ＩＧＦ−１値上昇剤
【課題】経口によってＩＧＦ−１の血中濃度を上昇させることができる、ＩＧＦ−１値上昇剤を提供する。
【解決手段】魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを経口投与すると、肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量が増大し、更に、ＩＧＦ−１の血中濃度に関与するＩＧＦＢＰ−２やＣｉ１量を左右するＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡやＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量も増大させ、ＩＧＦ−１値上昇剤として機能する。
【解決手段】魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを経口投与すると、肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量が増大し、更に、ＩＧＦ−１の血中濃度に関与するＩＧＦＢＰ−２やＣｉ１量を左右するＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡやＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量も増大させ、ＩＧＦ−１値上昇剤として機能する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚鱗および／または魚皮コラーゲンを加水分解してなるペプチドを主要成分とするＩＧＦ−１値上昇剤に関し、より詳細には、上記ペプチドを経口摂取することで肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡなどのＩＧＦ−１に関する遺伝子発現量を増加させ、最終的にＩＧＦ−１の血中濃度を上昇させることができるＩＧＦ−１値上昇剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であり、動物組織に普遍的に存在する。コラーゲンや、これを酵素、酸、アルカリなどで加水分解したコラーゲンペプチドは、単独で、または他の成分と併用して医薬組成物または食品組成物、栄養補助食品などとして広く使用されている。
【０００３】
例えば、魚から加熱抽出又は加圧加熱抽出によって得たコラーゲンをタンパク加水分解酵素で平均分子量が１０００〜１００００になるまで酵素分解し、この酵素分解物を濃縮および精製し、固形分中の遊離アミノ酸含量が１．０質量％以下、ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である魚類由来のコラーゲンペプチドを含有する飲食品がある(特許文献１)。コラーゲンの様々な生理効果を期待し、かつ魚特有の味や臭いがなく、ヒ素含量の少ない魚類由来のコラーゲンペプチドの製造方法およびこのようなコラーゲンペプチドを含有する飲食品を提供するものである。コラーゲンペプチドの平均分子量を上記範囲に限定したのは、低粘度で飲食品に使用できからである。
【０００４】
また、生体コラーゲン合成促進剤と異常タンパク質除去剤とを含有する抗老化用組成物であって、コラーゲン及び／またはゼラチンの分解物であって分子量が２００〜３００のものを含有する分解物を生体コラーゲン合成促進剤として含む抗老化用組成物もある（特許文献２）。コラーゲンペプチドによって皮膚のターンオーバーを促進させ皮膚の老化防止効果に優れるという。使用するコラーゲンは、牛や豚や魚などの動物の皮膚、骨及び腱などの結合組織から抽出したものでよく、タンパク分解酵素を使用し、平均分子量が２００〜３００付近のものを使用する。平均分子量が上記範囲であればトリペプチドを高含有するものであり、コラーゲン合成促進活性を飛躍的に向上させることができるからである。
【０００５】
また、コラーゲンやゼラチンのコラゲナーゼによる分解物であって、そのアミノ酸配列が、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（式中、Ｇｌｙは、グリシン残基を表し、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、互いにＸ，Ｙは同一であっても、異なってもよい）で表されるコラーゲントリペプチドからなるコラーゲンペプチド（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（ｎは、正の整数を表す）を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤もある（特許文献３）。特定のコラーゲンペプチドがヒアルロン酸産生促進剤として有効である事を見出したものである。コラーゲンペプチドの平均分子量は、２８０〜３０００であることが好ましく、より好ましくはコラーゲンペプチド（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎにおけるｎ＝１の含有量が、コラーゲンペプチド中に２５〜１００％のものである。このようなコラーゲンペプチドは、コラーゲンやゼラチンにコラゲナーゼを作用させて製造することができる。
【０００６】
更に、食品組成物であって、１）平均分子量１００００以下のコラーゲンを食品組成物全量に対して１０〜６０質量％と、２）グアーガムを食品組成物全量に対して０．００１〜０．１質量％と、３）メチルセルロースを食品組成物全量に対して０．０１〜１質量％、含有し、且つグアーガムの含有量がセルロースの含有量に対して５〜２０質量％であることを特徴とする、美肌用食品組成物もある（特許文献４）。この美肌用食品組成物は、水無しで摂取可能な顆粒形態であることを特徴とするものである。使用するコラーゲンは、魚類を基源として加水分解したものであり、平均分子量は１００００以下である。これを超えると口溶け性が阻害されて嚥下しにくくなるためである。
【０００７】
加えて、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物であって、分子量が１０００以下でありグルタミン酸単位が全アミノ酸単位の平均６モル％以上であるペプチドを有効成分として含む、カルシウム吸収促進剤もある（特許文献５）。吸収効率が高く、においの少ないカルシウム吸収促進剤を提供するものであり、コラーゲンの分解物は水溶性であるため吸収に優れ、かつグルタミン酸単位の含有量および分子量を特定することでカルシウム吸収剤の有効成分として使用できるという。ペプチドは、コラーゲンをブロメライン、フレーバーザイムＭなどの酵素で分解して製造することができる。分子量は１０００以下であることが好ましく、１０００を超えるとカルシウム吸収効率が低下するからである。また、ペプチドを構成する全アミノ酸単位中の酸性アミノ酸単位の割合は、平均６モル％以上である。６モル％未満であると、カルシウム吸収効率が低下するからである。
【０００８】
一方、ペプチドホルモンの一つに、下垂体から分泌される成長ホルモン(ＧＨ)によって肝臓から分泌されるインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）がある。ＩＧＦ−１は、インスリン様作用に加え細胞成長と発達に関与し、皮質の骨量、腎サイズ、前立腺サイズ、末梢血管抵抗性、ナトリウム貯留、癌進行、脳機能などの重要な内分泌効果を発揮する。このため、例えば、ＩＧＦ−１が毛根の活発化を介した育毛効果を発揮する事に鑑み、植物から抽出したスウェルチアマリンをＩＧＦ−１産生促進剤として毛髪毛乳頭細胞に直接投与する技術がある（特許文献６）。
【０００９】
一方、鮭の卵巣膜をタンパク分解酵素で処理して得られた成分からなるＩＧＦ−１上昇剤もある(特許文献７)。加齢によってＩＧＦ−１値が低下した場合でも、再びＩＧＦ−１値を上昇させることができる、という。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４２３６８５０号
【特許文献２】特許第４２８６５１３号
【特許文献３】特許第４３３６４８６号
【特許文献４】特許第４３６０９８６号
【特許文献５】特許第３８８１４５３号
【特許文献６】特開２００９−２６３２６２号公報
【特許文献７】特許第３９４６２３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
コラーゲンは、分子量によって粘度や溶解性などの物理的性質が異なり、加水分解の方法や分子量によって異なる薬効を発揮する。上記特許文献１のコラーゲンペプチドは様々の生理効果を、特許文献２のコラーゲンペプチドは皮膚の老化防止効果を、特許文献３のコラーゲンペプチドはヒアルロン酸産生促進効果を、特許文献４のコラーゲンペプチドは美肌効果および口溶け性を、特許文献５のコラーゲンペプチドはカルシウム吸収促進効果を発揮する。しかしながら、上記特許文献１〜５に示すコラーゲンペプチドは、主として皮膚や骨に対する局所的な作用を対象とするものである。
【００１２】
一方、ＩＧＦ−１は、ペプチドホルモンの一つであって、特許文献６に示すように、特定物質を毛髪毛乳頭細胞などの特定細胞に投与すると、ＩＧＦ−１の遺伝子発現が促進され、これにより毛根の活発化を介して育毛効果などの細胞成長効果が期待できる。また、特許文献７に示すように、鮭の卵巣膜をタンパク分解酵素で処理および抽出して得られる成分が、成年期を過ぎてＩＧＦ−１値が低下した場合でもＩＧＦ−１値を上昇させ、疲れやすさ、食欲、寝つき、眠りなどが改善されることも知られている。
【００１３】
一方、コラーゲンやコラーゲンペプチドは、動物組織に普遍的に存在するタンパク質であり、経口摂取による安全性が高い。コラーゲンやコラーゲンペプチドの経口摂取によってＩＧＦ−１の血中濃度が上昇すれば、極めて安全性の高いＩＧＦ−１値上昇剤となる。
【００１４】
上記状況に鑑み、コラーゲンの経口摂取によるＩＧＦ−１との係り、特に肝臓への関与を検討し、コラーゲンペプチドの新たな用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、本来廃棄される魚鱗および／または魚皮に由来するコラーゲンペプチドの経口摂取による肝臓への効果を検証したところ、後記する実施例に示すように、リボソームプロテインＳ６が増大し、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡ量が有意に増加し、および血中ＩＧＦ−１濃度も増加することが判明し、上記コラーゲンペプチドがＩＧＦ−１上昇剤として使用しうることを見出し、本発明を完成させた。魚鱗は廃棄部分であり、特定処理して得られた魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドが、経口摂取によって肝臓での遺伝子発現量を増強し、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の血中濃度を増加させることは、全く知られていなかった。
すなわち、本発明は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、前記タンパク分解酵素が、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであることを特徴とする、上記ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、前記コラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００である、上記ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
ＩＧＦ−１は、一般には、成長ホルモンによって肝臓から分泌され、インスリン様作用に加えて細胞成長と発達に関与するホルモンである。本発明によれば、特定処理した魚鱗および／または魚皮コラーゲンペプチドを経口で摂取するだけで、肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量を増大させ、かつＩＧＦ−１の血中濃度を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実験１の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのリボソームプロテインスモール６の遺伝子発現量の差を示す図である。**：ｐ＜０．０１
【図２】実験１の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのリボソームプロテインスモール６量の差を示す図である。
【図３】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【図４】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓での１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群とにおけるＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。**：ｐ＜０．０１
【図５】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける体重の経時変化を示す図である。*：ｐ＜０．０５、 **：ｐ＜０．０１
【図６】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群との餌摂取量の経時変化を示す図である。
【図７】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群との大腿骨の各部位における骨密度を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【図８】実験３の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓での１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群とにおけるＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤である。好ましくは、上記タンパク分解酵素がアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであり、得られたコラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００のものである。以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ＩＧＦ−１値上昇剤の製造方法
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドからなる。このコラーゲンペプチドの製造方法に限定はないが、魚鱗および／または魚皮を前処理し、ついでコラーゲンを抽出し、得られたコラーゲンをタンパク分解酵素で加水分解したものを好ましく使用することができる。加水分解物は、濾過その他によって精製し、イオン交換によってｐＨを５〜７に調整されたものであってもよい。
【００２１】
（ｉ）魚鱗および／または魚皮
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤に使用する魚鱗および／または魚皮としては、海水魚、淡水魚などの魚種を問わない。例えば、淡水魚であるテラピア、鯉、フナや、海水魚である鯛、鮭、鰺などを好適に使用することができる。本発明で使用する魚鱗および／または魚皮コラーゲンペプチドは、上記魚鱗および／または魚皮に含まれるコラーゲンをタンパク分解酵素で加水分解し、重量平均分子量が１０００〜１００００に限定したものである。
【００２２】
(ｉｉ)前処理
魚鱗および／または魚皮は、水洗して付着物を除去した後に使用することが好ましい。水洗後に更に脱灰処理を行ってもよい。魚鱗には、リン酸カルシウム等の無機物が含まれるため、脱灰処理を行うことでコラーゲン抽出が容易になるからである。
【００２３】
脱灰処理は、特に制限されるものではなく、例えば、魚鱗を、塩酸、エチレンジアミン４酢酸、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム等の処理液中で２〜４８時間攪拌する。前記処理液の使用量は、適宜設定すればよく、特に制限はない。脱灰処理は、必要に応じて複数回行なってもよいし、必要に応じて脱灰後に水洗を行なうようにしてもよい。なお、魚鱗および／または魚皮は粉砕したものを用いてもよい。
【００２４】
（ｉｉｉ）コラーゲン抽出
本発明では、前処理した魚鱗および／または魚皮からコラーゲンを抽出する。コラーゲン抽出方法としては、例えば、水を加えて加熱抽出又は加圧加熱抽出する方法が好ましく用いられる。この方法によれば、水難溶性であるエラスチン等の不溶性タンパク質が溶出せず、効率よくコラーゲンを抽出できる。コラーゲン抽出は、魚鱗および／または魚皮１００質量部に対して、１００〜５００質量部の水を加え、６０〜１００℃で０．５〜１０時間加熱抽出すればよい。なお、加圧加熱抽出する場合は１１０〜１２０℃で０．５〜３時間抽出すればよい。
【００２５】
（ｉｖ）加水分解
次いで、上記抽出工程で得たコラーゲンをタンパク加水分解酵素で処理して加水分解する。
【００２６】
使用するタンパク加水分解酵素は特に制限されず、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、植物由来、微生物由来のプロテアーゼを用いることができる。
【００２７】
植物起源のものとしては、パパイアのパパインやキモパパイン、パイナップルのブロメライン、イチジクのフィシン、キウイフルーツのアクチニジンがあり、又、パパイア、生姜、キウイフルーツ、マンゴー、パイナップルに由来するコラゲナーゼ等を使用することもできる。
【００２８】
また、微生物起源のものとしては、リゾムコール ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）やリゾムコール プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｕｓ）由来のレンネット、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）をはじめとする枯草菌由来のサチライシン、ズブチリシン、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）やリゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来する酸性プロテアーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するプロテアーゼ、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する中性またはアルカリ性プロテアーゼ、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するアルカリ性プロテアーゼ、ストレプトマイセス グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のアクチナーゼ、ストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）やクロストリジウム ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）に由来するコラゲナーゼ等がある。また、本発明においては、エンド型プロテアーゼ活性を有する前記酵素が望ましく、更にはエンド型プロテアーゼ活性を有する酵素及びエキソ型プロテアーゼ活性を有する酵素（アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ）の混合物を用いてもよい。
【００２９】
魚鱗および／または魚皮中のコラーゲンからコラーゲンペプチドを製造する条件は、使用されるタンパク分解酵素に最適な温度、ｐＨ、時間等を適宜選択することができる。一般的な温度は３０℃〜８０℃の範囲である。時間は１〜３６時間、好ましくは１〜２０時間である。
【００３０】
魚鱗および／または魚皮にタンパク分解酵素を作用させる前に、魚鱗および／または魚皮を、３０℃以上１００℃未満、好ましくは５０℃以上１００℃未満、特に好ましくは８０℃以上１００℃未満の温度の水中に、１０時間以下、好ましくは２時間以下、浸漬、保持することが好ましい。３０℃以上１００℃未満の温度の水中に浸漬、保持して前処理することでコラーゲンがゼラチン化し、その一部が水に溶出するのでタンパク質分解酵素による加水分解がスムーズに行われる。
【００３１】
なお、本発明では、魚鱗および／または魚皮からコラーゲンを抽出することなく、直接、コラーゲンペプチドを抽出してもよい。例えば、魚鱗および／または魚皮に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の細菌アルカリ性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、サーモライシン、トリプシン、プロナーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、スタフィロコッカスプロテアーゼ、ペプシン、プロクターゼＡ、プロクターゼＢなどの中性ないしアルカリ性タンパク質分解酵素を作用させるとコラーゲンペプチドを得る事ができる。
【００３２】
本発明で使用する魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドは、重量平均分子量が１０００〜１００００の範囲内にあることが好ましく、より好ましくは２０００〜１００００、特に好ましくは３０００〜７０００である。このような重量平均分子量のコラーゲンペプチドは、例えば加水分解工程で、酵素量を調整したり、または処理時間を調整することで、行うことができる。
【００３３】
（ｖ）精製
本発明では、上記によって得た魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドを含有する溶液について、酵素加水分解後、酵素を失活させ、ろ過、塩析や酸析によって水に難溶、不溶の成分を除去することが好ましい。更に、イオン交換樹脂処理、半透膜による透析処理、電気透析処理などで脱塩精製した後、ｐＨや濃度を調整してもよい。
【００３４】
例えば、得られたコラーゲンペプチド溶液をエバポレーターや逆浸透膜などで処理して濃縮液を回収する。逆浸透膜を用いて、濃縮・精製すれば、魚鱗および／または魚皮特有の味や臭い成分、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、核酸、有機酸、ミネラル、揮発性含硫化合物、脂肪酸、窒素化合物、カルボニル化合物等を除去することができる。回収した濃縮液は、そのまま、あるいは適宜乾燥して粉末化して用いることができる。
【００３５】
ここで用いられる逆浸透膜としては、例えば、商品名「ＮＴＲ−７４１０」、商品名「ＮＴＲ−７４３０」、商品名「ＮＴＲ−７４５０」（いずれも日東電工製）等が挙げられる。
【００３６】
逆浸透膜の食塩阻止率が上記範囲外であると、呈味成分や臭い成分、ヒ素などの不純物の除去が不十分になったり、コラーゲンペプチドの損失が大きくなるため好ましくない。なお、逆浸透膜処理の条件は適宜設定できるが、通常、処理液を固形分濃度１５質量％以下になるように調整し、ｐＨ４〜７、液温６０℃以下で循環しながら、固形分濃度２５質量％以上になるまで濃縮を行うことが好ましい。また、この際、適宜加水しながら原液量の１〜１０倍量、好ましくは３〜５倍量の水を加えて液を透過させることが好ましい。加水操作を繰り返すことにより、不純物を効率よく除去することができる。
（２）ＩＧＦ−１値上昇剤
上記で得たコラーゲンペプチドは水溶液状であるが、フリーズドライやスプレードライなどによって乾燥し、粉末に調製してもよい。また、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、上記コラーゲンペプチドの水溶液や粉末をそのまま摂取してもよいが、乳糖やコーンスターチなどの賦形剤を添加し、更に、他のアミノ酸やビタミン、油脂類、塩類などを添加して、錠剤や丸剤、水剤その他の製剤に調製してもよい。
【００３７】
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、経口投与によって血中ＩＧＦ−１濃度を上昇させうる点に特徴がある。その作用機序の詳細は、不明であるが、後記する実施例に示すように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ量の増加と共にＩＧＦ−１の血中濃度を制御するＩＧＦＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量が増大し、プロトン共役型オリゴペプチド・トランスポーターの一つであるＣｉ１のｍＲＮＡの発現量も増大している。特定配列を有するコラーゲンペプチドの経口摂取によって、消化産物であるトリペプチドやオリゴペプチドの消化管吸収物が肝臓に運ばれ、これらペプチドがＩＧＦ−１ ｍＲＮＡおよびＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１のｍＲＮＡの発現量を増大させ、およびリボソームプロテインの増加によるタンパク合成機能の増大によって、最終的にＩＧＦ−１の血中濃度を向上させたと推察される。
【００３８】
なお、本発明で使用する魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドは、タンパク分解酵素で加水分解したものに限定される。タンパク分解酵素の特異性によってコラーゲンペプチド中に特定のアミノ酸配列が保存され、このようなペプチドが肝臓に運ばれた結果、上記したように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡおよびＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡの発現量を増大させると考えられる。
【００３９】
本発明で使用するコラーゲンペプチドは、重量平均分子量が１０００〜１００００の範囲内にあることが好ましい。溶解性に優れるからである。
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、一日あたり３〜３０ｇ、より好ましくは５〜１０ｇの摂取でよく、食品に添加して健康食品などとして使用することもできる。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
（製造例１）
新鮮なテラピア鱗５ｋｇを水洗浄し、一旦水をきった後、水２４Ｌと３５％濃度塩酸１．６Ｌを加えた。２時間攪拌したのち、一旦リン酸カルシウムが溶け込んだ塩酸を取り除き、洗浄水のｐＨが６以上になるまで洗浄を行った。水をきったあと、熱水を１２Ｌ加え、５時間、７３℃で抽出した。
【００４１】
抽出したコラーゲン溶液の固形分１００質量部に対して、タンパク分解酵素であるアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のプロテアーゼを０．１質量部添加し、ｐＨを６．０とし、温度５０℃で２時間処理した。温度８５℃で３０分加熱することで酵素を失活させた後、珪藻土による助剤ろ過、イオン交換処理を施した。この溶液を濃度３０質量％に濃縮し、噴霧乾燥にて乾燥した。得られたコラーゲンの重量平均分子量を下記方法で測定したところ、５４００であった。
（測定方法）
重量平均分子量は、高速液体クロマトグラフを用いてゲル濾過法で測定した。
【００４２】
測定条件は、カラム：昭和電工社製、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ８０２．５ＨＱとＳＢ８０３ＨＱ各１本を直列に装着し、カラム温度４０℃で、溶離液（０．１ｍｏｌ／リン酸二水素カリウム溶液と０．１ｍｏｌ／リン酸水素二カリウム溶液をｐＨ６．９０になるように混合して０．４５μｍのフィルターでろ過したもの）を、０．８ｍｌ／分の流速で流し、試料を２０μｌ注入し、示差屈折率検出器で測定した。ピーク分子量が既知のゲル濾過用分子量測定スタンダード（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）のポリエチレングリコールの溶液１０種（ピーク分子量１０６、１９４、４００、６２０、１０８０、１９００、４０２０、６４５０、１１８４０、２２４５０）について、上記ＨＰＬＣ条件で同様に測定して作成した検量線に基づき、試料の重量平均分子量を得た。
(実験１)
（１）６週令のマウス２４頭を、１群１２頭で２群に分け、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン１０％とコーンスターチ４％とを含有した餌（１０Ｃ群）、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン６％と製造例１で調製したコラーゲンペプチド４％とコーンスターチ４％とを含有した餌（６Ｃ＋４ＣＰ群）を給餌した。
【００４３】
（２）各群について、給餌１０週後、全肝を摘出し、第一葉(約５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍ)をＲＮＡ安定化溶液（アンビオン株式会社製、商品名「ＲＮＡlater」）と共に−８０℃で保存した。
【００４４】
（３）前記保存肝臓組織から、核酸抽出試薬（株式会社ニッポンジーン、商品名「ＩＳＯＧＥＮ」）を使用してＲＮＡを抽出した。
（４）ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステム製、商品名「ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット」）を用いて、上記（３）で得たＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った。
【００４５】
リボソームプロテインスモール６のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０２３４２４５６＿ｇ１」）、リボソームプロテインスモール１０のプライマープライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０２３９１９９２＿ｇ１」）、リボソームプロテインスモール１７のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１３１４９２１＿ｇ１」）、リボソームプロテインラージ１３ａのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１６１２９８６＿ｇＨ」）および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０３３０２４９＿ｇｌ」）を使用し、リアルタイムＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ製；７３００リアルタイムＰＣＲシステム）を行った。具体的には、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス１０μｌ、プライマー１μｌおよび水９μｌからなる反応液２０μｌを、各ウェルに投与し、各サンプルに対し２つのウェルを使用してＰＣＲを行った。増幅条件として、５０℃で２分、９５℃で１０分、ついで９５℃で１５秒と６０℃で１分とを４０サイクル行い、Ｃｔ値を求めた。
【００４６】
各ターゲットの増幅によって得たＣｔ値をＧＡＰＤＨ発現レベルを使用して正規化した後にサンプル間で比較した。結果を表１に示す。この結果、リボソームプロテインスモール６のｍＲＮＡおよびリボソームプロテインラージ１３ａのｍＲＮＡの遺伝子発現において、６Ｃ＋４ＣＰ群で、ｔ−検定による有意な上昇が観察された。リボソームプロテインスモール６のｍＲＮＡの結果を図１に示す。
【００４７】
（４）上記（２）で得た肝臓をホモジナイズし、定法に従い、電気泳動、転写、一次抗体・二次抗体反応によるウェスタンブロッティングにより、ＧＡＰＤＨを内在コントロールとして、リボソームプロテインスモール６、リボソームプロテインスモール１４、リボソームプロテインラージ７ａ、リボソームプロテインラージ１０量を測定した。リボソームプロテインスモール６のプロテイン量は、１０Ｃ群より６Ｃ＋４ＣＰ群で高値であった。結果を図２に示す。
(実験２)
（１）６週令のマウス２４頭を、１群１２頭で２群に分け、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン１０％とコーンスターチ４％とを含有した餌（１０Ｃ群）、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン６％と製造例１で調製したコラーゲンペプチド４％とコーンスターチ４％とを含有した餌（６Ｃ＋４ＣＰ群）を給餌した。
【００４８】
（２）各群について、体重および餌摂取量の経時変化を測定した。
（３）また、各群について、給餌１０週後、心臓から採血し、血漿を得た。また、全肝を摘出し、第一葉(約５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍ)をＲＮＡ安定化溶液（アンビオン株式会社製、商品名「ＲＮＡlater」）と共に−８０℃で保存した。加えて、大腿骨を採取し、７０％エタノール中に保存した。大腿骨を２０等分した各位置での骨密度は、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（アロカ社製、商品名「ＣＳ−６００Ｒ」で測定した。
【００４９】
（４）ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステム製、商品名「ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット」）を用いて、各サンプルの全ＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った。
【００５０】
マウスＩＧＦ−１のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１２３３９６０＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−１のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００８３３４４７＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−２のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００４９２６３２＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−３のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５１５１５６＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−４のプライマーアプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１２９６３５１＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−５のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５１６０３７＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−６のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５９９６９６＿ｍｌ」）および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０３３０２４９＿ｇｌ」）を使用し、リアルタイムＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ製；７３００リアルタイムＰＣＲシステム）を行った。ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス１０μｌ、プライマー１μｌおよび水９μｌからなる反応液２０μｌを、各ウェルに投与し、各サンプルに対し２つのウェルを使用してＰＣＲを行った。増幅条件として、５０℃で２分、９５℃で１０分、ついで９５℃で１５秒と６０℃で１分とを４０サイクル行い、Ｃｔ値を求めた。
【００５１】
各ターゲットの増幅によって得たＣｔ値をＧＡＰＤＨ発現レベルを使用して正規化した後にサンプル間で比較した。その結果、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量においてｔ−検定により有意に高値を示した。結果を図３、図４に示す。
【００５２】
（５）体重および餌摂取量の経時変化を図５、図６に示す。
図５に示すように、６Ｃ+４ＣＰ群の体重の平均値は、１０Ｃ群と比較し、ｔ−検定により有意に低値であった。また、図６に示すように、餌の摂取量は各群で相違が少なかった。
【００５３】
（６）上記（３）で採取した大腿骨について、腰部から膝部に向けて２０等分した各部位での骨密度を測定した。結果を図７に示す。
(実験３)
実験２で得た肝臓組織を使用し、プロトン共役型オリゴペプチド・トランスポーターであるＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＰＨＴ１および、ヒトにおけるＰＨＴ２のマウス相同遺伝子であるＣｉ１について、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ：Ｍｍ００４５３５２４＿ｍ１，Ｍｍ００４５１６１０＿ｍ１，Ｍｍ００５０５７０９＿ｍ１，Ｍｍ００４９１６６６＿ｍ１を使用し、リアルタイムＰＣＲを行った。結果を表２に示す。
【００５４】
その結果、Ｃｉ１ ｍＲＮＡにおいて、６Ｃ＋４ＣＰ群は１０Ｃ群よりも有意に高値を示した。結果を図８に示す。
(実験４)
実験２で得た血漿を使用し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＩＧＦ−１濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
(結果)
（１）表３に示すように、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を１０週間に亘って経口投与した６Ｃ＋４ＣＰ群は、ＩＧＦ−１値上昇剤を投与しない１０Ｃ群と比較して血中のＩＧＦ−１濃度が上昇した。なお、ＧＯＴ値やＧＰＴ値は正常値であるから、ＩＧＦ−１値上昇剤の安全は極めて高い。
【００５８】
（２）肝臓には、およそ８０種類のリボソームプロテインが存在する。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を１０週間に亘って経口投与すると、約８割のリボソームプロテインのｍＲＮＡの発現量が増大した（非表示）。より詳細な発現量の増加を調べたところ、図１に示すように、６Ｃ＋４ＣＰ群では１０Ｃ群と比較して、有意にリボソームタンパクスモール６のｍＲＮＡの発現量が増加していた。また、図２に示すようにリボソームタンパクスモール６量も、６Ｃ＋４ＣＰ群で高値であった。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、肝臓でのリボソームタンパク量を増大させてタンパク合成を活発化させることが判明した。
【００５９】
（３）本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、図５に示すように、６Ｃ＋４ＣＰ群で体重の低下が観察されたが、図６に示すように、餌の摂取量に相違は少なかった。このようにして経口摂取されたＩＧＦ−１値上昇剤は、消化管から消化吸収されると考えられる。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤の摂取により、図８に示すように肝臓におけるＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量が有意差をもって増大している。この事から、ＩＧＦ−１の血中濃度の上昇には、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤によって肝臓でのペプチドトランスポーター量が増大し、これによって肝臓におけるペプチドの作用が円滑に進行した可能性がある。
【００６０】
（４）本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、図３、図４に示すように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡやＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量が増大している。また、実際に表３に示すようにＩＧＦ−１の血中濃度も上昇している。このことから、ＩＧＦ−１値上昇剤の経口摂取により、Ｃｉ１ ｍＲＮＡの発現量が増加し、これによって肝臓における本発明のＩＧＦ−１値上昇剤由来のペプチドの作用が肝臓において円滑に進行し、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡやＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−２のタンパク合成を増大させたと考えられる。特に、ＩＧＦＢＰ−２はＩＧＦ−１と結合して血液循環から末梢に移送させる作用を有するため、生産されたＩＧＦ−１は、血中へ移行した後、速やかに末梢に移行してその組織に特異的なＩＧＦ−１の作用を発揮すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、本来廃棄される魚鱗および／または魚皮から得たコラーゲンペプチドをタンパク分解酵素で処理および抽出したコラーゲンペプチドをＩＧＦ−１値上昇剤として使用することができる。このＩＧＦ−１値上昇剤は、安全性が高く、かつ経口摂取により血中ＩＧＦ−１濃度を上昇させることができ、有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚鱗および／または魚皮コラーゲンを加水分解してなるペプチドを主要成分とするＩＧＦ−１値上昇剤に関し、より詳細には、上記ペプチドを経口摂取することで肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡなどのＩＧＦ−１に関する遺伝子発現量を増加させ、最終的にＩＧＦ−１の血中濃度を上昇させることができるＩＧＦ−１値上昇剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であり、動物組織に普遍的に存在する。コラーゲンや、これを酵素、酸、アルカリなどで加水分解したコラーゲンペプチドは、単独で、または他の成分と併用して医薬組成物または食品組成物、栄養補助食品などとして広く使用されている。
【０００３】
例えば、魚から加熱抽出又は加圧加熱抽出によって得たコラーゲンをタンパク加水分解酵素で平均分子量が１０００〜１００００になるまで酵素分解し、この酵素分解物を濃縮および精製し、固形分中の遊離アミノ酸含量が１．０質量％以下、ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である魚類由来のコラーゲンペプチドを含有する飲食品がある(特許文献１)。コラーゲンの様々な生理効果を期待し、かつ魚特有の味や臭いがなく、ヒ素含量の少ない魚類由来のコラーゲンペプチドの製造方法およびこのようなコラーゲンペプチドを含有する飲食品を提供するものである。コラーゲンペプチドの平均分子量を上記範囲に限定したのは、低粘度で飲食品に使用できからである。
【０００４】
また、生体コラーゲン合成促進剤と異常タンパク質除去剤とを含有する抗老化用組成物であって、コラーゲン及び／またはゼラチンの分解物であって分子量が２００〜３００のものを含有する分解物を生体コラーゲン合成促進剤として含む抗老化用組成物もある（特許文献２）。コラーゲンペプチドによって皮膚のターンオーバーを促進させ皮膚の老化防止効果に優れるという。使用するコラーゲンは、牛や豚や魚などの動物の皮膚、骨及び腱などの結合組織から抽出したものでよく、タンパク分解酵素を使用し、平均分子量が２００〜３００付近のものを使用する。平均分子量が上記範囲であればトリペプチドを高含有するものであり、コラーゲン合成促進活性を飛躍的に向上させることができるからである。
【０００５】
また、コラーゲンやゼラチンのコラゲナーゼによる分解物であって、そのアミノ酸配列が、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（式中、Ｇｌｙは、グリシン残基を表し、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、互いにＸ，Ｙは同一であっても、異なってもよい）で表されるコラーゲントリペプチドからなるコラーゲンペプチド（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（ｎは、正の整数を表す）を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤もある（特許文献３）。特定のコラーゲンペプチドがヒアルロン酸産生促進剤として有効である事を見出したものである。コラーゲンペプチドの平均分子量は、２８０〜３０００であることが好ましく、より好ましくはコラーゲンペプチド（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎにおけるｎ＝１の含有量が、コラーゲンペプチド中に２５〜１００％のものである。このようなコラーゲンペプチドは、コラーゲンやゼラチンにコラゲナーゼを作用させて製造することができる。
【０００６】
更に、食品組成物であって、１）平均分子量１００００以下のコラーゲンを食品組成物全量に対して１０〜６０質量％と、２）グアーガムを食品組成物全量に対して０．００１〜０．１質量％と、３）メチルセルロースを食品組成物全量に対して０．０１〜１質量％、含有し、且つグアーガムの含有量がセルロースの含有量に対して５〜２０質量％であることを特徴とする、美肌用食品組成物もある（特許文献４）。この美肌用食品組成物は、水無しで摂取可能な顆粒形態であることを特徴とするものである。使用するコラーゲンは、魚類を基源として加水分解したものであり、平均分子量は１００００以下である。これを超えると口溶け性が阻害されて嚥下しにくくなるためである。
【０００７】
加えて、ゼラチンおよび／またはコラーゲンの分解物であって、分子量が１０００以下でありグルタミン酸単位が全アミノ酸単位の平均６モル％以上であるペプチドを有効成分として含む、カルシウム吸収促進剤もある（特許文献５）。吸収効率が高く、においの少ないカルシウム吸収促進剤を提供するものであり、コラーゲンの分解物は水溶性であるため吸収に優れ、かつグルタミン酸単位の含有量および分子量を特定することでカルシウム吸収剤の有効成分として使用できるという。ペプチドは、コラーゲンをブロメライン、フレーバーザイムＭなどの酵素で分解して製造することができる。分子量は１０００以下であることが好ましく、１０００を超えるとカルシウム吸収効率が低下するからである。また、ペプチドを構成する全アミノ酸単位中の酸性アミノ酸単位の割合は、平均６モル％以上である。６モル％未満であると、カルシウム吸収効率が低下するからである。
【０００８】
一方、ペプチドホルモンの一つに、下垂体から分泌される成長ホルモン(ＧＨ)によって肝臓から分泌されるインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）がある。ＩＧＦ−１は、インスリン様作用に加え細胞成長と発達に関与し、皮質の骨量、腎サイズ、前立腺サイズ、末梢血管抵抗性、ナトリウム貯留、癌進行、脳機能などの重要な内分泌効果を発揮する。このため、例えば、ＩＧＦ−１が毛根の活発化を介した育毛効果を発揮する事に鑑み、植物から抽出したスウェルチアマリンをＩＧＦ−１産生促進剤として毛髪毛乳頭細胞に直接投与する技術がある（特許文献６）。
【０００９】
一方、鮭の卵巣膜をタンパク分解酵素で処理して得られた成分からなるＩＧＦ−１上昇剤もある(特許文献７)。加齢によってＩＧＦ−１値が低下した場合でも、再びＩＧＦ−１値を上昇させることができる、という。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４２３６８５０号
【特許文献２】特許第４２８６５１３号
【特許文献３】特許第４３３６４８６号
【特許文献４】特許第４３６０９８６号
【特許文献５】特許第３８８１４５３号
【特許文献６】特開２００９−２６３２６２号公報
【特許文献７】特許第３９４６２３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
コラーゲンは、分子量によって粘度や溶解性などの物理的性質が異なり、加水分解の方法や分子量によって異なる薬効を発揮する。上記特許文献１のコラーゲンペプチドは様々の生理効果を、特許文献２のコラーゲンペプチドは皮膚の老化防止効果を、特許文献３のコラーゲンペプチドはヒアルロン酸産生促進効果を、特許文献４のコラーゲンペプチドは美肌効果および口溶け性を、特許文献５のコラーゲンペプチドはカルシウム吸収促進効果を発揮する。しかしながら、上記特許文献１〜５に示すコラーゲンペプチドは、主として皮膚や骨に対する局所的な作用を対象とするものである。
【００１２】
一方、ＩＧＦ−１は、ペプチドホルモンの一つであって、特許文献６に示すように、特定物質を毛髪毛乳頭細胞などの特定細胞に投与すると、ＩＧＦ−１の遺伝子発現が促進され、これにより毛根の活発化を介して育毛効果などの細胞成長効果が期待できる。また、特許文献７に示すように、鮭の卵巣膜をタンパク分解酵素で処理および抽出して得られる成分が、成年期を過ぎてＩＧＦ−１値が低下した場合でもＩＧＦ−１値を上昇させ、疲れやすさ、食欲、寝つき、眠りなどが改善されることも知られている。
【００１３】
一方、コラーゲンやコラーゲンペプチドは、動物組織に普遍的に存在するタンパク質であり、経口摂取による安全性が高い。コラーゲンやコラーゲンペプチドの経口摂取によってＩＧＦ−１の血中濃度が上昇すれば、極めて安全性の高いＩＧＦ−１値上昇剤となる。
【００１４】
上記状況に鑑み、コラーゲンの経口摂取によるＩＧＦ−１との係り、特に肝臓への関与を検討し、コラーゲンペプチドの新たな用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、本来廃棄される魚鱗および／または魚皮に由来するコラーゲンペプチドの経口摂取による肝臓への効果を検証したところ、後記する実施例に示すように、リボソームプロテインＳ６が増大し、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡ量が有意に増加し、および血中ＩＧＦ−１濃度も増加することが判明し、上記コラーゲンペプチドがＩＧＦ−１上昇剤として使用しうることを見出し、本発明を完成させた。魚鱗は廃棄部分であり、特定処理して得られた魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドが、経口摂取によって肝臓での遺伝子発現量を増強し、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の血中濃度を増加させることは、全く知られていなかった。
すなわち、本発明は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、前記タンパク分解酵素が、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであることを特徴とする、上記ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、前記コラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００である、上記ＩＧＦ−１値上昇剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
ＩＧＦ−１は、一般には、成長ホルモンによって肝臓から分泌され、インスリン様作用に加えて細胞成長と発達に関与するホルモンである。本発明によれば、特定処理した魚鱗および／または魚皮コラーゲンペプチドを経口で摂取するだけで、肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量を増大させ、かつＩＧＦ−１の血中濃度を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実験１の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのリボソームプロテインスモール６の遺伝子発現量の差を示す図である。**：ｐ＜０．０１
【図２】実験１の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのリボソームプロテインスモール６量の差を示す図である。
【図３】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓でのＩＧＦ−１ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【図４】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓での１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群とにおけるＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。**：ｐ＜０．０１
【図５】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける体重の経時変化を示す図である。*：ｐ＜０．０５、 **：ｐ＜０．０１
【図６】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群との餌摂取量の経時変化を示す図である。
【図７】実験２の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群との大腿骨の各部位における骨密度を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【図８】実験３の結果を示すものであり、カゼインを１０％含有する餌を経口摂食した群（１０Ｃ群）とカゼイン６％とコラーゲンペプチド４％含有する餌を経口摂食した群（６Ｃ＋４ＣＰ群）とにおける肝臓での１０Ｃ群と６Ｃ＋４ＣＰ群とにおけるＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量の差を示す図である。*：ｐ＜０．０５
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤である。好ましくは、上記タンパク分解酵素がアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであり、得られたコラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００のものである。以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ＩＧＦ−１値上昇剤の製造方法
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドからなる。このコラーゲンペプチドの製造方法に限定はないが、魚鱗および／または魚皮を前処理し、ついでコラーゲンを抽出し、得られたコラーゲンをタンパク分解酵素で加水分解したものを好ましく使用することができる。加水分解物は、濾過その他によって精製し、イオン交換によってｐＨを５〜７に調整されたものであってもよい。
【００２１】
（ｉ）魚鱗および／または魚皮
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤に使用する魚鱗および／または魚皮としては、海水魚、淡水魚などの魚種を問わない。例えば、淡水魚であるテラピア、鯉、フナや、海水魚である鯛、鮭、鰺などを好適に使用することができる。本発明で使用する魚鱗および／または魚皮コラーゲンペプチドは、上記魚鱗および／または魚皮に含まれるコラーゲンをタンパク分解酵素で加水分解し、重量平均分子量が１０００〜１００００に限定したものである。
【００２２】
(ｉｉ)前処理
魚鱗および／または魚皮は、水洗して付着物を除去した後に使用することが好ましい。水洗後に更に脱灰処理を行ってもよい。魚鱗には、リン酸カルシウム等の無機物が含まれるため、脱灰処理を行うことでコラーゲン抽出が容易になるからである。
【００２３】
脱灰処理は、特に制限されるものではなく、例えば、魚鱗を、塩酸、エチレンジアミン４酢酸、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム等の処理液中で２〜４８時間攪拌する。前記処理液の使用量は、適宜設定すればよく、特に制限はない。脱灰処理は、必要に応じて複数回行なってもよいし、必要に応じて脱灰後に水洗を行なうようにしてもよい。なお、魚鱗および／または魚皮は粉砕したものを用いてもよい。
【００２４】
（ｉｉｉ）コラーゲン抽出
本発明では、前処理した魚鱗および／または魚皮からコラーゲンを抽出する。コラーゲン抽出方法としては、例えば、水を加えて加熱抽出又は加圧加熱抽出する方法が好ましく用いられる。この方法によれば、水難溶性であるエラスチン等の不溶性タンパク質が溶出せず、効率よくコラーゲンを抽出できる。コラーゲン抽出は、魚鱗および／または魚皮１００質量部に対して、１００〜５００質量部の水を加え、６０〜１００℃で０．５〜１０時間加熱抽出すればよい。なお、加圧加熱抽出する場合は１１０〜１２０℃で０．５〜３時間抽出すればよい。
【００２５】
（ｉｖ）加水分解
次いで、上記抽出工程で得たコラーゲンをタンパク加水分解酵素で処理して加水分解する。
【００２６】
使用するタンパク加水分解酵素は特に制限されず、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、植物由来、微生物由来のプロテアーゼを用いることができる。
【００２７】
植物起源のものとしては、パパイアのパパインやキモパパイン、パイナップルのブロメライン、イチジクのフィシン、キウイフルーツのアクチニジンがあり、又、パパイア、生姜、キウイフルーツ、マンゴー、パイナップルに由来するコラゲナーゼ等を使用することもできる。
【００２８】
また、微生物起源のものとしては、リゾムコール ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）やリゾムコール プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｕｓ）由来のレンネット、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）をはじめとする枯草菌由来のサチライシン、ズブチリシン、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）やリゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来する酸性プロテアーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するプロテアーゼ、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する中性またはアルカリ性プロテアーゼ、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するアルカリ性プロテアーゼ、ストレプトマイセス グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のアクチナーゼ、ストレプトマイセス パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）やクロストリジウム ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）に由来するコラゲナーゼ等がある。また、本発明においては、エンド型プロテアーゼ活性を有する前記酵素が望ましく、更にはエンド型プロテアーゼ活性を有する酵素及びエキソ型プロテアーゼ活性を有する酵素（アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ）の混合物を用いてもよい。
【００２９】
魚鱗および／または魚皮中のコラーゲンからコラーゲンペプチドを製造する条件は、使用されるタンパク分解酵素に最適な温度、ｐＨ、時間等を適宜選択することができる。一般的な温度は３０℃〜８０℃の範囲である。時間は１〜３６時間、好ましくは１〜２０時間である。
【００３０】
魚鱗および／または魚皮にタンパク分解酵素を作用させる前に、魚鱗および／または魚皮を、３０℃以上１００℃未満、好ましくは５０℃以上１００℃未満、特に好ましくは８０℃以上１００℃未満の温度の水中に、１０時間以下、好ましくは２時間以下、浸漬、保持することが好ましい。３０℃以上１００℃未満の温度の水中に浸漬、保持して前処理することでコラーゲンがゼラチン化し、その一部が水に溶出するのでタンパク質分解酵素による加水分解がスムーズに行われる。
【００３１】
なお、本発明では、魚鱗および／または魚皮からコラーゲンを抽出することなく、直接、コラーゲンペプチドを抽出してもよい。例えば、魚鱗および／または魚皮に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の細菌アルカリ性プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、サーモライシン、トリプシン、プロナーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、スタフィロコッカスプロテアーゼ、ペプシン、プロクターゼＡ、プロクターゼＢなどの中性ないしアルカリ性タンパク質分解酵素を作用させるとコラーゲンペプチドを得る事ができる。
【００３２】
本発明で使用する魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドは、重量平均分子量が１０００〜１００００の範囲内にあることが好ましく、より好ましくは２０００〜１００００、特に好ましくは３０００〜７０００である。このような重量平均分子量のコラーゲンペプチドは、例えば加水分解工程で、酵素量を調整したり、または処理時間を調整することで、行うことができる。
【００３３】
（ｖ）精製
本発明では、上記によって得た魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドを含有する溶液について、酵素加水分解後、酵素を失活させ、ろ過、塩析や酸析によって水に難溶、不溶の成分を除去することが好ましい。更に、イオン交換樹脂処理、半透膜による透析処理、電気透析処理などで脱塩精製した後、ｐＨや濃度を調整してもよい。
【００３４】
例えば、得られたコラーゲンペプチド溶液をエバポレーターや逆浸透膜などで処理して濃縮液を回収する。逆浸透膜を用いて、濃縮・精製すれば、魚鱗および／または魚皮特有の味や臭い成分、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、核酸、有機酸、ミネラル、揮発性含硫化合物、脂肪酸、窒素化合物、カルボニル化合物等を除去することができる。回収した濃縮液は、そのまま、あるいは適宜乾燥して粉末化して用いることができる。
【００３５】
ここで用いられる逆浸透膜としては、例えば、商品名「ＮＴＲ−７４１０」、商品名「ＮＴＲ−７４３０」、商品名「ＮＴＲ−７４５０」（いずれも日東電工製）等が挙げられる。
【００３６】
逆浸透膜の食塩阻止率が上記範囲外であると、呈味成分や臭い成分、ヒ素などの不純物の除去が不十分になったり、コラーゲンペプチドの損失が大きくなるため好ましくない。なお、逆浸透膜処理の条件は適宜設定できるが、通常、処理液を固形分濃度１５質量％以下になるように調整し、ｐＨ４〜７、液温６０℃以下で循環しながら、固形分濃度２５質量％以上になるまで濃縮を行うことが好ましい。また、この際、適宜加水しながら原液量の１〜１０倍量、好ましくは３〜５倍量の水を加えて液を透過させることが好ましい。加水操作を繰り返すことにより、不純物を効率よく除去することができる。
（２）ＩＧＦ−１値上昇剤
上記で得たコラーゲンペプチドは水溶液状であるが、フリーズドライやスプレードライなどによって乾燥し、粉末に調製してもよい。また、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、上記コラーゲンペプチドの水溶液や粉末をそのまま摂取してもよいが、乳糖やコーンスターチなどの賦形剤を添加し、更に、他のアミノ酸やビタミン、油脂類、塩類などを添加して、錠剤や丸剤、水剤その他の製剤に調製してもよい。
【００３７】
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、経口投与によって血中ＩＧＦ−１濃度を上昇させうる点に特徴がある。その作用機序の詳細は、不明であるが、後記する実施例に示すように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ量の増加と共にＩＧＦ−１の血中濃度を制御するＩＧＦＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量が増大し、プロトン共役型オリゴペプチド・トランスポーターの一つであるＣｉ１のｍＲＮＡの発現量も増大している。特定配列を有するコラーゲンペプチドの経口摂取によって、消化産物であるトリペプチドやオリゴペプチドの消化管吸収物が肝臓に運ばれ、これらペプチドがＩＧＦ−１ ｍＲＮＡおよびＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１のｍＲＮＡの発現量を増大させ、およびリボソームプロテインの増加によるタンパク合成機能の増大によって、最終的にＩＧＦ−１の血中濃度を向上させたと推察される。
【００３８】
なお、本発明で使用する魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンペプチドは、タンパク分解酵素で加水分解したものに限定される。タンパク分解酵素の特異性によってコラーゲンペプチド中に特定のアミノ酸配列が保存され、このようなペプチドが肝臓に運ばれた結果、上記したように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡおよびＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡ、Ｃｉ１ ｍＲＮＡの発現量を増大させると考えられる。
【００３９】
本発明で使用するコラーゲンペプチドは、重量平均分子量が１０００〜１００００の範囲内にあることが好ましい。溶解性に優れるからである。
本発明のＩＧＦ−１値上昇剤は、一日あたり３〜３０ｇ、より好ましくは５〜１０ｇの摂取でよく、食品に添加して健康食品などとして使用することもできる。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
（製造例１）
新鮮なテラピア鱗５ｋｇを水洗浄し、一旦水をきった後、水２４Ｌと３５％濃度塩酸１．６Ｌを加えた。２時間攪拌したのち、一旦リン酸カルシウムが溶け込んだ塩酸を取り除き、洗浄水のｐＨが６以上になるまで洗浄を行った。水をきったあと、熱水を１２Ｌ加え、５時間、７３℃で抽出した。
【００４１】
抽出したコラーゲン溶液の固形分１００質量部に対して、タンパク分解酵素であるアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のプロテアーゼを０．１質量部添加し、ｐＨを６．０とし、温度５０℃で２時間処理した。温度８５℃で３０分加熱することで酵素を失活させた後、珪藻土による助剤ろ過、イオン交換処理を施した。この溶液を濃度３０質量％に濃縮し、噴霧乾燥にて乾燥した。得られたコラーゲンの重量平均分子量を下記方法で測定したところ、５４００であった。
（測定方法）
重量平均分子量は、高速液体クロマトグラフを用いてゲル濾過法で測定した。
【００４２】
測定条件は、カラム：昭和電工社製、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ８０２．５ＨＱとＳＢ８０３ＨＱ各１本を直列に装着し、カラム温度４０℃で、溶離液（０．１ｍｏｌ／リン酸二水素カリウム溶液と０．１ｍｏｌ／リン酸水素二カリウム溶液をｐＨ６．９０になるように混合して０．４５μｍのフィルターでろ過したもの）を、０．８ｍｌ／分の流速で流し、試料を２０μｌ注入し、示差屈折率検出器で測定した。ピーク分子量が既知のゲル濾過用分子量測定スタンダード（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）のポリエチレングリコールの溶液１０種（ピーク分子量１０６、１９４、４００、６２０、１０８０、１９００、４０２０、６４５０、１１８４０、２２４５０）について、上記ＨＰＬＣ条件で同様に測定して作成した検量線に基づき、試料の重量平均分子量を得た。
(実験１)
（１）６週令のマウス２４頭を、１群１２頭で２群に分け、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン１０％とコーンスターチ４％とを含有した餌（１０Ｃ群）、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン６％と製造例１で調製したコラーゲンペプチド４％とコーンスターチ４％とを含有した餌（６Ｃ＋４ＣＰ群）を給餌した。
【００４３】
（２）各群について、給餌１０週後、全肝を摘出し、第一葉(約５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍ)をＲＮＡ安定化溶液（アンビオン株式会社製、商品名「ＲＮＡlater」）と共に−８０℃で保存した。
【００４４】
（３）前記保存肝臓組織から、核酸抽出試薬（株式会社ニッポンジーン、商品名「ＩＳＯＧＥＮ」）を使用してＲＮＡを抽出した。
（４）ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステム製、商品名「ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット」）を用いて、上記（３）で得たＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った。
【００４５】
リボソームプロテインスモール６のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０２３４２４５６＿ｇ１」）、リボソームプロテインスモール１０のプライマープライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０２３９１９９２＿ｇ１」）、リボソームプロテインスモール１７のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１３１４９２１＿ｇ１」）、リボソームプロテインラージ１３ａのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１６１２９８６＿ｇＨ」）および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０３３０２４９＿ｇｌ」）を使用し、リアルタイムＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ製；７３００リアルタイムＰＣＲシステム）を行った。具体的には、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス１０μｌ、プライマー１μｌおよび水９μｌからなる反応液２０μｌを、各ウェルに投与し、各サンプルに対し２つのウェルを使用してＰＣＲを行った。増幅条件として、５０℃で２分、９５℃で１０分、ついで９５℃で１５秒と６０℃で１分とを４０サイクル行い、Ｃｔ値を求めた。
【００４６】
各ターゲットの増幅によって得たＣｔ値をＧＡＰＤＨ発現レベルを使用して正規化した後にサンプル間で比較した。結果を表１に示す。この結果、リボソームプロテインスモール６のｍＲＮＡおよびリボソームプロテインラージ１３ａのｍＲＮＡの遺伝子発現において、６Ｃ＋４ＣＰ群で、ｔ−検定による有意な上昇が観察された。リボソームプロテインスモール６のｍＲＮＡの結果を図１に示す。
【００４７】
（４）上記（２）で得た肝臓をホモジナイズし、定法に従い、電気泳動、転写、一次抗体・二次抗体反応によるウェスタンブロッティングにより、ＧＡＰＤＨを内在コントロールとして、リボソームプロテインスモール６、リボソームプロテインスモール１４、リボソームプロテインラージ７ａ、リボソームプロテインラージ１０量を測定した。リボソームプロテインスモール６のプロテイン量は、１０Ｃ群より６Ｃ＋４ＣＰ群で高値であった。結果を図２に示す。
(実験２)
（１）６週令のマウス２４頭を、１群１２頭で２群に分け、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン１０％とコーンスターチ４％とを含有した餌（１０Ｃ群）、オリエンタル酵母工業株式会社製、商品名「ＡＩＮ−９３Ｍ」にカゼイン６％と製造例１で調製したコラーゲンペプチド４％とコーンスターチ４％とを含有した餌（６Ｃ＋４ＣＰ群）を給餌した。
【００４８】
（２）各群について、体重および餌摂取量の経時変化を測定した。
（３）また、各群について、給餌１０週後、心臓から採血し、血漿を得た。また、全肝を摘出し、第一葉(約５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍ)をＲＮＡ安定化溶液（アンビオン株式会社製、商品名「ＲＮＡlater」）と共に−８０℃で保存した。加えて、大腿骨を採取し、７０％エタノール中に保存した。大腿骨を２０等分した各位置での骨密度は、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（アロカ社製、商品名「ＣＳ−６００Ｒ」で測定した。
【００４９】
（４）ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステム製、商品名「ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット」）を用いて、各サンプルの全ＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った。
【００５０】
マウスＩＧＦ−１のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１２３３９６０＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−１のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００８３３４４７＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−２のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００４９２６３２＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−３のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５１５１５６＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−４のプライマーアプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０１２９６３５１＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−５のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ 遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５１６０３７＿ｍｌ」）、ＩＧＦＢＰ−６のプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ００５９９６９６＿ｍｌ」）および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのプライマー（アプライドバイオシステムズ製、「ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ Ｍｍ０３３０２４９＿ｇｌ」）を使用し、リアルタイムＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ製；７３００リアルタイムＰＣＲシステム）を行った。ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス１０μｌ、プライマー１μｌおよび水９μｌからなる反応液２０μｌを、各ウェルに投与し、各サンプルに対し２つのウェルを使用してＰＣＲを行った。増幅条件として、５０℃で２分、９５℃で１０分、ついで９５℃で１５秒と６０℃で１分とを４０サイクル行い、Ｃｔ値を求めた。
【００５１】
各ターゲットの増幅によって得たＣｔ値をＧＡＰＤＨ発現レベルを使用して正規化した後にサンプル間で比較した。その結果、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡ、ＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量においてｔ−検定により有意に高値を示した。結果を図３、図４に示す。
【００５２】
（５）体重および餌摂取量の経時変化を図５、図６に示す。
図５に示すように、６Ｃ+４ＣＰ群の体重の平均値は、１０Ｃ群と比較し、ｔ−検定により有意に低値であった。また、図６に示すように、餌の摂取量は各群で相違が少なかった。
【００５３】
（６）上記（３）で採取した大腿骨について、腰部から膝部に向けて２０等分した各部位での骨密度を測定した。結果を図７に示す。
(実験３)
実験２で得た肝臓組織を使用し、プロトン共役型オリゴペプチド・トランスポーターであるＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＰＨＴ１および、ヒトにおけるＰＨＴ２のマウス相同遺伝子であるＣｉ１について、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析；ＩＤ：Ｍｍ００４５３５２４＿ｍ１，Ｍｍ００４５１６１０＿ｍ１，Ｍｍ００５０５７０９＿ｍ１，Ｍｍ００４９１６６６＿ｍ１を使用し、リアルタイムＰＣＲを行った。結果を表２に示す。
【００５４】
その結果、Ｃｉ１ ｍＲＮＡにおいて、６Ｃ＋４ＣＰ群は１０Ｃ群よりも有意に高値を示した。結果を図８に示す。
(実験４)
実験２で得た血漿を使用し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＩＧＦ−１濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
(結果)
（１）表３に示すように、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を１０週間に亘って経口投与した６Ｃ＋４ＣＰ群は、ＩＧＦ−１値上昇剤を投与しない１０Ｃ群と比較して血中のＩＧＦ−１濃度が上昇した。なお、ＧＯＴ値やＧＰＴ値は正常値であるから、ＩＧＦ−１値上昇剤の安全は極めて高い。
【００５８】
（２）肝臓には、およそ８０種類のリボソームプロテインが存在する。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を１０週間に亘って経口投与すると、約８割のリボソームプロテインのｍＲＮＡの発現量が増大した（非表示）。より詳細な発現量の増加を調べたところ、図１に示すように、６Ｃ＋４ＣＰ群では１０Ｃ群と比較して、有意にリボソームタンパクスモール６のｍＲＮＡの発現量が増加していた。また、図２に示すようにリボソームタンパクスモール６量も、６Ｃ＋４ＣＰ群で高値であった。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、肝臓でのリボソームタンパク量を増大させてタンパク合成を活発化させることが判明した。
【００５９】
（３）本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、図５に示すように、６Ｃ＋４ＣＰ群で体重の低下が観察されたが、図６に示すように、餌の摂取量に相違は少なかった。このようにして経口摂取されたＩＧＦ−１値上昇剤は、消化管から消化吸収されると考えられる。本発明のＩＧＦ−１値上昇剤の摂取により、図８に示すように肝臓におけるＣｉ１ ｍＲＮＡの発現量が有意差をもって増大している。この事から、ＩＧＦ−１の血中濃度の上昇には、本発明のＩＧＦ−１値上昇剤によって肝臓でのペプチドトランスポーター量が増大し、これによって肝臓におけるペプチドの作用が円滑に進行した可能性がある。
【００６０】
（４）本発明のＩＧＦ−１値上昇剤を経口投与すると、図３、図４に示すように、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡやＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量が増大している。また、実際に表３に示すようにＩＧＦ−１の血中濃度も上昇している。このことから、ＩＧＦ−１値上昇剤の経口摂取により、Ｃｉ１ ｍＲＮＡの発現量が増加し、これによって肝臓における本発明のＩＧＦ−１値上昇剤由来のペプチドの作用が肝臓において円滑に進行し、ＩＧＦ−１ ｍＲＮＡやＩＧＦＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現量ならびにＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−２のタンパク合成を増大させたと考えられる。特に、ＩＧＦＢＰ−２はＩＧＦ−１と結合して血液循環から末梢に移送させる作用を有するため、生産されたＩＧＦ−１は、血中へ移行した後、速やかに末梢に移行してその組織に特異的なＩＧＦ−１の作用を発揮すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、本来廃棄される魚鱗および／または魚皮から得たコラーゲンペプチドをタンパク分解酵素で処理および抽出したコラーゲンペプチドをＩＧＦ−１値上昇剤として使用することができる。このＩＧＦ−１値上昇剤は、安全性が高く、かつ経口摂取により血中ＩＧＦ−１濃度を上昇させることができ、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤。
【請求項２】
前記タンパク分解酵素が、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１記載のＩＧＦ−１値上昇剤。
【請求項３】
前記コラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００である、請求項１または２記載のＩＧＦ−１値上昇剤。
【請求項１】
魚鱗および／または魚皮由来コラーゲンをタンパク分解酵素で処理することにより抽出されたコラーゲンペプチドを含むことを特徴とする、ＩＧＦ−１値上昇剤。
【請求項２】
前記タンパク分解酵素が、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから産生されたプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１記載のＩＧＦ−１値上昇剤。
【請求項３】
前記コラーゲンペプチドの重量平均分子量が１０００〜１００００である、請求項１または２記載のＩＧＦ−１値上昇剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１１６７７３（Ｐ２０１２−１１６７７３Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６６０６３（Ｐ２０１０−２６６０６３）
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
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