ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、組成物、および方法
本出願において、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能である、ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、提供される。特定の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、減少したレベルの免疫抑制活性を示す。本発明の抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞に関連する癌の診断法、ならびにＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞に関連する癌の処置のための組成物およびＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞に関連する癌の処置のための方法において、用途を見出す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１２月１５日に出願した米国仮特許出願番号６０／６０８，９４４の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、免疫学の分野および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、およびＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を調製するための方法を提供する。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物および方法もまた、提供される。本明細書中に提示される抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原に特異的に結合し、そしてＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する。特定の実施形態において、アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、低下した免疫抑制活性レベルを示す。本発明の抗体は、診断方法における使用、ならびにＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞に関連する癌の処置のための組成物および方法における使用を見出す。
【背景技術】
【０００３】
クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（正常な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に構成的に発現される）は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞に対する抗原由来ペプチドの提示を担う。非特許文献１および非特許文献２。これらの分子を介するシグナル伝達は、活性化Ｂリンパ球のプログラムされた細胞死（ＰＣＤまたはアポトーシス）をもたらすセカンドメッセンジャーの生成を開始する。抗原提示に加えて、クラスＩＩ分子は、細胞増殖を調節し得るシグナルを伝達し、特定のクラスＩＩ ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されている（非特許文献３）。
【０００４】
ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ヒトＢリンパ球上に構成的に発現され、そして活性化後にヒトＴリンパ球上で誘導される。細胞死の６０％までが、ＨＬＡ−ＤＲ分子を介するリンパ球の刺激後に観察されている。特定のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、クラスＩＩ分子の細胞表面発現における９０％までの減少を引き起こす。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびそのフラグメントは、ＨＬＡ−ＤＰ分子およびＨＬＡ−ＤＱ分子の発現に影響を与えない（非特許文献４）。
【０００５】
癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されたクラスＩＩ ＭＨＣ特異的抗体はまた、頻繁に、正常なＴｈ細胞機能を妨害する（非特許文献５）。現在利用可能なアポトーシス誘導性クラスＩＩ特異的モノクローナル抗体の大多数は、ペプチド結合部位に見かけ上接近した状態にある、ＨＬＡ−ＤＲへテロダイマーの第一タンパク質ドメイン上に位置するエピトープを認識する。これらの抗体は、抗原提示を妨害し、Ｔｈ応答の強力なインビトロおよびインビボでの阻害を引き起こし、さらに、Ｂリンパ芽球様細胞および少ない割合の正常活性化Ｂ細胞に対して細胞傷害性である。そのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ダウンレギュレーションおよび細胞傷害性の両方を媒介し、一方、その一価Ｆａｂフラグメントは、細胞傷害性ではないが、ダウンレギュレーション特性およびＴ細胞阻害特性を保持する（非特許文献５）。
【非特許文献１】Ｂａｂｂｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１７：ｐ．３５９〜３６１
【非特許文献２】Ｔｒｕｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７年）８９（６）：ｐ．１９９６〜２００７
【非特許文献３】Ｎｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９３年）９０（２２）：ｐ．１０４５９〜１０４６３
【非特許文献４】Ｔｒｕｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４年）６（６）：ｐ．８８７〜８９６
【非特許文献５】Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５年）２５：ｐ．３３４９〜３３５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該分野で利用可能なほとんどのＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を含む癌処置用の組成物および方法におけるそれらの抗体の有用性を限定するのに充分な免疫抑制活性を示す。従って、改善されたＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体（例えば、非免疫抑制アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体）、ならびにこのような抗体を含む、これらの欠陥を克服する組成物および方法に関して、当該分野において必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、特に、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発可能なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびその抗原結合フラグメントを提供することによって、これらの必要性および他の関連する必要性に取り組む。本発明は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと特異的に反応する抗体は、表面上にＨＬＡ−ＤＲ分子を発現する細胞のアポトーシスを誘導し得るという発見に、部分的に基づく。本発明の抗体は、このＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が、ＨＬＡ−ＤＲを発現する非腫瘍細胞／非新形成細胞の生存度にも機能にも影響を与えないという点で、非常に特異的である。特定の実施形態において、本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗体のアポトーシス活性は、クラスＩＩ非依存性免疫応答を同時に抑制することなく、達成され得る。
【０００８】
本発明の重要な実用上の関連性は、「ＤＮ１９２４」と呼ばれるモノクローナル抗体、および「キメラＤＮ１９２４」と呼ばれるＤＮ１９２４のマウス／ヒト改変体が、ＨＬＡクラスＩＩ陽性新形成（血球新形成、例えば、プラズマ細胞腫／多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない）の選択的抗体ベース療法のために有効であり得ることである。インビトロ研究によって、ＤＮ１９２４モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、正常なＴｈ機能を妨害せず、従って、ＤＮ１９２４および／またはキメラＤＮ１９２４は、被験体の正常なＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に影響を与えないことが、示される。従って、現在利用可能な治療剤よりも副作用が少ないと予測することが、妥当である。
【０００９】
従って、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種から単離され得る。この動物種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコなどの起源が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、本明細書において、（１）配列番号１３および配列番号２においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、それぞれ、配列番号４６のポリヌクレオチドおよび配列番号４５のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、免疫抑制抗体ＤＮ１９２１と、（２）配列番号３５および配列番号２４においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、それぞれ、配列番号４８のポリヌクレオチドおよび配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、非免疫抑制抗体ＤＮ１９２４と、によって例証される。
【００１０】
本明細書中で例証されるＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインおよびマウスＩｇκ軽鎖定常ドメインをさらに含む。関連する代替的実施形態において、ＤＮ１９２１モノクローナル抗体および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、上記の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインと、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプ由来のマウス重鎖定常ドメインとを、含み得る。
【００１１】
また、ＤＮ１９２１重鎖およびＤＮ１９２１軽鎖ならびにＤＮ１９２４重鎖およびＤＮ１９２４軽鎖の、抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体も、提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００１２】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００１３】
本発明の他の局面は、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体を提供する。この抗体において、このキメラ抗体は、ヒト定常ドメインに作動可能に連結された非ヒト可変ドメインを含む。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、この抗体が結合する正常細胞においてはアポトーシスを誘導しない。特定の実施形態において、本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、被験体にインビボで投与された場合に、非免疫抑制性である。
【００１４】
本発明のキメラモノクローナル抗体の構築のために適切な非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインは、種々の動物種から単離され得る。この動物種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコなどの起源が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト抗体の重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプから単離され得る。
【００１５】
本明細書中に開示される例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号１３および配列番号２）を、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号１４および配列番号３）に作動可能に連結された状態で含む。本明細書中に開示されるキメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合に免疫抑制性である。この例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号１２として示される。この例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号１として示される。
【００１６】
また、配列番号１２のキメラＤＮ１９２１重鎖および配列番号１のキメラＤＮ１９２１軽鎖のそれぞれの改変体が、提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも９８％または９９％同一である。
【００１７】
本明細書中に開示される別の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号３５および配列番号２４）を、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号１４および配列番号３）に作動可能に連結された状態で含む。本明細書中に開示されるキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合に非免疫抑制性である。この例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号３４として示される。この例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号２３として示される。
【００１８】
代替的実施形態において、配列番号３４のキメラＤＮ１９２４重鎖および配列番号２３のキメラＤＮ１９２４軽鎖のそれぞれの改変体が、提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも９８％または９９％同一である。
【００１９】
なおさらなる実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、このヒト化抗体は、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）に作動可能に連結されて重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを作製する状態で含み、これらの可変ドメインは、ヒト定常ドメイン重鎖およびヒト定常ドメイン軽鎖（それぞれ、配列番号１４および配列番号３において示される重鎖ＩｇＧ２定常ドメインおよび軽鎖Ｉｇκ定常ドメインによって本明細書において例証される）に作動可能に連結された状態である。
【００２０】
本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１重鎖可変ドメイン（配列番号１３）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメインに作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号１４において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２１】
あるいは、またはさらに、本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１軽鎖可変ドメイン（配列番号２）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号３において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって本明細書中で例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２２】
ＤＮ１９２１に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合には免疫抑制性である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２１ ＣＤＲは、配列番号１７（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号８（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ３）として示される。
【００２３】
本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４重鎖可変ドメイン（配列番号３５）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号３６において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって本明細書中で例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２４】
あるいは、またはさらに、本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４軽鎖可変ドメイン（配列番号２４）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号２５において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２５】
ＤＮ１９２４に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合には非免疫抑制性である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２４ ＣＤＲは、配列番号３９（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号４３（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号３２（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ３）として示される。
【００２６】
本発明はまた、組成物および方法を提供し、これらは、本明細書中に示される、１つ以上の非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、キメラＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、および／またはヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む。そのようなＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物は、インビボ投与のために適切であり、そしてＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する際に有効である。
【００２７】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されたかのごとく、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２８】
配列番号１は、キメラＤＮ１９２１全長抗体軽鎖のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号２は、キメラＤＮ１９２１軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３は、キメラＤＮ１９２１軽鎖定常領域（ヒトＩｇＧ２κ）のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号４は、キメラＤＮ１９２１軽鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号５は、キメラＤＮ１９２１軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ１）のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号６は、キメラＤＮ１９２１軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号７は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号８は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号９は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１０は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１１は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１２は、キメラＤＮ１９２１全長抗体重鎖のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１３は、キメラＤＮ１９２１重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１４は、キメラＤＮ１９２１重鎖定常領域（ヒトＩｇＧ２）のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１５は、キメラＤＮ１９２１重鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１６は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１７は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１８は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１９は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２０は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２１は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２２は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２３は、キメラＤＮ１９２４全長抗体軽鎖のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２４は、キメラＤＮ１９２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２５は、キメラＤＮ１９２４軽鎖定常領域（ヒトＩｇκ）のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２６は、キメラＤＮ１９２４軽鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２７は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２８は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２９は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３０は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３１は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３２は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３３は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３４は、キメラＤＮ１９２４全長抗体重鎖のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３５は、キメラＤＮ１９２４重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３６は、キメラＤＮ１９２４重鎖定常領域（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３７は、キメラＤＮ１９２４重鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号３８は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３９は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４０は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号４１は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４２は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号４３は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４４は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号４５は、ＤＮ１９２１全長抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７３】
配列番号４６は、ＤＮ１９２１全長抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号４７は、ＤＮ１９２４全長抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７５】
配列番号４８は、ＤＮ１９２４全長抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号４９は、ヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５０は、ヒトＨＬＡ−ＤＲβ鎖のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号５１は、配列番号４９のヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００７９】
配列番号５２は、配列番号５０のヒトＨＬＡ−ＤＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００８０】
配列番号５３は、マウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインのアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号５４は、配列番号５３のマウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
【００８２】
配列番号５５は、マウスＩｇκ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号５６は、配列番号５５のマウスＩｇκ軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
【００８４】
配列番号５７は、プライマー配列
【００８５】
【化１】
である。
【００８６】
配列番号５８は、プライマー配列
【００８７】
【化２】
である。
【００８８】
配列番号５９は、プライマー配列
【００８９】
【化３】
である。
【００９０】
配列番号６０は、プライマー配列
【００９１】
【化４】
である。
【００９２】
配列番号６１は、プライマー配列
【００９３】
【化５】
である。
【００９４】
配列番号６２は、プライマー配列
【００９５】
【化６】
である。
【００９６】
配列番号６３は、プライマー配列
【００９７】
【化７】
である。
【００９８】
配列番号６４は、プライマー配列
【００９９】
【化８】
である。
【０１００】
配列番号６５は、プライマー配列
【０１０１】
【化９】
である。
【０１０２】
配列番号６６は、プライマー配列
【０１０３】
【化１０】
である。
【０１０４】
配列番号６７は、プライマー配列
【０１０５】
【化１１】
である。
【０１０６】
配列番号６８は、プライマー配列
【０１０７】
【化１２】
である。
【０１０８】
配列番号６９は、プライマー配列
【０１０９】
【化１３】
である。
【０１１０】
配列番号７０は、プライマー配列
【０１１１】
【化１４】
である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１２】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、ならびにＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物および方法に関する。本明細書に示される抗体は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにおいて有効であるが、ＨＬＡ−ＤＲを発現する正常細胞においては有効でない。特定の実施形態において、本発明のアポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、低下した免疫抑制活性をさらに示す。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、とりわけ、癌（ここでこの癌細胞の少なくとも部分集団は、ＨＬＡ−ＤR抗原を発現する）のような疾患の診断および処置における薬剤として有用である。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ−ＤＲ」とは、「ヒト白血球抗原」（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子座およびこれらのタンパク質産物をいい、このタンパク質産物は、ヒト白血球で発現される同種異系抗原である。同種異系抗原は、自己を外来組織から見分ける多型遺伝子の産物である。用語「クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体」、「クラスＩＩ ＭＨＣ」、または「クラスＩＩ」抗原とは、種々の細胞型で種々のレベルで発現されかつＴ細胞による全てのタンパク質抗原の認識において必須の役割を果たす抗原をいう。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、代表的には、７〜３０またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを結合し、抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞によって認識される複合体を形成する。このＣＤ４分子は、クラスＩＩ分子の第２のドメインに結合する。
【０１１４】
用語「アポトーシス性細胞死」、「細胞自己死」または「アポトーシス」とは、本明細書で使用される場合、その死亡をもたらす、正常な一連の細胞中の事象をいう。アポトーシスは、大部分の組織の生理学的維持において極めて重大な役割を果たす。細胞死プログラムの活性化を介して望ましくない細胞の排除を可能にすることは、通常の生物学的プロセスである。アポトーシスは、照射、ウイルス感染または異常な増殖に由来する損傷後に、癌の場合のように、これらの潜在的に危険な細胞を除去することによって、異常な細胞から生物を保護するために、緊急な応答を提供する。アポトーシス性細胞死は、細胞分化の特定の段階において、および特定の刺激に応答して起こる細胞事象の複雑なカスケードから生じ、死細胞の細胞質および核の凝縮によって特徴づけられる。
【０１１５】
用語「腫瘍」、「癌」または「新生物」とは、本明細書で交換可能に使用され、正常組織から発生するが、構造がなく異常に細胞が増殖している、異常な増殖をいう。腫瘍または癌細胞は、一般に、接触阻害の能力を欠き、侵襲性であり得、そして／または転移する能力を有し得る。本発明の抗体で処置しやすい腫瘍細胞は、クラスＩＩ腫瘍組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲの発現によって特徴づけられる。
【０１１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別であることを示さなければ、複数形への参照を包含する。
【０１１７】
本発明の実施は、反対であることが具体的に示されない限り、当該分野の技術範囲内である、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法が採用される。この従来の方法の多くは、例示目的で以下に示される。このような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８２）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ」（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８７）；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｃｏｌｉｇａｎら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。
【０１１８】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出、後出に拘わらず、その全体が本明細書に参考として援用される。本発明は、具体的な実施形態の詳細な説明を通じてよりよく理解される。これらの実施形態の各々は、本明細書で以下に詳細に記載される。
【０１１９】
（ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体）
本発明は、抗体、より具体的には、モノクローナル抗体、非ヒト／ヒトキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、および完全ヒトモノクローナル抗体であって、これらの抗体は、細胞表面に発現されたＨＬＡ−ＤＲに結合した場合に、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合し、かつ腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得る得が、正常細胞においては誘導しない、抗体に関する。特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、免疫抑制活性の低下したレベルによってさらに特徴づけられる。
【０１２０】
本明細書中で例示されるのは、マウスＩｇＧ重鎖およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号５３および５５）に作動可能に融合された、配列番号１３および２（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３５および２４（ＤＮ１９２４）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、それぞれ、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナル抗体である；ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ならびにヒトＩｇＧ２重鎖およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号１４および３（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３６および２５（ＤＮ１９２４）を含む）を含むキメラ抗体；ならびにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）およびヒト定常ドメインに作動可能に融合された、ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の可変ドメインの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒト化抗体である。
【０１２１】
本明細書で記載される場合、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体、ならびにその生物学的フラグメントもしくは抗原結合フラグメントおよび／またはその一部を包含する。本明細書で「抗体」への言及は、その一部、フラグメント、前駆体形態、誘導体、改変体、および遺伝子操作したかもしくは天然に変異した形態への言及を包含し、かつその得られる誘導体および／または改変体が、ＨＬＡ−ＤＲ結合特異性および／または親和性の少なくとも実質的な量を保持する限りにおいて、アミノ酸置換および化学物質および／もしくは放射性同位体などでの標識を含む。用語「抗体」とは、抗体重鎖および軽鎖の両方、ならびに抗体の全てのアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２が挙げられる）を広く包含し、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、およびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない）もまた包含する。
【０１２２】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、抗体結合特異性、親和性、および／または活性に実質的に影響を及ぼさない、天然に存在する変異を除いて、同一である抗体）をいう。
【０１２３】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、またはその抗原結合フラグメントは、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでＨＬＡ−ＤＲと反応しかつ類似の条件下で関連性のないポリペプチドとは検出可能に反応しない場合、ＨＬＡ−ＤＲに「特異的に結合する」、「免疫原性であるように（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌｌｙ）結合する」、そして／または「免疫学的に活性である」といわれる。
【０１２４】
この文脈で使用される場合、免疫学的に結合するとは、一般に、抗体と抗原（この抗原に対してその抗体が特異的である）との間に存在する型の非共有結合的反応をいう。抗体−ＨＬＡ−ＤＲ結合相互作用の強度、すなわち親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表され得、ここでＫｄが小さいほど、より大きな親和性を表す。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。１つのこのような方法は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を包含し、ここでこの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用に親和性、および両方の方向で速度に等しく影響を与える幾何的パラメーターに依存する。従って、「オン反応速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ反応速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度と、会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は、親和性に関しない全てのパラメーターのキャンセルを可能にし、よって、解離定数Ｋｄに等しい。一般には、Ｄａｖｉｅｓら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３（１９９０）を参照のこと。本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質に特異的に結合する。本明細書で「特異的に結合する」とは、その抗体が、少なくとも１０６〜１０９Ｍ、より一般には、少なくとも１０７〜１０９Ｍの範囲の結合定数でＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合することを意味する。
【０１２５】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」とは、ＨＬＡ−ＤＲ結合に関与する抗体分子の一部をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端改変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な拡がり（ｓｔｒｅｔｃｈ）は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接する拡がりの間に挟まれている「超可変領域」または「相補性決定領域（ＣＤＲ）」として言及される。
【０１２６】
従って、用語「ＦＲ」とは、抗体中のＣＤＲの間かつこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体分子において、軽鎖の３つのＣＤＲおよび重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲ結合表面を形成するために、三次元空間で互いに対して配置されている。このＨＬＡ−ＤＲ結合表面は、結合したＨＬＡ−ＤＲの三次元表面に相補的である。
【０１２７】
本明細書の目的に関して「機能的に活性な」または「機能的活性」とは、本明細書に開示されるＤＮ１９２１抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／またはＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の生物学的活性および／または免疫学的活性を保持しているＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体をいう。用語「エピトープ」とは、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と相互作用するＨＬＡ−ＤＲ抗原の特定の部分をいう。
【０１２８】
（ＨＬＡ−ＤＲ特異的非ヒトモノクローナル抗体）
本発明は、１つ以上のアポトーシス誘導性ドメインでＨＬＡ−ＤＲに結合し、それによって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＨＬＡ−ＤＲ発現正常細胞（これに対して抗体が結合する）では誘導しない非ヒトモノクローナル抗体を提供する。本明細書で例示されるのは、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称される、アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体である。ＤＮ１９２１は、免疫抑制活性によってさらに特徴づけられる一方で、ＤＮ１９２４は、ＤＮ１９２１と比較して、減少した免疫抑制活性を示す。
【０１２９】
機能のいかなる理論にも限定されずに、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲヘテロ二量体の第１のタンパク質ドメイン上の１つ以上のアポトーシス誘導性エピトープに特異的に結合することによって、アポトーシス活性を達成することができると考えられる。免疫抑制性ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体（本明細書ではＤＮ１９２１によって例示される）が、抗原結合ドメインについてさらに競合し得、従って、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞に抗原を提示し得る一方で、非免疫抑制性ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体（本明細書ではＤＮ１９２４によって例示される）が、抗原結合について低下した競合能力を有するとさらに考えられる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子（ＨＬＡ−ＤＲ）の第１のドメインに特異的に結合する、非ヒトモノクローナル抗体および非ヒト／ヒトキメラ抗体を、本明細書に開示されるように調製した。クラスＩＩ分子は、細胞増殖を調節し得るシグナルを伝達し、本明細書で示されるそのクラスＩＩ ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導し得る。
【０１３０】
ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子特異的抗体（ＤＮ１９２１、キメラＤＮ１９２１、ＤＮ１９２４、およびキメラＤＮ１９２４と称される）は、それらの表面でＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが分かった。これらの抗体の抗癌活性は、悪性でないＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生存性にも機能にも影響を及ぼさない点で、高度に選択性である。
【０１３１】
大部分の場合において、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質のエピトープまたはフラグメントに対して行われる抗体は、全長タンパク質に結合することができると同時に、他のタンパク質に対してはほとんどもしくは全く交叉反応性を示さない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、αＨＬＡ−ＤＲ鎖およびβＨＬＡ−ＤＲ鎖のアミノ酸１〜８８およびアミノ酸１〜９６（それぞれ、配列番号４９および５０）に対応するＨＬＡ−ＤＲ分子の第１のドメインに対して生成される。
【０１３２】
本明細書で例示される非ヒトモノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ、重鎖定常領域およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号５３および５５）に作動可能に融合された、配列番号１３および２（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３５および２４（ＤＮ１９２４）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、それぞれ、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナル抗体である。
【０１３３】
従って、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナル抗体ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種から単離され得る。これらの種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌおよびネコ起源が挙げられるが、限定されない。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、本明細書で、（１）配列番号１３および配列番号２にそれぞれおいて示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ配列番号４６および４５のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む免疫抑制性抗体ＤＮ１９２１、ならびに（２）配列番号３５および配列番号２４においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号４８および４７のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、非免疫抑制性抗体ＤＮ１９２４、によって例示される。
【０１３４】
本明細書で例示されるこのＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ、重鎖およびＩｇκ軽鎖定常ドメインをさらに含む。関連した代替実施形態において、ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、前述の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインならびにＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプに由来するマウス重鎖定常ドメインを含み得る。
【０１３５】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖および軽鎖の抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体もまた提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも７０％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１３６】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも７０％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１３７】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成のために、従来の方法論が採用され得る。一般に、齧歯類（通常はマウス）が、目的のＨＬＡ−ＤＲ抗原で繰り返し免疫され、抗体生成Ｂ細胞が塗擦した免疫動物から単離され、その抗体生成Ｂ細胞が、骨髄腫細胞と融合されてＢ細胞「ハイブリドーマ」を生じることによって不死化される。ハイブリドーマ細胞のライブラリーは、抗原結合特異性についてスクリーニングされ、適切なクローンが精製および増殖される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、以前に記載され、当該分野で容易に利用可能なもの）を用いて調製され得る。Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）。
【０１３８】
不死化細胞株は、例えば、上記のように、ＨＬＡ−ＤＲ抗原で免疫した動物から得た脾細胞より生成され得る。脾細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーと、好ましくは、免疫した動物と同系であるものと融合することにより不死化される。種々の融合技術が、採用され得る。例えば、その脾細胞および骨髄腫細胞は、数分の間非イオン性界面活性剤と合わされ、次いで、低密度で選択培地（この培地は、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない）にプレートされ得る。
【０１３９】
ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地中で培養され得る。例示的な不死化細胞株は、ａｒｅ ｔｈｏｓｅ ｔｈａｔ 効率的に融合し、その選択された抗体生成細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、かつヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）のような培地に感受性であるものである。より例示的な不死化細胞株は、マウス骨髄腫細胞株であり、この細胞株は、例えば、ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよびｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、ヒトモノクローナル抗体の生成のために記載された。Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．編，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。
【０１４０】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。このハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定され得る。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｎｉ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【０１４１】
望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈法によってサブクローニングされ得、標準的な方法によって増殖される。Ｇｏｄｉｎｇ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に関して、適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、そのハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１４２】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、増殖しつつあるハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術は、収率を高めるために使用され得、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔にハイブリドーマ細胞株を注射することが挙げられる。モノクローナル抗体は、次いで、腹水または血液から採取され得る。夾雑物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のＨＬＡ−ＤＲポリペプチド（例えば、配列番号４９および５０に示されるヒトＨＬＡ−ＤＲ αポリペプチドおよびβポリペプチド）は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製プロセスで使用され得る。あるいは、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の抗体精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または他のアフィニティークロマトグラフィー方法）により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【０１４３】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書に参考として援用される）に記載されるもの）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、そして従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。
【０１４４】
一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターにクローニングされ得る。次いでこのベクターは、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法で抗体タンパク質を生成しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域のコード配列を置換することによって、または非抗体ポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を、抗体コード配列に共有結合することによって、改変され得る。このような非抗体ポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代わりに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられて、本明細書で以下により詳細に記載されるキメラ二価抗体が作り出され得る。
【０１４５】
よって、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種（非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、家禽、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコ起源が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、（１）配列番号１３および配列番号２にそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、配列番号４６および４５のポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる）を含む免疫抑制性抗体ＤＮ１９２１、ならびに（２）配列番号３５および配列番号２４にそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これは、配列番号４８および４７のポリヌクレオチドによりそれぞれコードされる）を含む非免疫抑制性抗体ＤＮ１９２４によって、本明細書で例示される。
【０１４６】
本明細書で例示されるＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ１重鎖およびＩｇκ軽鎖の定常ドメインをさらに含む。関連する代替的な実施形態において、ＤＮ１９２１モノクローナル抗体および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、前述の重鎖および軽鎖の可変ドメインならびに抗体アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される）由来のマウスの重鎖定常ドメインを含み得る。
【０１４７】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖および軽鎖の抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体もまた提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１４８】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１４９】
（キメラ抗体）
本発明の他の局面は、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体を提供し、ここでこのキメラ抗体は、ヒト定常ドメインに作動可能に融合された非ヒト可変ドメインを含む。本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、その抗体が結合される正常細胞においては誘導しない。特定の実施形態において、本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、被験体にインビボで投与される場合、非免疫抑制性である。マウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によって例示される、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が本明細書で示される。これらのキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれらの構成的構造領域は、表１（キメラＤＮ１９２１）および表２（キメラＤＮ１９２４）において示される。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖を含む抗体分子であって、この抗体分子において、非ヒト抗体の可変ドメインが、ヒト定常ドメインに作動可能に融合されたものをいう。キメラ抗体は、一般に、その親の完全非ヒト抗体に比較して、減少した免疫原性を示す。
【０１５１】
ヒト定常ドメインに作動可能に融合された非ヒト抗原結合可変ドメインを含むキメラ抗体分子を作製するための方法論は、当該分野で記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；Ｓｈａｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）；Ｂｒｏｗｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）；米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙによる）；Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許出願第１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，欧州特許出願第１７１４９６（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Ｋｕｄｏら，欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年公開５月７日）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））を参照のこと。これらの参考文献の各々は、本明細書に参考として援用される。
【０１５２】
キメラ抗体は、一価抗体、二価抗体または多価抗体を包含する。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とジスルフィド架橋によって結合したキメラＨ鎖によって形成される重鎖および軽鎖（ＨＬ）の二量体である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合した２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。例えば、凝集するＣＨ領域（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖、またはμ鎖から）を使用することによって、多価キメラ抗体も生成され得る。
【０１５３】
本発明のマウス抗体およびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、個々の抗体の重鎖および／または軽鎖を含む。キメラ重鎖は、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部に連結された、ＨＬＡ−ＤＲに対して特異的な非ヒト抗体の重鎖に由来する抗原結合領域を含む。
【０１５４】
本発明に従うキメラ軽鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部に連結された、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な非ヒト抗体の軽鎖に由来する抗原結合領域を含む。
【０１５５】
同じまたは異なる可変領域結合特異性のキメラ重鎖およびキメラ軽鎖を有する抗体、フラグメントまたは誘導体はまた、公知の方法に従って（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）に従って）個々のポリペプチド鎖の適切な結合によって調製され得る。
【０１５６】
特定の実施形態において、キメラ重鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞は、キメラ軽鎖（またはその誘導体）を発現する宿主とは別個に培養されてもよく、その免疫グロブリン鎖は、別個に回収され、次いで結合されてもよい。あるいは、この宿主細胞は、一緒に培養され得、その鎖は、培養培地中で自発的に会合し、続いて、組み立てられた免疫グロブリン、フラグメントまたは誘導体を回収することが可能になる。
【０１５７】
本明細書で例示される場合、抗体重鎖および軽鎖は、同じ細胞にトランスフェクトされ、輸送および分泌されるときに細胞によって組み立てられてもよい。
【０１５８】
ハイブリッド細胞は、非ヒトＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞（代表的には、天然もしくは組換えいずれかのヒトＨＬＡ−ＤＲ、またはヒトＨＬＡ−ＤＲタンパク質配列のペプチドフラグメントに対して免疫された動物の脾細胞）の融合によって形成され得る。あるいは、非ヒトＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞は、ＨＬＡ−ＤＲで免疫した動物の血液、脾臓、リンパ節または他の組織から得られたＢリンパ球であり得る。
【０１５９】
第２の融合パートナーは、不死化機能を提供し、リンパ芽球腫細胞またはプラスマ細胞腫細胞または骨髄腫細胞であり得る。これらの細胞は、それら自身抗体生成細胞ではなく、悪性である。例示的な融合パートナー細胞としては、ハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）および骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、あまたはその誘導体が挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）を参照のこと。
【０１６０】
ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的なモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマは、マウス融合パートナー細胞（例えば、ＳＰ２／０）と、精製ＨＬＡ−ＤＲ、組換えＨＬＡ−ＤＲ、天然もしくは合成ＨＬＡ−ＤＲペプチド（αおよびβ ＨＬＡ−ＤＲ鎖（それぞれ配列番号４９および５０）のアミノ酸１〜８８およびアミノ酸１〜９６を含むペプチドが挙げられる）に対して免疫したマウス由来の脾細胞とを融合することによって形成される。
【０１６１】
マウスを免疫するために、種々の異なる従来のプロトコルが行われ得る。例えば、マウスは、ＨＬＡ−ＤＲの初回免疫および追加免疫を受容し得る。本発明のキメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列を与えるこの抗体生成細胞はまた、非ヒト（例えば、霊長類）細胞またはヒト細胞の形質転換によって生成され得る。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を生成するＢリンパ球は、エプスタイン−バーウイルスのようなウイルスに感染して形質転換されて、不死化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞を生じる。例えば、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２−７９（１９８３）を参照のこと。あるいは、Ｂリンパ球は、当該分野で周知のように、癌遺伝子または癌遺伝子産物を提供することによって形質転換され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）を参照のこと。
【０１６２】
本発明のキメラモノクローナル抗体の構築に適した非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインは、種々の動物種（非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、家禽、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、犬およびネコ起源が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプから単離され得る。
【０１６３】
本明細書で議論される、例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（そｒぞれ、配列番号１４および３）に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号１３および２）を含む。この本明細書で議論されるキメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体は、インビボで投与される場合に、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができ、かつ免疫抑制性である。例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２として示される。例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【０１６４】
キメラＤＮ１９２１の重鎖および軽鎖（それぞれ配列番号１２および１）の改変体もまた提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２１の重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも９８％または９９％同一である。
【０１６５】
本明細書で開示される、代替的な例示的ＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号３５および２４）に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号３５および２４）を含む。本明細書で開示されるキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、インビボで投与された場合に、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができ、非免疫抑制性である。例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号３４として示される。例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号２３として示される。
【０１６６】
代替的実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および２３である。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも９８％または９９％同一である。
【０１６７】
【表１−１】
【０１６８】
【表１−２】
【０１６９】
【表１−３】
【０１７０】
【表２−１】
【０１７１】
【表２−２】
【０１７２】
【表２−３】
【０１７３】
【表２−４】
（ヒト化抗体）
なおさらなる実施形態において、本発明は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体を提供し、ここで、このヒト化抗体は、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）、およびヒト重鎖定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ２重鎖定常ドメイン）およびヒト軽鎖定常ドメイン（例えば、Ｉｇκ軽鎖定常ドメイン）を含む。一般に、「ヒト化」ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、そうでなければ、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続時間および有効性を制限する、対応する非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体またはその非ヒト領域に対する、望ましくない免疫学的応答を最小にするのに有用である。Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｒｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化」は、ヒト抗体（レシピエント抗体）を含むことを意味し、ヒト化抗体においては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられる。いくつかの場合、ヒト抗体の可変ドメインフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、輸入されたＣＤＲまたはフレームワークの配列にも見られない残基を含み得る。
【０１７５】
一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして、代表的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のＣＤＲ領域に対応し、そして、これらの領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト抗体のコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、好適には、抗体の定常領域の少なくとも一部（代表的には、ヒト抗体の一部）を含む。
【０１７６】
ヒト化モノクローナル抗体は、代表的に、約９０〜９５％がヒトであり、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが非ヒトである。一般に、げっ歯類細胞において産生されるヒト化モノクローナル抗体は、それらが由来する種からの対応するキメラモノクローナル抗体よりも免疫原性が低い。Ｂｅｌｌら，Ｌａｎｃｅｔ ３５５：８５８−８５９（２０００）。
【０１７７】
上述のように、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、結合抗原の３次元表面と相補的な表面を形成する抗体分子の超可変領域をいう。Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体の重鎖および軽鎖の各々は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）から構成される。それゆえ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合部位、は、合計６つのＣＤＲを含み、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からの３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合抗原との広範な接触を形成し、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。
【０１７８】
ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体は、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）に作動可能に融合した１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを生じ、これらは、ヒト定常ドメインの重鎖および軽鎖（本明細書において、それぞれ、配列番号１４および３に示される、重鎖ＩｇＧ２定常ドメインおよび軽鎖Ｉｇκ定常ドメインにより例示される）に作動可能に融合している。
【０１７９】
本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメインに作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１重鎖可変ドメイン（配列番号１３）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、定常ドメインが、本明細書において、配列番号１４に示されるヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメインにより例示される、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される、ヒト重鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８０】
あるいは、またはさらに、本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１軽鎖可変ドメイン（配列番号２）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、本明細書において配列番号３に示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインにより例示される、ヒト軽鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８１】
ＤＮ１９２１に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得、そして、インビボで投与された場合に、免疫抑制的である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２１ ＣＤＲは、配列番号１７（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号８（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ３）として表される。
【０１８２】
本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４重鎖可変ドメイン（配列番号３５）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、定常ドメインが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択され、そして、本明細書において、配列番号３６に示されるヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメインにより例示される、ヒト重鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８３】
あるいは、またはさらに、本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４軽鎖可変ドメイン（配列番号２４）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、本明細書において、配列番号２５に示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによりヒト軽鎖定常ドメインにより例示される、ヒト軽鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８４】
ＤＮ１９２４に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導し得、そして、インビボで投与された場合に、非免疫抑制的である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２４ ＣＤＲは、配列番号３９（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号４３（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号３２（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ３）として表される。
【０１８５】
各ＣＤＲに隣接するのは、主にＶ領域を、抗原結合部位へと折りたたむことを担う、フレームワーク（ＦＲ）領域、特に、ＣＤＲに直ぐ隣接するＦＲ残基である。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原に接触し得る。ＦＲ内では、特定のアミノ残基および特定の構造的特徴が、非常に高度に保存されている。この点から、全てのＶ領域の配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折りたたまれるとき、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。ＣＤＲループの、特定の正確なＣＤＲアミノ酸配列への折りたたみ形状に影響を与える、ＦＲの保存された構造領域がある。さらに、特定の残基が、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化する、非共有結合性内部ドメイン接点に関与することが知られている。
【０１８６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、適切なヒト抗体定常ドメインに融合する前に、ヒト支持ＦＲにＣＤＲを接合することにより達成され得る。Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｒｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照のこと。
【０１８７】
あるいは、げっ歯類のＣＤＲは、組換え的に操作されたげっ歯類ＦＲにより支持され得る。１９９２年１２月２３日に公開された欧州特許第５１９，５９６号を参照のこと。Ｑｕｅｅｎに対する、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号；Ａｄａｉｒに対する米国特許第５，８５９，２０５号；ならびに、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号（これらの特許の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１８８】
実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基、そして、可能ないくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基で置き換えられているヒト抗体である。従って、本発明のヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の各々は、それぞれ、重鎖ＦＲと軽鎖ＦＲとの間に挿入された、少なくとも１、２もしくは３の非ヒト重鎖ＣＤＲ、および／または、少なくとも１、２もしくは３の非ヒト軽鎖ＣＤＲを含み、これらは、ＣＤＲに対する支持を提供し、そして、互いに関するＣＤＲの空間的関係を規定する。
【０１８９】
（完全ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術およびトランスジェニックマウス法により作製され得る。ファージディスプレイ技術により同定された抗体フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、組換え技術により合わされ、完全な「ヒト」抗体を生成する。トランスジェニックマウスから抗体を作製するために、ハイブリドーマが調製され、そして、従来のモノクローナル抗体法についてスクリーニングされる。
【０１９０】
ファージディスプレイ技術により完全ヒト抗体を作製するための方法論は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載される。米国特許第６，２４８，５１６号、同第６，２９１，１５８号、同第６，２９１，１５９号、同第６，２９１，１６０号、同第６，２９１，１６１号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，２６５，１５０号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号、および同第６，３００，０６４号（この各々は、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１９１】
完全ヒト抗体を作製するためのトランスジェニック動物系は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１６２，９６３号、同第６，０７５，１８１号および同第５，７７０，４２９号（この各々は、本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１９２】
またヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能なさらなる技術は、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｐ．７７（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ編，１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される。
【０１９３】
（ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合フラグメント、改変体および誘導体）
本発明はまた、前述のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体のいずれかの、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体、および／または誘導体を企図する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体の各々は、ＨＬＡ−ＤＲ発現正常細胞ではなく、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞において、アポトーシスを誘導し得る。特定の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体および誘導体（例えば、モノクローナル抗体ＤＮ１９２１に基づくもの）は、インビボで投与された場合、免疫抑制的である。他の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体および誘導体（例えば、モノクローナル抗体ＤＮ１９２４に基づくもの）は、インビボで投与された場合、非免疫抑制的である。
【０１９４】
対応する全長ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る、治療的に有用なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗原結合フラグメントを作製するための方法論は、当該分野で容易に利用可能である。本発明の方法は、ＨＬＡ−ＤＲ分子の架橋を促進し、それによりアポトーシスを刺激するために、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が二価、三価、または多価であることを必要とする。従って、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の１つ以上のフラグメントは、固体支持体に結合され、それにより、ＨＬＡ−ＤＲの架橋を促進し得る。
【０１９５】
タンパク質分解酵素であるパパインは、優先的にＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じ、このうち２つ（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）は、インタクトなこう現結合部位を含む共有結合性のヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを提供し得、このフラグメントは、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ抗体分子の、そして、時として、ＩｇＧ抗体分子またはＩｇＡ抗体分子の優先的なタンパク質分解性切断により生成され得る。Ｆｖフラグメントは、あるいは、当該分野で公知の技術を用いて作製され得る。Ｆｖフラグメントは、ネイティブな抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する、抗原結合部位を含む、非共有結合性のＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２（１９７２）；Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７０６−２７１０（１９７６）；およびＥｈｒｌｉｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６（１９８０）。
【０１９６】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーにより連結された、ＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９−５８８３（１９８８）。１つの抗体Ｖ領域に由来する、自然に凝集しているが、化学的には分かれている、軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、ｓＦｖ分子（抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造へと折り畳まれる）へと変換するための化学構造を見分けるための多数の方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【０１９７】
本発明に従う、抗体、およびその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、従来の分子生物学および組換えＤＮＡ方法論により作製され得る。このような方法論は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。これらの刊行物の各々は、その全体が参考として援用される。
【０１９８】
簡単に言うと、例えば、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内に連結され、この発現ベクターは、抗体領域をコードするポリペプチドに作動可能に連結された転写プロモーターを含み、そして、この抗体領域をコードするポリヌクレオチドの３’側には転写終止シグナルを含む。適切な発現ベクターはまた、転写開始部位、翻訳開始を命令するためのＫｏｚａｋ配列、および翻訳を停止させる終止コドンを提供し得る。さらに、発現ベクターはまた、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＨｉｓまたはＦＬＡＧ（登録商標）配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含み得、この配列は、抗体ペプチドの検出および親和性精製を容易にする。
【０１９９】
発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換または形質移入された任意の適切な宿主細胞内で達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および高等真核生物細胞が挙げられる。代表的に、使用される宿主細胞は、ＣＯＳまたはＣＨＯのような哺乳動物細胞株由来である。組換え抗体ポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な系からの上清が、まず、市販のフィルタを使用して濃縮され得る。濃縮の後、濃縮物が、適切な精製マトリクス（例えば、親和性マトリクスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最後に、１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用いて、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０２００】
抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、あるいは、従来のポリペプチド合成方法論により合成され得る。例えば、このような抗体フラグメントは、市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）を用いて合成され得、この方法において、アミノ酸が、増大するアミノ酸鎖に連続的に添加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６（１９６３）を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための設備は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）などの供給業者から市販されており、製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０２０１】
従って、本発明に従うＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびそのフラグメントは、フラグメント、誘導体および改変体がＨＬＡ−ＤＲ結合の特異的かつアポトーシス性の非免疫抑制活性の高原結合特性に実質的に影響を与えない限り、これらのフラグメント、誘導体および改変体を包含する。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「フラグメント、誘導体および改変体」は、ネイティブなポリペプチドまたはタンパク質とは、１つ以上の置換、欠失および／または挿入で異なるポリペプチドまたはタンパク質であり、その結果、このポリペプチドまたはタンパク質の抗原結合活性は、実質的に減少されない。換言すると、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する改変体の能力は、親ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、増強されていても不変であってもよいか、または、得られるＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体もしくはそのフラグメントの効力に影響を与えることなく、親抗体に対して、５０％未満、そして代表的には２０％未満消失していてもよい。一般に、適切なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の誘導体または改変体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する新生物細胞においてアポトーシスを誘導する、その誘導体または改変体の能力を評価することによって特徴付けられ得る。
【０２０３】
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」とは、具体的に同定された配列と異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を包含し、改変体においては、１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されている。改変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体であっても、天然に存在しない改変体であってもよい。改変体の配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、好ましくは、本発明の配列と、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を示す。
【０２０４】
％同一性は、以下に記載されるように、比較されるべき２つの配列を整列し、整列した部分における同一の残基の数を決定し、この数を、本発明の（照会した）配列内の残基の総数で割り、そして、その結果に１００をかけることによって決定される。列挙されたレベルの配列類似性を示すことに加え、本発明の改変体の配列は、好ましくは、その改変体が比較される配列の抗原結合に対して実質的に類似する抗原結合性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｉｔｙ）を示す。
【０２０５】
改変体は、１つのアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される、置換として定義される、「保存的アミノ酸置換」を含み得、その結果、ポリペプチドの二次構造および疎水性の性質は、実質的に不変である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして、類似の親水性値を有する、無電荷の極性頭基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他のグループとしては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは、非保存的な変化を含み得る。
【０２０６】
ポリペプチドの抗原結合フラグメント、誘導体および改変体は、抗体の化学的もしくは酵素的な消化のいずれかによってか、または、その抗体をコードするポリヌクレオチドおよび結果として生じる変異体のその後の発現の変異分析によって同定され得る。ついで、ポリペプチドのフラグメントまたは変異体ポリペプチドが、例えば、以下に提供される代表的なアッセイを使用して、どの部分が生物活性を保持するかを決定するために試験される。
【０２０７】
本発明の抗体のフラグメント、誘導体および改変体はまた、合成もしくは組換え手段によって作製され得る。約１００より少ないアミノ酸、一般には、約５０より少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、当業者に周知の技術を使用して作製され得る。例えば、このようなポリペプチドは、上述のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法により合成され得る。
【０２０８】
改変体はまた、オリゴヌクレオチド指向型、部位特異的変異誘発のような標準的な変異誘発技術を用いて調製され得る。Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）。ポリヌクレオチド配列の部分はまた、短縮型ポリペプチドの調製を可能にする標準的な技術を用いて除去され得る。改変体は、さらに、またはあるいは、例えば、ポリペプチドの二次構造および疎水性の性質に対して最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾され得る。
【０２０９】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体のフラグメント、誘導体および改変体は、好ましくは、ネイティブなＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％、そしてより好ましくは、少なくとも約９５％もしくは９８％の配列同一性を示す。ポリペプチド配列が整列され得、そして、特定の領域における同一なアミノ酸の百分率が、公的に利用可能なコンピュータアルゴリズムを用いて、別のポリペプチドに対して決定され得る。ポリペプチド配列の整列および同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて試験され得る。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ならびにＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）に記載される。
【０２１０】
ＢＬＡＳＴＰソフトウェアは、ＮＣＢＩの匿名のＦＴＰサーバ上で利用可能であり、そして、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４から利用可能である。文書に記載され、アルゴリズムと共に配布されているデフォルトパラメータに設定された、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．０．６［１９９８年９月１０日］およびバージョン２．０．１１［２０００年１月２０日］は、本発明に従う改変体の決定において使用するための例示的なものである。アルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリー（ＢＬＡＳＴＰを含む）の使用は、ＮＣＢＩのウェブサイトおよびＡｌｔｓｃｈｕｌら，「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９０３４０２（１９９７）の刊行物に記載される。
【０２１１】
ＢＬＡＳＴＰまたは類似のアルゴリズムにより得られた、照会配列による１つ以上のデータベースの配列に対する「ヒット」は、配列の類似の部分を整列し、そして同定する。このヒットは、配列の重なりの類似性の程度および長さの順に並べられる。データベースの配列に対するヒットは、一般に、照会配列の、配列の長さの一部のみに対する重なりを表す。
【０２１２】
ポリペプチド配列の％同一性は、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＰのような適切なアルゴリズムを使用してポリペプチド配列を整列し；整列された部分に対して同一のアミノ酸の数を同定し；同一なアミノ酸の数を、本発明のポリペプチドのアミノ酸の総数で割り；そして、１００をかけて、％同一性を決定することによって決定される。
【０２１３】
ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムはまた、ポリペプチドの整列についての「期待」値を生じる。この期待値（Ｅ）は、特定の大きさのデータベースを検索する際に、偶然、特定の数の隣接する配列にわたって見えることが「期待」され得るヒットの数を示す。期待値は、データベースに対するヒットが、真の類似性を示すかどうかを決定するための有意な閾値として使用される。例えば、ポリペプチドヒットに対して割当てられた０．１のＥ値が、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの大きさのデータベースにおける値を意味するものとして解釈される場合、ほんの偶然に、類似のスコアを有する配列の整列された部分にわたって、０．１のマッチを見ることが期待され得る。この基準によれば、配列の整列かつマッチした部分は、９０％の関連する確率を有する。整列かつマッチした部分にわたって０．０１以下のＥ値を有する配列について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて偶然にマッチを発見する確率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いた場合の１％以下である。
【０２１４】
１つの実施形態によれば、「改変体」ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体および抗体フラグメントの各々を参照すれば、好ましくは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と同じ数であるか、またはこれよりも少ないアミノ酸を有し、かつ、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と比較した場合に、０．０１以下のＥ値を生じる配列を含む。
【０２１５】
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して特定の％同一性を有することに加え、改変体抗体は、好ましくは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に共通するさらなる構造的および／または抗原結合特徴を有する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、特定の程度の同一性を有する抗体は、その一次構造において高い程度の類似性を共有し、そして、実質的に類似の抗原結合特性を有する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、高い程度の一次構造の類似性を共有することに加え、ＨＬＡ−ＤＲに対して特定の程度の同一性を有するか、または、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合し得る抗体は、好ましくは、以下の特徴のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）これらは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と実質的に同じ抗原結合特性を有する；または（ｉｉ）例えば、ＣＤＲおよび／もしくはフレームワーク領域のような、特定可能なドメインを共通して含む。
【０２１６】
（結合体）
意図される正確な治療的および／または診断的な適用に依存して、本発明の抗体またはそのフラグメントは、１つ以上の治療剤と結合されることが望ましくあり得る。この点で適切な薬剤としては、放射性核種、分化誘導因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）、薬物、毒素およびこれらの誘導体が挙げられる。例示的な適切な放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。例示的な適切な薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。例示的な適切な分化誘導因子としては、エステルおよび酪酸が挙げられる。例示的な適切な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０２１７】
治療剤は、直接または間接（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が、互いと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上にある求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、もう一方の上にある、カルボニル含有基（たとえば、無水物）もしくは、酸ハロゲン化物と、または、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応し得る。
【０２１８】
あるいは、治療剤と抗体とをリンカー基を介して結合することが望ましくあり得る。リンカー基は、結合能との干渉を避けるために、薬剤から抗体を遠ざけるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増加させ、従って、カップリング能を増加させるように機能し得る。化学反応性の増加はまた、そうでなければ、不可能であった、薬剤、または薬剤の官能基の使用を容易にする。
【０２１９】
ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の、種々の二官能性試薬または多官能性試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが、当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭化水素残基を介して達成され得る。このような方法論は、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号に記載される。
【０２２０】
治療剤が、本発明の免疫複合体の抗体部分を含まないときにより強力である場合、細胞内への内部移行の間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出のための機構としては、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射による切断（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体が媒介する加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸が触媒する加水分解による切断（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられる。
【０２２１】
１以上の薬剤を１つの抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が、１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つ以上の型の薬剤が、１つの抗体に結合される。特定の実施形態にかかわらず、１つ以上の薬剤との免疫複合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つ以上の薬剤は、抗体分子に直接結合され得るか、または、付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０２２２】
キャリアは、直接的であるか、もしくはリンカー基を介する共有結合を含む、種々の方法で薬剤を有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）、アミノデキストランのようなペプチドおよび多糖類（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、非共有結合またはリポソーム小胞内（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）のようなカプセル化によって薬剤を有し得る。放射性核種剤に固有のキャリアとしては、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびその合成を開示する。放射性核種キレートは、キレート化合物から形成され得、これらは、窒素原子および硫黄原子を、金属または金属酸化物、放射性核種と結合するためのドナー原子として含有する化合物を含む。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびその合成を開示する。
【０２２３】
用語「細胞傷害性薬物」とは、本明細書中で使用される場合、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞の死を促進するために使用される薬物を指す。細胞傷害性薬物の例としては、ａｒａ−Ｃ、ブレオマイシン、シスプラチン、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシドおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような化学療法剤が挙げられる。
【０２２４】
（抗ＨＬＡ−Ａ−ＤＲ抗体の同定および特徴づけのためのアッセイ系）
以下のアッセイ系は、本発明に従う、ＨＬＡ−ＤＲ特異的なアポトーシス性、非免疫抑制性抗体の慣用的な同定および特徴づけのために適切に使用され得る。
【０２２５】
（クラスＩＩ ＭＨＣ）
「免疫抑制的であり、かつ細胞傷害性である」抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂは、第１のドメインを認識し、ペプチド結合溝の近くに位置するエピトープに結合することによって抗原提示を阻害し得る。本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ（例えば、ＤＮ１９２４）は、「細胞傷害性のみ」である。従って、このような「細胞傷害性のみ」の抗体が結合する、ＨＬＡ−ＤＲの正確な配列は、「免疫抑制的であり、かつ細胞傷害性である」抗体の配列とは同一でない。Ｖｉｄｏｖｉｃら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３３４９−３３５５（１９９５）。
【０２２６】
（アポトーシスによる細胞死）
上述のように、アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体の、クラスＩＩを発現する細胞への結合と関係している。ＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞など）の表面上に発現されたクラスＩＩ ＭＨＣをコードする分子は、最終的に、両方の細胞型の活性化および分化をもたらす相互作用である、Ｔリンパ球に対する抗原提示の制限的要素として機能する。
【０２２７】
ＨＬＡ−ＤＲ媒介性の細胞死は、非常に迅速で、Ｆｃレセプター非依存性であり、かつ、補完的であり、非壊死性であることが実証されている。Ｔｒｕｍａｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（６）：８８７−８９６（１９９４）およびＴｒｕｍａｎら，Ｂｌｏｏｄ ８９（６）：１９９６−２００７（１９９７）。
【０２２８】
本発見は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発における抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の役割に関し、従って、このような細胞においてプログラムされた細胞死を誘導するための方法を提供する。例示的な実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を架橋し得る抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体およびそのフラグメントは、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞により媒介される状態を研究または処置する際に有用であり、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞に関連する障害を処置または予防するのに有用である。従って、本発明の抗体は、種々の疾患を処置するのに有用であり、これらの疾患としては、Ｂ細胞起源の癌により特徴付けられる任意の疾患（アポトーシスの増加が望ましくない）、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ急性白血病、骨髄腫および形質細胞腫が挙げられるがこれらに限定されない。Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２：２６９７−２８２８（１９９６）。
【０２２９】
（細胞死の機構の評価）
この節では、アポトーシスによる細胞死の程度を評価するために有用なインビトロアッセイを記載する。細胞死は、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）での細胞染色によってか、または、アポトーシスによる細胞死に特異的なアッセイ（例えば、アネキシンＶでの染色）を用いることによって検出され得る。Ｖｅｒｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４：３９−５１（１９９５）。壊死による細胞死は、以下に記載するような細胞の生存度についてのアッセイを、関連のある細胞の形態の顕微鏡での観察との組み合わせの結果を評価することによって、アポトーシスによる細胞死から区別され得る。
【０２３０】
（壊死性細胞死）
壊死は、内部ホメオスタシスの虚脱が細胞膜の完全性の損失およびその後の膨張を含む細胞の溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を導き、その後に細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）が続く、受動的プロセスである。Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９３。壊死性の細胞死は、細胞膜の完全性の損失、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のような、一次性の壊死および二次性の壊死を受ける細胞のＤＮＡに結合することが当業者に公知の色素に対する透過性によって、特徴付けられる。Ｖｉｔａｌｅら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １００：２２３−２２９（１９９３）およびＳｗａｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３７：７９−８７（１９９１）。壊死は、アポトーシスから区別され得る（アポトーシスの初期段階においては、細胞膜はインタクトなまま残る）。結果として、以下に記載されるようにアポトーシス性細胞死を壊死性細胞死から区別するため、アポトーシスについてのアッセイと並行して、ＰＩを使用した色素排除アッセイ（ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）が使用され得る。ＰＩを用いた蛍光活性化細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）ベースのフローサイトメトリーアッセイは、壊死性細胞の迅速な評価および定量化を可能にする。
【０２３１】
（アポトーシス性細胞死）
プログラムされた細胞死またはアポトーシスの検出は、当業者に理解されるように達成され得る。アポトーシスを受ける細胞のパーセンテージは、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の投与とともに、またはその投与なしで、アポトーシスの刺激後の種々の時間で測定され得る。アポトーシス性細胞死を受ける細胞の形態は、一般的に、細胞の細胞質および核の萎縮、ならびにクロマチンの凝縮および断片化によって特徴付けられる。Ｗｙｌｌｉｅら、Ｊ．Ｐａｔｒｏｌ．１４２：６７−７７（１９８４）。
【０２３２】
アポトーシス性Ｂ細胞における部分的ＤＮＡ分解が以前に報告されている。Ｔｒｕｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｕｎｏｌ．６：８８７−８９６（１９９４）およびＣｏｈｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６７−２９３（１９９２）。この観察に一致して、ＤＮＡ断片化は、以前に記載された腫瘍性Ｂ細胞をアポトーシス誘導性（ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）の抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂとともにインキュベーションした後には検出されなかった。しかし、これらの培養物の相対的細胞サイズおよびＰＩ取り込み式フローサイトメトリーのプロフィールは、アポトーシスを受ける細胞について以前に示されたプロフィールと本質的に同じである。Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１２８：１２７−１３５（１９８８）；Ｎｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０４５９−１０４６３（１９９３）；およびＴｒｕｍａｎら（１９９４）。
【０２３３】
（有用性）
（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に関する使用）
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、診断用および治療用の組成物ならびに診断用および治療用の方法において利用され得る。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞についての診断アッセイおよびＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞に関する治療において（例えば、組織または血清中のこのような細胞の発現を検出すること、およびこのような腫瘍を有する被験体において臨床的結果を改善する治療のための基礎として働くことに）使用され得る。
【０２３４】
当該分野で公知の種々の診断アッセイ技術（例えば、競合的結合アッセイ、直接もしくは間接サンドイッチアッセイ、および均一もしくは不均一相において実施される免疫沈降アッセイ）が使用され得る。Ｚｏｌａ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。この診断アッセイに使用され得る抗体は、検出可能な部分によって標識され得る。この検出可能な部分は、直接的もしくは間接的に、検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、この検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ）、蛍光化合物または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、あるいは酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。特異的結合を促進する分子としては、対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなど）が挙げられる。特異的結合を促進する分子の対のメンバーの一方は、標識が、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する公知の手順による検出を行わせる分子で標識され得る。抗体を検出可能な部分に結合させるための当該分野で公知の任意の方法が利用され得る。この方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｎ．３０：４０７（１９８２）によって記載される方法が挙げられる。
【０２３５】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体はまた、細胞培養物または天然の供給源からのＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞のアフィニティー精製のために有用である。このような方法において、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体は、当該分野で公知の方法論を用いて適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂もしくは濾紙）に固定化される。固定された抗体は、精製されるべきＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を含むサンプルと接触させられ、そして固体支持体は、固定化された抗体に結合するＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を除く、サンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な培地で洗浄される。支持体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を固定化された抗体から放出させる別の適切な培地で洗浄される。
【０２３６】
（抗ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生物学的効果）
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲの第１ドメインを認識する。本発明の抗体または特異的モノクローナル抗体のＣＤＲ領域は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞と免疫反応し、そしてこの腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し得る。ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４、およびマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、非腫瘍性成細胞と比較して、腫瘍（プラズマ細胞腫 ＭＣ／ＣＡＲ）細胞（両方ともＨＬＡ−ＤＲを発現する）におけるアポトーシスの誘導に関するインビトロでの特異性を示した。実施例２および図２〜４、ならびに実施例７および図８Ａ〜Ｆを参照のこと。さらに、ＤＮ１９２４による正常なＴｈ反応との干渉の欠如がインビトロで示された。実施例２および図５を参照のこと。
【０２３７】
（アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を用いたインビボ癌治療）
本発明の抗体は、治療的に有効であり、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現する腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死を刺激し得る。これらの発見は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性の癌（特に血液の癌）に対する選択的な抗体ベースの抗腫瘍治療の可能性を提起する。
【０２３８】
抗クラスＩＩ ＭＨＣ ｍＡｂの殺腫瘍性（ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ）効果は、クラスＩＩ依存性免疫応答の同時的な抑制なしで（両特性ともタンパク質の第一ドメインを認識するｍＡｂ認識に関連するが）達成され得る。
【０２３９】
所望の治療的効果を有する抗体は、宿主にとって生理学的に受容可能なキャリア中において投与され得、そして例えば、非経口、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）などの方法で投与され得る。導入の様式に依存して、抗体は、種々の方法で処方され得る。処方物中の治療的に活性な抗体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌまで変動し得る。
【０２４０】
本発明の目的のための「被験体」は、ヒトおよび他の動物（特に哺乳動物）の両方を包含する。従って、本方法は、ヒト治療および獣医学的適用の両方に対して適用可能である。例示的実施形態において、被験体は哺乳動物であり、最も例示的な実施形態において、被験体はヒトである。
【０２４１】
本明細書において使用される場合、用語「改善された治療結果」または「腫瘍細胞数の減少」とは、処置前後に患者および／または患者から採取されたサンプルの試験によって決定される場合の、血中および／または罹患する組織もしくは器官における腫瘍サイズまたは検出可能な循環性癌細胞の数のいずれかの５０％減少、好ましくは８０％減少、より好ましくは９０％減少、そしてさらにより好ましくは１００％減少を意味する。
【０２４２】
本明細書において使用される場合、用語「処置する工程」、「処置」および「治療」とは、治癒可能な治療、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療、および予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療をいう。
【０２４３】
本明細書において使用される場合、「治療上有効な量」によって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞を、そのアポトーシスを刺激することによって減少または消失させる用量が意味される。正確な用量は、処置の目的に依存し、そして公知の技術を使用して当業者によって確認され得る。
【０２４４】
好ましくは、抗体は、非経口投与のために、適切な不活性キャリア（例えば、滅菌生理学的食塩水）中に処方される。例えば、キャリア溶液中の抗体の濃度は、代表的に約１〜約１００ｍｇ／ｍｌの間である。投与される用量は、投与の経路によって決定される。例示的な投与の経路としては、非経口投与またはＩＶ投与が挙げられる。治療的に有効な用量は、ＨＬＡ−ＤＲ発現性新生物細胞のアポトーシス性細胞死の有意な増加を生じるのに有効な用量である。ＨＬＡ−ＤＲ発現性新生物細胞のアポトーシス性細胞死の有意な増加は、検出可能な量のＨＬＡ−ＤＲを発現しない細胞と比較して、ＨＬＡ−ＤＲ発現性細胞のアポトーシス性細胞死の２倍の増加、より好ましくは５倍の増加、さらにより好ましくは１０倍の増加、最も好ましくは２０倍の増加である。
【０２４５】
発明の重要な特徴に従って、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、単独で、または他の抗癌剤（例えば、化学治療剤（例えば、シスプラチン、タキソール、メトトレキサートなど）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；ＦＡＤＤ、ＰＭＡ；イオノマイシン；スタウロスポリンまたはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））と組み合わせて投与され得る。
【０２４６】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（例えば、ＤＮ１９２４）の治療上有効な量は、本明細書において記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死についてのインビトロモデルにおいてＤＮ１９２４に関して得られたデータと合わせて、公知の抗体についての確立された有効量との比較によって推定され得る。当該分野において公知であるように、抗体の変性、全身送達 対 局所送達、ならびに年齢、体重、健康、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用、および状態の重症度に起因して、用量の調節が必要であり得る。当業者によって、慣習的な実験を通じてこのような調節が行われ得、そして適切な用量が決定され得る。
【０２４７】
特定の実施形態の範囲内において、本発明の方法は、所望の抗原結合特異性および／または抗原結合親和性を有する抗体に関して細胞をスクリーニングする工程をさらに提供し得る。本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、抗体が特異的に結合および／または相互作用するこれらの物質、分子、タンパク質、核酸、脂質および／または炭水化物の全てを広範に包含する。
【０２４８】
抗体は、例示的な抗原結合特異性および／または抗原結合親和性に関して、当該分野で現在利用可能な任意の方法論によってスクリーニングされ得る。例えば、従来の細胞パニング手順、ウエスタンブロッティング手順、およびＥＬＩＳＡ手順が、特定の特異性を有する抗体をスクリーニングする工程を達成するために利用され得る。米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号、および同第４，０１８，６５３号（これらの各々は、本命最小において参考として援用される）への参照によって見られ得るように、広範囲の適切なイムノアッセイ技術が利用可能である。
【０２４９】
１つの型のアッセイにおいて、未標識の抗−抗体が固体支持体上に固定され、そして試験されるべき抗体含有サンプルがその固定された抗−抗体と接触させられる。第一の複合体の形成を可能にするのに十分な適切な時間の後、次に、検出可能なシグナルを生成し得るレポーター分子で標識された標識抗原を添加してインキュベートし、固定された抗−抗体／抗体サンプル／試験抗原の第二の複合体の形成のために十分な時間を与える。複合体化されない物質は、洗い流され、レポーター分子によって生成されたシグナルの観察によって抗原の存在が決定される。この結果は、眼に見えるシグナルの単純な観察による定性的なものであっても、既知の量の抗原または抗体を含むコントロールサンプルとの比較によって定量化されてもいずれでもよい。この型のアッセイの変化は、サンプルおよび標識された抗原の両方が結合抗体に対して同時に添加される同時アッセイを包含する。
【０２５０】
本明細書中で使用される場合、用語「固体支持体」とは、例えば、マイクロタイタープレート、膜およびビーズなどをいう。例えば、このような固体支持体は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロースまたはテフロン（登録商標）などで構成され得る。このような支持体の表面は、固体または多孔質であり得、そして任意の都合よい形状であり得る。
【０２５１】
第２の型のアッセイにおいて、抗体を探索するための抗原が固体支持体に結合される。この結合プロセスは当該分野において周知であり、そして一般的に、その抗原を固体支持体に対して架橋結合、共有結合、または物理的に吸収することからなる。ポリマー−抗原複合体は、試験サンプルに備えて洗浄される。次いで、試験されるべきサンプルのアリコートが、固相複合体に添加され、そして抗原への抗体の結合を可能にするのに十分な時間（例えば、２０〜４０分、またはより都合よい場合、一晩）、適切な条件下（例えば、ほぼ室温〜約３８℃、例えば２５℃）でインキュベートされる。インキュベーション時間に続いて、固体支持体は、洗浄され、乾燥され、そしてレポーター分子が結合し得る抗体とともにインキュベートされ、それによって固定された抗原に複合体化された試験抗体に対する二次抗体の結合の検出を可能にする。
【０２５２】
適切な固体支持体としては、ガラスまたはポリマーが挙げられ、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイの実施のために適切な任意の他の表面の形態であり得る。
【０２５３】
代替的アッセイシステムは、標的抗体を固定化し、そしてその固定化された抗体を抗原（レポーター分子に標的されていても、されていなくてもよい）に暴露する工程を包含する。本明細書において記載されるように、用語「レポーター分子」とは、その化学的、生物学的、および／または物理的性質によって、抗原または二次抗体と複合体化された抗体についてのスクリーニングを可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子をいう。検出は、定性的であっても定量的であってもいずれでもよい。本明細書において開示された型のアッセイにおいて利用される最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、放射性同位体、および／または化学発光分子である。１つの特定の有用なアッセイシステムにおいて、Ｂ細胞レポーターに関する抗体を細胞表面に発現する細胞ライブラリーの培養物が、標識（例えば、ビオチン）と共役された抗原か、または組換えエピトープ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ）を有する抗原とともにインキュベートされ得る。Ｃａｓｔｒｕｃｃｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：４６４７−４６５３（１９９２）。適切なインキュベーション時間の後、標識された抗原は、氷冷された培地中の懸濁液から２回または３回細胞をペレット化することによって洗い流される。
【０２５４】
細胞は、抗原に結合された標識に特異的に結合する試薬（例えば、ビオチン標識に対するストレプトアビジンもしくはアビジン、またはＦＬＡＧエピトープに対する抗ＦＬＡＧ抗体）に結合されたビーズの懸濁液を含有する培地中でさらにインキュベートされ得る。目的の抗原を結合したことの間接的な結果としてビーズに結合した細胞は、適切な手段によって残りの細胞から分離され、次いで組織培養物に戻されて増殖する。次第に限られた量の抗原を用いてこのプロセスを繰り返すことは、抗原に特異的におよび／または高い親和性で結合した細胞の濃縮を引き起こす。抗原に対する前結合とは関係なくビーズに直接的に結合する細胞は、抗原なしでビーズとともにインキュベーションすることによって除去され得る。次いで、個々の抗原結合クローンは、適切な蛍光色素（例えば、フルオレセイン）に対して直接的もしくは間接的に結合された抗原で細胞を標識した後に、例えば、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）などによって精製され得る。
【０２５５】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合、酵素は、一般的にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって検出抗体に結合される。しかし、容易に認識されるように、種々の異なる結合技術が存在し、これらは当業者に容易に利用され得る。一般的に使用される酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。一般に、酵素標識された抗体は、抗原と抗体との間の潜在的複合体に添加され、結合させられ、そして洗浄されて過剰の試薬が除去される。次いで、適切な基質を含む溶液が抗原／試験抗体／標識抗体の複合体に添加される。この基質は、二次抗体に結合した酵素と反応し、定性的な視覚的シグナルを与える。これはさらに、通常、分光光度法で定量化されて、サンプル中に存在する抗体の量を示し得る。
【０２５６】
あるいは、蛍光化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）または蛍光タンパク質（例えば、フィコエリトリン）が、抗体に、その結合能を変えることなく化学結合され得る。特定波長の光による照射によって活性化される場合、蛍光標識された抗体は、その光エネルギーを吸収し、その分子の励起状態を示し、続いて、光学顕微鏡または他の光学装置によって視覚的に検出され得る特徴的な色で光の放射を示す。ＥＩＡにおける場合、蛍光標識された抗体は、抗原−抗体複合体に結合させられる。未結合の試薬を除去した後、残りの第３の複合体は、適切な波長の光に曝される。観察された蛍光は、目的の結合抗体の存在を示す。免疫蛍光技術およびＥＩＡ技術は、どちらも当該分野において十分確立されている。他のレポーター分子（例えば、放射性同位体および化学発光分子および／もしくは生物発光分子）もまた、本明細書において開示されたスクリーニング法において適切に利用され得ることが理解される。
【０２５７】
以下の実施例は、上記の発明を使用する様式をより十分に記載するため、ならびに本発明の種々の局面を実施するために企図される最適な様式を示すために役立つ。これらの実施例は、決して、本発明の真の範囲を限定するために役立つのではなく、例示的目的のために提示される。以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【０２５８】
（実施例１）
（ＤＮ１９２１マウスモノクローナル抗体およびＤＮ１９２４マウスモノクローナル抗体の生成）
この実施例は、マウスＤＮ１９２１ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生成を示す。
【０２５９】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を、当該分野で公知の標準的な技術に従って調製した。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）。免疫原で過剰免疫された近交系実験用マウスＢＡＬＢ／ｃ系（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）がＢ細胞のドナーであった。ＢＡＬＢ／ｃ由来の変異Ｂリンパ腫株Ｍ１２．Ｃ３を、キメラヒト／マウス クラスＩＩ遺伝子でトランスフェクトし、免疫原として使用した。このトランスフェクト体（Ｍ１２．Ｃ３．２５と称する）によって発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲの第１の細胞外（α１およびβ１）ドメイン、ならびに対応するマウスＭＨＣクラスＩＩ分子Ｈ２−Ｅの第２の細胞外（α２およびβ２）ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインから構成された。Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３３４９−３３５５（１９９５）。マウスを、月１回の間隔で５回のＩＰ注射（各々は、１ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁された、１０７（−照射された（１００Ｇｙ）Ｍ１２．Ｃ３．２５細胞からなる）によって免疫化した。最後の注射から３日後、免疫脾臓細胞を、ＨＡＴ感受性Ｉｇ陰性マウスミエローマ細胞ＰＡＩ−０と融合した。Ｓｔｏｃｋｅｒら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ２１７ ：１５５−１５７（１９８２）。
【０２６０】
単一のハイブリドーマ培養物の上清流体を、４℃での４時間のインキュベーション後でのＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８に対するそれらの毒性、またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロでの増殖において誘導されたブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を抑制するそれらの能力についてスクリーニングした。所望の生物活性のモノクローナル抗体を適切な形式で分泌することが同定されたコロニーを、それぞれ「ＤＮ１９２１」および「ＤＮ１９２４」と称し、そして限界希釈法によって２回サブクローン化した。標準的アイソタイプ決定キット（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４が、両方ともマウスＩｇＧ１／κアイソタイプであることを見出した。
【０２６１】
（実施例２）
（ＤＮ１９２４モノクローナル抗体のインビトロ殺腫瘍性効果の評価）
この実施例は、ＤＮ１９２４と称するマウスＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得るが、ＨＬＡ−ＤＲを発現する正常（すなわち、非悪性）細胞においてはアポトーシスを誘導しないことを示す。
【０２６２】
ヒト細胞株ＭＣ／ＣＡＲ（プラズマ細胞腫）およびＲＰＭＩ １７８８（エプスタイン−バーウイルス形質転換リンパ芽球状Ｂ細胞株、ＥＢＶ−ＬＣＬ）を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から譲渡された。Ｒｉｔｔｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３１：１３３−１４１（１９８３）。細胞を、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン、および３×１０−５Ｍの２−ＭＥを補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、１０５／ｍｌの密度で、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気（組織培養インキュベーター）中で培養した。５×１０５細胞／ｍｌで培養したＨＬＡ−ＤＲ−特異的ｍＡｂ分泌性マウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞株ＤＮ１９２４および１０Ｆ１２の滅菌濾過された上清流体を、最終濃度２０％でヒト細胞を添加した。示された共培養期間に続いて、細胞を洗浄し、そしてさらに１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに５分インキュベーションし、その後、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ３．１ｆソフトウェアを用いたＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で、細胞の大きさ 対 赤色ＰＩ蛍光の分析した後、その生存度を決定した。Ｏｔｔｅｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、ｐｐ．５．４．１−５．４．１９（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）。生存細胞が積極的にＰＩを排除すること、一方死細胞が、それを、細胞のＤＮＡへの接近可能性と直接的に比例して取り込むことが示された。Ｓｗａｔら（１９９１）。
【０２６３】
新生物細胞のアポトーシスを誘導するＤＮ１９２４抗体の能力を、７５％を超える細胞死を引き起こした２つの独立なヒトＢ細胞腫瘍株（ＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８およびプラズマ細胞腫ＭＣ／ＣＡＲ）の共培養によって示した。図２。
【０２６４】
ヒト末梢血から得られた正常形成性（すなわち、非新生物性）ＨＬＡ−ＤＲ＋リンパ球においては、細胞毒性効果は全くなかった。対照的に、ＤＮ１９２４、１０Ｆ１２（第２のタンパク質ドメイン内に位置する共通エピトープについて特異的な抗ＤＲ ｍＡｂ）は、ＭＣ／ＣＡＲの生存度に影響しなかった。図３。
【０２６５】
２つの異なるインキュベーション条件下での細胞毒性の時間経過は、図４の上パネルに示される。ＤＮ１９２４誘導性細胞死が温度依存的であることは明らかである；これはヒト体温（３７℃）においてより速い速度（細胞毒性効果は３０分以内に明らかとなる）であり、そして４℃においては、遅くなるが、まだなお生じる（細胞毒性効果は１〜２時間以内に明らかとなる）。腫瘍細胞との長い（３週間）共培養後でさえも衰えていないＤＮ１９２４の腫瘍細胞毒性は、この抗体に対して耐性となる能力のないことを示す。図４の下パネル。
【０２６６】
（実施例３）
（ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体は、低下した免疫抑制活性を示す）
この実施例は、ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体が、低レベルの免疫抑制活性を示すことを示す。
【０２６７】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢに対するヒトＴｈ細胞のＨＬＡ−ＤＲ依存性インビトロ増殖反応を、先に記載したように生じさせた。Ｍｏｌｌｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：４６３−４６８（１９９１）。簡単にいうと、Ｆｉｃｏｌｌ分離によってヘパリン処理した血液から得られた２×１０５個の新鮮ヒトＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン、および３×１０−５Ｍの２−ＭＥを補充した０．２ｍｌのＩＭＤＭ培地中で０．１μｇ／ｍｌのＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）とともに３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気（組織培養インキュベーター）中で、３日間培養した。５×１０５細胞／ｍｌで培養したＨＬＡ−ＤＲ−特異的ｍＡｂ分泌性マウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞株ＤＮ１９２４およびＬ２４３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の滅菌濾過された上清流体を、最終濃度２０％でアッセイの開始時に添加した。Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｎｕｎｏｌ．１２５：２９３−２９９（１９８０）およびＦｕら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：２５３−２６０（１９９４）。３つ組の培養物のＴ細胞増殖を、最後の１６時間の間の［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。Ｂｒａｄｌｅｙ、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」ｐｐ．１５３−１７４（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）。Ｌ２４３およびＤＮ１９２４のｍＡｂの両方とも第１のＨＬＡ−ＤＲドメイン上のエピトープを認識するが、ｍＡｂ Ｌ２４３がＳＥＢで誘発されたＴ細胞反応の約７０％を抑制した一方、ＤＮ１９２４は効果を有さなかった（図５）。
【０２６８】
（実施例４）
（ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体のインビボ抗腫瘍活性の評価）
ＤＮ１９２４のインビボ抗腫瘍活性を、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ヒトプラズマ細胞種ＭＣ／ＣＡＲを注射された重症複合型免疫不全近交系（ｓｃｉｄ）マウスにおいて評価した。２０匹の８週齢のマウス（体重に関してランダム化された）に、マウスあたり０．１ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０培地中の１０７個のＭＣ／ＣＡＲ細胞を用いてＩＰ注射した。Ｒｉｔｔｓら、（１９８３）。その後、動物の半数は、０．１ｍｌのＰＢＳ中０．６２５ｍｇのＤＮ１９２４抗体の、単回ＩＰ用量を受けた。残りのマウスに、０．１ｍｌ ＰＢＳの対応するＩＰ注入を与えた。マウスを毎日モニタリングし、その生存を記録した。図６に示されるように、ＤＮ１９２４は、顕著な治療活性を示し、腫瘍を有するマウスの生存を延長した。
【０２６９】
（実施例５）
（マウスＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４におけるマウス／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生成）
この実施例は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ２の重鎖定常領域およびヒトＩｇκの軽鎖定常領域とを含むマウス／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の構築を記載する。
【０２７０】
可変領域セグメントを、ｃＤＮＡを全ＲＮＡから「ＲＡＣＥ」するプライマーを設計するための定常領域特異的配列を用いて、各抗体（ＤＮ１９２４およびＤＮ１９２１）のマウス版を発現するハイブリドーマ細胞からクローニングした。可変領域（ＤＮ１９２４−ｈｅａｖｙ、ＤＮ１９２４−ｌｉｇｈｔ；ＤＮ１９２１−ｈｅａｖｙ、ＤＮ１９２２−ｌｉｇｈｔ）配列を、これらのクローンから決定した。
【０２７１】
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域セグメントおよびヒトＩｇκ軽鎖定常領域セグメントを、ＮＣＢＩおよびＩＭＧＴのホームページから設計されたプライマーを用いて、ヒト脾臓全ＲＮＡからクローン化した。クローンを配列決定して、適切なＩｇκ定常領域またはヒトＩｇＧ２定常領域を確認した。
【０２７２】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４重鎖および軽鎖ポリヌクレオチド配列を増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、表３に提示される。
【０２７３】
（重鎖構築）
可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントとを組み合わせるため、ＰＣＲ「縫い付け（ｓｅｗｉｎｇ）」技術を利用した。簡単にいうと、プライマーを、抗体分子のコード領域の５’末端および３’末端に対応するように設計した（表３、プライマーＡおよびＢ）。プライマーの第２のセットを、別個のプラスミド上に最初に存在する２つの片の間の接合部に重なるように設計した。最初のＰＣＲ反応を、プライマーセットＡ＋Ｄとともに可変領域プラスミドをテンプレートとして用いて、またはプライマーセットＢ＋Ｃとともに定常領域プラスミドをテンプレートとして用いて、準備した。第２のＰＣＲ反応は、プライマーセットＡ＋Ｄを用いて最初の２つの一次反応の生成物を組み込んだ。最後のＰＣＲ生成物をクローニングし、配列を確認し、そして必要な場合、（コード領域の外に）制限酵素を利用して、発現ベクター中にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）した。
【０２７４】
（軽鎖構築）
可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントとを組み合わせるため、重鎖構築に関して上記したように、ＰＣＲ「縫い付け」技術を利用した。プライマーを、抗体分子のコード領域の５’末端および３’末端に対応するように設計した（表３、プライマーＡおよびＢ）。第３のプライマーを、別個のプラスミド上に最初に存在する２つの片の間の接合部に重なるように設計した。最初のＰＣＲ反応を、プライマーセットＣ＋Ｂとともに定常領域プラスミドをテンプレートとして用いて準備した。第２のＰＣＲ反応は、プライマーセットＡ＋Ｂを用いて、一次反応の生成物、およびプラスミドがコードする軽鎖可変領域を組み込んだ。最後のＰＣＲ生成物をクローニングし、配列を確認し、そして必要な場合、（コード領域の外に）制限酵素を利用して、発現ベクター中にシャトルした。
【０２７５】
（発現系）
ＤＮ１９２４重鎖およびＤＮ１９２４軽鎖を、ｐＥＥ１４．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）にサブクローニングし、キメラ免疫グロブリンの両方の鎖が同じベクター骨格上にコードされるようにした。各鎖の発現を、それ自身のＣＭＶ主要即時早期（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）（ＭＩＥ）プロモーターによって駆動した。重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームを含むプラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｓｖ細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中にトランスフェクトし、細胞を、標準的な技術を用いて、５０μＭのメチオニン−スルホキサミン（ｓｕｌｆｏｘａｍｉｎｅ）（ＭＳＸ）を含む無グルタミン培地中で選択した。細胞株を生成するキメラ抗体をＥＬＩＳＡによって同定した。
【０２７６】
ＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の発現に関して、同じプロトコールに従った。
【０２７７】
（表３）
（キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の構築に使用されたオリゴヌクレオチド）
【０２７８】
【表３】
表３のオリゴ配列において、大文字は、抗体分子のオープンリーディングフレーム中のアミノ酸残基についてのコドンを示し、小文字は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（下線）およびクローニング目的のための制限エンドヌクレアーゼ部位に対して付加されたヌクレオチドを示す。プライマー「Ｃ］および「Ｄ」中の点線は、マウス可変領域とヒト定常領域との間の接合部を示す。
【０２７９】
（実施例６）
（ＨＬＡ−ＤＲ細胞に特異的に結合するマウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体）
この実施例は、キメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の両方が、種々の組織培養細胞株において発現されたＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合することを示す。
【０２８０】
標準的免疫蛍光アッセイ［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １，ｐｐ．５．３．１−５．４．１３（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］を、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧビオチン結合体（１：２００最終希釈；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ならびにストレプトアビジン−ＰＥ（０．８μｇ／ｍｌ）をそれぞれ第２および第３の試薬として用いて行った。
【０２８１】
（実施例７）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導する）
この実施例は、キメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導するのに有効であるが、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞または正常ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞においては有効でないことを示す。
【０２８２】
アポトーシスアッセイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８結合体をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）対比染色とともに使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキットを用いて行った。簡単にいうと、５×１０５個の生存細胞を０．１〜１０μｇのｍＡｂとともに０．５〜１ｍｌの総容量の培地中で、３７℃で１０〜３０分間共培養し、２ｍｌの氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖおよび１μｇ／ｍｌでＰＩを含む１００μｌの１×緩衝液中に再懸濁し、室温、暗中で１５分間インキュベートした。次いで、３００μｌの１×緩衝液を添加し、そしてサンプルを３０分以内にフローサイトメーターによって分析した［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １，ｐｐ．５．４．１−５．４．１３（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］。
【０２８３】
表４は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ＬｃＬ細胞株の一団の各メンバーに結合し、そしてアポトーシスを誘導することを示す。各ＬｃＬ細胞株は、異なるＤＲβ１対立遺伝子を発現する。これらのデータは、ＤＲβ１対立遺伝子の幅広い範囲にわたるＨＬＡ−ＤＲ発現に関する疾患の処置における、本発明のマウス／ヒトキメラ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に対する有用性を支持する。
【０２８４】
（表４）
（マウス／ヒトキメラＤＮ−１９２４（ｍｕｔ−ｈＩｇＧ２クローンＤＮ１６）は、ある範囲のＤＲβ１対立遺伝子を発現するＨＬＡ−ＤＲ陽性ＬｃＬ細胞株の一団に特異的に結合し、アポトーシスを誘導する）
【０２８５】
【表４】
表５は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、腫瘍細胞株の一団（３つのＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞株および１２のＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株を含む）の各ＨＬＡ−ＤＲ陽性メンバー（ＫＧ−１を除く）に結合し、アポトーシスを誘導することを示す。キメラＤＮ１９２４は、Ｆｃレセプターを発現するもの（すなわちＵ９３７およびＴＨＰ−１）、またはＢ細胞腫瘍細胞株（すなわちＤＢ）でさえ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞株のアポトーシスを誘導しない。対照的に、キメラＤＮ１９２４は、１２のＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞株のうちの１１のアポトーシスを誘導する。ＫＧ−１（ＡＭＬ腫瘍細胞株）は、キメラＤＮ１９２４結合によってアポトーシスを受けないＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株の（特異的キメラＤＮ１９２４結合活性によって示されるように）唯一の例である。全体で、これらのデータは、キメラＤＮ１９２４が、広範なＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍型の処置において有効であることを示す。
【０２８６】
（表５）
（マウス／ヒトキメラＤＮ−１９２４（ｍｕｔ−ｈＩｇＧ２クローンＤＮ１６）は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株の一団に特異的に結合し、アポトーシスを誘導する）
【０２８７】
【表５】
（実施例８）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、免疫抑制性である）
以前に記載されるたように、ＩＬ−２分泌アッセイを行った［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１，ｐｐ．３．１４．１−３．１４．１１（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］。簡単にいうと、ＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマ株Ｐａｐｅｒｉｎｏ［Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：２３８−２４４，２００３］のハイブリドーマ細胞１０５個を、抗原提示細胞としての２×１０５個のヒトＨＬＡ−ＤＲ１＋ＰＢＭＣ、ＰＡＰ、およびｍＡｂ（ｍＤＮ１９２１＝マウスＤＮ１９２１；ｍＤＮ１９２４＝マウスＤＮ１９２４；ＤＳｍ８９＃３４＝キメラＤＮ１９２１；ＤＮ−ＧＳ＃１６＝キメラＤＮ１９２４）とともに、０．２ｍｌのマイクロウェル中で共培養した。１日後、培養上清を回収し、そしてＩＬ−２依存性細胞株ＨＴ−２の１０４個の細胞の増殖を支持するそれらの能力について、２４時間、５０％濃度で試験した。最後の６時間の培養期間の間、［３Ｈ］チミジンｃｐｍ組み込みによって細胞増殖を測定した。
【０２８８】
（実施例９）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体に誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ非依存性である）
この実施例は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４のアポトーシス誘導活性がカスパーゼ非依存性であることを示す。
【０２８９】
外膜に対するホスファチジルセリンの暴露（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色で検出される）およびカスパーゼ活性は、両方ともアポトーシスの指標である。しかし、本実施例は、キメラＤＮ１９２４に誘導されたアポトーシスが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、またはカスパーゼ９の活性に関与しないことを示す（図１３Ａ−Ｄおよび表６）。
【０２９０】
キメラＤＮ１９２４媒介性アポトーシスを、添加されたＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（広範囲のカスパーゼインヒビター）の存在下および非存在下の両方において誘導した。誘導後、アポトーシスを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色によって、ならびにカスパーゼ３、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９活性化を測定することによって検出した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色は、アポトーシス誘導を確証し、そしてＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋがアポトーシス誘導の阻害に不十分であることを確証した。従って、マウス／ヒトＤＮ１９２４で誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ３、カスパーゼ８、またはカスパーゼ９の活性化に非依存性であった。
【０２９１】
（表６）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４に誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ非依存性である）
【０２９２】
【表６】
（実施例１０）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、腫瘍増殖の速度を低下させること、およびＲＡＪＩ異種移植片ＳＣＩＤマウス動物系において生存の延長を促進することに有効である）
この実施例は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、腫瘍増殖の速度を低下させること（図１４）、およびＲａｊｉ異種移植片ｓｃｉｄマウス動物系において生存の延長を促進すること（図１５）に有効であることを示す。
【０２９３】
０日目、ｓｃｉｄマウス（５匹の動物の４つの群）は、０．１ｍｌ ＰＢＳ中の５×１０６個のＲａｊｉ腫瘍細胞（バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−８６）で負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）された。腫瘍負荷後１日目、４日目、７日目および１０日目において、グループ１は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのマウスＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を受け、グループ２は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのマウス／ヒトＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（クローン番号６４）を受け、グループ３は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのヒトＩｇＧ２，κアイソタイプコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５４０４）を受け、そしてグループ４は、腹腔内注射を介して、３００μｌのＰＢＳを受けた。
【０２９４】
図１４は、マウスＤＮ１９２４およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４の両方とも、ｓｃｉｄマウス動物モデル系において、Ｒａｊｉ異種移植片を用いた皮下負荷によって腫瘍増殖の速度を低下させるのに有効であったことを示す。
【０２９５】
図１５は、マウスＤＮ１９２４およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４の両方とも、ｓｃｉｄマウス動物モデル系において、Ｒａｊｉ異種移植片を用いた皮下負荷後に生存を延長させるのに有効であったことを示す。
【０２９６】
本発明は、特定の処置方法および組成物に関して記載されたが、本発明から逸脱することなく種々の変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１】ＨＬＡ−ＤＲ分子の概略的エピトープマップを示す。これは、ＣＹ：細胞質テール；ＴＭ：膜貫通部分；α１およびβ１：それぞれ、α鎖およびβ鎖の第１（細胞外）ドメイン；ならびにα２およびβ２：それぞれ、α鎖およびβ鎖の第２（細胞外）ドメインを示す。
【図２】図２は、ＤＮ１９２４マウスモノクローナル抗体とともに１６時間培養した後の種々の細胞集団の生存度を示す。生細胞が、２次元プロットの右下象限中に位置する。ＰＢＭＣは、末梢血単核球に対応する。
【図３】図３は、示されるモノクローナル抗体とともに１６時間培養した後のヒト細胞株の生存度を示す。
【図４】図４は、示されるような、種々の温度条件下で種々の時間の間ＤＮ１９２４モノクローナル抗体とともにインキュベーションした後のＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８の生存度を示す。
【図５】図５は、[３Ｈ]チミジン取り込みによって示される、ヒトＰＢＭＣのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）特異的インビトロ増殖応答に対するＤＮ１９２４モノクローナル抗体の免疫抑制効果が存在しないことを示す。
【図６】図６は、ＨＬＡ−ＤＲ＋ヒトプラズマ細胞腫ＭＣ／ＣＡＲを注射し、ＤＮ１９２４（白三角）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：黒四角）のいずれかで処理した、ｓｃｉｄマウスの生存を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図９】図９は、マウスＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によってはＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ特異的Ｐａｐｅｒｉｎｏ応答の阻害を示すが、マウスＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によってもキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によっても、ＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ特異的Ｐａｐｅｒｉｎｏ応答の阻害は示さない、グラフである。
【図１０】図１０は、キメラＤＮ１９２１を発現するプラスミドベクターおよびキメラＤＮ１９２４を発現するプラスミドベクターの構築の模式図である。
【図１１】図１１は、Ｉｇκ定常領域アライメントである。上の２行は、ヒトＩｇκについての２つの異なる登録番号（Ｊ００２４１およびＭ６３４３８）である。下の行は、マウスＩｇκ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３５１３８）である。
【図１２】図１２は、ＩｇＧ定常領域アライメントである。上の３行は、ヒト（ｈ）ＩｇＧ２、ｈＩｇＧ１、およびｈＩｇＧ４（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２５０１７０、ＡＦ０２７１５９、およびＡＪ２９４７３３）である。下の３行は、マウス（ｍ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００４５３、Ｊ００４７０、およびＪ００４６１）である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、Ｒａｊｉ異種移植ｓｃｉｄマウス動物モデル系における腫瘍増殖速度を減少することにおいて有効であることを示すグラフである。
【図１５】図１５は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、Ｒａｊｉ異種移植ｓｃｉｄマウス動物モデル系における生存増加を促進することにおいて有効であることを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１２月１５日に出願した米国仮特許出願番号６０／６０８，９４４の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、免疫学の分野および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、およびＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を調製するための方法を提供する。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物および方法もまた、提供される。本明細書中に提示される抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原に特異的に結合し、そしてＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する。特定の実施形態において、アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、低下した免疫抑制活性レベルを示す。本発明の抗体は、診断方法における使用、ならびにＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞に関連する癌の処置のための組成物および方法における使用を見出す。
【背景技術】
【０００３】
クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（正常な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に構成的に発現される）は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞に対する抗原由来ペプチドの提示を担う。非特許文献１および非特許文献２。これらの分子を介するシグナル伝達は、活性化Ｂリンパ球のプログラムされた細胞死（ＰＣＤまたはアポトーシス）をもたらすセカンドメッセンジャーの生成を開始する。抗原提示に加えて、クラスＩＩ分子は、細胞増殖を調節し得るシグナルを伝達し、特定のクラスＩＩ ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されている（非特許文献３）。
【０００４】
ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ヒトＢリンパ球上に構成的に発現され、そして活性化後にヒトＴリンパ球上で誘導される。細胞死の６０％までが、ＨＬＡ−ＤＲ分子を介するリンパ球の刺激後に観察されている。特定のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、クラスＩＩ分子の細胞表面発現における９０％までの減少を引き起こす。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびそのフラグメントは、ＨＬＡ−ＤＰ分子およびＨＬＡ−ＤＱ分子の発現に影響を与えない（非特許文献４）。
【０００５】
癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されたクラスＩＩ ＭＨＣ特異的抗体はまた、頻繁に、正常なＴｈ細胞機能を妨害する（非特許文献５）。現在利用可能なアポトーシス誘導性クラスＩＩ特異的モノクローナル抗体の大多数は、ペプチド結合部位に見かけ上接近した状態にある、ＨＬＡ−ＤＲへテロダイマーの第一タンパク質ドメイン上に位置するエピトープを認識する。これらの抗体は、抗原提示を妨害し、Ｔｈ応答の強力なインビトロおよびインビボでの阻害を引き起こし、さらに、Ｂリンパ芽球様細胞および少ない割合の正常活性化Ｂ細胞に対して細胞傷害性である。そのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ダウンレギュレーションおよび細胞傷害性の両方を媒介し、一方、その一価Ｆａｂフラグメントは、細胞傷害性ではないが、ダウンレギュレーション特性およびＴ細胞阻害特性を保持する（非特許文献５）。
【非特許文献１】Ｂａｂｂｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１７：ｐ．３５９〜３６１
【非特許文献２】Ｔｒｕｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７年）８９（６）：ｐ．１９９６〜２００７
【非特許文献３】Ｎｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９３年）９０（２２）：ｐ．１０４５９〜１０４６３
【非特許文献４】Ｔｒｕｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４年）６（６）：ｐ．８８７〜８９６
【非特許文献５】Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５年）２５：ｐ．３３４９〜３３５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該分野で利用可能なほとんどのＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を含む癌処置用の組成物および方法におけるそれらの抗体の有用性を限定するのに充分な免疫抑制活性を示す。従って、改善されたＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体（例えば、非免疫抑制アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体）、ならびにこのような抗体を含む、これらの欠陥を克服する組成物および方法に関して、当該分野において必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、特に、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発可能なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびその抗原結合フラグメントを提供することによって、これらの必要性および他の関連する必要性に取り組む。本発明は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと特異的に反応する抗体は、表面上にＨＬＡ−ＤＲ分子を発現する細胞のアポトーシスを誘導し得るという発見に、部分的に基づく。本発明の抗体は、このＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が、ＨＬＡ−ＤＲを発現する非腫瘍細胞／非新形成細胞の生存度にも機能にも影響を与えないという点で、非常に特異的である。特定の実施形態において、本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗体のアポトーシス活性は、クラスＩＩ非依存性免疫応答を同時に抑制することなく、達成され得る。
【０００８】
本発明の重要な実用上の関連性は、「ＤＮ１９２４」と呼ばれるモノクローナル抗体、および「キメラＤＮ１９２４」と呼ばれるＤＮ１９２４のマウス／ヒト改変体が、ＨＬＡクラスＩＩ陽性新形成（血球新形成、例えば、プラズマ細胞腫／多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない）の選択的抗体ベース療法のために有効であり得ることである。インビトロ研究によって、ＤＮ１９２４モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、正常なＴｈ機能を妨害せず、従って、ＤＮ１９２４および／またはキメラＤＮ１９２４は、被験体の正常なＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に影響を与えないことが、示される。従って、現在利用可能な治療剤よりも副作用が少ないと予測することが、妥当である。
【０００９】
従って、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種から単離され得る。この動物種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコなどの起源が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、本明細書において、（１）配列番号１３および配列番号２においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、それぞれ、配列番号４６のポリヌクレオチドおよび配列番号４５のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、免疫抑制抗体ＤＮ１９２１と、（２）配列番号３５および配列番号２４においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、それぞれ、配列番号４８のポリヌクレオチドおよび配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、非免疫抑制抗体ＤＮ１９２４と、によって例証される。
【００１０】
本明細書中で例証されるＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインおよびマウスＩｇκ軽鎖定常ドメインをさらに含む。関連する代替的実施形態において、ＤＮ１９２１モノクローナル抗体および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、上記の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインと、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプ由来のマウス重鎖定常ドメインとを、含み得る。
【００１１】
また、ＤＮ１９２１重鎖およびＤＮ１９２１軽鎖ならびにＤＮ１９２４重鎖およびＤＮ１９２４軽鎖の、抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体も、提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および配列番号２に対してそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００１２】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および配列番号２４に対してそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００１３】
本発明の他の局面は、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体を提供する。この抗体において、このキメラ抗体は、ヒト定常ドメインに作動可能に連結された非ヒト可変ドメインを含む。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、この抗体が結合する正常細胞においてはアポトーシスを誘導しない。特定の実施形態において、本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、被験体にインビボで投与された場合に、非免疫抑制性である。
【００１４】
本発明のキメラモノクローナル抗体の構築のために適切な非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインは、種々の動物種から単離され得る。この動物種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコなどの起源が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト抗体の重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプから単離され得る。
【００１５】
本明細書中に開示される例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号１３および配列番号２）を、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号１４および配列番号３）に作動可能に連結された状態で含む。本明細書中に開示されるキメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合に免疫抑制性である。この例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号１２として示される。この例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号１として示される。
【００１６】
また、配列番号１２のキメラＤＮ１９２１重鎖および配列番号１のキメラＤＮ１９２１軽鎖のそれぞれの改変体が、提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２１軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１に対して少なくとも９８％または９９％同一である。
【００１７】
本明細書中に開示される別の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号３５および配列番号２４）を、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号１４および配列番号３）に作動可能に連結された状態で含む。本明細書中に開示されるキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合に非免疫抑制性である。この例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号３４として示される。この例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書中では配列番号２３として示される。
【００１８】
代替的実施形態において、配列番号３４のキメラＤＮ１９２４重鎖および配列番号２３のキメラＤＮ１９２４軽鎖のそれぞれの改変体が、提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖の改変体およびキメラＤＮ１９２４軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号２３に対して少なくとも９８％または９９％同一である。
【００１９】
なおさらなる実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、このヒト化抗体は、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）に作動可能に連結されて重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを作製する状態で含み、これらの可変ドメインは、ヒト定常ドメイン重鎖およびヒト定常ドメイン軽鎖（それぞれ、配列番号１４および配列番号３において示される重鎖ＩｇＧ２定常ドメインおよび軽鎖Ｉｇκ定常ドメインによって本明細書において例証される）に作動可能に連結された状態である。
【００２０】
本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１重鎖可変ドメイン（配列番号１３）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメインに作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号１４において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２１】
あるいは、またはさらに、本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１軽鎖可変ドメイン（配列番号２）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号３において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって本明細書中で例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２２】
ＤＮ１９２１に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合には免疫抑制性である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２１ ＣＤＲは、配列番号１７（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号８（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ３）として示される。
【００２３】
本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４重鎖可変ドメイン（配列番号３５）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号３６において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって本明細書中で例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２４】
あるいは、またはさらに、本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４軽鎖可変ドメイン（配列番号２４）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３、および／または４に作動可能に連結されてヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを作製した状態で含む。このヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインは、必要に応じて、ヒト重鎖定常ドメインと、配列番号２５において示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによって例証されるヒト軽鎖定常ドメインとに作動可能に連結される。このヒト重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される。
【００２５】
ＤＮ１９２４に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、そしてインビボで投与された場合には非免疫抑制性である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２４ ＣＤＲは、配列番号３９（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号４３（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号３２（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ３）として示される。
【００２６】
本発明はまた、組成物および方法を提供し、これらは、本明細書中に示される、１つ以上の非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、キメラＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、および／またはヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む。そのようなＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物は、インビボ投与のために適切であり、そしてＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する際に有効である。
【００２７】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されたかのごとく、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２８】
配列番号１は、キメラＤＮ１９２１全長抗体軽鎖のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号２は、キメラＤＮ１９２１軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３は、キメラＤＮ１９２１軽鎖定常領域（ヒトＩｇＧ２κ）のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号４は、キメラＤＮ１９２１軽鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号５は、キメラＤＮ１９２１軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ１）のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号６は、キメラＤＮ１９２１軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号７は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号８は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号９は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１０は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１１は、キメラＤＮ１９２１軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１２は、キメラＤＮ１９２１全長抗体重鎖のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１３は、キメラＤＮ１９２１重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１４は、キメラＤＮ１９２１重鎖定常領域（ヒトＩｇＧ２）のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１５は、キメラＤＮ１９２１重鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１６は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１７は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１８は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１９は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２０は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２１は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２２は、キメラＤＮ１９２１重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２３は、キメラＤＮ１９２４全長抗体軽鎖のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２４は、キメラＤＮ１９２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２５は、キメラＤＮ１９２４軽鎖定常領域（ヒトＩｇκ）のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２６は、キメラＤＮ１９２４軽鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２７は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２８は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２９は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３０は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３１は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３２は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３３は、キメラＤＮ１９２４軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３４は、キメラＤＮ１９２４全長抗体重鎖のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３５は、キメラＤＮ１９２４重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３６は、キメラＤＮ１９２４重鎖定常領域（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３７は、キメラＤＮ１９２４重鎖リーダー配列のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号３８は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３９は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４０は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号４１は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４２は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号４３は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４４は、キメラＤＮ１９２４重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号４５は、ＤＮ１９２１全長抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７３】
配列番号４６は、ＤＮ１９２１全長抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号４７は、ＤＮ１９２４全長抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７５】
配列番号４８は、ＤＮ１９２４全長抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号４９は、ヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５０は、ヒトＨＬＡ−ＤＲβ鎖のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号５１は、配列番号４９のヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００７９】
配列番号５２は、配列番号５０のヒトＨＬＡ−ＤＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００８０】
配列番号５３は、マウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインのアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号５４は、配列番号５３のマウスＩｇＧ１重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
【００８２】
配列番号５５は、マウスＩｇκ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号５６は、配列番号５５のマウスＩｇκ軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
【００８４】
配列番号５７は、プライマー配列
【００８５】
【化１】
である。
【００８６】
配列番号５８は、プライマー配列
【００８７】
【化２】
である。
【００８８】
配列番号５９は、プライマー配列
【００８９】
【化３】
である。
【００９０】
配列番号６０は、プライマー配列
【００９１】
【化４】
である。
【００９２】
配列番号６１は、プライマー配列
【００９３】
【化５】
である。
【００９４】
配列番号６２は、プライマー配列
【００９５】
【化６】
である。
【００９６】
配列番号６３は、プライマー配列
【００９７】
【化７】
である。
【００９８】
配列番号６４は、プライマー配列
【００９９】
【化８】
である。
【０１００】
配列番号６５は、プライマー配列
【０１０１】
【化９】
である。
【０１０２】
配列番号６６は、プライマー配列
【０１０３】
【化１０】
である。
【０１０４】
配列番号６７は、プライマー配列
【０１０５】
【化１１】
である。
【０１０６】
配列番号６８は、プライマー配列
【０１０７】
【化１２】
である。
【０１０８】
配列番号６９は、プライマー配列
【０１０９】
【化１３】
である。
【０１１０】
配列番号７０は、プライマー配列
【０１１１】
【化１４】
である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１２】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、ならびにＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を含む組成物および方法に関する。本明細書に示される抗体は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにおいて有効であるが、ＨＬＡ−ＤＲを発現する正常細胞においては有効でない。特定の実施形態において、本発明のアポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、低下した免疫抑制活性をさらに示す。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、とりわけ、癌（ここでこの癌細胞の少なくとも部分集団は、ＨＬＡ−ＤR抗原を発現する）のような疾患の診断および処置における薬剤として有用である。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ−ＤＲ」とは、「ヒト白血球抗原」（ＨＬＡ）ＤＲ遺伝子座およびこれらのタンパク質産物をいい、このタンパク質産物は、ヒト白血球で発現される同種異系抗原である。同種異系抗原は、自己を外来組織から見分ける多型遺伝子の産物である。用語「クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体」、「クラスＩＩ ＭＨＣ」、または「クラスＩＩ」抗原とは、種々の細胞型で種々のレベルで発現されかつＴ細胞による全てのタンパク質抗原の認識において必須の役割を果たす抗原をいう。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、代表的には、７〜３０またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを結合し、抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞によって認識される複合体を形成する。このＣＤ４分子は、クラスＩＩ分子の第２のドメインに結合する。
【０１１４】
用語「アポトーシス性細胞死」、「細胞自己死」または「アポトーシス」とは、本明細書で使用される場合、その死亡をもたらす、正常な一連の細胞中の事象をいう。アポトーシスは、大部分の組織の生理学的維持において極めて重大な役割を果たす。細胞死プログラムの活性化を介して望ましくない細胞の排除を可能にすることは、通常の生物学的プロセスである。アポトーシスは、照射、ウイルス感染または異常な増殖に由来する損傷後に、癌の場合のように、これらの潜在的に危険な細胞を除去することによって、異常な細胞から生物を保護するために、緊急な応答を提供する。アポトーシス性細胞死は、細胞分化の特定の段階において、および特定の刺激に応答して起こる細胞事象の複雑なカスケードから生じ、死細胞の細胞質および核の凝縮によって特徴づけられる。
【０１１５】
用語「腫瘍」、「癌」または「新生物」とは、本明細書で交換可能に使用され、正常組織から発生するが、構造がなく異常に細胞が増殖している、異常な増殖をいう。腫瘍または癌細胞は、一般に、接触阻害の能力を欠き、侵襲性であり得、そして／または転移する能力を有し得る。本発明の抗体で処置しやすい腫瘍細胞は、クラスＩＩ腫瘍組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲの発現によって特徴づけられる。
【０１１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別であることを示さなければ、複数形への参照を包含する。
【０１１７】
本発明の実施は、反対であることが具体的に示されない限り、当該分野の技術範囲内である、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法が採用される。この従来の方法の多くは、例示目的で以下に示される。このような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８２）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ」（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８７）；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｃｏｌｉｇａｎら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。
【０１１８】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出、後出に拘わらず、その全体が本明細書に参考として援用される。本発明は、具体的な実施形態の詳細な説明を通じてよりよく理解される。これらの実施形態の各々は、本明細書で以下に詳細に記載される。
【０１１９】
（ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体）
本発明は、抗体、より具体的には、モノクローナル抗体、非ヒト／ヒトキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、および完全ヒトモノクローナル抗体であって、これらの抗体は、細胞表面に発現されたＨＬＡ−ＤＲに結合した場合に、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合し、かつ腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得る得が、正常細胞においては誘導しない、抗体に関する。特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、免疫抑制活性の低下したレベルによってさらに特徴づけられる。
【０１２０】
本明細書中で例示されるのは、マウスＩｇＧ重鎖およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号５３および５５）に作動可能に融合された、配列番号１３および２（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３５および２４（ＤＮ１９２４）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、それぞれ、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナル抗体である；ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ならびにヒトＩｇＧ２重鎖およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号１４および３（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３６および２５（ＤＮ１９２４）を含む）を含むキメラ抗体；ならびにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）およびヒト定常ドメインに作動可能に融合された、ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の可変ドメインの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒト化抗体である。
【０１２１】
本明細書で記載される場合、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体、ならびにその生物学的フラグメントもしくは抗原結合フラグメントおよび／またはその一部を包含する。本明細書で「抗体」への言及は、その一部、フラグメント、前駆体形態、誘導体、改変体、および遺伝子操作したかもしくは天然に変異した形態への言及を包含し、かつその得られる誘導体および／または改変体が、ＨＬＡ−ＤＲ結合特異性および／または親和性の少なくとも実質的な量を保持する限りにおいて、アミノ酸置換および化学物質および／もしくは放射性同位体などでの標識を含む。用語「抗体」とは、抗体重鎖および軽鎖の両方、ならびに抗体の全てのアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２が挙げられる）を広く包含し、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、およびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない）もまた包含する。
【０１２２】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、抗体結合特異性、親和性、および／または活性に実質的に影響を及ぼさない、天然に存在する変異を除いて、同一である抗体）をいう。
【０１２３】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、またはその抗原結合フラグメントは、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでＨＬＡ−ＤＲと反応しかつ類似の条件下で関連性のないポリペプチドとは検出可能に反応しない場合、ＨＬＡ−ＤＲに「特異的に結合する」、「免疫原性であるように（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌｌｙ）結合する」、そして／または「免疫学的に活性である」といわれる。
【０１２４】
この文脈で使用される場合、免疫学的に結合するとは、一般に、抗体と抗原（この抗原に対してその抗体が特異的である）との間に存在する型の非共有結合的反応をいう。抗体−ＨＬＡ−ＤＲ結合相互作用の強度、すなわち親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表され得、ここでＫｄが小さいほど、より大きな親和性を表す。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。１つのこのような方法は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を包含し、ここでこの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用に親和性、および両方の方向で速度に等しく影響を与える幾何的パラメーターに依存する。従って、「オン反応速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ反応速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度と、会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は、親和性に関しない全てのパラメーターのキャンセルを可能にし、よって、解離定数Ｋｄに等しい。一般には、Ｄａｖｉｅｓら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３（１９９０）を参照のこと。本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質に特異的に結合する。本明細書で「特異的に結合する」とは、その抗体が、少なくとも１０６〜１０９Ｍ、より一般には、少なくとも１０７〜１０９Ｍの範囲の結合定数でＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合することを意味する。
【０１２５】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」とは、ＨＬＡ−ＤＲ結合に関与する抗体分子の一部をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端改変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な拡がり（ｓｔｒｅｔｃｈ）は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接する拡がりの間に挟まれている「超可変領域」または「相補性決定領域（ＣＤＲ）」として言及される。
【０１２６】
従って、用語「ＦＲ」とは、抗体中のＣＤＲの間かつこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体分子において、軽鎖の３つのＣＤＲおよび重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲ結合表面を形成するために、三次元空間で互いに対して配置されている。このＨＬＡ−ＤＲ結合表面は、結合したＨＬＡ−ＤＲの三次元表面に相補的である。
【０１２７】
本明細書の目的に関して「機能的に活性な」または「機能的活性」とは、本明細書に開示されるＤＮ１９２１抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／またはＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の生物学的活性および／または免疫学的活性を保持しているＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体をいう。用語「エピトープ」とは、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と相互作用するＨＬＡ−ＤＲ抗原の特定の部分をいう。
【０１２８】
（ＨＬＡ−ＤＲ特異的非ヒトモノクローナル抗体）
本発明は、１つ以上のアポトーシス誘導性ドメインでＨＬＡ−ＤＲに結合し、それによって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＨＬＡ−ＤＲ発現正常細胞（これに対して抗体が結合する）では誘導しない非ヒトモノクローナル抗体を提供する。本明細書で例示されるのは、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称される、アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体である。ＤＮ１９２１は、免疫抑制活性によってさらに特徴づけられる一方で、ＤＮ１９２４は、ＤＮ１９２１と比較して、減少した免疫抑制活性を示す。
【０１２９】
機能のいかなる理論にも限定されずに、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲヘテロ二量体の第１のタンパク質ドメイン上の１つ以上のアポトーシス誘導性エピトープに特異的に結合することによって、アポトーシス活性を達成することができると考えられる。免疫抑制性ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体（本明細書ではＤＮ１９２１によって例示される）が、抗原結合ドメインについてさらに競合し得、従って、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞に抗原を提示し得る一方で、非免疫抑制性ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体（本明細書ではＤＮ１９２４によって例示される）が、抗原結合について低下した競合能力を有するとさらに考えられる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子（ＨＬＡ−ＤＲ）の第１のドメインに特異的に結合する、非ヒトモノクローナル抗体および非ヒト／ヒトキメラ抗体を、本明細書に開示されるように調製した。クラスＩＩ分子は、細胞増殖を調節し得るシグナルを伝達し、本明細書で示されるそのクラスＩＩ ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、癌細胞のアポトーシスを誘導し得る。
【０１３０】
ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子特異的抗体（ＤＮ１９２１、キメラＤＮ１９２１、ＤＮ１９２４、およびキメラＤＮ１９２４と称される）は、それらの表面でＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが分かった。これらの抗体の抗癌活性は、悪性でないＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生存性にも機能にも影響を及ぼさない点で、高度に選択性である。
【０１３１】
大部分の場合において、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質のエピトープまたはフラグメントに対して行われる抗体は、全長タンパク質に結合することができると同時に、他のタンパク質に対してはほとんどもしくは全く交叉反応性を示さない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、αＨＬＡ−ＤＲ鎖およびβＨＬＡ−ＤＲ鎖のアミノ酸１〜８８およびアミノ酸１〜９６（それぞれ、配列番号４９および５０）に対応するＨＬＡ−ＤＲ分子の第１のドメインに対して生成される。
【０１３２】
本明細書で例示される非ヒトモノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ、重鎖定常領域およびＩｇκ軽鎖定常領域（それぞれ、配列番号５３および５５）に作動可能に融合された、配列番号１３および２（ＤＮ１９２１）ならびに配列番号３５および２４（ＤＮ１９２４）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、それぞれ、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナル抗体である。
【０１３３】
従って、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナル抗体ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種から単離され得る。これらの種としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、鳥類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌおよびネコ起源が挙げられるが、限定されない。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、本明細書で、（１）配列番号１３および配列番号２にそれぞれおいて示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ配列番号４６および４５のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む免疫抑制性抗体ＤＮ１９２１、ならびに（２）配列番号３５および配列番号２４においてそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号４８および４７のポリヌクレオチドによってコードされる）を含む、非免疫抑制性抗体ＤＮ１９２４、によって例示される。
【０１３４】
本明細書で例示されるこのＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ、重鎖およびＩｇκ軽鎖定常ドメインをさらに含む。関連した代替実施形態において、ＤＮ１９２１および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、前述の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインならびにＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプに由来するマウス重鎖定常ドメインを含み得る。
【０１３５】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖および軽鎖の抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体もまた提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも７０％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１３６】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも７０％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１３７】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成のために、従来の方法論が採用され得る。一般に、齧歯類（通常はマウス）が、目的のＨＬＡ−ＤＲ抗原で繰り返し免疫され、抗体生成Ｂ細胞が塗擦した免疫動物から単離され、その抗体生成Ｂ細胞が、骨髄腫細胞と融合されてＢ細胞「ハイブリドーマ」を生じることによって不死化される。ハイブリドーマ細胞のライブラリーは、抗原結合特異性についてスクリーニングされ、適切なクローンが精製および増殖される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、以前に記載され、当該分野で容易に利用可能なもの）を用いて調製され得る。Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）。
【０１３８】
不死化細胞株は、例えば、上記のように、ＨＬＡ−ＤＲ抗原で免疫した動物から得た脾細胞より生成され得る。脾細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーと、好ましくは、免疫した動物と同系であるものと融合することにより不死化される。種々の融合技術が、採用され得る。例えば、その脾細胞および骨髄腫細胞は、数分の間非イオン性界面活性剤と合わされ、次いで、低密度で選択培地（この培地は、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない）にプレートされ得る。
【０１３９】
ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地中で培養され得る。例示的な不死化細胞株は、ａｒｅ ｔｈｏｓｅ ｔｈａｔ 効率的に融合し、その選択された抗体生成細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、かつヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）のような培地に感受性であるものである。より例示的な不死化細胞株は、マウス骨髄腫細胞株であり、この細胞株は、例えば、ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよびｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、ヒトモノクローナル抗体の生成のために記載された。Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．編，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。
【０１４０】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。このハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定され得る。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｎｉ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【０１４１】
望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈法によってサブクローニングされ得、標準的な方法によって増殖される。Ｇｏｄｉｎｇ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に関して、適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、そのハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１４２】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、増殖しつつあるハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術は、収率を高めるために使用され得、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔にハイブリドーマ細胞株を注射することが挙げられる。モノクローナル抗体は、次いで、腹水または血液から採取され得る。夾雑物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のＨＬＡ−ＤＲポリペプチド（例えば、配列番号４９および５０に示されるヒトＨＬＡ−ＤＲ αポリペプチドおよびβポリペプチド）は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製プロセスで使用され得る。あるいは、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の抗体精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または他のアフィニティークロマトグラフィー方法）により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【０１４３】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書に参考として援用される）に記載されるもの）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、そして従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。
【０１４４】
一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターにクローニングされ得る。次いでこのベクターは、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法で抗体タンパク質を生成しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域のコード配列を置換することによって、または非抗体ポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を、抗体コード配列に共有結合することによって、改変され得る。このような非抗体ポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代わりに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられて、本明細書で以下により詳細に記載されるキメラ二価抗体が作り出され得る。
【０１４５】
よって、特定の局面において、本発明は、非ヒトモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体を提供する。本発明の非ヒトモノクローナル抗体は、種々の動物種（非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、家禽、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、およびネコ起源が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性非ヒトモノクローナル抗体は、（１）配列番号１３および配列番号２にそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これらは、配列番号４６および４５のポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる）を含む免疫抑制性抗体ＤＮ１９２１、ならびに（２）配列番号３５および配列番号２４にそれぞれ示される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（これは、配列番号４８および４７のポリヌクレオチドによりそれぞれコードされる）を含む非免疫抑制性抗体ＤＮ１９２４によって、本明細書で例示される。
【０１４６】
本明細書で例示されるＤＮ１９２１抗体およびＤＮ１９２４抗体の各々は、マウスＩｇＧ１重鎖およびＩｇκ軽鎖の定常ドメインをさらに含む。関連する代替的な実施形態において、ＤＮ１９２１モノクローナル抗体および／またはＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、前述の重鎖および軽鎖の可変ドメインならびに抗体アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される）由来のマウスの重鎖定常ドメインを含み得る。
【０１４７】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖および軽鎖の抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体もまた提供される。特定の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２１の改変体は、配列番号１３および２にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１４８】
代替的実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも７０％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。なおさらなる実施形態において、ＤＮ１９２４の改変体は、配列番号３５および２４にそれぞれ少なくとも９８％または９９％同一である、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【０１４９】
（キメラ抗体）
本発明の他の局面は、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体を提供し、ここでこのキメラ抗体は、ヒト定常ドメインに作動可能に融合された非ヒト可変ドメインを含む。本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、その抗体が結合される正常細胞においては誘導しない。特定の実施形態において、本発明の非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体は、被験体にインビボで投与される場合、非免疫抑制性である。マウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によって例示される、非ヒト／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が本明細書で示される。これらのキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれらの構成的構造領域は、表１（キメラＤＮ１９２１）および表２（キメラＤＮ１９２４）において示される。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖を含む抗体分子であって、この抗体分子において、非ヒト抗体の可変ドメインが、ヒト定常ドメインに作動可能に融合されたものをいう。キメラ抗体は、一般に、その親の完全非ヒト抗体に比較して、減少した免疫原性を示す。
【０１５１】
ヒト定常ドメインに作動可能に融合された非ヒト抗原結合可変ドメインを含むキメラ抗体分子を作製するための方法論は、当該分野で記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；Ｓｈａｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）；Ｂｒｏｗｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）；米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙによる）；Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許出願第１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，欧州特許出願第１７１４９６（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Ｋｕｄｏら，欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年公開５月７日）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））を参照のこと。これらの参考文献の各々は、本明細書に参考として援用される。
【０１５２】
キメラ抗体は、一価抗体、二価抗体または多価抗体を包含する。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とジスルフィド架橋によって結合したキメラＨ鎖によって形成される重鎖および軽鎖（ＨＬ）の二量体である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合した２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。例えば、凝集するＣＨ領域（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖、またはμ鎖から）を使用することによって、多価キメラ抗体も生成され得る。
【０１５３】
本発明のマウス抗体およびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、個々の抗体の重鎖および／または軽鎖を含む。キメラ重鎖は、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部に連結された、ＨＬＡ−ＤＲに対して特異的な非ヒト抗体の重鎖に由来する抗原結合領域を含む。
【０１５４】
本発明に従うキメラ軽鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部に連結された、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な非ヒト抗体の軽鎖に由来する抗原結合領域を含む。
【０１５５】
同じまたは異なる可変領域結合特異性のキメラ重鎖およびキメラ軽鎖を有する抗体、フラグメントまたは誘導体はまた、公知の方法に従って（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）に従って）個々のポリペプチド鎖の適切な結合によって調製され得る。
【０１５６】
特定の実施形態において、キメラ重鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞は、キメラ軽鎖（またはその誘導体）を発現する宿主とは別個に培養されてもよく、その免疫グロブリン鎖は、別個に回収され、次いで結合されてもよい。あるいは、この宿主細胞は、一緒に培養され得、その鎖は、培養培地中で自発的に会合し、続いて、組み立てられた免疫グロブリン、フラグメントまたは誘導体を回収することが可能になる。
【０１５７】
本明細書で例示される場合、抗体重鎖および軽鎖は、同じ細胞にトランスフェクトされ、輸送および分泌されるときに細胞によって組み立てられてもよい。
【０１５８】
ハイブリッド細胞は、非ヒトＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞（代表的には、天然もしくは組換えいずれかのヒトＨＬＡ−ＤＲ、またはヒトＨＬＡ−ＤＲタンパク質配列のペプチドフラグメントに対して免疫された動物の脾細胞）の融合によって形成され得る。あるいは、非ヒトＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞は、ＨＬＡ−ＤＲで免疫した動物の血液、脾臓、リンパ節または他の組織から得られたＢリンパ球であり得る。
【０１５９】
第２の融合パートナーは、不死化機能を提供し、リンパ芽球腫細胞またはプラスマ細胞腫細胞または骨髄腫細胞であり得る。これらの細胞は、それら自身抗体生成細胞ではなく、悪性である。例示的な融合パートナー細胞としては、ハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）および骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、あまたはその誘導体が挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）を参照のこと。
【０１６０】
ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的なモノクローナル抗体を生成するマウスハイブリドーマは、マウス融合パートナー細胞（例えば、ＳＰ２／０）と、精製ＨＬＡ−ＤＲ、組換えＨＬＡ−ＤＲ、天然もしくは合成ＨＬＡ−ＤＲペプチド（αおよびβ ＨＬＡ−ＤＲ鎖（それぞれ配列番号４９および５０）のアミノ酸１〜８８およびアミノ酸１〜９６を含むペプチドが挙げられる）に対して免疫したマウス由来の脾細胞とを融合することによって形成される。
【０１６１】
マウスを免疫するために、種々の異なる従来のプロトコルが行われ得る。例えば、マウスは、ＨＬＡ−ＤＲの初回免疫および追加免疫を受容し得る。本発明のキメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列を与えるこの抗体生成細胞はまた、非ヒト（例えば、霊長類）細胞またはヒト細胞の形質転換によって生成され得る。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を生成するＢリンパ球は、エプスタイン−バーウイルスのようなウイルスに感染して形質転換されて、不死化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体生成細胞を生じる。例えば、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２−７９（１９８３）を参照のこと。あるいは、Ｂリンパ球は、当該分野で周知のように、癌遺伝子または癌遺伝子産物を提供することによって形質転換され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）およびＨａｒｌｏｗ（前出）を参照のこと。
【０１６２】
本発明のキメラモノクローナル抗体の構築に適した非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインは、種々の動物種（非ヒト霊長類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、家禽、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、犬およびネコ起源が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２からなる群より選択される抗体アイソタイプから単離され得る。
【０１６３】
本明細書で議論される、例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（そｒぞれ、配列番号１４および３）に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号１３および２）を含む。この本明細書で議論されるキメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体は、インビボで投与される場合に、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができ、かつ免疫抑制性である。例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２として示される。例示的な全長キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【０１６４】
キメラＤＮ１９２１の重鎖および軽鎖（それぞれ配列番号１２および１）の改変体もまた提供される。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２１の重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号１２および１に少なくとも９８％または９９％同一である。
【０１６５】
本明細書で開示される、代替的な例示的ＨＬＡ−ＤＲ特異的キメラモノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（それぞれ、配列番号３５および２４）に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号３５および２４）を含む。本明細書で開示されるキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体は、インビボで投与された場合に、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができ、非免疫抑制性である。例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号３４として示される。例示的な全長キメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号２３として示される。
【０１６６】
代替的実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ、配列番号３４および２３である。特定の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも７０％同一である。他の実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。なおさらなる実施形態において、キメラＤＮ１９２４重鎖および軽鎖の改変体は、それぞれ配列番号３４および２３に少なくとも９８％または９９％同一である。
【０１６７】
【表１−１】
【０１６８】
【表１−２】
【０１６９】
【表１−３】
【０１７０】
【表２−１】
【０１７１】
【表２−２】
【０１７２】
【表２−３】
【０１７３】
【表２−４】
（ヒト化抗体）
なおさらなる実施形態において、本発明は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性モノクローナル抗体を提供し、ここで、このヒト化抗体は、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）、およびヒト重鎖定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ２重鎖定常ドメイン）およびヒト軽鎖定常ドメイン（例えば、Ｉｇκ軽鎖定常ドメイン）を含む。一般に、「ヒト化」ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、そうでなければ、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続時間および有効性を制限する、対応する非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体またはその非ヒト領域に対する、望ましくない免疫学的応答を最小にするのに有用である。Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｒｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化」は、ヒト抗体（レシピエント抗体）を含むことを意味し、ヒト化抗体においては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられる。いくつかの場合、ヒト抗体の可変ドメインフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、輸入されたＣＤＲまたはフレームワークの配列にも見られない残基を含み得る。
【０１７５】
一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして、代表的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のＣＤＲ領域に対応し、そして、これらの領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト抗体のコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、好適には、抗体の定常領域の少なくとも一部（代表的には、ヒト抗体の一部）を含む。
【０１７６】
ヒト化モノクローナル抗体は、代表的に、約９０〜９５％がヒトであり、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが非ヒトである。一般に、げっ歯類細胞において産生されるヒト化モノクローナル抗体は、それらが由来する種からの対応するキメラモノクローナル抗体よりも免疫原性が低い。Ｂｅｌｌら，Ｌａｎｃｅｔ ３５５：８５８−８５９（２０００）。
【０１７７】
上述のように、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、結合抗原の３次元表面と相補的な表面を形成する抗体分子の超可変領域をいう。Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体の重鎖および軽鎖の各々は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）から構成される。それゆえ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合部位、は、合計６つのＣＤＲを含み、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からの３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合抗原との広範な接触を形成し、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。
【０１７８】
ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的アポトーシス性抗体は、ヒト可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）に作動可能に融合した１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを生じ、これらは、ヒト定常ドメインの重鎖および軽鎖（本明細書において、それぞれ、配列番号１４および３に示される、重鎖ＩｇＧ２定常ドメインおよび軽鎖Ｉｇκ定常ドメインにより例示される）に作動可能に融合している。
【０１７９】
本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメインに作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１重鎖可変ドメイン（配列番号１３）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、定常ドメインが、本明細書において、配列番号１４に示されるヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメインにより例示される、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択される、ヒト重鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８０】
あるいは、またはさらに、本発明の例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１軽鎖可変ドメイン（配列番号２）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、本明細書において配列番号３に示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインにより例示される、ヒト軽鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８１】
ＤＮ１９２１に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得、そして、インビボで投与された場合に、免疫抑制的である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２１ ＣＤＲは、配列番号１７（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１（ＤＮ１９２１ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号８（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＤＮ１９２１ ＶＬ ＣＤＲ３）として表される。
【０１８２】
本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４重鎖可変ドメイン（配列番号３５）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的重鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、定常ドメインが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる群より選択され、そして、本明細書において、配列番号３６に示されるヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメインにより例示される、ヒト重鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８３】
あるいは、またはさらに、本発明のさらなる例示的なＨＬＡ−ＤＲ特異的ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトフレームワーク（ＦＲ）ドメイン１、２、３および／または４に作動可能に融合された、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４軽鎖可変ドメイン（配列番号２４）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的軽鎖可変ドメインを生じ、これは、必要に応じて、本明細書において、配列番号２５に示されるヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインによりヒト軽鎖定常ドメインにより例示される、ヒト軽鎖定常ドメインに作動可能に融合される。
【０１８４】
ＤＮ１９２４に基づくヒト化モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導し得、そして、インビボで投与された場合に、非免疫抑制的である。本発明に従うヒト化抗体を作製するために適切なＤＮ１９２４ ＣＤＲは、配列番号３９（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号４１（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号４３（ＤＮ１９２４ ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号３２（ＤＮ１９２４ ＶＬ ＣＤＲ３）として表される。
【０１８５】
各ＣＤＲに隣接するのは、主にＶ領域を、抗原結合部位へと折りたたむことを担う、フレームワーク（ＦＲ）領域、特に、ＣＤＲに直ぐ隣接するＦＲ残基である。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原に接触し得る。ＦＲ内では、特定のアミノ残基および特定の構造的特徴が、非常に高度に保存されている。この点から、全てのＶ領域の配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折りたたまれるとき、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。ＣＤＲループの、特定の正確なＣＤＲアミノ酸配列への折りたたみ形状に影響を与える、ＦＲの保存された構造領域がある。さらに、特定の残基が、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化する、非共有結合性内部ドメイン接点に関与することが知られている。
【０１８６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、適切なヒト抗体定常ドメインに融合する前に、ヒト支持ＦＲにＣＤＲを接合することにより達成され得る。Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｒｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照のこと。
【０１８７】
あるいは、げっ歯類のＣＤＲは、組換え的に操作されたげっ歯類ＦＲにより支持され得る。１９９２年１２月２３日に公開された欧州特許第５１９，５９６号を参照のこと。Ｑｕｅｅｎに対する、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号；Ａｄａｉｒに対する米国特許第５，８５９，２０５号；ならびに、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号（これらの特許の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１８８】
実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基、そして、可能ないくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基で置き換えられているヒト抗体である。従って、本発明のヒト化ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の各々は、それぞれ、重鎖ＦＲと軽鎖ＦＲとの間に挿入された、少なくとも１、２もしくは３の非ヒト重鎖ＣＤＲ、および／または、少なくとも１、２もしくは３の非ヒト軽鎖ＣＤＲを含み、これらは、ＣＤＲに対する支持を提供し、そして、互いに関するＣＤＲの空間的関係を規定する。
【０１８９】
（完全ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術およびトランスジェニックマウス法により作製され得る。ファージディスプレイ技術により同定された抗体フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、組換え技術により合わされ、完全な「ヒト」抗体を生成する。トランスジェニックマウスから抗体を作製するために、ハイブリドーマが調製され、そして、従来のモノクローナル抗体法についてスクリーニングされる。
【０１９０】
ファージディスプレイ技術により完全ヒト抗体を作製するための方法論は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載される。米国特許第６，２４８，５１６号、同第６，２９１，１５８号、同第６，２９１，１５９号、同第６，２９１，１６０号、同第６，２９１，１６１号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，２６５，１５０号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号、および同第６，３００，０６４号（この各々は、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１９１】
完全ヒト抗体を作製するためのトランスジェニック動物系は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１６２，９６３号、同第６，０７５，１８１号および同第５，７７０，４２９号（この各々は、本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１９２】
またヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能なさらなる技術は、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｐ．７７（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ編，１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される。
【０１９３】
（ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合フラグメント、改変体および誘導体）
本発明はまた、前述のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体のいずれかの、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体、および／または誘導体を企図する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体、および誘導体の各々は、ＨＬＡ−ＤＲ発現正常細胞ではなく、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞において、アポトーシスを誘導し得る。特定の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体および誘導体（例えば、モノクローナル抗体ＤＮ１９２１に基づくもの）は、インビボで投与された場合、免疫抑制的である。他の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合フラグメント、改変体および誘導体（例えば、モノクローナル抗体ＤＮ１９２４に基づくもの）は、インビボで投与された場合、非免疫抑制的である。
【０１９４】
対応する全長ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る、治療的に有用なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗原結合フラグメントを作製するための方法論は、当該分野で容易に利用可能である。本発明の方法は、ＨＬＡ−ＤＲ分子の架橋を促進し、それによりアポトーシスを刺激するために、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が二価、三価、または多価であることを必要とする。従って、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の１つ以上のフラグメントは、固体支持体に結合され、それにより、ＨＬＡ−ＤＲの架橋を促進し得る。
【０１９５】
タンパク質分解酵素であるパパインは、優先的にＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じ、このうち２つ（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）は、インタクトなこう現結合部位を含む共有結合性のヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを提供し得、このフラグメントは、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ抗体分子の、そして、時として、ＩｇＧ抗体分子またはＩｇＡ抗体分子の優先的なタンパク質分解性切断により生成され得る。Ｆｖフラグメントは、あるいは、当該分野で公知の技術を用いて作製され得る。Ｆｖフラグメントは、ネイティブな抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する、抗原結合部位を含む、非共有結合性のＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２（１９７２）；Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７０６−２７１０（１９７６）；およびＥｈｒｌｉｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６（１９８０）。
【０１９６】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーにより連結された、ＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９−５８８３（１９８８）。１つの抗体Ｖ領域に由来する、自然に凝集しているが、化学的には分かれている、軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、ｓＦｖ分子（抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造へと折り畳まれる）へと変換するための化学構造を見分けるための多数の方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【０１９７】
本発明に従う、抗体、およびその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、従来の分子生物学および組換えＤＮＡ方法論により作製され得る。このような方法論は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。これらの刊行物の各々は、その全体が参考として援用される。
【０１９８】
簡単に言うと、例えば、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内に連結され、この発現ベクターは、抗体領域をコードするポリペプチドに作動可能に連結された転写プロモーターを含み、そして、この抗体領域をコードするポリヌクレオチドの３’側には転写終止シグナルを含む。適切な発現ベクターはまた、転写開始部位、翻訳開始を命令するためのＫｏｚａｋ配列、および翻訳を停止させる終止コドンを提供し得る。さらに、発現ベクターはまた、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＨｉｓまたはＦＬＡＧ（登録商標）配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含み得、この配列は、抗体ペプチドの検出および親和性精製を容易にする。
【０１９９】
発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換または形質移入された任意の適切な宿主細胞内で達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および高等真核生物細胞が挙げられる。代表的に、使用される宿主細胞は、ＣＯＳまたはＣＨＯのような哺乳動物細胞株由来である。組換え抗体ポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な系からの上清が、まず、市販のフィルタを使用して濃縮され得る。濃縮の後、濃縮物が、適切な精製マトリクス（例えば、親和性マトリクスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最後に、１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用いて、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０２００】
抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、あるいは、従来のポリペプチド合成方法論により合成され得る。例えば、このような抗体フラグメントは、市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）を用いて合成され得、この方法において、アミノ酸が、増大するアミノ酸鎖に連続的に添加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６（１９６３）を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための設備は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）などの供給業者から市販されており、製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０２０１】
従って、本発明に従うＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体およびそのフラグメントは、フラグメント、誘導体および改変体がＨＬＡ−ＤＲ結合の特異的かつアポトーシス性の非免疫抑制活性の高原結合特性に実質的に影響を与えない限り、これらのフラグメント、誘導体および改変体を包含する。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「フラグメント、誘導体および改変体」は、ネイティブなポリペプチドまたはタンパク質とは、１つ以上の置換、欠失および／または挿入で異なるポリペプチドまたはタンパク質であり、その結果、このポリペプチドまたはタンパク質の抗原結合活性は、実質的に減少されない。換言すると、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する改変体の能力は、親ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、増強されていても不変であってもよいか、または、得られるＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体もしくはそのフラグメントの効力に影響を与えることなく、親抗体に対して、５０％未満、そして代表的には２０％未満消失していてもよい。一般に、適切なＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体の誘導体または改変体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する新生物細胞においてアポトーシスを誘導する、その誘導体または改変体の能力を評価することによって特徴付けられ得る。
【０２０３】
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」とは、具体的に同定された配列と異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を包含し、改変体においては、１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されている。改変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体であっても、天然に存在しない改変体であってもよい。改変体の配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、好ましくは、本発明の配列と、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を示す。
【０２０４】
％同一性は、以下に記載されるように、比較されるべき２つの配列を整列し、整列した部分における同一の残基の数を決定し、この数を、本発明の（照会した）配列内の残基の総数で割り、そして、その結果に１００をかけることによって決定される。列挙されたレベルの配列類似性を示すことに加え、本発明の改変体の配列は、好ましくは、その改変体が比較される配列の抗原結合に対して実質的に類似する抗原結合性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｉｔｙ）を示す。
【０２０５】
改変体は、１つのアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される、置換として定義される、「保存的アミノ酸置換」を含み得、その結果、ポリペプチドの二次構造および疎水性の性質は、実質的に不変である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして、類似の親水性値を有する、無電荷の極性頭基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他のグループとしては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは、非保存的な変化を含み得る。
【０２０６】
ポリペプチドの抗原結合フラグメント、誘導体および改変体は、抗体の化学的もしくは酵素的な消化のいずれかによってか、または、その抗体をコードするポリヌクレオチドおよび結果として生じる変異体のその後の発現の変異分析によって同定され得る。ついで、ポリペプチドのフラグメントまたは変異体ポリペプチドが、例えば、以下に提供される代表的なアッセイを使用して、どの部分が生物活性を保持するかを決定するために試験される。
【０２０７】
本発明の抗体のフラグメント、誘導体および改変体はまた、合成もしくは組換え手段によって作製され得る。約１００より少ないアミノ酸、一般には、約５０より少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、当業者に周知の技術を使用して作製され得る。例えば、このようなポリペプチドは、上述のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法により合成され得る。
【０２０８】
改変体はまた、オリゴヌクレオチド指向型、部位特異的変異誘発のような標準的な変異誘発技術を用いて調製され得る。Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）。ポリヌクレオチド配列の部分はまた、短縮型ポリペプチドの調製を可能にする標準的な技術を用いて除去され得る。改変体は、さらに、またはあるいは、例えば、ポリペプチドの二次構造および疎水性の性質に対して最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾され得る。
【０２０９】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体のフラグメント、誘導体および改変体は、好ましくは、ネイティブなＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％、そしてより好ましくは、少なくとも約９５％もしくは９８％の配列同一性を示す。ポリペプチド配列が整列され得、そして、特定の領域における同一なアミノ酸の百分率が、公的に利用可能なコンピュータアルゴリズムを用いて、別のポリペプチドに対して決定され得る。ポリペプチド配列の整列および同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて試験され得る。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ならびにＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）に記載される。
【０２１０】
ＢＬＡＳＴＰソフトウェアは、ＮＣＢＩの匿名のＦＴＰサーバ上で利用可能であり、そして、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４から利用可能である。文書に記載され、アルゴリズムと共に配布されているデフォルトパラメータに設定された、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．０．６［１９９８年９月１０日］およびバージョン２．０．１１［２０００年１月２０日］は、本発明に従う改変体の決定において使用するための例示的なものである。アルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリー（ＢＬＡＳＴＰを含む）の使用は、ＮＣＢＩのウェブサイトおよびＡｌｔｓｃｈｕｌら，「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９０３４０２（１９９７）の刊行物に記載される。
【０２１１】
ＢＬＡＳＴＰまたは類似のアルゴリズムにより得られた、照会配列による１つ以上のデータベースの配列に対する「ヒット」は、配列の類似の部分を整列し、そして同定する。このヒットは、配列の重なりの類似性の程度および長さの順に並べられる。データベースの配列に対するヒットは、一般に、照会配列の、配列の長さの一部のみに対する重なりを表す。
【０２１２】
ポリペプチド配列の％同一性は、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＰのような適切なアルゴリズムを使用してポリペプチド配列を整列し；整列された部分に対して同一のアミノ酸の数を同定し；同一なアミノ酸の数を、本発明のポリペプチドのアミノ酸の総数で割り；そして、１００をかけて、％同一性を決定することによって決定される。
【０２１３】
ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムはまた、ポリペプチドの整列についての「期待」値を生じる。この期待値（Ｅ）は、特定の大きさのデータベースを検索する際に、偶然、特定の数の隣接する配列にわたって見えることが「期待」され得るヒットの数を示す。期待値は、データベースに対するヒットが、真の類似性を示すかどうかを決定するための有意な閾値として使用される。例えば、ポリペプチドヒットに対して割当てられた０．１のＥ値が、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの大きさのデータベースにおける値を意味するものとして解釈される場合、ほんの偶然に、類似のスコアを有する配列の整列された部分にわたって、０．１のマッチを見ることが期待され得る。この基準によれば、配列の整列かつマッチした部分は、９０％の関連する確率を有する。整列かつマッチした部分にわたって０．０１以下のＥ値を有する配列について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて偶然にマッチを発見する確率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いた場合の１％以下である。
【０２１４】
１つの実施形態によれば、「改変体」ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体および抗体フラグメントの各々を参照すれば、好ましくは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と同じ数であるか、またはこれよりも少ないアミノ酸を有し、かつ、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と比較した場合に、０．０１以下のＥ値を生じる配列を含む。
【０２１５】
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して特定の％同一性を有することに加え、改変体抗体は、好ましくは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に共通するさらなる構造的および／または抗原結合特徴を有する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、特定の程度の同一性を有する抗体は、その一次構造において高い程度の類似性を共有し、そして、実質的に類似の抗原結合特性を有する。本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体に対して、高い程度の一次構造の類似性を共有することに加え、ＨＬＡ−ＤＲに対して特定の程度の同一性を有するか、または、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合し得る抗体は、好ましくは、以下の特徴のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）これらは、本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体と実質的に同じ抗原結合特性を有する；または（ｉｉ）例えば、ＣＤＲおよび／もしくはフレームワーク領域のような、特定可能なドメインを共通して含む。
【０２１６】
（結合体）
意図される正確な治療的および／または診断的な適用に依存して、本発明の抗体またはそのフラグメントは、１つ以上の治療剤と結合されることが望ましくあり得る。この点で適切な薬剤としては、放射性核種、分化誘導因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）、薬物、毒素およびこれらの誘導体が挙げられる。例示的な適切な放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。例示的な適切な薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。例示的な適切な分化誘導因子としては、エステルおよび酪酸が挙げられる。例示的な適切な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０２１７】
治療剤は、直接または間接（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が、互いと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上にある求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、もう一方の上にある、カルボニル含有基（たとえば、無水物）もしくは、酸ハロゲン化物と、または、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応し得る。
【０２１８】
あるいは、治療剤と抗体とをリンカー基を介して結合することが望ましくあり得る。リンカー基は、結合能との干渉を避けるために、薬剤から抗体を遠ざけるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増加させ、従って、カップリング能を増加させるように機能し得る。化学反応性の増加はまた、そうでなければ、不可能であった、薬剤、または薬剤の官能基の使用を容易にする。
【０２１９】
ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の、種々の二官能性試薬または多官能性試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが、当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭化水素残基を介して達成され得る。このような方法論は、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号に記載される。
【０２２０】
治療剤が、本発明の免疫複合体の抗体部分を含まないときにより強力である場合、細胞内への内部移行の間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出のための機構としては、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射による切断（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体が媒介する加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸が触媒する加水分解による切断（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられる。
【０２２１】
１以上の薬剤を１つの抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が、１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つ以上の型の薬剤が、１つの抗体に結合される。特定の実施形態にかかわらず、１つ以上の薬剤との免疫複合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つ以上の薬剤は、抗体分子に直接結合され得るか、または、付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０２２２】
キャリアは、直接的であるか、もしくはリンカー基を介する共有結合を含む、種々の方法で薬剤を有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）、アミノデキストランのようなペプチドおよび多糖類（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、非共有結合またはリポソーム小胞内（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）のようなカプセル化によって薬剤を有し得る。放射性核種剤に固有のキャリアとしては、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびその合成を開示する。放射性核種キレートは、キレート化合物から形成され得、これらは、窒素原子および硫黄原子を、金属または金属酸化物、放射性核種と結合するためのドナー原子として含有する化合物を含む。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびその合成を開示する。
【０２２３】
用語「細胞傷害性薬物」とは、本明細書中で使用される場合、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞の死を促進するために使用される薬物を指す。細胞傷害性薬物の例としては、ａｒａ−Ｃ、ブレオマイシン、シスプラチン、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシドおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような化学療法剤が挙げられる。
【０２２４】
（抗ＨＬＡ−Ａ−ＤＲ抗体の同定および特徴づけのためのアッセイ系）
以下のアッセイ系は、本発明に従う、ＨＬＡ−ＤＲ特異的なアポトーシス性、非免疫抑制性抗体の慣用的な同定および特徴づけのために適切に使用され得る。
【０２２５】
（クラスＩＩ ＭＨＣ）
「免疫抑制的であり、かつ細胞傷害性である」抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂは、第１のドメインを認識し、ペプチド結合溝の近くに位置するエピトープに結合することによって抗原提示を阻害し得る。本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ（例えば、ＤＮ１９２４）は、「細胞傷害性のみ」である。従って、このような「細胞傷害性のみ」の抗体が結合する、ＨＬＡ−ＤＲの正確な配列は、「免疫抑制的であり、かつ細胞傷害性である」抗体の配列とは同一でない。Ｖｉｄｏｖｉｃら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３３４９−３３５５（１９９５）。
【０２２６】
（アポトーシスによる細胞死）
上述のように、アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体の、クラスＩＩを発現する細胞への結合と関係している。ＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞など）の表面上に発現されたクラスＩＩ ＭＨＣをコードする分子は、最終的に、両方の細胞型の活性化および分化をもたらす相互作用である、Ｔリンパ球に対する抗原提示の制限的要素として機能する。
【０２２７】
ＨＬＡ−ＤＲ媒介性の細胞死は、非常に迅速で、Ｆｃレセプター非依存性であり、かつ、補完的であり、非壊死性であることが実証されている。Ｔｒｕｍａｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（６）：８８７−８９６（１９９４）およびＴｒｕｍａｎら，Ｂｌｏｏｄ ８９（６）：１９９６−２００７（１９９７）。
【０２２８】
本発見は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発における抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の役割に関し、従って、このような細胞においてプログラムされた細胞死を誘導するための方法を提供する。例示的な実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を架橋し得る抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体およびそのフラグメントは、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞により媒介される状態を研究または処置する際に有用であり、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞に関連する障害を処置または予防するのに有用である。従って、本発明の抗体は、種々の疾患を処置するのに有用であり、これらの疾患としては、Ｂ細胞起源の癌により特徴付けられる任意の疾患（アポトーシスの増加が望ましくない）、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ急性白血病、骨髄腫および形質細胞腫が挙げられるがこれらに限定されない。Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２：２６９７−２８２８（１９９６）。
【０２２９】
（細胞死の機構の評価）
この節では、アポトーシスによる細胞死の程度を評価するために有用なインビトロアッセイを記載する。細胞死は、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）での細胞染色によってか、または、アポトーシスによる細胞死に特異的なアッセイ（例えば、アネキシンＶでの染色）を用いることによって検出され得る。Ｖｅｒｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４：３９−５１（１９９５）。壊死による細胞死は、以下に記載するような細胞の生存度についてのアッセイを、関連のある細胞の形態の顕微鏡での観察との組み合わせの結果を評価することによって、アポトーシスによる細胞死から区別され得る。
【０２３０】
（壊死性細胞死）
壊死は、内部ホメオスタシスの虚脱が細胞膜の完全性の損失およびその後の膨張を含む細胞の溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を導き、その後に細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）が続く、受動的プロセスである。Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９３。壊死性の細胞死は、細胞膜の完全性の損失、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のような、一次性の壊死および二次性の壊死を受ける細胞のＤＮＡに結合することが当業者に公知の色素に対する透過性によって、特徴付けられる。Ｖｉｔａｌｅら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １００：２２３−２２９（１９９３）およびＳｗａｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３７：７９−８７（１９９１）。壊死は、アポトーシスから区別され得る（アポトーシスの初期段階においては、細胞膜はインタクトなまま残る）。結果として、以下に記載されるようにアポトーシス性細胞死を壊死性細胞死から区別するため、アポトーシスについてのアッセイと並行して、ＰＩを使用した色素排除アッセイ（ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）が使用され得る。ＰＩを用いた蛍光活性化細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）ベースのフローサイトメトリーアッセイは、壊死性細胞の迅速な評価および定量化を可能にする。
【０２３１】
（アポトーシス性細胞死）
プログラムされた細胞死またはアポトーシスの検出は、当業者に理解されるように達成され得る。アポトーシスを受ける細胞のパーセンテージは、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の投与とともに、またはその投与なしで、アポトーシスの刺激後の種々の時間で測定され得る。アポトーシス性細胞死を受ける細胞の形態は、一般的に、細胞の細胞質および核の萎縮、ならびにクロマチンの凝縮および断片化によって特徴付けられる。Ｗｙｌｌｉｅら、Ｊ．Ｐａｔｒｏｌ．１４２：６７−７７（１９８４）。
【０２３２】
アポトーシス性Ｂ細胞における部分的ＤＮＡ分解が以前に報告されている。Ｔｒｕｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｕｎｏｌ．６：８８７−８９６（１９９４）およびＣｏｈｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６７−２９３（１９９２）。この観察に一致して、ＤＮＡ断片化は、以前に記載された腫瘍性Ｂ細胞をアポトーシス誘導性（ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）の抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂとともにインキュベーションした後には検出されなかった。しかし、これらの培養物の相対的細胞サイズおよびＰＩ取り込み式フローサイトメトリーのプロフィールは、アポトーシスを受ける細胞について以前に示されたプロフィールと本質的に同じである。Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１２８：１２７−１３５（１９８８）；Ｎｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０４５９−１０４６３（１９９３）；およびＴｒｕｍａｎら（１９９４）。
【０２３３】
（有用性）
（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に関する使用）
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、診断用および治療用の組成物ならびに診断用および治療用の方法において利用され得る。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞についての診断アッセイおよびＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞に関する治療において（例えば、組織または血清中のこのような細胞の発現を検出すること、およびこのような腫瘍を有する被験体において臨床的結果を改善する治療のための基礎として働くことに）使用され得る。
【０２３４】
当該分野で公知の種々の診断アッセイ技術（例えば、競合的結合アッセイ、直接もしくは間接サンドイッチアッセイ、および均一もしくは不均一相において実施される免疫沈降アッセイ）が使用され得る。Ｚｏｌａ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。この診断アッセイに使用され得る抗体は、検出可能な部分によって標識され得る。この検出可能な部分は、直接的もしくは間接的に、検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、この検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ）、蛍光化合物または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、あるいは酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。特異的結合を促進する分子としては、対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなど）が挙げられる。特異的結合を促進する分子の対のメンバーの一方は、標識が、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する公知の手順による検出を行わせる分子で標識され得る。抗体を検出可能な部分に結合させるための当該分野で公知の任意の方法が利用され得る。この方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｎ．３０：４０７（１９８２）によって記載される方法が挙げられる。
【０２３５】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体はまた、細胞培養物または天然の供給源からのＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞のアフィニティー精製のために有用である。このような方法において、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体は、当該分野で公知の方法論を用いて適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂もしくは濾紙）に固定化される。固定された抗体は、精製されるべきＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を含むサンプルと接触させられ、そして固体支持体は、固定化された抗体に結合するＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を除く、サンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な培地で洗浄される。支持体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現癌細胞を固定化された抗体から放出させる別の適切な培地で洗浄される。
【０２３６】
（抗ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生物学的効果）
本発明のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲの第１ドメインを認識する。本発明の抗体または特異的モノクローナル抗体のＣＤＲ領域は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞と免疫反応し、そしてこの腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し得る。ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２４、およびマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、非腫瘍性成細胞と比較して、腫瘍（プラズマ細胞腫 ＭＣ／ＣＡＲ）細胞（両方ともＨＬＡ−ＤＲを発現する）におけるアポトーシスの誘導に関するインビトロでの特異性を示した。実施例２および図２〜４、ならびに実施例７および図８Ａ〜Ｆを参照のこと。さらに、ＤＮ１９２４による正常なＴｈ反応との干渉の欠如がインビトロで示された。実施例２および図５を参照のこと。
【０２３７】
（アポトーシス性ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を用いたインビボ癌治療）
本発明の抗体は、治療的に有効であり、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現する腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死を刺激し得る。これらの発見は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性の癌（特に血液の癌）に対する選択的な抗体ベースの抗腫瘍治療の可能性を提起する。
【０２３８】
抗クラスＩＩ ＭＨＣ ｍＡｂの殺腫瘍性（ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ）効果は、クラスＩＩ依存性免疫応答の同時的な抑制なしで（両特性ともタンパク質の第一ドメインを認識するｍＡｂ認識に関連するが）達成され得る。
【０２３９】
所望の治療的効果を有する抗体は、宿主にとって生理学的に受容可能なキャリア中において投与され得、そして例えば、非経口、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）などの方法で投与され得る。導入の様式に依存して、抗体は、種々の方法で処方され得る。処方物中の治療的に活性な抗体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌまで変動し得る。
【０２４０】
本発明の目的のための「被験体」は、ヒトおよび他の動物（特に哺乳動物）の両方を包含する。従って、本方法は、ヒト治療および獣医学的適用の両方に対して適用可能である。例示的実施形態において、被験体は哺乳動物であり、最も例示的な実施形態において、被験体はヒトである。
【０２４１】
本明細書において使用される場合、用語「改善された治療結果」または「腫瘍細胞数の減少」とは、処置前後に患者および／または患者から採取されたサンプルの試験によって決定される場合の、血中および／または罹患する組織もしくは器官における腫瘍サイズまたは検出可能な循環性癌細胞の数のいずれかの５０％減少、好ましくは８０％減少、より好ましくは９０％減少、そしてさらにより好ましくは１００％減少を意味する。
【０２４２】
本明細書において使用される場合、用語「処置する工程」、「処置」および「治療」とは、治癒可能な治療、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療、および予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療をいう。
【０２４３】
本明細書において使用される場合、「治療上有効な量」によって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞を、そのアポトーシスを刺激することによって減少または消失させる用量が意味される。正確な用量は、処置の目的に依存し、そして公知の技術を使用して当業者によって確認され得る。
【０２４４】
好ましくは、抗体は、非経口投与のために、適切な不活性キャリア（例えば、滅菌生理学的食塩水）中に処方される。例えば、キャリア溶液中の抗体の濃度は、代表的に約１〜約１００ｍｇ／ｍｌの間である。投与される用量は、投与の経路によって決定される。例示的な投与の経路としては、非経口投与またはＩＶ投与が挙げられる。治療的に有効な用量は、ＨＬＡ−ＤＲ発現性新生物細胞のアポトーシス性細胞死の有意な増加を生じるのに有効な用量である。ＨＬＡ−ＤＲ発現性新生物細胞のアポトーシス性細胞死の有意な増加は、検出可能な量のＨＬＡ−ＤＲを発現しない細胞と比較して、ＨＬＡ−ＤＲ発現性細胞のアポトーシス性細胞死の２倍の増加、より好ましくは５倍の増加、さらにより好ましくは１０倍の増加、最も好ましくは２０倍の増加である。
【０２４５】
発明の重要な特徴に従って、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、単独で、または他の抗癌剤（例えば、化学治療剤（例えば、シスプラチン、タキソール、メトトレキサートなど）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；ＦＡＤＤ、ＰＭＡ；イオノマイシン；スタウロスポリンまたはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））と組み合わせて投与され得る。
【０２４６】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（例えば、ＤＮ１９２４）の治療上有効な量は、本明細書において記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死についてのインビトロモデルにおいてＤＮ１９２４に関して得られたデータと合わせて、公知の抗体についての確立された有効量との比較によって推定され得る。当該分野において公知であるように、抗体の変性、全身送達 対 局所送達、ならびに年齢、体重、健康、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用、および状態の重症度に起因して、用量の調節が必要であり得る。当業者によって、慣習的な実験を通じてこのような調節が行われ得、そして適切な用量が決定され得る。
【０２４７】
特定の実施形態の範囲内において、本発明の方法は、所望の抗原結合特異性および／または抗原結合親和性を有する抗体に関して細胞をスクリーニングする工程をさらに提供し得る。本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、抗体が特異的に結合および／または相互作用するこれらの物質、分子、タンパク質、核酸、脂質および／または炭水化物の全てを広範に包含する。
【０２４８】
抗体は、例示的な抗原結合特異性および／または抗原結合親和性に関して、当該分野で現在利用可能な任意の方法論によってスクリーニングされ得る。例えば、従来の細胞パニング手順、ウエスタンブロッティング手順、およびＥＬＩＳＡ手順が、特定の特異性を有する抗体をスクリーニングする工程を達成するために利用され得る。米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号、および同第４，０１８，６５３号（これらの各々は、本命最小において参考として援用される）への参照によって見られ得るように、広範囲の適切なイムノアッセイ技術が利用可能である。
【０２４９】
１つの型のアッセイにおいて、未標識の抗−抗体が固体支持体上に固定され、そして試験されるべき抗体含有サンプルがその固定された抗−抗体と接触させられる。第一の複合体の形成を可能にするのに十分な適切な時間の後、次に、検出可能なシグナルを生成し得るレポーター分子で標識された標識抗原を添加してインキュベートし、固定された抗−抗体／抗体サンプル／試験抗原の第二の複合体の形成のために十分な時間を与える。複合体化されない物質は、洗い流され、レポーター分子によって生成されたシグナルの観察によって抗原の存在が決定される。この結果は、眼に見えるシグナルの単純な観察による定性的なものであっても、既知の量の抗原または抗体を含むコントロールサンプルとの比較によって定量化されてもいずれでもよい。この型のアッセイの変化は、サンプルおよび標識された抗原の両方が結合抗体に対して同時に添加される同時アッセイを包含する。
【０２５０】
本明細書中で使用される場合、用語「固体支持体」とは、例えば、マイクロタイタープレート、膜およびビーズなどをいう。例えば、このような固体支持体は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロースまたはテフロン（登録商標）などで構成され得る。このような支持体の表面は、固体または多孔質であり得、そして任意の都合よい形状であり得る。
【０２５１】
第２の型のアッセイにおいて、抗体を探索するための抗原が固体支持体に結合される。この結合プロセスは当該分野において周知であり、そして一般的に、その抗原を固体支持体に対して架橋結合、共有結合、または物理的に吸収することからなる。ポリマー−抗原複合体は、試験サンプルに備えて洗浄される。次いで、試験されるべきサンプルのアリコートが、固相複合体に添加され、そして抗原への抗体の結合を可能にするのに十分な時間（例えば、２０〜４０分、またはより都合よい場合、一晩）、適切な条件下（例えば、ほぼ室温〜約３８℃、例えば２５℃）でインキュベートされる。インキュベーション時間に続いて、固体支持体は、洗浄され、乾燥され、そしてレポーター分子が結合し得る抗体とともにインキュベートされ、それによって固定された抗原に複合体化された試験抗体に対する二次抗体の結合の検出を可能にする。
【０２５２】
適切な固体支持体としては、ガラスまたはポリマーが挙げられ、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイの実施のために適切な任意の他の表面の形態であり得る。
【０２５３】
代替的アッセイシステムは、標的抗体を固定化し、そしてその固定化された抗体を抗原（レポーター分子に標的されていても、されていなくてもよい）に暴露する工程を包含する。本明細書において記載されるように、用語「レポーター分子」とは、その化学的、生物学的、および／または物理的性質によって、抗原または二次抗体と複合体化された抗体についてのスクリーニングを可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子をいう。検出は、定性的であっても定量的であってもいずれでもよい。本明細書において開示された型のアッセイにおいて利用される最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、放射性同位体、および／または化学発光分子である。１つの特定の有用なアッセイシステムにおいて、Ｂ細胞レポーターに関する抗体を細胞表面に発現する細胞ライブラリーの培養物が、標識（例えば、ビオチン）と共役された抗原か、または組換えエピトープ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ）を有する抗原とともにインキュベートされ得る。Ｃａｓｔｒｕｃｃｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：４６４７−４６５３（１９９２）。適切なインキュベーション時間の後、標識された抗原は、氷冷された培地中の懸濁液から２回または３回細胞をペレット化することによって洗い流される。
【０２５４】
細胞は、抗原に結合された標識に特異的に結合する試薬（例えば、ビオチン標識に対するストレプトアビジンもしくはアビジン、またはＦＬＡＧエピトープに対する抗ＦＬＡＧ抗体）に結合されたビーズの懸濁液を含有する培地中でさらにインキュベートされ得る。目的の抗原を結合したことの間接的な結果としてビーズに結合した細胞は、適切な手段によって残りの細胞から分離され、次いで組織培養物に戻されて増殖する。次第に限られた量の抗原を用いてこのプロセスを繰り返すことは、抗原に特異的におよび／または高い親和性で結合した細胞の濃縮を引き起こす。抗原に対する前結合とは関係なくビーズに直接的に結合する細胞は、抗原なしでビーズとともにインキュベーションすることによって除去され得る。次いで、個々の抗原結合クローンは、適切な蛍光色素（例えば、フルオレセイン）に対して直接的もしくは間接的に結合された抗原で細胞を標識した後に、例えば、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）などによって精製され得る。
【０２５５】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合、酵素は、一般的にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって検出抗体に結合される。しかし、容易に認識されるように、種々の異なる結合技術が存在し、これらは当業者に容易に利用され得る。一般的に使用される酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。一般に、酵素標識された抗体は、抗原と抗体との間の潜在的複合体に添加され、結合させられ、そして洗浄されて過剰の試薬が除去される。次いで、適切な基質を含む溶液が抗原／試験抗体／標識抗体の複合体に添加される。この基質は、二次抗体に結合した酵素と反応し、定性的な視覚的シグナルを与える。これはさらに、通常、分光光度法で定量化されて、サンプル中に存在する抗体の量を示し得る。
【０２５６】
あるいは、蛍光化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）または蛍光タンパク質（例えば、フィコエリトリン）が、抗体に、その結合能を変えることなく化学結合され得る。特定波長の光による照射によって活性化される場合、蛍光標識された抗体は、その光エネルギーを吸収し、その分子の励起状態を示し、続いて、光学顕微鏡または他の光学装置によって視覚的に検出され得る特徴的な色で光の放射を示す。ＥＩＡにおける場合、蛍光標識された抗体は、抗原−抗体複合体に結合させられる。未結合の試薬を除去した後、残りの第３の複合体は、適切な波長の光に曝される。観察された蛍光は、目的の結合抗体の存在を示す。免疫蛍光技術およびＥＩＡ技術は、どちらも当該分野において十分確立されている。他のレポーター分子（例えば、放射性同位体および化学発光分子および／もしくは生物発光分子）もまた、本明細書において開示されたスクリーニング法において適切に利用され得ることが理解される。
【０２５７】
以下の実施例は、上記の発明を使用する様式をより十分に記載するため、ならびに本発明の種々の局面を実施するために企図される最適な様式を示すために役立つ。これらの実施例は、決して、本発明の真の範囲を限定するために役立つのではなく、例示的目的のために提示される。以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【０２５８】
（実施例１）
（ＤＮ１９２１マウスモノクローナル抗体およびＤＮ１９２４マウスモノクローナル抗体の生成）
この実施例は、マウスＤＮ１９２１ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生成を示す。
【０２５９】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４と称されるマウスモノクローナルＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体を、当該分野で公知の標準的な技術に従って調製した。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）。免疫原で過剰免疫された近交系実験用マウスＢＡＬＢ／ｃ系（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）がＢ細胞のドナーであった。ＢＡＬＢ／ｃ由来の変異Ｂリンパ腫株Ｍ１２．Ｃ３を、キメラヒト／マウス クラスＩＩ遺伝子でトランスフェクトし、免疫原として使用した。このトランスフェクト体（Ｍ１２．Ｃ３．２５と称する）によって発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲの第１の細胞外（α１およびβ１）ドメイン、ならびに対応するマウスＭＨＣクラスＩＩ分子Ｈ２−Ｅの第２の細胞外（α２およびβ２）ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインから構成された。Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３３４９−３３５５（１９９５）。マウスを、月１回の間隔で５回のＩＰ注射（各々は、１ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁された、１０７（−照射された（１００Ｇｙ）Ｍ１２．Ｃ３．２５細胞からなる）によって免疫化した。最後の注射から３日後、免疫脾臓細胞を、ＨＡＴ感受性Ｉｇ陰性マウスミエローマ細胞ＰＡＩ−０と融合した。Ｓｔｏｃｋｅｒら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ２１７ ：１５５−１５７（１９８２）。
【０２６０】
単一のハイブリドーマ培養物の上清流体を、４℃での４時間のインキュベーション後でのＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８に対するそれらの毒性、またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロでの増殖において誘導されたブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を抑制するそれらの能力についてスクリーニングした。所望の生物活性のモノクローナル抗体を適切な形式で分泌することが同定されたコロニーを、それぞれ「ＤＮ１９２１」および「ＤＮ１９２４」と称し、そして限界希釈法によって２回サブクローン化した。標準的アイソタイプ決定キット（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４が、両方ともマウスＩｇＧ１／κアイソタイプであることを見出した。
【０２６１】
（実施例２）
（ＤＮ１９２４モノクローナル抗体のインビトロ殺腫瘍性効果の評価）
この実施例は、ＤＮ１９２４と称するマウスＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得るが、ＨＬＡ−ＤＲを発現する正常（すなわち、非悪性）細胞においてはアポトーシスを誘導しないことを示す。
【０２６２】
ヒト細胞株ＭＣ／ＣＡＲ（プラズマ細胞腫）およびＲＰＭＩ １７８８（エプスタイン−バーウイルス形質転換リンパ芽球状Ｂ細胞株、ＥＢＶ−ＬＣＬ）を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から譲渡された。Ｒｉｔｔｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３１：１３３−１４１（１９８３）。細胞を、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン、および３×１０−５Ｍの２−ＭＥを補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、１０５／ｍｌの密度で、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気（組織培養インキュベーター）中で培養した。５×１０５細胞／ｍｌで培養したＨＬＡ−ＤＲ−特異的ｍＡｂ分泌性マウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞株ＤＮ１９２４および１０Ｆ１２の滅菌濾過された上清流体を、最終濃度２０％でヒト細胞を添加した。示された共培養期間に続いて、細胞を洗浄し、そしてさらに１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに５分インキュベーションし、その後、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ３．１ｆソフトウェアを用いたＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で、細胞の大きさ 対 赤色ＰＩ蛍光の分析した後、その生存度を決定した。Ｏｔｔｅｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、ｐｐ．５．４．１−５．４．１９（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）。生存細胞が積極的にＰＩを排除すること、一方死細胞が、それを、細胞のＤＮＡへの接近可能性と直接的に比例して取り込むことが示された。Ｓｗａｔら（１９９１）。
【０２６３】
新生物細胞のアポトーシスを誘導するＤＮ１９２４抗体の能力を、７５％を超える細胞死を引き起こした２つの独立なヒトＢ細胞腫瘍株（ＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８およびプラズマ細胞腫ＭＣ／ＣＡＲ）の共培養によって示した。図２。
【０２６４】
ヒト末梢血から得られた正常形成性（すなわち、非新生物性）ＨＬＡ−ＤＲ＋リンパ球においては、細胞毒性効果は全くなかった。対照的に、ＤＮ１９２４、１０Ｆ１２（第２のタンパク質ドメイン内に位置する共通エピトープについて特異的な抗ＤＲ ｍＡｂ）は、ＭＣ／ＣＡＲの生存度に影響しなかった。図３。
【０２６５】
２つの異なるインキュベーション条件下での細胞毒性の時間経過は、図４の上パネルに示される。ＤＮ１９２４誘導性細胞死が温度依存的であることは明らかである；これはヒト体温（３７℃）においてより速い速度（細胞毒性効果は３０分以内に明らかとなる）であり、そして４℃においては、遅くなるが、まだなお生じる（細胞毒性効果は１〜２時間以内に明らかとなる）。腫瘍細胞との長い（３週間）共培養後でさえも衰えていないＤＮ１９２４の腫瘍細胞毒性は、この抗体に対して耐性となる能力のないことを示す。図４の下パネル。
【０２６６】
（実施例３）
（ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体は、低下した免疫抑制活性を示す）
この実施例は、ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体が、低レベルの免疫抑制活性を示すことを示す。
【０２６７】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢに対するヒトＴｈ細胞のＨＬＡ−ＤＲ依存性インビトロ増殖反応を、先に記載したように生じさせた。Ｍｏｌｌｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：４６３−４６８（１９９１）。簡単にいうと、Ｆｉｃｏｌｌ分離によってヘパリン処理した血液から得られた２×１０５個の新鮮ヒトＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン、および３×１０−５Ｍの２−ＭＥを補充した０．２ｍｌのＩＭＤＭ培地中で０．１μｇ／ｍｌのＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）とともに３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気（組織培養インキュベーター）中で、３日間培養した。５×１０５細胞／ｍｌで培養したＨＬＡ−ＤＲ−特異的ｍＡｂ分泌性マウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞株ＤＮ１９２４およびＬ２４３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の滅菌濾過された上清流体を、最終濃度２０％でアッセイの開始時に添加した。Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｎｕｎｏｌ．１２５：２９３−２９９（１９８０）およびＦｕら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：２５３−２６０（１９９４）。３つ組の培養物のＴ細胞増殖を、最後の１６時間の間の［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。Ｂｒａｄｌｅｙ、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」ｐｐ．１５３−１７４（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）。Ｌ２４３およびＤＮ１９２４のｍＡｂの両方とも第１のＨＬＡ−ＤＲドメイン上のエピトープを認識するが、ｍＡｂ Ｌ２４３がＳＥＢで誘発されたＴ細胞反応の約７０％を抑制した一方、ＤＮ１９２４は効果を有さなかった（図５）。
【０２６８】
（実施例４）
（ＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的マウスモノクローナル抗体のインビボ抗腫瘍活性の評価）
ＤＮ１９２４のインビボ抗腫瘍活性を、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ヒトプラズマ細胞種ＭＣ／ＣＡＲを注射された重症複合型免疫不全近交系（ｓｃｉｄ）マウスにおいて評価した。２０匹の８週齢のマウス（体重に関してランダム化された）に、マウスあたり０．１ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０培地中の１０７個のＭＣ／ＣＡＲ細胞を用いてＩＰ注射した。Ｒｉｔｔｓら、（１９８３）。その後、動物の半数は、０．１ｍｌのＰＢＳ中０．６２５ｍｇのＤＮ１９２４抗体の、単回ＩＰ用量を受けた。残りのマウスに、０．１ｍｌ ＰＢＳの対応するＩＰ注入を与えた。マウスを毎日モニタリングし、その生存を記録した。図６に示されるように、ＤＮ１９２４は、顕著な治療活性を示し、腫瘍を有するマウスの生存を延長した。
【０２６９】
（実施例５）
（マウスＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４におけるマウス／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の生成）
この実施例は、マウスモノクローナル抗体ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ２の重鎖定常領域およびヒトＩｇκの軽鎖定常領域とを含むマウス／ヒトキメラＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の構築を記載する。
【０２７０】
可変領域セグメントを、ｃＤＮＡを全ＲＮＡから「ＲＡＣＥ」するプライマーを設計するための定常領域特異的配列を用いて、各抗体（ＤＮ１９２４およびＤＮ１９２１）のマウス版を発現するハイブリドーマ細胞からクローニングした。可変領域（ＤＮ１９２４−ｈｅａｖｙ、ＤＮ１９２４−ｌｉｇｈｔ；ＤＮ１９２１−ｈｅａｖｙ、ＤＮ１９２２−ｌｉｇｈｔ）配列を、これらのクローンから決定した。
【０２７１】
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域セグメントおよびヒトＩｇκ軽鎖定常領域セグメントを、ＮＣＢＩおよびＩＭＧＴのホームページから設計されたプライマーを用いて、ヒト脾臓全ＲＮＡからクローン化した。クローンを配列決定して、適切なＩｇκ定常領域またはヒトＩｇＧ２定常領域を確認した。
【０２７２】
ＤＮ１９２１およびＤＮ１９２４重鎖および軽鎖ポリヌクレオチド配列を増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、表３に提示される。
【０２７３】
（重鎖構築）
可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントとを組み合わせるため、ＰＣＲ「縫い付け（ｓｅｗｉｎｇ）」技術を利用した。簡単にいうと、プライマーを、抗体分子のコード領域の５’末端および３’末端に対応するように設計した（表３、プライマーＡおよびＢ）。プライマーの第２のセットを、別個のプラスミド上に最初に存在する２つの片の間の接合部に重なるように設計した。最初のＰＣＲ反応を、プライマーセットＡ＋Ｄとともに可変領域プラスミドをテンプレートとして用いて、またはプライマーセットＢ＋Ｃとともに定常領域プラスミドをテンプレートとして用いて、準備した。第２のＰＣＲ反応は、プライマーセットＡ＋Ｄを用いて最初の２つの一次反応の生成物を組み込んだ。最後のＰＣＲ生成物をクローニングし、配列を確認し、そして必要な場合、（コード領域の外に）制限酵素を利用して、発現ベクター中にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）した。
【０２７４】
（軽鎖構築）
可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントとを組み合わせるため、重鎖構築に関して上記したように、ＰＣＲ「縫い付け」技術を利用した。プライマーを、抗体分子のコード領域の５’末端および３’末端に対応するように設計した（表３、プライマーＡおよびＢ）。第３のプライマーを、別個のプラスミド上に最初に存在する２つの片の間の接合部に重なるように設計した。最初のＰＣＲ反応を、プライマーセットＣ＋Ｂとともに定常領域プラスミドをテンプレートとして用いて準備した。第２のＰＣＲ反応は、プライマーセットＡ＋Ｂを用いて、一次反応の生成物、およびプラスミドがコードする軽鎖可変領域を組み込んだ。最後のＰＣＲ生成物をクローニングし、配列を確認し、そして必要な場合、（コード領域の外に）制限酵素を利用して、発現ベクター中にシャトルした。
【０２７５】
（発現系）
ＤＮ１９２４重鎖およびＤＮ１９２４軽鎖を、ｐＥＥ１４．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）にサブクローニングし、キメラ免疫グロブリンの両方の鎖が同じベクター骨格上にコードされるようにした。各鎖の発現を、それ自身のＣＭＶ主要即時早期（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）（ＭＩＥ）プロモーターによって駆動した。重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームを含むプラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｓｖ細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中にトランスフェクトし、細胞を、標準的な技術を用いて、５０μＭのメチオニン−スルホキサミン（ｓｕｌｆｏｘａｍｉｎｅ）（ＭＳＸ）を含む無グルタミン培地中で選択した。細胞株を生成するキメラ抗体をＥＬＩＳＡによって同定した。
【０２７６】
ＤＮ１９２１重鎖および軽鎖の発現に関して、同じプロトコールに従った。
【０２７７】
（表３）
（キメラＤＮ１９２１モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４モノクローナル抗体の構築に使用されたオリゴヌクレオチド）
【０２７８】
【表３】
表３のオリゴ配列において、大文字は、抗体分子のオープンリーディングフレーム中のアミノ酸残基についてのコドンを示し、小文字は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（下線）およびクローニング目的のための制限エンドヌクレアーゼ部位に対して付加されたヌクレオチドを示す。プライマー「Ｃ］および「Ｄ」中の点線は、マウス可変領域とヒト定常領域との間の接合部を示す。
【０２７９】
（実施例６）
（ＨＬＡ−ＤＲ細胞に特異的に結合するマウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体）
この実施例は、キメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体の両方が、種々の組織培養細胞株において発現されたＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合することを示す。
【０２８０】
標準的免疫蛍光アッセイ［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １，ｐｐ．５．３．１−５．４．１３（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］を、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧビオチン結合体（１：２００最終希釈；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ならびにストレプトアビジン−ＰＥ（０．８μｇ／ｍｌ）をそれぞれ第２および第３の試薬として用いて行った。
【０２８１】
（実施例７）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導する）
この実施例は、キメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導するのに有効であるが、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞または正常ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞においては有効でないことを示す。
【０２８２】
アポトーシスアッセイを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８結合体をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）対比染色とともに使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキットを用いて行った。簡単にいうと、５×１０５個の生存細胞を０．１〜１０μｇのｍＡｂとともに０．５〜１ｍｌの総容量の培地中で、３７℃で１０〜３０分間共培養し、２ｍｌの氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖおよび１μｇ／ｍｌでＰＩを含む１００μｌの１×緩衝液中に再懸濁し、室温、暗中で１５分間インキュベートした。次いで、３００μｌの１×緩衝液を添加し、そしてサンプルを３０分以内にフローサイトメーターによって分析した［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １，ｐｐ．５．４．１−５．４．１３（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］。
【０２８３】
表４は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ＬｃＬ細胞株の一団の各メンバーに結合し、そしてアポトーシスを誘導することを示す。各ＬｃＬ細胞株は、異なるＤＲβ１対立遺伝子を発現する。これらのデータは、ＤＲβ１対立遺伝子の幅広い範囲にわたるＨＬＡ−ＤＲ発現に関する疾患の処置における、本発明のマウス／ヒトキメラ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に対する有用性を支持する。
【０２８４】
（表４）
（マウス／ヒトキメラＤＮ−１９２４（ｍｕｔ−ｈＩｇＧ２クローンＤＮ１６）は、ある範囲のＤＲβ１対立遺伝子を発現するＨＬＡ−ＤＲ陽性ＬｃＬ細胞株の一団に特異的に結合し、アポトーシスを誘導する）
【０２８５】
【表４】
表５は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体が、腫瘍細胞株の一団（３つのＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞株および１２のＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株を含む）の各ＨＬＡ−ＤＲ陽性メンバー（ＫＧ−１を除く）に結合し、アポトーシスを誘導することを示す。キメラＤＮ１９２４は、Ｆｃレセプターを発現するもの（すなわちＵ９３７およびＴＨＰ−１）、またはＢ細胞腫瘍細胞株（すなわちＤＢ）でさえ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞株のアポトーシスを誘導しない。対照的に、キメラＤＮ１９２４は、１２のＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞株のうちの１１のアポトーシスを誘導する。ＫＧ−１（ＡＭＬ腫瘍細胞株）は、キメラＤＮ１９２４結合によってアポトーシスを受けないＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株の（特異的キメラＤＮ１９２４結合活性によって示されるように）唯一の例である。全体で、これらのデータは、キメラＤＮ１９２４が、広範なＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍型の処置において有効であることを示す。
【０２８６】
（表５）
（マウス／ヒトキメラＤＮ−１９２４（ｍｕｔ−ｈＩｇＧ２クローンＤＮ１６）は、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞株の一団に特異的に結合し、アポトーシスを誘導する）
【０２８７】
【表５】
（実施例８）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、免疫抑制性である）
以前に記載されるたように、ＩＬ−２分泌アッセイを行った［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１，ｐｐ．３．１４．１−３．１４．１１（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）］。簡単にいうと、ＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマ株Ｐａｐｅｒｉｎｏ［Ｖｉｄｏｖｉｃら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：２３８−２４４，２００３］のハイブリドーマ細胞１０５個を、抗原提示細胞としての２×１０５個のヒトＨＬＡ−ＤＲ１＋ＰＢＭＣ、ＰＡＰ、およびｍＡｂ（ｍＤＮ１９２１＝マウスＤＮ１９２１；ｍＤＮ１９２４＝マウスＤＮ１９２４；ＤＳｍ８９＃３４＝キメラＤＮ１９２１；ＤＮ−ＧＳ＃１６＝キメラＤＮ１９２４）とともに、０．２ｍｌのマイクロウェル中で共培養した。１日後、培養上清を回収し、そしてＩＬ−２依存性細胞株ＨＴ−２の１０４個の細胞の増殖を支持するそれらの能力について、２４時間、５０％濃度で試験した。最後の６時間の培養期間の間、［３Ｈ］チミジンｃｐｍ組み込みによって細胞増殖を測定した。
【０２８８】
（実施例９）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体に誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ非依存性である）
この実施例は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４のアポトーシス誘導活性がカスパーゼ非依存性であることを示す。
【０２８９】
外膜に対するホスファチジルセリンの暴露（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色で検出される）およびカスパーゼ活性は、両方ともアポトーシスの指標である。しかし、本実施例は、キメラＤＮ１９２４に誘導されたアポトーシスが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、またはカスパーゼ９の活性に関与しないことを示す（図１３Ａ−Ｄおよび表６）。
【０２９０】
キメラＤＮ１９２４媒介性アポトーシスを、添加されたＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（広範囲のカスパーゼインヒビター）の存在下および非存在下の両方において誘導した。誘導後、アポトーシスを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色によって、ならびにカスパーゼ３、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９活性化を測定することによって検出した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色は、アポトーシス誘導を確証し、そしてＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋがアポトーシス誘導の阻害に不十分であることを確証した。従って、マウス／ヒトＤＮ１９２４で誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ３、カスパーゼ８、またはカスパーゼ９の活性化に非依存性であった。
【０２９１】
（表６）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４に誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ非依存性である）
【０２９２】
【表６】
（実施例１０）
（マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体は、腫瘍増殖の速度を低下させること、およびＲＡＪＩ異種移植片ＳＣＩＤマウス動物系において生存の延長を促進することに有効である）
この実施例は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、腫瘍増殖の速度を低下させること（図１４）、およびＲａｊｉ異種移植片ｓｃｉｄマウス動物系において生存の延長を促進すること（図１５）に有効であることを示す。
【０２９３】
０日目、ｓｃｉｄマウス（５匹の動物の４つの群）は、０．１ｍｌ ＰＢＳ中の５×１０６個のＲａｊｉ腫瘍細胞（バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−８６）で負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）された。腫瘍負荷後１日目、４日目、７日目および１０日目において、グループ１は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのマウスＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を受け、グループ２は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのマウス／ヒトＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（クローン番号６４）を受け、グループ３は、腹腔内注射を介して、３００μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのヒトＩｇＧ２，κアイソタイプコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５４０４）を受け、そしてグループ４は、腹腔内注射を介して、３００μｌのＰＢＳを受けた。
【０２９４】
図１４は、マウスＤＮ１９２４およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４の両方とも、ｓｃｉｄマウス動物モデル系において、Ｒａｊｉ異種移植片を用いた皮下負荷によって腫瘍増殖の速度を低下させるのに有効であったことを示す。
【０２９５】
図１５は、マウスＤＮ１９２４およびマウス／ヒトキメラＤＮ１９２４の両方とも、ｓｃｉｄマウス動物モデル系において、Ｒａｊｉ異種移植片を用いた皮下負荷後に生存を延長させるのに有効であったことを示す。
【０２９６】
本発明は、特定の処置方法および組成物に関して記載されたが、本発明から逸脱することなく種々の変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１】ＨＬＡ−ＤＲ分子の概略的エピトープマップを示す。これは、ＣＹ：細胞質テール；ＴＭ：膜貫通部分；α１およびβ１：それぞれ、α鎖およびβ鎖の第１（細胞外）ドメイン；ならびにα２およびβ２：それぞれ、α鎖およびβ鎖の第２（細胞外）ドメインを示す。
【図２】図２は、ＤＮ１９２４マウスモノクローナル抗体とともに１６時間培養した後の種々の細胞集団の生存度を示す。生細胞が、２次元プロットの右下象限中に位置する。ＰＢＭＣは、末梢血単核球に対応する。
【図３】図３は、示されるモノクローナル抗体とともに１６時間培養した後のヒト細胞株の生存度を示す。
【図４】図４は、示されるような、種々の温度条件下で種々の時間の間ＤＮ１９２４モノクローナル抗体とともにインキュベーションした後のＥＢＶ−ＬＣＬ ＲＰＭＩ １７８８の生存度を示す。
【図５】図５は、[３Ｈ]チミジン取り込みによって示される、ヒトＰＢＭＣのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）特異的インビトロ増殖応答に対するＤＮ１９２４モノクローナル抗体の免疫抑制効果が存在しないことを示す。
【図６】図６は、ＨＬＡ−ＤＲ＋ヒトプラズマ細胞腫ＭＣ／ＣＡＲを注射し、ＤＮ１９２４（白三角）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：黒四角）のいずれかで処理した、ｓｃｉｄマウスの生存を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図７Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮ１９２１と、ＤＮ１９２４（図７Ａ）、キメラＤＮ１９２４（図７Ｂ）、およびキメラＤＮ１９２１（図７Ｃ）とがＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に特異的に結合するのを示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシス活性を誘導すること（図８Ａ）；ＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｂ）；キメラＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導すること（図８Ｃ）；キメラＤＮ１９２４によるアポトーシスの誘導が、用量依存性であること（図８Ｄ）；キメラＤＮ１９２４が、正常なＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｅ）；ＤＮ１９２４が、ＨＬＡ−ＤＲ陰性腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しないこと（図８Ｆ）；を示す、ＦＡＣＳデータである。
【図９】図９は、マウスＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体およびキメラＤＮ１９２１ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によってはＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ特異的Ｐａｐｅｒｉｎｏ応答の阻害を示すが、マウスＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によってもキメラＤＮ１９２４ ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体によっても、ＰＡＰ／ＨＬＡ−ＤＲ特異的Ｐａｐｅｒｉｎｏ応答の阻害は示さない、グラフである。
【図１０】図１０は、キメラＤＮ１９２１を発現するプラスミドベクターおよびキメラＤＮ１９２４を発現するプラスミドベクターの構築の模式図である。
【図１１】図１１は、Ｉｇκ定常領域アライメントである。上の２行は、ヒトＩｇκについての２つの異なる登録番号（Ｊ００２４１およびＭ６３４３８）である。下の行は、マウスＩｇκ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３５１３８）である。
【図１２】図１２は、ＩｇＧ定常領域アライメントである。上の３行は、ヒト（ｈ）ＩｇＧ２、ｈＩｇＧ１、およびｈＩｇＧ４（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２５０１７０、ＡＦ０２７１５９、およびＡＪ２９４７３３）である。下の３行は、マウス（ｍ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００４５３、Ｊ００４７０、およびＪ００４６１）である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ媒介性アポトーシスが、カスパーゼ非依存性であること（図１３Ａ）、およびカスパーゼ３（図１３Ｂ）も、カスパーゼ８（図１３Ｃ）も、カスパーゼ９（図１３Ｄ）も、キメラＤＮ１９２４処理細胞において活性化されることを示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、Ｒａｊｉ異種移植ｓｃｉｄマウス動物モデル系における腫瘍増殖速度を減少することにおいて有効であることを示すグラフである。
【図１５】図１５は、マウス／ヒトキメラＤＮ１９２４抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のインビボ皮下投与が、Ｒａｊｉ異種移植ｓｃｉｄマウス動物モデル系における生存増加を促進することにおいて有効であることを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、該抗体は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインならびに重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、該重鎖可変ドメインは、該重鎖定常ドメインに作動可能に融合されており、該軽鎖可変ドメインは、該軽鎖定常ドメインに作動可能に融合されており、該重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であり、該軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、該モノクローナル抗体は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖定常ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一である、抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、抗体。
【請求項４】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、抗体。
【請求項５】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインおよび前記軽鎖定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである、抗体。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記ヒト重鎖定常ドメインおよび前記ヒト軽鎖定常ドメインは、それぞれ、ヒトＩｇＭ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＤ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＥ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＡ１重鎖定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ２重鎖定常ドメイン、ならびにヒトＩｇＭ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＤ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＥ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＡ１軽鎖定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ２軽鎖定常ドメインである、抗体。
【請求項８】
請求項７に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインは、配列番号３６において示されるヒトＩｇＧ２κ重鎖定常ドメイン配列に対して少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖定常ドメインは、配列番号２５において示されるヒトＩｇＧ２κ軽鎖定常ドメイン配列に対して少なくとも７０％同一である、抗体。
【請求項９】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、抗体。
【請求項１２】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、該モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ依存性免疫応答を抑制しない、抗体。
【請求項１３】
請求項１または請求項６に記載の抗体を含む組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、組成物。
【請求項１４】
アポトーシスを誘発する方法であって、該方法は、
ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞を有する被験体に対して、治療上有効な量の請求項１または請求項６に記載の抗体を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞は、プラズマ細胞腫／多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞白血病からなる群より選択される癌に由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記抗体は、前記被験体に対して静脈内（ＩＶ）投与される、方法。
【請求項１】
ＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、該抗体は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインならびに重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、該重鎖可変ドメインは、該重鎖定常ドメインに作動可能に融合されており、該軽鎖可変ドメインは、該軽鎖定常ドメインに作動可能に融合されており、該重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であり、該軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、該モノクローナル抗体は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖定常ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一である、抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、抗体。
【請求項４】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、抗体。
【請求項５】
請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインおよび前記軽鎖定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである、抗体。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記ヒト重鎖定常ドメインおよび前記ヒト軽鎖定常ドメインは、それぞれ、ヒトＩｇＭ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＤ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＥ重鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＡ１重鎖定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ２重鎖定常ドメイン、ならびにヒトＩｇＭ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＤ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＥ軽鎖定常ドメイン、ヒトＩｇＡ１軽鎖定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ２軽鎖定常ドメインである、抗体。
【請求項８】
請求項７に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖定常ドメインは、配列番号３６において示されるヒトＩｇＧ２κ重鎖定常ドメイン配列に対して少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖定常ドメインは、配列番号２５において示されるヒトＩｇＧ２κ軽鎖定常ドメイン配列に対して少なくとも７０％同一である、抗体。
【請求項９】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、前記重鎖可変ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であり、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、抗体。
【請求項１２】
請求項８に記載のＨＬＡ−ＤＲ特異的モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であり、該モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ依存性免疫応答を抑制しない、抗体。
【請求項１３】
請求項１または請求項６に記載の抗体を含む組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、組成物。
【請求項１４】
アポトーシスを誘発する方法であって、該方法は、
ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞を有する被験体に対して、治療上有効な量の請求項１または請求項６に記載の抗体を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記ＨＬＡ−ＤＲを発現する腫瘍細胞は、プラズマ細胞腫／多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞白血病からなる群より選択される癌に由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記抗体は、前記被験体に対して静脈内（ＩＶ）投与される、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５１３９７６（Ｐ２００７−５１３９７６Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４１３４（Ｐ２００６−５４４１３４）
【出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５８２５１
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０００７２７１４）デンドレオン コーポレイション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１５日（２００４．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５８２５１
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０００７２７１４）デンドレオン コーポレイション (11)
【Ｆターム（参考）】
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