ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドおよびその用途
【課題】 ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの提供。
【解決手段】 ＣＭＬ６６由来のペプチドであって、ＷＹＱＤＳＶＹＹＩまたはＹＹＩＤＴＬＧＲＩのアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。前記抗原ペプチドにより活性化されるＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子と結合した前記抗原ペプチドを認識し、細胞傷害性を示すため、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を攻撃できる。前記ペプチドは、細胞免疫療法、ワクチン療法等の悪性腫瘍に対する医療分野に有用である。
【解決手段】 ＣＭＬ６６由来のペプチドであって、ＷＹＱＤＳＶＹＹＩまたはＹＹＩＤＴＬＧＲＩのアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。前記抗原ペプチドにより活性化されるＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子と結合した前記抗原ペプチドを認識し、細胞傷害性を示すため、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を攻撃できる。前記ペプチドは、細胞免疫療法、ワクチン療法等の悪性腫瘍に対する医療分野に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞を排除する機能を有する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）は、癌細胞表面に発現しているＨＬＡクラスＩ分子と癌特異的タンパク質由来ペプチドとの複合体を認識して、癌細胞を消滅させる。近年、このメカニズムを利用して、細胞傷害性Ｔ細胞が認識する標的ペプチドを同定し、これを抗原ペプチドとして人為的に宿主に与え、特異的な抗腫瘍免疫を誘導する方法が、研究されている。そして、そのメカニズムから、前記抗原ペプチドは、癌ワクチンとも呼ばれている。これまでに、いくつかの癌細胞に特異的な抗原ペプチドの同定が行われ、癌ワクチンの応用が試みられているが、効果が十分ではないため、新たな抗原ペプチドの同定が求められている。
【０００３】
ＣＭＬ６６は、５８３アミノ酸からなる分子量６６ｋＤのタンパク質であり、移植片対白血病作用（Graft−versus−Leukemia effect：GVL）と関連する白血病関連抗原であることが報告されている。そして、さらなる解析によって、（１）ｃｏｄｉｎｇ遺伝子が、第８番染色体長腕（８ｑ２３）に位置していること、（２）タンパク質の機能が依然として不明であること、（３）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来の細胞や前立腺がん患者由来の細胞、さらに、ヒト白血病やメラノーマ、肺がん等の患者由来の株化細胞において、ＣＭＬ６６タンパク質およびＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの過剰発現が認められるが、正常組織では、ＨＬＡ分子が発現しない精巣細胞で産生される以外では、わずかに心臓で発現が確認されるのみであること、（４）正常でも２つのsplicing isoform（ＣＭＬ６６−Ｌ、ＣＭＬ６６−Ｓ）が見られ、５５４アミノ酸からなる短縮型isoformであるＣＭＬ６６−Ｓは、主に精巣細胞で発現し、さらに、担がん患者血清中のＣＭＬ６６特異抗体は、ＣＭＬ６６−Ｌに対するものがほとんどであること等が明らかとなっている（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Yang X.F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7492-7497, 2001.
【非特許文献２】Wu C.J. et al. Clin. Cancer Res. 11: 4504-4511, 2005.
【非特許文献３】Yan Y. et al. J. Immunol. 172: 651-660, 2004.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述の情報は、ＣＭＬ６６が、腫瘍細胞の特性に関与しているか否かは不明であるものの、いわゆる、分化抗原としてのがん関連抗原（癌細胞特異的抗原）として、様々な癌に対する免疫療法の標的抗原となり得ることを示していると考えられる。
【０００５】
そこで、本発明は、ＣＭＬ６６由来のペプチドであって、癌ワクチンとして使用可能な新たな抗原ペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のペプチドは、下記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドである。
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ （配列番号１）
（２）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド
ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ （配列番号２）
（３）前記（１）または（２）のペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上であるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
（４）前記（１）または（２）のペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド。
【０００７】
本発明の活性化誘導剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、以下の第１および第２の活性化誘導剤がある。第１の活性化誘導剤は、前記本発明のペプチドまたはその誘導体を含む活性化誘導剤であり、第２の活性化誘導剤は、前記本発明のペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む活性化誘導剤である。
【０００８】
本発明のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法は、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、前記本発明のペプチドまたはその誘導体とをインキュベーションする工程
【０００９】
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、下記工程（ａ）および（ｂ）を含むことを特徴とする。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、本発明のペプチドまたはその誘導体とをインキュベーションする工程
【００１０】
本発明の医薬組成物は、癌免疫療法に用いる医薬組成物である。本発明の第１の医薬組成物は、抗原ペプチドとして、本発明のペプチドまたはその誘導体を含む。本発明の第２の医薬組成物は、本発明のペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の第３の医薬組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む。また、本発明の第４の医薬組成物は、本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された抗原提示細胞を含む。
【発明の効果】
【００１１】
一般的に、抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に認識される際、特定のＨＬＡクラスＩ分子（ヒト組織適合性抗原；ヒト白血球抗原）に結合することにより、初めてＴＣＲに認識される。このため、日本人の約６０％が占めているＨＬＡ−Ａ２４分子のような、頻度が高いＨＬＡクラスＩ分子に対して結合可能なペプチドであれば、その汎用性を担保できると考えられる。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＬＡ−Ａ２４と結合するＣＭＬ６６由来のペプチドを同定し、本発明に到った。本発明のペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識され得る、ＣＭＬ６６特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。
【００１２】
本発明のペプチドによれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞となるため、悪性腫瘍の破壊による効果的な治療が可能となる。このため、本発明のペプチドは、例えば、癌ワクチン（悪性腫瘍ワクチン）等として使用でき、白血病を含む悪性腫瘍に対するワクチン療法に有用である。
【００１３】
また、本発明のペプチドをリンパ球と共培養することで、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を製造できる。このようにして製造した細胞傷害性Ｔ細胞を、例えば、患者の体内に戻すことによって、例えば、白血病を含む悪性腫瘍に対する細胞免疫療法が可能となる。
【００１４】
また、本発明のペプチドを樹状細胞と共培養することで、本発明のペプチドを抗原提示する抗原提示細胞を製造できる。樹状細胞は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）や共刺激分子を共発現し、抗原未感作のナイーブＴ細胞をも刺激できる、極めて強力な抗原提示細胞である。このため、本発明の抗原提示細胞によれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に活性化して、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる。したがって、このような抗原提示細胞を、例えば、患者の体内に戻すことによって、例えば、白血病等の悪性腫瘍に対して、より効果的な細胞免疫療法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ペプチドおよびその用途
（１）ペプチド
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子上に結合してＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識されうるＣＭＬ６６の抗原ペプチドである。ＨＬＡ−Ａ２４分子のＨＬＡ遺伝子型は、Ａ＊２４０２であることが好ましい。
【００１６】
本発明において、「抗原ペプチド」とは、抗原決定基（エピトープ）を構成するペプチドをいう。前記抗原ペプチドは、抗原決定基の最小単位である必要はなく、例えば、８〜２６個、９〜２４個、１０〜２２個又は１１〜２０個の範囲のアミノ酸により構成されるペプチドがあげられる。
【００１７】
本発明において、「ＨＬＡ−Ａ２４分子上に結合してＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識される」とは、例えば、あるペプチドが、樹状細胞等の抗原提示細胞表面のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示された場合、適切な補助刺激因子（共刺激因子）とともに、ペプチド抗原特異的にＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化しうること等をいう。
【００１８】
本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との結合は、例えば、細胞内部で発現されたペプチド、もしくは、貪食作用により細胞内部に取り込まれたペプチドが、細胞内でＨＬＡ−Ａ２４分子と結合する場合でもよい。また、既に細胞表面に存在するＨＬＡ−Ａ２４分子に、細胞外に存在するペプチドが直接結合する場合であってもよい。
【００１９】
本発明において、ＨＬＡクラスＩ分子とは、ヒトのＭＨＣクラスＩ分子に対応する分子であり、ＨＬＡ−Ａ２４型とは、ＨＬＡクラスＩ分子のアロ抗原型がＡ２４型であること、すなわち、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の遺伝子産物であることをいい、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２型とは、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型がＡ＊２４０２であることをいう。
【００２０】
本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。ＣＭＬ６６タンパク質（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＫ７３０１７）において、配列番号１のアミノ酸配列（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）は、７０番目〜７８番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号２のアミノ酸配列（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）は、７６番目〜８４番目のアミノ酸配列に相当する。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを、「ＣＭＬ６６７０−７８」ともいい、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを、「ＣＭＬ６６７６−８４」ともいう。
【００２１】
また、本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと相同なペプチドを含む。ここで、アミノ酸配列が「相同」であるとは、その機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。また、一般的に、２つ以上のアミノ酸配列において、例えば、８０％以上、８４％以上、８８％以上、９２％以上、９６％以上の同一性又は類似性を示す場合、これらは相同であるといえる。前記同一性および類似性は、２以上の塩基配列又はアミノ酸配列間で、これらの配列を比較して決定される関係をいう。同一性が、アライメントされた場合の同一残基の割合を示すのに対し、類似性は、同一残基に加え、同類置換された残基も含む。同一性および類似性は、従来公知の様々なコンピュータープログラムにより、容易に決定できる。本発明のペプチドにおいて、「機能」とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞にペプチド抗原特異的に認識されうることを意味する。
【００２２】
また、本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記機能を有するものも含む。相違するアミノ酸の残基数としては、例えば、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個である。
【００２３】
本発明のペプチドは、例えば、天然のＣＭＬ６６由来のペプチドのような天然物でもよいし、化学合成ペプチドや、遺伝子工学により製造されたペプチドであってもよい。化学合成や遺伝子工学による製造の手法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。遺伝子工学を利用する場合、例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドや、前記ポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の適当な宿主に導入し、生物学的に製造してもよい。
【００２４】
本発明のペプチドは、前述のような癌ワクチンとして使用できるたけでなく、例えば、ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を患者体外で増殖させた後、体内に移入（例えば、点滴投与等）する養子免疫療法（受動免疫療法）等に使用することができる。また、この他にも、例えば、体内に存在するＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、高感度かつ迅速に検出できるペプチド・ＨＬＡテトラマー診断法にも応用可能である。
【００２５】
（２）第１の活性化誘導剤
本発明の第１の活性化誘導剤は、前述のように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第１の活性化誘導剤を、例えば、目的の細胞や組織、その周辺に投与することによって、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。そして、この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００２６】
本発明の第１の活性化誘導剤は、例えば、本発明のペプチドおよび誘導体のいずれか一方を含むのみでもよいし、両方を含んでもよい。また、本発明のペプチドおよび誘導体は、一種類でもよいし、二種類以上を含んでいてもよい。本発明の第１の活性化誘導剤は、例えば、本発明のペプチドまたは誘導体のみでもよいし、この他に、さらに、各種添加剤を含んでもよい。なお、具体的な使用方法等については、例えば、後述する第１の医薬組成物と同様である。
【００２７】
（３）第１の医薬組成物
本発明の第１の医薬組成物は、前述のように、癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第１の医薬組成物は、例えば、前述の第１の活性化誘導剤と同様に、本発明のペプチドまたは誘導体のみでもよいし、この他に、さらに、薬学的に許容できるアジュバンド、キャリア又は賦形剤等の添加剤を含んでもよい。また、本発明のペプチドの誘導体としては、特に制限されず、例えば、従来公知の修飾方法により修飾されたもの、例えば、塩、糖鎖修飾されたもの、脂質修飾されたもの等が含まれる。以下、「本発明のペプチド」とは、本発明のペプチドの誘導体を含む。
【００２８】
本発明の第１の医薬組成物は、例えば、ワクチンとして患者に有効量を投与することで、癌（例えば、悪性腫瘍）のワクチン療法に使用できる。前記ワクチンが投与されると、例えば、患者の体内において、本発明のペプチドが樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれ、ＨＬＡクラスＩ分子に結合して前記抗原提示細胞上に抗原提示される。そして、発現している共刺激分子とともに、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激、誘導（活性化）する。活性化により細胞傷害性活性を持ったＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、前記患者の体内で、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。これにより、悪性腫瘍の治療が可能になる。なお、ＨＬＡ−Ａ２４のＨＬＡ遺伝子頻度は、日本人で約６０％を占めるといわれている。したがって、このように高い頻度のＨＬＡ−Ａ２４に結合できる点からも、本発明のペプチドを含む医薬組成物は、臨床的有用性が極めて高いといえる。
【００２９】
本発明の第１の医薬組成物の調製方法は、例えば、従来公知のワクチンの調製方法を使用できる。前記ワクチンは、例えば、注射剤として使用する溶液や懸濁液として、本発明のペプチドと、薬学的に許容できる賦形剤とから調製してもよい。また、前記ワクチンを、固体に調製してもよい。前記賦形剤としては、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また必要に応じて、ワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含んでいてもよい。前記アジュバントとしては、特に制限されず、従来公知のものを使用でき、その中でも、患者の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞による本発明のペプチドの取込みを促進するものが好ましい。また、本発明のペプチドは、中性または薬学的に許容できる塩として、ワクチンに製剤化されてもよい。
【００３０】
ワクチンの投与方法は、制限されないが、例えば、表皮下、真皮内、真皮下又は筋肉内等への注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した製剤として、例えば、坐剤や、経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門及び頭蓋内製剤がある。ワクチンは、患者及び剤形に合わせて、治療に有効な量を投与することが好ましい。
【００３１】
本発明において、治療対象となる悪性腫瘍は、制限されない。具体例としては、例えば、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍があげられ、例えば、各種白血病や各種固形腫瘍等である。前記白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）等があげられ、前記固形腫瘍としては、例えば、肺、前立腺癌、並びに黒色腫等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ポリヌクレオチドおよびベクターならびにその用途
（１）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドを、例えば、目的の細胞に導入し、前記細胞内で本発明のペプチドを発現させれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３３】
前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下に示す塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドＣＭＬ６６７０−７８をコードするポリヌクレオチドの一例である。また、配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドＣＭＬ６６７６−８４をコードするポリヌクレオチドの一例である。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドでも二本鎖ポリヌクレオチドでもよい。
ＣＭＬ６６７０−７８ 5’−tggtatcaagacagtgtctactatatt−3’ （配列番号５）
ＣＭＬ６６７６−８４ 5’−tactatattgatacccttggaagaatt−3’ （配列番号６）
【００３４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相同な塩基配列、または、その相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの塩基配列が「相同」であるとは、前記ポリヌクレオチドがコードするペプチドが、本発明のペプチドとしての機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。例えば、塩基配列に、点変異、欠失又は付加による相違があるとしても、これらが前記遺伝子の機能に影響を与えないならば、両者は相同であるといえる。相違する塩基数としては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、２つ以上の配列において、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは約９９％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、２つのポリヌクレオチドの一方が、他方の相補配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、「Ｔｍ−２５℃」の温度で一晩保温する条件等があげられる。前記Ｔｍは、例えば、下記式により求められる。下記式中、Ｎはポリヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはポリヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。
Ｔｍ＝８１.５−１６.６(ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ）−(６００/Ｎ）
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成により製造してもよく、または、公知のＣＭＬ６６遺伝子に基づき設計したプライマーを使用して、各種遺伝子増幅法により製造し、または、適当なベクターにクローニングしてもよい。
【００３６】
（２）ベクター
本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターを、例えば、目的の細胞に導入し、前記細胞内で本発明のペプチドを発現させれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３７】
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、発現ベクターであることが好ましく、本発明のポリヌクレオチドが、本発明のベクターが導入される宿主細胞内で発現可能なように連結されていることが好ましい。本発明のベクターの種類は、特に制限されず、例えば、ウイルスベクターであってよく、非ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスがあげられる。非ウイルスベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，１９３−２００（１９９１））等の発現ベクターが例示できる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００３８】
（３）第２の活性化誘導剤
本発明の第２の活性化誘導剤は、前述のように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第２の活性化誘導剤を、例えば、目的の細胞に導入して、本発明のポリペプチドや誘導体を発現させることによって、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。そして、この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３９】
本発明の第２の活性化誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターのいずれか一方を含むのみでもよいし、両方を含んでもよい。また、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。本発明の第２の活性化誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターのみでもよいし、この他に、さらに、各種添加剤を含んでもよい。なお、具体的な使用方法等については、例えば、後述する第２の医薬組成物と同様にすることができる。
【００４０】
（４）第２の医薬組成物
本発明の第２の医薬組成物は、癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの少なくとも一方を含むことを特徴とする。第２の医薬組成物は、例えば、患者の体内、好ましくは、皮下組織、リンパ節内、筋肉細胞内に接種し、本発明のペプチドを発現させることで、ＣＭＬ６６特異的免疫反応を誘導するＤＮＡ（ＲＮＡ）ワクチン療法に使用できる。第２の医薬組成物の細胞への導入方法は、特に制限されず、ポリヌクレオチドやベクターの種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ウイルスベクターを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等があげられる。
【００４１】
ワクチンとしての調製方法は、特に制限されず、前述の本発明のペプチドを含むワクチン（第１の医薬組成物）と同様に調製できる。また、本発明の第２の医薬組成物において、本発明のポリヌクレオチドは、導入される細胞内で本発明のペプチドを発現できる形態であればよい。この場合、第２の医薬組成物は、例えば、ベクターに連結されていない本発明のポリヌクレオチドを、導入剤とともに含んでもよい。前記導入剤としては、特に制限されないが、例えば、リポソーム等の、非ベクター系遺伝子導入方法に使用されるものがあげられる。また、本発明のポリヌクレオチドを含む第２の医薬組成物を、例えば、パーティクルガン等を用いた直接注入法により、接種することもできる。
【００４２】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法およびその用途
（１）ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法
本発明のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法は、前述のように、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方とをインキュベーションする工程
【００４３】
前記工程（Ｂ）においては、例えば、前記リンパ球と、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞とをインキュベーションすることが好ましい。前記抗原提示細胞の調製方法は、特に制限されない。具体例としては、前記工程（Ｂ）において、例えば、前記リンパ球と、樹状細胞と、本発明のペプチドとをインキュベーションすることによって、抗原提示細胞を調製できる。前記樹状細胞は、例えば、本発明のペプチドをパルスされることによって、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞となる。そして、この抗原提示細胞が、前記リンパ球の増殖および活性化を誘導するため、細胞傷害活性を有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が得られる。
【００４４】
前記リンパ球は、通常、患者の血液から採取される。前記抗原提示細胞としては、例えば、リンパ球を採取した患者から採取したものが使用できる。この他にも、例えば、自己、同種同系、および、ＨＬＡクラスＩについて前記患者と一致する同種異系の抗原提示細胞が使用できる。前記抗原提示細胞としては、本発明のペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に対して提示し、これを増殖刺激して活性化し得るＨＬＡ−Ａ２４分子および補助刺激分子（共刺激分子）を発現するものが好ましく、例えば、樹状細胞があげられる。抗原提示細胞は、例えば、リンパ球を採取した患者から採取または調製することが好ましい。
【００４５】
本発明の製造方法により製造されるＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、白血病細胞を含む悪性腫瘍細胞に対してＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害性を示すという特徴的機能を有する。このため、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、前記ＨＬＡ−Ａ２４陽性患者の体内で、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。
【００４６】
（２）第３の医薬組成物
本発明の第３の医薬組成物は、本発明のＣＤ８＋傷害性Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む。この医薬組成物を、例えば、患者に有効量投与することで、悪性腫瘍を治療する細胞免疫療法が可能となる。
【００４７】
抗原提示細胞の製造方法およびその用途
（１）抗原提示細胞の製造方法
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、前述のように、下記工程（ａ）および（ｂ）を含むことを特徴とする。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方とをインキュベーションする工程
【００４８】
前記（ａ）工程において、樹状細胞は、例えば、患者血液に存在する細胞でもよいし、人為的に分化誘導することにより調製した樹状細胞でもよい。前者の場合、例えば、血液成分分離装置を用いて、患者本人の血液から樹状細胞そのものを採取する方法により得られる。また、後者の場合、患者の未成熟樹状細胞は、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、例えば、サイトカインの一種であるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４等の存在下で培養することにより得られる。さらに、例えば、ＴＮＦ−α等で成熟樹状細胞に分化させる。そして、このようにして得られた樹状細胞を本発明のペプチドまたは誘導体とインキュベーションすることにより、例えば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できる。
【００４９】
また、本発明の抗原提示細胞の製造方法において、前記工程（ｂ）に代えて、下記（ｃ）工程を含んでもよい。
（ｃ）前記樹状細胞に、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを導入する工程
【００５０】
このように、樹状細胞に本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを導入することで、樹状細胞内で本発明のペプチドが発現される。その結果、前記樹状細胞内で、発現したペプチドが前記細胞表面に提示されることで、抗原提示細胞が得られる。この抗原提示細胞は、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞である。ポリヌクレオチドやベクターの遺伝子導入方法としては、特に制限されず、その種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ウイルスベクターを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００５１】
本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された細胞は、下記医薬組成物として以外に、例えば、本発明のＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の製造方法における抗原提示細胞としても使用できる。
【００５２】
（２）第４の医薬組成物
本発明の第４の医薬組成物は、本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された抗原提示細胞を含む医薬組成物である。本発明の第４の医薬組成物は、ＣＭＬ６６特異的に免疫誘導力が向上した樹状細胞を含んでいるため、例えば、悪性腫瘍の樹状細胞療法に利用できる。また、本発明の第４の医薬組成物は、前記樹状細胞に加え、前述のＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【００５４】
［実施例１］
本実施例では、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原ペプチドの同定を行った。腫瘍細胞やＰＢＭＣにおけるＨＬＡクラスＩ発現は、ＦＩＴＣ標識抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を用いてフローサイトメトリー法で解析した。なお、前記フローサイトメトリー法による解析では、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社製）、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。
【００５５】
（１）ＣＭＬ６６ペプチドの合成
ＨＬＡ−Ａ２４と結合可能性のあるペプチドとして、ＣＭＬ６６のアミノ酸配列由来の複数のペプチドを合成した。
【００５６】
（２）ＣＭＬ６６ペプチドのＨＬＡクラスＩ分子に対する結合能の測定
Ｔ２細胞は、抗原提示システムにおいて本質的な役割を持つＴＡＰ（transporter associated with antigen processing）を欠損した細胞であるため、細胞内在性の抗原を、細胞表面のＨＬＡ上にＨＬＡ−ペプチド複合体として提示することができない。しかし、細胞に添加したペプチドが、前記細胞表面でＨＬＡと結合する場合には、細胞表面にＨＬＡ−ペプチド複合体を形成できる。このため、抗原ペプチドとＨＬＡとの直接の結合を解析するアッセイに用いる細胞として有用であることが知られている。そこで、まず、Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４を発現させたＴ２−Ａ２４細胞を、培地に１×１０６個となるようにまき、合成した各種ＣＭＬ６６ペプチド１０μｍｏｌ／Ｌを添加した後、２８℃で１８時間培養を行った。Ｔ２−Ａ２４細胞の培地としては、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（終濃度８００μg／ｍＬ）を添加した１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。そして、培養細胞を回収し、これに、ＦＩＴＣで標識した抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を添加した。これらを４℃で２０分反応させた後、０．１％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（−）で、前記細胞を２回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。蛍光指数は、下記式より算出した。
蛍光指数＝（Ｓ−Ｂ）／Ｂ
Ｓ：各サンプルの平均蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの平均蛍光強度
【００５７】
各種ＣＭＬ６６ペプチドについて、フローサイトメトリー法により、ＨＬＡクラスＩに対する親和性を調べた結果を下記表１に示す。下記表１に、ＨＬＡ−Ａ２４に対して親和性を示したＣＭＬ６６ペプチドの情報、ならびに、測定結果を示す。なお、一般的に、蛍光指数測定値が１．０以上であれば、結合能が十分高いと判断でき、より高い値であれば、さらに結合能が高いと判断できる（高親和性）。
【００５８】
【表１】
【００５９】
前記表１に示すように、ＴＡＰ欠損細胞を用いたフローサイトメトリー法によって、ＨＬＡ−Ａ２４分子（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）に結合し得るペプチドとして、ＣＭＬ６６２１７−２２５（ＫＹＥＩＩＫＲＤＩ；配列番号３）、ＣＭＬ６６２２−３０（ＧＹＫＬＳＬＥＰＬ；配列番号４）、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ：配列番号１）、ＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ；配列番号２）を、それぞれ初めて同定した。ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４は、ＨＬＡ−Ａ２４分子に対し、特に高い結合性を示した。なお、ペプチドの名称に付した数字は、ＣＭＬ６６タンパク質におけるアミノ酸部位であり、各ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の位置を示す。
【００６０】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で同定されたペプチドＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４を用いて、ＣＭＬ６６ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を樹立し、その細胞傷害性を確認した。
【００６１】
（１）ＣＭＬ６６ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の樹立
ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性ドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ１４陽性細胞を回収した。回収したＣＤ１４陽性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（７５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（８．３ｎｇ／ｍＬ）を加えた１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、５日培養した。培養５日目に、さらに、ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ）を加えて、単球由来成熟樹状細胞を誘導・樹立した。そして、培養８日目に樹状細胞を回収し、これを抗原提示細胞として用いた。
【００６２】
同一ドナーのＰＢＭＣから、ＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を回収した。そして、前記樹状細胞に１０μｍｏｌ／ＬのＣＭＬ６６由来ペプチド、すなわち、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）またはＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）を添加し、１ウェルあたり１００μＬの培地に前記樹状細胞１×１０４個をまき、さらに、回収したＣＤ８＋Ｔ細胞約１×１０５個を加えて、これを刺激した。なお、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地により培養した。培養開始から８日目、さらに、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＭＭＣ）処理したドナーＰＢＭＣ １×１０４個にＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、２回目の刺激を行った。その２日後、さらに、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）を加えて継続培養を行い、培養開始から１５日目に、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＭＭＣ）で処理した自己ＰＢＭＣ １×１０５個に前記ＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、３回目の刺激を行った。３回目の刺激より４〜５日後、細胞傷害度を、５１Ｃｒ放出試験によって測定し、ペプチド特異的な反応が見られる細胞傷害性Ｔ細胞をスクリーニングした。そして、選択した細胞を、前記ＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）で繰り返し刺激しながら培養した。前記ＣＭＬ６６由来ペプチドに対する特異反応性を示した細胞は、ＩＬ−２を添加した培地で継続的に培養した。以後、４回目、５回目の刺激には、ＭＭＣで処理した自己ＰＢＭＣを、６回目の刺激以降は、ＭＭＣで処理した自己ＬＣＬ（リンパ芽球様細胞）を、それぞれ抗原提示細胞として用いた。なお、ＬＣＬとは、末梢血Ｂリンパ球にＥＢウイルスを感染させ、不死化させることによって樹立した細胞である。
【００６３】
（２）細胞傷害性の測定
（２−１）自己ＬＣＬ細胞に対するＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害
前記（１）において樹立した細胞傷害性Ｔ細胞について、従来公知の５１Ｃｒ放出試験により細胞傷害活性を確認した。なお、標的抗原特異的細胞傷害活性は、ＣＭＬ６６由来ペプチド添加および無添加での比較により検討した。
【００６４】
まず、５１Ｃｒ（Ｎａ２５１ＣｒＯ４）でラベルされた標的細胞を準備した。９６穴丸底プレートに、１ウェルあたり２００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地と前記標的細胞０．５×１０４個とを加え、さらに、所定の細胞数の細胞傷害性Ｔ細胞を添加して、５時間培養を行った。なお、ＣＭＬ６６由来ペプチドを添加する場合は、予め、ＣＭＬ６６由来ペプチドの存在下で標的細胞を２時間培養した後に、細胞傷害性Ｔ細胞を添加した。標的細胞として前述のＬＣＬを使用した。細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）と標的細胞（ターゲット；Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ比）は、５：１とした。そして、標的細胞と細胞傷害性Ｔ細胞とを反応させた後、培養液の上清を回収して５１Ｃｒ放出量を測定した。細胞傷害度は、下記式より算出した。
細胞傷害度＝（Ｓ−Ｎ）／（Ｍ−Ｎ）
Ｓ：各サンプル５１Ｃｒ放出量
Ｎ：自然５１Ｃｒ放出量
Ｍ：最大５１Ｃｒ放出量
【００６５】
これらの結果を、図１に示す。同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフである。両図において、横軸は、各ＣＭＬ６６由来ペプチド濃度であり、縦軸は、ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度（％）である。また、両図において、○は、自己ＬＣＬ細胞にＣＭＬ６６由来ペプチドを添加、●は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性健常者由来ＬＣＬ細胞にＣＭＬ６６由来ペプチドを添加した、３ｒｄ ｐａｒｔｙ（第三者陰性対照）に対する細胞傷害性Ｔ細胞アッセイの結果をそれぞれ示す。同図（Ａ）に示すように、樹立した細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）を添加された場合に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性自己ＬＣＬ細胞に対する傷害性を示した。また、データは示さないが、自己由来ＬＣＬ細胞を標的とした場合でも、ＣＭＬ６６ペプチドの非存在下では、細胞傷害が全く見られないことは確認している。このことから、本実施例で樹立された細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性は、ＣＭＬ６６７０−７８特異性を示すことが証明された。さらに、この細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６７０−７８を添加したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性健常者由来ＬＣＬ細胞（３ｒｄ ｐａｒｔｙ）に対して細胞傷害性を示さなかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４を用いた場合も、同様の結果が得られた。以上のことから、樹立された細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に特異的に結合したＣＭＬ６６由来ペプチドを認識して、標的細胞を傷害すると考えられた。
【００６６】
（２−２）ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性細胞による細胞傷害
ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に拘束されることを確認するために、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性自己ＬＣＬ細胞、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性非自己ＬＣＬ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性非自己ＬＣＬ、白血病患者由来細胞株であるＣ１Ｒ細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２を発現させたＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた細胞傷害性アッセイを行った。実験の条件は、細胞傷害時のＣＭＬ６６７６−８４の濃度を１０μｍｏｌ／Ｌとした以外は、本実施例の（２−１）と同様に行った。また、各種抗体を添加した際の細胞傷害性についても確認した。これは、ＣＭＬ６６７６−８４の濃度を１０μｍｏｌ／Ｌとし、細胞傷害性Ｔ細胞を加える直前３０分間に１０μｇ／ｍＬの抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（w6/32）または抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（L243）を加えた以外は、前記（２−１）と同様に行った。
【００６７】
これらの結果を、図２に示す。同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７６−８４ペプチド存在下もしくは非存在下における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害性アッセイの結果であり、同図（Ｂ）は、さらに、各種抗体存在下での細胞傷害度を示す結果である。なお、両図において、「＊」は、バックグラウンド以下の値であることを示す。同図（Ａ）に示すように、標的細胞のＨＬＡ−Ａ＊２４０２の存在下でのみ、ＣＭＬ６６７６−８４による細胞傷害が起こることがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を認識する抗ＨＬＡクラスＩ抗体によって細胞傷害が阻害されたのに対し、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を認識しない抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体では全く阻害効果が認められなかった。以上の結果から、ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に拘束されることが確認された。
【００６８】
（３）樹立した細胞傷害性Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ２４拘束性のさらなる確認
細胞傷害性Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ２４拘束性をさらに確認するために、各種細胞を標的細胞として用いて、前記（２）と同様にして、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性を調べた。標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性細胞として、ＫＨ８８（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＣＬ２２（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＡＺＺ（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＳＡＳ５２７（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＯＵＮ−１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）およびＭＥＧ０１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）を使用し、ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陰性細胞として、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＴ−１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）およびＫＧ−１（急性骨髄性白血病M1型ヒト株化細胞）を使用した。また、健常者由来ＰＢＭＣ（末梢血単核球）、ＣＢ（ヒト臍帯血細胞）およびＣＢＭＣ（ヒト臍帯血単核細胞）を対照として使用した。各種細胞の培養には、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）と、標的細胞（ターゲット；Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ比）は、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いた実験では、４０：１、２０：１、１０：１、または、５：１とし、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いた実験では、１０：１、５：１、または２．５：１とした。これらの結果を、図３および図４のグラフに示す。両図において、横軸は、ＣＭＬ６６特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度（％）である。
【００６９】
また、一部の標的細胞については、各種抗体を添加した際の細胞傷害についても確認した。これは、エフェクターである細胞傷害性Ｔ細胞を添加する前、前記標的細胞に対して、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体（ｗ６／３２）または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３）を終濃度１０μｇ／ｍＬになるように加え、その後１時間培養し、細胞傷害性Ｔ細胞を添加した。なお、Ｅ：Ｔ比は１０：１とし、コントロールとしては、抗体に代えてＰＢＳを添加した。これらの結果を、図５のグラフに示す。同図において、横軸は、ＣＭＬ６６特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度（％）である。
【００７０】
なお、前記各種標的細胞におけるＣＭＬ６６発現量を、予めリアルタイムＰＣＲ法により確認した。まず、各腫瘍細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、公知の方法によりｃＤＮＡを調製した。そして、このｃＤＮＡを鋳型として、市販のキット（ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ、ＣＭＬ６６ ｐｒｉｍｅｒ、ＧＡＰＤＨ ｐｒｉｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ ｃｏｐｙ数を測定した。解析は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。そして、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ法を用いて、Ｋ５６２細胞株のＣＭＬ６６発現量を１としたときの、各種細胞における発現の相対値を計算した。その結果を図６の棒グラフに示す。同図において、縦軸は、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの相対発現量である。図示のとおり、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来株化細胞である、Ｋ５６２細胞、ＫＨ８８細胞、ＫＣＬ２２細胞、ＫＡＺＺ細胞、ＳＡＳ５２７細胞、ＫＴ−１細胞、ＯＵＮ−１細胞、ＭＥＧ０１細胞、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来株化細胞であるＫＧ−１細胞のいずれも、ＣＭＬ６６のｍＲＮＡを発現し、特に、ＫＣＬ２２およびＫＴ−１が、ＣＭＬ６６のｍＲＮＡを高発現することが確認された。
【００７１】
図３は、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞による白血病細胞に対する細胞傷害度を示すグラフであり、図４は、ＣＭＬＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞による白血病細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。なお、同図において、「＊」は、バックグラウンド以下の値であることを示す。ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞の場合、同図上段に示すように、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６を強く発現しているＨＬＡ−Ａ２４陽性白血病細胞（ＫＨ８８、ＫＣＬ２２、ＫＡＺＺ、ＳＡＳ５２７）に対して、ＣＭＬ６６７０−７８無添加であっても、高い細胞傷害性を示すことが確認された。他方、同図中段に示すように、ＣＭＬ６６を強く発現している細胞であっても、ＨＬＡ−Ａ２４陰性白血病細胞（ＫＴ−１、ＫＧ−１、Ｋ５６２）に対しては、細胞傷害性は示さなかった。さらに、同図下段に示すように、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者由来細胞に対しても、細胞傷害性は示さなかった。また、ＣＭＬＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞の場合、図４に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性白血病細胞（ＯＵＮ−１、ＭＥＧ０１）に対してのみ、高い細胞傷害性を示すことが確認された。
【００７２】
図５は、さらに各種抗体存在下での細胞傷害度を示すグラフであり、同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞の結果であり、同図（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の結果であり。両図に示すように、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体を添加することによって阻害された。このことから、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害を示すことが確認された。これらの結果は、ＣＭＬ６６が、腫瘍細胞内で断片化され、ペプチド抗原ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４が腫瘍細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２４分子と結合して提示されていることを意味している。同時に、前記ＣＭＬ６６抗原ペプチドを標的として、ＨＬＡ−Ａ２４陽性者に標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できることを意味している。
【００７３】
［実施例３］
本実施例では、ＣＭＬ６６が、癌免疫療法の標的分子になり得ることをさらに検証する目的で、白血病患者の末梢血中でのＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を調べた。
【００７４】
（１）白血病細胞でのＣＭＬ６６発現の定量
ＨＬＡ−Ａ２４陽性の急性骨髄性白血病患者、慢性骨髄性白血病患者（慢性期及び急性転化期）、急性リンパ性白血病患者由来の各種細胞、さらに慢性骨髄性白血病患者骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞について、前述と同様のリアルタイムＰＣＲ法により、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの発現を定量した。なお、ＣＤ３４陽性細胞の回収には、実施例２と同様に、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いた。
【００７５】
これらの結果を、図７〜１０のグラフに示す。図７は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、進行期慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭｏＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者由来の細胞、対照としてＣＭＬ患者由来の細胞であるＫ５６２細胞、および健常者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、健常者由来のヒト臍帯血細胞（ＣＢ）の結果を示す図である。図８は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の各種サブタイプ（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５ｂ）の患者由来の細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。図９は、ＣＭＬの臨床病期である急性転化期（ＣＭＬ−ＢＣ：Ｂｌａｓｔ Ｃｒｉｓｉｓ）、慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ：Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐｈａｓｅ）の患者由来の細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。図１０は、ＣＭＬ慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者または健常者から単離したＣＤ３４陽性細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。ＣＭＬ患者のＣＤ３４陽性細胞は、ＣＭＬの白血病性幹細胞を含むと考えられている。図７〜１０において、縦軸は、それぞれ、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの相対発現量である。図示のとおり、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）、急性転化期の慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ−ＢＣ）、急性リンパ性白血病細胞（ＡＬＬ）およびＣＤ３４陽性慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ−ＣＰ ＣＤ３４＋）のいずれにもＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの高発現が確認された。以上の結果は、ＣＭＬ６６は、単にＡＭＬ、ＣＭＬ、ＣＭＭｏＬ、ＡＬＬの治療の標的として有望であるというだけでなく、Ｉｍａｔｉｎｉｂのような従来の分子標的薬が奏功しにくい、より悪性度の高い急性転化期ＣＭＬおよびＣＭＬの白血病性幹細胞に対しても有効である可能性を示している。
【００７６】
（２）ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞頻度の測定
まず、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の急性骨髄性及びリンパ性白血病患者（化学療法後並びに同種骨髄移植後）、ならびに健常者より末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、１×１０６〜２×１０６個となるようにまき、さらにＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を加えた。前記ＰＢＭＣは、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１２（１００ｐｇ／ｍＬ）を含有する１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１週間ごとに、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した。培養４日目からは、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）を加えて継続培養し、培養１６日目頃に、ＥＬＩＳＰＯＴ法によりＣＭＬ６６に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を測定した。なお、ＣＭＬ６６由来ペプチド未添加培養群を陰性コントロールとした。
【００７７】
ＥＬＩＳＰＯＴ法は、以下の通り行った。まず、底がニトロセルロース膜で覆われた９６穴ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレートに、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で１８時間放置することによって、前記膜に抗体を結合させた。前記膜をＰＢＳ（−）で洗浄し、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０で、３７℃、１時間、前記膜をコーティーングした後、前述のＴ２−Ａ２４細胞５×１０４個をまき、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加して、１時間培養を行った。前記Ｔ２−２４細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０により培養し、その後、各患者のＰＢＭＣをまいて、１８時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で前記プレートを洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を加えて９０分、続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を加えて９０分おいた。そして、最後に、混合液（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）／３−amino−９−Ethylcarbazole／N,N dimethylformamide／０．０１５％ H2O2）１００μＬを加えて４０分反応させて、発色させた。前記プレートを水でよく洗浄し、乾燥させた後、倒立顕微鏡により、スポットを確認し、ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を測定した。
【００７８】
図１１に、前記ＥＬＩＳＰＯＴ法による、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞頻度の測定結果を示す。同図（Ａ）は、患者末梢血中に存在する、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を示すＥＬＩＳＰＯＴ法による解析結果を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、患者二名に関する前記ＥＬＩＳＰＯＴ法で得られたスポットの写真である。また、両図において、「＋」は、ＣＭＬ６６７６−８４添加の結果、「−」は、ＣＭＬ６６７６−８４無添加の結果である。同図（Ａ）に示すように、健常者（○、△、□）末梢血中にはＣＭＬ６６７６−８４に応答して増加する細胞傷害性Ｔ細胞がほとんど存在しなかった。一方、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者（▲、×、●）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者（◆、■、▼）の末梢血中には、ＣＭＬ６６７６−８４に応答して増加する細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが確認できた。また、同図（Ｂ）に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４ペプチド添加の場合、無添加よりもスポットの増加が目視によっても顕著であった。なお、図示していないが、ＣＭＬ６６７０−７８ペプチドを用いた場合にも、ほぼ同様の結果が得られることが確認できた。
【００７９】
前述の図７〜１０に示すように、白血病患者由来の細胞において、ＣＭＬ６６の高発現が確認された。また、前述のように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、それぞれの患者の末梢血中に、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが確認された。この結果は、白血病患者内で前記ＣＭＬ由来６６ペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞の標的抗原として、実際に機能していることを示している。このため、ペプチドワクチンＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４によれば、これらの細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、腫瘍細胞を排除できる可能性が非常に高いといえる。以上の結果から、ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４が癌ワクチンとして有用であることが臨床的に証明されたといえる。
【００８０】
本発明のペプチドは、例えば、骨髄性白血病の他に、慢性骨髄単球性白血病や急性リンパ性白血病等を含む各種白血病患者由来の細胞に対して、腫瘍抗原ペプチドとして機能し、また、その他にも、メラノーマ細胞株や各種固形癌株化細胞、前立腺がん患者由来の細胞に対しても、腫瘍抗原ペプチドとして機能することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上のように、本発明は、例えば、白血病を含む悪性腫瘍の医療分野、特に、細胞免疫療法、ワクチン療法、遺伝子治療等を含む免疫療法の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、本発明の実施例２において、ＣＭＬ由来ペプチドで誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８を使用した結果であり、（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４を使用した結果である。
【図２】図２（Ａ）は、前記実施例２において、ＣＭＬ６６７６−８４存在下もしくは非存在下での細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度を示すグラフであり、図２（Ｂ）は、各種ＨＬＡ阻害抗体の存在下における細胞傷害度を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例２における、ＣＭＬ６６７０−７８特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による各種白血病患者由来の細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。
【図４】図４は、前記実施例２における、ＣＭＬ６６７６−８４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による各種白血病患者由来の細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。
【図５】図５は、前記実施例２における、各種抗体の添加による、ＣＭＬ６６由来ペプチドで誘導した細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害度を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８で誘導した結果であり、（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４で誘導した結果である。
【図６】図６は、前記実施例２における、各種標的細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例３における、各種白血病患者由来の細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図８】図８は、前記実施例３における、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の各臨床病型ごとの患者白血病細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図９】図９は、前記実施例３における、慢性骨髄性白血病の急性転化期（ＣＭＬ−ＢＣ）、および慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者骨髄由来白血病細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、前記実施例３における、ＣＭＬ慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者または健常者から単離したＣＤ３４陽性細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図１１】図１１（Ａ）は、前記実施例３における、各種白血病患者の末梢血中に存在するＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、代表的な陽性例二症例での前記ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞のスポットを示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞を排除する機能を有する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）は、癌細胞表面に発現しているＨＬＡクラスＩ分子と癌特異的タンパク質由来ペプチドとの複合体を認識して、癌細胞を消滅させる。近年、このメカニズムを利用して、細胞傷害性Ｔ細胞が認識する標的ペプチドを同定し、これを抗原ペプチドとして人為的に宿主に与え、特異的な抗腫瘍免疫を誘導する方法が、研究されている。そして、そのメカニズムから、前記抗原ペプチドは、癌ワクチンとも呼ばれている。これまでに、いくつかの癌細胞に特異的な抗原ペプチドの同定が行われ、癌ワクチンの応用が試みられているが、効果が十分ではないため、新たな抗原ペプチドの同定が求められている。
【０００３】
ＣＭＬ６６は、５８３アミノ酸からなる分子量６６ｋＤのタンパク質であり、移植片対白血病作用（Graft−versus−Leukemia effect：GVL）と関連する白血病関連抗原であることが報告されている。そして、さらなる解析によって、（１）ｃｏｄｉｎｇ遺伝子が、第８番染色体長腕（８ｑ２３）に位置していること、（２）タンパク質の機能が依然として不明であること、（３）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来の細胞や前立腺がん患者由来の細胞、さらに、ヒト白血病やメラノーマ、肺がん等の患者由来の株化細胞において、ＣＭＬ６６タンパク質およびＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの過剰発現が認められるが、正常組織では、ＨＬＡ分子が発現しない精巣細胞で産生される以外では、わずかに心臓で発現が確認されるのみであること、（４）正常でも２つのsplicing isoform（ＣＭＬ６６−Ｌ、ＣＭＬ６６−Ｓ）が見られ、５５４アミノ酸からなる短縮型isoformであるＣＭＬ６６−Ｓは、主に精巣細胞で発現し、さらに、担がん患者血清中のＣＭＬ６６特異抗体は、ＣＭＬ６６−Ｌに対するものがほとんどであること等が明らかとなっている（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Yang X.F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7492-7497, 2001.
【非特許文献２】Wu C.J. et al. Clin. Cancer Res. 11: 4504-4511, 2005.
【非特許文献３】Yan Y. et al. J. Immunol. 172: 651-660, 2004.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述の情報は、ＣＭＬ６６が、腫瘍細胞の特性に関与しているか否かは不明であるものの、いわゆる、分化抗原としてのがん関連抗原（癌細胞特異的抗原）として、様々な癌に対する免疫療法の標的抗原となり得ることを示していると考えられる。
【０００５】
そこで、本発明は、ＣＭＬ６６由来のペプチドであって、癌ワクチンとして使用可能な新たな抗原ペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のペプチドは、下記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドである。
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ （配列番号１）
（２）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド
ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ （配列番号２）
（３）前記（１）または（２）のペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上であるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
（４）前記（１）または（２）のペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド。
【０００７】
本発明の活性化誘導剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、以下の第１および第２の活性化誘導剤がある。第１の活性化誘導剤は、前記本発明のペプチドまたはその誘導体を含む活性化誘導剤であり、第２の活性化誘導剤は、前記本発明のペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む活性化誘導剤である。
【０００８】
本発明のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法は、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、前記本発明のペプチドまたはその誘導体とをインキュベーションする工程
【０００９】
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、下記工程（ａ）および（ｂ）を含むことを特徴とする。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、本発明のペプチドまたはその誘導体とをインキュベーションする工程
【００１０】
本発明の医薬組成物は、癌免疫療法に用いる医薬組成物である。本発明の第１の医薬組成物は、抗原ペプチドとして、本発明のペプチドまたはその誘導体を含む。本発明の第２の医薬組成物は、本発明のペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の第３の医薬組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む。また、本発明の第４の医薬組成物は、本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された抗原提示細胞を含む。
【発明の効果】
【００１１】
一般的に、抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に認識される際、特定のＨＬＡクラスＩ分子（ヒト組織適合性抗原；ヒト白血球抗原）に結合することにより、初めてＴＣＲに認識される。このため、日本人の約６０％が占めているＨＬＡ−Ａ２４分子のような、頻度が高いＨＬＡクラスＩ分子に対して結合可能なペプチドであれば、その汎用性を担保できると考えられる。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＬＡ−Ａ２４と結合するＣＭＬ６６由来のペプチドを同定し、本発明に到った。本発明のペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識され得る、ＣＭＬ６６特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。
【００１２】
本発明のペプチドによれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞となるため、悪性腫瘍の破壊による効果的な治療が可能となる。このため、本発明のペプチドは、例えば、癌ワクチン（悪性腫瘍ワクチン）等として使用でき、白血病を含む悪性腫瘍に対するワクチン療法に有用である。
【００１３】
また、本発明のペプチドをリンパ球と共培養することで、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を製造できる。このようにして製造した細胞傷害性Ｔ細胞を、例えば、患者の体内に戻すことによって、例えば、白血病を含む悪性腫瘍に対する細胞免疫療法が可能となる。
【００１４】
また、本発明のペプチドを樹状細胞と共培養することで、本発明のペプチドを抗原提示する抗原提示細胞を製造できる。樹状細胞は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）や共刺激分子を共発現し、抗原未感作のナイーブＴ細胞をも刺激できる、極めて強力な抗原提示細胞である。このため、本発明の抗原提示細胞によれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に活性化して、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる。したがって、このような抗原提示細胞を、例えば、患者の体内に戻すことによって、例えば、白血病等の悪性腫瘍に対して、より効果的な細胞免疫療法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ペプチドおよびその用途
（１）ペプチド
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子上に結合してＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識されうるＣＭＬ６６の抗原ペプチドである。ＨＬＡ−Ａ２４分子のＨＬＡ遺伝子型は、Ａ＊２４０２であることが好ましい。
【００１６】
本発明において、「抗原ペプチド」とは、抗原決定基（エピトープ）を構成するペプチドをいう。前記抗原ペプチドは、抗原決定基の最小単位である必要はなく、例えば、８〜２６個、９〜２４個、１０〜２２個又は１１〜２０個の範囲のアミノ酸により構成されるペプチドがあげられる。
【００１７】
本発明において、「ＨＬＡ−Ａ２４分子上に結合してＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識される」とは、例えば、あるペプチドが、樹状細胞等の抗原提示細胞表面のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示された場合、適切な補助刺激因子（共刺激因子）とともに、ペプチド抗原特異的にＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化しうること等をいう。
【００１８】
本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との結合は、例えば、細胞内部で発現されたペプチド、もしくは、貪食作用により細胞内部に取り込まれたペプチドが、細胞内でＨＬＡ−Ａ２４分子と結合する場合でもよい。また、既に細胞表面に存在するＨＬＡ−Ａ２４分子に、細胞外に存在するペプチドが直接結合する場合であってもよい。
【００１９】
本発明において、ＨＬＡクラスＩ分子とは、ヒトのＭＨＣクラスＩ分子に対応する分子であり、ＨＬＡ−Ａ２４型とは、ＨＬＡクラスＩ分子のアロ抗原型がＡ２４型であること、すなわち、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の遺伝子産物であることをいい、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２型とは、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型がＡ＊２４０２であることをいう。
【００２０】
本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。ＣＭＬ６６タンパク質（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＫ７３０１７）において、配列番号１のアミノ酸配列（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）は、７０番目〜７８番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号２のアミノ酸配列（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）は、７６番目〜８４番目のアミノ酸配列に相当する。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを、「ＣＭＬ６６７０−７８」ともいい、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを、「ＣＭＬ６６７６−８４」ともいう。
【００２１】
また、本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと相同なペプチドを含む。ここで、アミノ酸配列が「相同」であるとは、その機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。また、一般的に、２つ以上のアミノ酸配列において、例えば、８０％以上、８４％以上、８８％以上、９２％以上、９６％以上の同一性又は類似性を示す場合、これらは相同であるといえる。前記同一性および類似性は、２以上の塩基配列又はアミノ酸配列間で、これらの配列を比較して決定される関係をいう。同一性が、アライメントされた場合の同一残基の割合を示すのに対し、類似性は、同一残基に加え、同類置換された残基も含む。同一性および類似性は、従来公知の様々なコンピュータープログラムにより、容易に決定できる。本発明のペプチドにおいて、「機能」とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞にペプチド抗原特異的に認識されうることを意味する。
【００２２】
また、本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記機能を有するものも含む。相違するアミノ酸の残基数としては、例えば、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個である。
【００２３】
本発明のペプチドは、例えば、天然のＣＭＬ６６由来のペプチドのような天然物でもよいし、化学合成ペプチドや、遺伝子工学により製造されたペプチドであってもよい。化学合成や遺伝子工学による製造の手法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。遺伝子工学を利用する場合、例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドや、前記ポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の適当な宿主に導入し、生物学的に製造してもよい。
【００２４】
本発明のペプチドは、前述のような癌ワクチンとして使用できるたけでなく、例えば、ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を患者体外で増殖させた後、体内に移入（例えば、点滴投与等）する養子免疫療法（受動免疫療法）等に使用することができる。また、この他にも、例えば、体内に存在するＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、高感度かつ迅速に検出できるペプチド・ＨＬＡテトラマー診断法にも応用可能である。
【００２５】
（２）第１の活性化誘導剤
本発明の第１の活性化誘導剤は、前述のように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第１の活性化誘導剤を、例えば、目的の細胞や組織、その周辺に投与することによって、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。そして、この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００２６】
本発明の第１の活性化誘導剤は、例えば、本発明のペプチドおよび誘導体のいずれか一方を含むのみでもよいし、両方を含んでもよい。また、本発明のペプチドおよび誘導体は、一種類でもよいし、二種類以上を含んでいてもよい。本発明の第１の活性化誘導剤は、例えば、本発明のペプチドまたは誘導体のみでもよいし、この他に、さらに、各種添加剤を含んでもよい。なお、具体的な使用方法等については、例えば、後述する第１の医薬組成物と同様である。
【００２７】
（３）第１の医薬組成物
本発明の第１の医薬組成物は、前述のように、癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第１の医薬組成物は、例えば、前述の第１の活性化誘導剤と同様に、本発明のペプチドまたは誘導体のみでもよいし、この他に、さらに、薬学的に許容できるアジュバンド、キャリア又は賦形剤等の添加剤を含んでもよい。また、本発明のペプチドの誘導体としては、特に制限されず、例えば、従来公知の修飾方法により修飾されたもの、例えば、塩、糖鎖修飾されたもの、脂質修飾されたもの等が含まれる。以下、「本発明のペプチド」とは、本発明のペプチドの誘導体を含む。
【００２８】
本発明の第１の医薬組成物は、例えば、ワクチンとして患者に有効量を投与することで、癌（例えば、悪性腫瘍）のワクチン療法に使用できる。前記ワクチンが投与されると、例えば、患者の体内において、本発明のペプチドが樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれ、ＨＬＡクラスＩ分子に結合して前記抗原提示細胞上に抗原提示される。そして、発現している共刺激分子とともに、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激、誘導（活性化）する。活性化により細胞傷害性活性を持ったＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、前記患者の体内で、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。これにより、悪性腫瘍の治療が可能になる。なお、ＨＬＡ−Ａ２４のＨＬＡ遺伝子頻度は、日本人で約６０％を占めるといわれている。したがって、このように高い頻度のＨＬＡ−Ａ２４に結合できる点からも、本発明のペプチドを含む医薬組成物は、臨床的有用性が極めて高いといえる。
【００２９】
本発明の第１の医薬組成物の調製方法は、例えば、従来公知のワクチンの調製方法を使用できる。前記ワクチンは、例えば、注射剤として使用する溶液や懸濁液として、本発明のペプチドと、薬学的に許容できる賦形剤とから調製してもよい。また、前記ワクチンを、固体に調製してもよい。前記賦形剤としては、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また必要に応じて、ワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含んでいてもよい。前記アジュバントとしては、特に制限されず、従来公知のものを使用でき、その中でも、患者の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞による本発明のペプチドの取込みを促進するものが好ましい。また、本発明のペプチドは、中性または薬学的に許容できる塩として、ワクチンに製剤化されてもよい。
【００３０】
ワクチンの投与方法は、制限されないが、例えば、表皮下、真皮内、真皮下又は筋肉内等への注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した製剤として、例えば、坐剤や、経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門及び頭蓋内製剤がある。ワクチンは、患者及び剤形に合わせて、治療に有効な量を投与することが好ましい。
【００３１】
本発明において、治療対象となる悪性腫瘍は、制限されない。具体例としては、例えば、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍があげられ、例えば、各種白血病や各種固形腫瘍等である。前記白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）等があげられ、前記固形腫瘍としては、例えば、肺、前立腺癌、並びに黒色腫等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ポリヌクレオチドおよびベクターならびにその用途
（１）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドを、例えば、目的の細胞に導入し、前記細胞内で本発明のペプチドを発現させれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３３】
前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下に示す塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドＣＭＬ６６７０−７８をコードするポリヌクレオチドの一例である。また、配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドＣＭＬ６６７６−８４をコードするポリヌクレオチドの一例である。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドでも二本鎖ポリヌクレオチドでもよい。
ＣＭＬ６６７０−７８ 5’−tggtatcaagacagtgtctactatatt−3’ （配列番号５）
ＣＭＬ６６７６−８４ 5’−tactatattgatacccttggaagaatt−3’ （配列番号６）
【００３４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相同な塩基配列、または、その相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの塩基配列が「相同」であるとは、前記ポリヌクレオチドがコードするペプチドが、本発明のペプチドとしての機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。例えば、塩基配列に、点変異、欠失又は付加による相違があるとしても、これらが前記遺伝子の機能に影響を与えないならば、両者は相同であるといえる。相違する塩基数としては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、２つ以上の配列において、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは約９９％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、２つのポリヌクレオチドの一方が、他方の相補配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、「Ｔｍ−２５℃」の温度で一晩保温する条件等があげられる。前記Ｔｍは、例えば、下記式により求められる。下記式中、Ｎはポリヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはポリヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。
Ｔｍ＝８１.５−１６.６(ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ）−(６００/Ｎ）
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成により製造してもよく、または、公知のＣＭＬ６６遺伝子に基づき設計したプライマーを使用して、各種遺伝子増幅法により製造し、または、適当なベクターにクローニングしてもよい。
【００３６】
（２）ベクター
本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターを、例えば、目的の細胞に導入し、前記細胞内で本発明のペプチドを発現させれば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３７】
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、発現ベクターであることが好ましく、本発明のポリヌクレオチドが、本発明のベクターが導入される宿主細胞内で発現可能なように連結されていることが好ましい。本発明のベクターの種類は、特に制限されず、例えば、ウイルスベクターであってよく、非ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスがあげられる。非ウイルスベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ１０８，１９３−２００（１９９１））等の発現ベクターが例示できる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００３８】
（３）第２の活性化誘導剤
本発明の第２の活性化誘導剤は、前述のように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の第２の活性化誘導剤を、例えば、目的の細胞に導入して、本発明のポリペプチドや誘導体を発現させることによって、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化・増殖を促進できる。そして、この活性化により、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞とすることができる。
【００３９】
本発明の第２の活性化誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターのいずれか一方を含むのみでもよいし、両方を含んでもよい。また、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、一種類でもよいし、二種類以上を含んでもよい。本発明の第２の活性化誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターのみでもよいし、この他に、さらに、各種添加剤を含んでもよい。なお、具体的な使用方法等については、例えば、後述する第２の医薬組成物と同様にすることができる。
【００４０】
（４）第２の医薬組成物
本発明の第２の医薬組成物は、癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの少なくとも一方を含むことを特徴とする。第２の医薬組成物は、例えば、患者の体内、好ましくは、皮下組織、リンパ節内、筋肉細胞内に接種し、本発明のペプチドを発現させることで、ＣＭＬ６６特異的免疫反応を誘導するＤＮＡ（ＲＮＡ）ワクチン療法に使用できる。第２の医薬組成物の細胞への導入方法は、特に制限されず、ポリヌクレオチドやベクターの種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ウイルスベクターを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等があげられる。
【００４１】
ワクチンとしての調製方法は、特に制限されず、前述の本発明のペプチドを含むワクチン（第１の医薬組成物）と同様に調製できる。また、本発明の第２の医薬組成物において、本発明のポリヌクレオチドは、導入される細胞内で本発明のペプチドを発現できる形態であればよい。この場合、第２の医薬組成物は、例えば、ベクターに連結されていない本発明のポリヌクレオチドを、導入剤とともに含んでもよい。前記導入剤としては、特に制限されないが、例えば、リポソーム等の、非ベクター系遺伝子導入方法に使用されるものがあげられる。また、本発明のポリヌクレオチドを含む第２の医薬組成物を、例えば、パーティクルガン等を用いた直接注入法により、接種することもできる。
【００４２】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法およびその用途
（１）ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法
本発明のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法は、前述のように、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方とをインキュベーションする工程
【００４３】
前記工程（Ｂ）においては、例えば、前記リンパ球と、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞とをインキュベーションすることが好ましい。前記抗原提示細胞の調製方法は、特に制限されない。具体例としては、前記工程（Ｂ）において、例えば、前記リンパ球と、樹状細胞と、本発明のペプチドとをインキュベーションすることによって、抗原提示細胞を調製できる。前記樹状細胞は、例えば、本発明のペプチドをパルスされることによって、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞となる。そして、この抗原提示細胞が、前記リンパ球の増殖および活性化を誘導するため、細胞傷害活性を有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が得られる。
【００４４】
前記リンパ球は、通常、患者の血液から採取される。前記抗原提示細胞としては、例えば、リンパ球を採取した患者から採取したものが使用できる。この他にも、例えば、自己、同種同系、および、ＨＬＡクラスＩについて前記患者と一致する同種異系の抗原提示細胞が使用できる。前記抗原提示細胞としては、本発明のペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に対して提示し、これを増殖刺激して活性化し得るＨＬＡ−Ａ２４分子および補助刺激分子（共刺激分子）を発現するものが好ましく、例えば、樹状細胞があげられる。抗原提示細胞は、例えば、リンパ球を採取した患者から採取または調製することが好ましい。
【００４５】
本発明の製造方法により製造されるＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、白血病細胞を含む悪性腫瘍細胞に対してＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害性を示すという特徴的機能を有する。このため、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、前記ＨＬＡ−Ａ２４陽性患者の体内で、ＣＭＬ６６を発現する悪性腫瘍細胞を破壊する。
【００４６】
（２）第３の医薬組成物
本発明の第３の医薬組成物は、本発明のＣＤ８＋傷害性Ｔ細胞の製造方法により製造されたＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む。この医薬組成物を、例えば、患者に有効量投与することで、悪性腫瘍を治療する細胞免疫療法が可能となる。
【００４７】
抗原提示細胞の製造方法およびその用途
（１）抗原提示細胞の製造方法
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、前述のように、下記工程（ａ）および（ｂ）を含むことを特徴とする。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、本発明のペプチドおよびその誘導体の少なくとも一方とをインキュベーションする工程
【００４８】
前記（ａ）工程において、樹状細胞は、例えば、患者血液に存在する細胞でもよいし、人為的に分化誘導することにより調製した樹状細胞でもよい。前者の場合、例えば、血液成分分離装置を用いて、患者本人の血液から樹状細胞そのものを採取する方法により得られる。また、後者の場合、患者の未成熟樹状細胞は、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、例えば、サイトカインの一種であるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４等の存在下で培養することにより得られる。さらに、例えば、ＴＮＦ−α等で成熟樹状細胞に分化させる。そして、このようにして得られた樹状細胞を本発明のペプチドまたは誘導体とインキュベーションすることにより、例えば、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞を製造できる。
【００４９】
また、本発明の抗原提示細胞の製造方法において、前記工程（ｂ）に代えて、下記（ｃ）工程を含んでもよい。
（ｃ）前記樹状細胞に、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを導入する工程
【００５０】
このように、樹状細胞に本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを導入することで、樹状細胞内で本発明のペプチドが発現される。その結果、前記樹状細胞内で、発現したペプチドが前記細胞表面に提示されることで、抗原提示細胞が得られる。この抗原提示細胞は、ＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫誘導力が増強された樹状細胞である。ポリヌクレオチドやベクターの遺伝子導入方法としては、特に制限されず、その種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ウイルスベクターを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００５１】
本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された細胞は、下記医薬組成物として以外に、例えば、本発明のＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の製造方法における抗原提示細胞としても使用できる。
【００５２】
（２）第４の医薬組成物
本発明の第４の医薬組成物は、本発明の抗原提示細胞の製造方法により製造された抗原提示細胞を含む医薬組成物である。本発明の第４の医薬組成物は、ＣＭＬ６６特異的に免疫誘導力が向上した樹状細胞を含んでいるため、例えば、悪性腫瘍の樹状細胞療法に利用できる。また、本発明の第４の医薬組成物は、前記樹状細胞に加え、前述のＣＭＬ６６特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【００５４】
［実施例１］
本実施例では、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原ペプチドの同定を行った。腫瘍細胞やＰＢＭＣにおけるＨＬＡクラスＩ発現は、ＦＩＴＣ標識抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を用いてフローサイトメトリー法で解析した。なお、前記フローサイトメトリー法による解析では、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社製）、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。
【００５５】
（１）ＣＭＬ６６ペプチドの合成
ＨＬＡ−Ａ２４と結合可能性のあるペプチドとして、ＣＭＬ６６のアミノ酸配列由来の複数のペプチドを合成した。
【００５６】
（２）ＣＭＬ６６ペプチドのＨＬＡクラスＩ分子に対する結合能の測定
Ｔ２細胞は、抗原提示システムにおいて本質的な役割を持つＴＡＰ（transporter associated with antigen processing）を欠損した細胞であるため、細胞内在性の抗原を、細胞表面のＨＬＡ上にＨＬＡ−ペプチド複合体として提示することができない。しかし、細胞に添加したペプチドが、前記細胞表面でＨＬＡと結合する場合には、細胞表面にＨＬＡ−ペプチド複合体を形成できる。このため、抗原ペプチドとＨＬＡとの直接の結合を解析するアッセイに用いる細胞として有用であることが知られている。そこで、まず、Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４を発現させたＴ２−Ａ２４細胞を、培地に１×１０６個となるようにまき、合成した各種ＣＭＬ６６ペプチド１０μｍｏｌ／Ｌを添加した後、２８℃で１８時間培養を行った。Ｔ２−Ａ２４細胞の培地としては、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（終濃度８００μg／ｍＬ）を添加した１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。そして、培養細胞を回収し、これに、ＦＩＴＣで標識した抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を添加した。これらを４℃で２０分反応させた後、０．１％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（−）で、前記細胞を２回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。蛍光指数は、下記式より算出した。
蛍光指数＝（Ｓ−Ｂ）／Ｂ
Ｓ：各サンプルの平均蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの平均蛍光強度
【００５７】
各種ＣＭＬ６６ペプチドについて、フローサイトメトリー法により、ＨＬＡクラスＩに対する親和性を調べた結果を下記表１に示す。下記表１に、ＨＬＡ−Ａ２４に対して親和性を示したＣＭＬ６６ペプチドの情報、ならびに、測定結果を示す。なお、一般的に、蛍光指数測定値が１．０以上であれば、結合能が十分高いと判断でき、より高い値であれば、さらに結合能が高いと判断できる（高親和性）。
【００５８】
【表１】
【００５９】
前記表１に示すように、ＴＡＰ欠損細胞を用いたフローサイトメトリー法によって、ＨＬＡ−Ａ２４分子（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）に結合し得るペプチドとして、ＣＭＬ６６２１７−２２５（ＫＹＥＩＩＫＲＤＩ；配列番号３）、ＣＭＬ６６２２−３０（ＧＹＫＬＳＬＥＰＬ；配列番号４）、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ：配列番号１）、ＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ；配列番号２）を、それぞれ初めて同定した。ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４は、ＨＬＡ−Ａ２４分子に対し、特に高い結合性を示した。なお、ペプチドの名称に付した数字は、ＣＭＬ６６タンパク質におけるアミノ酸部位であり、各ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の位置を示す。
【００６０】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で同定されたペプチドＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４を用いて、ＣＭＬ６６ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を樹立し、その細胞傷害性を確認した。
【００６１】
（１）ＣＭＬ６６ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の樹立
ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性ドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ１４陽性細胞を回収した。回収したＣＤ１４陽性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（７５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−４（８．３ｎｇ／ｍＬ）を加えた１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、５日培養した。培養５日目に、さらに、ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ）を加えて、単球由来成熟樹状細胞を誘導・樹立した。そして、培養８日目に樹状細胞を回収し、これを抗原提示細胞として用いた。
【００６２】
同一ドナーのＰＢＭＣから、ＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を回収した。そして、前記樹状細胞に１０μｍｏｌ／ＬのＣＭＬ６６由来ペプチド、すなわち、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）またはＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）を添加し、１ウェルあたり１００μＬの培地に前記樹状細胞１×１０４個をまき、さらに、回収したＣＤ８＋Ｔ細胞約１×１０５個を加えて、これを刺激した。なお、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地により培養した。培養開始から８日目、さらに、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＭＭＣ）処理したドナーＰＢＭＣ １×１０４個にＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、２回目の刺激を行った。その２日後、さらに、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）を加えて継続培養を行い、培養開始から１５日目に、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＭＭＣ）で処理した自己ＰＢＭＣ １×１０５個に前記ＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、３回目の刺激を行った。３回目の刺激より４〜５日後、細胞傷害度を、５１Ｃｒ放出試験によって測定し、ペプチド特異的な反応が見られる細胞傷害性Ｔ細胞をスクリーニングした。そして、選択した細胞を、前記ＣＭＬ６６由来ペプチド（１０μｍｏｌ／Ｌ）で繰り返し刺激しながら培養した。前記ＣＭＬ６６由来ペプチドに対する特異反応性を示した細胞は、ＩＬ−２を添加した培地で継続的に培養した。以後、４回目、５回目の刺激には、ＭＭＣで処理した自己ＰＢＭＣを、６回目の刺激以降は、ＭＭＣで処理した自己ＬＣＬ（リンパ芽球様細胞）を、それぞれ抗原提示細胞として用いた。なお、ＬＣＬとは、末梢血Ｂリンパ球にＥＢウイルスを感染させ、不死化させることによって樹立した細胞である。
【００６３】
（２）細胞傷害性の測定
（２−１）自己ＬＣＬ細胞に対するＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害
前記（１）において樹立した細胞傷害性Ｔ細胞について、従来公知の５１Ｃｒ放出試験により細胞傷害活性を確認した。なお、標的抗原特異的細胞傷害活性は、ＣＭＬ６６由来ペプチド添加および無添加での比較により検討した。
【００６４】
まず、５１Ｃｒ（Ｎａ２５１ＣｒＯ４）でラベルされた標的細胞を準備した。９６穴丸底プレートに、１ウェルあたり２００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地と前記標的細胞０．５×１０４個とを加え、さらに、所定の細胞数の細胞傷害性Ｔ細胞を添加して、５時間培養を行った。なお、ＣＭＬ６６由来ペプチドを添加する場合は、予め、ＣＭＬ６６由来ペプチドの存在下で標的細胞を２時間培養した後に、細胞傷害性Ｔ細胞を添加した。標的細胞として前述のＬＣＬを使用した。細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）と標的細胞（ターゲット；Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ比）は、５：１とした。そして、標的細胞と細胞傷害性Ｔ細胞とを反応させた後、培養液の上清を回収して５１Ｃｒ放出量を測定した。細胞傷害度は、下記式より算出した。
細胞傷害度＝（Ｓ−Ｎ）／（Ｍ−Ｎ）
Ｓ：各サンプル５１Ｃｒ放出量
Ｎ：自然５１Ｃｒ放出量
Ｍ：最大５１Ｃｒ放出量
【００６５】
これらの結果を、図１に示す。同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフである。両図において、横軸は、各ＣＭＬ６６由来ペプチド濃度であり、縦軸は、ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度（％）である。また、両図において、○は、自己ＬＣＬ細胞にＣＭＬ６６由来ペプチドを添加、●は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性健常者由来ＬＣＬ細胞にＣＭＬ６６由来ペプチドを添加した、３ｒｄ ｐａｒｔｙ（第三者陰性対照）に対する細胞傷害性Ｔ細胞アッセイの結果をそれぞれ示す。同図（Ａ）に示すように、樹立した細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）を添加された場合に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性自己ＬＣＬ細胞に対する傷害性を示した。また、データは示さないが、自己由来ＬＣＬ細胞を標的とした場合でも、ＣＭＬ６６ペプチドの非存在下では、細胞傷害が全く見られないことは確認している。このことから、本実施例で樹立された細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性は、ＣＭＬ６６７０−７８特異性を示すことが証明された。さらに、この細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６７０−７８を添加したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性健常者由来ＬＣＬ細胞（３ｒｄ ｐａｒｔｙ）に対して細胞傷害性を示さなかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４を用いた場合も、同様の結果が得られた。以上のことから、樹立された細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に特異的に結合したＣＭＬ６６由来ペプチドを認識して、標的細胞を傷害すると考えられた。
【００６６】
（２−２）ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性細胞による細胞傷害
ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に拘束されることを確認するために、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性自己ＬＣＬ細胞、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性非自己ＬＣＬ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性非自己ＬＣＬ、白血病患者由来細胞株であるＣ１Ｒ細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２を発現させたＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた細胞傷害性アッセイを行った。実験の条件は、細胞傷害時のＣＭＬ６６７６−８４の濃度を１０μｍｏｌ／Ｌとした以外は、本実施例の（２−１）と同様に行った。また、各種抗体を添加した際の細胞傷害性についても確認した。これは、ＣＭＬ６６７６−８４の濃度を１０μｍｏｌ／Ｌとし、細胞傷害性Ｔ細胞を加える直前３０分間に１０μｇ／ｍＬの抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（w6/32）または抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（L243）を加えた以外は、前記（２−１）と同様に行った。
【００６７】
これらの結果を、図２に示す。同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７６−８４ペプチド存在下もしくは非存在下における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害性アッセイの結果であり、同図（Ｂ）は、さらに、各種抗体存在下での細胞傷害度を示す結果である。なお、両図において、「＊」は、バックグラウンド以下の値であることを示す。同図（Ａ）に示すように、標的細胞のＨＬＡ−Ａ＊２４０２の存在下でのみ、ＣＭＬ６６７６−８４による細胞傷害が起こることがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を認識する抗ＨＬＡクラスＩ抗体によって細胞傷害が阻害されたのに対し、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を認識しない抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体では全く阻害効果が認められなかった。以上の結果から、ＣＭＬ６６由来ペプチド特異的細胞傷害が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に拘束されることが確認された。
【００６８】
（３）樹立した細胞傷害性Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ２４拘束性のさらなる確認
細胞傷害性Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ２４拘束性をさらに確認するために、各種細胞を標的細胞として用いて、前記（２）と同様にして、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性を調べた。標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陽性細胞として、ＫＨ８８（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＣＬ２２（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＡＺＺ（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＳＡＳ５２７（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＯＵＮ−１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）およびＭＥＧ０１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）を使用し、ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）陰性細胞として、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）、ＫＴ−１（慢性骨髄性白血病急性転化型ヒト株化細胞）およびＫＧ−１（急性骨髄性白血病M1型ヒト株化細胞）を使用した。また、健常者由来ＰＢＭＣ（末梢血単核球）、ＣＢ（ヒト臍帯血細胞）およびＣＢＭＣ（ヒト臍帯血単核細胞）を対照として使用した。各種細胞の培養には、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）と、標的細胞（ターゲット；Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ比）は、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いた実験では、４０：１、２０：１、１０：１、または、５：１とし、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いた実験では、１０：１、５：１、または２．５：１とした。これらの結果を、図３および図４のグラフに示す。両図において、横軸は、ＣＭＬ６６特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度（％）である。
【００６９】
また、一部の標的細胞については、各種抗体を添加した際の細胞傷害についても確認した。これは、エフェクターである細胞傷害性Ｔ細胞を添加する前、前記標的細胞に対して、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体（ｗ６／３２）または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３）を終濃度１０μｇ／ｍＬになるように加え、その後１時間培養し、細胞傷害性Ｔ細胞を添加した。なお、Ｅ：Ｔ比は１０：１とし、コントロールとしては、抗体に代えてＰＢＳを添加した。これらの結果を、図５のグラフに示す。同図において、横軸は、ＣＭＬ６６特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度（％）である。
【００７０】
なお、前記各種標的細胞におけるＣＭＬ６６発現量を、予めリアルタイムＰＣＲ法により確認した。まず、各腫瘍細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、公知の方法によりｃＤＮＡを調製した。そして、このｃＤＮＡを鋳型として、市販のキット（ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ、ＣＭＬ６６ ｐｒｉｍｅｒ、ＧＡＰＤＨ ｐｒｉｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ ｃｏｐｙ数を測定した。解析は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。そして、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ法を用いて、Ｋ５６２細胞株のＣＭＬ６６発現量を１としたときの、各種細胞における発現の相対値を計算した。その結果を図６の棒グラフに示す。同図において、縦軸は、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの相対発現量である。図示のとおり、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者由来株化細胞である、Ｋ５６２細胞、ＫＨ８８細胞、ＫＣＬ２２細胞、ＫＡＺＺ細胞、ＳＡＳ５２７細胞、ＫＴ−１細胞、ＯＵＮ−１細胞、ＭＥＧ０１細胞、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来株化細胞であるＫＧ−１細胞のいずれも、ＣＭＬ６６のｍＲＮＡを発現し、特に、ＫＣＬ２２およびＫＴ−１が、ＣＭＬ６６のｍＲＮＡを高発現することが確認された。
【００７１】
図３は、ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞による白血病細胞に対する細胞傷害度を示すグラフであり、図４は、ＣＭＬＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞による白血病細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。なお、同図において、「＊」は、バックグラウンド以下の値であることを示す。ＣＭＬ６６７０−７８（ＷＹＱＤＳＶＹＹＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞の場合、同図上段に示すように、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＭＬ６６を強く発現しているＨＬＡ−Ａ２４陽性白血病細胞（ＫＨ８８、ＫＣＬ２２、ＫＡＺＺ、ＳＡＳ５２７）に対して、ＣＭＬ６６７０−７８無添加であっても、高い細胞傷害性を示すことが確認された。他方、同図中段に示すように、ＣＭＬ６６を強く発現している細胞であっても、ＨＬＡ−Ａ２４陰性白血病細胞（ＫＴ−１、ＫＧ−１、Ｋ５６２）に対しては、細胞傷害性は示さなかった。さらに、同図下段に示すように、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者由来細胞に対しても、細胞傷害性は示さなかった。また、ＣＭＬＣＭＬ６６７６−８４（ＹＹＩＤＴＬＧＲＩ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞の場合、図４に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性白血病細胞（ＯＵＮ−１、ＭＥＧ０１）に対してのみ、高い細胞傷害性を示すことが確認された。
【００７２】
図５は、さらに各種抗体存在下での細胞傷害度を示すグラフであり、同図（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８特異的細胞傷害性Ｔ細胞の結果であり、同図（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の結果であり。両図に示すように、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性は、抗ＨＬＡ−クラスＩ抗体を添加することによって阻害された。このことから、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害を示すことが確認された。これらの結果は、ＣＭＬ６６が、腫瘍細胞内で断片化され、ペプチド抗原ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４が腫瘍細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２４分子と結合して提示されていることを意味している。同時に、前記ＣＭＬ６６抗原ペプチドを標的として、ＨＬＡ−Ａ２４陽性者に標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できることを意味している。
【００７３】
［実施例３］
本実施例では、ＣＭＬ６６が、癌免疫療法の標的分子になり得ることをさらに検証する目的で、白血病患者の末梢血中でのＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を調べた。
【００７４】
（１）白血病細胞でのＣＭＬ６６発現の定量
ＨＬＡ−Ａ２４陽性の急性骨髄性白血病患者、慢性骨髄性白血病患者（慢性期及び急性転化期）、急性リンパ性白血病患者由来の各種細胞、さらに慢性骨髄性白血病患者骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞について、前述と同様のリアルタイムＰＣＲ法により、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの発現を定量した。なお、ＣＤ３４陽性細胞の回収には、実施例２と同様に、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いた。
【００７５】
これらの結果を、図７〜１０のグラフに示す。図７は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、進行期慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭｏＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者由来の細胞、対照としてＣＭＬ患者由来の細胞であるＫ５６２細胞、および健常者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、健常者由来のヒト臍帯血細胞（ＣＢ）の結果を示す図である。図８は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の各種サブタイプ（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５ｂ）の患者由来の細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。図９は、ＣＭＬの臨床病期である急性転化期（ＣＭＬ−ＢＣ：Ｂｌａｓｔ Ｃｒｉｓｉｓ）、慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ：Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐｈａｓｅ）の患者由来の細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。図１０は、ＣＭＬ慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者または健常者から単離したＣＤ３４陽性細胞、およびＫ５６２についての結果を示す図である。ＣＭＬ患者のＣＤ３４陽性細胞は、ＣＭＬの白血病性幹細胞を含むと考えられている。図７〜１０において、縦軸は、それぞれ、ＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの相対発現量である。図示のとおり、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）、急性転化期の慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ−ＢＣ）、急性リンパ性白血病細胞（ＡＬＬ）およびＣＤ３４陽性慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ−ＣＰ ＣＤ３４＋）のいずれにもＣＭＬ６６ ｍＲＮＡの高発現が確認された。以上の結果は、ＣＭＬ６６は、単にＡＭＬ、ＣＭＬ、ＣＭＭｏＬ、ＡＬＬの治療の標的として有望であるというだけでなく、Ｉｍａｔｉｎｉｂのような従来の分子標的薬が奏功しにくい、より悪性度の高い急性転化期ＣＭＬおよびＣＭＬの白血病性幹細胞に対しても有効である可能性を示している。
【００７６】
（２）ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞頻度の測定
まず、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の急性骨髄性及びリンパ性白血病患者（化学療法後並びに同種骨髄移植後）、ならびに健常者より末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、１×１０６〜２×１０６個となるようにまき、さらにＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を加えた。前記ＰＢＭＣは、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１２（１００ｐｇ／ｍＬ）を含有する１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１週間ごとに、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した。培養４日目からは、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）を加えて継続培養し、培養１６日目頃に、ＥＬＩＳＰＯＴ法によりＣＭＬ６６に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を測定した。なお、ＣＭＬ６６由来ペプチド未添加培養群を陰性コントロールとした。
【００７７】
ＥＬＩＳＰＯＴ法は、以下の通り行った。まず、底がニトロセルロース膜で覆われた９６穴ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレートに、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で１８時間放置することによって、前記膜に抗体を結合させた。前記膜をＰＢＳ（−）で洗浄し、１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０で、３７℃、１時間、前記膜をコーティーングした後、前述のＴ２−Ａ２４細胞５×１０４個をまき、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加して、１時間培養を行った。前記Ｔ２−２４細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０により培養し、その後、各患者のＰＢＭＣをまいて、１８時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で前記プレートを洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を加えて９０分、続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を加えて９０分おいた。そして、最後に、混合液（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）／３−amino−９−Ethylcarbazole／N,N dimethylformamide／０．０１５％ H2O2）１００μＬを加えて４０分反応させて、発色させた。前記プレートを水でよく洗浄し、乾燥させた後、倒立顕微鏡により、スポットを確認し、ＣＭＬ６６特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を測定した。
【００７８】
図１１に、前記ＥＬＩＳＰＯＴ法による、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞頻度の測定結果を示す。同図（Ａ）は、患者末梢血中に存在する、ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を示すＥＬＩＳＰＯＴ法による解析結果を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、患者二名に関する前記ＥＬＩＳＰＯＴ法で得られたスポットの写真である。また、両図において、「＋」は、ＣＭＬ６６７６−８４添加の結果、「−」は、ＣＭＬ６６７６−８４無添加の結果である。同図（Ａ）に示すように、健常者（○、△、□）末梢血中にはＣＭＬ６６７６−８４に応答して増加する細胞傷害性Ｔ細胞がほとんど存在しなかった。一方、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者（▲、×、●）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者（◆、■、▼）の末梢血中には、ＣＭＬ６６７６−８４に応答して増加する細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが確認できた。また、同図（Ｂ）に示すように、ＣＭＬ６６７６−８４ペプチド添加の場合、無添加よりもスポットの増加が目視によっても顕著であった。なお、図示していないが、ＣＭＬ６６７０−７８ペプチドを用いた場合にも、ほぼ同様の結果が得られることが確認できた。
【００７９】
前述の図７〜１０に示すように、白血病患者由来の細胞において、ＣＭＬ６６の高発現が確認された。また、前述のように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、それぞれの患者の末梢血中に、ＣＭＬ６６７０−７８またはＣＭＬ６６７６−８４を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが確認された。この結果は、白血病患者内で前記ＣＭＬ由来６６ペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞の標的抗原として、実際に機能していることを示している。このため、ペプチドワクチンＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４によれば、これらの細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、腫瘍細胞を排除できる可能性が非常に高いといえる。以上の結果から、ＣＭＬ６６７０−７８およびＣＭＬ６６７６−８４が癌ワクチンとして有用であることが臨床的に証明されたといえる。
【００８０】
本発明のペプチドは、例えば、骨髄性白血病の他に、慢性骨髄単球性白血病や急性リンパ性白血病等を含む各種白血病患者由来の細胞に対して、腫瘍抗原ペプチドとして機能し、また、その他にも、メラノーマ細胞株や各種固形癌株化細胞、前立腺がん患者由来の細胞に対しても、腫瘍抗原ペプチドとして機能することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上のように、本発明は、例えば、白血病を含む悪性腫瘍の医療分野、特に、細胞免疫療法、ワクチン療法、遺伝子治療等を含む免疫療法の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、本発明の実施例２において、ＣＭＬ由来ペプチドで誘導した細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害度を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８を使用した結果であり、（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４を使用した結果である。
【図２】図２（Ａ）は、前記実施例２において、ＣＭＬ６６７６−８４存在下もしくは非存在下での細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞傷害度を示すグラフであり、図２（Ｂ）は、各種ＨＬＡ阻害抗体の存在下における細胞傷害度を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例２における、ＣＭＬ６６７０−７８特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による各種白血病患者由来の細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。
【図４】図４は、前記実施例２における、ＣＭＬ６６７６−８４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による各種白血病患者由来の細胞に対する細胞傷害度を示すグラフである。
【図５】図５は、前記実施例２における、各種抗体の添加による、ＣＭＬ６６由来ペプチドで誘導した細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害度を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＭＬ６６７０−７８で誘導した結果であり、（Ｂ）は、ＣＭＬ６６７６−８４で誘導した結果である。
【図６】図６は、前記実施例２における、各種標的細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例３における、各種白血病患者由来の細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図８】図８は、前記実施例３における、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の各臨床病型ごとの患者白血病細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図９】図９は、前記実施例３における、慢性骨髄性白血病の急性転化期（ＣＭＬ−ＢＣ）、および慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者骨髄由来白血病細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、前記実施例３における、ＣＭＬ慢性期（ＣＭＬ−ＣＰ）の患者または健常者から単離したＣＤ３４陽性細胞のＣＭＬ６６ ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図１１】図１１（Ａ）は、前記実施例３における、各種白血病患者の末梢血中に存在するＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、代表的な陽性例二症例での前記ＣＭＬ６６７６−８４特異的細胞傷害性Ｔ細胞のスポットを示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（２）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド
（３）前記（１）または（２）のペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上のペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
（４）前記（１）または（２）のペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド。
【請求項２】
前記ＨＬＡ−Ａ２４分子の遺伝子型が、Ａ＊２４０２である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つを含む活性化誘導剤。
【請求項４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む活性化誘導剤。
【請求項５】
さらに、ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが前記ベクターに挿入されている、請求項４記載の活性化誘導剤。
【請求項６】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
抗原ペプチドとして、請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項７】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８】
さらに、ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが前記ベクターに挿入されている、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つとをインキュベーションする工程
【請求項１０】
前記工程（Ｂ）において、前記リンパ球と、前記ペプチドおよび前記誘導体の少なくとも一方を提示する抗原提示細胞とをインキュベーションする、請求項９記載の細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１１】
抗原提示細胞の製造方法であって、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む抗原提示細胞の製造方法。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つとをインキュベーションする工程
【請求項１２】
前記工程（ａ）において、患者の単球を準備し、前記単球を分化誘導することにより、樹状細胞を調製する、請求項１１記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）に代えて、下記（ｃ）工程を含む、請求項１１または１２記載の抗原提示細胞の製造方法。
（ｃ） 前記樹状細胞に、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを導入する工程
【請求項１４】
前記（ｃ）工程において、前記樹状細胞に、前記ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを導入する、請求項１３記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１５】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
請求項９または１０に記載の製造方法により製造されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原提示細胞の少なくとも一方を含む医薬組成物。
【請求項１】
下記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（２）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド
（３）前記（１）または（２）のペプチドとのアミノ酸配列の相同性が８０％以上のペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド
（４）前記（１）または（２）のペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合することでＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に認識されうるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド。
【請求項２】
前記ＨＬＡ−Ａ２４分子の遺伝子型が、Ａ＊２４０２である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つを含む活性化誘導剤。
【請求項４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化を誘導する活性化誘導剤であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む活性化誘導剤。
【請求項５】
さらに、ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが前記ベクターに挿入されている、請求項４記載の活性化誘導剤。
【請求項６】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
抗原ペプチドとして、請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項７】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
請求項１および２記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８】
さらに、ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが前記ベクターに挿入されている、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法。
（Ａ） 患者のリンパ球を準備する工程
（Ｂ） 前記リンパ球と、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つとをインキュベーションする工程
【請求項１０】
前記工程（Ｂ）において、前記リンパ球と、前記ペプチドおよび前記誘導体の少なくとも一方を提示する抗原提示細胞とをインキュベーションする、請求項９記載の細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１１】
抗原提示細胞の製造方法であって、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む抗原提示細胞の製造方法。
（ａ） 患者の樹状細胞を準備する工程
（ｂ） 前記樹状細胞と、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つとをインキュベーションする工程
【請求項１２】
前記工程（ａ）において、患者の単球を準備し、前記単球を分化誘導することにより、樹状細胞を調製する、請求項１１記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）に代えて、下記（ｃ）工程を含む、請求項１１または１２記載の抗原提示細胞の製造方法。
（ｃ） 前記樹状細胞に、請求項１および２に記載のペプチドならびにその誘導体からなる群から選択された少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを導入する工程
【請求項１４】
前記（ｃ）工程において、前記樹状細胞に、前記ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを導入する、請求項１３記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１５】
癌免疫療法に用いる医薬組成物であって、
請求項９または１０に記載の製造方法により製造されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原提示細胞の少なくとも一方を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−３５５３４（Ｐ２００９−３５５３４Ａ）
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６３９２２（Ｐ２００８−１６３９２２）
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 電気通信回線による発表： 掲載年月日：平成２０年４月１６日 掲載アドレス１： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１１８４８９８１１／ｈｏｍｅ 掲載アドレス２： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１２００９１６６３／ａｂｓｔｒａｃｔ？ＣＲＥＴＲＹ＝１＆ＳＲＥＴＲＹ＝０ 掲載アドレス３： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｕｓｅｒ／ａｃｃｅｓｓｄｅｎｉｅｄ？ＩＤ＝１２００９１６６３＆Ａｃｔ＝２１３８＆Ｃｏｄｅ＝４７１７＆Ｐａｇｅ＝／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／１２００９１６６３／ＨＴＭＬＳＴＡＲＴ 掲載アドレス４： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｕｓｅｒ／ａｃｃｅｓｓｄｅｎｉｅｄ？ＩＤ＝１２００９１６６３＆Ａｃｔ＝２１３８＆Ｃｏｄｅ＝４７１７＆Ｐａｇｅ＝／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／１２００９１６６３／ＰＤＦＳＴＡＲＴ
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 電気通信回線による発表： 掲載年月日：平成２０年４月１６日 掲載アドレス１： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１１８４８９８１１／ｈｏｍｅ 掲載アドレス２： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１２００９１６６３／ａｂｓｔｒａｃｔ？ＣＲＥＴＲＹ＝１＆ＳＲＥＴＲＹ＝０ 掲載アドレス３： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｕｓｅｒ／ａｃｃｅｓｓｄｅｎｉｅｄ？ＩＤ＝１２００９１６６３＆Ａｃｔ＝２１３８＆Ｃｏｄｅ＝４７１７＆Ｐａｇｅ＝／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／１２００９１６６３／ＨＴＭＬＳＴＡＲＴ 掲載アドレス４： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｕｓｅｒ／ａｃｃｅｓｓｄｅｎｉｅｄ？ＩＤ＝１２００９１６６３＆Ａｃｔ＝２１３８＆Ｃｏｄｅ＝４７１７＆Ｐａｇｅ＝／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／１２００９１６６３／ＰＤＦＳＴＡＲＴ
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]