ＨＩＶ感染を阻害する方法および組成物
本発明はＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定するための新規方法を提供する。抗ＨＩＶ薬を、イソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）の生物学的活性、例えばそのイソペプチダーゼ活性またはウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）のような他の分子へのその結合を調節する能力について、試験化合物をスクリーニングすることによって同定する。かかるＩｓｏＴモジュレーターを、さらにＨＩＶ感染またはＨＩＶ複製の指標である活性を阻害する活性について試験することができる。これらの新規な抗ＨＩＶ薬はＨＩＶ感染およびＨＩＶ感染に関するもしくはＨＩＶ感染によってもたらされる状態の、予防または処置に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は米国仮出願第６０／６７３，６２３（出願日：２００５年４月２１日）に基づき合衆国法典第３５巻、１１９条（ｅ）の優先権を主張する。先の出願の開示はその全体をあらゆる目的のために引用し、本明細書の一部とする。
【０００２】
発明分野
本発明は、一般的にＨＩＶ感染を阻害する化合物を同定するための方法と、当該化合物の治療的に関する。より具体的には、本発明はイソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）の阻害剤をスクリーニングすること、そしてかかる阻害剤をＨＩＶの処置または予防のために使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はレトロウイルス科に属するレンチウイルスである。性的接触および妊娠期間中のＨＩＶの感染は世界中のＡＩＤＳ症例のほぼ９０％を占めると概算された。この感染は、感染個体の体液、例えば精液、膣分泌物または血液に曝露されたとき、性器の粘膜または胎盤を通じてＨＩＶが通過して引き起こされる。のこりのＡＩＤＳ症例はＨＩＶに汚染された血液の輸血、静脈内薬剤使用者間の針の共有、侵襲処置におけるＨＩＶ汚染体液への事故的曝露、そして感染ウイルスが受容ヒト組織へ直接接触することができる他の状況のためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在利用可能なＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの処置用薬剤は満足のいくものではない。ＨＩＶを処置するための一般薬剤、例えばＡＺＴまたはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の毒性または望ましくない副作用は、有効医薬濃度で使用したときそれらの抗ウイルス活性と相容れない。したがって、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染を予防および処置するためのよりよい他の化合物に対するこの分野における要求は未だに存在する。本発明は、このおよび他の要求に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
ある態様において、本発明はＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定するための方法を提供する。当該方法は、イソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）分子の生物学的活性を試験化合物の存在下でアッセイして、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定することを必要とする。これらの方法は、同定した化合物のＨＩＶ感染阻害能をさらに試験することを含むことができる。ある方法では、アッセイする生物学的活性はＩｓｏＴ分子のイソペプチダーゼ活性または他の分子（例えばユビキタンまたはＶｐｒ）とのその結合である。また、ＩｓｏＴ分子をコード化する遺伝子の発現であってもよい。典型的には、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子は哺乳類細胞に由来する。好ましい態様において、ヒトＩｓｏＴ分子を使用する。
【０００６】
これらのスクリーニング法のいくつかにおいて、同定した化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理した人工ＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する。これらの方法のいくつかにおいて、使用するＨＩＶ許容細胞はＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である。ある方法において、ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする。
【０００７】
本発明の他の方法において、同定されたＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する。使用される宿主細胞は２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である。いくつかの方法では、宿主細胞を、細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトする。
【０００８】
関連する局面において、本発明はＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法には、第１に試験化合物をスクリーニングしてＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとのその結合を下方制御するＩｓｏＴ調節化合物を同定すること、次に同定したＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染阻害能について試験することを含む。典型的には、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子は哺乳類細胞に由来する。好ましい態様において、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子はヒトＩｓｏＴである。
【０００９】
これらの方法のいくつかにおいて、ＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理したＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する。いくつかの方法において、使用されるＨＩＶ許容細胞はＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である。いくつかのスクリーニング法において、ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする。
【００１０】
他の方法において、ＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する。使用される宿主細胞は２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である。いくつかの方法では、宿主細胞を、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトする。
【００１１】
他の態様において、本発明は対象のＨＩＶ感染を処置する方法を提供する。かかる方法は、ＨＩＶ感染を有する対象に、有効量のＩｓｏＴ調節化合物を含む医薬組成物を投与することを必要とする。ＩｓｏＴ調節化合物はＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性、ＶｐｒとのＩｓｏＴ結合またはＩｓｏＴをコード化する遺伝子の発現を下方制御することができる。いくつかの方法において、使用するＩｓｏＴ調節化合物はヒトＩｓｏＴを下方制御することができる。いくつかの方法において、使用するＩｓｏＴ調節化合物はインビトロでＩｓｏＴ発現細胞におけるＨＩＶ複製を阻害することができる。これらの治療法において、ＩｓｏＴ調節化合物を既知の抗ＨＩＶ薬剤と共に投与することがある。いくつかの方法において、ＩｓｏＴ阻害薬剤はＩｓｏＴ活性を特異的に阻害する本発明によって同定された化合物である。他の方法において、ＩｓｏＴ阻害薬剤はＩｓｏＴの発現または細胞レベルを特異的に下方制御する核酸分子、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡである。
【００１２】
本発明の性質および利点の更なる理解を、明細書および特許請求の範囲の残りの部分を参照することによって理解することができる。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１ＢはＶｐｒのＩｓｏＴへの結合を示す：（Ａ）概略図およびＩｓｏＴプレイクローンの位置を酵母−２−ハイブリッドを全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡと比較して同定した。プレイクローンは２個のＵＢＡドメインを有するＣ末端２２７アミノ酸を含む。本明細書で使用する全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡクローンを膵臓由来のｃＤＮＡライブラリから増幅した。Ｃ３３５の相対位置（活性部位システイン）を示す。（Ｂ）ＶｐｒとＩｓｏＴの特異的相互作用を示すために、β−ガラクトシダーゼフィルターリフトアッセイを使用して酵母−２−ハイブリッドをアッセイする。ＶＰ１６は空ベクターである。
【００１４】
図２Ａ−２Ｃは野生型ＩｓｏＴ過剰発現がＨＩＶ−１ウイルスの力価を増加させるが、活性部位変異はそうではないことを示す：（Ａ）全長（ＦＬ）野生型ＩｓｏＴの過剰発現がトランスフェクション後２４および４８時間で偽ウイルス過剰発現を増加させる。２９３Ｔ細胞をＩｓｏＴをコード化する第４ｃＤＮＡの存在下（＋）または非存在下（−）において３個の偽ウイルスプラスミドとコトランスフェクトした。レポーターウイルス上清をトランスフェクション後２４または４８時間で回収し、２９３Ｔ標的細胞におけるレポーター活性についてアッセイした。細胞溶解物を平行してウェスタン分析で、ＩｓｏＴ特異的抗体を使用して内因性ＩｓｏＴ発現ならびにＩｓｏＴ過剰発現について分析した。１列目はプラスミドでトランスフェクトしていない、トランスフェクション試薬のみのものである。（Ｂ）２９３Ｔ細胞を（Ａ）のとおりに、第４プラスミドとしてＶＩＰ３（プラスミド骨格）、ＦＬ−野生型、ＰＬ−Ｃ末端２２７、またはＦＬ−Ｃ３３５Ａでコトランスフェクトした。トランスフェクション後３０時間に回収したウイルス上清由来のルシフェラーゼレポーター活性を２９３Ｔ標的細胞においてアッセイした。（Ｃ）ＨＩＶ力価に対する用量依存関数効果。ＦＬ−ＷＴおよびＦＬ−Ｃ３３５Ａを力価判定し、平行して第４プラスミドとして偽プラスミドとトランスフェクトした。
【００１５】
図３Ａ−３ＢはＶｐｒ（Ａ３０Ｌ）ウイルスの減少した出芽が感染性ではなく減少した粒子生産と関連することを示す。２９３Ｔ細胞を偽ウイルスＤＮＡ発現ＷＴおよびＶｐｒの変異型とトランスフェクトした。（Ａ）ＷＴまたは核局在化変異体Ｗ５４Ｒではなく、Ａ３０Ｌ Ｖｐｒ取り込み変異体は、２９３Ｔ標的細胞における感染性によって測定するとウイルス力価を減少した。（Ｂ）ｐ２４レベルを標的２９３Ｔ細胞を感染するために使用した偽ウイルスインプットについて、（Ａ）から標準化（９．３８ｎｇ）した。
【００１６】
図４Ａ−４ＢはＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏が２９３Ｔ細胞における偽ウイルス生産を阻害することを示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３（陰性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、ウェルあたり２：０．０５：０．５または１００ｎｇ：２．５ｎｇ：２５ｎｇのベクターＲＮＡ：デルタプサイ：ｅｎｖの比で、３プラスミド偽ウイルス系のｃＤＮＡトランスフェクションに供した。３つの複写ウェルを条件毎に行った。ウイルス上清を４８時間後に回収し、標的２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。これらの形質導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を４８時間後に測定し、Ａに示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３に対するｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。７２時間後細胞生存率をCellTiterGloを使用し、蛍光を測定して決定した。
【００１７】
図５はＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏がＨｅＬａ−ＣＤ４−β−ｇａｌ細胞におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩｂ複製を阻害することを示す。細胞をＴａｔ、ＩｓｏＴ、Ｖｐｒ、ルシフェラーゼＧＬ２（陰性対照）、またはＰｏｌＲ２Ａ（細胞毒性についての陽性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。２４時間培養後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩｂに感染させる。β−ガラクトシダーゼ活性を、感染の測定として感染後７２時間で測定した。細胞毒性をｓｉＲＮＡトランスフェクト非感染細胞について平行して測定した。データを陰性対照ＧＬ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞によって発生したシグナルの割合として表現する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
詳細な説明
Ｉ．概説
本発明は一部において、ＩｓｏＴがＨＩＶ感染に関与するという本発明者らの発見に基づく。ヒトＩｓｏＴは、遊離Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖のモノマーへの分解に関与する９３ｋＤａの亜鉛結合脱ユビキチン化酵素である。本発明者らはＩｓｏＴがＨＩＶ−１ウイルスのウイルス性タンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）の結合パートナーであることを見出した。Ｖｐｒは、単球およびマクロファージにおけるＨＩＶウイルス複製に必須であり、Ｔ細胞およびＴ細胞株におけるウイルス複製を増加させる９６アミノ酸、１４ｋＤａ付属タンパク質である（例えば、Cohen et al., J Virol 64:30973099, 1990；Paxton et al., J Virol 67:72297237, 1993；およびAndersen et al., Curr HIV Res. 3:43-51, 2005参照）。本発明者らはまた、活性部位変異体ではなく野生型ＩｓｏＴの過剰発現が生産細胞由来のウイルス力価を上昇させることを見出した。さらに、低分子干渉ＲＮＡを用いたＩｓｏＴレベルの欠乏がＨＥＫ２９３Ｔ生産細胞におけるウイルス力価を減少させ、そして実験室株ＨＩＶ−１（ＩＩＩｂ）およびＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌにおけるＨＩＶ−１ ＢａＬ、ならびにＵ３７３ ＨＩＶ−１インジケーター細胞株それぞれの感染性を減少させることを発見した。これらのデータはＩｓｏＴが宿主細胞からのＨＩＶ−１放出の効果を上昇させるのに重要な役割を果たしていることを示す。
【００１９】
これらの発見により、本発明はＨＩＶ感染を阻害する新規薬剤をスクリーニングする方法を提供する。試験化合物を、第１にＩｓｏＴ分子の生物学的活性、例えばその発現、そのＶｐｒとの相互作用、またはそのイソペプチダーゼ活性を調節する能力についてスクリーニングする。したがって同定された薬剤を、典型的にはさらにＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染を示す活性を調節する能力について試験する。様々なＩｓｏＴ分子をスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。例えば、ヒト、ウサギ、ラットまたはマウス由来のＩｓｏＴを調節剤のスクリーニングのために使用することができる。いくつかの好ましい態様において、ヒトＩｓｏＴ分子を使用する。本発明に開示したスクリーニング法の有用性を例示するために、本発明者らはヒトＩｓｏＴの阻害剤のために低分子化合物のハイスループットスクリーニングを行った。下記実施例に詳述するとおり、ＩｓｏＴを阻害することによる抗ウイルス活性を有する化合物がスクリーニングによって同定された。
【００２０】
本発明はまた、治療使用を含む。ＩｓｏＴ活性の薬理学的阻害はＨＩＶ感染に関連する状態の処置または予防の新規アプローチを提供する。典型的には、アプローチには本発明によって同定することができるＩｓｏＴ阻害剤（例えばｓｉＲＮＡまたは低分子有機化合物）を対象に投与することを含む。
【００２１】
以下の項は本発明の組成物を製造し、使用するための、そして本発明の方法を実施するための指標を提供する。
【００２２】
ＩＩ．定義
他に定義がない限り、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明が属する分野における当業者が通常理解するとおりの意味を有する。下記文献は当業者に本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供する： Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000)； Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley ＆ Sons (3rd ed., 2002)；および A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。さらに、下記定義を本発明の実施において読者を補助するために提供する。
【００２３】
「試験薬剤」または「試験化合物」なる用語には、あらゆる物質、分子、要素、化合物、実体、またはそれらの組合せを含む。限定されないが、例えばタンパク質、ポリペプチド、小有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等が含まれる。天然物、合成化合物または化学化合物または２種以上の物質の組合せであり得る。特に記載がない限り、「薬剤」、「物質」および「化合物」なる用語は相互に交換可能に使用することができる。
【００２４】
本明細書において「アナログ」なる用語は、参照分子と構造的に類似しているが参照分子の特定の置換基を別の置換基で置換することによって標的化および制御方法が修正されている分子を意味するものとして使用する。参照分子と比較して、アナログは同一の、類似のまたは改善された有用性を示すものと、当業者には予期される。アナログの合成およびスクリーニングは改善された特徴（例えば標的分子に対する高い結合親和性）を有する既知の化合物の変異体を同定するための薬学化学において周知の方法である。
【００２５】
ＨＩＶはレトロウイルスのファミリーであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を意味する。限定されないが、これらのウイルスにはＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−ＩＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＬＡＶ−１、ＬＡＶ−２としても知られる)等が含まれる。本明細書において使用するとき、ＨＩＶはＨＩＶファミリーにおけるあらゆる株、形態、サブタイプおよび変異体であり得る。
【００２６】
２個の核酸配列またはアミノ酸配列の文脈中での「同一」または「配列同一」なる用語は、特定の比較窓にわたって最大対応を並べたとき、２個の配列における残基が同じであることを意味する。比較のための配列のアラインメント法は、当業者に既知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズムによって； Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443のアラインメントアルゴリズムによって； Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 85:2444の同一性の調査法によって；by computerized implementations of these algorithms これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（限定されないが、Intelligentics, Mountain View, CAによるPC/GeneプログラムのCLUSTAL；およびWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.におけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、またはTFASTAを含む）によって、行うことができる。アラインメントは、検査およびマニュアルアラインメントによってしばしば行うこともできる。
【００２７】
「実質的に同一の」核酸またはアミノ酸配列なる用語は、上記プログラム（例えばＢＬＡＳＴ）を標準的なパラメータを用いて使用して標準配列と比較したとき、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、そしてもっとも好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する配列を含む核酸またはアミノ酸を意味する。好ましくは、実質的同一性は少なくとも約５０残基長である配列領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そしてもっとも好ましくは配列は少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。もっとも好ましい態様において、配列はコーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００２８】
ＩｓｏＴ分子の生物学的活性に関する「調節」なる用語は、ＩｓｏＴの細胞レベル、細胞内局在性または他の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性）における変化を意味する。ＩｓｏＴ活性の調節は上方制御（すなわち、活性化または刺激）あるいは下方制御（すなわち阻害または抑制）であってよい。例えば、調節は細胞レベル、あるいはＩｓｏＴの酵素的修飾（例えばリン酸化）、結合特性（例えばＶｐｒまたは基質への結合）、またはＩｓｏＴタンパク質の他の生物学的、機能的または免疫学的特徴における変化を引き起こし得る。活性の変化は例えば、ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現、ＩｓｏＴタンパク質をコード化するｍＲＮＡの安定性、翻訳効率の増加もしくは減少、またはＩｓｏＴ酵素の他の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性）の変化によって引き起こされ得る。ＩｓｏＴモジュレーターの作用の形態は、直接、例えばＩｓｏＴタンパク質またはＩｓｏＴタンパク質をコード化する遺伝子に結合することによっていても良い。変化はまた、関節、例えばＩｓｏＴを調節する他の分子と結合および／または修飾（例えば酵素的に）することによっていても良い。
【００２９】
「対象」なる用語は、哺乳類、とりわけヒトを意味する。これは他の非ヒト動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルを含む。
【００３０】
ＩｓｏＴのような分子の「変異体」は、分子全体またはそのフラグメントと構造および生物学的活性が実質的に同一の分子を意味する。したがって、２個の分子が類似の活性を有するならば、一方の分子の構成または２次、３次もしくは４次構造が他方のものと同一でなくとも、あるいはアミノ酸残基の配列が同一でなくとも、それらは本明細書で使用する用語としての変異体であると考える。
【００３１】
ＩＩＩ．スクリーニングスキーム
本発明によると、ＨＩＶ感染の新規な阻害剤を、第１に試験化合物をＩｓｏＴの生物学的活性を調節（例えば阻害）する能力についてスクリーニングすることによって同定する。スクリーニングアッセイにおいてモニターするＩｓｏＴの生物学的活性は、そのイソペプチダーゼ活性であってもよい。それは他の分子、例えばＶｐｒまたはユビキチンへのその結合であってもよい。生物学的活性はまた、ＩｓｏＴ発現またはその細胞レベルであり得る。ＩｓｏＴの生物学的活性を調節する試験化合物を同定した後、それらを典型的にはさらに、ＨＩＶ感染を調節する、あるいはＨＩＶ感染もしくはＨＩＶ複製の指標である活性を調節する能力について試験する。この工程は、ＩｓｏＴの生物学的活性を調節することによって第１の工程で同定された化合物が実際にＨＩＶ感染を制御（例えば阻害）することができることを確認するために行われる。
【００３２】
当業者に周知の様々な生化学および分子生物学の技術またはアッセイをＩｓｏＴモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。かかる技術は、例えばHandbook of Drug Screening, Seethala et al. (eds.), Marcel Dekker (1st ed., 2001)；High Throughput Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 190), Janzen (ed.), Humana Press (1st ed., 2002)； Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Ed.), John Wiley ＆ Sons Inc (2002); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)； および Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)に記載されている。
【００３３】
様々な種由来のＩｓｏＴを、本発明のＩｓｏＴモジュレーターのスクリーニングにおいて使用することができる。好ましくは、哺乳類細胞由来のＩｓｏＴ分子を使用する。例えば、ヒトＩｓｏＴ（受託番号 NM_003481 および NP_003472）がクローン化され、文献、例えば Falquet et al., FEBS Lett. 376: 233-237; 1995； Wilkinson et al., Biochemistry 34:14535-14546, 1995; and Lacombe et al., FEBS Lett. 531:469-474, 2002に記載された。他の例には、チンパンジーＩｓｏＴ（受託番号 XM_526393 および XP_526393）およびマウスＩｓｏＴ（受託番号 BC066993 および AAH66993）が含まれる。あらゆるこれらのＩｓｏＴ配列または実質的にその配列と同一の配列を、本発明のＩｓｏＴモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。下記実施例に例示したとおり、ＩｓｏＴポリヌクレオチドのクローニングおよび発現、ならびにＩｓｏＴポリペプチドの精製を、通常行われている方法および技術で行うことができる。かかる方法および技術は例えば、Sambrook et al., supra；および Brent et al., supraに記載されている。ＩｓｏＴを得る具体的な方法は、文献、例えばGabriel et al., Biochemistry 41:13755 -13766, 2002にも提供されている。
【００３４】
無傷のＩｓｏＴ分子または無傷のＩｓｏＴ分子をコード化する核酸に加えて、ＩｓｏＴフラグメント（例えば触媒ドメインまたはＶｐｒ結合ドメイン）、アナログまたは機能的誘導体も使用することができる。これらのアッセイにおいて使用することができるＩｓｏＴフラグメントは通常、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとの結合）の１種以上を保持している。上記のとおり、異なる種由来のＩｓｏＴは既に配列決定され、十分に特徴付けられている。したがって、それらのフラグメント、アナログ、誘導体または融合タンパク質を当業者に周知の方法を使用して容易に得ることができる。例えば、ＩｓｏＴの機能的誘導体をタンパク質分解的切断によって天然に発生した、あるいは組み換えによって発現したタンパク質から、当業者に既知の常套の精製方法によって製造することができる。あるいは、機能的誘導体をそのイソペプチダーゼ活性を保持しているＩｓｏＴのフラグメントのみを発現することによって、組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【００３５】
ＩＶ．試験化合物
本発明の方法でスクリーニングすることができる試験化合物には、ポリペプチド、βターン模倣薬、ポリサッカライド、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロ環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造アナログまたはそれらの組合せが含まれる。試験化合物は合成分子であることもあるし、天然分子であることもある。
【００３６】
試験化合物を、合成または天然化合物のライブラリーを含む広い種類のソースから得る。コンビナトリアルライブラリーを段階的方法で合成することができる多くのタイプの化合物のために製造することができる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーをWO 95/12608、WO 93/06121、WO 94/08051、WO 95/35503およびWO 95/30642に記載のコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構成することができる。ペプチドライブラリーをファージディスプレイ法（例えばDevlin, WO 91/18980参照）によって製造することもできる。バクテリア、菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを商業的ソースから得るか、あるいは実際に収集することができる。既知の薬理学的薬剤は、構造アナログを製造するためのアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような指向性またはランダム化学修飾に供することができる。
【００３７】
他の化合物またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーを任意の位置で配列優先または固定なしで十分にランダム化することができる。あるいは、ライブラリーを偏向させることができる、すなわち配列中のいくつかの位置が一定であるか、あるいは限定された数の可能性から選択される。例えば、いくつかの場合において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏向した（小または大）残基、システインの製造の方向、架橋、ＳＨ−３ドメインに関するプロリン、セリン、スレオニン、チロシンまたはリン酸化部位に関するヒスチジン、またはプリンのような明らかなクラス内でランダム化する。
【００３８】
試験化合物は、天然に発生するタンパク質またはそれらのフラグメントであり得る。かかる試験化合物は天然ソース、例えば細胞または組織溶解物から得ることができる。ポリペプチド薬剤のライブラリーを、例えば商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラリーから製造するか、あるいは常套の方法で製造することができる。試験化合物はまた、約５〜約３０個、好ましくは約５〜約２０個、とりわけ好ましくは約７〜約１５個のアミノ酸のペプチドのようなペプチドであり得る。ペプチドは天然に発生したタンパク質の消化物、ランダムペプチドまたは「偏向した」ランダムペプチドであってもよい。いくつかの方法において、試験化合物はポリペプチドまたはタンパク質である。
【００３９】
試験化合物は核酸でもあり得る。核酸試験化合物は天然に発生した核酸、ランダム核酸または「偏向した」ランダム核酸であってもよい。例えば、原核または真核ゲノムの消化物、を上記タンパク質と同様に使用することができる。
【００４０】
好ましい態様において、試験化合物は低分子、例えば約５００または１０００未満の分子量の分子である。好ましくはハイスループットアッセイを適用し、かかる低分子をスクリーニングするために使用することができる。いくつかの方法において、上記低分子試験化合物のコンビナトリアルライブラリーを容易に使用してＩｓｏＴの低分子モジュレーターをスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングには多くのアッセイ、例えばSchultz et al., Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414, 1998； Weller et al., Mol Divers. 3:61-70, 1997; Fernandes et al., Curr Opin Chem Biol 2:597-603, 1998；およびSittampalam et al., Curr Opin Chem Biol 1:384-91, 1997に記載のものを使用することができる。
【００４１】
本発明の方法でスクリーニングする試験化合物のライブラリーはまた、ＩｓｏＴポリペプチド、それらのフラグメントまたはアナログの構造的研究に基づき製造することができる。かかる構造的研究はＩｓｏポリペプチドとより結合しやすい試験化合物を同定することができる。ＩｓｏＴポリペプチドの３次元構造を多くの方法、例えば結晶構造および分子モデリングで研究することができる。Ｘ線結晶解析を使用したタンパク質の構造研究法は文献に周知である。Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221-239, および Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg ＆ D. C. Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979)参照。ＩｓｏＴポリペプチド構造のコンピューターモデリングは、ＩｓｏＴモジュレーターをスクリーニングするための試験化合物を設計する他の方法を提供する。分子モデリング法は文献、例えばU.S. Patent No. 5,612,894、表題“System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor”およびU.S. Patent No. 5,583,973、表題“Molecular modeling method and system”に記載されている。さらに、タンパク質構造も中性子回折および核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定することができる。例えばPhysical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J. (Prentice-Hall, New Jersey 1972), およびNMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interscience, New York 1986)参照。
【００４２】
本発明のモジュレーターにはＩｓｏＴポリペプチドに特異的に結合する抗体も含むことができる。かかる抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。かかる抗体は当業者に周知の方法を使用して製造することができる。例えば、非ヒト、例えばマウスもしくはラットモノクローナル抗体の製造を、例えばＩｓｏＴ ポリペプチドまたはそのフラグメントで動物を免疫することによって行うことができる（Harlow ＆ Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988参照）。かかる免疫源は天然ソースから、ペプチド合成または組換発現によって得ることができる。
【００４３】
マウス抗体のヒト化形態を、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域と組み換えＤＮＡ技術によって結合することによって製造することができる。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) および WO 90/07861参照。ヒト抗体をファージディスプレー法を使用して得ることができる。例えばDower et al., WO 91/17271； McCafferty et al., WO 92/01047参照。これらの方法において、ファージのライブラリーが形成され、そこではメンバーは外部表面に異なる抗体を提示する。抗体はＦｖまたはＦａｂフラグメントとして通常提示される。所望の特異性を有するファージ提示抗体を本発明のＩｓｏＴポリペプチドに対する親和性濃縮によって選択する。
【００４４】
ＩｓｏＴポリペプチドに対するヒト抗体を、少なくともヒト免疫グロブリン遺伝子座および不活性内因性免疫グロブリン遺伝子座のセグメントをコード化する導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から製造することもできる。例えばLonberg et al., WO93/12227 (1993)； Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)参照。ヒト抗体を競合的結合実験またはその他によって選択して、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有することができる。かかる抗体はとりわけ、マウス抗体の有用な機能的特徴を共有する可能性がある。ヒトポリクローナル抗体はまた、免疫源で免疫したヒト由来の血清の形態で提供され得る。所望により、かかるポリクローナル抗体はＩｓｏＴポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した親和性精製によって濃縮することができる。
【００４５】
Ｖ．ＩｓｏＴモジュレーターのための試験化合物スクリーニング
ＨＩＶ感染を阻害する新規化合物を同定するために、本明細書に記載のとおり、試験化合物を第１にＩｓｏＴの生物学的活性を調節する能力についてスクリーニングする。好ましい態様において、試験化合物はＩｓｏＴのイソペプチダーゼ活性を調節（例えば阻害）する能力について試験する。ＩｓｏＴの酵素活性を調節（例えば阻害）する化合物を多くのアッセイ形式で同定することができる。例えば、下記実施例に示すとおり、スクリーニングは精製ＩｓｏＴ酵素およびユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン（methlcoumarin）（Ｕｂ−ＡＭＣ）を基質として使用して生化学アッセイを行うことができる。試験化合物のＩｓｏＴのイソペプチダーゼ活性に対する効果を当業者に既知の、例えばLacombe et al., FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002；および Gabriel et al., Biochemistry. 19:41:13755-66, 2002のＩｓｏＴ活性アッセイを使用してモニターすることができる。例えば、ＩｓｏＴの酵素活性をユビキチンダイマー基質でアッセイすることができる。ＩｓｏＴによる基質の切断は、Lacombe et al., FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002に記載のとおり、電気泳動およびクーマシー染色によって分析することができる。分枝および直線ユビキチンダイマー基質を文献、例えばGabriel et al., Biochemistry 41:13755 -13766, 2002に記載のとおり製造することができる。ユビキチンダイマーの他に、他の基質もＩｓｏＴ酵素活性のモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。例えば多くのアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）ベースのペプチド基質を、ＩｓｏＴ活性をモニターするために使用することができる（Stein et al., Biochemistry 34:12616-12623, 1995）。これらの基質（例えばZ-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC または ユビキチン−アルデヒド）は、ＩｓｏＴイソペプチダーゼの反応速度論およびＩｓｏＴ活性のユビキチンアルデヒドによる阻害を研究するために文献において使用されている（Stein et al., Biochemistry 34:12616-12623, 1995；および Melandri et al., Biochemistry 35: 12893 -12900, 1996）。
【００４６】
他の態様において、試験化合物を第１にＩｓｏＴのＶｐｒまたはユビキチンのような他の分子との結合を調節する活性についてスクリーニングすることができる。Ｖｐｒはクローン化され、下記実施例および文献、例えばAmini et al., J Biol Chem. 279:46046-56, 2004； Iijima et al., Virol. 327:249-61, 2004; Yao et al., Retrovirology. 1:21-31, 2004； および Muthumani et al., Int Immunol. 17:103-16, 2005に既知の方法を使用して発現される。多くのアッセイおよび方法をＩｓｏＴポリペプチドのＶｐｒまたはユビキチンとの結合に対する試験化合物の効果を試験するために使用することができる。これらにはタンパク質と他の化合物（他のタンパク質を含む）の相互作用を研究するために当業者に一般的に知られている方法、例えば標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、免疫沈降法、ＧＳＴプルダウンアッセイ、酵母または哺乳類２種ハイブリッドスクリーニングおよび蛍光消光または蛍光偏光が含まれる。さらに、ＩｓｏＴの他の分子（例えばユビキチン）との結合を試験するための具体的な方法は、下記実施例および文献（Amini et al., J. Biol. Chem., 279:46046-46056, 2004；および Yao et al., Retrovirology. 1:21-31, 2004参照）に提供される。
【００４７】
ある態様において、ＩｓｏＴとＶｐｒ結合の物理的相互作用を下記実施例に例示のような共免疫沈降法によって分析することができる。標識または分子タグＩｓｏＴ（例えばＦＬＡＧ−ＩｓｏＴ）およびＶｐｒ（例えばＭｙｃ−Ｖｐｒ）を宿主細胞、例えば２９３Ｔ細胞において共発現させることができる。ＩｓｏＴのＶｐｒとの結合を細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、その後ウェスタンブロット分析することによって試験することができる。同様に、ＩｓｏＴのユビキチンとの結合も当業者に既知の方法で分析することができる。例えば、ＩｓｏＴ−ユビキチン結合をタンデムＫＣｌおよびウレア直線グラジエントを用いるユビキチン−セファロースカラムを使用して試験することができる。この方法はLacombe et al. （FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002） およびGabriel et al. （Biochemistry 41:13755 -13766, 2002）に記載されている。
【００４８】
他の方法において、試験化合物をＩｓｏＴの発現または細胞レベル（転写、翻訳または翻訳後修飾）を調節する活性についてアッセイする。周知の様々な生化学および分子生物学技術をＩｓｏＴ遺伝子の発現またはＩｓｏＴポリペプチドの細胞レベルを試験するために使用することができる。かかる技術は例えば、Sambrook et al., supra；および Brent et al., supraに記載されている。ある態様において、ＩｓｏＴ分子の内因性レベルを細胞が通常発現しているＩｓｏＴにおいて直接モニターすることができる。ある態様において、ＩｓｏＴ分子の発言または細胞レベルをクローンｃＤＮＡまたはＩｓｏＴをコード化するゲノム配列を使用して発現系において試験することができる。
【００４９】
あるいは、ＩｓｏＴ遺伝子の発現の調節を細胞ベースの系において、発現ベクターの培養細胞株への短期または安定トランスフェクションによって試験することができる。レポーター遺伝子と作動可能なように結合しているＩｓｏＴ遺伝子の転写制御配列（例えばプロモーター）を有するアッセイベクターを、プロモーター活性のアッセイのためにあらゆる哺乳類宿主細胞株にトランスフェクトすることができる。レポーター遺伝子と作動可能なように結合しているＩｓｏＴ遺伝子（またはＩｓｏＴ遺伝子の転写制御因子）を含む構成物を、分子生物学において通常実施されている技術および方法のみを使用して製造することができる（例えばSambrook et al. および Brent et al., supra参照）。細胞培養、トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイの一般的な方法は、文献、例えばBrent et al., supra； および Transfection Guide, Promega Corporation, Madison, WI (1998)に記載されている。あらゆる容易にトランスフェクト可能な哺乳類細胞株をＩｓｏＴプロモーター機能をアッセイするために、またはＩｓｏＴを発現するために使用することができる。例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ−７、およびＨｅｐＧ２は全て好適な細胞株である。
【００５０】
適当な宿主細胞に挿入したとき、発現ベクターにおける転写制御因子は宿主ＲＮＡポリメラーゼによるレポーター遺伝子の転写を誘導する。レポーター遺伝子は典型的には、宿主細胞には本来存在しない容易にアッセイされる酵素活性を有するポリペプチドをコード化する。真核細胞プロモーターの典型的なレポーターポリペプチドには例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルもしくはRenillaルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。
【００５１】
一般的に、スクリーニングで同定されたＩｓｏＴ−調節化合物はＩｓｏＴの生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとの結合）を顕著に改変することができる。調節の程度を同じ化合物の対照タンパク質（例えばルシフェラーゼまたはタンパク質キナーゼ）に対する活性と、あるいは対照化合物の同じＩｓｏＴ分子に対する活性と比較して測定する。例えば、ＩｓｏＴ発現またはＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性を阻害するＩｓｏＴ調節化合物は典型的には、対照酵素についてのＩＣ５０よりも少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、５００または１０００倍低いＩｓｏＴ分子（例えばヒトＩｓｏＴ）についてのＩＣ５０（最大阻害の５０％を引き起こす有効濃度）を有する。ＩｓｏＴ分子の同じ活性を阻害する陰性対照化合物のＩＣ５０よりもＩｓｏＴのＩＣ５０は少なくとも５、１０、２５、５０、１００、５００または１０００倍低いと定義することもできる。同様に、調節をＩｓｏＴのＶｐｒとの結合で測定するならば、同じ程度の阻害を達成するための対照化合物の濃度よりも５、１０、２５、５０または１００倍低い濃度でのＩｓｏＴ調節化合物が存在することで、通常ＩｓｏＴ−Ｖｐｒ結合活性を予防または阻害することができる。本明細書において使用するとき、ＩｓｏＴの他の分子への結合の阻害（例えばＶｐｒまたはユビキチン多量体）はＩｓｏＴのその分子への結合親和性を少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０、２０、５０または１００倍減少させることを意味する。
【００５２】
ＶＩ．ＨＩＶ阻害化合物のスクリーニング
ＨＩＶの新規阻害剤を同定するために、上記ＩｓｏＴモジュレーターを典型的にはさらに、それらのＨＩＶ感染に対する阻害作用を確認するために試験する。典型的には、化合物をＨＩＶ感染またはＨＩＶ複製の指標である活性を調節する能力についてスクリーニングする。多くのアッセイおよび方法をＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ阻害活性を試験するために使用することができる。ある方法では、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する潜在的な阻害活性を、当業者が通常実施している方法を使用して、インビトロでの培養細胞のＨＩＶ感染に対するそれらの効果を試験することによって試験することができる。例えば下記実施例に記載のように、化合物の抗ウイルス活性をＨＩＶウイルスに感染する前に化合物と接触させたＨｅＬａＣＤ４βｇａｌ細胞においてウイルス複製をモニターすることによって評価することができる。化合物を、Seddiki et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 15:381-90, 1999に記載のように第１マクロファージ培養物のＨＩＶ感染について試験することもできる。それらを、Fujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004に記載のように他のＴ細胞および単球細胞株のＨＩＶ感染について試験することもできる。ＨＩＶ感染をモニターするためのさらなるインビトロ系は文献に記載されている。例えばLi et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003； Steinberg et al., Virol. 193:524-7, 1993; Hansen et al., Antiviral Res. 16:233-42, 1991；および Piedimonte et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 6:251-60, 1990参照。
【００５３】
これらのアッセイにおいて、細胞のＨＩＶ感染を形態学的に、例えば顕微鏡細胞変異効果アッセイ（例えばFujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004参照）によってモニターすることができる。酵素的に、例えば細胞培養物の上清におけるＨＩＶ逆転写（ＲＴ）活性をアッセイすることによって評価することもできる。かかるアッセイは文献、例えばReynolds et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100:1615-20, 2003；および Li et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003に記載されている。他のアッセイではＨＩＶ感染をウイルス核酸またはウイルス抗原の定量的集積によってモニターする。例えば、Winters et al. （PCR Methods Appl. 1:257-62, 1992）はＨＩＶ感染細胞培養物からＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡおよびＤＮＡをアッセイする方法を記載した。Vanitharani et al.はウイルスｐ２４抗原の生産を測定するＨＩＶ感染アッセイを記載した（Virology 289:334-42, 2001）。ウイルス複製はまた、例えばChargelegue et al., J Virol Methods. 38(3):323-32, 1992；およびKlein et al., J Virol Methods. 107(2):169-75, 2003に記載のとおり、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイによってインビトロでモニターすることができる。全てのこれらのアッセイを、本発明のＩｓｏＴ調節化合物の抗ＨＩＶ活性を評価するために使用し、そして改変することができる。
【００５４】
ある方法において、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する潜在的な阻害効果をＨＩＶ複製が許容状態である人工レポーター細胞において試験することができる。これらの細胞において、ＨＩＶ転写制御因子、例えばＨＩＶ−ＬＴＲの制御下でのレポーター遺伝子の発現を試験することによって、ＨＩＶ感染および複製をモニターする。かかる細胞の一つの例がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶレポーター細胞である。下記実施例に説明のとおり、ＩｓｏＴ調節化合物で処理した後ＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌレポーター細胞をＨＩＶ−ＩＩＩｂで感染させるることができる。β−ガラクトシダーゼ活性を測定することによってモニターすると、化合物処理細胞のウイルス感染を化合物で処理しなかった対照細胞のものと比較することができる。ＩｓｏＴ調節化合物で処理した細胞のウイルス力価が減少しており、あるいは感染が減少していることで、当該化合物が実際にＨＩＶ感染またはウイルス複製を阻害することができると確認する。
【００５５】
本明細書で試験したＨｅｌａ−Ｔ４−βＧａｌ細胞に加えて、多くの類似のレポーターアッセイも文献に記載されている。例えばGervaix et al. （Proc Natl Acad Sci USA. 94:4653-8, 1997）はヒト化緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化するプラスミドをＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲプロモーターの制御下で発現する安定なＴ細胞株を開発した。ＨＩＶ−Ｉの感染によって、非感染細胞と比較して１００倍〜１０００倍の感染細胞の蛍光の増加が観察される。これらのアッセイ系のいずれかを本発明においてＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する効果をリアルタイムで観察するために使用することができる。これらのインビトロ系は感染細胞の時間にわたる定量と、化合物の感受性の測定を行うことができる。
【００５６】
他の方法において、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ複製に対する効果を当該化合物で処理した細胞におけるＨＩＶ−１偽ウイルスの生産を試験することによって試験することができる。細胞はＩｓｏＴを内因的にまたは外因的に発現し得る。ＩｓｏＴ−コード化構造を宿主細胞に、とりわけＩｓｏＴを内因的に発現していない宿主細胞にトランスフェクトすることができる。下記実施例に記載のとおり、ＨＩＶ−１偽ウイルスの生産を、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）をコード化するプサイ−陽性ＲＮＡ、全構造タンパク質をコード化するデルタプサイパッケージング構造、ならびに制御または修飾タンパク質、例えばＴａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｒおよびＶｉｆ、ならびにＶＳＶ−ｇエンベロープ発現プラスミドで生産細胞（例えば２９３Ｔ ＨＥＫ細胞）をトランスフェクトすることによって得ることができる。生産細胞で生産される偽ウイルスはレポーター遺伝子のみをコード化する。標的細胞を生産細胞由来の上清中の偽ウイルスでトランスフェクトした後、レポーター遺伝子を下記逆転写および標的細胞ゲノムへの集積によって発現する。
【００５７】
ＨＩＶ複製の阻害剤をスクリーニングするために、生産宿主細胞を偽ウイルスプラスミドのトランスフェクションの前、同時、または後にＩｓｏＴ調節化合物で処理することができる。好ましくは、化合物を偽ウイルスプラスミドのトランスフェクション前に宿主細胞に投与し、アッセイプロセス全体で存在させる。生産された偽ウイルスの力価を生産細胞由来の上清における偽ウイルスで標的細胞を感染させること、そして標的細胞におけるレポーターの活性（例えばルシフェラーゼ活性）を評価することによってモニターすることができる。対照として化合物で処理しなかった生産細胞由来の上清で感染させた標的細胞におけるレポーター活性も測定する。ＩｓｏＴ調節化合物がウイルス出芽に対する阻害効果を有するならば、化合物で処理した生産細胞由来の上清と接触させた標的細胞は対照細胞と比較して減少したレポーター活性を有する。
【００５８】
ＶＩＩ．治療適用
（ｉ）ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性；（ｉｉ）ＩｓｏＴのＶｐｒとの結合、または（ｉｉｉ）ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現を下方制御することによって、上記ＩｓｏＴ調節化合物は本発明の有用な治療適用を提供する。それらはＨＩＶに感染した細胞におけるＨＩＶ複製を阻害するために容易に使用することができる。それらはまた、ＨＩＶ感染ならびにＨＩＶ感染に関連する疾患または状態（例えばＡＩＤＳ）を有する対象を予防的または治療的に処置するために有用である。本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に適しているＨＩＶ感染には、あらゆるレトロウイルスのＨＩＶファミリー（例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）による対象、とりわけヒト対象の感染を含む。ＩｓｏＴ調節化合物は、レトロウイルスのＨＩＶファミリーのあらゆるメンバーのキャリアーである対象の処置に有用である。それらは活性ＡＩＤＳで診断される対象の処置に有用であり得る。化合物はまた、かかる対象におけるＡＩＤＳ関連状態の処置または予防に有用である。ＨＩＶ感染を有するとは診断されていないがＨＩＶによる感染の危険があると考えられる対象も、本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に適している。
【００５９】
本発明の治療適用に使用することができるＩｓｏＴ阻害化合物には、下記実施例に記載のような本発明の方法によって同定され得る低分子有機化合物が含まれる。一度同定されると、かかる化合物を有機化学の通常使用される方法を用いて容易に合成することができ、そして／または商業的供給者から容易に入手することができる。本発明の治療法を実施するために好適なＩｓｏＴモジュレーターには、ＩｓｏＴ細胞レベルまたはその生物学的活性（例えばその酵素活性）を特異的に調節することができる他の化合物も含む。かかる化合物には、ＩｓｏＴポリペプチドを特異的に認識するアンタゴニストまたはアゴニスト抗体が含まれる。それらにはまた、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および合成ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ならびに相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が含まれる。例えば、下記実施例に記載のＩｓｏＴ特異的またはＶｐｒ特異的ｓｉＲＮＡを使用することができる。さらに、治療的適用は、上記スクリーニング方法によって同定することができる他のＩｓｏＴ阻害剤を使用することができる。
【００６０】
いずれかのＡＩＤＳ関連状態を有する対象は本発明のＩｓｏＴ調節化合物で処置するのに適している。かかる状態にはＡＩＤＳ関連複合（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫（ＰＧＬ）、抗ＨＩＶ抗体陽性状態およびＨＩＶ陽性状態、ＡＩＤＳ関連神経学的状態（例えば認知症または熱帯性麻痺）、カポジ肉腫、血小板減少症紫斑病および関連する日和見感染、例えばニューモシスティス・カリニ肺炎、マイコバクテリア結核、食道カンジダ症、脳トキソプラズマ症、ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ関連脳障害、ＨＩＶ関連消耗症候群等が含まれる。
【００６１】
インビボでＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの進行を測定するための標準的な方法を、対象が本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に陽性に応答しているかどうかを決定するために使用することができる。例えば、本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置後、対象のＣＤ４＋ Ｔ細胞数、あるいは対象のウイルス量をモニターすることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加は対象が抗ウイルス治療の投与によって恩恵を受けていることを示す。これ、そして当業者に既知の他の方法を、本発明の化合物が対象におけるＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの処置に有効である程度を測定するために使用することができる。
【００６２】
本発明のＩｓｏＴモジュレーターを処置する対象に滅菌条件下で直接投与することができる。モジュレーターは単独で、または医薬組成物の有効成分として投与され得る。本発明の治療組成物はまた、他の治療剤と組み合わせて、あるいは関連して使用することができる。ある適用では、第１のＩｓｏＴモジュレーターを第２のＩｓｏＴモジュレーターと組み合わせて、１種のＩｓｏＴモジュレーターを個別に使用したときには達成できないようなより高度にＨＩＶ感染を阻害するために、使用される。他の適用において、本発明のＩｓｏＴ調節化合物をＡＺＴのような既知の抗ＨＩＶ薬剤と組み合わせて使用することができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物は典型的には、少なくとも１種の有効成分と１種以上の許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は組成物を改良または安定化し、あるいは組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は投与される具体的な組成物（例えば核酸、タンパク質または調節化合物）によって、そして組成物を投与するために使用する具体的な方法によって、ある程度決定される。それらはまた、他の成分と適合し、対象に有害でないという意味において、薬学的および生理学的に許容されるべきである。この担体は投与が望まれる製剤の形態、例えば経口、舌下、直腸、鼻、静脈内または非経腸に依存して広い範囲の形態を取り得る。例えば安定性または薬理学的特性を向上するためにＩｓｏＴ調節化合物を投与の前に担体タンパク質、例えばオブアルブミンまたは血清アルブミンと組み合わせることができる。
【００６４】
医薬組成物を様々な形態、例えば顆粒、錠剤、ピル、座薬、カプセル剤などに製剤することができる。製剤における治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％まで変化し得る。治療製剤を薬学の分野で周知の方法によって製造する。治療製剤を処置に使用することができるあらゆる有効な手段によって送達することができる。例えばGoodman ＆ Gilman’s The Pharmacological Bases of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional (10th ed., 2001)； Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro (ed.), Lippincott Williams ＆ Wilkins (20th ed., 2003)；およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds.), Lippincott Williams ＆ Wilkins (7th ed., 1999)参照。
【００６５】
治療製剤は便宜には単位投与形態で存在し、適当な治療用量で投与することができる。適当な治療用量はあらゆる周知の方法、例えば最大耐用用量を決定するための哺乳類での、そして安全用量を決定するための正常ヒト対象での臨床試験によって決定することができる。高用量が必要とされ得る特的の状況を除き、ＩｓｏＴモジュレーターの好ましい用量は通常、１日当たり約０．００１〜約１０００ｍｇ、より通常は約０．０１〜約５００ｍｇの範囲である。
【００６６】
ＩｓｏＴモジュレーターの好ましい投与量および投与形態は、処置している医師によって個別に見出される要素、例えば状態または処置される状態、具体的なＩｓｏＴモジュレーターを含む投与する組成物の選択、個々の対象の年齢、体重および応答、対象の状態の重症度、ならびに選択した投与経路に依存して、異なる対象について変化し得る。一般的な法則として、投与されるＩｓｏＴモジュレーターの量は対象の状態を効果的かつ確実に予防または縮小させる最小用量である。したがって、上記用量範囲は一般的なガイドラインを提供し、本明細書の記載を補助することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００６７】
下記実施例は説明のために提示しており、本発明を限定しない。
【００６８】
実施例１ ＶｐｒはＩｓｏＴのＣ末端領域と相互作用する
Ｖｐｒ−ＩｓｏＴ相互作用をヒト白血球ライブラリーを使用して酵母２ハイブリッドスクリーニングによって同定した。酵母におけるタンパク質−タンパク質のアッセイをＧＡＬ４とＬｅｘＡ融合タンパク質で行った。ＧＡＬ４発現ベクター（Clontech）にクローン化したヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーを、ＨＩＶ ＨＸＢ２ Ｖｐｒをおとりとして使用してスクリーニングした。Ｖｐｒ ｃＤＮＡをＶｐｒ特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。ｃＤＮＡをＬｅｘＡ ＤＢＤ発現ベクターｐＳＬＡＮＳに挿入した。ｐＳＬＡＮＳはｐＢＴＭ１１６（Bartel et al Biotechniques 14: 920-924, 1993）の改変版である。ＮｏｔＩ挿入を受け入れ、ｇｌｙ４−ｓｅｒ−ｇｌｙ４−ｓｅｒをＬｅｘＡとおとりの間に設置するため、改変した。ＬｅｘＡ ＤＢＤ−Ｖｐｒ融合タンパク質をコード化するｃＤＮＡをＬ４０ ＭＡＴａ酵母株に形質転換した。Ｇａｌ４ ＡＤ−白血球ｃＤＮＡ融合タンパク質をコード化するｃＤＮＡを酵母株５４０ ＭＡＴαに形質転換した。２種の酵母株を交配し、両プラスミドを含む形質転換体をＴＨＵＫＬ欠乏合成培地で選択し、タンパク質相互作用をβ−ガラクトシダーゼフィルターアッセイによって分析した。
【００６９】
ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２ Ｖｐｒを、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーにおいてコード化される新規な相互作用する宿主細胞因子を同定するための酵母２ハイブリッドスクリーニングにおいておとりとして使用した。約２００万の２倍形質転換体をスクリーニングし、多くの陽性候補を単離した。陽性コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性について、タンパク質−タンパク質相互作用の更なる確認のためのフィルターリフトアッセイを使用してアッセイした。独立の候補ｃＤＮＡクローンの配列決定およびＧｅｎＢａｎｋデータベースとの比較によって、ＩｓｏＴである相互作用パートナー、２６Ｓプロテアソームの成分を同定した。ＩｓｏＴは遊離ポリユビキチン鎖中に配列を有するユビキチンの再循環に主に関与している。プレイ長（ＰＬ）ＩｓｏＴの配列分析によってＣ末端２２７アミノ酸およびさらに６３５ｂｐの３’−ＵＴＲを含むクローンを確認した（図１Ａ）。興味深いことに、ＰＬクローンはＵＢＡ（２）ドメインを通じてＶｐｒと相互作用することが既に同定されているｈＨＲ２３Ａ ＤＮＡダメージ修復酵素と類似の２つのＵＢＡドメインを有する。β−ガラクトシダーゼ活性によってＩｓｏＴとＶｐｒの酵母中での相互作用を確認したが、Ｖｐｒと陰性対照ベクターＶＰ１６はβ−ガラクトシダーゼ活性を示さなかった（図１Ｂ）。ＨＸＢ２に由来するＶｐｒタンパク質をシングルＴヌクレオチドの挿入によってフレームシフトして、７４〜７８位で５個のフレームシフトしたアミノ酸に導く。したがって、ＶｐｒのＣ末端領域（アミノ酸位置７４〜９６）はＩｓｏＴとの結合を媒介するのに必要でない。これらの残基（８４〜９４）はウイルス粒子取り込みに重要であると思われる（Paxton et al., 1993）。
【００７０】
本発明者らはまた、動物細胞におけるＶｐｒ−ＩｓｏＴ相互作用を分析するために共免疫沈降実験を行った。ＩｓｏＴ哺乳類発現ベクターをＦＬＡＧエピトープを全長ＩｓｏＴ遺伝子の５’末端と融合することによって構成した。ＶＩＰ３ベクターを修飾してＭｙｃタグ（Ｍｙｃ：Ｖｐｒ融合タンパク質）またはＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ：ＩｓｏＴ融合タンパク質）のいずれかを発現させた。ＩｓｏＴの全長クローンを、ＩｓｏＴ特異的プライマーを使用した膵臓由来のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によって得て、ＩｓｏＴであることを配列分析によって確認した後、ＦＬＡＧタグ化ＶＩＰ３ベクターにサブクローニングした。約３×１０６個の２９３Ｔ細胞（１０ｃｍプレート）を２０μｇのＦＬＡＧ−ＩｓｏＴおよび／またはＭｙｃ−Ｖｐｒと、ＣａＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を氷上で、緩い低浸透圧バッファー（０．５％のトリトン−Ｘ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル） [Complete, Roche Molecular Biochemicals]中で３０分間溶解させた。細胞溶解物を１６，０００×ｇで５分間（チェック）遠心分離することによって澄まし、上清を抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ−チェック）で免疫沈降（２時間、４℃）し、その後タンパク質Ａ結合ゲルビーズとインキュベートした。結合タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー中で沸騰させて溶出し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヤギ抗Ｍｙｃ抗体でウェスタンブロッティングによって分析した。
【００７１】
結果は、エピトープ−タグ化ＩｓｏＴとＶｐｒのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における過剰発現によって、ＶｐｒとＩｓｏＴのヒト細胞における相互作用を示した（データは示さず）。
【００７２】
実施例２ ＩｓｏＴ ｃＤＮＡ過剰発現はＨＩＶ生産を増加させる
ＨＩＶライフサイクルにおけるＩｓｏＴの役割を明らかにするため、ＩｓｏＴを偽ウイルスプラスミドで平行してトランスフェクトし、標的２９３Ｔ細胞で形質導入し、ルシフェラーゼ受容体活性についてアッセイしてウイルス上清を分析した。２９３Ｔ ＨＥＫ細胞の偽ウイルス生産のための一時的トランスフェクションを、６ウェルマイクロタイタープレート（３×１０５細胞／ウェル）中で、カルシウムホスファターゼ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。ルシフェラーゼベクタープラスミド（ゲノムＲＮＡをコード化する）、デルタプサイパッケージング構造物（全構造タンパク質ならびに制御および修飾タンパク質Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｒおよびＶｉｆをコード化する）およびＶＳＶ−ｇエンベロープ発現プラスミドを２．０：１．５：０．５（それぞれ２、１．５、０．５μｇのＤＮＡ／ウェル）の比でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ受容体活性を、ウイルス上清の等量アリコートで２９３Ｔ標的細胞を、９６ウェルまたは３８４ウェルフォーマットで形質導入し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質および適当な蛍光フィルターを有するＡｃｑｕｅｓｔプレートリーダーを使用して、測定した。値を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【００７３】
製造した偽ウイルスは標的細胞ゲノムへの逆転写および集積によって発現するルシフェラーゼ遺伝子のみをコード化する。第４プラスミドのコトランスフェクションにるウイルス出芽への効果の上昇または減少は、偽ウイルスプラスミド単独のときと比較して標的細胞のルシフェラーゼ活性の変化に反映される。過剰発現したＩｓｏＴの存在下でトランスフェクション後２４時間で回収したウイルス上清はウイルス生産で２倍（５０％）の増加を導いた（１０，０００ｒｌｕ対２０，０００ｒｌｕ）。トランスフェクション後４８時間で、ウイルス生産はＩｓｏＴの存在下で３倍増加した（図２Ａ）。偽ウイルス感染性における２４および４８時間後のウイルス生産の観察された増加に伴って、本発明者らはウェスタン分析によって外因性ＩｓｏＴ発現が平行して増加することを見出した。
【００７４】
ＩｓｏＴの役割をさらに評価するために、残基３３５の活性部位システインをアラニンで置換して触媒的に不活性の変異体を製造した。ＩｓｏＴ−Ｃ３３５Ａ変異体を、ＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法によって製造した部位特異的ヌクレオチド置換体を使用して製造した。ＰＣＲを天然Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）が特定した条件下で行った。ＰＣＲ産物をサブクローニング of the Ｃ３３５ＡフラグメントのＩｓｏＴ ｃＤＮＡ：ＶＩＰ３プラスミドへのサブクローニングに利用する適当な制限部位を有するように加工した。カスタムオリゴヌクレオチドプライマーをＮＮＮから商業的に得た。ＰＣＲのテンプレートはＩｓｏＴ：ＶＩＰ３構造物であった。
【００７５】
ＩｓｏＴ−Ｃ３３５Ａ変異体の発現が、不活性のときＨＩＶ偽ウイルス生産を増加させるとは予期されなかった。これは図２Ｂに示す。全長野生型（ＦＬ−ＷＴ）ＩｓｏＴの過剰発現はＣ３３５Ａ変異体と比較して約２．５倍力価が増加した。プレイ長クローンは全長クローンで観察された表現型と置換することができず、正しいコンフォメーションにおいて機能的に活性なタンパク質がウイルス力価の増加を媒介するのに重要であることを示唆した。ＦＬ−ＷＴ ＩｓｏＴ発現のＨＩＶ力価の増加に対する用量依存効果を生産細胞へＨＩＶ−１ベクタープラスミドで平行して力価判定した。逆に、Ｃ３３５Ａの発現は内因的に発現したＩｓｏＴのみで観察されたレベルと比較して、約５０％ＨＩＶ力価が減少したトランスドミナント陰性方法において作用すると思われる（図２Ｃ、０μｇ）。ＦＬおよびＣ３３５Ａ変異体タンパク質の発現レベルは、ウェスタン分析によって測定されたものと同等であった（データは示さず）。
【００７６】
実施例３ ブロッキングＶｐｒ取り込みがウイルス生産レベルを減少させる
ＶｐｒのＨＩＶビリオン取り込み変異体を、デルタプサイパッケージングプラスミドにおけるＶｐｒのコドン３０で、アラニンをリジンで置換することによって製造した。案の定、Ｖｐｒ−Ａ３０Ｌビリオン取り込み変異体はＷＴウイルス生産と比較して、標的２９３Ｔ細胞におけるレポーターウイルスのルシフェラーゼ活性を測定すると、ウイルス生産において４０％の減少を導いた（図３Ａ）。対照的に、核局在化に欠陥がある変異体Ｖｐｒ（Ｗ５４Ｒ）はウイルス生産にほとんど効果がなかった。ｐ２４レベルもウイルス上清のアリコートから定量したが、これは図３Ａの感染性の減少が生産細胞から放出されたウイルス粒子の数が４０％減少したことと関連した（データは示さず）。製造したウイルスの感染性はＶｐｒに導入し、ｐ２４レベルに正規化した変異体には影響しなかった（図３Ｂ）。
【００７７】
実施例４ ＩｓｏＴ減少によるＨＩＶ粒子生産の阻害
ＩｓｏＴの過剰発現が上昇したウイルスベクター生産を導き、Ｖｐｒのブロッキング取り込みがウイルスベクター生産の減少を導くという観察から、本発明者らは次に、ＩｓｏＴおよびＶｐｒのＨＩＶ−１ベクター生産における減少効果を試験した。ＩｓｏＴおよびＶｐｒ標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ効果を確認するため、前日にＩｓｏＴおよびＶｐｒ ＲＮＡそれぞれを標的とする低分子干渉ｓｉＲＮＡを導入した後、ＦＬＡＧタグ化ＩｓｏＴおよびＭｙｃタグ化Ｖｐｒを２９３Ｔにおいて過剰発現させた。２つのｓｉＲＮＡをＩｓｏＴ、ＶｐｒおよびＴａｔに対して各々設計し、QiagenにＨＰＰグレードを発注した。具体的には、ＩｓｏＴ特異的ｓｉＲＮＡの配列は：ＩｓｏＴ １： 5’-AGUUCACCUUCGGCUUAGAUU-3’ (SEQ ID NO:1)；およびＩｓｏＴ ２： 5’-GGCAGAUGGGUGAUCUACA-dTdT-3’ (SEQ ID NO:2)である。Ｖｐｒ特異的ｓｉＲＮＡの配列は： Ｖｐｒ １： 5’-GGAGUGGAAGCCAUAAUAA-UU-3’ (SEQ ID NO:3)；およびＶｐｒ ２： 5’-ACAACUGCUGUUUAUCCAUUU-3’ (SEQ ID NO:4)である。Ｔａｔ特異的ｓｉＲＮＡの配列は：Ｔａｔ １： 5’-CUGCUUGUACCAAUUGCUA-dTdT-3’ (SEQ ID NO:5)；およびＴａｔ ２： 5’-GCCUUAGGCAUCUCCUAUG-dTdT-3’ (SEQ ID NO:6)である。２つのｓｉＲＮＡを１：１の比で組合せ、他に記載がない限りプールとして使用した。実験で使用した他のｓｉＲＮＡはDharmacon Researchに発注した。
【００７８】
試験した全てのｓｉＲＮＡがＩｓｏＴまたはＶｐｒのレベルを効果的に減少させた（データは示さず）ため、選択したｓｉＲＮＡは有効である。別注のＩｓｏＴ抗体の生産に際して、内因性ＩｓｏＴの減少を確認した。内因性レベルの高度な減少を、４８時間と比較して７２時間で観察した。アラマーブルー（ミトコンドリア活性）および細胞力価ｇｌｏ（ＡＴＰ放出）細胞生存率キット試薬によって評価した２９３Ｔ細胞生存率に効果はなかった（データは示さず）。
【００７９】
ＩｓｏＴ減少のウイルスベクター生産に対する影響を評価するため、２９３Ｔ細胞をｓｉＲＮＡで処理し、翌日偽ウイルスプラスミドでトランスフェクションし、そしてウイルスを２日後に収穫し、２９３Ｔ標的細胞における感染性を測定した。ＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴおよびＶｐｒタンパク質の減少は、２９３Ｔ標的細胞において評価すると力価の減少を導いた（図４）。ＩｓｏＴ減少は６０％の力価（感染性）の減少を導いた（図４Ａ）。これは非飽和状態に依存し；ウイルス生産量は生産細胞へのデルタプサイ（構造遺伝子）のトランスフェクト量、および／またはウイルス収穫までの時間の長さ（４８時間後、ウイルス生産量は典型的には飽和した）によって規制されるように線形の範囲であった。驚くべきことに、Ｖｐｒレベルの減少はＴａｔレベルの減少と比較して重度にウイルス生産を減少させた。デルタプサイパッケージングプラスミドから非飽和状態下で生産されるＶｐｒのレベルの減少は、明らかにこのアッセイにおいて感染性ウイルス粒子形成に重要である。使用したｓｉＲＮＡはいずれも、２９３Ｔにおいて全く毒性を示さなかった（図４Ｂ）。
【００８０】
ＶｐｒおよびＴａｔの減少が効果的にウイルス生産を減少させるが、ＩｓｏＴ減少は感染性ウイルス生産を６０％のみ減少させるという観察は、大部分が、ＴａｔおよびＶｐｒのデノボ合成の前に低分子干渉ＲＮＡを添加したためであろう。これは外因性対内因性ＩｓｏＴのＩｓｏＴ減少で観察された結果と類似している。ＲＮＡ干渉の前に合成されたＩｓｏＴタンパク質がＶｐｒによってなおも使用され、出芽および放出を促進していると思われる。ＩｓｏＴを標的とする５つの独立した、個性的なｓｉＲＮＡがタンパク質発現およびＨＩＶ偽ウイルス力価を効果的に減少させた（データは示さず）。
【００８１】
実施例５ ＩｓｏＴおよびＶｐｒレベルの減少はＨＩＶ−１ IIIb複製を減少させる
本発明者らは次に、ＨＩＶ複製可能な細胞におけるＩｓｏＴおよびＶｐｒ減少の効果を試験しようとした。この目的のために、ＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ受容体細胞をＨＩＶ ＩＩＩｂで感染させ、その後ｓｉＲＮＡ処理を行った。ＨｅＬａ−ＣＤ４−βｇａｌ細胞（Kimpton et al., J Virol 66:2232-2239, 1992）はAIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIHを通じてDr. Michael Emermanから得た。結果は、感染の７２時間後、ＩｓｏＴまたはＶｐｒ減少によって、全く細胞毒性が観察されることなく、ＨＩＶ複製がおよそ４０％減少した（図５）。Ｔａｔレベルの減少によって約８５％複製が減少した。宿主細胞因子の減少による細胞毒性の対照として、ＲＮＡ干渉を使用してＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルを減少させた。減少したＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルの存在下での細胞生存率の顕著な減少がウイルス複製の観察された阻害を十分に説明した。これらのデータは、許容細胞におけるＨＩＶ−１複製を効果的に補助し、機構が細胞毒性に貢献しないというＩｓｏＴおよびＶｐｒの役割と一致する。
【００８２】
本発明者らはまた、正常上皮細胞におけるＩｓｏＴレベルの減少の影響を評価した。この目的のため、ＩｓｏＴレベルを低分子干渉ＲＮＡを使用してＩＯＳＥ−８０細胞において減少させた。結果は、ＩｓｏＴレベルの減少が正常上皮細胞の生存能力には影響しないが、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルの減少は生存率を６５％減少させることを示した（データは示さず）。これらの結果は、ＩｓｏＴ機能の下方制御が正常の、非感染細胞の生存能力に影響しないことを示す。
【００８３】
実施例６ 本発明のスクリーニング法によるＨＩＶ阻害化合物の同定
この実施例は上記方法を使用したＨＩＶ阻害剤の同定について記載する。具体的には、低分子有機化合物のライブラリーをハイスループット形式でスクリーニングした。試験化合物を、ＩｓｏＴの阻害能についてスクリーニングした。１次スクリーニングによって同定したヒットした化合物を、さらにＨＩＶ感染の阻害効果について試験した。簡潔に述べると、ユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）を基質として使用したＩｓｏＴ酵素活性の生化学アッセイを開発した。ＩＭＣのＩｓｏＴによる分裂および遊離が３８０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放射蛍光シグナルを発生する。化合物の存在下での切断活性の阻害はスクリーニングヒットを構成する。内部での低分子化合物回収（１．７×１０６化合物）を、１５３６ウェルＨＴＳ形式で、内部で作成したＩｓｏＴ酵素を使用してスクリーニングした。スクリーニングヒット率は０．４％であった。オリジナルヒット（１，７６１の化合物の８７．３％が入手可能と再確認）を、第１に細胞毒性化合物の再確認、除去に供し、そして精製した化合物のアッセイを行った。同定された化合物はＨＩＶ複製の阻害活性について試験し、他の優先順位の特徴（例えば有効性、選択窓、化学的な取り扱いやすさ）を試験した。潜在的なＨＩＶ阻害剤として同定した６個の化合物が存在した。
【００８４】
かくして同定したＨＩＶ阻害化合物の代表は、化合物Ａである。この化合物のＩｓｏＴプロテアーゼ阻害についてのＩＣ５０は１２９ｎＭである。化合物のＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ感染モデルにおけるＨＩＶ ＩＩＩｂに対する抗ウイルス活性についてのＥＣ５０は６．１４μＭであり、細胞毒性は観察されなかった。脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素に対してアッセイを行ったとき、当該化合物はＩｓｏＴ、ならびにミクロレベルのＵＣＨ−Ｌ１およびＵＳＰ７よりも低い程度のＵＣＨ−Ｌ３およびＵＳＰ２ｉｓｏ２の阻害が示された。阻害はイソペプチダーゼ活性に特異的であり、システインプロテアーゼのパネルには阻害が観察されなかった（データは示さず）。ＩｓｏＴプロテアーゼ活性の直接阻害についての更なる支持を、テトラユビキチン切断アッセイ、次いで抗Ｕｂ抗体を使用したウェスタン分析を使用して得た。結果は、化合物を力価評価すると、テトラユビキチンの阻害に良好な用量依存性が存在することを示した。化合物Ａのモル濃度が増加すると、製造された遊離（切断）ユビキチンレベルの減少が存在する。見かけのＩＣ５０は約１００ｎｍであり、これは生化学アッセイにおいてＩｓｏＴ阻害について観察されたＩＣ５０と良好に相関する。これらのデータはさらに、化合物によるＨＩＶ複製の阻害がＩｓｏＴ活性の阻害によることを支持する。ハイスループットスクリーニングデザインならびにスクリーニングに使用した物質および方法は、以下に詳述する。
【００８５】
ＩｓｏＴハイスループットスクリーニングデザイン：アッセイデザインはDang et al. （Biochemistry. 37:1868-79, 1998）の方法を基礎とし、さらに１５３６ウェル形式におけるウルトラＨＴＳについて最適化した。簡潔に述べると、イソペプチダーゼ活性をユビキチンＡＭＣ基質からＡＭＣの遊離を通じて検出し、蛍光シグナルを測定する。阻害剤化合物またはユビキチンアルデヒドの存在下では、プロテアーゼ活性を阻害する：完全反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．８）中、５μＬ／ウェルの３６０ｐＭのＩｓｏＴを黒色個体非ＴＣ１５３６ウェルプレート（Greiner Bio-one, Cat＃ 789176）に、カスタムBottleValve液体分配機によって分注し、５０ｎＬ １ｍＭの化合物および対照（Ｕｂアルデヒド）を本発明者らの社内取り付けＰｉｎＴｏｏｌを使用して移し（最終化合物濃度１０μＭ）、そして相互作用を３時間、３７℃で進行させる。１μＬ ３００ｎＭのＵｂ−ＡＭＣを分注し、反応物を２０分間、３０℃でインキュベートする。蛍光強度をViewLuxプレートリーダー（PerkinElmer）を使用して測定する。化合物の用量依存性およびＩＣ５０測定についての滴定を、Minitrak装置（Packard BioScience）を使用して、ＤＭＳＯでの半対数（half-log）連続希釈について行う。
【００８６】
ＩｓｏＴ酵素の製造：ＩｓｏＴをｐＲＳＥＴａへと、標準的なクローン化方法を使用してクローン化し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換する。タンパク質の発現を、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したことを除き既出のとおり（Lesley et al., 2002）に行った。タンパク質の精製を以下のとおりに行った：４グラムの細胞ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．９からなる溶解バッファー４０ｍｌ中に再懸濁し、４×１分間超音波を加えた。１５，０００×ｇで２０分間スピンさせた後、澄明な溶解物を、ニッケルを入れた１．５ｍｌのベッド体積のChelating-sepharose FastFlow （Amersham）を含むカラムに注いだ。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾールおよび１０％ グリセロール、ｐＨ７．９からなる洗浄バッファー７．５ｍｌで洗浄した。タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール、１０％ グリセロール、ｐＨ８．０からなる溶出バッファー４．５ｍｌで溶出した。
【００８７】
ＩｓｏＴ阻害剤のＨＩＶ ＩＩＩｂに対する試験：ＩｓｏＴスクリーニングからＤＭＳＯで希釈した化合物を、１ｍＭから出発して、３８４ウェルポリプロピレン化合物プレート（Greiner）に並べ、次いでＤＭＳＯでの半対数連続希釈で、合計８個、Minitrak装置（Packard Bioscience）を使用して製造した。ＨｅＬａＣＤ４βｇａｌ細胞（１５００／５０μＬ／ウェル）を３８４ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、一晩密着の後、５００ｎＬの化合物を３つの複製細胞プレートに、Minitrak（Packard Bioscience）を使用して、感染性および細胞毒性試験のために移し、１０μＭから出発して最終化合物連続希釈を得た。３０分後、ＨＩＶ−ＩＩＩｂ（１６ｎｇ／１０μＬ／ウェル）を感染性試験細胞プレートに加えた。化合物およびウィルス添加の３日後、５０μＬのGal Screen（Applied Biosystems）を感染細胞に加え、１時間後にCLIPR （Molecular Devices）で蛍光を読み取って、感染を評価した。５０μＬの１：４希釈Cell Titer Glo （Promega）を感染細胞に加え、１時間後にCLIPRで読み取って、細胞毒性を評価した。用量応答測定を標準のシグモイド型用量応答式を使用して解釈した。社内の曲線適合コンピュータプログラムをＩＣ５０の計算に使用した。
【００８８】
ＩｓｏＴ阻害剤によるテトラユビキチン（Ｕｂ４）切断の阻害：ＩｓｏＴを反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ＝７．８）で最終濃度７６０ｐＭとなるように希釈し、１８μＬを９個のエッペンドルフチューブそれぞれに加えた。化合物２０９６をＤＭＳＯで、２００μＭから出発して合計８個、半分対数連続希釈した。１μＬの各希釈物をＩｓｏＴのチューブに加え、アッセイチューブ中１０μＭから出発する連続希釈を得た。最大切断についての対照として、１個のチューブに１μＬのＤＭＳＯのみを加えた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、１μＬの反応バッファー中テトラユビキチン（Ｕｂ４；Biomol）の２５０μｇ／ｍＬ溶液を各チューブに加え、当該チューブを３７℃で１８時間さらにインキュベートした。変性タンパク質サンプルバッファー（Invitrogen）を加え、全サンプルを沸騰させ、４〜１２％NuPage bis-Tris ゲル（Invitrogen）にロードし、製造者の指示通りにゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースへと移した後、ブロットをＰＢＳＴ（０．０５％ Tween２０を含むリン酸緩衝化食塩水）中５％無脂肪ミルクでブロックし、ユビキチンに対するウサギポリクローナル抗体（上記ＰＢＳＴ中５％無脂肪ミルクで１：１０００に希釈）で、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ２次抗体（ＰＢＳＴ中５％無脂肪ミルクで１：３０００、Southern Biotechnologies）でのイムノブロッティングに供した。バンドをＥＣＬプラス検出試薬（Amersham）を使用して可視化した。
【００８９】
本明細書に記載の例および態様は例示のみを目的としており、その範囲内で様々な修飾または改変が当業者には提案され、そして本願および添付の特許請求の範囲の技術的範囲に含まれることが理解される。本明細書に記載のものと類似または同様のあらゆる方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および物質は記載されている。
【００９０】
本明細書に記載した全ての文献、GenBank配列、特許および特許公報は、各々そのように記載されているが如く、その全体について、あらゆる目的のために本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１Ａ−１ＢはＶｐｒのＩｓｏＴへの結合を示す：（Ａ）概略図およびＩｓｏＴプレイクローンの位置を酵母−２−ハイブリッドを全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡと比較して同定した。プレイクローンは２個のＵＢＡドメインを有するＣ末端２２７アミノ酸を含む。本明細書で使用する全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡクローンを膵臓由来のｃＤＮＡライブラリから増幅した。Ｃ３３５の相対位置（活性部位システイン）を示す。（Ｂ）ＶｐｒとＩｓｏＴの特異的相互作用を示すために、β−ガラクトシダーゼフィルターリフトアッセイを使用して酵母−２−ハイブリッドをアッセイする。ＶＰ１６は空ベクターである。
【００９２】
【図２】図２Ａ−２Ｃは野生型ＩｓｏＴ過剰発現がＨＩＶ−１ウイルスの力価を増加させるが、活性部位変異はそうではないことを示す：（Ａ）全長（ＦＬ）野生型ＩｓｏＴの過剰発現がトランスフェクション後２４および４８時間で偽ウイルス過剰発現を増加させる。２９３Ｔ細胞をＩｓｏＴをコード化する第４ｃＤＮＡの存在下（＋）または非存在下（−）において３個の偽ウイルスプラスミドとコトランスフェクトした。レポーターウイルス上清をトランスフェクション後２４または４８時間で回収し、２９３Ｔ標的細胞におけるレポーター活性についてアッセイした。細胞溶解物を平行してウェスタン分析で、ＩｓｏＴ特異的抗体を使用して内因性ＩｓｏＴ発現ならびにＩｓｏＴ過剰発現について分析した。１列目はプラスミドでトランスフェクトしていない、トランスフェクション試薬のみのものである。（Ｂ）２９３Ｔ細胞を（Ａ）のとおりに、第４プラスミドとしてＶＩＰ３（プラスミド骨格）、ＦＬ−野生型、ＰＬ−Ｃ末端２２７、またはＦＬ−Ｃ３３５Ａでコトランスフェクトした。トランスフェクション後３０時間に回収したウイルス上清由来のルシフェラーゼレポーター活性を２９３Ｔ標的細胞においてアッセイした。（Ｃ）ＨＩＶ力価に対する用量依存関数効果。ＦＬ−ＷＴおよびＦＬ−Ｃ３３５Ａを力価判定し、平行して第４プラスミドとして偽プラスミドとトランスフェクトした。
【００９３】
【図３】図３Ａ−３ＢはＶｐｒ（Ａ３０Ｌ）ウイルスの減少した出芽が感染性ではなく減少した粒子生産と関連することを示す。２９３Ｔ細胞を偽ウイルスＤＮＡ発現ＷＴおよびＶｐｒの変異型とトランスフェクトした。（Ａ）ＷＴまたは核局在化変異体Ｗ５４Ｒではなく、Ａ３０Ｌ Ｖｐｒ取り込み変異体は、２９３Ｔ標的細胞における感染性によって測定するとウイルス力価を減少した。（Ｂ）ｐ２４レベルを標的２９３Ｔ細胞を感染するために使用した偽ウイルスインプットについて、（Ａ）から標準化（９．３８ｎｇ）した。
【００９４】
【図４】図４Ａ−４ＢはＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏が２９３Ｔ細胞における偽ウイルス生産を阻害することを示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３（陰性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、ウェルあたり２：０．０５：０．５または１００ｎｇ：２．５ｎｇ：２５ｎｇのベクターＲＮＡ：デルタプサイ：ｅｎｖの比で、３プラスミド偽ウイルス系のｃＤＮＡトランスフェクションに供した。３つの複写ウェルを条件毎に行った。ウイルス上清を４８時間後に回収し、標的２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。これらの形質導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を４８時間後に測定し、Ａに示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３に対するｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。７２時間後細胞生存率をCellTiterGloを使用し、蛍光を測定して決定した。
【００９５】
【図５】図５はＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏がＨｅＬａ−ＣＤ４−β−ｇａｌ細胞におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩｂ複製を阻害することを示す。細胞をＴａｔ、ＩｓｏＴ、Ｖｐｒ、ルシフェラーゼＧＬ２（陰性対照）、またはＰｏｌＲ２Ａ（細胞毒性についての陽性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。２４時間培養後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩｂに感染させる。β−ガラクトシダーゼ活性を、感染の測定として感染後７２時間で測定した。細胞毒性をｓｉＲＮＡトランスフェクト非感染細胞について平行して測定した。データを陰性対照ＧＬ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞によって発生したシグナルの割合として表現する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は米国仮出願第６０／６７３，６２３（出願日：２００５年４月２１日）に基づき合衆国法典第３５巻、１１９条（ｅ）の優先権を主張する。先の出願の開示はその全体をあらゆる目的のために引用し、本明細書の一部とする。
【０００２】
発明分野
本発明は、一般的にＨＩＶ感染を阻害する化合物を同定するための方法と、当該化合物の治療的に関する。より具体的には、本発明はイソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）の阻害剤をスクリーニングすること、そしてかかる阻害剤をＨＩＶの処置または予防のために使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はレトロウイルス科に属するレンチウイルスである。性的接触および妊娠期間中のＨＩＶの感染は世界中のＡＩＤＳ症例のほぼ９０％を占めると概算された。この感染は、感染個体の体液、例えば精液、膣分泌物または血液に曝露されたとき、性器の粘膜または胎盤を通じてＨＩＶが通過して引き起こされる。のこりのＡＩＤＳ症例はＨＩＶに汚染された血液の輸血、静脈内薬剤使用者間の針の共有、侵襲処置におけるＨＩＶ汚染体液への事故的曝露、そして感染ウイルスが受容ヒト組織へ直接接触することができる他の状況のためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在利用可能なＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの処置用薬剤は満足のいくものではない。ＨＩＶを処置するための一般薬剤、例えばＡＺＴまたはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の毒性または望ましくない副作用は、有効医薬濃度で使用したときそれらの抗ウイルス活性と相容れない。したがって、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染を予防および処置するためのよりよい他の化合物に対するこの分野における要求は未だに存在する。本発明は、このおよび他の要求に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
ある態様において、本発明はＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定するための方法を提供する。当該方法は、イソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）分子の生物学的活性を試験化合物の存在下でアッセイして、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定することを必要とする。これらの方法は、同定した化合物のＨＩＶ感染阻害能をさらに試験することを含むことができる。ある方法では、アッセイする生物学的活性はＩｓｏＴ分子のイソペプチダーゼ活性または他の分子（例えばユビキタンまたはＶｐｒ）とのその結合である。また、ＩｓｏＴ分子をコード化する遺伝子の発現であってもよい。典型的には、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子は哺乳類細胞に由来する。好ましい態様において、ヒトＩｓｏＴ分子を使用する。
【０００６】
これらのスクリーニング法のいくつかにおいて、同定した化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理した人工ＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する。これらの方法のいくつかにおいて、使用するＨＩＶ許容細胞はＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である。ある方法において、ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする。
【０００７】
本発明の他の方法において、同定されたＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する。使用される宿主細胞は２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である。いくつかの方法では、宿主細胞を、細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトする。
【０００８】
関連する局面において、本発明はＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法には、第１に試験化合物をスクリーニングしてＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとのその結合を下方制御するＩｓｏＴ調節化合物を同定すること、次に同定したＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染阻害能について試験することを含む。典型的には、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子は哺乳類細胞に由来する。好ましい態様において、スクリーニングに使用するＩｓｏＴ分子はヒトＩｓｏＴである。
【０００９】
これらの方法のいくつかにおいて、ＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理したＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する。いくつかの方法において、使用されるＨＩＶ許容細胞はＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である。いくつかのスクリーニング法において、ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする。
【００１０】
他の方法において、ＩｓｏＴ調節化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する。使用される宿主細胞は２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である。いくつかの方法では、宿主細胞を、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトする。
【００１１】
他の態様において、本発明は対象のＨＩＶ感染を処置する方法を提供する。かかる方法は、ＨＩＶ感染を有する対象に、有効量のＩｓｏＴ調節化合物を含む医薬組成物を投与することを必要とする。ＩｓｏＴ調節化合物はＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性、ＶｐｒとのＩｓｏＴ結合またはＩｓｏＴをコード化する遺伝子の発現を下方制御することができる。いくつかの方法において、使用するＩｓｏＴ調節化合物はヒトＩｓｏＴを下方制御することができる。いくつかの方法において、使用するＩｓｏＴ調節化合物はインビトロでＩｓｏＴ発現細胞におけるＨＩＶ複製を阻害することができる。これらの治療法において、ＩｓｏＴ調節化合物を既知の抗ＨＩＶ薬剤と共に投与することがある。いくつかの方法において、ＩｓｏＴ阻害薬剤はＩｓｏＴ活性を特異的に阻害する本発明によって同定された化合物である。他の方法において、ＩｓｏＴ阻害薬剤はＩｓｏＴの発現または細胞レベルを特異的に下方制御する核酸分子、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡである。
【００１２】
本発明の性質および利点の更なる理解を、明細書および特許請求の範囲の残りの部分を参照することによって理解することができる。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１ＢはＶｐｒのＩｓｏＴへの結合を示す：（Ａ）概略図およびＩｓｏＴプレイクローンの位置を酵母−２−ハイブリッドを全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡと比較して同定した。プレイクローンは２個のＵＢＡドメインを有するＣ末端２２７アミノ酸を含む。本明細書で使用する全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡクローンを膵臓由来のｃＤＮＡライブラリから増幅した。Ｃ３３５の相対位置（活性部位システイン）を示す。（Ｂ）ＶｐｒとＩｓｏＴの特異的相互作用を示すために、β−ガラクトシダーゼフィルターリフトアッセイを使用して酵母−２−ハイブリッドをアッセイする。ＶＰ１６は空ベクターである。
【００１４】
図２Ａ−２Ｃは野生型ＩｓｏＴ過剰発現がＨＩＶ−１ウイルスの力価を増加させるが、活性部位変異はそうではないことを示す：（Ａ）全長（ＦＬ）野生型ＩｓｏＴの過剰発現がトランスフェクション後２４および４８時間で偽ウイルス過剰発現を増加させる。２９３Ｔ細胞をＩｓｏＴをコード化する第４ｃＤＮＡの存在下（＋）または非存在下（−）において３個の偽ウイルスプラスミドとコトランスフェクトした。レポーターウイルス上清をトランスフェクション後２４または４８時間で回収し、２９３Ｔ標的細胞におけるレポーター活性についてアッセイした。細胞溶解物を平行してウェスタン分析で、ＩｓｏＴ特異的抗体を使用して内因性ＩｓｏＴ発現ならびにＩｓｏＴ過剰発現について分析した。１列目はプラスミドでトランスフェクトしていない、トランスフェクション試薬のみのものである。（Ｂ）２９３Ｔ細胞を（Ａ）のとおりに、第４プラスミドとしてＶＩＰ３（プラスミド骨格）、ＦＬ−野生型、ＰＬ−Ｃ末端２２７、またはＦＬ−Ｃ３３５Ａでコトランスフェクトした。トランスフェクション後３０時間に回収したウイルス上清由来のルシフェラーゼレポーター活性を２９３Ｔ標的細胞においてアッセイした。（Ｃ）ＨＩＶ力価に対する用量依存関数効果。ＦＬ−ＷＴおよびＦＬ−Ｃ３３５Ａを力価判定し、平行して第４プラスミドとして偽プラスミドとトランスフェクトした。
【００１５】
図３Ａ−３ＢはＶｐｒ（Ａ３０Ｌ）ウイルスの減少した出芽が感染性ではなく減少した粒子生産と関連することを示す。２９３Ｔ細胞を偽ウイルスＤＮＡ発現ＷＴおよびＶｐｒの変異型とトランスフェクトした。（Ａ）ＷＴまたは核局在化変異体Ｗ５４Ｒではなく、Ａ３０Ｌ Ｖｐｒ取り込み変異体は、２９３Ｔ標的細胞における感染性によって測定するとウイルス力価を減少した。（Ｂ）ｐ２４レベルを標的２９３Ｔ細胞を感染するために使用した偽ウイルスインプットについて、（Ａ）から標準化（９．３８ｎｇ）した。
【００１６】
図４Ａ−４ＢはＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏が２９３Ｔ細胞における偽ウイルス生産を阻害することを示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３（陰性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、ウェルあたり２：０．０５：０．５または１００ｎｇ：２．５ｎｇ：２５ｎｇのベクターＲＮＡ：デルタプサイ：ｅｎｖの比で、３プラスミド偽ウイルス系のｃＤＮＡトランスフェクションに供した。３つの複写ウェルを条件毎に行った。ウイルス上清を４８時間後に回収し、標的２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。これらの形質導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を４８時間後に測定し、Ａに示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３に対するｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。７２時間後細胞生存率をCellTiterGloを使用し、蛍光を測定して決定した。
【００１７】
図５はＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏がＨｅＬａ−ＣＤ４−β−ｇａｌ細胞におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩｂ複製を阻害することを示す。細胞をＴａｔ、ＩｓｏＴ、Ｖｐｒ、ルシフェラーゼＧＬ２（陰性対照）、またはＰｏｌＲ２Ａ（細胞毒性についての陽性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。２４時間培養後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩｂに感染させる。β−ガラクトシダーゼ活性を、感染の測定として感染後７２時間で測定した。細胞毒性をｓｉＲＮＡトランスフェクト非感染細胞について平行して測定した。データを陰性対照ＧＬ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞によって発生したシグナルの割合として表現する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
詳細な説明
Ｉ．概説
本発明は一部において、ＩｓｏＴがＨＩＶ感染に関与するという本発明者らの発見に基づく。ヒトＩｓｏＴは、遊離Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖のモノマーへの分解に関与する９３ｋＤａの亜鉛結合脱ユビキチン化酵素である。本発明者らはＩｓｏＴがＨＩＶ−１ウイルスのウイルス性タンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）の結合パートナーであることを見出した。Ｖｐｒは、単球およびマクロファージにおけるＨＩＶウイルス複製に必須であり、Ｔ細胞およびＴ細胞株におけるウイルス複製を増加させる９６アミノ酸、１４ｋＤａ付属タンパク質である（例えば、Cohen et al., J Virol 64:30973099, 1990；Paxton et al., J Virol 67:72297237, 1993；およびAndersen et al., Curr HIV Res. 3:43-51, 2005参照）。本発明者らはまた、活性部位変異体ではなく野生型ＩｓｏＴの過剰発現が生産細胞由来のウイルス力価を上昇させることを見出した。さらに、低分子干渉ＲＮＡを用いたＩｓｏＴレベルの欠乏がＨＥＫ２９３Ｔ生産細胞におけるウイルス力価を減少させ、そして実験室株ＨＩＶ−１（ＩＩＩｂ）およびＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌにおけるＨＩＶ−１ ＢａＬ、ならびにＵ３７３ ＨＩＶ−１インジケーター細胞株それぞれの感染性を減少させることを発見した。これらのデータはＩｓｏＴが宿主細胞からのＨＩＶ−１放出の効果を上昇させるのに重要な役割を果たしていることを示す。
【００１９】
これらの発見により、本発明はＨＩＶ感染を阻害する新規薬剤をスクリーニングする方法を提供する。試験化合物を、第１にＩｓｏＴ分子の生物学的活性、例えばその発現、そのＶｐｒとの相互作用、またはそのイソペプチダーゼ活性を調節する能力についてスクリーニングする。したがって同定された薬剤を、典型的にはさらにＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染を示す活性を調節する能力について試験する。様々なＩｓｏＴ分子をスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。例えば、ヒト、ウサギ、ラットまたはマウス由来のＩｓｏＴを調節剤のスクリーニングのために使用することができる。いくつかの好ましい態様において、ヒトＩｓｏＴ分子を使用する。本発明に開示したスクリーニング法の有用性を例示するために、本発明者らはヒトＩｓｏＴの阻害剤のために低分子化合物のハイスループットスクリーニングを行った。下記実施例に詳述するとおり、ＩｓｏＴを阻害することによる抗ウイルス活性を有する化合物がスクリーニングによって同定された。
【００２０】
本発明はまた、治療使用を含む。ＩｓｏＴ活性の薬理学的阻害はＨＩＶ感染に関連する状態の処置または予防の新規アプローチを提供する。典型的には、アプローチには本発明によって同定することができるＩｓｏＴ阻害剤（例えばｓｉＲＮＡまたは低分子有機化合物）を対象に投与することを含む。
【００２１】
以下の項は本発明の組成物を製造し、使用するための、そして本発明の方法を実施するための指標を提供する。
【００２２】
ＩＩ．定義
他に定義がない限り、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明が属する分野における当業者が通常理解するとおりの意味を有する。下記文献は当業者に本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供する： Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000)； Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley ＆ Sons (3rd ed., 2002)；および A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。さらに、下記定義を本発明の実施において読者を補助するために提供する。
【００２３】
「試験薬剤」または「試験化合物」なる用語には、あらゆる物質、分子、要素、化合物、実体、またはそれらの組合せを含む。限定されないが、例えばタンパク質、ポリペプチド、小有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等が含まれる。天然物、合成化合物または化学化合物または２種以上の物質の組合せであり得る。特に記載がない限り、「薬剤」、「物質」および「化合物」なる用語は相互に交換可能に使用することができる。
【００２４】
本明細書において「アナログ」なる用語は、参照分子と構造的に類似しているが参照分子の特定の置換基を別の置換基で置換することによって標的化および制御方法が修正されている分子を意味するものとして使用する。参照分子と比較して、アナログは同一の、類似のまたは改善された有用性を示すものと、当業者には予期される。アナログの合成およびスクリーニングは改善された特徴（例えば標的分子に対する高い結合親和性）を有する既知の化合物の変異体を同定するための薬学化学において周知の方法である。
【００２５】
ＨＩＶはレトロウイルスのファミリーであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を意味する。限定されないが、これらのウイルスにはＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−ＩＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＬＡＶ−１、ＬＡＶ−２としても知られる)等が含まれる。本明細書において使用するとき、ＨＩＶはＨＩＶファミリーにおけるあらゆる株、形態、サブタイプおよび変異体であり得る。
【００２６】
２個の核酸配列またはアミノ酸配列の文脈中での「同一」または「配列同一」なる用語は、特定の比較窓にわたって最大対応を並べたとき、２個の配列における残基が同じであることを意味する。比較のための配列のアラインメント法は、当業者に既知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズムによって； Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443のアラインメントアルゴリズムによって； Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 85:2444の同一性の調査法によって；by computerized implementations of these algorithms これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（限定されないが、Intelligentics, Mountain View, CAによるPC/GeneプログラムのCLUSTAL；およびWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.におけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、またはTFASTAを含む）によって、行うことができる。アラインメントは、検査およびマニュアルアラインメントによってしばしば行うこともできる。
【００２７】
「実質的に同一の」核酸またはアミノ酸配列なる用語は、上記プログラム（例えばＢＬＡＳＴ）を標準的なパラメータを用いて使用して標準配列と比較したとき、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、そしてもっとも好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する配列を含む核酸またはアミノ酸を意味する。好ましくは、実質的同一性は少なくとも約５０残基長である配列領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、そしてもっとも好ましくは配列は少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。もっとも好ましい態様において、配列はコーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００２８】
ＩｓｏＴ分子の生物学的活性に関する「調節」なる用語は、ＩｓｏＴの細胞レベル、細胞内局在性または他の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性）における変化を意味する。ＩｓｏＴ活性の調節は上方制御（すなわち、活性化または刺激）あるいは下方制御（すなわち阻害または抑制）であってよい。例えば、調節は細胞レベル、あるいはＩｓｏＴの酵素的修飾（例えばリン酸化）、結合特性（例えばＶｐｒまたは基質への結合）、またはＩｓｏＴタンパク質の他の生物学的、機能的または免疫学的特徴における変化を引き起こし得る。活性の変化は例えば、ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現、ＩｓｏＴタンパク質をコード化するｍＲＮＡの安定性、翻訳効率の増加もしくは減少、またはＩｓｏＴ酵素の他の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性）の変化によって引き起こされ得る。ＩｓｏＴモジュレーターの作用の形態は、直接、例えばＩｓｏＴタンパク質またはＩｓｏＴタンパク質をコード化する遺伝子に結合することによっていても良い。変化はまた、関節、例えばＩｓｏＴを調節する他の分子と結合および／または修飾（例えば酵素的に）することによっていても良い。
【００２９】
「対象」なる用語は、哺乳類、とりわけヒトを意味する。これは他の非ヒト動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルを含む。
【００３０】
ＩｓｏＴのような分子の「変異体」は、分子全体またはそのフラグメントと構造および生物学的活性が実質的に同一の分子を意味する。したがって、２個の分子が類似の活性を有するならば、一方の分子の構成または２次、３次もしくは４次構造が他方のものと同一でなくとも、あるいはアミノ酸残基の配列が同一でなくとも、それらは本明細書で使用する用語としての変異体であると考える。
【００３１】
ＩＩＩ．スクリーニングスキーム
本発明によると、ＨＩＶ感染の新規な阻害剤を、第１に試験化合物をＩｓｏＴの生物学的活性を調節（例えば阻害）する能力についてスクリーニングすることによって同定する。スクリーニングアッセイにおいてモニターするＩｓｏＴの生物学的活性は、そのイソペプチダーゼ活性であってもよい。それは他の分子、例えばＶｐｒまたはユビキチンへのその結合であってもよい。生物学的活性はまた、ＩｓｏＴ発現またはその細胞レベルであり得る。ＩｓｏＴの生物学的活性を調節する試験化合物を同定した後、それらを典型的にはさらに、ＨＩＶ感染を調節する、あるいはＨＩＶ感染もしくはＨＩＶ複製の指標である活性を調節する能力について試験する。この工程は、ＩｓｏＴの生物学的活性を調節することによって第１の工程で同定された化合物が実際にＨＩＶ感染を制御（例えば阻害）することができることを確認するために行われる。
【００３２】
当業者に周知の様々な生化学および分子生物学の技術またはアッセイをＩｓｏＴモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。かかる技術は、例えばHandbook of Drug Screening, Seethala et al. (eds.), Marcel Dekker (1st ed., 2001)；High Throughput Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 190), Janzen (ed.), Humana Press (1st ed., 2002)； Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Ed.), John Wiley ＆ Sons Inc (2002); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)； および Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)に記載されている。
【００３３】
様々な種由来のＩｓｏＴを、本発明のＩｓｏＴモジュレーターのスクリーニングにおいて使用することができる。好ましくは、哺乳類細胞由来のＩｓｏＴ分子を使用する。例えば、ヒトＩｓｏＴ（受託番号 NM_003481 および NP_003472）がクローン化され、文献、例えば Falquet et al., FEBS Lett. 376: 233-237; 1995； Wilkinson et al., Biochemistry 34:14535-14546, 1995; and Lacombe et al., FEBS Lett. 531:469-474, 2002に記載された。他の例には、チンパンジーＩｓｏＴ（受託番号 XM_526393 および XP_526393）およびマウスＩｓｏＴ（受託番号 BC066993 および AAH66993）が含まれる。あらゆるこれらのＩｓｏＴ配列または実質的にその配列と同一の配列を、本発明のＩｓｏＴモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。下記実施例に例示したとおり、ＩｓｏＴポリヌクレオチドのクローニングおよび発現、ならびにＩｓｏＴポリペプチドの精製を、通常行われている方法および技術で行うことができる。かかる方法および技術は例えば、Sambrook et al., supra；および Brent et al., supraに記載されている。ＩｓｏＴを得る具体的な方法は、文献、例えばGabriel et al., Biochemistry 41:13755 -13766, 2002にも提供されている。
【００３４】
無傷のＩｓｏＴ分子または無傷のＩｓｏＴ分子をコード化する核酸に加えて、ＩｓｏＴフラグメント（例えば触媒ドメインまたはＶｐｒ結合ドメイン）、アナログまたは機能的誘導体も使用することができる。これらのアッセイにおいて使用することができるＩｓｏＴフラグメントは通常、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとの結合）の１種以上を保持している。上記のとおり、異なる種由来のＩｓｏＴは既に配列決定され、十分に特徴付けられている。したがって、それらのフラグメント、アナログ、誘導体または融合タンパク質を当業者に周知の方法を使用して容易に得ることができる。例えば、ＩｓｏＴの機能的誘導体をタンパク質分解的切断によって天然に発生した、あるいは組み換えによって発現したタンパク質から、当業者に既知の常套の精製方法によって製造することができる。あるいは、機能的誘導体をそのイソペプチダーゼ活性を保持しているＩｓｏＴのフラグメントのみを発現することによって、組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【００３５】
ＩＶ．試験化合物
本発明の方法でスクリーニングすることができる試験化合物には、ポリペプチド、βターン模倣薬、ポリサッカライド、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロ環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造アナログまたはそれらの組合せが含まれる。試験化合物は合成分子であることもあるし、天然分子であることもある。
【００３６】
試験化合物を、合成または天然化合物のライブラリーを含む広い種類のソースから得る。コンビナトリアルライブラリーを段階的方法で合成することができる多くのタイプの化合物のために製造することができる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーをWO 95/12608、WO 93/06121、WO 94/08051、WO 95/35503およびWO 95/30642に記載のコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構成することができる。ペプチドライブラリーをファージディスプレイ法（例えばDevlin, WO 91/18980参照）によって製造することもできる。バクテリア、菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを商業的ソースから得るか、あるいは実際に収集することができる。既知の薬理学的薬剤は、構造アナログを製造するためのアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような指向性またはランダム化学修飾に供することができる。
【００３７】
他の化合物またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーを任意の位置で配列優先または固定なしで十分にランダム化することができる。あるいは、ライブラリーを偏向させることができる、すなわち配列中のいくつかの位置が一定であるか、あるいは限定された数の可能性から選択される。例えば、いくつかの場合において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏向した（小または大）残基、システインの製造の方向、架橋、ＳＨ−３ドメインに関するプロリン、セリン、スレオニン、チロシンまたはリン酸化部位に関するヒスチジン、またはプリンのような明らかなクラス内でランダム化する。
【００３８】
試験化合物は、天然に発生するタンパク質またはそれらのフラグメントであり得る。かかる試験化合物は天然ソース、例えば細胞または組織溶解物から得ることができる。ポリペプチド薬剤のライブラリーを、例えば商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラリーから製造するか、あるいは常套の方法で製造することができる。試験化合物はまた、約５〜約３０個、好ましくは約５〜約２０個、とりわけ好ましくは約７〜約１５個のアミノ酸のペプチドのようなペプチドであり得る。ペプチドは天然に発生したタンパク質の消化物、ランダムペプチドまたは「偏向した」ランダムペプチドであってもよい。いくつかの方法において、試験化合物はポリペプチドまたはタンパク質である。
【００３９】
試験化合物は核酸でもあり得る。核酸試験化合物は天然に発生した核酸、ランダム核酸または「偏向した」ランダム核酸であってもよい。例えば、原核または真核ゲノムの消化物、を上記タンパク質と同様に使用することができる。
【００４０】
好ましい態様において、試験化合物は低分子、例えば約５００または１０００未満の分子量の分子である。好ましくはハイスループットアッセイを適用し、かかる低分子をスクリーニングするために使用することができる。いくつかの方法において、上記低分子試験化合物のコンビナトリアルライブラリーを容易に使用してＩｓｏＴの低分子モジュレーターをスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングには多くのアッセイ、例えばSchultz et al., Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414, 1998； Weller et al., Mol Divers. 3:61-70, 1997; Fernandes et al., Curr Opin Chem Biol 2:597-603, 1998；およびSittampalam et al., Curr Opin Chem Biol 1:384-91, 1997に記載のものを使用することができる。
【００４１】
本発明の方法でスクリーニングする試験化合物のライブラリーはまた、ＩｓｏＴポリペプチド、それらのフラグメントまたはアナログの構造的研究に基づき製造することができる。かかる構造的研究はＩｓｏポリペプチドとより結合しやすい試験化合物を同定することができる。ＩｓｏＴポリペプチドの３次元構造を多くの方法、例えば結晶構造および分子モデリングで研究することができる。Ｘ線結晶解析を使用したタンパク質の構造研究法は文献に周知である。Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221-239, および Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg ＆ D. C. Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979)参照。ＩｓｏＴポリペプチド構造のコンピューターモデリングは、ＩｓｏＴモジュレーターをスクリーニングするための試験化合物を設計する他の方法を提供する。分子モデリング法は文献、例えばU.S. Patent No. 5,612,894、表題“System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor”およびU.S. Patent No. 5,583,973、表題“Molecular modeling method and system”に記載されている。さらに、タンパク質構造も中性子回折および核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定することができる。例えばPhysical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J. (Prentice-Hall, New Jersey 1972), およびNMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interscience, New York 1986)参照。
【００４２】
本発明のモジュレーターにはＩｓｏＴポリペプチドに特異的に結合する抗体も含むことができる。かかる抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。かかる抗体は当業者に周知の方法を使用して製造することができる。例えば、非ヒト、例えばマウスもしくはラットモノクローナル抗体の製造を、例えばＩｓｏＴ ポリペプチドまたはそのフラグメントで動物を免疫することによって行うことができる（Harlow ＆ Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988参照）。かかる免疫源は天然ソースから、ペプチド合成または組換発現によって得ることができる。
【００４３】
マウス抗体のヒト化形態を、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域と組み換えＤＮＡ技術によって結合することによって製造することができる。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) および WO 90/07861参照。ヒト抗体をファージディスプレー法を使用して得ることができる。例えばDower et al., WO 91/17271； McCafferty et al., WO 92/01047参照。これらの方法において、ファージのライブラリーが形成され、そこではメンバーは外部表面に異なる抗体を提示する。抗体はＦｖまたはＦａｂフラグメントとして通常提示される。所望の特異性を有するファージ提示抗体を本発明のＩｓｏＴポリペプチドに対する親和性濃縮によって選択する。
【００４４】
ＩｓｏＴポリペプチドに対するヒト抗体を、少なくともヒト免疫グロブリン遺伝子座および不活性内因性免疫グロブリン遺伝子座のセグメントをコード化する導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から製造することもできる。例えばLonberg et al., WO93/12227 (1993)； Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)参照。ヒト抗体を競合的結合実験またはその他によって選択して、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有することができる。かかる抗体はとりわけ、マウス抗体の有用な機能的特徴を共有する可能性がある。ヒトポリクローナル抗体はまた、免疫源で免疫したヒト由来の血清の形態で提供され得る。所望により、かかるポリクローナル抗体はＩｓｏＴポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した親和性精製によって濃縮することができる。
【００４５】
Ｖ．ＩｓｏＴモジュレーターのための試験化合物スクリーニング
ＨＩＶ感染を阻害する新規化合物を同定するために、本明細書に記載のとおり、試験化合物を第１にＩｓｏＴの生物学的活性を調節する能力についてスクリーニングする。好ましい態様において、試験化合物はＩｓｏＴのイソペプチダーゼ活性を調節（例えば阻害）する能力について試験する。ＩｓｏＴの酵素活性を調節（例えば阻害）する化合物を多くのアッセイ形式で同定することができる。例えば、下記実施例に示すとおり、スクリーニングは精製ＩｓｏＴ酵素およびユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン（methlcoumarin）（Ｕｂ−ＡＭＣ）を基質として使用して生化学アッセイを行うことができる。試験化合物のＩｓｏＴのイソペプチダーゼ活性に対する効果を当業者に既知の、例えばLacombe et al., FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002；および Gabriel et al., Biochemistry. 19:41:13755-66, 2002のＩｓｏＴ活性アッセイを使用してモニターすることができる。例えば、ＩｓｏＴの酵素活性をユビキチンダイマー基質でアッセイすることができる。ＩｓｏＴによる基質の切断は、Lacombe et al., FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002に記載のとおり、電気泳動およびクーマシー染色によって分析することができる。分枝および直線ユビキチンダイマー基質を文献、例えばGabriel et al., Biochemistry 41:13755 -13766, 2002に記載のとおり製造することができる。ユビキチンダイマーの他に、他の基質もＩｓｏＴ酵素活性のモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。例えば多くのアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）ベースのペプチド基質を、ＩｓｏＴ活性をモニターするために使用することができる（Stein et al., Biochemistry 34:12616-12623, 1995）。これらの基質（例えばZ-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC または ユビキチン−アルデヒド）は、ＩｓｏＴイソペプチダーゼの反応速度論およびＩｓｏＴ活性のユビキチンアルデヒドによる阻害を研究するために文献において使用されている（Stein et al., Biochemistry 34:12616-12623, 1995；および Melandri et al., Biochemistry 35: 12893 -12900, 1996）。
【００４６】
他の態様において、試験化合物を第１にＩｓｏＴのＶｐｒまたはユビキチンのような他の分子との結合を調節する活性についてスクリーニングすることができる。Ｖｐｒはクローン化され、下記実施例および文献、例えばAmini et al., J Biol Chem. 279:46046-56, 2004； Iijima et al., Virol. 327:249-61, 2004; Yao et al., Retrovirology. 1:21-31, 2004； および Muthumani et al., Int Immunol. 17:103-16, 2005に既知の方法を使用して発現される。多くのアッセイおよび方法をＩｓｏＴポリペプチドのＶｐｒまたはユビキチンとの結合に対する試験化合物の効果を試験するために使用することができる。これらにはタンパク質と他の化合物（他のタンパク質を含む）の相互作用を研究するために当業者に一般的に知られている方法、例えば標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、免疫沈降法、ＧＳＴプルダウンアッセイ、酵母または哺乳類２種ハイブリッドスクリーニングおよび蛍光消光または蛍光偏光が含まれる。さらに、ＩｓｏＴの他の分子（例えばユビキチン）との結合を試験するための具体的な方法は、下記実施例および文献（Amini et al., J. Biol. Chem., 279:46046-46056, 2004；および Yao et al., Retrovirology. 1:21-31, 2004参照）に提供される。
【００４７】
ある態様において、ＩｓｏＴとＶｐｒ結合の物理的相互作用を下記実施例に例示のような共免疫沈降法によって分析することができる。標識または分子タグＩｓｏＴ（例えばＦＬＡＧ−ＩｓｏＴ）およびＶｐｒ（例えばＭｙｃ−Ｖｐｒ）を宿主細胞、例えば２９３Ｔ細胞において共発現させることができる。ＩｓｏＴのＶｐｒとの結合を細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、その後ウェスタンブロット分析することによって試験することができる。同様に、ＩｓｏＴのユビキチンとの結合も当業者に既知の方法で分析することができる。例えば、ＩｓｏＴ−ユビキチン結合をタンデムＫＣｌおよびウレア直線グラジエントを用いるユビキチン−セファロースカラムを使用して試験することができる。この方法はLacombe et al. （FEBS Lett. 20:531:469-74, 2002） およびGabriel et al. （Biochemistry 41:13755 -13766, 2002）に記載されている。
【００４８】
他の方法において、試験化合物をＩｓｏＴの発現または細胞レベル（転写、翻訳または翻訳後修飾）を調節する活性についてアッセイする。周知の様々な生化学および分子生物学技術をＩｓｏＴ遺伝子の発現またはＩｓｏＴポリペプチドの細胞レベルを試験するために使用することができる。かかる技術は例えば、Sambrook et al., supra；および Brent et al., supraに記載されている。ある態様において、ＩｓｏＴ分子の内因性レベルを細胞が通常発現しているＩｓｏＴにおいて直接モニターすることができる。ある態様において、ＩｓｏＴ分子の発言または細胞レベルをクローンｃＤＮＡまたはＩｓｏＴをコード化するゲノム配列を使用して発現系において試験することができる。
【００４９】
あるいは、ＩｓｏＴ遺伝子の発現の調節を細胞ベースの系において、発現ベクターの培養細胞株への短期または安定トランスフェクションによって試験することができる。レポーター遺伝子と作動可能なように結合しているＩｓｏＴ遺伝子の転写制御配列（例えばプロモーター）を有するアッセイベクターを、プロモーター活性のアッセイのためにあらゆる哺乳類宿主細胞株にトランスフェクトすることができる。レポーター遺伝子と作動可能なように結合しているＩｓｏＴ遺伝子（またはＩｓｏＴ遺伝子の転写制御因子）を含む構成物を、分子生物学において通常実施されている技術および方法のみを使用して製造することができる（例えばSambrook et al. および Brent et al., supra参照）。細胞培養、トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイの一般的な方法は、文献、例えばBrent et al., supra； および Transfection Guide, Promega Corporation, Madison, WI (1998)に記載されている。あらゆる容易にトランスフェクト可能な哺乳類細胞株をＩｓｏＴプロモーター機能をアッセイするために、またはＩｓｏＴを発現するために使用することができる。例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ−７、およびＨｅｐＧ２は全て好適な細胞株である。
【００５０】
適当な宿主細胞に挿入したとき、発現ベクターにおける転写制御因子は宿主ＲＮＡポリメラーゼによるレポーター遺伝子の転写を誘導する。レポーター遺伝子は典型的には、宿主細胞には本来存在しない容易にアッセイされる酵素活性を有するポリペプチドをコード化する。真核細胞プロモーターの典型的なレポーターポリペプチドには例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルもしくはRenillaルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。
【００５１】
一般的に、スクリーニングで同定されたＩｓｏＴ−調節化合物はＩｓｏＴの生物学的活性（例えばそのイソペプチダーゼ活性またはＶｐｒとの結合）を顕著に改変することができる。調節の程度を同じ化合物の対照タンパク質（例えばルシフェラーゼまたはタンパク質キナーゼ）に対する活性と、あるいは対照化合物の同じＩｓｏＴ分子に対する活性と比較して測定する。例えば、ＩｓｏＴ発現またはＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性を阻害するＩｓｏＴ調節化合物は典型的には、対照酵素についてのＩＣ５０よりも少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、５００または１０００倍低いＩｓｏＴ分子（例えばヒトＩｓｏＴ）についてのＩＣ５０（最大阻害の５０％を引き起こす有効濃度）を有する。ＩｓｏＴ分子の同じ活性を阻害する陰性対照化合物のＩＣ５０よりもＩｓｏＴのＩＣ５０は少なくとも５、１０、２５、５０、１００、５００または１０００倍低いと定義することもできる。同様に、調節をＩｓｏＴのＶｐｒとの結合で測定するならば、同じ程度の阻害を達成するための対照化合物の濃度よりも５、１０、２５、５０または１００倍低い濃度でのＩｓｏＴ調節化合物が存在することで、通常ＩｓｏＴ−Ｖｐｒ結合活性を予防または阻害することができる。本明細書において使用するとき、ＩｓｏＴの他の分子への結合の阻害（例えばＶｐｒまたはユビキチン多量体）はＩｓｏＴのその分子への結合親和性を少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０、２０、５０または１００倍減少させることを意味する。
【００５２】
ＶＩ．ＨＩＶ阻害化合物のスクリーニング
ＨＩＶの新規阻害剤を同定するために、上記ＩｓｏＴモジュレーターを典型的にはさらに、それらのＨＩＶ感染に対する阻害作用を確認するために試験する。典型的には、化合物をＨＩＶ感染またはＨＩＶ複製の指標である活性を調節する能力についてスクリーニングする。多くのアッセイおよび方法をＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ阻害活性を試験するために使用することができる。ある方法では、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する潜在的な阻害活性を、当業者が通常実施している方法を使用して、インビトロでの培養細胞のＨＩＶ感染に対するそれらの効果を試験することによって試験することができる。例えば下記実施例に記載のように、化合物の抗ウイルス活性をＨＩＶウイルスに感染する前に化合物と接触させたＨｅＬａＣＤ４βｇａｌ細胞においてウイルス複製をモニターすることによって評価することができる。化合物を、Seddiki et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 15:381-90, 1999に記載のように第１マクロファージ培養物のＨＩＶ感染について試験することもできる。それらを、Fujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004に記載のように他のＴ細胞および単球細胞株のＨＩＶ感染について試験することもできる。ＨＩＶ感染をモニターするためのさらなるインビトロ系は文献に記載されている。例えばLi et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003； Steinberg et al., Virol. 193:524-7, 1993; Hansen et al., Antiviral Res. 16:233-42, 1991；および Piedimonte et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 6:251-60, 1990参照。
【００５３】
これらのアッセイにおいて、細胞のＨＩＶ感染を形態学的に、例えば顕微鏡細胞変異効果アッセイ（例えばFujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004参照）によってモニターすることができる。酵素的に、例えば細胞培養物の上清におけるＨＩＶ逆転写（ＲＴ）活性をアッセイすることによって評価することもできる。かかるアッセイは文献、例えばReynolds et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100:1615-20, 2003；および Li et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003に記載されている。他のアッセイではＨＩＶ感染をウイルス核酸またはウイルス抗原の定量的集積によってモニターする。例えば、Winters et al. （PCR Methods Appl. 1:257-62, 1992）はＨＩＶ感染細胞培養物からＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡおよびＤＮＡをアッセイする方法を記載した。Vanitharani et al.はウイルスｐ２４抗原の生産を測定するＨＩＶ感染アッセイを記載した（Virology 289:334-42, 2001）。ウイルス複製はまた、例えばChargelegue et al., J Virol Methods. 38(3):323-32, 1992；およびKlein et al., J Virol Methods. 107(2):169-75, 2003に記載のとおり、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイによってインビトロでモニターすることができる。全てのこれらのアッセイを、本発明のＩｓｏＴ調節化合物の抗ＨＩＶ活性を評価するために使用し、そして改変することができる。
【００５４】
ある方法において、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する潜在的な阻害効果をＨＩＶ複製が許容状態である人工レポーター細胞において試験することができる。これらの細胞において、ＨＩＶ転写制御因子、例えばＨＩＶ−ＬＴＲの制御下でのレポーター遺伝子の発現を試験することによって、ＨＩＶ感染および複製をモニターする。かかる細胞の一つの例がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶレポーター細胞である。下記実施例に説明のとおり、ＩｓｏＴ調節化合物で処理した後ＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌレポーター細胞をＨＩＶ−ＩＩＩｂで感染させるることができる。β−ガラクトシダーゼ活性を測定することによってモニターすると、化合物処理細胞のウイルス感染を化合物で処理しなかった対照細胞のものと比較することができる。ＩｓｏＴ調節化合物で処理した細胞のウイルス力価が減少しており、あるいは感染が減少していることで、当該化合物が実際にＨＩＶ感染またはウイルス複製を阻害することができると確認する。
【００５５】
本明細書で試験したＨｅｌａ−Ｔ４−βＧａｌ細胞に加えて、多くの類似のレポーターアッセイも文献に記載されている。例えばGervaix et al. （Proc Natl Acad Sci USA. 94:4653-8, 1997）はヒト化緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化するプラスミドをＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲプロモーターの制御下で発現する安定なＴ細胞株を開発した。ＨＩＶ−Ｉの感染によって、非感染細胞と比較して１００倍〜１０００倍の感染細胞の蛍光の増加が観察される。これらのアッセイ系のいずれかを本発明においてＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ感染に対する効果をリアルタイムで観察するために使用することができる。これらのインビトロ系は感染細胞の時間にわたる定量と、化合物の感受性の測定を行うことができる。
【００５６】
他の方法において、ＩｓｏＴ調節化合物のＨＩＶ複製に対する効果を当該化合物で処理した細胞におけるＨＩＶ−１偽ウイルスの生産を試験することによって試験することができる。細胞はＩｓｏＴを内因的にまたは外因的に発現し得る。ＩｓｏＴ−コード化構造を宿主細胞に、とりわけＩｓｏＴを内因的に発現していない宿主細胞にトランスフェクトすることができる。下記実施例に記載のとおり、ＨＩＶ−１偽ウイルスの生産を、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）をコード化するプサイ−陽性ＲＮＡ、全構造タンパク質をコード化するデルタプサイパッケージング構造、ならびに制御または修飾タンパク質、例えばＴａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｒおよびＶｉｆ、ならびにＶＳＶ−ｇエンベロープ発現プラスミドで生産細胞（例えば２９３Ｔ ＨＥＫ細胞）をトランスフェクトすることによって得ることができる。生産細胞で生産される偽ウイルスはレポーター遺伝子のみをコード化する。標的細胞を生産細胞由来の上清中の偽ウイルスでトランスフェクトした後、レポーター遺伝子を下記逆転写および標的細胞ゲノムへの集積によって発現する。
【００５７】
ＨＩＶ複製の阻害剤をスクリーニングするために、生産宿主細胞を偽ウイルスプラスミドのトランスフェクションの前、同時、または後にＩｓｏＴ調節化合物で処理することができる。好ましくは、化合物を偽ウイルスプラスミドのトランスフェクション前に宿主細胞に投与し、アッセイプロセス全体で存在させる。生産された偽ウイルスの力価を生産細胞由来の上清における偽ウイルスで標的細胞を感染させること、そして標的細胞におけるレポーターの活性（例えばルシフェラーゼ活性）を評価することによってモニターすることができる。対照として化合物で処理しなかった生産細胞由来の上清で感染させた標的細胞におけるレポーター活性も測定する。ＩｓｏＴ調節化合物がウイルス出芽に対する阻害効果を有するならば、化合物で処理した生産細胞由来の上清と接触させた標的細胞は対照細胞と比較して減少したレポーター活性を有する。
【００５８】
ＶＩＩ．治療適用
（ｉ）ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性；（ｉｉ）ＩｓｏＴのＶｐｒとの結合、または（ｉｉｉ）ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現を下方制御することによって、上記ＩｓｏＴ調節化合物は本発明の有用な治療適用を提供する。それらはＨＩＶに感染した細胞におけるＨＩＶ複製を阻害するために容易に使用することができる。それらはまた、ＨＩＶ感染ならびにＨＩＶ感染に関連する疾患または状態（例えばＡＩＤＳ）を有する対象を予防的または治療的に処置するために有用である。本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に適しているＨＩＶ感染には、あらゆるレトロウイルスのＨＩＶファミリー（例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）による対象、とりわけヒト対象の感染を含む。ＩｓｏＴ調節化合物は、レトロウイルスのＨＩＶファミリーのあらゆるメンバーのキャリアーである対象の処置に有用である。それらは活性ＡＩＤＳで診断される対象の処置に有用であり得る。化合物はまた、かかる対象におけるＡＩＤＳ関連状態の処置または予防に有用である。ＨＩＶ感染を有するとは診断されていないがＨＩＶによる感染の危険があると考えられる対象も、本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に適している。
【００５９】
本発明の治療適用に使用することができるＩｓｏＴ阻害化合物には、下記実施例に記載のような本発明の方法によって同定され得る低分子有機化合物が含まれる。一度同定されると、かかる化合物を有機化学の通常使用される方法を用いて容易に合成することができ、そして／または商業的供給者から容易に入手することができる。本発明の治療法を実施するために好適なＩｓｏＴモジュレーターには、ＩｓｏＴ細胞レベルまたはその生物学的活性（例えばその酵素活性）を特異的に調節することができる他の化合物も含む。かかる化合物には、ＩｓｏＴポリペプチドを特異的に認識するアンタゴニストまたはアゴニスト抗体が含まれる。それらにはまた、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および合成ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ならびに相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が含まれる。例えば、下記実施例に記載のＩｓｏＴ特異的またはＶｐｒ特異的ｓｉＲＮＡを使用することができる。さらに、治療的適用は、上記スクリーニング方法によって同定することができる他のＩｓｏＴ阻害剤を使用することができる。
【００６０】
いずれかのＡＩＤＳ関連状態を有する対象は本発明のＩｓｏＴ調節化合物で処置するのに適している。かかる状態にはＡＩＤＳ関連複合（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫（ＰＧＬ）、抗ＨＩＶ抗体陽性状態およびＨＩＶ陽性状態、ＡＩＤＳ関連神経学的状態（例えば認知症または熱帯性麻痺）、カポジ肉腫、血小板減少症紫斑病および関連する日和見感染、例えばニューモシスティス・カリニ肺炎、マイコバクテリア結核、食道カンジダ症、脳トキソプラズマ症、ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ関連脳障害、ＨＩＶ関連消耗症候群等が含まれる。
【００６１】
インビボでＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの進行を測定するための標準的な方法を、対象が本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置に陽性に応答しているかどうかを決定するために使用することができる。例えば、本発明のＩｓｏＴ調節化合物での処置後、対象のＣＤ４＋ Ｔ細胞数、あるいは対象のウイルス量をモニターすることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加は対象が抗ウイルス治療の投与によって恩恵を受けていることを示す。これ、そして当業者に既知の他の方法を、本発明の化合物が対象におけるＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの処置に有効である程度を測定するために使用することができる。
【００６２】
本発明のＩｓｏＴモジュレーターを処置する対象に滅菌条件下で直接投与することができる。モジュレーターは単独で、または医薬組成物の有効成分として投与され得る。本発明の治療組成物はまた、他の治療剤と組み合わせて、あるいは関連して使用することができる。ある適用では、第１のＩｓｏＴモジュレーターを第２のＩｓｏＴモジュレーターと組み合わせて、１種のＩｓｏＴモジュレーターを個別に使用したときには達成できないようなより高度にＨＩＶ感染を阻害するために、使用される。他の適用において、本発明のＩｓｏＴ調節化合物をＡＺＴのような既知の抗ＨＩＶ薬剤と組み合わせて使用することができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物は典型的には、少なくとも１種の有効成分と１種以上の許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は組成物を改良または安定化し、あるいは組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は投与される具体的な組成物（例えば核酸、タンパク質または調節化合物）によって、そして組成物を投与するために使用する具体的な方法によって、ある程度決定される。それらはまた、他の成分と適合し、対象に有害でないという意味において、薬学的および生理学的に許容されるべきである。この担体は投与が望まれる製剤の形態、例えば経口、舌下、直腸、鼻、静脈内または非経腸に依存して広い範囲の形態を取り得る。例えば安定性または薬理学的特性を向上するためにＩｓｏＴ調節化合物を投与の前に担体タンパク質、例えばオブアルブミンまたは血清アルブミンと組み合わせることができる。
【００６４】
医薬組成物を様々な形態、例えば顆粒、錠剤、ピル、座薬、カプセル剤などに製剤することができる。製剤における治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％まで変化し得る。治療製剤を薬学の分野で周知の方法によって製造する。治療製剤を処置に使用することができるあらゆる有効な手段によって送達することができる。例えばGoodman ＆ Gilman’s The Pharmacological Bases of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional (10th ed., 2001)； Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro (ed.), Lippincott Williams ＆ Wilkins (20th ed., 2003)；およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds.), Lippincott Williams ＆ Wilkins (7th ed., 1999)参照。
【００６５】
治療製剤は便宜には単位投与形態で存在し、適当な治療用量で投与することができる。適当な治療用量はあらゆる周知の方法、例えば最大耐用用量を決定するための哺乳類での、そして安全用量を決定するための正常ヒト対象での臨床試験によって決定することができる。高用量が必要とされ得る特的の状況を除き、ＩｓｏＴモジュレーターの好ましい用量は通常、１日当たり約０．００１〜約１０００ｍｇ、より通常は約０．０１〜約５００ｍｇの範囲である。
【００６６】
ＩｓｏＴモジュレーターの好ましい投与量および投与形態は、処置している医師によって個別に見出される要素、例えば状態または処置される状態、具体的なＩｓｏＴモジュレーターを含む投与する組成物の選択、個々の対象の年齢、体重および応答、対象の状態の重症度、ならびに選択した投与経路に依存して、異なる対象について変化し得る。一般的な法則として、投与されるＩｓｏＴモジュレーターの量は対象の状態を効果的かつ確実に予防または縮小させる最小用量である。したがって、上記用量範囲は一般的なガイドラインを提供し、本明細書の記載を補助することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００６７】
下記実施例は説明のために提示しており、本発明を限定しない。
【００６８】
実施例１ ＶｐｒはＩｓｏＴのＣ末端領域と相互作用する
Ｖｐｒ−ＩｓｏＴ相互作用をヒト白血球ライブラリーを使用して酵母２ハイブリッドスクリーニングによって同定した。酵母におけるタンパク質−タンパク質のアッセイをＧＡＬ４とＬｅｘＡ融合タンパク質で行った。ＧＡＬ４発現ベクター（Clontech）にクローン化したヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーを、ＨＩＶ ＨＸＢ２ Ｖｐｒをおとりとして使用してスクリーニングした。Ｖｐｒ ｃＤＮＡをＶｐｒ特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。ｃＤＮＡをＬｅｘＡ ＤＢＤ発現ベクターｐＳＬＡＮＳに挿入した。ｐＳＬＡＮＳはｐＢＴＭ１１６（Bartel et al Biotechniques 14: 920-924, 1993）の改変版である。ＮｏｔＩ挿入を受け入れ、ｇｌｙ４−ｓｅｒ−ｇｌｙ４−ｓｅｒをＬｅｘＡとおとりの間に設置するため、改変した。ＬｅｘＡ ＤＢＤ−Ｖｐｒ融合タンパク質をコード化するｃＤＮＡをＬ４０ ＭＡＴａ酵母株に形質転換した。Ｇａｌ４ ＡＤ−白血球ｃＤＮＡ融合タンパク質をコード化するｃＤＮＡを酵母株５４０ ＭＡＴαに形質転換した。２種の酵母株を交配し、両プラスミドを含む形質転換体をＴＨＵＫＬ欠乏合成培地で選択し、タンパク質相互作用をβ−ガラクトシダーゼフィルターアッセイによって分析した。
【００６９】
ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２ Ｖｐｒを、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーにおいてコード化される新規な相互作用する宿主細胞因子を同定するための酵母２ハイブリッドスクリーニングにおいておとりとして使用した。約２００万の２倍形質転換体をスクリーニングし、多くの陽性候補を単離した。陽性コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性について、タンパク質−タンパク質相互作用の更なる確認のためのフィルターリフトアッセイを使用してアッセイした。独立の候補ｃＤＮＡクローンの配列決定およびＧｅｎＢａｎｋデータベースとの比較によって、ＩｓｏＴである相互作用パートナー、２６Ｓプロテアソームの成分を同定した。ＩｓｏＴは遊離ポリユビキチン鎖中に配列を有するユビキチンの再循環に主に関与している。プレイ長（ＰＬ）ＩｓｏＴの配列分析によってＣ末端２２７アミノ酸およびさらに６３５ｂｐの３’−ＵＴＲを含むクローンを確認した（図１Ａ）。興味深いことに、ＰＬクローンはＵＢＡ（２）ドメインを通じてＶｐｒと相互作用することが既に同定されているｈＨＲ２３Ａ ＤＮＡダメージ修復酵素と類似の２つのＵＢＡドメインを有する。β−ガラクトシダーゼ活性によってＩｓｏＴとＶｐｒの酵母中での相互作用を確認したが、Ｖｐｒと陰性対照ベクターＶＰ１６はβ−ガラクトシダーゼ活性を示さなかった（図１Ｂ）。ＨＸＢ２に由来するＶｐｒタンパク質をシングルＴヌクレオチドの挿入によってフレームシフトして、７４〜７８位で５個のフレームシフトしたアミノ酸に導く。したがって、ＶｐｒのＣ末端領域（アミノ酸位置７４〜９６）はＩｓｏＴとの結合を媒介するのに必要でない。これらの残基（８４〜９４）はウイルス粒子取り込みに重要であると思われる（Paxton et al., 1993）。
【００７０】
本発明者らはまた、動物細胞におけるＶｐｒ−ＩｓｏＴ相互作用を分析するために共免疫沈降実験を行った。ＩｓｏＴ哺乳類発現ベクターをＦＬＡＧエピトープを全長ＩｓｏＴ遺伝子の５’末端と融合することによって構成した。ＶＩＰ３ベクターを修飾してＭｙｃタグ（Ｍｙｃ：Ｖｐｒ融合タンパク質）またはＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ：ＩｓｏＴ融合タンパク質）のいずれかを発現させた。ＩｓｏＴの全長クローンを、ＩｓｏＴ特異的プライマーを使用した膵臓由来のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によって得て、ＩｓｏＴであることを配列分析によって確認した後、ＦＬＡＧタグ化ＶＩＰ３ベクターにサブクローニングした。約３×１０６個の２９３Ｔ細胞（１０ｃｍプレート）を２０μｇのＦＬＡＧ−ＩｓｏＴおよび／またはＭｙｃ−Ｖｐｒと、ＣａＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を氷上で、緩い低浸透圧バッファー（０．５％のトリトン−Ｘ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル） [Complete, Roche Molecular Biochemicals]中で３０分間溶解させた。細胞溶解物を１６，０００×ｇで５分間（チェック）遠心分離することによって澄まし、上清を抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ−チェック）で免疫沈降（２時間、４℃）し、その後タンパク質Ａ結合ゲルビーズとインキュベートした。結合タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー中で沸騰させて溶出し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヤギ抗Ｍｙｃ抗体でウェスタンブロッティングによって分析した。
【００７１】
結果は、エピトープ−タグ化ＩｓｏＴとＶｐｒのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における過剰発現によって、ＶｐｒとＩｓｏＴのヒト細胞における相互作用を示した（データは示さず）。
【００７２】
実施例２ ＩｓｏＴ ｃＤＮＡ過剰発現はＨＩＶ生産を増加させる
ＨＩＶライフサイクルにおけるＩｓｏＴの役割を明らかにするため、ＩｓｏＴを偽ウイルスプラスミドで平行してトランスフェクトし、標的２９３Ｔ細胞で形質導入し、ルシフェラーゼ受容体活性についてアッセイしてウイルス上清を分析した。２９３Ｔ ＨＥＫ細胞の偽ウイルス生産のための一時的トランスフェクションを、６ウェルマイクロタイタープレート（３×１０５細胞／ウェル）中で、カルシウムホスファターゼ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。ルシフェラーゼベクタープラスミド（ゲノムＲＮＡをコード化する）、デルタプサイパッケージング構造物（全構造タンパク質ならびに制御および修飾タンパク質Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｒおよびＶｉｆをコード化する）およびＶＳＶ−ｇエンベロープ発現プラスミドを２．０：１．５：０．５（それぞれ２、１．５、０．５μｇのＤＮＡ／ウェル）の比でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ受容体活性を、ウイルス上清の等量アリコートで２９３Ｔ標的細胞を、９６ウェルまたは３８４ウェルフォーマットで形質導入し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質および適当な蛍光フィルターを有するＡｃｑｕｅｓｔプレートリーダーを使用して、測定した。値を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【００７３】
製造した偽ウイルスは標的細胞ゲノムへの逆転写および集積によって発現するルシフェラーゼ遺伝子のみをコード化する。第４プラスミドのコトランスフェクションにるウイルス出芽への効果の上昇または減少は、偽ウイルスプラスミド単独のときと比較して標的細胞のルシフェラーゼ活性の変化に反映される。過剰発現したＩｓｏＴの存在下でトランスフェクション後２４時間で回収したウイルス上清はウイルス生産で２倍（５０％）の増加を導いた（１０，０００ｒｌｕ対２０，０００ｒｌｕ）。トランスフェクション後４８時間で、ウイルス生産はＩｓｏＴの存在下で３倍増加した（図２Ａ）。偽ウイルス感染性における２４および４８時間後のウイルス生産の観察された増加に伴って、本発明者らはウェスタン分析によって外因性ＩｓｏＴ発現が平行して増加することを見出した。
【００７４】
ＩｓｏＴの役割をさらに評価するために、残基３３５の活性部位システインをアラニンで置換して触媒的に不活性の変異体を製造した。ＩｓｏＴ−Ｃ３３５Ａ変異体を、ＰＣＲを利用した部位特異的突然変異誘発法によって製造した部位特異的ヌクレオチド置換体を使用して製造した。ＰＣＲを天然Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）が特定した条件下で行った。ＰＣＲ産物をサブクローニング of the Ｃ３３５ＡフラグメントのＩｓｏＴ ｃＤＮＡ：ＶＩＰ３プラスミドへのサブクローニングに利用する適当な制限部位を有するように加工した。カスタムオリゴヌクレオチドプライマーをＮＮＮから商業的に得た。ＰＣＲのテンプレートはＩｓｏＴ：ＶＩＰ３構造物であった。
【００７５】
ＩｓｏＴ−Ｃ３３５Ａ変異体の発現が、不活性のときＨＩＶ偽ウイルス生産を増加させるとは予期されなかった。これは図２Ｂに示す。全長野生型（ＦＬ−ＷＴ）ＩｓｏＴの過剰発現はＣ３３５Ａ変異体と比較して約２．５倍力価が増加した。プレイ長クローンは全長クローンで観察された表現型と置換することができず、正しいコンフォメーションにおいて機能的に活性なタンパク質がウイルス力価の増加を媒介するのに重要であることを示唆した。ＦＬ−ＷＴ ＩｓｏＴ発現のＨＩＶ力価の増加に対する用量依存効果を生産細胞へＨＩＶ−１ベクタープラスミドで平行して力価判定した。逆に、Ｃ３３５Ａの発現は内因的に発現したＩｓｏＴのみで観察されたレベルと比較して、約５０％ＨＩＶ力価が減少したトランスドミナント陰性方法において作用すると思われる（図２Ｃ、０μｇ）。ＦＬおよびＣ３３５Ａ変異体タンパク質の発現レベルは、ウェスタン分析によって測定されたものと同等であった（データは示さず）。
【００７６】
実施例３ ブロッキングＶｐｒ取り込みがウイルス生産レベルを減少させる
ＶｐｒのＨＩＶビリオン取り込み変異体を、デルタプサイパッケージングプラスミドにおけるＶｐｒのコドン３０で、アラニンをリジンで置換することによって製造した。案の定、Ｖｐｒ−Ａ３０Ｌビリオン取り込み変異体はＷＴウイルス生産と比較して、標的２９３Ｔ細胞におけるレポーターウイルスのルシフェラーゼ活性を測定すると、ウイルス生産において４０％の減少を導いた（図３Ａ）。対照的に、核局在化に欠陥がある変異体Ｖｐｒ（Ｗ５４Ｒ）はウイルス生産にほとんど効果がなかった。ｐ２４レベルもウイルス上清のアリコートから定量したが、これは図３Ａの感染性の減少が生産細胞から放出されたウイルス粒子の数が４０％減少したことと関連した（データは示さず）。製造したウイルスの感染性はＶｐｒに導入し、ｐ２４レベルに正規化した変異体には影響しなかった（図３Ｂ）。
【００７７】
実施例４ ＩｓｏＴ減少によるＨＩＶ粒子生産の阻害
ＩｓｏＴの過剰発現が上昇したウイルスベクター生産を導き、Ｖｐｒのブロッキング取り込みがウイルスベクター生産の減少を導くという観察から、本発明者らは次に、ＩｓｏＴおよびＶｐｒのＨＩＶ−１ベクター生産における減少効果を試験した。ＩｓｏＴおよびＶｐｒ標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ効果を確認するため、前日にＩｓｏＴおよびＶｐｒ ＲＮＡそれぞれを標的とする低分子干渉ｓｉＲＮＡを導入した後、ＦＬＡＧタグ化ＩｓｏＴおよびＭｙｃタグ化Ｖｐｒを２９３Ｔにおいて過剰発現させた。２つのｓｉＲＮＡをＩｓｏＴ、ＶｐｒおよびＴａｔに対して各々設計し、QiagenにＨＰＰグレードを発注した。具体的には、ＩｓｏＴ特異的ｓｉＲＮＡの配列は：ＩｓｏＴ １： 5’-AGUUCACCUUCGGCUUAGAUU-3’ (SEQ ID NO:1)；およびＩｓｏＴ ２： 5’-GGCAGAUGGGUGAUCUACA-dTdT-3’ (SEQ ID NO:2)である。Ｖｐｒ特異的ｓｉＲＮＡの配列は： Ｖｐｒ １： 5’-GGAGUGGAAGCCAUAAUAA-UU-3’ (SEQ ID NO:3)；およびＶｐｒ ２： 5’-ACAACUGCUGUUUAUCCAUUU-3’ (SEQ ID NO:4)である。Ｔａｔ特異的ｓｉＲＮＡの配列は：Ｔａｔ １： 5’-CUGCUUGUACCAAUUGCUA-dTdT-3’ (SEQ ID NO:5)；およびＴａｔ ２： 5’-GCCUUAGGCAUCUCCUAUG-dTdT-3’ (SEQ ID NO:6)である。２つのｓｉＲＮＡを１：１の比で組合せ、他に記載がない限りプールとして使用した。実験で使用した他のｓｉＲＮＡはDharmacon Researchに発注した。
【００７８】
試験した全てのｓｉＲＮＡがＩｓｏＴまたはＶｐｒのレベルを効果的に減少させた（データは示さず）ため、選択したｓｉＲＮＡは有効である。別注のＩｓｏＴ抗体の生産に際して、内因性ＩｓｏＴの減少を確認した。内因性レベルの高度な減少を、４８時間と比較して７２時間で観察した。アラマーブルー（ミトコンドリア活性）および細胞力価ｇｌｏ（ＡＴＰ放出）細胞生存率キット試薬によって評価した２９３Ｔ細胞生存率に効果はなかった（データは示さず）。
【００７９】
ＩｓｏＴ減少のウイルスベクター生産に対する影響を評価するため、２９３Ｔ細胞をｓｉＲＮＡで処理し、翌日偽ウイルスプラスミドでトランスフェクションし、そしてウイルスを２日後に収穫し、２９３Ｔ標的細胞における感染性を測定した。ＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴおよびＶｐｒタンパク質の減少は、２９３Ｔ標的細胞において評価すると力価の減少を導いた（図４）。ＩｓｏＴ減少は６０％の力価（感染性）の減少を導いた（図４Ａ）。これは非飽和状態に依存し；ウイルス生産量は生産細胞へのデルタプサイ（構造遺伝子）のトランスフェクト量、および／またはウイルス収穫までの時間の長さ（４８時間後、ウイルス生産量は典型的には飽和した）によって規制されるように線形の範囲であった。驚くべきことに、Ｖｐｒレベルの減少はＴａｔレベルの減少と比較して重度にウイルス生産を減少させた。デルタプサイパッケージングプラスミドから非飽和状態下で生産されるＶｐｒのレベルの減少は、明らかにこのアッセイにおいて感染性ウイルス粒子形成に重要である。使用したｓｉＲＮＡはいずれも、２９３Ｔにおいて全く毒性を示さなかった（図４Ｂ）。
【００８０】
ＶｐｒおよびＴａｔの減少が効果的にウイルス生産を減少させるが、ＩｓｏＴ減少は感染性ウイルス生産を６０％のみ減少させるという観察は、大部分が、ＴａｔおよびＶｐｒのデノボ合成の前に低分子干渉ＲＮＡを添加したためであろう。これは外因性対内因性ＩｓｏＴのＩｓｏＴ減少で観察された結果と類似している。ＲＮＡ干渉の前に合成されたＩｓｏＴタンパク質がＶｐｒによってなおも使用され、出芽および放出を促進していると思われる。ＩｓｏＴを標的とする５つの独立した、個性的なｓｉＲＮＡがタンパク質発現およびＨＩＶ偽ウイルス力価を効果的に減少させた（データは示さず）。
【００８１】
実施例５ ＩｓｏＴおよびＶｐｒレベルの減少はＨＩＶ−１ IIIb複製を減少させる
本発明者らは次に、ＨＩＶ複製可能な細胞におけるＩｓｏＴおよびＶｐｒ減少の効果を試験しようとした。この目的のために、ＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ受容体細胞をＨＩＶ ＩＩＩｂで感染させ、その後ｓｉＲＮＡ処理を行った。ＨｅＬａ−ＣＤ４−βｇａｌ細胞（Kimpton et al., J Virol 66:2232-2239, 1992）はAIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIHを通じてDr. Michael Emermanから得た。結果は、感染の７２時間後、ＩｓｏＴまたはＶｐｒ減少によって、全く細胞毒性が観察されることなく、ＨＩＶ複製がおよそ４０％減少した（図５）。Ｔａｔレベルの減少によって約８５％複製が減少した。宿主細胞因子の減少による細胞毒性の対照として、ＲＮＡ干渉を使用してＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルを減少させた。減少したＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルの存在下での細胞生存率の顕著な減少がウイルス複製の観察された阻害を十分に説明した。これらのデータは、許容細胞におけるＨＩＶ−１複製を効果的に補助し、機構が細胞毒性に貢献しないというＩｓｏＴおよびＶｐｒの役割と一致する。
【００８２】
本発明者らはまた、正常上皮細胞におけるＩｓｏＴレベルの減少の影響を評価した。この目的のため、ＩｓｏＴレベルを低分子干渉ＲＮＡを使用してＩＯＳＥ−８０細胞において減少させた。結果は、ＩｓｏＴレベルの減少が正常上皮細胞の生存能力には影響しないが、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩレベルの減少は生存率を６５％減少させることを示した（データは示さず）。これらの結果は、ＩｓｏＴ機能の下方制御が正常の、非感染細胞の生存能力に影響しないことを示す。
【００８３】
実施例６ 本発明のスクリーニング法によるＨＩＶ阻害化合物の同定
この実施例は上記方法を使用したＨＩＶ阻害剤の同定について記載する。具体的には、低分子有機化合物のライブラリーをハイスループット形式でスクリーニングした。試験化合物を、ＩｓｏＴの阻害能についてスクリーニングした。１次スクリーニングによって同定したヒットした化合物を、さらにＨＩＶ感染の阻害効果について試験した。簡潔に述べると、ユビキチン−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）を基質として使用したＩｓｏＴ酵素活性の生化学アッセイを開発した。ＩＭＣのＩｓｏＴによる分裂および遊離が３８０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放射蛍光シグナルを発生する。化合物の存在下での切断活性の阻害はスクリーニングヒットを構成する。内部での低分子化合物回収（１．７×１０６化合物）を、１５３６ウェルＨＴＳ形式で、内部で作成したＩｓｏＴ酵素を使用してスクリーニングした。スクリーニングヒット率は０．４％であった。オリジナルヒット（１，７６１の化合物の８７．３％が入手可能と再確認）を、第１に細胞毒性化合物の再確認、除去に供し、そして精製した化合物のアッセイを行った。同定された化合物はＨＩＶ複製の阻害活性について試験し、他の優先順位の特徴（例えば有効性、選択窓、化学的な取り扱いやすさ）を試験した。潜在的なＨＩＶ阻害剤として同定した６個の化合物が存在した。
【００８４】
かくして同定したＨＩＶ阻害化合物の代表は、化合物Ａである。この化合物のＩｓｏＴプロテアーゼ阻害についてのＩＣ５０は１２９ｎＭである。化合物のＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ感染モデルにおけるＨＩＶ ＩＩＩｂに対する抗ウイルス活性についてのＥＣ５０は６．１４μＭであり、細胞毒性は観察されなかった。脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素に対してアッセイを行ったとき、当該化合物はＩｓｏＴ、ならびにミクロレベルのＵＣＨ−Ｌ１およびＵＳＰ７よりも低い程度のＵＣＨ−Ｌ３およびＵＳＰ２ｉｓｏ２の阻害が示された。阻害はイソペプチダーゼ活性に特異的であり、システインプロテアーゼのパネルには阻害が観察されなかった（データは示さず）。ＩｓｏＴプロテアーゼ活性の直接阻害についての更なる支持を、テトラユビキチン切断アッセイ、次いで抗Ｕｂ抗体を使用したウェスタン分析を使用して得た。結果は、化合物を力価評価すると、テトラユビキチンの阻害に良好な用量依存性が存在することを示した。化合物Ａのモル濃度が増加すると、製造された遊離（切断）ユビキチンレベルの減少が存在する。見かけのＩＣ５０は約１００ｎｍであり、これは生化学アッセイにおいてＩｓｏＴ阻害について観察されたＩＣ５０と良好に相関する。これらのデータはさらに、化合物によるＨＩＶ複製の阻害がＩｓｏＴ活性の阻害によることを支持する。ハイスループットスクリーニングデザインならびにスクリーニングに使用した物質および方法は、以下に詳述する。
【００８５】
ＩｓｏＴハイスループットスクリーニングデザイン：アッセイデザインはDang et al. （Biochemistry. 37:1868-79, 1998）の方法を基礎とし、さらに１５３６ウェル形式におけるウルトラＨＴＳについて最適化した。簡潔に述べると、イソペプチダーゼ活性をユビキチンＡＭＣ基質からＡＭＣの遊離を通じて検出し、蛍光シグナルを測定する。阻害剤化合物またはユビキチンアルデヒドの存在下では、プロテアーゼ活性を阻害する：完全反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．８）中、５μＬ／ウェルの３６０ｐＭのＩｓｏＴを黒色個体非ＴＣ１５３６ウェルプレート（Greiner Bio-one, Cat＃ 789176）に、カスタムBottleValve液体分配機によって分注し、５０ｎＬ １ｍＭの化合物および対照（Ｕｂアルデヒド）を本発明者らの社内取り付けＰｉｎＴｏｏｌを使用して移し（最終化合物濃度１０μＭ）、そして相互作用を３時間、３７℃で進行させる。１μＬ ３００ｎＭのＵｂ−ＡＭＣを分注し、反応物を２０分間、３０℃でインキュベートする。蛍光強度をViewLuxプレートリーダー（PerkinElmer）を使用して測定する。化合物の用量依存性およびＩＣ５０測定についての滴定を、Minitrak装置（Packard BioScience）を使用して、ＤＭＳＯでの半対数（half-log）連続希釈について行う。
【００８６】
ＩｓｏＴ酵素の製造：ＩｓｏＴをｐＲＳＥＴａへと、標準的なクローン化方法を使用してクローン化し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換する。タンパク質の発現を、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したことを除き既出のとおり（Lesley et al., 2002）に行った。タンパク質の精製を以下のとおりに行った：４グラムの細胞ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．９からなる溶解バッファー４０ｍｌ中に再懸濁し、４×１分間超音波を加えた。１５，０００×ｇで２０分間スピンさせた後、澄明な溶解物を、ニッケルを入れた１．５ｍｌのベッド体積のChelating-sepharose FastFlow （Amersham）を含むカラムに注いだ。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾールおよび１０％ グリセロール、ｐＨ７．９からなる洗浄バッファー７．５ｍｌで洗浄した。タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール、１０％ グリセロール、ｐＨ８．０からなる溶出バッファー４．５ｍｌで溶出した。
【００８７】
ＩｓｏＴ阻害剤のＨＩＶ ＩＩＩｂに対する試験：ＩｓｏＴスクリーニングからＤＭＳＯで希釈した化合物を、１ｍＭから出発して、３８４ウェルポリプロピレン化合物プレート（Greiner）に並べ、次いでＤＭＳＯでの半対数連続希釈で、合計８個、Minitrak装置（Packard Bioscience）を使用して製造した。ＨｅＬａＣＤ４βｇａｌ細胞（１５００／５０μＬ／ウェル）を３８４ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、一晩密着の後、５００ｎＬの化合物を３つの複製細胞プレートに、Minitrak（Packard Bioscience）を使用して、感染性および細胞毒性試験のために移し、１０μＭから出発して最終化合物連続希釈を得た。３０分後、ＨＩＶ−ＩＩＩｂ（１６ｎｇ／１０μＬ／ウェル）を感染性試験細胞プレートに加えた。化合物およびウィルス添加の３日後、５０μＬのGal Screen（Applied Biosystems）を感染細胞に加え、１時間後にCLIPR （Molecular Devices）で蛍光を読み取って、感染を評価した。５０μＬの１：４希釈Cell Titer Glo （Promega）を感染細胞に加え、１時間後にCLIPRで読み取って、細胞毒性を評価した。用量応答測定を標準のシグモイド型用量応答式を使用して解釈した。社内の曲線適合コンピュータプログラムをＩＣ５０の計算に使用した。
【００８８】
ＩｓｏＴ阻害剤によるテトラユビキチン（Ｕｂ４）切断の阻害：ＩｓｏＴを反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ＝７．８）で最終濃度７６０ｐＭとなるように希釈し、１８μＬを９個のエッペンドルフチューブそれぞれに加えた。化合物２０９６をＤＭＳＯで、２００μＭから出発して合計８個、半分対数連続希釈した。１μＬの各希釈物をＩｓｏＴのチューブに加え、アッセイチューブ中１０μＭから出発する連続希釈を得た。最大切断についての対照として、１個のチューブに１μＬのＤＭＳＯのみを加えた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、１μＬの反応バッファー中テトラユビキチン（Ｕｂ４；Biomol）の２５０μｇ／ｍＬ溶液を各チューブに加え、当該チューブを３７℃で１８時間さらにインキュベートした。変性タンパク質サンプルバッファー（Invitrogen）を加え、全サンプルを沸騰させ、４〜１２％NuPage bis-Tris ゲル（Invitrogen）にロードし、製造者の指示通りにゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースへと移した後、ブロットをＰＢＳＴ（０．０５％ Tween２０を含むリン酸緩衝化食塩水）中５％無脂肪ミルクでブロックし、ユビキチンに対するウサギポリクローナル抗体（上記ＰＢＳＴ中５％無脂肪ミルクで１：１０００に希釈）で、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ２次抗体（ＰＢＳＴ中５％無脂肪ミルクで１：３０００、Southern Biotechnologies）でのイムノブロッティングに供した。バンドをＥＣＬプラス検出試薬（Amersham）を使用して可視化した。
【００８９】
本明細書に記載の例および態様は例示のみを目的としており、その範囲内で様々な修飾または改変が当業者には提案され、そして本願および添付の特許請求の範囲の技術的範囲に含まれることが理解される。本明細書に記載のものと類似または同様のあらゆる方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および物質は記載されている。
【００９０】
本明細書に記載した全ての文献、GenBank配列、特許および特許公報は、各々そのように記載されているが如く、その全体について、あらゆる目的のために本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１Ａ−１ＢはＶｐｒのＩｓｏＴへの結合を示す：（Ａ）概略図およびＩｓｏＴプレイクローンの位置を酵母−２−ハイブリッドを全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡと比較して同定した。プレイクローンは２個のＵＢＡドメインを有するＣ末端２２７アミノ酸を含む。本明細書で使用する全長ＩｓｏＴ ｃＤＮＡクローンを膵臓由来のｃＤＮＡライブラリから増幅した。Ｃ３３５の相対位置（活性部位システイン）を示す。（Ｂ）ＶｐｒとＩｓｏＴの特異的相互作用を示すために、β−ガラクトシダーゼフィルターリフトアッセイを使用して酵母−２−ハイブリッドをアッセイする。ＶＰ１６は空ベクターである。
【００９２】
【図２】図２Ａ−２Ｃは野生型ＩｓｏＴ過剰発現がＨＩＶ−１ウイルスの力価を増加させるが、活性部位変異はそうではないことを示す：（Ａ）全長（ＦＬ）野生型ＩｓｏＴの過剰発現がトランスフェクション後２４および４８時間で偽ウイルス過剰発現を増加させる。２９３Ｔ細胞をＩｓｏＴをコード化する第４ｃＤＮＡの存在下（＋）または非存在下（−）において３個の偽ウイルスプラスミドとコトランスフェクトした。レポーターウイルス上清をトランスフェクション後２４または４８時間で回収し、２９３Ｔ標的細胞におけるレポーター活性についてアッセイした。細胞溶解物を平行してウェスタン分析で、ＩｓｏＴ特異的抗体を使用して内因性ＩｓｏＴ発現ならびにＩｓｏＴ過剰発現について分析した。１列目はプラスミドでトランスフェクトしていない、トランスフェクション試薬のみのものである。（Ｂ）２９３Ｔ細胞を（Ａ）のとおりに、第４プラスミドとしてＶＩＰ３（プラスミド骨格）、ＦＬ−野生型、ＰＬ−Ｃ末端２２７、またはＦＬ−Ｃ３３５Ａでコトランスフェクトした。トランスフェクション後３０時間に回収したウイルス上清由来のルシフェラーゼレポーター活性を２９３Ｔ標的細胞においてアッセイした。（Ｃ）ＨＩＶ力価に対する用量依存関数効果。ＦＬ−ＷＴおよびＦＬ−Ｃ３３５Ａを力価判定し、平行して第４プラスミドとして偽プラスミドとトランスフェクトした。
【００９３】
【図３】図３Ａ−３ＢはＶｐｒ（Ａ３０Ｌ）ウイルスの減少した出芽が感染性ではなく減少した粒子生産と関連することを示す。２９３Ｔ細胞を偽ウイルスＤＮＡ発現ＷＴおよびＶｐｒの変異型とトランスフェクトした。（Ａ）ＷＴまたは核局在化変異体Ｗ５４Ｒではなく、Ａ３０Ｌ Ｖｐｒ取り込み変異体は、２９３Ｔ標的細胞における感染性によって測定するとウイルス力価を減少した。（Ｂ）ｐ２４レベルを標的２９３Ｔ細胞を感染するために使用した偽ウイルスインプットについて、（Ａ）から標準化（９．３８ｎｇ）した。
【００９４】
【図４】図４Ａ−４ＢはＲＮＡ干渉によるＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏が２９３Ｔ細胞における偽ウイルス生産を阻害することを示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３（陰性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、ウェルあたり２：０．０５：０．５または１００ｎｇ：２．５ｎｇ：２５ｎｇのベクターＲＮＡ：デルタプサイ：ｅｎｖの比で、３プラスミド偽ウイルス系のｃＤＮＡトランスフェクションに供した。３つの複写ウェルを条件毎に行った。ウイルス上清を４８時間後に回収し、標的２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。これらの形質導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を４８時間後に測定し、Ａに示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｔａｔ、ＩｓｏＴ、ＶｐｒまたはルシフェラーゼＧＬ３に対するｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。７２時間後細胞生存率をCellTiterGloを使用し、蛍光を測定して決定した。
【００９５】
【図５】図５はＩｓｏＴまたはＶｐｒの欠乏がＨｅＬａ−ＣＤ４−β−ｇａｌ細胞におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩｂ複製を阻害することを示す。細胞をＴａｔ、ＩｓｏＴ、Ｖｐｒ、ルシフェラーゼＧＬ２（陰性対照）、またはＰｏｌＲ２Ａ（細胞毒性についての陽性対照）を標的とする示したｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。２４時間培養後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩｂに感染させる。β−ガラクトシダーゼ活性を、感染の測定として感染後７２時間で測定した。細胞毒性をｓｉＲＮＡトランスフェクト非感染細胞について平行して測定した。データを陰性対照ＧＬ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞によって発生したシグナルの割合として表現する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法であって、イソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）分子またはそのフラグメントの生物学的活性を、試験化合物の存在下でアッセイして、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定し；それによってＨＩＶ感染を阻害する化合物を同定することを含んでなる方法。
【請求項２】
さらに、同定された化合物をＨＩＶ感染阻害能について試験することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的活性が、ＩｓｏＴのＶｐｒまたはユビキチンへの結合である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物学的活性がＩｓｏＴ分子のイソペプチダーゼ活性またはＩｓｏＴ分子をコード化する遺伝子の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩｓｏＴ分子が哺乳類細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩｓｏＴ分子がヒトＩｓｏＴである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理した人工ＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＨＩＶ許容細胞がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物をスクリーニングして、ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性またはそのＶｐｒとの結合を下方制御するＩｓｏＴ調節化合物を同定する工程、そして
（ｂ）同定されたＩｓｏＴ調節化合物をＨＩＶ感染阻害能について試験する工程
を含んでなる方法。
【請求項１４】
ＩｓｏＴ分子が哺乳類細胞に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩｓｏＴ分子がヒトＩｓｏＴである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理したＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＶ許容細胞がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶ複製を阻害する方法であって、（ｉ）ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性；（ｉｉ）ＶｐｒとのＩｓｏＴの結合；または（ｉｉｉ）ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現；を下方制御する化合物を当該細胞に接触させ；それによって対象におけるＨＩＶ感染を処置することを含んでなる方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ感染細胞がＨＩＶ感染を有する対象に存在し、そして当該対象に有効量の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩｓｏＴがヒトＩｓｏＴである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化合物がインビトロでＩｓｏＴ発現細胞におけるＨＩＶ複製を阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および合成ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ならびに相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がＩｓｏＴまたはＶｐｒに対するｓｉＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物を既知の抗ＨＩＶ薬と共に対象に投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
ＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法であって、イソペプチダーゼＴ（ＩｓｏＴ）分子またはそのフラグメントの生物学的活性を、試験化合物の存在下でアッセイして、ＩｓｏＴ分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定し；それによってＨＩＶ感染を阻害する化合物を同定することを含んでなる方法。
【請求項２】
さらに、同定された化合物をＨＩＶ感染阻害能について試験することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的活性が、ＩｓｏＴのＶｐｒまたはユビキチンへの結合である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物学的活性がＩｓｏＴ分子のイソペプチダーゼ活性またはＩｓｏＴ分子をコード化する遺伝子の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩｓｏＴ分子が哺乳類細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩｓｏＴ分子がヒトＩｓｏＴである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理した人工ＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＨＩＶ許容細胞がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物をスクリーニングして、ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性またはそのＶｐｒとの結合を下方制御するＩｓｏＴ調節化合物を同定する工程、そして
（ｂ）同定されたＩｓｏＴ調節化合物をＨＩＶ感染阻害能について試験する工程
を含んでなる方法。
【請求項１４】
ＩｓｏＴ分子が哺乳類細胞に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩｓｏＴ分子がヒトＩｓｏＴである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物によるＨＩＶ−１感染の阻害能を、当該化合物で処理したＨＩＶ許容細胞におけるＨＩＶ複製と、当該化合物で処理しなかった対照細胞におけるＨＩＶ複製を比較することによって試験する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＶ許容細胞がＨｅＬａ−Ｔ４−βＧａｌ ＨＩＶ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ複製をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによってモニターする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
化合物によるＨＩＶ感染の阻害能を、当該化合物で処理した宿主細胞における偽ウイルス生産と、当該化合物で処理しなかった対照宿主細胞における偽ウイルス生産を比較することによって試験する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が２９３Ｔ ＨＥＫ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が、当該細胞においてＨＩＶ偽ウイルスを生産する偽ウイルスプラスミドでトランスフェクトされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶ複製を阻害する方法であって、（ｉ）ＩｓｏＴイソペプチダーゼ活性；（ｉｉ）ＶｐｒとのＩｓｏＴの結合；または（ｉｉｉ）ＩｓｏＴコード化遺伝子の発現；を下方制御する化合物を当該細胞に接触させ；それによって対象におけるＨＩＶ感染を処置することを含んでなる方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ感染細胞がＨＩＶ感染を有する対象に存在し、そして当該対象に有効量の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩｓｏＴがヒトＩｓｏＴである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化合物がインビトロでＩｓｏＴ発現細胞におけるＨＩＶ複製を阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および合成ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ならびに相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がＩｓｏＴまたはＶｐｒに対するｓｉＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物を既知の抗ＨＩＶ薬と共に対象に投与する、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５３８５０４（Ｐ２００８−５３８５０４Ａ）
【公表日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７９１５（Ｐ２００８−５０７９１５）
【出願日】平成１８年４月２１日（２００６．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１５０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６０７５
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２１日（２００６．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１５０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６０７５
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]