質成分がまた、１回以上の追加刺激免疫に投与される。このタンパク質成分は、典型的には、ＭＦ−５９アジュバントと混合された少なくとも１つのＨＩＶポリペプチド（例えば、ＣＨＯ細胞によって生成されるＶ２領域に欠失がある組換えオリゴマーエンベロープタンパク質）を含む。
【００７４】
（薬学的組成物）
好ましい実施形態において、本明細書に記載されるＨＩＶワクチンは、６〜９ヶ月またはさらに長い期間において（例えば、筋内投与）が意図される複数回（例えば、３以上）投与の成分を含む。この成分は同時にまたは異なる時点で与えられ得る。例えば、２つの核酸「初回刺激」免疫が与えられ得、ここで各初回刺激免疫が、Ｇａｇタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ＳＦ２由来のｐ５５ Ｇａｇ）および／またはＥｎｖタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２由来の、オリゴマーで、Ｖ２が欠失しているｇｐ１４０エンベロープタンパク質）をコードするＤＮＡの２つの別個の調製物を含み、両方の調製物がＰＬＧ微粒子上に処方される。これらの核酸は、１μｇと１０ｍｇの間のＤＮＡおよび１０μｇと１００ｍｇの間のＰＬＧ（例えば、１ｍｇのＤＮＡおよび２５ｍｇのＰＬＧ微粒子）を含む単位用量バイアルにおいて、代表的に別個に提供される。このＤＮＡ含有用量は、代表的に凍結乾燥された形態において保存され、そしてバイアルは一般に使用時に元に戻される。各単位用量バイアルは、典型的には、実際に患者に投与されるより多いＤＮＡ（またはタンパク質）を含むことに注意するべきである。最終的な投薬量は、代表的に、Ｇａｇ ＤＮＡおよびＥｎｖ ＤＮＡそれぞれ０．５ｍＬ中１ｍｇからなる。このワクチンのＤＮＡ成分は、初回刺激抗体、ＨＩＶ抗原（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖ）に応答するＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞が意図される。
【００７５】
上に言及されるように、本明細書に記載される免疫原性系（ワクチン）はまた、少なくとも１つのタンパク質成分、代表的に任意のＨＩＶ単離物またはＨＩＶ株由来のＨＩＶポリペプチドを含む。例えば、特定の実施形態において、このタンパク質成分は、ＨＩＶ−１のＳＦ１６２株由来の組換えオリゴマーエンベロープタンパク質を含む。ＨＩＶ Ｅｎｖのタンパク質モノマーは、（例えば、可溶性を向上させるために）約１４０ｋＤの分子サイズに切断され得、そしてＶ２ループは少なくとも部分的に取り除かれ得る。得られたオリゴマー分子は、ＨＩＶのエンベロープ構造に非常に似ている。このＶ２可変ループの除去は、レセプター結合および／または共レセプター結合に関する保存されたエピトープを露出する。サブタイプＢ（ＣＣＲ５）一次単離物ＳＦ１６２由来のオリゴマーＶ２欠失ｇｐ１４０をコードする裸のＤＮＡワクチンで初回刺激され、対応する組換えタンパク質で追加刺激されたマカークザルは、異なるサブタイプＢ一次単離物の範囲を中和することが可能な抗体を産生しする。Ｂａｒｎｅｔｔら（２００１）Ｊ Ｖｉｏｌ．７５（１２）：５５２６−４０；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（２００２）Ｊ Ｖｉｏｌ．（６）：２８３５−４７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）Ｊ．Ｖｉｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９。
【００７６】
マカークザル研究においてみられる、マカークザルを保護するために必要とされる受動的に投与される量ならびに中和力価の大きさと幅に基づき、本明細書に記載されるワクチンにより誘発される抗体は、動物の大部分において感染からの保護を提供するであろうことが示唆される。Ｍａｓｃｏｌａら（１９９９）Ｊ Ｖｉｏｌ．７３（５）：４００９−１８。１用量あたりのタンパク質の量は、マイクログラム量からミリグラム量まで変動し得る。特定の実施形態において、このタンパク質は、投与された用量が、防腐剤無しでｐＨ６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液において、エンベロープタンパク質を含んでいる単位用量バイアルにおいて約１００μｇであるように提供される。
【００７７】
本明細書に記載されるタンパク質組成物および／または核酸組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このキャリアは、宿主に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導すべきでない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。適切なキャリアは、代表的に、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウィルス粒子）である。粒子キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来の粒子状キャリアならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして知られているポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら（１９９７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０；Ｏ’Ｈａｇａｎら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４参照のこと。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイドのような細菌性のトキソイド、ならびにＥ．ｃｏｌｉ．に由来する毒素に結合され得る。
【００７８】
薬学的に受容可能な塩もまた、本発明の組成物において使用され得る（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような無機塩類、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩のような有機塩類）。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミン、破傷風トキサイドおよび当業者に周知な他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキスロトース、エタノールなど）を、単独もしくは組み合せて、ならびに湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームはまた、本発明の組成物のためのキャリアとして使用され得、このようなリポソームは上に記載されている。
【００７９】
簡単に、ウィルス性粒子に関しては、複製欠陥ベクター（上で粒子とも称される）は、天然のままの形態または精製形態のいずれかで保存され得る。保存方法および条件は、米国特許第６，０１５，６９４号に記載される。
【００８０】
さらに、本明細書に記載される組成物は、様々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。好ましくは、この組成物は免疫学的応答を開始させるのに十分な量の抗原を含む。適切な有効量は、当業者により決定され得る。このような量は、慣用的試験によって決定され得る比較的広い範囲に入り、そして一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ（例えば、抗原および／または粒子）、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇの粒子／抗原の程度の量である。
【００８１】
すでに示されたように、１つ以上の組成物は、さらに１つ以上のアジュバントを含み得る。有効性を増強し得る好ましいアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない組成物を含む：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を有するかまたは有さない）（例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、マイクロフルイダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９ＴＭ（国際公報ＷＯ ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ第１０章：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、（ｂ）１ミクロン未満のエマルジョンへとマイクロフルイダイズされたかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを作製するためにボルテックスされたかのいずれかの、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ））；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が用いられ得る）またはそれから作製された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体））このＩＳＣＯＭＳは、付加的な洗浄剤を欠き得る（例えば、ＷＯ ００／０７６２１を参照のこと））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ ９９／４４６３６）、ＩＬ１６など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−βＲａｎｔｅｓなど）など）；（６）必要に応じて、肺炎双球菌の糖と共に使用される場合、実質的にミョウバンの非存在下で、モノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−ジアシレートＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）（ＷＯ ００／５６３５８）；（７）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンと３ｄＭＰＬとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（８）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４：１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０：８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６：１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７：２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６：１２１６−１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４２：５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３：２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６：４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７：７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ． Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９：８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７：１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７：５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０：４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０５：５８９８−５９０６；国際特許出願ＷＯ ９６／０２５５５、ＷＯ ９８／１６２４７、ＷＯ ９８／１８８１０、ＷＯ ９８／４０１００５、ＷＯ ９８／５５４９５、ＷＯ ９８／３７９１９およびＷＯ ９８／５２５８１）すなわち、必要に応じてシトシンの代わりに使用される５メチルシトシンと共に少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド含む；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチロン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｏｎｅ）エステル、例えばＷＯ ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組み合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ ０１／２１２０７）もしくは少なくとも１つのさらなる非イオン性の界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合せた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ ０１／２１１５２）；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ ００／６２８００）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ ００／２３１０５）；（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン（例えば、ＷＯ ９９／１１２４１）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＝ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、ＷＯ ９９／５７６５９）（１４）組成物の有効性を増強する免疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバン（特にリン酸アルミニウムおよび／または水酸化物アルミニウム）およびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【００８２】
ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【００８３】
本明細書に記載される薬学的組成物の投与は、任意の適切な経路により行われ得る（例えば、セクションＣを参照のこと）。特に、筋内投与または粘膜（例えば、直腸および／または膣）投与が好ましい。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回の用量スケジュールは、最初のコース（ｃｏｕｒｓｅ）のワクチン接種が、１〜１０回の別々の用量であり得、次いで他の用量が、免疫応答を維持および／または増強するように選択された時間間隔の後（例えば、第２の用量について１〜６ヶ月間）で与えられ、そして必要な場合、続いての用量が数ヵ月後に与えられるスケジュールである。この投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、モダリティーの有効性、送達が行われるワクチン、被験体の必要性によって決定され、そして開業医の判断に依存する。
【００８４】
特定の実施形態において、このタンパク質成分は、水中油型エマルジョンアジュバントである独立のＭＦ５９Ｃ．１（以後ＭＦ５９と称される）と投与前に混合される（例えば、国際公報ＷＯ番号 ９０／１４８３７参照のこと）。様々なサブユニット抗原（例えば、ＨＣＶ Ｅ２、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＢｓＡｇ、ＣＭＶ ｇＢおよびＨＳＶ ２ｇＤ）が、ＭＦ５９アジュバントと組み合わせられ、そして優れた安全性および許容できるプロフィールで現在までに、１８，０００人以上のヒト被験体に投与されてきた。タンパク質ブースターは、初回刺激抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を幅と継続時間において増幅することが意図され、免疫系の体液性区画および細胞性区画の両方において平衡のとれた応答を提供し、ＨＩＶ−１感染の予防を達成することを可能にする。
【００８５】
すでに示されたように、ＭＦ５９アジュバントは、インフルエンザ、単純疱疹ウィルス２（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）およびＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）由来のサブユニット抗原を含む、多数の異なるサブユニット抗原を用いて臨床試験において徹底的に評価されており、そしてこれは、一般的に一過性でかつ軽度から中等度の重篤度である、最小の局所的有害反応および全体的有害反応に十分許容される。３０を超える臨床研究において、１２，０００人を超える被験体が、ＭＦ５９アジュバントエマルジョンと組み合わせてインフルエンザウィルスワクチンを受けた。わずか２人の患者が、深刻な副作用を受けた。さらに、副作用の発生率は、使用される抗原に依存する。
【００８６】
（初回刺激−追加刺激レジメン）
特定の実施形態において、複数回投与（例えば、初回刺激−追加刺激型投与）は有利に行われ得る。例えば、１つ以上の目的のＨＩＶ抗原を発現する核酸構築物が投与される。次いで、例えば、ポリペプチド抗原および適切なアジュバントを含む組成物において、同一のおよび／または異なるＨＩＶ抗原が投与される。あるいは、抗原はＤＮＡより前に投与される。複数回ポリペプチド投与および複数回核酸投与（任意のオーダーで）がまた、行われ得る。
【００８７】
本明細書に記載のように、本明細書に記載されるある典型的な初回刺激−追加刺激のレジメンは、一つ以上のＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡの二回以上の投与、続いてＨＩＶポリペプチド抗原そのものの一回以上の投与を含む。例えば、ＨＩＶ ＧａｇおよびＨＩＶ ＥｎｖのＤＮＡ／ＰＬＧ組成物（例えば、別個のＧａｇおよびＥｎｖ）の二回以上の投与後、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の一回以上の投与がなされ得る。ＨＩＶ−１ ＤＮＡ構築物は、免疫系の細胞性部門（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｒｍ）および体液性部門（ｈｕｍｏｒａｌ ａｒｍ）を刺激し得、チンパンジーにおけるＨＩＶ感染予防可能な免疫応答を惹起し得る。Ｂｏｙｅｒら（１９９７），Ｎａｔ Ｍｅｄ３：５２６−５３２。ＰＬＧ微粒子の表面上へのＤＮＡの吸着は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＤＮＡの取り込みを改善し、細胞性免疫応答および液性免疫応答を高める。Ｏ’Ｈａｇａｎら、（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１９）：９０３７−４３。ＰＬＧは、ＤＮＡを送達するのに特に好まれる。なぜなら、このポリマーは、生物分解性であり、生体適合性であり、いくつかの薬物送達系を開発するのに使われてきたからである。Ｏｋａｄａら（１９９７）、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ２８（１）：４３−７０。ある実施形態では、ＤＮＡ：ＰＬＧの比率は、約１ｗ／ｗ％と１６ｗ／ｗ％との間（またはその間の任意の値）である。
【００８８】
「ブースター」構成成分は、任意のＨＩＶ株またはサブタイプ由来のＨＩＶタンパク質（例えば、サブタイプＢ株（例えば、ＳＦ２、ＳＦ１６２など）および／またはサブタイプＣ株（ボツワナ株および／またはＴＶ１のような南アフリカ株）由来の、組換えオリゴマー化エンベロープタンパク質）を含む。例えば、Ｓｃｒｉｂａら（２００１），ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １７（８）：７７５−８１；Ｓｃｒｉｂａら（２００２）、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １８（２）１４９−５９；Ｔｒｅｕｒｎｉｃｈｔら（２００２），Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．６８（２）：１４１−６を参照のこと。Ｅｎｖタンパク質のタンパク質単量体は、トランケートになり得、そしてＶ２ループは、交差反応性中和抗体を惹起するためにより効率的である保存されたエピトープの露出を増やすために、部分的に除去され得る。一つの理論に縛り付けられることなく、上記タンパク質ブースターは、一次抗体およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の応答を幅および期間において増幅するように意図されている。Ｂａｒｎｅｔｔら（２００１），Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（１２）：５５２６−４０；Ｃｈｅｒｐｅｌｉｓら（２００１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（３）：１５４７−５０。各々の用量におけるタンパク質濃度は、約１μｇから１０００μｇを超えるまで（またはその間の任意の値）、好ましくは約１０μｇと５００μｇとの間で、そしてなお好ましくは約３０μｇと３００μｇの間で変化し得る。
【００８９】
今日まで、本明細書に記載されるような、ＨＩＶワクチンは、前臨床研究および臨床試験において安全性についての強力な記録を示してきた。以下の実施例４もまた参照のこと。ワクチン関連の免疫不全の証拠は、報告されていない。ＨＩＶワクチンを用いてマウスおよびラビットで実施された毒物学研究は、このワクチンが非常によく寛容されることを示した。発見は、他のウイルスサブユニットワクチンまたはＭＦ５９アジュバントを用いて実施された研究と一致していた。可逆的局部（筋肉内）炎症は、そのようなワクチンで観察される唯一の顕著な変化である（実施例４参照）。
【００９０】
ＨＩＶワクチンの開発計画の目的は、広い体液応答および細胞性応答の組み合わせを惹起し得、かつＨＩＶの感染または進行したＨＩＶ疾患／ＡＩＤＳの発症を予防し得る、新規なＤＮＡプライムプラス組換えタンパク質−追加刺激ＨＩＶワクチンの安全性および効力を証明することである。
【００９１】
（ＨＩＶ抗原の供給源）
ポリヌクレオチド配列（例えば、核酸発現構築物における使用のための）は、例えば、その遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすること、またはその遺伝子を含むことが公知のベクターからその遺伝子を取得することによって、組換え技術を用いて、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、その遺伝子を含む細胞および組織から、標準的な技術、例えば、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲを用いて、直接単離され得る。ＤＮＡを取得および単離するために用いられる技術の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら上記参照。目的とする遺伝子は、クローン化されるよりもむしろ、化学合成によってもまた生産され得る。そのヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について適切なコドンを用いて設計され得る。一般的に、そのアミノ酸配列が発現される意図される宿主にとって好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全なコード配列１へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．，（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３を参照のこと。
【００９２】
次に、所望される抗原をコードする遺伝子配列は、例えば、米国特許第６，６０２，７０５号および国際特許出願公開ＷＯ ００／３９３０２；ＷＯ ０２／０４４９３；ＷＯ ００／３９３０３；およびＷＯ ００／３９３０４に記載のベクターに挿入され得る。これらの特許は、適切な例示的な核酸発現ベクターおよび本明細書に記載の組成物および方法において有用な、さらなるベクターを取得する方法を記載している。
【００９３】
発現構築物（例えば、プラスミド）は、代表的には、上記コード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み、この制御エレメントは、対象種中におけるインビボでのその遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的な発現プロモーターとしては、とりわけＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターのようなＣＭＶプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような、他の非ウイルス性プロモーターもまた、哺乳動物発現のために用途が見出される。代表的には、翻訳終止コドンに対して３’側に存在する転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた、存在する。好ましくは、上記コード配列に対して５’側に位置する、翻訳開始の最適化のための配列もまた、存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されるような、ＳＶ４０由来のものおよびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
【００９４】
エンハンサーエレメントはまた、上記哺乳動物構築物の発現レベルを上げるために本明細書で使われ得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるような、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるような、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるような、ヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【００９５】
さらに、キメラ抗原をコードする遺伝子配列（例えば、目的とする複数の抗原／エピトープ（例えば、一つ以上のウイルス単離株由来のもの）をコードする）を含むＨＩＶポリペプチドをコードする核酸が、構築され得る。あるいは、マルチシストロン性カセット（例えば、２−シストロン性カセット）が構築され得、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどを用いた単一ｍＲＮＡからの複数の抗原の発現を可能にする。
【００９６】
さらに、本願処方物に用いられる上記ＨＩＶ抗原（およびこれらの抗原をコードするポリヌクレオチド）は、ＨＩＶの一つ以上のサブタイプから得られ得る。ＨＩＶ−１の配列の系統発生樹には、３本の別個の枝があり、これらの間で、Ｍ（主要）ウイルスは、世界中のヒトの感染のほとんど全てを占める。上記Ｍ群のウイルスは、９個の別個の遺伝子サブタイプまたは（ＡからＫまでの）クレードに分類されてきた。世界中で、上記サブタイプＡおよびＣは、上記感染のほとんどを占め、これらのサブタイプは、南アフリカおよびインドにおいて最も一般的である。上記サブタイプＢは、アメリカ大陸、オーストラリアおよびヨーロッパで支配的である。Ｍａｌｉｍら，（２００１）Ｃｅｌｌ １０４（４）：４６９−７２。これらのサブタイプの後に頻繁に、より新しい循環組換え形態（ＣＲＦ）が生じる。ＨＩＶ−１は、サブタイプの内部で、および単一の個体の内部でさえ、新規の遺伝的多様性を示す。Ｋｗｏｎｇら，（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７４（４）：１９６１−７２。有効なワクチンが開発されたウイルスにおいて見出される多様性と比べた場合、この多様性は非常に莫大である。Ｍｏｏｒｅら，（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：５７２１−９。従って、ＨＩＶに関して、本明細書に記載されるワクチンは、代表的には、支配的な遺伝子サブタイプに基づいて開発されるが、特定のサブタイプに対して有効なワクチンは、本明細書に記載の教示を用いて容易に生産され得る。
【００９７】
（産業上の利用可能性）
ＨＩＶがＡＩＤＳの病因物質であるという１９８３年から１９８４年における発見は、ワクチンの迅速な開発に希望をわかせた。４０種類より多くのＨＩＶのワクチンの候補が、すでにフェーズＩおよびフェーズＩＩの臨床試験で試験されており、最初のフェーズＩＩ試験は、米国およびタイで現在進行中である。Ｅｓｐａｒｚａ，Ｊ．（２００１）Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．７９（１２）：１１３３−７。しかし、そのワクチンの開発の主な障害は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳに対する防御の免疫学的相関に関する科学的証拠が欠如していることであった。Ｃｌｅｒｉｃｉら（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５１（１−２）：６９−７３。ＨＩＶに感染したほとんどの個体は、広汎な免疫学的応答を上記ウイルスに対して発生するけれども、これらの応答は、上記感染も除去し得ないし、疾患の進行も防止し得ない。この問題は、ＨＩＶ株は世界の様々な地域で著しく変わるという事実により、さらに複雑となる。ＨＩＶは、特にウイルスエンベロープタンパク質をコードしている遺伝子において、広範囲にわたる遺伝子配列不均一性を示す。種々のサブタイプのウイルスは、それら自体の間で結合し得、付加的循環組換え形態（ＣＲＦ）を産生する。ＭｃＣｕｔｃｈａｎら（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（６）：３３３１−３３３８。
【００９８】
ＨＩＶ−１感染に対する天然の応答よりも効果的である特異的抗ＨＩＶ−１免疫応答を誘導するためのワクチン接種の使用は遂行し難いことが、証明されてきた。ワクチンが有効な感染の大部分において、ウイルス血症または菌血症は、病原体が標的器官に到達する前に免疫系がその病原体を含むことを可能にする重大な段階である。Ａｄａら（２００１）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３４５：１０４２−１０５３。従って、想定されてきた。ＨＩＶ−１の十分な免疫制御の欠損が、そのウイルス血症の初期段階の間の主要な標的であるＣＤ４＋細胞にＨＩＶ−１が感染して瀉出する能力（Ｇｒｅｅｎｅら（２００２），Ｎａｔ Ｍｅｄ．８（７）：６７３−８０）；表面抗原の配列を変異させるＨＩＶ−１の能力；ＨＩＶ−１は、マスクしなければ中和抗体に認識される表面エピトープをマスクする能力を有する、弱い抗原であるという事実；および／またはＨＩＶ−１は、細胞性免疫応答を回避し得、免疫系に接近不能な部位での潜在性感染を確立し得るという事実（Ｇｏｔｃｈら，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １３（１）：１３−１７）を含む、いくつかの要因に起因する可能性があるいうことが想定されてきた。
【００９９】
さらに、ほとんどの認可されたワクチンは、細胞性応答および抗体応答の両方を惹起するが、これらの公知のワクチンが感染に対して実際にどのように防御するかについてはほとんど知られていない。機能的抗体応答は、細菌を殺すこと、ウイルスを不活化することまたは毒素を中和することのいずれかにより、その接種物を排除し得る。Ｐｌｏｔｋｉｎら（２００１），Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ．２０（１）：６３−７５。しかし、以前に、試験されたそのＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ−１の多様な一次単離株に対する、広汎なＨＩＶ−１特異的中和抗体の十分な力価を惹起し得なかった。
【０１００】
科学界には、成功するために、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのワクチンは、ｉ）広範囲の一次単離物を中和し得る抗体を誘導し、ｉｉ）種々の株に対する持続性のＣＤ８＋培介性細胞傷害性応答を誘導し、そしてｉｉｉ）ＣＴＬ活性を維持する強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するべきである、という全体的な合意がある。例えば、Ｍａｓｃｏｌａら（１９９９），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３（５）：４００９−１８を参照のこと。受動的に投与された抗体だけで、病原性ＳＨＩＶを用いた粘膜性およびＩＶの両方のチャレンジに対して、マカクを防御し得る。例えば、Ｍａｓｃｏｌａら，（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（４）：４８９−９５を参照のこと。しかし、広汎に交差反応性の中和抗体が免疫化によりヒトにおいて惹起され得るという疑いが存在する。これは、何人かの研究者に、ワクチンにエンベローブを含ませる努力をあきらめさせ、防御のために細胞性免疫に専ら頼るワクチンを奨励させた。また、Ｋａｕｌら（２００１），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０７（３）：３４１−９参照のこと。しかし、そのようなワクチンは、感染から防御する見込みがなく、疾患の進行を制限することが期待され得る。
【０１０１】
従って、本明細書に記載される組成物および方法は、好ましくは体液性応答（中和抗体）ならびに細胞性応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）の組み合わせを惹起する。（体液性応答または細胞性応答それぞれで十分であり得るのだが。）その初回刺激レジメンは、好ましくはＧａｇ ＨＩＶ遺伝子および／またはＥｎｖ ＨＩＶ遺伝子をそれぞれ含む核酸ベクター（例えば、ｐＣＭＶもしくはｐＳＩＮ）に基づく。ＤＮＡを基にしたワクチンは魅力的である。なぜなら、そのワクチンは融通がきき、比較的生産しやすいからである。そのワクチンの配布は、簡単にされ得る。なぜなら、ＤＮＡそれ自体は、適切に保存された場合、非常に耐久性だからである。抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを用いた免疫化は、抗体媒介性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を惹起する。ＤＮＡ免疫化は、様々な動物モデルにおいて防御性免疫を提供した。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７），Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０（３）：１６３−７２を参照のこと。マラリア抗原をコードするＤＮＡワクチンは、２０人の志願者により、比較的十分に寛容され、ほんのわずかな穏やかな局部的反応原生および全身性症状しか伴わなかった。Ｗａｎｇら（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３８８）：４７６−８０。ＨＩＶ−１のＥｎｖ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む、ＤＮＡを基にしたワクチンは、抗ウイルス薬を用いていない１５人の無症候のＨＩＶ感染患者に投与された。そのワクチンは、局部反応も全身反応も誘導せず、実験の異常は何も検出されなかった。特に、自己免疫抗体を生じた患者はいなかった。ＭａｃＧｒｅｇｏｒら（１９９８），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１７８（１）：９２−１００。進行中のフェーズ１の臨床試験は、治療ワクチンは、ヒトにおいて抗ＨＩＶ−１免疫応答を実際に追加刺激するということを示す。Ｕｇｅｎら（１９９８），Ｖａｃｃｉｎｅ １６（１９）：１８１８−２１。
【０１０２】
本明細書に記載される組成物および方法の追加刺激構成成分は、代表的にはＨＩＶタンパク質（例えば、Ｖ２ループの欠損を有し、それゆえに保存されたエピトープを露出しているＨＩＶエンベロープｇｐ１４０タンパク質）を含む。本明細書に記載されるＨＩＶタンパク質ワクチンは、一般的に、サブユニット組換え抗原を含み、そして、非組換えＨＩＶタンパク質ワクチンを用いて得られる安全日および有効日を考慮して、十分に寛容され、かつ（体液性および細胞性）免疫原性であることの両方が予測される。
【０１０３】
（処方物および投与）
上記に言及されている通り、上記組成物は、好ましくは「初回刺激−追加刺激」アプローチを使用して投与される。例えば、２回の初回刺激注射物（例えば、各々が、ＨＩＶ−１のＳＦ２由来のｐ５５ ＧａｇをコードするＤＮＡ調製物およびＨＩＶ−１のＳＦ１６２由来の、Ｖ２ループを欠損したオリゴマーｇｐ１４０エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡの調製物という２種の別個の調製物を含み、その両方が、ＰＬＧ微粒子（Ｅｎｖ ＰＬＧ／ＤＮＡまたはＧａｇ ＰＬＧ／ＤＮＡ）上に処方されている）が投与される。追加刺激組成物は、タンパク質を含み、例えば抗原は、ＭＦ５９アジュバントと組み合わせた、組換えオリゴマーの、Ｖ２ループの欠失したｇｐ１４０エンベロープタンパク質（ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０）から構成されている。そのタンパク質は、代表的には、注射の直前に上記アジュバントと混合される。
【０１０４】
上記ＤＮＡワクチンは、バイアル１本当たり１．４ｍｇのＤＮＡおよび３５ｍｇのＰＬＧ微粒子を凍結乾燥形態で５．０ｍＬのＩ型のガラスバイアルにて提供され得る。ＨＩＶ
ｏ−ｇｐ１４０抗原は、バイアル１本当たり０．３５ｍＬ中に１４０μｇを含む、３ｍＬのＩ型ガラスバイアルに入った液体として供給される。ＭＦ５９アジュバントは、バイアル１本当たり０．７ｍＬを含む３ｍＬのＩ型ガラスバイアルに入れて供給される。一般的に、実際に被験体に投与されるＤＮＡおよびタンパク質の用量は、そのバイアルに含まれる用量未満である。例えば、そのバイアルが１．４ｍｇを含む場合、約１．０ｍｇのＤＮＡが、代表的に被験体に投与される。同様に、各々の単位容量バイアルが、１４０μｇのタンパク質を含む場合、約１００μｇのタンパク質が、代表的に被験体に投与される。
【０１０５】
核酸およびポリペプチドに関しては、任意の適切な送達様式が使用され得る。リポソームもまた、これらの分子の送達のために用いられ得る。核酸の送達用のキャリアとしてのリポソームの使用の概観として、Ｈｕｇ ａｎｄ Ｓｌｅｉｇｈｔ， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）のＶｏｌ．１０１のｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電している）調製物、アニオン性（負に荷電している）調製物および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態でのプラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されてきた。カチオン性リポソームは、容易に入手できる。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で入手可能である．（また、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照のこと。）市販されている他の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０１０６】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を用いて容易に作られる。そのような物質には、とりわけ、フォスファチジルコリン、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルフォスファチジルエタノーコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、適当な比率でＤＯＴＭＡ開始剤およびＤＯＴＡＰ開始剤と混合され得る。これらの物質を用いてリポソームを作る方法は、当業者に十分に公知である。
【０１０７】
前記ＤＮＡ抗原および／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４；４８３−４９１に記載されるものに類似した蝸牛殻状（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）脂質組成物の状態で送達され得る。また、米国特許第４，６６３，１６１号および第４，８７１，４８８号を参照のこと。
【０１０８】
上記ワクチンの構成成分はまた、粒子カプセル状キャリアにカプセル化されるか、粒子状キャリアに吸着されるか、または結合され得る。そのようなキャリアは、複数のコピー数の選択された抗原を免疫系に提示し、局部リンパ節中での抗原の捕捉および保持を促進する。その粒子は、マクロファージにより貪食され得、そしてサイトカインの放出により抗原提示を増強し得る。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のものならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−コ−グリコチド）由来の微粒子−が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）１４９−５４，１９９３を参照のこと。適切な微粒子はまた、例えばアニオン性洗剤またはカチオン性洗剤のような、電荷を帯びた洗剤の存在下で生産され得、正味負の電荷または正味正の電荷を持つ表面を有する微粒子を生産する。例えば、アニオン性洗剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））を用いて生産される微粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、負に荷電している高分子（例えば、ＤＮＡを吸着する。）（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと。）核酸を送達するためのＰＬＧ粒子の製造方法および使用方法が、国際特許出願公開ＷＯ ９８／３３４８７；ＷＯ００／０６１２３；ＷＯ０２／２６２１２；およびＷＯ ０２／０２６２０９に記載されている。
【０１０９】
ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマーおよびこれらの分子の結合体もまた、目的とする核酸を移入するために用いられ得る。
【０１１０】
さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを用いたバイオリスティック送達ステムは、本発明の核酸ベクターを送達するのに特に有用である。上記粒子は、送達されるべき核酸で覆われ、「遺伝子銃」からの火薬発射を使って一般的には減圧雰囲気下で、高速に加速される。そのような技術およびそれゆえ有用な装置の説明に関しては、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、第５，１００，７９２号、第５，１７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および第５，４７８，７４４号を参照のこと。無針注射システムもまた使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０１１１】
本明細書に記載された組成物は、予防薬（感染を予防するため）であるか、または治療法（感染後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。上記組成物は、「治療上有効な量」の目的の遺伝子を、その組成物が投与される個体において免疫応答が生成されるような量の抗原がインビボで産生され得るように、含む。正確な必要量は、治療される被験体に依存して変化する；とりわけ、処置される被験体の年齢および全身的状態；その被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原およびその投与様式に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療上の有効量」は、慣用的試行を通して決定され得る比較的広い範囲にある。
【０１１２】
その組成物は、一つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を一般的に含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）はそのようなビヒクルに存在し得る。核酸取り込みおよび／または核酸発現の特定の促進物質もまた、上記組成物に含まれ得るか、または、たとえばブピバカイン、心臓毒性およびスクロース（これらに限定されない）と共に投与され得る。
【０１１３】
一旦処方されれば、本発明の組成物は、（例えば、上に記載されたように）被験体に直接投与され得るか、あるいは、上記の方法のような方法を用いてエキソビボで上記被験体由来の細胞に送達され得る。例えば、被験体への形質転換細胞のエキソビボでの送達のための方法および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして、この方法としては、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミンおよびＬＴ−１媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へ（対応する抗原を含むかまたは含まない）ポリヌクレオチドのカプセル化、ならびに核への上記ＤＮＡの直接微量注入が挙げられ得る。
【０１１４】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのインビボでの直接送達は、一般的には本明細書に記載のように、従来の注射器またはＡｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような遺伝子銃のどちらかを用いた注入により遂行される。上記構築物は、皮下注射、表皮注射、皮内注射、および粘膜内注射（例えば鼻内注射、直腸内注射、および膣内注射、腹腔内注射、静脈注射、口腔注射もしくは好ましくは、筋肉内注射）のいずれかにより注入され得る。投与処理は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と組み合わされ得る。
【０１１５】
下記は、本発明を実行するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示の目的のためにだけ提供され、これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされてきたが、いくらかの実験的誤差および偏差は、当然計上されるべきである。
【実施例】
【０１１６】
（実験）
（実施例１：ワクチン製造プロセスおよび放出）
（Ａ．ＰＬＧ／ＤＮＡ ＨＩＶワクチン）
核酸を用いたＰＬＧ／ＤＮＡ初回刺激免疫化に関して、プラスミドＤＮＡ（ＥｎｖまたはＧａｇ）を、本質的には以下の通りに生分解性ポリマー微粒子（ＰＬＧ）上に吸着させた。そのＤＮＡワクチンを製造するために、大腸菌（ＤＨ５株）を、上記ＨＩＶ Ｅｎｖ遺伝子およびＧａｇ遺伝子をコードするプラスミドを用いて形質転換した。改変型アルカリ溶解方法を使用して、プラスミドＤＮＡを、染色体ＤＮＡ、タンパク質および他の細胞断片から単離した。プラスミドＤＮＡを、ＰＥＧ８０００を用いた沈殿により濃縮した。その後、上記プラスミドは、二回のクロマトグラフィー工程により精製し、限外濾過により処方物緩衝液中に移した。
【０１１７】
ＰＬＧ微粒子を、無菌製造プロセスによって生産した。例えば、米国特許第５，６０３，９６０号；第６，５３４，０６４号および６，５７３，２３８号；Ｇｕｐｔａら（１９９８），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．３２（３）：２２５−２４６；Ｏ’Ｈａｇａｎ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０（１）：１−１０を参照のこと。特に、（塩化メチレンに溶解した）ＰＬＧを、高速および高せん断の混合条件下で処方物緩衝液およびＣＴＡＢ（カチオン性界面活性剤）溶液を用いてホモジネートし、安定なエマルジョンを形成した。窒素パージによる塩化メチレンの除去は、そのカチオン性界面活性剤がＰＬＧの界面にとどまる傾向に起因して、ＰＬＧに微粒子を形成させる。これらの正に帯電した微粒子は、負に帯電したＤＮＡと結合し、上記ＰＬＧ／ＤＮＡ免疫原を形成する。
【０１１８】
（Ｂ．ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原）
上記組換えオリゴマー性ＨＩＶ ｇｐ−１４０（ｏ−ｇｐ１４０）を、本質的にはＳｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９に記載のように調製した。宿主細胞の発酵に続き、細胞培養液の上清を得、濾過し、濃縮し、そして精製した。
【０１１９】
その精製ｏ−ｇｐ１４０タンパク質画分を、外来性ウイルスを除去するためにさらに処理した。これらの工程の第１の工程は、ｐＨ３．５で１時間のウイルスの不活性化であった。その後、サンプルを濃縮し、ＳＰ樹脂を用いたカチオンの捕獲のためにｐＨ４で緩衝液にディアフィルトレーションした。ＳＰ樹脂は、ｏ−ｇｐ１４０レジンを捕捉し、多くのウイルスを通り抜けさせる。そのｏ−ｇｐ１４０を溶出し、濃縮して処方物緩衝液中にディアフィルトレーションした。この処方された大量生産物を、次にＵｌｔｉｐｏｒ（登録商標） ＶＦ グレード ＤＶ５０ウイルス除去膜を通して濾過した後、０．２μｍ膜を通して濾過した。
【０１２０】
（Ｃ．ＭＦ５９ アジュバント）
ＭＦ５９アジュバント（ＭＦ５９Ｃ．１）は、スクアレン内部油相およびクエン酸塩緩衝液外部水相を持つ、水中油滴型エマルジョンである。例えば、米国特許第６，２９９，８８４号および６，０８６，９０１号；Ｏｔｔら，「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７７−２９６（１９９５）。二つの非イオン性界面活性剤、トリオレイン酸ソルビタンおよびポリソルベート８０は、上記エマルジョンを安定化させるのに役立つ。上記ＭＦ５９アジュバンドの安定性は、動物およびヒトにおいて、多くの抗体と組み合わせて示されている。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら，「ＭＦ５９ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｂｏｔｈ Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｏｌｄ Ｍｉｃｅ」Ｖａｃｃｉｎｅ １４（６）：４７８−４８４（１９９６）を参照のこと。
【０１２１】
（実施例２ ワクチン組成物）
上記ＰＬＧ／ＤＮＡ初回刺激ワクチン、ｏ−ｇｐ１４０追加刺激抗原、およびＭＦ５９アジュバンドの要素を、以下の表において規定する。
【０１２２】
（表１ ＰＬＧ ＤＮＡ（Ｅｎｖ）ワクチン組成物）
【０１２３】
【表１】
＊再構成の後。
【０１２４】
（表２ ＰＬＧ ＤＮＡ（Ｇａｇ）ワクチン組成物）
【０１２５】
【表２】
＊再構成の後。
【０１２６】
（表３ ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原組成物）
【０１２７】
【表３】
（表４ ＭＦ５９Ｃ．１アジュバント組成物）
【０１２８】
【表４】
ワクチン注射のスケジュールは、複数の時点で（例えば、５つの異なる時点または６つの異なる時点で）注射することであり、０月目、１月目、２月目、６月目、９月目および可能ならば１２月目に投与される。いくつかの免疫化スケジュールは、免疫応答を最大化するように評価される。これらのスケジュールは、例えば、以下に記載されるような任意のスケジュールに従う、４つの時点または５つの時点でのワクチン接種を含み得る。すべてのワクチン接種は、外来患者の設定で筋肉内注射により投与される。表５は、例示的な免疫化プロトコールを示す。
【０１２９】
（表５ 免疫化のプロトコール）
【０１３０】
【表５】
＃スケジュール
＊免疫応答を維持する必要がある場合
（実施例３：取り扱いおよび保存）
投与用に上記ＤＮＡ／ＰＬＧワクチンを調製するため、一本のバイアルの各々のＤＮＡ／ＰＬＧ（ＥｎｖまたはＧａｇ）を、０．７ｍＬの注射用水を注射器に引き出すことおよびそれをその二本のバイアルに添加することにより、再構成する。そのバイアルを、二分間まで激しく攪拌する。上記懸濁物が均一であり、乳白色であり、十分に分散した場合、その混合物は完成している。その再構成された溶液を、最大のＤＮＡ／ＰＬＧ用量（１０００μｇ）を送達するために、更なる調製なしに投与する。５００μｇ用量および２５０μｇ用量を調製するために、新しい注射器を使って０．７ｍＬまたは２．１ｍＬのさらなる０．９％のＮａＣｌ溶液（生理食塩水）それぞれを、準備され、再構成されたすべてのバイアルに加え、かき混ぜて混合する。新しい注射器を用いて、０．５ｍＬの上記Ｅｎｖ ＰＬＧ／ＤＮＡ混合物を、その後０．５ｍＬの上記Ｇａｇ ＤＮＡ／ＰＬＧ混合物を同一の注射器に引き出す。その後、合わせた容積１ｍＬ中の、全ＤＮＡ用量を、三角筋に筋肉内注射（ＩＭ）し得る。
【０１３１】
ＨＩＶのｏ−ｇｐ１４０抗原を、投与前にＭＦ５９アジュバンドと混合する。ワクチンの投与用量を調製するため、上記ＭＦ５９バイアルの中身を繰り返し施回させること、および（激しい振盪ではなく）反転させることにより混合し、次に０．３５ｍＬを１ｍＬの無菌注射器に引き出す。このアジュバントを、解凍したＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原を含む上記３ｍＬバイアルに注入し、そして緩やかに施回することにより混合する。新たな注射器を用いて上記混合物の０．５ｍＬを引き出し、その後、その混合物を三角筋に筋肉内注射（ＩＭ）し得る。最終ワクチンは、乳白色の不透明性を有する。上記注射は、上記アジュバントの添加の直後に投与するべきである。
【０１３２】
上記解凍したＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０抗原は、２℃〜８℃で８時間安定である。８時間より長時間解凍された抗原は、（冷蔵されていても）好ましくない。なぜなら、それは減少した効力を有し得るからである。
【０１３３】
偽薬を受ける個体は、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まない、リン酸緩衝化生理食塩水を０．５ｍＬ受ける。１ｍＬ用量を送達するための一定容積を含むバイアルに入れて、無色透明な溶液として供給する。上記バイアルは、２℃〜８℃にて冷蔵庫中で保存しなければならない。
【０１３４】
（Ａ．ワクチン保存条件）
前記凍結乾燥したＤＮＡ／ＰＬＧワクチンを、２℃〜８℃にて保存する。ＨＩＶ ｏ−ｇｐ１４０を、−６０℃未満で凍結して保存し、そして上記ＭＦ５９アジュバントを、冷蔵庫中に２℃〜８℃にて保存する。ＭＦ５９は、凍結するべきではない。
【０１３５】
（実施例４：動物研究）
非臨床安全評価計画を、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の３筋肉内（ＩＭ）用量、次いで上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物の３ＩＭ用量の臨床投与を援助するために設計した。上記ＤＮＡワクチン処方物の１臨床用量（１．０ｍＬ）は、１ｍｇのＥｎｖ−ＤＮＡ、１ｍｇのＧａｇ−ＤＮＡおよび５０ｍｇのＰＬＧを含み、一方、上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの１臨床用量（０．５ｍＬ）は、０．１ｍｇ／０．２５ｍＬのＥｎｖタンパク質および０．２５ｍＬのＭＦ５９を含む。
【０１３６】
以下のＧＬＰ研究を、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を単回のＩＭ注射として、ニュージーランドシロウサギに投与した場合、宿主のゲノムＤＮＡ中への組込みが生じるかを評価するため、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合は上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の組織局在および持続性を特徴付けるためにそれぞれ行った。これらの研究を、以下の「ニュージーランドシロウサギに対する単回筋肉内注射後のＤＮＡ−ＰＬＧ処方物を用いた組み込み研究」と題したセクションＡおよび「ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の単回用量生体分布研究」と題したセクションＢにおいてさらに記述する。
【０１３７】
以下にさらに詳細に記述するように、これらの研究では、生存度、臨床的知見、体重および肉眼的剖検に基づいて毒性を評価した。注射部位の理学的検査および皮膚評点付けもまた、マウス生体分布研究においても遂行した。これらの研究の結果は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡワクチン処方物の単回用量の投与により、上記ウサギのゲノムＤＮＡへの組込みが生じず、そしてニュージーランドシロウサギおよびＢＡＬＢ／ｃマウスに十分な耐性が生じることを証明した。上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の分布に関するマウス組織の分析もまた行った。
【０１３８】
さらに、以下のＧＬＰ毒物学研究を実行して、ニュージーランドシロウサギにＩＭ注射により投与した場合の、上記ＨＩＶワクチン処方物の全身的寛容および局部的寛容を評価した。（「ニュージーランドシロウサギにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を用いた複数回用量の筋肉内注射毒性研究」と題した以下のセクションＣを参照のこと。）本研究では、動物に、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の４用量を二週間間隔で与え、続いて上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物の４用量を二週間間隔で与えた。最初のＨＩＶタンパク質ワクチン用量は、最終ＨＩＶ ＤＮＡワクチン用量と同じ日に投与した。二週間の回復期間を、その研究計画は含んだ。ウサギに、上記予定の臨床用量（１ｍＬ ＨＩＶ ＤＮＡワクチン／用量；０．５ｍＬ ＨＩＶタンパク質ワクチン／用量）を臨床的投与経路（ＩＭ）で与えた。しかし、ウサギに、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンの各々の４用量および上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの４用量を与えた。これは、意図した臨床的レジメン（各３用量）よりも１用量だけ多かった。ウサギ投与レジメンは、（月１回の）臨床的レジメンに比較して濃密であるが、ウサギ免疫原性研究は、２週ごとのレジメンが免疫学的観点から適当であるということを示した。
【０１３９】
本研究では、毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、体温、食物消費、検眼鏡検査、臨床病理学（血液学、血清化学およびフィブリノーゲンを含む凝固）、器官の重さ、ならびに肉眼的剖検および組織病理学的検査に基づいて評価した。抗体（抗核抗体ならびに抗Ｅｎｖ抗体および抗Ｇａｇ抗体）に関する血清の分析もまた実行した。本研究の条件のもとでかつ利用可能な予備データ（末期の器官の重さ、肉眼検査評価および未解決の組織学）に基づいて、上記ＨＩＶワクチン処方物の投与に関連するいかなる全身的効果も局部的効果も確認されなかった。
【０１４０】
上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の注射部位における安全性および存続性を、以下の非ＧＬＰ研究においてさらに評価した。そしてその非ＧＬＰ研究には、さらに詳細に、以下の「雄のニュージーランドシロウサギにおける、予備的ＤＮＡ／ＰＬＧ局部刺激寛容研究」と題したセクションＤおよび「ＰＣＲ注入部位評価を用いた、単回用量筋肉内マウス免疫原性研究および複数（２）用量筋肉内マウス免疫原性研究」と題したセクションＥに記述した。
【０１４１】
上記単回用量研究を行い、単回のＩＭ注射により投与した場合の、雄のニュージーランドシロウサギにおける、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧの潜在的局部刺激効果を評価した。潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、総合肉眼検診および注射部位の顕微鏡検査に基づいて評価した。本研究の条件下では、単回ＩＭ注射として雄のニュージーランドシロウサギに投与した場合、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧは、十分に寛容された。
【０１４２】
上記複数回用量免疫原性研究は、Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ処方物の２回投与（０日目および２８日目）を受けた雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、最終投与の４週間後および８週間後の、上記ＩＭ注射部位でのＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧの存在を評価した。結果は、上記ＰＬＧ処方物は、裸のＤＮＡコントロールと、持続性という観点で匹敵するということ、および最終投与の４週間後および８週間後での注射部位に残存する量は、不十分（上記感染量の約１０−７％）であるということを示した。
【０１４３】
（Ａ ニュージーランドシロウサギに対する、単回筋肉内注射後のＤＮＡ−ＰＬＧ処方物を用いた組み込み研究）
ニュージーランドシロウサギに対する単回ＩＭ注射によって上記ＨＩＶ ＤＮＡ−ＰＬＧワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の宿主ゲノムＤＮＡへの組込みを評価するため、以下の研究を行った。その研究は、３群から成り立っており、その１群あたり雌雄二匹ずつのウサギを含んでいた。０日目に、処理したウサギの各々の後脚に上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたは上記Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのどちらか一方の単回ＩＭ注射（０．５ｍＬ／脚）をした（表６参照）。コントロールのウサギには、いかなる注射もしなかった。全ての動物を、２９日目に剖検した。
（表６ 実験的研究設計）
【０１４４】
【表６】
ａ動物一匹あたりの全用量２ｍｇのＤＮＡ、５０ｍｇのＰＬＧ与えるために、群２および群３の動物に、各々の後脚に、脚一本あたり１ｍｇ／０．５ｍＬのＤＮＡ、２５ｍｇ／０．５ｍＬのＰＬＧの１用量を与えた。本研究の０日目に投与を行った。
ｂ動物一匹あたり総容積１ｍＬを与えるために、群２および群３の動物に、脚一本あたり容積０．５ｍＬの量を与えた。
ｃ剖検を、投与３０日後（２９日目）に行った。
【０１４５】
潜在的毒性を、死亡率に関する生存度の知見および全身的状態に関する生存度の知見、体重ならびに総合的剖検肉眼検査に基づいて評価した。さらに、剖検の際にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析のために注射部位を集め、上記ウサギのゲノムＤＮＡ中への上記ＤＮＡワクチンの組み込みを評価した。上記注射部位で陽性組み込み結果の事象がある場合にあり得るＰＣＲ分析のために、さらなる組織（表７参照）もまた集めた。上記ＰＣＲ分析のために、ＤＮＡを上記ウサギ組織から抽出し、定量し、フィールド逆転ゲル電気泳動に供して、上記ウサギゲノムＤＮＡを染色体外プラスミドＤＮＡから分離した。１７ｋｂより大きいサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、精製した。上記の抽出したＤＮＡおよびＦＩＧＥ精製ＤＮＡ（１μｇ）の両方を、定量的ＰＣＲアッセイを用いて分析し、各々の調製物における標的配列（プラスミドベクターＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の組み込みを評価した。コントロール動物の組織から抽出したＤＮＡを、性別に従ってプールした；処理した動物由来のＤＮＡをプールしなかったが、別々に分析した。
【０１４６】
（表７ ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１４７】
【表７】
死亡は一つもなく、臨床的徴候および体重に対する処理関連の副作用も一つもなかった。肉眼的検査における、処理関連の変化も注目されなかった。上記ＰＣＲ組み込み分析の結果は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧの上記宿主ゲノムＤＮＡ中への組み込みがないことを示した（表８参照）。上記注射部位で組み込みが一つも生じなかったので、さらなる組織は評価しなかった。
【０１４８】
（表８ 注射部位の定量的ＰＣＲアッセイ結果）
【０１４９】
【表８】
ｑフィールド逆転ゲル電気泳動（染色体外プラスミドＤＮＡ＋ゲノムＤＮＡ）の前のゲノムＤＮＡ中の上記標的配列の定量
ｑフィールド逆転ゲル電気泳動（ゲノムＤＮＡのみ）により精製したゲノムＤＮＡ中の上記標的配列の定量
ＬＬＤ＝上記アッセイの低い方の検出限界（５コピー数／μｇ ＤＮＡ）よりも低い。
【０１５０】
結論として、合計２ｍｇのＤＮＡおよび５０ｍｇのＰＬＧを含む、Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかの単回ＩＭ用量は、ニュージーランドシロウサギにおいて十分に寛容された。処理関連の副作用は全く注目されず、そしてプラスミドベクターＥｎｖ−ＤＮＡの、上記注射部位から得たウサギゲノムＤＮＡ中への組み込みは検出されなかった。
【０１５１】
（Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物の単回用量生体分布研究）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する筋肉内（ＩＭ）注射による単回投与後の、上記ＨＩＶ ＤＮＡ ＰＬＧワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）の組織局在および持続性を評価するため、以下の研究を行った。その研究は、１群あたり雄雌１５匹ずつの動物からなる群を５つ含んでいた。１日目に、処理したマウスの右大腿二頭筋領域に、高用量のＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧもしくはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ、または低用量のＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧもしくはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかを単回筋肉内（ＩＭ）注射した。コントロールのマウスには、いかなる注射もしなかった。一群あたり雄雌５匹ずつの動物を、投与１週間後（８日目）、投与２ヶ月後（６１日目）または投与３ヶ月後（９１日目）に剖検した。（表９）。
【０１５２】
潜在的毒性を、死亡率および全身的状態に関する生存度の知見、理学的検査、体重、注射部位の皮膚のＤｒａｚｉｅ評点付け、ならびに総合的剖検肉眼検査に基づいて評価した。さらに、選択した組織（表１０参照）を、各々の剖検の際に、ＰＣＲ分析のために収集し、マウス組織中への上記ＤＮＡワクチンの生体分布および持続性を評価した。上記ＰＣＲ分析のために、各々のマウス組織からＤＮＡを抽出し、定量し、蛍光プローブを用いるＰＣＲ増幅に供し、その後、蛍光検出を行った。収集した組織の内、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧで処理したウサギ由来の組織のみを分析した。
【０１５３】
（表９ 実験的研究設計）
【０１５４】
【表９】
ａ本研究の１日目に投与を行った。
【０１５５】
（表１０ ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１５６】
【表１０】
上記試験物質の投与に関連し得る死亡は一つもなく、臨床的徴候および体重に対する処理関連の副作用も一つもなかった。注射部位において、紅斑も浮腫も見られなかった。肉眼検査において注目された処理関連の変化はなかった。
【０１５７】
結論として、１００μｇまでのＤＮＡおよび２．５ｍｇまでのＰＬＧを含む、Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧまたはＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧのいずれかの単回筋肉内（ＩＭ）用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて十分に寛容された。処理関連の副作用は、何も気付かれなかった。
【０１５８】
（Ｃ．ニュージーランドシロウサギにおける、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物を用いた複数回用量筋肉内注射毒性研究）
上記ＨＩＶワクチン処方物の、反復投与後のニュージーランドシロウサギにおける局所的毒性および全身的毒性を評価するため、ならびに知見の可逆性を決定するため、以下の研究を行った。一群あたり雌雄８匹ずつの動物の群を二つ用いた。処理したウサギに、隔週与える上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチン処方物（Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧおよびＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ）を４回投与した。その後、上記処理したウサギに、同様に隔週与える上記ＨＩＶタンパク質ワクチン処方物を４回投与した。最後のＨＩＶ ＤＮＡワクチン用量および最初のＨＩＶタンパク質ワクチン用量を、同じ日（４３日目）に投与した。用量は、筋肉内（ＩＭ）注射により大腿四頭筋に投与し、両足に注射した４３日目を除いて、脚を交互に選んだ。コントロール動物に、生理食塩水溶液の筋肉内（ＩＭ）注射を４回し、その後、ＭＦ５９の筋肉内（ＩＭ）注射を４回した。一群あたり雄雌４匹ずつを、投与の３日後（８８日目、主要剖検）または投与の２週間後（９９日目、回復剖検）に剖検した。表１１は、実験的研究設計を示す。
【０１５９】
潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体温、体重、食物消費、眼の検査、臨床的病状（血液学、凝固、および血清化学パラメーター）、器官の重さ、総合肉眼検査試験、および選択した組織の顕微鏡的な評価に基づいて評価した。
【０１６０】
（表１１ 実験的研究設計）
【０１６１】
【表１１】
ａ１６匹の動物（８匹の雄＋８匹の雌）
ｃ０．２５ｍＬのＭＦ５９＋０．２５ｍＬの生理食塩水からなる。
ｃ０．５ｍＬのＥｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧ（２ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ，５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧ）＋０．５ｍＬのＧａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ（２ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ，５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧ）からなる。
ｄ０．２５ｍＬのＥｎｖタンパク質（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋０．２５ｍＬのＭＦ５９からなる。
ｅ一群あたり雄雌４匹ずつの動物。
【０１６２】
上記動物を、死亡率および罹患率に関して１日に２回観察し、そして毒性の徴候に関して１日に１回観察した。さらに、詳細な観察を、投与前、各々の投与日の４時間後、毎週１回および各剖検の際に行った。注射部位を刺激の徴候に関して評価し、投与前、ならびに各注射の２４時間後および４８時間後に、改変Ｄｒａｉｚｅスコアに基づいて等級付けした。体温を、処理前、各投与前および各投与の２４時間後に測定した。体重を、処理前、その後毎週１回、および剖検の際に記録した。食物消費を毎週１回評価した。眼科学的評価を、処理前および各剖検の前に行った。血液学、血清化学および（フィブリノーゲンを含む）凝固分析についてのさらなる血液サンプルを、処理前、２９日目および５７日目の投与前、ならびに８７日目および９９日目に収集した。各々抗体（抗核抗体ならびに抗Ｅｎｖ抗体および抗Ｇａｇ抗体）分析のために、血液サンプルを、処理前、１５日目、４３日目および７１日目の投与前、ならびに８７日目および９９日目にさらに採取した。各剖検の際、完全な肉眼検査および選択した組織の顕微鏡的評価（表１２参照）を行った。選択した器官（表１３）に関する器官の重量のデータをまた収集した。さらに、ＰＣＲ分析による上記ＤＮＡワクチンの宿主組織中への分布の可能な評価（表１４）のために、選択した組織を収集した。
【０１６３】
（表１２ 組織病理学組織一覧表）
【０１６４】
【表１２】
（表１３ 器官重量一覧表）
【０１６５】
【表１３】
（表１４ 潜在的ＰＣＲ分析のために収集した組織）
【０１６６】
【表１４】
（８４日目までの）予備的データは、上記試験物質の投与に関連し得る死はなく、臨床的徴候、体重、食物消費および体温に対する処理関連の副作用はないということを示した。注射部位の皮膚評点付けは、コントロール群および処理群の両方からの、少数の動物における浮腫または紅斑が時折生じる事例を示した。これらの皮膚刺激反応の発生率は、（ＨＩＶワクチン処理した）群２の動物においてわずかに高かったが、上記所見は重篤度が軽かった（非常にわずか〜わずか）。そして上記所見は、次の観察期間までに完全に消散した。臨床病理学に関する（５７日目までの）入手可能な予備データは、血液学、凝固または臨床化学パラメーターに対する処理関連の影響はないということを示した。
【０１６７】
結論として、本研究の条件下でしかも入手可能な予備データに基づき、上記ＨＩＶワクチン処方物の投与に関連する全身的な効果は、何も同定されなかった。局部的効果は、非常にわずかからわずかの紅斑または浮腫の予備例から成り、それは次の観察期間までに完全に消散したようだった。隔週与える上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンの４回の筋肉内（ＩＭ）注射、次いでまた隔週与える上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの４回の筋肉内（ＩＭ）注射は、ニュージーランドシロウサギにより十分に寛容された。
【０１６８】
（Ｄ．雄のニュージーランドシロウサギにおける、予備的ＤＮＡ／ＰＬＧ局部刺激寛容研究−筋肉内単回用量）
単回筋肉内（ＩＭ）注射により投与した場合の、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧの潜在的局部刺激効果を、雄のニュージーランドシロウサギにおいて評価するため、以下の研究を２群の雄のウサギ９匹をそれぞれ用いて行った。１日目に、各々のウサギに、上記試験物およびコントロール物質の０．５ｍＬの筋肉内（ＩＭ）注射を与えた。１群あたり３羽のウサギを投与の１日後（２日目）、投与の１週間後（８日目）、または投与の２週間後（１５日目）に剖検した。実験設計を、表１５に示す。
【０１６９】
潜在的毒性を、臨床的徴候、注射部位の皮膚評点付け、体重、総合的肉眼検査、および注射部位の顕微鏡評価に基づいて評価した。
【０１７０】
（表１５ 実験設計）
【０１７１】
【表１５】
ａ注射容積＝０．５ｍＬ
ＤＦ＝開発処方物
ＲＦ＝研究処方物
死亡は一つもなく、また体重に対するいかなる処理関連の影響もなかった。注射部位の明確な挫傷を、１日目から４日目の間に、群１のウサギ９匹中４匹および群２のウサギ９匹中５匹においてそれぞれ散発的に観察した。損傷は、注射部位番号２を除くすべての注射部位において注目された。注射部位におけるわずかの損傷のこの所見は、筋肉内（ＩＭ）注射に一致している。注射部位における皮膚のＤｒａｉｚｅ評点付けの結果を、表１６に提示する。１３日目から１５日目にかけて、群１の２羽のウサギ（ＩＭ部位３および４）に、そして１３日目から１４日目にかけて群２の１羽のウサギ（ＩＭ部位４）に、非常にわずかな浮腫があるのが注目された。剖検肉眼的所見を、注射部位に限定した。剖検肉眼所見は、赤く堅い領域、黄褐色領域、筋肉を覆う筋膜での出血、皮下出血領域からなった。これらの所見は、２日目の方がより有勢であった。注射部位の組織病理学的検査は、生理食塩水処理部位において針外傷に対する特徴的応答（筋線維変性および出血）を示した。試験物質処理部位の評価は、２日目に、全ての処方物に関して同様の、最小限の処理関連の炎症〜軽度の処理関連の炎症を示した。８日目に、肉芽腫性変化は、顕著な所見であり、処方物の間に違いはなかった。これらの肉芽腫性変化は、ＰＬＧ微粒子に対する公知の応答および／または再生プロセスと一致している。１５日目までに、上記組織病理的変化は、部分的［１％ＤＮＡ＋１００ｍｇＰＬＧ（開発（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）処方物および研究（ｒｅｓｅａｒｃｈ）処方物），２％ＤＮＡ＋５０ｍｇＰＬＧ，４％ＤＮＡ＋２５ｍｇＰＬＧ］にまたは完全［１００ｍｇ ＰＬＧ／ＰＶＡ］に消散した。また、表１６を参照のこと。
【０１７２】
（表１６ 皮膚刺激の結果）
【０１７３】
【表１６】
ＤＦ＝開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）処方物
ＲＦ＝研究（Ｒｅｓｅａｒｃｈ）処方物。
【０１７４】
結論として、単回筋肉内（ＩＭ）注射として雄ニュージーランドシロウサギに投与した場合、種々の濃度のＤＮＡ／ＰＬＧは、十分に寛容された。注射部位所見は、２日目に最も頻繁で最も強く（軽度〜最小限）、そして注射部位の所見は、回復期間の終期までに部分的にまたは完全に消散した。
【０１７５】
（Ｅ．ＰＣＲ注射部位評価を用いた複数（２）用量マウス免疫原性研究）
Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧ処方物の筋肉内（ＩＭ）注射部位での免疫原性および持続性を評価するため、１群あたり１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表１７で概説するように処理した。０日目および２８日目に動物に投与し、筋肉内（ＩＭ）注射部位を最終投与後４週目および８週目に取得した。本研究で試験した上記処方物は、上記毒性研究で用いた処方物と類似していた。
【０１７６】
（表１７ 実験設計）
【０１７７】
【表１７】
ａ筋肉内（ＩＭ）注射により、０日目および２８日目に投与した。
ｂ投与の４週間後
ｃ投与の８週間後
注射部位の上記ＰＣＲ分析の結果を、表１８に提示する。結果は、上記ＤＮＡ−ＰＬＧ処方物は、持続性という点で上記裸のＤＮＡのコントロールに匹敵するということを示した。上記Ｇａｇ−ＤＮＡは、最終投与後の４週間および８週間で、注射部位でまだ検出可能であるが、その残存する量は、不十分（上記注射されたＤＮＡの約１０−７％）であるということを示した。
【０１７８】
（表１８ 注射部位のＰＣＲ分析）
【０１７９】
【表１８】
ａ最終投与の４週間後
ｂ最終投与の８週間後
ｃ時間０での平均ＤＮＡコピー数を、コピー数／注射したＤＮＡのμｇに基づいて推定した。
【０１８０】
（結論）
これらの研究の条件下で、上記ＨＩＶワクチン処方物の単回投与および／または複数回投与は、動物モデル（ニュージーランドシロウサギおよびＢＡＬＢ／ｃマウス）において十分に寛容され、そしてさらに、上記処方物は、強力な免疫応答を惹起した。上記複数回用量ウサギ研究では、上記ＨＩＶワクチン処方物は、臨床的知見、体重、体温、食物消費、ならびに臨床病理学（血液学、凝固および臨床化学）に対して、処理関連の副作用を全く生じなかった。注射部位の皮膚評点付けは、非常にわずか〜わずかの紅斑または浮腫が時折生じる事例を示した。そしてその事例は、可逆的であるようだった。上記注射部位でのこれらの所見は、単回用量局所寛容ウサギ研究において観察される所見と一致している。後者において、組織病理学的評価は、上記注射部位において、処理に関連する最小限〜軽度の炎症を示し、上記回復期間の終期までに部分的にまたは完全に消散した。さらなる研究では、上記注射部位のＰＣＲ分析は、上記Ｅｎｖ−ＤＮＡ ＰＬＧは上記宿主ゲノムＤＮＡに組み込まないということ、および上記Ｇａｇ−ＤＮＡ ＰＬＧは４週間後にも８週間後にも上記注射部位で持続しないということを示した。
【０１８１】
上記複数回用量ウサギ研究では、上記計画臨床用量（１ｍＬ ＨＩＶ ＤＮＡワクチン／用量、０．５ｍＬ ＨＩＶタンパク質ワクチン／用量）を、臨床的投与経路（ＩＭ）により動物に与えた。しかし、ウサギに、上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンおよび上記ＨＩＶタンパク質ワクチンの各々の４用量を与えた。これは、上記意図される臨床的レジメン（各々３用量）より１用量だけ多かった。さらに、体重をもとにすると、ウサギ（約２．５Ｋｇ）での上記用量は、ヒト（約６０Ｋｇ）における同じ量より約２４倍高かった。それゆえ、上記臨床用量の投与および正常ヒト被験体に対するレジメンは、十分に寛容されることが予想される。
【０１８２】
さらに、Ｇａｇ抗体およびＥｎｖ抗体の高い力価を観測したので、上記処方物は免疫原性であることが示された。
【０１８３】
（実施例５：組換えタンパク質で初回刺激−追加刺激するレジメンを用いた、アカゲザルマカクにおけるプラスミドＤＮＡ／ＰＬＧ微粒子ＨＩＶワクチンの増大した効力）
以下の研究を実行し、免疫原性に対するＰＬＧ媒介性送達の効果を決定した。
【０１８４】
（Ａ．ベクター、タンパク質、ＰＬＧの調製）
本明細書に記載されるＨＩＶワクチンを、赤毛ザルマカクにおいて次のように評価した。プラスミドｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２およびプラスミドｐＣＭＶＫｍ２．ｏ−ｇｐ１４０．ＳＦ１６２を、本質的には米国特許第６，６０２，７０５号に記載のように調製した。ｇａｇ挿入部分およびｅｎｖ挿入部分をｐＣＭＶＫｍ２構築物から切除し、ｐＳＩＮＣＰ（ｐＳＩＮ１．５の改変版であって、本質的にはＨａｒｉｈａｒａｎら（１９９８）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（２）：９５０−８に記載されている）に連結することにより、シンドビス構築物を調製した。
【０１８５】
組換えＥｎｖタンパク質ｏ−ｇｐ１４０ＳＦ１６２ΔＶ２を、本質的にはＳｒｉｖａｓｔａｖａら（２００３）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１２４４−１１２５９に記載のように、ＣＨＯ細胞において産生し、精製した。
【０１８６】
カチオン性ＰＬＧ微粒子を、以下のように調製した。上記微粒子を、ＩＫＡホモジェナイザーを高速で用いて、１０ｍｌの５％ｗ／ｖのポリマー溶液を１ｍｌのＰＢＳと一緒に塩化メチレン中で乳化した。その後、その最初のエマルジョンを、ＣＴＡＢ（０．５％ ｗ／ｖ）を含む５０ｍｌの蒸留水に加えた。これにより、水中油中水エマルジョンの形成が生じ、これを、室温で１２時間６０００ｒｐｍで攪拌される、塩化メチレンを気化させた。生じた微粒子を、１０，０００ｇでの遠心分離により蒸留水中で４回洗浄し、凍結乾燥した。上記ＤＮＡを、１ｍｇのＤＮＡを１ｍｌの１Ｘ ＴＥ緩衝液に１００ｍｇの微粒子と一緒に、穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートすることにより、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子に吸着させた。その後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、上記微粒子をペレットにし、１Ｘ ＴＥ緩衝液で洗浄し、再度遠心分離し、そして５ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして凍結乾燥した。微粒子のサイズ分布を、粒子径分析器（Ｍａｓｔｅｒ ｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて決定した。
【０１８７】
ＤＮＡ構築物を、上記のようにＰＬＧ粒子上に吸着させた。同様に、ＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質を、以下のようにアニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着させた。１０ｍｌの６％ ｗ／ｖポリマー溶液を、ＳＤＳ（１％ ｗ／ｖ）を含む４０ｍｌの蒸留水と一緒に塩化メチレン中で、１０ｍｍのプローブを使って高速でホモジェナイズすることにより、微粒子を調製した。これにより、水中油エマルジョンが生じ、そのエマルジョンを室温で１２時間１，０００ｒｐｍで攪拌し、上記塩化メチレンを気化させた。その生じた微粒子を、３８μｍのメッシュを通して濾過し、３回蒸留水で洗浄し、そして凍結乾燥した。上記微粒子のサイズの分布を粒子径分析器（Ｍａｓｔｅｒ ｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて決定した。
【０１８８】
５０ｍｇの凍結乾燥したＳＤＳブランク微粒子を、０．５ｍｇのｐ５５ ｇａｇタンパク質と一緒に、ｐＨ９の６Ｍ尿素を含む２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液１０ｍｌ中でインキュベートした。５０ｍｇの凍結乾燥したＤＳＳブランク微粒子を、０．５ｍｇのｇｐ１２０タンパク質とともに１０ｍＬのＰＢＳ中でインキュベートした。粒子を、室温で５時間、研究室の振盪機（Ａｌｉｑｕｏｔ ｍｉｘｅｒ，Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に放置した。上記微粒子を、遠心分離によりインキュベーション媒体から分離し、上記ＳＤＳペレットを一回、６Ｍの尿素を含むホウ酸塩緩衝液で洗浄し、その後、蒸留水で３回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０１８９】
微粒子に吸着するタンパク質の負荷レベルを、１０ｍｇの上記微粒子を５％ ＳＤＳ−０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液２ｍｌ中に室温で溶解することにより決定した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により測定した。ブランク微粒子および吸着微粒子の両方についてのゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ分析器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。
【０１９０】
（Ｂ．ワクチン接種）
アカゲザル免疫化研究を行って、組換えタンパク質を用いた初回刺激−追加刺激レジメンにおける、２つのＤＮＡワクチンベクターおよびカチオン性ＰＬＧ微粒子ＤＮＡ送達系を評価した。５匹のアカゲザルマカクの群を、筋肉内注射により免疫化した。ＰＬＧ微粒子に吸着しているか吸着していない、ＨＩＶ ＳＦ２ Ｇａｇ（０．５ｍｇ）およびＨＩＶ ＳＦ１６２ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（１．０ｍｇ）をコードするＤＮＡワクチンで、０週目、４週目、１４週目に注射した。上記動物を、２９週目に、アニオン性ＰＬＧ微粒子上に吸着した酵母由来のｐ５５ Ｇａｇタンパク質（Ｇａｇ／ＰＬＧ）で追加刺激した。最後に、上記動物を、３８週目および７５週目に、水中油ＭＦ５９アジュバントと共に投与した、ＣＨＯ細胞由来のＶ２領域欠失オリゴマーｇｐ１４０Ｅｎｖタンパク質（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）を用いて追加刺激した。
【０１９１】
上記ワクチン組成物の免疫原性を、抗体（ＥＬＩＳＡ，中和）の定量測定および定性測定ならびにＴ細胞の応答（リンパ球増殖，細胞内サイトカイン染色，ＣＴＬ）により、各々の免疫化後の様々な時点で評価した。
【０１９２】
（Ｃ．抗体アッセイ）
Ｅｎｖタンパク質およびＧａｇタンパク質に対する抗体応答を、酵素結合免疫反応吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。両方のＥＬＩＳＡに関し、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中５μｇ／ｍｌのＥｎｖタンパク質５０μｌまたはＰＢＳ（ｐＨ７．０）中５μｇ／ｍｌのＧａｇタンパク質５０μｌで、一晩４℃で被覆した。上記被覆ウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１５０μｌで、３７℃にて１時間ブロッキングした。血清のサンプルをまず、ブロッキング緩衝液中に１：２５または１：１００で希釈し、次いで３倍ずつの段階希釈を行った。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗サルＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈した）を用いて検出し、３７℃で１時間インキュベートした。発色のため、３，３’，５，５’テトラメチルベンズジジン（ＴＭＢ）を、製造者の指示に従って１５分間インキュベートし、そしてその反応を、２ＮのＨＣｌを加えることにより停止させた。その後、上記アッセイプレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４５０ｎｍの吸収波長にて読み取った。血清標準を、各々のマイクロタイタープレート上に含んだ。上記標準の参照値を、上記サンプルＥＬＩＳＡ力価の正規化のために用いた。上記力価は、上記血清希釈の逆数を表し、光学密度０．５を与える。ウイルス中和抗体を、標準的技術を用いて、同族のＨＩＶ−１ ＳＦ１６２ウイルスに対して評価した。
【０１９３】
（Ｄ．アカゲザルＰＢＭＣの精製およびＢリンパ芽球様様細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）の誘導）
アカゲザルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ハイパーク勾配にヘパリン化した全血から分離した。アカゲザルＢリンパ芽球様細胞株を誘導するために、ＰＭＢＣを、０．５μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、上記５９４Ｓ細胞株からヘルペスウイルスのパピオ含有培養上清に曝露した。アカゲザルＰＢＭＣを、２４ウェルプレート中の、１０％の熱非働体化ウシ胎仔血清（ＡＲ１０）を補充したＡＩＭ−Ｖ：ＲＰＭＩ１６４０（５０：５０）培養培地（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌ中で、１ウェル当たり２×１０６〜３×１０６個の細胞にて８日間、培養した。抗原特異的細胞を、ｇａｇペプチドまたはｅｎｖペプチド（１０．７μｇ／ｍｌの総ペプチド）のいずれかのプールの添加により刺激した。組換えヒトＩＬ−７（１５ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、培養の開始時に添加した。ヒトｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，２０ ＩＵ／ｍｌ，Ｃｈｉｒｏｎ）を、１日目、３日目および６日目に添加した。
【０１９４】
（Ｅ．ＣＴＬ活性に関する５１Ｃｒ放出アッセイ）
自己のＢ−ＬＣＬを、ｇａｇ（ｒＶＶ ｇａｇ−ｐｏｌＳＦ２）またはｅｎｖ（ｒＶＶ ｇｐ１６０ ｅｎｖＳＦ１６２）を発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）を用いて感染させ、その後、一晩Ｎａ２［５１Ｃｒ］Ｏ４（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；２．５×１０５のＢ−ＬＣＬあたり１０μＣｉ）で標識し、そして洗浄した。組換えＶＶ（組換えワクチニアウイルス）に感染した５１Ｃｒ標識Ｂ−ＬＣＬ（１丸底ウェル当たり２５００個）を、培養ＰＢＭＣの３回の段階希釈を含む複製ウェルに添加した。非標識Ｂ−ＬＣＬ（１ウェル当たり１×１０５個）を、非特異的細胞溶解を防止するために添加した。４時間後、５０μｌの培養の上清を取得し、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）に添加し、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて計測した。溶解した標的から放出された５１Ｃｒを、以下の式：
（特異的５１Ｃｒ放出パーセント）＝１００％×（平均実験放出−自然発生放出）／（最大放出−自然発生放出）
で正規化した。ここで、
自然発生放出＝ＰＢＭＣの不在下で標的細胞から放出された毎分平均カウント（ｃｐｍ）であり、そして
最大放出＝０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在下で標的細胞から放出された平均ｃｐｍ
である。ＰＢＭＣの二回の段階希釈（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）の際、正味の特異的溶解（抗原特異的溶解−非特異的溶解）が１０％以上の場合、応答を陽性として評点付けた。
【０１９５】
（Ｆ．リンパ球増殖アッセイ）
ｐ５５ Ｇａｇタンパク質（３μｇ／ｍｌ）またはＥｎｖペプチド（１６μｇ／ｍｌ）のプールの不在下または存在下で、２×１０５個のＰＢＭＣを、平底マイクロタイターウェル中で、０．２ｍｌの容積のＡＲ１０中でインキュベートした。 ６つのレプリカ培養を確率した。４日間のインキュベーションの後、［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えた（１μＣｉ／ウェル）。一晩のインキュベーションに続き、培養物をガラス微小繊維フィルタ上に得た。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、細胞の［３Ｈ］ＴｄＲ取り込みを測定した。
【０１９６】
（Ｇ．細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）
抗原ｇａｇペプチドプール３０μｇ／ｍｌまたはｅｎｖペプチドプール３０μｇ／ｍｌ）の不在下または存在下で、アカゲザルＰＢＭＣを３７℃にて１晩培養した。抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を同時刺激の供給源として添加し、ブレフェルジンＡ（１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、サイトカインの分泌を防止するために加えた。１晩のインキュベーションの後、ＰＢＭＣを、細胞表面のＣＤ４（抗ＣＤ４アロフィコシアニン結合体、クローンＳＫ３、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＣＤ８（抗ＣＤ８α ＰｅｒＣＰ結合体、クローンＳＫ１、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）について染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて透過性処理し、そしてその後、細胞内ＩＦＮ−γ（モノクローナル抗体４Ｓ．Ｂ３、フィコエリトリン結合体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および細胞内ＴＮＦ−α（ＭＡｂ１１、ＦＩＴＣ結合体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）について染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）を用いて分析した。
【０１９７】
（Ｈ．ＤＮＡワクチンベクターの比較）
ＰＬＧを伴わないＤＮＡベクターの免疫原性を評価した。抗Ｇａｇ抗体について、最初の免疫原性レジメンとして生理食塩水中にて加えた場合、（ｐＣＭＶもｐＳＩＮＣＰも）いずれのベクターも有効ではなかった。しかし、Ｇａｇ／ＰＬＧタンパク質抗原を用いて、裸のｇａｇ ＤＮＡで初回刺激した動物の追加刺激は、著しい抗体応答を迅速に惹起した。同様に、Ｅｎｖ／ＭＦ５９タンパク質は、抗Ｅｎｖ抗体の量を迅速にブーストした。いかなる時にも、ｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰにより誘導される抗体の力価に有意差はなかった。
【０１９８】
ヘルパーＴ細胞の応答を、リンパ球増殖（ＬＰＡ）および細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）の両方により測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、組換えｐ５５ ｇａｇタンパク質で刺激するか、または合成ｅｎｖペプチドのプールで刺激した。抗体応答と同様に、上記裸のｐＣＭＶ ＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡワクチンは、ＬＰＡ応答もＩＣＳ応答も誘導するのにそれほど有効ではなかった。しかし、Ｇａｇ ＬＰＡ応答に関して、ｐＳＩＮＣＰは、一般的に、より効力があるようだった。上記ｐＳＩＮＣＰ群とｐＣＭＶ群との間の統計的有意性は、２０週目および２７週目（それぞれ、ｐ＝０．０１８，０．０２３）に達せられた。
【０１９９】
同様に、ｐＳＩＮＣＰは、Ｅｎｖ ＬＰＡ応答を惹起するのに、より効果的であるようだった。群間で有意に高いＬＰＡ応答を、２０週目、２４週目および２７週目のＤＮＡ初回刺激の間（それぞれｐ＝０．０２８，０．０２２および０．０４４）ならびに４４週目の上記Ｅｎｖタンパク質の追加刺激の後（ｐ＝０．０１６）に観察した。
【０２００】
さらにＴ細胞応答を定量するために、ＰＢＭＣを抗原で１晩刺激し、そしてその後、上記ＰＢＭＣを、ＰＥ結合体化抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合体化抗ＴＮＦ−α ｍＡｂ（細胞内）で染色した。ＰＢＭＣをＡＰＣ結合体化抗ＣＤ４およびＰｅｒＣＰ結合体化抗ＣＤ８で対比染色し、サイトカイン陽性細胞、特に最も有勢な抗原提示細胞であったＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α二重陽性細胞について、フローサイトメトリーで分析した。ｐＳＩＮＣＰを受ける動物群とｐＣＭＶを受ける動物群との間で、抗原特異的Ｔ細胞の頻度の有意差は見られなかった。
【０２０１】
ＣＴＬの測定のために、ｇａｇペプチドのプールまたはｅｎｖペプチドのプール、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で、ＰＢＭＣを培養した。８日目に、ＰＢＭＣ培養を取得し、段階希釈し、そしてｇａｇ（ｒＶＶ ｇａｇｐｏｌＳＦ２）またはｅｎｖ（ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖＳＦ１６２）を発現する組換えワクチニアベクターを用いて前日に感染させた５１Ｃｒ標識自己Ｂ−ＬＣＬを含むマイクロタイターウェルに添加した。ｐＣＭＶは、Ｇａｇ ＣＴＬ応答を惹起する点で、ｐＳＩＮＣＰより有効であるようで、上記研究の過程の間ずっと、非常に沢山の応答を伴った。
【０２０２】
要約すれば、ｐＣＭＶの裸のＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰの裸のＤＮＡワクチンの両方は、ＨＩＶ ＧａｇおよびＨＩＶ Ｅｎｖに対して抗体応答およびＴ細胞応答を誘導した。
【０２０３】
（Ｉ．ＤＮＡワクチンのＰＬＧ微粒子送達）
動物をまた、ＤＮＡ／ＰＬＧ組成物を用いて上記のように免疫化し、ＰＬＧ微粒子に吸着したＤＮＡワクチンの免疫原性を評価した。上記ＨＩＶ ＤＮＡワクチンのカチオン性ＰＬＧ微粒子上への吸着は、（特に抗体応答に関する）免疫応答を増強するのに有効であった。ＰＬＧ送達は、ｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰのいずれかを受けるマカクにおける抗体力価を、有意に増加した。ＤＮＡ初回刺激フェーズの間ずっと、ＰＬＧ群の抗ｇａｇ力価は、測定した全ての時点において、裸のＤＮＡに比べて有意に高く（ｐ＝０．０００３〜０．０４）、力価のピーク値は約１０００倍高かった（図１）。タンパク質追加刺激の後、これらの差は維持され、ｐＣＭＶ／ＰＬＧおよびｐＳＩＮＣＰ／ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較して、約１０倍〜２５倍高かった（ｐ＝０．０２〜０．０４）。抗Ｅｎｖ抗体の応答はまた、上記ＰＬＧ群において有意に高かったが、ＤＮＡ初回刺激後（第２のＤＮＡの投与の２週から６週後）のピークの応答においてのみであった（Ｐ＝０．００３〜０．０１５）。タンパク質追加刺激の後およびタンパク質追加刺激の間、上記抗ｅｎｖ力価は、全ての群において類似していた。上記ＰＬＧ／ＤＮＡワクチン群については、抗体応答のピークを、２回目のＤＮＡ免疫化の後に取得したが、一方、裸のＤＮＡによる応答のピークには、３回の免疫化が必要だった。
【０２０４】
上記ＰＬＧ／ＤＮＡワクチンは、ＬＰＡおよびＩＣＳにより測定した場合、ＧａｇおよびＥｎｖに対するヘルパーＴ細胞応答を誘導した。裸のＤＮＡ群およびＰＬＧ／ＤＮＡ群における応答の規模は一般的に同様であったが、まとめられた場合（ｐＣＭＶ＋ｐＳＩＮＣＰ）、ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較して、Ｇａｇについては６週間目に、そしてＥｎｖについては１６週間目に、有意に高い応答を起こした（ｐ＝０．０５）。ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカイン産生の頻度は、ＩＣＳにより測定した場合、第２のＤＮＡの投与の二週間後に、裸のＤＮＡと比較して、上記Ｇａｇ／ＰＬＧ群（ｐＣＭＶ＋ｐＳＩＮＣＰ群の結合体）においては応答の強化を示した（ｐ＜０．０５）。上記Ｅｎｖ ＤＮＡワクチンに関しては、違いが全く観察されなかった。ＣＤ８ Ｔ細胞応答を、ＩＣＳおよび５１Ｃｒ放出により測定した。ＩＣＳによって、その応答は一般的に低く、群間に違いは見られなかった。培養ＰＢＭＣの５１Ｃｒ放出により、良好なＣＴＬ応答がＧａｇに対して検出されたが、Ｅｎｖに対しては検出されなかった。本研究の過程にわたるＧａｇ ＣＴＬ応答の総数は、ＰＬＧ群においては２４、そして裸のＤＮＡ群においては１８であり、上記ｐＣＭＶ／ＰＬＧ群における抗Ｇａｇ−ＣＴＬの明らかに早期の開始を伴った（５匹の動物のうち、３匹の動物が最初のＤＮＡの二週間後）。
【０２０５】
結論として、ＨＩＶ ＤＮＡワクチンのＰＬＧ送達は、抗体免疫応答および細胞性免疫応答を誘導するのに有効であった。さらに、ＰＬＧは、裸のＤＮＡと比較すると免疫応答を有意に強化した。抗体応答の特に強力な強化が、上記ｐＣＭＶ ＤＮＡワクチンおよびｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡワクチンの両方に関して観察された。Ｇａｇに関しては、本研究の上記ＤＮＡ初回刺激フェーズおよびタンパク質追加刺激フェーズの両方の間に、これが当てはまる。応答の早期の開始、応答の規模の増大、および応答の頻度の増加により見られるように、いくつかの場合では、細胞性免疫応答はまた、ＤＮＡ初回刺激の間にＰＬＧにより強化される。
【０２０６】
（Ｊ．タンパク質追加刺激）
上記動物を、２９週目にアニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着した組換えＧａｇタンパク質を用い、その後３８週目および７５週目にＭＦ５９アジュバント中の組換えＥｎｖを用いて、追加刺激した（それぞれ最終ＤＮＡ免疫化の１５週間後、２４週間後、５１週間後）。抗体の力価が全ての群において増加した（図１、図２）。ｇａｇタンパク質を用いて追加刺激した後、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ−ＤＮＡで初回刺激された動物における上記抗ｇａｇ抗体の力価は、裸のＤＮＡで初回刺激された動物より約１０倍高かった。上記抗ｇａｇ力価は、ＤＮＡ初回刺激により達成されるピークの力価に等しい（ＤＮＡ／ＰＬＧ）か、またはＤＮＡ初回刺激により達成されるピークの力価を超えていた（ＤＮＡ／生理食塩水）。Ｅｎｖに関しては、ＤＮＡ初回刺激の後、全ての群の力価が、ピークの力価を超えて著しく増加された（ｐ＝０．０００２〜０．０２）（図２）。第２のＥｎｖタンパク質追加刺激は、抗体の力価を、第１のＥｎｖタンパク質追加刺激の後に見られるレベルにまで回復した。ＤＮＡワクチン初回刺激の後、ウイルス中和抗体応答は、どの動物においても検出されなかった。しかし、１回および２回のタンパク質追加刺激免疫化の後、増加する力価が観察され、全幾何平均力価（それぞれ８または６４）（ｐ＝０．０００７１）であった。（図３）。これらの時点の両方において、上記力価は、種々のワクチン群の間で統計的に異なっていた。
【０２０７】
タンパク質免疫化の後、Ｔ細胞の応答もまた、増加されるようであった。Ｇａｇに関しては、タンパク質追加刺激の後、平均ＳＩが、基準線の４倍〜７倍に増加し、応答細胞の数が２０のうち、７から１４に増加した。しかし、上記応答の規模は、ＤＮＡ初回刺激の後のピーク時に見られる規模ほど大きくはなかった。
【０２０８】
Ｅｎｖタンパク質追加免疫化の後、平均ＳＩが、基準線を越えて１１倍〜２５倍増加し、そしてこれらの応答は、ＤＮＡ初回刺激の後測定した応答よりも大きかった。ＩＣＳにより、Ｇａｇタンパク質の追加刺激の後、観察された増加は、ほとんどまたは全くなかったが、各々のＥｎｖタンパク質の追加刺激の後、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌する細胞の比率の実質的増加が、見られた。さらに、第２のタンパク質追加刺激後の上記ＩＣＳ応答の全体規模は、第１のタンパク質追加刺激後のＩＣＳ応答の全体規模に比べて大きく（ｐ＝０．０００８）（図４）、何匹かの動物中では、応答がＣＤ４ Ｔ細胞の４％に接近していた。
【０２０９】
要約すれば、ＤＮＡ初回刺激したマカクを組換えＧａｇタンパク質および組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激すると、抗体応答およびＴ細胞応答の迅速かつ有意な強化を生じた。いくつかの場合、これらの応答の規模は、ＤＮＡ初回刺激後に得られる応答の規模よりも著しく大きかった。
【０２１０】
従って、本明細書に記載のＤＮＡ／ＰＬＧワクチンは、アカゲザルマカクにおいて強力な免疫応答を誘導し、特に抗体応答ならびにヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞に対する効力を強化した。ＤＮＡ／ＰＬＧで初回刺激されたマカクを、組換えタンパク質で追加刺激する有効性（Ｅｎｖタンパク質追加刺激後の、Ｔ細胞からのＴｈ−１型サイトカインの強力な産生を含む）は、また確立された。
【０２１１】
（実施例６：ヒト研究）
上記ＨＩＶワクチン試験（および他の成果）からのデータに基づけば、偽薬コントロールにおける深刻で有害な経験の割合は、約３．５％であった。他の組換え糖タンパク質抗原をＭＦ５９と一緒に使用した広範な安全性データは、そのようなワクチン抗原は、ＭＦ５９と一緒に投与された場合、非常に安全で一般的に十分に寛容されるということを示す。さらに、これらのワクチンは、特定の抗原に対して、強力な抗体応答を惹起した。ＤＮＡ／ＰＬＧで初回刺激されたマカクを、組換えタンパク質で追加刺激する有効性（Ｅｎｖタンパク質追加刺激の後、Ｔ細胞からのＴｈ−１型サイトカインの強力な産生を含む）は、また証明された。
【０２１２】
ヒト研究のための例示的なプロトコールを、以下の表１９に示す。サブタイプＢに関して例示されているが、上記プロトコールはまた、ＨＩＶの他の株または他のサブタイプに関して、そのままでか、または改変されて使われ得ることが容易に明らかである。
【０２１３】
（表１９ ヒトプロトコール）
【０２１４】
【表１９】
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｇａｇ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図１Ａは、０週、４週、および１４週にプラスミドＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｇａｇ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）についての相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｇａｇ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図１Ｂは、０週、４週、および１４週にｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｇａｇ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）についての相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｅｎｖ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図２Ａは、０週、４週、および１４週にプラスミドＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激した動物の、相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示す。抗Ｅｎｖ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）に対する相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＮＡワクチンによって誘発された抗Ｅｎｖ抗体応答に対するＰＬＧ粒子の効果を示すグラフである。図２Ｂは、０週、４週、および１４週にｐＳＩＮＣＰ ＤＮＡで免疫し、次いで３８週および７５週に、ＭＦ５９と共に処方した組換えＥｎｖタンパク質で追加刺激された動物の、相乗平均力価を示す。抗Ｅｎｖ抗体は、裸のｐＣＭＶ（黒丸）およびＰＬＧ／ｐＣＭＶ（白丸）に対する相乗平均ＥＬＩＳＡ力価としてプロットされ、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図３】図３は、ＤＮＡ投与後の相乗平均中和力価を示すグラフである。
【図４】図４は、ＤＮＡワクチンによって初回刺激されたＴ細胞応答に対する、Ｅｎｖタンパク質追加刺激の効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物であって、
少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇコード配列またはＥｎｖコード配列を含む核酸発現ベクター；および
ＰＬＧ
を含む、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＰＬＧの濃度が、前記核酸発現ベクターの濃度より約５と１００倍の間で高い、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
請求項２に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記核酸の濃度が約１０μｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間であり、そして前記ＰＬＧの濃度が約１００μｇ／ｍＬと１００ｍｇ／ｍＬの間である、ワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、ここで、１用量あたりの前記核酸の濃度が約１μｇ／用量と５ｍｇ／用量の間であり、かつ１用量あたりの前記ＰＬＧの濃度が、約１０μｇ／用量と１００ｍｇ／用量の間である、ワクチン組成物。
【請求項５】
表１または表２において記載される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
表９のカラム２において記載される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ＨＩＶワクチン組成物であって、
オリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）；および
薬学的に受容可能な賦形剤
を含む、ＨＩＶワクチン組成物。
【請求項８】
前記ｏ−ｇｐ１４０の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの間である、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項９】
１用量あたりの前記ｏ−ｇｐ１４０の濃度が、約１００μｇ／用量である、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１０】
表３または表１１において記載される、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１１】
さらにアジュバントを含む、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１２】
前記アジュバントが、ＭＦ５９またはＣｐＧである、請求項１１に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１３】
前記アジュバントがＭＦ５９であり、そして該ＭＦ５９が表４に記載される、請求項１２に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１４】
ＨＩＶワクチンであって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ Ｅｎｖ ＤＮＡワクチン；
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ Ｇａｇ ＤＮＡワクチン；および
請求項７〜１３のいずれか１項に記載のＨＩＶワクチン
を含む、ＨＩＶワクチン。
【請求項１５】
被験体において免疫応答を起こさせる方法であって、
（ａ）該被験体に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、
（ｂ）工程（ａ）の投与の後に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物を投与する工程を包含し、かつ
工程（ｂ）が、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物の複数回投与を包含し、かつ
工程（ｂ）が、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物の複数回投与を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、１ヶ月間隔で２回または３回の投与を包含し；
工程（ｂ）が、１、２または３ヶ月間隔で２回または３回の投与を包含し；かつ
工程（ａ）の投与と工程（ｂ）の投与との間の時間が、１〜５ヶ月である、方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに１項に記載の方法であって、ここで工程（ａ）が、少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１５または１８に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡワクチン、および請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチンを同時投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、少なくとも１回の投与が、筋内または皮内である、方法。
【請求項２３】
オリゴマーＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０タンパク質を作製する方法であって、以下の工程：
ｇｐ１４０をコードする核酸を宿主細胞に導入する工程；
ｇｐ１４０が細胞において発現される条件下で宿主細胞を培養する工程；および
オリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）タンパク質を宿主細胞から単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記ｏ−ｇｐ１４０が、前記細胞から分泌され、そして該細胞上清から単離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ ＤＮＡワクチンを作製する方法であって、
核酸が無菌のＰＬＧ微粒子に結合して、ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを形成するように、１つ以上のＨＩＶポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、該ＰＬＧ微粒子とを結合させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
さらに前記ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを、凍結乾燥する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載のＨＩＶワクチンを作製する方法であって、ｏ−ｇｐ１４０とアジュバントとを結合させる工程を包含する、方法。
【請求項１】
ＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物であって、
少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇコード配列またはＥｎｖコード配列を含む核酸発現ベクター；および
ＰＬＧ
を含む、ＨＩＶ ＤＮＡワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＰＬＧの濃度が、前記核酸発現ベクターの濃度より約５と１００倍の間で高い、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
請求項２に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記核酸の濃度が約１０μｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間であり、そして前記ＰＬＧの濃度が約１００μｇ／ｍＬと１００ｍｇ／ｍＬの間である、ワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、ここで、１用量あたりの前記核酸の濃度が約１μｇ／用量と５ｍｇ／用量の間であり、かつ１用量あたりの前記ＰＬＧの濃度が、約１０μｇ／用量と１００ｍｇ／用量の間である、ワクチン組成物。
【請求項５】
表１または表２において記載される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
表９のカラム２において記載される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ＨＩＶワクチン組成物であって、
オリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）；および
薬学的に受容可能な賦形剤
を含む、ＨＩＶワクチン組成物。
【請求項８】
前記ｏ−ｇｐ１４０の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの間である、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項９】
１用量あたりの前記ｏ−ｇｐ１４０の濃度が、約１００μｇ／用量である、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１０】
表３または表１１において記載される、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１１】
さらにアジュバントを含む、請求項７に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１２】
前記アジュバントが、ＭＦ５９またはＣｐＧである、請求項１１に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１３】
前記アジュバントがＭＦ５９であり、そして該ＭＦ５９が表４に記載される、請求項１２に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１４】
ＨＩＶワクチンであって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ Ｅｎｖ ＤＮＡワクチン；
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ Ｇａｇ ＤＮＡワクチン；および
請求項７〜１３のいずれか１項に記載のＨＩＶワクチン
を含む、ＨＩＶワクチン。
【請求項１５】
被験体において免疫応答を起こさせる方法であって、
（ａ）該被験体に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、
（ｂ）工程（ａ）の投与の後に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチン組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物を投与する工程を包含し、かつ
工程（ｂ）が、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物の複数回投与を包含し、かつ
工程（ｂ）が、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのワクチン組成物の複数回投与を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、
工程（ａ）が、１ヶ月間隔で２回または３回の投与を包含し；
工程（ｂ）が、１、２または３ヶ月間隔で２回または３回の投与を包含し；かつ
工程（ａ）の投与と工程（ｂ）の投与との間の時間が、１〜５ヶ月である、方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに１項に記載の方法であって、ここで工程（ａ）が、少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１５または１８に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡワクチン、および請求項７〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＨＩＶワクチンを同時投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が少なくとも１つのＨＩＶ Ｇａｇワクチンおよび少なくとも１つのＨＩＶ Ｅｎｖワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、少なくとも１回の投与が、筋内または皮内である、方法。
【請求項２３】
オリゴマーＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０タンパク質を作製する方法であって、以下の工程：
ｇｐ１４０をコードする核酸を宿主細胞に導入する工程；
ｇｐ１４０が細胞において発現される条件下で宿主細胞を培養する工程；および
オリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）タンパク質を宿主細胞から単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記ｏ−ｇｐ１４０が、前記細胞から分泌され、そして該細胞上清から単離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＩＶ ＤＮＡワクチンを作製する方法であって、
核酸が無菌のＰＬＧ微粒子に結合して、ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを形成するように、１つ以上のＨＩＶポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、該ＰＬＧ微粒子とを結合させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
さらに前記ＤＮＡ／ＰＬＧ ＨＩＶワクチンを、凍結乾燥する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載のＨＩＶワクチンを作製する方法であって、ｏ−ｇｐ１４０とアジュバントとを結合させる工程を包含する、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５０２２２８（Ｐ２００６−５０２２２８Ａ）
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４３５５９（Ｐ２００４−５４３５５９）
【出願日】平成１５年１０月７日（２００３．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３１９３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２８６０
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月７日（２００３．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３１９３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２８６０
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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