ＩＬ−１３およびＩＬ−１３レセプター鎖の拮抗による線維症の処置
【課題】ＩＬ−１３とそのレセプターおよびレセプター成分との相互作用の拮抗による線維症の処置および阻害のための手段を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＩＬ−１３とそのレセプターおよびレセプター成分との相互作用の拮抗による、線維症の処置および阻害に関する。本発明に従って、インターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドが開示される。本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物もまた提供される。本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。この化合物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る。これらの方法によって同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビター、およびそれを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【解決手段】本発明は、ＩＬ−１３とそのレセプターおよびレセプター成分との相互作用の拮抗による、線維症の処置および阻害に関する。本発明に従って、インターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドが開示される。本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物もまた提供される。本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。この化合物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る。これらの方法によって同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビター、およびそれを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１９９７年４月３０日出願の出願番号０８／８４１，７５１号の一部係属出願（これは、１９９６年３月１日に出願の出願番号０８／６０９，５２７号の分割出願である）である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−１３とそのレセプターおよびレセプター成分との相互作用の拮抗による、線維症の処置および阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含む、サイトカインとして公知の種々の調節分子が、同定されている。ＩＬ−１３の種々のタンパク質形態およびＩＬ−１３活性の種々の形態をコードするＤＮＡは、ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３７３５（１９９３）；Ｍｉｎｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２４８（１９９３）；およびＡｖｅｒｓａら、ＷＯ９４／０４６８０に記載される。従って、用語「ＩＬ−１３」は、これらの文献に記載される配列および／または生物学的活性を有するタンパク質を含み、このＩＬ−１３は、遺伝子組換え技術によって産生されるか；天然で因子を産生する細胞源から、または他の因子での誘導により精製されるか；化学技術によって合成されるか；あるいは上記の組み合わせである。
【０００４】
ＩＬ−１３は、以下：ＩｇＧ４とＩｇＥのスイッチングの誘導（ヒトの未熟Ｂ細胞（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０９４（１９９４）を含む）；正常のヒトＢ細胞中の生殖細胞系ＩｇＥ重鎖（ε）の転写およびＣＤ２３の発現の誘導（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３０（１９９３））；およびＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０ｍＡｂの存在下でのＢ細胞増殖の誘導（Ｃｏｏｋｒａ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６５７（１９９３））を含む数種の生物学的活性の産物に関連するサイトカインである。ＩＬ−１３の多くの活性は、ＩＬ−４の活性と類似しているが、ＩＬ−４に対してＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞またはＴ細胞クローンにおいて、増殖促進効果を有さない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１２：２６６３（１９９３））。
【０００５】
ほとんどのサイトカインのように、ＩＬ−１３は、標的細胞の表面上でＩＬ−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）と相互作用することによって、特定の生物学的活性を示す。ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４レセプター（「ＩＬ−４Ｒ」）は、レセプター活性に必要とされる共通の成分を共有するが、ＩＬ−１３は、１３０ｋＤＩＬ−４Ｒ（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、前出）を用いてトランスフェクトされる細胞に結合しない。従って、このＩＬ−１３Ｒは、少なくとも１つの他のリガンド結合鎖を含まなければならない。サイトカインレセプターは、一般に２または３の鎖からなる。ＩＬ−１３に対する、１つのリガンド結合鎖のクローニングが、最近報告されている（Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４９７−５０１）。
【０００６】
ＩＬ−１３の任意の他のＩＬ−１３結合鎖に対して配列を同定およびクローン化することが所望されており、ＩＬ−１３タンパク質が、種々の理由から産生され得、レセプターおよびレセプターシグナル伝達に結合するＩＬ−１３結合の阻害のための、治療法およびスクリーニングの生成を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明に従って、インターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドが開示され、これには、マウスレセプターおよびヒトレセプター由来のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝コードの縮重の結果として、（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチド配列の配列とは異なるヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）において特定される配列の種ホモログをコードするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体。
好ましくは、このヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ−１３レセプターの生物学的活性を有するタンパク質をコードする。このヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド３１９〜１２５７のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列；または、配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。他の好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列をコードする。
【０００９】
このポリヌクレオチドで形質転換された、宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）もまた提供される。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下を包含する：
（ａ）適切な培養培地において、本発明の宿主細胞の培養物を増殖させる工程；および
（ｂ）この培養物からヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程。
これらの方法に従って産生されたタンパク質もまた提供される。
【００１１】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
好ましくは、このタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列；配列番号４の配列；または、配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列を含む。他の好ましい実施形態では、特性されたアミノ酸配列は、融合タンパク質（ＩＬ−１３ｂｃ由来ではない、さらなるアミノ酸配列を有する）の部分である。好ましい融合タンパク質は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）を含む。特に好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物もまた提供される。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。
【００１４】
ＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３レセプターに対するＩＬ−１３の結合のインヒビターを同定する方法もまた、提供される。これらの方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３またはそのフラグメントとを結合させる工程であって、この結合が、第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）この第１の結合混合物において、タンパク質と、ＩＬ−１３またはフラグメントとの結合の量を測定する工程；
（ｃ）化合物を、タンパク質およびＩＬ１３またはフラグメントと結合させて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）この第２の結合混合物における結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）この第１の結合混合物における結合の量を、この第２の結合混合物における結合の量と比較する工程；
を包含し、ここで、第２の結合混合物の結合の量において減少が生じた場合に、この化合物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る。これらの方法によって同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビター、およびそれを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【００１５】
哺乳動物被験体において、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法もまた開示され、この方法は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３ｂｃもしくはＩＬ−１３Ｒインヒビター、またはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１６】
ＩＬ−１３活性を増強するための方法もまた提供され、この方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質を、本発明のタンパク質と結合させる工程、およびこのような結合物を、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する。好ましくは、この接触させる工程は、哺乳動物被験体に、治療的有効量のこのような結合物を投与することによって実施される。
【００１７】
哺乳動物被験体におけるＩＬ−１３関連状態を処置するためのさらなる方法が提供され、この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。哺乳動物被験体における、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃタンパク質との相互作用を阻害する方法についての他の方法が提供され、この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。好ましくは、このアンタゴニストは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体もしくはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子、からなる群から選択される。
【００１８】
さらに他の実施形態では、本発明は、哺乳動物被験体において組織線維症を処置する方法を提供する。この方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、このタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物被験体において、組織線維症の形成を阻害する方法を提供する。この方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここでこのタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物被験体において組織線維症を処置または阻害する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２１】
線維症を処置または阻害するこのような方法を実施する際に、好ましくは、組織線維症は、以下からなる群から選択される組織に罹患している：肝臓、皮膚表皮、皮膚内皮（ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ）、筋肉、腱、軟骨、心臓組織、膵臓組織、肺組織、子宮組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、弁、結腸、小腸、胆管、および腸；最も好ましくは、肝臓組織（住血吸虫属に感染した組織を含む）。特定の実施形態では、線維症は、創傷（外科的切開を含む）の治癒から生じる。
【００２２】
アンタゴニストを用いて、線維症を処置または阻害するこのような方法を実施する際に、好ましくは、このようなアンタゴニストは、以下からなる群から選択される：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体もしくはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子。特定の好ましい実施形態では、アンタゴニストは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００２３】
アンタゴニストを使用して、このような方法を実施する他の好ましい方法において、アンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体もしくはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体もしくはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）哺乳動物の被験体の組織線維症を処置する方法であって、該方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該タンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含む、方法。
（項目２）項目１に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目３）前記組織が、肝臓である、項目２に記載の方法。
（項目４）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目２に記載の方法。
（項目５）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目１に記載の方法。
（項目６）哺乳動物被験体の組織線維症の形成を阻害する方法であって、該方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該タンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含む、方法。
（項目７）項目６に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目８）前記組織が、肝臓である、項目７に記載の方法。
（項目９）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目７に記載の方法。
（項目１０）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目６に記載の方法。
（項目１１）前記創傷が、外科的切開である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）前記創傷が、外科的切開である、項目５に記載の方法。
（項目１３）哺乳動物被験体の組織線維症を処置する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１４）項目１３に記載の方法であって、前記アンタゴニストは、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１−結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目１５）項目１４に記載の方法であって、前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）ア配列番号２のミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含むタンパク質である、方法。
（項目１６）項目１３に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目１７）前記組織が、肝臓である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目１３に記載の方法。
（項目２０）前記創傷が、外科的切開である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）哺乳動物被験体の組織線維症の形成を阻止する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）項目２１に記載の方法であって、前記アンタゴニストは、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１−結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、あるいはＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目２３）項目２２に記載の方法であって、前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含むタンパク質である、方法。
（項目２４）項目２１に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目２５）前記組織が、肝臓である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目２１に記載の方法。
（項目２８）前記創傷が、外科的切開である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）項目２１に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体またはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体またはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目３０）項目１３に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体またはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体またはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】この図は、上記の実施例４に記載されたように、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃへの曝露後に、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１および偽性（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の写真を表す。
【図２】住血吸虫症病因におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の役割の特徴付け。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、次いで、感染の８週間後に屠殺して、肝臓肉芽腫のサイズ（パネルＡ）、組織好酸球増加（パネルＢ）、および肝臓線維症（パネルＣ）を評価した。個々の群のマウスを、方法の節で記載した様に、コントロール−ＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。示されるデータは、個々のマウスからの測定値であり、そして直線は、各群についての平均を示す。統計的比較を、スチューデントｔ検定（パネルＡおよびＢ）および共分散分析（パネルＣ）によって実施した。統計的比較およびそれらのｐ値を、図中に示す。すべてのデータが、第２の研究において再現された。
【図３】肝臓コラーゲンが、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理／感染マウスにおいて減少する。肝臓切片を、チャレンジ感染の８週間後に調製した。コントロールＦｃ−処理マウス（パネルＡおよびＢ）およびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理ＷＴ感染マウス（これらは、ほぼ同一の組織卵負荷量（ｔｉｓｓｕｅ ｅｇｇ ｂｕｒｄｅｎ）を含んだ）を、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）（パネルＡおよびＣ）で染色し、そしてコラーゲンに富む領域を強調させるために、偏光を使用して照射した（パネルＢおよびＤ）。複屈折領域は、陽性のコラーゲン染色を示し、そして示される領域は、各肝臓についての代表である（倍率、×４０）。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理マウス由来の肝臓切片は、コントロール動物と比較して、非常にわずかな肉芽腫および門脈管関連コラーゲンを示した。
【図４Ａ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図４Ｂ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図４Ｃ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図５】Ｔｈ２型サイトカインｍＲＮＡ発現は、感染したＩＬ−４欠損マウス（しかし、ＩＬ−１３遮断に罹患していない）の肝臓において減少する。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。すべての動物を、感染の８週間後に屠殺し、そして方法の節で記載したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために肝臓標本を調製した。示されるデータは、一群あたり９〜１０匹の動物の個々の値であり、そして棒は、各群内の平均を示す。*記号は、データが、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）によって決定される場合に、ＷＴコントロール−Ｆｃ群とは有意に異なることを示す。５匹の非感染ＷＴ（黒丸）および５匹の非感染ＩＬ−４欠損マウス（白丸）からの平均値を、各サイトカインについてのＹ軸に示す。すべてのデータが、第２の研究において再現された。
【図６】コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡ発現は、感染したｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理マウス（しかし、ＩＬ−４欠損に罹患していない）の肝臓において減少する。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。すべての動物を、感染の８週間後に屠殺し、そして方法の節で記載したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために肝臓標本を調製した。示されるデータは、一群あたり９〜１０匹の動物の個々の値であり、そして棒は、各群内の平均を示す。*記号は、データが、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）によって決定される場合に、ＷＴおよびＩＬ−４欠損コントロール−Ｆｃ群とは有意に異なることを示す。５匹の非感染ＷＴ（黒丸）および５匹の非感染ＩＬ−４欠損マウス（白丸）からの平均値を、各サイトカインについてのＹ軸に示す。これらデータは、個々のにおいて再現された。
【図７】ＩＬ−１３は、マウス３Ｔ３線維芽細胞においてＩ型コラーゲン合成を誘導する。細胞を、培地（レーン１）、ｒＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）（レーン２）、またはｒＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）（レーン３および４（それぞれ、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから））で４８時間刺激した。還元条件下で、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて全細胞溶解産物を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、そしてウサギＩｇＧ抗マウスＩ型コラーゲンでプロービングした。上部の二重バンドおよび下部のバンド（矢印）は、レーン５において分離された精製ラットＩ型コラーゲンに対応する（パネルＡ）。下の図（パネルＢ）は、濃度計の値（任意のピクセル単位）である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本願の発明者らは、ＩＬ−１３ＲのＩＬ−１３結合鎖（以後「ＩＬ−１３ｂｃ」）をコードするポリヌクレオチド（マウスおよびヒトのＩＬ−１３ｂｃをコードするポリヌクレオチドを含むが、限定はされない）を初めて同定および提供した。
【００２６】
配列番号１は、マウスＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。配列番号２は、推定シグナル配列アミノ酸１〜２１を含む、レセプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。その成熟マウスＩＬ−１３ｂｃは、配列番号２のアミノ酸２２〜３８３の配列を有すると考えられる。その成熟マウスレセプター鎖は、少なくとも３つの異なるドメイン：細胞外ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸２２〜３３４を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸３３５〜３５６を含む）および細胞内ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸３５７〜３８３を含む）を有する。
【００２７】
配列番号３は、ヒトＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。配列番号４は、推定シグナル配列アミノ酸１〜２５を含む、レセプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。その成熟ヒトＩＬ−１３ｂｃは、配列番号４のアミノ酸２６〜３８０の配列を有すると考えられる。その成熟ヒトレセプター鎖は、少なくとも３つの異なるドメイン：細胞外ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸２６〜３４１を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸３４２〜３６２を含む）および細胞内ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸３６３〜３８０を含む）を有する。
【００２８】
ヒトＩＬ−１３ｂｃ配列の最初の８１アミノ酸は、「ｙｇ９９ｆ１０．ｒ１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ４１６４８ ５」として同定されかつデータベースアクセス番号Ｒ５２７９５．ｇｂ＿ｅｓｔ２を割り当てられた発現配列タグ（ＥＳＴ）の翻訳配列と同一である。このＥＳＴ配列中には、コードされたタンパク質を当業者がサイトカインレセプターとして同定することをもたらす相同性または配列モチーフは存在しない。このデータベースエントリーの対応するｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから公に利用可能である。本願の優先日後に、このようなクローンは、本出願人により順序付けられそして配列決定された。このようなクローンの配列は、本明細書中の配列番号３として本出願人により以前に報告された配列であることが決定された。
【００２９】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態もまた、産生され得る。このような可溶性形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３４または２２〜３３４を含むタンパク質、あるいは配列番号４のアミノ酸１〜３４１または２６〜３４１を含むタンパク質が挙げられるが、限定はされない。ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態は、好ましくは室温にて、水溶液中で可溶性であることによりさらに特徴付けられる。細胞内ドメインまたはその一部のみを含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、産生され得る。全長より短いＩＬ−１３ｂｃの任意の形態が、本発明内に包含され、そして本明細書中で全長および成熟形態とまとめて「ＩＬ−１３ｂｃ」または「ＩＬ−１３ｂｃタンパク質」と呼ばれる。全長より短いＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、全長ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１または配列番号３）の対応するフラグメントを発現することにより、産生され得る。これらの対応するポリヌクレオチドフラグメントもまた、本発明の一部である。上記のような改変型ポリヌクレオチドは、標準的分子生物学技術（適切な所望の欠失変異体の構築、部位特異的変異誘発法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む）によって、作製され得る。
【００３０】
本発明の目的のために、タンパク質は、以下の特徴のうちの１つ以上を保有する場合に、「ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性」を有する：（１）ＩＬ−１３またはそのフラグメント（好ましくは、その生物学的に活性なフラグメント）に結合する能力；および／あるいは（２）ＩＬ−１３Ｒの第２の非ＩＬ−１３結合鎖と相互作用して、ＩＬ−１３がＩＬ−１３Ｒに結合するというシグナル特徴を生成する能力。好ましくは、そのタンパク質により保有される生物学的活性は、ＩＬ−１３またはそのフラグメントに結合する能力であり、好ましくは、ＫDが、約０．１〜約１００ｎＭである。特定のタンパク質またはペプチドがこのような活性を有するか否かを決定するための方法としては、本明細書中にて提供される実施例に記載される方法が挙げられるが、限定はされない。
【００３１】
ＩＬ−１３ｂｃまたはその活性フラグメント（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）は、キャリア分子（例えば、免疫グロブリン）に融合され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態が、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され得る。他の融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰとの融合タンパク質）もまた、使用され得る。
【００３２】
本発明はまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまたコードする、配列番号１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体（すなわち、配列番号１または配列番号３の単離されたポリヌクレオチドの天然に存在する代替形態）（好ましくはＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するタンパク質）を包含する。また本発明に含まれるのは、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に、非常にストリンジェントな条件（例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ）下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重によって、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするが配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列とは異なる、単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。点変異または誘導された改変によって生じる、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列におけるバリエーションもまた、本発明に含まれる。
【００３３】
本発明はまた、他の動物種（特に、他の哺乳動物種）由来のマウスＩＬ−１３ｂｃおよびヒトＩＬ−１３ｂｃのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供する。種ホモログは、本明細書中に開示されるマウス配列またはヒト配列からプローブまたはプライマーを作製すること、および適切な種由来のライブラリー（例えば、関連する種のＰＢＭＣ、胸腺または精巣から構築されたライブラリー）をスクリーニングすることによって、同定および単離され得る。
【００３４】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を組換え産生するために、発現制御配列（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５〜４４９０（１９９１）に開示されるＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクター）に、作動可能に連結され得る。多くの適切な発現制御配列が、当該分野で公知である。組換えタンパク質を発現させる一般的方法もまた公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、５３７〜５６６（１９９０）に例示される。本明細書中にて定義される場合、「作動可能に連結された」とは、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主細胞により発現されるような様式で、本発明の単離されたポリヌクレオチドとその発現制御配列との間に共有結合が形成されるように酵素によってかまたは化学的に連結されていることを意味する。
【００３５】
多数の型の細胞が、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現のために適切な宿主細胞として作用し得る。機能的なＩＬ−１３ｂｃタンパク質を発現し得る任意の細胞型が、使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、初代移植片のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ−９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｒａｔ２細胞、ＢａＦ３細胞、３２Ｄ細胞、ＦＤＣＰ−１細胞、ＰＣ１２細胞、Ｍ１ｘ細胞またはＣ２Ｃ１２細胞。
【００３６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、１つ以上の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列に作動可能に連結すること、および昆虫発現系を使用することによって、産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からのキット（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）にて市販されており、そしてそのような方法は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野で周知である。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態はまた、上記のような適切な単離されたポリヌクレオチドを使用して、昆虫細胞において産生され得る。
【００３７】
あるいは、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、下等真核生物（例えば、酵母）または原核生物（例えば、細菌）において産生され得る。適切な酵母株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が、挙げられる。適切な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が、挙げられる。
【００３８】
細菌における発現は、その組換えタンパク質を組み込んだ封入体の形成を生じ得る。従って、その組換えタンパク質の再折り畳みが、活性な物質またはより活性な物質を産生するためには必要であり得る。正確に折り畳まれた異種タンパク質を細菌の封入体から得るためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。これらの方法は、一般には、その封入体からタンパク質を可溶化すること、次いでそのタンパク質を、カオトロピック剤を使用して完全に変性することを包含する。システイン残基がそのタンパク質の一次アミノ酸配列中に存在する場合に、ジスルフィド結合の正確な形成が可能である環境（酸化還元系）においてその再折り畳みを達成することが、しばしば必要である。再折り畳みの一般的方法は、Ｋｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８５：１８７〜１９５（１９９０）に開示されている。ＥＰ ０４３３２２５および同時係属中の米国特許出願第０８／１６３，８７７号は、他の適切な方法を記載する。
【００３９】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴付けられるトランスジェニック動物の生成物として（例えば、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックブタ、またはトランスジェニックヒツジの、乳の成分として）、発現され得る。
【００４０】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、所望のタンパク質を発現するために必要な培養条件下で、培養形質転換宿主細胞を増殖させることによって、調製され得る。次いで、生じた発現したタンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態は、馴化培地から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の膜結合形態は、その発現タンパク質から総膜画分を調製すること、および非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）でその膜を抽出することによって、精製され得る。
【００４１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、当業者に公知の方法を使用して精製され得る。例えば、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して、精製され得る。濃縮工程の後、その濃縮物が、ゲル濾過マトリックスのような精製マトリックスにアプライされ得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、垂れ下がったジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有する、マトリックスまたは基質）が使用され得る。そのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製にて一般的に使用される他の型であり得る。あるいは、カチオン交換工程が、使用され得る。適切なカチオン交換剤としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む、種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が、好ましい（例えば、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム）。培養上清からのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の精製はまた、コンカナバリンＡ−アガロース、ｈｅｐａｒｉｎ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＧｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３ＧＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような親和性樹脂に対する１つ以上のカラム工程；あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーを含み得る。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、垂れ下がったメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質をさらに精製するために使用され得る。ＩＬ−１３またはそのフラグメントを含むアフィニティーカラム、あるいはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含むアフィニティーカラムもまた、公知の方法に従う精製にて使用され得る。上記の精製工程のいくつかまたはすべてがまた、種々の組み合わせでかまたは他の公知の方法とともに、実質的に精製された単離された組換えタンパク質を提供するために使用され得る。好ましくは、その単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、それが他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まないように、精製されている。
【００４２】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、ＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３Ｒに結合し得る薬剤、あるいはＩＬ−１３またはＩＬ−１３ｂｃ（細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれか）へのＩＬ−１３の結合を妨害し、従って、正常な結合およびサイトカイン作用のインヒビターとして作用し得る薬剤（「ＩＬ−１３Ｒインヒビター」）についてスクリーニングするために使用され得る。所望の結合タンパク質（固定されているかまたはされていない）を使用する結合アッセイが、当該分野で周知であり、そして本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用してこの目的のために使用され得る。精製細胞に基づくスクリーニングアッセイまたはタンパク質に基づく（無細胞）スクリーニングアッセイが、このような薬剤を同定するために使用され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、キャリア上に精製形態で固定され得、そして精製ＩＬ−１３ｂｃタンパク質への結合が、潜在的阻害剤の存在下および不在下で測定され得る。適切な結合アッセイは、あるいは本発明のＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態を使用し得る。インヒビターがスクリーニングされ得る系の別の例が、下記実施例２にて記載される。
【００４３】
このようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物が、ＩＬ−１３またはそのフラグメントをＩＬ−１３タンパク質と混合することにより形成され、そしてその第１の結合混合物における結合の量（ＢO）が測定される。第２の結合混合物もまた、ＩＬ−１３またはそのフラグメント、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、およびスクリーニングされる化合物または薬剤を混合することにより形成され、そしてその第２の結合混合物における結合の量（Ｂ）が測定される。第１の結合混合物における結合の量と第２の結合混合物における結合の量が、例えば、比Ｂ／ＢOの算出を行うことによって、比較される。化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較した場合に第２の結合混合物において結合の減少が観察された場合に、結合を阻害し得ると見なされる。必要に応じて、ＩＬ−１３Ｒの第２鎖が、その結合混合物の１つまたは両方に添加され得る。結合混合物の処方および最適化は、当業者のレベル内であり、このような結合混合物はまた、結合を増大または最適化するために必要な緩衝液または塩を含み得、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイに含まれ得る。
【００４４】
ＩＬ−１３またはそのフラグメントへのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の結合活性を、いくらかの程度、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは約５０％以上減少させることが見出される化合物は、このように同定され得、次いで他の結合アッセイおよびインビボアッセイにおいて二次スクリーニングされ得る。これらの手段によって、治療剤として適切であり得るＩＬ−１３ｂｃ結合についての阻害活性を有する化合物が、同定され得る。
【００４５】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドもまた、ＩＬ−１３ｂｃ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１３、あるいはＩＬ−１３ｂｃを発現する細胞、ＩＬ−１３Ｒを発現する細胞、またはＩＬ−１３を発現する細胞の発現または存在を検出するための診断剤として使用され得る。そのタンパク質またはポリヌクレオチドは、これらの型の物質を使用する診断アッセイについての標準的手順において、このような目的のために使用され得る。適切な方法が、当業者に周知である。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１３Ｒ」とは、「ＩＬ−１３Ｒα１」または「ＮＲ４」として公知であるＩＬ−１３ｂｃおよび／または第２のＩＬ−１３レセプター鎖をいう（マウスレセプター鎖、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６、９３：４９７〜５０１；ヒトレセプター鎖、Ａｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１：２９２６５〜７０、およびＧａｕｃｈａｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７：９７１〜８を参照のこと）。
【００４７】
ＩＬ−１３ｂｃは、ＩＬ−１３の公知の生物学的活性のモジュレーターとして作用する。結果として、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（特に、可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）、ＩＬ−１３Ｒインヒビター（すなわち、ＩＬ−１３ＲとのＩＬ−１３の相互作用のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３Ｒ（特に、ＩＬ−１３ｂｃ、またはＩＬ−１３Ｒα１を含む）に対する抗体およびそのフラグメント、ＩＬ−１３に対する抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質、ならびにＩＬ−１３ＲとのＩＬ−１３の相互作用（ＩＬ−１３ｂｃおよび／またはＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を含む）の低分子インヒビターまたは他のインヒビター）が、ＩＬ−１３が関係する種々の医学的状態またはＩＬ−１３の活性（またはその欠失）によりもたらされる種々の医学的状態（まとめて、「ＩＬ−１３関連状態」）の処置または調節において有用であり得る。ＩＬ−１３Ｒに結合するＩＬ−４の変異形態もまた、ＩＬ−１３アンタゴニストとして使用され得る（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８、９５：９４５４〜８；Ａｖｅｒｓａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３、１７８：２２１３〜８；ならびにＧｒｕｎｅｗａｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０：４００４〜９に開示されるものを参照のこと）。
【００４８】
ＩＬ−１３関連状態としては、Ｉｇ媒介性の状態および疾患（特に、ＩｇＥ媒介性状態（アトピー、アレルギー状態、喘息、免疫複合体病（例えば、狼瘡、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、甲状腺炎およびグレーブス病）を含むが、限定はされない）；肺の炎症状態；免疫欠乏（特に、造血前駆体細胞における欠乏、またはそれに関する障害；癌および他の疾患が挙げられるが、限定はされない。このような病理学的状態は、疾患、放射線への曝露または薬物から生じ得、そして例えば、白血球減少症、細菌感染およびウイルス感染、貧血、Ｂ細胞欠乏またはＴ細胞欠乏（例えば、骨髄移植後の免疫細胞欠乏または造血細胞欠乏）を含む。ＩＬ−１３はマクロファージ活性化を阻害するので、ＩＬ−１３ｂｃはまた、マクロファージ活性を増強するため（すなわち、ワクチン接種、ミコバクテリア感染または細胞内生物感染または寄生生物感染の処置において）有用であり得る。
【００４９】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた用いて、ＩＬ−１３の効果をインビトロおよびインビボで強化し得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質（好ましくは、ＩＬ−１３）と合わされ得、そして得られる組み合わせを、ＩＬ−１３ｂｃ以外の、ＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖（好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの全ての鎖（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１））を発現する細胞と接触させ得る。好ましくは、接触工程は、治療有効量のこのような組み合わせを哺乳動物被験体にインビボで投与することによって行われる。ＩＬ−１３タンパク質とＩＬ−１３ｂｃタンパク質との予め樹立した会合は、適切なシグナル伝達に必要な完全なＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒ複合体の形成を助ける。例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１３５１（１９９５）に記載の方法を参照のこと。
【００５０】
細胞から精製されたかまたは組換え産生された、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質およびＩＬ−１３Ｒインヒビターは、薬学的に受容可能なキャリアと合わされた場合、薬学的組成物として用いられ得る。このような組成物は、ＩＬ−１３ｂｃまたはインヒビターおよびキャリアに加えて、当該分野で周知の種々の希釈剤、フィラー、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を含み得る。用語「薬学的に受容可能な」とは、活性成分の生物学的活性を有効性を妨害しない非中毒性の物質を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存する。
【００５１】
本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４．．．ＩＬ−２４、１Ｌ−２５）、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子およびエリスロポエチン）を含み得る。薬学的組成物はまた、抗サイトカイン抗体を含み得る。薬学的組成物はさらに、他の抗炎症剤を含み得る。このようなさらなる因子および／または薬剤は、薬学的組成物中に含まれて、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターとの相乗効果を生じ得るか、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターによって引き起こされる副作用を最小にし得る。逆に、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の処方物中に含まれて、このサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小にし得る。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、他の薬学的に受容可能なキャリアに加えて、水溶液中でミセル、不溶性単層、脂質結晶またはラメラ層のような凝集した形態で両親媒性薬剤（例えば、脂質存在する）と合わされている、リポソームの形態であり得る。リポソーム処方のために適切な脂質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、ホスホリピド、サポニン、胆汁酸など。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号（これらは全て本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、当該分野のレベルの範囲内である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、患者にとって意味のある利益（例えば、このような状態の症状の改善、治癒、または治癒速度の上昇）を示すに充分である、薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々の活性な成分に適用される場合、この用語は、その成分単独をいう。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせで投与されるか、逐次投与されるかまたは同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、活性成分の合わせた量をいう。
【００５４】
本発明の処置または使用の方法を実施する際に、治療有効量の単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、哺乳動物に投与される。単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、単独で、または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子を用いる処置）との組み合わせのいずれかで、本発明の方法に従って投与され得る。１以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子と同時投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子と同時に、または逐次にのいずれかで投与され得る。逐次で投与された場合、主治医は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊または抗血栓因子と組み合わせてＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与する適切な順序を決定する。
【００５５】
本発明の薬学的組成物において用いられるかまたは本発明の方法を実施するために用いられるＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの投与は、種々の従来の方法で、例えば、経口摂取、吸入、または皮膚注射、皮下注射もしくは静脈内注射において実施され得る。患者に対する静脈内投与が好ましい。
【００５６】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが経口投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物はさらに、固体キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。錠剤、カプセル剤および散剤は、約５％〜９５％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含み、好ましくは、約２５％〜９０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。液体形態で投与される場合、液体キャリア（例えば、水、石油、動物もしくは植物起源の油（例えば、ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油もしくはゴマ油）、または合成油）が添加され得る。液体形態の薬学的組成物はさらに、生理学的食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖の溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）を含み得る。液体形態で投与される場合、薬学的組成物は、約０．５重量％〜９０重量％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含み、好ましくは約１％〜５０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。
【００５７】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、発熱物質を含まない、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、張度（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）、安定性などに関する制限（ｄｕｅ）を有するこのような非経口的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、当該分野の技術範囲内である。静脈内注射、皮膚注射または皮下注射のために好ましい薬学的組成物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターに加えて、等張性ビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射剤（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リンゲル注射剤（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、デキストロース注射剤（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、乳酸加リンゲル注射剤（Ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、または当該分野で公知のような他のビヒクル）を含むべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤または当業者に公知の他の添加剤を含み得る。
【００５８】
本発明の薬学的組成物中のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量は、処置されるべき状態の性質および重篤度、ならびに患者が受けた以前の処置の性質に依存する。最終的に、主治医は、各個体患者を処置する、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量を決定する。最初に、主治医は、低用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与し、そして患者の応答を観察する。最適な治療効果がその患者について得られるまで、さらに多くの用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが投与され得、そしてその時点で、投薬量は一般にさらには増加されない。本発明の方法を実施するために用いられる種々の薬学的組成物が、１ｋｇ体重あたり、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約２０μｇ〜約５００μｇ）のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含むべきであることが意図される。
【００５９】
本発明の薬学的組成物を用いる静脈内治療の持続時間は、処置されるべき疾患の重篤度、ならびに各個体患者の状態および可能性のある特異体質応答に依存して変化する。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの各適用の持続時間が、１２時間〜２４時間の範囲の連続静脈内投与であることが意図される。最終的に、主治医は、本発明の薬学的組成物を用いた静脈内治療の適切な持続時間を決定する。
【００６０】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた用いて動物を免疫して、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質と特異的に反応しかつそのレセプターに対するＩＬ−１３またはそれらのフラグメントの結合を阻害し得る、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を入手し得る。このような抗体は、ＩＬ−１３ｂｃ全体を免疫原として用いて、またはＬ−１３ｂｃのフラグメント（例えば、可溶性成熟ＩＬ−１３ｂｃ）を用いることによって入手され得る。ＩＬ−１３ｂｃのより小さなフラグメントをまた用いて、動物を免疫し得る。ペプチド免疫原はさらに、システイン残基をカルボキシル末端に含み得、そしてハプテン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合体化される。さらなるペプチド免疫原は、チロシン残基を硫酸化チロシン残基で置換することによって作製され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｒ．Ｐ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９−２１５４（１９６３）；Ｊ．Ｌ．Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１１，１０ （１９８７）においてように、当該分野で公知である。
【００６１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質に結合する、中和抗体または非中和抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）もまた、特定の腫瘍について、そしてまた上記の状態の処置において有用な治療剤であり得る。これらの中和モノクローナル抗体は、ＩＬ−１３ｂｃに対するＩＬ−１３の結合をブロックし得る。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（ＩＬ−１３ｂｃ ｃＤＮＡの単離）
（マウスＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺から調製した。二本鎖のヘミメチル化ｃＤＮＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｃＤＮＡ合成キットを製造業者の説明書に従って用いて調製した。手短に述べると、第１鎖を、オリゴｄＴ−Ｘｈｏプライマーを用いてプライム（ｐｒｉｍｅ）し、そして第２鎖合成の後、ＥｃｏＲＩアダプターを添加し、そしてｃＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、そして精製した。ｃＤＮＡを、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）λベクターのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結し、そしてＧｉｇａｐａｋ ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の説明書に従って用いてパッケージングした。１．５×１０6の得られた組換えファージのライブラリーを、製造業者の説明書に従って増幅した。このライブラリーを、配列ＫＳＲＣＴＣＣＡＢＫ ＣＲＣＴＣＣＡ（配列番号５）（Ｋ＝Ｇ＋Ｔ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｒ＝Ａ＋Ｇ；Ｂ＝Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）の縮重１７マーオリゴヌクレオチドプローブを用い、記載された（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５、６．４．３節）通りの標準的なＴＭＡＣハイブリダイゼーション条件を用いてスクリーニングした。クローンＡ２５が同定された。なぜなら、クローンＡ２５はこの１７マープローブにハイブリダイズするが、公知の造血素レセプター由来のプローブにはハイブリダイズしないからである。このクローンを、製造業者の説明書に従ってＺａｐＥｘｐｒｅｓｓベクターからプラスミド形態で単離し、そしてＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡ配列は、造血素レセプターファミリーの新規なメンバーをコードしていた。
【００６３】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含むクローンＡ２５を１９９６年２月２２日に受託番号６９９９７でｐＡ２５ｐＢＫＣＭＶとしてＡＴＣＣに寄託した。
【００６４】
（ヒトＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
マウスレセプターのヒトホモログの部分的フラグメントを、マウス配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たヒト精巣ポリＡ＋ＲＮＡから調製した。２７４塩基対のＤＮＡフラグメントを、３０サイクルのインキュベーション（９４℃×１分間、４２℃にて１分間および７２℃にて１分間）について１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む１×Ｔａｑ緩衝液中で、以下のオリゴヌクレオチドを用い、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲによってこのｃＤＮＡから増幅した：ＡＴＡＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号６）およびＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣ（配列番号７）。このフラグメントのＤＮＡ配列を決定し、そして２つのオリゴヌクレオチドを、以下の配列を用いてこのフラグメントの内部部分から調製した：ＡＧＴＣＴＡＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＣＧ（配列番号８）およびＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣ（配列番号９）。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（カタログ番号ＨＬ１１６１）から購入したヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。フィルターを、標準的な５×ＳＳＣハイブリダイゼーション条件を用いて５２℃にてハイブリダイズし、そして２×ＳＳＣ中で５２℃にて洗浄した。４００，０００クローンのスクリーニングにおいて両方のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする２２個のクローンを単離した。これらのｃＤＮＡクローンのうちの４つのＤＮＡ配列を決定し、そして全てが同じ新規な造血素レセプターをコードしていた。全長ヒトレセプター鎖の推定されるＤＮＡ配列を配列番号３として示す。
【００６５】
このヒトクローンを、１９９６年２月２２日に受託番号６９９９８でｐｈＡ２５＃１１ｐＤＲ２としてＡＴＣＣに寄託した。
【００６６】
（実施例２）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現および活性のアッセイ）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの産生および精製）
マウスＩＬ−１３ｂｃの細胞外ドメインのアミノ酸１〜３３１をコードするＤＮＡを、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙをコードするスペーサー配列にＰＣＲによって融合し、そしてＣＯＳ−１発現ベクターｐＥＤ．ＦｃのヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２ ＣＨ３領域をコードする配列とインフレームで連結した。ＩＬ−１３ｂｃ−ＩｇをＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクトＣＯＳ−１細胞から産生し、そしてプロテインＡセファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製した。
【００６７】
（Ｂ９増殖アッセイ）
ＩＬ−１３またはＩＬ−４に応じたＢ９細胞（Ａａｒｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７．１７：１４１１−１４１６）の増殖刺激を、ＤＮＡ中への３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。細胞（５×１０3／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの存在下または非存在下で種々の濃度の増殖因子を含む培地を有する９６ウェルプレートに播種した。３日間のインキュベーション後、１ｕＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加し、そして細胞をさらに４時間インキュベートした。取り込まれた放射能を、ＬＫＢ １２０５ Ｐｌａｔｅリーダーを用いて決定した。
【００６８】
Ｂ９細胞株は、ＩＬ−１３、ＩＬ−４またはＩＬ−６に応じて増殖した。ＩＬ−１３に対する応答のみが、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇによって阻害された。このことは、このレセプターがＩＬ−１３に特異的に結合するが、ＩＬ−４にもＩＬ−６にも結合しないことを示す。この表はｃｐｍを示す。２つの別個の実験を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
（実施例３）
（表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）によって測定した、ＩＬ−１３に対する可溶性ＩＬ−１３ｂｃの直接結合）
Ｂｉａｃｏｒｅのバイオセンサーを用いて、精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、１９９１）に対するＩＬ−１３の特異的結合を直接測定した。約１０，０００〜１７，０００の共鳴単位（ＲＵ）の精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ、ヒトＩｇＧ１または無関係のレセプターを各々、製造業者によって推奨されるようにセンサーチップ上の異なるフローセルに共有結合によって固定した。（ＲＵは、センサーチップ表面に結合したタンパク質の質量を反映するもの（ｒｅｆｅｌｃｔｉｏｎ）である。）精製されたＩＬ−１３を、過剰の精製ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの存在下または非存在下で１０分間にわたって５μｌ／分でフローセルと交差して注入した。結合を、サンプル注入の前と後とのＲＵの差として定量した。４８１．９ＲＵの特異的ＩＬ−１３結合は、固定化ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇについてのみ観察され、一方、ＩＬ−１３＋ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの結合体化は、固定化ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇに対する結合がないことをもたらした（４ＲＵ）。ＩＬ−１３結合は、固定化ＩｇＧまたはＩＬ−１１Ｒ−Ｉｇのいずれについても観察されなかった（それぞれ、５．４ＲＵおよび３．７ＲＵ）。
【００７１】
【表３】
（実施例４）
（標識ＩＬ−１３ＢＣ−Ｉｇ融合タンパク質に対する、ＣＯＳ細胞中で発現されたＩＬ−１３の結合：ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを用いたＩＬ−１３のＣＯＳインサイチュ検出）
ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１についての発現ベクターまたは空のベクターを、ＤＥＡＥ−デキストラン方法によって二連のプレート中のＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして４℃にてメタノールで１０分間、培養ディッシュ中で固定した。固定後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで結合緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）で１回リンスし、そして１．０ｕｇ／ｍｌでＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを有するか関連する抗サイトカイン抗血清を有する結合緩衝液中で４℃で２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして結合緩衝液中に５００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ウサギＦ（ａｂ）２’抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ融合体検出のため）またはウサギＦ（ａｂ）２’抗ラットＩｇＧ（抗サイトカイン検出のため）中で振盪しながら４℃でインキュベートした。細胞をさらに、ＰＢＳ中で２回洗浄した。アルカリホスファターゼ活性を、ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートを用いて可視化した。
【００７２】
特異的結合を、顕微鏡下で可視化した。ＩＬ−１３でトランスフェクトした細胞のみが、ＩＬ１３ｂｃ−Ｉｇに対する特異的結合を示した（図面の、トランスフェクトした細胞の写真を参照のこと）。
【００７３】
（実施例５）
（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の生物学的活性を決定するための他の系）
他の系を用いて、特定のＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書中で定義される通りのＩＬ−１３ｂｃの「生物学的活性」を示すか否かをを決定し得る。以下は、このような系の例である。
【００７４】
（ＩＬ−１３結合についてのアッセイ）
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質がＩＬ−１３またはそのフラグメントを結合する能力は、このような結合を検出し得る任意の適切なアッセイによって決定され得る。いくつかの適切な例が以下に続く。
【００７５】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の細胞外領域に対するＩＬ−１３の結合は、レセプタータンパク質に対するホスホチロシンの迅速な誘導を特異的に引き起こす。リン酸化の誘導によって測定した場合のリガンド結合活性についてのアッセイを以下に記載する。
【００７６】
あるいは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（例えば、細胞外ドメインの可溶性形態など）を産生し、そしてこれを用いてＩＬ−１３結合を検出する。例えば、細胞外ドメイン（推定される膜貫通ドメインの前で、好ましくは、直前で短縮化される）が、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）γ１のヒンジＣH２ドメインおよびＣH３ドメインをコードするｃＤＮＡにインフレームで連結されたＤＮＡ構築物を調製する。この構築物は、ＣＯＳ細胞について適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＤΔＣまたはｐＭＴ２）中で作製される。このプラスミドは、ＣＯＳ細胞中に一時的にトランスフェクトされる。分泌されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質は、馴化培地中で回収され、そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって精製される。
【００７７】
精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、多数の適用においてＩＬ−１３結合を実証する。ＩＬ−１３を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレートの表面上にコーティングし得、次いで、さらなる結合部位を、標準的なＥＬＩＳＡ緩衝液を用いてウシ血清アルブミンまたはカゼインでブロックし得る。次いで、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を固相ＩＬ−１３に結合させ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化された二次ヤギ抗ヒトＩｇを用いて結合を検出する。特異的に結合した酵素の活性は、比色基質（例えば、テトラメチルベンジジン）および吸光度の読み取りを用いて測定され得る。
【００７８】
ＩＬ−１３はまた、例えば、膜貫通ドメインまたはグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を提供することによって細胞表面に発現され得る。膜に結合したＩＬ−１３を発現する細胞は、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて同定され得る。可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合体はこれらの細胞の表面に結合し、そして蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇおよびフローサイトメトリーを用いて検出される。
【００７９】
（相互作用捕捉）
酵母の遺伝的選択方法である「相互作用捕捉（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ）」［Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３，１９９３］を用いて、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書中で定義したとおりのＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するか否かを決定し得る。この系では、ＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺの両方からのレポーター遺伝子の発現は、ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質（例えば、この場合、ヒトＩＬ−１３ｂｃと相互作用する種）と、プレイ（ｐｒｅｙ）（例えば、この場合、ヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質）との間の相互作用に依存する。従って、Ｌｅｕ２発現またはＬａｃＺ発現のレベルによって相互作用の強さを測定し得る。最も単純な方法は、ＬａｃＺコードタンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの活性を測定することである。この活性は、Ｘ−Ｇａｌ含有培地またはフィルター上の青色の程度によって判断され得る。β−ガラクトシダーゼ活性の定量的測定について、標準的なアッセイは、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．、Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．による）に見出され得る。
【００８０】
このような方法では、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が特定の種（例えば、ＩＬ−１３ｂｃの細胞内ドメインとインビボで結合する細胞質ゾルタンパク質など）と相互作用するか否かを決定しようとする場合、その種は、相互作用捕捉において「ベイト」として用いられ得、試験されるべきＩＬ−１３ｂｃタンパク質は「プレイ」として供給され得るか、またはその逆であり得る。
【００８１】
（実施例６）
（可溶性ＩＬ−１３Ｒを用いた線維症の阻害）
線維性組織の発達は、損傷後の治癒の正常なプロセスの一部である。それにもかかわらず、いくつかの状況では、罹患組織の正常な機能を妨害する、過剰のコラーゲンの破壊的蓄積が存在する。実際、コラーゲン合成およびおよび組織瘢痕形成（ｔｉｓｓｕｅ ｓｃａｒｉｎｇ）は、いくつかの自己免疫、アレルギー性疾患および感染性疾患を含めた多数の慢性および消耗性の病気の主な病理学的症状発現である1-7。瘢痕組織形成のプロセスに関する機構のたくさんの情報が存在する8、9が、線維性プロセスの開始における炎症細胞およびサイトカインの役割の理解にはなお大きな隔たりが存在する。
【００８２】
本明細書中で使用される場合「線維症」は、線維性組織の形成を含む任意の状態を含む（このような形成が望ましいか望ましくないかにかかわらず）。このような状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結合組織炎、線維腫の形成（線維腫症）、線維形成（肺の線維形成を含む）、線維弾性症（心内膜線維弾性症を含む）、線維筋症の形成、線維性剛直症、類線維の形成、線維線腫の形成、線維粘液腫の形成および線維膀胱炎（ｆｉｂｒｏｃｙｓｔｏｔｉｔｉｓ）（嚢胞性線維症を含む）。
【００８３】
ＩＬ−１３レセプター複合体は、ＩＬ−４レセプター、低親和性結合性ＩＬ−１３Ｒα１鎖、および高親和性結合性鎖ＩＬ−１３Ｒα２を含む、少なくとも３つの別個の成分から構成される35、42〜44。近年、可溶性ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ融合タンパク質が調製され、そしてこれを用いてＩＬ−１３をインビトロ35およびインビボ30、39〜41の両方で好首尾に中和した。この融合タンパク質はＩＬ−１３に高親和性で結合するが、ＩＬ−４を中和することができないので、このタンパク質は、ＩＬ−１３の特異的役割を決定するための優れたツールを提供した。本研究では、本発明者らは、野生型マウスおよびＩＬ−４欠損マウスにおいてＩＬ−１３アンタゴニストを用いて、マウス住血吸虫症における肝臓線維症の発症に対するＩＬ−１３の寄与とＩＬ−４の寄与とを分離した。これらの研究では、肉芽腫形成を詳細に試験し、好酸球および肥満細胞の補充に焦点を当て、そしてより重要なことには、卵誘発性線維症の発症を、生化学的技術、組織学的技術および分子技術を用いて定量した。本発明者らはまた、Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカイン応答の調節に対するＩＬ−４およびＩＬ−１３の寄与を、腸間膜リンパ節培養物においてインビトロで、そして肉芽腫性肝臓においてインビボでの両方で調べた。この研究からの結果は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が住血吸虫症の病因においていくつかの重複した活性を示すことを示す一方、両方のサイトカインについての別個の機能もまた明確に解明された。おそらく、最も重要かつ新規な知見は、ＩＬ−１３が、感染したマウスにおけるＩ型およびＩＩＩ型のコラーゲンｍＲＮＡ産生および肝臓線維症を駆動する主要なＴｈ２型サイトカインであり、そしてＩＬ−４はそうでないという、観察であった。従って、本発明者らの知見は、ＩＬ−１３インヒビター／アンタゴニスト（例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）が、線維症（例えば、慢性感染性疾患に関連した線維症など）を予防する際に治療的に有益なものであり得ることを確立する。
【００８４】
（結果）
（住血吸虫症病因における、ＩＬ−４、ＩＬ−１３またはＩＬ−４／ＩＬ−１３二重欠損の匹敵する効果：ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置は、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ感染マウスにおける肝臓線維症を有意に減少させる）
住血吸虫症の病因におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の調節の役割を比較するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスを２５のＳ．ｍａｎｓｏｎｉ ｃｅｒｃａｒｉａｅに経皮的に感染させた。別個の群の動物を、「材料および方法」に記載されるように、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃまたはコントロール−Ｆｃのいずれかで処置した。処置を産卵開始時である５週目に始め、そして全ての動物を感染８週後に屠殺し、そしていくつかの寄生生物学的および免疫学的パラメーターについて調べた。表ＩＩＩに示すように、４群のマウスは全て、類似した寄生生物負荷を宿しており、そして１対の寄生生物あたりに産生される組織卵は群の間でそれほど異ならなかった。ピーク組織応答の時点である45感染８週間後に、ＷＴマウスは、ＩＬ−１３遮断の結果として、肉芽腫の大きさにおける有意な変化を示さなかった（図２Ａ）。興味深いことに、コントロール−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスはまた、減少した肉芽腫性応答を示すことができず、そして実際に、肉芽腫はこれらのマウスにおいて有意に大きかった。これらの観察とは著しく対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、ＩＬ−１３が阻害された場合著しく減少した肉芽腫性応答を提示した（図２Ａ、一番右）。実際、ＩＬ−４二重欠損／ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスは、コントロールまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴ動物のいずれもと比較した場合、肉芽腫容量における平均４０％〜５０％の減少を提示し、そしてコントロール−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスと比較した場合、７５％を超える減少を提示した。
【００８５】
病巣の細胞組成をまた、ギムザ染色した肝臓切片において評価し、そして表ＩＩＩに示すように、ＩＬ−４欠損マウスは、肉芽腫関連肥満細胞の顕著な減少を提示した。対照的に、ＩＬ−１３阻害単独によって肥満細胞数に変化はなく、そしてＩＬ−１３遮断は、ＩＬ−４欠損マウスにおける既に高度に減少した数の肥満細胞に対して付加的な効果を有さなかった。いくぶん同様に、肉芽腫関連好酸球を評価した場合、なお別個の知見が観察された（図２Ｂ）。ここで、好酸球の数は、ＩＬ−１３遮断によってＷＴマウスにおいて４６％から６４％へと増加し、そしてＩＬ−４欠損の結果として有意に減少した（２８％）。組織好酸球増加症におけるＩＬ−１３およびＩＬ−４についての明らかに対照的な役割にもかかわらず、ＩＬ−４欠損マウスをＩＬ−１３インヒビターで処置した場合、なおさらに著しい、合わされた阻害効果が観察された。これらのマウスでは、肉芽腫好酸球の平均数は１０％未満であった。最後に、ＷＴ動物対ＩＬ−４欠損動物において実質関連肝臓壊死の程度でも卵関連肝臓壊死の程度でも変化は存在しなかったが、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴ群およびＩＬ−４欠損群の両方は、実質壊死全体においては顕著な減少を示した。
【００８６】
おそらく最も重要なことに、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置は単独で、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）で染色した組織切片において評価した場合、ＷＴマウスにおける肝臓肉芽腫のコラーゲン含有量を有意に減少させた（表ＩＩＩおよび図３）。対照的に、感染させたＩＬ−４欠損マウスは、顕微鏡分析によって、肉芽腫コラーゲン沈着において検出可能な変化を示さなかった。興味深いことに、このパラメーターにおいて、ＩＬ−１３およびＩＬ−４について合わされた役割も相乗的な役割も存在しないようであった。なぜなら、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスとｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスとの間に有意な差が存在しなかったからである（表ＩＩＩ）。図３は、類似の寄生生物数、組織卵負荷、および肉芽腫の大きさがコントロールおよびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて見出されたとはいえ、ＩＬ−１３の遮断は、肝臓内のコラーゲン沈着に対してかなりの阻害効果を有したことを示す。最後に、肝臓線維症の程度をまた、ヒドロキシプロリンレベルの評価によって測定した（図２Ｃ）。ヒドロキシプロリンレベルは、上記の組織学的技術よりも定量的である。可溶性ＩＬ−１３アンタゴニストは単独で、肝臓のヒドロキシプロリンレベルを顕著に減少させ、一方、ＩＬ−４欠損は、それほど有意でない減少をもたらした。ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重欠損は、ヒドロキシプロリンをｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて既に観察されたレベルより低く減少させることができなかったが（図２Ｃ）、第２の研究においてわずかな傾向が存在した（有意ではない）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−１３が、マウス住血吸虫症における肝臓線維症の発達を担う主なＴｈ２関連サイトカインであることを実証する。
【００８７】
（Ｔｈ２型サイトカイン産生は、ＩＬ−４欠損マウスにおいて減少するが、ＩＬ−１３阻害による影響を受けない）
ＩＬ−４はＣＤ４+Ｔｈ２細胞発達を駆動する主なサイトカインであることが周知である21、22が、Ｔｈ２型応答の生成および維持におけるＩＬ−１３の役割は、議論の余地があり、そして研究されている宿主の遺伝および感染性疾患モデルの両方によって影響を受け得る30、34、38。それゆえ、肝臓病理におけるｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ誘導性変化がＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインバランスにおける変化によって生じたか否かを決定するために、本発明者らは、腸間膜リンパ節および脾臓を、感染させたマウスから単離し、単細胞懸濁物を調製し、そしてこの培養物を寄生生物抗原でインビトロで再刺激した。さらなる細胞培養物を、抗ＣＤ４ ｍＡｂの存在下で寄生生物抗原に曝露して、サイトカイン産生がＣＤ４+Ｔ細胞応答に依存性であるか否かを決定した。培養上清を、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによって分析した。予測され得るように15、ＷＴマウスから調製された腸間膜培養物（図５）および脾臓培養物（データは示さず）は、非常に偏ったＴｈ２型サイトカイン応答を提示した。これらは、ＳＥＡ刺激に応じて高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生し、そしてＩＦＮ−γをほとんどまたは全く産生しなかった。対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、より混ざったＴｈ１／Ｔｈ２型プロフィールを示した。実際、有意なＳＥＡ特異的ＩＦＮ−γ応答がＩＬ−４欠損マウスにおいて検出された。これは、以前の研究23、24と一致する。ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、そしてより低い程度でＩＬ−５もまた、これらの動物において検出され、一方、これらのサイトカインのレベルは、ＷＴマウスと比較した場合、顕著に減少した。重要なことに、低いがしかし有意なＩＬ−４依存性ＩＬ−１３応答の維持が、ＩＬ−４の非存在下で維持される著しい肉芽腫性応答を説明するようである（図２）。驚くべきことに、肝臓線維症に対するその顕著な阻害効果にもかかわらず、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃは、ＷＴマウスまたはＩＬ−４欠損マウスのいずれでも、Ｔｈ１型サイトカイン応答にもＴｈ２型サイトカイン応答にも有意な影響を有さなかった。全ての場合、サイトカイン産生がＣＤ４+Ｔ細胞応答に非常に依存していたことにもまた留意すべきである。なぜなら、抗ＣＤ４ ｍＡｂ処置ＳＥＡ刺激培養物のいずれにおいてもサイトカイン発現がほとんどまたは全く検出されなかったからである。
【００８８】
（ＩＬ−４欠損およびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスの肉芽腫性肝臓におけるＴｈ１／Ｔｈ２型サイトカインｍＲＮＡ発現の変化）
類似のパターンのサイトカイン発現が、肉芽腫形成部位でインビボで観察されるか否かを決定するために、本発明者らは、感染８週間後に種々の群のマウスから肝臓ｍＲＮＡを単離し、そして定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。図５に示すように、感染したＷＴマウスは、強力なＴｈ２型サイトカインｍＲＮＡプロフィールを示した。これは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−１０のｍＲＮＡにおける顕著な増加を示す。ＷＴマウスはまた、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現における中程度の増加を示した。これは、以前の観察19と一致した。これらの知見とは対照的に、ＩＬ−１３およびＩＬ−５のｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−４欠損マウスにおいてずっと低く、一方、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡは有意に増加し、そしてＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現は変化しなかった。さらに、腸間膜リンパ節培養物および脾細胞培養物から得られたインビトロでの結果と同様に、ＩＬ−１３遮断は、ＷＴマウスまたはＩＬ−４欠損マウスのいずれにもサイトカインｍＲＮＡ発現に対して有意な影響を有さなかった。しかし、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処置したＩＬ−４欠損マウスにおけるＩＬ−１０ ｍＲＮＡレベルには中程度の増加が存在したが、これは、線維症における減少を説明しないようである。なぜなら、ＩＬ−４欠損マウスと比較して非常に多様なレベルのＩＬ−１０がｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて検出され、依然として線維症における類似の減少が観察されたからである。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ｂのｍＲＮＡ発現をまた、肉芽腫性組織において調べたが、感染したＩＬ−４欠損マウスでもｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処置した動物でも有意差は観察されなかった（データは示さず）。
【００８９】
（コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡレベルは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスの肝臓において減少するが、ＩＬ−４欠損によっては影響を受けない）
上記のインビトロおよびインビボでのサイトカイン研究は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの抗線維症効果が、Ｔｈ１型またはＴｈ２型のサイトカイン発現における変化によって説明されないようであることを示唆した。それゆえ、その後の実験では、本発明者らは、コラーゲンＩ（Ｃｏｌ Ｉ）およびコラーゲンＩＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩＩ）のｍＲＮＡ発現パターンを調査して、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ誘導性の線維症減少が、これらの２つの重要なコラーゲン産生遺伝子19における発現における直接変化を伴うか否かを決定した。図６に示すように、ＩＬ−１３遮断は、Ｃｏｌ ＩおよびＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡ発現をＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスの両方で有意に減少させた。ＩＬ−４欠損マウスにおいてＣｏｌ ＩまたはＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡの感染誘導レベルにおける変化は存在せず、そしてｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスと比較した場合、同様に処置したＩＬ−４欠損マウスにおいてさらなる減少は存在しなかった。
【００９０】
（ＩＬ−１３は、マウス３Ｔ３線維芽細胞におけるコラーゲン産生を刺激する）
ＩＬ−１３遮断が、感染させたＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスの肝臓におけるＣｏｌ ＩおよびＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡ発現をインビボで有意に減少させることを示したので、本発明者らは、ＩＬ−１３が線維芽細胞におけるコラーゲン合成を直接刺激するか否かを決定しようとした。この問題に答えるために、本発明者らは、マウス３Ｔ３線維芽細胞におけるＩ型コラーゲンの誘導を、ウェスタンブロッティングによって調べた。図７に示すように、ＩＬ−１３は、刺激の４８時間後にコラーゲン合成を誘導した。最小のＩ型コラーゲンが、未刺激の細胞において検出された（図７、レーン１）かまたはサイトカイン活性化培養物において、より早期の時点で検出された（データは示さず）。ＩＬ−４はまた、コラーゲンＩ合成を誘導し（レーン２）、そして高レベルの分泌コラーゲンが、サイトカインで刺激した両方の培養物において得られた上清において容易に検出可能であった（データは示さず）。反応の特異性を、精製したＩ型コラーゲンを用いて確認し（レーン５）、そして細菌のコラゲナーゼ処置は、抗体がコラーゲンについて特異的であることを示した（データは示さず）。
【００９１】
（考察）
ＣＤ４+Ｔｈ２型サイトカインパターンは、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉで感染されたマウスにおける免疫応答を支配する12、13。しかし、ＩＬ−４欠損マウスを用いた以前のＩＬ−４除去の研究および実験は、住血吸虫症の病因におけるこのサイトカインの不可欠な役割を示すことができなかった15、23、24。実際は、線維症における部分的な減少がいくつかの研究で観察されたが15、卵細胞（ｅｇｇ）誘導肉芽腫形成は、ＩＬ−４が完全に無い中で進行し得た23、24。これらの知見と対照的に、肝線維症の肉芽腫形成および発達は、Ｓｔａｔ６欠損マウスにおいて厳しく損傷しており16、これは、いくつかのＴｈ２関連サイトカインの産生における主要な欠損を示した46。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は両方ともＳｔａｔ６を介してシグナル伝達し、従って、感染されたＩＬ−４欠損マウスとＳｔａｒ６欠損マウスとの間に観察される明らかな病理の差違は、ＩＬ−１３によって説明され得る。それにもかかわらず、疾患進行におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の異なる寄与は、Ｓｔａｔ６欠損マウスまたはＩＬ−４欠損マウスの単独研究からは認められ得なかった。本研究において、本発明者らは、感染されたＷＴおよびＩＬ−４欠損マウスにＩＬ−１３の強力なインヒビターを使用し、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が重複することならびに住血吸血病の病因における独特の役割を示すことを証明する。
【００９２】
いくつかの研究により、Ｔｈ２型サイトカイン応答が、ＩＬ−４またはＩＬ−４レセプターの非存在下においてインビボで発達し得ることが示された26、39。これは、本発明者らの知見と一致する。なぜなら、減少されたが有意なＩＬ−１３、ＩＬ−１０およびＩＬ−５発現が、感染されたＩＬ−４欠損マウスの腸間膜リンパ節（図４）および肝臓（図５）に検出されたからである。これらの産生はまた、ＣＤ４+Ｔ細胞応答に非常に依存し（図４）、これはさらに、従来のＴｈ２型応答が確立されたことを示す。これらの知見によって、最大のＩＬ−１３発現はＩＬ−４に依存するが、連続性のＩＬ−１３の産生がＩＬ−４の非存在下での有意な肉芽腫性応答の維持を説明し得るという証拠が提供される23-25。確かに、ＩＬ−１３単独の阻害はＷＴマウスの肉芽腫の大きさに影響を与えなかったが、ＩＬ−４欠損マウスにおいて残りのＩＬ−１３を阻害することは、肉芽腫体積に顕著かつ非常に有意な減少を生じた（図２Ａ）。これらの知見により、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方は肉芽腫発達を媒介するのに十分であることが示され、ＩＬ−４欠損マウスにおける肉芽腫の産生対Ｓｔａｔ６欠損マウスにおける肉芽腫のほとんど完全な欠失が形式的に説明される16、24。これらはまた、肺性卵細胞肉芽腫モデルにおける近年の知見を支持する30。なぜなら、肉芽腫は、卵細胞によって放出される強力に致死の肝臓毒素を遮ることによって重要な宿主保護的役割に貢献し47、この宿主が、好ましい宿主−寄生虫関係を保証するために、肉芽腫形成に対して重複した機構を発展し得るからである。
【００９３】
これらの知見によって、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が、肉芽腫形成に活動的に関与することが明確に示されたが、肥満細胞リクルートメント、組織好酸球増加症、および最も重要には肝線維症の生成における両方のサイトカインの特有の役割がこれらの研究で明らかになった。感染されたマウス由来の肝臓切片の組織学的試験によって、ＩＬ−１３が肥満細胞（表ＩＩＩ）または好酸球（図２Ｂ）分化およびリクルートメントに必要ではないことが示された。なぜなら、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理されたＷＴマウスの肉芽腫が、いずれの細胞型においても減少を示さなかったからである。実際、好酸球数は、ＩＬ−１３阻害されたＷＴマウスの病巣において有意に増加し（図２Ｂ）、これは、ＩＬ−１３がこの効果を部分的にアンタゴナイズし得ることを示唆する。対照的に、肥満細胞は、ＩＬ−４欠損マウス中の病巣でほとんど完全に存在せず、そして好酸球は、５０％以上減少されていた。興味深いことに、ＩＬ−１３は、ＩＬ−４欠損マウスにおいて、減少されたが有意な卵細胞誘導の組織好酸球増加症を部分的に支持しているようである。なぜなら、好酸球は、ＩＬ−４−欠損／ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置動物において１０％より下に減少されたからである。それにもかかわらず、これらのデータは、ＩＬ−４が肉芽腫内の好酸球および肥満細胞集団の発達の原因である優性サイトカインであることを示す。
【００９４】
おそらく、本研究からの最も重要な進歩は、肝線維症がｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃによってブロックされ得るという知見であった。確かに、顕微鏡技術（表ＩＩＩ）、生化学的技術（図２Ｃ）および分子技術（図６）は全て、ＩＬ−４ではなくＩＬ−１３が、卵細胞誘導肝線維症の発達に主要な役割を果たしていることを示した。以前の研究により、Ｔｈｌ／Ｔｈ２サイトカインのバランスが、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ感染されたマウスにおけるの組織線維症の程度に有意に影響を与え得ることが示された19。それにもかかわらず、本研究は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの効果が、Ｔｈ細胞サイトカイン応答の傾斜を介して媒介されないことを示唆する。ＩＬ−１３の阻害は、インビトロで腸間膜リンパ節（図４）または脾細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３の産生に有意な効果を示さなかった。そしてまた、病巣形成の部位において、インビボでサイトカインのｍＲＮＡ発現に変化は存在しなかった（図５）。これらの知見と対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、流入領域リンパ節において増加したＩＦＮ−γ応答（図４）を示し、そしてリンパ節（図４）および肝臓（図５）の両方において減少したＩＬ−５発現およびＩＬ−１３発現を示した。従って、ヒドロキシプロリン分析によってＩＬ−４欠損マウスで検出された線維症におけるわずかな減少（図２Ｃ）は、減少したＩＬ−１３産生に起因し得る。ＩＬ−４産生がＩＬ−１３封鎖によって影響されず、線維症がさらにこれらの動物において最大に減少されたという事実は、ＩＬ−１３によって果たされる重要な役割を強調する。実際、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスは、同様に処置されたＷＴマウスでの観察に対して、ヒドロキシプロリンレベルにほとんどさらなる減少を示さず（図２Ｃ）、かつコラーゲンＩまたはＩＩＩのｍＲＮＡ発現における差違も示されなかった（図６）。コントロール−Ｆｃ−処置ＩＬ−４−欠損マウスにおけるコラーゲンＩまたはＩＩＩ発現にも、ＷＴ動物と比較した場合、変化はなく、さらにＩＬ−４の寄与に重視をしない。さらに、３Ｔ３細胞を用いたインビトロ研究により、初めて線維芽細胞におけるコラーゲン産生を刺激するためのＩＬ−１３の能力が示された（図７）。従って、線維症に対するＩＬ−１３の効果は、より直接的であり得、そしてＴｈｌ／Ｔｈ２サイトカイン応答における調節に依存しない。この結論を支持して、近年の研究により、ＩＬ−１３レセプターが線維芽細胞上で発現され32、そしてＩＬ−１３はヒト肺線維芽細胞で接着分子および炎症性サイトカインの発現を増加することが示された48。最後に、ＩＬ−１３（図７）およびＩＬ−４49は両方とも、線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進し得るが、培養されたリンパ節細胞がＩＬ−４よりも、１００倍近く多いＩＬ−１３を産生したという事実は（図４）、このプロセスにおけるＩＬ−１３の強力に重要な寄与を強調するためのみに提供される。確かに、肺性肉芽腫モデルにおける研究は、ＩＬ−４ ｍＲＮＡ発現は病巣形成部位でよりきつく調節され、一方、ＩＬ−１３ ｍＲＮＡの誘導はより多くその間維持されることを明らかにした30。それにもかかわらず、本研究者らは、感染された動物におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現の運動を調べなかった。従って、本研究者らは、同様のパターンが肉芽腫性肝臓であてはまるか否かを言及することはできない。
【００９５】
ＩＬ−１３はまた、近年、腸の線虫に対する耐性に重要であることが示された27、37-39。ＩＬ−４欠損マウス39およびＩＬ−１３欠損マウス37、38における研究は、ＩＬ−４と対照的にＩＬ−１３がＮ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓおよびＴ．ｍｕｒｉｓの両方の排除において必須の役割を果たすことを示唆した。それにもかかわらず、寄生虫排除における特定の機構は未知のままである。しかし、上皮細胞中のＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導の変化および腸の生理が可能な標的として示唆されてきた50、51。ＩＬ−１３はまた、マウス喘息モデルにおいて中心的な役割を果たす。これらの研究において、ＩＬ−１３がアレルギー性喘息の発現に必要かつ十分であることが見いだされた40、41。上皮下線維症および気道平滑筋肥大は、慢性重篤喘息の共通の特徴であり5、そして慢性肺性線維症は、疾患の初期および後期段階におけるＩＩＩ型およびＩ型コラーゲンの産生とそれぞれ関連する。従って、本研究で明らかになったＩＬ−１３と線維症との間のつながりが、いくつかの重要なヒト疾患の病因を解明し、そしてより有効な線維症性疾患の処置の型を一般的に提供する。
【００９６】
本発明者らの以前の研究は、卵細胞特異的ＩＬ−１２誘導Ｔｈｌ記憶応答が、連続して感染されたマウスにおける肝線維症を効果的に減少し得ることを示した19。病理における減少は、正常なＴｈ２応答からＴｈｌ型サイトカインによる優性応答への変換を伴った。近年の研究からの知見により、このＩＬ−１２ベースのワクチン化プロトコールの抗病理効果が、ＩＬ−１３の阻害によって説明され得ることが示唆された。興味深いことに、異なるプロトコールを用いた第２の研究は、肉芽腫瘍形成のＴｈ２優性期の間に６〜８週間与えられたｒＩＬ−１２の反復注射が、肉芽腫形成および線維症の阻害にほとんど完全に効果的でなかったということを示した52。関連する研究は、ＩＬ−１２が、確立されたＴｈ２型応答をほとんど調節し得ないということを示唆し53、これは、後の研究において病理の調節の欠失を説明するようである52。これらの知見と対照的に、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃは、たとえ感染の後期段階の間のみに投与されたとしても、肝線維症の減少に非常に効果的であった。これらの知見は、ＩＬ−１３アンタゴニスト作用が、病原性Ｔｈ２型免疫応答が既に確立された状況における線維症の検証に、より十分に効果的な治療手段であることを示唆する。要約すると、本発明者らの知見は、ＩＬ−１３インヒビター（例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）が、慢性感染性疾患と関連する線維症の予防における一般的な治療的利点のインヒビターである証拠を提供し、そして住血吸血病の病因におけるＩＬ−１３の重要かつ希少な役割を示す。
【００９７】
（方法）
（動物、寄生虫およびＡｇ調製物）
６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＬ−４欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景、１０代戻し交配）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得た。全てのマウスは、研究動物の取り扱いの認定に関するＮＩＨ米国協会が承認した動物施設で、滅菌したフィルタートップのケージ中で飼育し、そして滅菌水で維持した。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉのＰｕｅｒｔｏ Ｒｉｃａｎ種のケルカリア（ＮＭＲＩ）は、感染させたＢｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｇｌａｂｒａｔａ巻貝から得た（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。可溶性卵細胞抗原（ＳＥＡ）は、以前に記載されるように15、ホモジナイズした卵細胞から精製した。
【００９８】
（試薬）
可溶性ＩＬ−１３レセプターα２−Ｆｃ融合タンパク質（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）は、以前に記載されるように調製され35、そしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ．によって提供された。内毒素混入は、Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＬＡＬアッセイ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，ＭＡ）によって測定された場合＜２ＥＵ／ｍｇであった。Ｂ９増殖アッセイにおいて３ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１３を中和する能力によって決定された場合、インビトロＩＤ５０は、約１０ｎｇ／ｍｌであった。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃに対するコントロールとして使用されたヒトＩｇＧ（コントロール−Ｆｃ）は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃに関して記載されるように35、組換えプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーによってアフィニティー精製された。以前に記載されたように、コントロール−Ｆｃは、感染されたマウスにおける病理学またはサイトカイン発現に検出可能な効果を有さなかった30。
【００９９】
（感染および処置）
マウスは、２０と２５との間のケルカリアを含む水の中で、尾の皮膚に４０分間経皮チャレンジをすることによって感染させた。動物は、卵細胞産生が発症した後（第５週）１日おきに、０．５ｍｌ ＰＢＳ中、ヒトコントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃのいずれかを用い腹腔することによって処置した。インビボ使用のための最適な濃度（２００μｇ／マウス／日）は、動力学的アッセイおよび感作／静脈内卵細胞注射されたマウスにおける用量応答実験に基づいて選択した30。血清は、屠殺した日にマウスから収集した。全ての動物は、第８週にフェノバルビタールナトリウムの腹腔内投与（１８ｍｇ／マウス、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって屠殺し、そしてクエン酸生理食塩水を用いて灌流し、寄生虫負荷を評価した15。処置されたいずれの群においても死亡は観察されなかった。
【０１００】
（組織病理学および線維症測定）
肉芽腫の測定に関して、肝臓の約半分をＢｏｕｉｎ−Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液を用い、そして以前に記載されたように15進めて固定した。肝肉芽腫の大きさは、ライトギムザ染色（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，ＭＤ）によって染色された組織学的切片で測定された。単一の生存可能な卵細胞を含む肉芽腫の各直径は、接眼マイクロメータを用いて測定し、そして肉芽腫の各体積は、球形を想定して算出した。最も長い直径およびこれに対して垂直の直径の平均を使用した。好酸球、肥満細胞および他の細胞型のパーセンテージは、同じ切片中で評価した。実質ネクローシスは、０〜４のスコアで得点付けし、０は最も小さい広がりのネクローシスであり、４は最も大きい広がりのネクローシスであった。肥満細胞のこの頻度はまた、類似の尺度に対して割り当てられ、これは０〜４の範囲を用いた。肝臓および腸における住血吸虫卵細胞の数ならびに肝臓のコラーゲン含量（ヒドロキシプロリンとして測定される）は、以前記載されたように測定した15。線維症はまた、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）を用いて染色された切片を用いて組織的に得点付けした。ピクロシリウス試薬は、コラーゲンを特異的に染色し、切片が偏光下で観察される場合、コラーゲンが沈着する明るい領域が照射される。各切片内の全ての肉芽腫は、尺度１〜４に基づいてピクロシリウス（レッド）「密度」に対して得点付けされ、「関連する領域」の第２の測定はまた、同じ尺度を用いて測定された。全線維症スコアは、各肉芽腫に対する密度と領域を乗算することによって決定された（すなわち、１６のスコアが最大である）。マウス１匹あたり平均３０個の肉芽腫が、全ての分析に含まれた。一貫性を制御するために、同じ個体が全ての組織学的特徴を得点付けされ、そして実験的な設計は全く認識していない。
【０１０１】
（ＲＮＡの単離および精製）
各動物由来の肝臓の２つの部分を合わせて、１ｍｌのＲＮＡ−ＳＴＡＴ ６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）中に置き、ドライアイス上で凍結しそして使用するまで−７０℃で保存した。組織ポリトロン（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ，ＣＴ）を用いて組織をホモジナイズし、そして全ＲＮＡを製造者らの推奨に従って抽出した。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、分光光度的に定量化した。
【０１０２】
（サイトカインｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出）
ＲＴ−ＰＣＲ手順を使用して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２およびＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）のｍＲＮＡの相対量を測定した。ｃＤＮＡは、記載されるように14、１μｇのＲＮＡの逆転写後に得た。全ての遺伝子のプライマーおよびプローブは、以前に公開された14、19、54。各サイトカインに対して使用したＰＣＲサイクルは、以下のようであった：ＩＬ−４（３３）、ＩＬ−５（３１）、ＩＦＮ−γ（２９）、コラーゲンＩ（２６）、コラーゲンＩＩＩ（２２）、ＴＧＦβｌ（３４）、ＴＧＦβ２（３４）およびＨＰＲＴ（２３）。
【０１０３】
（ＰＣＲ産物の分析および定量化）
増幅されたＤＮＡを、以前に記載されるように14、電気泳動、サザンブロットおよび非放射性サイトカイン特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションによって分析した。ＰＣＲ産物は、ＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。化学発光シグナルは、平らな土台のスキャナー（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ ｍｏｄｅｌ ６００ ＺＳ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて量を測定した。ＰＣＲ産物の量は、個体サンプルにおける、ＨＰＲＴ特異的シグナル密度に対するサイトカイン特異的シグナル密度の比を比較することによって決定した。引き続いて、個体サンプルに関する任意の濃度測定単位に１００という因数を掛けた。
【０１０４】
（インビトロ培養）
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞および脾臓を、マウスから抽出し、そして単一細胞懸濁液を調製した。赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いた浸透処理によって溶解した。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ2で、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および５０μＭ ２−ＭＥを補充したＲＰＭＩ １６４０培地に置いた。細胞を、２４ウェルプレート（３×１０6／ｍｌ，ｌｍｌ）に置き、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）で刺激し、そして上清をＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γのレベルを測定するために７２時間後に収集した。さらなるＳＥＡ刺激された培養物はまた、５０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（ＧＫ１．５）を用いて処理した。抗−ＣＤ４ ｍＡｂ単独で処置した培養物は、コントロール培地の培養物で観察されたものと比較した場合、サイトカイン発現に変化を見せなかった（データには示さない）。ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γは、特定のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した15。ＩＬ−１３レベルは、マウスＩＬ− １３ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。サイトカインレベルは、組換えサイトカインを用いて作成されたカーブから計算した。ＩＬ−４は、ＩＬ−４感受性細胞株ＣＴ．４Ｓを用いて測定した。これらの細胞の増殖は、（3Ｈ）ＴｄＲ取り込みによって量を測定し、そしてサイトカインの量は、既知の量の組換えＩＬ−４を用いた比較によって測定した。
【０１０５】
（コラーゲンＩのウエスタンブロット検出）
３Ｔ３線維芽細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、および５０μＭ ２−ＭＥを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。コンフルエントの細胞を、２４ウェルプレート（５００，０００細胞／ｍｌ）にプレートし、そしてＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）またはｒＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて６、２４および４８時間刺激した。培養上清を収集し、分泌されたコラーゲン１を分析した。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で一度洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解した。細胞溶解液および培養上清を、還元状態を使用する６％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中の電気泳動分離に供し、そしてニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ブロットは、ウサギＩｇＧ抗マウスＩ型コラーゲン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｎｂｕｎｋ，ＭＥ）を用いてプローブ化し、そしてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２次Ａｂとして使用した。バンドは、ウエスタンブロット化学発光試薬を用いて可視化した（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。コラーゲンバンドの同一性を確認するために、細胞溶解液を、ＰＢＳ（１ｍＭ ＣａＣｌ2および１％ＦＣＳを補充する）中の０．５ ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、３７℃で１時間処理した。精製されたラットコラーゲンＩ調製物をまた、コントロールとして使用した。
【０１０６】
（統計）
住血吸虫および卵細胞の数、サイトカインｍＲＮＡの変化、およ分泌されたサイトカインタンパク質の値を、スチューデントの２テールの（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）ｔ−検定を用いて比較した。肝線維症は、共分散の分析によって比較し、これは、卵細胞１個あたりの、共分散（ｃｏｖａｒｉａｔｅ）としての全肝臓卵細胞のログおよびヒドロキシプロリンのログを使用した。ｐ＜０．０５が有効であると考えられた。
【０１０７】
（参考文献）
【０１０８】
【数１】
全ての特許および参考文献は、完全に記載されるように参考として援用される。
［配列表］
【数２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１９９７年４月３０日出願の出願番号０８／８４１，７５１号の一部係属出願（これは、１９９６年３月１日に出願の出願番号０８／６０９，５２７号の分割出願である）である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−１３とそのレセプターおよびレセプター成分との相互作用の拮抗による、線維症の処置および阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含む、サイトカインとして公知の種々の調節分子が、同定されている。ＩＬ−１３の種々のタンパク質形態およびＩＬ−１３活性の種々の形態をコードするＤＮＡは、ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３７３５（１９９３）；Ｍｉｎｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２４８（１９９３）；およびＡｖｅｒｓａら、ＷＯ９４／０４６８０に記載される。従って、用語「ＩＬ−１３」は、これらの文献に記載される配列および／または生物学的活性を有するタンパク質を含み、このＩＬ−１３は、遺伝子組換え技術によって産生されるか；天然で因子を産生する細胞源から、または他の因子での誘導により精製されるか；化学技術によって合成されるか；あるいは上記の組み合わせである。
【０００４】
ＩＬ−１３は、以下：ＩｇＧ４とＩｇＥのスイッチングの誘導（ヒトの未熟Ｂ細胞（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０９４（１９９４）を含む）；正常のヒトＢ細胞中の生殖細胞系ＩｇＥ重鎖（ε）の転写およびＣＤ２３の発現の誘導（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３０（１９９３））；およびＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０ｍＡｂの存在下でのＢ細胞増殖の誘導（Ｃｏｏｋｒａ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６５７（１９９３））を含む数種の生物学的活性の産物に関連するサイトカインである。ＩＬ−１３の多くの活性は、ＩＬ−４の活性と類似しているが、ＩＬ−４に対してＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞またはＴ細胞クローンにおいて、増殖促進効果を有さない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１２：２６６３（１９９３））。
【０００５】
ほとんどのサイトカインのように、ＩＬ−１３は、標的細胞の表面上でＩＬ−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）と相互作用することによって、特定の生物学的活性を示す。ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４レセプター（「ＩＬ−４Ｒ」）は、レセプター活性に必要とされる共通の成分を共有するが、ＩＬ−１３は、１３０ｋＤＩＬ−４Ｒ（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、前出）を用いてトランスフェクトされる細胞に結合しない。従って、このＩＬ−１３Ｒは、少なくとも１つの他のリガンド結合鎖を含まなければならない。サイトカインレセプターは、一般に２または３の鎖からなる。ＩＬ−１３に対する、１つのリガンド結合鎖のクローニングが、最近報告されている（Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４９７−５０１）。
【０００６】
ＩＬ−１３の任意の他のＩＬ−１３結合鎖に対して配列を同定およびクローン化することが所望されており、ＩＬ−１３タンパク質が、種々の理由から産生され得、レセプターおよびレセプターシグナル伝達に結合するＩＬ−１３結合の阻害のための、治療法およびスクリーニングの生成を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明に従って、インターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドが開示され、これには、マウスレセプターおよびヒトレセプター由来のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝コードの縮重の結果として、（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチド配列の配列とは異なるヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）において特定される配列の種ホモログをコードするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）において特定されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体。
好ましくは、このヌクレオチド配列は、ヒトＩＬ−１３レセプターの生物学的活性を有するタンパク質をコードする。このヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド３１９〜１２５７のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列；または、配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。他の好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列をコードする。
【０００９】
このポリヌクレオチドで形質転換された、宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）もまた提供される。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下を包含する：
（ａ）適切な培養培地において、本発明の宿主細胞の培養物を増殖させる工程；および
（ｂ）この培養物からヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程。
これらの方法に従って産生されたタンパク質もまた提供される。
【００１１】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
好ましくは、このタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列；配列番号４の配列；または、配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列を含む。他の好ましい実施形態では、特性されたアミノ酸配列は、融合タンパク質（ＩＬ−１３ｂｃ由来ではない、さらなるアミノ酸配列を有する）の部分である。好ましい融合タンパク質は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）を含む。特に好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物もまた提供される。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。
【００１４】
ＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３レセプターに対するＩＬ−１３の結合のインヒビターを同定する方法もまた、提供される。これらの方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３またはそのフラグメントとを結合させる工程であって、この結合が、第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）この第１の結合混合物において、タンパク質と、ＩＬ−１３またはフラグメントとの結合の量を測定する工程；
（ｃ）化合物を、タンパク質およびＩＬ１３またはフラグメントと結合させて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）この第２の結合混合物における結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）この第１の結合混合物における結合の量を、この第２の結合混合物における結合の量と比較する工程；
を包含し、ここで、第２の結合混合物の結合の量において減少が生じた場合に、この化合物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る。これらの方法によって同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビター、およびそれを含む薬学的組成物もまた、提供される。
【００１５】
哺乳動物被験体において、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法もまた開示され、この方法は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３ｂｃもしくはＩＬ−１３Ｒインヒビター、またはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１６】
ＩＬ−１３活性を増強するための方法もまた提供され、この方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質を、本発明のタンパク質と結合させる工程、およびこのような結合物を、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する。好ましくは、この接触させる工程は、哺乳動物被験体に、治療的有効量のこのような結合物を投与することによって実施される。
【００１７】
哺乳動物被験体におけるＩＬ−１３関連状態を処置するためのさらなる方法が提供され、この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。哺乳動物被験体における、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃタンパク質との相互作用を阻害する方法についての他の方法が提供され、この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。好ましくは、このアンタゴニストは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体もしくはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子、からなる群から選択される。
【００１８】
さらに他の実施形態では、本発明は、哺乳動物被験体において組織線維症を処置する方法を提供する。この方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、このタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物被験体において、組織線維症の形成を阻害する方法を提供する。この方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここでこのタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物被験体において組織線維症を処置または阻害する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療的有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２１】
線維症を処置または阻害するこのような方法を実施する際に、好ましくは、組織線維症は、以下からなる群から選択される組織に罹患している：肝臓、皮膚表皮、皮膚内皮（ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ）、筋肉、腱、軟骨、心臓組織、膵臓組織、肺組織、子宮組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、弁、結腸、小腸、胆管、および腸；最も好ましくは、肝臓組織（住血吸虫属に感染した組織を含む）。特定の実施形態では、線維症は、創傷（外科的切開を含む）の治癒から生じる。
【００２２】
アンタゴニストを用いて、線維症を処置または阻害するこのような方法を実施する際に、好ましくは、このようなアンタゴニストは、以下からなる群から選択される：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体もしくはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体もしくはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子。特定の好ましい実施形態では、アンタゴニストは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。
【００２３】
アンタゴニストを使用して、このような方法を実施する他の好ましい方法において、アンタゴニストは、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体もしくはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体もしくはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）哺乳動物の被験体の組織線維症を処置する方法であって、該方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該タンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含む、方法。
（項目２）項目１に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目３）前記組織が、肝臓である、項目２に記載の方法。
（項目４）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目２に記載の方法。
（項目５）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目１に記載の方法。
（項目６）哺乳動物被験体の組織線維症の形成を阻害する方法であって、該方法は、タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該タンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含む、方法。
（項目７）項目６に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目８）前記組織が、肝臓である、項目７に記載の方法。
（項目９）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目７に記載の方法。
（項目１０）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目６に記載の方法。
（項目１１）前記創傷が、外科的切開である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）前記創傷が、外科的切開である、項目５に記載の方法。
（項目１３）哺乳動物被験体の組織線維症を処置する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１４）項目１３に記載の方法であって、前記アンタゴニストは、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１−結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目１５）項目１４に記載の方法であって、前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）ア配列番号２のミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含むタンパク質である、方法。
（項目１６）項目１３に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目１７）前記組織が、肝臓である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目１３に記載の方法。
（項目２０）前記創傷が、外科的切開である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）哺乳動物被験体の組織線維症の形成を阻止する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−１３アンタゴニストおよびＩＬ−４アンタゴニストからなる群から選択される分子、ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）項目２１に記載の方法であって、前記アンタゴニストは、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１−結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ−結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、あるいはＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目２３）項目２２に記載の方法であって、前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、を含むタンパク質である、方法。
（項目２４）項目２１に記載の方法であって、前記組織線維症が、肝臓、皮膚の内皮、皮膚の表皮、筋肉、腱、軟骨、心臓の組織、膵臓の組織、肺の組織、子宮の組織、神経組織、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、大腸、結腸、小腸、胆管および腸からなる群から選択される、組織に影響を与える、方法。
（項目２５）前記組織が、肝臓である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）前記線維症が、住血吸虫属の感染の結果である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）前記線維症が、創傷の治癒の結果である、項目２１に記載の方法。
（項目２８）前記創傷が、外科的切開である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）項目２１に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体またはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体またはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
（項目３０）項目１３に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、ＩＬ−４Ｒの可溶性形態、ＩＬ−４に対する抗体またはそのＩＬ−４結合フラグメント、ＩＬ−４Ｒに対する抗体またはそのＩＬ−４Ｒ結合フラグメント、およびＩＬ−４とＩＬ−４Ｒとの相互作用を阻害し得る低分子からなる群から選択される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】この図は、上記の実施例４に記載されたように、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃへの曝露後に、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１および偽性（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の写真を表す。
【図２】住血吸虫症病因におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の役割の特徴付け。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、次いで、感染の８週間後に屠殺して、肝臓肉芽腫のサイズ（パネルＡ）、組織好酸球増加（パネルＢ）、および肝臓線維症（パネルＣ）を評価した。個々の群のマウスを、方法の節で記載した様に、コントロール−ＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。示されるデータは、個々のマウスからの測定値であり、そして直線は、各群についての平均を示す。統計的比較を、スチューデントｔ検定（パネルＡおよびＢ）および共分散分析（パネルＣ）によって実施した。統計的比較およびそれらのｐ値を、図中に示す。すべてのデータが、第２の研究において再現された。
【図３】肝臓コラーゲンが、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理／感染マウスにおいて減少する。肝臓切片を、チャレンジ感染の８週間後に調製した。コントロールＦｃ−処理マウス（パネルＡおよびＢ）およびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理ＷＴ感染マウス（これらは、ほぼ同一の組織卵負荷量（ｔｉｓｓｕｅ ｅｇｇ ｂｕｒｄｅｎ）を含んだ）を、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）（パネルＡおよびＣ）で染色し、そしてコラーゲンに富む領域を強調させるために、偏光を使用して照射した（パネルＢおよびＤ）。複屈折領域は、陽性のコラーゲン染色を示し、そして示される領域は、各肝臓についての代表である（倍率、×４０）。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理マウス由来の肝臓切片は、コントロール動物と比較して、非常にわずかな肉芽腫および門脈管関連コラーゲンを示した。
【図４Ａ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図４Ｂ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図４Ｃ】Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカインプロフィールは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理によって影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。腸間膜リンパ節細胞を、個々のマウスから単離し、そして単一細胞懸濁液を調製し（２４ウェルプレート中で３×１０6細胞／ウェル）、そして培地単独（四角）、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）（丸）、またはＳＥＡおよび５０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ ｍＡｂ（三角）で刺激した。すべてのサイトカインを、方法の節において記載したように、刺激の７２時間後にＥＬＩＳＡによって、培養上清中でアッセイした。記号は、個々のマウスの値を示し、そして棒は、各群内の平均を示す。
【図５】Ｔｈ２型サイトカインｍＲＮＡ発現は、感染したＩＬ−４欠損マウス（しかし、ＩＬ−１３遮断に罹患していない）の肝臓において減少する。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。すべての動物を、感染の８週間後に屠殺し、そして方法の節で記載したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために肝臓標本を調製した。示されるデータは、一群あたり９〜１０匹の動物の個々の値であり、そして棒は、各群内の平均を示す。*記号は、データが、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）によって決定される場合に、ＷＴコントロール−Ｆｃ群とは有意に異なることを示す。５匹の非感染ＷＴ（黒丸）および５匹の非感染ＩＬ−４欠損マウス（白丸）からの平均値を、各サイトカインについてのＹ軸に示す。すべてのデータが、第２の研究において再現された。
【図６】コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡ発現は、感染したｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理マウス（しかし、ＩＬ−４欠損に罹患していない）の肝臓において減少する。Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＩＬ−４欠損（４ＫＯ）マウスに、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉの２５ケルカリアを感染させ、そして個々の群のマウスを、方法の節で記載したように、コントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処理した。すべての動物を、感染の８週間後に屠殺し、そして方法の節で記載したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために肝臓標本を調製した。示されるデータは、一群あたり９〜１０匹の動物の個々の値であり、そして棒は、各群内の平均を示す。*記号は、データが、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）によって決定される場合に、ＷＴおよびＩＬ−４欠損コントロール−Ｆｃ群とは有意に異なることを示す。５匹の非感染ＷＴ（黒丸）および５匹の非感染ＩＬ−４欠損マウス（白丸）からの平均値を、各サイトカインについてのＹ軸に示す。これらデータは、個々のにおいて再現された。
【図７】ＩＬ−１３は、マウス３Ｔ３線維芽細胞においてＩ型コラーゲン合成を誘導する。細胞を、培地（レーン１）、ｒＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）（レーン２）、またはｒＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）（レーン３および４（それぞれ、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから））で４８時間刺激した。還元条件下で、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて全細胞溶解産物を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、そしてウサギＩｇＧ抗マウスＩ型コラーゲンでプロービングした。上部の二重バンドおよび下部のバンド（矢印）は、レーン５において分離された精製ラットＩ型コラーゲンに対応する（パネルＡ）。下の図（パネルＢ）は、濃度計の値（任意のピクセル単位）である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本願の発明者らは、ＩＬ−１３ＲのＩＬ−１３結合鎖（以後「ＩＬ−１３ｂｃ」）をコードするポリヌクレオチド（マウスおよびヒトのＩＬ−１３ｂｃをコードするポリヌクレオチドを含むが、限定はされない）を初めて同定および提供した。
【００２６】
配列番号１は、マウスＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。配列番号２は、推定シグナル配列アミノ酸１〜２１を含む、レセプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。その成熟マウスＩＬ−１３ｂｃは、配列番号２のアミノ酸２２〜３８３の配列を有すると考えられる。その成熟マウスレセプター鎖は、少なくとも３つの異なるドメイン：細胞外ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸２２〜３３４を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸３３５〜３５６を含む）および細胞内ドメイン（配列番号２のおよそアミノ酸３５７〜３８３を含む）を有する。
【００２７】
配列番号３は、ヒトＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。配列番号４は、推定シグナル配列アミノ酸１〜２５を含む、レセプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。その成熟ヒトＩＬ−１３ｂｃは、配列番号４のアミノ酸２６〜３８０の配列を有すると考えられる。その成熟ヒトレセプター鎖は、少なくとも３つの異なるドメイン：細胞外ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸２６〜３４１を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸３４２〜３６２を含む）および細胞内ドメイン（配列番号４のおよそアミノ酸３６３〜３８０を含む）を有する。
【００２８】
ヒトＩＬ−１３ｂｃ配列の最初の８１アミノ酸は、「ｙｇ９９ｆ１０．ｒ１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ４１６４８ ５」として同定されかつデータベースアクセス番号Ｒ５２７９５．ｇｂ＿ｅｓｔ２を割り当てられた発現配列タグ（ＥＳＴ）の翻訳配列と同一である。このＥＳＴ配列中には、コードされたタンパク質を当業者がサイトカインレセプターとして同定することをもたらす相同性または配列モチーフは存在しない。このデータベースエントリーの対応するｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから公に利用可能である。本願の優先日後に、このようなクローンは、本出願人により順序付けられそして配列決定された。このようなクローンの配列は、本明細書中の配列番号３として本出願人により以前に報告された配列であることが決定された。
【００２９】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態もまた、産生され得る。このような可溶性形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３４または２２〜３３４を含むタンパク質、あるいは配列番号４のアミノ酸１〜３４１または２６〜３４１を含むタンパク質が挙げられるが、限定はされない。ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態は、好ましくは室温にて、水溶液中で可溶性であることによりさらに特徴付けられる。細胞内ドメインまたはその一部のみを含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、産生され得る。全長より短いＩＬ−１３ｂｃの任意の形態が、本発明内に包含され、そして本明細書中で全長および成熟形態とまとめて「ＩＬ−１３ｂｃ」または「ＩＬ−１３ｂｃタンパク質」と呼ばれる。全長より短いＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、全長ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１または配列番号３）の対応するフラグメントを発現することにより、産生され得る。これらの対応するポリヌクレオチドフラグメントもまた、本発明の一部である。上記のような改変型ポリヌクレオチドは、標準的分子生物学技術（適切な所望の欠失変異体の構築、部位特異的変異誘発法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む）によって、作製され得る。
【００３０】
本発明の目的のために、タンパク質は、以下の特徴のうちの１つ以上を保有する場合に、「ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性」を有する：（１）ＩＬ−１３またはそのフラグメント（好ましくは、その生物学的に活性なフラグメント）に結合する能力；および／あるいは（２）ＩＬ−１３Ｒの第２の非ＩＬ−１３結合鎖と相互作用して、ＩＬ−１３がＩＬ−１３Ｒに結合するというシグナル特徴を生成する能力。好ましくは、そのタンパク質により保有される生物学的活性は、ＩＬ−１３またはそのフラグメントに結合する能力であり、好ましくは、ＫDが、約０．１〜約１００ｎＭである。特定のタンパク質またはペプチドがこのような活性を有するか否かを決定するための方法としては、本明細書中にて提供される実施例に記載される方法が挙げられるが、限定はされない。
【００３１】
ＩＬ−１３ｂｃまたはその活性フラグメント（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）は、キャリア分子（例えば、免疫グロブリン）に融合され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態が、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され得る。他の融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰとの融合タンパク質）もまた、使用され得る。
【００３２】
本発明はまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまたコードする、配列番号１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体（すなわち、配列番号１または配列番号３の単離されたポリヌクレオチドの天然に存在する代替形態）（好ましくはＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するタンパク質）を包含する。また本発明に含まれるのは、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に、非常にストリンジェントな条件（例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ）下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重によって、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするが配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列とは異なる、単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。点変異または誘導された改変によって生じる、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列におけるバリエーションもまた、本発明に含まれる。
【００３３】
本発明はまた、他の動物種（特に、他の哺乳動物種）由来のマウスＩＬ−１３ｂｃおよびヒトＩＬ−１３ｂｃのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供する。種ホモログは、本明細書中に開示されるマウス配列またはヒト配列からプローブまたはプライマーを作製すること、および適切な種由来のライブラリー（例えば、関連する種のＰＢＭＣ、胸腺または精巣から構築されたライブラリー）をスクリーニングすることによって、同定および単離され得る。
【００３４】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を組換え産生するために、発現制御配列（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５〜４４９０（１９９１）に開示されるＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクター）に、作動可能に連結され得る。多くの適切な発現制御配列が、当該分野で公知である。組換えタンパク質を発現させる一般的方法もまた公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、５３７〜５６６（１９９０）に例示される。本明細書中にて定義される場合、「作動可能に連結された」とは、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主細胞により発現されるような様式で、本発明の単離されたポリヌクレオチドとその発現制御配列との間に共有結合が形成されるように酵素によってかまたは化学的に連結されていることを意味する。
【００３５】
多数の型の細胞が、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現のために適切な宿主細胞として作用し得る。機能的なＩＬ−１３ｂｃタンパク質を発現し得る任意の細胞型が、使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、初代移植片のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ−９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｒａｔ２細胞、ＢａＦ３細胞、３２Ｄ細胞、ＦＤＣＰ−１細胞、ＰＣ１２細胞、Ｍ１ｘ細胞またはＣ２Ｃ１２細胞。
【００３６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、１つ以上の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列に作動可能に連結すること、および昆虫発現系を使用することによって、産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からのキット（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）にて市販されており、そしてそのような方法は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野で周知である。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態はまた、上記のような適切な単離されたポリヌクレオチドを使用して、昆虫細胞において産生され得る。
【００３７】
あるいは、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、下等真核生物（例えば、酵母）または原核生物（例えば、細菌）において産生され得る。適切な酵母株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が、挙げられる。適切な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が、挙げられる。
【００３８】
細菌における発現は、その組換えタンパク質を組み込んだ封入体の形成を生じ得る。従って、その組換えタンパク質の再折り畳みが、活性な物質またはより活性な物質を産生するためには必要であり得る。正確に折り畳まれた異種タンパク質を細菌の封入体から得るためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。これらの方法は、一般には、その封入体からタンパク質を可溶化すること、次いでそのタンパク質を、カオトロピック剤を使用して完全に変性することを包含する。システイン残基がそのタンパク質の一次アミノ酸配列中に存在する場合に、ジスルフィド結合の正確な形成が可能である環境（酸化還元系）においてその再折り畳みを達成することが、しばしば必要である。再折り畳みの一般的方法は、Ｋｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８５：１８７〜１９５（１９９０）に開示されている。ＥＰ ０４３３２２５および同時係属中の米国特許出願第０８／１６３，８７７号は、他の適切な方法を記載する。
【００３９】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴付けられるトランスジェニック動物の生成物として（例えば、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックブタ、またはトランスジェニックヒツジの、乳の成分として）、発現され得る。
【００４０】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、所望のタンパク質を発現するために必要な培養条件下で、培養形質転換宿主細胞を増殖させることによって、調製され得る。次いで、生じた発現したタンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態は、馴化培地から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の膜結合形態は、その発現タンパク質から総膜画分を調製すること、および非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）でその膜を抽出することによって、精製され得る。
【００４１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、当業者に公知の方法を使用して精製され得る。例えば、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して、精製され得る。濃縮工程の後、その濃縮物が、ゲル濾過マトリックスのような精製マトリックスにアプライされ得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、垂れ下がったジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有する、マトリックスまたは基質）が使用され得る。そのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製にて一般的に使用される他の型であり得る。あるいは、カチオン交換工程が、使用され得る。適切なカチオン交換剤としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む、種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が、好ましい（例えば、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム）。培養上清からのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の精製はまた、コンカナバリンＡ−アガロース、ｈｅｐａｒｉｎ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＧｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３ＧＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような親和性樹脂に対する１つ以上のカラム工程；あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーを含み得る。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、垂れ下がったメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、そのＩＬ−１３ｂｃタンパク質をさらに精製するために使用され得る。ＩＬ−１３またはそのフラグメントを含むアフィニティーカラム、あるいはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含むアフィニティーカラムもまた、公知の方法に従う精製にて使用され得る。上記の精製工程のいくつかまたはすべてがまた、種々の組み合わせでかまたは他の公知の方法とともに、実質的に精製された単離された組換えタンパク質を提供するために使用され得る。好ましくは、その単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、それが他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まないように、精製されている。
【００４２】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、ＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３Ｒに結合し得る薬剤、あるいはＩＬ−１３またはＩＬ−１３ｂｃ（細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれか）へのＩＬ−１３の結合を妨害し、従って、正常な結合およびサイトカイン作用のインヒビターとして作用し得る薬剤（「ＩＬ−１３Ｒインヒビター」）についてスクリーニングするために使用され得る。所望の結合タンパク質（固定されているかまたはされていない）を使用する結合アッセイが、当該分野で周知であり、そして本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用してこの目的のために使用され得る。精製細胞に基づくスクリーニングアッセイまたはタンパク質に基づく（無細胞）スクリーニングアッセイが、このような薬剤を同定するために使用され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、キャリア上に精製形態で固定され得、そして精製ＩＬ−１３ｂｃタンパク質への結合が、潜在的阻害剤の存在下および不在下で測定され得る。適切な結合アッセイは、あるいは本発明のＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態を使用し得る。インヒビターがスクリーニングされ得る系の別の例が、下記実施例２にて記載される。
【００４３】
このようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物が、ＩＬ−１３またはそのフラグメントをＩＬ−１３タンパク質と混合することにより形成され、そしてその第１の結合混合物における結合の量（ＢO）が測定される。第２の結合混合物もまた、ＩＬ−１３またはそのフラグメント、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、およびスクリーニングされる化合物または薬剤を混合することにより形成され、そしてその第２の結合混合物における結合の量（Ｂ）が測定される。第１の結合混合物における結合の量と第２の結合混合物における結合の量が、例えば、比Ｂ／ＢOの算出を行うことによって、比較される。化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較した場合に第２の結合混合物において結合の減少が観察された場合に、結合を阻害し得ると見なされる。必要に応じて、ＩＬ−１３Ｒの第２鎖が、その結合混合物の１つまたは両方に添加され得る。結合混合物の処方および最適化は、当業者のレベル内であり、このような結合混合物はまた、結合を増大または最適化するために必要な緩衝液または塩を含み得、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイに含まれ得る。
【００４４】
ＩＬ−１３またはそのフラグメントへのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の結合活性を、いくらかの程度、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは約５０％以上減少させることが見出される化合物は、このように同定され得、次いで他の結合アッセイおよびインビボアッセイにおいて二次スクリーニングされ得る。これらの手段によって、治療剤として適切であり得るＩＬ−１３ｂｃ結合についての阻害活性を有する化合物が、同定され得る。
【００４５】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドもまた、ＩＬ−１３ｂｃ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１３、あるいはＩＬ−１３ｂｃを発現する細胞、ＩＬ−１３Ｒを発現する細胞、またはＩＬ−１３を発現する細胞の発現または存在を検出するための診断剤として使用され得る。そのタンパク質またはポリヌクレオチドは、これらの型の物質を使用する診断アッセイについての標準的手順において、このような目的のために使用され得る。適切な方法が、当業者に周知である。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１３Ｒ」とは、「ＩＬ−１３Ｒα１」または「ＮＲ４」として公知であるＩＬ−１３ｂｃおよび／または第２のＩＬ−１３レセプター鎖をいう（マウスレセプター鎖、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６、９３：４９７〜５０１；ヒトレセプター鎖、Ａｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１：２９２６５〜７０、およびＧａｕｃｈａｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７：９７１〜８を参照のこと）。
【００４７】
ＩＬ−１３ｂｃは、ＩＬ−１３の公知の生物学的活性のモジュレーターとして作用する。結果として、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（特に、可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）、ＩＬ−１３Ｒインヒビター（すなわち、ＩＬ−１３ＲとのＩＬ−１３の相互作用のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３Ｒ（特に、ＩＬ−１３ｂｃ、またはＩＬ−１３Ｒα１を含む）に対する抗体およびそのフラグメント、ＩＬ−１３に対する抗体およびそのフラグメント、可溶性ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質、ならびにＩＬ−１３ＲとのＩＬ−１３の相互作用（ＩＬ−１３ｂｃおよび／またはＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を含む）の低分子インヒビターまたは他のインヒビター）が、ＩＬ−１３が関係する種々の医学的状態またはＩＬ−１３の活性（またはその欠失）によりもたらされる種々の医学的状態（まとめて、「ＩＬ−１３関連状態」）の処置または調節において有用であり得る。ＩＬ−１３Ｒに結合するＩＬ−４の変異形態もまた、ＩＬ−１３アンタゴニストとして使用され得る（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８、９５：９４５４〜８；Ａｖｅｒｓａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３、１７８：２２１３〜８；ならびにＧｒｕｎｅｗａｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０：４００４〜９に開示されるものを参照のこと）。
【００４８】
ＩＬ−１３関連状態としては、Ｉｇ媒介性の状態および疾患（特に、ＩｇＥ媒介性状態（アトピー、アレルギー状態、喘息、免疫複合体病（例えば、狼瘡、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、甲状腺炎およびグレーブス病）を含むが、限定はされない）；肺の炎症状態；免疫欠乏（特に、造血前駆体細胞における欠乏、またはそれに関する障害；癌および他の疾患が挙げられるが、限定はされない。このような病理学的状態は、疾患、放射線への曝露または薬物から生じ得、そして例えば、白血球減少症、細菌感染およびウイルス感染、貧血、Ｂ細胞欠乏またはＴ細胞欠乏（例えば、骨髄移植後の免疫細胞欠乏または造血細胞欠乏）を含む。ＩＬ−１３はマクロファージ活性化を阻害するので、ＩＬ−１３ｂｃはまた、マクロファージ活性を増強するため（すなわち、ワクチン接種、ミコバクテリア感染または細胞内生物感染または寄生生物感染の処置において）有用であり得る。
【００４９】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた用いて、ＩＬ−１３の効果をインビトロおよびインビボで強化し得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質（好ましくは、ＩＬ−１３）と合わされ得、そして得られる組み合わせを、ＩＬ−１３ｂｃ以外の、ＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖（好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの全ての鎖（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１））を発現する細胞と接触させ得る。好ましくは、接触工程は、治療有効量のこのような組み合わせを哺乳動物被験体にインビボで投与することによって行われる。ＩＬ−１３タンパク質とＩＬ−１３ｂｃタンパク質との予め樹立した会合は、適切なシグナル伝達に必要な完全なＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒ複合体の形成を助ける。例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１３５１（１９９５）に記載の方法を参照のこと。
【００５０】
細胞から精製されたかまたは組換え産生された、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質およびＩＬ−１３Ｒインヒビターは、薬学的に受容可能なキャリアと合わされた場合、薬学的組成物として用いられ得る。このような組成物は、ＩＬ−１３ｂｃまたはインヒビターおよびキャリアに加えて、当該分野で周知の種々の希釈剤、フィラー、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を含み得る。用語「薬学的に受容可能な」とは、活性成分の生物学的活性を有効性を妨害しない非中毒性の物質を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存する。
【００５１】
本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４．．．ＩＬ−２４、１Ｌ−２５）、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子およびエリスロポエチン）を含み得る。薬学的組成物はまた、抗サイトカイン抗体を含み得る。薬学的組成物はさらに、他の抗炎症剤を含み得る。このようなさらなる因子および／または薬剤は、薬学的組成物中に含まれて、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターとの相乗効果を生じ得るか、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターによって引き起こされる副作用を最小にし得る。逆に、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の処方物中に含まれて、このサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小にし得る。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、他の薬学的に受容可能なキャリアに加えて、水溶液中でミセル、不溶性単層、脂質結晶またはラメラ層のような凝集した形態で両親媒性薬剤（例えば、脂質存在する）と合わされている、リポソームの形態であり得る。リポソーム処方のために適切な脂質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、ホスホリピド、サポニン、胆汁酸など。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号（これらは全て本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、当該分野のレベルの範囲内である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、患者にとって意味のある利益（例えば、このような状態の症状の改善、治癒、または治癒速度の上昇）を示すに充分である、薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々の活性な成分に適用される場合、この用語は、その成分単独をいう。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせで投与されるか、逐次投与されるかまたは同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、活性成分の合わせた量をいう。
【００５４】
本発明の処置または使用の方法を実施する際に、治療有効量の単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、哺乳動物に投与される。単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、単独で、または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子を用いる処置）との組み合わせのいずれかで、本発明の方法に従って投与され得る。１以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子と同時投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子もしくは抗血栓因子と同時に、または逐次にのいずれかで投与され得る。逐次で投与された場合、主治医は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊または抗血栓因子と組み合わせてＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与する適切な順序を決定する。
【００５５】
本発明の薬学的組成物において用いられるかまたは本発明の方法を実施するために用いられるＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの投与は、種々の従来の方法で、例えば、経口摂取、吸入、または皮膚注射、皮下注射もしくは静脈内注射において実施され得る。患者に対する静脈内投与が好ましい。
【００５６】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが経口投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物はさらに、固体キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。錠剤、カプセル剤および散剤は、約５％〜９５％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含み、好ましくは、約２５％〜９０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。液体形態で投与される場合、液体キャリア（例えば、水、石油、動物もしくは植物起源の油（例えば、ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油もしくはゴマ油）、または合成油）が添加され得る。液体形態の薬学的組成物はさらに、生理学的食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖の溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）を含み得る。液体形態で投与される場合、薬学的組成物は、約０．５重量％〜９０重量％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含み、好ましくは約１％〜５０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。
【００５７】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、発熱物質を含まない、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、張度（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）、安定性などに関する制限（ｄｕｅ）を有するこのような非経口的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、当該分野の技術範囲内である。静脈内注射、皮膚注射または皮下注射のために好ましい薬学的組成物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターに加えて、等張性ビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射剤（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リンゲル注射剤（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、デキストロース注射剤（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、乳酸加リンゲル注射剤（Ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、または当該分野で公知のような他のビヒクル）を含むべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤または当業者に公知の他の添加剤を含み得る。
【００５８】
本発明の薬学的組成物中のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量は、処置されるべき状態の性質および重篤度、ならびに患者が受けた以前の処置の性質に依存する。最終的に、主治医は、各個体患者を処置する、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量を決定する。最初に、主治医は、低用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与し、そして患者の応答を観察する。最適な治療効果がその患者について得られるまで、さらに多くの用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが投与され得、そしてその時点で、投薬量は一般にさらには増加されない。本発明の方法を実施するために用いられる種々の薬学的組成物が、１ｋｇ体重あたり、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約２０μｇ〜約５００μｇ）のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含むべきであることが意図される。
【００５９】
本発明の薬学的組成物を用いる静脈内治療の持続時間は、処置されるべき疾患の重篤度、ならびに各個体患者の状態および可能性のある特異体質応答に依存して変化する。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの各適用の持続時間が、１２時間〜２４時間の範囲の連続静脈内投与であることが意図される。最終的に、主治医は、本発明の薬学的組成物を用いた静脈内治療の適切な持続時間を決定する。
【００６０】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた用いて動物を免疫して、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質と特異的に反応しかつそのレセプターに対するＩＬ−１３またはそれらのフラグメントの結合を阻害し得る、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を入手し得る。このような抗体は、ＩＬ−１３ｂｃ全体を免疫原として用いて、またはＬ−１３ｂｃのフラグメント（例えば、可溶性成熟ＩＬ−１３ｂｃ）を用いることによって入手され得る。ＩＬ−１３ｂｃのより小さなフラグメントをまた用いて、動物を免疫し得る。ペプチド免疫原はさらに、システイン残基をカルボキシル末端に含み得、そしてハプテン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合体化される。さらなるペプチド免疫原は、チロシン残基を硫酸化チロシン残基で置換することによって作製され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｒ．Ｐ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９−２１５４（１９６３）；Ｊ．Ｌ．Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１１，１０ （１９８７）においてように、当該分野で公知である。
【００６１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質に結合する、中和抗体または非中和抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）もまた、特定の腫瘍について、そしてまた上記の状態の処置において有用な治療剤であり得る。これらの中和モノクローナル抗体は、ＩＬ−１３ｂｃに対するＩＬ−１３の結合をブロックし得る。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（ＩＬ−１３ｂｃ ｃＤＮＡの単離）
（マウスＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺から調製した。二本鎖のヘミメチル化ｃＤＮＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｃＤＮＡ合成キットを製造業者の説明書に従って用いて調製した。手短に述べると、第１鎖を、オリゴｄＴ−Ｘｈｏプライマーを用いてプライム（ｐｒｉｍｅ）し、そして第２鎖合成の後、ＥｃｏＲＩアダプターを添加し、そしてｃＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、そして精製した。ｃＤＮＡを、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）λベクターのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結し、そしてＧｉｇａｐａｋ ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の説明書に従って用いてパッケージングした。１．５×１０6の得られた組換えファージのライブラリーを、製造業者の説明書に従って増幅した。このライブラリーを、配列ＫＳＲＣＴＣＣＡＢＫ ＣＲＣＴＣＣＡ（配列番号５）（Ｋ＝Ｇ＋Ｔ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｒ＝Ａ＋Ｇ；Ｂ＝Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）の縮重１７マーオリゴヌクレオチドプローブを用い、記載された（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５、６．４．３節）通りの標準的なＴＭＡＣハイブリダイゼーション条件を用いてスクリーニングした。クローンＡ２５が同定された。なぜなら、クローンＡ２５はこの１７マープローブにハイブリダイズするが、公知の造血素レセプター由来のプローブにはハイブリダイズしないからである。このクローンを、製造業者の説明書に従ってＺａｐＥｘｐｒｅｓｓベクターからプラスミド形態で単離し、そしてＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡ配列は、造血素レセプターファミリーの新規なメンバーをコードしていた。
【００６３】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含むクローンＡ２５を１９９６年２月２２日に受託番号６９９９７でｐＡ２５ｐＢＫＣＭＶとしてＡＴＣＣに寄託した。
【００６４】
（ヒトＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
マウスレセプターのヒトホモログの部分的フラグメントを、マウス配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たヒト精巣ポリＡ＋ＲＮＡから調製した。２７４塩基対のＤＮＡフラグメントを、３０サイクルのインキュベーション（９４℃×１分間、４２℃にて１分間および７２℃にて１分間）について１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む１×Ｔａｑ緩衝液中で、以下のオリゴヌクレオチドを用い、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲによってこのｃＤＮＡから増幅した：ＡＴＡＧＴＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号６）およびＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣ（配列番号７）。このフラグメントのＤＮＡ配列を決定し、そして２つのオリゴヌクレオチドを、以下の配列を用いてこのフラグメントの内部部分から調製した：ＡＧＴＣＴＡＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＣＧ（配列番号８）およびＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣ（配列番号９）。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（カタログ番号ＨＬ１１６１）から購入したヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。フィルターを、標準的な５×ＳＳＣハイブリダイゼーション条件を用いて５２℃にてハイブリダイズし、そして２×ＳＳＣ中で５２℃にて洗浄した。４００，０００クローンのスクリーニングにおいて両方のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする２２個のクローンを単離した。これらのｃＤＮＡクローンのうちの４つのＤＮＡ配列を決定し、そして全てが同じ新規な造血素レセプターをコードしていた。全長ヒトレセプター鎖の推定されるＤＮＡ配列を配列番号３として示す。
【００６５】
このヒトクローンを、１９９６年２月２２日に受託番号６９９９８でｐｈＡ２５＃１１ｐＤＲ２としてＡＴＣＣに寄託した。
【００６６】
（実施例２）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現および活性のアッセイ）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの産生および精製）
マウスＩＬ−１３ｂｃの細胞外ドメインのアミノ酸１〜３３１をコードするＤＮＡを、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙをコードするスペーサー配列にＰＣＲによって融合し、そしてＣＯＳ−１発現ベクターｐＥＤ．ＦｃのヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２ ＣＨ３領域をコードする配列とインフレームで連結した。ＩＬ−１３ｂｃ−ＩｇをＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクトＣＯＳ−１細胞から産生し、そしてプロテインＡセファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製した。
【００６７】
（Ｂ９増殖アッセイ）
ＩＬ−１３またはＩＬ−４に応じたＢ９細胞（Ａａｒｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７．１７：１４１１−１４１６）の増殖刺激を、ＤＮＡ中への３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。細胞（５×１０3／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの存在下または非存在下で種々の濃度の増殖因子を含む培地を有する９６ウェルプレートに播種した。３日間のインキュベーション後、１ｕＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加し、そして細胞をさらに４時間インキュベートした。取り込まれた放射能を、ＬＫＢ １２０５ Ｐｌａｔｅリーダーを用いて決定した。
【００６８】
Ｂ９細胞株は、ＩＬ−１３、ＩＬ−４またはＩＬ−６に応じて増殖した。ＩＬ−１３に対する応答のみが、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇによって阻害された。このことは、このレセプターがＩＬ−１３に特異的に結合するが、ＩＬ−４にもＩＬ−６にも結合しないことを示す。この表はｃｐｍを示す。２つの別個の実験を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
（実施例３）
（表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）によって測定した、ＩＬ−１３に対する可溶性ＩＬ−１３ｂｃの直接結合）
Ｂｉａｃｏｒｅのバイオセンサーを用いて、精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、１９９１）に対するＩＬ−１３の特異的結合を直接測定した。約１０，０００〜１７，０００の共鳴単位（ＲＵ）の精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ、ヒトＩｇＧ１または無関係のレセプターを各々、製造業者によって推奨されるようにセンサーチップ上の異なるフローセルに共有結合によって固定した。（ＲＵは、センサーチップ表面に結合したタンパク質の質量を反映するもの（ｒｅｆｅｌｃｔｉｏｎ）である。）精製されたＩＬ−１３を、過剰の精製ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの存在下または非存在下で１０分間にわたって５μｌ／分でフローセルと交差して注入した。結合を、サンプル注入の前と後とのＲＵの差として定量した。４８１．９ＲＵの特異的ＩＬ−１３結合は、固定化ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇについてのみ観察され、一方、ＩＬ−１３＋ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの結合体化は、固定化ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇに対する結合がないことをもたらした（４ＲＵ）。ＩＬ−１３結合は、固定化ＩｇＧまたはＩＬ−１１Ｒ−Ｉｇのいずれについても観察されなかった（それぞれ、５．４ＲＵおよび３．７ＲＵ）。
【００７１】
【表３】
（実施例４）
（標識ＩＬ−１３ＢＣ−Ｉｇ融合タンパク質に対する、ＣＯＳ細胞中で発現されたＩＬ−１３の結合：ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを用いたＩＬ−１３のＣＯＳインサイチュ検出）
ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１についての発現ベクターまたは空のベクターを、ＤＥＡＥ−デキストラン方法によって二連のプレート中のＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして４℃にてメタノールで１０分間、培養ディッシュ中で固定した。固定後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで結合緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）で１回リンスし、そして１．０ｕｇ／ｍｌでＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを有するか関連する抗サイトカイン抗血清を有する結合緩衝液中で４℃で２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして結合緩衝液中に５００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ウサギＦ（ａｂ）２’抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ融合体検出のため）またはウサギＦ（ａｂ）２’抗ラットＩｇＧ（抗サイトカイン検出のため）中で振盪しながら４℃でインキュベートした。細胞をさらに、ＰＢＳ中で２回洗浄した。アルカリホスファターゼ活性を、ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートを用いて可視化した。
【００７２】
特異的結合を、顕微鏡下で可視化した。ＩＬ−１３でトランスフェクトした細胞のみが、ＩＬ１３ｂｃ−Ｉｇに対する特異的結合を示した（図面の、トランスフェクトした細胞の写真を参照のこと）。
【００７３】
（実施例５）
（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の生物学的活性を決定するための他の系）
他の系を用いて、特定のＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書中で定義される通りのＩＬ−１３ｂｃの「生物学的活性」を示すか否かをを決定し得る。以下は、このような系の例である。
【００７４】
（ＩＬ−１３結合についてのアッセイ）
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質がＩＬ−１３またはそのフラグメントを結合する能力は、このような結合を検出し得る任意の適切なアッセイによって決定され得る。いくつかの適切な例が以下に続く。
【００７５】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の細胞外領域に対するＩＬ−１３の結合は、レセプタータンパク質に対するホスホチロシンの迅速な誘導を特異的に引き起こす。リン酸化の誘導によって測定した場合のリガンド結合活性についてのアッセイを以下に記載する。
【００７６】
あるいは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（例えば、細胞外ドメインの可溶性形態など）を産生し、そしてこれを用いてＩＬ−１３結合を検出する。例えば、細胞外ドメイン（推定される膜貫通ドメインの前で、好ましくは、直前で短縮化される）が、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）γ１のヒンジＣH２ドメインおよびＣH３ドメインをコードするｃＤＮＡにインフレームで連結されたＤＮＡ構築物を調製する。この構築物は、ＣＯＳ細胞について適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＤΔＣまたはｐＭＴ２）中で作製される。このプラスミドは、ＣＯＳ細胞中に一時的にトランスフェクトされる。分泌されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質は、馴化培地中で回収され、そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって精製される。
【００７７】
精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、多数の適用においてＩＬ−１３結合を実証する。ＩＬ−１３を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレートの表面上にコーティングし得、次いで、さらなる結合部位を、標準的なＥＬＩＳＡ緩衝液を用いてウシ血清アルブミンまたはカゼインでブロックし得る。次いで、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を固相ＩＬ−１３に結合させ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化された二次ヤギ抗ヒトＩｇを用いて結合を検出する。特異的に結合した酵素の活性は、比色基質（例えば、テトラメチルベンジジン）および吸光度の読み取りを用いて測定され得る。
【００７８】
ＩＬ−１３はまた、例えば、膜貫通ドメインまたはグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を提供することによって細胞表面に発現され得る。膜に結合したＩＬ−１３を発現する細胞は、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて同定され得る。可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合体はこれらの細胞の表面に結合し、そして蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇおよびフローサイトメトリーを用いて検出される。
【００７９】
（相互作用捕捉）
酵母の遺伝的選択方法である「相互作用捕捉（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ）」［Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３，１９９３］を用いて、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書中で定義したとおりのＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するか否かを決定し得る。この系では、ＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺの両方からのレポーター遺伝子の発現は、ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質（例えば、この場合、ヒトＩＬ−１３ｂｃと相互作用する種）と、プレイ（ｐｒｅｙ）（例えば、この場合、ヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質）との間の相互作用に依存する。従って、Ｌｅｕ２発現またはＬａｃＺ発現のレベルによって相互作用の強さを測定し得る。最も単純な方法は、ＬａｃＺコードタンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの活性を測定することである。この活性は、Ｘ−Ｇａｌ含有培地またはフィルター上の青色の程度によって判断され得る。β−ガラクトシダーゼ活性の定量的測定について、標準的なアッセイは、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．、Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．による）に見出され得る。
【００８０】
このような方法では、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が特定の種（例えば、ＩＬ−１３ｂｃの細胞内ドメインとインビボで結合する細胞質ゾルタンパク質など）と相互作用するか否かを決定しようとする場合、その種は、相互作用捕捉において「ベイト」として用いられ得、試験されるべきＩＬ−１３ｂｃタンパク質は「プレイ」として供給され得るか、またはその逆であり得る。
【００８１】
（実施例６）
（可溶性ＩＬ−１３Ｒを用いた線維症の阻害）
線維性組織の発達は、損傷後の治癒の正常なプロセスの一部である。それにもかかわらず、いくつかの状況では、罹患組織の正常な機能を妨害する、過剰のコラーゲンの破壊的蓄積が存在する。実際、コラーゲン合成およびおよび組織瘢痕形成（ｔｉｓｓｕｅ ｓｃａｒｉｎｇ）は、いくつかの自己免疫、アレルギー性疾患および感染性疾患を含めた多数の慢性および消耗性の病気の主な病理学的症状発現である1-7。瘢痕組織形成のプロセスに関する機構のたくさんの情報が存在する8、9が、線維性プロセスの開始における炎症細胞およびサイトカインの役割の理解にはなお大きな隔たりが存在する。
【００８２】
本明細書中で使用される場合「線維症」は、線維性組織の形成を含む任意の状態を含む（このような形成が望ましいか望ましくないかにかかわらず）。このような状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結合組織炎、線維腫の形成（線維腫症）、線維形成（肺の線維形成を含む）、線維弾性症（心内膜線維弾性症を含む）、線維筋症の形成、線維性剛直症、類線維の形成、線維線腫の形成、線維粘液腫の形成および線維膀胱炎（ｆｉｂｒｏｃｙｓｔｏｔｉｔｉｓ）（嚢胞性線維症を含む）。
【００８３】
ＩＬ−１３レセプター複合体は、ＩＬ−４レセプター、低親和性結合性ＩＬ−１３Ｒα１鎖、および高親和性結合性鎖ＩＬ−１３Ｒα２を含む、少なくとも３つの別個の成分から構成される35、42〜44。近年、可溶性ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ融合タンパク質が調製され、そしてこれを用いてＩＬ−１３をインビトロ35およびインビボ30、39〜41の両方で好首尾に中和した。この融合タンパク質はＩＬ−１３に高親和性で結合するが、ＩＬ−４を中和することができないので、このタンパク質は、ＩＬ−１３の特異的役割を決定するための優れたツールを提供した。本研究では、本発明者らは、野生型マウスおよびＩＬ−４欠損マウスにおいてＩＬ−１３アンタゴニストを用いて、マウス住血吸虫症における肝臓線維症の発症に対するＩＬ−１３の寄与とＩＬ−４の寄与とを分離した。これらの研究では、肉芽腫形成を詳細に試験し、好酸球および肥満細胞の補充に焦点を当て、そしてより重要なことには、卵誘発性線維症の発症を、生化学的技術、組織学的技術および分子技術を用いて定量した。本発明者らはまた、Ｔｈ１／Ｔｈ２型サイトカイン応答の調節に対するＩＬ−４およびＩＬ−１３の寄与を、腸間膜リンパ節培養物においてインビトロで、そして肉芽腫性肝臓においてインビボでの両方で調べた。この研究からの結果は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が住血吸虫症の病因においていくつかの重複した活性を示すことを示す一方、両方のサイトカインについての別個の機能もまた明確に解明された。おそらく、最も重要かつ新規な知見は、ＩＬ−１３が、感染したマウスにおけるＩ型およびＩＩＩ型のコラーゲンｍＲＮＡ産生および肝臓線維症を駆動する主要なＴｈ２型サイトカインであり、そしてＩＬ−４はそうでないという、観察であった。従って、本発明者らの知見は、ＩＬ−１３インヒビター／アンタゴニスト（例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）が、線維症（例えば、慢性感染性疾患に関連した線維症など）を予防する際に治療的に有益なものであり得ることを確立する。
【００８４】
（結果）
（住血吸虫症病因における、ＩＬ−４、ＩＬ−１３またはＩＬ−４／ＩＬ−１３二重欠損の匹敵する効果：ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置は、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ感染マウスにおける肝臓線維症を有意に減少させる）
住血吸虫症の病因におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の調節の役割を比較するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスを２５のＳ．ｍａｎｓｏｎｉ ｃｅｒｃａｒｉａｅに経皮的に感染させた。別個の群の動物を、「材料および方法」に記載されるように、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃまたはコントロール−Ｆｃのいずれかで処置した。処置を産卵開始時である５週目に始め、そして全ての動物を感染８週後に屠殺し、そしていくつかの寄生生物学的および免疫学的パラメーターについて調べた。表ＩＩＩに示すように、４群のマウスは全て、類似した寄生生物負荷を宿しており、そして１対の寄生生物あたりに産生される組織卵は群の間でそれほど異ならなかった。ピーク組織応答の時点である45感染８週間後に、ＷＴマウスは、ＩＬ−１３遮断の結果として、肉芽腫の大きさにおける有意な変化を示さなかった（図２Ａ）。興味深いことに、コントロール−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスはまた、減少した肉芽腫性応答を示すことができず、そして実際に、肉芽腫はこれらのマウスにおいて有意に大きかった。これらの観察とは著しく対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、ＩＬ−１３が阻害された場合著しく減少した肉芽腫性応答を提示した（図２Ａ、一番右）。実際、ＩＬ−４二重欠損／ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスは、コントロールまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴ動物のいずれもと比較した場合、肉芽腫容量における平均４０％〜５０％の減少を提示し、そしてコントロール−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスと比較した場合、７５％を超える減少を提示した。
【００８５】
病巣の細胞組成をまた、ギムザ染色した肝臓切片において評価し、そして表ＩＩＩに示すように、ＩＬ−４欠損マウスは、肉芽腫関連肥満細胞の顕著な減少を提示した。対照的に、ＩＬ−１３阻害単独によって肥満細胞数に変化はなく、そしてＩＬ−１３遮断は、ＩＬ−４欠損マウスにおける既に高度に減少した数の肥満細胞に対して付加的な効果を有さなかった。いくぶん同様に、肉芽腫関連好酸球を評価した場合、なお別個の知見が観察された（図２Ｂ）。ここで、好酸球の数は、ＩＬ−１３遮断によってＷＴマウスにおいて４６％から６４％へと増加し、そしてＩＬ−４欠損の結果として有意に減少した（２８％）。組織好酸球増加症におけるＩＬ−１３およびＩＬ−４についての明らかに対照的な役割にもかかわらず、ＩＬ−４欠損マウスをＩＬ−１３インヒビターで処置した場合、なおさらに著しい、合わされた阻害効果が観察された。これらのマウスでは、肉芽腫好酸球の平均数は１０％未満であった。最後に、ＷＴ動物対ＩＬ−４欠損動物において実質関連肝臓壊死の程度でも卵関連肝臓壊死の程度でも変化は存在しなかったが、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴ群およびＩＬ−４欠損群の両方は、実質壊死全体においては顕著な減少を示した。
【００８６】
おそらく最も重要なことに、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置は単独で、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）で染色した組織切片において評価した場合、ＷＴマウスにおける肝臓肉芽腫のコラーゲン含有量を有意に減少させた（表ＩＩＩおよび図３）。対照的に、感染させたＩＬ−４欠損マウスは、顕微鏡分析によって、肉芽腫コラーゲン沈着において検出可能な変化を示さなかった。興味深いことに、このパラメーターにおいて、ＩＬ−１３およびＩＬ−４について合わされた役割も相乗的な役割も存在しないようであった。なぜなら、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスとｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスとの間に有意な差が存在しなかったからである（表ＩＩＩ）。図３は、類似の寄生生物数、組織卵負荷、および肉芽腫の大きさがコントロールおよびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて見出されたとはいえ、ＩＬ−１３の遮断は、肝臓内のコラーゲン沈着に対してかなりの阻害効果を有したことを示す。最後に、肝臓線維症の程度をまた、ヒドロキシプロリンレベルの評価によって測定した（図２Ｃ）。ヒドロキシプロリンレベルは、上記の組織学的技術よりも定量的である。可溶性ＩＬ−１３アンタゴニストは単独で、肝臓のヒドロキシプロリンレベルを顕著に減少させ、一方、ＩＬ−４欠損は、それほど有意でない減少をもたらした。ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重欠損は、ヒドロキシプロリンをｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて既に観察されたレベルより低く減少させることができなかったが（図２Ｃ）、第２の研究においてわずかな傾向が存在した（有意ではない）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−１３が、マウス住血吸虫症における肝臓線維症の発達を担う主なＴｈ２関連サイトカインであることを実証する。
【００８７】
（Ｔｈ２型サイトカイン産生は、ＩＬ−４欠損マウスにおいて減少するが、ＩＬ−１３阻害による影響を受けない）
ＩＬ−４はＣＤ４+Ｔｈ２細胞発達を駆動する主なサイトカインであることが周知である21、22が、Ｔｈ２型応答の生成および維持におけるＩＬ−１３の役割は、議論の余地があり、そして研究されている宿主の遺伝および感染性疾患モデルの両方によって影響を受け得る30、34、38。それゆえ、肝臓病理におけるｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ誘導性変化がＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインバランスにおける変化によって生じたか否かを決定するために、本発明者らは、腸間膜リンパ節および脾臓を、感染させたマウスから単離し、単細胞懸濁物を調製し、そしてこの培養物を寄生生物抗原でインビトロで再刺激した。さらなる細胞培養物を、抗ＣＤ４ ｍＡｂの存在下で寄生生物抗原に曝露して、サイトカイン産生がＣＤ４+Ｔ細胞応答に依存性であるか否かを決定した。培養上清を、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによって分析した。予測され得るように15、ＷＴマウスから調製された腸間膜培養物（図５）および脾臓培養物（データは示さず）は、非常に偏ったＴｈ２型サイトカイン応答を提示した。これらは、ＳＥＡ刺激に応じて高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生し、そしてＩＦＮ−γをほとんどまたは全く産生しなかった。対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、より混ざったＴｈ１／Ｔｈ２型プロフィールを示した。実際、有意なＳＥＡ特異的ＩＦＮ−γ応答がＩＬ−４欠損マウスにおいて検出された。これは、以前の研究23、24と一致する。ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、そしてより低い程度でＩＬ−５もまた、これらの動物において検出され、一方、これらのサイトカインのレベルは、ＷＴマウスと比較した場合、顕著に減少した。重要なことに、低いがしかし有意なＩＬ−４依存性ＩＬ−１３応答の維持が、ＩＬ−４の非存在下で維持される著しい肉芽腫性応答を説明するようである（図２）。驚くべきことに、肝臓線維症に対するその顕著な阻害効果にもかかわらず、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃは、ＷＴマウスまたはＩＬ−４欠損マウスのいずれでも、Ｔｈ１型サイトカイン応答にもＴｈ２型サイトカイン応答にも有意な影響を有さなかった。全ての場合、サイトカイン産生がＣＤ４+Ｔ細胞応答に非常に依存していたことにもまた留意すべきである。なぜなら、抗ＣＤ４ ｍＡｂ処置ＳＥＡ刺激培養物のいずれにおいてもサイトカイン発現がほとんどまたは全く検出されなかったからである。
【００８８】
（ＩＬ−４欠損およびｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスの肉芽腫性肝臓におけるＴｈ１／Ｔｈ２型サイトカインｍＲＮＡ発現の変化）
類似のパターンのサイトカイン発現が、肉芽腫形成部位でインビボで観察されるか否かを決定するために、本発明者らは、感染８週間後に種々の群のマウスから肝臓ｍＲＮＡを単離し、そして定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。図５に示すように、感染したＷＴマウスは、強力なＴｈ２型サイトカインｍＲＮＡプロフィールを示した。これは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＬ−１０のｍＲＮＡにおける顕著な増加を示す。ＷＴマウスはまた、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現における中程度の増加を示した。これは、以前の観察19と一致した。これらの知見とは対照的に、ＩＬ−１３およびＩＬ−５のｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−４欠損マウスにおいてずっと低く、一方、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡは有意に増加し、そしてＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現は変化しなかった。さらに、腸間膜リンパ節培養物および脾細胞培養物から得られたインビトロでの結果と同様に、ＩＬ−１３遮断は、ＷＴマウスまたはＩＬ−４欠損マウスのいずれにもサイトカインｍＲＮＡ発現に対して有意な影響を有さなかった。しかし、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処置したＩＬ−４欠損マウスにおけるＩＬ−１０ ｍＲＮＡレベルには中程度の増加が存在したが、これは、線維症における減少を説明しないようである。なぜなら、ＩＬ−４欠損マウスと比較して非常に多様なレベルのＩＬ−１０がｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスにおいて検出され、依然として線維症における類似の減少が観察されたからである。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ｂのｍＲＮＡ発現をまた、肉芽腫性組織において調べたが、感染したＩＬ−４欠損マウスでもｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃで処置した動物でも有意差は観察されなかった（データは示さず）。
【００８９】
（コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡレベルは、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置マウスの肝臓において減少するが、ＩＬ−４欠損によっては影響を受けない）
上記のインビトロおよびインビボでのサイトカイン研究は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの抗線維症効果が、Ｔｈ１型またはＴｈ２型のサイトカイン発現における変化によって説明されないようであることを示唆した。それゆえ、その後の実験では、本発明者らは、コラーゲンＩ（Ｃｏｌ Ｉ）およびコラーゲンＩＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩＩ）のｍＲＮＡ発現パターンを調査して、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ誘導性の線維症減少が、これらの２つの重要なコラーゲン産生遺伝子19における発現における直接変化を伴うか否かを決定した。図６に示すように、ＩＬ−１３遮断は、Ｃｏｌ ＩおよびＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡ発現をＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスの両方で有意に減少させた。ＩＬ−４欠損マウスにおいてＣｏｌ ＩまたはＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡの感染誘導レベルにおける変化は存在せず、そしてｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＷＴマウスと比較した場合、同様に処置したＩＬ−４欠損マウスにおいてさらなる減少は存在しなかった。
【００９０】
（ＩＬ−１３は、マウス３Ｔ３線維芽細胞におけるコラーゲン産生を刺激する）
ＩＬ−１３遮断が、感染させたＷＴマウスおよびＩＬ−４欠損マウスの肝臓におけるＣｏｌ ＩおよびＣｏｌ ＩＩＩのｍＲＮＡ発現をインビボで有意に減少させることを示したので、本発明者らは、ＩＬ−１３が線維芽細胞におけるコラーゲン合成を直接刺激するか否かを決定しようとした。この問題に答えるために、本発明者らは、マウス３Ｔ３線維芽細胞におけるＩ型コラーゲンの誘導を、ウェスタンブロッティングによって調べた。図７に示すように、ＩＬ−１３は、刺激の４８時間後にコラーゲン合成を誘導した。最小のＩ型コラーゲンが、未刺激の細胞において検出された（図７、レーン１）かまたはサイトカイン活性化培養物において、より早期の時点で検出された（データは示さず）。ＩＬ−４はまた、コラーゲンＩ合成を誘導し（レーン２）、そして高レベルの分泌コラーゲンが、サイトカインで刺激した両方の培養物において得られた上清において容易に検出可能であった（データは示さず）。反応の特異性を、精製したＩ型コラーゲンを用いて確認し（レーン５）、そして細菌のコラゲナーゼ処置は、抗体がコラーゲンについて特異的であることを示した（データは示さず）。
【００９１】
（考察）
ＣＤ４+Ｔｈ２型サイトカインパターンは、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉで感染されたマウスにおける免疫応答を支配する12、13。しかし、ＩＬ−４欠損マウスを用いた以前のＩＬ−４除去の研究および実験は、住血吸虫症の病因におけるこのサイトカインの不可欠な役割を示すことができなかった15、23、24。実際は、線維症における部分的な減少がいくつかの研究で観察されたが15、卵細胞（ｅｇｇ）誘導肉芽腫形成は、ＩＬ−４が完全に無い中で進行し得た23、24。これらの知見と対照的に、肝線維症の肉芽腫形成および発達は、Ｓｔａｔ６欠損マウスにおいて厳しく損傷しており16、これは、いくつかのＴｈ２関連サイトカインの産生における主要な欠損を示した46。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は両方ともＳｔａｔ６を介してシグナル伝達し、従って、感染されたＩＬ−４欠損マウスとＳｔａｒ６欠損マウスとの間に観察される明らかな病理の差違は、ＩＬ−１３によって説明され得る。それにもかかわらず、疾患進行におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の異なる寄与は、Ｓｔａｔ６欠損マウスまたはＩＬ−４欠損マウスの単独研究からは認められ得なかった。本研究において、本発明者らは、感染されたＷＴおよびＩＬ−４欠損マウスにＩＬ−１３の強力なインヒビターを使用し、ＩＬ−１３およびＩＬ−４が重複することならびに住血吸血病の病因における独特の役割を示すことを証明する。
【００９２】
いくつかの研究により、Ｔｈ２型サイトカイン応答が、ＩＬ−４またはＩＬ−４レセプターの非存在下においてインビボで発達し得ることが示された26、39。これは、本発明者らの知見と一致する。なぜなら、減少されたが有意なＩＬ−１３、ＩＬ−１０およびＩＬ−５発現が、感染されたＩＬ−４欠損マウスの腸間膜リンパ節（図４）および肝臓（図５）に検出されたからである。これらの産生はまた、ＣＤ４+Ｔ細胞応答に非常に依存し（図４）、これはさらに、従来のＴｈ２型応答が確立されたことを示す。これらの知見によって、最大のＩＬ−１３発現はＩＬ−４に依存するが、連続性のＩＬ−１３の産生がＩＬ−４の非存在下での有意な肉芽腫性応答の維持を説明し得るという証拠が提供される23-25。確かに、ＩＬ−１３単独の阻害はＷＴマウスの肉芽腫の大きさに影響を与えなかったが、ＩＬ−４欠損マウスにおいて残りのＩＬ−１３を阻害することは、肉芽腫体積に顕著かつ非常に有意な減少を生じた（図２Ａ）。これらの知見により、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方は肉芽腫発達を媒介するのに十分であることが示され、ＩＬ−４欠損マウスにおける肉芽腫の産生対Ｓｔａｔ６欠損マウスにおける肉芽腫のほとんど完全な欠失が形式的に説明される16、24。これらはまた、肺性卵細胞肉芽腫モデルにおける近年の知見を支持する30。なぜなら、肉芽腫は、卵細胞によって放出される強力に致死の肝臓毒素を遮ることによって重要な宿主保護的役割に貢献し47、この宿主が、好ましい宿主−寄生虫関係を保証するために、肉芽腫形成に対して重複した機構を発展し得るからである。
【００９３】
これらの知見によって、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が、肉芽腫形成に活動的に関与することが明確に示されたが、肥満細胞リクルートメント、組織好酸球増加症、および最も重要には肝線維症の生成における両方のサイトカインの特有の役割がこれらの研究で明らかになった。感染されたマウス由来の肝臓切片の組織学的試験によって、ＩＬ−１３が肥満細胞（表ＩＩＩ）または好酸球（図２Ｂ）分化およびリクルートメントに必要ではないことが示された。なぜなら、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理されたＷＴマウスの肉芽腫が、いずれの細胞型においても減少を示さなかったからである。実際、好酸球数は、ＩＬ−１３阻害されたＷＴマウスの病巣において有意に増加し（図２Ｂ）、これは、ＩＬ−１３がこの効果を部分的にアンタゴナイズし得ることを示唆する。対照的に、肥満細胞は、ＩＬ−４欠損マウス中の病巣でほとんど完全に存在せず、そして好酸球は、５０％以上減少されていた。興味深いことに、ＩＬ−１３は、ＩＬ−４欠損マウスにおいて、減少されたが有意な卵細胞誘導の組織好酸球増加症を部分的に支持しているようである。なぜなら、好酸球は、ＩＬ−４−欠損／ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置動物において１０％より下に減少されたからである。それにもかかわらず、これらのデータは、ＩＬ−４が肉芽腫内の好酸球および肥満細胞集団の発達の原因である優性サイトカインであることを示す。
【００９４】
おそらく、本研究からの最も重要な進歩は、肝線維症がｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃによってブロックされ得るという知見であった。確かに、顕微鏡技術（表ＩＩＩ）、生化学的技術（図２Ｃ）および分子技術（図６）は全て、ＩＬ−４ではなくＩＬ−１３が、卵細胞誘導肝線維症の発達に主要な役割を果たしていることを示した。以前の研究により、Ｔｈｌ／Ｔｈ２サイトカインのバランスが、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ感染されたマウスにおけるの組織線維症の程度に有意に影響を与え得ることが示された19。それにもかかわらず、本研究は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの効果が、Ｔｈ細胞サイトカイン応答の傾斜を介して媒介されないことを示唆する。ＩＬ−１３の阻害は、インビトロで腸間膜リンパ節（図４）または脾細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３の産生に有意な効果を示さなかった。そしてまた、病巣形成の部位において、インビボでサイトカインのｍＲＮＡ発現に変化は存在しなかった（図５）。これらの知見と対照的に、ＩＬ−４欠損マウスは、流入領域リンパ節において増加したＩＦＮ−γ応答（図４）を示し、そしてリンパ節（図４）および肝臓（図５）の両方において減少したＩＬ−５発現およびＩＬ−１３発現を示した。従って、ヒドロキシプロリン分析によってＩＬ−４欠損マウスで検出された線維症におけるわずかな減少（図２Ｃ）は、減少したＩＬ−１３産生に起因し得る。ＩＬ−４産生がＩＬ−１３封鎖によって影響されず、線維症がさらにこれらの動物において最大に減少されたという事実は、ＩＬ−１３によって果たされる重要な役割を強調する。実際、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置ＩＬ−４欠損マウスは、同様に処置されたＷＴマウスでの観察に対して、ヒドロキシプロリンレベルにほとんどさらなる減少を示さず（図２Ｃ）、かつコラーゲンＩまたはＩＩＩのｍＲＮＡ発現における差違も示されなかった（図６）。コントロール−Ｆｃ−処置ＩＬ−４−欠損マウスにおけるコラーゲンＩまたはＩＩＩ発現にも、ＷＴ動物と比較した場合、変化はなく、さらにＩＬ−４の寄与に重視をしない。さらに、３Ｔ３細胞を用いたインビトロ研究により、初めて線維芽細胞におけるコラーゲン産生を刺激するためのＩＬ−１３の能力が示された（図７）。従って、線維症に対するＩＬ−１３の効果は、より直接的であり得、そしてＴｈｌ／Ｔｈ２サイトカイン応答における調節に依存しない。この結論を支持して、近年の研究により、ＩＬ−１３レセプターが線維芽細胞上で発現され32、そしてＩＬ−１３はヒト肺線維芽細胞で接着分子および炎症性サイトカインの発現を増加することが示された48。最後に、ＩＬ−１３（図７）およびＩＬ−４49は両方とも、線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進し得るが、培養されたリンパ節細胞がＩＬ−４よりも、１００倍近く多いＩＬ−１３を産生したという事実は（図４）、このプロセスにおけるＩＬ−１３の強力に重要な寄与を強調するためのみに提供される。確かに、肺性肉芽腫モデルにおける研究は、ＩＬ−４ ｍＲＮＡ発現は病巣形成部位でよりきつく調節され、一方、ＩＬ−１３ ｍＲＮＡの誘導はより多くその間維持されることを明らかにした30。それにもかかわらず、本研究者らは、感染された動物におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現の運動を調べなかった。従って、本研究者らは、同様のパターンが肉芽腫性肝臓であてはまるか否かを言及することはできない。
【００９５】
ＩＬ−１３はまた、近年、腸の線虫に対する耐性に重要であることが示された27、37-39。ＩＬ−４欠損マウス39およびＩＬ−１３欠損マウス37、38における研究は、ＩＬ−４と対照的にＩＬ−１３がＮ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓおよびＴ．ｍｕｒｉｓの両方の排除において必須の役割を果たすことを示唆した。それにもかかわらず、寄生虫排除における特定の機構は未知のままである。しかし、上皮細胞中のＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導の変化および腸の生理が可能な標的として示唆されてきた50、51。ＩＬ−１３はまた、マウス喘息モデルにおいて中心的な役割を果たす。これらの研究において、ＩＬ−１３がアレルギー性喘息の発現に必要かつ十分であることが見いだされた40、41。上皮下線維症および気道平滑筋肥大は、慢性重篤喘息の共通の特徴であり5、そして慢性肺性線維症は、疾患の初期および後期段階におけるＩＩＩ型およびＩ型コラーゲンの産生とそれぞれ関連する。従って、本研究で明らかになったＩＬ−１３と線維症との間のつながりが、いくつかの重要なヒト疾患の病因を解明し、そしてより有効な線維症性疾患の処置の型を一般的に提供する。
【００９６】
本発明者らの以前の研究は、卵細胞特異的ＩＬ−１２誘導Ｔｈｌ記憶応答が、連続して感染されたマウスにおける肝線維症を効果的に減少し得ることを示した19。病理における減少は、正常なＴｈ２応答からＴｈｌ型サイトカインによる優性応答への変換を伴った。近年の研究からの知見により、このＩＬ−１２ベースのワクチン化プロトコールの抗病理効果が、ＩＬ−１３の阻害によって説明され得ることが示唆された。興味深いことに、異なるプロトコールを用いた第２の研究は、肉芽腫瘍形成のＴｈ２優性期の間に６〜８週間与えられたｒＩＬ−１２の反復注射が、肉芽腫形成および線維症の阻害にほとんど完全に効果的でなかったということを示した52。関連する研究は、ＩＬ−１２が、確立されたＴｈ２型応答をほとんど調節し得ないということを示唆し53、これは、後の研究において病理の調節の欠失を説明するようである52。これらの知見と対照的に、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃは、たとえ感染の後期段階の間のみに投与されたとしても、肝線維症の減少に非常に効果的であった。これらの知見は、ＩＬ−１３アンタゴニスト作用が、病原性Ｔｈ２型免疫応答が既に確立された状況における線維症の検証に、より十分に効果的な治療手段であることを示唆する。要約すると、本発明者らの知見は、ＩＬ−１３インヒビター（例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）が、慢性感染性疾患と関連する線維症の予防における一般的な治療的利点のインヒビターである証拠を提供し、そして住血吸血病の病因におけるＩＬ−１３の重要かつ希少な役割を示す。
【００９７】
（方法）
（動物、寄生虫およびＡｇ調製物）
６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＬ−４欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景、１０代戻し交配）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得た。全てのマウスは、研究動物の取り扱いの認定に関するＮＩＨ米国協会が承認した動物施設で、滅菌したフィルタートップのケージ中で飼育し、そして滅菌水で維持した。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉのＰｕｅｒｔｏ Ｒｉｃａｎ種のケルカリア（ＮＭＲＩ）は、感染させたＢｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｇｌａｂｒａｔａ巻貝から得た（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。可溶性卵細胞抗原（ＳＥＡ）は、以前に記載されるように15、ホモジナイズした卵細胞から精製した。
【００９８】
（試薬）
可溶性ＩＬ−１３レセプターα２−Ｆｃ融合タンパク質（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）は、以前に記載されるように調製され35、そしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ．によって提供された。内毒素混入は、Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＬＡＬアッセイ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，ＭＡ）によって測定された場合＜２ＥＵ／ｍｇであった。Ｂ９増殖アッセイにおいて３ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１３を中和する能力によって決定された場合、インビトロＩＤ５０は、約１０ｎｇ／ｍｌであった。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃに対するコントロールとして使用されたヒトＩｇＧ（コントロール−Ｆｃ）は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃに関して記載されるように35、組換えプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーによってアフィニティー精製された。以前に記載されたように、コントロール−Ｆｃは、感染されたマウスにおける病理学またはサイトカイン発現に検出可能な効果を有さなかった30。
【００９９】
（感染および処置）
マウスは、２０と２５との間のケルカリアを含む水の中で、尾の皮膚に４０分間経皮チャレンジをすることによって感染させた。動物は、卵細胞産生が発症した後（第５週）１日おきに、０．５ｍｌ ＰＢＳ中、ヒトコントロールＦｃまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃのいずれかを用い腹腔することによって処置した。インビボ使用のための最適な濃度（２００μｇ／マウス／日）は、動力学的アッセイおよび感作／静脈内卵細胞注射されたマウスにおける用量応答実験に基づいて選択した30。血清は、屠殺した日にマウスから収集した。全ての動物は、第８週にフェノバルビタールナトリウムの腹腔内投与（１８ｍｇ／マウス、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって屠殺し、そしてクエン酸生理食塩水を用いて灌流し、寄生虫負荷を評価した15。処置されたいずれの群においても死亡は観察されなかった。
【０１００】
（組織病理学および線維症測定）
肉芽腫の測定に関して、肝臓の約半分をＢｏｕｉｎ−Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定液を用い、そして以前に記載されたように15進めて固定した。肝肉芽腫の大きさは、ライトギムザ染色（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，ＭＤ）によって染色された組織学的切片で測定された。単一の生存可能な卵細胞を含む肉芽腫の各直径は、接眼マイクロメータを用いて測定し、そして肉芽腫の各体積は、球形を想定して算出した。最も長い直径およびこれに対して垂直の直径の平均を使用した。好酸球、肥満細胞および他の細胞型のパーセンテージは、同じ切片中で評価した。実質ネクローシスは、０〜４のスコアで得点付けし、０は最も小さい広がりのネクローシスであり、４は最も大きい広がりのネクローシスであった。肥満細胞のこの頻度はまた、類似の尺度に対して割り当てられ、これは０〜４の範囲を用いた。肝臓および腸における住血吸虫卵細胞の数ならびに肝臓のコラーゲン含量（ヒドロキシプロリンとして測定される）は、以前記載されたように測定した15。線維症はまた、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）を用いて染色された切片を用いて組織的に得点付けした。ピクロシリウス試薬は、コラーゲンを特異的に染色し、切片が偏光下で観察される場合、コラーゲンが沈着する明るい領域が照射される。各切片内の全ての肉芽腫は、尺度１〜４に基づいてピクロシリウス（レッド）「密度」に対して得点付けされ、「関連する領域」の第２の測定はまた、同じ尺度を用いて測定された。全線維症スコアは、各肉芽腫に対する密度と領域を乗算することによって決定された（すなわち、１６のスコアが最大である）。マウス１匹あたり平均３０個の肉芽腫が、全ての分析に含まれた。一貫性を制御するために、同じ個体が全ての組織学的特徴を得点付けされ、そして実験的な設計は全く認識していない。
【０１０１】
（ＲＮＡの単離および精製）
各動物由来の肝臓の２つの部分を合わせて、１ｍｌのＲＮＡ−ＳＴＡＴ ６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）中に置き、ドライアイス上で凍結しそして使用するまで−７０℃で保存した。組織ポリトロン（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ，ＣＴ）を用いて組織をホモジナイズし、そして全ＲＮＡを製造者らの推奨に従って抽出した。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、分光光度的に定量化した。
【０１０２】
（サイトカインｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出）
ＲＴ−ＰＣＲ手順を使用して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２およびＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）のｍＲＮＡの相対量を測定した。ｃＤＮＡは、記載されるように14、１μｇのＲＮＡの逆転写後に得た。全ての遺伝子のプライマーおよびプローブは、以前に公開された14、19、54。各サイトカインに対して使用したＰＣＲサイクルは、以下のようであった：ＩＬ−４（３３）、ＩＬ−５（３１）、ＩＦＮ−γ（２９）、コラーゲンＩ（２６）、コラーゲンＩＩＩ（２２）、ＴＧＦβｌ（３４）、ＴＧＦβ２（３４）およびＨＰＲＴ（２３）。
【０１０３】
（ＰＣＲ産物の分析および定量化）
増幅されたＤＮＡを、以前に記載されるように14、電気泳動、サザンブロットおよび非放射性サイトカイン特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションによって分析した。ＰＣＲ産物は、ＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。化学発光シグナルは、平らな土台のスキャナー（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ ｍｏｄｅｌ ６００ ＺＳ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて量を測定した。ＰＣＲ産物の量は、個体サンプルにおける、ＨＰＲＴ特異的シグナル密度に対するサイトカイン特異的シグナル密度の比を比較することによって決定した。引き続いて、個体サンプルに関する任意の濃度測定単位に１００という因数を掛けた。
【０１０４】
（インビトロ培養）
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞および脾臓を、マウスから抽出し、そして単一細胞懸濁液を調製した。赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いた浸透処理によって溶解した。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ2で、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および５０μＭ ２−ＭＥを補充したＲＰＭＩ １６４０培地に置いた。細胞を、２４ウェルプレート（３×１０6／ｍｌ，ｌｍｌ）に置き、ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）で刺激し、そして上清をＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γのレベルを測定するために７２時間後に収集した。さらなるＳＥＡ刺激された培養物はまた、５０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（ＧＫ１．５）を用いて処理した。抗−ＣＤ４ ｍＡｂ単独で処置した培養物は、コントロール培地の培養物で観察されたものと比較した場合、サイトカイン発現に変化を見せなかった（データには示さない）。ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γは、特定のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した15。ＩＬ−１３レベルは、マウスＩＬ− １３ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。サイトカインレベルは、組換えサイトカインを用いて作成されたカーブから計算した。ＩＬ−４は、ＩＬ−４感受性細胞株ＣＴ．４Ｓを用いて測定した。これらの細胞の増殖は、（3Ｈ）ＴｄＲ取り込みによって量を測定し、そしてサイトカインの量は、既知の量の組換えＩＬ−４を用いた比較によって測定した。
【０１０５】
（コラーゲンＩのウエスタンブロット検出）
３Ｔ３線維芽細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、および５０μＭ ２−ＭＥを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。コンフルエントの細胞を、２４ウェルプレート（５００，０００細胞／ｍｌ）にプレートし、そしてＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）またはｒＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて６、２４および４８時間刺激した。培養上清を収集し、分泌されたコラーゲン１を分析した。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で一度洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解した。細胞溶解液および培養上清を、還元状態を使用する６％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中の電気泳動分離に供し、そしてニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ブロットは、ウサギＩｇＧ抗マウスＩ型コラーゲン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｎｂｕｎｋ，ＭＥ）を用いてプローブ化し、そしてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２次Ａｂとして使用した。バンドは、ウエスタンブロット化学発光試薬を用いて可視化した（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。コラーゲンバンドの同一性を確認するために、細胞溶解液を、ＰＢＳ（１ｍＭ ＣａＣｌ2および１％ＦＣＳを補充する）中の０．５ ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、３７℃で１時間処理した。精製されたラットコラーゲンＩ調製物をまた、コントロールとして使用した。
【０１０６】
（統計）
住血吸虫および卵細胞の数、サイトカインｍＲＮＡの変化、およ分泌されたサイトカインタンパク質の値を、スチューデントの２テールの（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）ｔ−検定を用いて比較した。肝線維症は、共分散の分析によって比較し、これは、卵細胞１個あたりの、共分散（ｃｏｖａｒｉａｔｅ）としての全肝臓卵細胞のログおよびヒドロキシプロリンのログを使用した。ｐ＜０．０５が有効であると考えられた。
【０１０７】
（参考文献）
【０１０８】
【数１】
全ての特許および参考文献は、完全に記載されるように参考として援用される。
［配列表］
【数２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−７８４３２（Ｐ２０１１−７８４３２Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５６９（Ｐ２０１１−２５６９）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【分割の表示】特願２０００−６１４２９３（Ｐ２０００−６１４２９３）の分割
【原出願日】平成１２年４月２８日（２０００．４．２８）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（３０５０５６８５８）ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ，センターズ フォー (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【分割の表示】特願２０００−６１４２９３（Ｐ２０００−６１４２９３）の分割
【原出願日】平成１２年４月２８日（２０００．４．２８）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（３０５０５６８５８）ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ，センターズ フォー (15)
【Ｆターム（参考）】
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