ＩＬ−１２に対する抗体を使用する、確立した結腸炎を処置する方法
【課題】炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のための処置の提供及びインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の結腸炎誘導効果を阻害する物質についてスクリーニングする方法の提供。
【解決手段】炎症性腸疾患を有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法であって、炎症性腸疾患由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程を包含する、方法。
【解決手段】炎症性腸疾患を有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法であって、炎症性腸疾患由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、サイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の結腸炎誘導効果を阻害することによって、炎症性腸疾患の確立した結腸炎を処置する方法に関する。詳細には、本発明は、特に、ＩＬ−１２に対する抗体を投与することによって、確立した結腸炎を処置するための方法を提供する。さらに、マウスモデルにおいて、確立した結腸炎の炎症応答の減少および炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ）を包含する）は、西洋人に頻繁にみられる特発性の慢性疾患である（１、２）。最近、ＩＢＤの病因論に新たな洞察を提供するであろう慢性腸炎症の種々の動物モデルが確立されている（３）。これらには、ＨＬＡ−Ｂ２７およびβ２−ミクログロブリンのトランスジーンを有するマウス（４）、ならびにインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子（５）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）遺伝子（６）およびＴ細胞レセプターのαまたはβ鎖の遺伝子（７）が相同組換えにより不活化されているマウスが含まれる。さらに、最近、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の正常ＣＤ４５ＲＢｈｉ Ｔ細胞のＣ．Ｂ．−１７ ｓｃｉｄマウスへの養子免疫細胞移入によって結腸炎モデルが確立された。ここで、移入されたＴ細胞は、肉芽性炎症に関連するＴｈ１サイトカイン応答を発現（顕現）する。この実験的結腸炎は、抗インターフェロンγ（抗ＩＦＮ−γ）の全身投与（２用量）によって、および組換えインターロイキン４（ｒＩＬ４）ではなく組換えＩＬ−１０（ｒＩＬ１０）の毎日の全身投与（疾患が誘導されると同時に与えられる）によって予防され得る（８）。しかし、これらの方法を使用する確立したＩＢＤの処置は、示唆されていなかった。ＩＬ−４（Ｔｈ２細胞分化の産物）ではなく、ＩＬ−１０（これもＴｈ２細胞分化の産物）の投与が実験的結腸炎を防止し得るとの観察は、ＩＢＤを予防または処置するためのサイトカイン投与の予測不可能性を強調する。
【０００３】
ＩＬ−１２は、独特の構造および多向性効果を有する最近特徴付けられたサイトカインである（９〜１０）。これは、２つのジスルフィド結合サブユニットであるｐ４０およびｐ３５からなる。これらサブユニットは、機能的に活性なｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーまたは阻害性ｐ４０ホモダイマーを形成する。ＩＬ−１２は、マクロファージ／単球によって主に産生され、そして細胞内寄生物、細菌、および細菌産生物によって効率的に誘導され得る。機能的な研究により、ＩＬ−１２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの細胞溶解活性を増強し、そしてＢ７／ＣＤ２８相互作用と協同作用して、活性化したＮＫ細胞およびＴ細胞のサイトカイン産生および増殖を誘導することが示された（１３）。さらに、ＩＬ−１２はＴｈ１ Ｔ細胞分化においてきわめて重要な役割を演じ、そしてナイーブＴ細胞をＩＦＮ−γを産生させるよう誘導する。Ｔｈ１表現型に対してＴ細胞応答を駆動するこの能力の結果、ＩＬ−１２は、マウスにおける確立した寄生物感染（これはＴｈ２ Ｔ細胞応答を誘発する）の効果的な処置であることが示されている（１４、１５）。ＩＬ−１２に対する抗体は実験的な自己免疫脳炎（Ｔｈ１ Ｔ細胞によって媒介される疾患（１６））の予防に有用であることが示されているが、これらの結果は、確立した自己免疫脳炎の処置には拡張されていない。
【０００４】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対する抗体がＣＤの処置に用いられたことが示されている（２９）。この管理されていない研究において、ＣＤの急性病勢悪化は鈍くなったが、患者はステロイド依存のままであり、そして疾患は決まって数ヶ月以内に再発した。
【０００５】
国際特許出願第ＷＯ ９５／０１９９７号は、ヒトにおけるインターロイキン１が媒介する炎症性障害を処置するためのインターロイキン１βに対する抗体の使用を開示する。国際特許出願第ＷＯ ９５／２３８６５号は、炎症性障害（例えば、炎症性腸疾患および細菌性肺炎）の処置のためのインターロイキン８に対する抗体の使用を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現存する治療法より意外により効果的なＩＢＤのための有効な処置を提供すること。ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害する能力において効果的な物質についてスクリーニングする方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、現存する治療法より意外により効果的なＩＢＤのための有効な処置を提供する。本発明は、さらに、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害する能力において効果的な物質についてスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、ＩＢＤを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、ＩＢＤ由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程を包含する。
【０００９】
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法もまた提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびインターロイキン１２に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程、を包含する。ここで、炎症応答の減少量がＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αに対する抗体の投与によって生じる減少量より大きければ、有効な物質を示す。
【００１０】
さらに、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現についてこの動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の防止におけるその物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程、を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１） 炎症性腸疾患を有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法であって、
炎症性腸疾患由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２） 上記被験体がヒトである、項目１に記載の方法。
・（項目３） 確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ）確立した結腸炎を有する動物を得る工程；
ｂ）上記物質を上記動物に投与する工程；および
ｃ）上記結腸炎の炎症応答の減少をもたらすインターロイキン１２に対する効果について上記動物をアッセイする工程であって、インターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体の投与により生じる減少量よりも大きな上記炎症応答の減少量が、有効な物質を示す、工程
を包含する、方法。
・（項目４） 上記動物が、上記動物の結腸に、有効量のハプテン試薬を導入することによって生じさせた確立した結腸炎を有する、項目３に記載の方法。
・（項目５） 上記ハプテン試薬が２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸である、項目４に記載の方法。
・（項目６） 上記動物がマウスである、項目３に記載の方法。
・（項目７） 炎症性腸疾患を予防することにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ）上記物質を結腸炎に罹患し易い動物に投与する工程；
ｂ）上記動物を、結腸炎を誘導する処置に供する工程；
ｃ）上記動物を結腸炎発症についてアッセイする工程；および
ｄ）結腸炎の発症を予防することにおける上記物質の有効性を、結腸炎の発症を予防することにおけるインターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程であって、結腸炎の発症を予防することにおいてインターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体よりも有効な物質が、有効な物質を示す、工程
を包含する、方法。
・（項目８） 上記動物がマウスである、項目７に記載の方法。
・（項目９） 上記結腸炎を誘導する処置が、上記動物の結腸への有効量のハプテン試薬の導入である、項目７に記載の方法。
・（項目１０） 上記ハプテン試薬が２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸である、項目９に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
好ましい実施態様の説明
本発明は、本明細書中に含まれる以下の特定の実施態様の詳細な説明および実施例を参照することによってより容易に理解され得る。
【００１２】
本発明は、ＩＢＤを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎と診断された被験体に、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量のＩＬ−１２に対する抗体を投与する工程を包含する。ヒトが主たる治療標的であるが、結腸炎に罹患し易いどんな動物でもこの方法によって処置され得る。本明細書中で使用される場合、「確立した結腸炎」とは、１つまたはそれ以上の以下の組織学的特徴が検出され得る炎症状態によって特徴付けられる結腸の状態をいう：白血球浸潤；結腸壁の肥厚；経壁浸潤；杯状細胞の消失；潰瘍形成；肉芽腫；および線維形成。臨床的症状には、下痢、直腸脱、体重減少、腹痛、脱水症、および巨脾症が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００１３】
ＩＬ−１２に対する抗体は任意の供給源由来であり得る。しかし、免疫グロブリン自体の免疫原性を減少させるために、抗体は、好ましくは、ヒト起源であるか、または、実施例ＶＩに記載のように、他の種において生成され、そしてヒトにおける投与のために「ヒト化」された抗体である。ＩＬ−１２結合活性を維持する抗体フラグメントおよびＩＬ−１２結合活性（例えば、ホモダイマー形成）を維持しＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させるＩＬ−１２フラグメントは、用語「抗体」の意に含まれる。このような抗体およびフラグメントは、当該分野において公知の技術により作製され、そして本明細書中の実施例に記載の方法に従って特異性および活性についてスクリーニングされ得る。例えば、抗体産生についての一般的な方法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（２３）に見い出され得る。
【００１４】
本発明において、ＩＬ−１２に対する抗体は、薬学的に受容可能なキャリア中において、経口または非経口で、ヒト被験体に投与され得る。本発明における使用に適切なキャリアとしては、発熱物質を含まない生理食塩水が挙げられるが、これに限定されない。抗体の非経口投与のためには、添加剤（例えば、エチルオレエートまたはイソプロピルミリステート）を含み得る滅菌溶液または懸濁液が生理食塩水中に調製され、そして例えば、皮下または筋内組織中に注射され得る。
【００１５】
あるいは、抗体は、天然または合成のいずれかのポリマーを用いて、直径４〜８μｍのマイクロ粒子中にマイクロカプセル化され得る。このマイクロ粒子は、腸リンパ系組織を標的し、そして４週間までの抗体の持続性放出を生じる（２２、２８）。
【００１６】
ヒトの処置のためには、溶液形態のＩＬ−１２に対する抗体は、代表的には、体重１ｋｇあたり１０ｍｇと２０ｍｇとの間の単回投薬量で投与される。あるいは、患者は、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇを毎週、結腸炎の症状が治まるまで与えられ得る。経口投与のためには、５００ｍｇ〜１０００ｍｇがＰ．Ｏ．で与えられ得る。非経口投与のためには、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇが、単回のまたは週毎の静脈内注射として投与され得る。しかし、最終的な用量の決定には、個体の年齢、体重、および状態を考慮しなければならない。粒子形態のＩＬ−１２に対する抗体の投与のためには、５００ｍｇ〜１０００ｍｇが、４〜８週間にわたる徐放について記載されるようにマイクロカプセル化され得る。当業者は、投薬量が臨床医の実践により至適化されること、および投薬量決定の方法が、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２４）に記載されていることを理解する。
【００１７】
ＩＬ−１２に対する抗体の経口投与に適切なキャリアには、香味剤、潤滑剤、懸濁剤、または保護剤としても作用し得る１つまたはそれ以上の物質が含まれる。適切な固体キャリアには、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレン、またはシクロデキストランが含まれる。適切な液体キャリアには、水、薬学的に受容可能な油、またはそれらの混合物が含まれ得る。これらの液体はまた、他の適切な薬学的添加物（例えば、緩衝液、保存剤、香味剤、粘性または浸透圧調節剤、安定剤または懸濁剤）を含み得る。適切な液体キャリアの例としては、種々の添加剤（ｐＨ調節されたゲルとしてのカルボキシポリメチレンを含む）を含むまたは含まない水が挙げられる。抗体は、胃での分解を避けるために腸に抗体を放出する腸溶皮カプセルに含ませられ得る。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびＩＬ−１２に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程を包含する。ここで、炎症応答の減少量がＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、または他のサイトカインに対する抗体の投与あるいはサイトカイン自体の投与から生じる減少量より大きければ、有効な物質であることを示す。確立した結腸炎の炎症応答の減少に有効な物質は、上記のような、炎症の組織学的および臨床的な徴候を減少させるかまたは逆転させるものである。
【００１９】
物質がＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させる能力は、目的の物質の投与前後に、結腸炎を有する動物の上記のような組織学的および臨床的な徴候を評価すること、および炎症の減少量を定量化することによって決定され得る。物質の投与後の動物において測定されるＩＬ−１２によって誘導される炎症応答の減少量が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたは他のサイトカインに対する抗体の投与後、あるいはサイトカイン自体の投与後の動物において測定されるＩＬ−１２によって誘導される炎症応答の減少量より大きい場合、その物質は確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて有効であると決定される。
【００２０】
結腸炎を生じさせる動物は任意の哺乳動物であり得、そしてこれには、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、およびチンパンジーが含まれ得るが、これらに限定されない。結腸炎は、当該分野において公知の任意の方法によって、動物中に生じさせ得る。例えば、動物の結腸に、有効量のハプテン試薬を導入することによって、結腸炎を生じさせ得る。ハプテン試薬には、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロクロロベンゼンおよび他のトリニトロフェニルアミン化合物が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２１】
ＩＢＤを有するヒトにおける抗ＩＬ−１２処置の効力を評価するために、以下の研究を実施し得る。結腸および／または末端回腸の活性な炎症を有する患者であって、ＩＢＤの制御のための標準的なプレドニゾン治療（非経口または経口）に失敗した患者が、選択され得る。薬物効力は結腸鏡検査によりモニターされ得る。患者は２つの異なるプロトコルに無作為に分けられ得る。一方のプロトコルにおいて、被験体は最初のステロイド投薬量に維持され得、そして第二のプロトコルにおいて、被験体は抗ＩＬ−１２治療を受けた後ステロイド投薬量を漸減され得る。
【００２２】
処置は、２時間にわたって注入される、単回投薬量が体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇのＩＬ−１２に対する抗体、または結腸炎の症状が治まるまで各回２時間にわたって注入される、週投薬量が体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇのＩＬ−１２に対する抗体のいずれかからなり得る。被験体の血圧、脈拍および体温を、２時間の注入期間の前、および注入の間３０分間隔でモニターし得る。被験体は、１）抗ＩＬ−１２注入時；２）注入の２４時間後；３）注入の７２時間後；４）最後の注入の２週間後；５）最後の注入の４週間後；６）最後の注入の６週間後；および７）最後の注入の８週間後の、血小板分画算定を伴う完全血球算定（ＣＢＣ）、ＳＭＡ−１８化学プロフィール、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ反応性タンパク質アッセイからなる検査室評価を受け得る。
【００２３】
被験体はまた、抗ＩＬ−１２の注入時、ならびに再び、最後の注入の２、４、６および８週間後に、ビデオ監視を伴うルーチンの結腸鏡検査を受け得る。
【００２４】
さらに、被験体の血清サンプルは、ＩＦＮ−γレベルについてＥＬＩＳＡによってアッセイされて、薬物効力をモニターし得る。また、結腸鏡検査の間に得られた組織剖検サンプルは培養され、そしてＩＦＮ−γレベルについてアッセイされ得る。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現について動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の予防における物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
【００２６】
ＩＢＤの防止に効果的であることが見い出された物質（例えば、ＩＬ−１２に対する抗体）は、本明細書中に記載される投与プロトコルに従って、結腸炎の発現を予防するために投与され得る。
【００２７】
本発明は、本発明における多くの改変および変形が当業者に明らかであるので、例示としてのみ意図される以下の実施例においてより詳細に記載される。
【実施例】
【００２８】
実施例
実施例Ｉ．材料、抗体、および細胞
試薬およびモノクローナル抗体。未標識およびビオチン化したモノクローナルラット抗マウスＩＬ−２抗体（クローンＪＥＳ６−１Ａ１２／ＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＩＬ−４抗体（ＢＶＤ４−１Ｄ１１／ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＩＬ−１０抗体（ＪＥＳ５−２Ａ５／ＳＸＣ−１）、およびＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２／ＸＭＧ１．２）、ならびに組換えマウスＩＬ−２（比活性：２．５×１０６Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＲＭＰ）単位／ｍｇ）、ＩＬ−４（ＣＴＬＬ−２．４アッセイにより１×１０７単位／ｍｇ）、ＩＬ−１０（５×１０５単位／ｍｇ）、およびＩＦＮ−γ（１×１０７単位／ｍｇ）を、それぞれ、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）から購入した。精製したハムスター抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１）およびハムスター抗マウスＣＤ２８抗体（クローン３７．５１）を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した。
【００２９】
細胞の単離および固有層ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＬＰ細胞）の精製。ＬＰ細胞を、新たに入手した結腸標本から、ｖａｎ ｄｅｒ ＨｅｉｊｄｅｎおよびＳｔｏｋ（１７）により記載された技術の変法を用いて単離した。パイアー斑の除去後、結腸を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ−ＣＭＦ）中で洗浄し、０．５ｃｍ片に切断し、そしてエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（０．３７ｍｇ／ｍｌ）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）（０．１４５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＢＳＳ中で、３７℃にて１５分間、２回インキュベートした。組織を、振盪インキュベーターにおいてコラゲナーゼＤ（４００Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中で、３７℃にてさらに消化した。次いで、ＬＰ細胞を、４０％−１００％Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）上に重層し、そしてリンパ球富化集団を、４０−１００％界面で細胞から単離した。富化したＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を、マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞単離カラム（ＩＳＯＣＥＬＬ(R)；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてネガティブ選択により得た。得られた細胞は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）により分析した場合、８５％を超えるＣＤ４＋細胞からなっていた。
【００３０】
ＬＰ細胞の細胞培養。ＬＰ細胞の細胞培養を、３ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、それぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ならびに１０％ ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地からなる完全培地中で行なった。
【００３１】
脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞の単離。脾臓を、無菌的に取り出し、続いて、コラゲナーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（１２．５μｇ／ｍｌ）で、３７℃にて１５分間消化した。濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）の後、得られた脾細胞懸濁液から、塩化アンモニウム−Ｔｒｉｓ（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｂ＆Ｂ Ｓｃｏｔｔ， Ｗ．Ｗａｒｗｉｃｋ， ＲＩ）での低張性溶解により赤血球（ＲＢＣ）を枯渇させた。Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエント遠心分離物の７０％／９０％層から回収した細胞を、マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞単離カラムを用いてさらにネガティブ選択した。蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析により評価したところ、得られた細胞集団は、８５％を超えるＣＤ４＋細胞を含んでいた。
【００３２】
脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞の細胞培養。１０５個の脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、１ｍｌの完全培地中で培養した。培養上清を、４８時間後に取り出し、そして上記のようにサイトカイン濃度についてアッセイした。
【００３３】
実施例ＩＩ．抗ＩＬ−１２抗体でのマウスの処置
抗ＩＬ−１２抗体での処置。ラット抗マウスＩＬ−１２中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（Ｃ１７．８）（Ｇ．Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ（２０， ２１））を用いて、標準的手順に従ってヌードマウス中に腹水液を作製し、そして抗体を、Ｅ−Ｚ−ＳＥＰ精製キット（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ， Ｆｏｘｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）を用いて精製した。ラットコントロールＩｇＧを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）から入手した。それぞれ１ｍｇのラット抗マウスＩＬ−１２抗体またはラットコントロールＩｇＧを、種々の時点でＴＮＢＳで予め処置したマウスに腹腔内投与した。
【００３４】
実施例ＩＩＩ．結腸炎の誘導および評価
結腸炎の誘導。特定病原体未感染の２〜４月齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃまたはＳＪＬ／Ｊマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から入手し、そしてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのビルの１０Ａ動物施設で維持した。マウスをメトファン（ｍｅｔｏｆａｎｅ）（メトキシフルラン；Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ， Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ ＩＬ）で軽く麻酔した。３．５Ｆカテーテルを、先端が肛門から４ｃｍとなるまで結腸中に挿入した。結腸炎を誘導するために、５０％エタノール中の０．５ｍｇのハプテン試薬２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、（腸上皮バリアを破壊するために）結腸の管腔中に、１ｍｌ注射器に取り付けたカテーテルを通してゆっくりと投与した。コントロール実験では、上記と同じ技術を用いてマウスに５０％エタノールを単独で与えた。総注入容量は、両群とも１００μｌであった。このことは、ＴＮＢＳまたはエタノールが、盲腸および虫垂を含む結腸全体に到達することを可能にする。動物を、垂直姿勢に３０秒間保持し、そしてケージに戻した。
【００３５】
組織学的変化の等級付け。組織を種々の時点で取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。パラフィン切片を作製し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。結腸の顕微鏡用横断切片上で炎症の程度を、０から４まで半定量的に等級付けした［０−炎症の徴候なく、結腸は、正常な結腸と区別できない；１−非常に低レベルの白血球浸潤（視野の１〜１０％で白血球が浸潤）；２−低レベルの白血球浸潤（視野の１１〜２５％で白血球が浸潤）、充血；３−高レベルの白血球浸潤（視野の２６〜５０％で白血球が浸潤）、高い血管密度、結腸壁の肥厚；４−経壁白血球浸潤（視野の＞５０％で白血球が浸潤）、杯状細胞の喪失、高い血管密度、結腸壁の肥厚］。等級付けを、同じ病理学者により盲検様式で行なった。
【００３６】
結腸壁の厚さの形態計測評価。各処置群からの３体以上の動物を、種々の時点でランダムに選択し、そして結腸サンプルを取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。結腸壁の厚さを、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ Ｓ１顕微鏡を用いて目盛り付き接眼レンズを通して、各切片の長さ全体を通して２ｍｍ間隔で、奬膜表面から管腔表面までの距離を測定することにより横断切片で決定した。
【００３７】
免疫組織化学。サンプルを、ドライアイス上で最適切断温度（ＯＣＴ）コンパウンド中に配置し、そして７μｍの凍結切片を、標準的手順に従って切断した。次いで、切片を風乾し、そして冷アセトン中で室温で２分間固定した。サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１５分間再水和し、ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で２０分間ブロックし、そしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ラット抗マウスＣＤ４抗体（１：１００希釈； Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とともに、４５分間、湿潤暗チャンバー中でインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で１５分間洗浄し、マウントし、そして４９０ｎｍの励起波長で蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【００３８】
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の定量を、各時点および各処置群からの少なくとも３標本について凍結切片で、ランダムに選択した１０個の強拡大視野（ＨＰＦ）を検査することにより行なった。これらの実験条件下（×４００倍）で、１つのＨＰＦは０．２５ｍｍ２を示した。
【００３９】
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の直腸内投与は、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬ／Ｊマウスに慢性の肉芽腫性結腸炎を誘導する。５０％エタノール中のＴＮＢＳの直腸内投与に供したＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬ／Ｊマウスは、広範な消耗病を併発する重篤な下痢および直腸脱を伴う全結腸炎（ｐａｎｃｏｌｉｔｉｓ）を再現性よく発現した。臨床的疾患のピークは３週間で生じ、そして結腸の臨床的徴候は、通常、２カ月後に沈静化する。５０％エタノール単独で処置したコントロールマウスは、消耗病を発現せず、そして健康に見えた。
【００４０】
ＴＮＢＳの投与後７日目に取り出したＴＮＢＳ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸は、著しい充血および炎症を現したが、一方、５０％エタノール単独で処置したコントロールマウスの結腸は、炎症の肉眼的徴候を全く示さなかった。ＴＮＢＳ処置したマウスは、巨脾腫を示した。
【００４１】
結腸炎の誘導後１日目の間の組織学的分析は、結腸内への好中性顆粒球の浸潤を示した。７日目に、結腸全体（しかし、小腸を除く）を冒した経壁炎症が見出された。結腸炎を、結腸壁の肥厚、潰瘍形成、杯状細胞の喪失、および肉芽腫の存在に関連する、リンパ球浸潤により主に特徴付けた。免疫組織化学的染色は、７日目に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸でコントロールマウスと比較して増加したことを示した。炎症活性の相違は、結腸切片の組織学的等級付けによりさらに確認された（図１）。結腸壁の厚さの形態計測分析およびＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数（表１）により評価したように、疾患の強度は、通常、ＴＮＢＳの投与後２週間〜４週間の間にピークがあった。疾患の後期では、顆粒球の数が減少したが、しかし壁内リンパ様凝集体は残存し、そして初期線維症が見出された。炎症のこれらの組織学的徴候は、ＴＮＢＳ処置の２カ月後に依然として検出されたが、しかしエタノール処置したマウスには存在しなかった。
【００４２】
組織学的に、ＴＮＢＳ処置したマウスの脾臓は、コントロールマウスからの脾臓と比較した場合、７日目に赤色脾髄および細動脈周囲リンパ様鞘のサイズの増大を示した。脾臓リンパ球の蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析は、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて、エタノール処置したコントロールマウスおよび正常なＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合の２倍増加、ならびにＢ２２０＋ Ｂ細胞の減少を明らかにした。
【００４３】
ＩＬ−１２に対する抗体の早期投与は、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて結腸炎を抑制し、そして消耗病をなくす。ＩＬ−１２に対する抗体が疾患活性に影響を及ぼし得るか否かを決定するために、結腸炎誘導の５日後および９日後に、抗ＩＬ−１２またはコントロールのラットＩｇＧでマウスを全身的に処置した。マウスを抗ＩＬ−１２で処置した場合、消耗病の著しい改善が明らかになった。抗ＩＬ−１２処置したマウスは、非処置のマウスまたはコントロールのラットＩｇＧを与えたマウスと比較して、より活動的になり、そして立毛の外観が消えた。さらに、抗ＩＬ−１２を投与したマウスは、通常、最初の体重を維持したが、一方、コントロールＩｇＧを処置したマウスは、体重が減少し続けた。最終的に、１２日目での結腸の肉眼検査は、抗ＩＬ−１２を投与した動物での炎症活性の減少を明らかにした。
【００４４】
組織学的研究は、抗ＩＬ−１２処置したマウスの結腸において、著しく少ない炎症性細胞を示した。ほとんどの場合、抗ＩＬ−１２処置は、ＴＮＢＳが誘導した炎症を完全に排除し、そして結腸の正常な組織学的外観を回復した。このことは、結腸切片の組織学的等級付けにより確認された；３つの独立実験によりプールされたデータは、抗ＩＬ−１２処置後の炎症活性の著しい減少を示した（図２）。
【００４５】
実施例ＩＶ．サイトカインアッセイ
ＥＬＩＳＡ。サイトカイン産生を測定するために、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌ マウス抗ＣＤ３ε抗体で、４℃にて一晩、コートした。１０５ ＬＰ Ｔ細胞を、予めコートしたかまたはコートしていないウェルにおいて１ｍｌの完全培地中で培養し、そして１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体を、抗ＣＤ３εコートしたウェルに添加した。培養上清を４８時間後に取り出し、そしてサイトカイン濃度についてアッセイした。サイトカイン濃度を、製造者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の推奨により、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４ ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）を用いて、特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。光学密度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００ ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍの波長で測定した。
【００４６】
ＴＮＢＳ処置したマウスの刺激ＬＰ細胞は、Ｔｈ１サイトカインを分泌する。ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸における浸潤ＬＰ細胞によるサイトカイン産生を試験するために、この細胞集団を結腸炎の誘導後７日目に結腸組織標本から精製し、そしてこれらの細胞のサイトカインパターンを、エタノール処置したコントロールマウスの結腸組織標本から得たＬＰ細胞のパターンと比較した。細胞を２日間培養し、そして培養上清を、特異的ＥＬＩＳＡによりＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の濃度について分析した。ＬＰ細胞による自発的ＩＦＮ−γ産生の１０倍増加が、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて見出された。さらに、ＴＮＢＳ処置したマウスからの、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＬＰ細胞は、コントロールマウスからのＬＰ細胞よりも２０〜５０倍高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。同様に、自発的（４．５Ｕ対１．８Ｕ）および誘導された（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激後、４６Ｕ対１６．８Ｕ）、脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増加は、ＴＮＢＳ処置した動物において、この時点でのエタノールコントロール群と比較して見出された。
【００４７】
上記の知見とは対照的に、ＴＮＢＳ処置したマウスからの刺激していないＬＰ細胞によるＩＬ−４の分泌は、エタノール処置したコントロールマウスからのＬＰ細胞と比較して同じであった。ＴＮＢＳ処置したマウスからの刺激されたＬＰ細胞において、ＩＬ−４の平均分泌は、エタノール処置したコントロールマウスと比較して約５倍減少した。最終的に、刺激されたかまたは刺激されていないＬＰ細胞によるＩＬ−１０の分泌は、ＴＮＢＳ処置したマウスおよびエタノール処置したマウスで同様であった。
【００４８】
インサイチュ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現についてのインサイチュＲＴ−ＰＣＲを、以前に記載された（１８）ように行なった。凍結切片を、荷電したスライドグラス上に配置して、０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにフィットするように切断した。サンプルを１０％ホルムアルデヒド中で４℃にて一晩固定し、ＰＢＳ中で３回およびオートクレーブしたｄＨ２Ｏ中で４回、５分間づつ洗浄した。切片を、０．０１Ｎ ＨＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌトリプシノーゲン（Ｓｉｇｍａ）で２５℃にて１５分間透過化し、次いで緩衝液Ａ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で中和した。ＤＮＡ分解のために、切片を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する緩衝液Ｂ中のＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（８Ｕ／１００ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手）中で、３７℃にて１２分間および７５℃にて１０分間、インキュベートした。次に、切片を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で以下の反応混合物１００μｌ中で５０℃にて６０分間インキュベートした：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭ ｄＡＴＰ、２５μＭ ｄＴＴＰ、２５μＭ ｄＣＴＰ、２５μＭ ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、１００ｎＭのいずれかのＩＦＮ−γプライマー（センス：５’−ＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１）；アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡ−３’（配列番号２）（１９））、１０ｍＭ ＤＴＴ、７５Ｕ ＲＮａｓｉｎ、および４００Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）。スライドを、クエン酸ナトリウム緩衝液（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０、２×ＳＳＣ）、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ中でそれぞれ５回づつ、そしてｄＨ２Ｏ中で２回洗浄した。
【００４９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を、センスまたはアンチセンスのいずれかでプライムしたｃＤＮＡについて、以下の反応混合液１００μｌ中でインサイチュで行なった：それぞれ２５μＭのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および２３．７μＭ ｄＴＴＰ、１．２５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、および１０ｎＭのＩＦＮ−γプライマー。９５℃にて４分間のサンプル変性後、サーモサイクリングを、５サイクル（９４℃にて７０秒間、６２℃にて１分間、７２℃にて１分間）行い；最終伸長を７２℃にて１０分間行なった。次いで、サンプルを、ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ；それぞれ５回）中で洗浄し、そしてＤＩＧ核酸検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて免疫検出を行なった。切片を、段階的なエタノール中で脱水して、キシレン中に配置し、そしてカバースリップに載せた。
【００５０】
ＩＦＮ−γについてのＥｌｉｓｐｏｔアッセイ。１０５個のＬＰ細胞を、抗ＣＤ３εでコートした２４ウェルプレート中で１日インキュベートし、そして１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体を添加した。細胞を、ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートした２４ウェルプレート中でインキュベートした。１２時間後、プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で洗浄し、そしてビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（２μｇ／ｍｌ）を添加した。プレートを、４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で洗浄した後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１：１０００希釈；Ｚｙｍｅｄから入手した）を、３７℃にて３０分間添加した。プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で再度洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、１％アガロースゲルとともに添加した。発色反応を、２４時間進行させた後スポットを撮影した。
【００５１】
インサイチュポリメラーゼ連鎖反応研究は、ＴＮＢＳ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸における上昇したＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現を示す。ＩＦＮ−γ産生において観察された増大がｍＲＮＡレベルでも観察されるか否かを決定するために、ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸におけるＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現を、インサイチュＰＣＲ研究により評価した。エタノール処置したコントロール動物は、７日目にはＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの有意な発現を示さなかった。しかし、ＴＮＢＳ処置した動物において、同じ時点でのＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現の劇的なアップレギュレーションが観察された。高い染色強度は、特に上皮下領域で見られた。
【００５２】
刺激されたＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、抗ＩＬ−１２を与えられたＴＮＢＳ処置したマウスにおいてなくなる。抗ＩＬ−１２処置した動物におけるＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ産生の分析は、ラットＩｇＧ処置したマウスと比較して、ＴＮＢＳ処置し、抗ＩＬ−１２を投与したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生の排除を明らかにした。このことは、抗ＩＬ−１２処置が、局所のＣＤ４＋ Ｔ細胞のＴｈ１様応答に影響を与えることにより作用し得ることを示す。さらに、ＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ分泌についてのＥｌｉｓｐｏｔアッセイは、ラットコントロールＩｇＧ処置群と比較して、抗ＩＬ−１２処置群におけるＥｌｉｓｐｏｔの平均数の劇的な減少を示した。しかし、Ｅｌｉｓｐｏｔのサイズは両方の群で同様であった。このことは、抗ＩＬ−１２処置したマウスからのＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の減少が、主にＩＦＮ−γ分泌細胞数の減少に起因したことを示す。
【００５３】
ＩＬ−１２に対する抗体の後期投与は、ＴＮＢＳ誘導性結腸炎を有するマウスにおける消耗病をなくす。結腸炎が完全に確立された場合、抗ＩＬ−１２処置が疾患の後期相の間に有効であるか否かを決定するために、抗ＩＬ−１２またはコントロールラットＩｇＧの投与を、２０日目に開始し、そして２４日目および２８日目に繰り返した。マウスの平均重量の著しい増大は、抗ＩＬ−１２処置後に見出されたが、しかしラットコントロールＩｇＧ処置の後には見出されなかった。さらに、このようなマウスからのＬＰ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した場合、ＩＦＮ−γ分泌の排除は、抗ＩＬ−１２を与えたマウスでは観察されたが、しかしラットコントロールＩｇＧを与えたマウスでは観察されなかった。
【００５４】
実施例Ｖ．抗ＩＬ−１２抗体でのヒトの処置
確立した結腸炎と診断されたヒト被験体への、ＩＬ−１２に対する抗体の投与。ヒト被験体におけるＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害するために、１０ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の、ＩＬ−１２に対する抗体を、結腸炎の症状（例えば、腹痛、下痢、脱水、またはＩＢＤの他の通常の症状）が沈静化されるまで、２時間にわたって投与される単回用量として、または２時間にわたって投与される週単位注入として非経口投与し得る。経口投与のために、ＩＬ−１２に対する抗体の５００〜１０００ｍｇを、上記の結腸炎の症状が沈静化するまで、単回用量または週単位用量としてＰ．Ｏ．投与し得る。
【００５５】
実施例ＶＩ．ヒト化抗体
ＩＬ−１２に対するヒト化マウス抗体の作製。齧歯類のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、Ｊｕｎｇｈａｎｓら （２５）、Ｂｒｏｗｎら（２６）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（２７）に示すプロトコルに従って改変し得る。詳細には、齧歯類抗体を、当業者に公知の組換えＤＮＡプロトコルにより、齧歯類の可変領域ならびにヒトの重鎖および軽鎖の定常領域から構成されるキメラ齧歯類−ヒト抗体を構築することにより、ヒト投与のために改変し得る。齧歯類抗体をヒト化するための他のアプローチは、齧歯類の可変領域由来の齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトの可変領域にグラフト化することである。これらのアプローチのいずれかを用いることにより、齧歯類抗体は、ヒト被験体への投与のためにヒト化され得る。
【００５６】
実施例ＶＩＩ．動物モデルにおいて物質をスクリーニングするための方法
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性についての物質のスクリーニング。ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を逆転させることにより、確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて、ある物質が有効であるか否かを決定するために、確立した結腸炎の動物モデルを、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って調製し得る。次いで、ある量の目的の物質を、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメで、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。ＩＦＮ−γに対する抗体およびＴＮＦ−αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物では、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメまたは１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎が確立される。抗ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αの投与により誘導される炎症減少量よりも大きな程度で結腸炎の炎症応答を減少させる物質は、確立した結腸炎を処置するために有効な物質であると考えられる。
【００５７】
ＩＢＤを予防することにおける有効性についての物質のスクリーニング。ある物質がＩＢＤを予防することにおいて有効であるか否かを決定するために、物質を、結腸炎に罹患し易い動物に投与し得、次いでこの動物に結腸炎を誘導する処置を（例えば、本明細書中の実施例に記載のようにハプテン試薬で処置することにより）受けさせ得る。ある量の目的の物質を、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメ、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。ＩＦＮ−γに対する抗体およびＴＮＦ−αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物は、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメ、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎に罹患し易い。抗ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αの投与により誘導された炎症予防の程度よりも大きな程度で炎症応答を予防する物質は、ＩＢＤを予防するために有効な物質であると考えられる。
【００５８】
本発明のプロセスは、その特定の実施態様の具体的な詳細を参照して記載されているが、このような詳細が、これらが添付の請求の範囲に含まれる場合およびその程度までを除いて、本発明の範囲の限定とみなされるべきであるとは意図していない。
【００５９】
【表１】
表１。ＴＮＢＳ処置およびエタノール処置をしたＢＡＬＢ／ｃマウスの処置後の種々の時点での結腸における結腸壁の厚さおよび１強拡大視野（ＨＰＦ）あたりのＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数の評価。結腸壁の厚さは、μｍ±ＳＥＭで表される。報告されたＣＤ４＋ Ｔリンパ球についての値は、１ＨＰＦあたりのポジティブ細胞±ＳＥＭとして表される。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、エタノールで処置したコントロールＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸切片（白抜きバー）およびＴＮＢＳで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。ＴＮＢＳまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、ＨＥ染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
【図２】図２は、ＴＮＢＳおよびＩＬ−１２に対する抗体で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸切片（白抜きバー）ならびにＴＮＢＳおよびラットコントロールＩｇＧで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。ＴＮＢＳまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、ＨＥ染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
【００６５】
（配列表）
【００６６】
【表６】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、サイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の結腸炎誘導効果を阻害することによって、炎症性腸疾患の確立した結腸炎を処置する方法に関する。詳細には、本発明は、特に、ＩＬ−１２に対する抗体を投与することによって、確立した結腸炎を処置するための方法を提供する。さらに、マウスモデルにおいて、確立した結腸炎の炎症応答の減少および炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ）を包含する）は、西洋人に頻繁にみられる特発性の慢性疾患である（１、２）。最近、ＩＢＤの病因論に新たな洞察を提供するであろう慢性腸炎症の種々の動物モデルが確立されている（３）。これらには、ＨＬＡ−Ｂ２７およびβ２−ミクログロブリンのトランスジーンを有するマウス（４）、ならびにインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子（５）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）遺伝子（６）およびＴ細胞レセプターのαまたはβ鎖の遺伝子（７）が相同組換えにより不活化されているマウスが含まれる。さらに、最近、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の正常ＣＤ４５ＲＢｈｉ Ｔ細胞のＣ．Ｂ．−１７ ｓｃｉｄマウスへの養子免疫細胞移入によって結腸炎モデルが確立された。ここで、移入されたＴ細胞は、肉芽性炎症に関連するＴｈ１サイトカイン応答を発現（顕現）する。この実験的結腸炎は、抗インターフェロンγ（抗ＩＦＮ−γ）の全身投与（２用量）によって、および組換えインターロイキン４（ｒＩＬ４）ではなく組換えＩＬ−１０（ｒＩＬ１０）の毎日の全身投与（疾患が誘導されると同時に与えられる）によって予防され得る（８）。しかし、これらの方法を使用する確立したＩＢＤの処置は、示唆されていなかった。ＩＬ−４（Ｔｈ２細胞分化の産物）ではなく、ＩＬ−１０（これもＴｈ２細胞分化の産物）の投与が実験的結腸炎を防止し得るとの観察は、ＩＢＤを予防または処置するためのサイトカイン投与の予測不可能性を強調する。
【０００３】
ＩＬ−１２は、独特の構造および多向性効果を有する最近特徴付けられたサイトカインである（９〜１０）。これは、２つのジスルフィド結合サブユニットであるｐ４０およびｐ３５からなる。これらサブユニットは、機能的に活性なｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーまたは阻害性ｐ４０ホモダイマーを形成する。ＩＬ−１２は、マクロファージ／単球によって主に産生され、そして細胞内寄生物、細菌、および細菌産生物によって効率的に誘導され得る。機能的な研究により、ＩＬ−１２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの細胞溶解活性を増強し、そしてＢ７／ＣＤ２８相互作用と協同作用して、活性化したＮＫ細胞およびＴ細胞のサイトカイン産生および増殖を誘導することが示された（１３）。さらに、ＩＬ−１２はＴｈ１ Ｔ細胞分化においてきわめて重要な役割を演じ、そしてナイーブＴ細胞をＩＦＮ−γを産生させるよう誘導する。Ｔｈ１表現型に対してＴ細胞応答を駆動するこの能力の結果、ＩＬ−１２は、マウスにおける確立した寄生物感染（これはＴｈ２ Ｔ細胞応答を誘発する）の効果的な処置であることが示されている（１４、１５）。ＩＬ−１２に対する抗体は実験的な自己免疫脳炎（Ｔｈ１ Ｔ細胞によって媒介される疾患（１６））の予防に有用であることが示されているが、これらの結果は、確立した自己免疫脳炎の処置には拡張されていない。
【０００４】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対する抗体がＣＤの処置に用いられたことが示されている（２９）。この管理されていない研究において、ＣＤの急性病勢悪化は鈍くなったが、患者はステロイド依存のままであり、そして疾患は決まって数ヶ月以内に再発した。
【０００５】
国際特許出願第ＷＯ ９５／０１９９７号は、ヒトにおけるインターロイキン１が媒介する炎症性障害を処置するためのインターロイキン１βに対する抗体の使用を開示する。国際特許出願第ＷＯ ９５／２３８６５号は、炎症性障害（例えば、炎症性腸疾患および細菌性肺炎）の処置のためのインターロイキン８に対する抗体の使用を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現存する治療法より意外により効果的なＩＢＤのための有効な処置を提供すること。ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害する能力において効果的な物質についてスクリーニングする方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、現存する治療法より意外により効果的なＩＢＤのための有効な処置を提供する。本発明は、さらに、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害する能力において効果的な物質についてスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、ＩＢＤを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、ＩＢＤ由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程を包含する。
【０００９】
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法もまた提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびインターロイキン１２に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程、を包含する。ここで、炎症応答の減少量がＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αに対する抗体の投与によって生じる減少量より大きければ、有効な物質を示す。
【００１０】
さらに、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現についてこの動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の防止におけるその物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程、を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１） 炎症性腸疾患を有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法であって、
炎症性腸疾患由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン１２に対する抗体を投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２） 上記被験体がヒトである、項目１に記載の方法。
・（項目３） 確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ）確立した結腸炎を有する動物を得る工程；
ｂ）上記物質を上記動物に投与する工程；および
ｃ）上記結腸炎の炎症応答の減少をもたらすインターロイキン１２に対する効果について上記動物をアッセイする工程であって、インターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体の投与により生じる減少量よりも大きな上記炎症応答の減少量が、有効な物質を示す、工程
を包含する、方法。
・（項目４） 上記動物が、上記動物の結腸に、有効量のハプテン試薬を導入することによって生じさせた確立した結腸炎を有する、項目３に記載の方法。
・（項目５） 上記ハプテン試薬が２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸である、項目４に記載の方法。
・（項目６） 上記動物がマウスである、項目３に記載の方法。
・（項目７） 炎症性腸疾患を予防することにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ）上記物質を結腸炎に罹患し易い動物に投与する工程；
ｂ）上記動物を、結腸炎を誘導する処置に供する工程；
ｃ）上記動物を結腸炎発症についてアッセイする工程；および
ｄ）結腸炎の発症を予防することにおける上記物質の有効性を、結腸炎の発症を予防することにおけるインターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程であって、結腸炎の発症を予防することにおいてインターフェロンγに対する抗体または腫瘍壊死因子αに対する抗体よりも有効な物質が、有効な物質を示す、工程
を包含する、方法。
・（項目８） 上記動物がマウスである、項目７に記載の方法。
・（項目９） 上記結腸炎を誘導する処置が、上記動物の結腸への有効量のハプテン試薬の導入である、項目７に記載の方法。
・（項目１０） 上記ハプテン試薬が２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸である、項目９に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
好ましい実施態様の説明
本発明は、本明細書中に含まれる以下の特定の実施態様の詳細な説明および実施例を参照することによってより容易に理解され得る。
【００１２】
本発明は、ＩＢＤを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎と診断された被験体に、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量のＩＬ−１２に対する抗体を投与する工程を包含する。ヒトが主たる治療標的であるが、結腸炎に罹患し易いどんな動物でもこの方法によって処置され得る。本明細書中で使用される場合、「確立した結腸炎」とは、１つまたはそれ以上の以下の組織学的特徴が検出され得る炎症状態によって特徴付けられる結腸の状態をいう：白血球浸潤；結腸壁の肥厚；経壁浸潤；杯状細胞の消失；潰瘍形成；肉芽腫；および線維形成。臨床的症状には、下痢、直腸脱、体重減少、腹痛、脱水症、および巨脾症が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００１３】
ＩＬ−１２に対する抗体は任意の供給源由来であり得る。しかし、免疫グロブリン自体の免疫原性を減少させるために、抗体は、好ましくは、ヒト起源であるか、または、実施例ＶＩに記載のように、他の種において生成され、そしてヒトにおける投与のために「ヒト化」された抗体である。ＩＬ−１２結合活性を維持する抗体フラグメントおよびＩＬ−１２結合活性（例えば、ホモダイマー形成）を維持しＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させるＩＬ−１２フラグメントは、用語「抗体」の意に含まれる。このような抗体およびフラグメントは、当該分野において公知の技術により作製され、そして本明細書中の実施例に記載の方法に従って特異性および活性についてスクリーニングされ得る。例えば、抗体産生についての一般的な方法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（２３）に見い出され得る。
【００１４】
本発明において、ＩＬ−１２に対する抗体は、薬学的に受容可能なキャリア中において、経口または非経口で、ヒト被験体に投与され得る。本発明における使用に適切なキャリアとしては、発熱物質を含まない生理食塩水が挙げられるが、これに限定されない。抗体の非経口投与のためには、添加剤（例えば、エチルオレエートまたはイソプロピルミリステート）を含み得る滅菌溶液または懸濁液が生理食塩水中に調製され、そして例えば、皮下または筋内組織中に注射され得る。
【００１５】
あるいは、抗体は、天然または合成のいずれかのポリマーを用いて、直径４〜８μｍのマイクロ粒子中にマイクロカプセル化され得る。このマイクロ粒子は、腸リンパ系組織を標的し、そして４週間までの抗体の持続性放出を生じる（２２、２８）。
【００１６】
ヒトの処置のためには、溶液形態のＩＬ−１２に対する抗体は、代表的には、体重１ｋｇあたり１０ｍｇと２０ｍｇとの間の単回投薬量で投与される。あるいは、患者は、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇを毎週、結腸炎の症状が治まるまで与えられ得る。経口投与のためには、５００ｍｇ〜１０００ｍｇがＰ．Ｏ．で与えられ得る。非経口投与のためには、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇが、単回のまたは週毎の静脈内注射として投与され得る。しかし、最終的な用量の決定には、個体の年齢、体重、および状態を考慮しなければならない。粒子形態のＩＬ−１２に対する抗体の投与のためには、５００ｍｇ〜１０００ｍｇが、４〜８週間にわたる徐放について記載されるようにマイクロカプセル化され得る。当業者は、投薬量が臨床医の実践により至適化されること、および投薬量決定の方法が、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２４）に記載されていることを理解する。
【００１７】
ＩＬ−１２に対する抗体の経口投与に適切なキャリアには、香味剤、潤滑剤、懸濁剤、または保護剤としても作用し得る１つまたはそれ以上の物質が含まれる。適切な固体キャリアには、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレン、またはシクロデキストランが含まれる。適切な液体キャリアには、水、薬学的に受容可能な油、またはそれらの混合物が含まれ得る。これらの液体はまた、他の適切な薬学的添加物（例えば、緩衝液、保存剤、香味剤、粘性または浸透圧調節剤、安定剤または懸濁剤）を含み得る。適切な液体キャリアの例としては、種々の添加剤（ｐＨ調節されたゲルとしてのカルボキシポリメチレンを含む）を含むまたは含まない水が挙げられる。抗体は、胃での分解を避けるために腸に抗体を放出する腸溶皮カプセルに含ませられ得る。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびＩＬ−１２に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程を包含する。ここで、炎症応答の減少量がＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、または他のサイトカインに対する抗体の投与あるいはサイトカイン自体の投与から生じる減少量より大きければ、有効な物質であることを示す。確立した結腸炎の炎症応答の減少に有効な物質は、上記のような、炎症の組織学的および臨床的な徴候を減少させるかまたは逆転させるものである。
【００１９】
物質がＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を減少させる能力は、目的の物質の投与前後に、結腸炎を有する動物の上記のような組織学的および臨床的な徴候を評価すること、および炎症の減少量を定量化することによって決定され得る。物質の投与後の動物において測定されるＩＬ−１２によって誘導される炎症応答の減少量が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたは他のサイトカインに対する抗体の投与後、あるいはサイトカイン自体の投与後の動物において測定されるＩＬ−１２によって誘導される炎症応答の減少量より大きい場合、その物質は確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて有効であると決定される。
【００２０】
結腸炎を生じさせる動物は任意の哺乳動物であり得、そしてこれには、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、およびチンパンジーが含まれ得るが、これらに限定されない。結腸炎は、当該分野において公知の任意の方法によって、動物中に生じさせ得る。例えば、動物の結腸に、有効量のハプテン試薬を導入することによって、結腸炎を生じさせ得る。ハプテン試薬には、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロクロロベンゼンおよび他のトリニトロフェニルアミン化合物が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２１】
ＩＢＤを有するヒトにおける抗ＩＬ−１２処置の効力を評価するために、以下の研究を実施し得る。結腸および／または末端回腸の活性な炎症を有する患者であって、ＩＢＤの制御のための標準的なプレドニゾン治療（非経口または経口）に失敗した患者が、選択され得る。薬物効力は結腸鏡検査によりモニターされ得る。患者は２つの異なるプロトコルに無作為に分けられ得る。一方のプロトコルにおいて、被験体は最初のステロイド投薬量に維持され得、そして第二のプロトコルにおいて、被験体は抗ＩＬ−１２治療を受けた後ステロイド投薬量を漸減され得る。
【００２２】
処置は、２時間にわたって注入される、単回投薬量が体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇのＩＬ−１２に対する抗体、または結腸炎の症状が治まるまで各回２時間にわたって注入される、週投薬量が体重１ｋｇあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇのＩＬ−１２に対する抗体のいずれかからなり得る。被験体の血圧、脈拍および体温を、２時間の注入期間の前、および注入の間３０分間隔でモニターし得る。被験体は、１）抗ＩＬ−１２注入時；２）注入の２４時間後；３）注入の７２時間後；４）最後の注入の２週間後；５）最後の注入の４週間後；６）最後の注入の６週間後；および７）最後の注入の８週間後の、血小板分画算定を伴う完全血球算定（ＣＢＣ）、ＳＭＡ−１８化学プロフィール、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ反応性タンパク質アッセイからなる検査室評価を受け得る。
【００２３】
被験体はまた、抗ＩＬ−１２の注入時、ならびに再び、最後の注入の２、４、６および８週間後に、ビデオ監視を伴うルーチンの結腸鏡検査を受け得る。
【００２４】
さらに、被験体の血清サンプルは、ＩＦＮ−γレベルについてＥＬＩＳＡによってアッセイされて、薬物効力をモニターし得る。また、結腸鏡検査の間に得られた組織剖検サンプルは培養され、そしてＩＦＮ−γレベルについてアッセイされ得る。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現について動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の予防における物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
【００２６】
ＩＢＤの防止に効果的であることが見い出された物質（例えば、ＩＬ−１２に対する抗体）は、本明細書中に記載される投与プロトコルに従って、結腸炎の発現を予防するために投与され得る。
【００２７】
本発明は、本発明における多くの改変および変形が当業者に明らかであるので、例示としてのみ意図される以下の実施例においてより詳細に記載される。
【実施例】
【００２８】
実施例
実施例Ｉ．材料、抗体、および細胞
試薬およびモノクローナル抗体。未標識およびビオチン化したモノクローナルラット抗マウスＩＬ−２抗体（クローンＪＥＳ６−１Ａ１２／ＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＩＬ−４抗体（ＢＶＤ４−１Ｄ１１／ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＩＬ−１０抗体（ＪＥＳ５−２Ａ５／ＳＸＣ−１）、およびＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２／ＸＭＧ１．２）、ならびに組換えマウスＩＬ−２（比活性：２．５×１０６Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＲＭＰ）単位／ｍｇ）、ＩＬ−４（ＣＴＬＬ−２．４アッセイにより１×１０７単位／ｍｇ）、ＩＬ−１０（５×１０５単位／ｍｇ）、およびＩＦＮ−γ（１×１０７単位／ｍｇ）を、それぞれ、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）から購入した。精製したハムスター抗マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１）およびハムスター抗マウスＣＤ２８抗体（クローン３７．５１）を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した。
【００２９】
細胞の単離および固有層ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＬＰ細胞）の精製。ＬＰ細胞を、新たに入手した結腸標本から、ｖａｎ ｄｅｒ ＨｅｉｊｄｅｎおよびＳｔｏｋ（１７）により記載された技術の変法を用いて単離した。パイアー斑の除去後、結腸を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ−ＣＭＦ）中で洗浄し、０．５ｃｍ片に切断し、そしてエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（０．３７ｍｇ／ｍｌ）およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）（０．１４５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＢＳＳ中で、３７℃にて１５分間、２回インキュベートした。組織を、振盪インキュベーターにおいてコラゲナーゼＤ（４００Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中で、３７℃にてさらに消化した。次いで、ＬＰ細胞を、４０％−１００％Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）上に重層し、そしてリンパ球富化集団を、４０−１００％界面で細胞から単離した。富化したＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を、マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞単離カラム（ＩＳＯＣＥＬＬ(R)；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてネガティブ選択により得た。得られた細胞は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）により分析した場合、８５％を超えるＣＤ４＋細胞からなっていた。
【００３０】
ＬＰ細胞の細胞培養。ＬＰ細胞の細胞培養を、３ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、それぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ならびに１０％ ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地からなる完全培地中で行なった。
【００３１】
脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞の単離。脾臓を、無菌的に取り出し、続いて、コラゲナーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（１２．５μｇ／ｍｌ）で、３７℃にて１５分間消化した。濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）の後、得られた脾細胞懸濁液から、塩化アンモニウム−Ｔｒｉｓ（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｂ＆Ｂ Ｓｃｏｔｔ， Ｗ．Ｗａｒｗｉｃｋ， ＲＩ）での低張性溶解により赤血球（ＲＢＣ）を枯渇させた。Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエント遠心分離物の７０％／９０％層から回収した細胞を、マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞単離カラムを用いてさらにネガティブ選択した。蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析により評価したところ、得られた細胞集団は、８５％を超えるＣＤ４＋細胞を含んでいた。
【００３２】
脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞の細胞培養。１０５個の脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、１ｍｌの完全培地中で培養した。培養上清を、４８時間後に取り出し、そして上記のようにサイトカイン濃度についてアッセイした。
【００３３】
実施例ＩＩ．抗ＩＬ−１２抗体でのマウスの処置
抗ＩＬ−１２抗体での処置。ラット抗マウスＩＬ−１２中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（Ｃ１７．８）（Ｇ．Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ（２０， ２１））を用いて、標準的手順に従ってヌードマウス中に腹水液を作製し、そして抗体を、Ｅ−Ｚ−ＳＥＰ精製キット（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ， Ｆｏｘｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）を用いて精製した。ラットコントロールＩｇＧを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）から入手した。それぞれ１ｍｇのラット抗マウスＩＬ−１２抗体またはラットコントロールＩｇＧを、種々の時点でＴＮＢＳで予め処置したマウスに腹腔内投与した。
【００３４】
実施例ＩＩＩ．結腸炎の誘導および評価
結腸炎の誘導。特定病原体未感染の２〜４月齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃまたはＳＪＬ／Ｊマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から入手し、そしてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのビルの１０Ａ動物施設で維持した。マウスをメトファン（ｍｅｔｏｆａｎｅ）（メトキシフルラン；Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ， Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ ＩＬ）で軽く麻酔した。３．５Ｆカテーテルを、先端が肛門から４ｃｍとなるまで結腸中に挿入した。結腸炎を誘導するために、５０％エタノール中の０．５ｍｇのハプテン試薬２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、（腸上皮バリアを破壊するために）結腸の管腔中に、１ｍｌ注射器に取り付けたカテーテルを通してゆっくりと投与した。コントロール実験では、上記と同じ技術を用いてマウスに５０％エタノールを単独で与えた。総注入容量は、両群とも１００μｌであった。このことは、ＴＮＢＳまたはエタノールが、盲腸および虫垂を含む結腸全体に到達することを可能にする。動物を、垂直姿勢に３０秒間保持し、そしてケージに戻した。
【００３５】
組織学的変化の等級付け。組織を種々の時点で取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。パラフィン切片を作製し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。結腸の顕微鏡用横断切片上で炎症の程度を、０から４まで半定量的に等級付けした［０−炎症の徴候なく、結腸は、正常な結腸と区別できない；１−非常に低レベルの白血球浸潤（視野の１〜１０％で白血球が浸潤）；２−低レベルの白血球浸潤（視野の１１〜２５％で白血球が浸潤）、充血；３−高レベルの白血球浸潤（視野の２６〜５０％で白血球が浸潤）、高い血管密度、結腸壁の肥厚；４−経壁白血球浸潤（視野の＞５０％で白血球が浸潤）、杯状細胞の喪失、高い血管密度、結腸壁の肥厚］。等級付けを、同じ病理学者により盲検様式で行なった。
【００３６】
結腸壁の厚さの形態計測評価。各処置群からの３体以上の動物を、種々の時点でランダムに選択し、そして結腸サンプルを取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。結腸壁の厚さを、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ Ｓ１顕微鏡を用いて目盛り付き接眼レンズを通して、各切片の長さ全体を通して２ｍｍ間隔で、奬膜表面から管腔表面までの距離を測定することにより横断切片で決定した。
【００３７】
免疫組織化学。サンプルを、ドライアイス上で最適切断温度（ＯＣＴ）コンパウンド中に配置し、そして７μｍの凍結切片を、標準的手順に従って切断した。次いで、切片を風乾し、そして冷アセトン中で室温で２分間固定した。サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１５分間再水和し、ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で２０分間ブロックし、そしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ラット抗マウスＣＤ４抗体（１：１００希釈； Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とともに、４５分間、湿潤暗チャンバー中でインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で１５分間洗浄し、マウントし、そして４９０ｎｍの励起波長で蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【００３８】
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の定量を、各時点および各処置群からの少なくとも３標本について凍結切片で、ランダムに選択した１０個の強拡大視野（ＨＰＦ）を検査することにより行なった。これらの実験条件下（×４００倍）で、１つのＨＰＦは０．２５ｍｍ２を示した。
【００３９】
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の直腸内投与は、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬ／Ｊマウスに慢性の肉芽腫性結腸炎を誘導する。５０％エタノール中のＴＮＢＳの直腸内投与に供したＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬ／Ｊマウスは、広範な消耗病を併発する重篤な下痢および直腸脱を伴う全結腸炎（ｐａｎｃｏｌｉｔｉｓ）を再現性よく発現した。臨床的疾患のピークは３週間で生じ、そして結腸の臨床的徴候は、通常、２カ月後に沈静化する。５０％エタノール単独で処置したコントロールマウスは、消耗病を発現せず、そして健康に見えた。
【００４０】
ＴＮＢＳの投与後７日目に取り出したＴＮＢＳ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸は、著しい充血および炎症を現したが、一方、５０％エタノール単独で処置したコントロールマウスの結腸は、炎症の肉眼的徴候を全く示さなかった。ＴＮＢＳ処置したマウスは、巨脾腫を示した。
【００４１】
結腸炎の誘導後１日目の間の組織学的分析は、結腸内への好中性顆粒球の浸潤を示した。７日目に、結腸全体（しかし、小腸を除く）を冒した経壁炎症が見出された。結腸炎を、結腸壁の肥厚、潰瘍形成、杯状細胞の喪失、および肉芽腫の存在に関連する、リンパ球浸潤により主に特徴付けた。免疫組織化学的染色は、７日目に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸でコントロールマウスと比較して増加したことを示した。炎症活性の相違は、結腸切片の組織学的等級付けによりさらに確認された（図１）。結腸壁の厚さの形態計測分析およびＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数（表１）により評価したように、疾患の強度は、通常、ＴＮＢＳの投与後２週間〜４週間の間にピークがあった。疾患の後期では、顆粒球の数が減少したが、しかし壁内リンパ様凝集体は残存し、そして初期線維症が見出された。炎症のこれらの組織学的徴候は、ＴＮＢＳ処置の２カ月後に依然として検出されたが、しかしエタノール処置したマウスには存在しなかった。
【００４２】
組織学的に、ＴＮＢＳ処置したマウスの脾臓は、コントロールマウスからの脾臓と比較した場合、７日目に赤色脾髄および細動脈周囲リンパ様鞘のサイズの増大を示した。脾臓リンパ球の蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析は、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて、エタノール処置したコントロールマウスおよび正常なＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合の２倍増加、ならびにＢ２２０＋ Ｂ細胞の減少を明らかにした。
【００４３】
ＩＬ−１２に対する抗体の早期投与は、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて結腸炎を抑制し、そして消耗病をなくす。ＩＬ−１２に対する抗体が疾患活性に影響を及ぼし得るか否かを決定するために、結腸炎誘導の５日後および９日後に、抗ＩＬ−１２またはコントロールのラットＩｇＧでマウスを全身的に処置した。マウスを抗ＩＬ−１２で処置した場合、消耗病の著しい改善が明らかになった。抗ＩＬ−１２処置したマウスは、非処置のマウスまたはコントロールのラットＩｇＧを与えたマウスと比較して、より活動的になり、そして立毛の外観が消えた。さらに、抗ＩＬ−１２を投与したマウスは、通常、最初の体重を維持したが、一方、コントロールＩｇＧを処置したマウスは、体重が減少し続けた。最終的に、１２日目での結腸の肉眼検査は、抗ＩＬ−１２を投与した動物での炎症活性の減少を明らかにした。
【００４４】
組織学的研究は、抗ＩＬ−１２処置したマウスの結腸において、著しく少ない炎症性細胞を示した。ほとんどの場合、抗ＩＬ−１２処置は、ＴＮＢＳが誘導した炎症を完全に排除し、そして結腸の正常な組織学的外観を回復した。このことは、結腸切片の組織学的等級付けにより確認された；３つの独立実験によりプールされたデータは、抗ＩＬ−１２処置後の炎症活性の著しい減少を示した（図２）。
【００４５】
実施例ＩＶ．サイトカインアッセイ
ＥＬＩＳＡ。サイトカイン産生を測定するために、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌ マウス抗ＣＤ３ε抗体で、４℃にて一晩、コートした。１０５ ＬＰ Ｔ細胞を、予めコートしたかまたはコートしていないウェルにおいて１ｍｌの完全培地中で培養し、そして１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体を、抗ＣＤ３εコートしたウェルに添加した。培養上清を４８時間後に取り出し、そしてサイトカイン濃度についてアッセイした。サイトカイン濃度を、製造者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の推奨により、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４ ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）を用いて、特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。光学密度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ５０００ ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍの波長で測定した。
【００４６】
ＴＮＢＳ処置したマウスの刺激ＬＰ細胞は、Ｔｈ１サイトカインを分泌する。ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸における浸潤ＬＰ細胞によるサイトカイン産生を試験するために、この細胞集団を結腸炎の誘導後７日目に結腸組織標本から精製し、そしてこれらの細胞のサイトカインパターンを、エタノール処置したコントロールマウスの結腸組織標本から得たＬＰ細胞のパターンと比較した。細胞を２日間培養し、そして培養上清を、特異的ＥＬＩＳＡによりＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の濃度について分析した。ＬＰ細胞による自発的ＩＦＮ−γ産生の１０倍増加が、ＴＮＢＳ処置したマウスにおいて見出された。さらに、ＴＮＢＳ処置したマウスからの、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＬＰ細胞は、コントロールマウスからのＬＰ細胞よりも２０〜５０倍高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。同様に、自発的（４．５Ｕ対１．８Ｕ）および誘導された（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激後、４６Ｕ対１６．８Ｕ）、脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増加は、ＴＮＢＳ処置した動物において、この時点でのエタノールコントロール群と比較して見出された。
【００４７】
上記の知見とは対照的に、ＴＮＢＳ処置したマウスからの刺激していないＬＰ細胞によるＩＬ−４の分泌は、エタノール処置したコントロールマウスからのＬＰ細胞と比較して同じであった。ＴＮＢＳ処置したマウスからの刺激されたＬＰ細胞において、ＩＬ−４の平均分泌は、エタノール処置したコントロールマウスと比較して約５倍減少した。最終的に、刺激されたかまたは刺激されていないＬＰ細胞によるＩＬ−１０の分泌は、ＴＮＢＳ処置したマウスおよびエタノール処置したマウスで同様であった。
【００４８】
インサイチュ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現についてのインサイチュＲＴ−ＰＣＲを、以前に記載された（１８）ように行なった。凍結切片を、荷電したスライドグラス上に配置して、０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにフィットするように切断した。サンプルを１０％ホルムアルデヒド中で４℃にて一晩固定し、ＰＢＳ中で３回およびオートクレーブしたｄＨ２Ｏ中で４回、５分間づつ洗浄した。切片を、０．０１Ｎ ＨＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌトリプシノーゲン（Ｓｉｇｍａ）で２５℃にて１５分間透過化し、次いで緩衝液Ａ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で中和した。ＤＮＡ分解のために、切片を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する緩衝液Ｂ中のＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（８Ｕ／１００ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手）中で、３７℃にて１２分間および７５℃にて１０分間、インキュベートした。次に、切片を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で以下の反応混合物１００μｌ中で５０℃にて６０分間インキュベートした：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭ ｄＡＴＰ、２５μＭ ｄＴＴＰ、２５μＭ ｄＣＴＰ、２５μＭ ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、１００ｎＭのいずれかのＩＦＮ−γプライマー（センス：５’−ＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１）；アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡ−３’（配列番号２）（１９））、１０ｍＭ ＤＴＴ、７５Ｕ ＲＮａｓｉｎ、および４００Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）。スライドを、クエン酸ナトリウム緩衝液（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０、２×ＳＳＣ）、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ中でそれぞれ５回づつ、そしてｄＨ２Ｏ中で２回洗浄した。
【００４９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を、センスまたはアンチセンスのいずれかでプライムしたｃＤＮＡについて、以下の反応混合液１００μｌ中でインサイチュで行なった：それぞれ２５μＭのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および２３．７μＭ ｄＴＴＰ、１．２５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、および１０ｎＭのＩＦＮ−γプライマー。９５℃にて４分間のサンプル変性後、サーモサイクリングを、５サイクル（９４℃にて７０秒間、６２℃にて１分間、７２℃にて１分間）行い；最終伸長を７２℃にて１０分間行なった。次いで、サンプルを、ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ；それぞれ５回）中で洗浄し、そしてＤＩＧ核酸検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて免疫検出を行なった。切片を、段階的なエタノール中で脱水して、キシレン中に配置し、そしてカバースリップに載せた。
【００５０】
ＩＦＮ−γについてのＥｌｉｓｐｏｔアッセイ。１０５個のＬＰ細胞を、抗ＣＤ３εでコートした２４ウェルプレート中で１日インキュベートし、そして１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体を添加した。細胞を、ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートした２４ウェルプレート中でインキュベートした。１２時間後、プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で洗浄し、そしてビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（２μｇ／ｍｌ）を添加した。プレートを、４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で洗浄した後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１：１０００希釈；Ｚｙｍｅｄから入手した）を、３７℃にて３０分間添加した。プレートをＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ(R)中で再度洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、１％アガロースゲルとともに添加した。発色反応を、２４時間進行させた後スポットを撮影した。
【００５１】
インサイチュポリメラーゼ連鎖反応研究は、ＴＮＢＳ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸における上昇したＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現を示す。ＩＦＮ−γ産生において観察された増大がｍＲＮＡレベルでも観察されるか否かを決定するために、ＴＮＢＳ処置したマウスの結腸におけるＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現を、インサイチュＰＣＲ研究により評価した。エタノール処置したコントロール動物は、７日目にはＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの有意な発現を示さなかった。しかし、ＴＮＢＳ処置した動物において、同じ時点でのＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現の劇的なアップレギュレーションが観察された。高い染色強度は、特に上皮下領域で見られた。
【００５２】
刺激されたＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、抗ＩＬ−１２を与えられたＴＮＢＳ処置したマウスにおいてなくなる。抗ＩＬ−１２処置した動物におけるＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ産生の分析は、ラットＩｇＧ処置したマウスと比較して、ＴＮＢＳ処置し、抗ＩＬ−１２を投与したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生の排除を明らかにした。このことは、抗ＩＬ−１２処置が、局所のＣＤ４＋ Ｔ細胞のＴｈ１様応答に影響を与えることにより作用し得ることを示す。さらに、ＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ分泌についてのＥｌｉｓｐｏｔアッセイは、ラットコントロールＩｇＧ処置群と比較して、抗ＩＬ−１２処置群におけるＥｌｉｓｐｏｔの平均数の劇的な減少を示した。しかし、Ｅｌｉｓｐｏｔのサイズは両方の群で同様であった。このことは、抗ＩＬ−１２処置したマウスからのＬＰ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の減少が、主にＩＦＮ−γ分泌細胞数の減少に起因したことを示す。
【００５３】
ＩＬ−１２に対する抗体の後期投与は、ＴＮＢＳ誘導性結腸炎を有するマウスにおける消耗病をなくす。結腸炎が完全に確立された場合、抗ＩＬ−１２処置が疾患の後期相の間に有効であるか否かを決定するために、抗ＩＬ−１２またはコントロールラットＩｇＧの投与を、２０日目に開始し、そして２４日目および２８日目に繰り返した。マウスの平均重量の著しい増大は、抗ＩＬ−１２処置後に見出されたが、しかしラットコントロールＩｇＧ処置の後には見出されなかった。さらに、このようなマウスからのＬＰ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した場合、ＩＦＮ−γ分泌の排除は、抗ＩＬ−１２を与えたマウスでは観察されたが、しかしラットコントロールＩｇＧを与えたマウスでは観察されなかった。
【００５４】
実施例Ｖ．抗ＩＬ−１２抗体でのヒトの処置
確立した結腸炎と診断されたヒト被験体への、ＩＬ−１２に対する抗体の投与。ヒト被験体におけるＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を阻害するために、１０ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の、ＩＬ−１２に対する抗体を、結腸炎の症状（例えば、腹痛、下痢、脱水、またはＩＢＤの他の通常の症状）が沈静化されるまで、２時間にわたって投与される単回用量として、または２時間にわたって投与される週単位注入として非経口投与し得る。経口投与のために、ＩＬ−１２に対する抗体の５００〜１０００ｍｇを、上記の結腸炎の症状が沈静化するまで、単回用量または週単位用量としてＰ．Ｏ．投与し得る。
【００５５】
実施例ＶＩ．ヒト化抗体
ＩＬ−１２に対するヒト化マウス抗体の作製。齧歯類のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、Ｊｕｎｇｈａｎｓら （２５）、Ｂｒｏｗｎら（２６）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（２７）に示すプロトコルに従って改変し得る。詳細には、齧歯類抗体を、当業者に公知の組換えＤＮＡプロトコルにより、齧歯類の可変領域ならびにヒトの重鎖および軽鎖の定常領域から構成されるキメラ齧歯類−ヒト抗体を構築することにより、ヒト投与のために改変し得る。齧歯類抗体をヒト化するための他のアプローチは、齧歯類の可変領域由来の齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトの可変領域にグラフト化することである。これらのアプローチのいずれかを用いることにより、齧歯類抗体は、ヒト被験体への投与のためにヒト化され得る。
【００５６】
実施例ＶＩＩ．動物モデルにおいて物質をスクリーニングするための方法
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性についての物質のスクリーニング。ＩＬ−１２の結腸炎誘導効果を逆転させることにより、確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて、ある物質が有効であるか否かを決定するために、確立した結腸炎の動物モデルを、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って調製し得る。次いで、ある量の目的の物質を、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメで、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。ＩＦＮ−γに対する抗体およびＴＮＦ−αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物では、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメまたは１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎が確立される。抗ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αの投与により誘導される炎症減少量よりも大きな程度で結腸炎の炎症応答を減少させる物質は、確立した結腸炎を処置するために有効な物質であると考えられる。
【００５７】
ＩＢＤを予防することにおける有効性についての物質のスクリーニング。ある物質がＩＢＤを予防することにおいて有効であるか否かを決定するために、物質を、結腸炎に罹患し易い動物に投与し得、次いでこの動物に結腸炎を誘導する処置を（例えば、本明細書中の実施例に記載のようにハプテン試薬で処置することにより）受けさせ得る。ある量の目的の物質を、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメ、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。ＩＦＮ−γに対する抗体およびＴＮＦ−αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物は、１ｍｇの単回用量からなる投薬レジメ、または１ｍｇを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎に罹患し易い。抗ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例ＩＩＩに示すプロトコルに従って決定し得る。抗ＩＦＮ−γまたは抗ＴＮＦ−αの投与により誘導された炎症予防の程度よりも大きな程度で炎症応答を予防する物質は、ＩＢＤを予防するために有効な物質であると考えられる。
【００５８】
本発明のプロセスは、その特定の実施態様の具体的な詳細を参照して記載されているが、このような詳細が、これらが添付の請求の範囲に含まれる場合およびその程度までを除いて、本発明の範囲の限定とみなされるべきであるとは意図していない。
【００５９】
【表１】
表１。ＴＮＢＳ処置およびエタノール処置をしたＢＡＬＢ／ｃマウスの処置後の種々の時点での結腸における結腸壁の厚さおよび１強拡大視野（ＨＰＦ）あたりのＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数の評価。結腸壁の厚さは、μｍ±ＳＥＭで表される。報告されたＣＤ４＋ Ｔリンパ球についての値は、１ＨＰＦあたりのポジティブ細胞±ＳＥＭとして表される。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、エタノールで処置したコントロールＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸切片（白抜きバー）およびＴＮＢＳで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。ＴＮＢＳまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、ＨＥ染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
【図２】図２は、ＴＮＢＳおよびＩＬ−１２に対する抗体で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸切片（白抜きバー）ならびにＴＮＢＳおよびラットコントロールＩｇＧで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。ＴＮＢＳまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、ＨＥ染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
【００６５】
（配列表）
【００６６】
【表６】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載されるような、確立した結腸炎を処置するための方法。
【請求項１】
明細書に記載されるような、確立した結腸炎を処置するための方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１６９１９９（Ｐ２００８−１６９１９９Ａ）
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０５０６５（Ｐ２００７−３０５０６５）
【出願日】平成１９年１１月２６日（２００７．１１．２６）
【分割の表示】特願平９−５１６５７６の分割
【原出願日】平成８年３月２９日（１９９６．３．２９）
【出願人】（３０５０５６８５８）ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２６日（２００７．１１．２６）
【分割の表示】特願平９−５１６５７６の分割
【原出願日】平成８年３月２９日（１９９６．３．２９）
【出願人】（３０５０５６８５８）ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ (15)
【Ｆターム（参考）】
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