ＩＢ−ＱＸ様株に由来する伝染性気管支炎ワクチン
本発明は、ＩＢ−ＱＸとして公知である最近確認された遺伝子型のＩＢウイルス、または本明細書においてＩＢ−ＱＸ様ウイルスと呼ぶ、ＩＢ−ＱＸに遺伝的に関係のあるウイルスに由来する、伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスに関する。本発明のＩＢウイルスは、生きており弱毒化されたものでも、不活化されたものでもよい。本発明の弱毒化生ＩＢウイルスは、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的継代によって作製することができる。本発明のＩＢウイルスは、特に、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスに対するワクチンに有用である。これまで、ＩＢウイルスの公知のワクチン株は、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスによって引き起こされる伝染性気管支炎から保護するには不十分であることが分かっていた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２００８年８月８日に出願された仮出願第６１／０８７，２２８号の優先権を米国特許法１１９条（ｅ）項に基づいて主張する。
【０００２】
本発明は、鳥類感染症に対するワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は、伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスに対する新規なワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスは、家禽（例えば、ニワトリ）の呼吸器疾患を引き起こすコロナウイルスである。ＩＢ疾患の症状としては、例えば、呼吸困難、体重減少、産卵低下、異常卵の出現率上昇、および死亡率上昇が挙げられる。
【０００４】
いくつかの異なる遺伝子型および血清型のＩＢウイルスが確認されている。ＩＢウイルスの遺伝子型解析は、一般に、そのウイルスのＳ１（スパイク）タンパク質をコードする遺伝子の全体または一部分を配列決定することによって遂行される。Ｓ１タンパク質は、ＩＢウイルスのゲノムにコードされる大型Ｓ糖タンパク質のＮ末端切断産物である。Ｓ糖タンパク質のＣ末端切断産物は、Ｓ２タンパク質と呼ばれる。Ｓ１タンパク質は細胞付着を担っており、ＩＢウイルスの主要な抗原決定基である。ＩＢウイルスの例示的な遺伝子型（または「株」）としては、７９３Ｂ、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、イタリア（Ｉｔａｌｙ）０２、Ｄ２７４、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、Ｂ１６４８、およびＤ１４６６が挙げられる。（例えば、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７を参照されたい）。
【０００５】
「ＱＸ」と名付けられた（「ＱＸＩＢＶ」とも呼ばれる）新規な遺伝子型のＩＢウイルスは、１９９０年代の終わりに中国で最初に確認された。（Ｌｉｕら（２００６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５１：１１３３〜１１４８を参照されたい）。最初のＱＸ遺伝子型が確認されて以来、Ｓ１ヌクレオチド配列レベルでＱＸとの高度な類似性／同一性を有する多数のＩＢウイルス遺伝子型が世界中で確認されている。これらの「ＩＢ−ＱＸ様」ウイルス（本明細書においてさらに定義される）は、例えば、フランス、ドイツ、オランダ、ベルギー、イギリス、イタリア、およびポーランドで確認されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
明らかに、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは家禽産業に深刻な脅威をもたらす。このタイプのＩＢウイルスが急速に出現していることの重要性にもかかわらず、これまで、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに特異的なワクチンは、当技術分野において利用可能でもなく、説明されてもいなかった。市販されているＩＢワクチン（弱毒化生株）は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスからニワトリを保護するのには効果がないことが判明している。したがって、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスからの特異的保護を実現する新しいワクチン組成物およびワクチン接種方法が当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスによる感染から保護するワクチン組成物中の抗原性成分としてとりわけ有用であるＩＢウイルスを提供することによって、当技術分野における前述の必要を満たす。本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの生きており弱毒化された種類を含む。このような弱毒化生株は、例えば、十分な弱毒化が得られるまでＩＢ−ＱＸ様ウイルスを連続的に継代することによって作製することができる。本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの不活化された種類も含む。本発明において使用するためのＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの寄託株、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス感染の野外症例から、または特定のＳ１遺伝子配列など所定の予め定められた遺伝子セグメントを発現する組換えＩＢウイルスを構築することによって、得ることができる。
【０００８】
本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株または死滅株を含むワクチン組成物、ならびにＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株および／または死滅株を作出するための方法も提供する。本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株または死滅株を含むワクチン組成物を鳥に投与することによって、鳥に伝染性気管支炎のワクチン接種をするための方法も提供する。本発明の他の態様は、本明細書において下記に説明する発明を実施するための形態および実施例から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスを提供する。
【００１０】
本明細書において使用される場合、「ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」という用語は、元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスを意味する。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１（表１を参照されたい）によって表され、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで利用可能である。
【００１１】
【表１】
【００１２】
したがって、配列番号１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスが、本発明の目的のための「ＩＢ−ＱＸ様」ウイルスである。ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの例は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７において説明されており、Ｌ−１１４８（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１１４８／０４」とも呼ばれる）、１４４９−２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１４４９Ｋ／０４」とも呼ばれる）、１４４９−１０（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１４４９Ｔ／０４」とも呼ばれる）、およびＲｏｂｅｒｔｏｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献においてＦＲ／Ｌ−１４５０Ｔ／０５とも呼ばれる）と名付けられたＩＢウイルス遺伝子型が挙げられる。本発明のＩＢウイルスが由来し得る例示的なＩＢ−ＱＸ様株は、下記の表２において説明する。本発明の目的において、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスという用語は、特に、元のＱＸ ＩＢウイルスを含む。
【００１３】
【表２】
【００１４】
Ｓ１コード配列の配列比較のほかに、他の方法を用いてＩＢ−ＱＸ様ウイルスを同定することもできる。このような方法は、例えば、ウイルス試料の大きな集団（ｐｏｏｌ）から候補のＩＢ−ＱＸ様ウイルスを同定するための予備スクリーニングとして使用され得る。これらの予備スクリーニングの内の１つによって、ウイルスがＩＢ−ＱＸ様陽性であると判定される場合、次いで、本明細書において別の箇所で説明するようにＳ１ヌクレオチド遺伝子の配列決定および比較をすることによって、そのウイルスの遺伝子型を確認することができる。ＩＢ−ＱＸ様ウイルス（または推定上のＩＢ−ＱＸ様ウイルス）を同定するための例示的な「予備の」方法は、ＩＢ−ＱＸウイルスまたはＩＢ−ＱＸ様ウイルスに感染した動物に由来する抗血清を、候補ウイルスを中和する能力に関して試験する血清中和である。中和結果が陽性である場合、候補ウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであることが示唆され得る。
【００１５】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの別の例示的な予備スクリーニング方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である。この場合、候補ウイルス由来のＳ１遺伝子のＤＮＡコピーが、ＲＴ−ＰＣＲによって作製される。次いで、このＤＮＡコピーが、非ＩＢ−ＱＸ様株のＳ１遺伝子では切断されない位置でＩＢ−ＱＸ様株のＳ１遺伝子を切断する（または逆の場合も同じ）ことが公知である制限酵素に曝露される。制限断片消化の差は、例えばゲル電気泳動により、結果として生じる消化されたＤＮＡをサイズに基づいて分離することによって可視化することができる。
【００１６】
本発明の単離されたＩＢウイルスは、本明細書において言及するＩＢ−ＱＸ様ウイルスのいずれか、ならびに野外から単離され得る他の任意のＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来してよい。その他のＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、ＩＢウイルスに感染していると疑われるか、またはそうでなければ伝染性気管支炎の１つもしくは複数の症状を示しているニワトリから採取された試料（例えば、口腔咽頭スワブ）をスクリーニングすることによって得ることができる。このような試料からＲＮＡが単離され、Ｓ１遺伝子またはその一部分のＤＮＡコピーが、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製される。次いで、Ｓ１ ＤＮＡコピーが配列決定され、このようにして得られたヌクレオチド配列がＩＢ ＱＸのＳ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と比較され、これら２つの配列間の同一性パーセントが決定される。
【００１７】
いくつかの例示的な実施形態において、本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスＬ−１１４８のＳ１タンパク質（配列番号２）、１４４９−２のＳ１タンパク質（配列番号３）、または１４４９−１０のＳ１タンパク質（配列番号４）と同じアミノ酸配列を有するＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスを含む。これらの株に由来するＳ１タンパク質のアミノ酸配列を表３に示す。
【００１８】
【表３−１】
【００１９】
【表３−２】
【００２０】
また、本発明の単離されたＩＢウイルスは、組換え方法または「逆遺伝学（reverse
genetics）」方法を用いて当業者が作製することもできる。例えば、Ｃａｓａｉｓら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：９０８４〜９０８９では、異種スパイク遺伝子を発現する組換えＩＢウイルスの構築を説明している。（Ｈｏｄｇｓｏｎら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３８０４〜１３８１１も参照されたい）。この系は、ＩＢウイルス感染性クローン、すなわち、例えば、ワクシニアウイルスベクターなどのベクター中にクローニングされた完全長ＩＢウイルスｃＤＮＡの使用を伴う。（例えば、Ｃａｓａｉｓら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２３５９〜１２３６９を参照されたい）。ＩＢウイルス感染性クローンを出発材料として、他の任意のＩＢウイルスのＳ１タンパク質を発現する組換えＩＢウイルスを構築することができる。したがって、Ｃａｓａｉｓらの系またはその変形を用いて、任意のＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＳ１タンパク質（すなわち、配列番号１と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列にコードされるＳ１タンパク質）を発現する組換えＩＢウイルスを容易に作り、それによって、組換えＩＢ−ＱＸ様ウイルスを作製することができる。このようにして作製された組換えＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、本明細書において詳細に説明するように、天然に得られるＩＢ−ＱＸ様ウイルス（例えば、野外での単離物）が使用されるのと同じ様式で、本発明において使用され得る。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「同一性パーセント」とは、対象配列（またはその指定された部分）中のヌクレオチドと同一の参照ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの百分率を意味し、これは、すべての検索パラメーターを初期設定値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、以下、「ＢＬＡＳＴ」と呼ぶ）によって求められる配列同一性パーセントを最大にするために、これらの配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入した後の百分率である。ヌクレオチドの配列同一性パーセントの値は、一致する同一ヌクレオチドの数を同一性パーセントが報告される配列の長さで割ることによって決定される。
【００２２】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは当技術分野において公知であるが、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスは当技術分野において説明も提案もされておらず、したがって、本発明の主題である。本明細書において使用される場合、ＩＢウイルスに関する「由来する」という用語は、ＩＢウイルスが次のいずれかであることを意味する：（１）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫、または（２）ウイルスを不活化するか、もしくはウイルスの病原性を低下させる条件に供されたＩＢ−ＱＸ様ウイルス。したがって、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに「由来する」ウイルスは、生きている／弱毒化されたもの、または不活化された／死滅させられたもののいずれでもよい。
【００２３】
上述したように、いくつかの実施形態において、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスは、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫である。「ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫」は、本明細書において、ウイルス複製の助けとなる環境でＩＢ−ＱＸ様ウイルスを増殖させ、前記環境から取り出し、次いで、同じまたは同様の環境において少なくともさらに１回増殖させた後に得られるウイルスと定義される。増殖および分離の各サイクルは、１回の「継代」とみなされる。ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫は、好ましくは弱毒化され、例えば、弱毒化は、連続的な継代の結果である。
【００２４】
ＩＢウイルス（ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを含む）を連続的に継代する例示的な方法は、ウイルス複製の助けとなる環境として家禽（例えば、ニワトリ）の発育卵の使用を伴う。例えば、発育鶏卵に、尿膜腔を介してある量のＩＢ−ＱＸ様ウイルスを接種する。接種した卵を、例えば３７℃で２４時間（または他の適切なインキュベーション条件、時間、および温度のもとで）、インキュベートする。これらの卵から尿膜腔液を回収する。この時点で、ウイルスは「１回」継代された。第１の継代物から回収した尿膜腔液を適切に希釈し、次いで、新しい発育卵に接種する。これらの発育卵を例えば３７℃で２４時間インキュベートし、この第２の卵セットから尿膜腔液を回収する。この時点で、ウイルスは「２回」継代された。この様式で継続される継代は、無期限に続けることができる。ＩＢウイルスを継代するのに使用され得る、ウイルス複製の助けとなる代替の環境としては、例えば、ニワトリ腎臓細胞培養物またはニワトリ胎仔線維芽細胞培養物などの細胞培養物が挙げられる。
【００２５】
ＩＢウイルスを継代するための例示的なインキュベーションステップとして、３７℃で２４時間のインキュベーションを本明細書において挙げるが、他のインキュベーション温度および／またはインキュベーション時間を使用できることを当業者は理解するであろう。例えば、発育卵は、２０℃〜４２℃の範囲の温度でインキュベートしてよい。ウイルス継代のためのインキュベーション時間は、４時間〜４日、より好ましくは、１６〜３６時間の範囲でよい。
【００２６】
各継代の後（または、２回毎、４回毎、５回毎、１０回毎などの継代後）、ウイルス試料をビルレンスの程度に関して試験してよい。ビルレンスの程度は、例えば、継代されたウイルスをヒヨコに投与し、伝染性気管支炎を示す様々なパラメーターを評価することによって決定することができる。例示的なパラメーターとしては次のものが挙げられる。（ｉ）気管外植片の繊毛活動、（ｉｉ）例えば、眼もしくは鼻からの水様滲出液、喘ぎ、または下痢などの臨床徴候、（ｉｉｉ）例えば、上気道、腎臓、脾臓、および／または腸の肉眼による病理学的検査、ならびに（ｉｖ）気管、肺および腎臓の組織像。これらの各パラメーターの例示的な測定値を下記の実施例２において提示する。連続的継代によるＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来ＩＢウイルスは、伝染性気管支炎を示すこれらのパラメーターの内の１つまたは複数が、親（継代されていない）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに感染したヒヨコにおいて観察される対応するパラメーターと比べて減少、消失、または改善している場合、「弱毒化」されているとみなされる。比較は、他の公知のビルレントＩＢウイルス株に感染したヒヨコに対して行ってもよい。
【００２７】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する連続的に継代されたＩＢウイルスのビルレンスを評価するための非限定的な例示的方法を実施例２において示す。手短に言えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する連続的に継代されたＩＢウイルスを接種されたヒヨコに、（ｉ）気管外植片の繊毛活動、（ｉｉ）臨床徴候、および（ｉｉｉ）病理学的検査を反映する数値的スコアを与える。合計スコア［（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）］を決定する。ビルレンス分類を次のように確立する。
・「非ビルレント」：合計スコアが、チャレンジされていない対照群の合計スコア以下である場合。
・「軽度」：合計スコアが、チャレンジされていない対照群の合計スコアを上回るが、公知の軽度のＩＢウイルス株（例えば、ＰＯＵＬＶＡＣ ＩＢ Ｈ１２０（マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）株）、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・「中程度のビルレント」：合計スコアが、公知の軽度のＩＢウイルス株をチャレンジされた群の合計スコアを上回るが、公知のビルレントＩＢウイルス株（例えば、親ＩＢ−ＱＸ様株またはＩＢ−Ｍ４１株など他の公知のビルレント株）をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・「ビルレント」：合計スコアが、公知のビルレントＩＢウイルス株をチャレンジされた群の合計スコア以上である場合。
【００２８】
前述の分類スキームに従って「非ビルレント」または「軽度」と分類されるＩＢウイルスは、弱毒化生ワクチン株として適切である。いくつかの状況において、「中程度のビルレント」ＩＢウイルスもまた、弱毒化生ワクチン株として適切であり得る。
【００２９】
連続的に継代されたＩＢ−ＱＸ様ウイルスのワクチン株としての適性を評価するための代替方法は当技術分野において公知であり、本明細書において別の場所で、例えば実施例３において例示する。実施例３に示すように、繊毛スコアならびに腎臓および気管の形態を利用して、複数回継代後の弱毒化の程度を判定する。これらのパラメーターは、次に、所与の株がワクチン目的に適しているか（例えば、安全性は十分であるか）どうかを判定するために使用され得る。
【００３０】
上述したように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに「由来する」ＩＢウイルスの他の範ちゅうは、ウイルスを不活化するか、またはウイルスの病原性を低下させる条件に供されたＩＢ−ＱＸ様ウイルスである。典型的には弱毒化生ウイルスである、連続的に継代されたＩＢウイルスとは対照的に、この第２の範ちゅうに入るＩＢウイルスは、典型的には不活化されるかまたは死滅させられていると考えられる。ＩＢウイルスを含むウイルスを不活化する方法は、当技術分野において公知である。
【００３１】
したがって、上記の考察が示すように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する本発明のＩＢウイルスは、不活化されるか、または弱毒化されてよい。不活化される場合、本発明のＩＢウイルスは、例えばβ−プロピオラクトンまたはホルマリンなどの不活化化合物にウイルスを接触させることによって、不活化され得る。弱毒化される場合、本発明のＩＢウイルスは、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの最初の継代から始める連続的継代によって弱毒化され得る。これらのＩＢウイルスは、ウイルス複製の助けとなる任意の環境で継代してよい。このような環境としては、例えば、家禽の発育卵が挙げられる。家禽の発育卵としては、例えば、特定病原体除去（ＳＰＦ）鶏卵などの発育鶏卵が挙げられる。他の適切な環境としては、例えば、細胞培養物が挙げられる。
【００３２】
本発明のＩＢウイルスを弱毒化するために、これらのウイルスを任意の回数継代してよい。いくつかの実施形態において、ウイルスは、結果として生じるウイルスが、本明細書の別の場所で言及した分類方法によって「非ビルレント」、「軽度」、または（いくつかの状況において）「軽度ビルレント」のいずれかとして特徴付けられるように、少なくとも十分な回数、継代される。いくつかの例示的な実施形態において、本発明のＩＢウイルスは、５〜４００回継代される。例えば、ＩＢウイルスは、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、６５回、７０回、７５回、８０回、８５回、９０回、９５回、１００回、１０５回、１１０回、１１５回、１２０回、１２５回、１３０回、１３５回、１４０回、１４５回、１５０回、１５５回、１６０回、１６５回、１７０回、１７５回、１８０回、１８５回、１９０回、１９５回、２００回、２０５回、２１０回、２１５回、２２０回、２２５回、２３０回、２３５回、２４０回、２４５回、２５０回、２５５回、２６０回、２６５回、２７０回、２７５回、２８０回、２８５回、２９０回、２９５回、３００回、３０５回、３１０回、３１５回、３２０回、３２５回、３３０回、３３５回、３４０回、３４５回、３５０回、３５５回、３６０回、３６５回、３７０回、３７５回、３８０回、３８５回、３９０回、３９５回、４００回、または必要もしくは所望の場合には、それより多い回数、継代してよい。
【００３３】
本発明のＩＢウイルスは、好ましくは単離される。本明細書において使用される場合、「単離される」という用語は、ウイルスが、生きた動物の組織内に含有されないことを意味する。
【００３４】
本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎ウイルスのいくつかの非限定的な実施例を含む。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスＬ−１１４８を、１０〜１１日目の特定病原体除去（ＳＰＦ）発育鶏卵において６４回継代した。６５回目の継代のために、継代レベル６４から得た尿膜腔液の１０００倍希釈物０．２ｍＬをＳＰＦ卵に接種した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、尿膜腔液の分取物（ｐｏｏｌ）を回収した。６５回継代された材料は、本明細書においてＬ−１１４８（ｐ６５）と呼ばれる（実施例３を参照されたい）。滅菌したＬ−１１４８（ｐ６５）分取物を選択し、まとめ、安定化剤と混合し、３ｍＬバイアルに入れ（バイアル１本当たり１ｍＬ）、凍結乾燥して、マスターシードウイルスＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５を作った。さらに１５回の継代を実施して、合計８０回の継代を行って、Ｌ−１１４８（ｐ８０）を作製した（実施例３を参照されたい）。６５回継代された材料と同様に、８０回継代物から尿膜腔液の分取物を回収した。滅菌した分取物を選択し、まとめ、安定化剤と混合し、３ｍＬバイアルに入れ（バイアル１本当たり１ｍＬ）、凍結乾燥して、マスターシードウイルスＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０を作った。ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５およびＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０をさらに５回それぞれ継代して、それぞれＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ Ｘ＋５およびＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ Ｘ＋５を得た。
【００３５】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００２を割り付けられた。
【００３６】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００４を割り付けられた。
【００３７】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００３を割り付けられた。
【００３８】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００１を割り付けられた。
【００３９】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスのその他の非限定的な例は、本明細書の別の場所で説明する。
【００４０】
本発明は、（ｉ）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスおよび（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含むワクチン組成物を含む。薬学的に許容できる担体は、例えば、水、安定化剤、保存剤、培地、もしくは緩衝剤、または前記のものの任意の組合せでよい。本発明のワクチン組成物は、懸濁液の形態もしくは凍結乾燥した形態、または別法として、凍結した形態で調製することができる。凍結する場合には、凍結時の安定性を向上させるために、グリセロールまたは他の同様な作用物質を添加してよい。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、特に、組成物内に含有されるＩＢウイルスを不活化する（すなわち、死滅させる）場合には、アジュバントを含んでよい。アジュバントは、アクリルポリマー、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、またはアクリルポリマーおよびＤＤＡの組合せでよい。本明細書において使用される場合、アクリルポリマーとは、アクリル部分を含有する任意のポリマーまたはコポリマーである。例示的なアクリルポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、メタクリル酸、メタクリラート、アクリルアミド、アクリラート、アクリルニトリル、およびポリアクリル酸のアルキルエステルが挙げられる。アクリルコポリマーの例としては、例えば、ポリ（アクリルアミド−ｃｏブチル、メタクリラート）、アクリル−メタクリル酸、アクリル−アクリルアミド、およびポリ（メタクリラート）が挙げられる。市販されているアクリルポリマーの例としては、カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、カーボセット（Ｃａｒｂｏｓｅｔ）、（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、ネオクリル（Ｎｅｏｃｒｙｌ）（Ａｖｅｃｉａ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）、およびユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）（Ｒｏｈｍ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｍａｌｄｅｎ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。本発明のエマルジョンにおいて使用するために特に好ましいアクリルポリマーはカーボポールであり、これは、ポリアリールスクロースで架橋されたアクリル酸の水溶性ポリマーとも呼ばれる。アジュバントは、水溶性アジュバントでも水分散性アジュバントでもよい。アジュバントは、油エマルジョン、例えば、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、または水中油中水型エマルジョンでよい。油中水型エマルジョンはさらに、１つもしくは複数の油溶性界面活性剤、１つもしくは複数の水溶性界面活性剤、付加的なアジュバント、付加的な水相成分、エマルジョン安定化剤、またはそれらの組合せを含んでよい。
【００４２】
本発明のワクチン組成物は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスに加えて、他の抗原性成分も含んでよい。ワクチン組成物中に含まれる他の抗原性成分は、感染病原体、例えば、ニワトリの感染病原体に由来してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する少なくとも１つの付加的な弱毒化生ＩＢウイルスをさらに含んでもよい。本明細書において使用される場合、「非ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」とは、元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対する同一性が９５％未満であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のＩＢウイルスを意味する。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１によって表され、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで利用可能である。したがって、配列番号１に対する同一性が９５％未満であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスが、本発明の目的のための「非ＩＢ−ＱＸ様」ウイルスである。例示的な非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスとしては、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、ジョージア（Ｇｅｏｒｇｉａ）−９８、イタリア（Ｉｔａｌｙ）−０２、７９３−Ｂ、Ｄ２７４、Ｄ１４６６、または前述の非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスのいずれかのＳ１遺伝子型を有する株などの株が挙げられる。本発明のワクチン組成物は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスに加えて、１つまたは複数の市販されているＩＢワクチン株も含有してよい。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、ＩＢウイルスではない感染病原体に由来する付加的な抗原性成分を含有してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、弱毒化生トリウイルスまたは不活化トリウイルス、例えば、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、レオウイルス、トリインフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、またはトリ脳脊髄炎ウイルスをさらに含んでよい。
【００４４】
本発明はまた、弱毒化生ＩＢウイルスを調製するための方法も含む。本発明のこの態様に従って調製した弱毒化生ウイルスは、特に、ＩＢウイルスに対してニワトリにワクチン接種をするのに有用である。本発明のこの態様に従う方法は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、家禽の発育卵（例えば、発育鶏卵）において、または細胞培養物（例えば、ニワトリ腎臓細胞培養物）において継代することができる。弱毒化させるためにＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代しなければならない回数は、本明細書において説明する教示に基づいて決定することができる。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代した後に、結果として生じるＩＢウイルスをニワトリに投与することができ、次いで、例えば、気管外植片の繊毛活動、臨床徴候、肉眼的病理、および／または伝染性気管支炎の組織学的徴候についてニワトリを評価する。由来元である親ＩＢ−ＱＸ様ウイルスと比べて（または他の公知の参照ＩＢ株と比べて）、少ないかまたは重症度の低いＩＢ徴候をもたらす継代されたＩＢウイルスは、本発明の目的のための弱毒化株とみなされる。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、得られたウイルスが本明細書の別の場所で説明した分類方法論に従って「非ビルレント」または「軽度」に分類されるまで、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む。
【００４５】
本発明はまた、鳥に伝染性気管支炎のワクチン接種をするための方法も含む。本発明のこの態様に従う方法は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスを鳥に投与するステップを含む。本発明のこの態様に従う方法は、本明細書の別の場所で説明するように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する任意のＩＢウイルスを含む任意のワクチン組成物を投与するステップを含んでよい。本発明のワクチン組成物は、活性成分または抗原性成分が鳥の呼吸器粘膜と直ちにまたは最終的に接触するような任意の様式で、投与することができる。したがって、ワクチン組成物は、例えば、鼻腔内、経口、および／または眼内経由で鳥に投与することができる。鳥類に投与するためのワクチン組成物は、前述したように、および／またはエアロゾル（鼻腔内投与用）を含むスプレーによるか、もしくは飲料水（経口投与用）による投与に適した形態で製剤化することができる。本発明のワクチン組成物はまた、皮下、筋肉内、または卵内に投与することもできる。（米国特許第７，２０８，１６４号を参照されたい）。本発明のこの態様に従って、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスを含むワクチン組成物は、１日齢〜１８週齢の鳥に投与することができる。卵内に投与する場合、ワクチン組成物は、例えば、抱卵期間の後半に投与することができる。例えば、ニワトリの場合、一般に、抱卵約１２日目〜抱卵約２０日目に卵に接種する。好ましくは、接種は、１４日目〜約１９日目に行われる。より好ましくは、約１５〜１８日目に鶏卵に接種する。
【００４６】
以下の実施例は例示的であるが、本発明の方法および組成物を限定しない。本開示に鑑みて当業者には明らかである、分子生物学および化学において普通に出くわす様々な条件およびパラメーターの他の適切な修正および改変は、本発明の精神および範囲に含まれる。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの同定
本実施例は、候補ＩＢウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるか判定するための方法を提供する。候補ＩＢウイルスは、例えば、伝染性気管支炎の１つもしくは複数の症状を示している動物から、または公共の寄託機関から得た組織スワブを含めて、様々な供給源から得ることができる。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」とは、最初に確認されたＩＢ−ＱＸ株のＳ１ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるＳ１ヌクレオチド配列を有する伝染性気管支炎ウイルスである。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１ヌクレオチド配列は配列番号１であり、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで見出すことができる。
【００４９】
候補ウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるかどうか確認するために、標準的なＲＮＡ単離方法を用いて、候補ウイルス粒子を含有する試料（例えば、組織スワブ）からＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアナート、フェノール−クロロホルム法を用いて抽出することができる。（ＣｈｏｍｃｚｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２：１５６〜１５９、Ｌｉら（１９９３）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２：７７１〜７８３）。さらに、いくつかのＲＮＡ単離キットが市販されており、この目的に適している。次いで、このＲＮＡを逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で用いて、完全なＳ１遺伝子またはＳ１遺伝子のいわゆる「超可変領域」の増幅されたＤＮＡコピーを生じさせる。ＲＴ−ＰＣＲで使用されるプライマーは、好ましくは、ＩＢウイルスの大半の公知株に対して共通なものである。例示的なプライマーは、候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子の超可変領域を増幅するために使用され得る対応するＲＴ−ＰＣＲ法と共に、例えば、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７、およびＪｏｎｅｓら（２００５）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １５６：６４６〜６４７に説明されている。Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献では、ＲＴ反応に続いてネステッドＰＣＲを実施して、約３９３塩基対を有するＳ１超可変領域のＤＮＡコピーを作製する。完全長Ｓ１の配列決定は、Ａｄｚｈａｒら（１９９６）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：８１７〜８３６の方法を用いて実施することができる。ＩＢウイルスの公的に入手可能な配列情報を用いて、当業者は、Ｓ１遺伝子またはその一部分を増幅するために適した代替えのプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ条件を容易に設計することができる。
【００５０】
候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子全体またはその一部分（例えば、超可変領域）のヌクレオチド配列を決定した後、この配列をＩＢ−ＱＸ株のＳ１遺伝子配列（配列番号１）と比較して、同一性パーセントを決定する。候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子またはその超可変領域のヌクレオチド配列がＩＢ−ＱＸのＳ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも９５％同一である場合、候補ＩＢウイルスはＩＢ−ＱＸ様ウイルスとみなされる。
【００５１】
候補ＩＢウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるかどうかを判定するための例示的な方法はまた、例えば、Ｇｏｕｇｈら（２００８）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １６２：９９〜１００、およびＤｏｍａｎｓｋａ−Ｂｌｉｃｈａｒｚら（２００６）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １５８：８０８において説明されており、これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
（実施例２）
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化
導入
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを発育鶏卵中で複数回継代し、結果として生じるウイルスの弱毒化をニワトリにおいて実証した実験を要約する。
【００５３】
材料および方法
伝染性気管支炎ウイルス
Ｌ−１１４８、１４４９−２、および１４４９−１０と名付けられたＩＢ−ＱＸ様ウイルスの３種の株を本実施例において使用した。Ｓ１遺伝子の配列決定ならびにＩＢ−ＱＸウイルスおよび他のＩＢ−ＱＸ様ウイルスとのヌクレオチド比較により、これらの株は３種ともすべて、ＩＢ−ＱＸ様であることが確認されていた（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７を参照されたい）。
【００５４】
Ｌ−１１４８株および１４４９−１０株はそれぞれ、発育鶏卵中で５０回継代し、１４４９−２株は、発育鶏卵中で５回継代した。これらの複数回継代から得た株をそれぞれＬ−１１４８（ｐ５０）、１４４９−１０（ｐ５０）、および１４４９−２（ｐ５）と名付けた。すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ５０）はＬ−１１４８に由来し、１４４９−１０（ｐ５０）は１４４９−１０に由来し、１４４９−２（ｐ５）は１４４９−２に由来した。
【００５５】
試験計画
Ｌ−１１４８（ｐ５０）ウイルス、１４４９−１０（ｐ５０）ウイルス、および１４４９−２（ｐ５）ウイルス、ならびに公知の軽度ＩＢ株（ＩＢ−Ｈ１２０、ワクチン株）およびビルレントＩＢ株（ＩＢ−Ｍ４１）をヒヨコにチャレンジした。チャレンジされていない対照群もまた、試験に含めた。試験計画を表４に要約する。
【００５６】
【表４】
【００５７】
動物および飼育
ＳＰＦヒヨコ６０匹を本実施例において使用した。１５日齢の時点で、ヒヨコ５０匹を５群（１〜５）に分け、隔離飼育器に入れた。対照として使用したヒヨコ１０匹は鶏小屋にとどまった。順化させるために、隔離飼育器に移したこれらのヒヨコを、３日間単独で放置した。食物および水は自由に入手可能であった。試験期間の全体を通して、全ヒヨコのＩＢ臨床徴候を観察した。
【００５８】
ウイルス投与
１ｍｌ注射器を用い、全ヒヨコの各眼に０．１ｍｌを投与することによって、連続してヒヨコ５匹にＩＢウイルスをチャレンジした。ＩＢ−Ｍ４１の場合、眼１つ当たり０．２５ｍｌをヒヨコに与えた。１８日齢の時点で、約１０６．０ＥＩＤ５０のＩＢウイルスを全ヒヨコにチャレンジした。ウイルスストックは−７０℃で保存し、投与前に栄養ブロス中で希釈して適切な濃度にした。
【００５９】
これらのウイルスをヒヨコに投与した直後に、使用したウイルスの試料は再度力価測定するために−７０℃、滅菌瓶中で保存した。
【００６０】
気管外植片の繊毛活動
チャレンジ後４日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。３４％Ｏ２および６６％ＣＯ２のガス混合物でヒヨコを気絶させた。完全な麻酔状態に達したら、１００％ＣＯ２を吸入させることによってこれらのヒヨコを屠殺した。死亡直後に、気管（頭部の基部〜鳴管から０．５ｃｍ基部寄りの位置）を摘出した。気管を摘出した直後に、無針注射器を用いて３７℃のＰＢＳでそれをすすぎ、さらに処理するまで３７℃のＰＢＳ中で保存した。ＭｃＩｌｗａｉｎ組織裁断器（ＭｃＩｌｗａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｐｐｅｒ）（Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、気管の０．６ｍｍ横断切片を作った。これらの気管横断切片を３７℃のＰＢＳ ２ｍｌと共にペトリ皿に入れ、４分以内に顕微鏡下で検査した。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率（４００倍）顕微鏡観察によって検査した。鳥を屠殺してから２０分以内に、各気管切片の繊毛活動を検査した。
【００６１】
０（１００％の繊毛活動）〜４（０％の繊毛活動）の尺度に基づいて、繊毛活動を採点した。次いで、停止を示した気管切片の合計を１群当たりのヒヨコ数で割ることによって、各群の繊毛静止（ciliostasis）平均値を算出した。算出した１群当たりの繊毛静止平均値を、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ １２０およびＩＢ−Ｍ４１をチャレンジした群、ならびに非ワクチン接種群の繊毛静止平均値と比較した。ＩＢ−Ｍ４１はビルレントに分類されており、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０のＩＢウイルスは軽度に分類されている。
【００６２】
臨床徴候
試験期間の全体を通して、動物技術者がこれらの鳥の臨床徴候を毎日観察した。ＩＢ感染に帰される臨床徴候を以下のように採点した。
【００６３】
【表５】
【００６４】
肉眼による病理学的検査
各ヒヨコの剖検を実施して、ＩＢ感染の結果であり得る任意の異常を判定した。これらの異常（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を以下のように採点した。
・上気道：正常な外観＝０、粘液＝１、気管支炎／気管炎＝２
・腎臓：正常な外観＝０、腫大または色が薄く尿酸結晶が認められる＝１
・脾臓：正常な外観＝０、腫大＝１
・腸：正常な外観＝０、異常＝２
【００６５】
気管、肺、および腎臓の組織像
ウイルス投与後４日目に、気管、肺、および腎臓の試料を採取した。試料はすべて、組織学的検査に供した。ＩＢＶを検出するために、ＩＢＶエピトープ４８．４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色を全試料に適用した。
【００６６】
評価
ＳＰＦヒヨコ中のＩＢウイルスのビルレンスを下記に基づいて決定した。
・気管外植片の繊毛活動
・臨床徴候の存在および重篤性
・病理学的検査で判明した異常
【００６７】
ＳＰＦヒヨコ中のＩＢＶのビルレンスを下記のように分類した。
・非ビルレント：その群の合計スコアが、チャレンジされていない群の合計スコア以下である場合。
・軽度：その群の合計スコアが、対照群の合計スコアを上回り、かつ、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・中程度のビルレント：その群の合計スコアが、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０をチャレンジされた群の合計スコアを上回り、かつ、ＩＢ Ｍ４をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・ビルレント：その群の合計スコアが、ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジされた群の合計スコア以上である場合。
【００６８】
１０％超のヒヨコがワクチンウイルスに帰すことができない原因で死んだ場合は、試験を有効とみなさなかった。本実施例において、以下の場合には、ワクチンウイルスは十分に安全とみなした。
・鳥類伝染性気管支炎の顕著な臨床徴候を示すニワトリも、ワクチンウイルスに帰すことができる原因で死ぬニワトリもいなかった場合。
・繊毛静止平均スコアが２５以下であった場合。
・腎臓の組織学的検査の間に認められた炎症病変がせいぜい中程度であった場合。
【００６９】
中程度のビルレントまたはビルレントに分類され、かつ、前述の要件に従わないウイルスは、それでもなお、チャレンジ用ウイルスとして使用するのに適する可能性がある。
【００７０】
結果
ヒヨコへの投与後のＩＢウイルスの力価測定
ヒヨコにチャレンジした後の様々なＩＢウイルスの力価を表５に示す。この表に示すように、すべての場合において、１０６．０ＥＩＤ５０を超えるＩＢウイルスをヒヨコにチャレンジした。
【００７１】
【表６】
【００７２】
臨床徴候、繊毛活動、および病理学的検査
試験期間中に死んだヒヨコはいなかった。ＩＢ １４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジした一部のヒヨコにおいて、ヒヨコへの処置後に、極めて軽度の眼鼻からの滲出性分泌物（鼻の穴に小さな液滴）および喘ぎが観察されただけであった。
【００７３】
繊毛静止は、対照ヒヨコのいずれにおいても観察されなかったが、ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコでははっきりと示された。Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０ウイルスをチャレンジしたヒヨコ１０匹の内の３匹は、完全な繊毛静止を示した。繊毛静止を示す気管切片の数は、ＩＢＶ １１４８（ｐ５０）（切片６個）、ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）（切片２０個）、およびＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）（切片４１個）をヒヨコにチャレンジした場合に増加した。
【００７４】
ヒヨコの病理学的検査の間に、ＩＢ １４４９−２（ｐ５）、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０、またはＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコでは、カタル性の滲出液が気管中に存在することが判明した。ＩＢ １４４９−２（ｐ５）をチャレンジした１匹のヒヨコでは、腫大した色の薄い腎臓が見出された。
【００７５】
表６に要約する繊毛活動、臨床徴候、および死後所見に基づいて、ＩＢ−ＱＸ様由来ウイルスの分類を行った。Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０およびＩＢ−Ｍ４１と比べて、Ｌ−１１４８（ｐ５０）株を軽度に分類し、ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）を中程度のビルレントに分類し、ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）をわずかなビルレントに分類した。
【００７６】
【表７】
【００７７】
気管、肺、および腎臓の組織像
Ｌ−１１４８（ｐ５０）、１４４９−２（ｐ５）、およびＩＢ−Ｈ１２０をチャレンジしたヒヨコの気管には異常は認められなかった。１４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジした後に、壊死を伴う局所的気管炎が、気管４つの内の１つで認められた。ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコの気管はすべて、急性気管炎を示した。ＩＢＶは、ＩＢ−Ｍ４１に感染したヒヨコの気管においてのみ検出することができた。
【００７８】
どのヒヨコの肺においても、異常は見出されず、ＩＢＶは検出されなかった。
【００７９】
Ｌ−１１４８（ｐ５０）および１４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジされたヒヨコの腎臓の組織像から、一部の場合において、単核細胞および形質細胞性細胞のわずかな浸潤が実証された。管上皮は罹患していなかった。感染後４日目に採取された腎臓試料の管上皮細胞において、免疫組織化学によってＩＢＶ−抗原は検出されなかった。免疫組織化学的染色後に、どの群の腎臓においても、ＩＢＶを検出することができなかった。
【００８０】
考察
ＩＢＶは、気管粘膜に最初に感染し、次いで、他の器官の上皮、例えば、腎臓の管上皮細胞および輸卵管の上皮において複製する。上皮細胞におけるＩＢＶの複製は、細胞の変性をもたらす可能性があり、続いて、器官／組織の病理学的変化が起こり得る。臨床徴候が発生するかどうかは、ＩＢＶのビルレンス、感染した器官、二次感染の発生、およびヒヨコの全体的健康状態などいくつかの因子に依存する。これは、ＩＢＶをチャレンジしたヒヨコの気管において認められ、その際、繊毛活動は、これらの動物のすべて（ＩＢＶ−Ｍ４１）、４０％（１４４９−１０（ｐ５０））、２０％（１４４９−２（ｐ５））、および１０％（ＩＢＶ Ｌ−１１４８（ｐ５０））において損なわれている。ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０、およびＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコの気管には、カタル性の滲出液が存在した。ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）をヒヨコにチャレンジした場合のみ、軽度の臨床徴候が認められた。これらは、繊毛静止およびそれに続く粘液増大の結果であったようである。高用量のＩＢＶをヒヨコにチャレンジしたということを念頭におくと、本実施例の結果は有望である。ＩＢＶ Ｌ−１１４８（ｐ５０）およびＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）をヒヨコにチャレンジした後に臨床徴候がなかったことは、対応する野外株によって引き起こされる臨床徴候が軽度であることを反映している可能性が高い。ＩＢＶ １４４９−１０の野外株はビルレントであったため、ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）をＳＰＦヒヨコにチャレンジした後に軽度の呼吸器徴候のみが認められたことは、この株が弱毒化されていることを実証する。
【００８１】
結論
本実施例に示すように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、複数回の継代によって弱毒化させることができる。結果として生じる、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来の弱毒化株は、伝染性気管支炎に対する新しいワクチン株として大いに有望である。ニワトリに投与した場合に中程度のビルレント作用を引き起こす、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来の継代ウイルスは、新規なＩＢワクチン、特にＩＢ−ＱＸ様ウイルスに対するワクチンを研究し、さらに開発するために、チャレンジ材料として有用であると思われる。
【００８２】
（実施例３）
ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８のさらなる継代および安全性
導入
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス株Ｌ−１１４８を発育鶏卵中で複数回継代した。ニワトリの繊毛静止の程度および腎臓形態を測定することによって、様々な継代レベルにおけるこのウイルスの安全性を評価した。下記に示すように、Ｌ−１１４８株の複数回継代の結果、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスによる感染症に対するワクチンとして適切な弱毒化株が得られた。
【００８３】
ＳＰＦ発育鶏卵におけるＬ−１１４８の継代
ウイルス継代のために、１０〜１１日目の特定病原体除去（ＳＰＦ）発育鶏卵を使用した。ＳＰＦ鶏卵中でＬ−１１４８株を最初に７回継代した。最初の５回の継代の間、希釈されていない尿膜腔液を接種した。継代は、胚が生きている卵から得た尿膜腔液を用いてのみ、行った。この結果、約５０％の死亡胚が生じた。生理的塩類溶液中で１００倍希釈した尿膜腔液を用いて継代を継続することに決めたところ、死亡胚の数は減った。継代７３回まで、継代を継続した。７３回継代物の回収の際、ＩＢ Ｌ−１１４８株にニューカッスル病（ＮＤ）ウイルスが混入していることが分かった。ＩＢ Ｌ−１１４８株の５０回継代物をワクチン接種したニワトリから得た血液試料は、ＮＤウイルスに対する抗体を含有していた。８回継代物の試料のＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＩＢ Ｌ−１１４８株には最初からこのウイルスが混入していたことが明らかになった。継代を中止し、ＩＢ Ｌ−１１４８ウイルス株の汚染を浄化することに決めた。
【００８４】
Ｌ−１１４８継代物の汚染除去
２２回、４７回、および７３回継代物から試料を採取し、ＮＤ特異的抗血清で処理した。手短に言えば、尿膜腔液：血清の体積比１：２で、尿膜腔液試料をＮＤ特異的ポリクローナル抗血清の試料と混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、続いて、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、１０倍希釈系列を調製し、希釈物１つ当たり５個の卵に、０．１ｍｌをそれぞれ接種した。２日後、尿膜腔液を回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってＩＢに対して依然として陽性であることが確認された内で最も高濃度の希釈物に由来する試料を集めた。胚が死んでいる卵は廃棄した。尿膜腔液を前述のＮＤ抗血清で再び処理し、希釈系列を卵に再び接種した。インキュベーション後、ＲＴ−ＰＣＲによってＩＢに対して依然として陽性であることが確認された内で最も高濃度の希釈物を再び集め、分割して容器に入れ（ｆｉｌｌｅｄ）、凍結し、−７０℃で保存した。
【００８５】
前述の汚染除去プロセスにより、浄化されクローニングされた２４回継代物、４９回継代物、および７５回継代物が得られた。卵１個当たり０．２ｍｌの１０７倍希釈物を卵に接種し、３７℃で４８時間インキュベートした後に回収することによって、継代レベル２５のバッチを作った。尿膜腔液を少量ずつ分割して容器に入れ、−７０℃で保存した。同じ手順に従って、５０回継代物のバッチを作った。７５回継代物を継代８０回までさらに継代した。８０回継代物の尿膜腔液を集め、少量ずつ分割して容器に入れ、凍結し、−７０℃で保存した。
【００８６】
安全性試験
様々な継代レベルのＩＢ Ｌ−１１４８株のニワトリにおける安全性を数回試験した。ビルレントなマサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）様株ＩＢ−Ｍ４１および軽度ワクチン株Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０と共に、弱毒化されていないＩＢ−ＱＸ様株１４４９−１０も、試験に含めた。
【００８７】
１日齢のＳＰＦニワトリを各試験に使用した。試験は、標準手順に従って実施した。手短に言えば、１ｍｌ注射器を用い、すべてのヒヨコの各眼に０．１ｍｌを投与することによって、連続してヒヨコ５匹にＩＢウイルスをチャレンジした。ＩＢ−Ｍ４１の場合、眼１つ当たり０．２５ｍｌをヒヨコに与えた。凍結乾燥したウイルスを注射用水に溶解して復元し、さらなる希釈物は栄養ブロスに溶かして調製した。続いて、これらの鳥の臨床徴候を毎日観察した。
【００８８】
ウイルス投与後５日目に、５匹のニワトリの気管外植片の繊毛活動を検査した。安楽死させたニワトリから気管を摘出し、気管の０．６ｍｍ横断切片、すなわち、気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つを作った。これらの気管横断切片を３７℃のＰＢＳ ２ｍｌを入れたペトリ皿に入れ、４分以内に顕微鏡下で検査した。
【００８９】
０（１００％の繊毛活動）〜４（０％の繊毛活動）の尺度に基づいて、顕微鏡によって繊毛活動を採点した。停止を示す気管切片の合計を１群当たりのヒヨコ数で割ることによって、各群の繊毛静止平均値を算出した。
【００９０】
気管、肺、および腎臓の試料を、安楽死させた動物から採取した。全試料を組織学的に検査した。ＩＢウイルスを検出するために、ＩＢＶエピトープ４８，４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色を実施した。
【００９１】
これらの結果を表７に要約する。
【００９２】
【表８】
【００９３】
これらの結果から、ＩＢ−Ｍ４１（ビルレント株）が高い繊毛スコアを有していたことが示され、達成され得る最大スコアは４０である。ＩＢ １４４９−１０株もまた、高い繊毛スコアを有していた。ワクチン株ＩＢ Ｈ１２０は、規制要件を満たす低スコア（例えば、２５未満）を有していた。ＩＢ Ｌ−１１４８株の８回継代物は、試験Ａにおいて３９という高スコアを有していた。継代レベル２５では、１８まで大幅に減少していた。継代レベル４０および５０では、試験Ａにおいて繊毛静止スコアが増加し、ｐ５０では３１まで増加していた。試験Ａにおいて試験したＩＢ Ｌ−１１４８株の試料はすべて、ＮＤウイルスに汚染されていた。ＮＤ汚染を浄化した後、継代レベル２５および５０を再び試験した。この時、繊毛静止スコアは明らかに低く、ワクチン株として許容できる範囲内であった。試験Ｂでは、８０回継代物も試験した。この継代物は、ＩＢ Ｈ１２０よりもはるかに低い、非常に低い繊毛静止スコアを与えるようであった。継代レベル８０は、安全なワクチン株のために必要である程度を超えて弱毒化されている可能性があることが予想された。
【００９４】
表７はまた、腎臓および気管の検査結果も示す。軽度〜中程度の腎炎は、一過性である限り、許容できるとみなした。気管炎は、一過性である場合のみ、許容できるとみなし、気管中の粘液に関しても同じとした。これらの結果から、ＩＢ Ｌ−１１４８の８回、２５回、４０回、および５０回継代物は、参照ワクチン株ＩＢ Ｈ１２０とちょうど同じように腎臓を冒したが、ＩＢ株１４４９−１０ほど重症ではなかったことが示される。８０回継代物もまた、腎臓に対していくらか影響を与えた。
【００９５】
試験ＡおよびＢの結果を解析した後、継代レベル６５のＩＢ Ｌ−１１４８のバッチ（すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ６５））を作製し、結果として得られるウイルスの安全性を評価することに決めた。それ以前の継代物に由来する尿膜腔液から集めた上清の１００倍希釈物０．１ｍｌをそれぞれ継代レベル６４まで卵に接種することによって、継代５０回〜継代６４回の継代物を調製した。ＧＭＰのもとで、継代レベル６５の大きなバッチを作製した。継代レベル６４から得た尿膜腔液の１０００倍希釈物０．２ｍｌをそれぞれ卵に接種した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、尿膜腔液を分取物として回収した。これらの分取物の内の１つから試料を採取し、力価測定し、安全性試験に供した。これらの結果を表７（試験Ｃ）に要約する。これらの結果から、平均繊毛静止スコアが１８であったことが示され、これは、ＩＢ Ｈ１２０に関する以前の試験で判明した結果と類似している。腎炎は観察されず、ニワトリ１５匹の内の１匹のみで、いくらかの粘液が気管中に存在した。
【００９６】
結論
本実施例は、発育鶏卵において複数回ＩＢ−ＱＸ様株を継代することによって、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに対する安全なワクチン株を作製できることを実証する。本実施例において、２５〜８０の継代レベルは、公知の許容できるＩＢワクチンと同等の安全性プロファイルを有する弱毒化ウイルスをもたらした。
【００９７】
（実施例４）
ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８に由来するワクチンの有効性
本実施例において、ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８に由来する２種のワクチン株の有効性を評価した。試験したワクチン株は、Ｌ−１１４８（ｐ６５）およびＬ−１１４８（ｐ８０）であった（実施例３を参照されたい）。
【００９８】
１日齢のＳＰＦ産卵ニワトリに、スプレーによって（１用量当たり０．５ｍｌ）ワクチン接種した。ワクチン接種後３週目に、１０４．０ＥＩＤ５０のＩＢ株Ｄ３８８（オランダで単離されたビルレントＩＢ−ＱＸ様株）の１用量をこれらのニワトリにそれぞれチャレンジした。
【００９９】
チャレンジ後５日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。気管の小さな横断切片を手作業で作った。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。
【０１００】
下記の分類基準を用いて、繊毛活動を採点した。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
所与の気管切片に関して、内輪（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｎｇ）の少なくとも５０％（スコア０）が力強い繊毛運動を示す場合、繊毛活動は正常とみなした。輪１０個の内の９個以上が正常な繊毛活動を示す場合、ニワトリは疾患に冒されていないとみなした。気管試料採取後２時間目よりも後に気管切片を顕微鏡によって検査した場合、試験は有効ではなかった。
【０１０３】
結果を表８に要約する。
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
ワクチン接種されず、かつチャレンジされていない対照群では、ニワトリ２０匹の内の１匹が、繊毛活動の低下を示したが、理由は特定されなかった。他のニワトリでは、繊毛運動は正常であった。ワクチン接種されず、チャレンジされた群では、すべてのニワトリが、繊毛活動の低下を示した。Ｌ−１１４８（ｐ６５）およびＬ１１４８（ｐ８０）をワクチン接種された群では、保護が観察されなかった１０２．４ＥＩＤ５０のＬ−１１４８（ｐ６５）をワクチン接種された群を除いて、規制当局によって規定されているよりも優れた保護が認められた（例えば、少なくとも８０％が保護された）。
【０１０６】
本実施例は、連続的継代によってＩＢ−ＱＸ様株から誘導したワクチン株の有効性を実証する。
【０１０７】
（実施例５）
その他のＩＢ−ＱＸ様ワクチン株の安全性評価
導入
本実施例では、ニワトリにおけるＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８（ｐ８０）（本明細書において「マスターシードウイルス」または「ＭＳＶ−ｐ８０」とも呼ばれる）の安全性を、継代レベル１０１のＬ−１１４８株（「Ｌ−１１４８（ｐ１０１）」）および継代レベル１８の１４４９−２株（「１４４９−２（ｐ１８）」）と共に評価した。
【０１０８】
健常な雌の白色レグホーンヒヨコ２５０匹を各５０匹の５群に分け、表９に示す試験計画に従って本実施例で使用した。
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
眼鼻経路によってワクチン接種を実施した。各ヒヨコに、体積０．２ｍＬ（各眼に０．１ｍＬ）の対応するワクチンを与えた。ワクチンはすべて、１０５．０ＥＩＤ５０／鳥の用量で投与した。
【０１１１】
試験の間、鳥の臨床症状を毎日観察した。いかなる臨床徴候または死亡も記録した。試験中に死亡した鳥は、死後検査にかけた。
【０１１２】
１２週齢で検査した第２群の若い雌鶏を除いて、１１週齢に輸卵管を検査した。若い雌鶏を安楽死させ、体腔を開き、嚢胞、狭窄、変形、または形成不全の存在について、輸卵管全体の外面および内面を（輸卵管をハサミで縦方向に開いて）巨視的に検査した。
【０１１３】
結果
死亡率の結果を表１０に要約する。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
輸卵管検査の結果を表１１に要約する。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
第１群では、ニワトリ４８匹中６匹（１２．５％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。１匹のニワトリが、直径４．４ｍｍの小さな嚢胞を有していた。これは、壁の近くに位置し、輸卵管の管状構造に影響を与えなかった。
【０１１８】
第２群では、生き残ったニワトリ４９匹すべてが、正常な卵巣および輸卵管を有していた。１匹のニワトリが、２．４×４．１ｍｍの小さな嚢胞を有していた。これは、卵巣の近くに位置したが、輸卵管の管状構造に影響を与えなかった。
【０１１９】
第３群では、ニワトリ４３匹中４匹（９．３％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。
【０１２０】
第４群では、ニワトリ３９匹中２匹（５．１３％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。
【０１２１】
考察
試験ワクチンをワクチン接種した鳥において、死亡率が相対的に低く、観察される嚢胞性かつ形成不全性の輸卵管の発生率が低かったことから、これらのワクチンが通常安全であることが示される。７日齢の若い雌鶏に投与されたＭＳＶ−ｐ８０ワクチンは、特に優れた安全性プロファイルを有していると思われ、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の安全要件を満たす。
【０１２２】
（実施例６）
ビルレンス復帰試験
導入
実施例５で上述したように、ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８（ｐ８０）をマスターシードウイルスまたは「ＭＳＶ−ｐ８０」と名付けた。本実施例において、ＭＳＶ−ｐ８０およびビルレンスに復帰させるために戻し継代した派生体「ＭＳＶ＋１ＢＰ」の性質を評価した。
【０１２３】
下記のワクチンを本実施例において使用した：
（Ａ）ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０の用量のＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０（すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ８０））。
（Ｂ）１回のニワトリ戻し継代の後に回収した、ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０の用量の戻し継代ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０（「ＭＳＶ＋１ＢＰ」）。戻し継代の手順は次の通りである。（ｉ）１用量当たり１０４．０ＥＩＤ５０のＭＳＶ−ｐ８０を含有する０．１ｍＬを点眼することによって、１４日齢ＳＰＦニワトリ５匹にワクチン接種した。（ｉｉ）ワクチン接種後４日目にこれらのニワトリを安楽死させ、気管粘膜の懸濁液を調製した。（ｉｉｉ）１４日齢ＳＰＦニワトリ５匹の第２の群にこの気管懸濁液を接種した。ＲＴ−ＰＣＲおよび卵接種によって、気管粘膜試料をウイルスの存在について試験した。最初のニワトリ戻し継代の段階では、ＰＣＲおよび卵接種によってウイルスが検出されたが、２回目のニワトリ戻し継代の段階では、ウイルスを検出することができなかった。最初のニワトリ継代の段階の気管粘膜試料から得たウイルスを増幅し、ＭＳＶ＋１ＢＰと名付けた。
【０１２４】
１日齢のＳＰＦニワトリ合計５１匹を３群に分け、表１２に示す試験計画に従ってワクチン接種した。
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
眼鼻経路によってワクチン接種を実施した。各ニワトリに、体積０．１ｍＬ（各眼に０．０５ｍＬ）の対応するワクチンを与えた。
【０１２７】
ワクチン接種後５日目、７日目、および１０日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。１００％ＣＯ２を吸入させることによってニワトリを安楽死させた。死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。ＭｃＩｌｗａｉｎ組織裁断器（Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いて、気管の０．６ｍｍ横断切片を作った。ペトリ皿中で、これらの気管横断切片を３７℃の生理食塩水２．０ｍＬと混合した。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。気管外植片はすべて、試料採取後２時間以内に検査した。下記の定義を用いて、繊毛の活動を０〜４の尺度に基づいて採点した：
【０１２８】
スコア定義
０ 気管切片全体の繊毛が活動を示した。
１ 気管切片の６７％を超えるが１００％未満の繊毛が活動を示した。
２ 気管切片の３３％〜６７％の繊毛が活動を示した。
３ 気管切片の３３％未満であるが０％を超える繊毛が活動を示した。
４ 気管切片全体の繊毛が活動を示さなかった。
【０１２９】
各群のニワトリを、（ａ）気管外植片の繊毛活動、（ｂ）肉眼による病理学的検査、（ｃ）腎臓の組織像、および（ｄ）血清学的検査について評価した。停止を示した気管切片のスコアの合計を群当たりのニワトリ数で割ることによって、繊毛静止を算出した。肉眼による病理学的検査のために、各ニワトリの剖検を実施して、ワクチンに関連し得る任意の異常を判定した。ホルマリン固定した腎臓組織の組織学的検査を実施し、調査結果を次のように記録した。腎炎なし、軽度の腎炎、中程度の腎炎、または重度の腎炎。血清学解析のために、１日齢ニワトリ１０匹から採取した血清において血清中和試験およびＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【０１３０】
結果
１．臨床徴候
試験期間中、ＭＳＶ−ｐ８０またはＭＳＶ＋１ＢＰに帰すことができる臨床徴候は、観察されなかった。しかし、ＭＳＶ−ｐ８０をワクチン接種したニワトリ１匹が、ワクチン接種後２日目に死んでいるのが発見された。剖検時に、気管炎および肺炎が観察された。死因は、気管中の多量の粘液に起因する窒息であると判定した。他のニワトリのどれも全く臨床徴候を示さず、かつ、ＩＢのためのインキュベーション期間（４日）よりはるかに短い期間である、ワクチン接種後たった２日目の時点で死亡が起こったため、伝染性気管支炎が死因である見込みは少ないと考えた。
【０１３１】
２．繊毛活動
ワクチン接種後５日目、７日目、および１０日目の繊毛静止スコアを表１３に示す。１つの気管試料である１つの切片を除いて、ワクチン接種後５日目に採取した気管試料のいずれにおいても繊毛活動停止は認められなかった。しかし、７日目および１５日目に、比較的小規模の繊毛活動停止が両群で観察された。ＭＳＶ−ｐ８０およびＭＳＶ＋１ＢＰの平均繊毛静止スコアはそれぞれ１５および１０であった。
【０１３２】
３．病理学的検査ならびに気管および腎臓の組織像
腎臓のいくらかの非特異的な色の薄さのほかには、気管および腎臓において、巨視的異常は全く観察されなかった。（表１３を参照されたい）。いくらかの間質内リンパ細胞浸潤が、腎臓試料の組織病理学的検査中に観察された。他の病変（顆粒状変性、管上皮の空胞形成および剥離、ならびに大量のヘテロフィル浸潤）がないことから、観察されるリンパ球浸潤は免疫応答の開始に起因する可能性が高いことが示唆された。
【０１３３】
【表１５】
【０１３４】
４．血清学的検査
伝染性気管支炎ウイルスに対する抗体は、免疫前血清中では検出されなかった（データ不掲載）。
【０１３５】
考察および結論
ＭＳＶ−ｐ８０およびＭＳＶ＋１ＢＰの両方をワクチン接種したニワトリの平均繊毛静止スコアは２５未満であり、鳥類伝染性気管支炎の顕著な臨床徴候を示したニワトリはいなかった。ＭＳＶ−ｐ８０（すなわちＬ−１１４８（ｐ８０））は気道および腎臓にとって安全であり、標準要件を満たすと結論付けた。さらに、ニワトリにおける戻し継代後にＭＳＶ−ｐ８０のビルレンスが増大する徴候はない。
【０１３６】
（実施例７）
ＩＢ−ＱＸ様ワクチンの有効性および最小保護用量
導入
本実施例において、４種の異なるＩＢ−ＱＸ様ワクチンの最小保護用量を、ビルレントＩＢ−ＱＸ様ウイルスをチャレンジしたニワトリにおいて決定した。
【０１３７】
下記の生ワクチンを本実施例において使用した。
（１）本明細書において「ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋２」と呼ぶ、さらに２回継代したＭＳＶ−ｐ８０（したがって、合計８２回継代されている）。
（２）本明細書において「ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋５」と呼ぶ、さらに５回継代したＭＳＶ−ｐ８０（合計８５回継代されている）。
（３）本明細書においてＬ−１１４８（ｐ１０１）と呼ぶ、１０１回継代したＬ−１１４８株。
（４）本明細書において１４４９−２（ｐ１９）と呼ぶ、１９回継代した１４４９−２株。
【０１３８】
合計２０８匹の健常な１日齢ＳＰＦニワトリをこの試験において使用した。（市販されている花用噴霧器を用いて）粗いスプレーによって、様々な用量の前述のワクチンをニワトリにワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目に、１０４．０ＥＩＤ５０のビルレントＩＢ−ＱＸ様株Ｄ３８８を点眼（各眼に０．０５ｍＬ）することによって、これらのニワトリにチャレンジした。チャレンジ後５日目に、ニワトリ２０匹において、気管外植片の繊毛活動を判定した。ワクチン接種実施日およびワクチン接種後２１日目に、血液を採取した。実験計画を表１４に要約する。
【０１３９】
【表１６】
【０１４０】
チャレンジ後５日目に、ニワトリ２０匹において、気管外植片の繊毛活動を検査した。ニワトリを安楽死させ、死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。気管の小さな横断切片を手作業で作った。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。下記の分類基準を用いて、繊毛活動を採点した：
【０１４１】
スコア判定基準
０ 気管切片の少なくとも５０％が繊毛活動を示した。
１ 気管切片の５０％未満が繊毛活動を示した。
【０１４２】
所与の気管切片に関して、内輪の少なくとも５０％（スコア０）が力強い繊毛運動を示す場合、繊毛活動は正常とみなした。輪１０個の内の９個以上が正常な繊毛活動を示す場合、ニワトリは疾患に冒されていないとみなした。気管試料採取後２時間目よりも後に気管切片を顕微鏡によって検査した場合、試験は有効ではないとみなした。
【０１４３】
チャレンジ後５日目に各ニワトリの剖検を実施して、ＩＢＶ感染の結果であり得る腎臓の任意の異常を判定した。次の判定基準を用いて、腎臓における巨視的所見を採点した。正常＝正常な外観（ｎ．ａ．）。腫大、色が薄い、または尿酸結晶＝１。
【０１４４】
結果
１．ワクチン接種後の臨床徴候
繊毛の検査結果および肉眼による病理学的検査の結果を表１５に要約する。
【０１４５】
【表１７】
【０１４６】
表１５に示す結果から、ＭＳＶ−ｐ８０ワクチンは、１０３．０ＥＩＤ５０以上の用量が使用される限り、有効であることが示される。１０２．７ＥＩＤ５０の用量では保護を誘導しなかった。ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋２およびＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋５によってもたらされた保護には有意ではない少しの差があった。この試験において、Ｘ＋２の方がＸ＋５よりいくらか優れた保護を与えた。Ｌ−１１４８（ｐ１０１）株が与えた保護は、それより継代レベルが少ないものよりも劣っていた。
【０１４７】
概要
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０に由来するワクチンの安全性および有効性をさらに実証する。
【０１４８】
（実施例８）
ニワトリ間での弱毒化ＩＢ ＱＸの伝播および体内での拡散
導入
本実施例では、弱毒化ＩＢ ＱＸワクチン株ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０の体内での拡散およびワクチン接種されていないニワトリへのＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０の伝播を調査した。
【０１４９】
実験計画
１．動物
ＳＰＦニワトリ合計１６５匹を表１６に示す群に分けた。通常の手順に従ってニワトリを飼育した。食物および水は自由に入手可能であった。試験期間の全体を通して、すべてのニワトリの臨床徴候を観察した。
【０１５０】
【表１８】
【０１５１】
２．方法
２．１ ワクチン接種
１０８．２ＥＩＤ５０を有するＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０を入れた１つのバイアルを緩衝液１５７．５ｍｌ中で希釈し、調製後２時間以内に使用した。第１群の１日齢ニワトリに、希釈したウイルス０．１ｍｌを点眼によって（ニワトリ１匹当たり１０５．０ＥＩＤ５０のＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０）ワクチン接種した。ワクチン接種後、使用したワクチンの試料を−５０℃で保存した。逆滴定を実施して、投与したワクチン中のウイルスの力価を測定した。投与したワクチンは、１ｍｌ当たり１０６．０７ＥＩＤ５０のＩＢ ＱＸを含有することが判明した。これは、ニワトリ１匹当たり１０５．０７ＥＩＤ５０の用量に相当する。
【０１５２】
２．２ 実験計画
第１群のニワトリに、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０をワクチン接種した。ワクチン接種後３日目に、ワクチン接種された第１群のニワトリ３０匹を、同じ鳥齢および起源の第２群のワクチン接種されていないニワトリ３５匹を入れた封じ込め施設（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｕｎｉｔ）に追加した。ワクチン接種後７日目に、第４群のワクチン接種されていないニワトリ３０匹からなる群をこの封じ込め施設に追加した。ワクチン接種後１４日目に、ワクチン接種されたニワトリと同じ鳥齢および起源の第３群のワクチン接種されていないニワトリ３５匹をこの封じ込め施設に追加した。一定の間隔で、１００％ＣＯ２を吸入させることによって、第２〜４群の各群のニワトリ２匹を屠殺し、嚢（ｂｕｒｓａ）、十二指腸、肺、腎臓、膵臓、および気管から試料を採取して、ＩＢＶの存在を判定した。
【０１５３】
ホルマリン固定した試料のＩＢＶエピトープ４８．４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色によって、器官試料中のＩＢＶを検出した。ニワトリを屠殺した後、排泄腔および口腔咽頭からスワブを採取した。
【０１５４】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩワンステップｑＲＴ−ＰＣＲキットを用いたＰＣＲによって、スワブ中のＩＢ ＱＸの存在を検出した。ＰＣＲ混合物は、２倍ミックス２５μｌ、水１８μｌ、Ｔａｑプラチナ１μｌ、フォワードプライマー２μｌ、リバースプライマー２μｌ、および鋳型（ＲＮＡ）２μｌを含有した。以下のプライマーを使用した。
ＩＢＶ共通プライマー
ＳＸ３＋Ａ／Ｂ フォワード５’−ＴＡＡＴＡＣＴＧＧＹＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号５）
ＳＸ４− リバース５’−ＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号６）
ＩＢ ＱＸ特異的プライマー
Ａｌｇ−ＱＸ−１３９ フォワード５’−ＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴ−３’（配列番号７）
Ａｌｇ−ＱＸ−３９４− リバース５’−ＣＡＣＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＡＴ−３’（配列番号８）
【０１５５】
気管ＲＮＡを鋳型として使用した。ウイルスを陽性対照として使用した。
【０１５６】
下記のプログラムに従ってＲＴ−ＰＣＲを実施した。
１．５０℃で３０分
２．９５℃で１０分
３．９５℃で３０秒
４．５０℃で３０秒
５．７２℃で４５秒、ステップ３〜５を４０サイクル
６．７２℃で７分
７．４℃で５分
【０１５７】
アガロースゲル電気泳動によってＲＴ−ＰＣＲ産物を解析した。
【０１５８】
１日齢ニワトリ１０匹から血液試料を採取した。これは、試験の２１日目に、第１群、第２群、第３群、および第４群のそれぞれのニワトリ１０匹から採取した。１日齢ニワトリの断頭または翼静脈の穿刺によって血液を採取した。ＩＤＥＸＸ、ＵＳから入手可能なＦｌｏｃｋｃｈｅｋ（商標）ＩＢＶ抗体試験キットまたはＸ−Ｏｖｏ、Ｆｒａｎｃｅ社製のＦｌｏｃｋｓｃｒｅｅｎ（商標）ＩＢ−ＨＩキットを用いて、抗体力価を測定した。
【０１５９】
３．結果
結果を表１７に要約する。
【０１６０】
【表１９−１】
【０１６１】
【表１９−２】
【０１６２】
試験期間中、呼吸器徴候も、ＩＢを示唆する他の臨床徴候も、観察されなかった。第２群のニワトリ１匹が、卵黄嚢の炎症が原因で死亡した。第１群のニワトリ１匹は、共食いが原因で死亡した。ＩＢ ＱＸ抗原は十分な赤血球凝集を与えないため、血清学的試験のために、ＩＢ ７９３Ｂ抗原を用いて赤血球凝集抑制（ＨＩ）試験を実施した。どの血清中にも、ＨＩ試験またはＥＬＩＳＡによってＩＢ抗体は検出されなかった。
【０１６３】
ＩＨＴ染色により、ウイルスへの最初の曝露後４〜１１日目のニワトリの気管中ならびに４日目および１１日目の膵臓中でＩＢ ＱＸが検出された。嚢、十二指腸、肺、および腎臓では、ＩＨＴ染色によってＩＢ ＱＸが検出されなかった。
【０１６４】
ＩＢ ＱＸの存在は、すべての群から得た喉頭スワブおよび排泄腔スワブのＩＨＴ染色およびＰＣＲによって検出した。ＰＣＲにより、ＩＢ ＱＸへの最初の曝露後２〜１５日目に得た排泄腔スワブおよび喉頭スワブにおいてＩＢが検出された。ＩＢ ＱＸ陽性である頻度は、喉頭スワブの方が排泄腔スワブよりも高かった。
【０１６５】
４．考察
４．１ 拡散
上気道はＩＢＶ複製の主要部位であるため、気管中でＩＢ ＱＸが検出されることは予想された。続いて、ウイルス血症が起こり、ウイルスが他の組織に拡散する。膵臓中のＩＢ ＱＸの検出によって、このことが実証された。ＩＢＶは、主として上皮親和性のウイルスであるが、継代レベル８０のＩＢ ＱＸは腎臓でも肺でも検出できなかったことから、ニワトリ１匹当たり１０５．０ＥＩＤ５０のワクチン用量を投与した際、これらの器官からウイルスが除去されたことが示唆される。ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０のＩＢ ＱＸをニワトリにワクチン接種した、同じ継代レベルのＩＢ ＱＸを用いた安全性試験では、ワクチン接種後１０日間、腎臓および肺においてウイルスが検出された。本発明の試験では、気管中では１１日間、喉頭では１５日間、ＩＢ ＱＸが検出された。文献にある報告では、ＩＢは、臨床段階の間、感染後５〜１０日間、気管中で、また、感染後最長で２８日間、気管中で検出され得ることが発見されていた。ＩＢ ＱＸは膵臓において検出されたが、肉眼による病理学的検査の間に異常は観察されなかった。
【０１６６】
４．２ 伝播
ワクチン接種されていない群のすべてにおいてＩＢ ＱＸの存在が検出されたため、ＩＢ ＱＸの伝播が明らかに実証された。
【０１６７】
４．３ 安全性
点眼により、ニワトリ１匹当たり１０５．０７ＥＩＤ５０の用量で継代レベル８０のＩＢ ＱＸを投与したところ、ワクチンに関連したいかなる臨床徴候も、ワクチン接種後に引き起こされなかった。ワクチン接種されたニワトリへの接触後にＩＢ ＱＸに感染させた、ワクチン接種されていないニワトリにおいて、ＩＢの臨床徴候は観察されなかった。
【０１６８】
５．結論
ワクチン接種後、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０ウイルスの増殖が気管中で起こり、ＩＢ ＱＸは他の器官に拡散した。ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０は少なくとも１回、ニワトリ間で伝播した。ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０および群間で継代したワクチンは安全であった。
【０１６９】
（実施例９）
ＩＢ ＭＭワクチンおよびＩＢ ＱＸワクチンを用いた混合ワクチン接種
ＩＢ ＭＭワクチンおよびＩＢ ＱＸワクチンを用いた混合ワクチン接種の有効性をＳＰＦニワトリにおいて試験した。０日目および１４日目に、ＩＢ ＱＸ生ワクチンと共にＰｏｕｌｖａｃ ＩＢＭＭワクチン（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）をニワトリにワクチン接種した。１４日目の時点でＩＢ株ＩＴ０２を、また、３５日目の時点でＩＢ株７９３Ｂを、ワクチン接種された系統にチャレンジした。ワクチン接種の結果は、気管切片の繊毛静止試験（ＣＳＴ）の解析および腎臓病理の判定に基づいて判定した。ワクチン接種されたニワトリは、ＩＴ０２株および７９３株によるチャレンジから完全に保護された。
【０１７０】
各ワクチン接種プロトコルおよび結果の要約を表１８に示す。
【０１７１】
【表２０】
【０１７２】
前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の精神および範囲に入るあらゆる変更および修正を包含すると意図される。
【０１７３】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示している。すべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されたかのように、同じように参照により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２００８年８月８日に出願された仮出願第６１／０８７，２２８号の優先権を米国特許法１１９条（ｅ）項に基づいて主張する。
【０００２】
本発明は、鳥類感染症に対するワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は、伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスに対する新規なワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスは、家禽（例えば、ニワトリ）の呼吸器疾患を引き起こすコロナウイルスである。ＩＢ疾患の症状としては、例えば、呼吸困難、体重減少、産卵低下、異常卵の出現率上昇、および死亡率上昇が挙げられる。
【０００４】
いくつかの異なる遺伝子型および血清型のＩＢウイルスが確認されている。ＩＢウイルスの遺伝子型解析は、一般に、そのウイルスのＳ１（スパイク）タンパク質をコードする遺伝子の全体または一部分を配列決定することによって遂行される。Ｓ１タンパク質は、ＩＢウイルスのゲノムにコードされる大型Ｓ糖タンパク質のＮ末端切断産物である。Ｓ糖タンパク質のＣ末端切断産物は、Ｓ２タンパク質と呼ばれる。Ｓ１タンパク質は細胞付着を担っており、ＩＢウイルスの主要な抗原決定基である。ＩＢウイルスの例示的な遺伝子型（または「株」）としては、７９３Ｂ、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、イタリア（Ｉｔａｌｙ）０２、Ｄ２７４、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、Ｂ１６４８、およびＤ１４６６が挙げられる。（例えば、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７を参照されたい）。
【０００５】
「ＱＸ」と名付けられた（「ＱＸＩＢＶ」とも呼ばれる）新規な遺伝子型のＩＢウイルスは、１９９０年代の終わりに中国で最初に確認された。（Ｌｉｕら（２００６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５１：１１３３〜１１４８を参照されたい）。最初のＱＸ遺伝子型が確認されて以来、Ｓ１ヌクレオチド配列レベルでＱＸとの高度な類似性／同一性を有する多数のＩＢウイルス遺伝子型が世界中で確認されている。これらの「ＩＢ−ＱＸ様」ウイルス（本明細書においてさらに定義される）は、例えば、フランス、ドイツ、オランダ、ベルギー、イギリス、イタリア、およびポーランドで確認されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
明らかに、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは家禽産業に深刻な脅威をもたらす。このタイプのＩＢウイルスが急速に出現していることの重要性にもかかわらず、これまで、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに特異的なワクチンは、当技術分野において利用可能でもなく、説明されてもいなかった。市販されているＩＢワクチン（弱毒化生株）は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスからニワトリを保護するのには効果がないことが判明している。したがって、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスからの特異的保護を実現する新しいワクチン組成物およびワクチン接種方法が当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＩＢ−ＱＸウイルスおよびＩＢ−ＱＸ様ウイルスによる感染から保護するワクチン組成物中の抗原性成分としてとりわけ有用であるＩＢウイルスを提供することによって、当技術分野における前述の必要を満たす。本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの生きており弱毒化された種類を含む。このような弱毒化生株は、例えば、十分な弱毒化が得られるまでＩＢ−ＱＸ様ウイルスを連続的に継代することによって作製することができる。本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの不活化された種類も含む。本発明において使用するためのＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの寄託株、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス感染の野外症例から、または特定のＳ１遺伝子配列など所定の予め定められた遺伝子セグメントを発現する組換えＩＢウイルスを構築することによって、得ることができる。
【０００８】
本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株または死滅株を含むワクチン組成物、ならびにＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株および／または死滅株を作出するための方法も提供する。本発明はまた、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化生株または死滅株を含むワクチン組成物を鳥に投与することによって、鳥に伝染性気管支炎のワクチン接種をするための方法も提供する。本発明の他の態様は、本明細書において下記に説明する発明を実施するための形態および実施例から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスを提供する。
【００１０】
本明細書において使用される場合、「ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」という用語は、元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスを意味する。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１（表１を参照されたい）によって表され、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで利用可能である。
【００１１】
【表１】
【００１２】
したがって、配列番号１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスが、本発明の目的のための「ＩＢ−ＱＸ様」ウイルスである。ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの例は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７において説明されており、Ｌ−１１４８（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１１４８／０４」とも呼ばれる）、１４４９−２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１４４９Ｋ／０４」とも呼ばれる）、１４４９−１０（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献において「ＮＬ／Ｌ−１４４９Ｔ／０４」とも呼ばれる）、およびＲｏｂｅｒｔｏｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献においてＦＲ／Ｌ−１４５０Ｔ／０５とも呼ばれる）と名付けられたＩＢウイルス遺伝子型が挙げられる。本発明のＩＢウイルスが由来し得る例示的なＩＢ−ＱＸ様株は、下記の表２において説明する。本発明の目的において、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスという用語は、特に、元のＱＸ ＩＢウイルスを含む。
【００１３】
【表２】
【００１４】
Ｓ１コード配列の配列比較のほかに、他の方法を用いてＩＢ−ＱＸ様ウイルスを同定することもできる。このような方法は、例えば、ウイルス試料の大きな集団（ｐｏｏｌ）から候補のＩＢ−ＱＸ様ウイルスを同定するための予備スクリーニングとして使用され得る。これらの予備スクリーニングの内の１つによって、ウイルスがＩＢ−ＱＸ様陽性であると判定される場合、次いで、本明細書において別の箇所で説明するようにＳ１ヌクレオチド遺伝子の配列決定および比較をすることによって、そのウイルスの遺伝子型を確認することができる。ＩＢ−ＱＸ様ウイルス（または推定上のＩＢ−ＱＸ様ウイルス）を同定するための例示的な「予備の」方法は、ＩＢ−ＱＸウイルスまたはＩＢ−ＱＸ様ウイルスに感染した動物に由来する抗血清を、候補ウイルスを中和する能力に関して試験する血清中和である。中和結果が陽性である場合、候補ウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであることが示唆され得る。
【００１５】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの別の例示的な予備スクリーニング方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である。この場合、候補ウイルス由来のＳ１遺伝子のＤＮＡコピーが、ＲＴ−ＰＣＲによって作製される。次いで、このＤＮＡコピーが、非ＩＢ−ＱＸ様株のＳ１遺伝子では切断されない位置でＩＢ−ＱＸ様株のＳ１遺伝子を切断する（または逆の場合も同じ）ことが公知である制限酵素に曝露される。制限断片消化の差は、例えばゲル電気泳動により、結果として生じる消化されたＤＮＡをサイズに基づいて分離することによって可視化することができる。
【００１６】
本発明の単離されたＩＢウイルスは、本明細書において言及するＩＢ−ＱＸ様ウイルスのいずれか、ならびに野外から単離され得る他の任意のＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来してよい。その他のＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、ＩＢウイルスに感染していると疑われるか、またはそうでなければ伝染性気管支炎の１つもしくは複数の症状を示しているニワトリから採取された試料（例えば、口腔咽頭スワブ）をスクリーニングすることによって得ることができる。このような試料からＲＮＡが単離され、Ｓ１遺伝子またはその一部分のＤＮＡコピーが、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製される。次いで、Ｓ１ ＤＮＡコピーが配列決定され、このようにして得られたヌクレオチド配列がＩＢ ＱＸのＳ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と比較され、これら２つの配列間の同一性パーセントが決定される。
【００１７】
いくつかの例示的な実施形態において、本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスＬ−１１４８のＳ１タンパク質（配列番号２）、１４４９−２のＳ１タンパク質（配列番号３）、または１４４９−１０のＳ１タンパク質（配列番号４）と同じアミノ酸配列を有するＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスを含む。これらの株に由来するＳ１タンパク質のアミノ酸配列を表３に示す。
【００１８】
【表３−１】
【００１９】
【表３−２】
【００２０】
また、本発明の単離されたＩＢウイルスは、組換え方法または「逆遺伝学（reverse
genetics）」方法を用いて当業者が作製することもできる。例えば、Ｃａｓａｉｓら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：９０８４〜９０８９では、異種スパイク遺伝子を発現する組換えＩＢウイルスの構築を説明している。（Ｈｏｄｇｓｏｎら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３８０４〜１３８１１も参照されたい）。この系は、ＩＢウイルス感染性クローン、すなわち、例えば、ワクシニアウイルスベクターなどのベクター中にクローニングされた完全長ＩＢウイルスｃＤＮＡの使用を伴う。（例えば、Ｃａｓａｉｓら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２３５９〜１２３６９を参照されたい）。ＩＢウイルス感染性クローンを出発材料として、他の任意のＩＢウイルスのＳ１タンパク質を発現する組換えＩＢウイルスを構築することができる。したがって、Ｃａｓａｉｓらの系またはその変形を用いて、任意のＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＳ１タンパク質（すなわち、配列番号１と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列にコードされるＳ１タンパク質）を発現する組換えＩＢウイルスを容易に作り、それによって、組換えＩＢ−ＱＸ様ウイルスを作製することができる。このようにして作製された組換えＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、本明細書において詳細に説明するように、天然に得られるＩＢ−ＱＸ様ウイルス（例えば、野外での単離物）が使用されるのと同じ様式で、本発明において使用され得る。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「同一性パーセント」とは、対象配列（またはその指定された部分）中のヌクレオチドと同一の参照ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの百分率を意味し、これは、すべての検索パラメーターを初期設定値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、以下、「ＢＬＡＳＴ」と呼ぶ）によって求められる配列同一性パーセントを最大にするために、これらの配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入した後の百分率である。ヌクレオチドの配列同一性パーセントの値は、一致する同一ヌクレオチドの数を同一性パーセントが報告される配列の長さで割ることによって決定される。
【００２２】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは当技術分野において公知であるが、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスは当技術分野において説明も提案もされておらず、したがって、本発明の主題である。本明細書において使用される場合、ＩＢウイルスに関する「由来する」という用語は、ＩＢウイルスが次のいずれかであることを意味する：（１）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫、または（２）ウイルスを不活化するか、もしくはウイルスの病原性を低下させる条件に供されたＩＢ−ＱＸ様ウイルス。したがって、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに「由来する」ウイルスは、生きている／弱毒化されたもの、または不活化された／死滅させられたもののいずれでもよい。
【００２３】
上述したように、いくつかの実施形態において、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスは、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫である。「ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫」は、本明細書において、ウイルス複製の助けとなる環境でＩＢ−ＱＸ様ウイルスを増殖させ、前記環境から取り出し、次いで、同じまたは同様の環境において少なくともさらに１回増殖させた後に得られるウイルスと定義される。増殖および分離の各サイクルは、１回の「継代」とみなされる。ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの連続的に継代された子孫は、好ましくは弱毒化され、例えば、弱毒化は、連続的な継代の結果である。
【００２４】
ＩＢウイルス（ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを含む）を連続的に継代する例示的な方法は、ウイルス複製の助けとなる環境として家禽（例えば、ニワトリ）の発育卵の使用を伴う。例えば、発育鶏卵に、尿膜腔を介してある量のＩＢ−ＱＸ様ウイルスを接種する。接種した卵を、例えば３７℃で２４時間（または他の適切なインキュベーション条件、時間、および温度のもとで）、インキュベートする。これらの卵から尿膜腔液を回収する。この時点で、ウイルスは「１回」継代された。第１の継代物から回収した尿膜腔液を適切に希釈し、次いで、新しい発育卵に接種する。これらの発育卵を例えば３７℃で２４時間インキュベートし、この第２の卵セットから尿膜腔液を回収する。この時点で、ウイルスは「２回」継代された。この様式で継続される継代は、無期限に続けることができる。ＩＢウイルスを継代するのに使用され得る、ウイルス複製の助けとなる代替の環境としては、例えば、ニワトリ腎臓細胞培養物またはニワトリ胎仔線維芽細胞培養物などの細胞培養物が挙げられる。
【００２５】
ＩＢウイルスを継代するための例示的なインキュベーションステップとして、３７℃で２４時間のインキュベーションを本明細書において挙げるが、他のインキュベーション温度および／またはインキュベーション時間を使用できることを当業者は理解するであろう。例えば、発育卵は、２０℃〜４２℃の範囲の温度でインキュベートしてよい。ウイルス継代のためのインキュベーション時間は、４時間〜４日、より好ましくは、１６〜３６時間の範囲でよい。
【００２６】
各継代の後（または、２回毎、４回毎、５回毎、１０回毎などの継代後）、ウイルス試料をビルレンスの程度に関して試験してよい。ビルレンスの程度は、例えば、継代されたウイルスをヒヨコに投与し、伝染性気管支炎を示す様々なパラメーターを評価することによって決定することができる。例示的なパラメーターとしては次のものが挙げられる。（ｉ）気管外植片の繊毛活動、（ｉｉ）例えば、眼もしくは鼻からの水様滲出液、喘ぎ、または下痢などの臨床徴候、（ｉｉｉ）例えば、上気道、腎臓、脾臓、および／または腸の肉眼による病理学的検査、ならびに（ｉｖ）気管、肺および腎臓の組織像。これらの各パラメーターの例示的な測定値を下記の実施例２において提示する。連続的継代によるＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来ＩＢウイルスは、伝染性気管支炎を示すこれらのパラメーターの内の１つまたは複数が、親（継代されていない）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに感染したヒヨコにおいて観察される対応するパラメーターと比べて減少、消失、または改善している場合、「弱毒化」されているとみなされる。比較は、他の公知のビルレントＩＢウイルス株に感染したヒヨコに対して行ってもよい。
【００２７】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する連続的に継代されたＩＢウイルスのビルレンスを評価するための非限定的な例示的方法を実施例２において示す。手短に言えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する連続的に継代されたＩＢウイルスを接種されたヒヨコに、（ｉ）気管外植片の繊毛活動、（ｉｉ）臨床徴候、および（ｉｉｉ）病理学的検査を反映する数値的スコアを与える。合計スコア［（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）］を決定する。ビルレンス分類を次のように確立する。
・「非ビルレント」：合計スコアが、チャレンジされていない対照群の合計スコア以下である場合。
・「軽度」：合計スコアが、チャレンジされていない対照群の合計スコアを上回るが、公知の軽度のＩＢウイルス株（例えば、ＰＯＵＬＶＡＣ ＩＢ Ｈ１２０（マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）株）、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・「中程度のビルレント」：合計スコアが、公知の軽度のＩＢウイルス株をチャレンジされた群の合計スコアを上回るが、公知のビルレントＩＢウイルス株（例えば、親ＩＢ−ＱＸ様株またはＩＢ−Ｍ４１株など他の公知のビルレント株）をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・「ビルレント」：合計スコアが、公知のビルレントＩＢウイルス株をチャレンジされた群の合計スコア以上である場合。
【００２８】
前述の分類スキームに従って「非ビルレント」または「軽度」と分類されるＩＢウイルスは、弱毒化生ワクチン株として適切である。いくつかの状況において、「中程度のビルレント」ＩＢウイルスもまた、弱毒化生ワクチン株として適切であり得る。
【００２９】
連続的に継代されたＩＢ−ＱＸ様ウイルスのワクチン株としての適性を評価するための代替方法は当技術分野において公知であり、本明細書において別の場所で、例えば実施例３において例示する。実施例３に示すように、繊毛スコアならびに腎臓および気管の形態を利用して、複数回継代後の弱毒化の程度を判定する。これらのパラメーターは、次に、所与の株がワクチン目的に適しているか（例えば、安全性は十分であるか）どうかを判定するために使用され得る。
【００３０】
上述したように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに「由来する」ＩＢウイルスの他の範ちゅうは、ウイルスを不活化するか、またはウイルスの病原性を低下させる条件に供されたＩＢ−ＱＸ様ウイルスである。典型的には弱毒化生ウイルスである、連続的に継代されたＩＢウイルスとは対照的に、この第２の範ちゅうに入るＩＢウイルスは、典型的には不活化されるかまたは死滅させられていると考えられる。ＩＢウイルスを含むウイルスを不活化する方法は、当技術分野において公知である。
【００３１】
したがって、上記の考察が示すように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する本発明のＩＢウイルスは、不活化されるか、または弱毒化されてよい。不活化される場合、本発明のＩＢウイルスは、例えばβ−プロピオラクトンまたはホルマリンなどの不活化化合物にウイルスを接触させることによって、不活化され得る。弱毒化される場合、本発明のＩＢウイルスは、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの最初の継代から始める連続的継代によって弱毒化され得る。これらのＩＢウイルスは、ウイルス複製の助けとなる任意の環境で継代してよい。このような環境としては、例えば、家禽の発育卵が挙げられる。家禽の発育卵としては、例えば、特定病原体除去（ＳＰＦ）鶏卵などの発育鶏卵が挙げられる。他の適切な環境としては、例えば、細胞培養物が挙げられる。
【００３２】
本発明のＩＢウイルスを弱毒化するために、これらのウイルスを任意の回数継代してよい。いくつかの実施形態において、ウイルスは、結果として生じるウイルスが、本明細書の別の場所で言及した分類方法によって「非ビルレント」、「軽度」、または（いくつかの状況において）「軽度ビルレント」のいずれかとして特徴付けられるように、少なくとも十分な回数、継代される。いくつかの例示的な実施形態において、本発明のＩＢウイルスは、５〜４００回継代される。例えば、ＩＢウイルスは、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、６５回、７０回、７５回、８０回、８５回、９０回、９５回、１００回、１０５回、１１０回、１１５回、１２０回、１２５回、１３０回、１３５回、１４０回、１４５回、１５０回、１５５回、１６０回、１６５回、１７０回、１７５回、１８０回、１８５回、１９０回、１９５回、２００回、２０５回、２１０回、２１５回、２２０回、２２５回、２３０回、２３５回、２４０回、２４５回、２５０回、２５５回、２６０回、２６５回、２７０回、２７５回、２８０回、２８５回、２９０回、２９５回、３００回、３０５回、３１０回、３１５回、３２０回、３２５回、３３０回、３３５回、３４０回、３４５回、３５０回、３５５回、３６０回、３６５回、３７０回、３７５回、３８０回、３８５回、３９０回、３９５回、４００回、または必要もしくは所望の場合には、それより多い回数、継代してよい。
【００３３】
本発明のＩＢウイルスは、好ましくは単離される。本明細書において使用される場合、「単離される」という用語は、ウイルスが、生きた動物の組織内に含有されないことを意味する。
【００３４】
本発明は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎ウイルスのいくつかの非限定的な実施例を含む。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスＬ−１１４８を、１０〜１１日目の特定病原体除去（ＳＰＦ）発育鶏卵において６４回継代した。６５回目の継代のために、継代レベル６４から得た尿膜腔液の１０００倍希釈物０．２ｍＬをＳＰＦ卵に接種した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、尿膜腔液の分取物（ｐｏｏｌ）を回収した。６５回継代された材料は、本明細書においてＬ−１１４８（ｐ６５）と呼ばれる（実施例３を参照されたい）。滅菌したＬ−１１４８（ｐ６５）分取物を選択し、まとめ、安定化剤と混合し、３ｍＬバイアルに入れ（バイアル１本当たり１ｍＬ）、凍結乾燥して、マスターシードウイルスＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５を作った。さらに１５回の継代を実施して、合計８０回の継代を行って、Ｌ−１１４８（ｐ８０）を作製した（実施例３を参照されたい）。６５回継代された材料と同様に、８０回継代物から尿膜腔液の分取物を回収した。滅菌した分取物を選択し、まとめ、安定化剤と混合し、３ｍＬバイアルに入れ（バイアル１本当たり１ｍＬ）、凍結乾燥して、マスターシードウイルスＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０を作った。ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５およびＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０をさらに５回それぞれ継代して、それぞれＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ Ｘ＋５およびＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ Ｘ＋５を得た。
【００３５】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００２を割り付けられた。
【００３６】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００４を割り付けられた。
【００３７】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００３を割り付けられた。
【００３８】
ＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５は、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの名義で２００９年６月１０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、ＵＫ（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、仮の受託番号０９０６１００１を割り付けられた。
【００３９】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスのその他の非限定的な例は、本明細書の別の場所で説明する。
【００４０】
本発明は、（ｉ）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離されたＩＢウイルスおよび（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含むワクチン組成物を含む。薬学的に許容できる担体は、例えば、水、安定化剤、保存剤、培地、もしくは緩衝剤、または前記のものの任意の組合せでよい。本発明のワクチン組成物は、懸濁液の形態もしくは凍結乾燥した形態、または別法として、凍結した形態で調製することができる。凍結する場合には、凍結時の安定性を向上させるために、グリセロールまたは他の同様な作用物質を添加してよい。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、特に、組成物内に含有されるＩＢウイルスを不活化する（すなわち、死滅させる）場合には、アジュバントを含んでよい。アジュバントは、アクリルポリマー、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、またはアクリルポリマーおよびＤＤＡの組合せでよい。本明細書において使用される場合、アクリルポリマーとは、アクリル部分を含有する任意のポリマーまたはコポリマーである。例示的なアクリルポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、メタクリル酸、メタクリラート、アクリルアミド、アクリラート、アクリルニトリル、およびポリアクリル酸のアルキルエステルが挙げられる。アクリルコポリマーの例としては、例えば、ポリ（アクリルアミド−ｃｏブチル、メタクリラート）、アクリル−メタクリル酸、アクリル−アクリルアミド、およびポリ（メタクリラート）が挙げられる。市販されているアクリルポリマーの例としては、カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、カーボセット（Ｃａｒｂｏｓｅｔ）、（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、ネオクリル（Ｎｅｏｃｒｙｌ）（Ａｖｅｃｉａ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）、およびユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）（Ｒｏｈｍ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｍａｌｄｅｎ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。本発明のエマルジョンにおいて使用するために特に好ましいアクリルポリマーはカーボポールであり、これは、ポリアリールスクロースで架橋されたアクリル酸の水溶性ポリマーとも呼ばれる。アジュバントは、水溶性アジュバントでも水分散性アジュバントでもよい。アジュバントは、油エマルジョン、例えば、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、または水中油中水型エマルジョンでよい。油中水型エマルジョンはさらに、１つもしくは複数の油溶性界面活性剤、１つもしくは複数の水溶性界面活性剤、付加的なアジュバント、付加的な水相成分、エマルジョン安定化剤、またはそれらの組合せを含んでよい。
【００４２】
本発明のワクチン組成物は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスに加えて、他の抗原性成分も含んでよい。ワクチン組成物中に含まれる他の抗原性成分は、感染病原体、例えば、ニワトリの感染病原体に由来してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する少なくとも１つの付加的な弱毒化生ＩＢウイルスをさらに含んでもよい。本明細書において使用される場合、「非ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」とは、元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対する同一性が９５％未満であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のＩＢウイルスを意味する。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１によって表され、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで利用可能である。したがって、配列番号１に対する同一性が９５％未満であるヌクレオチド配列にコードされたＳ１タンパク質を有する任意のウイルスが、本発明の目的のための「非ＩＢ−ＱＸ様」ウイルスである。例示的な非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスとしては、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、ジョージア（Ｇｅｏｒｇｉａ）−９８、イタリア（Ｉｔａｌｙ）−０２、７９３−Ｂ、Ｄ２７４、Ｄ１４６６、または前述の非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスのいずれかのＳ１遺伝子型を有する株などの株が挙げられる。本発明のワクチン組成物は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスに加えて、１つまたは複数の市販されているＩＢワクチン株も含有してよい。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、ＩＢウイルスではない感染病原体に由来する付加的な抗原性成分を含有してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、弱毒化生トリウイルスまたは不活化トリウイルス、例えば、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、レオウイルス、トリインフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、またはトリ脳脊髄炎ウイルスをさらに含んでよい。
【００４４】
本発明はまた、弱毒化生ＩＢウイルスを調製するための方法も含む。本発明のこの態様に従って調製した弱毒化生ウイルスは、特に、ＩＢウイルスに対してニワトリにワクチン接種をするのに有用である。本発明のこの態様に従う方法は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、家禽の発育卵（例えば、発育鶏卵）において、または細胞培養物（例えば、ニワトリ腎臓細胞培養物）において継代することができる。弱毒化させるためにＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代しなければならない回数は、本明細書において説明する教示に基づいて決定することができる。例えば、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代した後に、結果として生じるＩＢウイルスをニワトリに投与することができ、次いで、例えば、気管外植片の繊毛活動、臨床徴候、肉眼的病理、および／または伝染性気管支炎の組織学的徴候についてニワトリを評価する。由来元である親ＩＢ−ＱＸ様ウイルスと比べて（または他の公知の参照ＩＢ株と比べて）、少ないかまたは重症度の低いＩＢ徴候をもたらす継代されたＩＢウイルスは、本発明の目的のための弱毒化株とみなされる。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、得られたウイルスが本明細書の別の場所で説明した分類方法論に従って「非ビルレント」または「軽度」に分類されるまで、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む。
【００４５】
本発明はまた、鳥に伝染性気管支炎のワクチン接種をするための方法も含む。本発明のこの態様に従う方法は、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスを鳥に投与するステップを含む。本発明のこの態様に従う方法は、本明細書の別の場所で説明するように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する任意のＩＢウイルスを含む任意のワクチン組成物を投与するステップを含んでよい。本発明のワクチン組成物は、活性成分または抗原性成分が鳥の呼吸器粘膜と直ちにまたは最終的に接触するような任意の様式で、投与することができる。したがって、ワクチン組成物は、例えば、鼻腔内、経口、および／または眼内経由で鳥に投与することができる。鳥類に投与するためのワクチン組成物は、前述したように、および／またはエアロゾル（鼻腔内投与用）を含むスプレーによるか、もしくは飲料水（経口投与用）による投与に適した形態で製剤化することができる。本発明のワクチン組成物はまた、皮下、筋肉内、または卵内に投与することもできる。（米国特許第７，２０８，１６４号を参照されたい）。本発明のこの態様に従って、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来するＩＢウイルスを含むワクチン組成物は、１日齢〜１８週齢の鳥に投与することができる。卵内に投与する場合、ワクチン組成物は、例えば、抱卵期間の後半に投与することができる。例えば、ニワトリの場合、一般に、抱卵約１２日目〜抱卵約２０日目に卵に接種する。好ましくは、接種は、１４日目〜約１９日目に行われる。より好ましくは、約１５〜１８日目に鶏卵に接種する。
【００４６】
以下の実施例は例示的であるが、本発明の方法および組成物を限定しない。本開示に鑑みて当業者には明らかである、分子生物学および化学において普通に出くわす様々な条件およびパラメーターの他の適切な修正および改変は、本発明の精神および範囲に含まれる。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの同定
本実施例は、候補ＩＢウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるか判定するための方法を提供する。候補ＩＢウイルスは、例えば、伝染性気管支炎の１つもしくは複数の症状を示している動物から、または公共の寄託機関から得た組織スワブを含めて、様々な供給源から得ることができる。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「ＩＢ−ＱＸ様ウイルス」とは、最初に確認されたＩＢ−ＱＸ株のＳ１ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるＳ１ヌクレオチド配列を有する伝染性気管支炎ウイルスである。元のＩＢ−ＱＸ株のＳ１ヌクレオチド配列は配列番号１であり、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９３４２３のもとで見出すことができる。
【００４９】
候補ウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるかどうか確認するために、標準的なＲＮＡ単離方法を用いて、候補ウイルス粒子を含有する試料（例えば、組織スワブ）からＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアナート、フェノール−クロロホルム法を用いて抽出することができる。（ＣｈｏｍｃｚｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２：１５６〜１５９、Ｌｉら（１９９３）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２：７７１〜７８３）。さらに、いくつかのＲＮＡ単離キットが市販されており、この目的に適している。次いで、このＲＮＡを逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で用いて、完全なＳ１遺伝子またはＳ１遺伝子のいわゆる「超可変領域」の増幅されたＤＮＡコピーを生じさせる。ＲＴ−ＰＣＲで使用されるプライマーは、好ましくは、ＩＢウイルスの大半の公知株に対して共通なものである。例示的なプライマーは、候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子の超可変領域を増幅するために使用され得る対応するＲＴ−ＰＣＲ法と共に、例えば、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７、およびＪｏｎｅｓら（２００５）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １５６：６４６〜６４７に説明されている。Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎらの文献では、ＲＴ反応に続いてネステッドＰＣＲを実施して、約３９３塩基対を有するＳ１超可変領域のＤＮＡコピーを作製する。完全長Ｓ１の配列決定は、Ａｄｚｈａｒら（１９９６）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：８１７〜８３６の方法を用いて実施することができる。ＩＢウイルスの公的に入手可能な配列情報を用いて、当業者は、Ｓ１遺伝子またはその一部分を増幅するために適した代替えのプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ条件を容易に設計することができる。
【００５０】
候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子全体またはその一部分（例えば、超可変領域）のヌクレオチド配列を決定した後、この配列をＩＢ−ＱＸ株のＳ１遺伝子配列（配列番号１）と比較して、同一性パーセントを決定する。候補ＩＢウイルスのＳ１遺伝子またはその超可変領域のヌクレオチド配列がＩＢ−ＱＸのＳ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも９５％同一である場合、候補ＩＢウイルスはＩＢ−ＱＸ様ウイルスとみなされる。
【００５１】
候補ＩＢウイルスがＩＢ−ＱＸ様ウイルスであるかどうかを判定するための例示的な方法はまた、例えば、Ｇｏｕｇｈら（２００８）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １６２：９９〜１００、およびＤｏｍａｎｓｋａ−Ｂｌｉｃｈａｒｚら（２００６）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １５８：８０８において説明されており、これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
（実施例２）
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスの弱毒化
導入
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを発育鶏卵中で複数回継代し、結果として生じるウイルスの弱毒化をニワトリにおいて実証した実験を要約する。
【００５３】
材料および方法
伝染性気管支炎ウイルス
Ｌ−１１４８、１４４９−２、および１４４９−１０と名付けられたＩＢ−ＱＸ様ウイルスの３種の株を本実施例において使用した。Ｓ１遺伝子の配列決定ならびにＩＢ−ＱＸウイルスおよび他のＩＢ−ＱＸ様ウイルスとのヌクレオチド比較により、これらの株は３種ともすべて、ＩＢ−ＱＸ様であることが確認されていた（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎら（２００８年６月）、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７：２４７〜２５７を参照されたい）。
【００５４】
Ｌ−１１４８株および１４４９−１０株はそれぞれ、発育鶏卵中で５０回継代し、１４４９−２株は、発育鶏卵中で５回継代した。これらの複数回継代から得た株をそれぞれＬ−１１４８（ｐ５０）、１４４９−１０（ｐ５０）、および１４４９−２（ｐ５）と名付けた。すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ５０）はＬ−１１４８に由来し、１４４９−１０（ｐ５０）は１４４９−１０に由来し、１４４９−２（ｐ５）は１４４９−２に由来した。
【００５５】
試験計画
Ｌ−１１４８（ｐ５０）ウイルス、１４４９−１０（ｐ５０）ウイルス、および１４４９−２（ｐ５）ウイルス、ならびに公知の軽度ＩＢ株（ＩＢ−Ｈ１２０、ワクチン株）およびビルレントＩＢ株（ＩＢ−Ｍ４１）をヒヨコにチャレンジした。チャレンジされていない対照群もまた、試験に含めた。試験計画を表４に要約する。
【００５６】
【表４】
【００５７】
動物および飼育
ＳＰＦヒヨコ６０匹を本実施例において使用した。１５日齢の時点で、ヒヨコ５０匹を５群（１〜５）に分け、隔離飼育器に入れた。対照として使用したヒヨコ１０匹は鶏小屋にとどまった。順化させるために、隔離飼育器に移したこれらのヒヨコを、３日間単独で放置した。食物および水は自由に入手可能であった。試験期間の全体を通して、全ヒヨコのＩＢ臨床徴候を観察した。
【００５８】
ウイルス投与
１ｍｌ注射器を用い、全ヒヨコの各眼に０．１ｍｌを投与することによって、連続してヒヨコ５匹にＩＢウイルスをチャレンジした。ＩＢ−Ｍ４１の場合、眼１つ当たり０．２５ｍｌをヒヨコに与えた。１８日齢の時点で、約１０６．０ＥＩＤ５０のＩＢウイルスを全ヒヨコにチャレンジした。ウイルスストックは−７０℃で保存し、投与前に栄養ブロス中で希釈して適切な濃度にした。
【００５９】
これらのウイルスをヒヨコに投与した直後に、使用したウイルスの試料は再度力価測定するために−７０℃、滅菌瓶中で保存した。
【００６０】
気管外植片の繊毛活動
チャレンジ後４日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。３４％Ｏ２および６６％ＣＯ２のガス混合物でヒヨコを気絶させた。完全な麻酔状態に達したら、１００％ＣＯ２を吸入させることによってこれらのヒヨコを屠殺した。死亡直後に、気管（頭部の基部〜鳴管から０．５ｃｍ基部寄りの位置）を摘出した。気管を摘出した直後に、無針注射器を用いて３７℃のＰＢＳでそれをすすぎ、さらに処理するまで３７℃のＰＢＳ中で保存した。ＭｃＩｌｗａｉｎ組織裁断器（ＭｃＩｌｗａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｐｐｅｒ）（Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、気管の０．６ｍｍ横断切片を作った。これらの気管横断切片を３７℃のＰＢＳ ２ｍｌと共にペトリ皿に入れ、４分以内に顕微鏡下で検査した。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率（４００倍）顕微鏡観察によって検査した。鳥を屠殺してから２０分以内に、各気管切片の繊毛活動を検査した。
【００６１】
０（１００％の繊毛活動）〜４（０％の繊毛活動）の尺度に基づいて、繊毛活動を採点した。次いで、停止を示した気管切片の合計を１群当たりのヒヨコ数で割ることによって、各群の繊毛静止（ciliostasis）平均値を算出した。算出した１群当たりの繊毛静止平均値を、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ １２０およびＩＢ−Ｍ４１をチャレンジした群、ならびに非ワクチン接種群の繊毛静止平均値と比較した。ＩＢ−Ｍ４１はビルレントに分類されており、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０のＩＢウイルスは軽度に分類されている。
【００６２】
臨床徴候
試験期間の全体を通して、動物技術者がこれらの鳥の臨床徴候を毎日観察した。ＩＢ感染に帰される臨床徴候を以下のように採点した。
【００６３】
【表５】
【００６４】
肉眼による病理学的検査
各ヒヨコの剖検を実施して、ＩＢ感染の結果であり得る任意の異常を判定した。これらの異常（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を以下のように採点した。
・上気道：正常な外観＝０、粘液＝１、気管支炎／気管炎＝２
・腎臓：正常な外観＝０、腫大または色が薄く尿酸結晶が認められる＝１
・脾臓：正常な外観＝０、腫大＝１
・腸：正常な外観＝０、異常＝２
【００６５】
気管、肺、および腎臓の組織像
ウイルス投与後４日目に、気管、肺、および腎臓の試料を採取した。試料はすべて、組織学的検査に供した。ＩＢＶを検出するために、ＩＢＶエピトープ４８．４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色を全試料に適用した。
【００６６】
評価
ＳＰＦヒヨコ中のＩＢウイルスのビルレンスを下記に基づいて決定した。
・気管外植片の繊毛活動
・臨床徴候の存在および重篤性
・病理学的検査で判明した異常
【００６７】
ＳＰＦヒヨコ中のＩＢＶのビルレンスを下記のように分類した。
・非ビルレント：その群の合計スコアが、チャレンジされていない群の合計スコア以下である場合。
・軽度：その群の合計スコアが、対照群の合計スコアを上回り、かつ、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・中程度のビルレント：その群の合計スコアが、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０をチャレンジされた群の合計スコアを上回り、かつ、ＩＢ Ｍ４をチャレンジされた群の合計スコア以下である場合。
・ビルレント：その群の合計スコアが、ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジされた群の合計スコア以上である場合。
【００６８】
１０％超のヒヨコがワクチンウイルスに帰すことができない原因で死んだ場合は、試験を有効とみなさなかった。本実施例において、以下の場合には、ワクチンウイルスは十分に安全とみなした。
・鳥類伝染性気管支炎の顕著な臨床徴候を示すニワトリも、ワクチンウイルスに帰すことができる原因で死ぬニワトリもいなかった場合。
・繊毛静止平均スコアが２５以下であった場合。
・腎臓の組織学的検査の間に認められた炎症病変がせいぜい中程度であった場合。
【００６９】
中程度のビルレントまたはビルレントに分類され、かつ、前述の要件に従わないウイルスは、それでもなお、チャレンジ用ウイルスとして使用するのに適する可能性がある。
【００７０】
結果
ヒヨコへの投与後のＩＢウイルスの力価測定
ヒヨコにチャレンジした後の様々なＩＢウイルスの力価を表５に示す。この表に示すように、すべての場合において、１０６．０ＥＩＤ５０を超えるＩＢウイルスをヒヨコにチャレンジした。
【００７１】
【表６】
【００７２】
臨床徴候、繊毛活動、および病理学的検査
試験期間中に死んだヒヨコはいなかった。ＩＢ １４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジした一部のヒヨコにおいて、ヒヨコへの処置後に、極めて軽度の眼鼻からの滲出性分泌物（鼻の穴に小さな液滴）および喘ぎが観察されただけであった。
【００７３】
繊毛静止は、対照ヒヨコのいずれにおいても観察されなかったが、ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコでははっきりと示された。Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０ウイルスをチャレンジしたヒヨコ１０匹の内の３匹は、完全な繊毛静止を示した。繊毛静止を示す気管切片の数は、ＩＢＶ １１４８（ｐ５０）（切片６個）、ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）（切片２０個）、およびＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）（切片４１個）をヒヨコにチャレンジした場合に増加した。
【００７４】
ヒヨコの病理学的検査の間に、ＩＢ １４４９−２（ｐ５）、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０、またはＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコでは、カタル性の滲出液が気管中に存在することが判明した。ＩＢ １４４９−２（ｐ５）をチャレンジした１匹のヒヨコでは、腫大した色の薄い腎臓が見出された。
【００７５】
表６に要約する繊毛活動、臨床徴候、および死後所見に基づいて、ＩＢ−ＱＸ様由来ウイルスの分類を行った。Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０およびＩＢ−Ｍ４１と比べて、Ｌ−１１４８（ｐ５０）株を軽度に分類し、ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）を中程度のビルレントに分類し、ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）をわずかなビルレントに分類した。
【００７６】
【表７】
【００７７】
気管、肺、および腎臓の組織像
Ｌ−１１４８（ｐ５０）、１４４９−２（ｐ５）、およびＩＢ−Ｈ１２０をチャレンジしたヒヨコの気管には異常は認められなかった。１４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジした後に、壊死を伴う局所的気管炎が、気管４つの内の１つで認められた。ＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコの気管はすべて、急性気管炎を示した。ＩＢＶは、ＩＢ−Ｍ４１に感染したヒヨコの気管においてのみ検出することができた。
【００７８】
どのヒヨコの肺においても、異常は見出されず、ＩＢＶは検出されなかった。
【００７９】
Ｌ−１１４８（ｐ５０）および１４４９−１０（ｐ５０）をチャレンジされたヒヨコの腎臓の組織像から、一部の場合において、単核細胞および形質細胞性細胞のわずかな浸潤が実証された。管上皮は罹患していなかった。感染後４日目に採取された腎臓試料の管上皮細胞において、免疫組織化学によってＩＢＶ−抗原は検出されなかった。免疫組織化学的染色後に、どの群の腎臓においても、ＩＢＶを検出することができなかった。
【００８０】
考察
ＩＢＶは、気管粘膜に最初に感染し、次いで、他の器官の上皮、例えば、腎臓の管上皮細胞および輸卵管の上皮において複製する。上皮細胞におけるＩＢＶの複製は、細胞の変性をもたらす可能性があり、続いて、器官／組織の病理学的変化が起こり得る。臨床徴候が発生するかどうかは、ＩＢＶのビルレンス、感染した器官、二次感染の発生、およびヒヨコの全体的健康状態などいくつかの因子に依存する。これは、ＩＢＶをチャレンジしたヒヨコの気管において認められ、その際、繊毛活動は、これらの動物のすべて（ＩＢＶ−Ｍ４１）、４０％（１４４９−１０（ｐ５０））、２０％（１４４９−２（ｐ５））、および１０％（ＩＢＶ Ｌ−１１４８（ｐ５０））において損なわれている。ＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）、Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０、およびＩＢ−Ｍ４１をチャレンジしたヒヨコの気管には、カタル性の滲出液が存在した。ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）をヒヨコにチャレンジした場合のみ、軽度の臨床徴候が認められた。これらは、繊毛静止およびそれに続く粘液増大の結果であったようである。高用量のＩＢＶをヒヨコにチャレンジしたということを念頭におくと、本実施例の結果は有望である。ＩＢＶ Ｌ−１１４８（ｐ５０）およびＩＢＶ １４４９−２（ｐ５）をヒヨコにチャレンジした後に臨床徴候がなかったことは、対応する野外株によって引き起こされる臨床徴候が軽度であることを反映している可能性が高い。ＩＢＶ １４４９−１０の野外株はビルレントであったため、ＩＢＶ １４４９−１０（ｐ５０）をＳＰＦヒヨコにチャレンジした後に軽度の呼吸器徴候のみが認められたことは、この株が弱毒化されていることを実証する。
【００８１】
結論
本実施例に示すように、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスは、複数回の継代によって弱毒化させることができる。結果として生じる、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来の弱毒化株は、伝染性気管支炎に対する新しいワクチン株として大いに有望である。ニワトリに投与した場合に中程度のビルレント作用を引き起こす、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス由来の継代ウイルスは、新規なＩＢワクチン、特にＩＢ−ＱＸ様ウイルスに対するワクチンを研究し、さらに開発するために、チャレンジ材料として有用であると思われる。
【００８２】
（実施例３）
ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８のさらなる継代および安全性
導入
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ様ウイルス株Ｌ−１１４８を発育鶏卵中で複数回継代した。ニワトリの繊毛静止の程度および腎臓形態を測定することによって、様々な継代レベルにおけるこのウイルスの安全性を評価した。下記に示すように、Ｌ−１１４８株の複数回継代の結果、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスによる感染症に対するワクチンとして適切な弱毒化株が得られた。
【００８３】
ＳＰＦ発育鶏卵におけるＬ−１１４８の継代
ウイルス継代のために、１０〜１１日目の特定病原体除去（ＳＰＦ）発育鶏卵を使用した。ＳＰＦ鶏卵中でＬ−１１４８株を最初に７回継代した。最初の５回の継代の間、希釈されていない尿膜腔液を接種した。継代は、胚が生きている卵から得た尿膜腔液を用いてのみ、行った。この結果、約５０％の死亡胚が生じた。生理的塩類溶液中で１００倍希釈した尿膜腔液を用いて継代を継続することに決めたところ、死亡胚の数は減った。継代７３回まで、継代を継続した。７３回継代物の回収の際、ＩＢ Ｌ−１１４８株にニューカッスル病（ＮＤ）ウイルスが混入していることが分かった。ＩＢ Ｌ−１１４８株の５０回継代物をワクチン接種したニワトリから得た血液試料は、ＮＤウイルスに対する抗体を含有していた。８回継代物の試料のＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＩＢ Ｌ−１１４８株には最初からこのウイルスが混入していたことが明らかになった。継代を中止し、ＩＢ Ｌ−１１４８ウイルス株の汚染を浄化することに決めた。
【００８４】
Ｌ−１１４８継代物の汚染除去
２２回、４７回、および７３回継代物から試料を採取し、ＮＤ特異的抗血清で処理した。手短に言えば、尿膜腔液：血清の体積比１：２で、尿膜腔液試料をＮＤ特異的ポリクローナル抗血清の試料と混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、続いて、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、１０倍希釈系列を調製し、希釈物１つ当たり５個の卵に、０．１ｍｌをそれぞれ接種した。２日後、尿膜腔液を回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってＩＢに対して依然として陽性であることが確認された内で最も高濃度の希釈物に由来する試料を集めた。胚が死んでいる卵は廃棄した。尿膜腔液を前述のＮＤ抗血清で再び処理し、希釈系列を卵に再び接種した。インキュベーション後、ＲＴ−ＰＣＲによってＩＢに対して依然として陽性であることが確認された内で最も高濃度の希釈物を再び集め、分割して容器に入れ（ｆｉｌｌｅｄ）、凍結し、−７０℃で保存した。
【００８５】
前述の汚染除去プロセスにより、浄化されクローニングされた２４回継代物、４９回継代物、および７５回継代物が得られた。卵１個当たり０．２ｍｌの１０７倍希釈物を卵に接種し、３７℃で４８時間インキュベートした後に回収することによって、継代レベル２５のバッチを作った。尿膜腔液を少量ずつ分割して容器に入れ、−７０℃で保存した。同じ手順に従って、５０回継代物のバッチを作った。７５回継代物を継代８０回までさらに継代した。８０回継代物の尿膜腔液を集め、少量ずつ分割して容器に入れ、凍結し、−７０℃で保存した。
【００８６】
安全性試験
様々な継代レベルのＩＢ Ｌ−１１４８株のニワトリにおける安全性を数回試験した。ビルレントなマサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）様株ＩＢ−Ｍ４１および軽度ワクチン株Ｐｏｕｌｖａｃ ＩＢ Ｈ１２０と共に、弱毒化されていないＩＢ−ＱＸ様株１４４９−１０も、試験に含めた。
【００８７】
１日齢のＳＰＦニワトリを各試験に使用した。試験は、標準手順に従って実施した。手短に言えば、１ｍｌ注射器を用い、すべてのヒヨコの各眼に０．１ｍｌを投与することによって、連続してヒヨコ５匹にＩＢウイルスをチャレンジした。ＩＢ−Ｍ４１の場合、眼１つ当たり０．２５ｍｌをヒヨコに与えた。凍結乾燥したウイルスを注射用水に溶解して復元し、さらなる希釈物は栄養ブロスに溶かして調製した。続いて、これらの鳥の臨床徴候を毎日観察した。
【００８８】
ウイルス投与後５日目に、５匹のニワトリの気管外植片の繊毛活動を検査した。安楽死させたニワトリから気管を摘出し、気管の０．６ｍｍ横断切片、すなわち、気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つを作った。これらの気管横断切片を３７℃のＰＢＳ ２ｍｌを入れたペトリ皿に入れ、４分以内に顕微鏡下で検査した。
【００８９】
０（１００％の繊毛活動）〜４（０％の繊毛活動）の尺度に基づいて、顕微鏡によって繊毛活動を採点した。停止を示す気管切片の合計を１群当たりのヒヨコ数で割ることによって、各群の繊毛静止平均値を算出した。
【００９０】
気管、肺、および腎臓の試料を、安楽死させた動物から採取した。全試料を組織学的に検査した。ＩＢウイルスを検出するために、ＩＢＶエピトープ４８，４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色を実施した。
【００９１】
これらの結果を表７に要約する。
【００９２】
【表８】
【００９３】
これらの結果から、ＩＢ−Ｍ４１（ビルレント株）が高い繊毛スコアを有していたことが示され、達成され得る最大スコアは４０である。ＩＢ １４４９−１０株もまた、高い繊毛スコアを有していた。ワクチン株ＩＢ Ｈ１２０は、規制要件を満たす低スコア（例えば、２５未満）を有していた。ＩＢ Ｌ−１１４８株の８回継代物は、試験Ａにおいて３９という高スコアを有していた。継代レベル２５では、１８まで大幅に減少していた。継代レベル４０および５０では、試験Ａにおいて繊毛静止スコアが増加し、ｐ５０では３１まで増加していた。試験Ａにおいて試験したＩＢ Ｌ−１１４８株の試料はすべて、ＮＤウイルスに汚染されていた。ＮＤ汚染を浄化した後、継代レベル２５および５０を再び試験した。この時、繊毛静止スコアは明らかに低く、ワクチン株として許容できる範囲内であった。試験Ｂでは、８０回継代物も試験した。この継代物は、ＩＢ Ｈ１２０よりもはるかに低い、非常に低い繊毛静止スコアを与えるようであった。継代レベル８０は、安全なワクチン株のために必要である程度を超えて弱毒化されている可能性があることが予想された。
【００９４】
表７はまた、腎臓および気管の検査結果も示す。軽度〜中程度の腎炎は、一過性である限り、許容できるとみなした。気管炎は、一過性である場合のみ、許容できるとみなし、気管中の粘液に関しても同じとした。これらの結果から、ＩＢ Ｌ−１１４８の８回、２５回、４０回、および５０回継代物は、参照ワクチン株ＩＢ Ｈ１２０とちょうど同じように腎臓を冒したが、ＩＢ株１４４９−１０ほど重症ではなかったことが示される。８０回継代物もまた、腎臓に対していくらか影響を与えた。
【００９５】
試験ＡおよびＢの結果を解析した後、継代レベル６５のＩＢ Ｌ−１１４８のバッチ（すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ６５））を作製し、結果として得られるウイルスの安全性を評価することに決めた。それ以前の継代物に由来する尿膜腔液から集めた上清の１００倍希釈物０．１ｍｌをそれぞれ継代レベル６４まで卵に接種することによって、継代５０回〜継代６４回の継代物を調製した。ＧＭＰのもとで、継代レベル６５の大きなバッチを作製した。継代レベル６４から得た尿膜腔液の１０００倍希釈物０．２ｍｌをそれぞれ卵に接種した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、尿膜腔液を分取物として回収した。これらの分取物の内の１つから試料を採取し、力価測定し、安全性試験に供した。これらの結果を表７（試験Ｃ）に要約する。これらの結果から、平均繊毛静止スコアが１８であったことが示され、これは、ＩＢ Ｈ１２０に関する以前の試験で判明した結果と類似している。腎炎は観察されず、ニワトリ１５匹の内の１匹のみで、いくらかの粘液が気管中に存在した。
【００９６】
結論
本実施例は、発育鶏卵において複数回ＩＢ−ＱＸ様株を継代することによって、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに対する安全なワクチン株を作製できることを実証する。本実施例において、２５〜８０の継代レベルは、公知の許容できるＩＢワクチンと同等の安全性プロファイルを有する弱毒化ウイルスをもたらした。
【００９７】
（実施例４）
ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８に由来するワクチンの有効性
本実施例において、ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８に由来する２種のワクチン株の有効性を評価した。試験したワクチン株は、Ｌ−１１４８（ｐ６５）およびＬ−１１４８（ｐ８０）であった（実施例３を参照されたい）。
【００９８】
１日齢のＳＰＦ産卵ニワトリに、スプレーによって（１用量当たり０．５ｍｌ）ワクチン接種した。ワクチン接種後３週目に、１０４．０ＥＩＤ５０のＩＢ株Ｄ３８８（オランダで単離されたビルレントＩＢ−ＱＸ様株）の１用量をこれらのニワトリにそれぞれチャレンジした。
【００９９】
チャレンジ後５日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。気管の小さな横断切片を手作業で作った。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。
【０１００】
下記の分類基準を用いて、繊毛活動を採点した。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
所与の気管切片に関して、内輪（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｎｇ）の少なくとも５０％（スコア０）が力強い繊毛運動を示す場合、繊毛活動は正常とみなした。輪１０個の内の９個以上が正常な繊毛活動を示す場合、ニワトリは疾患に冒されていないとみなした。気管試料採取後２時間目よりも後に気管切片を顕微鏡によって検査した場合、試験は有効ではなかった。
【０１０３】
結果を表８に要約する。
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
ワクチン接種されず、かつチャレンジされていない対照群では、ニワトリ２０匹の内の１匹が、繊毛活動の低下を示したが、理由は特定されなかった。他のニワトリでは、繊毛運動は正常であった。ワクチン接種されず、チャレンジされた群では、すべてのニワトリが、繊毛活動の低下を示した。Ｌ−１１４８（ｐ６５）およびＬ１１４８（ｐ８０）をワクチン接種された群では、保護が観察されなかった１０２．４ＥＩＤ５０のＬ−１１４８（ｐ６５）をワクチン接種された群を除いて、規制当局によって規定されているよりも優れた保護が認められた（例えば、少なくとも８０％が保護された）。
【０１０６】
本実施例は、連続的継代によってＩＢ−ＱＸ様株から誘導したワクチン株の有効性を実証する。
【０１０７】
（実施例５）
その他のＩＢ−ＱＸ様ワクチン株の安全性評価
導入
本実施例では、ニワトリにおけるＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８（ｐ８０）（本明細書において「マスターシードウイルス」または「ＭＳＶ−ｐ８０」とも呼ばれる）の安全性を、継代レベル１０１のＬ−１１４８株（「Ｌ−１１４８（ｐ１０１）」）および継代レベル１８の１４４９−２株（「１４４９−２（ｐ１８）」）と共に評価した。
【０１０８】
健常な雌の白色レグホーンヒヨコ２５０匹を各５０匹の５群に分け、表９に示す試験計画に従って本実施例で使用した。
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
眼鼻経路によってワクチン接種を実施した。各ヒヨコに、体積０．２ｍＬ（各眼に０．１ｍＬ）の対応するワクチンを与えた。ワクチンはすべて、１０５．０ＥＩＤ５０／鳥の用量で投与した。
【０１１１】
試験の間、鳥の臨床症状を毎日観察した。いかなる臨床徴候または死亡も記録した。試験中に死亡した鳥は、死後検査にかけた。
【０１１２】
１２週齢で検査した第２群の若い雌鶏を除いて、１１週齢に輸卵管を検査した。若い雌鶏を安楽死させ、体腔を開き、嚢胞、狭窄、変形、または形成不全の存在について、輸卵管全体の外面および内面を（輸卵管をハサミで縦方向に開いて）巨視的に検査した。
【０１１３】
結果
死亡率の結果を表１０に要約する。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
輸卵管検査の結果を表１１に要約する。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
第１群では、ニワトリ４８匹中６匹（１２．５％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。１匹のニワトリが、直径４．４ｍｍの小さな嚢胞を有していた。これは、壁の近くに位置し、輸卵管の管状構造に影響を与えなかった。
【０１１８】
第２群では、生き残ったニワトリ４９匹すべてが、正常な卵巣および輸卵管を有していた。１匹のニワトリが、２．４×４．１ｍｍの小さな嚢胞を有していた。これは、卵巣の近くに位置したが、輸卵管の管状構造に影響を与えなかった。
【０１１９】
第３群では、ニワトリ４３匹中４匹（９．３％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。
【０１２０】
第４群では、ニワトリ３９匹中２匹（５．１３％）が嚢胞性輸卵管および上部区域の形成不全を示した。
【０１２１】
考察
試験ワクチンをワクチン接種した鳥において、死亡率が相対的に低く、観察される嚢胞性かつ形成不全性の輸卵管の発生率が低かったことから、これらのワクチンが通常安全であることが示される。７日齢の若い雌鶏に投与されたＭＳＶ−ｐ８０ワクチンは、特に優れた安全性プロファイルを有していると思われ、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の安全要件を満たす。
【０１２２】
（実施例６）
ビルレンス復帰試験
導入
実施例５で上述したように、ＩＢ−ＱＸ様株Ｌ−１１４８（ｐ８０）をマスターシードウイルスまたは「ＭＳＶ−ｐ８０」と名付けた。本実施例において、ＭＳＶ−ｐ８０およびビルレンスに復帰させるために戻し継代した派生体「ＭＳＶ＋１ＢＰ」の性質を評価した。
【０１２３】
下記のワクチンを本実施例において使用した：
（Ａ）ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０の用量のＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０（すなわち、Ｌ−１１４８（ｐ８０））。
（Ｂ）１回のニワトリ戻し継代の後に回収した、ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０の用量の戻し継代ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０（「ＭＳＶ＋１ＢＰ」）。戻し継代の手順は次の通りである。（ｉ）１用量当たり１０４．０ＥＩＤ５０のＭＳＶ−ｐ８０を含有する０．１ｍＬを点眼することによって、１４日齢ＳＰＦニワトリ５匹にワクチン接種した。（ｉｉ）ワクチン接種後４日目にこれらのニワトリを安楽死させ、気管粘膜の懸濁液を調製した。（ｉｉｉ）１４日齢ＳＰＦニワトリ５匹の第２の群にこの気管懸濁液を接種した。ＲＴ−ＰＣＲおよび卵接種によって、気管粘膜試料をウイルスの存在について試験した。最初のニワトリ戻し継代の段階では、ＰＣＲおよび卵接種によってウイルスが検出されたが、２回目のニワトリ戻し継代の段階では、ウイルスを検出することができなかった。最初のニワトリ継代の段階の気管粘膜試料から得たウイルスを増幅し、ＭＳＶ＋１ＢＰと名付けた。
【０１２４】
１日齢のＳＰＦニワトリ合計５１匹を３群に分け、表１２に示す試験計画に従ってワクチン接種した。
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
眼鼻経路によってワクチン接種を実施した。各ニワトリに、体積０．１ｍＬ（各眼に０．０５ｍＬ）の対応するワクチンを与えた。
【０１２７】
ワクチン接種後５日目、７日目、および１０日目に、気管外植片の繊毛活動を検査した。１００％ＣＯ２を吸入させることによってニワトリを安楽死させた。死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。ＭｃＩｌｗａｉｎ組織裁断器（Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いて、気管の０．６ｍｍ横断切片を作った。ペトリ皿中で、これらの気管横断切片を３７℃の生理食塩水２．０ｍＬと混合した。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。気管外植片はすべて、試料採取後２時間以内に検査した。下記の定義を用いて、繊毛の活動を０〜４の尺度に基づいて採点した：
【０１２８】
スコア定義
０ 気管切片全体の繊毛が活動を示した。
１ 気管切片の６７％を超えるが１００％未満の繊毛が活動を示した。
２ 気管切片の３３％〜６７％の繊毛が活動を示した。
３ 気管切片の３３％未満であるが０％を超える繊毛が活動を示した。
４ 気管切片全体の繊毛が活動を示さなかった。
【０１２９】
各群のニワトリを、（ａ）気管外植片の繊毛活動、（ｂ）肉眼による病理学的検査、（ｃ）腎臓の組織像、および（ｄ）血清学的検査について評価した。停止を示した気管切片のスコアの合計を群当たりのニワトリ数で割ることによって、繊毛静止を算出した。肉眼による病理学的検査のために、各ニワトリの剖検を実施して、ワクチンに関連し得る任意の異常を判定した。ホルマリン固定した腎臓組織の組織学的検査を実施し、調査結果を次のように記録した。腎炎なし、軽度の腎炎、中程度の腎炎、または重度の腎炎。血清学解析のために、１日齢ニワトリ１０匹から採取した血清において血清中和試験およびＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【０１３０】
結果
１．臨床徴候
試験期間中、ＭＳＶ−ｐ８０またはＭＳＶ＋１ＢＰに帰すことができる臨床徴候は、観察されなかった。しかし、ＭＳＶ−ｐ８０をワクチン接種したニワトリ１匹が、ワクチン接種後２日目に死んでいるのが発見された。剖検時に、気管炎および肺炎が観察された。死因は、気管中の多量の粘液に起因する窒息であると判定した。他のニワトリのどれも全く臨床徴候を示さず、かつ、ＩＢのためのインキュベーション期間（４日）よりはるかに短い期間である、ワクチン接種後たった２日目の時点で死亡が起こったため、伝染性気管支炎が死因である見込みは少ないと考えた。
【０１３１】
２．繊毛活動
ワクチン接種後５日目、７日目、および１０日目の繊毛静止スコアを表１３に示す。１つの気管試料である１つの切片を除いて、ワクチン接種後５日目に採取した気管試料のいずれにおいても繊毛活動停止は認められなかった。しかし、７日目および１５日目に、比較的小規模の繊毛活動停止が両群で観察された。ＭＳＶ−ｐ８０およびＭＳＶ＋１ＢＰの平均繊毛静止スコアはそれぞれ１５および１０であった。
【０１３２】
３．病理学的検査ならびに気管および腎臓の組織像
腎臓のいくらかの非特異的な色の薄さのほかには、気管および腎臓において、巨視的異常は全く観察されなかった。（表１３を参照されたい）。いくらかの間質内リンパ細胞浸潤が、腎臓試料の組織病理学的検査中に観察された。他の病変（顆粒状変性、管上皮の空胞形成および剥離、ならびに大量のヘテロフィル浸潤）がないことから、観察されるリンパ球浸潤は免疫応答の開始に起因する可能性が高いことが示唆された。
【０１３３】
【表１５】
【０１３４】
４．血清学的検査
伝染性気管支炎ウイルスに対する抗体は、免疫前血清中では検出されなかった（データ不掲載）。
【０１３５】
考察および結論
ＭＳＶ−ｐ８０およびＭＳＶ＋１ＢＰの両方をワクチン接種したニワトリの平均繊毛静止スコアは２５未満であり、鳥類伝染性気管支炎の顕著な臨床徴候を示したニワトリはいなかった。ＭＳＶ−ｐ８０（すなわちＬ−１１４８（ｐ８０））は気道および腎臓にとって安全であり、標準要件を満たすと結論付けた。さらに、ニワトリにおける戻し継代後にＭＳＶ−ｐ８０のビルレンスが増大する徴候はない。
【０１３６】
（実施例７）
ＩＢ−ＱＸ様ワクチンの有効性および最小保護用量
導入
本実施例において、４種の異なるＩＢ−ＱＸ様ワクチンの最小保護用量を、ビルレントＩＢ−ＱＸ様ウイルスをチャレンジしたニワトリにおいて決定した。
【０１３７】
下記の生ワクチンを本実施例において使用した。
（１）本明細書において「ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋２」と呼ぶ、さらに２回継代したＭＳＶ−ｐ８０（したがって、合計８２回継代されている）。
（２）本明細書において「ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋５」と呼ぶ、さらに５回継代したＭＳＶ−ｐ８０（合計８５回継代されている）。
（３）本明細書においてＬ−１１４８（ｐ１０１）と呼ぶ、１０１回継代したＬ−１１４８株。
（４）本明細書において１４４９−２（ｐ１９）と呼ぶ、１９回継代した１４４９−２株。
【０１３８】
合計２０８匹の健常な１日齢ＳＰＦニワトリをこの試験において使用した。（市販されている花用噴霧器を用いて）粗いスプレーによって、様々な用量の前述のワクチンをニワトリにワクチン接種した。ワクチン接種後２１日目に、１０４．０ＥＩＤ５０のビルレントＩＢ−ＱＸ様株Ｄ３８８を点眼（各眼に０．０５ｍＬ）することによって、これらのニワトリにチャレンジした。チャレンジ後５日目に、ニワトリ２０匹において、気管外植片の繊毛活動を判定した。ワクチン接種実施日およびワクチン接種後２１日目に、血液を採取した。実験計画を表１４に要約する。
【０１３９】
【表１６】
【０１４０】
チャレンジ後５日目に、ニワトリ２０匹において、気管外植片の繊毛活動を検査した。ニワトリを安楽死させ、死亡直後に、気管を摘出し、３７℃の生理食塩水ですすぎ、さらに処理するまで３７℃の生理食塩水中で保存した。気管の小さな横断切片を手作業で作った。気管の上部の切片３つ、中央部の切片４つ、および下部の切片３つの繊毛活動を低倍率顕微鏡観察によって検査した。下記の分類基準を用いて、繊毛活動を採点した：
【０１４１】
スコア判定基準
０ 気管切片の少なくとも５０％が繊毛活動を示した。
１ 気管切片の５０％未満が繊毛活動を示した。
【０１４２】
所与の気管切片に関して、内輪の少なくとも５０％（スコア０）が力強い繊毛運動を示す場合、繊毛活動は正常とみなした。輪１０個の内の９個以上が正常な繊毛活動を示す場合、ニワトリは疾患に冒されていないとみなした。気管試料採取後２時間目よりも後に気管切片を顕微鏡によって検査した場合、試験は有効ではないとみなした。
【０１４３】
チャレンジ後５日目に各ニワトリの剖検を実施して、ＩＢＶ感染の結果であり得る腎臓の任意の異常を判定した。次の判定基準を用いて、腎臓における巨視的所見を採点した。正常＝正常な外観（ｎ．ａ．）。腫大、色が薄い、または尿酸結晶＝１。
【０１４４】
結果
１．ワクチン接種後の臨床徴候
繊毛の検査結果および肉眼による病理学的検査の結果を表１５に要約する。
【０１４５】
【表１７】
【０１４６】
表１５に示す結果から、ＭＳＶ−ｐ８０ワクチンは、１０３．０ＥＩＤ５０以上の用量が使用される限り、有効であることが示される。１０２．７ＥＩＤ５０の用量では保護を誘導しなかった。ＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋２およびＭＳＶ−ｐ８０ Ｘ＋５によってもたらされた保護には有意ではない少しの差があった。この試験において、Ｘ＋２の方がＸ＋５よりいくらか優れた保護を与えた。Ｌ−１１４８（ｐ１０１）株が与えた保護は、それより継代レベルが少ないものよりも劣っていた。
【０１４７】
概要
本実施例では、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０に由来するワクチンの安全性および有効性をさらに実証する。
【０１４８】
（実施例８）
ニワトリ間での弱毒化ＩＢ ＱＸの伝播および体内での拡散
導入
本実施例では、弱毒化ＩＢ ＱＸワクチン株ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０の体内での拡散およびワクチン接種されていないニワトリへのＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０の伝播を調査した。
【０１４９】
実験計画
１．動物
ＳＰＦニワトリ合計１６５匹を表１６に示す群に分けた。通常の手順に従ってニワトリを飼育した。食物および水は自由に入手可能であった。試験期間の全体を通して、すべてのニワトリの臨床徴候を観察した。
【０１５０】
【表１８】
【０１５１】
２．方法
２．１ ワクチン接種
１０８．２ＥＩＤ５０を有するＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０を入れた１つのバイアルを緩衝液１５７．５ｍｌ中で希釈し、調製後２時間以内に使用した。第１群の１日齢ニワトリに、希釈したウイルス０．１ｍｌを点眼によって（ニワトリ１匹当たり１０５．０ＥＩＤ５０のＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０）ワクチン接種した。ワクチン接種後、使用したワクチンの試料を−５０℃で保存した。逆滴定を実施して、投与したワクチン中のウイルスの力価を測定した。投与したワクチンは、１ｍｌ当たり１０６．０７ＥＩＤ５０のＩＢ ＱＸを含有することが判明した。これは、ニワトリ１匹当たり１０５．０７ＥＩＤ５０の用量に相当する。
【０１５２】
２．２ 実験計画
第１群のニワトリに、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０をワクチン接種した。ワクチン接種後３日目に、ワクチン接種された第１群のニワトリ３０匹を、同じ鳥齢および起源の第２群のワクチン接種されていないニワトリ３５匹を入れた封じ込め施設（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｕｎｉｔ）に追加した。ワクチン接種後７日目に、第４群のワクチン接種されていないニワトリ３０匹からなる群をこの封じ込め施設に追加した。ワクチン接種後１４日目に、ワクチン接種されたニワトリと同じ鳥齢および起源の第３群のワクチン接種されていないニワトリ３５匹をこの封じ込め施設に追加した。一定の間隔で、１００％ＣＯ２を吸入させることによって、第２〜４群の各群のニワトリ２匹を屠殺し、嚢（ｂｕｒｓａ）、十二指腸、肺、腎臓、膵臓、および気管から試料を採取して、ＩＢＶの存在を判定した。
【０１５３】
ホルマリン固定した試料のＩＢＶエピトープ４８．４（核タンパク質）に関する免疫組織化学的染色によって、器官試料中のＩＢＶを検出した。ニワトリを屠殺した後、排泄腔および口腔咽頭からスワブを採取した。
【０１５４】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩワンステップｑＲＴ−ＰＣＲキットを用いたＰＣＲによって、スワブ中のＩＢ ＱＸの存在を検出した。ＰＣＲ混合物は、２倍ミックス２５μｌ、水１８μｌ、Ｔａｑプラチナ１μｌ、フォワードプライマー２μｌ、リバースプライマー２μｌ、および鋳型（ＲＮＡ）２μｌを含有した。以下のプライマーを使用した。
ＩＢＶ共通プライマー
ＳＸ３＋Ａ／Ｂ フォワード５’−ＴＡＡＴＡＣＴＧＧＹＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号５）
ＳＸ４− リバース５’−ＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号６）
ＩＢ ＱＸ特異的プライマー
Ａｌｇ−ＱＸ−１３９ フォワード５’−ＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴ−３’（配列番号７）
Ａｌｇ−ＱＸ−３９４− リバース５’−ＣＡＣＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＡＴ−３’（配列番号８）
【０１５５】
気管ＲＮＡを鋳型として使用した。ウイルスを陽性対照として使用した。
【０１５６】
下記のプログラムに従ってＲＴ−ＰＣＲを実施した。
１．５０℃で３０分
２．９５℃で１０分
３．９５℃で３０秒
４．５０℃で３０秒
５．７２℃で４５秒、ステップ３〜５を４０サイクル
６．７２℃で７分
７．４℃で５分
【０１５７】
アガロースゲル電気泳動によってＲＴ−ＰＣＲ産物を解析した。
【０１５８】
１日齢ニワトリ１０匹から血液試料を採取した。これは、試験の２１日目に、第１群、第２群、第３群、および第４群のそれぞれのニワトリ１０匹から採取した。１日齢ニワトリの断頭または翼静脈の穿刺によって血液を採取した。ＩＤＥＸＸ、ＵＳから入手可能なＦｌｏｃｋｃｈｅｋ（商標）ＩＢＶ抗体試験キットまたはＸ−Ｏｖｏ、Ｆｒａｎｃｅ社製のＦｌｏｃｋｓｃｒｅｅｎ（商標）ＩＢ−ＨＩキットを用いて、抗体力価を測定した。
【０１５９】
３．結果
結果を表１７に要約する。
【０１６０】
【表１９−１】
【０１６１】
【表１９−２】
【０１６２】
試験期間中、呼吸器徴候も、ＩＢを示唆する他の臨床徴候も、観察されなかった。第２群のニワトリ１匹が、卵黄嚢の炎症が原因で死亡した。第１群のニワトリ１匹は、共食いが原因で死亡した。ＩＢ ＱＸ抗原は十分な赤血球凝集を与えないため、血清学的試験のために、ＩＢ ７９３Ｂ抗原を用いて赤血球凝集抑制（ＨＩ）試験を実施した。どの血清中にも、ＨＩ試験またはＥＬＩＳＡによってＩＢ抗体は検出されなかった。
【０１６３】
ＩＨＴ染色により、ウイルスへの最初の曝露後４〜１１日目のニワトリの気管中ならびに４日目および１１日目の膵臓中でＩＢ ＱＸが検出された。嚢、十二指腸、肺、および腎臓では、ＩＨＴ染色によってＩＢ ＱＸが検出されなかった。
【０１６４】
ＩＢ ＱＸの存在は、すべての群から得た喉頭スワブおよび排泄腔スワブのＩＨＴ染色およびＰＣＲによって検出した。ＰＣＲにより、ＩＢ ＱＸへの最初の曝露後２〜１５日目に得た排泄腔スワブおよび喉頭スワブにおいてＩＢが検出された。ＩＢ ＱＸ陽性である頻度は、喉頭スワブの方が排泄腔スワブよりも高かった。
【０１６５】
４．考察
４．１ 拡散
上気道はＩＢＶ複製の主要部位であるため、気管中でＩＢ ＱＸが検出されることは予想された。続いて、ウイルス血症が起こり、ウイルスが他の組織に拡散する。膵臓中のＩＢ ＱＸの検出によって、このことが実証された。ＩＢＶは、主として上皮親和性のウイルスであるが、継代レベル８０のＩＢ ＱＸは腎臓でも肺でも検出できなかったことから、ニワトリ１匹当たり１０５．０ＥＩＤ５０のワクチン用量を投与した際、これらの器官からウイルスが除去されたことが示唆される。ニワトリ１匹当たり１０６．０ＥＩＤ５０のＩＢ ＱＸをニワトリにワクチン接種した、同じ継代レベルのＩＢ ＱＸを用いた安全性試験では、ワクチン接種後１０日間、腎臓および肺においてウイルスが検出された。本発明の試験では、気管中では１１日間、喉頭では１５日間、ＩＢ ＱＸが検出された。文献にある報告では、ＩＢは、臨床段階の間、感染後５〜１０日間、気管中で、また、感染後最長で２８日間、気管中で検出され得ることが発見されていた。ＩＢ ＱＸは膵臓において検出されたが、肉眼による病理学的検査の間に異常は観察されなかった。
【０１６６】
４．２ 伝播
ワクチン接種されていない群のすべてにおいてＩＢ ＱＸの存在が検出されたため、ＩＢ ＱＸの伝播が明らかに実証された。
【０１６７】
４．３ 安全性
点眼により、ニワトリ１匹当たり１０５．０７ＥＩＤ５０の用量で継代レベル８０のＩＢ ＱＸを投与したところ、ワクチンに関連したいかなる臨床徴候も、ワクチン接種後に引き起こされなかった。ワクチン接種されたニワトリへの接触後にＩＢ ＱＸに感染させた、ワクチン接種されていないニワトリにおいて、ＩＢの臨床徴候は観察されなかった。
【０１６８】
５．結論
ワクチン接種後、ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０ウイルスの増殖が気管中で起こり、ＩＢ ＱＸは他の器官に拡散した。ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０は少なくとも１回、ニワトリ間で伝播した。ＩＢ−ＱＸ ＭＳＶ−ｐ８０および群間で継代したワクチンは安全であった。
【０１６９】
（実施例９）
ＩＢ ＭＭワクチンおよびＩＢ ＱＸワクチンを用いた混合ワクチン接種
ＩＢ ＭＭワクチンおよびＩＢ ＱＸワクチンを用いた混合ワクチン接種の有効性をＳＰＦニワトリにおいて試験した。０日目および１４日目に、ＩＢ ＱＸ生ワクチンと共にＰｏｕｌｖａｃ ＩＢＭＭワクチン（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）をニワトリにワクチン接種した。１４日目の時点でＩＢ株ＩＴ０２を、また、３５日目の時点でＩＢ株７９３Ｂを、ワクチン接種された系統にチャレンジした。ワクチン接種の結果は、気管切片の繊毛静止試験（ＣＳＴ）の解析および腎臓病理の判定に基づいて判定した。ワクチン接種されたニワトリは、ＩＴ０２株および７９３株によるチャレンジから完全に保護された。
【０１７０】
各ワクチン接種プロトコルおよび結果の要約を表１８に示す。
【０１７１】
【表２０】
【０１７２】
前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の精神および範囲に入るあらゆる変更および修正を包含すると意図される。
【０１７３】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示している。すべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されたかのように、同じように参照により本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルス。
【請求項２】
不活化されている、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項３】
生きており、かつ弱毒化されている、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項４】
継代することによって弱毒化されている、請求項３に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項５】
少なくとも５回継代することによって弱毒化されている、請求項４に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項６】
少なくとも５０回継代することによって弱毒化されている、請求項５に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項７】
株の呼称がＬ−１１４８であるＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項８】
株の呼称が１４４９−２または１４４９−１０であるＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項１０】
配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項１１】
（ｉ）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスおよび（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含むワクチン組成物。
【請求項１２】
前記単離されたＩＢウイルスが不活化されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種のアジュバントをさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記単離されたＩＢウイルスが生きており、かつ弱毒化されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する少なくとも１種の付加的な弱毒化生ＩＢウイルスをさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の付加的な弱毒化生ＩＢウイルスが、７９３Ｂ、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、イタリア（Ｉｔａｌｙ）−０２、Ｄ２７４、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、Ｄ１４６６、Ｂ１６４８、およびジョージア（Ｇｅｏｒｇｉａ）−９８からなる群より選択される非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ＩＢウイルス以外の感染病原体に由来する１つまたは複数の付加的な抗原性成分をさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記付加的な抗原性成分が、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、レオウイルス、トリインフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、またはトリ脳脊髄炎ウイルスに由来する、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
家禽の発育卵においてＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む、弱毒化生伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスを調製するための方法。
【請求項２０】
前記ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを家禽の発育卵において５〜４００回継代する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを家禽の発育卵において１０〜１００回継代する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載のワクチン組成物を鳥に投与するステップを含む、鳥に伝染性気管支炎（ＩＢ）のワクチン接種をするための方法。
【請求項２３】
伝染性気管支炎（ＩＢ）ＱＸウイルスまたはＩＢ ＱＸ様ウイルスからトリ宿主を保護するための方法であって、前記トリ宿主にワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンが、前記トリ宿主１匹当たり約１０２ＴＣＩＤ５０〜前記トリ宿主１匹当たり約１０６ＴＣＩＤ５０のおおよその範囲である免疫原的に有効な量の弱毒化生株ＩＢ ＱＸウイルスまたはＩＢ ＱＸ様ウイルスから本質的になる、方法。
【請求項２４】
前記トリ宿主１匹当たり約１０５ＴＣＩＤ５０を投与するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記トリ宿主がニワトリである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチンを点眼またはスプレーによって投与する、請求項２３から２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＱＸウイルスまたはＱＸ様ウイルスを、卵を介して継代することによって弱毒化する、請求項２３から２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも３０回継代されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも６５回継代されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも７０回継代されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも８０回継代されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも８５回継代されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に仮の受託番号０９０６１００２で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００４で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００３で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５と名付けられた株、またはＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００１で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５と名付けられた株の内の１つまたは複数を投与するステップを含む、請求項２３から３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＢウイルス以外の１つまたは複数の付加的な感染病原体に対するワクチン接種をするステップをさらに含む、請求項２３から３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に仮の受託番号０９０６１００２で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００４で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００３で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５と名付けられた株、またはＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００１で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５と名付けられた株から選択される、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された弱毒化伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルス。
【請求項１】
ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルス。
【請求項２】
不活化されている、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項３】
生きており、かつ弱毒化されている、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項４】
継代することによって弱毒化されている、請求項３に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項５】
少なくとも５回継代することによって弱毒化されている、請求項４に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項６】
少なくとも５０回継代することによって弱毒化されている、請求項５に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項７】
株の呼称がＬ−１１４８であるＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項８】
株の呼称が１４４９−２または１４４９−１０であるＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項１０】
配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むＳ１タンパク質を有するＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１に記載の単離されたＩＢウイルス。
【請求項１１】
（ｉ）ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスおよび（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含むワクチン組成物。
【請求項１２】
前記単離されたＩＢウイルスが不活化されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種のアジュバントをさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記単離されたＩＢウイルスが生きており、かつ弱毒化されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する少なくとも１種の付加的な弱毒化生ＩＢウイルスをさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の付加的な弱毒化生ＩＢウイルスが、７９３Ｂ、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、イタリア（Ｉｔａｌｙ）−０２、Ｄ２７４、アーカンソー（Ａｒｋａｎｓａｓ）、Ｄ１４６６、Ｂ１６４８、およびジョージア（Ｇｅｏｒｇｉａ）−９８からなる群より選択される非ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ＩＢウイルス以外の感染病原体に由来する１つまたは複数の付加的な抗原性成分をさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記付加的な抗原性成分が、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、レオウイルス、トリインフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、またはトリ脳脊髄炎ウイルスに由来する、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
家禽の発育卵においてＩＢ−ＱＸ様ウイルスを継代するステップを含む、弱毒化生伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスを調製するための方法。
【請求項２０】
前記ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを家禽の発育卵において５〜４００回継代する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＩＢ−ＱＸ様ウイルスを家禽の発育卵において１０〜１００回継代する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載のワクチン組成物を鳥に投与するステップを含む、鳥に伝染性気管支炎（ＩＢ）のワクチン接種をするための方法。
【請求項２３】
伝染性気管支炎（ＩＢ）ＱＸウイルスまたはＩＢ ＱＸ様ウイルスからトリ宿主を保護するための方法であって、前記トリ宿主にワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチンが、前記トリ宿主１匹当たり約１０２ＴＣＩＤ５０〜前記トリ宿主１匹当たり約１０６ＴＣＩＤ５０のおおよその範囲である免疫原的に有効な量の弱毒化生株ＩＢ ＱＸウイルスまたはＩＢ ＱＸ様ウイルスから本質的になる、方法。
【請求項２４】
前記トリ宿主１匹当たり約１０５ＴＣＩＤ５０を投与するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記トリ宿主がニワトリである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチンを点眼またはスプレーによって投与する、請求項２３から２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＱＸウイルスまたはＱＸ様ウイルスを、卵を介して継代することによって弱毒化する、請求項２３から２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも３０回継代されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも６５回継代されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも７０回継代されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも８０回継代されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記弱毒化されたウイルスが少なくとも８５回継代されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に仮の受託番号０９０６１００２で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００４で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００３で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５と名付けられた株、またはＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００１で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５と名付けられた株の内の１つまたは複数を投与するステップを含む、請求項２３から３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＢウイルス以外の１つまたは複数の付加的な感染病原体に対するワクチン接種をするステップをさらに含む、請求項２３から３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に仮の受託番号０９０６１００２で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８ ＭＳＶ６５と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００４で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０と名付けられた株、ＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００３で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ６５ ｘ＋５と名付けられた株、またはＥＣＡＣＣに仮の受託番号０９０６１００１で寄託されているＩＢ ＱＸ Ｌ１１４８Ａ ＭＳＶ８０ ｘ＋５と名付けられた株から選択される、ＩＢ−ＱＸ様ウイルスに由来する単離された弱毒化伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルス。
【公表番号】特表２０１１−５３０２９４（Ｐ２０１１−５３０２９４Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２２６１（Ｐ２０１１−５２２２６１）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３０８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７４４０
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３０８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７４４０
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
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