ＨＬＡ新規アリル
【課題】ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２４に含まれる新規アリルを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ新規アリル、または、特定の塩基配列もしくはその相補配列を有するＨＬＡ新規アリルに関する。
【効果】新規アリルについて、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を解析したところ、Ａ＊２４０２が陽性となるプローブすべてに反応し、別のプローブにも陽性反応を示す。
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ新規アリル、または、特定の塩基配列もしくはその相補配列を有するＨＬＡ新規アリルに関する。
【効果】新規アリルについて、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を解析したところ、Ａ＊２４０２が陽性となるプローブすべてに反応し、別のプローブにも陽性反応を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下、ＨＬＡと略す）の新規アリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病（Graft-Versus-Host Disease））が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡの型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは、抗体を用いて行われる血清学的手法であった。近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがある。コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２４に含まれる遺伝子型は２００６年１月の時点で、６６種類が報告されており、一部の地域を除き、最も頻度が高い遺伝子型はＡ＊２４０２であるとされている（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成１８年２月１日検索]、インターネット＜URL：http://www.allelefrequencies.net＞
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２４に含まれる新規アリルを提供することにある。
【０００８】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、Ａ＊２４０２が陽性となるプローブすべてに反応し、別のプローブにも陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ新規アリルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ新規アリルを提供するものである。
【００１１】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明による新規アリルは下記のようにして得られたものである。
ＤＮＡタイピング法の１つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社のｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）を用いてＨＬＡ−Ａ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液と口腔内粘膜スワブより抽出した２種類のＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応が示されなかった。これらの検体では、遺伝子型がＡ＊２４０２ホモ接合の場合に陽性となるプローブセットに加えて、３プローブにおいて陽性反応が見られた。
【００１３】
これらの検体について、同じ試薬を用いて再タイピングを行ったところ、Ａ＊２４０２以外の反応を示した３種類のプローブは、全て１１４番目のアミノ酸付近（エクソン３の５’末端寄り）にある２０塩基程度の領域に設定されており、Ａ＊３１などのアリルで陽性となるプローブの一部であるが、この領域以外に設定されたプローブは陽性反応を示さなかった。
【００１４】
ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりこの領域の配列を確認した。エクソン３の上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、この領域内の２箇所の塩基について、それぞれ異なる２種類の塩基の存在を示す両峰性のピークが検出され、この検体がＡ＊２４０２とＡ＊２４０２のエクソン３に未知の変異を持つアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００１５】
配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ａ抗原遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ａ抗原のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、血液由来の検体より得られた１３クローン、スワブ由来の検体より得られた１０クローンのプラスミドについて配列を確認した。
【００１６】
その結果、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２が１０クローン、ＨＬＡ−Ａ以外の遺伝子が８クローン見つかった他、ダイレクトシークエンシング法で変異が示唆された２塩基に変異が存在するＡ＊２４０２の変異型が５クローン見つかった。
【００１７】
この遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＡ＊２４０２の配列のエクソン３内に２箇所の変異を確認した。これらの変異は、図２に示す１１４番目のアミノ酸がヒスチジンからグルタミンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸へとアミノ酸が置き換わる非同義置換であった。Ａ２４に含まれる遺伝子型の中ではこれら二箇所のアミノ酸は共有されている。また、１１４番目、１１６番目のアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置している。
【００１８】
このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ａ＊２４０２と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ａ＊２４０２Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があるので、臓器移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ａ＊２４６２」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを、「Ａ＊２４０２Ｖ」または「Ａ＊２４６２」のいずれかで表示する。
【００１９】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、本発明によるＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質が提供される。本発明によるＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質も、アリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ａ＊２４０２）と本件新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）との塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ａ＊２４０２のアミノ酸配列上の、１１４番目のアミノ酸がヒスチジンからグルタミンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸へと置き換わっている場合が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】既知のアリル（Ａ＊２４０２）とＨＬＡ新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（Ａ＊２４０２）とＨＬＡ新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）とのアミノ酸配列の比較。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下、ＨＬＡと略す）の新規アリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病（Graft-Versus-Host Disease））が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡの型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは、抗体を用いて行われる血清学的手法であった。近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがある。コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２４に含まれる遺伝子型は２００６年１月の時点で、６６種類が報告されており、一部の地域を除き、最も頻度が高い遺伝子型はＡ＊２４０２であるとされている（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成１８年２月１日検索]、インターネット＜URL：http://www.allelefrequencies.net＞
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプのひとつであるＡ２４に含まれる新規アリルを提供することにある。
【０００８】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、Ａ＊２４０２が陽性となるプローブすべてに反応し、別のプローブにも陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ新規アリルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ新規アリルを提供するものである。
【００１１】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明による新規アリルは下記のようにして得られたものである。
ＤＮＡタイピング法の１つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社のｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）を用いてＨＬＡ−Ａ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液と口腔内粘膜スワブより抽出した２種類のＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応が示されなかった。これらの検体では、遺伝子型がＡ＊２４０２ホモ接合の場合に陽性となるプローブセットに加えて、３プローブにおいて陽性反応が見られた。
【００１３】
これらの検体について、同じ試薬を用いて再タイピングを行ったところ、Ａ＊２４０２以外の反応を示した３種類のプローブは、全て１１４番目のアミノ酸付近（エクソン３の５’末端寄り）にある２０塩基程度の領域に設定されており、Ａ＊３１などのアリルで陽性となるプローブの一部であるが、この領域以外に設定されたプローブは陽性反応を示さなかった。
【００１４】
ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりこの領域の配列を確認した。エクソン３の上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、この領域内の２箇所の塩基について、それぞれ異なる２種類の塩基の存在を示す両峰性のピークが検出され、この検体がＡ＊２４０２とＡ＊２４０２のエクソン３に未知の変異を持つアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００１５】
配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ａ抗原遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ａ抗原のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、血液由来の検体より得られた１３クローン、スワブ由来の検体より得られた１０クローンのプラスミドについて配列を確認した。
【００１６】
その結果、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２が１０クローン、ＨＬＡ−Ａ以外の遺伝子が８クローン見つかった他、ダイレクトシークエンシング法で変異が示唆された２塩基に変異が存在するＡ＊２４０２の変異型が５クローン見つかった。
【００１７】
この遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＡ＊２４０２の配列のエクソン３内に２箇所の変異を確認した。これらの変異は、図２に示す１１４番目のアミノ酸がヒスチジンからグルタミンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸へとアミノ酸が置き換わる非同義置換であった。Ａ２４に含まれる遺伝子型の中ではこれら二箇所のアミノ酸は共有されている。また、１１４番目、１１６番目のアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置している。
【００１８】
このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ａ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ａ＊２４０２と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ａ＊２４０２Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があるので、臓器移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ａ＊２４６２」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを、「Ａ＊２４０２Ｖ」または「Ａ＊２４６２」のいずれかで表示する。
【００１９】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、本発明によるＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質が提供される。本発明によるＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質も、アリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ａ＊２４０２）と本件新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）との塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ａ＊２４０２のアミノ酸配列上の、１１４番目のアミノ酸がヒスチジンからグルタミンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸へと置き換わっている場合が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】既知のアリル（Ａ＊２４０２）とＨＬＡ新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（Ａ＊２４０２）とＨＬＡ新規アリル（Ａ＊２４０２Ｖ）とのアミノ酸配列の比較。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ新規アリル。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ新規アリル。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有する、タンパク質。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング方法。
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ新規アリル。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ新規アリル。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＬＡ新規アリルでコードされるペプチドを有する、タンパク質。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ａ抗原のタイピング方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２２８９６５（Ｐ２００７−２２８９６５Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５２９３（Ｐ２００７−２５２９３）
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
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