Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性疾患のためのキメラワクチン
【課題】Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する特異的でかつ制御性の免疫応答を惹起するワクチン候補物を開発すること。
【解決手段】キメラタンパク質であって、ＰｉｌＡの一部分およびＬＢ１ペプチドの一部分を含む、キメラタンパク質。本発明は、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡを含むキメラタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の１またはそれより多くのキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【解決手段】キメラタンパク質であって、ＰｉｌＡの一部分およびＬＢ１ペプチドの一部分を含む、キメラタンパク質。本発明は、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡを含むキメラタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の１またはそれより多くのキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年７月８日に出願した米国仮出願第６０／６９７，６４２号および２００６年５月１９日に出願した米国仮出願第６０／８０１，８３５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５タンパク質の一部分を提示するＮＴＨｉ単収縮ピリ線毛（ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ ｐｉｌｕｓ）主要サブユニットタンパク質（ＰｉｌＡ）を含むキメラタンパク質に関する。本発明は、このキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳感染についての臨床用語は中耳炎（ＯＭ）である。非特許文献１によれば、ＯＭは、健康管理を受ける病気の小児、および抗生物質を受けるかまたは全身麻酔を受ける米国の小児についての最も一般的な理由である。統計は、１９９０年にはＯＭについて２４５０万人の内科医院の訪問者があったことを示す。これは、１９８０年代に報告されたのよりも２００％より高く増加していることを示す。死亡と関連することは稀であるとはいえ、ＯＭに関連した死亡は重大である。難聴は、この疾患と関連した一般的な問題であり、しばしば、小児の行動、教育および言語習熟の発達に影響を与える（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＯＭの社会経済的な影響もまた大きく、ＯＭの診断および管理の直接的費用および間接的費用は、米国だけでも毎年５０億ドルを超える（非特許文献５）。
【０００４】
ＯＭは、感染性要因、環境要因および宿主の遺伝学的要因から生じると考えられている。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのような細菌は、ＯＭにおいて最も一般的な感染性生物体である。急性ＯＭは、中耳における炎症の徴候および症状の迅速な発症および短期間の持続期間によって特徴付けられる疾患であり、他方、慢性ＯＭとは、中耳における比較的無症候性の流体（または滲出液）の存在によって定義される病的状態をいう。しかし、慢性ＯＭにおいては、急性感染の特定の徴候（すなわち、耳の疼痛または発熱）が存在しないにもかかわらず、これらの異常な中耳液は、３ヶ月間を超える期間にわたって持続し得る。抗生物質治療による急性ＯＭの処置が一般的であるが、ＯＭの原因となる３つの属全ての細菌において、多剤耐性細菌が出現している。慢性ＯＭの外科的管理は、小児では全身麻酔下をかけた状態での、耳の鼓膜を通しての中耳腔換気用チューブの挿入を含む。この手順はごく普通であり（罹患率は、米国において１年あたり挿入されるチューブが約１００万本である；非特許文献６）、そして蓄積した流体を中耳から排出することにより有痛症状を軽減することに関しては非常に有効であるが、これは侵襲性であり、さしせまった危険性がある（非特許文献７；非特許文献６；Ｃｉｍｏｎｓ，ＡＳＭ Ｎｅｗｓ，６０：５２７−５２８；非特許文献８）。従って、ＯＭの管理、好ましくはＯＭの予防に対するさらなるアプローチが必要とされている。
【０００５】
ＯＭワクチンの開発はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて最も進んでいる。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、７価莢膜結合体ワクチンＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）の近年の承認および発売により証明されたように、急性ＯＭ（ＡＯＭ）の主な原因因子である（非特許文献９）。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は侵襲性の肺炎球菌の疾患に関しては非常に有効であるが、ＯＭに関する適用範囲は、ワクチンに含まれていない血清型に起因するＯＭ症例数の増加が報告されており、失望されている（６〜８％）（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、上記のように、ＯＭにおいて役割を果たすグラム陰性細菌である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの臨床単離体は、それぞれ、型特異的多糖莢膜がその細菌に存在するかまたは存在しないかに依存して、「ａ」〜「ｆ」のいずれかとして、または分類不能型として分類される。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型についてのワクチンが開発されている。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）と同様に、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチンは、この生物体の多糖莢膜を標的とし、それゆえ、このワクチンは、タンパク質キャリアに結合した莢膜多糖から構成される。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）またはｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチンのいずれも、ＯＭを含めたＮＴＨＩ誘発性気道疾患に対しては効力を有さない。分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）のためのワクチンに関しては、ほとんど進んでいない。ＮＴＨｉは、小児における急性ＯＭのうちの約２０％を引き起こし、そして滲出液を有する慢性ＯＭにおいて優勢である（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。ＮＴＨｉはまた、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、心膜（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｓ）、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｔｉｖｉｔｉｓ）、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｔａｓｉｓ）および嚢胞性線維症）の増悪を引き起こし得る。基本型のＮＴＨｉ単離体は、継代数の少ない単離体８６−０２８ＮＰである。８６−０２８ＮＰは、慢性ＯＭを有する小児から回収された。この株は、インビトロにおいて（非特許文献１７；非特許文献１８）、ならびにチンチラＯＭモデルにおいて（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）、充分に特徴付けられている。ＮＴＨｉの８６−０２６ＮＰ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１０月１６日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ−４７６４が割り当てられた。８６−０２８ＮＰ株のゲノムからのコンティグのセットは、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓのウェブサイトにおいて見出され得る。
【０００７】
付着およびコロニー形成は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性疾患の病因において認められる最初の段階である。それゆえ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、赤血球凝集性のピリ線毛、線毛および非線毛性付着因子を含めた複数の付着因子を発現する（非特許文献２２；非特許文献２３；および非特許文献２４）。特に、記載された付着因子はいずれも、運動性機能とはこれまで関連付けられていない。さらに、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、運動性とも関連する鞭毛を発現しない。単収縮運動性は、水分のある表面上での鞭毛非依存性形態の細菌の移動であり、ＩＶ型ピリ線毛として公知の極構造体の伸長、係留、次いで収縮によって起こる（非特許文献２５；非特許文献２６；Ｗｏｌｆｇａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯＪ．，１９，６４０８−６４１８，；非特許文献２７）。ＩＶ型ピリ線毛は、代表的には直径５〜７ｍｍであり、長さは数マイクロメートルであり、１ターンあたり約５サブユニットのらせんコンホメーションへと組み立てられる、１つのタンパク質サブユニットから構成される（非特許文献２８；非特許文献２９）。ＩＶ型ピリンのサブユニットは、通常、１４５〜１６０アミノ酸長であり、グリコシル化されてもよく、またはリン酸化されてもよい。２つのクラスのピリンサブユニット（ＩＶａ型およびＩＶｂ型）が存在する。これらは、リーダーペプチドおよび成熟サブユニットの平均長、どのＮ−メチル化アミノ酸が成熟タンパク質のＮ末端位置を占めるか、およびＤ領域（ジスルフィド領域にちなむ）の平均長によって互いに区別される。呼吸器病原体の大部分は、ＩＶａクラスのピリンを発現し、一方、腸病原体は、クラスＩＶｂピリンをより代表的に発現する。ＩＶａ型ピリ線毛は、高度に保存された疎水性Ｎ末端メチル化フェニルアラニンの存在によって識別される。
【０００８】
ＩＶ型ピリ線毛は、迅速移動手段および新たな表面のコロニー形成手段として役立つ。従って、ＩＶ型ピリ線毛の発現は、多くの細菌による付着およびバイオフィルム形成の両方（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３）にとって、ならびにとりわけ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのビルレンスにとって、重要である（非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３４；非特許文献３５）。バイオフィルムは、エクソポリサッカリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）または他の物質から構成される、細菌によって排出されたマトリックスを介して表面に係留された複雑な構成の細菌である。このマトリックスは細菌を覆い、そして人の免疫系から細菌を保護する。非特許文献３６は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅによるバイオフィルム形成を記載する。ＩＶ型ピリ線毛と人の身体との間の相互作用をブロックすることにより、細菌感染を回避または停止させ得ると仮定されている（２００１年７月３１日に発行されたＭｅｙｅｒらの特許文献１）。
【０００９】
ＩＶ型ピリ線毛の発現は、複雑で高度に調節された細菌機能である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおいては、ＩＶ型ピリ線毛の生物合成および機能は、４０個を超える遺伝子によって制御される（非特許文献３５）。今日まで、極めて多数の関連するＩＶ型ピリ線毛遺伝子のうちのごくわずかのセブセット（非特許文献２６；非特許文献３７）しか、ＨＡＰ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）科の数種のメンバーにおいては見出されていない（非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０）が、ＩＶ型ピリ線毛の発現も単収縮運動のいずれもこれまでのところ、あらゆるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離株について記載されていない。実際、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、Ｒｄ株ゲノム内での潜在的遺伝子クラスターの存在（非特許文献４１）にもかかわらず、これらの構造を発現しない細菌であると古典的に記載されている（非特許文献４２；非特許文献４３）。Ｒｄ株は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血清型ｄ生物体の非被包性誘導株である（非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）。Ｒｄ株はいくつかのビルレンス特性を有するが、血清型ｄの株は一般に、片利共生であると考えられる；これらは、疾患を頻繁には引き起こさない（非特許文献４７）。それゆえ、それゆえ、疾患を引き起こす株のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＲｄ株とを識別することが重要である。
【００１０】
線毛は、分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ上で見出される表面の付属器であり、慢性中耳炎を有する小児の中耳および鼻咽頭領域から回収された１００％の細菌によって産生される。分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの線毛に由来する糸状タンパク質であるフィンブリンから構成されるワクチンが以前に開発された。それは、中耳炎の研究、予防または重篤度の軽減に有用である。しかし、細菌外膜からフィンブリンタンパク質を単離する既存の方法論は、退屈で時間がかかる。同様に、他の宿主ベクター中のフィンブリン遺伝子によって発現されるフィンブリンの精製もまた、フィンブリンタンパク質と宿主ベクターの外膜タンパク質との間での相同性に起因して退屈である。
【００１１】
ＬＢ１と示され、特許文献２において記載されている合成キメラワクチン候補物は、２匹の齧歯動物宿主において、複数の前臨床ワクチン試験においてすさまじい効力を示した。この合成ペプチドは、麻疹ワクチンの融合タンパク質由来のＴ細胞無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）エピトープと共線的に合成されたＰ５−フィンブリンのＢ細胞エピトープを含む。ＬＢ１ペプチドは前臨床試験において有効であることが示されているが、非常に若い小児における使用が意図されるＴ細胞無差別エピトープを含むワクチンを試験および販売する能力についての懸念が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，２６８，１７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８４３，４６４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２−Ｓ８，２０００
【非特許文献２】Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ，１４：６０１−６０４，１９９３
【非特許文献３】Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ Ｓｕｐｐｌ．，１６３：５９−６１，１９９４
【非特許文献４】Ｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６２：６８５−６９４，１９９０
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，１６：Ｓ９−１１，１９９７
【非特許文献６】Ｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８３（７）：１０２６−８，１９９３
【非特許文献７】Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９３（３）：３５３−６３，１９９４
【非特許文献８】Ｐａａｐ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３０（１１）：１２９１−７，１９９６
【非特許文献９】Ｅｓｋｏｌａ ａｎｄ Ｋｉｌｐｉ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１６：Ｓ７２−７８，２０００
【非特許文献１０】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１９：１８７−１９５，２０００
【非特許文献１１】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１９：Ｓ７２−７８，２０００
【非特許文献１２】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，３４４：４０３−４０９，２００１
【非特許文献１３】Ｓｎｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｏｔｏｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．，２３：１−２，２００２
【非特許文献１４】Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（５），１７１６−１７２２，１９９１
【非特許文献１５】Ｋｌｅｉｎ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１６，Ｓ５−８，１９９７
【非特許文献１６】Ｓｐｉｎｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５４，１００−１０９，１９８６
【非特許文献１７】Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５３：３３１−５，１９８８
【非特許文献１８】Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２３：１５７−６６，１９９７
【非特許文献１９】Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−６１，１９９７
【非特許文献２０】Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−８，１９９４
【非特許文献２１】ＤｅＭａｒｉａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：５１８７−９２，１９９６
【非特許文献２２】Ｇｉｌｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ３９，３４３−３４８，１９９６
【非特許文献２３】Ｇｉｌｓｄｏｒｆ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５，２９９７−３００２，１９９７
【非特許文献２４】Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩ，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４，１９１−２００，２００２
【非特許文献２５】Ｂａｒｄｙ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，２９５−３０４，２００３
【非特許文献２６】Ｔｏｎｊｕｍ ａｎｄ Ｋｏｏｍｅｙ，Ｇｅｎｅ，１９２，１５５−１６３，１９９７
【非特許文献２７】Ｍａｔｔｉｃｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，２８９−３１４，２００２
【非特許文献２８】Ｂａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，２９５−３０４，２００３
【非特許文献２９】Ｗａｌｌ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３２，１−１０，１９９９
【非特許文献３０】Ｍａｔｔｉｃｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，２８９−３１４ ２００２
【非特許文献３１】Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ａｎｄ Ｋｏｌｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３０，２９５−３０４，１９９８
【非特許文献３２】Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５０，６１−６８，２００３
【非特許文献３３】Ｊｅｓａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，４３２９−４３３９，２００３
【非特許文献３４】Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４８，１５１１−１５２４，２００３
【非特許文献３５】Ｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｌｏｒｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４７，５６５−５９６，１９９３
【非特許文献３６】Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ，ＪＡＭＡ，２８７（１３），１７１０−１７１５（２００２）
【非特許文献３７】ＤａｒｚｉｎｓおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，１９２，１０９−１１５，１９９７
【非特許文献３８】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９２，１２１−１３４，２００３
【非特許文献３９】Ｄｏｕｇｈｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７２，７９−９０，２０００
【非特許文献４０】Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５，４０１−４０９ １９９９
【非特許文献４１】Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，４９６−５１２，１９９５
【非特許文献４２】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９，３６９５−３７００，２００３
【非特許文献４３】Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９２，１２５−１３４，１９９７
【非特許文献４４】Ｚｗａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４２，７０８−７１５，１９８３
【非特許文献４５】Ｂｅｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｇｏｏｄｇａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７０，４１１−４２２，１９７２
【非特許文献４６】Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６１，１７１−１８０，１９９９
【非特許文献４７】Ｄａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５２，２７７−２８２，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それゆえ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する特異的でかつ制御性の免疫応答を惹起するワクチン候補物を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）のＩＶ型ピリ線毛主要サブユニットタンパク質（ＰｉｌＡ）の一部およびＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５タンパク質（Ｐ５−フィンブリン、フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５−相同付着因子ともいう）の一部を含むキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡを含むキメラタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の１またはそれより多くのキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【００１６】
ＬＢ１ペプチドは、４０アミノ酸の合成キメラＰ５−フィンブリン由来ペプチド（配列番号５３）であり、ＮＴＨｉに対する免疫原性応答を誘導し、退屈な精製技術を必要としないので、有利である。ＬＢ１ペプチドは、Ｂ細胞エピトープ（配列番号４）であるＮ末端１９アミノ酸のペプチドを含む。このＢ細胞エピトープは、ＯＭＰ Ｐ５（Ｐ５−フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５相同付着因子ともいわれる）と示されるＮＴＨｉの外膜タンパク質（フィンブリン）の予測された表面露出ループ３から誘導された。ＬＢ１ペプチドは、短い５マーのリンカーペプチドおよび１６残基のＴ細胞無差別エピトープをさらに含む。このＴ細胞エピトープは、麻疹ウイルスの融合タンパク質から誘導された。このＴ細胞無差別エピトープは、このエピトープに曝露された個体において、非常に強いＴ細胞応答を誘導する。
【００１７】
本発明は、ＬＢ１ペプチドの一部分またはフラグメントを、Ｂ細胞応答誘導の有効性を低減しない、より安全でかつ選択的なキャリアタンパク質へと挿入することを意図する。好ましくは、ＬＢ１ペプチドの一部分は、それ自体もまたＮＴＨｉ誘発性疾患に対する防御を付与するキャリアへと挿入される。ＮＴＨｉ誘発性疾患に対する防御を誘導し得る１つのこのようなキャリアは、ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）としても公知のＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛（単収縮ピリ線毛）タンパク質を含むタンパク質である。ＰｉｌＡタンパク質は、ｐｉｌＡ遺伝子（配列番号１）によってコードされる。
【００１８】
本発明は、ＬＢ１ペプチドを提示して免疫原性応答を誘導するための、ＬＢ１ペプチドの一部分を含むキメラタンパク質を提供する。本発明は、１２〜３５アミノ酸であるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを、より好ましくは１５〜３０アミノ酸であるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを、最も好ましくは１８〜１９アミノ酸でありフィンブリンタンパク質のサブユニットであるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを意図する。ＬＢ１ペプチドの好ましい部分は、Ｎ末端アミノ酸配列ＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧ（配列番号４）である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、キメラタンパク質を提供し、ここで、ＰｉｌＡタンパク質は、２４アミノ酸のペプチドを提示するように改変される。２４アミノ酸のペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列（ＬＶＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧＲＨＴ）中に設定されるように改変されたＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを含み得、ここで、ロイシンおよびバリンが、ＬＢ１のＢ細胞エピトープのＮ末端に付加されており、そしてアルギニン、ヒスチジンおよびトレオニンがＬＢ１のＢ細胞エピトープのＣ末端に付加されている。Ｂ細胞エピトープに対するこれらの改変は、タンパク質の折り畳みおよび／または抗原提示を補助することが意図される。本発明はさらに、タンパク質の折り畳みおよび／または抗原提示を補助する、ＬＢ１のＢ細胞エピトープに対する任意の改変を意図する。
【００２０】
ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５の表面に露出したループ３のアミノ酸配列は、ＮＴＨｉ株毎に変化し得る。本発明は、ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５のループ３の任意の改変体アミノ酸配列のＢ細胞エピトープを提示するように改変された、ＰｉｌＡタンパク質の一部分を含むキメラタンパク質を意図する。特に、本発明は、キメラタンパク質を提供し、ここで、ＰｉｌＡタンパク質は、以下の改変体ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５アミノ酸配列のうちの１つを提示するように改変されている：ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＳＮＳＴＬＫＮＬＧＥ（配列番号６）、ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＴＬＫＤＬＧＥ（配列番号７）およびＲＳＤＹＫＦＹＤＮＫＲＩＤ（配列番号８）。これらの改変体ペプチドはまた、ロイシンおよびバリンをＮ末端に付加し、アルギニン、ヒスチジンおよびトレオニンをＣ末端に付加して、またはタンパク質の折り畳みおよび／もしくは抗原提示を補助する任意の他の改変を行って提示され得る。
【００２１】
本発明のキメラタンパク質は、改変ＰｉｌＡアミノ酸を含み、ここで、ネイティブなＰｉｌＡアミノ酸は、ＬＢ１ペプチドの一部分によって置換されている。さらに、本発明のキメラタンパク質は、改変ＰｉｌＡアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、ネイティブＰｉｌＡアミノ酸に加えて、その中に挿入されている。本発明のキメラタンパク質は、２つのタンパク質に対する抗体形成を誘導する能力を有し、それゆえ、より有効でかつより特異的なワクチン候補物である。
【００２２】
１つの実施形態では、これらのキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜残基１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号２の６２位のシステイン残基と７２位のシステイン残基との間に挿入されており、そしてネイティブアミノ酸配列と置き換わり得る（例えば、配列番号５４のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質）。このキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そして配列番号２の残基６２と残基７２との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）を有する。別の実施形態では、ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号２の１３１位のシステイン残基と１４４位のシステイン残基との間に挿入され、そしてネイティブアミノ酸と置き換わり得る（例えば、配列番号５５のアミノ酸配列を有するタンパク質）。このキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜１４９を含み、そして配列番号２の残基１３１と残基１４４との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）を有する。
【００２３】
別の実施形態では、このキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、ＰｉｌＡタンパク質のＣ末端に挿入されている。例えば、配列番号５６のキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そしてＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）が配列番号２の残基１４９の後ろに挿入されている。
【００２４】
別の実施形態では、このキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜残基１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分がＰｉｌＡタンパク質のＮ末端に挿入されている。例えば、配列番号５７のキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そしてＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）が配列番号２の残基４０の前に挿入されている。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分および本明細書中に記載されるＬＢ１ペプチドのうちの１つまたはそれより多くを含むキメラタンパク質を提供する。本発明のキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分内に同じＬＢ１ペプチドを１回より多く提示するもの、およびＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分内に２つまたはそれより多くの異なるＬＢ１ペプチドを提示するものを包含する。
【００２６】
本発明はさらに、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分および免疫応答を惹起する任意の抗原性タンパク質を含むキメラタンパク質を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下のタンパク質、方法などが提供される：
（項目１）
キメラタンパク質であって、ＰｉｌＡの一部分およびＬＢ１ペプチドの一部分を含む、キメラタンパク質。
（項目２）
前記ＬＢ１ペプチドの一部分が、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを含む、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）
前記ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む、項目２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目６）
項目５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目７）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目８）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質に特異的に結合する、抗体。
（項目９）
項目８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１０）
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を惹起するための方法であって、免疫原性用量の項目１〜４のいずれか１項に記載の１以上のキメラタンパク質を、ＮＴＨｉ細菌感染の危険性がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１）
前記ＮＴＨｉ感染が、中耳においてである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ＮＴＨｉ細菌感染を処置または予防する方法であって、項目８に記載の抗体を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３）
前記ＮＴＨｉ感染が、中耳においてである、項目１２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例５に記載される効力実験に関する免疫レジメン、ウイルス接種、細菌チャレンジおよびＯＭ疾患の評価期間のタイムラインを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（本発明のＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛（ＰｉｌＡ）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明のキメラタンパク質は、ｐｉｌＡ遺伝子によってコードされる、ＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛の主要サブユニットの全長または一部分を含み得る。ＮＴＨｉ単離株８６−０２８ＮＰのＰｉｌＡタンパク質は、配列番号２として示される核酸配列によってコードされる。配列番号２は、米国特許出願第１１／０１９，００５号中に記載される。米国特許出願第１１／０１９，００５号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。また提供されるのは、ＮＴＨｉの臨床単離株１７２８ＭＥＥ、１７２９ＭＥＥ、３２２４Ａ、１０５４８ＭＥＥ、１０６０ＭＥＥ、１８８５ＭＥＥ、１７１４ＭＥＥ、１２３６ＭＥＥ、１１２８ＭＥＥおよび２１４ＮＰ由来のＰｉｌＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。これらのＰｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２に示される。代替的なコドン使用法の可能性が、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて特に意図される。１つの実施形態では、これらのポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１に示されるヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。
【００２９】
本発明は、ストリンジェントな条件下で以下にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１に示されるヌクレオチド配列の相補体；（ｂ）上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｃ）上記のタンパク質のうちのいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；または（ｄ）本発明のポリペプチドの特定のドメインまたは短縮物を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株由来の、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのａ株、ｂ株、ｃ株、ｅ株およびｆ株由来のＰｉｌＡポリヌクレオチドが特に意図される。これらのポリヌクレオチドは、それぞれ、プローブまたはプライマーとして配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１のポリヌクレオチドの一部分または全てを用いて、当該分野において標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応）によって同定および単離され得る。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドに実質的に均等なヌクレオチド配列を包含する。本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％の、より代表的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％の、さらにより代表的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を、上記のＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して有し得る。
【００３１】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１のＮＴＨｉヌクレオチド配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、このフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きく、好ましくは７ヌクレオチドより大きく、より好ましくは９ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは１７ヌクレオチドよりも大きい。例えば、選択的である（すなわち、本発明のＰｉｌＡポリヌクレオチドのうちのいずれか１つに対して特異的にハイブリダイズする）、１５ヌクレオチド、１７ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドまたはそれより大きなヌクレオチドのフラグメントが意図される。本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズし得るこれらの核酸配列フラグメントは、本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして用いられ得るか、そして／または本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドを他の細菌遺伝子から識別し得、そして好ましくは独特なヌクレオチド配列に基づく。
【００３２】
用語「ストリンジェント」は、本明細書中では、当該分野においてストリンジェントと通常理解される条件をいうために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、６５〜６８℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または４２℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
【００３３】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた使用され得るが、ハイブリダイゼーション速度が影響される。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する例では、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴについて）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄が挙げられる。
【００３４】
他の薬剤もまた、非特異的ハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを減らすことを目的として、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ））、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）およびデキストラン硫酸であるが、他の適切な薬剤もまた使用され得る。これらの添加剤の濃度およびタイプは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、ｐＨ６．８〜７．４において通常実施されるが、代表的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーション速度はｐＨとはほぼ独立している。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適合させるために、そして異なる配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者によって調整され得る。
【００３５】
上記のように、本発明によって意図されるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１の特定のＰｉｌＡポリヌクレオチドに限定されないが、例えば、それらの対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションをも包含する。対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションは、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１中に提供される配列（好ましくはそれらの中のオープンリーディングフレーム、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１内のオープンリーディングフレームに対して少なくとも９０％同一の（好ましくは９５％同一の）ヌクレオチド配列）を、同種または別種の別の単離株由来の配列と比較することによって慣用的に決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるがこれに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，前出）から公に入手され得る。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用しても、同一性を決定し得る。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離されてもよく、または標準的な化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１０３：３１８５（１９８１）において記載されるホスホトリエステル法）によって合成されてもよい。
【００３７】
本発明は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分を含むキメラタンパク質を提供する。１つの実施形態では、これらのポリペプチドは、配列番号２においてそれぞれ示される、ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２に示されるＰｉｌＡポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態では、本発明のＰｉｌＡポリペプチドは、他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のものおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのａ株、ｂ株、ｃ株、ｅ株およびｆ株由来のものである。
【００３８】
本発明のポリペプチドとしては、本発明の全長ポリペプチドの１つまたはそれより多くの生物学的特性または免疫学的特性を保持する、ＰｉｌＡポリペプチドのペプチドフラグメント（すなわち、ペプチド）またはフラグメントが特に挙げられる。１つの実施形態では、本発明によって提供されるＰｉｌＡペプチドフラグメントは、ＴｆｐＱ２、ＴｆｐＱ３、ＴｆｐＱ４およびＯＬＰ３と命名され、そしてそれぞれ、配列番号２のアミノ酸３５〜６８、配列番号２のアミノ酸６９〜１０２、配列番号２のアミノ酸１０３〜１３７、および配列番号２のアミノ酸２１〜３５を含む。本発明によって提供される別のＰｉｌＡペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸４０〜１４９を含む。
【００３９】
本発明はまた、ＰｉｌＡポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性に影響を与えない１つまたはそれより多くの保存的アミノ酸置換を有する、ＰｉｌＡポリペプチドの一部分を含むキメラタンパク質を提供する。あるいは、本発明のＰｉｌＡポリペプチドは、生物学的活性を変えてもよくまたは変えなくてもよい、保存的アミノ酸置換を有することが意図される。用語「保存的アミノ酸置換」とは、ネイティブなアミノ酸残基を、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどまたは全く影響がないように非ネイティブ残基（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を包含する）で置換することをいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基を任意の他の非極性残基で置換することによる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」の方法に従ってアラニンで置換され得る。天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖に基づいて以下のとおりに特徴付けられる：塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アルパラギン酸；非荷電で極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン；および非極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換についての一般則を以下の表１に示す。
【００４０】
【表１】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリペプチドの改変体の一部分を含み、生物学的活性および／または免疫学的活性を保持する、キメラタンパク質（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、代表的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、より代表的には少なくとも約９８％、または最も代表的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を、配列番号２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２のポリペプチドに対して示すポリペプチド）を提供する。
【００４１】
本発明は、本発明のＰｉｌＡポリヌクレオチドが増幅または発現用のベクター中に挿入され得ることを意図する。発現のために、これらのポリヌクレオチドは、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列）に作動可能に連結される。さらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。例示的な原核生物宿主細胞としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｅｒｒａｔｉａ）が挙げられる。宿主細胞を増殖させ、そして宿主細胞または増殖培地からポリペプチドを単離することによって本発明のポリペプチドを産生する方法が特に意図される。あるいは、本発明のポリペプチドは、標準的な手段を用いて化学合成によって調製され得る。特に便利であるのは、固相技術（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２５５を参照のこと）である。自動固相合成機は市販されている。さらに、配列中の改変が、適切な残基の置換、付加または省略によって容易に作製される。例えば、システイン残基がカルボキシ末端に付加されて、キャリアタンパク質への便利な結合のためにスルフヒドリル基が提供されてもよく、またはスペーサーエレメント（例えば、さらなるグリシン残基）が、Ｃ末端の連結アミノ酸とペプチドの残りの部分との間に配列中に組み込まれてもよい。
【００４２】
用語「単離された」とは、その物質が天然に存在する環境中の他の成分から取り出されており、そして本質的にその他の成分を含まない物質をいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞性タンパク質から分離されるか、またはＤＮＡは、それが天然で存在するゲノム中でそれと隣接している他のＤＮＡから分離される。
【００４３】
組換えＰｉｌＡタンパク質（ｒＰｉｌＡ）は、より容易に更新可能な生成物として役立たせるために生成され得る。これを行うために、Ｋｅｉｚｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２４１８６−１４１９３，２００１）の公開されたプロトコルを利用する。Ｋｅｉｚｅｒらは、ネイティブなピリンサブユニットの機能的特性を保有するようにｒＰｉｌＡが同様に適切に折り畳まれることが重要であるので、ピリン（これもまた、４つのＣｙｓ残基を有する）を研究した。手短に述べると、短縮されたピリンが操作され、ここで、凝集を防ぐために最初の２８残基がＮ末端から除去され、そしてこの短縮化ピリンは、構築物中にＯｍｐＡリーダー配列を組み込むことにより、ペリプラズムへと輸送されるようにさらに操作される。このストラテジーを用いて、Ｋｅｉｚｅｒらは、組換え可溶性モノマーＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａピリンタンパク質を生成した。このピリンタンパク質は、そのレセプター（アシアロＧＭ１）にインビトロアッセイで結合し得、そしてこのペプチドを異種チャレンジの１５分前に送達した場合、マウスにおける罹患率および死亡率を減少させ得た。この可溶性でモノマーの短縮形態のＮＴＨｉ ＰｉｌＡは、本明細書中に記載される研究において有用である。
【００４４】
本発明はまた、合成キメラタンパク質を提供する。これらのキメラタンパク質は、標準的な技術を用いて合成、精製および配列決定され得る。例えば、これらのキメラタンパク質は、段階的Ｆｍｏｃ−ｔｅｒｔ−ブチル固相合成によって半ば手動で集合させられ得、そしてＨＰＬＣによって精製され得る。組換えキメラタンパク質および合成キメラタンパク質の組成およびアミノ酸配列は、アミノ酸分析および／または質量スペクトル分析により確認され得る。
【００４５】
（抗体）
本発明は、本発明のキメラタンパク質の抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの独特のエピトープに対するそれらの結合能力を保持した抗体フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単鎖抗体およびヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗体は、本発明のキメラタンパク質または本発明のキメラタンパク質を発現する宿主細胞を抗原として用いて、当該分野で標準的な技術によって作製され得る。
【００４６】
本発明は、本発明のキメラタンパク質およびそれらのフラグメントに特異的な抗体を提供し、この抗体は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺傷する能力およびヒトを感染から防御する能力の両方を示す。本発明はまた、本発明のキメラタンパク質に特異的な抗体を提供し、この抗体は、ビルレンスを低減し、付着を阻害し、バイオフィルム形成を阻害し、単収縮運動性を阻害し、細胞分裂を阻害し、そして／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への透過を阻害し、そして／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の食作用を増強する。
【００４７】
インビトロでの補体媒介性殺細菌アッセイ系（Ｍｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４，１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８，１９７２）を用いて、抗キメラタンパク質抗体の殺細菌活性を測定し得る。
【００４８】
本発明のキメラタンパク質に対して予め形成された抗体の投与による受動免疫療法によって短期防御を宿主に付与することもまた可能である。従って、本発明の抗体は、受動免疫療法において用いられ得る。ヒト免疫グロブリンは、ヒトの医薬において好ましい。なぜなら、異種の免疫グロブリンは、その外来免疫原性成分に対して免疫応答を惹起し得るからである。このような受動免疫は、特別な危険性に曝される未免疫の個体の迅速な防御に関して緊急時に用いられ得る。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生において用いられ得、この抗イディオタイプ抗体は次いで、このキメラタンパク質エピトープまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅエピトープに対する免疫応答を刺激するための抗原として用いられ得る。
【００５０】
（免疫応答を惹起するための方法およびそれらのための組成物）
本発明は、個体におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を個体において惹起する方法を意図する。特定の実施形態では、これらの方法は、本発明のキメラタンパク質に対する免疫応答を惹起する。これらの方法は、１つまたはそれより多くの免疫応答を惹起し、これらの応答としては、細菌複製を阻害する免疫応答、細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着をブロックする免疫応答、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの単収縮を予防する免疫応答、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺傷する免疫応答およびバイオフィルム形成を防御する免疫応答が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。別の実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質を発現する細胞を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。なお別の実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質をコードする１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。これらのポリヌクレオチドは、他のあらゆる核酸と会合していない裸のポリヌクレオチドであってもよく、またはプラスミドもしくはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）のようなベクター中に存在してもよい。これらの方法は、１個体において組み合わせて用いられ得る。これらの方法は、個体のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染の前または感染後に用いられ得る。本発明の方法および組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類可能型（ｔｙｐｅａｂｌｅ）株および分類不能型株）に関連する任意の病理学的状態（例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）、心膜、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症および慢性閉塞性肺疾患および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症）の悪化を処置または予防するために用いられ得る。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物は、プライミング用量として投与され、続いて１またはそれより多くの追加免疫用量として投与される。免疫を有益に増強するタンパク質またはポリペプチド（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘発性分子（例えば、Ｌｅａｆ）または補助刺激分子）の共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）もまた意図される。
【００５２】
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与後に、投与前に検出可能な免疫応答と比較して、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、検出可能な体液性（抗体）免疫応答および／または細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を生じる用量である。本発明は、これらの方法によって得られる免疫応答が防御性および／または治療性であり得ることを意図する。好ましい実施形態では、この抗体および／またはＴ細胞免疫応答は、個体をＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染（特に、中耳および／または鼻咽頭もしくは下気道の感染）から防御する。この用途では、正確な用量は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者１人あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、より一般的には体重７０ｋｇあたり約１０μｇ〜約５００μｇの範囲に及ぶ。
【００５３】
体液性免疫応答は、多くの周知の方法（例えば、単放射状免疫拡散アッセイ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｒａｄｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＳＲＩＤ）、酵素免疫アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）および赤血球凝集阻害アッセイ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＨＡＩ））によって測定され得る。特に、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含むゲル（例えば、アガロース）の層を利用する。このゲル中にウェルが切り出され、そして試験される血清がそのウェル中に配置される。ゲルへの抗体の拡散により沈降環が形成され、その沈降環の面積は、試験される血清中での抗体濃度に比例する。ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）としても公知）は、サンプル中の抗体の合計を決定するために用いられる。この免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。この試験血清は、プレートに曝露され、続いて酵素結合免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に曝露される。このプレートに付着した酵素活性は、任意の便利な手段（例えば、分光測光法）によって定量され、そして試験サンプル中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、免疫原（例えば、ウイルスタンパク質）のニワトリ赤血球（など）凝集能力を利用する。このアッセイは、中和抗体（すなわち、赤血球凝集を阻害し得る抗体）を検出する。試験血清の希釈物は、標準濃度の免疫原とともにインキュベートされ、続いて赤血球が添加される。中和抗体の存在は、免疫原による赤血球の凝集を阻害する。細胞性免疫応答を測定する試験としては、遅延型過敏症の決定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖応答の測定が挙げられる。
【００５４】
本発明は、本発明のキメラタンパク質に対する免疫応答を惹起するために適切な組成物を対応して提供する。上記のように、これらの組成物は、１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質、１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質を発現する細胞、または１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質をコードする１つもしくはそれより多くのポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、他の成分（例えば、キャリアおよびアジュバント）も含み得る。
【００５５】
本発明の組成物では、キメラタンパク質は、組換え法によって産生される場合、別のタンパク質に融合され得る。１つの実施形態では、この他のタンパク質は、それ単独では、抗体を惹起しないかもしれないが、第１のタンパク質を安定化し、そして免疫原性活性を保持する融合タンパク質を形成する。別の実施形態では、この融合タンパク質は、免疫原性である別のタンパク質（例えば、融合タンパク質を可溶化し、そしてそれらの産生および精製を容易にする比較的大きな共タンパク質（ｃｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）である、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ）を含む。この他のタンパク質は、免疫系の全身刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。この他のタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかへと融合され得る。
【００５６】
本発明の他の組成物では、キメラタンパク質は、他の方法でキャリア物質へと連結され得る。当該分野で公知のこのような連結を作製する任意の方法が用いられ得る。連結は、一方の官能基端にジスルフィド結合を生じ、他方にペプチド結合を生じる、ヘテロ二官能性薬剤（例えば、ジスルフィドアミド形成剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５，１９８２）を参照のこと））およびジスルフィド結合ではなくチオエーテル結合を形成する二官能性カップリング剤（例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステル）、ならびにナトリウム塩（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））についてはスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸と合わせることによりカルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて形成され得る。
【００５７】
これらのキメラタンパク質は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）および無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）を用いて形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩ））および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカイン）から形成され得る。
【００５８】
本発明の組成物は、アジュバントをさらに含み得る。既知のアジュバントとしては、例えば、乳濁液（例えば、フロイントアジュバントおよび他の油乳濁液）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａからの精製サポニン（ＱＳ２１）、アルミニウム塩（例えば、水酸化物、リン酸塩および明礬）、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、ゲル（例えば、水酸化アルミニウム塩）、マイコバクテリウム生成物（ムラミルジペプチドが挙げられる）、固体物質、粒子（例えば、リポソームおよびビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ））が挙げられる。アジュバントとして使用されることが公知の天然の生成物および細菌性生成物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５２９（合成ＭＰＬ様アシル化モノサッカリド）、ＯＭ−１７４（これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのリピドＡ誘導体である）、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）またはその誘導体のうちの１つ、百日咳毒素（ＰＴ）およびＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素（ＬＴ）またはその誘導体のうちの１つ）、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、多くの要因（例えば、キャリア効果、蓄積物形成、改変されたリンパ球再循環、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激およびマクロファージの刺激）によって影響され得る。
【００５９】
本発明の組成物は代表的に、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能物として処方される；注射の前に液体中に溶解または懸濁するために適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。活性な免疫原性成分はしばしば賦形剤と混合され、これらの賦形剤は、薬学的に受容可能であり、かつこの活性成分と適合性である。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望の場合、これらのワクチンは、小量の補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバント（これはワクチンの有効性を増強する））を含み得る。これらのワクチンは、非経口で、注射により（例えば、皮下または筋肉内のいずれかで）従来どおりに投与される。
【００６０】
他の投与形態に適切であるさらなる処方物としては坐剤が挙げられ、場合によっては経口処方物が挙げられる。坐剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレン（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る；このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物としては、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方物または粉剤の形態をとり、そして１０％〜９５％（好ましくは２５％〜７０％）の活性成分を含む。
【００６１】
組成物はまた、ジェット式注射器、顕微針、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロカプセル化、ポリマーまたはリポソームを利用して経皮経路を通して、ネブライザー、エアゾールおよび鼻スプレーを使用して経粘膜経路および鼻腔内経路を通して、投与され得る。天然または合成のポリマー（例えば、澱粉、アルギネートおよびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−乳酸−ｃｏグリコール酸マイクロスフェア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリホスファゼン、ポリホスファタゼン）を用いたマイクロカプセル化は、経皮投与および経粘膜投与の両方について有用である。合成ポリオルニテート（ｐｏｌｙ−ｏｒｎｉｔｈａｔｅ）、ポリリジンおよびポリアルギニンまたは両親媒性ペプチドを含むポリマー複合体は、経皮送達系に有用である。さらに、それらの両親媒性という性質に起因して、リポソームは、経皮ワクチン送達系、経粘膜ワクチン送達系および鼻腔内ワクチン送達系が意図される。ワクチン送達のために使用される通常の脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウム−メチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ−プロピル−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジミスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ｄｉｍｙｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ；ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｉ）が挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームとの組み合わせは、皮膚を通してのリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。さらに、チリシャボンノキ樹皮（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のトリテルペノイドグリコシドまたはサポニンおよびキトサン（脱アセチル化キタン（ｃｈｉｔａｎ））は、鼻腔内ワクチン送達および経粘膜ワクチン送達に有用なアジュバントであることが意図される。
【００６２】
処方物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、封のされたアンプルおよびバイアル）中で提示され得、そして使用直前の滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。
【００６３】
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの阻害方法）
あるいは、本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩＶ型ピリ線毛機能を個体において阻害する方法を包含する。この方法は、この個体に、例えば、１もしくはそれより多くの本発明の抗体および／または１もしくはそれより多くの本発明のキメラタンパク質を、ピリ線毛の機能を阻害する量で投与する工程を包含する。インビトロアッセイを用いて、ピリ線毛機能を阻害する能力を実証し得る。これらの方法の実施形態としては、例えば、ＩＶ型ピリ線毛によって媒介される付着のインヒビターを用いる方法、ＩＶ型ピリ線毛によって媒介される既存のバイオフィルムを破壊するインヒビターを用いる方法、および単収縮のインヒビターを用いる方法が挙げられる。
【００６４】
阻害は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに関与する任意の病理学的状態（例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋、心膜、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、慢性閉塞性肺疾患および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症）の悪化）について意図される。
【００６５】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩＶ型ピリ線毛機能のインヒビターを含む組成物が提供される。この組成物は、上記の活性成分のうちの１つのみからなってもよく、上記の活性成分の組み合わせを含んでもよく、または、細菌感染を処置するために用いられるさらなる活性成分を含んでもよい。上記で考察したとおり、これらの組成物は、１またはそれより多くのさらなる成分（例えば、薬学的に有効なキャリア）を含み得る。上記でも考察されるように、これらの組成物の投与量および投与頻度は、標準的な技術によって決定され、そして例えば、個体の体重および齢、投与経路、ならびに症状の重篤度に依存する。これらの薬学的組成物の投与は、当該分野で標準的な（例えば、非経口、静脈内、経口、頬内、鼻腔、肺、直腸、鼻腔内または膣の）経路によって行われ得る。
【００６６】
（動物モデル）
本発明の方法は、ＯＭについての実験モデルとして広く受け入れられているチンチラモデルにおいて実証され得る。特に、ＮＴＨｉ誘発性ＯＭのチンチラモデルはよく特徴付けられており（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−８７２，１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：２２３−２２５，１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−１７１８，１９９４；Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７１：３４５４−３４６２，２００３）、そしてＯＭに対するいくつかのＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物の防御効力を決定するために用いられている（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−９６１，１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７：２７４６−２７６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：２７５６−２７６５，２０００；Ｋｙｄ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６：２２７２−２２７８，２００３；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，１９７８−１９８３，２００３）。
【００６７】
このモデルでは、アデノウイルスは、チンチラをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性ＯＭ媒体に罹りやすくする。このことは、ＮＴＨｉの生物学的評価のための関連した細胞、組織および器官の培養系の確立を可能にした（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−７２，１９９３；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：１７１０−８，１９９４）。アデノウイルス感染単独を用いて、誘導された血清抗体の鼓室への漏出が評価されており（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４（２）：２２３−５，１９９７）、そしてＮＴＨｉとともに共病原体（ｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）として用いられて、中耳炎に対する痘苗原としての種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物を標的とするいくつかの能動免疫レジメンおよび受動免疫レジメンの防御効力が決定されている（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７（６）：２７４６−６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８（５）：２７５６−６５，２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（４）：２１１９−２８，２０００；Ｐｏｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１０８−１５，２０００）。
【実施例】
【００６８】
（発明の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を例示し、ここで、実施例１は、本発明のキメラタンパク質の組換え産生を記載し、実施例２は、本発明のキメラタンパク質の免疫原性を試験するアッセイを記載し、実施例３は、受動免疫を評価するためのアッセイを記載し、実施例４は、能動免疫を評価するためのアッセイを記載し、そして実施例５は、本発明のキメラタンパク質の評価を記載する。
【００６９】
（実施例１ キメラタンパク質の合成）
本発明のキメラタンパク質を、標準的な組換え法を用いて産生した。最初に、遺伝子合成会社（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）が、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましいコドン使用法に最適化した、本明細書中に記載のキメラタンパク質のアミノ酸配列に基づいて最初のプラスミドを作製するという契約を結んだ。手短に述べると、Ｎ末端（配列番号２の残基１〜３９）を切り落とし、そして配列番号３に示すＨＩＳタグ配列およびトロンビン切断部位を付加することにより、ネイティブなＮＴＨｉピリンタンパク質配列を改変した。このＨＩＳタグの前には、発現を補助するための配列（ＭＧＳＳ）があった。トロンビン切断部位は、ＨＩＳタグの放出を可能にした。次いで、これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。次いでこのプラスミドを、可溶性Ｈｉｓタグ化キメラタンパク質の発現のための宿主としてＥ．ｃｏｌｉ株「Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）」（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能）中に形質転換した。使用され得る別のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞発現株は、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【００７０】
このキメラタンパク質のＨｉｓタグ化改変体を、ニッケルカラムクロマトグラフィーによって回収し、次いで最初の研究に用いて、以下のうちのいずれかに対する抗血清と反応性であるか否かを決定する：ネイティブなＯＭＰ Ｐ５−フィンブリン、ＬＢ１（全長４０アミノ酸ペプチド）、ＬＢ１（１）（ＬＢ１の１９アミノ酸のＢ細胞エピトープのみを提示する合成ペプチド）、組換えＰｉｌＡタンパク質またはネイティブなＰｉｌＡタンパク質。一旦Ｈｉｓタグがトロンビン部位切断によって除去されると、この組換えキメラタンパク質は免疫原として用いられて、それらの免疫原性および防御能力が決定される。
【００７１】
本発明の例示的なキメラタンパク質は、以下の表２に示す配列を有する。配列番号１０のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質、配列番号１２のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質および配列番号１４のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質が、上記のとおりにＥ．ｃｏｌｉによって発現されている。
【００７２】
【表２−１】
【００７３】
【表２−２】
【００７４】
【表２−３】
本発明のさらなる例示的なキメラタンパク質は、以下の表３に示すとおりのアミノ酸配列を有する。これらのキメラタンパク質は、上記のとおりに、Ｅ．ｃｏｌｉによって発現されており、そしてＨＩＳタグを用いて精製されている。表３に示されるキメラタンパク質は、免疫原として使用するために除去されるＨＩＳタグ配列を有する。配列番号５６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質を、実施例５に記載した研究において用いた。
【００７５】
【表３】
（実施例２ キメラタンパク質の免疫原性）
ウサギまたはチンチラを、これらのキメラタンパク質で免疫する。ウサギは、完全フロイントアジュバント中の５００μｇの第１免疫用量のキメラタンパク質を受ける。これらのウサギは、４００μｇの第２用量のキメラタンパク質を２１日後に受ける。これらのウサギは、完全フロイントアジュバント中の第３用量のキメラタンパク質を、ＩＦＡまたはＰＢＳのいずれか中での４００μｇの同じペプチド（１つの希釈剤あたり１羽のウサギ）とともに、第１免疫用量の４２日後に受ける。各投与の３週間後に血清を得る。チンチラは、アジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）中の１０μｇの第１免疫用量のキメラタンパク質を受ける。１ヵ月（約３０日）後、チンチラは、第２の同一の用量を受ける。第３用量でかつ最終用量を第２用量の約３０日後に送達する。各用量の約１０〜１４日後に血清を得る。全ての動物からの血清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびバイオセンサーによって、ＬＢ１ペプチド（４０マー）、ＬＢ１（１）、ＰｉｌＡタンパク質およびキメラタンパク質に対する力価および特異性について評価する。抗血清をまた、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析により、細菌全体に対して試験する。
【００７６】
（実施例３ 受動免疫の評価）
本発明のキメラタンパク質に対する動物の免疫応答によって付与される防御を、実験的中耳炎のチンチラモデルにおいて決定する。チンチラを、本発明のキメラタンパク質に対する超免疫チンチラ血清または超免疫ヒト血清５ｍｌ／ｋｇで受動免疫する。コントロールのチンチラは、正常なチンチラ血清または正常なヒト血清を受ける。次に、これらのチンチラは、まず、ウイルス共病原体を鼻腔内に受け、次いで１週間後に、ＮＴＨｉ細菌による鼻腔内チャレンジを受ける。これらのチンチラを検査し、そして細菌チャレンジ後３５日目まで毎日または２日毎に評価する。免疫チンチラ血清またはヒト血清を受ける免疫したチンチラは、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリの両方によって決定したところ、減少した鼓膜病状を表し、そして中耳空間の感染の徴候は減少しているかまたは徴候はない。このアッセイでは、コントロールと比較したとき、チンチラまたはヒトの抗キメラタンパク質血清を受けるチンチラ中の中耳液の存在は減少している。
【００７７】
（実施例４ 能動免疫の評価）
各々５〜１０匹のチンチラのコホートに、食塩水コントロール調製物、アジュバントのみの調製物または適切なアジュバントと混合した本発明のキメラタンパク質のうちの１つのいずれかを能動免疫する。これらの免疫原を、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから名称ＱＣＬ−１０００の下で市販される色素形成性変形溶解産物アッセイによって、免疫源としてのそれらの使用の前に、内毒素含有量について評価する。次いで、これらのチンチラに、アジュバントＭＰＬ（または別の適切なアジュバント）中の１０μｇの免疫原を皮下注射する。次いで３０日後に、これらは、ＭＰＬ中の１０μｇの同じ免疫原を受ける。２回目の免疫の３０日後、これらの動物は最終免疫用量を受ける。最後の免疫用量を送達してから約１０〜１４日後、チンチラにＮＴＨｉの１株を経水疱（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）および鼻腔内の両方でチャレンジする。これらのチンチラを、３５日間の期間にわたって、以下について評価する：ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリにより、鼓膜の病状；下水疱（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｂｕｌｌａ）の鼓室上部穿刺および鼻咽頭の受動洗浄によって回収されたＮＴＨｉの半定量；ならびに組織病理学についての固定された中耳粘膜上皮および鼓膜の光学顕微鏡検査。例えば、本発明のキメラタンパク質で免疫されたチンチラは、減少した鼓膜病状を有し、中耳滲出液がないかもしくは培養陰性である滲出液を含み、鼓室に存在するバイオフィルムは減少しているかもしくは存在せず、中耳粘膜の最小の厚みがあり、最小の骨新生（ｏｓｔｅｏｎｅｏｇｅｎｓｉｓ）があり、そして上皮下空間における赤血球および炎症細胞の両方の存在が減少している。
【００７８】
（実施例５ キメラタンパク質の評価）
配列番号５６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質（本明細書中では「ｃｈｉｍ−Ｖ３」という）の防御効力を、ＯＭのチンチラ受動転移超感染モデルを用いて評価した。このキメラペプチドは、組換えＰｉｌＡ（配列番号２の残基４０〜１４９）のＣ末端グルタミン残基の後に発現されたＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープ（配列番号５）からなっていた。受動転移効力研究において使用するためのポリクローナル抗血清を作製するために、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を、アジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）＋トレハロースジミコレート（Ｃｏｒｉｘａ）とともに成体チンチラのコホートに送達した。免疫レジメンを示すタイムラインを図１に示す。免疫血清プールを作製するために、警戒しやすい（ａｌｅｒｔ ｐｒｏｎｅ）チンチラに３０μｇのｃｈｉｍ−Ｖ３＋１０μｇのＭＰＬまたは１０μｇ ＭＰＬ単独を２１日間毎に３回皮下免疫した。５６日目に、接種した動物の最後の採血を収集し、そして未刺激の若齢動物への転移のために血清をプールした。効力を研究するために、別々のコホートの若齢チンチラを、−７日目に最初にアデノウイルスでチャレンジした。６日後（−１日目）、プールした抗ｃｈｉｍ−Ｖ３免疫血清を、アデノウイルスに曝したこれらの動物へと受動転移した。翌日（０日目）、受動転移による抗ｃｈｉｍ−Ｖ３血清を受けた動物に、分類不能型Ｈａｅｍｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌をチャレンジした。次いで、これらの動物を、ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリによって毎日、ならびにＸｅｎｏｇｅｎインビボ画像化によって１日おきに、（細菌チャレンジに対して）２６日間の時間経過にわたって、疾患の発生率および重篤度についてモニタリングした。
【００７９】
抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体の力価を、接種した動物から収集した免疫血清において、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。この分析は、収集された抗血清がｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質に特異的な抗体を含むことを実証した。収集された抗血清における抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体の存在はまた、ウェスタンブロット分析を用いても確認された。
【００８０】
ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫された動物からの血清免疫グロブリンが、ＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰによって発現される表面に露出したネイティブ構造を認識する能力を測定した。ＮＴＨｉ細菌を、ｃｈｉｍ−Ｖ３抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、次いで未刺激ＦＩＴＣ−プロテインＡまたは免疫ＦＩＴＣ−プロテインＡとともにインキュベートし、洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析により分析した。ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質の接種は、ＮＴＨｉ表面タンパク質またはｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を認識し得る抗体の顕著な増加を誘導した。得られたデータは、抗体力価およびアビディティの両方、ならびにインビトロで増殖させた場合のＮＴＨｉによるＩＶ型ピリ線毛およびＯＭＰ Ｐ５相同接着因子の両方の相対発現に依存した。
【００８１】
発光レポーターＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰ ｐＫＭＬＮ−１を用い、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボリアルタイム画像化を用いて、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を接種した動物におけるＮＴＨｉ感染を検出した。発光株ＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰ ｐＫＭＬＮ−１および親株ＮＴＨｉ ８６−０２８の増殖曲線は、発光ＮＴＨｉ株の増殖が親株と匹敵することを実証した。接種した動物の鼻咽頭に住み着いたＮＴＨｉの発光画像化は容易に達成されたが、罹患した中耳の微好気性に起因して、中耳内に存在するＮＴＨｉの発光を疾患経過全体にわたってモニタリングすることはできなかった。なぜなら、発光は、酸素利用可能性に依存するからである。動物を、発光性細菌の存在について１日おきにモニタリングし、そして細菌が検出された場合、これを発光事象として記録した。接種された動物において、チャレンジ後少なくとも６日間発光性感染が検出された。ｃｈｉｍ−Ｖ３接種動物中の発光事象の総数は、（ＭＰＬのみを接種した）コントロール動物における発光事象の総数よりも少なかった。
【００８２】
研究の経過全体をとおして、毎日のビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリを用いて、ＯＭを有するチンチラ中耳のパーセントを決定した。ｃｈｉｍ−Ｖ３の接種は、（ＭＰＬのみを接種した）コントロール動物と比較して、ＯＭを有する中耳を有する動物数の５３％の低下を引き起こした。
【００８３】
これらの研究の全ては、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質が免疫原性であったこと、および抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体がＯＭのチンチラ受動転移超感染モデルにおいて防御性であったことを実証する。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年７月８日に出願した米国仮出願第６０／６９７，６４２号および２００６年５月１９日に出願した米国仮出願第６０／８０１，８３５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５タンパク質の一部分を提示するＮＴＨｉ単収縮ピリ線毛（ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ ｐｉｌｕｓ）主要サブユニットタンパク質（ＰｉｌＡ）を含むキメラタンパク質に関する。本発明は、このキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳感染についての臨床用語は中耳炎（ＯＭ）である。非特許文献１によれば、ＯＭは、健康管理を受ける病気の小児、および抗生物質を受けるかまたは全身麻酔を受ける米国の小児についての最も一般的な理由である。統計は、１９９０年にはＯＭについて２４５０万人の内科医院の訪問者があったことを示す。これは、１９８０年代に報告されたのよりも２００％より高く増加していることを示す。死亡と関連することは稀であるとはいえ、ＯＭに関連した死亡は重大である。難聴は、この疾患と関連した一般的な問題であり、しばしば、小児の行動、教育および言語習熟の発達に影響を与える（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＯＭの社会経済的な影響もまた大きく、ＯＭの診断および管理の直接的費用および間接的費用は、米国だけでも毎年５０億ドルを超える（非特許文献５）。
【０００４】
ＯＭは、感染性要因、環境要因および宿主の遺伝学的要因から生じると考えられている。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのような細菌は、ＯＭにおいて最も一般的な感染性生物体である。急性ＯＭは、中耳における炎症の徴候および症状の迅速な発症および短期間の持続期間によって特徴付けられる疾患であり、他方、慢性ＯＭとは、中耳における比較的無症候性の流体（または滲出液）の存在によって定義される病的状態をいう。しかし、慢性ＯＭにおいては、急性感染の特定の徴候（すなわち、耳の疼痛または発熱）が存在しないにもかかわらず、これらの異常な中耳液は、３ヶ月間を超える期間にわたって持続し得る。抗生物質治療による急性ＯＭの処置が一般的であるが、ＯＭの原因となる３つの属全ての細菌において、多剤耐性細菌が出現している。慢性ＯＭの外科的管理は、小児では全身麻酔下をかけた状態での、耳の鼓膜を通しての中耳腔換気用チューブの挿入を含む。この手順はごく普通であり（罹患率は、米国において１年あたり挿入されるチューブが約１００万本である；非特許文献６）、そして蓄積した流体を中耳から排出することにより有痛症状を軽減することに関しては非常に有効であるが、これは侵襲性であり、さしせまった危険性がある（非特許文献７；非特許文献６；Ｃｉｍｏｎｓ，ＡＳＭ Ｎｅｗｓ，６０：５２７−５２８；非特許文献８）。従って、ＯＭの管理、好ましくはＯＭの予防に対するさらなるアプローチが必要とされている。
【０００５】
ＯＭワクチンの開発はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて最も進んでいる。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、７価莢膜結合体ワクチンＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）の近年の承認および発売により証明されたように、急性ＯＭ（ＡＯＭ）の主な原因因子である（非特許文献９）。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は侵襲性の肺炎球菌の疾患に関しては非常に有効であるが、ＯＭに関する適用範囲は、ワクチンに含まれていない血清型に起因するＯＭ症例数の増加が報告されており、失望されている（６〜８％）（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、上記のように、ＯＭにおいて役割を果たすグラム陰性細菌である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの臨床単離体は、それぞれ、型特異的多糖莢膜がその細菌に存在するかまたは存在しないかに依存して、「ａ」〜「ｆ」のいずれかとして、または分類不能型として分類される。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型についてのワクチンが開発されている。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）と同様に、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチンは、この生物体の多糖莢膜を標的とし、それゆえ、このワクチンは、タンパク質キャリアに結合した莢膜多糖から構成される。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）またはｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチンのいずれも、ＯＭを含めたＮＴＨＩ誘発性気道疾患に対しては効力を有さない。分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）のためのワクチンに関しては、ほとんど進んでいない。ＮＴＨｉは、小児における急性ＯＭのうちの約２０％を引き起こし、そして滲出液を有する慢性ＯＭにおいて優勢である（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。ＮＴＨｉはまた、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、心膜（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｓ）、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｔｉｖｉｔｉｓ）、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｔａｓｉｓ）および嚢胞性線維症）の増悪を引き起こし得る。基本型のＮＴＨｉ単離体は、継代数の少ない単離体８６−０２８ＮＰである。８６−０２８ＮＰは、慢性ＯＭを有する小児から回収された。この株は、インビトロにおいて（非特許文献１７；非特許文献１８）、ならびにチンチラＯＭモデルにおいて（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）、充分に特徴付けられている。ＮＴＨｉの８６−０２６ＮＰ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１０月１６日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ−４７６４が割り当てられた。８６−０２８ＮＰ株のゲノムからのコンティグのセットは、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓのウェブサイトにおいて見出され得る。
【０００７】
付着およびコロニー形成は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性疾患の病因において認められる最初の段階である。それゆえ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、赤血球凝集性のピリ線毛、線毛および非線毛性付着因子を含めた複数の付着因子を発現する（非特許文献２２；非特許文献２３；および非特許文献２４）。特に、記載された付着因子はいずれも、運動性機能とはこれまで関連付けられていない。さらに、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、運動性とも関連する鞭毛を発現しない。単収縮運動性は、水分のある表面上での鞭毛非依存性形態の細菌の移動であり、ＩＶ型ピリ線毛として公知の極構造体の伸長、係留、次いで収縮によって起こる（非特許文献２５；非特許文献２６；Ｗｏｌｆｇａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯＪ．，１９，６４０８−６４１８，；非特許文献２７）。ＩＶ型ピリ線毛は、代表的には直径５〜７ｍｍであり、長さは数マイクロメートルであり、１ターンあたり約５サブユニットのらせんコンホメーションへと組み立てられる、１つのタンパク質サブユニットから構成される（非特許文献２８；非特許文献２９）。ＩＶ型ピリンのサブユニットは、通常、１４５〜１６０アミノ酸長であり、グリコシル化されてもよく、またはリン酸化されてもよい。２つのクラスのピリンサブユニット（ＩＶａ型およびＩＶｂ型）が存在する。これらは、リーダーペプチドおよび成熟サブユニットの平均長、どのＮ−メチル化アミノ酸が成熟タンパク質のＮ末端位置を占めるか、およびＤ領域（ジスルフィド領域にちなむ）の平均長によって互いに区別される。呼吸器病原体の大部分は、ＩＶａクラスのピリンを発現し、一方、腸病原体は、クラスＩＶｂピリンをより代表的に発現する。ＩＶａ型ピリ線毛は、高度に保存された疎水性Ｎ末端メチル化フェニルアラニンの存在によって識別される。
【０００８】
ＩＶ型ピリ線毛は、迅速移動手段および新たな表面のコロニー形成手段として役立つ。従って、ＩＶ型ピリ線毛の発現は、多くの細菌による付着およびバイオフィルム形成の両方（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３）にとって、ならびにとりわけ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのビルレンスにとって、重要である（非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３４；非特許文献３５）。バイオフィルムは、エクソポリサッカリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）または他の物質から構成される、細菌によって排出されたマトリックスを介して表面に係留された複雑な構成の細菌である。このマトリックスは細菌を覆い、そして人の免疫系から細菌を保護する。非特許文献３６は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅによるバイオフィルム形成を記載する。ＩＶ型ピリ線毛と人の身体との間の相互作用をブロックすることにより、細菌感染を回避または停止させ得ると仮定されている（２００１年７月３１日に発行されたＭｅｙｅｒらの特許文献１）。
【０００９】
ＩＶ型ピリ線毛の発現は、複雑で高度に調節された細菌機能である。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおいては、ＩＶ型ピリ線毛の生物合成および機能は、４０個を超える遺伝子によって制御される（非特許文献３５）。今日まで、極めて多数の関連するＩＶ型ピリ線毛遺伝子のうちのごくわずかのセブセット（非特許文献２６；非特許文献３７）しか、ＨＡＰ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）科の数種のメンバーにおいては見出されていない（非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０）が、ＩＶ型ピリ線毛の発現も単収縮運動のいずれもこれまでのところ、あらゆるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離株について記載されていない。実際、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、Ｒｄ株ゲノム内での潜在的遺伝子クラスターの存在（非特許文献４１）にもかかわらず、これらの構造を発現しない細菌であると古典的に記載されている（非特許文献４２；非特許文献４３）。Ｒｄ株は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血清型ｄ生物体の非被包性誘導株である（非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）。Ｒｄ株はいくつかのビルレンス特性を有するが、血清型ｄの株は一般に、片利共生であると考えられる；これらは、疾患を頻繁には引き起こさない（非特許文献４７）。それゆえ、それゆえ、疾患を引き起こす株のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＲｄ株とを識別することが重要である。
【００１０】
線毛は、分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ上で見出される表面の付属器であり、慢性中耳炎を有する小児の中耳および鼻咽頭領域から回収された１００％の細菌によって産生される。分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの線毛に由来する糸状タンパク質であるフィンブリンから構成されるワクチンが以前に開発された。それは、中耳炎の研究、予防または重篤度の軽減に有用である。しかし、細菌外膜からフィンブリンタンパク質を単離する既存の方法論は、退屈で時間がかかる。同様に、他の宿主ベクター中のフィンブリン遺伝子によって発現されるフィンブリンの精製もまた、フィンブリンタンパク質と宿主ベクターの外膜タンパク質との間での相同性に起因して退屈である。
【００１１】
ＬＢ１と示され、特許文献２において記載されている合成キメラワクチン候補物は、２匹の齧歯動物宿主において、複数の前臨床ワクチン試験においてすさまじい効力を示した。この合成ペプチドは、麻疹ワクチンの融合タンパク質由来のＴ細胞無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）エピトープと共線的に合成されたＰ５−フィンブリンのＢ細胞エピトープを含む。ＬＢ１ペプチドは前臨床試験において有効であることが示されているが、非常に若い小児における使用が意図されるＴ細胞無差別エピトープを含むワクチンを試験および販売する能力についての懸念が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，２６８，１７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８４３，４６４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２−Ｓ８，２０００
【非特許文献２】Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ，１４：６０１−６０４，１９９３
【非特許文献３】Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ Ｓｕｐｐｌ．，１６３：５９−６１，１９９４
【非特許文献４】Ｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６２：６８５−６９４，１９９０
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，１６：Ｓ９−１１，１９９７
【非特許文献６】Ｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８３（７）：１０２６−８，１９９３
【非特許文献７】Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９３（３）：３５３−６３，１９９４
【非特許文献８】Ｐａａｐ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３０（１１）：１２９１−７，１９９６
【非特許文献９】Ｅｓｋｏｌａ ａｎｄ Ｋｉｌｐｉ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１６：Ｓ７２−７８，２０００
【非特許文献１０】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１９：１８７−１９５，２０００
【非特許文献１１】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１９：Ｓ７２−７８，２０００
【非特許文献１２】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，３４４：４０３−４０９，２００１
【非特許文献１３】Ｓｎｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｏｔｏｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．，２３：１−２，２００２
【非特許文献１４】Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（５），１７１６−１７２２，１９９１
【非特許文献１５】Ｋｌｅｉｎ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ，１６，Ｓ５−８，１９９７
【非特許文献１６】Ｓｐｉｎｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５４，１００−１０９，１９８６
【非特許文献１７】Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５３：３３１−５，１９８８
【非特許文献１８】Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２３：１５７−６６，１９９７
【非特許文献１９】Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−６１，１９９７
【非特許文献２０】Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−８，１９９４
【非特許文献２１】ＤｅＭａｒｉａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：５１８７−９２，１９９６
【非特許文献２２】Ｇｉｌｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ３９，３４３−３４８，１９９６
【非特許文献２３】Ｇｉｌｓｄｏｒｆ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５，２９９７−３００２，１９９７
【非特許文献２４】Ｓｔ．Ｇｅｍｅ ＩＩＩ，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４，１９１−２００，２００２
【非特許文献２５】Ｂａｒｄｙ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，２９５−３０４，２００３
【非特許文献２６】Ｔｏｎｊｕｍ ａｎｄ Ｋｏｏｍｅｙ，Ｇｅｎｅ，１９２，１５５−１６３，１９９７
【非特許文献２７】Ｍａｔｔｉｃｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，２８９−３１４，２００２
【非特許文献２８】Ｂａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９，２９５−３０４，２００３
【非特許文献２９】Ｗａｌｌ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３２，１−１０，１９９９
【非特許文献３０】Ｍａｔｔｉｃｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，２８９−３１４ ２００２
【非特許文献３１】Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ａｎｄ Ｋｏｌｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３０，２９５−３０４，１９９８
【非特許文献３２】Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５０，６１−６８，２００３
【非特許文献３３】Ｊｅｓａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，４３２９−４３３９，２００３
【非特許文献３４】Ｋｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４８，１５１１−１５２４，２００３
【非特許文献３５】Ｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｌｏｒｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４７，５６５−５９６，１９９３
【非特許文献３６】Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ，ＪＡＭＡ，２８７（１３），１７１０−１７１５（２００２）
【非特許文献３７】ＤａｒｚｉｎｓおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，１９２，１０９−１１５，１９９７
【非特許文献３８】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９２，１２１−１３４，２００３
【非特許文献３９】Ｄｏｕｇｈｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７２，７９−９０，２０００
【非特許文献４０】Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５，４０１−４０９ １９９９
【非特許文献４１】Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，４９６−５１２，１９９５
【非特許文献４２】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９，３６９５−３７００，２００３
【非特許文献４３】Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９２，１２５−１３４，１９９７
【非特許文献４４】Ｚｗａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４２，７０８−７１５，１９８３
【非特許文献４５】Ｂｅｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｇｏｏｄｇａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７０，４１１−４２２，１９７２
【非特許文献４６】Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６１，１７１−１８０，１９９９
【非特許文献４７】Ｄａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５２，２７７−２８２，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それゆえ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する特異的でかつ制御性の免疫応答を惹起するワクチン候補物を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）のＩＶ型ピリ線毛主要サブユニットタンパク質（ＰｉｌＡ）の一部およびＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５タンパク質（Ｐ５−フィンブリン、フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５−相同付着因子ともいう）の一部を含むキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡを含むキメラタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の１またはそれより多くのキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本発明のキメラタンパク質を用いて免疫応答を惹起する方法を提供する。
【００１６】
ＬＢ１ペプチドは、４０アミノ酸の合成キメラＰ５−フィンブリン由来ペプチド（配列番号５３）であり、ＮＴＨｉに対する免疫原性応答を誘導し、退屈な精製技術を必要としないので、有利である。ＬＢ１ペプチドは、Ｂ細胞エピトープ（配列番号４）であるＮ末端１９アミノ酸のペプチドを含む。このＢ細胞エピトープは、ＯＭＰ Ｐ５（Ｐ５−フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５相同付着因子ともいわれる）と示されるＮＴＨｉの外膜タンパク質（フィンブリン）の予測された表面露出ループ３から誘導された。ＬＢ１ペプチドは、短い５マーのリンカーペプチドおよび１６残基のＴ細胞無差別エピトープをさらに含む。このＴ細胞エピトープは、麻疹ウイルスの融合タンパク質から誘導された。このＴ細胞無差別エピトープは、このエピトープに曝露された個体において、非常に強いＴ細胞応答を誘導する。
【００１７】
本発明は、ＬＢ１ペプチドの一部分またはフラグメントを、Ｂ細胞応答誘導の有効性を低減しない、より安全でかつ選択的なキャリアタンパク質へと挿入することを意図する。好ましくは、ＬＢ１ペプチドの一部分は、それ自体もまたＮＴＨｉ誘発性疾患に対する防御を付与するキャリアへと挿入される。ＮＴＨｉ誘発性疾患に対する防御を誘導し得る１つのこのようなキャリアは、ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）としても公知のＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛（単収縮ピリ線毛）タンパク質を含むタンパク質である。ＰｉｌＡタンパク質は、ｐｉｌＡ遺伝子（配列番号１）によってコードされる。
【００１８】
本発明は、ＬＢ１ペプチドを提示して免疫原性応答を誘導するための、ＬＢ１ペプチドの一部分を含むキメラタンパク質を提供する。本発明は、１２〜３５アミノ酸であるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを、より好ましくは１５〜３０アミノ酸であるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを、最も好ましくは１８〜１９アミノ酸でありフィンブリンタンパク質のサブユニットであるＬＢ１ペプチドの一部分を提示することを意図する。ＬＢ１ペプチドの好ましい部分は、Ｎ末端アミノ酸配列ＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧ（配列番号４）である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、キメラタンパク質を提供し、ここで、ＰｉｌＡタンパク質は、２４アミノ酸のペプチドを提示するように改変される。２４アミノ酸のペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列（ＬＶＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧＲＨＴ）中に設定されるように改変されたＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを含み得、ここで、ロイシンおよびバリンが、ＬＢ１のＢ細胞エピトープのＮ末端に付加されており、そしてアルギニン、ヒスチジンおよびトレオニンがＬＢ１のＢ細胞エピトープのＣ末端に付加されている。Ｂ細胞エピトープに対するこれらの改変は、タンパク質の折り畳みおよび／または抗原提示を補助することが意図される。本発明はさらに、タンパク質の折り畳みおよび／または抗原提示を補助する、ＬＢ１のＢ細胞エピトープに対する任意の改変を意図する。
【００２０】
ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５の表面に露出したループ３のアミノ酸配列は、ＮＴＨｉ株毎に変化し得る。本発明は、ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５のループ３の任意の改変体アミノ酸配列のＢ細胞エピトープを提示するように改変された、ＰｉｌＡタンパク質の一部分を含むキメラタンパク質を意図する。特に、本発明は、キメラタンパク質を提供し、ここで、ＰｉｌＡタンパク質は、以下の改変体ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５アミノ酸配列のうちの１つを提示するように改変されている：ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＳＮＳＴＬＫＮＬＧＥ（配列番号６）、ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＴＬＫＤＬＧＥ（配列番号７）およびＲＳＤＹＫＦＹＤＮＫＲＩＤ（配列番号８）。これらの改変体ペプチドはまた、ロイシンおよびバリンをＮ末端に付加し、アルギニン、ヒスチジンおよびトレオニンをＣ末端に付加して、またはタンパク質の折り畳みおよび／もしくは抗原提示を補助する任意の他の改変を行って提示され得る。
【００２１】
本発明のキメラタンパク質は、改変ＰｉｌＡアミノ酸を含み、ここで、ネイティブなＰｉｌＡアミノ酸は、ＬＢ１ペプチドの一部分によって置換されている。さらに、本発明のキメラタンパク質は、改変ＰｉｌＡアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、ネイティブＰｉｌＡアミノ酸に加えて、その中に挿入されている。本発明のキメラタンパク質は、２つのタンパク質に対する抗体形成を誘導する能力を有し、それゆえ、より有効でかつより特異的なワクチン候補物である。
【００２２】
１つの実施形態では、これらのキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜残基１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号２の６２位のシステイン残基と７２位のシステイン残基との間に挿入されており、そしてネイティブアミノ酸配列と置き換わり得る（例えば、配列番号５４のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質）。このキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そして配列番号２の残基６２と残基７２との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）を有する。別の実施形態では、ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号２の１３１位のシステイン残基と１４４位のシステイン残基との間に挿入され、そしてネイティブアミノ酸と置き換わり得る（例えば、配列番号５５のアミノ酸配列を有するタンパク質）。このキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜１４９を含み、そして配列番号２の残基１３１と残基１４４との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）を有する。
【００２３】
別の実施形態では、このキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、ＰｉｌＡタンパク質のＣ末端に挿入されている。例えば、配列番号５６のキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そしてＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）が配列番号２の残基１４９の後ろに挿入されている。
【００２４】
別の実施形態では、このキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（残基１３〜残基１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分がＰｉｌＡタンパク質のＮ末端に挿入されている。例えば、配列番号５７のキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０〜残基１４９を含み、そしてＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５）が配列番号２の残基４０の前に挿入されている。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分および本明細書中に記載されるＬＢ１ペプチドのうちの１つまたはそれより多くを含むキメラタンパク質を提供する。本発明のキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分内に同じＬＢ１ペプチドを１回より多く提示するもの、およびＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分内に２つまたはそれより多くの異なるＬＢ１ペプチドを提示するものを包含する。
【００２６】
本発明はさらに、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分および免疫応答を惹起する任意の抗原性タンパク質を含むキメラタンパク質を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下のタンパク質、方法などが提供される：
（項目１）
キメラタンパク質であって、ＰｉｌＡの一部分およびＬＢ１ペプチドの一部分を含む、キメラタンパク質。
（項目２）
前記ＬＢ１ペプチドの一部分が、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを含む、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）
前記ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む、項目２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目６）
項目５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目７）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目８）
項目１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質に特異的に結合する、抗体。
（項目９）
項目８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１０）
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を惹起するための方法であって、免疫原性用量の項目１〜４のいずれか１項に記載の１以上のキメラタンパク質を、ＮＴＨｉ細菌感染の危険性がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１）
前記ＮＴＨｉ感染が、中耳においてである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ＮＴＨｉ細菌感染を処置または予防する方法であって、項目８に記載の抗体を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３）
前記ＮＴＨｉ感染が、中耳においてである、項目１２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例５に記載される効力実験に関する免疫レジメン、ウイルス接種、細菌チャレンジおよびＯＭ疾患の評価期間のタイムラインを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（本発明のＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛（ＰｉｌＡ）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明のキメラタンパク質は、ｐｉｌＡ遺伝子によってコードされる、ＮＴＨｉのＩＶ型ピリ線毛の主要サブユニットの全長または一部分を含み得る。ＮＴＨｉ単離株８６−０２８ＮＰのＰｉｌＡタンパク質は、配列番号２として示される核酸配列によってコードされる。配列番号２は、米国特許出願第１１／０１９，００５号中に記載される。米国特許出願第１１／０１９，００５号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。また提供されるのは、ＮＴＨｉの臨床単離株１７２８ＭＥＥ、１７２９ＭＥＥ、３２２４Ａ、１０５４８ＭＥＥ、１０６０ＭＥＥ、１８８５ＭＥＥ、１７１４ＭＥＥ、１２３６ＭＥＥ、１１２８ＭＥＥおよび２１４ＮＰ由来のＰｉｌＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。これらのＰｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２に示される。代替的なコドン使用法の可能性が、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて特に意図される。１つの実施形態では、これらのポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１に示されるヌクレオチド配列によってそれぞれコードされる。
【００２９】
本発明は、ストリンジェントな条件下で以下にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１に示されるヌクレオチド配列の相補体；（ｂ）上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｃ）上記のタンパク質のうちのいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；または（ｄ）本発明のポリペプチドの特定のドメインまたは短縮物を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株由来の、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのａ株、ｂ株、ｃ株、ｅ株およびｆ株由来のＰｉｌＡポリヌクレオチドが特に意図される。これらのポリヌクレオチドは、それぞれ、プローブまたはプライマーとして配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１のポリヌクレオチドの一部分または全てを用いて、当該分野において標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応）によって同定および単離され得る。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドに実質的に均等なヌクレオチド配列を包含する。本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％の、より代表的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％の、さらにより代表的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を、上記のＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して有し得る。
【００３１】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１のＮＴＨｉヌクレオチド配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、このフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きく、好ましくは７ヌクレオチドより大きく、より好ましくは９ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは１７ヌクレオチドよりも大きい。例えば、選択的である（すなわち、本発明のＰｉｌＡポリヌクレオチドのうちのいずれか１つに対して特異的にハイブリダイズする）、１５ヌクレオチド、１７ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドまたはそれより大きなヌクレオチドのフラグメントが意図される。本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズし得るこれらの核酸配列フラグメントは、本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして用いられ得るか、そして／または本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリヌクレオチドを他の細菌遺伝子から識別し得、そして好ましくは独特なヌクレオチド配列に基づく。
【００３２】
用語「ストリンジェント」は、本明細書中では、当該分野においてストリンジェントと通常理解される条件をいうために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、６５〜６８℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または４２℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
【００３３】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた使用され得るが、ハイブリダイゼーション速度が影響される。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する例では、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴについて）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄が挙げられる。
【００３４】
他の薬剤もまた、非特異的ハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを減らすことを目的として、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ））、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）およびデキストラン硫酸であるが、他の適切な薬剤もまた使用され得る。これらの添加剤の濃度およびタイプは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、ｐＨ６．８〜７．４において通常実施されるが、代表的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーション速度はｐＨとはほぼ独立している。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適合させるために、そして異なる配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者によって調整され得る。
【００３５】
上記のように、本発明によって意図されるポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１の特定のＰｉｌＡポリヌクレオチドに限定されないが、例えば、それらの対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションをも包含する。対立遺伝子バリエーションおよび種バリエーションは、配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１中に提供される配列（好ましくはそれらの中のオープンリーディングフレーム、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１内のオープンリーディングフレームに対して少なくとも９０％同一の（好ましくは９５％同一の）ヌクレオチド配列）を、同種または別種の別の単離株由来の配列と比較することによって慣用的に決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるがこれに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，前出）から公に入手され得る。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用しても、同一性を決定し得る。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離されてもよく、または標準的な化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１０３：３１８５（１９８１）において記載されるホスホトリエステル法）によって合成されてもよい。
【００３７】
本発明は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分を含むキメラタンパク質を提供する。１つの実施形態では、これらのポリペプチドは、配列番号２においてそれぞれ示される、ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２に示されるＰｉｌＡポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態では、本発明のＰｉｌＡポリペプチドは、他の分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のものおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのａ株、ｂ株、ｃ株、ｅ株およびｆ株由来のものである。
【００３８】
本発明のポリペプチドとしては、本発明の全長ポリペプチドの１つまたはそれより多くの生物学的特性または免疫学的特性を保持する、ＰｉｌＡポリペプチドのペプチドフラグメント（すなわち、ペプチド）またはフラグメントが特に挙げられる。１つの実施形態では、本発明によって提供されるＰｉｌＡペプチドフラグメントは、ＴｆｐＱ２、ＴｆｐＱ３、ＴｆｐＱ４およびＯＬＰ３と命名され、そしてそれぞれ、配列番号２のアミノ酸３５〜６８、配列番号２のアミノ酸６９〜１０２、配列番号２のアミノ酸１０３〜１３７、および配列番号２のアミノ酸２１〜３５を含む。本発明によって提供される別のＰｉｌＡペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ酸４０〜１４９を含む。
【００３９】
本発明はまた、ＰｉｌＡポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性に影響を与えない１つまたはそれより多くの保存的アミノ酸置換を有する、ＰｉｌＡポリペプチドの一部分を含むキメラタンパク質を提供する。あるいは、本発明のＰｉｌＡポリペプチドは、生物学的活性を変えてもよくまたは変えなくてもよい、保存的アミノ酸置換を有することが意図される。用語「保存的アミノ酸置換」とは、ネイティブなアミノ酸残基を、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどまたは全く影響がないように非ネイティブ残基（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を包含する）で置換することをいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基を任意の他の非極性残基で置換することによる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」の方法に従ってアラニンで置換され得る。天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖に基づいて以下のとおりに特徴付けられる：塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アルパラギン酸；非荷電で極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン；および非極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換についての一般則を以下の表１に示す。
【００４０】
【表１】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリペプチドの改変体の一部分を含み、生物学的活性および／または免疫学的活性を保持する、キメラタンパク質（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、代表的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、より代表的には少なくとも約９８％、または最も代表的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を、配列番号２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２のポリペプチドに対して示すポリペプチド）を提供する。
【００４１】
本発明は、本発明のＰｉｌＡポリヌクレオチドが増幅または発現用のベクター中に挿入され得ることを意図する。発現のために、これらのポリヌクレオチドは、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列）に作動可能に連結される。さらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。例示的な原核生物宿主細胞としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｅｒｒａｔｉａ）が挙げられる。宿主細胞を増殖させ、そして宿主細胞または増殖培地からポリペプチドを単離することによって本発明のポリペプチドを産生する方法が特に意図される。あるいは、本発明のポリペプチドは、標準的な手段を用いて化学合成によって調製され得る。特に便利であるのは、固相技術（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２５５を参照のこと）である。自動固相合成機は市販されている。さらに、配列中の改変が、適切な残基の置換、付加または省略によって容易に作製される。例えば、システイン残基がカルボキシ末端に付加されて、キャリアタンパク質への便利な結合のためにスルフヒドリル基が提供されてもよく、またはスペーサーエレメント（例えば、さらなるグリシン残基）が、Ｃ末端の連結アミノ酸とペプチドの残りの部分との間に配列中に組み込まれてもよい。
【００４２】
用語「単離された」とは、その物質が天然に存在する環境中の他の成分から取り出されており、そして本質的にその他の成分を含まない物質をいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞性タンパク質から分離されるか、またはＤＮＡは、それが天然で存在するゲノム中でそれと隣接している他のＤＮＡから分離される。
【００４３】
組換えＰｉｌＡタンパク質（ｒＰｉｌＡ）は、より容易に更新可能な生成物として役立たせるために生成され得る。これを行うために、Ｋｅｉｚｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２４１８６−１４１９３，２００１）の公開されたプロトコルを利用する。Ｋｅｉｚｅｒらは、ネイティブなピリンサブユニットの機能的特性を保有するようにｒＰｉｌＡが同様に適切に折り畳まれることが重要であるので、ピリン（これもまた、４つのＣｙｓ残基を有する）を研究した。手短に述べると、短縮されたピリンが操作され、ここで、凝集を防ぐために最初の２８残基がＮ末端から除去され、そしてこの短縮化ピリンは、構築物中にＯｍｐＡリーダー配列を組み込むことにより、ペリプラズムへと輸送されるようにさらに操作される。このストラテジーを用いて、Ｋｅｉｚｅｒらは、組換え可溶性モノマーＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａピリンタンパク質を生成した。このピリンタンパク質は、そのレセプター（アシアロＧＭ１）にインビトロアッセイで結合し得、そしてこのペプチドを異種チャレンジの１５分前に送達した場合、マウスにおける罹患率および死亡率を減少させ得た。この可溶性でモノマーの短縮形態のＮＴＨｉ ＰｉｌＡは、本明細書中に記載される研究において有用である。
【００４４】
本発明はまた、合成キメラタンパク質を提供する。これらのキメラタンパク質は、標準的な技術を用いて合成、精製および配列決定され得る。例えば、これらのキメラタンパク質は、段階的Ｆｍｏｃ−ｔｅｒｔ−ブチル固相合成によって半ば手動で集合させられ得、そしてＨＰＬＣによって精製され得る。組換えキメラタンパク質および合成キメラタンパク質の組成およびアミノ酸配列は、アミノ酸分析および／または質量スペクトル分析により確認され得る。
【００４５】
（抗体）
本発明は、本発明のキメラタンパク質の抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの独特のエピトープに対するそれらの結合能力を保持した抗体フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単鎖抗体およびヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗体は、本発明のキメラタンパク質または本発明のキメラタンパク質を発現する宿主細胞を抗原として用いて、当該分野で標準的な技術によって作製され得る。
【００４６】
本発明は、本発明のキメラタンパク質およびそれらのフラグメントに特異的な抗体を提供し、この抗体は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺傷する能力およびヒトを感染から防御する能力の両方を示す。本発明はまた、本発明のキメラタンパク質に特異的な抗体を提供し、この抗体は、ビルレンスを低減し、付着を阻害し、バイオフィルム形成を阻害し、単収縮運動性を阻害し、細胞分裂を阻害し、そして／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への透過を阻害し、そして／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の食作用を増強する。
【００４７】
インビトロでの補体媒介性殺細菌アッセイ系（Ｍｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４，１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８，１９７２）を用いて、抗キメラタンパク質抗体の殺細菌活性を測定し得る。
【００４８】
本発明のキメラタンパク質に対して予め形成された抗体の投与による受動免疫療法によって短期防御を宿主に付与することもまた可能である。従って、本発明の抗体は、受動免疫療法において用いられ得る。ヒト免疫グロブリンは、ヒトの医薬において好ましい。なぜなら、異種の免疫グロブリンは、その外来免疫原性成分に対して免疫応答を惹起し得るからである。このような受動免疫は、特別な危険性に曝される未免疫の個体の迅速な防御に関して緊急時に用いられ得る。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生において用いられ得、この抗イディオタイプ抗体は次いで、このキメラタンパク質エピトープまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅエピトープに対する免疫応答を刺激するための抗原として用いられ得る。
【００５０】
（免疫応答を惹起するための方法およびそれらのための組成物）
本発明は、個体におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫応答を個体において惹起する方法を意図する。特定の実施形態では、これらの方法は、本発明のキメラタンパク質に対する免疫応答を惹起する。これらの方法は、１つまたはそれより多くの免疫応答を惹起し、これらの応答としては、細菌複製を阻害する免疫応答、細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着をブロックする免疫応答、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの単収縮を予防する免疫応答、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺傷する免疫応答およびバイオフィルム形成を防御する免疫応答が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。別の実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質を発現する細胞を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。なお別の実施形態では、これらの方法は、本発明の１つまたはそれより多くのキメラタンパク質をコードする１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。これらのポリヌクレオチドは、他のあらゆる核酸と会合していない裸のポリヌクレオチドであってもよく、またはプラスミドもしくはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）のようなベクター中に存在してもよい。これらの方法は、１個体において組み合わせて用いられ得る。これらの方法は、個体のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染の前または感染後に用いられ得る。本発明の方法および組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類可能型（ｔｙｐｅａｂｌｅ）株および分類不能型株）に関連する任意の病理学的状態（例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋（ｅｐｉｇｌｏｔｔｉｓ）、心膜、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症および慢性閉塞性肺疾患および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症）の悪化を処置または予防するために用いられ得る。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物は、プライミング用量として投与され、続いて１またはそれより多くの追加免疫用量として投与される。免疫を有益に増強するタンパク質またはポリペプチド（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘発性分子（例えば、Ｌｅａｆ）または補助刺激分子）の共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）もまた意図される。
【００５２】
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与後に、投与前に検出可能な免疫応答と比較して、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、検出可能な体液性（抗体）免疫応答および／または細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を生じる用量である。本発明は、これらの方法によって得られる免疫応答が防御性および／または治療性であり得ることを意図する。好ましい実施形態では、この抗体および／またはＴ細胞免疫応答は、個体をＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染（特に、中耳および／または鼻咽頭もしくは下気道の感染）から防御する。この用途では、正確な用量は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者１人あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、より一般的には体重７０ｋｇあたり約１０μｇ〜約５００μｇの範囲に及ぶ。
【００５３】
体液性免疫応答は、多くの周知の方法（例えば、単放射状免疫拡散アッセイ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｒａｄｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＳＲＩＤ）、酵素免疫アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）および赤血球凝集阻害アッセイ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＨＡＩ））によって測定され得る。特に、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含むゲル（例えば、アガロース）の層を利用する。このゲル中にウェルが切り出され、そして試験される血清がそのウェル中に配置される。ゲルへの抗体の拡散により沈降環が形成され、その沈降環の面積は、試験される血清中での抗体濃度に比例する。ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）としても公知）は、サンプル中の抗体の合計を決定するために用いられる。この免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。この試験血清は、プレートに曝露され、続いて酵素結合免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に曝露される。このプレートに付着した酵素活性は、任意の便利な手段（例えば、分光測光法）によって定量され、そして試験サンプル中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、免疫原（例えば、ウイルスタンパク質）のニワトリ赤血球（など）凝集能力を利用する。このアッセイは、中和抗体（すなわち、赤血球凝集を阻害し得る抗体）を検出する。試験血清の希釈物は、標準濃度の免疫原とともにインキュベートされ、続いて赤血球が添加される。中和抗体の存在は、免疫原による赤血球の凝集を阻害する。細胞性免疫応答を測定する試験としては、遅延型過敏症の決定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖応答の測定が挙げられる。
【００５４】
本発明は、本発明のキメラタンパク質に対する免疫応答を惹起するために適切な組成物を対応して提供する。上記のように、これらの組成物は、１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質、１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質を発現する細胞、または１つもしくはそれより多くのキメラタンパク質をコードする１つもしくはそれより多くのポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、他の成分（例えば、キャリアおよびアジュバント）も含み得る。
【００５５】
本発明の組成物では、キメラタンパク質は、組換え法によって産生される場合、別のタンパク質に融合され得る。１つの実施形態では、この他のタンパク質は、それ単独では、抗体を惹起しないかもしれないが、第１のタンパク質を安定化し、そして免疫原性活性を保持する融合タンパク質を形成する。別の実施形態では、この融合タンパク質は、免疫原性である別のタンパク質（例えば、融合タンパク質を可溶化し、そしてそれらの産生および精製を容易にする比較的大きな共タンパク質（ｃｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）である、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ）を含む。この他のタンパク質は、免疫系の全身刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。この他のタンパク質は、本発明のキメラタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかへと融合され得る。
【００５６】
本発明の他の組成物では、キメラタンパク質は、他の方法でキャリア物質へと連結され得る。当該分野で公知のこのような連結を作製する任意の方法が用いられ得る。連結は、一方の官能基端にジスルフィド結合を生じ、他方にペプチド結合を生じる、ヘテロ二官能性薬剤（例えば、ジスルフィドアミド形成剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５，１９８２）を参照のこと））およびジスルフィド結合ではなくチオエーテル結合を形成する二官能性カップリング剤（例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステル）、ならびにナトリウム塩（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））についてはスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸と合わせることによりカルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて形成され得る。
【００５７】
これらのキメラタンパク質は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）および無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）を用いて形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩ））および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカイン）から形成され得る。
【００５８】
本発明の組成物は、アジュバントをさらに含み得る。既知のアジュバントとしては、例えば、乳濁液（例えば、フロイントアジュバントおよび他の油乳濁液）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａからの精製サポニン（ＱＳ２１）、アルミニウム塩（例えば、水酸化物、リン酸塩および明礬）、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、ゲル（例えば、水酸化アルミニウム塩）、マイコバクテリウム生成物（ムラミルジペプチドが挙げられる）、固体物質、粒子（例えば、リポソームおよびビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ））が挙げられる。アジュバントとして使用されることが公知の天然の生成物および細菌性生成物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５２９（合成ＭＰＬ様アシル化モノサッカリド）、ＯＭ−１７４（これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのリピドＡ誘導体である）、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）またはその誘導体のうちの１つ、百日咳毒素（ＰＴ）およびＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素（ＬＴ）またはその誘導体のうちの１つ）、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、多くの要因（例えば、キャリア効果、蓄積物形成、改変されたリンパ球再循環、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激およびマクロファージの刺激）によって影響され得る。
【００５９】
本発明の組成物は代表的に、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能物として処方される；注射の前に液体中に溶解または懸濁するために適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。活性な免疫原性成分はしばしば賦形剤と混合され、これらの賦形剤は、薬学的に受容可能であり、かつこの活性成分と適合性である。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望の場合、これらのワクチンは、小量の補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバント（これはワクチンの有効性を増強する））を含み得る。これらのワクチンは、非経口で、注射により（例えば、皮下または筋肉内のいずれかで）従来どおりに投与される。
【００６０】
他の投与形態に適切であるさらなる処方物としては坐剤が挙げられ、場合によっては経口処方物が挙げられる。坐剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレン（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る；このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物としては、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方物または粉剤の形態をとり、そして１０％〜９５％（好ましくは２５％〜７０％）の活性成分を含む。
【００６１】
組成物はまた、ジェット式注射器、顕微針、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロカプセル化、ポリマーまたはリポソームを利用して経皮経路を通して、ネブライザー、エアゾールおよび鼻スプレーを使用して経粘膜経路および鼻腔内経路を通して、投与され得る。天然または合成のポリマー（例えば、澱粉、アルギネートおよびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−乳酸−ｃｏグリコール酸マイクロスフェア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリホスファゼン、ポリホスファタゼン）を用いたマイクロカプセル化は、経皮投与および経粘膜投与の両方について有用である。合成ポリオルニテート（ｐｏｌｙ−ｏｒｎｉｔｈａｔｅ）、ポリリジンおよびポリアルギニンまたは両親媒性ペプチドを含むポリマー複合体は、経皮送達系に有用である。さらに、それらの両親媒性という性質に起因して、リポソームは、経皮ワクチン送達系、経粘膜ワクチン送達系および鼻腔内ワクチン送達系が意図される。ワクチン送達のために使用される通常の脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウム−メチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ−プロピル−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジミスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ｄｉｍｙｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ；ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｉ）が挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームとの組み合わせは、皮膚を通してのリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。さらに、チリシャボンノキ樹皮（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のトリテルペノイドグリコシドまたはサポニンおよびキトサン（脱アセチル化キタン（ｃｈｉｔａｎ））は、鼻腔内ワクチン送達および経粘膜ワクチン送達に有用なアジュバントであることが意図される。
【００６２】
処方物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、封のされたアンプルおよびバイアル）中で提示され得、そして使用直前の滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。
【００６３】
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの阻害方法）
あるいは、本発明は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩＶ型ピリ線毛機能を個体において阻害する方法を包含する。この方法は、この個体に、例えば、１もしくはそれより多くの本発明の抗体および／または１もしくはそれより多くの本発明のキメラタンパク質を、ピリ線毛の機能を阻害する量で投与する工程を包含する。インビトロアッセイを用いて、ピリ線毛機能を阻害する能力を実証し得る。これらの方法の実施形態としては、例えば、ＩＶ型ピリ線毛によって媒介される付着のインヒビターを用いる方法、ＩＶ型ピリ線毛によって媒介される既存のバイオフィルムを破壊するインヒビターを用いる方法、および単収縮のインヒビターを用いる方法が挙げられる。
【００６４】
阻害は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに関与する任意の病理学的状態（例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染および新生児感染、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋、心膜、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染、尿路感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、慢性閉塞性肺疾患および基礎をなす肺疾患（例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症）の悪化）について意図される。
【００６５】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩＶ型ピリ線毛機能のインヒビターを含む組成物が提供される。この組成物は、上記の活性成分のうちの１つのみからなってもよく、上記の活性成分の組み合わせを含んでもよく、または、細菌感染を処置するために用いられるさらなる活性成分を含んでもよい。上記で考察したとおり、これらの組成物は、１またはそれより多くのさらなる成分（例えば、薬学的に有効なキャリア）を含み得る。上記でも考察されるように、これらの組成物の投与量および投与頻度は、標準的な技術によって決定され、そして例えば、個体の体重および齢、投与経路、ならびに症状の重篤度に依存する。これらの薬学的組成物の投与は、当該分野で標準的な（例えば、非経口、静脈内、経口、頬内、鼻腔、肺、直腸、鼻腔内または膣の）経路によって行われ得る。
【００６６】
（動物モデル）
本発明の方法は、ＯＭについての実験モデルとして広く受け入れられているチンチラモデルにおいて実証され得る。特に、ＮＴＨｉ誘発性ＯＭのチンチラモデルはよく特徴付けられており（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−８７２，１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：２２３−２２５，１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：１７１０−１７１８，１９９４；Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７１：３４５４−３４６２，２００３）、そしてＯＭに対するいくつかのＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物の防御効力を決定するために用いられている（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：９５５−９６１，１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７：２７４６−２７６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：２７５６−２７６５，２０００；Ｋｙｄ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６：２２７２−２２７８，２００３；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，１９７８−１９８３，２００３）。
【００６７】
このモデルでは、アデノウイルスは、チンチラをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性ＯＭ媒体に罹りやすくする。このことは、ＮＴＨｉの生物学的評価のための関連した細胞、組織および器官の培養系の確立を可能にした（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：８６５−７２，１９９３；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：１７１０−８，１９９４）。アデノウイルス感染単独を用いて、誘導された血清抗体の鼓室への漏出が評価されており（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４（２）：２２３−５，１９９７）、そしてＮＴＨｉとともに共病原体（ｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）として用いられて、中耳炎に対する痘苗原としての種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物を標的とするいくつかの能動免疫レジメンおよび受動免疫レジメンの防御効力が決定されている（Ｂａｋａｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７（６）：２７４６−６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８（５）：２７５６−６５，２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（４）：２１１９−２８，２０００；Ｐｏｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１０８−１５，２０００）。
【実施例】
【００６８】
（発明の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を例示し、ここで、実施例１は、本発明のキメラタンパク質の組換え産生を記載し、実施例２は、本発明のキメラタンパク質の免疫原性を試験するアッセイを記載し、実施例３は、受動免疫を評価するためのアッセイを記載し、実施例４は、能動免疫を評価するためのアッセイを記載し、そして実施例５は、本発明のキメラタンパク質の評価を記載する。
【００６９】
（実施例１ キメラタンパク質の合成）
本発明のキメラタンパク質を、標準的な組換え法を用いて産生した。最初に、遺伝子合成会社（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）が、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましいコドン使用法に最適化した、本明細書中に記載のキメラタンパク質のアミノ酸配列に基づいて最初のプラスミドを作製するという契約を結んだ。手短に述べると、Ｎ末端（配列番号２の残基１〜３９）を切り落とし、そして配列番号３に示すＨＩＳタグ配列およびトロンビン切断部位を付加することにより、ネイティブなＮＴＨｉピリンタンパク質配列を改変した。このＨＩＳタグの前には、発現を補助するための配列（ＭＧＳＳ）があった。トロンビン切断部位は、ＨＩＳタグの放出を可能にした。次いで、これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。次いでこのプラスミドを、可溶性Ｈｉｓタグ化キメラタンパク質の発現のための宿主としてＥ．ｃｏｌｉ株「Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）」（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能）中に形質転換した。使用され得る別のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞発現株は、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【００７０】
このキメラタンパク質のＨｉｓタグ化改変体を、ニッケルカラムクロマトグラフィーによって回収し、次いで最初の研究に用いて、以下のうちのいずれかに対する抗血清と反応性であるか否かを決定する：ネイティブなＯＭＰ Ｐ５−フィンブリン、ＬＢ１（全長４０アミノ酸ペプチド）、ＬＢ１（１）（ＬＢ１の１９アミノ酸のＢ細胞エピトープのみを提示する合成ペプチド）、組換えＰｉｌＡタンパク質またはネイティブなＰｉｌＡタンパク質。一旦Ｈｉｓタグがトロンビン部位切断によって除去されると、この組換えキメラタンパク質は免疫原として用いられて、それらの免疫原性および防御能力が決定される。
【００７１】
本発明の例示的なキメラタンパク質は、以下の表２に示す配列を有する。配列番号１０のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質、配列番号１２のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質および配列番号１４のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質が、上記のとおりにＥ．ｃｏｌｉによって発現されている。
【００７２】
【表２−１】
【００７３】
【表２−２】
【００７４】
【表２−３】
本発明のさらなる例示的なキメラタンパク質は、以下の表３に示すとおりのアミノ酸配列を有する。これらのキメラタンパク質は、上記のとおりに、Ｅ．ｃｏｌｉによって発現されており、そしてＨＩＳタグを用いて精製されている。表３に示されるキメラタンパク質は、免疫原として使用するために除去されるＨＩＳタグ配列を有する。配列番号５６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質を、実施例５に記載した研究において用いた。
【００７５】
【表３】
（実施例２ キメラタンパク質の免疫原性）
ウサギまたはチンチラを、これらのキメラタンパク質で免疫する。ウサギは、完全フロイントアジュバント中の５００μｇの第１免疫用量のキメラタンパク質を受ける。これらのウサギは、４００μｇの第２用量のキメラタンパク質を２１日後に受ける。これらのウサギは、完全フロイントアジュバント中の第３用量のキメラタンパク質を、ＩＦＡまたはＰＢＳのいずれか中での４００μｇの同じペプチド（１つの希釈剤あたり１羽のウサギ）とともに、第１免疫用量の４２日後に受ける。各投与の３週間後に血清を得る。チンチラは、アジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）中の１０μｇの第１免疫用量のキメラタンパク質を受ける。１ヵ月（約３０日）後、チンチラは、第２の同一の用量を受ける。第３用量でかつ最終用量を第２用量の約３０日後に送達する。各用量の約１０〜１４日後に血清を得る。全ての動物からの血清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびバイオセンサーによって、ＬＢ１ペプチド（４０マー）、ＬＢ１（１）、ＰｉｌＡタンパク質およびキメラタンパク質に対する力価および特異性について評価する。抗血清をまた、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析により、細菌全体に対して試験する。
【００７６】
（実施例３ 受動免疫の評価）
本発明のキメラタンパク質に対する動物の免疫応答によって付与される防御を、実験的中耳炎のチンチラモデルにおいて決定する。チンチラを、本発明のキメラタンパク質に対する超免疫チンチラ血清または超免疫ヒト血清５ｍｌ／ｋｇで受動免疫する。コントロールのチンチラは、正常なチンチラ血清または正常なヒト血清を受ける。次に、これらのチンチラは、まず、ウイルス共病原体を鼻腔内に受け、次いで１週間後に、ＮＴＨｉ細菌による鼻腔内チャレンジを受ける。これらのチンチラを検査し、そして細菌チャレンジ後３５日目まで毎日または２日毎に評価する。免疫チンチラ血清またはヒト血清を受ける免疫したチンチラは、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリの両方によって決定したところ、減少した鼓膜病状を表し、そして中耳空間の感染の徴候は減少しているかまたは徴候はない。このアッセイでは、コントロールと比較したとき、チンチラまたはヒトの抗キメラタンパク質血清を受けるチンチラ中の中耳液の存在は減少している。
【００７７】
（実施例４ 能動免疫の評価）
各々５〜１０匹のチンチラのコホートに、食塩水コントロール調製物、アジュバントのみの調製物または適切なアジュバントと混合した本発明のキメラタンパク質のうちの１つのいずれかを能動免疫する。これらの免疫原を、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから名称ＱＣＬ−１０００の下で市販される色素形成性変形溶解産物アッセイによって、免疫源としてのそれらの使用の前に、内毒素含有量について評価する。次いで、これらのチンチラに、アジュバントＭＰＬ（または別の適切なアジュバント）中の１０μｇの免疫原を皮下注射する。次いで３０日後に、これらは、ＭＰＬ中の１０μｇの同じ免疫原を受ける。２回目の免疫の３０日後、これらの動物は最終免疫用量を受ける。最後の免疫用量を送達してから約１０〜１４日後、チンチラにＮＴＨｉの１株を経水疱（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）および鼻腔内の両方でチャレンジする。これらのチンチラを、３５日間の期間にわたって、以下について評価する：ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリにより、鼓膜の病状；下水疱（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｂｕｌｌａ）の鼓室上部穿刺および鼻咽頭の受動洗浄によって回収されたＮＴＨｉの半定量；ならびに組織病理学についての固定された中耳粘膜上皮および鼓膜の光学顕微鏡検査。例えば、本発明のキメラタンパク質で免疫されたチンチラは、減少した鼓膜病状を有し、中耳滲出液がないかもしくは培養陰性である滲出液を含み、鼓室に存在するバイオフィルムは減少しているかもしくは存在せず、中耳粘膜の最小の厚みがあり、最小の骨新生（ｏｓｔｅｏｎｅｏｇｅｎｓｉｓ）があり、そして上皮下空間における赤血球および炎症細胞の両方の存在が減少している。
【００７８】
（実施例５ キメラタンパク質の評価）
配列番号５６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質（本明細書中では「ｃｈｉｍ−Ｖ３」という）の防御効力を、ＯＭのチンチラ受動転移超感染モデルを用いて評価した。このキメラペプチドは、組換えＰｉｌＡ（配列番号２の残基４０〜１４９）のＣ末端グルタミン残基の後に発現されたＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープ（配列番号５）からなっていた。受動転移効力研究において使用するためのポリクローナル抗血清を作製するために、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を、アジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）＋トレハロースジミコレート（Ｃｏｒｉｘａ）とともに成体チンチラのコホートに送達した。免疫レジメンを示すタイムラインを図１に示す。免疫血清プールを作製するために、警戒しやすい（ａｌｅｒｔ ｐｒｏｎｅ）チンチラに３０μｇのｃｈｉｍ−Ｖ３＋１０μｇのＭＰＬまたは１０μｇ ＭＰＬ単独を２１日間毎に３回皮下免疫した。５６日目に、接種した動物の最後の採血を収集し、そして未刺激の若齢動物への転移のために血清をプールした。効力を研究するために、別々のコホートの若齢チンチラを、−７日目に最初にアデノウイルスでチャレンジした。６日後（−１日目）、プールした抗ｃｈｉｍ−Ｖ３免疫血清を、アデノウイルスに曝したこれらの動物へと受動転移した。翌日（０日目）、受動転移による抗ｃｈｉｍ−Ｖ３血清を受けた動物に、分類不能型Ｈａｅｍｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌をチャレンジした。次いで、これらの動物を、ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリによって毎日、ならびにＸｅｎｏｇｅｎインビボ画像化によって１日おきに、（細菌チャレンジに対して）２６日間の時間経過にわたって、疾患の発生率および重篤度についてモニタリングした。
【００７９】
抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体の力価を、接種した動物から収集した免疫血清において、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。この分析は、収集された抗血清がｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質に特異的な抗体を含むことを実証した。収集された抗血清における抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体の存在はまた、ウェスタンブロット分析を用いても確認された。
【００８０】
ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫された動物からの血清免疫グロブリンが、ＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰによって発現される表面に露出したネイティブ構造を認識する能力を測定した。ＮＴＨｉ細菌を、ｃｈｉｍ−Ｖ３抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、次いで未刺激ＦＩＴＣ−プロテインＡまたは免疫ＦＩＴＣ−プロテインＡとともにインキュベートし、洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析により分析した。ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質の接種は、ＮＴＨｉ表面タンパク質またはｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を認識し得る抗体の顕著な増加を誘導した。得られたデータは、抗体力価およびアビディティの両方、ならびにインビトロで増殖させた場合のＮＴＨｉによるＩＶ型ピリ線毛およびＯＭＰ Ｐ５相同接着因子の両方の相対発現に依存した。
【００８１】
発光レポーターＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰ ｐＫＭＬＮ−１を用い、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボリアルタイム画像化を用いて、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質を接種した動物におけるＮＴＨｉ感染を検出した。発光株ＮＴＨｉ ８６−０２８ ＮＰ ｐＫＭＬＮ−１および親株ＮＴＨｉ ８６−０２８の増殖曲線は、発光ＮＴＨｉ株の増殖が親株と匹敵することを実証した。接種した動物の鼻咽頭に住み着いたＮＴＨｉの発光画像化は容易に達成されたが、罹患した中耳の微好気性に起因して、中耳内に存在するＮＴＨｉの発光を疾患経過全体にわたってモニタリングすることはできなかった。なぜなら、発光は、酸素利用可能性に依存するからである。動物を、発光性細菌の存在について１日おきにモニタリングし、そして細菌が検出された場合、これを発光事象として記録した。接種された動物において、チャレンジ後少なくとも６日間発光性感染が検出された。ｃｈｉｍ−Ｖ３接種動物中の発光事象の総数は、（ＭＰＬのみを接種した）コントロール動物における発光事象の総数よりも少なかった。
【００８２】
研究の経過全体をとおして、毎日のビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリを用いて、ＯＭを有するチンチラ中耳のパーセントを決定した。ｃｈｉｍ−Ｖ３の接種は、（ＭＰＬのみを接種した）コントロール動物と比較して、ＯＭを有する中耳を有する動物数の５３％の低下を引き起こした。
【００８３】
これらの研究の全ては、ｃｈｉｍ−Ｖ３タンパク質が免疫原性であったこと、および抗ｃｈｉｍ−Ｖ３抗体がＯＭのチンチラ受動転移超感染モデルにおいて防御性であったことを実証する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１７２３３２（Ｐ２０１０−１７２３３２Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３７７６８（Ｐ２００９−２３７７６８）
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【分割の表示】特願２００８−５２０３５７（Ｐ２００８−５２０３５７）の分割
【原出願日】平成１８年７月５日（２００６．７．５）
【出願人】（５０２２００８３０）ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【分割の表示】特願２００８−５２０３５７（Ｐ２００８−５２０３５７）の分割
【原出願日】平成１８年７月５日（２００６．７．５）
【出願人】（５０２２００８３０）ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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