ＩＬ−１０産生促進作用を有する免疫賦活組成物
【課題】フコイダンおよび乳酸菌を含有し、高いＩＬ−１０産生促進作用を有することを特徴とする免疫賦活組成物を提供する。
【解決手段】テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属等の乳酸菌の菌体重量１重量部に対して、ワカメ由来のフコイダン０．１〜１０重量部を添加、培養することにより、ＩＬ−１２産生促進作用だけでなく、高いＩＬ−１０産生促進作用を有する免疫賦活組成物を得ることができる。当該免疫賦活組成物は、Ｉ型アレルギーの症状改善や炎症性疾患である潰瘍性大腸炎等の症状緩和に高い効果を有することが期待される。
【解決手段】テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属等の乳酸菌の菌体重量１重量部に対して、ワカメ由来のフコイダン０．１〜１０重量部を添加、培養することにより、ＩＬ−１２産生促進作用だけでなく、高いＩＬ−１０産生促進作用を有する免疫賦活組成物を得ることができる。当該免疫賦活組成物は、Ｉ型アレルギーの症状改善や炎症性疾患である潰瘍性大腸炎等の症状緩和に高い効果を有することが期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌にワカメ由来のフコイダンを添加することで乳酸菌の有するＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を増強した免疫賦活組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどによる感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はリンパ球と抗原提示細胞である。リンパ球と抗原提示細胞は、抗原特異的または抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高める。リンパ球や抗原提示細胞の活性化において、インターロイキン１２（以下、「ＩＬ−１２」という。）は、ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」という。）やヘルパーＴ細胞に作用してインターフェロンγ（以下、「ＩＦＮ−γ」という。）や腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という。）の産生を誘導し、抗原提示細胞を活性化すること、ＮＫ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の細胞障害活性を増強すること、インターロイキン２（以下、「ＩＬ−２」という。）と相乗的に作用して、細胞障害性リンパ球を活性化するとともにリンホカイン活性化キラー細胞を誘導すること、細胞性免疫を補助するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ１タイプへの分化や、そのバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の制御にも関与していることが知られている。このようにＩＬ−１２は、自然免疫ならびに細胞性免疫の強化による感染防御、抗腫瘍活性またはアレルギー予防など免疫賦活作用を促進する点において重要な役割を担っている。また、インターロイキン１０（以下、「ＩＬ−１０」という。）は、主にＴｈ２細胞や制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、単球、肥満細胞からも産生される。ＩＬ−１０は、主に単球系細胞に作用して炎症性サイトカインの産生を始めとする免疫機能を抑制性に制御するため、炎症の抑制に重要な役割を果たしている。
【０００３】
一方、乳酸菌は、免疫賦活能を有することが知られており、これを摂取することにより生体の免疫活性を向上する作用が認められる。例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属またはロイコノストック属に属する乳酸菌を摂取することにより、ＩＬ−１２の産生が促進される（例えば、特許文献１参照）。また、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属、ストレプトコッカス属など乳酸菌８種類の合剤の経口摂取により、ＩＬ−１０産生を促進し、潰瘍性大腸炎を緩和することが知られている。（例えば、非特許文献１参照）。このような乳酸菌の作用から、乳酸菌を摂取することは、生体内の免疫状態を良好に保つうえで有効な手段であるといえる。
【０００４】
しかしながら、前記のような効果を発揮するためには、多量の菌体を摂取する必要があり、乳酸菌を含む免疫賦活組成物を提供する際に、煩雑な工程を経なければならず、高いコストを要する欠点がある。この欠点を補うために、カゼイン加水分解物を添加した培地を用いて乳酸菌を培養する方法（例えば、特許文献２参照）や、フコイダン加水分解物を乳酸菌に添加することで、乳酸菌の持つ免疫賦活能を増強させる方法（例えば、特許文献３参照）が提案されている。これらの方法により、ある程度高い免疫賦活能を有する乳酸菌を得ることができ、通年性アレルギー性鼻炎や花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのＩ型アレルギーの症状緩和が期待できる免疫賦活組成物を提供することができる。しかしながら、充分な免疫賦活能を有しているとは言えず、特に、ＩＬ−１０産生が極端に低く、改善がみられないことから、炎症性疾患である潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症などを予防・改善する効果を得ることは難しいのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「医学のあゆみ Vol.228 No.3」2009年 p.227-232
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−０２８０４７号公報
【特許文献２】再表２００６／０７３１４５号公報
【特許文献３】特開２００７−０３９３４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸菌含量が低くとも高い免疫賦活能を有し、特に生体のＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を促進する免疫賦活組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定の乳酸菌にワカメ由来のフコイダンを添加し、乳酸菌の有するＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を増強し、高い免疫賦活作用を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
１）ワカメ由来フコイダンおよびテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはラクトバチルス属の乳酸菌のいずれか１種または２種以上を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
２）前記１）記載の乳酸菌が、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である免疫賦活組成物。
３）前記１）〜２）記載の免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物。
４）前記１）〜３）記載の免疫賦活組成物を有効成分とするＩＬ−１０産生促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、乳酸菌菌体の含有量が低くても、高いＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を有する免疫賦活組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マクロファージを各乳酸菌で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１２産生量を表す。
【図２】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１０産生量を表す。
【図３】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１２産生量を表す。
【図４】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際の各サイトカイン産生量を表す。
【図５】フコイダン添加時のＫＫ２２１貪食細胞の割合を表す。
【図６】脾臓細胞をＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１０産生量を表す。
【図７】脾臓細胞をＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＦＮ−γ産生量を表す。
【図８】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を表す。
【図９】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際の脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生量を表す。
【図１０】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際の脾臓細胞からのＩＬ−４産生量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（乳酸菌）
本発明に用いられる乳酸菌は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属またはラクトバチルス属の乳酸菌である。その中でも、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７；以下、「ＫＫ２２１」という。）は、後述する免疫賦活組成物の免疫賦活能が特に高いことから好ましい。当該乳酸菌にフコイダンを添加することで、極めて高いＩＬ−１０産生促進作用を有する免疫賦活組成物を得ることができる。
【００１２】
（フコイダン）
フコイダンとは、コンブ、ワカメまたはモズク等の褐藻類の粘質物に多く含まれる含硫多糖の一種である。本発明に用いられるフコイダンは、ワカメ由来のフコイダンであり、後述する免疫賦活組成物としての効果が高く、安価である特徴を有する。ワカメからフコイダンを抽出する方法は、特に制限されることはないが、例えば、ワカメを酢酸または希塩酸の水溶液に懸濁させ、抽出を行う酸抽出法等、公知の方法を用いることができる。
【００１３】
（免疫賦活組成物）
本発明の免疫賦活組成物は、前記乳酸菌および前記フコイダンを有効成分とする。また、免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量およびフコイダン重量の比率が、免疫賦活組成物の免疫賦活能を左右する大きな要因であり、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部であることが重要である。フコイダン重量が、当該範囲を下回る場合、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２産生促進作用が低くなってしまう。一方、フコイダン重量を増やしていくと、ＩＬ−１０産生促進作用に関しては、フコイダン濃度の増加に比例して高くなるものの、ＩＬ−１２産生促進作用は、フコイダン濃度が一定濃度を越えるとかえって減少してしまう。また、ＩＬ−１０の過剰産生によりＩ型アレルギーの症状改善効果を示さない可能性も考えられるため、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２双方の産生促進作用を考慮すると、前記濃度の範囲を上回る量のフコイダンを添加するのは好ましくない。本発明である免疫賦活組成物は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属およびラクトバチルス属の乳酸菌、ワカメ由来のフコイダンを一定濃度の範囲で含有することで、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進作用が共に高く、幅広い免疫賦活能を有することを最大の特徴とする。
【００１４】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
[フコイダンによるＩＬ−１２産生促進試験]
１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌（ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９、ラクトバチルス・ペントサスＮＲＩＣ０３９１、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１０３８、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７、ラクトバチルス・ヘルベティカスＮＲＩＣ１５４５、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８、ＫＫ２２１）を１×１０７個／ｍｌとなるようＭＲＳ培地に接種した。ＫＫ２２１は、食塩１０％を含有するＭＲＳ培地に１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。それぞれを、３０℃で４８〜７２時間静置培養し、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、細胞培養用のＲＰＭＩ完全培地に２×１０７個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。
【００１６】
２．フコイダン溶液の調製
ワカメ由来フコイダンをＲＰＭＩ完全培地に０．８、４、８または４０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、フコイダン溶液を調製した。
【００１７】
３．ＩＬ−１２産生促進試験
フコイダンによる乳酸菌のＩＬ−１２産生促進活性の増強作用を、マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より採取・調製した腹腔滲出マクロファージ細胞を用いて評価した。
【００１８】
（１）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取および調製
チオグリコレート２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウスから、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。採取したマクロファージを１％ＦＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて洗浄後、細胞数を測定し、ＲＰＭＩ完全培地で、２×１０６個／ｍｌの濃度になるようマクロファージ細胞溶液を調製した。調製したマクロファージ細胞溶液を用いて、９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当たり１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。これに、前記の乳酸菌懸濁液を、１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ（１×１０６個／ウェル）加えた。一方、対照群として、乳酸菌菌体を添加していないＲＰＭＩ完全培地を１ウェル当たり５０μｌ加えた。次に、前記のフコイダン溶液を、実験群、対照群ともに１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ（最終濃度０．２、２または１０μｇ／ｍｌ）加えた。該プレートを、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で培養し、培養開始後２４時間の培養上清を回収した。
【００１９】
（２）ＩＬ−１２産生促進活性の測定
上記の工程により回収した培養上清中のＩＬ−１２濃度を、エンザイムイムノアッセイで測定した。なお、エンザイムイムノアッセイは、下記の工程に従い、測定を行った。
【００２０】
ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）が２μｇ／ｍｌとなるよう、０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液を用いて調製した溶液を、９６ウェル組織培養プレート１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で一晩静置後、ラット抗ＩＬ−１２抗体を各ウェルに付着させたプレートを調製した。当該プレートに１ウェル当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間静置し、培養上清中のマウスＩＬ−１２を、プレートに付着させたラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、前記マウスＩＬ−１２に結合させた。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体中のビオチンに結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を、０．５Ｎ塩酸で停止後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）により作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求めた。この結果を図１に示す。
【００２１】
図１に示すとおり、各乳酸菌にフコイダンを添加することで、マクロファージのＩＬ−１２産生促進が増強されることが確認された。一方、フコイダンの添加量が多くなると、マクロファージのＩＬ−１２産生促進が増強された後に、産生量が低下することが確認された。この結果により、乳酸菌にフコイダンを添加することで、マクロファージによる菌体貪食が促進され、ＩＬ−１２産生促進活性が増強されることが示唆された。
【実施例２】
【００２２】
［乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討１］
免疫賦活組成物が高い免疫賦活能を有するために乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討を行った。実施例１に記載の方法に従い、２×１０６個／ｍｌマクロファージ細胞溶液を調製し、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、１ウェルあたり該マクロファージ細胞溶液を１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。次に、ＫＫ２２１を用いて５０μｇ／ｍｌの濃度となるよう乳酸菌懸濁液を調製し、１ウェルあたり該乳酸菌懸濁液５０μｌ（２．５μｇ／ウェル）を添加した。さらに、４、８または４０μｇ／ｍｌのフコイダン溶液を調製し、１ウェルあたり５０μｌ（０．２、０．４または２μｇ／ウェル）を添加した。２４時間培養後、培養上清中のＩＬ−１０濃度を測定した。ＩＬ−１０濃度は、マウスＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて、実施例１に記載の方法に従い測定した。この結果を図２に示す。
【００２３】
図２に示すとおり、乳酸菌にフコイダンを添加することにより、マクロファージのＩＬ−１０産生が、フコイダンの濃度依存的に促進されることが確認された。なお、ＩＬ−１０産生促進作用が確認された際の、乳酸菌およびフコイダンの重量比は、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量０．０８重量部であった。このことから、フコイダン重量が０．１重量部以上であれば、乳酸菌によるＩＬ−１０産生が充分に促進されると考えられる。
【実施例３】
【００２４】
［乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討２］
実施例１に記載の方法に従い、２×１０６個／ｍｌマクロファージ細胞溶液を調製し、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、１ウェルあたり該マクロファージ細胞溶液を１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。次に、ＫＫ２２１を用いて８μｇ／ｍｌの濃度となるよう乳酸菌懸濁液を調製し、１ウェルあたり該乳酸菌懸濁液５０μｌ（０．４μｇ／ウェル）を添加した。さらに、０．８、８、４０または８０μｇ／ｍｌのフコイダン溶液を調製し、１ウェルあたり５０μｌ（０．０４、０．４、２または４μｇ／ウェル）を添加した。２４時間培養後、培養上清中のＩＬ−１２濃度を、実施例１に記載の方法に従い測定した。結果を図３に示す。
【００２５】
図３に示すとおり、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲において、マクロファージのＩＬ−１２産生が促進され、フコイダン重量が１重量部において、ＩＬ−１２産生促進の効果は最大となった。
実施例２、３の結果により、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物は、ＩＬ−１２産生およびＩＬ−１０産生の双方が促進され、相乗的に作用することにより、Ｉ型アレルギーの症状改善や炎症性疾患である潰瘍性大腸炎等の症状緩和に効果を有することが期待される。
【実施例４】
【００２６】
[フコイダンによる乳酸菌のサイトカイン産生促進作用]
実施例１に記載の方法と同様に、マクロファージ細胞溶液、ＫＫ２２１の乳酸菌懸濁液、フコイダン溶液を調製し、培養２４時間後の培養上清中のＴＮＦ−α濃度およびＩＬ−６濃度を測定した。ＴＮＦ−α濃度およびＩＬ−６濃度は、マウスＴＮＦ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、マウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて、実施例１に記載の方法に従い測定した。この結果を図４に示す。
図４に示すとおり、ＫＫ２２１にフコイダンを添加することにより、マクロファージの各サイトカインの産生が促進されることが確認された。この結果は、乳酸菌にフコイダンを添加することにより、乳酸菌の免疫賦活作用が増強されたことを示唆している。
【実施例５】
【００２７】
[マウスマクロファージを用いたフコイダンによる乳酸菌の貪食促進作用]
１．乳酸菌懸濁液の調製
実施例１に記載の方法と同様に、菌体を調製後、１ｍｌの菌体懸濁液に１０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ溶液（同仁化学研究所製）を１０μｌ添加し、３０℃で１時間インキュベートを行った。その後、生理食塩水にて菌体を３回洗浄し、最後に４×１０６個／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。
【００２８】
２．フコイダン溶液の調製
実施例１に記載の方法と同様に調製した。
【００２９】
３．菌体貪食促進作用の評価
マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より採取、調製した腹腔滲出マクロファージ細胞を用いて、菌体貪食促進作用を評価した。マクロファージ細胞溶液は実施例１に記載の方法と同様に調製した。２４ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、マクロファージ細胞溶液、前記の乳酸菌懸濁液（１×１０６個／ウェル）、前記のフコイダン溶液（最終濃度０．２、１、２または１０μｇ／ｍｌ）を、１ウェル当たりそれぞれ２５０μｌ加えた。対照群として、乳酸菌懸濁液（１×１０６個／ウェル）を添加したＲＰＭＩ完全培地を、１ウェル当たり２５０μｌ加えた。３７℃にて、５％炭酸ガス培養器内で培養し、培養開始４時間後に培養上清を除き、生理食塩水にて２回洗浄後、トリプシン処理を行い、細胞を回収した。回収した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により解析し、ＦＩＴＣ陽性の細胞を菌体貪食細胞とし、その割合を算出した。この結果を図５に示す。
【００３０】
図５に示すとおり、フコイダンの濃度依存的に、マクロファージの菌体貪食率が上昇していることが確認された。この結果により、実施例１〜４において確認された乳酸菌のサイトカイン産生の促進が、フコイダンがマクロファージの菌体貪食作用を促進したことに由来するものであることが示唆された。
【実施例６】
【００３１】
[マウス脾臓細胞を用いたフコイダンと乳酸菌によるＩＬ−１０産生促進作用およびＩＬ−１２を介したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生促進作用]
マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より脾臓を採取後、４００ユニット／ｍｌのタイプ１コラゲナーゼ（シグマ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で攪拌、細胞の懸濁を行い、マウス脾臓細胞を回収した。その後、ＲＰＭＩ完全培地に、マウス脾臓細胞の濃度が５×１０６個／ｍｌとなるように懸濁し、脾臓細胞懸濁液を調製した。乳酸菌懸濁液は、実施例１に記載の方法に従い乳酸菌の濃度が５×１０６個／ｍｌとなるように調製した。９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に脾臓細胞懸濁液を１００μｌ、乳酸菌懸濁液を１００μｌ、フコイダン溶液を５０μｌ（フコイダンの終濃度０、０．２、１、２または１０μｇ／ｍｌ）添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で４８時間培養した（抗体無添加群）。また、ＩＦＮ−γ産生に対するＩＬ-１２の関与について検討するために、培養液中に、ＩＬ-１２中和抗体添加群として抗マウスＩＬ-１２中和抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、コントロール抗体添加群として抗ラットＩｇＧ２ａ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように加えたものを調製した。
【００３２】
培養後、１５，００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を回収し、抗体無添加群についてはＩＬ−１０濃度およびＩＦＮ−γ濃度を、抗マウスＩＬ-１２中和抗体添加群およびコントロール抗体添加群についてはＩＦＮ−γ濃度を、実施例１、２に記載の方法に従い測定した。なお、ＩＦＮ−γ濃度の測定は、抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いたエンザイムイムノアッセイにより実施した。この結果を図６、７に示す。なお、有意差検定（Ｔ検定）は、抗マウスＩＬ-１２中和抗体添加群をコントロール抗体添加群に対し行なった。
【００３３】
図６に示すとおり、ＩＬ-１０産生は、フコイダン濃度依存的に促進することが確認された。
【００３４】
図７に示すとおり、ＩＦＮ−γ産生は、フコイダン濃度依存的に促進することが確認された。また、抗マウスＩＬ-１２中和抗体を添加することにより、ＩＦＮ−γ産生が抑制されたことから、フコイダンによるＩＦＮ−γ産生の促進作用は、ＩＬ−１２を介した作用であることが示唆された。
【実施例７】
【００３５】
[乳酸菌とフコイダンを併用することによるマウスの抗原特異的ＩｇＥの上昇抑制効果]
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）を用いて、ＫＫ２２１、フコイダンまたはその両方の連続強制経口投与を行い、ＫＫ２２１とフコイダンを投与することによるマウスの抗原特異的ＩｇＥの上昇抑制効果を調べた。オボアルブミン（ＯＶＡ）感作を行い、アレルギーを誘導することで、乳酸菌摂取が血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。ＯＶＡ感作は試験開始０日目、１４日目に、下記の方法に従い実施した。
【００３６】
１．ＯＶＡ感作
試験開始０日目から２０日目までの２１日間、前記マウスに、フコイダン溶液が２５ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水に懸濁した溶液０．２ｍｌ（５ｍｇ／日）またはＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌとなるよう生理食塩水に懸濁した溶液０．２ｍｌ（４×１０８個／日）を摂取させた。また、フコイダン溶液が５ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇ／日）およびＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌ（４×１０８個／日）となるよう生理食塩水に懸濁した低用量フコイダン・乳酸菌溶液０．２ｍｌ、フコイダン溶液が２５ｍｇ／ｍｌ（５ｍｇ／日）およびＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌ（４×１０８個／日）となるよう生理食塩水に懸濁した高用量フコイダン・乳酸菌溶液０．２ｍｌを、実験群としてマウスに投与した。対照群として、何も添加しない生理食塩水０．２ｍｌを摂取させた。試験開始０日目および１４日目に、ＯＶＡ（ＧｒａｄｅＶ；シグマ社製）２０μｇ／生理食塩水０．２ｍｌとなるように調製した試薬を、または、水酸化アルミニウム（和光純薬工業社製）２ｍｇ／生理食塩水０．２ｍｌとなるように調製した試薬を、腹腔内にそれぞれ０．２ｍｌ投与した。試験開始２１日目にマウスより脾臓および血液を採取し、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓由来のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生量を測定した。
【００３７】
２．血中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定
試験開始２１日目に採血を行い、１５００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、血清を得た。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を５０μｇ／ｍｌとなるように１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液 （ｐＨ８．２）に溶解し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＥ抗体(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製)を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＶＡ感作を行った対照群の値に対する相対値を算出し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を定量化した。この結果を、図８に示す。なお、有意差検定は分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００３８】
図８に示すとおり、マウスにＫＫ２２１を摂取させると、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量が低下することが確認された。また、低用量フコイダン・乳酸菌溶液および高用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させたマウスにおいても、同様の効果が確認された。
【００３９】
３．脾臓細胞から産生されるＩＦＮ−γの測定
試験開始２１日目に脾臓を採取後、メッシュにより脾臓をすり潰し、細胞の懸濁を行い、脾臓細胞を回収した。その後、２４ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）加ＲＰＭＩ１６４０培地において脾臓細胞を１×１０７個／ｍｌの濃度で懸濁後、３日間培養を行った。培養後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイによりＩＦＮ−γ濃度を測定した。エンザイムイムノアッセイは、実施例７と同様の方法で行なった。この結果を、図９に示す。なお、有意差検定は、分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００４０】
図９に示すとおり、フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させることにより、マウスの脾臓細胞由来のＩＦＮ−γ産生量が増加し、その効果は低用量フコイダン・乳酸菌溶液において最も高いことが確認された。
４．脾臓細胞から産生されるＩＬ−４の測定
上記の培養上清中に産生されたＩＬ−４濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を２μｇ／ｍｌとなるように１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、上清サンプルをプレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識抗ＩＬ−４マウス抗体(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、リコンビナントマウスＩＬ−４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−４の濃度を求めた。この結果を、図１０に示す。なお、有意差検定は分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００４１】
図１０に示すとおり、低用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させることにより、マウスの脾臓由来のＩＬ−４産生量が抑制された。
【００４２】
上記の結果より、抗原に対する脾臓細胞の応答は、低用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させたマウスにおいて最も改善されたことが確認された。この結果により、本発明である免疫賦活組成物が、生体においても高い免疫賦活能を有していることを示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌にワカメ由来のフコイダンを添加することで乳酸菌の有するＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を増強した免疫賦活組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどによる感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はリンパ球と抗原提示細胞である。リンパ球と抗原提示細胞は、抗原特異的または抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高める。リンパ球や抗原提示細胞の活性化において、インターロイキン１２（以下、「ＩＬ−１２」という。）は、ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」という。）やヘルパーＴ細胞に作用してインターフェロンγ（以下、「ＩＦＮ−γ」という。）や腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という。）の産生を誘導し、抗原提示細胞を活性化すること、ＮＫ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の細胞障害活性を増強すること、インターロイキン２（以下、「ＩＬ−２」という。）と相乗的に作用して、細胞障害性リンパ球を活性化するとともにリンホカイン活性化キラー細胞を誘導すること、細胞性免疫を補助するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ１タイプへの分化や、そのバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の制御にも関与していることが知られている。このようにＩＬ−１２は、自然免疫ならびに細胞性免疫の強化による感染防御、抗腫瘍活性またはアレルギー予防など免疫賦活作用を促進する点において重要な役割を担っている。また、インターロイキン１０（以下、「ＩＬ−１０」という。）は、主にＴｈ２細胞や制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、単球、肥満細胞からも産生される。ＩＬ−１０は、主に単球系細胞に作用して炎症性サイトカインの産生を始めとする免疫機能を抑制性に制御するため、炎症の抑制に重要な役割を果たしている。
【０００３】
一方、乳酸菌は、免疫賦活能を有することが知られており、これを摂取することにより生体の免疫活性を向上する作用が認められる。例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属またはロイコノストック属に属する乳酸菌を摂取することにより、ＩＬ−１２の産生が促進される（例えば、特許文献１参照）。また、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属、ストレプトコッカス属など乳酸菌８種類の合剤の経口摂取により、ＩＬ−１０産生を促進し、潰瘍性大腸炎を緩和することが知られている。（例えば、非特許文献１参照）。このような乳酸菌の作用から、乳酸菌を摂取することは、生体内の免疫状態を良好に保つうえで有効な手段であるといえる。
【０００４】
しかしながら、前記のような効果を発揮するためには、多量の菌体を摂取する必要があり、乳酸菌を含む免疫賦活組成物を提供する際に、煩雑な工程を経なければならず、高いコストを要する欠点がある。この欠点を補うために、カゼイン加水分解物を添加した培地を用いて乳酸菌を培養する方法（例えば、特許文献２参照）や、フコイダン加水分解物を乳酸菌に添加することで、乳酸菌の持つ免疫賦活能を増強させる方法（例えば、特許文献３参照）が提案されている。これらの方法により、ある程度高い免疫賦活能を有する乳酸菌を得ることができ、通年性アレルギー性鼻炎や花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのＩ型アレルギーの症状緩和が期待できる免疫賦活組成物を提供することができる。しかしながら、充分な免疫賦活能を有しているとは言えず、特に、ＩＬ−１０産生が極端に低く、改善がみられないことから、炎症性疾患である潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症などを予防・改善する効果を得ることは難しいのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「医学のあゆみ Vol.228 No.3」2009年 p.227-232
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−０２８０４７号公報
【特許文献２】再表２００６／０７３１４５号公報
【特許文献３】特開２００７−０３９３４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸菌含量が低くとも高い免疫賦活能を有し、特に生体のＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を促進する免疫賦活組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定の乳酸菌にワカメ由来のフコイダンを添加し、乳酸菌の有するＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を増強し、高い免疫賦活作用を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
１）ワカメ由来フコイダンおよびテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはラクトバチルス属の乳酸菌のいずれか１種または２種以上を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
２）前記１）記載の乳酸菌が、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である免疫賦活組成物。
３）前記１）〜２）記載の免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物。
４）前記１）〜３）記載の免疫賦活組成物を有効成分とするＩＬ−１０産生促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、乳酸菌菌体の含有量が低くても、高いＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進効果を有する免疫賦活組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マクロファージを各乳酸菌で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１２産生量を表す。
【図２】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１０産生量を表す。
【図３】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１２産生量を表す。
【図４】マクロファージをＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際の各サイトカイン産生量を表す。
【図５】フコイダン添加時のＫＫ２２１貪食細胞の割合を表す。
【図６】脾臓細胞をＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＬ−１０産生量を表す。
【図７】脾臓細胞をＫＫ２２１で刺激し、フコイダンを添加した際のＩＦＮ−γ産生量を表す。
【図８】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を表す。
【図９】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際の脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生量を表す。
【図１０】フコイダン、ＫＫ２２１または両方を摂取した際の脾臓細胞からのＩＬ−４産生量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（乳酸菌）
本発明に用いられる乳酸菌は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属またはラクトバチルス属の乳酸菌である。その中でも、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７；以下、「ＫＫ２２１」という。）は、後述する免疫賦活組成物の免疫賦活能が特に高いことから好ましい。当該乳酸菌にフコイダンを添加することで、極めて高いＩＬ−１０産生促進作用を有する免疫賦活組成物を得ることができる。
【００１２】
（フコイダン）
フコイダンとは、コンブ、ワカメまたはモズク等の褐藻類の粘質物に多く含まれる含硫多糖の一種である。本発明に用いられるフコイダンは、ワカメ由来のフコイダンであり、後述する免疫賦活組成物としての効果が高く、安価である特徴を有する。ワカメからフコイダンを抽出する方法は、特に制限されることはないが、例えば、ワカメを酢酸または希塩酸の水溶液に懸濁させ、抽出を行う酸抽出法等、公知の方法を用いることができる。
【００１３】
（免疫賦活組成物）
本発明の免疫賦活組成物は、前記乳酸菌および前記フコイダンを有効成分とする。また、免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量およびフコイダン重量の比率が、免疫賦活組成物の免疫賦活能を左右する大きな要因であり、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部であることが重要である。フコイダン重量が、当該範囲を下回る場合、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２産生促進作用が低くなってしまう。一方、フコイダン重量を増やしていくと、ＩＬ−１０産生促進作用に関しては、フコイダン濃度の増加に比例して高くなるものの、ＩＬ−１２産生促進作用は、フコイダン濃度が一定濃度を越えるとかえって減少してしまう。また、ＩＬ−１０の過剰産生によりＩ型アレルギーの症状改善効果を示さない可能性も考えられるため、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２双方の産生促進作用を考慮すると、前記濃度の範囲を上回る量のフコイダンを添加するのは好ましくない。本発明である免疫賦活組成物は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属およびラクトバチルス属の乳酸菌、ワカメ由来のフコイダンを一定濃度の範囲で含有することで、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生促進作用が共に高く、幅広い免疫賦活能を有することを最大の特徴とする。
【００１４】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
[フコイダンによるＩＬ−１２産生促進試験]
１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌（ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９、ラクトバチルス・ペントサスＮＲＩＣ０３９１、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１０３８、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７、ラクトバチルス・ヘルベティカスＮＲＩＣ１５４５、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８、ＫＫ２２１）を１×１０７個／ｍｌとなるようＭＲＳ培地に接種した。ＫＫ２２１は、食塩１０％を含有するＭＲＳ培地に１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。それぞれを、３０℃で４８〜７２時間静置培養し、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、細胞培養用のＲＰＭＩ完全培地に２×１０７個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。
【００１６】
２．フコイダン溶液の調製
ワカメ由来フコイダンをＲＰＭＩ完全培地に０．８、４、８または４０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、フコイダン溶液を調製した。
【００１７】
３．ＩＬ−１２産生促進試験
フコイダンによる乳酸菌のＩＬ−１２産生促進活性の増強作用を、マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より採取・調製した腹腔滲出マクロファージ細胞を用いて評価した。
【００１８】
（１）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取および調製
チオグリコレート２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウスから、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。採取したマクロファージを１％ＦＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて洗浄後、細胞数を測定し、ＲＰＭＩ完全培地で、２×１０６個／ｍｌの濃度になるようマクロファージ細胞溶液を調製した。調製したマクロファージ細胞溶液を用いて、９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当たり１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。これに、前記の乳酸菌懸濁液を、１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ（１×１０６個／ウェル）加えた。一方、対照群として、乳酸菌菌体を添加していないＲＰＭＩ完全培地を１ウェル当たり５０μｌ加えた。次に、前記のフコイダン溶液を、実験群、対照群ともに１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ（最終濃度０．２、２または１０μｇ／ｍｌ）加えた。該プレートを、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で培養し、培養開始後２４時間の培養上清を回収した。
【００１９】
（２）ＩＬ−１２産生促進活性の測定
上記の工程により回収した培養上清中のＩＬ−１２濃度を、エンザイムイムノアッセイで測定した。なお、エンザイムイムノアッセイは、下記の工程に従い、測定を行った。
【００２０】
ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）が２μｇ／ｍｌとなるよう、０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液を用いて調製した溶液を、９６ウェル組織培養プレート１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で一晩静置後、ラット抗ＩＬ−１２抗体を各ウェルに付着させたプレートを調製した。当該プレートに１ウェル当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間静置し、培養上清中のマウスＩＬ−１２を、プレートに付着させたラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、前記マウスＩＬ−１２に結合させた。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体中のビオチンに結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を、０．５Ｎ塩酸で停止後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）により作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求めた。この結果を図１に示す。
【００２１】
図１に示すとおり、各乳酸菌にフコイダンを添加することで、マクロファージのＩＬ−１２産生促進が増強されることが確認された。一方、フコイダンの添加量が多くなると、マクロファージのＩＬ−１２産生促進が増強された後に、産生量が低下することが確認された。この結果により、乳酸菌にフコイダンを添加することで、マクロファージによる菌体貪食が促進され、ＩＬ−１２産生促進活性が増強されることが示唆された。
【実施例２】
【００２２】
［乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討１］
免疫賦活組成物が高い免疫賦活能を有するために乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討を行った。実施例１に記載の方法に従い、２×１０６個／ｍｌマクロファージ細胞溶液を調製し、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、１ウェルあたり該マクロファージ細胞溶液を１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。次に、ＫＫ２２１を用いて５０μｇ／ｍｌの濃度となるよう乳酸菌懸濁液を調製し、１ウェルあたり該乳酸菌懸濁液５０μｌ（２．５μｇ／ウェル）を添加した。さらに、４、８または４０μｇ／ｍｌのフコイダン溶液を調製し、１ウェルあたり５０μｌ（０．２、０．４または２μｇ／ウェル）を添加した。２４時間培養後、培養上清中のＩＬ−１０濃度を測定した。ＩＬ−１０濃度は、マウスＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて、実施例１に記載の方法に従い測定した。この結果を図２に示す。
【００２３】
図２に示すとおり、乳酸菌にフコイダンを添加することにより、マクロファージのＩＬ−１０産生が、フコイダンの濃度依存的に促進されることが確認された。なお、ＩＬ−１０産生促進作用が確認された際の、乳酸菌およびフコイダンの重量比は、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量０．０８重量部であった。このことから、フコイダン重量が０．１重量部以上であれば、乳酸菌によるＩＬ−１０産生が充分に促進されると考えられる。
【実施例３】
【００２４】
［乳酸菌およびフコイダンの最適な重量比の検討２］
実施例１に記載の方法に従い、２×１０６個／ｍｌマクロファージ細胞溶液を調製し、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、１ウェルあたり該マクロファージ細胞溶液を１００μｌ（２×１０５個／ウェル）播種した。次に、ＫＫ２２１を用いて８μｇ／ｍｌの濃度となるよう乳酸菌懸濁液を調製し、１ウェルあたり該乳酸菌懸濁液５０μｌ（０．４μｇ／ウェル）を添加した。さらに、０．８、８、４０または８０μｇ／ｍｌのフコイダン溶液を調製し、１ウェルあたり５０μｌ（０．０４、０．４、２または４μｇ／ウェル）を添加した。２４時間培養後、培養上清中のＩＬ−１２濃度を、実施例１に記載の方法に従い測定した。結果を図３に示す。
【００２５】
図３に示すとおり、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲において、マクロファージのＩＬ−１２産生が促進され、フコイダン重量が１重量部において、ＩＬ−１２産生促進の効果は最大となった。
実施例２、３の結果により、乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物は、ＩＬ−１２産生およびＩＬ−１０産生の双方が促進され、相乗的に作用することにより、Ｉ型アレルギーの症状改善や炎症性疾患である潰瘍性大腸炎等の症状緩和に効果を有することが期待される。
【実施例４】
【００２６】
[フコイダンによる乳酸菌のサイトカイン産生促進作用]
実施例１に記載の方法と同様に、マクロファージ細胞溶液、ＫＫ２２１の乳酸菌懸濁液、フコイダン溶液を調製し、培養２４時間後の培養上清中のＴＮＦ−α濃度およびＩＬ−６濃度を測定した。ＴＮＦ−α濃度およびＩＬ−６濃度は、マウスＴＮＦ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、マウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて、実施例１に記載の方法に従い測定した。この結果を図４に示す。
図４に示すとおり、ＫＫ２２１にフコイダンを添加することにより、マクロファージの各サイトカインの産生が促進されることが確認された。この結果は、乳酸菌にフコイダンを添加することにより、乳酸菌の免疫賦活作用が増強されたことを示唆している。
【実施例５】
【００２７】
[マウスマクロファージを用いたフコイダンによる乳酸菌の貪食促進作用]
１．乳酸菌懸濁液の調製
実施例１に記載の方法と同様に、菌体を調製後、１ｍｌの菌体懸濁液に１０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ溶液（同仁化学研究所製）を１０μｌ添加し、３０℃で１時間インキュベートを行った。その後、生理食塩水にて菌体を３回洗浄し、最後に４×１０６個／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。
【００２８】
２．フコイダン溶液の調製
実施例１に記載の方法と同様に調製した。
【００２９】
３．菌体貪食促進作用の評価
マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より採取、調製した腹腔滲出マクロファージ細胞を用いて、菌体貪食促進作用を評価した。マクロファージ細胞溶液は実施例１に記載の方法と同様に調製した。２４ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に、マクロファージ細胞溶液、前記の乳酸菌懸濁液（１×１０６個／ウェル）、前記のフコイダン溶液（最終濃度０．２、１、２または１０μｇ／ｍｌ）を、１ウェル当たりそれぞれ２５０μｌ加えた。対照群として、乳酸菌懸濁液（１×１０６個／ウェル）を添加したＲＰＭＩ完全培地を、１ウェル当たり２５０μｌ加えた。３７℃にて、５％炭酸ガス培養器内で培養し、培養開始４時間後に培養上清を除き、生理食塩水にて２回洗浄後、トリプシン処理を行い、細胞を回収した。回収した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により解析し、ＦＩＴＣ陽性の細胞を菌体貪食細胞とし、その割合を算出した。この結果を図５に示す。
【００３０】
図５に示すとおり、フコイダンの濃度依存的に、マクロファージの菌体貪食率が上昇していることが確認された。この結果により、実施例１〜４において確認された乳酸菌のサイトカイン産生の促進が、フコイダンがマクロファージの菌体貪食作用を促進したことに由来するものであることが示唆された。
【実施例６】
【００３１】
[マウス脾臓細胞を用いたフコイダンと乳酸菌によるＩＬ−１０産生促進作用およびＩＬ−１２を介したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生促進作用]
マウス（６〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より脾臓を採取後、４００ユニット／ｍｌのタイプ１コラゲナーゼ（シグマ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で攪拌、細胞の懸濁を行い、マウス脾臓細胞を回収した。その後、ＲＰＭＩ完全培地に、マウス脾臓細胞の濃度が５×１０６個／ｍｌとなるように懸濁し、脾臓細胞懸濁液を調製した。乳酸菌懸濁液は、実施例１に記載の方法に従い乳酸菌の濃度が５×１０６個／ｍｌとなるように調製した。９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に脾臓細胞懸濁液を１００μｌ、乳酸菌懸濁液を１００μｌ、フコイダン溶液を５０μｌ（フコイダンの終濃度０、０．２、１、２または１０μｇ／ｍｌ）添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で４８時間培養した（抗体無添加群）。また、ＩＦＮ−γ産生に対するＩＬ-１２の関与について検討するために、培養液中に、ＩＬ-１２中和抗体添加群として抗マウスＩＬ-１２中和抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、コントロール抗体添加群として抗ラットＩｇＧ２ａ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように加えたものを調製した。
【００３２】
培養後、１５，００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を回収し、抗体無添加群についてはＩＬ−１０濃度およびＩＦＮ−γ濃度を、抗マウスＩＬ-１２中和抗体添加群およびコントロール抗体添加群についてはＩＦＮ−γ濃度を、実施例１、２に記載の方法に従い測定した。なお、ＩＦＮ−γ濃度の測定は、抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いたエンザイムイムノアッセイにより実施した。この結果を図６、７に示す。なお、有意差検定（Ｔ検定）は、抗マウスＩＬ-１２中和抗体添加群をコントロール抗体添加群に対し行なった。
【００３３】
図６に示すとおり、ＩＬ-１０産生は、フコイダン濃度依存的に促進することが確認された。
【００３４】
図７に示すとおり、ＩＦＮ−γ産生は、フコイダン濃度依存的に促進することが確認された。また、抗マウスＩＬ-１２中和抗体を添加することにより、ＩＦＮ−γ産生が抑制されたことから、フコイダンによるＩＦＮ−γ産生の促進作用は、ＩＬ−１２を介した作用であることが示唆された。
【実施例７】
【００３５】
[乳酸菌とフコイダンを併用することによるマウスの抗原特異的ＩｇＥの上昇抑制効果]
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）を用いて、ＫＫ２２１、フコイダンまたはその両方の連続強制経口投与を行い、ＫＫ２２１とフコイダンを投与することによるマウスの抗原特異的ＩｇＥの上昇抑制効果を調べた。オボアルブミン（ＯＶＡ）感作を行い、アレルギーを誘導することで、乳酸菌摂取が血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。ＯＶＡ感作は試験開始０日目、１４日目に、下記の方法に従い実施した。
【００３６】
１．ＯＶＡ感作
試験開始０日目から２０日目までの２１日間、前記マウスに、フコイダン溶液が２５ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水に懸濁した溶液０．２ｍｌ（５ｍｇ／日）またはＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌとなるよう生理食塩水に懸濁した溶液０．２ｍｌ（４×１０８個／日）を摂取させた。また、フコイダン溶液が５ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇ／日）およびＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌ（４×１０８個／日）となるよう生理食塩水に懸濁した低用量フコイダン・乳酸菌溶液０．２ｍｌ、フコイダン溶液が２５ｍｇ／ｍｌ（５ｍｇ／日）およびＫＫ２２１が２×１０９個／ｍｌ（４×１０８個／日）となるよう生理食塩水に懸濁した高用量フコイダン・乳酸菌溶液０．２ｍｌを、実験群としてマウスに投与した。対照群として、何も添加しない生理食塩水０．２ｍｌを摂取させた。試験開始０日目および１４日目に、ＯＶＡ（ＧｒａｄｅＶ；シグマ社製）２０μｇ／生理食塩水０．２ｍｌとなるように調製した試薬を、または、水酸化アルミニウム（和光純薬工業社製）２ｍｇ／生理食塩水０．２ｍｌとなるように調製した試薬を、腹腔内にそれぞれ０．２ｍｌ投与した。試験開始２１日目にマウスより脾臓および血液を採取し、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓由来のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生量を測定した。
【００３７】
２．血中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定
試験開始２１日目に採血を行い、１５００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、血清を得た。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を５０μｇ／ｍｌとなるように１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液 （ｐＨ８．２）に溶解し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＥ抗体(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製)を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＶＡ感作を行った対照群の値に対する相対値を算出し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を定量化した。この結果を、図８に示す。なお、有意差検定は分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００３８】
図８に示すとおり、マウスにＫＫ２２１を摂取させると、血中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量が低下することが確認された。また、低用量フコイダン・乳酸菌溶液および高用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させたマウスにおいても、同様の効果が確認された。
【００３９】
３．脾臓細胞から産生されるＩＦＮ−γの測定
試験開始２１日目に脾臓を採取後、メッシュにより脾臓をすり潰し、細胞の懸濁を行い、脾臓細胞を回収した。その後、２４ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）加ＲＰＭＩ１６４０培地において脾臓細胞を１×１０７個／ｍｌの濃度で懸濁後、３日間培養を行った。培養後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイによりＩＦＮ−γ濃度を測定した。エンザイムイムノアッセイは、実施例７と同様の方法で行なった。この結果を、図９に示す。なお、有意差検定は、分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００４０】
図９に示すとおり、フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させることにより、マウスの脾臓細胞由来のＩＦＮ−γ産生量が増加し、その効果は低用量フコイダン・乳酸菌溶液において最も高いことが確認された。
４．脾臓細胞から産生されるＩＬ−４の測定
上記の培養上清中に産生されたＩＬ−４濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を２μｇ／ｍｌとなるように１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、上清サンプルをプレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識抗ＩＬ−４マウス抗体(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、リコンビナントマウスＩＬ−４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−４の濃度を求めた。この結果を、図１０に示す。なお、有意差検定は分散分析後、ダンカン法により行なった。
【００４１】
図１０に示すとおり、低用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させることにより、マウスの脾臓由来のＩＬ−４産生量が抑制された。
【００４２】
上記の結果より、抗原に対する脾臓細胞の応答は、低用量フコイダン・乳酸菌溶液を摂取させたマウスにおいて最も改善されたことが確認された。この結果により、本発明である免疫賦活組成物が、生体においても高い免疫賦活能を有していることを示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワカメ由来フコイダンおよびテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはラクトバチルス属の乳酸菌のいずれか１種または２種以上を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
【請求項２】
請求項１記載の乳酸菌が、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である免疫賦活組成物。
【請求項３】
請求項１〜２記載の免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物。
【請求項４】
請求項１〜３記載の免疫賦活組成物を有効成分とするＩＬ−１０産生促進剤。
【請求項１】
ワカメ由来フコイダンおよびテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはラクトバチルス属の乳酸菌のいずれか１種または２種以上を含有することを特徴とする免疫賦活組成物。
【請求項２】
請求項１記載の乳酸菌が、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である免疫賦活組成物。
【請求項３】
請求項１〜２記載の免疫賦活組成物に含まれる乳酸菌菌体重量１重量部に対し、フコイダン重量が０．１〜１０重量部の範囲である免疫賦活組成物。
【請求項４】
請求項１〜３記載の免疫賦活組成物を有効成分とするＩＬ−１０産生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−２３５５２８（Ｐ２０１０−２３５５２８Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６２１０（Ｐ２００９−８６２１０）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（３９００１０６７４）理研ビタミン株式会社 (236)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（３９００１０６７４）理研ビタミン株式会社 (236)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]